癌細胞を標的とする遺伝子の伝達方法
本発明の目的は、抗−腫瘍遺伝子治療に有用な特異的に癌細胞を標的できるレトロウィルス遺伝子伝達システムを提供することである。Ｔａｇ−７２表面抗原に特異的な単鎖抗体（ＳｃＦｖ）及びＧａＬＶ外被糖蛋白質の融合ポリペプチド形態である本発明のキメラリガンド蛋白質は癌細胞に対し高い形質導入効率を現し、標的細胞を特異的に感染させ、治療遺伝子を効果的に伝達する。従って、本発明のキメラリガンドは、腫瘍の成長及び転移を抑制するための遺伝子治療に有効に使用できる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は腫瘍−関連糖蛋白質の表面抗原に特異的に結合できる単鎖抗体及びレトロウィルス外被糖蛋白質の融合ポリペプチド形態のキメラリガンド（ｃｈｉｍｅｒｉｃ ｌｉｇａｎｄ）；前記キメラリガンドをコードする遺伝子を含む発現ベクター；前記発現ベクターが形質導入された組換レトロウィルス；及び前記キメラリガンドを有効成分とする薬学組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
遺伝子治療は先天性代謝異常によって発病する疾病だけでなく癌・糖尿病・エイズ等を始めとする後天的疾病の治療を目的とする急激に注目されている分野である。現在遺伝子治療に使われている幾つかの遺伝子伝達ベクターシステムの中でもレトロウィルスベクターシステムはアデノウィルス、リポソーム、エレクトロポレーション（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ）法及び遺伝子銃（ｇｅｎｅ ｇｕｎ）などに比べ有利である。例えば、レトロウィルスベクターシステムは形質導入された細胞の安定的な発現を可能にする宿主細胞内へ永久的に統合できる。しかし、このようなシステムは特定標的細胞に遺伝子を伝達するには限界がある。
【０００３】
レトロウィルスを利用して治療遺伝子を標的細胞に特異的に導入する様々な方法が開発されており、次のような例を挙げられる：糖分子を化学的な方法を用いてレトロウィルスの外被糖蛋白質に連結して糖連結（ｓｕｇａｒ ｃｏｕｐｌｅ）外被糖蛋白質を標的細胞のアシアロ糖蛋白質受容体（ａｓｉａｌｏｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）に結合させる方法（Ｎｅｄａ，Ｈ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６：１４１４３−１４１４６，１９９１）；レトロウィルスの外被糖蛋白質と標的細胞の受容体或いは表面抗原 の両方に連結できる連結抗体を利用する方法（Ｇｏｕｄ Ｂ．ｅｔ ａｌ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １６３：２５１−２５４，１９８８；Ｒｏｕｘ，Ｐ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８６：９０７９−９０８３，１９８９；Ｅｔｉｅｎｎｅ−Ｊｕｌａｎ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．７３：３２５１−３２５５，１９９２）；単鎖抗体をレトロウィルスの外被糖蛋白質に遺伝工学的方法で結合させて標的細胞に感染させる方法（Ｒｕｓｓｅｌｌ，Ｓ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２１：１０８１−１０８５，１９９３；Ｓｏｍｉａ，Ｎ．Ｖ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９２：７５７０−７５７４，１９９５；Ａｇｅｒ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．７：２１５７−２１６４，１９９６；Ｍａｒｉｎ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７０：２９５７−２９６２，１９９６；Ｓｃｈｎｉｅｒｌｅ，Ｂ．Ｓ．ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．３：３３４−３４２，１９９６）；及びペプチドリガンド（ｐｅｐｔｉｄｅ ｌｉｇａｎｄ）をレトロウィルスの外被糖蛋白質に遺伝子工学的な方法で結合させて標的細胞に感染させる方法（Ｋａｓａｈａｒａ，Ｎ．ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６６：１３７３−１３７６，１９９４；Ｃｏｓｓｅｔ，Ｆ．Ｌ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６９：６３１４−６３２２，１９９５；Ｓｃｈｎｉｅｒｌｅ，Ｂ．Ｓ．，ａｎｄ Ｇｒｏｎｅｒ，Ｂ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．３：１０６９−１０７３，１９９６）。しかし、これらの方法は形質導入（ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ）効率が非常に低いという問題がある。
【０００４】
治療遺伝子を人間の標的細胞に導入するため鳥類やマウス（ｍｕｒｉｎｅ）レトロウィルスを利用する方法も開発されている（Ｃｈｕ，Ｔ−Ｈ．Ｔ．，ａｎｄ Ｒ．Ｄｏｒｎｂｕｒｇ．Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６９：２６５９−２６６３，１９９５；Ｃｈｕ，Ｔ−Ｈ．Ｔ．ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１：２９２−２９９，１９９４；Ｖａｌｓｅｓｉａ−Ｗｉｔｔｍａｎｎ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６８：４６０９−４６１９，１９９４；Ｃｏｓｓｅｔ，Ｆ−Ｌ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６９：６３１４−６３２２，１９９５；Ｈａｎ，Ｘ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９２：９７４７−９７５１，１９９５；Ｋａｓａｈａｒａ，Ｎ．ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６６：１３７３−１３７６，１９９４；Ｓｏｍｉａ，Ｎ．Ｖ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９２：７５７０−７５７４，１９９５；ＨＡＮ，Ｊ．Ｙ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７１，８１０３−８１０８，１９９７）。マウス（ｍｕｒｉｎｅ）レトロウィルスの構造及び機能に対しては多く研究されているが、特にＭｏ−ＭｕＬＶとＦｒ−ＭｕＬＶの外被糖蛋白質の３次構造がＸ−ｒａｙ結晶によって最近明かされている。
【０００５】
標的細胞の受容体（ｒｅｃｅｐｔｏｒ）又は表面抗原が知られているか特異的である場合は、単鎖抗体（ｓｉｎｇｌｅ−ｃｈａｉｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ：ＳｃＦｖ）をレトロウィルスの外被糖蛋白質に遺伝工学的な方法で結合させて標的細胞に感染させる方法が標的細胞の特異的感染に非常に有用である。
【０００６】
単鎖抗体（ＳｃＦｖ）とは適切な合成アミノ酸リンカーによりＶＨのカルボキシ末端（ｃａｒｂｏｘｙ−ｔｅｒｍｉｎａｌ）とＶＬのアミノ末端（ａｍｉｎｏ−ｔｅｒｍｉｎａｌ）が繋がった形態である。前記抗体結合部位は重鎖と軽鎖の可変領域からなっている抗体分子のＦｖ（ｆｒａｇｍｅｎｔ ｖａｒｉａｂｌｅ）領域に位置する（Ｐｏｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ３９：１９−２４，２００２；Ｆｕｊｉｗａｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４１：１２７２９−１２７３８，２００２）．
【０００７】
最近、安全性と形質導入効率を向上させるためにレトロウィルスの擬似型（ｐｓｅｕｄｏｔｙｐｅ）が研究されている。例えば、様々な人体細胞株で両指向性（ａｍｐｈｏｔｒｏｐｉｃ）マウス（ｍｕｒｉｎｅ）レトロウィルスベクターよりもテナガザル白血病ウィルス（ｇｉｂｂｏｎ ａｐｅ ｌｅｕｋｅｍｉａ ｖｉｒｕｓ，ＧａＬＶ）Ｅｎｖ−偽型レトロウィルスベクターが５〜３０倍程高い感染効率を現した（Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ａｍｅｒ．Ａｓｓｏｃ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．３８：１７７，１９９７）。しかし、特異的標的作用に関しては依然として解決すべき限界がある。
ここに、本発明者らはより高いウィルス力価と形質導入効率を現すレトロウィルスを利用した遺伝子伝達システムの要求を満たすために鋭意研究し、ＧａＬＶ外被糖蛋白質と腫瘍−関連糖蛋白質（ｔｕｍｏｒ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ）７２（Ｔａｇ−７２）の表面抗原に特異的に結合できるモノクローナル抗体（ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ）由来の単鎖抗体（Ｓｉｎｇｌｅ ｃｈａｉｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ）の融合ポリペプチド形態でキメラリガンド（ｃｈｉｍｅｒｉｃ ｌｉｇａｎｄ）を開発することによって本発明に至った。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の目的は抗−腫瘍遺伝子治療において有用な特異的に癌細胞を標的とするレトロウィルス遺伝子伝達システムを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
前記目的を達成するために、本発明は、腫瘍−関連糖蛋白質７２（Ｔａｇ−７２）の表面抗原に特異的に結合できる単鎖抗体とレトロウィルス外被糖蛋白質（Ｅｎｖ ＧＰ）の融合ポリペプチド形態のキメラリガンドを提供する。
また、本発明は前記キメラリガンドをコードする遺伝子を含む組換発現ベクター及び前記発現ベクターが形質導入されて前記レトロウィルスを生産できるパッケージ細胞株を提供する。
【００１０】
さらに、本発明は前記キメラリガンド又はパッケージ細胞株を有効成分として含む癌細胞標的性遺伝子治療用薬学組成物を提供する。
【発明の効果】
【００１１】
上に述べたように、腫瘍−関連糖蛋白質Ｔａｇ−７２表面抗原に特異的な単鎖抗体とＧａＬＶ外被糖蛋白質を融合させた本発明のキメラリガンドはＴａｇ−７２を発現する腫瘍細胞に対し形質導入効率が非常に高く、標的細胞を特異的に感染する治療遺伝子を効果的に伝達できるため、癌の成長及び転移抑制のための遺伝子治療に有効に利用することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
以下、本発明をより詳細に説明する。
本発明は腫瘍−関連糖蛋白質７２（Ｔａｇ−７２）の表面抗原に特異的な単鎖抗体とＧａＬＶ外被糖蛋白質の融合ポリペプチド形態であるキメラリガンドを提供する。
【００１３】
レトロウィルス遺伝子伝達システムを開発するために、本発明者らは、結腸癌、胃癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌等を含む様々な癌細胞で発現される腫瘍関連糖蛋白質７２（Ｔａｇ−７２）の表面抗原に特異的に結合できる単鎖抗体の利用を鋭意研究した。また、治療遺伝子を人間の標的細胞に効率的に導入するために、ＭｕＬＶ（Ｍｕｒｉｎｅ Ｌｅｕｋｅｍｉａ Ｖｉｒｕｓ）外被糖蛋白質よりも高い人体癌細胞への形質導入効率及び人間血液に対する安定性を現すＧａＬＶ外被糖蛋白質の利用も合わせて研究した。
【００１４】
細胞表面の受容体に対するウィルス外被糖蛋白質上に分布された外被糖蛋白質間結合は標的細胞内へのレトロウィルス感染に必須であり、感染の特異性を決める重要な要因でもある。標的細胞への特異的な遺伝子伝達システムで、標的細胞の受容体に結合するよう細胞に特異性を与えるウィルス外被糖蛋白質を操作することにより標的細胞を特異的に感染可能なウィルスを製造することができる。よって、本発明者らはＧａＬＶ外被糖蛋白質の細胞特異性を決定して特異的細胞受容体と結合できる表面サブユニット（ｓｕｒｆａｃｅ ｓｕｂｕｎｉｔ，ＳＵ）領域へＴａｇ−７２表面抗原に特異的な単鎖抗体Ｔａｇ−７２ｐＳ１を融合させてキメラリガンドを製造した。単鎖抗体に融合された外被糖蛋白質を発現するレトロウィルスは標的細胞に特異的に結合して効果的に治療遺伝子を伝達することができる。
【００１５】
ＧａＬＶ外被糖蛋白質と類似した構造を持つＭｕＬＶ外被糖蛋白質の場合、外被糖蛋白質に導入された点突然変異（ｐｏｉｎｔ ｍｕｔａｔｉｏｎ）、挿入突然変異（ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ ｍｕｔａｔｉｏｎ）或いは欠失突然変異（ｄｅｌｅｔｉｏｎ ｍｕｔａｔｉｏｎ）が構造的変化を引き起こす非正常的な機能を持つウィルス外被糖蛋白質を生産し、それによりウィルスの感染性が低下するようになると報告されたことがある（Ｒｕｓｓｅｌｌ，Ｓ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２１：１０８１−１０８５，１９９３；Ｓｏｍｉａ，Ｎ．Ｖ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９２：７５７０−７５７４，１９９５；Ａｇｅｒ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．７：２１５７−２１６４，１９９６；Ｍａｒｉｎ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７０：２９５７−２９６２，１９９６；Ｓｃｈｎｉｅｒｌｅ，Ｂ．Ｓ．ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．３：３３４−３４２，１９９６；Ｃｈｒｉｓ Ａ．Ｂｅｎｅｄｉｃｔ．ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ １０：５４５−５５７，１９９９；Ｍａｒｉａｎａ Ｍａｒｉｎ．ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７０：２９５７−２９６２，１９９６；Ｔｅ−Ｈｕａ Ｔｅａｒｉｎａ Ｃ．Ｈ．ａｎｄ Ｒａｌｐｈ Ｄｏｒｎｂｕｒｇ，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７１：７２０−７２５，１９９７）。つまり、外来ペプチドが外被糖蛋白質に挿入されたり或いは外被糖蛋白質の特定部分が欠失されたとき、感染性が顕著に低下したウィルスが生産される。従って、レトロウィルスの外被糖蛋白質にＳｃＦｖのような外来リガンドが挿入される時、外被糖蛋白質の構造と機能の間の相関関係を細心に考慮しなければならない。本発明のキメラリガンドは細胞特異性と細胞表面に対する結合を決める外被糖蛋白質の種々なＳＵ領域の中で選ばれた可変領域Ｂ（ｖａｒｉａｂｌｅ ｒｅｇｉｏｎ Ｂ：ＶＲＢ）内に単鎖抗体（ＳｃＦｖ）を挿入して標的細胞に特異的に感染するように設計された。
【００１６】
好ましい実施例として、本発明者らはＧａＬＶ外被糖蛋白質の可変領域Ｂ部位であるＡＴＧ開始コドンから翻訳された最初のメチオニンから１９９番目及び２００番目アミノ酸残基の間にＴａｇ−７２表面抗原に特異的結合する単鎖抗体Ｔａｇ−７２ｐＳ１を挿入して製造した融合キメラリガンド；及び前記キメラリガンドを含む発現ベクターを製造する方法を開発した。本発明に使われたＧａＬＶ外被糖蛋白質はＲ−ペプチドを持つＳＥＡＴＯタイプであり配列番号７に記載の塩基配列（ＮＣＢＩ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＡＡＣ９６０８３）を有する。また、Ｔａｇ−７２表面抗原に特異的な単鎖抗体Ｔａｇ−７２ｐＳ１は配列番号８に記載の塩基配列を有する。ＦｖＧＥＬ１９９と命名された本発明のキメラリガンドは配列番号１０に記載の塩基配列を有し、これは配列番号１１に記載の融合ポリペプチドをコードし、単鎖抗体Ｔａｇ−７２ｐＳ１がＧｌｙ４Ｓｅｒの５つのアミノ酸で構成されたリンカーによりＧａＬＶ外被糖蛋白質に連結される。
このように製造された単鎖抗体ＧａＬＶ外被糖蛋白質（ＳｃＦｖ−ＧａＬＶ Ｅｎｖ ＧＰ）キメラリガンドをその発現転写が促進されるＨＣＭＶプロモーターを有する骨格ベクターｐＨＹＫＥＦ１（Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，９３：１８３，２００２）に挿入して発現ベクターｐＨＥＦｖＧＥＬ１９９を製造した。前記発現ベクターは単鎖抗体Ｔａｇ−７２ｐＳ１がＧａＬＶ外被糖蛋白質ＳＵ部分の１９９番目及び２００番目アミノ酸残基の間に挿入されて形成された９５６個のアミノ酸で構成された融合ポリペプチドを発現する。
【００１７】
本発明の好ましい実施例により、結腸菌ＤＨ５αを発現ベクターｐＨＥＦｖＧＥＬ１９９で形質転換したベクターをＤＨ５α／ｐＨＥＦｖＧＥＬ１９９と命名した結腸菌形質転換体を得て、これを特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約に基づき、寄託番号ＫＣＣＭ−１０５９６で韓国生命工学院（ＫＲＩＢＢ）遺伝子銀行（ＫＣＴＣ）（アドレス：韓国生命工学研究院，＃５２，オ・ウンドン、ユ・ソング、大田広域市、３０５−３３３，韓国）に２００４年２月１３日付で寄託した。
【００１８】
本発明はまた前記キメラリガンドをコードする遺伝子を含む組換レトロウィルスベクターが形質導入されてレトロウィルスを生産するパッケージ細胞株を提供する。
【００１９】
本発明で使用できるパッケージ細胞株としては、Ｇａｇ−Ｐｏｌ蛋白質は発現するが動物細胞株へのウィルス感染を媒介できる如何なるウィルス外被糖蛋白質も含まないパッケージ細胞株、例えばＧＰ２９３細胞株（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）であるのが好ましい。好ましくは、レトロウィルス形質導入方法は、カルシウム燐酸塩共沈殿法（ｃａｌｃｉｕｍ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｃｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ；Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，２ｎｄ ｅｄ．，１９８９）及びリポフェクトアミン方法（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、米国）のように当分野で公知の通常的な方法を使うことができる。形質導入された細胞株はＧ４１８のような抗生剤を含む適切な選択培地で培養してコロニー選別することができる。本発明の好ましい実施例では、組換レトロウィルスベクターｐＨＥＦｖＧＥＬ１９９をパッケージ細胞株ＧＰ２９３細胞に形質導入し、形質導入された細胞から高い力価で組換レトロウィルスを生産できるパッケージ細胞株ＧＰ２９３ＨＦｖＧＥＬ１９９を選別した。
【００２０】
このように選別されたパッケージ細胞株は、標的細胞に特異的な方式で人間癌細胞内に効果的に導入されて前記キメラリガンドを効率的に発現させることができるため、癌の成長と転移を効果的に抑制することができる。
【００２１】
従って、さらに本発明は、有効量の本発明によるパッケージ細胞株又はキメラリガンド及び薬学的に許容可能な担体を含む薬学組成物を提供する。
【００２２】
本発明の薬学組成物は通常的な方法を用いて製剤化することができる。剤型の製造において、この有効成分は担体と混合または希釈するのが好ましい。好ましい担体・賦形剤又は希釈剤の例としては、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、澱粉、アラビアガム、アルギン塩酸、ゼラチン、リン酸カルシウム、ケイ酸カルシウム、セルロース、メチルセルロース、微細結晶セルロース、ポリビニルピロリドン、水、メチルヒドロキシベンゾエート、プロピルヒドロキシベンゾエート、タルク、マグネシウムステアリン酸及び鉱油を含む。前記剤型は追加的に充填剤、抗凝集剤、光沢剤、湿潤剤、芳香剤、乳化剤、保存剤及びその他を含む。本発明の組成物は患者に投与された後に活性成の迅速的且つ持続的な、または遅延された放出を提供するための当分野で公知の方法を用いて剤型化することができる。
【００２３】
本発明の薬学剤型は筋肉内注射で投与することができる。好ましくは、本発明の組成物は等張液又は懸濁液である。
【００２４】
人間（患者）を治療するために、有効成分として本発明のパッケージ細胞株の通常的投与量は１０５〜１０８細胞数／ｋｇ体重、好ましくは１０６〜１０７細胞数／ｋｇ体重の範囲で１日１回〜数回投与することができる。しかし、活性成分の実際投与量は治療条件・投与経路・患者の年齢・性別及び体重、癌の種類及び重症度などの様々な関連因子に照らし合わせて決定するべきと理解しなければならず、よって前記投与量は如何なる方法でも本発明の範囲を限定するものではない。
【００２５】
実施例１：ＳｃＦｖ−ＧａＬＶ外被糖蛋白質キメラリガンドを発現する組換レトロウィルスベクターの製造
＜１−１＞ ＧａＬＶ外被糖蛋白質の構造及び機能分析
Ｔａｇ−７２表面抗原に対し特異的な単鎖抗体Ｔａｇ−７２ｐＳ１とＧａＬＶ外被糖蛋白質（Ｅｎｖ ＧＰ）の融合ポリペプチド形態のキメラリガンドを次のように製造した。
【００２６】
ＭｕＬＶ又はＨＩＶのようなレトロウィルスの外被糖蛋白質やインフルエンザＡウィルス（ｉｎｆｌｕｅｎｚａ Ａ ｖｉｒｕｓ）の血球凝集素（ｈａｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ，ＨＡ）などとは異なり、ＧａＬＶ外被糖蛋白質の３次構造及び機能に対しては殆ど知られていない。従って、単鎖抗体が挿入されるＧａＬＶ外被糖蛋白質の適切な部位を選別するためにＧａＬＶ外被糖蛋白質とその他レトロウィルス外被糖蛋白質の間の構造的且つ機能的相互関係分析を行った。本発明者らはＧａＬＶ外被糖蛋白質とその他レトロウィルス外被糖蛋白質を対象にＰｆａｒｍ分析（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｆａｍｉｌｉｅｓ Ｄａｔａｂａｓｅ ｏｆ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔｓ ａｎｄ ＨＭＭｓ）を利用して相同性（ｈｏｍｏｌｏｇｙ）を行った。その結果、これらのレトロウィルスの外被糖蛋白質中幾つかが膜貫通（ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ，ＴＭ）カルボキシル末端ドメイン（Ｃ−末端）に位置するＲ−ペプチドだけでなく可変領域Ａ（ＶＲＡ）、可変領域Ｂ（ＶＲＢ）、可変領域Ｃ（ＶＲＣ）及びプロリンリッチ領域（ＰＲＲ）を含むＧａＬＶ外被糖蛋白質において特徴的な表面サブユニット（ＳＵ）構造を有することが明らかになった。また、哺乳動物タイプ−ＣレトロウィルスＦｒ−ＭｕＬＶ、γレトロウィルスＧａＬＶ、ＦＬＶ及びＭｕＬＶの外被糖蛋白質の間の配列相同性を様々なコンピュータプログラムを利用して分析した。その結果、特異的受容体結合部位として知られていた受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）、機能が知られていないプロリンリッチ領域（ＰＲＲ）及びＣ−末端部位以外の部位が非常に高い配列の相同性と同一性（ｉｄｅｎｔｉｔｙ）を現すことが確認された（表１及び図１）。
【表１】
【００２７】
このような相同性分析結果に基づいてＦｒ−ＭｕＬＶ外被糖蛋白質の公知の３次構造（ＮＣＢＩ ＰＤＢ 登載番号：１ＡＯＬ）に関するＧａＬＶ外被糖蛋白質の２次構造分析を通じてＴａｇ−７２表面抗原に特異的な単鎖抗体を挿入するためのＧａＬＶ外被糖蛋白質の適切な位置を調査した。アミノ酸配列で保存された部位は進化的観点から見て構造的及び機能的に重要な部位と見なされるため、挿入位置の最初の考慮対象は突然変異、自然選択、適応又は進化の過程で柔軟性を有する高度の可変領域である。従って、種々なＧａＬＶ外被糖蛋白の部分型と多様な哺乳動物タイプ−Ｃレトロウィルス外被糖蛋白質のアミノ酸整列（ａｌｉｇｎｍｅｎｔ）分析に基づいてＧａＬＶ外被糖蛋白質の高度可変領域を決定した（図２）。次に、前記外被糖蛋白質の構造的及び機能的変化を最少化できる位置を決めるために、親水性（ｈｙｄｒｏｐａｔｈｙ）、表面可能性（ｓｕｒｆａｃｅ ｐｒｏｂａｂｉｌｉｔｙ）、抗原指数（ａｎｔｉｇｅｎｉｃ ｉｎｄｅｘ）、α−フェリックス、β−シート、コイル構造、変換プロット（ｔｕｒｎ ｐｌｏｔ）、変換頻度及び柔軟性（ｆｌｅｘｉｂｉｌｉｔｙ）の観点からＧａＬＶ Ｅｎｖ糖蛋白質の２次構造分析を行った。また、ＧａＬＶ Ｅｎｖ糖蛋白質の２次構造をＦｒ−ＭｕＬＶ外被糖蛋白質の公知の３次構造の対応部分としてＧａＬＶ Ｅｎｖ糖蛋白質の仮想的３次構造の適切な挿入位置を予測するためにＦｒ−ＭｕＬＶ糖蛋白質の２次構造と比較した。その結果、標的細胞受容体に対するＧａＬＶ外被糖蛋白質の特異的認識と結合に関与する受容体結合ドメイン（ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｂｉｎｄｉｎｇ ｄｏｍａｉｎ；ＲＢＤ）である可変領域Ｂ（ＶＲＢ）がＴａｇ−７２表面抗原に特異的な単鎖抗体の挿入するための適切な部位として選ばれた。
【００２８】
図３はレトロウィルス外被糖蛋白質の２次構造を示し、ＧａＬＶ外被糖蛋白質内への単鎖抗体糖蛋白質の挿入位置は可変領域Ｂ内１９９番目及び２００番目アミノ酸残基の間は赤色実線で、アミノ酸配列上の位置は数字で示しており、数字で示されたアミノ酸配列は最初のアミノ酸でメチオニンを持つシグナルペプチドを含む。
＜１−２＞単鎖抗体及びレトロウィルス外被糖蛋白質の融合キメラリガンドの製造
ＧａＬＶ外被糖蛋白質とＴａｇ−７２表面抗原に特異的な単鎖抗体Ｔａｇ−７２ｐＳ１の融合ポリペプチド形態であるキメラリガンドをヒュースタンなど（Ｈｕｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８５：５８７９−５８８３，１９８８）の方法を用いてＡＫＡ人間化抗体（韓国特許第３１８７６１号）の重鎖及び軽鎖可変領域から製造した。このように製造された単鎖抗体をｐＣＡＮＴＡＢ５Ｅベクターの制限酵素ＳｆｉＩ／ＮｏｔＩ部位に挿入してベクターｐＣＡＮＴＡＢ−３Ｅ８ＳｃＦｖＰｒｅＳ１を製作した。野生型ＧａＬＶ外被糖蛋白質遺伝子（ＳＥＡＴＯ）（ＮＣＢＩ登載番号ＡＡＣ９６０８３）をベクターｐＨＹＫＥＦ−１（Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，９３：１８３，２００２）にクローニングしてベクターｐＨＥＧＥＬを製作した。このように製作されたｐＣＡＮＴＡＢ−３Ｅ８ＳｃＦｖＰｒｅＳ１及びｐＨＥＧＥＬベクターをＰＣＲで増幅してキメラリガンドを製造した。
【００２９】
ベクターｐＨＥＧＥＬ内にクローニングされたＧａＬＶ外被糖蛋白質遺伝子はＲ−ペプチドを持つＳＥＡＴＯタイプ（ＮＣＢＩ 登載番号ＡＡＣ９６０８３）であり配列番号：７に記載される塩基配列を有する。Ｔａｇ−７２表面抗体に特異的な単鎖抗体Ｔａｇ−７２ｐＳ１をコードする遺伝子は配列番号８に記載される塩基配列を有するが、前記単鎖抗体Ｔａｇ−７２ｐＳ１は重鎖と軽鎖の可変領域であるＶＬとＶＨで構成されたＦｖ（ｆｒａｇｍｅｎｔ ｖａｒｉａｂｌｅ）が（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３のアミノ酸１５つを含むリンカーにより軽鎖可変領域ＶＬのアミノ末端（ａｍｉｎｏ−ｔｅｒｍｎａｌ）によって連結された重鎖可変領域ＶＨのカルボキシ末端（ｃａｒｂｏｘｙ−ｔｅｒｍｉｎａｌ）を含む単鎖の形態として発現される。配列番号：９に記載されるＰｒｅＳ１エピトープは単鎖抗体のＣ−末端部位に標識された。最初のメチオニンから１９９番目・２００番目アミノ酸残基の間に単鎖抗体Ｔａｇ−７２ｐＳ１を挿入させてなるキメラリガンドを製造するために、次のようなポリメラーゼ酵素連鎖反応を実施した。
【００３０】
ベクターｐＨＥＧＥＬを鋳型として配列番号：１のＥｎｖ Ｆプライマーと配列番号：２の５９７ＬＮプライマーを利用してＰＣＲを行い、６８０ｂｐのＰＣＲ産物を増幅させた。ベクターｐＨＥＧＥＬを鋳型として配列番号３のＬＣ５９７プライマーと配列番号：４のＳｐｉｋｅ Ｒ２プライマーを利用してＰＣＲを行い、１，５００ｂｐのＰＣＲ産物を増幅させた。ベクターｐＣＡＮＴＡＢ−３Ｅ８ＳｃＦｖＰｒｅＳ１を鋳型として配列番号：５のＬｎｋＮＳｃＦｖプライマー配列番号６のＳｃＦｖＬｎｋＣプライマーを利用してＰＣＲを行い、８２０ｂｐのＰＣＲ産物を増幅させた。このように増幅された３つのＰＣＲ産物を全て混合してから、これを鋳型として配列番号１のＥｎｖ Ｆプライマーと配列番号：４のＳｐｉｋｅ Ｒ２プライマーを利用してＰＣＲを行い、２，９３０ｂｐのＰＣＲ産物を増幅させた。ＰＣＲ反応溶液は鋳型ＤＮＡ ２００ｎｇ、ポリメラーゼ５単位、ＰＣＲ緩衝溶液１０μｌ，ｄＮＴＰ ０．２ｍＭ及び各プライマー５０ｐｍｏｌずつ混合してから最終体積を１００μｌにした。前記ＰＣＲ緩衝溶液は２００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１００ｍＭ ＫＣｌ、１００ｍＭ（ＮＨ４）２ＳＯ４、２０ｍＭ ＭｇＳＯ４、１％トリトンＸ−１００及び１ ｍｇ／ｍｌアセチル化ＢＳＡ（ｐＨ８．８）を含む。前記ＰＣＲ反応に使用したポリメラーゼはＰｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｂｉｏｎｅｅｒ社、韓国）又はＴａｋａｒａ Ｅｘ Ｔａｑ重合酵素（ＴａＫａＲａ社、日本）を使用した。該ＰＣＲ反応条件は９４℃で４分間前変性させてから９４℃で１分（変性）、５５℃で１分（アニーリング）及び７２℃で３分（延長）の増幅反応を３０回繰り返した後、７２℃で１０分間最終増幅した。
【００３１】
前記方法で増幅されたＳｃＦｖ−ＧａＬＶ外被糖蛋白質キメラリガンド遺伝子をコードする２，９３０ ｂｐのＰＣＲ切片を制限酵素ＢａｍＨＩとＸｂａＩで切断した。前記切片を高効率遺伝子発現ベクターであるｐＨＹＫＥＦ１の同該制限酵素部位に挿入してＳｃＦｖ−ＧａＬＶ外被糖蛋白質キメラリガンド遺伝子を発現する組換ベクターｐＨＥＦｖＧＥＬ１９９を製造したが、ベクターｐＨＹＫＥＦ１で外来遺伝子の発現はＨＣＭＶプロモーターにより調節され、その転写はＥＦ１αイントロンによって活性化する（Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，９３：１８３，２００２）。対照群として野生型ＧａＬＶ（ＳＥＡＴＯ）外被糖蛋白質遺伝子を前記骨格ベクターに挿入して発現ベクターｐＨＥＧＥＬを製造した。塩基配列分析によって本発明のキメラリガンドが発現ベクターｐＨＥＦｖＧＥＬ１９９に挿入されたことを確認した。前記ＳｃＦｖ−ＧａＬＶ外被糖蛋白質キメラリガンドをＦｖＧＥＬ１９９と命名した。
【００３２】
前記で製造された本発明のキメラリガンドは配列番号１１に記載されるペプチドをコードする配列番号１０に記載される塩基配列を有する。図４はＳｃＦｖ−ＧａＬＶ外被糖蛋白質融合キメラリガンドＦｖＧＥＬ１９９の模式図を現したものである。レトロウィルスベクターｐＨＥＧＥＬは６８５個のアミノ酸で構成された野生型ＧａＬＶ外被糖蛋白質を発現する。また、組換レトロウィルスベクターｐＨＥＦｖＧＥＬ１９９／ｐＭＥＦｖＧＥＬ１９９はＧａＬＶ外被糖蛋白質のＳＵ地域内１９９番目及び２００番目アミノ酸残基の間に単鎖抗体Ｔａｇ−７２ｐＳ１を挿入させて製造したアミノ酸９５６個で構成された融合ポリペプチドを発現する。本発明の融合キメラリガンドで単鎖抗体Ｔａｇ−７２ｐＳ１はＧｌｙ４Ｓｅｒの５個のアミノ酸を含むリンカーによりＧａＬＶの外被糖蛋白質に連結されている。
【００３３】
＜１−３＞ ＳｃＦｖ−ＧａＬＶ Ｅｎｖ ＧＰキメラリガンドの発現
本発明のＳｃＦｖ−ＧａＬＶ Ｅｎｖ糖蛋白質キメラリガンドを発現するレトロウィルスを生産するためには、これを前記宿主細胞内でキメラリガンドの形態で発現させ；発現されたキメラリガンドがゴルジ装置内で転写後変形（ｐｏｓｔｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）、三量化（ｔｒｉｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ）及びＳＵ／ＴＭ切断され；細胞表面に移動してからウィルスパッケージングの間にウィルス外被膜に分布しなければならない。それから、前記ウィルス外被上に分布したキメラリガンドが認識されて細胞内に侵入するためにはウィルスパッケージが標的細胞の特定受容体に結合し、それから前記ウィルス粒子が膜間（ｉｎｔｅｒ−ｍｅｍｂｒａｎｅ）融合を通じて細胞質に流入する。従って、前記実施例＜１−２＞で製造された組換レトロウィルスベクターｐＨＥＦｖＧＥＬ１９９がＳｃＦｖ−ＧａＬＶ Ｅｎｖ糖蛋白質キメラリガンドを発現するか否かを下記のように調査した。
【００３４】
人間腎臓上皮細胞（ｈｕｍａｎ ｋｉｄｎｅｙ ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌｓ）である２９３或いは２９３Ｔ細胞を形質感染一日前に６−ウェルプレートに２×１０５細胞／ウェルの濃度で分株し、リポフェクトアミン・プラス（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、米国）を利用して製造社の指針通り組換発現ベクターｐＨＥＦｖＧＥＬ１９９を形質感染させた。その際キメラリガンドを発現させないｐＨＥＧＥＬベクターに形質導入された細胞を対照群として使用した。前記形質導入細胞を１０％ ウシ胎児血清（ＦＢＳ，ＨｙＣｌｏｎｅ）、１００ Ｕ／ｍｌのペニシリンＧ及び０．１ ｍｇ／ｍｌ ストレプトマイシンが添加されたＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ ｍｅｄｉｕｍ，Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）培地に接種してから３７℃で３〜６時間間培養した。前記細胞を新鮮な培地に移してさらに２日間培養した後、培養された細胞を回収し遠心分離して細胞ペレットを分離した。前記細胞ペレットを１００μｌの燐酸塩緩衝溶液（ＰＢＳ）に懸濁し、同量のＳＤＳ−ＰＡＧＥ 試料緩衝溶液（４％ＳＤＳ，２０％グリシン、１０％β−メルカプトエタノール、０．０５％ブロモフェノールブルー、１２５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ６．８）を前記懸濁液に添加した。この試料を電気泳動させてからウェスタンブロット分析を行って融合キメラリガンドの発現を確認した。
【００３５】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥはＬａｅｍｍｌｉ（Ｌａｅｍｍｌｉ，Ｕ．Ｋ．，Ｎａｔｕｒｅ ２７７：６８０−６８５，１９７０）方法で行った。電気泳動されたゲル上に展開された融合キメラリガンドを伝達緩衝溶液（Ｔｒａｎｓｆｅｒ ｂｕｆｆｅｒ，１０ ｍＭ グリシン，２０％ エタノール、０．１％ ＳＤＳ，１００ ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ）を用いて８０ Ｖで３時間電流を流し、ＰＶＤＦ膜に移し、ウェスタンブロット分析をトービン（Ｔｏｗｂｉｎ，Ｈ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７６：４３５０−４３５４，１９７９）方法で行った。ブロット膜をＴＢＳＴ緩衝溶液（１５０ｍＭ ＮａＣｌ，０．１％ ツイン２０，２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．４）で５分間洗浄してから５％（ｗ／ｖ）脱脂乳粉末（ｎｏｎ−ｆａｔ ｍｉｌｋ ｐｏｗｄｅｒ）が添加されたＴＢＳＴ緩衝溶液（ＴＴＭ−５％）に４℃で一晩放置した。ＳｃＦｖ−ＧａＬＶ Ｅｎｖ糖蛋白質融合キメラリガンドＦｖＧＥＬ１９９の発現を確認するために、ＳｃＦＶのＣ−末端部位に標識された配列番号９のＰｒｅＳ１に対するマウスモノクローナル抗体（ｍｏｕｓｅ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｒａｉｓｅｄ ａｇａｉｎｓｔ ＰｒｅＳ１ ｅｐｉｔｏｐｅ；Ａｐｒｏｇｅｎ）を１次抗体として使用した。前記１次抗体をＴＴＭ−５％緩衝溶液に１：１，０００〜１：４，０００の割合で希釈し、これをＰＶＤＦ膜と常温で３時間間反応させた。前記膜をＴＴＭ−０．５％緩衝溶液を利用して１０分間隔で３回洗浄してから、ＴＴＭ−５％緩衝溶液で１：１，０００〜１：２，０００でＨＲＰ−接合塩素抗体抗マウスＩｇＧ（ＨＲＰ−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ｇｏａｔ ａｎｔｉｂｏｄｙ ａｎｔｉ ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ）を希釈して製造した２次抗体を前記膜と常温で３時間間反応させた。反応が終わると、再度膜をＴＴＭ−０．５％緩衝溶液で１０分間隔で５回洗浄してからＴＢＳ緩衝溶液（１５０ｍＭ ＮａＣｌ，２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．４）で５分間洗浄し、化学発光システム（ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ ｓｙｓｔｅｍ，ＳａｎｔａＣｒｕｚ）とＫｏｄａｋバイオマックスＭＲフィルム（Ｋｏｄａｋ Ｂｉｏｍａｘ ＭＲ ｆｉｌｍ）を用いて製造社の指針通り免疫ブロット分析（ｉｍｍｕｎｏｂｌｏｔ ａｎａｌｙｓｉｓ）を行った。蛋白質の分子量は前もって染色された蛋白質マーカー（ｐｒｅｓｔａｉｎｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｍａｒｋｅｒ，Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を電気泳動時に使用して測定した。
【００３６】
その結果、本発明の融合キメラリガンドＦｖＧＥＬ１９９はシグナルペプチドとＴＭ部位が切断された後に７１８個のアミノ酸を含むペプチドの分子量に相応する位置から検出される免疫反応により引き起こされる帯域を示したが（図５のＬａｎｅ２）、ｐＨＥＧＥＬベクターに対しては如何なる帯域も検出されなかった（図５のＬａｎｅ１）。これにより、本発明の組換発現ベクターｐＨＥＦｖＧＥＬ１９９で形質導入された細胞が融合キメラリガンドＳｃＦｖ−ＧａＬＶ Ｅｎｖ糖蛋白質を発現することが分かる。
【００３７】
実施例２：ＳｃＦｖ−ＧａＬＶ Ｅｎｖ ＧＰキメラリガンドを発現するレトロウィルスの形質導入
＜２−１＞ ＳｃＦｖ−ＧａＬＶ Ｅｎｖ ＧＰキメラリガンド発現レトロウィルスの製造
モロニーマウス白血病ウィルス（Ｍｏｌｏｎｅｙ ｍｕｒｉｎｅ ｌｅｕｋｅｍｉａ ｖｉｒｕｓ；Ｍｏ−ＭｕＬＶ）のＧａｇ−Ｐｏｌ蛋白質を発現するＧＰ２９３細胞（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社、米国）をレトロウィルスの生産のために使用した。ＧＰ２９３細胞を１０％ ＦＢＳ（ＨｙＣｌｏｎｅ）、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン Ｇ及び０．１ｍｇ／ｍｌストレプトマイシンが添加されたＤＭＥＭ培地に接種し、３７℃、５％ＣＯ２ 培養機で培養した。培養されたＧＰ２９３細胞に、本発明の融合キメラリガンドを発現する組換レトロウィルスベクターｐＨＥＦｖＧＥＬ１９９と、パッケージシグナル（ｐａｃｋａｇｉｎｇ ｓｉｇｎａｌ）を含み、ＬＴＲプロモーターによってβ−ガラクトシダーゼ（β−ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ）遺伝子を発現する組換レトロウィルスベクターｐＭＦＧ／ＬａｃＺ／ｐｕｒｏ（Ｏｈ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌｓ １１：１９２−１９７，２００１）とをリポフェクトアミン方法（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ 社、米国）を用いて形質導入した。４時間後、前記細胞を２％ ＦＢＳが添加された新鮮なＤＭＥＭ培地に移してから３７℃でさらに２日間培養して細胞及びウィルスを含む培養液を得た。前記培養液を０．４５μｍフィルターに通して細胞滓を除去することによって無細胞ウィルス培養液を得た。この無細胞ウィルス培養液を１２時間８，０００ｒｐｍ、４℃の条件で遠心分離（Ｂｅｃｋｍａｎ ｓｗ５５ ｒｏｔｏｒ）して上澄み液を除去してから残余ウィルスペレットを回収した。このウィルスペレットをＳＤＳ−ＰＡＧＥ 試料緩衝溶液に懸濁してから電気泳動とウェスタンブロット分析を行ってキメラリガンドの発現を確認した（図６）。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウェスタンブロット分析は前記実施例＜１−３＞と同じ方法で行った。この際、１次抗体としてはマウスモノクローナル抗体ａｎｔｉ−ＰｒｅＳ１を使用し、２次抗体としては塩素ＩｇＧ ａｎｔｉ−マウスＩｇＧを使用した。
その結果、本発明の融合キメラリガンドＦｖＧＥＬ１９９はシグナルペプチドとＴＭ部位が欠失されたアミノ酸７１８個の分子量を持つペプチドに相応する位置での抗原−抗体免疫反応により引き起こされる帯域を示した（図６のＬａｎｅ ２）。この結果、本発明のＳｃＦｖ−ＧａＬＶ Ｅｎｖ ＧＰ 融合キメラリガンドを含む組換レトロウィルスの生産が確認された。
【００３８】
実施例３：ＳｃＦｖ−ＧａＬＶ Ｅｎｖ ＧＰキメラリガンドを発現するレトロウィルスの標的細胞特異的感染
＜３−１＞ Ｔａｇ−７２表面抗原 発現癌細胞株の確認
Ｔａｇ−７２表面抗原関連細胞株を利用したマウス転移モデルを構築するため、多様な人間癌細胞株を対象にＴａｇ−７２表面抗原の発現をＦＡＣＳ分析（fluorescence-activated cell sorting analysis）及び免疫組織化学分析（immunohistochemical analysis）で調査した。
【００３９】
先ず、人間結腸癌細胞株ＬＳ１７４Ｔ（ＡＴＣＣ Ｎｏ．ＣＬ−１８８０）及びＷｉＤｒ（ＡＴＣＣ Ｎｏ．ＣＣＬ−２１８）、人間乳癌細胞株ＭＣＦ７（ＫＣＬＢ Ｎｏ．３００２２）、ＭＤＡ−ＭＢ２３１（ＡＴＣＣ ＨＴＢ−２６）及びＭＤＡ−ＭＢ４３５（ＡＴＣＣ ＨＴＢ−１２９）を対象にＦＡＣＳ分析を行った。多様な人間癌細胞株からＴａｇ−７２表面抗原の発現を確認するため、抗Ｔａｇ−７２モノクローナル抗体ＣＣ４９を１次抗体として使った（Lee et al., Mol. Immunol., 36: 61-71, 1999）。各癌細胞株（１０６細胞／ｍｌ）を抗Ｔａｇ−７２ １次抗体と４℃で３０分間反応させた。冷却ＰＢＡ溶液で前記細胞を３回洗浄してからＦＩＴＣが結合された抗−マウスＩｇＧ２次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ社、米国）と４℃で３０分間反応させた。得られた細胞を冷却ＰＢＡ溶液で３回洗浄してからＦａｃｓｃａｎで分析した（図７のＡ）。その結果、人間結腸癌細胞株ＬＳ１７４Ｔ及び人間乳癌細胞株ＭＣＦ７はＴａｇ−７２表面抗原に対して陽性反応を示した反面、人間結腸癌細胞株ＷｉＤｒ、人間乳癌細胞株ＭＤＡ−ＭＢ２３１及びＭＤＡ−ＭＢ４３５はＴａｇ−７２表面抗原に対して陰性反応を示した。
【００４０】
また、免疫組織化学分析を利用してＴａｇ−７２表面抗原の発現を確認した。免疫組織化学分析はＤＡＫＯ ＬＳＡＢ２及びアルカリホスファターゼ（ａｌｋａｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ，＃Ｋ６７４）を利用して行った。ＰＢＳで１：１，０００比率に希釈された抗Ｔａｇ−７２抗体であるＡＫＡ（韓国特許第３１８７６１号）を１次抗体として使用した。前記抗Ｔａｇ−７２抗体はＴａｇ−７２表面抗原に対する人間化マウスモノクローナル抗体を安定的に発現するチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ；韓国特許公開第２００３−１３６３３号）細胞の培養上澄み液をハイトラップ蛋白質Ａコラム（Hytrap Protein A column, Amersham）を利用して精製して用意した。人間ＩｇＧ Ｈ＆Ｌに対するｂｉｏｔｉｎ−ヤギポリクローナル抗体（ａｂ６８５７−１，Ａａｂｃａｍ）をＰＢＳで１：１，０００比率希釈し、これを２次抗体として使用した。また、背景染色防止のためにラヴァミソル（lavamisole, endogeous alkaline phosphatase inhibitor, ×3021）溶液を使用した。
【００４１】
その結果、乳癌細胞株ＭＣＦ−７では１０〜２０％の細胞が染色された反面、結腸癌細胞株ＬＳ１７４Ｔでは８０〜９０％ 以上の細胞が染色された。これはＴａｇ−７２表面抗原が細胞表面に分布されていることを意味する。このような結果から、結腸癌細胞株ＬＳ１７４Ｔ及び乳癌細胞株ＭＣＦ−７はＴａｇ−７２ 陽性細胞株であり結腸癌細胞株ＷｉＤｒ及び乳癌細胞株ＭＤＡ−ＭＢ４３５とＭＤＡ−ＭＢ２３１はＴａｇ−７２ 陰性細胞株であることが分かる（図７のＢ）。
【００４２】
＜３−２＞ 標的細胞特異的感染の確認
前記実施例＜３−１＞で確認されたＴａｇ−７２表面抗原陽性或いは陰性の人間癌細胞株をＳｃＦｖ−ＧａＬＶ ＥｎＶ ＧＰキメラリガンド及びＬａｃＺを発現する組換レトロウィルスに感染させた。二日後、前記組換レトロウィルスの標的細胞特異的感染を確認するためにＬａｃＺ遺伝子の発現を調査した。
【００４３】
具体的にパッケージ細胞株ＧＰ２９３細胞を６−ウェルプレートに３×１０５細胞／ウェルの濃度で形質導入一日前に分株した。０．５μｇずつ発現ベクターｐＨＥＧＥＬ（野生型ＧａＬＶ Ｅｎｖ ＧＰ）とｐＨＥＦｖＧＥＬ１９９（ＳｃＦｖ−ＧａＬＶ ＥｎｖＧＰキメラリガンド）をそれぞれｐＭＦＧ／ＬａｃＺ／ｐｕｒｏ ０．５μｇと混合し、リポフェクトアミンプラス（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、米国）を利用して前記プレートに分株した細胞に形質導入させた。前記ウェルプレートを二日間３７℃、５％ＣＯ２動物細胞培養機で培養してレトロウィルスを含む培養上澄み液を得た。１２−ウェルプレートに２９３、ＬＳ１７４Ｔ、ＭＣＦ−７、ＭＤＡ−ＭＢ２３１、ＭＫＮ−７５及び標的細胞を５×１０４細胞／ウェル濃度で分株し、２４時間放置した。前記標的細胞を先程製造した各ウィルス上澄み液で８ μｇ／ｍｌ／ウェル濃度でポリブレン（ｐｏｌｙｂｒｅｎｅ，Ｓｉｇｍａ）を利用して感染させた。感染させてから４時間経過後に感染された細胞を新しい培地に移し、３７℃、５％ＣＯ２ 培養機で４８時間追加培養した。培養が終わってから培養液を除去し、細胞ペレットを細胞固定液（１％ホルムアルデヒド、０．２％グルタルアルデヒド）で固定して常温で１０分間放置した。これをＰＢＳ溶液で３回洗浄し、Ｘ−ｇａｌ（ＰＢＳ，０．２ Ｍ フェロシアン化カリウム［ｐｏｔａｓｓｉｕｍ ｆｅｒｒｏｃｙａｎｉｄｅ］，０．２ Ｍ フェロシアン化カリウム［ｐｏｔａｓｓｉｕｍ ｆｅｒｒｉｃｙａｎｉｄｅ］，２．０Ｍ ＭｇＣｌ２，４０ｍｇ／ｍｌ Ｘ−ｇａｌ）を用いて３７℃で一晩間染色してＬａｃＺ遺伝子の発現を調査した。
【表２】
【００４４】
前記表２及び図８に示したように、野生型ＧａＬＶ Ｅｎｖ ＧＰ 発現ベクターｐＨＥＧＥＬを利用したＬａｃＺ遺伝子の形質導入の結果は、２９３細胞株の形質導入効率は２×１０６；癌細胞株であるＭＤＡ−ＭＢ４３５、ＭＤＡ−ＭＢ２３１及びＭＣＦ−７の形質導入効率は０．５〜１．５×１０５の範囲；およびＬＳ１７４Ｔ細胞株の形質導入効率は６×１０３であったことを示した。ＳｃＦｖ−ＧａＬＶ Ｅｎｖ ＧＰキメラリガンドを発現する組換レトロウィルスベクターｐＨＥＦｖＧＥＬ１９９を利用したＬａｃＺ遺伝子の形質導入の結果、ＬａｃＺ遺伝子は、２９３細胞株と共にＴａｇ−７２陽性細胞株であるＭＣＦ−７及びＬＳ１７４Ｔ細胞株から発現された反面、Ｔａｇ−７２陰性細胞株であるＭＤＡ−ＭＢ４３５及びＭＤＡ−ＭＢ２３１細胞株はＬａｃＺ遺伝子を発現しなかった。特に、２９３細胞株がＴａｇ−７２陽性であると確認されたことはないが、本発明のＳｃＦｖ−ＧａＬＶ Ｅｎｖ ＧＰキメラリガンドで感染された２９３細胞株がＬａｃＺを発現することは他の細胞株に比べ非常に高い感染効率による非特異的感染であるからである。前記結果から、本発明のＳｃＦｖ−ＧａＬＶ Ｅｎｖ ＧＰキメラリガンドを発現する組換ベクターｐＨＥＦｖＧＥＬ１９９はＴａｇ−７２抗原を発現する細胞に特異的に結合して標的細胞にＬａｃＺ遺伝子（β−ガラクトシダーゼ）を効果的に伝達することを確認した。
【００４５】
ＭＬＶを含む他のレトロウィルスベクターの場合、キメラリガンドが野生型Ｅｎｖよりも低いウィルス力価を示すと報告されている。例えば、同種指向性外被（ｅｃｏｔｒｏｐｉｃ Ｅｎｖ）や両指向性外被（ａｍｐｈｏｔｒｏｐｉｃ Ｅｎｖ）は、標的細胞によって１０５〜１０７ 範囲のウィルス力価を見せる反面、大部分のＳｃＦｖ−Ｅｎｖ ＧＰキメラリガンドは、標的細胞受容体によって多少の差はあるが、１０３以下のウィルス力価を示し、これはＳｃＦｖ−Ｅｎｖ ＧＰキメラリガンドのウィルス力価が野生型Ｅｎｖよりも１０２〜１０４倍ほど低かった（Ｃｈｒｉｓ Ａ．Ｂｅｎｅｄｉｃｔ．ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ １０：５４５−５５７，１９９９；Ｍａｒｉａｎａ Ｍａｒｉｎ．ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７０：２９５７−２９６２，１９９６；Ｔｅ−Ｈｕａ Ｔｅａｒｉｎａ Ｃ．Ｈ．ａｎｄ Ｒａｌｐｈ Ｄｏｒｎｂｕｒｇ，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７１：７２０−７２５，１９９７）。このような現象は外被糖蛋白質に挿入された外来リガンドによりレトロウィルスの元の構造が変形され、ウィルスの感染性低下を引き起こしたためである。一般的に、外被糖蛋白質の表面サブユニット（ＳＵ）が特異的受容体を認識し結合する時、融合機能を持つ膜貫通（ＴＭ）部位の構造的な変化（ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ ｃｈａｎｇｅ）が誘導されて標的細胞がウィルスによって感染される。その際、外来リガンドの挿入は元の構造の変形を引き起こし、ＳＵからＴＭへの信号伝達を破壊して、構造的な変化を誘導することができなくなる。その結果、ウィルスが宿主細胞に結合して細胞内部に流入されても膜融合が発生せずウィルス粒子が細胞質内に導入されなくなり、これは結合後遮断（ｐｏｓｔｂｉｎｄｉｎｇ ｂｌｏｃｋ）の結果であって、染性低下の主な原因である。前記結果から本発明のＳｃＦｖ−ＧａＬＶ Ｅｎｖ ＧＰキメラリガンドＦｖＧＥＬ１９９が今まで報告された他のレトロウィルスベクターよりも高い形質導入効率で標的細胞を特異的に感染させることができ、よって標的細胞に治療遺伝子を効果的に伝達できることが分かる。
【００４６】
実施例４：ＳｃＦｖ−ＧａＬＶ Ｅｎｖ ＧＰキメラリガンドを発現する癌細胞標的性パッケージ細胞株の製造
本発明のＳｃＦｖ−ＧａＬＶ Ｅｎｖ ＧＰキメラリガンドを発現する組換発現ベクターｐＨＥＦｖＧＥＬ１９９をＧａｇ−Ｐｏｌ蛋白質を発現するパッケージ細胞株ＧＰ２９３細胞にリポフェクトアミンプラス（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ 社、米国）を使用して形質感染させた。形質感染された細胞を４００ μｇ／ｍｌのＧ４１８（ｎｅｏｍｙｃｉｎｅ）で１４日間処理してコロニー（ｃｏｌｏｎｙ）を１０個選別してから各コロニーを適切な培地で増殖させた。選別されたコロニーにＬａｃＺ レポーター遺伝子（β−ガラクトシダーゼ）を発現するレトロウィルス転移ベクターｐＭＦＧ／ＬａｃＺ／ｐｕｒｏ（Ｏｈ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌｓ １１：１９２−１９７，２００１）１ μｇを形質導入させ、それから４８時間後に各ウィルスを収穫した。Ｔａｇ−７２ 陽性細胞株であるＭＣＦ−７（ＫＣＬＢ ３００２２）を各ウィルスに感染させた後、ウィルス形質導入効率をＬａｃＺ遺伝子の発現を調査して確認した。その中で最も形質導入効率が高く現れたウィルスを生産するコロニーを選別し、それを本発明のＳｃＦｖ−ＧａＬＶ Ｅｎｖ ＧＰキメラリガンドを持続的に発現するパッケージ細胞株ＧＰ２９３ＨＥＦｖＧＥＬ１９９と命名した。また、野生型ＧａＬＶ Ｅｎｖを発現するｐＨＥＧＥＬベクターもまた前記に記述された方法と同様に標的細胞に形質導入させ、それからクローンを選別して野生型ＧａＬＶ Ｅｎｖを発現するパッケージ細胞株ＧＰ２９３ＨＥＧＥＬを得た。図９は前記方法で製作されたＧＰ２９３ＨＥＦｖＧＥＬ１９９又はＧＰ２９３ＨＥＧＥＬパッケージ細胞株をＬａｃＺ 発現レトロウィルス転移ベクターと共に形質導入して得たウィルスで各標的細胞を感染させた結果である。
【００４７】
実施例５：ＳｃＦｖ−ＧａＬＶ Ｅｎｖ ＧＰキメラリガンドを発現するレトロウィルス生産細胞株の製造
本発明のＳｃＦｖ−ＧａＬＶ Ｅｎｖ ＧＰキメラリガンドを発現する組換発現ベクターｐＨＥＦｖＧＥＬ１９９をレトロウィルス転移ベクターｐＭＦＧ／ＬａｃＺ／ｐｕｒｏ（０．５ μｇ）と共にパッケージ細胞株ＧＰ２９３細胞（３×１０５細胞／６−ウェル）にリポフェクトアミン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＵＳＡ）を使用して形質導入させた。形質導入された細胞を４００ μｇ／ｍｌの Ｇ４１８（ｎｅｏｍｙｃｉｎｅ）と０．５ μｇ／ｍｌのピュロマイシン（ｐｕｒｏｍｉｃｉｎ）で連続２週間処理し、それからコロニーを８個選別した。選別されたコロニーを適切な培地で増殖させてウィルス含有培養液を得てからＭＣＦ−７細胞をこの培養液で感染させた。その結果、最高のウィルス力価を現すコロニーを選別培養して本発明のＳｃＦｖ−ＧａＬＶ Ｅｎｖキメラリガンドがその外膜に分布されたＬａｃＺ遺伝子発現レトロウィルスを持続的に生産できるウィルス生産細胞株ＧＰ２９３ＨＥＦｖＧＥＬ１９９／ｌａｃＺを構築した。野生型ＧａＬＶ Ｅｎｖを発現するｐＨＥＧＥＬベクターも前記と同様な方法で標的細胞に形質導入させ、ここから形質導入されたコロニーを選別して野生型ＧａＬＶ Ｅｎｖを持つ ＬａｃＺ遺伝子発現レトロウィルスを持続的に生産できるウィルス生産細胞株ＧＰ２９３ＨＥＧＥＬ／ｌａｃＺを得た。図１０は前記で製作したＧＰ２９３ＨＥＦｖＧＥＬ１９９／ｌａｃＺ及びＧＰ２９３ＨＥＧＥＬ／ｌａｃＺウィルス生産細胞株を培養して得られたウィルスで各標的細胞を感染させた結果である。
【００４８】
実施例６：Ｔａｇ−７２抗原関連細胞株を利用したマウス転移モデルの構築
前記実施例＜３−１＞で多様な人間癌細胞株を対象としてＴａｇ−７２表面抗原の発現をＦＡＣＳと免疫組織化学分析で調査した結果、人間乳癌細胞株ＭＣＦ−７及び結腸癌細胞株ＬＳ１７４ＴはＴａｇ−７２ 陽性であり、人間乳癌細胞株ＭＤＡ−ＭＢ２３１・ＭＤＡ−ＭＢ４３５と結腸癌細胞株ＷＩＤＲはＴａｇ−７２ 陰性であると確認された。ＭＤＡ−ＭＢ４３５細胞株がＴａｇ−７２ 陰性細胞株の中でＭＤＡ−ＭＢ２３１細胞株よりも相対的に高い肺転移能力を見せたため（Ｌｅｅ ＆ Ｗｅｌｃｈ，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ５７：２３８４，１９９７）、ＭＤＡ−ＭＢ４３５細胞株を癌転移モデルの構築に使用した。また、ＭＣＦ−７乳癌細胞株（Ｔａｇ−７２ 陽性）は肺への転移を殆ど起こさないので生体内実験に使うことはできないが、ＬＳ１７４Ｔ結腸癌細胞株では腎臓注射（ｉｎｔｒａｓｐｌｅｎｉｃ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）による肝転移及び静脈注射（ｉｎｔｒａｖｅｎｏｕｓ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）による肺転移が可能である。従って、ＬＳ１７４Ｔ細胞株をＭＤＡ−ＭＢ４３５細胞株と共に癌転移動物モデルの構築に使用した。
【００４９】
＜６−１＞ 静脈注射を利用した結腸癌転移モデルの確立
Ｔａｇ−７２陽性であるＬＳ１７４Ｔ結腸癌細胞株とＴａｇ−７２ 陰性であるＭＤＡ−ＭＢ４３５乳癌細胞株を培養してから前記細胞をトリプシン−ＥＤＴＡで処理し、遠心分離で収穫して無血清培地で２回洗浄した。その細胞を再度ＰＢＳで２回洗浄しＰＢＳ内１×１０６細胞／１００ μｌの濃度で６週齢の雌Ｂａｌｂ／ｃヌードマウスの尻尾静脈に注射した。６週間マウスの状態を観察し、マウスから肺を摘出して４％ ホルマリン溶液で固定してから肺に形成された転移塊の数を調査した。静脈注射を通じた肺転移能を調査した結果、ＬＳ１７４Ｔ結腸癌細胞株においては平均７．６個の転移塊が形成され、ＭＤＡ−ＭＢ４３５乳癌細胞株においては平均１２．２個の転移塊が形成されたことが確認できた（図１１ａ及び１１ｂ）。従って、人間結腸癌細胞株ＬＳ１７４Ｔの肺転移モデルをＴａｇ−７２抗原特異的癌細胞的中遺伝子治療剤の効果を調査するための動物テストモデルとして用いた。
【００５０】
＜６−２＞ ＳｃＦｖ−ＧａＬＶ Ｅｎｖ ＧＰキメラリガンドを発現する組換レトロウィルスベクターを利用した生体内形質導入効率の検証
パッケージ細胞株であるＧＰ２９３細胞を６−ウェルプレートに１ウェル当たり３×１０５細胞に分株し、このウェルプレートを２４時間放置した後、前記細胞をリポフェクトアミンプラスを利用してＳｃＦｖ−ＧａＬＶ Ｅｎｖ ＧＰキメラリガンドを発現するレトロウィルスベクターｐＨＥＦｖＧＥＬ１９９とβ−ガラクトシダーゼを発現するレトロウィルス転移ベクターｐＭＦＧ／ＬａｃＺ／ｐｕｒｏで形質導入させた。前記ウェルプレートを２日間３７℃、５％ＣＯ２動物細胞培養機で培養してウィルス生産細胞株を得た。培養されたＬＳ１７４Ｔ細胞（１×１０６細胞／５０μｌ ｉｎ ＰＢＳ）とＭＤＡ−ＭＢ４３５細胞（１×１０６細胞／５０μｌ ｉｎ ＰＢＳ）を６週齢の雌Ｂａｌｂ／ｃヌードマウスの尻尾静脈（ｔａｉｌ ｖｅｉｎ）に注射した後、直ちに前記で得られたウィルス生産細胞株（１×１０６細胞／５０μｌ ｉｎ ＰＢＳ）を前記と同様な方法で注射した。それから３日間隔でウィルス生産細胞株（１×１０６細胞ｉｎ １００μｌのＰＢＳ）を６週間各マウスに静脈注射した。６週経過後マウスを犠牲して肺を摘出してから固定液に浸けて組織を固定し、Ｘ−ｇａｌ染色を行って生体内での形質導入効率を調査した。
その結果、Ｔａｇ−７２ 陽性細胞株であるＬＳ１７４Ｔの静脈注射により肺に転移塊が形成された場合、本発明のＳｃＦｖ−ＧａＬＶ Ｅｎｖ ＧＰキメラリガンドにより媒介されたレポーター遺伝子ＬａｃＺの形質導入は効率３７．８％程度で非常に効果的であり、Ｔａｇ−７２ 特異的であることを確認した。反面、Ｔａｇ−７２ 陰性細胞株であるＭＤＡ−ＭＢ４３５細胞株の静脈注射により形成された転移塊は９．７７％のみ染色された。その結果から、本発明のＳｃＦｖ−ＧａＬＶ Ｅｎｖ ＧＰキメラリガンド発現ベクターを利用した癌細胞標的遺伝子伝達システムがＴａｇ−７２表面抗原に非常に特異的に且つ標的細胞へ効率的に形質導入されることが確認された。図１２ａは本発明のＳｃＦｖ−ＧａＬＶ Ｅｎｖ ＧＰキメラリガンドＦｖＧＥＬ１９９発現レトロウィルスベクターを利用したＬａｃＺ（β−ガラクトシダーゼ）レポーター遺伝子の導入及び発現により染色された肺転移塊を解剖顕微鏡で撮影した写真である。また、下記表３は各マウスから摘出した肺で発見された転移塊の数と染色された転移塊数を示したものであり、図１２ｂは表３の結果をパーセンテージ（％）に換算して示したグラフである。
【表３】
【００５１】
本発明を上記の具体的な実施例に関し記述したが、添付された特許請求範囲において定義された本発明の範囲内当分野の熟練者が本発明を多様に変形及び変化させられることを理解しなければならない。
【００５２】
【図面の簡単な説明】
【００５３】
【図１】図１はＧａＬＶ外被糖蛋白質（ＧａＬＶ Ｅｎｖ ＧＰ）と類似した哺乳動物タイプ−Ｃレトロウィルスの外被糖蛋白質構造を示す図である。ａ：シグナルペプチダーゼ切断部位、 ｂ：ＳＵ／ＴＭ切断部位、ｃ：Ｒ−ペプチド切断部位、 ＳＰ：シグナルペプチド、ＶＲＡ：可変領域Ａ、 ＶＲＢ；可変領域Ｂ、ＶＲＣ：可変領域Ｃ、 ＲＢＤ：受容体結合ドメイン、ＰＲＲ：プロリンリッチ領域、 ＣＴ：ＳＵのＣ−末端地域、ＳＵ：表面サブユニット、 ＦＰ：融合蛋白質、Ａｎｃ：固定地域（anchorage region）、 ＲＰ：Ｒ−ペプチド、ＴＭ：膜貫通ドメイン、
【００５４】
【図２】図２は幾つかのレトロウィルス外被糖蛋白質のアミノ酸整列（ａｌｉｇｎｍｅｎｔ）の結果を示す図である。ＶＲＡ：可変領域Ａ、 ＶＲＢ：可変領域Ｂ、ＶＲＣ：可変領域Ｃ、 ＰＲＲ：プロリンリッチ領域、ＳＵ：表面ドメイン、 ＴＭ：膜貫通ドメイン
【００５５】
【図３】図３はＧａＬＶ外被糖蛋白質の２次構造分析結果を示す図である。ＶＲＡ：可変領域Ａ、 ＶＲＢ：可変領域ＢＳＵ：表面ドメイン、 ＴＭ：膜貫通ドメイン
【００５６】
【図４】図４は本発明のＳｃＦｖ−ＧａＬＶ Ｅｎｖ ＧＰキメラリガンドＦｖＧＥＬ１９９及び野生型ＧａＬＶ外被糖蛋白質それぞれを発現させるベクターの概略構造を示す図である。
【００５７】
【図５】図５はパッケージ細胞株のキメラリガンドＦｖＧＥＬ１９９発現を調査したウェスタンブロット分析結果を現した写真であって、ＨＣＭＶプロモーターにより調節されるベクター内で発現されたＦｖＧＥＬ１９９を示す図である。Ｌａｎｅ １：ｐＨＥＧＥＬを含むＧＰ２９３細胞抽出液、Ｌａｎｅ ２：ｐＨＥＦｖＧＥＬ１９９を含むＧＰ２９３細胞抽出液、
【００５８】
【図６】図６はＳｃＦｖ−ＧａＬＶ Ｅｎｖ ＧＰキメラリガンドＦｖＧＥＬ１９９を含む組換レトロウィルスの生産を調査したウェスタンブロット分析の結果を示す写真である。Ｌａｎｅ １：ｐＨＥＧＥＬを含むＧＰ２９３細胞培養液から得たウィルス沈殿物、Ｌａｎｅ ２：ｐＨＥＦｖＧＥＬ１９９を含むＧＰ２９３細胞培養液から得たウィルス沈殿物
【００５９】
【図７】図７ａ及び図７ｂは多様な人間癌細胞株からＴａｇ−７２表面抗原の発現を調査したＦＡＣＳ及び免疫組織化学染色方法の結果を示す写真である。
【００６０】
【図８】図８はｐＨＥＦｖＧＥＬ１９９を含む組換発現ベクターが形質導入された細胞の写真である。
【００６１】
【図９】図９は本発明のパッケージ細胞株ＧＰ２９３ＨＥＦｖＧＥＬ１９９及びＧＰ２９３ＨＥＧＥＬにＬａｃＺ 発現レトロウィルスベクターを形質導入して獲得したｌａｃＺ 発現組換ウィルスで形質導入された細胞の写真である。
【００６２】
【図１０】図１０は安定的に構築された本発明のウィルス生産細胞株ＧＰ２９３ＨＥＦｖＧＥＬ１９９／ｌａｃＺ及びＧＰ２９３ＨＥＧＥＬ／ｌａｃＺそれぞれから得たｌａｃＺ 発現組換レトロウィルスに形質導入された細胞の写真である。
【００６３】
【図１１】図１１ａはＴａｇ−７２陽性又は陰性細胞株が各静脈に注射された時に観察した解剖顕微鏡（×１０）写真である。図１１ｂは図１１ａで観察された転移塊数を示すグラフである。
【００６４】
【図１２】図１２ａは本発明のＳｃＦｖ−ＧａＬＶ Ｅｎｖ ＧＰキメラリガンドＦｖＧＥＬ１９９ 発現レトロウィルスによるＬａｃＺ遺伝子の生体内形質導入を示す解剖顕微鏡写真である。図１２ｂは図１２ａで観察されたＬａｃＺ遺伝子の相対的生体内形質導入効率を示すグラフである。
【技術分野】
【０００１】
本発明は腫瘍−関連糖蛋白質の表面抗原に特異的に結合できる単鎖抗体及びレトロウィルス外被糖蛋白質の融合ポリペプチド形態のキメラリガンド（ｃｈｉｍｅｒｉｃ ｌｉｇａｎｄ）；前記キメラリガンドをコードする遺伝子を含む発現ベクター；前記発現ベクターが形質導入された組換レトロウィルス；及び前記キメラリガンドを有効成分とする薬学組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
遺伝子治療は先天性代謝異常によって発病する疾病だけでなく癌・糖尿病・エイズ等を始めとする後天的疾病の治療を目的とする急激に注目されている分野である。現在遺伝子治療に使われている幾つかの遺伝子伝達ベクターシステムの中でもレトロウィルスベクターシステムはアデノウィルス、リポソーム、エレクトロポレーション（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ）法及び遺伝子銃（ｇｅｎｅ ｇｕｎ）などに比べ有利である。例えば、レトロウィルスベクターシステムは形質導入された細胞の安定的な発現を可能にする宿主細胞内へ永久的に統合できる。しかし、このようなシステムは特定標的細胞に遺伝子を伝達するには限界がある。
【０００３】
レトロウィルスを利用して治療遺伝子を標的細胞に特異的に導入する様々な方法が開発されており、次のような例を挙げられる：糖分子を化学的な方法を用いてレトロウィルスの外被糖蛋白質に連結して糖連結（ｓｕｇａｒ ｃｏｕｐｌｅ）外被糖蛋白質を標的細胞のアシアロ糖蛋白質受容体（ａｓｉａｌｏｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）に結合させる方法（Ｎｅｄａ，Ｈ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６：１４１４３−１４１４６，１９９１）；レトロウィルスの外被糖蛋白質と標的細胞の受容体或いは表面抗原 の両方に連結できる連結抗体を利用する方法（Ｇｏｕｄ Ｂ．ｅｔ ａｌ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １６３：２５１−２５４，１９８８；Ｒｏｕｘ，Ｐ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８６：９０７９−９０８３，１９８９；Ｅｔｉｅｎｎｅ−Ｊｕｌａｎ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．７３：３２５１−３２５５，１９９２）；単鎖抗体をレトロウィルスの外被糖蛋白質に遺伝工学的方法で結合させて標的細胞に感染させる方法（Ｒｕｓｓｅｌｌ，Ｓ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２１：１０８１−１０８５，１９９３；Ｓｏｍｉａ，Ｎ．Ｖ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９２：７５７０−７５７４，１９９５；Ａｇｅｒ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．７：２１５７−２１６４，１９９６；Ｍａｒｉｎ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７０：２９５７−２９６２，１９９６；Ｓｃｈｎｉｅｒｌｅ，Ｂ．Ｓ．ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．３：３３４−３４２，１９９６）；及びペプチドリガンド（ｐｅｐｔｉｄｅ ｌｉｇａｎｄ）をレトロウィルスの外被糖蛋白質に遺伝子工学的な方法で結合させて標的細胞に感染させる方法（Ｋａｓａｈａｒａ，Ｎ．ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６６：１３７３−１３７６，１９９４；Ｃｏｓｓｅｔ，Ｆ．Ｌ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６９：６３１４−６３２２，１９９５；Ｓｃｈｎｉｅｒｌｅ，Ｂ．Ｓ．，ａｎｄ Ｇｒｏｎｅｒ，Ｂ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．３：１０６９−１０７３，１９９６）。しかし、これらの方法は形質導入（ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ）効率が非常に低いという問題がある。
【０００４】
治療遺伝子を人間の標的細胞に導入するため鳥類やマウス（ｍｕｒｉｎｅ）レトロウィルスを利用する方法も開発されている（Ｃｈｕ，Ｔ−Ｈ．Ｔ．，ａｎｄ Ｒ．Ｄｏｒｎｂｕｒｇ．Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６９：２６５９−２６６３，１９９５；Ｃｈｕ，Ｔ−Ｈ．Ｔ．ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１：２９２−２９９，１９９４；Ｖａｌｓｅｓｉａ−Ｗｉｔｔｍａｎｎ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６８：４６０９−４６１９，１９９４；Ｃｏｓｓｅｔ，Ｆ−Ｌ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６９：６３１４−６３２２，１９９５；Ｈａｎ，Ｘ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９２：９７４７−９７５１，１９９５；Ｋａｓａｈａｒａ，Ｎ．ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６６：１３７３−１３７６，１９９４；Ｓｏｍｉａ，Ｎ．Ｖ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９２：７５７０−７５７４，１９９５；ＨＡＮ，Ｊ．Ｙ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７１，８１０３−８１０８，１９９７）。マウス（ｍｕｒｉｎｅ）レトロウィルスの構造及び機能に対しては多く研究されているが、特にＭｏ−ＭｕＬＶとＦｒ−ＭｕＬＶの外被糖蛋白質の３次構造がＸ−ｒａｙ結晶によって最近明かされている。
【０００５】
標的細胞の受容体（ｒｅｃｅｐｔｏｒ）又は表面抗原が知られているか特異的である場合は、単鎖抗体（ｓｉｎｇｌｅ−ｃｈａｉｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ：ＳｃＦｖ）をレトロウィルスの外被糖蛋白質に遺伝工学的な方法で結合させて標的細胞に感染させる方法が標的細胞の特異的感染に非常に有用である。
【０００６】
単鎖抗体（ＳｃＦｖ）とは適切な合成アミノ酸リンカーによりＶＨのカルボキシ末端（ｃａｒｂｏｘｙ−ｔｅｒｍｉｎａｌ）とＶＬのアミノ末端（ａｍｉｎｏ−ｔｅｒｍｉｎａｌ）が繋がった形態である。前記抗体結合部位は重鎖と軽鎖の可変領域からなっている抗体分子のＦｖ（ｆｒａｇｍｅｎｔ ｖａｒｉａｂｌｅ）領域に位置する（Ｐｏｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ３９：１９−２４，２００２；Ｆｕｊｉｗａｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４１：１２７２９−１２７３８，２００２）．
【０００７】
最近、安全性と形質導入効率を向上させるためにレトロウィルスの擬似型（ｐｓｅｕｄｏｔｙｐｅ）が研究されている。例えば、様々な人体細胞株で両指向性（ａｍｐｈｏｔｒｏｐｉｃ）マウス（ｍｕｒｉｎｅ）レトロウィルスベクターよりもテナガザル白血病ウィルス（ｇｉｂｂｏｎ ａｐｅ ｌｅｕｋｅｍｉａ ｖｉｒｕｓ，ＧａＬＶ）Ｅｎｖ−偽型レトロウィルスベクターが５〜３０倍程高い感染効率を現した（Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ａｍｅｒ．Ａｓｓｏｃ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．３８：１７７，１９９７）。しかし、特異的標的作用に関しては依然として解決すべき限界がある。
ここに、本発明者らはより高いウィルス力価と形質導入効率を現すレトロウィルスを利用した遺伝子伝達システムの要求を満たすために鋭意研究し、ＧａＬＶ外被糖蛋白質と腫瘍−関連糖蛋白質（ｔｕｍｏｒ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ）７２（Ｔａｇ−７２）の表面抗原に特異的に結合できるモノクローナル抗体（ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ）由来の単鎖抗体（Ｓｉｎｇｌｅ ｃｈａｉｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ）の融合ポリペプチド形態でキメラリガンド（ｃｈｉｍｅｒｉｃ ｌｉｇａｎｄ）を開発することによって本発明に至った。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の目的は抗−腫瘍遺伝子治療において有用な特異的に癌細胞を標的とするレトロウィルス遺伝子伝達システムを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
前記目的を達成するために、本発明は、腫瘍−関連糖蛋白質７２（Ｔａｇ−７２）の表面抗原に特異的に結合できる単鎖抗体とレトロウィルス外被糖蛋白質（Ｅｎｖ ＧＰ）の融合ポリペプチド形態のキメラリガンドを提供する。
また、本発明は前記キメラリガンドをコードする遺伝子を含む組換発現ベクター及び前記発現ベクターが形質導入されて前記レトロウィルスを生産できるパッケージ細胞株を提供する。
【００１０】
さらに、本発明は前記キメラリガンド又はパッケージ細胞株を有効成分として含む癌細胞標的性遺伝子治療用薬学組成物を提供する。
【発明の効果】
【００１１】
上に述べたように、腫瘍−関連糖蛋白質Ｔａｇ−７２表面抗原に特異的な単鎖抗体とＧａＬＶ外被糖蛋白質を融合させた本発明のキメラリガンドはＴａｇ−７２を発現する腫瘍細胞に対し形質導入効率が非常に高く、標的細胞を特異的に感染する治療遺伝子を効果的に伝達できるため、癌の成長及び転移抑制のための遺伝子治療に有効に利用することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
以下、本発明をより詳細に説明する。
本発明は腫瘍−関連糖蛋白質７２（Ｔａｇ−７２）の表面抗原に特異的な単鎖抗体とＧａＬＶ外被糖蛋白質の融合ポリペプチド形態であるキメラリガンドを提供する。
【００１３】
レトロウィルス遺伝子伝達システムを開発するために、本発明者らは、結腸癌、胃癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌等を含む様々な癌細胞で発現される腫瘍関連糖蛋白質７２（Ｔａｇ−７２）の表面抗原に特異的に結合できる単鎖抗体の利用を鋭意研究した。また、治療遺伝子を人間の標的細胞に効率的に導入するために、ＭｕＬＶ（Ｍｕｒｉｎｅ Ｌｅｕｋｅｍｉａ Ｖｉｒｕｓ）外被糖蛋白質よりも高い人体癌細胞への形質導入効率及び人間血液に対する安定性を現すＧａＬＶ外被糖蛋白質の利用も合わせて研究した。
【００１４】
細胞表面の受容体に対するウィルス外被糖蛋白質上に分布された外被糖蛋白質間結合は標的細胞内へのレトロウィルス感染に必須であり、感染の特異性を決める重要な要因でもある。標的細胞への特異的な遺伝子伝達システムで、標的細胞の受容体に結合するよう細胞に特異性を与えるウィルス外被糖蛋白質を操作することにより標的細胞を特異的に感染可能なウィルスを製造することができる。よって、本発明者らはＧａＬＶ外被糖蛋白質の細胞特異性を決定して特異的細胞受容体と結合できる表面サブユニット（ｓｕｒｆａｃｅ ｓｕｂｕｎｉｔ，ＳＵ）領域へＴａｇ−７２表面抗原に特異的な単鎖抗体Ｔａｇ−７２ｐＳ１を融合させてキメラリガンドを製造した。単鎖抗体に融合された外被糖蛋白質を発現するレトロウィルスは標的細胞に特異的に結合して効果的に治療遺伝子を伝達することができる。
【００１５】
ＧａＬＶ外被糖蛋白質と類似した構造を持つＭｕＬＶ外被糖蛋白質の場合、外被糖蛋白質に導入された点突然変異（ｐｏｉｎｔ ｍｕｔａｔｉｏｎ）、挿入突然変異（ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ ｍｕｔａｔｉｏｎ）或いは欠失突然変異（ｄｅｌｅｔｉｏｎ ｍｕｔａｔｉｏｎ）が構造的変化を引き起こす非正常的な機能を持つウィルス外被糖蛋白質を生産し、それによりウィルスの感染性が低下するようになると報告されたことがある（Ｒｕｓｓｅｌｌ，Ｓ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２１：１０８１−１０８５，１９９３；Ｓｏｍｉａ，Ｎ．Ｖ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９２：７５７０−７５７４，１９９５；Ａｇｅｒ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．７：２１５７−２１６４，１９９６；Ｍａｒｉｎ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７０：２９５７−２９６２，１９９６；Ｓｃｈｎｉｅｒｌｅ，Ｂ．Ｓ．ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．３：３３４−３４２，１９９６；Ｃｈｒｉｓ Ａ．Ｂｅｎｅｄｉｃｔ．ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ １０：５４５−５５７，１９９９；Ｍａｒｉａｎａ Ｍａｒｉｎ．ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７０：２９５７−２９６２，１９９６；Ｔｅ−Ｈｕａ Ｔｅａｒｉｎａ Ｃ．Ｈ．ａｎｄ Ｒａｌｐｈ Ｄｏｒｎｂｕｒｇ，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７１：７２０−７２５，１９９７）。つまり、外来ペプチドが外被糖蛋白質に挿入されたり或いは外被糖蛋白質の特定部分が欠失されたとき、感染性が顕著に低下したウィルスが生産される。従って、レトロウィルスの外被糖蛋白質にＳｃＦｖのような外来リガンドが挿入される時、外被糖蛋白質の構造と機能の間の相関関係を細心に考慮しなければならない。本発明のキメラリガンドは細胞特異性と細胞表面に対する結合を決める外被糖蛋白質の種々なＳＵ領域の中で選ばれた可変領域Ｂ（ｖａｒｉａｂｌｅ ｒｅｇｉｏｎ Ｂ：ＶＲＢ）内に単鎖抗体（ＳｃＦｖ）を挿入して標的細胞に特異的に感染するように設計された。
【００１６】
好ましい実施例として、本発明者らはＧａＬＶ外被糖蛋白質の可変領域Ｂ部位であるＡＴＧ開始コドンから翻訳された最初のメチオニンから１９９番目及び２００番目アミノ酸残基の間にＴａｇ−７２表面抗原に特異的結合する単鎖抗体Ｔａｇ−７２ｐＳ１を挿入して製造した融合キメラリガンド；及び前記キメラリガンドを含む発現ベクターを製造する方法を開発した。本発明に使われたＧａＬＶ外被糖蛋白質はＲ−ペプチドを持つＳＥＡＴＯタイプであり配列番号７に記載の塩基配列（ＮＣＢＩ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＡＡＣ９６０８３）を有する。また、Ｔａｇ−７２表面抗原に特異的な単鎖抗体Ｔａｇ−７２ｐＳ１は配列番号８に記載の塩基配列を有する。ＦｖＧＥＬ１９９と命名された本発明のキメラリガンドは配列番号１０に記載の塩基配列を有し、これは配列番号１１に記載の融合ポリペプチドをコードし、単鎖抗体Ｔａｇ−７２ｐＳ１がＧｌｙ４Ｓｅｒの５つのアミノ酸で構成されたリンカーによりＧａＬＶ外被糖蛋白質に連結される。
このように製造された単鎖抗体ＧａＬＶ外被糖蛋白質（ＳｃＦｖ−ＧａＬＶ Ｅｎｖ ＧＰ）キメラリガンドをその発現転写が促進されるＨＣＭＶプロモーターを有する骨格ベクターｐＨＹＫＥＦ１（Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，９３：１８３，２００２）に挿入して発現ベクターｐＨＥＦｖＧＥＬ１９９を製造した。前記発現ベクターは単鎖抗体Ｔａｇ−７２ｐＳ１がＧａＬＶ外被糖蛋白質ＳＵ部分の１９９番目及び２００番目アミノ酸残基の間に挿入されて形成された９５６個のアミノ酸で構成された融合ポリペプチドを発現する。
【００１７】
本発明の好ましい実施例により、結腸菌ＤＨ５αを発現ベクターｐＨＥＦｖＧＥＬ１９９で形質転換したベクターをＤＨ５α／ｐＨＥＦｖＧＥＬ１９９と命名した結腸菌形質転換体を得て、これを特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約に基づき、寄託番号ＫＣＣＭ−１０５９６で韓国生命工学院（ＫＲＩＢＢ）遺伝子銀行（ＫＣＴＣ）（アドレス：韓国生命工学研究院，＃５２，オ・ウンドン、ユ・ソング、大田広域市、３０５−３３３，韓国）に２００４年２月１３日付で寄託した。
【００１８】
本発明はまた前記キメラリガンドをコードする遺伝子を含む組換レトロウィルスベクターが形質導入されてレトロウィルスを生産するパッケージ細胞株を提供する。
【００１９】
本発明で使用できるパッケージ細胞株としては、Ｇａｇ−Ｐｏｌ蛋白質は発現するが動物細胞株へのウィルス感染を媒介できる如何なるウィルス外被糖蛋白質も含まないパッケージ細胞株、例えばＧＰ２９３細胞株（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）であるのが好ましい。好ましくは、レトロウィルス形質導入方法は、カルシウム燐酸塩共沈殿法（ｃａｌｃｉｕｍ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｃｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ；Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，２ｎｄ ｅｄ．，１９８９）及びリポフェクトアミン方法（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、米国）のように当分野で公知の通常的な方法を使うことができる。形質導入された細胞株はＧ４１８のような抗生剤を含む適切な選択培地で培養してコロニー選別することができる。本発明の好ましい実施例では、組換レトロウィルスベクターｐＨＥＦｖＧＥＬ１９９をパッケージ細胞株ＧＰ２９３細胞に形質導入し、形質導入された細胞から高い力価で組換レトロウィルスを生産できるパッケージ細胞株ＧＰ２９３ＨＦｖＧＥＬ１９９を選別した。
【００２０】
このように選別されたパッケージ細胞株は、標的細胞に特異的な方式で人間癌細胞内に効果的に導入されて前記キメラリガンドを効率的に発現させることができるため、癌の成長と転移を効果的に抑制することができる。
【００２１】
従って、さらに本発明は、有効量の本発明によるパッケージ細胞株又はキメラリガンド及び薬学的に許容可能な担体を含む薬学組成物を提供する。
【００２２】
本発明の薬学組成物は通常的な方法を用いて製剤化することができる。剤型の製造において、この有効成分は担体と混合または希釈するのが好ましい。好ましい担体・賦形剤又は希釈剤の例としては、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、澱粉、アラビアガム、アルギン塩酸、ゼラチン、リン酸カルシウム、ケイ酸カルシウム、セルロース、メチルセルロース、微細結晶セルロース、ポリビニルピロリドン、水、メチルヒドロキシベンゾエート、プロピルヒドロキシベンゾエート、タルク、マグネシウムステアリン酸及び鉱油を含む。前記剤型は追加的に充填剤、抗凝集剤、光沢剤、湿潤剤、芳香剤、乳化剤、保存剤及びその他を含む。本発明の組成物は患者に投与された後に活性成の迅速的且つ持続的な、または遅延された放出を提供するための当分野で公知の方法を用いて剤型化することができる。
【００２３】
本発明の薬学剤型は筋肉内注射で投与することができる。好ましくは、本発明の組成物は等張液又は懸濁液である。
【００２４】
人間（患者）を治療するために、有効成分として本発明のパッケージ細胞株の通常的投与量は１０５〜１０８細胞数／ｋｇ体重、好ましくは１０６〜１０７細胞数／ｋｇ体重の範囲で１日１回〜数回投与することができる。しかし、活性成分の実際投与量は治療条件・投与経路・患者の年齢・性別及び体重、癌の種類及び重症度などの様々な関連因子に照らし合わせて決定するべきと理解しなければならず、よって前記投与量は如何なる方法でも本発明の範囲を限定するものではない。
【００２５】
実施例１：ＳｃＦｖ−ＧａＬＶ外被糖蛋白質キメラリガンドを発現する組換レトロウィルスベクターの製造
＜１−１＞ ＧａＬＶ外被糖蛋白質の構造及び機能分析
Ｔａｇ−７２表面抗原に対し特異的な単鎖抗体Ｔａｇ−７２ｐＳ１とＧａＬＶ外被糖蛋白質（Ｅｎｖ ＧＰ）の融合ポリペプチド形態のキメラリガンドを次のように製造した。
【００２６】
ＭｕＬＶ又はＨＩＶのようなレトロウィルスの外被糖蛋白質やインフルエンザＡウィルス（ｉｎｆｌｕｅｎｚａ Ａ ｖｉｒｕｓ）の血球凝集素（ｈａｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ，ＨＡ）などとは異なり、ＧａＬＶ外被糖蛋白質の３次構造及び機能に対しては殆ど知られていない。従って、単鎖抗体が挿入されるＧａＬＶ外被糖蛋白質の適切な部位を選別するためにＧａＬＶ外被糖蛋白質とその他レトロウィルス外被糖蛋白質の間の構造的且つ機能的相互関係分析を行った。本発明者らはＧａＬＶ外被糖蛋白質とその他レトロウィルス外被糖蛋白質を対象にＰｆａｒｍ分析（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｆａｍｉｌｉｅｓ Ｄａｔａｂａｓｅ ｏｆ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔｓ ａｎｄ ＨＭＭｓ）を利用して相同性（ｈｏｍｏｌｏｇｙ）を行った。その結果、これらのレトロウィルスの外被糖蛋白質中幾つかが膜貫通（ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ，ＴＭ）カルボキシル末端ドメイン（Ｃ−末端）に位置するＲ−ペプチドだけでなく可変領域Ａ（ＶＲＡ）、可変領域Ｂ（ＶＲＢ）、可変領域Ｃ（ＶＲＣ）及びプロリンリッチ領域（ＰＲＲ）を含むＧａＬＶ外被糖蛋白質において特徴的な表面サブユニット（ＳＵ）構造を有することが明らかになった。また、哺乳動物タイプ−ＣレトロウィルスＦｒ−ＭｕＬＶ、γレトロウィルスＧａＬＶ、ＦＬＶ及びＭｕＬＶの外被糖蛋白質の間の配列相同性を様々なコンピュータプログラムを利用して分析した。その結果、特異的受容体結合部位として知られていた受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）、機能が知られていないプロリンリッチ領域（ＰＲＲ）及びＣ−末端部位以外の部位が非常に高い配列の相同性と同一性（ｉｄｅｎｔｉｔｙ）を現すことが確認された（表１及び図１）。
【表１】
【００２７】
このような相同性分析結果に基づいてＦｒ−ＭｕＬＶ外被糖蛋白質の公知の３次構造（ＮＣＢＩ ＰＤＢ 登載番号：１ＡＯＬ）に関するＧａＬＶ外被糖蛋白質の２次構造分析を通じてＴａｇ−７２表面抗原に特異的な単鎖抗体を挿入するためのＧａＬＶ外被糖蛋白質の適切な位置を調査した。アミノ酸配列で保存された部位は進化的観点から見て構造的及び機能的に重要な部位と見なされるため、挿入位置の最初の考慮対象は突然変異、自然選択、適応又は進化の過程で柔軟性を有する高度の可変領域である。従って、種々なＧａＬＶ外被糖蛋白の部分型と多様な哺乳動物タイプ−Ｃレトロウィルス外被糖蛋白質のアミノ酸整列（ａｌｉｇｎｍｅｎｔ）分析に基づいてＧａＬＶ外被糖蛋白質の高度可変領域を決定した（図２）。次に、前記外被糖蛋白質の構造的及び機能的変化を最少化できる位置を決めるために、親水性（ｈｙｄｒｏｐａｔｈｙ）、表面可能性（ｓｕｒｆａｃｅ ｐｒｏｂａｂｉｌｉｔｙ）、抗原指数（ａｎｔｉｇｅｎｉｃ ｉｎｄｅｘ）、α−フェリックス、β−シート、コイル構造、変換プロット（ｔｕｒｎ ｐｌｏｔ）、変換頻度及び柔軟性（ｆｌｅｘｉｂｉｌｉｔｙ）の観点からＧａＬＶ Ｅｎｖ糖蛋白質の２次構造分析を行った。また、ＧａＬＶ Ｅｎｖ糖蛋白質の２次構造をＦｒ−ＭｕＬＶ外被糖蛋白質の公知の３次構造の対応部分としてＧａＬＶ Ｅｎｖ糖蛋白質の仮想的３次構造の適切な挿入位置を予測するためにＦｒ−ＭｕＬＶ糖蛋白質の２次構造と比較した。その結果、標的細胞受容体に対するＧａＬＶ外被糖蛋白質の特異的認識と結合に関与する受容体結合ドメイン（ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｂｉｎｄｉｎｇ ｄｏｍａｉｎ；ＲＢＤ）である可変領域Ｂ（ＶＲＢ）がＴａｇ−７２表面抗原に特異的な単鎖抗体の挿入するための適切な部位として選ばれた。
【００２８】
図３はレトロウィルス外被糖蛋白質の２次構造を示し、ＧａＬＶ外被糖蛋白質内への単鎖抗体糖蛋白質の挿入位置は可変領域Ｂ内１９９番目及び２００番目アミノ酸残基の間は赤色実線で、アミノ酸配列上の位置は数字で示しており、数字で示されたアミノ酸配列は最初のアミノ酸でメチオニンを持つシグナルペプチドを含む。
＜１−２＞単鎖抗体及びレトロウィルス外被糖蛋白質の融合キメラリガンドの製造
ＧａＬＶ外被糖蛋白質とＴａｇ−７２表面抗原に特異的な単鎖抗体Ｔａｇ−７２ｐＳ１の融合ポリペプチド形態であるキメラリガンドをヒュースタンなど（Ｈｕｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８５：５８７９−５８８３，１９８８）の方法を用いてＡＫＡ人間化抗体（韓国特許第３１８７６１号）の重鎖及び軽鎖可変領域から製造した。このように製造された単鎖抗体をｐＣＡＮＴＡＢ５Ｅベクターの制限酵素ＳｆｉＩ／ＮｏｔＩ部位に挿入してベクターｐＣＡＮＴＡＢ−３Ｅ８ＳｃＦｖＰｒｅＳ１を製作した。野生型ＧａＬＶ外被糖蛋白質遺伝子（ＳＥＡＴＯ）（ＮＣＢＩ登載番号ＡＡＣ９６０８３）をベクターｐＨＹＫＥＦ−１（Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，９３：１８３，２００２）にクローニングしてベクターｐＨＥＧＥＬを製作した。このように製作されたｐＣＡＮＴＡＢ−３Ｅ８ＳｃＦｖＰｒｅＳ１及びｐＨＥＧＥＬベクターをＰＣＲで増幅してキメラリガンドを製造した。
【００２９】
ベクターｐＨＥＧＥＬ内にクローニングされたＧａＬＶ外被糖蛋白質遺伝子はＲ−ペプチドを持つＳＥＡＴＯタイプ（ＮＣＢＩ 登載番号ＡＡＣ９６０８３）であり配列番号：７に記載される塩基配列を有する。Ｔａｇ−７２表面抗体に特異的な単鎖抗体Ｔａｇ−７２ｐＳ１をコードする遺伝子は配列番号８に記載される塩基配列を有するが、前記単鎖抗体Ｔａｇ−７２ｐＳ１は重鎖と軽鎖の可変領域であるＶＬとＶＨで構成されたＦｖ（ｆｒａｇｍｅｎｔ ｖａｒｉａｂｌｅ）が（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３のアミノ酸１５つを含むリンカーにより軽鎖可変領域ＶＬのアミノ末端（ａｍｉｎｏ−ｔｅｒｍｎａｌ）によって連結された重鎖可変領域ＶＨのカルボキシ末端（ｃａｒｂｏｘｙ−ｔｅｒｍｉｎａｌ）を含む単鎖の形態として発現される。配列番号：９に記載されるＰｒｅＳ１エピトープは単鎖抗体のＣ−末端部位に標識された。最初のメチオニンから１９９番目・２００番目アミノ酸残基の間に単鎖抗体Ｔａｇ−７２ｐＳ１を挿入させてなるキメラリガンドを製造するために、次のようなポリメラーゼ酵素連鎖反応を実施した。
【００３０】
ベクターｐＨＥＧＥＬを鋳型として配列番号：１のＥｎｖ Ｆプライマーと配列番号：２の５９７ＬＮプライマーを利用してＰＣＲを行い、６８０ｂｐのＰＣＲ産物を増幅させた。ベクターｐＨＥＧＥＬを鋳型として配列番号３のＬＣ５９７プライマーと配列番号：４のＳｐｉｋｅ Ｒ２プライマーを利用してＰＣＲを行い、１，５００ｂｐのＰＣＲ産物を増幅させた。ベクターｐＣＡＮＴＡＢ−３Ｅ８ＳｃＦｖＰｒｅＳ１を鋳型として配列番号：５のＬｎｋＮＳｃＦｖプライマー配列番号６のＳｃＦｖＬｎｋＣプライマーを利用してＰＣＲを行い、８２０ｂｐのＰＣＲ産物を増幅させた。このように増幅された３つのＰＣＲ産物を全て混合してから、これを鋳型として配列番号１のＥｎｖ Ｆプライマーと配列番号：４のＳｐｉｋｅ Ｒ２プライマーを利用してＰＣＲを行い、２，９３０ｂｐのＰＣＲ産物を増幅させた。ＰＣＲ反応溶液は鋳型ＤＮＡ ２００ｎｇ、ポリメラーゼ５単位、ＰＣＲ緩衝溶液１０μｌ，ｄＮＴＰ ０．２ｍＭ及び各プライマー５０ｐｍｏｌずつ混合してから最終体積を１００μｌにした。前記ＰＣＲ緩衝溶液は２００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１００ｍＭ ＫＣｌ、１００ｍＭ（ＮＨ４）２ＳＯ４、２０ｍＭ ＭｇＳＯ４、１％トリトンＸ−１００及び１ ｍｇ／ｍｌアセチル化ＢＳＡ（ｐＨ８．８）を含む。前記ＰＣＲ反応に使用したポリメラーゼはＰｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｂｉｏｎｅｅｒ社、韓国）又はＴａｋａｒａ Ｅｘ Ｔａｑ重合酵素（ＴａＫａＲａ社、日本）を使用した。該ＰＣＲ反応条件は９４℃で４分間前変性させてから９４℃で１分（変性）、５５℃で１分（アニーリング）及び７２℃で３分（延長）の増幅反応を３０回繰り返した後、７２℃で１０分間最終増幅した。
【００３１】
前記方法で増幅されたＳｃＦｖ−ＧａＬＶ外被糖蛋白質キメラリガンド遺伝子をコードする２，９３０ ｂｐのＰＣＲ切片を制限酵素ＢａｍＨＩとＸｂａＩで切断した。前記切片を高効率遺伝子発現ベクターであるｐＨＹＫＥＦ１の同該制限酵素部位に挿入してＳｃＦｖ−ＧａＬＶ外被糖蛋白質キメラリガンド遺伝子を発現する組換ベクターｐＨＥＦｖＧＥＬ１９９を製造したが、ベクターｐＨＹＫＥＦ１で外来遺伝子の発現はＨＣＭＶプロモーターにより調節され、その転写はＥＦ１αイントロンによって活性化する（Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，９３：１８３，２００２）。対照群として野生型ＧａＬＶ（ＳＥＡＴＯ）外被糖蛋白質遺伝子を前記骨格ベクターに挿入して発現ベクターｐＨＥＧＥＬを製造した。塩基配列分析によって本発明のキメラリガンドが発現ベクターｐＨＥＦｖＧＥＬ１９９に挿入されたことを確認した。前記ＳｃＦｖ−ＧａＬＶ外被糖蛋白質キメラリガンドをＦｖＧＥＬ１９９と命名した。
【００３２】
前記で製造された本発明のキメラリガンドは配列番号１１に記載されるペプチドをコードする配列番号１０に記載される塩基配列を有する。図４はＳｃＦｖ−ＧａＬＶ外被糖蛋白質融合キメラリガンドＦｖＧＥＬ１９９の模式図を現したものである。レトロウィルスベクターｐＨＥＧＥＬは６８５個のアミノ酸で構成された野生型ＧａＬＶ外被糖蛋白質を発現する。また、組換レトロウィルスベクターｐＨＥＦｖＧＥＬ１９９／ｐＭＥＦｖＧＥＬ１９９はＧａＬＶ外被糖蛋白質のＳＵ地域内１９９番目及び２００番目アミノ酸残基の間に単鎖抗体Ｔａｇ−７２ｐＳ１を挿入させて製造したアミノ酸９５６個で構成された融合ポリペプチドを発現する。本発明の融合キメラリガンドで単鎖抗体Ｔａｇ−７２ｐＳ１はＧｌｙ４Ｓｅｒの５個のアミノ酸を含むリンカーによりＧａＬＶの外被糖蛋白質に連結されている。
【００３３】
＜１−３＞ ＳｃＦｖ−ＧａＬＶ Ｅｎｖ ＧＰキメラリガンドの発現
本発明のＳｃＦｖ−ＧａＬＶ Ｅｎｖ糖蛋白質キメラリガンドを発現するレトロウィルスを生産するためには、これを前記宿主細胞内でキメラリガンドの形態で発現させ；発現されたキメラリガンドがゴルジ装置内で転写後変形（ｐｏｓｔｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）、三量化（ｔｒｉｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ）及びＳＵ／ＴＭ切断され；細胞表面に移動してからウィルスパッケージングの間にウィルス外被膜に分布しなければならない。それから、前記ウィルス外被上に分布したキメラリガンドが認識されて細胞内に侵入するためにはウィルスパッケージが標的細胞の特定受容体に結合し、それから前記ウィルス粒子が膜間（ｉｎｔｅｒ−ｍｅｍｂｒａｎｅ）融合を通じて細胞質に流入する。従って、前記実施例＜１−２＞で製造された組換レトロウィルスベクターｐＨＥＦｖＧＥＬ１９９がＳｃＦｖ−ＧａＬＶ Ｅｎｖ糖蛋白質キメラリガンドを発現するか否かを下記のように調査した。
【００３４】
人間腎臓上皮細胞（ｈｕｍａｎ ｋｉｄｎｅｙ ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌｓ）である２９３或いは２９３Ｔ細胞を形質感染一日前に６−ウェルプレートに２×１０５細胞／ウェルの濃度で分株し、リポフェクトアミン・プラス（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、米国）を利用して製造社の指針通り組換発現ベクターｐＨＥＦｖＧＥＬ１９９を形質感染させた。その際キメラリガンドを発現させないｐＨＥＧＥＬベクターに形質導入された細胞を対照群として使用した。前記形質導入細胞を１０％ ウシ胎児血清（ＦＢＳ，ＨｙＣｌｏｎｅ）、１００ Ｕ／ｍｌのペニシリンＧ及び０．１ ｍｇ／ｍｌ ストレプトマイシンが添加されたＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ ｍｅｄｉｕｍ，Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）培地に接種してから３７℃で３〜６時間間培養した。前記細胞を新鮮な培地に移してさらに２日間培養した後、培養された細胞を回収し遠心分離して細胞ペレットを分離した。前記細胞ペレットを１００μｌの燐酸塩緩衝溶液（ＰＢＳ）に懸濁し、同量のＳＤＳ−ＰＡＧＥ 試料緩衝溶液（４％ＳＤＳ，２０％グリシン、１０％β−メルカプトエタノール、０．０５％ブロモフェノールブルー、１２５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ６．８）を前記懸濁液に添加した。この試料を電気泳動させてからウェスタンブロット分析を行って融合キメラリガンドの発現を確認した。
【００３５】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥはＬａｅｍｍｌｉ（Ｌａｅｍｍｌｉ，Ｕ．Ｋ．，Ｎａｔｕｒｅ ２７７：６８０−６８５，１９７０）方法で行った。電気泳動されたゲル上に展開された融合キメラリガンドを伝達緩衝溶液（Ｔｒａｎｓｆｅｒ ｂｕｆｆｅｒ，１０ ｍＭ グリシン，２０％ エタノール、０．１％ ＳＤＳ，１００ ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ）を用いて８０ Ｖで３時間電流を流し、ＰＶＤＦ膜に移し、ウェスタンブロット分析をトービン（Ｔｏｗｂｉｎ，Ｈ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７６：４３５０−４３５４，１９７９）方法で行った。ブロット膜をＴＢＳＴ緩衝溶液（１５０ｍＭ ＮａＣｌ，０．１％ ツイン２０，２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．４）で５分間洗浄してから５％（ｗ／ｖ）脱脂乳粉末（ｎｏｎ−ｆａｔ ｍｉｌｋ ｐｏｗｄｅｒ）が添加されたＴＢＳＴ緩衝溶液（ＴＴＭ−５％）に４℃で一晩放置した。ＳｃＦｖ−ＧａＬＶ Ｅｎｖ糖蛋白質融合キメラリガンドＦｖＧＥＬ１９９の発現を確認するために、ＳｃＦＶのＣ−末端部位に標識された配列番号９のＰｒｅＳ１に対するマウスモノクローナル抗体（ｍｏｕｓｅ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｒａｉｓｅｄ ａｇａｉｎｓｔ ＰｒｅＳ１ ｅｐｉｔｏｐｅ；Ａｐｒｏｇｅｎ）を１次抗体として使用した。前記１次抗体をＴＴＭ−５％緩衝溶液に１：１，０００〜１：４，０００の割合で希釈し、これをＰＶＤＦ膜と常温で３時間間反応させた。前記膜をＴＴＭ−０．５％緩衝溶液を利用して１０分間隔で３回洗浄してから、ＴＴＭ−５％緩衝溶液で１：１，０００〜１：２，０００でＨＲＰ−接合塩素抗体抗マウスＩｇＧ（ＨＲＰ−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ｇｏａｔ ａｎｔｉｂｏｄｙ ａｎｔｉ ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ）を希釈して製造した２次抗体を前記膜と常温で３時間間反応させた。反応が終わると、再度膜をＴＴＭ−０．５％緩衝溶液で１０分間隔で５回洗浄してからＴＢＳ緩衝溶液（１５０ｍＭ ＮａＣｌ，２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．４）で５分間洗浄し、化学発光システム（ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ ｓｙｓｔｅｍ，ＳａｎｔａＣｒｕｚ）とＫｏｄａｋバイオマックスＭＲフィルム（Ｋｏｄａｋ Ｂｉｏｍａｘ ＭＲ ｆｉｌｍ）を用いて製造社の指針通り免疫ブロット分析（ｉｍｍｕｎｏｂｌｏｔ ａｎａｌｙｓｉｓ）を行った。蛋白質の分子量は前もって染色された蛋白質マーカー（ｐｒｅｓｔａｉｎｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｍａｒｋｅｒ，Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を電気泳動時に使用して測定した。
【００３６】
その結果、本発明の融合キメラリガンドＦｖＧＥＬ１９９はシグナルペプチドとＴＭ部位が切断された後に７１８個のアミノ酸を含むペプチドの分子量に相応する位置から検出される免疫反応により引き起こされる帯域を示したが（図５のＬａｎｅ２）、ｐＨＥＧＥＬベクターに対しては如何なる帯域も検出されなかった（図５のＬａｎｅ１）。これにより、本発明の組換発現ベクターｐＨＥＦｖＧＥＬ１９９で形質導入された細胞が融合キメラリガンドＳｃＦｖ−ＧａＬＶ Ｅｎｖ糖蛋白質を発現することが分かる。
【００３７】
実施例２：ＳｃＦｖ−ＧａＬＶ Ｅｎｖ ＧＰキメラリガンドを発現するレトロウィルスの形質導入
＜２−１＞ ＳｃＦｖ−ＧａＬＶ Ｅｎｖ ＧＰキメラリガンド発現レトロウィルスの製造
モロニーマウス白血病ウィルス（Ｍｏｌｏｎｅｙ ｍｕｒｉｎｅ ｌｅｕｋｅｍｉａ ｖｉｒｕｓ；Ｍｏ−ＭｕＬＶ）のＧａｇ−Ｐｏｌ蛋白質を発現するＧＰ２９３細胞（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社、米国）をレトロウィルスの生産のために使用した。ＧＰ２９３細胞を１０％ ＦＢＳ（ＨｙＣｌｏｎｅ）、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン Ｇ及び０．１ｍｇ／ｍｌストレプトマイシンが添加されたＤＭＥＭ培地に接種し、３７℃、５％ＣＯ２ 培養機で培養した。培養されたＧＰ２９３細胞に、本発明の融合キメラリガンドを発現する組換レトロウィルスベクターｐＨＥＦｖＧＥＬ１９９と、パッケージシグナル（ｐａｃｋａｇｉｎｇ ｓｉｇｎａｌ）を含み、ＬＴＲプロモーターによってβ−ガラクトシダーゼ（β−ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ）遺伝子を発現する組換レトロウィルスベクターｐＭＦＧ／ＬａｃＺ／ｐｕｒｏ（Ｏｈ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌｓ １１：１９２−１９７，２００１）とをリポフェクトアミン方法（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ 社、米国）を用いて形質導入した。４時間後、前記細胞を２％ ＦＢＳが添加された新鮮なＤＭＥＭ培地に移してから３７℃でさらに２日間培養して細胞及びウィルスを含む培養液を得た。前記培養液を０．４５μｍフィルターに通して細胞滓を除去することによって無細胞ウィルス培養液を得た。この無細胞ウィルス培養液を１２時間８，０００ｒｐｍ、４℃の条件で遠心分離（Ｂｅｃｋｍａｎ ｓｗ５５ ｒｏｔｏｒ）して上澄み液を除去してから残余ウィルスペレットを回収した。このウィルスペレットをＳＤＳ−ＰＡＧＥ 試料緩衝溶液に懸濁してから電気泳動とウェスタンブロット分析を行ってキメラリガンドの発現を確認した（図６）。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウェスタンブロット分析は前記実施例＜１−３＞と同じ方法で行った。この際、１次抗体としてはマウスモノクローナル抗体ａｎｔｉ−ＰｒｅＳ１を使用し、２次抗体としては塩素ＩｇＧ ａｎｔｉ−マウスＩｇＧを使用した。
その結果、本発明の融合キメラリガンドＦｖＧＥＬ１９９はシグナルペプチドとＴＭ部位が欠失されたアミノ酸７１８個の分子量を持つペプチドに相応する位置での抗原−抗体免疫反応により引き起こされる帯域を示した（図６のＬａｎｅ ２）。この結果、本発明のＳｃＦｖ−ＧａＬＶ Ｅｎｖ ＧＰ 融合キメラリガンドを含む組換レトロウィルスの生産が確認された。
【００３８】
実施例３：ＳｃＦｖ−ＧａＬＶ Ｅｎｖ ＧＰキメラリガンドを発現するレトロウィルスの標的細胞特異的感染
＜３−１＞ Ｔａｇ−７２表面抗原 発現癌細胞株の確認
Ｔａｇ−７２表面抗原関連細胞株を利用したマウス転移モデルを構築するため、多様な人間癌細胞株を対象にＴａｇ−７２表面抗原の発現をＦＡＣＳ分析（fluorescence-activated cell sorting analysis）及び免疫組織化学分析（immunohistochemical analysis）で調査した。
【００３９】
先ず、人間結腸癌細胞株ＬＳ１７４Ｔ（ＡＴＣＣ Ｎｏ．ＣＬ−１８８０）及びＷｉＤｒ（ＡＴＣＣ Ｎｏ．ＣＣＬ−２１８）、人間乳癌細胞株ＭＣＦ７（ＫＣＬＢ Ｎｏ．３００２２）、ＭＤＡ−ＭＢ２３１（ＡＴＣＣ ＨＴＢ−２６）及びＭＤＡ−ＭＢ４３５（ＡＴＣＣ ＨＴＢ−１２９）を対象にＦＡＣＳ分析を行った。多様な人間癌細胞株からＴａｇ−７２表面抗原の発現を確認するため、抗Ｔａｇ−７２モノクローナル抗体ＣＣ４９を１次抗体として使った（Lee et al., Mol. Immunol., 36: 61-71, 1999）。各癌細胞株（１０６細胞／ｍｌ）を抗Ｔａｇ−７２ １次抗体と４℃で３０分間反応させた。冷却ＰＢＡ溶液で前記細胞を３回洗浄してからＦＩＴＣが結合された抗−マウスＩｇＧ２次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ社、米国）と４℃で３０分間反応させた。得られた細胞を冷却ＰＢＡ溶液で３回洗浄してからＦａｃｓｃａｎで分析した（図７のＡ）。その結果、人間結腸癌細胞株ＬＳ１７４Ｔ及び人間乳癌細胞株ＭＣＦ７はＴａｇ−７２表面抗原に対して陽性反応を示した反面、人間結腸癌細胞株ＷｉＤｒ、人間乳癌細胞株ＭＤＡ−ＭＢ２３１及びＭＤＡ−ＭＢ４３５はＴａｇ−７２表面抗原に対して陰性反応を示した。
【００４０】
また、免疫組織化学分析を利用してＴａｇ−７２表面抗原の発現を確認した。免疫組織化学分析はＤＡＫＯ ＬＳＡＢ２及びアルカリホスファターゼ（ａｌｋａｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ，＃Ｋ６７４）を利用して行った。ＰＢＳで１：１，０００比率に希釈された抗Ｔａｇ−７２抗体であるＡＫＡ（韓国特許第３１８７６１号）を１次抗体として使用した。前記抗Ｔａｇ−７２抗体はＴａｇ−７２表面抗原に対する人間化マウスモノクローナル抗体を安定的に発現するチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ；韓国特許公開第２００３−１３６３３号）細胞の培養上澄み液をハイトラップ蛋白質Ａコラム（Hytrap Protein A column, Amersham）を利用して精製して用意した。人間ＩｇＧ Ｈ＆Ｌに対するｂｉｏｔｉｎ−ヤギポリクローナル抗体（ａｂ６８５７−１，Ａａｂｃａｍ）をＰＢＳで１：１，０００比率希釈し、これを２次抗体として使用した。また、背景染色防止のためにラヴァミソル（lavamisole, endogeous alkaline phosphatase inhibitor, ×3021）溶液を使用した。
【００４１】
その結果、乳癌細胞株ＭＣＦ−７では１０〜２０％の細胞が染色された反面、結腸癌細胞株ＬＳ１７４Ｔでは８０〜９０％ 以上の細胞が染色された。これはＴａｇ−７２表面抗原が細胞表面に分布されていることを意味する。このような結果から、結腸癌細胞株ＬＳ１７４Ｔ及び乳癌細胞株ＭＣＦ−７はＴａｇ−７２ 陽性細胞株であり結腸癌細胞株ＷｉＤｒ及び乳癌細胞株ＭＤＡ−ＭＢ４３５とＭＤＡ−ＭＢ２３１はＴａｇ−７２ 陰性細胞株であることが分かる（図７のＢ）。
【００４２】
＜３−２＞ 標的細胞特異的感染の確認
前記実施例＜３−１＞で確認されたＴａｇ−７２表面抗原陽性或いは陰性の人間癌細胞株をＳｃＦｖ−ＧａＬＶ ＥｎＶ ＧＰキメラリガンド及びＬａｃＺを発現する組換レトロウィルスに感染させた。二日後、前記組換レトロウィルスの標的細胞特異的感染を確認するためにＬａｃＺ遺伝子の発現を調査した。
【００４３】
具体的にパッケージ細胞株ＧＰ２９３細胞を６−ウェルプレートに３×１０５細胞／ウェルの濃度で形質導入一日前に分株した。０．５μｇずつ発現ベクターｐＨＥＧＥＬ（野生型ＧａＬＶ Ｅｎｖ ＧＰ）とｐＨＥＦｖＧＥＬ１９９（ＳｃＦｖ−ＧａＬＶ ＥｎｖＧＰキメラリガンド）をそれぞれｐＭＦＧ／ＬａｃＺ／ｐｕｒｏ ０．５μｇと混合し、リポフェクトアミンプラス（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、米国）を利用して前記プレートに分株した細胞に形質導入させた。前記ウェルプレートを二日間３７℃、５％ＣＯ２動物細胞培養機で培養してレトロウィルスを含む培養上澄み液を得た。１２−ウェルプレートに２９３、ＬＳ１７４Ｔ、ＭＣＦ−７、ＭＤＡ−ＭＢ２３１、ＭＫＮ−７５及び標的細胞を５×１０４細胞／ウェル濃度で分株し、２４時間放置した。前記標的細胞を先程製造した各ウィルス上澄み液で８ μｇ／ｍｌ／ウェル濃度でポリブレン（ｐｏｌｙｂｒｅｎｅ，Ｓｉｇｍａ）を利用して感染させた。感染させてから４時間経過後に感染された細胞を新しい培地に移し、３７℃、５％ＣＯ２ 培養機で４８時間追加培養した。培養が終わってから培養液を除去し、細胞ペレットを細胞固定液（１％ホルムアルデヒド、０．２％グルタルアルデヒド）で固定して常温で１０分間放置した。これをＰＢＳ溶液で３回洗浄し、Ｘ−ｇａｌ（ＰＢＳ，０．２ Ｍ フェロシアン化カリウム［ｐｏｔａｓｓｉｕｍ ｆｅｒｒｏｃｙａｎｉｄｅ］，０．２ Ｍ フェロシアン化カリウム［ｐｏｔａｓｓｉｕｍ ｆｅｒｒｉｃｙａｎｉｄｅ］，２．０Ｍ ＭｇＣｌ２，４０ｍｇ／ｍｌ Ｘ−ｇａｌ）を用いて３７℃で一晩間染色してＬａｃＺ遺伝子の発現を調査した。
【表２】
【００４４】
前記表２及び図８に示したように、野生型ＧａＬＶ Ｅｎｖ ＧＰ 発現ベクターｐＨＥＧＥＬを利用したＬａｃＺ遺伝子の形質導入の結果は、２９３細胞株の形質導入効率は２×１０６；癌細胞株であるＭＤＡ−ＭＢ４３５、ＭＤＡ−ＭＢ２３１及びＭＣＦ−７の形質導入効率は０．５〜１．５×１０５の範囲；およびＬＳ１７４Ｔ細胞株の形質導入効率は６×１０３であったことを示した。ＳｃＦｖ−ＧａＬＶ Ｅｎｖ ＧＰキメラリガンドを発現する組換レトロウィルスベクターｐＨＥＦｖＧＥＬ１９９を利用したＬａｃＺ遺伝子の形質導入の結果、ＬａｃＺ遺伝子は、２９３細胞株と共にＴａｇ−７２陽性細胞株であるＭＣＦ−７及びＬＳ１７４Ｔ細胞株から発現された反面、Ｔａｇ−７２陰性細胞株であるＭＤＡ−ＭＢ４３５及びＭＤＡ−ＭＢ２３１細胞株はＬａｃＺ遺伝子を発現しなかった。特に、２９３細胞株がＴａｇ−７２陽性であると確認されたことはないが、本発明のＳｃＦｖ−ＧａＬＶ Ｅｎｖ ＧＰキメラリガンドで感染された２９３細胞株がＬａｃＺを発現することは他の細胞株に比べ非常に高い感染効率による非特異的感染であるからである。前記結果から、本発明のＳｃＦｖ−ＧａＬＶ Ｅｎｖ ＧＰキメラリガンドを発現する組換ベクターｐＨＥＦｖＧＥＬ１９９はＴａｇ−７２抗原を発現する細胞に特異的に結合して標的細胞にＬａｃＺ遺伝子（β−ガラクトシダーゼ）を効果的に伝達することを確認した。
【００４５】
ＭＬＶを含む他のレトロウィルスベクターの場合、キメラリガンドが野生型Ｅｎｖよりも低いウィルス力価を示すと報告されている。例えば、同種指向性外被（ｅｃｏｔｒｏｐｉｃ Ｅｎｖ）や両指向性外被（ａｍｐｈｏｔｒｏｐｉｃ Ｅｎｖ）は、標的細胞によって１０５〜１０７ 範囲のウィルス力価を見せる反面、大部分のＳｃＦｖ−Ｅｎｖ ＧＰキメラリガンドは、標的細胞受容体によって多少の差はあるが、１０３以下のウィルス力価を示し、これはＳｃＦｖ−Ｅｎｖ ＧＰキメラリガンドのウィルス力価が野生型Ｅｎｖよりも１０２〜１０４倍ほど低かった（Ｃｈｒｉｓ Ａ．Ｂｅｎｅｄｉｃｔ．ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ １０：５４５−５５７，１９９９；Ｍａｒｉａｎａ Ｍａｒｉｎ．ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７０：２９５７−２９６２，１９９６；Ｔｅ−Ｈｕａ Ｔｅａｒｉｎａ Ｃ．Ｈ．ａｎｄ Ｒａｌｐｈ Ｄｏｒｎｂｕｒｇ，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７１：７２０−７２５，１９９７）。このような現象は外被糖蛋白質に挿入された外来リガンドによりレトロウィルスの元の構造が変形され、ウィルスの感染性低下を引き起こしたためである。一般的に、外被糖蛋白質の表面サブユニット（ＳＵ）が特異的受容体を認識し結合する時、融合機能を持つ膜貫通（ＴＭ）部位の構造的な変化（ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ ｃｈａｎｇｅ）が誘導されて標的細胞がウィルスによって感染される。その際、外来リガンドの挿入は元の構造の変形を引き起こし、ＳＵからＴＭへの信号伝達を破壊して、構造的な変化を誘導することができなくなる。その結果、ウィルスが宿主細胞に結合して細胞内部に流入されても膜融合が発生せずウィルス粒子が細胞質内に導入されなくなり、これは結合後遮断（ｐｏｓｔｂｉｎｄｉｎｇ ｂｌｏｃｋ）の結果であって、染性低下の主な原因である。前記結果から本発明のＳｃＦｖ−ＧａＬＶ Ｅｎｖ ＧＰキメラリガンドＦｖＧＥＬ１９９が今まで報告された他のレトロウィルスベクターよりも高い形質導入効率で標的細胞を特異的に感染させることができ、よって標的細胞に治療遺伝子を効果的に伝達できることが分かる。
【００４６】
実施例４：ＳｃＦｖ−ＧａＬＶ Ｅｎｖ ＧＰキメラリガンドを発現する癌細胞標的性パッケージ細胞株の製造
本発明のＳｃＦｖ−ＧａＬＶ Ｅｎｖ ＧＰキメラリガンドを発現する組換発現ベクターｐＨＥＦｖＧＥＬ１９９をＧａｇ−Ｐｏｌ蛋白質を発現するパッケージ細胞株ＧＰ２９３細胞にリポフェクトアミンプラス（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ 社、米国）を使用して形質感染させた。形質感染された細胞を４００ μｇ／ｍｌのＧ４１８（ｎｅｏｍｙｃｉｎｅ）で１４日間処理してコロニー（ｃｏｌｏｎｙ）を１０個選別してから各コロニーを適切な培地で増殖させた。選別されたコロニーにＬａｃＺ レポーター遺伝子（β−ガラクトシダーゼ）を発現するレトロウィルス転移ベクターｐＭＦＧ／ＬａｃＺ／ｐｕｒｏ（Ｏｈ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌｓ １１：１９２−１９７，２００１）１ μｇを形質導入させ、それから４８時間後に各ウィルスを収穫した。Ｔａｇ−７２ 陽性細胞株であるＭＣＦ−７（ＫＣＬＢ ３００２２）を各ウィルスに感染させた後、ウィルス形質導入効率をＬａｃＺ遺伝子の発現を調査して確認した。その中で最も形質導入効率が高く現れたウィルスを生産するコロニーを選別し、それを本発明のＳｃＦｖ−ＧａＬＶ Ｅｎｖ ＧＰキメラリガンドを持続的に発現するパッケージ細胞株ＧＰ２９３ＨＥＦｖＧＥＬ１９９と命名した。また、野生型ＧａＬＶ Ｅｎｖを発現するｐＨＥＧＥＬベクターもまた前記に記述された方法と同様に標的細胞に形質導入させ、それからクローンを選別して野生型ＧａＬＶ Ｅｎｖを発現するパッケージ細胞株ＧＰ２９３ＨＥＧＥＬを得た。図９は前記方法で製作されたＧＰ２９３ＨＥＦｖＧＥＬ１９９又はＧＰ２９３ＨＥＧＥＬパッケージ細胞株をＬａｃＺ 発現レトロウィルス転移ベクターと共に形質導入して得たウィルスで各標的細胞を感染させた結果である。
【００４７】
実施例５：ＳｃＦｖ−ＧａＬＶ Ｅｎｖ ＧＰキメラリガンドを発現するレトロウィルス生産細胞株の製造
本発明のＳｃＦｖ−ＧａＬＶ Ｅｎｖ ＧＰキメラリガンドを発現する組換発現ベクターｐＨＥＦｖＧＥＬ１９９をレトロウィルス転移ベクターｐＭＦＧ／ＬａｃＺ／ｐｕｒｏ（０．５ μｇ）と共にパッケージ細胞株ＧＰ２９３細胞（３×１０５細胞／６−ウェル）にリポフェクトアミン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＵＳＡ）を使用して形質導入させた。形質導入された細胞を４００ μｇ／ｍｌの Ｇ４１８（ｎｅｏｍｙｃｉｎｅ）と０．５ μｇ／ｍｌのピュロマイシン（ｐｕｒｏｍｉｃｉｎ）で連続２週間処理し、それからコロニーを８個選別した。選別されたコロニーを適切な培地で増殖させてウィルス含有培養液を得てからＭＣＦ−７細胞をこの培養液で感染させた。その結果、最高のウィルス力価を現すコロニーを選別培養して本発明のＳｃＦｖ−ＧａＬＶ Ｅｎｖキメラリガンドがその外膜に分布されたＬａｃＺ遺伝子発現レトロウィルスを持続的に生産できるウィルス生産細胞株ＧＰ２９３ＨＥＦｖＧＥＬ１９９／ｌａｃＺを構築した。野生型ＧａＬＶ Ｅｎｖを発現するｐＨＥＧＥＬベクターも前記と同様な方法で標的細胞に形質導入させ、ここから形質導入されたコロニーを選別して野生型ＧａＬＶ Ｅｎｖを持つ ＬａｃＺ遺伝子発現レトロウィルスを持続的に生産できるウィルス生産細胞株ＧＰ２９３ＨＥＧＥＬ／ｌａｃＺを得た。図１０は前記で製作したＧＰ２９３ＨＥＦｖＧＥＬ１９９／ｌａｃＺ及びＧＰ２９３ＨＥＧＥＬ／ｌａｃＺウィルス生産細胞株を培養して得られたウィルスで各標的細胞を感染させた結果である。
【００４８】
実施例６：Ｔａｇ−７２抗原関連細胞株を利用したマウス転移モデルの構築
前記実施例＜３−１＞で多様な人間癌細胞株を対象としてＴａｇ−７２表面抗原の発現をＦＡＣＳと免疫組織化学分析で調査した結果、人間乳癌細胞株ＭＣＦ−７及び結腸癌細胞株ＬＳ１７４ＴはＴａｇ−７２ 陽性であり、人間乳癌細胞株ＭＤＡ−ＭＢ２３１・ＭＤＡ−ＭＢ４３５と結腸癌細胞株ＷＩＤＲはＴａｇ−７２ 陰性であると確認された。ＭＤＡ−ＭＢ４３５細胞株がＴａｇ−７２ 陰性細胞株の中でＭＤＡ−ＭＢ２３１細胞株よりも相対的に高い肺転移能力を見せたため（Ｌｅｅ ＆ Ｗｅｌｃｈ，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ５７：２３８４，１９９７）、ＭＤＡ−ＭＢ４３５細胞株を癌転移モデルの構築に使用した。また、ＭＣＦ−７乳癌細胞株（Ｔａｇ−７２ 陽性）は肺への転移を殆ど起こさないので生体内実験に使うことはできないが、ＬＳ１７４Ｔ結腸癌細胞株では腎臓注射（ｉｎｔｒａｓｐｌｅｎｉｃ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）による肝転移及び静脈注射（ｉｎｔｒａｖｅｎｏｕｓ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）による肺転移が可能である。従って、ＬＳ１７４Ｔ細胞株をＭＤＡ−ＭＢ４３５細胞株と共に癌転移動物モデルの構築に使用した。
【００４９】
＜６−１＞ 静脈注射を利用した結腸癌転移モデルの確立
Ｔａｇ−７２陽性であるＬＳ１７４Ｔ結腸癌細胞株とＴａｇ−７２ 陰性であるＭＤＡ−ＭＢ４３５乳癌細胞株を培養してから前記細胞をトリプシン−ＥＤＴＡで処理し、遠心分離で収穫して無血清培地で２回洗浄した。その細胞を再度ＰＢＳで２回洗浄しＰＢＳ内１×１０６細胞／１００ μｌの濃度で６週齢の雌Ｂａｌｂ／ｃヌードマウスの尻尾静脈に注射した。６週間マウスの状態を観察し、マウスから肺を摘出して４％ ホルマリン溶液で固定してから肺に形成された転移塊の数を調査した。静脈注射を通じた肺転移能を調査した結果、ＬＳ１７４Ｔ結腸癌細胞株においては平均７．６個の転移塊が形成され、ＭＤＡ−ＭＢ４３５乳癌細胞株においては平均１２．２個の転移塊が形成されたことが確認できた（図１１ａ及び１１ｂ）。従って、人間結腸癌細胞株ＬＳ１７４Ｔの肺転移モデルをＴａｇ−７２抗原特異的癌細胞的中遺伝子治療剤の効果を調査するための動物テストモデルとして用いた。
【００５０】
＜６−２＞ ＳｃＦｖ−ＧａＬＶ Ｅｎｖ ＧＰキメラリガンドを発現する組換レトロウィルスベクターを利用した生体内形質導入効率の検証
パッケージ細胞株であるＧＰ２９３細胞を６−ウェルプレートに１ウェル当たり３×１０５細胞に分株し、このウェルプレートを２４時間放置した後、前記細胞をリポフェクトアミンプラスを利用してＳｃＦｖ−ＧａＬＶ Ｅｎｖ ＧＰキメラリガンドを発現するレトロウィルスベクターｐＨＥＦｖＧＥＬ１９９とβ−ガラクトシダーゼを発現するレトロウィルス転移ベクターｐＭＦＧ／ＬａｃＺ／ｐｕｒｏで形質導入させた。前記ウェルプレートを２日間３７℃、５％ＣＯ２動物細胞培養機で培養してウィルス生産細胞株を得た。培養されたＬＳ１７４Ｔ細胞（１×１０６細胞／５０μｌ ｉｎ ＰＢＳ）とＭＤＡ−ＭＢ４３５細胞（１×１０６細胞／５０μｌ ｉｎ ＰＢＳ）を６週齢の雌Ｂａｌｂ／ｃヌードマウスの尻尾静脈（ｔａｉｌ ｖｅｉｎ）に注射した後、直ちに前記で得られたウィルス生産細胞株（１×１０６細胞／５０μｌ ｉｎ ＰＢＳ）を前記と同様な方法で注射した。それから３日間隔でウィルス生産細胞株（１×１０６細胞ｉｎ １００μｌのＰＢＳ）を６週間各マウスに静脈注射した。６週経過後マウスを犠牲して肺を摘出してから固定液に浸けて組織を固定し、Ｘ−ｇａｌ染色を行って生体内での形質導入効率を調査した。
その結果、Ｔａｇ−７２ 陽性細胞株であるＬＳ１７４Ｔの静脈注射により肺に転移塊が形成された場合、本発明のＳｃＦｖ−ＧａＬＶ Ｅｎｖ ＧＰキメラリガンドにより媒介されたレポーター遺伝子ＬａｃＺの形質導入は効率３７．８％程度で非常に効果的であり、Ｔａｇ−７２ 特異的であることを確認した。反面、Ｔａｇ−７２ 陰性細胞株であるＭＤＡ−ＭＢ４３５細胞株の静脈注射により形成された転移塊は９．７７％のみ染色された。その結果から、本発明のＳｃＦｖ−ＧａＬＶ Ｅｎｖ ＧＰキメラリガンド発現ベクターを利用した癌細胞標的遺伝子伝達システムがＴａｇ−７２表面抗原に非常に特異的に且つ標的細胞へ効率的に形質導入されることが確認された。図１２ａは本発明のＳｃＦｖ−ＧａＬＶ Ｅｎｖ ＧＰキメラリガンドＦｖＧＥＬ１９９発現レトロウィルスベクターを利用したＬａｃＺ（β−ガラクトシダーゼ）レポーター遺伝子の導入及び発現により染色された肺転移塊を解剖顕微鏡で撮影した写真である。また、下記表３は各マウスから摘出した肺で発見された転移塊の数と染色された転移塊数を示したものであり、図１２ｂは表３の結果をパーセンテージ（％）に換算して示したグラフである。
【表３】
【００５１】
本発明を上記の具体的な実施例に関し記述したが、添付された特許請求範囲において定義された本発明の範囲内当分野の熟練者が本発明を多様に変形及び変化させられることを理解しなければならない。
【００５２】
【図面の簡単な説明】
【００５３】
【図１】図１はＧａＬＶ外被糖蛋白質（ＧａＬＶ Ｅｎｖ ＧＰ）と類似した哺乳動物タイプ−Ｃレトロウィルスの外被糖蛋白質構造を示す図である。ａ：シグナルペプチダーゼ切断部位、 ｂ：ＳＵ／ＴＭ切断部位、ｃ：Ｒ−ペプチド切断部位、 ＳＰ：シグナルペプチド、ＶＲＡ：可変領域Ａ、 ＶＲＢ；可変領域Ｂ、ＶＲＣ：可変領域Ｃ、 ＲＢＤ：受容体結合ドメイン、ＰＲＲ：プロリンリッチ領域、 ＣＴ：ＳＵのＣ−末端地域、ＳＵ：表面サブユニット、 ＦＰ：融合蛋白質、Ａｎｃ：固定地域（anchorage region）、 ＲＰ：Ｒ−ペプチド、ＴＭ：膜貫通ドメイン、
【００５４】
【図２】図２は幾つかのレトロウィルス外被糖蛋白質のアミノ酸整列（ａｌｉｇｎｍｅｎｔ）の結果を示す図である。ＶＲＡ：可変領域Ａ、 ＶＲＢ：可変領域Ｂ、ＶＲＣ：可変領域Ｃ、 ＰＲＲ：プロリンリッチ領域、ＳＵ：表面ドメイン、 ＴＭ：膜貫通ドメイン
【００５５】
【図３】図３はＧａＬＶ外被糖蛋白質の２次構造分析結果を示す図である。ＶＲＡ：可変領域Ａ、 ＶＲＢ：可変領域ＢＳＵ：表面ドメイン、 ＴＭ：膜貫通ドメイン
【００５６】
【図４】図４は本発明のＳｃＦｖ−ＧａＬＶ Ｅｎｖ ＧＰキメラリガンドＦｖＧＥＬ１９９及び野生型ＧａＬＶ外被糖蛋白質それぞれを発現させるベクターの概略構造を示す図である。
【００５７】
【図５】図５はパッケージ細胞株のキメラリガンドＦｖＧＥＬ１９９発現を調査したウェスタンブロット分析結果を現した写真であって、ＨＣＭＶプロモーターにより調節されるベクター内で発現されたＦｖＧＥＬ１９９を示す図である。Ｌａｎｅ １：ｐＨＥＧＥＬを含むＧＰ２９３細胞抽出液、Ｌａｎｅ ２：ｐＨＥＦｖＧＥＬ１９９を含むＧＰ２９３細胞抽出液、
【００５８】
【図６】図６はＳｃＦｖ−ＧａＬＶ Ｅｎｖ ＧＰキメラリガンドＦｖＧＥＬ１９９を含む組換レトロウィルスの生産を調査したウェスタンブロット分析の結果を示す写真である。Ｌａｎｅ １：ｐＨＥＧＥＬを含むＧＰ２９３細胞培養液から得たウィルス沈殿物、Ｌａｎｅ ２：ｐＨＥＦｖＧＥＬ１９９を含むＧＰ２９３細胞培養液から得たウィルス沈殿物
【００５９】
【図７】図７ａ及び図７ｂは多様な人間癌細胞株からＴａｇ−７２表面抗原の発現を調査したＦＡＣＳ及び免疫組織化学染色方法の結果を示す写真である。
【００６０】
【図８】図８はｐＨＥＦｖＧＥＬ１９９を含む組換発現ベクターが形質導入された細胞の写真である。
【００６１】
【図９】図９は本発明のパッケージ細胞株ＧＰ２９３ＨＥＦｖＧＥＬ１９９及びＧＰ２９３ＨＥＧＥＬにＬａｃＺ 発現レトロウィルスベクターを形質導入して獲得したｌａｃＺ 発現組換ウィルスで形質導入された細胞の写真である。
【００６２】
【図１０】図１０は安定的に構築された本発明のウィルス生産細胞株ＧＰ２９３ＨＥＦｖＧＥＬ１９９／ｌａｃＺ及びＧＰ２９３ＨＥＧＥＬ／ｌａｃＺそれぞれから得たｌａｃＺ 発現組換レトロウィルスに形質導入された細胞の写真である。
【００６３】
【図１１】図１１ａはＴａｇ−７２陽性又は陰性細胞株が各静脈に注射された時に観察した解剖顕微鏡（×１０）写真である。図１１ｂは図１１ａで観察された転移塊数を示すグラフである。
【００６４】
【図１２】図１２ａは本発明のＳｃＦｖ−ＧａＬＶ Ｅｎｖ ＧＰキメラリガンドＦｖＧＥＬ１９９ 発現レトロウィルスによるＬａｃＺ遺伝子の生体内形質導入を示す解剖顕微鏡写真である。図１２ｂは図１２ａで観察されたＬａｃＺ遺伝子の相対的生体内形質導入効率を示すグラフである。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
腫瘍関連糖蛋白質Ｔａｇ−７２の表面抗原に特異的な単鎖抗体（ＳｃＦｖ）とテナガザル白血病ウィルス（ＧａＬＶ）外被糖蛋白質の融合ポリペプチド形態であるキメラリガンド蛋白質。
【請求項２】
前記ＳｃＦｖがＧａＬＶ外被糖蛋白質の表面サブユニットの１９９番目及び２００番目アミノ酸残基の間に挿入されていることを特徴とする請求項１に記載のキメラリガンド蛋白質。
【請求項３】
配列番号９のアミノ酸配列を有することを特徴とする請求項１に記載のキメラリガンド蛋白質。
【請求項４】
請求項１に記載のキメラリガンド蛋白質をコードする遺伝子。
【請求項５】
配列番号８の塩基配列を有することを特徴とする請求項４に記載の遺伝子。
【請求項６】
請求項４に記載の遺伝子を含む組換発現ベクター。
【請求項７】
ｐＨＥＦｖＧＥＬ１９９（寄託番号：ＫＣＴＣ−１０５９６ＢＰ）であることを特徴とする請求項６に記載の組換発現ベクター。
【請求項８】
請求項６に記載の組換発現ベクターに形質導入されたパッケージ細胞株。
【請求項９】
請求項８に記載のパッケージ細胞株によって生産され、キメラリガンドが外膜上に分布されている組換レトロウィルス。
【請求項１０】
請求項１に記載のキメラリガンド蛋白質を有効成分として薬剤学的に許容できる担体を含む抗癌剤組成物。
【請求項１】
腫瘍関連糖蛋白質Ｔａｇ−７２の表面抗原に特異的な単鎖抗体（ＳｃＦｖ）とテナガザル白血病ウィルス（ＧａＬＶ）外被糖蛋白質の融合ポリペプチド形態であるキメラリガンド蛋白質。
【請求項２】
前記ＳｃＦｖがＧａＬＶ外被糖蛋白質の表面サブユニットの１９９番目及び２００番目アミノ酸残基の間に挿入されていることを特徴とする請求項１に記載のキメラリガンド蛋白質。
【請求項３】
配列番号９のアミノ酸配列を有することを特徴とする請求項１に記載のキメラリガンド蛋白質。
【請求項４】
請求項１に記載のキメラリガンド蛋白質をコードする遺伝子。
【請求項５】
配列番号８の塩基配列を有することを特徴とする請求項４に記載の遺伝子。
【請求項６】
請求項４に記載の遺伝子を含む組換発現ベクター。
【請求項７】
ｐＨＥＦｖＧＥＬ１９９（寄託番号：ＫＣＴＣ−１０５９６ＢＰ）であることを特徴とする請求項６に記載の組換発現ベクター。
【請求項８】
請求項６に記載の組換発現ベクターに形質導入されたパッケージ細胞株。
【請求項９】
請求項８に記載のパッケージ細胞株によって生産され、キメラリガンドが外膜上に分布されている組換レトロウィルス。
【請求項１０】
請求項１に記載のキメラリガンド蛋白質を有効成分として薬剤学的に許容できる担体を含む抗癌剤組成物。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７ａ】
【図７ｂ】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１ａ】
【図１１ｂ】
【図１２ａ】
【図１２ｂ】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７ａ】
【図７ｂ】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１ａ】
【図１１ｂ】
【図１２ａ】
【図１２ｂ】
【公表番号】特表２００８−５０００１８（Ｐ２００８−５０００１８Ａ）
【公表日】平成２０年１月１０日（２００８．１．１０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−５３９３６３（Ｐ２００６−５３９３６３）
【出願日】平成１６年３月１５日（２００４．３．１５）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＫＲ２００４／０００５４５
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０４７３３８
【国際公開日】平成１７年５月２６日（２００５．５．２６）
【出願人】（５０６１５８９０２）インジェ・ユニバーシティ (1)
【氏名又は名称原語表記】ＩＮＪＥ ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２０年１月１０日（２００８．１．１０）
【国際特許分類】
【出願日】平成１６年３月１５日（２００４．３．１５）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＫＲ２００４／０００５４５
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０４７３３８
【国際公開日】平成１７年５月２６日（２００５．５．２６）
【出願人】（５０６１５８９０２）インジェ・ユニバーシティ (1)
【氏名又は名称原語表記】ＩＮＪＥ ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]