真菌ストレスタンパク質ＨＳＰ９０と結合する新規な抗体分子および核酸
アミノ酸スペーサーにより連結されたＶＨドメインとＶＬドメインを含むｓｃＦｖペプチドが開示される。ＶＨドメインは、配列番号６４の配列と少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含む。ＶＬドメインは、配列番号６６の配列と少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含む。ｓｃＦｖペプチドはまた、ＶＨドメインのＣ２８に相当する位置にアミノ酸置換または欠失も含む。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、真菌ストレスタンパク質ｈｓｐ９０と特異的に結合する新規な抗体分子、このようなペプチドをコードする核酸および医薬組成物ならびにその使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
ｈｓｐ９０真菌ストレスタンパク質と結合する抗体フラグメントならびにその治療的使用は、例えばＷＯ０１／７６６２７またはＷＯ０５／１０２３８６に記載されている。Mycograb(登録商標)(Efungumab)としても知られるこの抗体フラグメントは、リンカーペプチドにより連結された免疫グロブリンのＶＨドメインとＶＬドメインを含む融合タンパク質である。このような抗体フラグメントは「一本鎖可変フラグメント」(ｓｃＦｖ)としても知られる。Mycograb(登録商標)は大腸菌(E.coli)での発酵により封入体の形態で産生され、細胞塊から抽出され、再折りたたみされた後、変性条件下でクロマトグラフィー工程により精製される。自然条件下で行われた特徴付け研究では、efungumabタンパク質には多量体または凝集塊(ここでは「多量体」と「凝集塊」は互換的に用いられる)を形成する傾向があることが示された。このような凝集塊、特に高分子量凝集塊は、治療的使用に望ましいものではない可能性がある。よって、治療的使用には、高分子量凝集塊を排除もしくは低減すること、またはこのような凝集塊の大多数に含まれる単量体の数を一定の範囲、例えば１０〜１００個の単量体、例えば１１〜７３個または２６〜５７個の単量体となるように凝集を制御することが望ましい可能性がある。
【発明の概要】
【０００３】
今回、本発明は、例えば折りたたみ特性および／または凝集塊の形成に関して有利な特性を有する、ｈｓｐ９０真菌ストレスタンパク質と結合する、改良されたｓｃＦｖペプチドを提供する。よって、本発明のペプチドは治療的使用に特に有用である。
【０００４】
本発明の第一の局面によれば、アミノ酸スペーサーにより連結されたＶＨドメインとＶＬドメインを含み、該ＶＨドメインが配列番号６４の配列と少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含み、そして該ＶＬドメインが配列番号６６の配列と少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含むｓｃＦｖペプチドが提供され、ここで、該ｓｃＦｖペプチドは：
(ａ)ＶＨドメインのＣ２８、Ｉ２９、Ｈ６８、Ｎ８５、Ｃ９７およびその組合せからなる群から選択されるものに相当する位置におけるアミノ酸置換または欠失；
(ｂ)ＶＬドメインのＶ２、Ｖ３、Ｆ１０、Ｆ１４、Ａ３９、Ｎ７６およびその組合せからなる群から選択されるものに相当する位置におけるアミノ酸置換または欠失；
(ｃ)アミノ酸スペーサーが配列(ＧＧＧＧＳ)ｎ(式中、ｎは４〜６の間である)を含むこと；
(ｄ)ＶＨドメインが、配列番号６８の配列またはそれと少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含むＮ末端ｐｅｌＢシグナル配列をさらに含むこと；
(ｅ)ＶＬドメインが、ＶＨドメインのＮ末端側末端に位置すること；および
(ｆ)特徴(ａ)〜(ｅ)の組合せ
からなる群から選択される付加的特徴を含む。
【０００５】
ＶＨドメインは配列番号６４の配列と少なくとも９０％、９５％、９９％または１００％の同一性を有する配列を含むことが好ましい。また、ＶＬドメインは配列番号６６の配列と少なくとも９０％、９５％、９９％または１００％の同一性を有する配列を含むことも好ましい。付加的特徴は配列同一性のレベルとは無関係に存在すると理解すべきである。例えば、付加的特徴がＣ２８位でのアミノ酸置換であれば、ＶＨドメインが配列番号６４と８０％の配列同一性しかない配列を含む態様であっても、この置換が存在する。
【０００６】
好都合には、ＶＨドメインのアミノ酸置換はＣ２８Ｙ、Ｃ２８Ｓ、Ｉ２９Ｓ、Ｈ６８Ｒ、Ｎ８５Ｓ、Ｃ９７Ｙ、Ｃ９７Ｓおよびその組合せからなる群から選択される。置換Ｃ２８Ｙが特に好ましい。
【０００７】
有利には、ＶＬドメインのアミノ酸置換はＶ２Ｉ、Ｖ３Ｑ、Ｆ１０Ｓ、Ｆ１４Ｓ、Ａ３９Ｋ、Ｎ７６Ｓおよびその組合せからなる群から選択される。
【０００８】
好ましくは、ｓｃＦｖペプチドは、配列番号８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０および６２(配列中、Ｘａａはシステイン以外のアミノ酸残基を表し、Ｎ末端メチオニン残基は所望により切断されていてもよい)からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。Ｘａａはチロシン残基を表すことが好ましい。
【０００９】
一態様では、ＸａａはＴｙｒ(Ｙ)である。別の態様では、ＸａａはＡｌａ(Ａ)、Ｌｅｕ(Ｌ)、Ｉｌｅ(Ｉ)、Ｖａｌ(Ｖ)、Ｐｒｏ(Ｐ)またはＭｅｔ(Ｍ)であり；さらに別の態様では、ＸａａはＰｈｅ(Ｆ)またはＴｒｙ(Ｗ)であり；さらに別の態様では、ＸａａはＧｌｙ(Ｇ)であり；さらに別の態様では、ＸはＳｅｒ(Ｓ)またはＴｈｒ(Ｔ)であり；さらに別の態様では、ＸａａはＧｌｕ(Ｅ)またはＡｓｐ(Ｄ)であり；さらに別の態様では、ＸａａはＧｌｎ(Ｑ)またはＡｓｎ(Ｎ)であり；さらに別の態様では、ＸａａはＡｒｇ(Ｒ)、Ｌｙｓ(Ｋ)またはＨｉｓ(Ｈ)である。
【００１０】
好ましくは、ｓｃＦｖペプチドは、Ｃ末端に精製タグ、より好ましくは、６ヒスチジン残基の配列をさらに含む。
【００１１】
本発明の別の態様によれば、配列番号８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０および６２で示されるアミノ酸配列からなる、または本質的になるｓｃＦｖペプチドが提供され、該ペプチドは、所望により、例えばＨｉｓタグなどの精製タグを含んでもよい(例えば、配列番号１０、２２または３４で示される通り)。
【００１２】
精製タグは一般にその分子の治療効果には寄与せず、従って、本発明のｓｃＦｖフラグメントの精製後に除去可能である。
【００１３】
本発明の別の態様によれば、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０および６２で示されるアミノ酸配列を含むｓｃＦｖペプチドが提供される。一態様では、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０および６２で示されるアミノ酸配列からなる、または本質的になるｓｃＦｖペプチドが提供され、該ペプチドは、所望により、例えばＨｉｓタグなどの精製タグを含んでもよい(例えば、配列番号２、４または２０で示される通り)。
【００１４】
当業者により容易に認識される通り、本発明のペプチドの最初のＭｅｔ残基はまた、大腸菌で発現させる場合には、例えば大腸菌ＭＡＰ(メチオニンアミノペプチダーゼ)によりin vivoで切断され得る。
【００１５】
本発明のｓｃＦｖペプチドは、例えば、アミノ酸配列(ＧＧＧＧＳ)ｎ(配列中、ｎは１〜１２の整数、例えば、１、２、３、４または５である)を有するアミノ酸スペーサー(用語「スペーサー」と「リンカー」は互換的に用いられる)により連結された２つのドメインを含む。ＶＨで示される一方のドメインは、抗体フラグメントの重鎖部分(例えば、配列番号２および配列番号３０で示されるアミノ酸配列のｓｃＦｖフラグメントのアミノ酸残基２〜１２２、または配列番号３２のアミノ酸残基１３２〜１５２に相当)に相当する。ＶＬで示される他方のドメインは、抗体フラグメントの軽鎖部分(例えば、配列番号２のアミノ酸残基１３８〜２４６、または配列番号１２のアミノ酸残基１３８〜２４６、または配列番号３２のアミノ酸残基２〜１１０に相当)に相当する。ＶＨまたはＶＬドメインは本発明のｓｃＦｖペプチドのＮ末端に位置してもよく、すなわち、これらの分子は次のように連結され得る：ＶＨ−リンカー−ＶＬまたはＶＬ−リンカー−ＶＨ。
【００１６】
任意選択のｐｅｌＢシグナル配列は、大腸菌で発現されるとき、該ペプチドの溶解度を高めるために、周辺細胞質膜への該ペプチドの細胞下局在をもたらす。
【００１７】
一態様では、配列番号３０または３２で示されるアミノ酸配列を含むｓｃＦｖフラグメントが提供される。別の態様では、配列番号３０または３２で示されるアミノ酸配列からなる、または実質的になるｓｃＦｖペプチドが提供され、該ペプチドは、所望により、例えばＨｉｓタグなどの精製タグを含んでもよい。
【００１８】
一局面において、本発明は、次の位置：Ｃ２９Ｘ、Ｉ３０Ｘ、Ｈ６９Ｘ、Ｎ８６Ｘ、Ｃ９８Ｘ、Ｖ１３９Ｘ、Ｖ１４０Ｘ、Ｆ１４７Ｘ、Ｆ１５１Ｘ、Ａ１７６Ｘ、Ｎ２１３Ｘ(ここで、Ｘは配列番号２で示されるもの以外のアミノ酸を表す(番号は配列番号２で示される通りであり、他の突然変異体の相当するアミノ酸位置は容易に同定可能である))の１個所以上に少なくとも１個のアミノ酸置換を有する、ＶＨおよびＶＬドメインと本発明のリンカーとを含むｓｃＦｖフラグメント(例えば、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、３０、３２または３４で示される通り)を提供する。好ましい態様において、本発明は、以下のアミノ酸置換：Ｃ２９ＹまたはＣ２９Ｓ、Ｉ３０Ｓ、Ｈ６９Ｒ、Ｎ８６Ｓ、Ｃ９８ＹまたはＣ９８Ｓ、Ｖ１３９Ｉ、Ｖ１４０Ｑ、Ｆ１４７Ｓ、Ｆ１５１Ｓ、Ａ１７６Ｋ、Ｎ２１３Ｓの少なくとも１つを有するｓｃＦｖフラグメントを提供する。この局面に関してのアミノ酸の番号はＮ末端メチオニン残基を含むと認識すべきである。
【００１９】
一態様では、配列番号２４、２６または２８で示されるアミノ酸配列を含むｓｃＦｖフラグメントが提供される。別の態様では、配列番号２４、２６または２８で示されるアミノ酸配列からなる、または本質的になるｓｃＦｖペプチドが提供され、該ペプチドは、所望により、例えばＨｉｓタグなどの精製タグを含んでもよい。
【００２０】
本発明のペプチドは治療薬として有用である。よって、本発明の一局面では、例えば、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０および６２(配列中、Ｘａａは上記の通り定義される)で示されるアミノ酸配列を含む本発明のｓｃＦｖペプチドを、薬学上許容される賦形剤、希釈剤または担体と組み合わせて含む医薬組成物が提供される。好適な賦形剤の詳細は、Remington's Pharmaceutical Sciences and US Pharmacopoeia, 1984, Mack Publishing Company, Easton, PA, USAに示されている。賦形剤の例としては、医薬級(Ｐｈ Ｅｕｒ)尿素およびＬ−アルギニン(Ｐｈ Ｅｕｒ)が挙げられる。例えば、本発明のｓｃＦｖペプチドの典型的な製剤は、１０ｍｇの純粋なｓｃＦｖペプチド、１５０ｍｇの医薬級(Ｐｈ Ｅｕｒ)尿素および１７４ｍｇ Ｌ−アルギニン(Ｐｈ Ｅｕｒ)を５ｍｌの水で再構成したものである。
【００２１】
本発明のｓｃＦｖペプチドまたは医薬組成物は、０.１〜１０ｍｇ／ｋｇ患者体重の範囲の用量で投与することができる。０.５〜５ｍｇ／ｋｇ体重の範囲の用量が好ましく、約１ｍｇ／ｋｇの投与量が特に好ましい。該医薬組成物は経口投与が可能である。
【００２２】
本発明のペプチドは、例えば、ＷＯ０１／７６６２７またはＷＯ０５／１０２３８６(それぞれ出典明示により本明細書の一部とされる)に開示されている通り真菌感染の処置に有用である。例えば、本発明のペプチドは、浸潤性カンジダ症または浸潤性アスペルギルス症または浸潤性髄膜炎などの全身性真菌感染症、例えば、病原性カンジダ属カンジダ・アルビカンス(C. albicans)、カンジダ・トロピカリス(C. tropicalis)およびカンジダ・クルセイ(C. krusei)ならびに低病原性カンジダ・パラプシロシス(C. parapsilosis)およびトルロプシス・グラブラタ(Torulopsis glabrata)の処置に有用である。本発明のペプチドはまた、カンジダ、クリプトコッカス、ヒストプラズマ、アスペルギルス、トルロプシス、ムコール症、ブラストミセス症、コクシジオイデス症、パラコクシジオイデス症の生物体またはマラリアによる感染症の処置にも有用である。よって、本発明は、例えば、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０および６２(配列中、Ｘａａ上記の通り定義される)で示されるアミノ酸配列を含む、有効量の本発明のｓｃＦｖペプチドを患者に投与することを含む、真菌感染患者の処置方法を提供する。Ｎ末端Ｍｅｔは所望により切断されていてもよい。
【００２３】
本発明のペプチドは組合せ療法に特に有用である。よって、別の局面において、本発明は、例えば、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０および６２(Ｎ末端Ｍｅｔは所望により切断されていてもよい)(配列中、Ｘａａは上記の通り定義される)で示されるアミノ酸配列を含む本発明のｓｃＦｖペプチドと、例えば、ポリエン抗真菌剤またはエキノカンディン抗真菌剤またはアゾール抗真菌剤などの抗真菌剤を含む組成物または組合せ製剤を提供する。本発明のｓｃＦｖペプチドの組合せ相手として有用な抗真菌剤の例としては、例えば、アムホテリシンＢ、アムホテリシンＢの誘導体、例えば、ＡｍＢｉｓｏｍｅ、アムホテリシン−Ｂ脂質複合体(Abelcet)、アムホテリシン−Ｂコロイド分散物(Amphocil)およびアムホテリシン−Ｂ脂質内エマルション；ナイスタチン；５−フルオロシトシン；カスポファンギン(caspofungin)、アニジュラファンギン(anidulafungin)、ミカファンギン(micafungin)、ＬＹ３０３３６６；イサブコナゾール、ボリコナゾール、イトラコナゾール、フルコナゾール、ミコナゾール、ケトコナゾール、ポサコナゾール、アニジュラファンギン、ミカファンギン、グリセオフルビン、テルビナフィンなどのアゾール類が挙げられる。このような組合せは一定用量組合せであってもよいが、一般には、ｓｃＦｖペプチドとその組合せ相手は一定用量組合せとしてはパッケージングされない。本発明の組合せ製剤は真菌感染症の処置において同時、個別または逐次使用のためのものであり得る。本発明のペプチドはまた、例えば、アムホテリシンＢと５−フルオロシトシン、ファンギンとアムホテリシンＢまたはエキノカンディンとアゾールなど、１種以上の抗真菌剤と組み合わせて使用してもよい。
【００２４】
別の態様において、本発明は、有効量の、例えば、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０および６２(Ｎ末端Ｍｅｔは所望により切断されていてもよい)(配列中、Ｘａａは上記の通り定義される)で示されるアミノ酸配列を含む本発明のｓｃＦｖペプチドと少なくとも１つの上記抗真菌剤を患者に投与することを含む真菌感染患者の処置方法を提供する。好ましい組合せ相手はアムホテリシンＢまたはアムホテリシンＢの誘導体、カスポファンギン、アニジュラファンギン、ミカファンギン、ボリコナゾール、イトラコナゾールである。これらの組合せ相手は同時、個別または逐次投与することができる。
【００２５】
本発明の一態様では、感染を引き起こす真菌は、本発明のペプチドの抗真菌性組合せ相手に対して耐性であるか、または部分的に耐性がある。
【００２６】
本発明のペプチドはまた、癌、または例えばそれぞれ出典明示により本明細書の一部とされるＷＯ０６／００３３８４またはＷＯ０７／０７７４５４(ＰＣＴ／ＧＢ２００７／００００２９)に開示されている自己免疫疾患または敗血症などのＴＮＦαおよび／またはＩＬ−６のレベルの上昇が関与する症状の処置にも有用である。例えば、本発明のペプチドは、例えば、リンパ性(Iymphoid)(リンパ球性(Iymphocytic))白血病(ＣＬＬ)、急性骨髄性(骨髄芽球性)白血病(leukeemia)(ＡＭＬ)、急性リンパ性(Iymphoid)(リンパ芽球性(IymphoBlastic))白血病(leukeemia)(ＡＬＬ)、慢性骨髄性白血病(ＣＭＬ)、乳癌、結腸癌、前立腺癌、多発性骨髄腫などの白血病の処置；またはヒトｈｓｐ９０を標的とする敗血症(ＷＯ０７／０７７４５４)の処置に有用である。よって、本発明は、有効量の、例えば、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０および６２(Ｎ末端Ｍｅｔは所望により切断されていてもよい)(配列中、Ｘａａは上記の通り定義される)で示されるアミノ酸配列を含む本発明のｓｃＦｖペプチドを患者に投与することを含む、癌疾患、またはＴＮＦαおよび／もしくはＩＬ−６のレベルの上昇が関与する症状(例えば、自己免疫疾患、ＳＩＲＳまたは敗血症)を有する患者の処置方法を提供する。
【００２７】
いくつかの態様では、自己免疫疾患はクローン病、関節リウマチ、潰瘍性大腸炎または全身性紅斑性狼瘡である。
【００２８】
本発明のペプチドは、抗癌剤との組合せ療法に有用である。好適な抗癌剤の例としては、ドキソルビシン、ダウノルビシン、エピルビシン、ハーセプチン、ドセタキセル、シスプラチン、イマチニブ(グリベック(Gleevec)(登録商標))、パクリタキセル、シタラビンまたはヒドロキシ尿素が挙げられる。よって、本発明は、例えば、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０および６２(Ｎ末端Ｍｅｔは所望により切断されていてもよい)(配列中、Ｘａａは上記の通り定義される)で示されるアミノ酸配列と、ドキソルビシン、ダウノルビシン、エピルビシン、ハーセプチン、ドセタキセル、シスプラチン、イマチニブ、パクリタキセルおよびヒドロキシ尿素からなる群から選択される抗癌剤とを含む、本発明のｓｃＦｖペプチドを含む組成物または組合せ製剤を提供する。また、例えば、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０および６２(Ｎ末端Ｍｅｔは所望により切断されていてもよい)(配列中、Ｘａａは上記の通り定義される)で示されるアミノ酸配列を含むペプチドなどの、有効量の本発明のｓｃＦｖとドキソルビシン、ダウノルビシン、エピルビシン、ハーセプチン、ドセタキセル、シスプラチン、イマチニブ、パクリタキセルおよびヒドロキシ尿素からなる群から選択される少なくとも１種の抗癌剤を、それを必要とする患者に投与することを含む、癌疾患を有する患者の処置方法も提供される。
【００２９】
本発明の別の態様によれば、記載されているｓｃＦｖペプチドをコードする改良された核酸分子、および例えば大腸菌でこのようなｓｃＦｖペプチドを発現させるのに特に有用な改良された核酸構築物が提供される。本発明の核酸構築物は、大腸菌において、例えば、発現されたｓｃＦｖペプチドの均質性および力価に関して、ｓｃＦｖペプチドの改良された発現をもたらす。
【００３０】
好ましくは、この核酸分子は、ｓｃＦｖペプチドをコードする配列の３’末端に位置する配列(ｔａａ)ｎ(配列中、ｎは１または２である)をさらに含む。
【００３１】
本発明の別の局面によれば、配列番号６４の配列と少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含むＶＨドメインと、配列番号６６の配列と少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含むＶＬドメインをコードする配列を含み、かつ、ＶＨまたはＶＬドメインをコードする配列の３’末端に位置する配列(ｔａａ)ｎ(配列中、ｎは１または２である)をさらに含む核酸分子が提供される。３’末端に複数の停止コドンを設けることで誤った読み過ごし事象が避けられる。
【００３２】
別の局面において、本発明は、配列番号３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９または６１(配列中、ｎｎｎはＣｙｓ以外のアミノ酸をコードするコドンを表す)で示されるヌクレオチド配列を含む核酸分子、例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ分子を提供する。例えば、一態様では、ｎｎｎは例えばＴＡＴなどＴｙｒをコードし得る。別の局面において、本発明は、配列番号１、３、５、１１、１５または１９で示されるヌクレオチド配列を含む核酸分子を提供する。当業者に認識される通り、核酸配列は、コードされるアミノ酸配列を変化させずに容易に改変することができる。１個以上(例えば、１０、２０、５０または１００まで)のこのようなサイレント突然変異を伴う配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９または６１で示されるヌクレオチド配列を含むヌクレオチド配列に基づく核酸分子も、本発明の範囲内に含まれる。さらに、(ｉ)配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９または６１と少なくとも８０％の同一性、好ましくは、少なくとも９０％、９５％、９９％または１００％の同一性を有するか；あるいは(ii)高ストリンジェンシー条件下で、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９または６１で示される配列を有する核酸分子とハイブリダイズする核酸分子も含まれる。高ストリンジェンシー条件とは、当業者には容易に理解され、例えば、６×ＳＳＣ／０.０５％ピロリン酸ナトリウム中、３７℃(１４塩基のオリゴの場合)、４８℃(１７塩基のオリゴの場合)、５５℃(２０塩基のオリゴの場合)、また６０℃(２３塩基のオリゴの場合)で洗浄することを指し得る。様々な組成の核酸に対するこのようなストリンジェンシー条件の好適な範囲はKrause and Aaronson (1991) Methods in Enzymology, 200:546-556に記載されている。
【００３３】
一態様において、本発明は、例えば、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９または６１で示される本発明の核酸分子のヌクレオチド配列を含むベクター分子を提供する。好ましくは、このようなベクター分子は、例えば大腸菌で、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９または６１で示される核酸分子を発現させるのに好適である。好適な発現ベクターは当業者であれば容易に分かる。好適なベクターの例としては、例えば、ｐＧＥＸまたはｐＥＴが挙げられる。別の態様では、このようなベクター分子を含む宿主細胞、例えば大腸菌を提供する。
【００３４】
別の態様では、好適な転写制御エレメントの制御下に、例えば、配列番号３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９または６１に記載される本発明の核酸分子を含む発現ベクターが組み込まれている宿主細胞を、その宿主細胞、例えば大腸菌での該ペプチドの発現に十分な条件下で培養し、それにより、該ペプチドを産生させ、そして該細胞により産生されたペプチドを回収することを含む、例えば、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０または６２(Ｎ末端Ｍｅｔは所望により切断されていてもよい)(配列中、Ｘａａは上記の通り定義される)で示されるアミノ酸配列を含む本発明のｓｃＦｖペプチドの産生方法が提供される。
【００３５】
２つの配列間の「同一性」パーセンテージは、ＢＬＡＳＴＰアルゴリズムバージョン２.２.２(Altschul, Stephen F., Thomas L. Madden, Alejandro A. Schaffer, Jinghui Zhang, Zheng Zhang, Webb Miller, and David J. Lipman (1997), “Gapped BLAST and PSI-PLAST: a new generation of protein database search programs”, Nucleic Acids Res. 25:3389-3402)を用い、デフォルトパラメーターを使用して決定される。特に、ＢＬＡＳＴアルゴリズムは、URL http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/にてインターネットでアクセス可能である。
【図面の簡単な説明】
【００３６】
【図１】野生型Mycograb ｓｃＦｖペプチドおよびMycograb突然変異体の配列を模式的に示す図である。個々のペプチドをコードする核酸分子の停止コドンもＣ末端に示されている。
【図２】実施例２のＥＬＩＳＡアッセイの原理を示す図である。
【図３】黒棒が試験した全ての突然変異体のＮＬＳによる可溶化後の収率を示すグラフである。エラーバーはサンプルを２回分析した際の標準偏差を示す。白棒は試験した全ての突然変異体のＮＬＳ再折りたたみ後の質量収支をグラフで表したものである。突然変異体は再折りたたみ回収値の増加に従ってランク付けされている。
【図４】選択された５つの突然変異体について、可溶化剤として尿素およびＤＴＴを用いた場合(Ａ)、および可溶化剤としてＧｕＨＣｌおよびＤＴＴを用いた場合(Ｂ)の、折りたたみ後の回収率を示したグラフである。白棒：ＩＢ.ＳＯＬ溶液中に見られるタンパク質の質量を計算(式１)に用いた場合の回収率。黒棒：ＩＢ.ＲＥＳ溶液中に見られるタンパク質の質量を計算に用いた場合の再折りたたみ回収率。
【図５】全ての試験した突然変異体についての、４％ＮＬＳ添加後、目に見える可溶化溶液の透明化が始まるまでに要した時間(白棒)と、それ以上の透明化が見られなくなるまでに要した時間(黒棒)を示したグラフである。突然変異体は開始時間に従って昇順でランク付けされている。
【図６】可溶化の応答開始に関する変動性のチャートであり、システインの数、リンカーエレメントの数および重鎖(ｖｈ)または軽鎖(ｖｌ)フラグメントがＮ末端にあったかどうかを示す。１：突然変異体Ｍｙｃ １０６は可溶化の開始が最も早かったが、５つのシステインを含んでいた。
【図７】突然変異体ＭＹＣ １３５、Ｍｙｃ １３０、Ｍｙｃ １３３、Ｍｙｃ １１９、 Ｍｙｃ １２３野生型およびＭｙｃ １１６のＲＥＦ ｅｎｄサンプルのクロマトグラムを重ね合わせたものを示す。
【図８】突然変異体ＭＹＣ １３４、Ｍｙｃ １３７、Ｍｙｃ １３８、Ｍｙｃ １０６ Ｍｙｃ １３６、Ｍｙｃ １２３およびＭｙｃ １３９のＲＥＦ ｅｎｄサンプルのクロマトグラムを重ね合わせたものを示す。
【図９】突然変異体の応答保持時間に対するスケール化評価値および以下のパラメーター：リンカー長、システインの数およびＶｈ／Ｖｌ配置の予測プロファイラーを示す。スケール化評価値は、パラメーターが中点(ｘ軸上の予測プロファイラープロットの赤い数字)から最高レベルまで上昇する際に保持時間がどの程度変化するかを予測する。
【図１０】試験した突然変異体に関して、ＲＰ−ＨＰＬＣ(ＲＰＣ２)で測定した保持時間に対してリンカー長をプロットしたものである。ＭＹＣ １３０の早い保持時間を他の突然変異体と比較して強調してある。
【図１１】ピーク２のピーク面積の評価のため、図７および８の全てのＲＥＦ.ＥＮＤサンプルを標準化して重ね合わせたものを示す。
【図１２】８Ｍ尿素＋ＤＴＴ、８Ｍ尿素、６Ｍ ＧｕＨＣｌ＋ＤＴＴおよび６Ｍ ＧｕＨＣｌで可溶化したＭＹＣ １１９のＲＥＦ.ＥｎｄサンプルのＲＰ−ＨＰＬＣ２クロマトグラムを重ね合わせたものを示す(２０ｍＭ Ｔｒｉｓ、２ｍＭシステイン、１％ＮＬＳ、ｐＨ９.０で１：５０希釈)。
【図１３】６Ｍ尿素および５ｍＭ ＤＴＴで可溶化し、次いで、１：１０希釈により再折りたたみした後のＭＹＣ １１９のＲＥＦ.ＥｎｄサンプルのＲＰＣ ２クロマトグラムを示す。
【図１４】６Ｍ尿素で可溶化し、それぞれ１：１０および１：５０希釈により再折りたたみした後のＭＹＣ １１９のＲＥＦ.ＩＭサンプルおよびＲＥＦ.ＥＮＤサンプルのＳＤＳ Ｐａｇｅ分析後のゲルの画像である。レーン１〜８：非還元ＳＤＳ Ｐａｇｅ、レーン９〜１４：還元ＳＤＳ Ｐａｇｅ。Ｒ＝還元；ｎ−ｒ＝非還元。
【図１５】６Ｍ尿素(黒)および４％ＮＬＳ(青)で可溶化した後の突然変異体ＭＹＣ １１９からの封入体サンプルのＲＰ−ＨＰＬＣのクロマトグラムを重ね合わせたもの(ＲＰＣ２)である。
【図１６】左のゲル：突然変異体ＭＹＣ １１８、１１９、１３０、１３３、１３４、１３５および１３７の還元(ｒ)ＳＤＳ−Ｐａｇｅと、右のゲル：同じサンプルの非還元(ｎ−ｒ)ＳＤＳ Ｐａｇｅの画像を示す。
【図１７】左のゲル：突然変異体ＭＹＣ １０６、１２３ ｗｔ、１３６、１３８、１３９および１４０の還元ＳＤＳ−Ｐａｇｅと、右のゲル：同じサンプルの非還元ＳＤＳ Ｐａｇｅの画像を示す。
【図１８】突然変異体Ｍｙｃ １１８、Ｍｙｃ １１９、Ｍｙｃ １３０、Ｍｙｃ １３３およびＭｙｃ １３５のＲＥＦ.ＥｎｄサンプルのＳＥＣ ＨＰＬＣ ０.５％ＮＬＳクロマトグラムを重ね合わせたものである。これらの突然変異体由来のＩＢをベンチスケールで単離した。
【図１９】突然変異体Ｍｙｃ １３４、Ｍｙｃ １３６、Ｍｙｃ １３７、Ｍｙｃ １３８、Ｍｙｃ １３９、Ｍｙｃ １４０、Ｍｙｃ １０６およびＭｙｃ １２３野生型のＲＥＦ.ＥｎｄサンプルのＳＥＣ ＨＰＬＣ ０.５％ＮＬＳクロマトグラムを重ね合わせたものである。これらの突然変異体由来のＩＢをパイロットプラントに単離した。
【図２０】全ての突然変異体のＲＥＦ.Ｅｎｄサンプルの理論的ＭＷに対する測定したＭＷの分散プロットおよび直線回帰(連続直線)を示す。当てはめに関する９５％信頼区間も示されている(破線)。左上の点はＭＹＣ １３０を示す。破線内の点は９５％ＣＩの範囲内であり、従って、野生型との有意な違いはない。両破線より下の点は、予測値よりも低い平均ＭＷを有する突然変異体を表し、両破線より上の点は、予測値よりも高い平均ＭＷが測定された突然変異体を表す。
【図２１】５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ９.０バッファーに対するＵＦＤＦ後のＭｙｃ １１９、Ｍｙｃ １０６−ｏｒｉｇａｍｉ、Ｍｙｃ １２３ ｗｔおよびＭｙｃ １３７のＲＥＦ.ＥＮＤサンプルのＳＥＣ−ＨＰＬＣ(形式)クロマトグラムを示す。各容量再構成の後にサンプルを採取した。ＵＦＤＦ処理後のサンプル(５)、１回目(３)、３回目(４)および最後(５)の「バッファー交換」工程後。
【図２２】全ての試験した突然変異体のＲＥＦ.ＩＭ、ＲＥＦ.３ＴおよびＲＥＦ.ＥＮＤサンプルのＲＰ−ＨＰＬＣ ２クロマトグラムを示す。
【００３７】
配列表の簡単な説明
配列番号１は、Ｍｙｃ１２３である。
配列番号２は、配列番号１によりコードされているペプチド配列である。
配列番号３は、Ｍｙｃ１０２、Mycograb−６Ｈ−ＴＡＡである。
配列番号４は、配列番号３によりコードされているペプチド配列である。
配列番号５は、Ｍｙｃ１０１、Mycograb−ＴＡＡである。
【００３８】
配列番号６は、配列番号５によりコードされているペプチド配列である。
配列番号７は、ＭｙｃＣ２９Ｘ−ＴＡＡ、例えば、Ｍｙｃ１０５、ＭｙｃＣ２９Ｙ−ＴＡＡである。
配列番号８は、配列番号７によりコードされているペプチド配列である。
配列番号９は、ＭｙｃＣ２９Ｘ−６Ｈ−ＴＡＡ、例えば、Ｍｙｃ１０６、ＭｙｃＣ２９Ｙ−６Ｈ−ＴＡＡ、Ｍｙｃ１１３、ＭｙｃｏＣ２９Ｓ−６Ｈ−ＴＡＡである。
配列番号１０は、配列番号９によりコードされているペプチド配列である。
【００３９】
配列番号１１は、Ｍｙｃ１０７、Ｍｙｃｏ−４−ＴＡＡである。
配列番号１２は、配列番号１１によりコードされているペプチド配列である。
配列番号１３は、ＭｙｃｏＣ２９Ｘ−４−ＴＡＡ、例えば、Ｍｙｃ１０８、ＭｙｃｏＣ２９Ｙ−４−ＴＡＡ；Ｍｙｃ１１４、ＭｙｃｏＣ２９Ｓ−４−ＴＡＡである。
配列番号１４は、配列番号１３によりコードされているペプチド配列である。
配列番号１５は、Ｍｙｃ１０９、Ｎ−Ｍｙｃｏ−４−ＴＡＡである。
【００４０】
配列番号１６は、配列番号１５によりコードされているペプチド配列である。
配列番号１７は、Ｎ−ＭｙｃｏＣ２９Ｘ−４−ＴＡＡ、例えば、Ｍｙｃ１１０、Ｎ−ＭｙｃｏＣ２９Ｙ−４−ＴＡＡである。
配列番号１８は、配列番号１７によりコードされているペプチド配列である。
配列番号１９は、Ｍｙｃ１１１、Ｎ−Ｍｙｃｏ−６Ｈ−ＴＡＡである。
配列番号２０は、配列番号１９によりコードされているペプチド配列である。
【００４１】
配列番号２１は、Ｎ−ＭｙｃｏＣ２９Ｘ−６Ｈ−ＴＡＡ、例えば、Ｍｙｃ１１２、Ｎ−ＭｙｃｏＣ２９Ｙ−６Ｈ−ＴＡＡである。
配列番号２２は、配列番号２１によりコードされているペプチド配列である。
配列番号２３は、Ｍｙｃ１１５、ＭｙｃＹＳＳＳである。
配列番号２４は、配列番号２３によりコードされているペプチド配列である。
配列番号２５は、Ｍｙｃ１１６、ＭｙｃＹＳＩＱＳＳである。
【００４２】
配列番号２６は、配列番号２５によりコードされているペプチド配列である。
配列番号２７は、Ｍｙｃ１１７、ＭｙｃＳＩＱＫＳである。
配列番号２８は、配列番号２７によりコードされているペプチド配列である。
配列番号２９は、Ｍｙｃ１１８、ＶＨ−２Ｂａｍ−２ＶＬである。
配列番号３０は、配列番号２９によりコードされているペプチド配列である。
【００４３】
配列番号３１は、Ｍｙｃ１１９、ＶＬ−２Ｂａｍ−２ＶＨである。
配列番号３２は、配列番号３１によりコードされているペプチド配列である。
配列番号３３は、Ｍｙｃ１４５、ＭｙｃＣ９８Ｘ−６Ｈ−ＴＡＡである。
配列番号３４は、配列番号３３によりコードされているペプチド配列である。
配列番号３５は、Ｍｙｃ１２９(ＭｙｃＹＳＲＩＱＳＳ)である。
【００４４】
配列番号３６は、配列番号３５によりコードされているペプチド配列である。
配列番号３７は、Ｍｙｃ１３０(ＭｙｃＹＳＲＳＩＱＳＳＫＳ)である。
配列番号３８は、配列番号３７によりコードされているペプチド配列である。
配列番号３９は、Ｍｙｃ１３３である。
配列番号４０は、配列番号３９によりコードされているペプチド配列である。
【００４５】
配列番号４１は、Ｍｙｃ１３４である。
配列番号４２は、配列番号４１によりコードされているペプチド配列である。
配列番号４３は、Ｍｙｃ１３５である。
配列番号４４は、配列番号４３によりコードされているペプチド配列である。
配列番号４５は、Ｍｙｃ１３６である。
【００４６】
配列番号４６は、配列番号４５によりコードされているペプチド配列である。
配列番号４７は、Ｍｙｃ１３７である。
配列番号４８は、配列番号４７によりコードされているペプチド配列である。
配列番号４９は、Ｍｙｃ１３８である。
配列番号５０は、配列番号４９によりコードされているペプチド配列である。
【００４７】
配列番号５１は、Ｍｙｃ１３９である。
配列番号５２は、配列番号５１によりコードされているペプチド配列である。
配列番号５３は、Ｍｙｃ１４０である。
配列番号５４は、配列番号５３によりコードされているペプチド配列である。
配列番号５５は、Ｍｙｃ１４１である。
【００４８】
配列番号５６は、配列番号５５によりコードされているペプチド配列である。
配列番号５７は、Ｍｙｃ１４２である。
配列番号５８は、配列番号５７によりコードされているペプチド配列である。
配列番号５９は、Ｍｙｃ１４３である。
配列番号６０は、配列番号５９によりコードされているペプチド配列である。
【００４９】
配列番号６１は、Ｍｙｃ１４４である。
配列番号６２は、配列番号６１によりコードされているペプチド配列である。
配列番号６３は、野生型Ｍｙｃ１２３ ｓｃＦｖペプチドの重鎖をコードするヌクレオチド配列である。
配列番号６４は、配列番号６３によりコードされているペプチド配列である。
配列番号６５は、野生型Ｍｙｃ１２３ ｓｃＦｖペプチドの軽鎖をコードするヌクレオチド配列である。
【００５０】
配列番号６６は、配列番号６５によりコードされているペプチド配列である。
配列番号６７は、ｐｅｌＢシグナル配列のヌクレオチド配列である。
配列番号６８は、配列番号６７によりコードされているペプチド配列である。
配列番号６９は、配列番号２のｓｃＦｖペプチド(Mycograb)が特異的であるカンジダｈｓｐ９０由来のエピトープである。
配列番号７０は、実施例２の結合アッセイで用いたスクランブルペプチドのエピトープである。
【実施例】
【００５１】
実施例１
大腸菌宿主細胞を発現ベクターで形質転換させ、浸漬培養で培養する。適当なＯＤ６００において、誘導プロモーター(すなわち、ｔａｃ、ｔｒｃまたはＴ７−ｌａｃプロモーター)の抑制または活性化によりｓｃＦｖの発現を誘導する。この誘導により宿主細胞内にｓｃＦｖが蓄積され、主として凝集ｓｃＦｖからなる不溶性の封入体が生産される。適当な発現期間の後、遠心分離により細胞を採取し、破砕する。次に、不溶性の封入体を重量的手段により単離する。
【００５２】
配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９または６１で示されるＤＮＡ配列を大腸菌に適した発現ベクター(すなわち、ｐＥＴ)に挿入する。このタンパク質を大腸菌宿主内で発現させた後、アフィニティークロマトグラフィーにより精製する。標準的な分子生物学プロトコールを用いる(例えば、Harlow & Lane, 前掲; Sambrook, J. et al., 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York; Sambrook, J. & Russell, D., 200 1, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbors参照)。
【００５３】
これらのｓｃＦｖペプチドは、細胞内発現の後、大腸菌細胞内に封入体の形態で蓄積される。精製のため、封入体を単離し、生成物を可溶化および再折りたたみにより抽出する。イオン交換クロマトグラフィーおよび固定化金属アフィニティークロマトグラフィー(ＩＭＡＣ)により９５％を超える純度までの精製が達成される。
【００５４】
実施例２ ＥＬＩＳＡ活性アッセイ
１. 概要
ＭＹＣ１２３(「野生型」Mycograb)および突然変異体Mycograbペプチドの結合活性をＥＬＩＳＡにて、抗原としてｈｓｐ ９０のペプチドエピトープを用いて検出した。Mycograbまたは突然変異体Mycograbはビオチン化ペプチドに結合するようになり、次に、これをストレプトアビジンがコーティングされたマイクロタイタープレートに結合させた。スクランブルペプチドを対照配列として用いた。検出はＭＹＣ１２３タンパク質のＨｉｓ領域に結合するペルオキシダーゼコンジュゲート抗Ｈｉｓ抗体を用いて行った。ペルオキシダーゼをＡＢＴＳ基質と反応させて緑色物質を生成し、その吸収を４０５ｎｍで測定した。この４０５ｎｍでの吸収は溶液中のＭＹＣ１２３の活性と比例する。活性を参照標準の６点検量曲線から決定し、参照に対する活性％として示した。
【００５５】
ＥＬＩＳＡの原理を、ストレプトアビジン１がプレートにコーティングされ、ビオチン２と結合する図２に示す。そして、ビオチン２は、ＭＹＣ１２３ ｓｃＦｖペプチド５のＨｓｐ９０結合部位４に存在するＨｓｐ ９０ペプチド３と結合する。このｓｃＦｖペプチド５はＨｉｓタグ６を有し、これに抗Ｈｉｓ−ペルオキシダーゼ検出抗体７が結合する。
【００５６】
２. 手順の原理および供給源
用いたＥＬＩＳＡは、Mycograbまたは突然変異体Mycograbが、ビオチン化抗原ペプチド(ビオチン−ＮＫＩＬＫＶＩＲＫＮＩＶＫＫ−カンジダＨｓｐ９０由来のエピトープ配列)がコーティングされたストレプトアビジン表面マイクロプレートを用いて捕捉される直接検出アッセイであった。次に、Mycograbまたは突然変異体Mycograbの存在を、セイヨウワサビ・ペルオキシダーゼにコンジュゲートされた抗Ｈｉｓタグ抗体を用いて検出した。その後、セイヨウワサビ・ペルオキシダーゼの基質であるＡＢＴＳをウェルに加え、存在するMycograbの濃度を４０５ｎｍで測定した吸光度と比例させた。Mycograbまたは突然変異体Mycograbのサンプルの活性を、既存のMycograb薬品参照材料を用いて作製した標準曲線から直接求めた。
【００５７】
３. 材料
３.１ 機器
Streptawell High Bindマイクロタイタープレートは、Roche(カタログ番号１１９８９６８５００１)から供給された。アッセイはBio-Radモデル６８０マイクロプレートリーダーを用いて行った。ハードウエアの制御はMicroplate Manager Softwareバージョン５.２.１(Bio-Rad, USA)を用いて行った。データ分析はMicrosoft Excelを用いて行った。
【００５８】
３.２ 化学薬品および試薬
３.２.１ 化学薬品
化学薬品は、特に断りのない限り、全て分析等級のものであった。
【表１】
【００５９】
３.２.２ 試薬
ブロッキングバッファーストック１(Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水中５％ｗ／ｖ ＢＳＡ)
ＢＳＡ ２.５ｇ
２.５ｇのＢＳＡを秤取り、５０ｍＬのＭｉｌｌｉ−Ｑ水に加えた。４℃で１週間保存した。
【００６０】
１Ｍ Ｔｒｉｓバッファー ｐＨ７.８
Ｔｒｉｓ １２１.２４ｇ
１２１.２４ｇのＴｒｉｓを秤取り、９５０ｍｌのＭｉｌｌｉ−Ｑ水に攪拌しながら溶かした。ｐＨを確認し、ｐＨ７.８となるまで濃塩酸を滴下して調整した。Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水で１リットルとした。０.２２μｍフィルター(Sartorius)で濾過し、室温で最大１か月保存した。
【００６１】
サンプル希釈バッファー(２０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ７.８ ０.１％ｗ／ｖ ＢＳＡ)
１ｍＬの１Ｍ Ｔｒｉｓ保存溶液を４８ｍｌのＭｉｌｌｉ−Ｑ水および１ｍｌのブロッキングバッファーストック１溶液に加えた。実験の度に新しくした。
【００６２】
洗浄バッファー(ＰＢＳ＋Ｔｗｅｅｎ ２０ ０.１％ｖ／ｖ)
ＰＢＳタブレット５錠を９００ｍＬのＭｉｌｌｉ−Ｑ水に溶かし、１ｍＬのＴｗｅｅｎ ２０を加え、タブレットが溶けるまで攪拌し、Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水で１０００ｍＬとした。４℃で１週間まで保存した。
【００６３】
ブロッキングバッファーストック２(洗浄バッファー＋５％ｗ／ｖ ＢＳＡ)
ＢＳＡ ２.５ｇ
２.５ｇのＢＳＡを秤取り、５０ｍＬの洗浄バッファーに溶かした。４℃で最大１週間保存した。
【００６４】
ペプチド希釈バッファー(ＰＢＳ＋０.１％ｖ／ｖ Ｔｗｅｅｎ ２０＋０.１％ｗ／ｖ ＢＳＡ)
１ｍＬのブロッキングバッファーストック２を４９ｍＬの洗浄バッファーに加えた。実験の度に新しくした。
【００６５】
抗原ペプチド溶液
ビオチン-NKILKVIRKNIVKKペプチド １０ｍｇ
発注合成した抗原ペプチドの２ｍｇ／ｍｌ溶液を、１０ｍｇのペプチドを秤取り、５ｍｌのＭｉｌｌｉ−Ｑ水に溶かすことにより作製した。５０〜１００μｌのアリコートを１.５ｍｌのエッペンドルフ管に分注し、最大１年間−８０℃で冷凍保存した。
【００６６】
抗原ペプチド作業溶液(ペプチド希釈バッファー中４μｇ／ｍＬペプチド)
２５μＬの抗原ペプチド溶液(２ｍｇ／ｍＬ)を１２.４７５ｍＬのペプチド希釈バッファーに加え、４μｇ／ｍＬの溶液とした。実験の度に新しくした。
【００６７】
３.２.３ サンプル調製
対照品
１×１０ｍｇのMycograb参照バッチ(ＢＮ２７０６０３)を５ｍｌのＭｉｌｌｉ−Ｑ水に再懸濁させ、バイアル内の全ての粉末が確実に取り込まれ、溶解するよう穏やかに混合した。１３,０００ｒｐｍで５分間遠心分離して粒状物質を除去した。次に、この溶液のタンパク質濃度を標準的なＵＶタンパク質濃度法に従って測定した。
【００６８】
試験品
１×１０ｍｇのMycograbまたは突然変異体Mycograb試験材料を５ｍｌのＭｉｌｌｉ−Ｑ水に再懸濁させ、対照品と同様に処理した。
【００６９】
検量曲線標準
対照品材料をサンプル希釈バッファーで希釈し、上限濃度５μｇ／ｍＬのサンプル５ｍＬを得た。次に、この溶液を用いて、それぞれ最終容量２ｍＬで、濃度範囲５〜０.１５６μｇ／ｍＬにわたり２倍連続希釈サンプルを作製した。
【００７０】
４. 手順
１. ２ｍｇ／ｍｌの抗原ペプチド保存溶液のアリコートを冷凍庫から取り出し、０.１％(ｗ／ｖ)ＢＳＡおよび０.１％(ｖ／ｖ)Ｔｗｅｅｎ ２０を含有するＰＢＳバッファーで１：５００希釈し(バッファー１２.５ｍｌ中、ペプチド２５μｌ)、４μｇ／ｍｌペプチドの作業溶液を作製した。９６ウェルのhigh bind StreptaWellプレート(Roche)のＢ〜Ｈ行を０.１％(ｗ／ｖ)ＢＳＡ ＰＢＳ−０.１％(ｖ／ｖ)Ｔｗｅｅｎ ２０中、４μｇ／ｍｌのビオチン-NKILKVIRKNIVKKペプチド１００μｌでコーティングした。ウェル当たり１００μｌの０.１％(ｗ／ｖ)ＢＳＡ ＰＢＳ−０.１％(ｖ／ｖ)Ｔｗｅｅｎ ２０をＡ行の全てのウェルに加えた。その後、このプレートを一晩４℃で保存した。
【００７１】
２. 次に、このプレートのウェルをThermo WellWash ACにて、ＰＢＳ ０.１％(ｖ／ｖ)Ｔｗｅｅｎ ２０バッファー２００μｌで３０秒３回洗浄した。
【００７２】
３. ローディングに先立ち、再懸濁させたMycograbバイアル保存溶液から２０ｍＭ Ｔｒｉｓバッファー ｐＨ７.８、０.１％(ｗ／ｖ)ＢＳＡで５μｇ／ｍｌに希釈することにより、Mycograbおよび突然変異体Mycograbサンプルを作製した。次に、Mycograb(登録商標)サンプルをこの最初の５μｇ／ｍｌ溶液から、２０ｍＭ Ｔｒｉｓバッファー ｐＨ７.８、０.１％(ｗ／ｖ)ＢＳＡで、０.１５６２５μｇ／ｍｌまで２倍連続希釈することにより調製した。個々の希釈は全て、実験に必要な量に応じて、１.５ｍｌのエッペンドルフ管(ＶＷＲカタログ番号２１１−２１３９)か、７ｍｌのＢｉｊｏｕｘコンテナ(ＶＷＲカタログ番号２１５−０３２８)かのいずれかで行った。その後、各希釈溶液サンプル１００μｌをプレートにトリプリケートで添加した。１００μｌ ２０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ７.８、０.１％(ｗ／ｖ)ＢＳＡを含有するブランクウェルの対照セットもＨ行に含めた。
【００７３】
４. このプレートを室温で１時間放置した後、ステップ２に記載の通り、ウェルをＰＢＳ−０.１％(ｖ／ｖ)Ｔｗｅｅｎ ２０で３回洗浄した。
【００７４】
５. １００μｌのマウスモノクローナル抗Ｈｉｓ ＨＲＰコンジュゲート(Sigma A7058)を各ウェルに０.１％(ｗ／ｖ)ＢＳＡ ＰＢＳ−０.１％(ｖ／ｖ)Ｔｗｅｅｎ ２０中１：２０００濃度で添加し、室温で１時間放置した。
【００７５】
６. 次に、ウェルを上記の通り洗浄し、結合したMycograb(登録商標)を、１００μｌのＡＢＴＳ(登録商標)試薬を添加することにより検出した。この発色を４０５ｎｍで読み、２つ目の検量曲線で最高濃度のサンプルの吸光度が１.３ＡＵに達した際に読み取りを行った。Mycograb(登録商標)の濃度はＡ４０５ｎｍでの吸収に比例した。
【００７６】
７. 参照材料のＡ４０５ｎｍでの吸光度結果をエクセルのスプレッドシートに移し、６点二次検量曲線関数ｙ＝ａ＋ｂｘ＋ｃｘ２を、Mycograb(登録商標)の濃度(μｇ／ｍｌ)に対し、(参照サンプルＡ４０５ｎｍ−ブランク)からプロットし、相関係数≧０.９９であった。「ホック」効果の存在が見られれば、最高濃度点をグラフから除き、５点検量曲線とした。いくつかの状況では、３回の測定当たり異常値が１個を超えないならば、プレート当たり２個ずつのウェルの外れ値(目により決定)をデータ分析から除いた。適当な吸光度平均を用い、サンプル中の見掛けの濃度を計算する非直線回帰分析を用い、活性％を計算した。
【００７７】
この試験で得られたＥＬＩＳＡ結果を表１に示す。
【表２】
【００７８】
サンプル１および３〜６は封入体の予備精製、再折りたたみおよび洗剤ＮＬＳの除去(Ｄｏｗｅｘクロマトグラフィーまたはダイアフィルトレーションによる)の後に得られた処理中間体である(最終薬剤物質ではない)。サンプル２は、Biomeva/Thymoorganにより製造され、第III相治験に用いられた元の野生型薬剤である。元の薬品の仕様(specification)は参照標準の７５〜１２５％であった。全てのサンプルが活性である(結合する)と判断された。
【００７９】
実施例３ クリプトコックス・ネオフォルマンス(Cryptococcus neoformans)の最小阻害濃度の決定
概要
ＭＩＣアッセイでは、モデル生物としてクリプトコックス・ネオフォルマンスを用い、ＭＹＣ１２３の抗真菌活性を決定した。このアッセイでは抗真菌活性を評価し、臨床状況でのＭＹＣ１２３の作用を模倣することができる。
【００８０】
ＭＹＣ１２３のＭＩＣは、the National Committee for Clinical Laboratory Standards document M27-A2 (2002)に従い、培養液の微量希釈により測定した。簡単に言うと、ＲＰＭＩ培地に１０３ＣＦＵ／ｍｌのクリプトコックス・ネオフォルマンスを接種した。ＭＹＣ１２３を培地に漸減濃度で添加した(１０２４μｇ／ｍｌ、５１２μｇ／ｍｌ、２５６μｇ／ｍｌ・・・)。これらのＭＩＣプレートを３７℃で７２時間インキュベートした。エンドポイントは、光学的に透明なウェルとなる濃度(ＭＩＣ−０)および増殖対照と比べて濁度の顕著な低下をもたらす濃度(≧５０％増殖阻害、ＭＩＣ−２)として判定した。
【００８１】
方法
予備アッセイの調製
セーフティーキャビネット：ＳＡＢプレートにクリプトコックス・ネオフォルマンスを接種し、３５℃で４８〜７２時間インキュベートした。プレートをパラフィルムで封じた。
【００８２】
ベンチ：
ＲＰＭＩを調製した。抗真菌剤はＮＣＣＬＳ法に従って調製し(Ｍ２７−Ａ２)、ＲＰＭＩ増殖培地中全部で１１種類の濃度とした。濃度は１つのＭＩＣに必要な終濃度の２倍とした。
【００８３】
ＭＩＣプレート
Ｕ型９６ウェルプレートにて、試験する最高薬剤濃度１００μｌ(必要濃度の２倍)をＡ行およびＢ行のウェル１に加えた(アッセイはデュプリケートで行った)。これをプレートの列に、例えば、行ＡとＢのウェル２に次の濃度、行ＡとＢのウェル３に次の濃度というように、漸減濃度で反復した。ウェル１２は増殖培地のみを含んだ。
【００８４】
セーフティーキャビネット：接種物の調製−直接コロニー懸濁液。クリプトコックス・ネオフォルマンスの直接コロニー懸濁液を、ＲＭＰＩ培地で４８〜７２時間プレートから作製した。これを０.５ ＭａｃＦａｒｌａｎｄｓ標準(およそ１×１０６〜５×１０６ｃｆｕ／ｍｌ)に調整した。１：５０希釈液を作製した。さらに１：２０希釈液(およそ１×１０３〜５×１０３ｃｆｕ／ｍｌ、必要接種量の２倍)を作製した。
【００８５】
セーフティーキャビネット：プレートの接種。プレートはウェル１２からウェル１へと用いた。これにより薬剤の持ち越しを避けた。１００μｌの接種懸濁液を各ウェルにピペットで入れた(最終接種量０.５×１０３〜２.５×１０３ｃｆｕ／ｍｌ)。プレートをパラフィルムで封じた。
【００８６】
インキュベーション
これらのＭＩＣプレートを３７℃で７２時間インキュベートした。接種を確認するため、接種懸濁液を連続希釈し、これらの希釈液１０μｌをＳＡＢプレートにプレーティングし、３７℃で７２時間インキュベートした。
【００８７】
読み取り結果
読み取りミラーを用い、増殖を「薬剤無しの」対照(ウェル１２)と比較し、次のように増殖をスコア付けした。
０−光学的に透明
１−やや濁りがある
２−著しい増殖の低下(およそ５０％)
３−若干の濁度低下
４−濁度の低下無し
本研究では表２に示されるようなＭＩＣ結果が得られた。
【表３】
【００８８】
サンプル１および３〜６は封入体の予備精製、再折りたたみおよび洗剤ＮＬＳの除去(Ｄｏｗｅｘクロマトグラフィーまたはダイアフィルトレーションによる)の後に得られた処理中間体である(最終薬剤物質ではない)。サンプル２は、Biomeva/Thymoorganにより製造され、第III相治験に用いられた元の野生型薬品であった。
【００８９】
これらのサンプルに関して得られたＭＩＣ結果を、対応するバッファーに関して得られた結果と比較した。サンプル３を除く全てのサンプルが参照０７０６０２と比較して活性があるとみなされた。サンプル３およびバッファー６からは同じ結果が得られ、ＭＹＣ１２３不含バッファーがこの試験生物に有毒であったことを示す。サンプル１および４〜６の値はＴｒｉｓバッファーの値とかけ離れており、これはデータの高い信頼性を示す。
【００９０】
実施例４
概要
Mycograb突然変異体の目的は、野生型Mycograbに比べて構造特性が改良された突然変異体ｓｃＦｖペプチドを得ることであった。点突然変異、特に遊離システインのチロシンによる置換により、凝集および下流プロセシングの際の不適切なジスルフィド結合の形成が軽減されるはずであると考えられた。また、重鎖フラグメントの配向を軽鎖フラグメントと入れ替え、ＨＩＳタグを除去することが、Mycograb分子の天然の３Ｄ構造の形成に有益であるとも考えられた。
【００９１】
クローニングした後に、発酵の前にこれらの構築物の配列決定を行った。封入体(ＩＢ)の単離のため、およびさらなる下流プロセシングのために十分な材料を得るために発酵をスケールアップした。これらの突然変異体の発現構築物を、再折りたたみの最終工程まで、適合させたＢｉｏｍｅｖａプロセスに従って精製した。
【００９２】
一定範囲の突然変異体Mycograbペプチドの物理的パラメーターを実施例５〜１２に示す通りに試験した。
【００９３】
試験した突然変異体およびそれらの突然変異の概要を表３に示す。比較のため、試験に野生型を含めた。
【表４】
【００９４】
試験アッセイに用いた方法論を以下に記載する。
【００９５】
封入体(ＩＢ)の単離
ＬＶＡ(Laborversuchsanstalt)にて突然変異体Ｍｙｃ １１８、１１９、１３０、１３３およびＭｙｃ １３５の振盪フラスコから得られた４Ｌの発酵液を、高圧ホモジナイザー(ＬＡＢ ４０−１５ ＲＢＦＩ)を用い、ＲＰＰ４中、７００バールで２サイクル、各々１５分間で破砕した。ＩＢを、４℃、１００００ｒｐｍで２０分間、実験室規模でボトル遠心機を用い、細胞残渣から分離した。ＩＢを実験室用の水(ＷＦＬ)で２回洗浄し、その後、ＷＦＬ中２０％(ｗ／ｖ)の懸濁液を調製した。この懸濁液のアリコートを−２０℃で保存した。
【００９６】
ＩＢを、突然変異体Ｍｙｃ １３４、１３７、１３８、１０６、１３６、１３９、１４０およびＭｙｃ １２３(ｗｔ)から、これらの突然変異体の発酵をバイオリアクターにて３０Ｌ規模で行ったため、ＲＰＰ４中パイロットスケールで単離した。ディスクスタック遠心機を用い、細胞残渣からＩＢを分離した。ＷＦＩで２０％の懸濁液(ｗ／ｖ)を調製した。この懸濁液のアリコートを−２０℃で保存した。
【００９７】
可溶化
ＮＬＳによる可溶化(適合させたBiomevaプロセスに従う)。２０％ＩＢ懸濁液の可溶化は、タンパク質濃度８ｍｇ／ｍｌとなるまでＷＦＬで希釈した後、１００ｍＭ Ｔｒｉｓ／塩基、４％ＮＬＳ、ｐＨ９.０バッファーで１：２希釈することにより行った。この溶液をビーカー中、室温で、透明となるまで、しかしながら少なくとも３０分間攪拌した。透明化の開始および終了までの時間を記録した。
【００９８】
尿素、ＧｕＨＣｌ、ＤＴＴのよる別の可溶化。この別の可溶化戦略は、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ ８Ｍ尿素＋／−５ｍＭ ＤＴＴまたは２０ｍＭ Ｔｒｉｓ、６Ｍ ＧｕＨＣｌ＋／−５ｍＭ ＤＴＴ(双方ともｐＨ９.０)を用いた２０％ＩＢ懸濁液の各量の１：１０希釈により行った。尿素およびＧｕＨＣｌの得られた濃度は、ＩＢ懸濁液の容量によってそれぞれ７.２Ｍおよび５.２Ｍであった。
【００９９】
可溶化されたＩＢの再折りたたみ
ＮＬＳによる再折りたたみ。再折りたたみは、この可溶化溶液を５０ｍＭ Ｔｒｉｓ／塩基バッファーで１：４希釈することにより行った。ＮＬＳの終濃度は０.５％であった。再折りたたみは５０μＭ ＣｕＣｌ２の添加により開始させた。サンプルを採取し、ＣｕＣｌ２添加前と添加後、次いでＣｕＣｌ２添加後およそ２４、４８、７２および９６時間に直ぐにＲＰＣ２分析した。
【０１００】
尿素、ＧｕＨＣｌによる可溶化後の再折りたたみ。８Ｍ尿素または６Ｍ ＧｕＨＣｌ＋／−ＤＴＴによる可溶化後のMycograb溶液の再折りたたみは、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ／塩基、１％ＮＬＳおよび２ｍＭ Cystinを含有するバッファーｐＨ９.０で１：５０希釈することにより行った。
【０１０１】
いくつかの突然変異体では、尿素による可溶化後のMycograb溶液の希釈は、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ／塩基、０.５Ｍ Ｌ−アルギニンおよび２ｍＭ Cystinを含有するバッファーｐＨ ９.０で１：１０希釈することによっても行った。
この再折りたたみ溶液をそれぞれ４℃で９６時間または室温で２４時間攪拌した。
【０１０２】
再折りたたみの動態
必要な再折りたたみ時間を決定するため、突然変異体Ｍｙｃ １１９の再折りたたみ動態を記録した。Ｍｙｃ１１９の２０％ＩＢ懸濁液のサンプルを上記の通り可溶化した。再折りたたみは、サンプルをそれぞれの時間間隔で採取し、ＲＰＣ２により分析した以外、上記の通り行った。
【０１０３】
ＵＦ／ＤＦによる再折りたたみ溶液からのＮＬＳの除去。突然変異体Ｍｙｃ１１９、Ｍｙｃ １３７、Ｍｙｃ １０６およびＭｙｃ １２３(ｗｔ)を上記の通り可溶化し、再折りたたみした。再折りたたみ後、ＲＥＦ.ＥＮＤ溶液のバッファー交換を、Amicon stir cellを用いて分子量カットオフ１０ｋＤａで行った。各ターンオーバー容量後のＮＬＳ濃度をＲＰ−ＨＰＬＣで測定した。５０ｍｌのＲＥＦ.ＥＮＤ溶液を２５ｍｌまで濃縮した後、ダイアフィルトレーションバッファーで再び５０ｍｌとした。この手順を４回行った。ＮＬＳ除去後の凝集傾向を、フォーミュレーションバッファーを流すＳＥＣ−ＨＰＬＣで測定した。
【０１０４】
ＳＤＳ Ｐａｇｅ分析
ＳＤＳ Ｐａｇｅは、ＮｕＰＡＧＥ ４−１２ ＢｉｓＴｒｉｓゲルと泳動バッファーとしてＭＯＰＳを用いて行った。泳動時間は２００ボルトで６５分であった。質量０.２〜０.４μｇのMycograbを各レーンに適用した。電気泳動後、ゲルを銀で染色した。還元ＳＤＳ Ｐａｇｅでは、１００ｍＭのＤＴＴをサンプルに加えた。
【０１０５】
結果
突然変異体の発現構築物を、表４に挙げられている分析方法を用い、下流手順の種々の段階で分析した。
【表５】
【０１０６】
表５は、突然変異体の評価に用いた、表４に挙げられている分析方法の説明を示す。特定のアッセイの特異性を記載した注釈も含まれている。
【表６】
【０１０７】
試験した突然変異体の個々のアッセイのさらなる詳細を以下の実施例５〜１２にまとめ、考察する。
【０１０８】
実施例５ 可溶化および再折りたたみ後の質量収支 − 結果としてのＲＰＣ１力価の測定
ＩＢの可溶化および再折りたたみ前後のタンパク質濃度を力価アッセイで測定した。このアッセイではサンプル中に存在する全可溶性タンパク質を測定するので、質量収支は１００％になるはずである。可溶化に関する質量収支を、式１を用いて計算した。
【数１】
式中、ｍｇ ＲＰＣ１ ＩＢ.ＳＯＬは、ＲＰＣ １法による濃度測定値とＩＢ ＳＯＬ溶液の容量から計算したＩＢの可溶化溶液中のタンパク質の質量である。ｍｇ ＲＰＣ１ ＩＢ.ＲＥＳは、ＲＰＣ １法による濃度測定値と単離されたＩＢをＤＩに再懸濁させた後の溶液の容量から計算した２０％ＩＢ懸濁液中の質量である。
【０１０９】
再折りたたみに関する質量収支は式２を用いて計算し、回収率％として表す。４％ＮＬＳ、８Ｍ尿素＋／−５ｍＭ ＤＴＴまたは６Ｍ ＧｕＨＣｌ＋／−５ｍＭ ＤＴＴのいずれかで可溶化したＩＢを、それぞれ３.３.１および３.３.２に記載のように希釈し、再折りたたみを行った。
【数２】
式中、ｍｇ ＲＰＣ１ Ｒｅｆ.ＥＮＤは、再折りたたみ溶液の容量を掛けた再折りたたみ溶液中に見られるＲＰ−ＨＰＬＣでの濃度測定値によるタンパク質の質量である。ｍｇ ＲＰＣ１ ＩＢ.ＳＯＬは、ＩＢ可溶化物中に見られるタンパク質の質量であり、％ＲＥＦは再折りたたみ後の回収率である。
【０１１０】
式１および２により計算される通り、４％ＮＬＳでの可溶化とその後の全ての突然変異体の再折りたたみ後の質量収支は表３に示されている。生データは表６および７に見られる。
【０１１１】
表６は、全ての試験した突然変異体についての、ＩＢ＿ＲＥＳ懸濁液のＮＬＳで可溶化した後の回収率と、分析法ＲＰＣ Ｉから計算した再折りたたみ後の回収率を示す。また、ＩＢ−ＲＥＳ溶液中のタンパク質濃度および分析法ＲＰＣＩにより測定された再折りたたみ溶液中のタンパク質濃度も示す。表７は、尿素(ＳＯＬ：尿素)での可溶化およびＧｕＨＣｌ(ＳＯＬ：ＧｕＨＣＬ)での可溶化後にＩＢ＿ＲＥＳ、ＩＢ＿ＳＯＬおよびＲＥＦ.ＥＮＤサンプルのＲＰＣにより測定されたタンパク質濃度を示す。再折りたたみ時間は４℃で９６時間であった。ＲＥＦ.ＥＮＤ溶液を得るための希釈倍率は、ＩＢ＿ＲＥＳおよびＩＢ＿ＳＯＬでそれぞれ５００および５０であった。
【０１１２】
【表７】
【表８】
【０１１３】
可溶化の質量収支は試験した１２種の突然変異体のうち１０種で１００％を超えていた。これは、ＩＢ懸濁液が粗サンプル型であり、結果として、サンプルを採取した際にＩＢが完全に溶けておらず、不均質な溶液となり、よって、全タンパク質濃度の過小評価に至ったためであり得る。データ変動は高く、２回分析した６つの突然変異体の相対標準偏差は２.６％(Ｍｙｃ １３８)〜４２.９％(Ｍｙｃ １３３)の範囲であった。
【０１１４】
再折りたたみ後の回収率％は７２％(Ｍｙｃ １３８)〜９９％(Ｍｙｃ １３４)の間であった。予測回収率は１００％である(可溶化後の回収率と同じ)。再折りたたみ後の回収率は全て１００％より低く、分散は可溶化後の回収率ほど大きくなかった。これは、ＩＢ.ＳＯＬおよびＲＥＦ.ｅｎｄサンプル中のタンパク質濃度の概算がＩＢ.ＲＥＳサンプルよりも精度が高いことを示す。しかしながら、回収率の計算は、主として、可溶化実験および再折りたたみ実験の対照として役立つ。
【０１１５】
８Ｍ尿素または６Ｍ ＧｕＨＣｌを可溶化剤として用いた場合の可溶化溶液ＩＢ.ＳＯＬおよびＩＢ懸濁液ＩＢ.ＲＥＳに関する再折りたたみ収率を図４に示す。
【０１１６】
回収率は、おそらくサンプリング前の均質性が不十分なために、特にＩＢ.ＳＯＬおよびＩＢ.ＲＥＳサンプルで、タンパク質濃度の測定に伴う問題を反映して４４％から２３０％まで様々である。
【０１１７】
尿素可溶化後のＲＥＦ.ＥＮＤサンプル中の濃度は、平均倍率で１.２倍高いが、ＧｕＨＣｌ可溶化後のＲＥＦ.ＥＮＤ中の濃度に匹敵した(表６および７参照)。よって、希釈は一貫していた。
【０１１８】
実施例６ 可溶化時間
ＮＬＳを用いた場合の可溶化時間を全ての突然変異体について試験した。溶液が透明になり始めるまでの時間とそれ以上の透明化が見られなくなるまでの時間を記録し、図５に示す。
２％ＮＬＳを用いるのに対し、尿素＋／−ＤＴＴおよびＧｕＨＣｌ＋／−ＤＴＴによる可溶化は２〜３倍速かった。
【０１１９】
システインの数と透明化が始まるのに要した時間との間には相関が見られた。突然変異体１３４(システイン５個)を除き、４個のシステイン残基を有する突然変異体は５個のシステイン残基を有する突然変異体よりも速く可溶化した。図６は、透明化の開始［分］が、Ｎ末端における重鎖または軽鎖フラグメントのアライメント、リンカーエレメントおよびシステイン残基の数、の３つのカテゴリーに対してプロットされている変数チャートを示す。図６の１で示されたＭｙｃ １３４を除き、システイン４個のカテゴリーのデータ点は、システイン５個のカテゴリーのデータ点に比べて、早い可溶化開始時間に分散している。
【０１２０】
回帰モデル(Ｍｙｃ １３４を除いてＲ２＝０.７２)では、５個ではなく４個のシステインを有するMycograb構築物では、可溶化の開始が２０分から１１.３分に短縮されることを予測した(モデルは示されていない)。
【０１２１】
実施例７ ＲＰＣ ２−ＮＬＳ再折りたたみ
Ｂｉｏｍｅｖａ適合プロセス(実施例４に記載)に従って可溶化および再折りたたみされたMycograb ＲＥＦ.ＥＮＤサンプル突然変異体をＲＰＣ ２により分析した。
【０１２２】
野生型(ＭＹＣ １２３)を含む全ての試験した突然変異体からのＲＥＦ.ＥＮＤサンプルを重ね合わせたものを図７および図８に示す。最初に突然変異体Ｍｙｃ １１６をｌａｂ ＤＳＰ−ＤＥＶ １でスクリーニングし、比較のためにこの重ね合わせに含めた。
【０１２３】
図７では、ベンチスケールで単離されたＩＢから作成されたＲＥＦ.ＥＮＤサンプルのクロマトグラムを、図８では、パイロットプラントにおいてより大規模に単離されたＩＢから作成されたＲＥＦ.ＥＮＤサンプルのクロマトグラムを示す。
【０１２４】
溶出プロフィールを、
１. ピーク１保持時間(疎水性を反映)、
２. ピーク１の形状(ピークが鋭い場合には、二量体の存在および単量体の均質性を反映)
３. 凝集塊／不純物ピーク(ピーク２)に対する単量体／二量体ピーク(ピーク１)の面積比(凝集塊／不純物含量を反映)
【０１２５】
保持時間ピーク１(疎水性を反映)
試験した突然変異体の単量体／二量体ピークの保持時間を表８に示す。
【表９】
【０１２６】
保持時間は分子構築物によって大きく異なる。予測通り、保持時間(疎水性を反映)がリンカー長とともに長くなるという傾向はない。１つのリンカーエレメントは４つのグリシンと１つのセリン残基からなる。グリシンは、親水性であるセリンとは対照的に疎水性である。しかしながら、リンカー中のグリシン含量は４倍高いので、ＲＰＣ２において保持時間により測定して、疎水性は有意に高まらないと思われる。
【０１２７】
Ｍｙｃ １３０の保持時間は、残りの突然変異体よりも短い。１０個のアミノ酸がより親水性の高い(セリン５個)性質のアミノ酸で置換されたことから、分子の疎水性が低下し、その結果、保持時間は短くなる。このデータ点を統計分析から除くと、ＶＬの配向がＮ末端である場合に、配向がＣ末端である場合に比べて保持時間に有意な違いを示すモデルが得られる。ＶＬエレメントがＮ末端に位置する場合、それがＣ末端に位置する場合に比べて保持時間が０.４１分増す。図９は、このモデルのスケール化評価値と予測プロファイラーを、因子としてのシステインの数、リンカー長および鎖フラグメントの配向と応答としての保持時間ともに示す。
【０１２８】
このモデルからはＭｙｃ １３０の保持時間が除かれていることに注意すべきである。図１０に示されているリンカー長に対する保持時間のプロットは、この構築物の保持時間が、上述のようにより親水性の高い性質をもたらす点突然変異のために、残りの突然変異体と比べて短いことを示す。
【０１２９】
ピーク１の形状
ショルダーが無いか、またはわずかしか無い鋭いピーク１は単量体Mycograbの均質性を反映する。ピークの形状は、全ての突然変異体からのＲＥＦ.ＥｎｄサンプルのＲＰＣ ２クロマトグラムの重ね合わせにより評価し、突然変異体Ｍｙｃ １３７、Ｍｙｃ １３８およびＭｙｃ １３９に関して最も鋭いピークを決定した。ピーク１は野生型Ｍｙｃ １２３よりも鋭く、ピーク１と２はほとんどベースラインで分離した。これは、これらの構築物が野生型より均質性の高い単量体／二量体タンパク質を発現することを示し得る。
【０１３０】
単量体／二量体ピークの面積比
図７(Ｍｙｃ １２３ ｗｔ)に示される通り、Ｍｙｃ １１６およびＭＹＣ１２３についての単量体／二量体に関する不純物／凝集塊含量が最も低かった。しかしながら、これらの２つのサンプルの分析は、別の研究室により３か月早く行われ、ピーク２の増加は経時的に顕著になった。試験した突然変異体のＲＥＦ.Ｅｎｄサンプルと同じ月に調製および分析されたＭｙｃ １２３からのＲＥＦ.Ｅｎｄサンプルのクロマトグラムを図８に示す。図７に示されているＭＹＣ １２３のクロマトグラムと図８に示されているものとの比較から、サンプル調製と分析法が厳密に再現性があるわけではないという結論に至る。
【０１３１】
凝集塊ピークに対する単量体／二量体ピークの面積比は、ピーク１を同じピーク極大に対して標準化することにより求めた。標準化後のピーク２のピーク面積は、視覚により面積評価を用い、大きさの増加に従ってランク付けした。標準化した概要を図１１に示す。
【０１３２】
次のランク付けを確立した：Ｍｙｃ １１６、Ｍｙｃ １３９、Ｍｙｃ １３６＜Ｍｙｃ １１９、Ｍｙｃ １２、Ｍｙｃ１４０＜Ｍｙｃ１３７、Ｍｙｃ １３５、Ｍｙｃ１３８＜Ｍｙｃ １０６＜Ｍｙｃ １３０＜Ｍｙｃ １３４＜Ｍｙｃ１１８＜Ｍｙｃ１３３。
【０１３３】
突然変異体Ｍｙｃ １０６、１３４、１３６〜１３９のＩＢから作成したＲＥＦ.ＥｎｄサンプルのＲＰＣ ２クロマトグラムをパイロットプラントで処理したところ、ベンチスケールで単離された突然変異体Ｍｙｃ １１８〜１３５のＩＢよりも低い不純物／凝集塊ピークを示した(図８参照)。
【０１３４】
実施例８ ＲＰＣ ２尿素／ＧｕＨＣｌ再折りたたみ
突然変異体Ｍｙｃ １１８、１１９、１３０およびＭｙｃ １３３を７.６Ｍ尿素＋／−ＤＴＴおよび５.６Ｍ ＧｕＨＣｌ＋／−ＤＴＴを用いて溶解させ、再折りたたみバッファーで希釈することにより再折りたたみを開始させた。
【０１３５】
ＲＥＦ.Ｅｎｄサンプルは全て、ＲＰＣ ２において単量体／二量体ピーク(ピーク１)を示さなかった。凝集塊および不純物であると思われる大きなピーク２が優勢である。突然変異体Ｍｙｃ １１９からの再折りたたみ終了サンプルの代表的なＲＰ ＨＰＬＣクロマトグラムを図１２に示す。このサンプルは実施例４に記載の通り調製した。
【０１３６】
単量体はおよそ１０.５分に溶出すると予測された。それより早く溶出するピークは同定されず、０.５％ＮＬＳでの再折りたたみでは見られなかった。大きなピーク２は強い凝集を示す。尿素／ＧｕＨＣｌ可溶化後の全てのＲＥＦ.Ｅｎｄサンプルで、同様の溶出プロフィールが得られた。
【０１３７】
２０ｍＭ Ｔｒｉｓ／塩基、０.５Ｍ Ｌ−アルギニンおよび２ｍＭ シスチンを含有するバッファーｐＨ９.０で１：１０希釈することにより再折りたたみを行った場合にも同様の溶出プロフィールが得られた。代表的なクロマトグラムを図１３に示す。
【０１３８】
この強い凝集傾向を非還元条件下でのＳＤＳ−Ｐａｇｅにより確認し、ＲＥＦ.Ｅｎｄサンプルでは大きな強いＨＭＷスミア(smear)が検出され、尿素可溶化後、目に見える単量体バンドは無かった。その後、このスミアは、サンプルが還元され、単量体Mycograbバンドが現れた際に消失した。図１４では、尿素可溶化後の還元および非還元ＲＥＦ.ＥｎｄサンプルのＳＤＳ Ｐａｇｅ分析を示す。レーン４〜７は、非還元条件下、２種類の異なる濃度でのＭＹＣ １１９のＲＥＦ.ＩＭサンプルとＲＥＦ.Ｅｎｄサンプルを示す。レーン１０〜１３は、還元条件下での同じサンプルを示す。この凝集塊スミアは、このサンプルが還元され、単量体ならびに二量体バンドは目に見えるようになった際に消失した。
【０１３９】
尿素およびＧｕＨＣｌは、タンパク質の凝集を避けることができない低濃度(尿素では、１：５０希釈の場合０.１４Ｍ、１：１０希釈の場合０.７２Ｍ；ＧｕＨＣｌでは、１：５０希釈の場合０.１１Ｍ、１：１０希釈の場合０.５６Ｍであった)で再折りたたみ溶液中に存在した。図１２に示される通り、ＤＴＴの使用は、比較可能であると見られるＤＴＴを用いても用いなくても、ＲＰ−ＨＰＬＣクロマトグラム(ＲＰＣ ２)として凝集に有意な影響を及ぼすとは思われない。
【０１４０】
ＲＥＦ.Ｅｎｄサンプルとは対照的に、尿素で溶解させたＩＢ.ＳＯＬサンプルのＲＰＣ ２クロマトグラムは、２％ＮＬＳに溶解させたＩＢ.ＳＯＬサンプルと、ピーク形状に関して比較可能であった。図１５はＨＰＬＣクロマトグラムの重ね合わせを示す。
【０１４１】
非還元ＩＢ.ＳＯＬサンプルのＳＤＳ−Ｐａｇｅ分析は、サンプルを尿素で溶解させたとき、２％ＮＬＳに溶解させたＩＢ.ＳＯＬサンプルの場合よりも強いＨＭＷバンドを示した。これは図１４に示され、レーン３では、サンプルは尿素で可溶化し、レーン８では、サンプルは２％ＮＬＳで可溶化した。ＩＢ.ＳＯＬサンプルのクロマトグラムのピーク２の重ね合わせはＮＬＳ中よりも尿素中の方がいっそう小さいので、ＲＰ−ＨＰＬＣのピーク２からは凝集塊含量についての示唆が得られないと結論付けることができる。
【０１４２】
その後の再折りたたみでは単量体ピークは得られず、タンパク質は完全に凝集する。
【０１４３】
実施例９ 還元および非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ
還元および非還元ＳＤＳ−Ｐａｇｅを行い、ＲＥＦ.Ｅｎｄサンプル中の不純物および凝集塊含量を求めた。還元ＳＤＳ−Ｐａｇｅを用いた場合、Mycograb種は単量体および二量体バンドを現し、サンプル中の宿主細胞不純物含量は、非還元ＳＤＳ−Ｐａｇｅゲルと比べた場合、凝集種から識別可能であった。非還元ＳＤＳ Ｐａｇｅは、単量体、二量体および凝集塊を示した。非還元ＳＤＳ−Ｐａｇｅの銀染色ゲルを還元ＳＤＳ−Ｐａｇｅ分析と比較すると、凝集種の量が半定量的に評価することができた。全ての試験した突然変異体のＲＥＦ.ＥＮＤサンプルの還元および非還元ＳＤＳ−Ｐａｇｅを図１６および図１７に示す。
【０１４４】
図１６の左側のゲルは、突然変異体ＭＹＣ １１８、１１９、１３０、１３３、１３４、１３５、１３７からのＲＥＦ.Ｅｎｄサンプルの還元ＳＤＳ−Ｐａｇｅを示す。３０ｋＤａのバンドは単量体Mycograbであり、これは全サンプルで優勢であった。この単量体バンドの移動によれば、突然変異体ＭＹＣ １３４で発現されたMycograbはこのゲルで分析された他の突然変異体よりも大きな分子量を有するものと予測された。程度は低いが、同様のことがＭＹＣ １３５でも検出された。表９によれば、ＭＹＣ １３４は図１６に示されている突然変異体の中で最も大きな理論的分子量を有し、ＭＹＣ １３５がこれに次いだ。
【０１４５】
非還元ＳＤＳ−Ｐａｇｅゲルでは、凝集種ならびに二量体が確認された。レーン１３(ＭＹＣ １３４)および１５(ＭＹＣ １３７)では、ＨＭＷバンドが他のレーンの場合よりも弱い。これは最も低い凝集種含量を示すが、この単量体のバンドもより弱い。
【０１４６】
図１６に示されているＭｙｃ １３３を除いた全ての突然変異体で、互いに比較した際に移動時間と強度の異なる二本のバンドが見られた。これらのバンドの同定は難しかったが、これは天然様構造のMycograb単量体であったと推測された。
【０１４７】
図１７は、突然変異体ＭＹＣ １０６、１３６、１３８、１３９、１４０および野生型ＭＹＣ １２３のＲＥＦ.Ｅｎｄサンプルの還元および非還元ＳＤＳ Ｐａｇｅを示す。異なる構築物のＭＷの違いは単量体バンドの移動の違いによって同定できた。レーン５および７のバンドは、レーン２、３、６および表９に挙げられている理論的ＭＷと一致する４のバンドよりもやや小さいＭＷで現れた。
【０１４８】
ゲルに適用されたタンパク質の質量は一貫しておらず、ＲＥＦ.Ｅｎｄサンプル中の濃度測定は精度が十分でなかったために単量体バンドの強度は様々であった。よって、不純物含量の半定量的分析は不可能であった。しかしながら、単量体バンドの濃さがＭｙｃ １４０の一つと同等であるが、他のバンドの強度が幾分高いため、Ｍｙｃ １０６のＲＥＦ.ｅｎｄサンプルの不純物含量がさらに高いことは明らかであった。
【０１４９】
ＳＤＳ−Ｐａｇｅ分析は、Ｍｙｃ １０６ ｏｒｉｇａｍｉのＲＥＦ.Ｅｎｄサンプルがより高いＨＣＰおよび生成物関連の不純物を含有していることを示した。しかしながら、これはＲＰＣ２分析法によっては確認されず、ピーク２の面積は他の突然変異体と同じ範囲であった。
【０１５０】
実施例１０ ＳＥＣ ０.５％ＮＬＳ：ＲＥＦ.ＲＮＤサンプルにおけるMycograb種の分子量の測定
適合されたＢｉｏｍｅｖａ法(実施例４参照)に従って調製された全ＲＥＦ.ＥＮＤサンプルを０.５％ＮＬＳ中、ＳＥＣ−ＨＰＬＣで分析し、平均分子量を求めた。ＳＥＣクロマトグラムの重ね合わせを図１８および図１９に示す。
【０１５１】
平均分子量は４８.６ｋＤａ〜６５.８ｋＤａの範囲であった。ピークの幅の広さはサンプルの種の不均質性を反映する。ＲＥＦ.Ｅｎｄサンプルにおいて生成物のおよそ８０％が単量体であったが、二量体およびさらにＭＷの大きな種、ならびに非生成物関連の不純物が存在しており、その結果、幅広の溶出ピークとなった。
【０１５２】
図１８では、Ｍｙｃ １３０の溶出プロフィールは、他の試験したサンプルと比較して前に来ていたために目立った。これは、構築物の性質(親水性が高い)によるサンプルの高い不均質性のため、または偶発的にサンプルの処理が異なったためである可能性があった。
【０１５３】
図１８に示されているサンプルは同時に調製し、分析まで４℃で５日間保存した。図１９に示されているサンプルも同時に調製し、４℃で分析まで一晩保存した。これらの構築物のＭＷは同様の範囲内であったので、サンプルは４℃で安定であるものと思われた。
【０１５４】
Ｍｙｃ １３０が前に来ていたのは、他の検討サンプルと比較して凝集種の量が多いためである可能性がある。しかしながら、対応するＲＰＣ ２クロマトグラムのピーク２は目立って大きいものではないが、ＳＥＣ ０.５％ＮＬＳにより測定された高い分子量とＲＰＣ２で測定された大きなピーク２のピーク面積の間にはときどき相関があるだけであることが認められた。
【０１５５】
さらに、Ｍｙｃ １３０のＳＤＳ−ｐａｇｅは、サンプルのより高い不純物含量および不均質性の増加は示さなかった。カラムの過負荷および分析中の温度の上昇などのＳＥＣの前進をもたらす他の要因は、全サンプルを同じ日に分析したので除外可能である。
ＲＰＣ２においてＭｙｃ １３０では保持時間が極めて短かった。
【０１５６】
ＲＥＦ.Ｅｎｄサンプルの平均ＭＷは二量体、凝集塊および不純物の量が増すにつれ大きくなった。種々の突然変異体で発現された単量体Mycograbの計算ＭＷは、異なるリンカー長および他の突然変異のために２６〜２７ｋＤａの間であった。アミノ酸から計算された理論ＭＷ、ＳＥＣにより決定されたＲＥＦ.ＥｎｄサンプルのＭＷ、アミノ酸の数、リンカー長、およびシステインの数を挙げた表が表９に示されている。
【表１０】
【０１５７】
理論的ＭＷを、ＳＥＣにより決定されたＭＷに対してプロットし、Ｍｙｃ １３０のデータ点を除いた際の相関係数０.７７を有する直線関係を見出した。
【０１５８】
図２０の下の破線の右側に点で現される突然変異体Ｍｙｃ １０６、Ｍｙｃ １３８およびＭｙｃ １３５は、野生型よりも小さな平均ＭＷを有していた。上の破線の左側に点で現される突然変異体Ｍｙｃ １３３、１３６および１３９は、野生型よりも大きな平均ＭＷを有していた。しかしながら、アッセイの変動性は考慮しなければならない。さらに、図１９から、注入されるタンパク質の量はいくつかのサンプルでピーク面積と常に同じとは限らなかった。共有結合的凝集塊の形成は、５つのシステインを有するMycograbに比べて４つのシステインを有する突然変異体では、分子間ＳＳ端の形成後に、４つのシステインを有する突然変異体の遊離のシステインに使用可能なものはないので、低下するはずである。システインを４つだけ有する突然変異体であっても再折りたたみの際に分子間共有結合的凝集塊が形成されるが、おそらくその量は５つのシステインを有する突然変異体でよりも少ない。
【０１５９】
実施例１１ ＳＥＣ形成：凝集傾向を評価するための再折りたたみ溶液からのＵＦ／ＤＦによるＮＬＳ除去
Mycograb突然変異体の凝集傾向を評価するため、ＮＬＳ濃度は、攪拌細胞を用いた限外濾過／ダイアフィルトレーションによるＲＥＦ.Ｅｎｄ溶液より平均５分の１だけ低下した。ダイアフィルトレーションの際に用いた全バッファー量を保持液量で割ったものがダイアファクターであり、２.５であった。
【０１６０】
この実験の原理は、溶解剤ＮＬＳが、凝集がそれ以上回避できない濃度まで低下される際の突然変異体の凝集傾向を調べることであった。
【０１６１】
凝集塊の形成はＳＥＣ−ＨＰＬＣ方式で評価可能であると予想された。溶出バッファーは０.５Ｍ尿素バッファーを含んだが、ＮＬＳは凝集を抑制しなかった。
分子量の増加を凝集傾向の指標として用いたところ、突然変異体の比較が可能であった。
【０１６２】
第一の実験セットに関して突然変異体Ｍｙｃ １３７、Ｍｙｃ １０６、Ｍｙｃ １１９および野生型Ｍｙｃ １２３を選択した。表１０は、ＵＦＤＦ前後のフォーミュレーションバッファーにてＳＥＣ−ＨＰＬＣ実施により測定された分子量(ＭＷ)(ｋＤａ)と突然変異体ＭＹＣ １１９、１３７、１０６およびＭＹＣ １２３からのＲＥＦ.ＥｎｄサンプルのＲＰ−ＨＰＬＣにより測定されたＮＬＳ濃度(％)を示す。ＮＬＳ低下倍率は、ＵＦＤＦ前のサンプルのＮＬＳ濃度(＃２)をＵＦＤＦ後のＮＬＳ濃度(＃３)で割ることで計算した。ＳＥＣ ＨＰＬＣ ０.５％ＮＬＳに基づくＭＷ増加率％は、それぞれの突然変異体で、ＲＥＦ.ＥＮＤサンプル(＃１)のＭＷとＵＦＤＦ後のＭＷ(＃３)から計算した。
【表１１】
＊分子量は、流れるバッファー中に０.％ＮＬＳを含有する分析的ＳＥＣ ＨＰＬＣ法(ＳＥＣ ＨＰＬＣ ０.５％ ＮＬＳ)で測定した。
＊＊表９からのデータ
【０１６３】
ＵＦＤＦ前のサンプルのＳＥＣ ＨＰＬＣ(フォーミュレーションバッファーで流す)により測定された見掛けの高分子量は、分析中のタンパク質の凝集によるものであった。
【０１６４】
ＵＦＤＦ前のサンプルはなお０.５％ＮＬＳを含んでいた。サンプルがカラムを移動するにつれ、ＮＬＳはこのタンパク質よりも強く保持されるようになり、結果として凝集が起こった。よって、この分析法は、ＮＬＳを含有するサンプルの分子量の決定に適していなかった。
【０１６５】
ＲＥＦ.Ｅｎｄサンプル中のMycograbの分子量を測定するためには、流れるバッファー中０.５％ＮＬＳを用いたＳＥＣ ＨＰＬＣを使用した。ＵＦＤＦによりＲＥＦ.Ｅｎｄサンプル中のＮＬＳを除去した後のＭＷの増加は、表１０に関して上記の通り計算した。値は表１０の６行目に示されている。ＭＹＣ １２３は最小のＭＷ増加を示し、ＭＹＣ １１９は４００％という最大の増加を示した。
【０１６６】
これらのデータに基づけば、ＭＹＣ １２３はＭＹＣ １１９より凝集傾向が小さい。しかしながら、分析的ＳＥＣ ＨＰＬＣはタンパク質構造と凝集塊の形成に影響を及ぼし得ると考えなければならない。さらに、ＭＷの増加は２つの異なる分析法から得られたデータから計算され、サンプルのＭＷは、２つの方法で決定される場合に同じであるかどうかは評価することはできない。
【０１６７】
表１１では、突然変異体を、突然変異と共にＮＬＳ除去後のＭＷの増加に従ってランク付けした。３×リンカーエレメントを有する２つの突然変異体が、４×リンカーエレメントを有する突然変異体に比べて有意に低いＭＷ増加率％を有することは、注意すべきである。
【表１２】
【０１６８】
図２１は、ＵＦＤＦ前と各容量再構成後のサンプルから得られたＳＥＣ ＨＰＬＣクロマトグラムの重ね合わせを示す。溶出ピークの形状は、ＮＬＳ濃度の低下によって有意に変化しなかった。結論として、サンプルのＭＷもＮＬＳが少なくなっても一定のままであった。これは、それ未満では凝集が誘発されるがそれ以上進行しない界面活性剤の濃度下限界があることを示唆し得る。しかしながら、サンプルのＭＷに対する分析法の影響は分かっておらず、それはなぜ全てのサンプルが類似のＭＷを有するかという理由であるかもしれない。
【０１６９】
ＮＬＳ濃度は、２.５のダイアボリュームに相当する５倍量再構成の後、平均(ｎ＝５)０.１２４％の濃度まで低下した。理論上、ＮＬＳのＲ＝０では、計算された残留ＮＬＳ濃度は０.０２０％であるはずである。理論的に残留するＮＬＳ濃度の計算には式３を用いた。
【数３】
式中、ｃｒｅｔｅｎｔａｔは保持液のＮＬＳ濃度であり、ｃｆｅｅｄは供給溶液のＮＬＳ濃度である。Ｒは保持物、すなわち、膜によって保持される溶質の画分である。ＶＣＦは、容量濃縮倍率であり、Ｎは、ダイアフィルトレーションの際に操作に導入された全バッファー量である２倍容量を保持液量で割ったものである。
【０１７０】
保持物中のＮＬＳの理論濃度と測定濃度の間の矛盾は、膜によるＮＬＳの保持が０より大きいということを示す。これはＮＬＳとタンパク質、膜および／またはその他の成分の間の相互作用によるものであり得る。変形する能力も望ましくない保持をもたらし得る。
【０１７１】
実施例１２ Ｐｅｐ−Ｍａｐ分析
全突然変異体のＲＥＦ.Ｅｎｄサンプルを、ペプチドマップを用いてジスルフィド架橋に関して分析した。分析前に、サンプルをヨードアセトアミドでアルキル化し、トリプシンで消化し、ＬＣ−ＭＳを行った。単一ペプチドのＵＶピークを、質量分析を用いて同定した。遊離のＳＨ基を有するペプチドは適切、また不適切にＳ−Ｓ結合を形成するとともに、二量体ペプチドは、可能であればいつでも半定量的に測定した。
【０１７２】
５つのシステインを有する適切に折りたたまされた構築物は、それぞれＴ３およびＴ９に相当するＣｙｓ ２３およびＣｙｓ ９７の間でＳ−Ｓ結合を形成する。このＴ３−Ｔ９結合は軽鎖に存在する。他のジスルフィド結合は、Ｔ１２およびＴ１７に相当する重鎖のＣｙｓ １５９とＣｙｓ ２２４の間にある。５番目のシステインはＣｙｓ２８上にあり、Ｔ４ペプチドに相当する。
【０１７３】
４つのシステインを有する構築物は常にＣｙｓ ２８残基を欠き、適切なＳ−Ｓ橋は５つのシステインを有する構築物の場合と同様である。
【０１７４】
突然変異体１１８、１１９、１３０、１３５、１３３、１３４、１３７およびＣ２８Ｙ＋ＨＩＳ(１０６)ならびにＣ２８Ｙ−ＨＩＳ(１０８)をｌａｂ ＡＬ１で分析した。突然変異体１０６ ｏｒｉｇａｍｉ、１３６、１３８、１３９、１４０および野生型１２３は、異なるデバイスを用いて分析的ｌａｂ ＡＬ２で分析した。ＡＬ１の質量分析計の感度はＡＬ２の場合よりも大きく、従って、ＡＬ２で分析された突然変異体の半定量的分析は得ることができなかった。しかしながら、適切に形成されたＳ−Ｓ橋が存在するかどうかは決定することができた。
【０１７５】
得られたデータのまとめを表１２に示す。これらの結果は、ＳＨ、架橋システインおよび二量体システインの３つのカテゴリーからなる。遊離システインは、ジスルフィド結合を形成しなかったＳＨ基を示す。架橋システインは分子内ジスルフィド結合であり、二量体システインは分子間ジスルフィドを表す。Ｗは個々のペプチドの弱いシグナルが検出されたことを示し、Ｘは強いシグナルを与えるペプチドを表す。ＡＬ ２で分析した突然変異体に＊を付す。
【表１３】
【０１７６】
「適切に」折りたたまれた、５つのシステインを有するMycograbは、Ｔ４ペプチドにおける遊離ＳＨの有意なシグナルを与えるはずである。さらに、適切なジスルフィドＴ３−Ｔ９およびＴ１２−Ｔ１７の強いシグナルが予測され、不適切なＳＳ結合は存在しないはずである。最後に、分子間ＳＳ結合も存在しないはずである。
【０１７７】
「適切に」折りたたまれた、４つのシステインを有するMycograbは、遊離ＳＨ基を含まないはずである。適切なＳ−Ｓ結合Ｔ３−Ｔ９およびＴ１２−Ｔ１７だけが検出されるはずである。さらに、分子間ＳＳ結合は存在しないはずである。
【０１７８】
表１２は、野生型もいずれの突然変異体も適切なＳ−Ｓ結合の強いシグナルだけを示すわけではなかった。ＲＥＦ.Ｅｎｄサンプルは様々な折りたたみで、共有結合的に凝集した集団からなり、従って、ジスルフィド結合と遊離ＳＨ基の、全ての可能な組合せの混合物が存在すると考えるべきである。しかしながら、有望な突然変異体は、ＭＹＣ １３７に場合である適切なＳ−Ｓ橋と突然変異体Ｃ２８Ｙ＋ＨＩＳおよびＣ２８Ｙ−ＨＩＳの双方の有意なシグナルを少なくとも示すはずである。
【０１７９】
５例では、不適切なＳ−Ｓ結合のみが見られ、適切なジスルフィド結合に対するシグナルは得られないか、または弱いものに過ぎなかった。
【０１８０】
ＭＹＣ １２３、ＭＹＣ １３８、ＭＹＣ １３９およびＭＹＣ １４０のシグナルは極めて弱く、これらのサンプルを再分析しても高いシグナルは得られなかった。Mycograb特異的ペプチドが見られたが、システイン含有ペプチドはシグナルを生じなかったか、または弱いシグナルしか生じなかった。これは、切断部位が構造的に遮断されているためにトリプシンによるタンパク質の個々の部分に消化が不十分であることによる可能性がある。また、リンカー長が長い(３×に対して５×および６×)突然変異体ほど消化しにくくなり、結果として、溶出の遅いペプチドのシグナルは検出できないか、または検出するのが困難になるということも注意すべきである。
【０１８１】
興味深いことに、共有結合的ジスルフィドは、１つの例外があるが、Ｃｙｓ ９７残基に相当する２つのＴ９ペプチド間でのみ形成された。
【０１８２】
突然変異体Ｍｙｃ １１８、１１９、１３０、１３３、１３７ならびに突然変異体Ｃ２８Ｙ＋ＨＩＳおよびＣ２８Ｙ−ＨＩＳは、野生型よりも適切なＳ−Ｓ結合に対して強いシグナルを生じた。しかしながら、Ｍｙｃ １２３は感度の低い違う質量分析計で分析されたので、シグナル強度は比較できないと考えるべきである。Ｍｙｃ １２３のペプチドからのシグナルは、突然変異体１０６ ｏｒｉｇａｍｉ、１３６、１３８、１３９および１４０からのシグナルと比較可能である。これらの構築物の中に適切なジスルフィド橋が得られたものはなかった。不適切ジスルフィドのシグナルのみが見られた。
【０１８３】
Ｍｙｃ １３７、Ｍｙｃ Ｃ２８Ｙ＋ＨＩＳおよびＭｙｃ Ｃ２８Ｙ−ＨＩＳのＰｅｐマップ結果が、適切な両ジスルフィド橋の有意なシグナルを伴い、最も有望であった。突然変異体Ｍｙｃ １１８、Ｍｙｃ １１９およびＭｙｃ １３３もまた、ジスルフィド橋様の一定量の天然型を示したが、Ｔ１２−Ｔ１７のシグナルは弱かった。
【０１８４】
突然変異体Ｍｙｃ １３０はＴ１２−Ｔ１７ ＳＳ結合の強いシグナルを示したが、第二の適切なジスルフィドは見られなかった。
【０１８５】
結論
分析結果の相関
Ｐｏｒｏｓカラム(ＲＰＣ１)を用いた力価アッセイによって測定して、再折りたたみ後の最良の回収率はＭＹＣ １２３(ｗｔ)およびＭＹＣ １３４で得られた。
【０１８６】
カオトロピック剤によるＩＢの可溶化はＮＬＳによる可溶化よりも速かった。尿素またはＮＬＳで可溶化したＩＢのＲＰＣ ２クロマトグラムを比較した。しかしながら、ＳＤＳ Ｐａｇｅは、尿素で可溶化されたＩＢに比べて凝集塊スミアが減ったことから、ＮＬＳの強い溶解力を示した(図１４参照)。
【０１８７】
カオトロピック剤による可溶化後の希釈およびシステイン、Ｌ−アルギニン、１％ＮＬＳおよび低濃度の尿素／ＧｕＨＣｌなどの種々の添加剤の使用による再折りたたみはＲＰＣ ２において単量体ピークを示さなかった(図１２および図１３参照)。ＳＤＳ Ｐａｇｅ、非還元およびＲＰＣ ２クロマトグラムにより確認された完全に凝集したタンパク質は大きなピーク２を示した。
【０１８８】
ＳＥＣ ＨＰＬＣ ０.５％ＮＬＳによるＭＷの測定は、１つの外れ値を除いたとき、理論的に計算されたＭＷとＲ２ ０.７７で相関していた。ＳＤＳ ＰＡＧＥの解像度はＭＷの微妙な違いを全て検出するには不十分であったが、理論的には０.６ｋＤａ、ｋＳＥＣ ＨＰＬＣ(それぞれＭＹＣ １３４およびＭＹＣ １１８)で測定する場合は１４ｋＤａ異なるＭＷの２つの突然変異体の間で移動時間の違いが見られた。
【０１８９】
ＲＰＣ ２クロマトグラフィーは、１０個の疎水性アミノ酸がより親水性の高いもので置換された突然変異体(ＭＹＣ １３０)の疎水性の低下を確認することができた。このリンカーエレメントは固定相の結合部位には容易に接近することができないので、保持挙動には影響を及ぼさなかった。また、リンカー長の長い構築物のＰｅｐマップ分析では、リンカー長の短い構築物に比べて対象ペプチドに対して弱いシグナルしか得られないことも認められた。リンカーエレメントは消化酵素には容易には接近できないことが明らかであった。
【０１９０】
ＭＹＣ １３７、１３８および１３９のＲＰＣ２クロマトグラムは、他の試験した突然変異体に比べてMycograb単量体に当たる最も鋭いピークを示し、このサンプルの高い均質性を示唆した。
【０１９１】
Ｐｅｐマップ分析は、４つのシステインを有する突然変異体のＲＥＦ.Ｅｎｄサンプルには遊離ＳＨ基がほとんど存在しないことを示した。これは、ジスルフィド橋(不適切なものおよび適切なもの)のほぼ完全な形成ならびに共有結合的凝集塊の形成を示す。５つのシステインを有する突然変異体では、種々の遊離ＳＨ基に関して弱いシグナルが得られたが、突然変異体Ｍｙｃ １１８、Ｍｙｃ １１９およびＭｙｃ １３３だけは、「天然」単量体においては依然として還元されているはずの５番目のシステインの位置、すなわちＴ４に遊離ＳＨ基を有していた。このことは、５つのシステインを有する突然変異体は全て遊離ＳＨ基のシグナルを生じるが、そのうち３つだけで、遊離ＳＨ基が検出されたことから、Ｔ４ペプチド上のＳＨ基はＳＳ結合を好ましく形成するということを示す。
【０１９２】
ＳＥＣ ＨＰＬＣによって測定されたＭＷは、サンプル中のバッファーマトリックスに極めて依存的である。ＳＥＣ ＨＰＬＣ法の組合せはサンプルのバッファーと同様に流れるバッファーによって確立しなければならなかった。ＭＷのマトリックス依存性は、処理工程間でのＭＷの比較を困難にする(表１０)。
【０１９３】
ＵＦＤＦ実験は、ＮＬＳがある程度、サンプル溶液に保持され、効率的に除去できないことを示した。
【０１９４】
突然変異体ＭＹＣ Ｃ２８Ｙ ＋ＨＩＳ、Ｃ２８Ｙ−ＨＩＳおよびＭＹＣ １３７のＰｅｐマップで得られた結果は特に有望であった。これらの結果は、ＨＩＳタグとシステインを４つだけ有する突然変異体が特に好ましいことを示す。このＨＩＳタグは、効率の高い精製ステップであるＩＭＡＣを用いた精製に必要である。システインを４つだけ有する構築物は適切なジスルフィドとより少ない共有結合的凝集塊を形成する可能性が高い。
【０１９５】
突然変異の効果
突然変異の最も有益な効果は５番目のシステインの除去に起因し得る。適切なジスルフィド結合の数は５つのシステインを有する構築物に比べて増加した。さらに、ＩＢの溶解度も５つのシステインを有する構築物に比べて高まった。
【０１９６】
重鎖フラグメントと軽鎖フラグメントの配向を入れ替えると、ＲＰＣ ２における保持時間に小さな影響があり、ＶＬエレメントがＣ末端にある場合には、Ｎ末端配向の場合に比べて保持時間が短くなった。
【０１９７】
ＮＬＳ除去後のペプチドの凝集傾向は、リンカーエレメントの数とともに高まる可能性がある。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、真菌ストレスタンパク質ｈｓｐ９０と特異的に結合する新規な抗体分子、このようなペプチドをコードする核酸および医薬組成物ならびにその使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
ｈｓｐ９０真菌ストレスタンパク質と結合する抗体フラグメントならびにその治療的使用は、例えばＷＯ０１／７６６２７またはＷＯ０５／１０２３８６に記載されている。Mycograb(登録商標)(Efungumab)としても知られるこの抗体フラグメントは、リンカーペプチドにより連結された免疫グロブリンのＶＨドメインとＶＬドメインを含む融合タンパク質である。このような抗体フラグメントは「一本鎖可変フラグメント」(ｓｃＦｖ)としても知られる。Mycograb(登録商標)は大腸菌(E.coli)での発酵により封入体の形態で産生され、細胞塊から抽出され、再折りたたみされた後、変性条件下でクロマトグラフィー工程により精製される。自然条件下で行われた特徴付け研究では、efungumabタンパク質には多量体または凝集塊(ここでは「多量体」と「凝集塊」は互換的に用いられる)を形成する傾向があることが示された。このような凝集塊、特に高分子量凝集塊は、治療的使用に望ましいものではない可能性がある。よって、治療的使用には、高分子量凝集塊を排除もしくは低減すること、またはこのような凝集塊の大多数に含まれる単量体の数を一定の範囲、例えば１０〜１００個の単量体、例えば１１〜７３個または２６〜５７個の単量体となるように凝集を制御することが望ましい可能性がある。
【発明の概要】
【０００３】
今回、本発明は、例えば折りたたみ特性および／または凝集塊の形成に関して有利な特性を有する、ｈｓｐ９０真菌ストレスタンパク質と結合する、改良されたｓｃＦｖペプチドを提供する。よって、本発明のペプチドは治療的使用に特に有用である。
【０００４】
本発明の第一の局面によれば、アミノ酸スペーサーにより連結されたＶＨドメインとＶＬドメインを含み、該ＶＨドメインが配列番号６４の配列と少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含み、そして該ＶＬドメインが配列番号６６の配列と少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含むｓｃＦｖペプチドが提供され、ここで、該ｓｃＦｖペプチドは：
(ａ)ＶＨドメインのＣ２８、Ｉ２９、Ｈ６８、Ｎ８５、Ｃ９７およびその組合せからなる群から選択されるものに相当する位置におけるアミノ酸置換または欠失；
(ｂ)ＶＬドメインのＶ２、Ｖ３、Ｆ１０、Ｆ１４、Ａ３９、Ｎ７６およびその組合せからなる群から選択されるものに相当する位置におけるアミノ酸置換または欠失；
(ｃ)アミノ酸スペーサーが配列(ＧＧＧＧＳ)ｎ(式中、ｎは４〜６の間である)を含むこと；
(ｄ)ＶＨドメインが、配列番号６８の配列またはそれと少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含むＮ末端ｐｅｌＢシグナル配列をさらに含むこと；
(ｅ)ＶＬドメインが、ＶＨドメインのＮ末端側末端に位置すること；および
(ｆ)特徴(ａ)〜(ｅ)の組合せ
からなる群から選択される付加的特徴を含む。
【０００５】
ＶＨドメインは配列番号６４の配列と少なくとも９０％、９５％、９９％または１００％の同一性を有する配列を含むことが好ましい。また、ＶＬドメインは配列番号６６の配列と少なくとも９０％、９５％、９９％または１００％の同一性を有する配列を含むことも好ましい。付加的特徴は配列同一性のレベルとは無関係に存在すると理解すべきである。例えば、付加的特徴がＣ２８位でのアミノ酸置換であれば、ＶＨドメインが配列番号６４と８０％の配列同一性しかない配列を含む態様であっても、この置換が存在する。
【０００６】
好都合には、ＶＨドメインのアミノ酸置換はＣ２８Ｙ、Ｃ２８Ｓ、Ｉ２９Ｓ、Ｈ６８Ｒ、Ｎ８５Ｓ、Ｃ９７Ｙ、Ｃ９７Ｓおよびその組合せからなる群から選択される。置換Ｃ２８Ｙが特に好ましい。
【０００７】
有利には、ＶＬドメインのアミノ酸置換はＶ２Ｉ、Ｖ３Ｑ、Ｆ１０Ｓ、Ｆ１４Ｓ、Ａ３９Ｋ、Ｎ７６Ｓおよびその組合せからなる群から選択される。
【０００８】
好ましくは、ｓｃＦｖペプチドは、配列番号８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０および６２(配列中、Ｘａａはシステイン以外のアミノ酸残基を表し、Ｎ末端メチオニン残基は所望により切断されていてもよい)からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。Ｘａａはチロシン残基を表すことが好ましい。
【０００９】
一態様では、ＸａａはＴｙｒ(Ｙ)である。別の態様では、ＸａａはＡｌａ(Ａ)、Ｌｅｕ(Ｌ)、Ｉｌｅ(Ｉ)、Ｖａｌ(Ｖ)、Ｐｒｏ(Ｐ)またはＭｅｔ(Ｍ)であり；さらに別の態様では、ＸａａはＰｈｅ(Ｆ)またはＴｒｙ(Ｗ)であり；さらに別の態様では、ＸａａはＧｌｙ(Ｇ)であり；さらに別の態様では、ＸはＳｅｒ(Ｓ)またはＴｈｒ(Ｔ)であり；さらに別の態様では、ＸａａはＧｌｕ(Ｅ)またはＡｓｐ(Ｄ)であり；さらに別の態様では、ＸａａはＧｌｎ(Ｑ)またはＡｓｎ(Ｎ)であり；さらに別の態様では、ＸａａはＡｒｇ(Ｒ)、Ｌｙｓ(Ｋ)またはＨｉｓ(Ｈ)である。
【００１０】
好ましくは、ｓｃＦｖペプチドは、Ｃ末端に精製タグ、より好ましくは、６ヒスチジン残基の配列をさらに含む。
【００１１】
本発明の別の態様によれば、配列番号８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０および６２で示されるアミノ酸配列からなる、または本質的になるｓｃＦｖペプチドが提供され、該ペプチドは、所望により、例えばＨｉｓタグなどの精製タグを含んでもよい(例えば、配列番号１０、２２または３４で示される通り)。
【００１２】
精製タグは一般にその分子の治療効果には寄与せず、従って、本発明のｓｃＦｖフラグメントの精製後に除去可能である。
【００１３】
本発明の別の態様によれば、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０および６２で示されるアミノ酸配列を含むｓｃＦｖペプチドが提供される。一態様では、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０および６２で示されるアミノ酸配列からなる、または本質的になるｓｃＦｖペプチドが提供され、該ペプチドは、所望により、例えばＨｉｓタグなどの精製タグを含んでもよい(例えば、配列番号２、４または２０で示される通り)。
【００１４】
当業者により容易に認識される通り、本発明のペプチドの最初のＭｅｔ残基はまた、大腸菌で発現させる場合には、例えば大腸菌ＭＡＰ(メチオニンアミノペプチダーゼ)によりin vivoで切断され得る。
【００１５】
本発明のｓｃＦｖペプチドは、例えば、アミノ酸配列(ＧＧＧＧＳ)ｎ(配列中、ｎは１〜１２の整数、例えば、１、２、３、４または５である)を有するアミノ酸スペーサー(用語「スペーサー」と「リンカー」は互換的に用いられる)により連結された２つのドメインを含む。ＶＨで示される一方のドメインは、抗体フラグメントの重鎖部分(例えば、配列番号２および配列番号３０で示されるアミノ酸配列のｓｃＦｖフラグメントのアミノ酸残基２〜１２２、または配列番号３２のアミノ酸残基１３２〜１５２に相当)に相当する。ＶＬで示される他方のドメインは、抗体フラグメントの軽鎖部分(例えば、配列番号２のアミノ酸残基１３８〜２４６、または配列番号１２のアミノ酸残基１３８〜２４６、または配列番号３２のアミノ酸残基２〜１１０に相当)に相当する。ＶＨまたはＶＬドメインは本発明のｓｃＦｖペプチドのＮ末端に位置してもよく、すなわち、これらの分子は次のように連結され得る：ＶＨ−リンカー−ＶＬまたはＶＬ−リンカー−ＶＨ。
【００１６】
任意選択のｐｅｌＢシグナル配列は、大腸菌で発現されるとき、該ペプチドの溶解度を高めるために、周辺細胞質膜への該ペプチドの細胞下局在をもたらす。
【００１７】
一態様では、配列番号３０または３２で示されるアミノ酸配列を含むｓｃＦｖフラグメントが提供される。別の態様では、配列番号３０または３２で示されるアミノ酸配列からなる、または実質的になるｓｃＦｖペプチドが提供され、該ペプチドは、所望により、例えばＨｉｓタグなどの精製タグを含んでもよい。
【００１８】
一局面において、本発明は、次の位置：Ｃ２９Ｘ、Ｉ３０Ｘ、Ｈ６９Ｘ、Ｎ８６Ｘ、Ｃ９８Ｘ、Ｖ１３９Ｘ、Ｖ１４０Ｘ、Ｆ１４７Ｘ、Ｆ１５１Ｘ、Ａ１７６Ｘ、Ｎ２１３Ｘ(ここで、Ｘは配列番号２で示されるもの以外のアミノ酸を表す(番号は配列番号２で示される通りであり、他の突然変異体の相当するアミノ酸位置は容易に同定可能である))の１個所以上に少なくとも１個のアミノ酸置換を有する、ＶＨおよびＶＬドメインと本発明のリンカーとを含むｓｃＦｖフラグメント(例えば、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、３０、３２または３４で示される通り)を提供する。好ましい態様において、本発明は、以下のアミノ酸置換：Ｃ２９ＹまたはＣ２９Ｓ、Ｉ３０Ｓ、Ｈ６９Ｒ、Ｎ８６Ｓ、Ｃ９８ＹまたはＣ９８Ｓ、Ｖ１３９Ｉ、Ｖ１４０Ｑ、Ｆ１４７Ｓ、Ｆ１５１Ｓ、Ａ１７６Ｋ、Ｎ２１３Ｓの少なくとも１つを有するｓｃＦｖフラグメントを提供する。この局面に関してのアミノ酸の番号はＮ末端メチオニン残基を含むと認識すべきである。
【００１９】
一態様では、配列番号２４、２６または２８で示されるアミノ酸配列を含むｓｃＦｖフラグメントが提供される。別の態様では、配列番号２４、２６または２８で示されるアミノ酸配列からなる、または本質的になるｓｃＦｖペプチドが提供され、該ペプチドは、所望により、例えばＨｉｓタグなどの精製タグを含んでもよい。
【００２０】
本発明のペプチドは治療薬として有用である。よって、本発明の一局面では、例えば、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０および６２(配列中、Ｘａａは上記の通り定義される)で示されるアミノ酸配列を含む本発明のｓｃＦｖペプチドを、薬学上許容される賦形剤、希釈剤または担体と組み合わせて含む医薬組成物が提供される。好適な賦形剤の詳細は、Remington's Pharmaceutical Sciences and US Pharmacopoeia, 1984, Mack Publishing Company, Easton, PA, USAに示されている。賦形剤の例としては、医薬級(Ｐｈ Ｅｕｒ)尿素およびＬ−アルギニン(Ｐｈ Ｅｕｒ)が挙げられる。例えば、本発明のｓｃＦｖペプチドの典型的な製剤は、１０ｍｇの純粋なｓｃＦｖペプチド、１５０ｍｇの医薬級(Ｐｈ Ｅｕｒ)尿素および１７４ｍｇ Ｌ−アルギニン(Ｐｈ Ｅｕｒ)を５ｍｌの水で再構成したものである。
【００２１】
本発明のｓｃＦｖペプチドまたは医薬組成物は、０.１〜１０ｍｇ／ｋｇ患者体重の範囲の用量で投与することができる。０.５〜５ｍｇ／ｋｇ体重の範囲の用量が好ましく、約１ｍｇ／ｋｇの投与量が特に好ましい。該医薬組成物は経口投与が可能である。
【００２２】
本発明のペプチドは、例えば、ＷＯ０１／７６６２７またはＷＯ０５／１０２３８６(それぞれ出典明示により本明細書の一部とされる)に開示されている通り真菌感染の処置に有用である。例えば、本発明のペプチドは、浸潤性カンジダ症または浸潤性アスペルギルス症または浸潤性髄膜炎などの全身性真菌感染症、例えば、病原性カンジダ属カンジダ・アルビカンス(C. albicans)、カンジダ・トロピカリス(C. tropicalis)およびカンジダ・クルセイ(C. krusei)ならびに低病原性カンジダ・パラプシロシス(C. parapsilosis)およびトルロプシス・グラブラタ(Torulopsis glabrata)の処置に有用である。本発明のペプチドはまた、カンジダ、クリプトコッカス、ヒストプラズマ、アスペルギルス、トルロプシス、ムコール症、ブラストミセス症、コクシジオイデス症、パラコクシジオイデス症の生物体またはマラリアによる感染症の処置にも有用である。よって、本発明は、例えば、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０および６２(配列中、Ｘａａ上記の通り定義される)で示されるアミノ酸配列を含む、有効量の本発明のｓｃＦｖペプチドを患者に投与することを含む、真菌感染患者の処置方法を提供する。Ｎ末端Ｍｅｔは所望により切断されていてもよい。
【００２３】
本発明のペプチドは組合せ療法に特に有用である。よって、別の局面において、本発明は、例えば、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０および６２(Ｎ末端Ｍｅｔは所望により切断されていてもよい)(配列中、Ｘａａは上記の通り定義される)で示されるアミノ酸配列を含む本発明のｓｃＦｖペプチドと、例えば、ポリエン抗真菌剤またはエキノカンディン抗真菌剤またはアゾール抗真菌剤などの抗真菌剤を含む組成物または組合せ製剤を提供する。本発明のｓｃＦｖペプチドの組合せ相手として有用な抗真菌剤の例としては、例えば、アムホテリシンＢ、アムホテリシンＢの誘導体、例えば、ＡｍＢｉｓｏｍｅ、アムホテリシン−Ｂ脂質複合体(Abelcet)、アムホテリシン−Ｂコロイド分散物(Amphocil)およびアムホテリシン−Ｂ脂質内エマルション；ナイスタチン；５−フルオロシトシン；カスポファンギン(caspofungin)、アニジュラファンギン(anidulafungin)、ミカファンギン(micafungin)、ＬＹ３０３３６６；イサブコナゾール、ボリコナゾール、イトラコナゾール、フルコナゾール、ミコナゾール、ケトコナゾール、ポサコナゾール、アニジュラファンギン、ミカファンギン、グリセオフルビン、テルビナフィンなどのアゾール類が挙げられる。このような組合せは一定用量組合せであってもよいが、一般には、ｓｃＦｖペプチドとその組合せ相手は一定用量組合せとしてはパッケージングされない。本発明の組合せ製剤は真菌感染症の処置において同時、個別または逐次使用のためのものであり得る。本発明のペプチドはまた、例えば、アムホテリシンＢと５−フルオロシトシン、ファンギンとアムホテリシンＢまたはエキノカンディンとアゾールなど、１種以上の抗真菌剤と組み合わせて使用してもよい。
【００２４】
別の態様において、本発明は、有効量の、例えば、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０および６２(Ｎ末端Ｍｅｔは所望により切断されていてもよい)(配列中、Ｘａａは上記の通り定義される)で示されるアミノ酸配列を含む本発明のｓｃＦｖペプチドと少なくとも１つの上記抗真菌剤を患者に投与することを含む真菌感染患者の処置方法を提供する。好ましい組合せ相手はアムホテリシンＢまたはアムホテリシンＢの誘導体、カスポファンギン、アニジュラファンギン、ミカファンギン、ボリコナゾール、イトラコナゾールである。これらの組合せ相手は同時、個別または逐次投与することができる。
【００２５】
本発明の一態様では、感染を引き起こす真菌は、本発明のペプチドの抗真菌性組合せ相手に対して耐性であるか、または部分的に耐性がある。
【００２６】
本発明のペプチドはまた、癌、または例えばそれぞれ出典明示により本明細書の一部とされるＷＯ０６／００３３８４またはＷＯ０７／０７７４５４(ＰＣＴ／ＧＢ２００７／００００２９)に開示されている自己免疫疾患または敗血症などのＴＮＦαおよび／またはＩＬ−６のレベルの上昇が関与する症状の処置にも有用である。例えば、本発明のペプチドは、例えば、リンパ性(Iymphoid)(リンパ球性(Iymphocytic))白血病(ＣＬＬ)、急性骨髄性(骨髄芽球性)白血病(leukeemia)(ＡＭＬ)、急性リンパ性(Iymphoid)(リンパ芽球性(IymphoBlastic))白血病(leukeemia)(ＡＬＬ)、慢性骨髄性白血病(ＣＭＬ)、乳癌、結腸癌、前立腺癌、多発性骨髄腫などの白血病の処置；またはヒトｈｓｐ９０を標的とする敗血症(ＷＯ０７／０７７４５４)の処置に有用である。よって、本発明は、有効量の、例えば、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０および６２(Ｎ末端Ｍｅｔは所望により切断されていてもよい)(配列中、Ｘａａは上記の通り定義される)で示されるアミノ酸配列を含む本発明のｓｃＦｖペプチドを患者に投与することを含む、癌疾患、またはＴＮＦαおよび／もしくはＩＬ−６のレベルの上昇が関与する症状(例えば、自己免疫疾患、ＳＩＲＳまたは敗血症)を有する患者の処置方法を提供する。
【００２７】
いくつかの態様では、自己免疫疾患はクローン病、関節リウマチ、潰瘍性大腸炎または全身性紅斑性狼瘡である。
【００２８】
本発明のペプチドは、抗癌剤との組合せ療法に有用である。好適な抗癌剤の例としては、ドキソルビシン、ダウノルビシン、エピルビシン、ハーセプチン、ドセタキセル、シスプラチン、イマチニブ(グリベック(Gleevec)(登録商標))、パクリタキセル、シタラビンまたはヒドロキシ尿素が挙げられる。よって、本発明は、例えば、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０および６２(Ｎ末端Ｍｅｔは所望により切断されていてもよい)(配列中、Ｘａａは上記の通り定義される)で示されるアミノ酸配列と、ドキソルビシン、ダウノルビシン、エピルビシン、ハーセプチン、ドセタキセル、シスプラチン、イマチニブ、パクリタキセルおよびヒドロキシ尿素からなる群から選択される抗癌剤とを含む、本発明のｓｃＦｖペプチドを含む組成物または組合せ製剤を提供する。また、例えば、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０および６２(Ｎ末端Ｍｅｔは所望により切断されていてもよい)(配列中、Ｘａａは上記の通り定義される)で示されるアミノ酸配列を含むペプチドなどの、有効量の本発明のｓｃＦｖとドキソルビシン、ダウノルビシン、エピルビシン、ハーセプチン、ドセタキセル、シスプラチン、イマチニブ、パクリタキセルおよびヒドロキシ尿素からなる群から選択される少なくとも１種の抗癌剤を、それを必要とする患者に投与することを含む、癌疾患を有する患者の処置方法も提供される。
【００２９】
本発明の別の態様によれば、記載されているｓｃＦｖペプチドをコードする改良された核酸分子、および例えば大腸菌でこのようなｓｃＦｖペプチドを発現させるのに特に有用な改良された核酸構築物が提供される。本発明の核酸構築物は、大腸菌において、例えば、発現されたｓｃＦｖペプチドの均質性および力価に関して、ｓｃＦｖペプチドの改良された発現をもたらす。
【００３０】
好ましくは、この核酸分子は、ｓｃＦｖペプチドをコードする配列の３’末端に位置する配列(ｔａａ)ｎ(配列中、ｎは１または２である)をさらに含む。
【００３１】
本発明の別の局面によれば、配列番号６４の配列と少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含むＶＨドメインと、配列番号６６の配列と少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含むＶＬドメインをコードする配列を含み、かつ、ＶＨまたはＶＬドメインをコードする配列の３’末端に位置する配列(ｔａａ)ｎ(配列中、ｎは１または２である)をさらに含む核酸分子が提供される。３’末端に複数の停止コドンを設けることで誤った読み過ごし事象が避けられる。
【００３２】
別の局面において、本発明は、配列番号３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９または６１(配列中、ｎｎｎはＣｙｓ以外のアミノ酸をコードするコドンを表す)で示されるヌクレオチド配列を含む核酸分子、例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ分子を提供する。例えば、一態様では、ｎｎｎは例えばＴＡＴなどＴｙｒをコードし得る。別の局面において、本発明は、配列番号１、３、５、１１、１５または１９で示されるヌクレオチド配列を含む核酸分子を提供する。当業者に認識される通り、核酸配列は、コードされるアミノ酸配列を変化させずに容易に改変することができる。１個以上(例えば、１０、２０、５０または１００まで)のこのようなサイレント突然変異を伴う配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９または６１で示されるヌクレオチド配列を含むヌクレオチド配列に基づく核酸分子も、本発明の範囲内に含まれる。さらに、(ｉ)配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９または６１と少なくとも８０％の同一性、好ましくは、少なくとも９０％、９５％、９９％または１００％の同一性を有するか；あるいは(ii)高ストリンジェンシー条件下で、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９または６１で示される配列を有する核酸分子とハイブリダイズする核酸分子も含まれる。高ストリンジェンシー条件とは、当業者には容易に理解され、例えば、６×ＳＳＣ／０.０５％ピロリン酸ナトリウム中、３７℃(１４塩基のオリゴの場合)、４８℃(１７塩基のオリゴの場合)、５５℃(２０塩基のオリゴの場合)、また６０℃(２３塩基のオリゴの場合)で洗浄することを指し得る。様々な組成の核酸に対するこのようなストリンジェンシー条件の好適な範囲はKrause and Aaronson (1991) Methods in Enzymology, 200:546-556に記載されている。
【００３３】
一態様において、本発明は、例えば、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９または６１で示される本発明の核酸分子のヌクレオチド配列を含むベクター分子を提供する。好ましくは、このようなベクター分子は、例えば大腸菌で、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９または６１で示される核酸分子を発現させるのに好適である。好適な発現ベクターは当業者であれば容易に分かる。好適なベクターの例としては、例えば、ｐＧＥＸまたはｐＥＴが挙げられる。別の態様では、このようなベクター分子を含む宿主細胞、例えば大腸菌を提供する。
【００３４】
別の態様では、好適な転写制御エレメントの制御下に、例えば、配列番号３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９または６１に記載される本発明の核酸分子を含む発現ベクターが組み込まれている宿主細胞を、その宿主細胞、例えば大腸菌での該ペプチドの発現に十分な条件下で培養し、それにより、該ペプチドを産生させ、そして該細胞により産生されたペプチドを回収することを含む、例えば、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０または６２(Ｎ末端Ｍｅｔは所望により切断されていてもよい)(配列中、Ｘａａは上記の通り定義される)で示されるアミノ酸配列を含む本発明のｓｃＦｖペプチドの産生方法が提供される。
【００３５】
２つの配列間の「同一性」パーセンテージは、ＢＬＡＳＴＰアルゴリズムバージョン２.２.２(Altschul, Stephen F., Thomas L. Madden, Alejandro A. Schaffer, Jinghui Zhang, Zheng Zhang, Webb Miller, and David J. Lipman (1997), “Gapped BLAST and PSI-PLAST: a new generation of protein database search programs”, Nucleic Acids Res. 25:3389-3402)を用い、デフォルトパラメーターを使用して決定される。特に、ＢＬＡＳＴアルゴリズムは、URL http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/にてインターネットでアクセス可能である。
【図面の簡単な説明】
【００３６】
【図１】野生型Mycograb ｓｃＦｖペプチドおよびMycograb突然変異体の配列を模式的に示す図である。個々のペプチドをコードする核酸分子の停止コドンもＣ末端に示されている。
【図２】実施例２のＥＬＩＳＡアッセイの原理を示す図である。
【図３】黒棒が試験した全ての突然変異体のＮＬＳによる可溶化後の収率を示すグラフである。エラーバーはサンプルを２回分析した際の標準偏差を示す。白棒は試験した全ての突然変異体のＮＬＳ再折りたたみ後の質量収支をグラフで表したものである。突然変異体は再折りたたみ回収値の増加に従ってランク付けされている。
【図４】選択された５つの突然変異体について、可溶化剤として尿素およびＤＴＴを用いた場合(Ａ)、および可溶化剤としてＧｕＨＣｌおよびＤＴＴを用いた場合(Ｂ)の、折りたたみ後の回収率を示したグラフである。白棒：ＩＢ.ＳＯＬ溶液中に見られるタンパク質の質量を計算(式１)に用いた場合の回収率。黒棒：ＩＢ.ＲＥＳ溶液中に見られるタンパク質の質量を計算に用いた場合の再折りたたみ回収率。
【図５】全ての試験した突然変異体についての、４％ＮＬＳ添加後、目に見える可溶化溶液の透明化が始まるまでに要した時間(白棒)と、それ以上の透明化が見られなくなるまでに要した時間(黒棒)を示したグラフである。突然変異体は開始時間に従って昇順でランク付けされている。
【図６】可溶化の応答開始に関する変動性のチャートであり、システインの数、リンカーエレメントの数および重鎖(ｖｈ)または軽鎖(ｖｌ)フラグメントがＮ末端にあったかどうかを示す。１：突然変異体Ｍｙｃ １０６は可溶化の開始が最も早かったが、５つのシステインを含んでいた。
【図７】突然変異体ＭＹＣ １３５、Ｍｙｃ １３０、Ｍｙｃ １３３、Ｍｙｃ １１９、 Ｍｙｃ １２３野生型およびＭｙｃ １１６のＲＥＦ ｅｎｄサンプルのクロマトグラムを重ね合わせたものを示す。
【図８】突然変異体ＭＹＣ １３４、Ｍｙｃ １３７、Ｍｙｃ １３８、Ｍｙｃ １０６ Ｍｙｃ １３６、Ｍｙｃ １２３およびＭｙｃ １３９のＲＥＦ ｅｎｄサンプルのクロマトグラムを重ね合わせたものを示す。
【図９】突然変異体の応答保持時間に対するスケール化評価値および以下のパラメーター：リンカー長、システインの数およびＶｈ／Ｖｌ配置の予測プロファイラーを示す。スケール化評価値は、パラメーターが中点(ｘ軸上の予測プロファイラープロットの赤い数字)から最高レベルまで上昇する際に保持時間がどの程度変化するかを予測する。
【図１０】試験した突然変異体に関して、ＲＰ−ＨＰＬＣ(ＲＰＣ２)で測定した保持時間に対してリンカー長をプロットしたものである。ＭＹＣ １３０の早い保持時間を他の突然変異体と比較して強調してある。
【図１１】ピーク２のピーク面積の評価のため、図７および８の全てのＲＥＦ.ＥＮＤサンプルを標準化して重ね合わせたものを示す。
【図１２】８Ｍ尿素＋ＤＴＴ、８Ｍ尿素、６Ｍ ＧｕＨＣｌ＋ＤＴＴおよび６Ｍ ＧｕＨＣｌで可溶化したＭＹＣ １１９のＲＥＦ.ＥｎｄサンプルのＲＰ−ＨＰＬＣ２クロマトグラムを重ね合わせたものを示す(２０ｍＭ Ｔｒｉｓ、２ｍＭシステイン、１％ＮＬＳ、ｐＨ９.０で１：５０希釈)。
【図１３】６Ｍ尿素および５ｍＭ ＤＴＴで可溶化し、次いで、１：１０希釈により再折りたたみした後のＭＹＣ １１９のＲＥＦ.ＥｎｄサンプルのＲＰＣ ２クロマトグラムを示す。
【図１４】６Ｍ尿素で可溶化し、それぞれ１：１０および１：５０希釈により再折りたたみした後のＭＹＣ １１９のＲＥＦ.ＩＭサンプルおよびＲＥＦ.ＥＮＤサンプルのＳＤＳ Ｐａｇｅ分析後のゲルの画像である。レーン１〜８：非還元ＳＤＳ Ｐａｇｅ、レーン９〜１４：還元ＳＤＳ Ｐａｇｅ。Ｒ＝還元；ｎ−ｒ＝非還元。
【図１５】６Ｍ尿素(黒)および４％ＮＬＳ(青)で可溶化した後の突然変異体ＭＹＣ １１９からの封入体サンプルのＲＰ−ＨＰＬＣのクロマトグラムを重ね合わせたもの(ＲＰＣ２)である。
【図１６】左のゲル：突然変異体ＭＹＣ １１８、１１９、１３０、１３３、１３４、１３５および１３７の還元(ｒ)ＳＤＳ−Ｐａｇｅと、右のゲル：同じサンプルの非還元(ｎ−ｒ)ＳＤＳ Ｐａｇｅの画像を示す。
【図１７】左のゲル：突然変異体ＭＹＣ １０６、１２３ ｗｔ、１３６、１３８、１３９および１４０の還元ＳＤＳ−Ｐａｇｅと、右のゲル：同じサンプルの非還元ＳＤＳ Ｐａｇｅの画像を示す。
【図１８】突然変異体Ｍｙｃ １１８、Ｍｙｃ １１９、Ｍｙｃ １３０、Ｍｙｃ １３３およびＭｙｃ １３５のＲＥＦ.ＥｎｄサンプルのＳＥＣ ＨＰＬＣ ０.５％ＮＬＳクロマトグラムを重ね合わせたものである。これらの突然変異体由来のＩＢをベンチスケールで単離した。
【図１９】突然変異体Ｍｙｃ １３４、Ｍｙｃ １３６、Ｍｙｃ １３７、Ｍｙｃ １３８、Ｍｙｃ １３９、Ｍｙｃ １４０、Ｍｙｃ １０６およびＭｙｃ １２３野生型のＲＥＦ.ＥｎｄサンプルのＳＥＣ ＨＰＬＣ ０.５％ＮＬＳクロマトグラムを重ね合わせたものである。これらの突然変異体由来のＩＢをパイロットプラントに単離した。
【図２０】全ての突然変異体のＲＥＦ.Ｅｎｄサンプルの理論的ＭＷに対する測定したＭＷの分散プロットおよび直線回帰(連続直線)を示す。当てはめに関する９５％信頼区間も示されている(破線)。左上の点はＭＹＣ １３０を示す。破線内の点は９５％ＣＩの範囲内であり、従って、野生型との有意な違いはない。両破線より下の点は、予測値よりも低い平均ＭＷを有する突然変異体を表し、両破線より上の点は、予測値よりも高い平均ＭＷが測定された突然変異体を表す。
【図２１】５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ９.０バッファーに対するＵＦＤＦ後のＭｙｃ １１９、Ｍｙｃ １０６−ｏｒｉｇａｍｉ、Ｍｙｃ １２３ ｗｔおよびＭｙｃ １３７のＲＥＦ.ＥＮＤサンプルのＳＥＣ−ＨＰＬＣ(形式)クロマトグラムを示す。各容量再構成の後にサンプルを採取した。ＵＦＤＦ処理後のサンプル(５)、１回目(３)、３回目(４)および最後(５)の「バッファー交換」工程後。
【図２２】全ての試験した突然変異体のＲＥＦ.ＩＭ、ＲＥＦ.３ＴおよびＲＥＦ.ＥＮＤサンプルのＲＰ−ＨＰＬＣ ２クロマトグラムを示す。
【００３７】
配列表の簡単な説明
配列番号１は、Ｍｙｃ１２３である。
配列番号２は、配列番号１によりコードされているペプチド配列である。
配列番号３は、Ｍｙｃ１０２、Mycograb−６Ｈ−ＴＡＡである。
配列番号４は、配列番号３によりコードされているペプチド配列である。
配列番号５は、Ｍｙｃ１０１、Mycograb−ＴＡＡである。
【００３８】
配列番号６は、配列番号５によりコードされているペプチド配列である。
配列番号７は、ＭｙｃＣ２９Ｘ−ＴＡＡ、例えば、Ｍｙｃ１０５、ＭｙｃＣ２９Ｙ−ＴＡＡである。
配列番号８は、配列番号７によりコードされているペプチド配列である。
配列番号９は、ＭｙｃＣ２９Ｘ−６Ｈ−ＴＡＡ、例えば、Ｍｙｃ１０６、ＭｙｃＣ２９Ｙ−６Ｈ−ＴＡＡ、Ｍｙｃ１１３、ＭｙｃｏＣ２９Ｓ−６Ｈ−ＴＡＡである。
配列番号１０は、配列番号９によりコードされているペプチド配列である。
【００３９】
配列番号１１は、Ｍｙｃ１０７、Ｍｙｃｏ−４−ＴＡＡである。
配列番号１２は、配列番号１１によりコードされているペプチド配列である。
配列番号１３は、ＭｙｃｏＣ２９Ｘ−４−ＴＡＡ、例えば、Ｍｙｃ１０８、ＭｙｃｏＣ２９Ｙ−４−ＴＡＡ；Ｍｙｃ１１４、ＭｙｃｏＣ２９Ｓ−４−ＴＡＡである。
配列番号１４は、配列番号１３によりコードされているペプチド配列である。
配列番号１５は、Ｍｙｃ１０９、Ｎ−Ｍｙｃｏ−４−ＴＡＡである。
【００４０】
配列番号１６は、配列番号１５によりコードされているペプチド配列である。
配列番号１７は、Ｎ−ＭｙｃｏＣ２９Ｘ−４−ＴＡＡ、例えば、Ｍｙｃ１１０、Ｎ−ＭｙｃｏＣ２９Ｙ−４−ＴＡＡである。
配列番号１８は、配列番号１７によりコードされているペプチド配列である。
配列番号１９は、Ｍｙｃ１１１、Ｎ−Ｍｙｃｏ−６Ｈ−ＴＡＡである。
配列番号２０は、配列番号１９によりコードされているペプチド配列である。
【００４１】
配列番号２１は、Ｎ−ＭｙｃｏＣ２９Ｘ−６Ｈ−ＴＡＡ、例えば、Ｍｙｃ１１２、Ｎ−ＭｙｃｏＣ２９Ｙ−６Ｈ−ＴＡＡである。
配列番号２２は、配列番号２１によりコードされているペプチド配列である。
配列番号２３は、Ｍｙｃ１１５、ＭｙｃＹＳＳＳである。
配列番号２４は、配列番号２３によりコードされているペプチド配列である。
配列番号２５は、Ｍｙｃ１１６、ＭｙｃＹＳＩＱＳＳである。
【００４２】
配列番号２６は、配列番号２５によりコードされているペプチド配列である。
配列番号２７は、Ｍｙｃ１１７、ＭｙｃＳＩＱＫＳである。
配列番号２８は、配列番号２７によりコードされているペプチド配列である。
配列番号２９は、Ｍｙｃ１１８、ＶＨ−２Ｂａｍ−２ＶＬである。
配列番号３０は、配列番号２９によりコードされているペプチド配列である。
【００４３】
配列番号３１は、Ｍｙｃ１１９、ＶＬ−２Ｂａｍ−２ＶＨである。
配列番号３２は、配列番号３１によりコードされているペプチド配列である。
配列番号３３は、Ｍｙｃ１４５、ＭｙｃＣ９８Ｘ−６Ｈ−ＴＡＡである。
配列番号３４は、配列番号３３によりコードされているペプチド配列である。
配列番号３５は、Ｍｙｃ１２９(ＭｙｃＹＳＲＩＱＳＳ)である。
【００４４】
配列番号３６は、配列番号３５によりコードされているペプチド配列である。
配列番号３７は、Ｍｙｃ１３０(ＭｙｃＹＳＲＳＩＱＳＳＫＳ)である。
配列番号３８は、配列番号３７によりコードされているペプチド配列である。
配列番号３９は、Ｍｙｃ１３３である。
配列番号４０は、配列番号３９によりコードされているペプチド配列である。
【００４５】
配列番号４１は、Ｍｙｃ１３４である。
配列番号４２は、配列番号４１によりコードされているペプチド配列である。
配列番号４３は、Ｍｙｃ１３５である。
配列番号４４は、配列番号４３によりコードされているペプチド配列である。
配列番号４５は、Ｍｙｃ１３６である。
【００４６】
配列番号４６は、配列番号４５によりコードされているペプチド配列である。
配列番号４７は、Ｍｙｃ１３７である。
配列番号４８は、配列番号４７によりコードされているペプチド配列である。
配列番号４９は、Ｍｙｃ１３８である。
配列番号５０は、配列番号４９によりコードされているペプチド配列である。
【００４７】
配列番号５１は、Ｍｙｃ１３９である。
配列番号５２は、配列番号５１によりコードされているペプチド配列である。
配列番号５３は、Ｍｙｃ１４０である。
配列番号５４は、配列番号５３によりコードされているペプチド配列である。
配列番号５５は、Ｍｙｃ１４１である。
【００４８】
配列番号５６は、配列番号５５によりコードされているペプチド配列である。
配列番号５７は、Ｍｙｃ１４２である。
配列番号５８は、配列番号５７によりコードされているペプチド配列である。
配列番号５９は、Ｍｙｃ１４３である。
配列番号６０は、配列番号５９によりコードされているペプチド配列である。
【００４９】
配列番号６１は、Ｍｙｃ１４４である。
配列番号６２は、配列番号６１によりコードされているペプチド配列である。
配列番号６３は、野生型Ｍｙｃ１２３ ｓｃＦｖペプチドの重鎖をコードするヌクレオチド配列である。
配列番号６４は、配列番号６３によりコードされているペプチド配列である。
配列番号６５は、野生型Ｍｙｃ１２３ ｓｃＦｖペプチドの軽鎖をコードするヌクレオチド配列である。
【００５０】
配列番号６６は、配列番号６５によりコードされているペプチド配列である。
配列番号６７は、ｐｅｌＢシグナル配列のヌクレオチド配列である。
配列番号６８は、配列番号６７によりコードされているペプチド配列である。
配列番号６９は、配列番号２のｓｃＦｖペプチド(Mycograb)が特異的であるカンジダｈｓｐ９０由来のエピトープである。
配列番号７０は、実施例２の結合アッセイで用いたスクランブルペプチドのエピトープである。
【実施例】
【００５１】
実施例１
大腸菌宿主細胞を発現ベクターで形質転換させ、浸漬培養で培養する。適当なＯＤ６００において、誘導プロモーター(すなわち、ｔａｃ、ｔｒｃまたはＴ７−ｌａｃプロモーター)の抑制または活性化によりｓｃＦｖの発現を誘導する。この誘導により宿主細胞内にｓｃＦｖが蓄積され、主として凝集ｓｃＦｖからなる不溶性の封入体が生産される。適当な発現期間の後、遠心分離により細胞を採取し、破砕する。次に、不溶性の封入体を重量的手段により単離する。
【００５２】
配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９または６１で示されるＤＮＡ配列を大腸菌に適した発現ベクター(すなわち、ｐＥＴ)に挿入する。このタンパク質を大腸菌宿主内で発現させた後、アフィニティークロマトグラフィーにより精製する。標準的な分子生物学プロトコールを用いる(例えば、Harlow & Lane, 前掲; Sambrook, J. et al., 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York; Sambrook, J. & Russell, D., 200 1, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbors参照)。
【００５３】
これらのｓｃＦｖペプチドは、細胞内発現の後、大腸菌細胞内に封入体の形態で蓄積される。精製のため、封入体を単離し、生成物を可溶化および再折りたたみにより抽出する。イオン交換クロマトグラフィーおよび固定化金属アフィニティークロマトグラフィー(ＩＭＡＣ)により９５％を超える純度までの精製が達成される。
【００５４】
実施例２ ＥＬＩＳＡ活性アッセイ
１. 概要
ＭＹＣ１２３(「野生型」Mycograb)および突然変異体Mycograbペプチドの結合活性をＥＬＩＳＡにて、抗原としてｈｓｐ ９０のペプチドエピトープを用いて検出した。Mycograbまたは突然変異体Mycograbはビオチン化ペプチドに結合するようになり、次に、これをストレプトアビジンがコーティングされたマイクロタイタープレートに結合させた。スクランブルペプチドを対照配列として用いた。検出はＭＹＣ１２３タンパク質のＨｉｓ領域に結合するペルオキシダーゼコンジュゲート抗Ｈｉｓ抗体を用いて行った。ペルオキシダーゼをＡＢＴＳ基質と反応させて緑色物質を生成し、その吸収を４０５ｎｍで測定した。この４０５ｎｍでの吸収は溶液中のＭＹＣ１２３の活性と比例する。活性を参照標準の６点検量曲線から決定し、参照に対する活性％として示した。
【００５５】
ＥＬＩＳＡの原理を、ストレプトアビジン１がプレートにコーティングされ、ビオチン２と結合する図２に示す。そして、ビオチン２は、ＭＹＣ１２３ ｓｃＦｖペプチド５のＨｓｐ９０結合部位４に存在するＨｓｐ ９０ペプチド３と結合する。このｓｃＦｖペプチド５はＨｉｓタグ６を有し、これに抗Ｈｉｓ−ペルオキシダーゼ検出抗体７が結合する。
【００５６】
２. 手順の原理および供給源
用いたＥＬＩＳＡは、Mycograbまたは突然変異体Mycograbが、ビオチン化抗原ペプチド(ビオチン−ＮＫＩＬＫＶＩＲＫＮＩＶＫＫ−カンジダＨｓｐ９０由来のエピトープ配列)がコーティングされたストレプトアビジン表面マイクロプレートを用いて捕捉される直接検出アッセイであった。次に、Mycograbまたは突然変異体Mycograbの存在を、セイヨウワサビ・ペルオキシダーゼにコンジュゲートされた抗Ｈｉｓタグ抗体を用いて検出した。その後、セイヨウワサビ・ペルオキシダーゼの基質であるＡＢＴＳをウェルに加え、存在するMycograbの濃度を４０５ｎｍで測定した吸光度と比例させた。Mycograbまたは突然変異体Mycograbのサンプルの活性を、既存のMycograb薬品参照材料を用いて作製した標準曲線から直接求めた。
【００５７】
３. 材料
３.１ 機器
Streptawell High Bindマイクロタイタープレートは、Roche(カタログ番号１１９８９６８５００１)から供給された。アッセイはBio-Radモデル６８０マイクロプレートリーダーを用いて行った。ハードウエアの制御はMicroplate Manager Softwareバージョン５.２.１(Bio-Rad, USA)を用いて行った。データ分析はMicrosoft Excelを用いて行った。
【００５８】
３.２ 化学薬品および試薬
３.２.１ 化学薬品
化学薬品は、特に断りのない限り、全て分析等級のものであった。
【表１】
【００５９】
３.２.２ 試薬
ブロッキングバッファーストック１(Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水中５％ｗ／ｖ ＢＳＡ)
ＢＳＡ ２.５ｇ
２.５ｇのＢＳＡを秤取り、５０ｍＬのＭｉｌｌｉ−Ｑ水に加えた。４℃で１週間保存した。
【００６０】
１Ｍ Ｔｒｉｓバッファー ｐＨ７.８
Ｔｒｉｓ １２１.２４ｇ
１２１.２４ｇのＴｒｉｓを秤取り、９５０ｍｌのＭｉｌｌｉ−Ｑ水に攪拌しながら溶かした。ｐＨを確認し、ｐＨ７.８となるまで濃塩酸を滴下して調整した。Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水で１リットルとした。０.２２μｍフィルター(Sartorius)で濾過し、室温で最大１か月保存した。
【００６１】
サンプル希釈バッファー(２０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ７.８ ０.１％ｗ／ｖ ＢＳＡ)
１ｍＬの１Ｍ Ｔｒｉｓ保存溶液を４８ｍｌのＭｉｌｌｉ−Ｑ水および１ｍｌのブロッキングバッファーストック１溶液に加えた。実験の度に新しくした。
【００６２】
洗浄バッファー(ＰＢＳ＋Ｔｗｅｅｎ ２０ ０.１％ｖ／ｖ)
ＰＢＳタブレット５錠を９００ｍＬのＭｉｌｌｉ−Ｑ水に溶かし、１ｍＬのＴｗｅｅｎ ２０を加え、タブレットが溶けるまで攪拌し、Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水で１０００ｍＬとした。４℃で１週間まで保存した。
【００６３】
ブロッキングバッファーストック２(洗浄バッファー＋５％ｗ／ｖ ＢＳＡ)
ＢＳＡ ２.５ｇ
２.５ｇのＢＳＡを秤取り、５０ｍＬの洗浄バッファーに溶かした。４℃で最大１週間保存した。
【００６４】
ペプチド希釈バッファー(ＰＢＳ＋０.１％ｖ／ｖ Ｔｗｅｅｎ ２０＋０.１％ｗ／ｖ ＢＳＡ)
１ｍＬのブロッキングバッファーストック２を４９ｍＬの洗浄バッファーに加えた。実験の度に新しくした。
【００６５】
抗原ペプチド溶液
ビオチン-NKILKVIRKNIVKKペプチド １０ｍｇ
発注合成した抗原ペプチドの２ｍｇ／ｍｌ溶液を、１０ｍｇのペプチドを秤取り、５ｍｌのＭｉｌｌｉ−Ｑ水に溶かすことにより作製した。５０〜１００μｌのアリコートを１.５ｍｌのエッペンドルフ管に分注し、最大１年間−８０℃で冷凍保存した。
【００６６】
抗原ペプチド作業溶液(ペプチド希釈バッファー中４μｇ／ｍＬペプチド)
２５μＬの抗原ペプチド溶液(２ｍｇ／ｍＬ)を１２.４７５ｍＬのペプチド希釈バッファーに加え、４μｇ／ｍＬの溶液とした。実験の度に新しくした。
【００６７】
３.２.３ サンプル調製
対照品
１×１０ｍｇのMycograb参照バッチ(ＢＮ２７０６０３)を５ｍｌのＭｉｌｌｉ−Ｑ水に再懸濁させ、バイアル内の全ての粉末が確実に取り込まれ、溶解するよう穏やかに混合した。１３,０００ｒｐｍで５分間遠心分離して粒状物質を除去した。次に、この溶液のタンパク質濃度を標準的なＵＶタンパク質濃度法に従って測定した。
【００６８】
試験品
１×１０ｍｇのMycograbまたは突然変異体Mycograb試験材料を５ｍｌのＭｉｌｌｉ−Ｑ水に再懸濁させ、対照品と同様に処理した。
【００６９】
検量曲線標準
対照品材料をサンプル希釈バッファーで希釈し、上限濃度５μｇ／ｍＬのサンプル５ｍＬを得た。次に、この溶液を用いて、それぞれ最終容量２ｍＬで、濃度範囲５〜０.１５６μｇ／ｍＬにわたり２倍連続希釈サンプルを作製した。
【００７０】
４. 手順
１. ２ｍｇ／ｍｌの抗原ペプチド保存溶液のアリコートを冷凍庫から取り出し、０.１％(ｗ／ｖ)ＢＳＡおよび０.１％(ｖ／ｖ)Ｔｗｅｅｎ ２０を含有するＰＢＳバッファーで１：５００希釈し(バッファー１２.５ｍｌ中、ペプチド２５μｌ)、４μｇ／ｍｌペプチドの作業溶液を作製した。９６ウェルのhigh bind StreptaWellプレート(Roche)のＢ〜Ｈ行を０.１％(ｗ／ｖ)ＢＳＡ ＰＢＳ−０.１％(ｖ／ｖ)Ｔｗｅｅｎ ２０中、４μｇ／ｍｌのビオチン-NKILKVIRKNIVKKペプチド１００μｌでコーティングした。ウェル当たり１００μｌの０.１％(ｗ／ｖ)ＢＳＡ ＰＢＳ−０.１％(ｖ／ｖ)Ｔｗｅｅｎ ２０をＡ行の全てのウェルに加えた。その後、このプレートを一晩４℃で保存した。
【００７１】
２. 次に、このプレートのウェルをThermo WellWash ACにて、ＰＢＳ ０.１％(ｖ／ｖ)Ｔｗｅｅｎ ２０バッファー２００μｌで３０秒３回洗浄した。
【００７２】
３. ローディングに先立ち、再懸濁させたMycograbバイアル保存溶液から２０ｍＭ Ｔｒｉｓバッファー ｐＨ７.８、０.１％(ｗ／ｖ)ＢＳＡで５μｇ／ｍｌに希釈することにより、Mycograbおよび突然変異体Mycograbサンプルを作製した。次に、Mycograb(登録商標)サンプルをこの最初の５μｇ／ｍｌ溶液から、２０ｍＭ Ｔｒｉｓバッファー ｐＨ７.８、０.１％(ｗ／ｖ)ＢＳＡで、０.１５６２５μｇ／ｍｌまで２倍連続希釈することにより調製した。個々の希釈は全て、実験に必要な量に応じて、１.５ｍｌのエッペンドルフ管(ＶＷＲカタログ番号２１１−２１３９)か、７ｍｌのＢｉｊｏｕｘコンテナ(ＶＷＲカタログ番号２１５−０３２８)かのいずれかで行った。その後、各希釈溶液サンプル１００μｌをプレートにトリプリケートで添加した。１００μｌ ２０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ７.８、０.１％(ｗ／ｖ)ＢＳＡを含有するブランクウェルの対照セットもＨ行に含めた。
【００７３】
４. このプレートを室温で１時間放置した後、ステップ２に記載の通り、ウェルをＰＢＳ−０.１％(ｖ／ｖ)Ｔｗｅｅｎ ２０で３回洗浄した。
【００７４】
５. １００μｌのマウスモノクローナル抗Ｈｉｓ ＨＲＰコンジュゲート(Sigma A7058)を各ウェルに０.１％(ｗ／ｖ)ＢＳＡ ＰＢＳ−０.１％(ｖ／ｖ)Ｔｗｅｅｎ ２０中１：２０００濃度で添加し、室温で１時間放置した。
【００７５】
６. 次に、ウェルを上記の通り洗浄し、結合したMycograb(登録商標)を、１００μｌのＡＢＴＳ(登録商標)試薬を添加することにより検出した。この発色を４０５ｎｍで読み、２つ目の検量曲線で最高濃度のサンプルの吸光度が１.３ＡＵに達した際に読み取りを行った。Mycograb(登録商標)の濃度はＡ４０５ｎｍでの吸収に比例した。
【００７６】
７. 参照材料のＡ４０５ｎｍでの吸光度結果をエクセルのスプレッドシートに移し、６点二次検量曲線関数ｙ＝ａ＋ｂｘ＋ｃｘ２を、Mycograb(登録商標)の濃度(μｇ／ｍｌ)に対し、(参照サンプルＡ４０５ｎｍ−ブランク)からプロットし、相関係数≧０.９９であった。「ホック」効果の存在が見られれば、最高濃度点をグラフから除き、５点検量曲線とした。いくつかの状況では、３回の測定当たり異常値が１個を超えないならば、プレート当たり２個ずつのウェルの外れ値(目により決定)をデータ分析から除いた。適当な吸光度平均を用い、サンプル中の見掛けの濃度を計算する非直線回帰分析を用い、活性％を計算した。
【００７７】
この試験で得られたＥＬＩＳＡ結果を表１に示す。
【表２】
【００７８】
サンプル１および３〜６は封入体の予備精製、再折りたたみおよび洗剤ＮＬＳの除去(Ｄｏｗｅｘクロマトグラフィーまたはダイアフィルトレーションによる)の後に得られた処理中間体である(最終薬剤物質ではない)。サンプル２は、Biomeva/Thymoorganにより製造され、第III相治験に用いられた元の野生型薬剤である。元の薬品の仕様(specification)は参照標準の７５〜１２５％であった。全てのサンプルが活性である(結合する)と判断された。
【００７９】
実施例３ クリプトコックス・ネオフォルマンス(Cryptococcus neoformans)の最小阻害濃度の決定
概要
ＭＩＣアッセイでは、モデル生物としてクリプトコックス・ネオフォルマンスを用い、ＭＹＣ１２３の抗真菌活性を決定した。このアッセイでは抗真菌活性を評価し、臨床状況でのＭＹＣ１２３の作用を模倣することができる。
【００８０】
ＭＹＣ１２３のＭＩＣは、the National Committee for Clinical Laboratory Standards document M27-A2 (2002)に従い、培養液の微量希釈により測定した。簡単に言うと、ＲＰＭＩ培地に１０３ＣＦＵ／ｍｌのクリプトコックス・ネオフォルマンスを接種した。ＭＹＣ１２３を培地に漸減濃度で添加した(１０２４μｇ／ｍｌ、５１２μｇ／ｍｌ、２５６μｇ／ｍｌ・・・)。これらのＭＩＣプレートを３７℃で７２時間インキュベートした。エンドポイントは、光学的に透明なウェルとなる濃度(ＭＩＣ−０)および増殖対照と比べて濁度の顕著な低下をもたらす濃度(≧５０％増殖阻害、ＭＩＣ−２)として判定した。
【００８１】
方法
予備アッセイの調製
セーフティーキャビネット：ＳＡＢプレートにクリプトコックス・ネオフォルマンスを接種し、３５℃で４８〜７２時間インキュベートした。プレートをパラフィルムで封じた。
【００８２】
ベンチ：
ＲＰＭＩを調製した。抗真菌剤はＮＣＣＬＳ法に従って調製し(Ｍ２７−Ａ２)、ＲＰＭＩ増殖培地中全部で１１種類の濃度とした。濃度は１つのＭＩＣに必要な終濃度の２倍とした。
【００８３】
ＭＩＣプレート
Ｕ型９６ウェルプレートにて、試験する最高薬剤濃度１００μｌ(必要濃度の２倍)をＡ行およびＢ行のウェル１に加えた(アッセイはデュプリケートで行った)。これをプレートの列に、例えば、行ＡとＢのウェル２に次の濃度、行ＡとＢのウェル３に次の濃度というように、漸減濃度で反復した。ウェル１２は増殖培地のみを含んだ。
【００８４】
セーフティーキャビネット：接種物の調製−直接コロニー懸濁液。クリプトコックス・ネオフォルマンスの直接コロニー懸濁液を、ＲＭＰＩ培地で４８〜７２時間プレートから作製した。これを０.５ ＭａｃＦａｒｌａｎｄｓ標準(およそ１×１０６〜５×１０６ｃｆｕ／ｍｌ)に調整した。１：５０希釈液を作製した。さらに１：２０希釈液(およそ１×１０３〜５×１０３ｃｆｕ／ｍｌ、必要接種量の２倍)を作製した。
【００８５】
セーフティーキャビネット：プレートの接種。プレートはウェル１２からウェル１へと用いた。これにより薬剤の持ち越しを避けた。１００μｌの接種懸濁液を各ウェルにピペットで入れた(最終接種量０.５×１０３〜２.５×１０３ｃｆｕ／ｍｌ)。プレートをパラフィルムで封じた。
【００８６】
インキュベーション
これらのＭＩＣプレートを３７℃で７２時間インキュベートした。接種を確認するため、接種懸濁液を連続希釈し、これらの希釈液１０μｌをＳＡＢプレートにプレーティングし、３７℃で７２時間インキュベートした。
【００８７】
読み取り結果
読み取りミラーを用い、増殖を「薬剤無しの」対照(ウェル１２)と比較し、次のように増殖をスコア付けした。
０−光学的に透明
１−やや濁りがある
２−著しい増殖の低下(およそ５０％)
３−若干の濁度低下
４−濁度の低下無し
本研究では表２に示されるようなＭＩＣ結果が得られた。
【表３】
【００８８】
サンプル１および３〜６は封入体の予備精製、再折りたたみおよび洗剤ＮＬＳの除去(Ｄｏｗｅｘクロマトグラフィーまたはダイアフィルトレーションによる)の後に得られた処理中間体である(最終薬剤物質ではない)。サンプル２は、Biomeva/Thymoorganにより製造され、第III相治験に用いられた元の野生型薬品であった。
【００８９】
これらのサンプルに関して得られたＭＩＣ結果を、対応するバッファーに関して得られた結果と比較した。サンプル３を除く全てのサンプルが参照０７０６０２と比較して活性があるとみなされた。サンプル３およびバッファー６からは同じ結果が得られ、ＭＹＣ１２３不含バッファーがこの試験生物に有毒であったことを示す。サンプル１および４〜６の値はＴｒｉｓバッファーの値とかけ離れており、これはデータの高い信頼性を示す。
【００９０】
実施例４
概要
Mycograb突然変異体の目的は、野生型Mycograbに比べて構造特性が改良された突然変異体ｓｃＦｖペプチドを得ることであった。点突然変異、特に遊離システインのチロシンによる置換により、凝集および下流プロセシングの際の不適切なジスルフィド結合の形成が軽減されるはずであると考えられた。また、重鎖フラグメントの配向を軽鎖フラグメントと入れ替え、ＨＩＳタグを除去することが、Mycograb分子の天然の３Ｄ構造の形成に有益であるとも考えられた。
【００９１】
クローニングした後に、発酵の前にこれらの構築物の配列決定を行った。封入体(ＩＢ)の単離のため、およびさらなる下流プロセシングのために十分な材料を得るために発酵をスケールアップした。これらの突然変異体の発現構築物を、再折りたたみの最終工程まで、適合させたＢｉｏｍｅｖａプロセスに従って精製した。
【００９２】
一定範囲の突然変異体Mycograbペプチドの物理的パラメーターを実施例５〜１２に示す通りに試験した。
【００９３】
試験した突然変異体およびそれらの突然変異の概要を表３に示す。比較のため、試験に野生型を含めた。
【表４】
【００９４】
試験アッセイに用いた方法論を以下に記載する。
【００９５】
封入体(ＩＢ)の単離
ＬＶＡ(Laborversuchsanstalt)にて突然変異体Ｍｙｃ １１８、１１９、１３０、１３３およびＭｙｃ １３５の振盪フラスコから得られた４Ｌの発酵液を、高圧ホモジナイザー(ＬＡＢ ４０−１５ ＲＢＦＩ)を用い、ＲＰＰ４中、７００バールで２サイクル、各々１５分間で破砕した。ＩＢを、４℃、１００００ｒｐｍで２０分間、実験室規模でボトル遠心機を用い、細胞残渣から分離した。ＩＢを実験室用の水(ＷＦＬ)で２回洗浄し、その後、ＷＦＬ中２０％(ｗ／ｖ)の懸濁液を調製した。この懸濁液のアリコートを−２０℃で保存した。
【００９６】
ＩＢを、突然変異体Ｍｙｃ １３４、１３７、１３８、１０６、１３６、１３９、１４０およびＭｙｃ １２３(ｗｔ)から、これらの突然変異体の発酵をバイオリアクターにて３０Ｌ規模で行ったため、ＲＰＰ４中パイロットスケールで単離した。ディスクスタック遠心機を用い、細胞残渣からＩＢを分離した。ＷＦＩで２０％の懸濁液(ｗ／ｖ)を調製した。この懸濁液のアリコートを−２０℃で保存した。
【００９７】
可溶化
ＮＬＳによる可溶化(適合させたBiomevaプロセスに従う)。２０％ＩＢ懸濁液の可溶化は、タンパク質濃度８ｍｇ／ｍｌとなるまでＷＦＬで希釈した後、１００ｍＭ Ｔｒｉｓ／塩基、４％ＮＬＳ、ｐＨ９.０バッファーで１：２希釈することにより行った。この溶液をビーカー中、室温で、透明となるまで、しかしながら少なくとも３０分間攪拌した。透明化の開始および終了までの時間を記録した。
【００９８】
尿素、ＧｕＨＣｌ、ＤＴＴのよる別の可溶化。この別の可溶化戦略は、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ ８Ｍ尿素＋／−５ｍＭ ＤＴＴまたは２０ｍＭ Ｔｒｉｓ、６Ｍ ＧｕＨＣｌ＋／−５ｍＭ ＤＴＴ(双方ともｐＨ９.０)を用いた２０％ＩＢ懸濁液の各量の１：１０希釈により行った。尿素およびＧｕＨＣｌの得られた濃度は、ＩＢ懸濁液の容量によってそれぞれ７.２Ｍおよび５.２Ｍであった。
【００９９】
可溶化されたＩＢの再折りたたみ
ＮＬＳによる再折りたたみ。再折りたたみは、この可溶化溶液を５０ｍＭ Ｔｒｉｓ／塩基バッファーで１：４希釈することにより行った。ＮＬＳの終濃度は０.５％であった。再折りたたみは５０μＭ ＣｕＣｌ２の添加により開始させた。サンプルを採取し、ＣｕＣｌ２添加前と添加後、次いでＣｕＣｌ２添加後およそ２４、４８、７２および９６時間に直ぐにＲＰＣ２分析した。
【０１００】
尿素、ＧｕＨＣｌによる可溶化後の再折りたたみ。８Ｍ尿素または６Ｍ ＧｕＨＣｌ＋／−ＤＴＴによる可溶化後のMycograb溶液の再折りたたみは、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ／塩基、１％ＮＬＳおよび２ｍＭ Cystinを含有するバッファーｐＨ９.０で１：５０希釈することにより行った。
【０１０１】
いくつかの突然変異体では、尿素による可溶化後のMycograb溶液の希釈は、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ／塩基、０.５Ｍ Ｌ−アルギニンおよび２ｍＭ Cystinを含有するバッファーｐＨ ９.０で１：１０希釈することによっても行った。
この再折りたたみ溶液をそれぞれ４℃で９６時間または室温で２４時間攪拌した。
【０１０２】
再折りたたみの動態
必要な再折りたたみ時間を決定するため、突然変異体Ｍｙｃ １１９の再折りたたみ動態を記録した。Ｍｙｃ１１９の２０％ＩＢ懸濁液のサンプルを上記の通り可溶化した。再折りたたみは、サンプルをそれぞれの時間間隔で採取し、ＲＰＣ２により分析した以外、上記の通り行った。
【０１０３】
ＵＦ／ＤＦによる再折りたたみ溶液からのＮＬＳの除去。突然変異体Ｍｙｃ１１９、Ｍｙｃ １３７、Ｍｙｃ １０６およびＭｙｃ １２３(ｗｔ)を上記の通り可溶化し、再折りたたみした。再折りたたみ後、ＲＥＦ.ＥＮＤ溶液のバッファー交換を、Amicon stir cellを用いて分子量カットオフ１０ｋＤａで行った。各ターンオーバー容量後のＮＬＳ濃度をＲＰ−ＨＰＬＣで測定した。５０ｍｌのＲＥＦ.ＥＮＤ溶液を２５ｍｌまで濃縮した後、ダイアフィルトレーションバッファーで再び５０ｍｌとした。この手順を４回行った。ＮＬＳ除去後の凝集傾向を、フォーミュレーションバッファーを流すＳＥＣ−ＨＰＬＣで測定した。
【０１０４】
ＳＤＳ Ｐａｇｅ分析
ＳＤＳ Ｐａｇｅは、ＮｕＰＡＧＥ ４−１２ ＢｉｓＴｒｉｓゲルと泳動バッファーとしてＭＯＰＳを用いて行った。泳動時間は２００ボルトで６５分であった。質量０.２〜０.４μｇのMycograbを各レーンに適用した。電気泳動後、ゲルを銀で染色した。還元ＳＤＳ Ｐａｇｅでは、１００ｍＭのＤＴＴをサンプルに加えた。
【０１０５】
結果
突然変異体の発現構築物を、表４に挙げられている分析方法を用い、下流手順の種々の段階で分析した。
【表５】
【０１０６】
表５は、突然変異体の評価に用いた、表４に挙げられている分析方法の説明を示す。特定のアッセイの特異性を記載した注釈も含まれている。
【表６】
【０１０７】
試験した突然変異体の個々のアッセイのさらなる詳細を以下の実施例５〜１２にまとめ、考察する。
【０１０８】
実施例５ 可溶化および再折りたたみ後の質量収支 − 結果としてのＲＰＣ１力価の測定
ＩＢの可溶化および再折りたたみ前後のタンパク質濃度を力価アッセイで測定した。このアッセイではサンプル中に存在する全可溶性タンパク質を測定するので、質量収支は１００％になるはずである。可溶化に関する質量収支を、式１を用いて計算した。
【数１】
式中、ｍｇ ＲＰＣ１ ＩＢ.ＳＯＬは、ＲＰＣ １法による濃度測定値とＩＢ ＳＯＬ溶液の容量から計算したＩＢの可溶化溶液中のタンパク質の質量である。ｍｇ ＲＰＣ１ ＩＢ.ＲＥＳは、ＲＰＣ １法による濃度測定値と単離されたＩＢをＤＩに再懸濁させた後の溶液の容量から計算した２０％ＩＢ懸濁液中の質量である。
【０１０９】
再折りたたみに関する質量収支は式２を用いて計算し、回収率％として表す。４％ＮＬＳ、８Ｍ尿素＋／−５ｍＭ ＤＴＴまたは６Ｍ ＧｕＨＣｌ＋／−５ｍＭ ＤＴＴのいずれかで可溶化したＩＢを、それぞれ３.３.１および３.３.２に記載のように希釈し、再折りたたみを行った。
【数２】
式中、ｍｇ ＲＰＣ１ Ｒｅｆ.ＥＮＤは、再折りたたみ溶液の容量を掛けた再折りたたみ溶液中に見られるＲＰ−ＨＰＬＣでの濃度測定値によるタンパク質の質量である。ｍｇ ＲＰＣ１ ＩＢ.ＳＯＬは、ＩＢ可溶化物中に見られるタンパク質の質量であり、％ＲＥＦは再折りたたみ後の回収率である。
【０１１０】
式１および２により計算される通り、４％ＮＬＳでの可溶化とその後の全ての突然変異体の再折りたたみ後の質量収支は表３に示されている。生データは表６および７に見られる。
【０１１１】
表６は、全ての試験した突然変異体についての、ＩＢ＿ＲＥＳ懸濁液のＮＬＳで可溶化した後の回収率と、分析法ＲＰＣ Ｉから計算した再折りたたみ後の回収率を示す。また、ＩＢ−ＲＥＳ溶液中のタンパク質濃度および分析法ＲＰＣＩにより測定された再折りたたみ溶液中のタンパク質濃度も示す。表７は、尿素(ＳＯＬ：尿素)での可溶化およびＧｕＨＣｌ(ＳＯＬ：ＧｕＨＣＬ)での可溶化後にＩＢ＿ＲＥＳ、ＩＢ＿ＳＯＬおよびＲＥＦ.ＥＮＤサンプルのＲＰＣにより測定されたタンパク質濃度を示す。再折りたたみ時間は４℃で９６時間であった。ＲＥＦ.ＥＮＤ溶液を得るための希釈倍率は、ＩＢ＿ＲＥＳおよびＩＢ＿ＳＯＬでそれぞれ５００および５０であった。
【０１１２】
【表７】
【表８】
【０１１３】
可溶化の質量収支は試験した１２種の突然変異体のうち１０種で１００％を超えていた。これは、ＩＢ懸濁液が粗サンプル型であり、結果として、サンプルを採取した際にＩＢが完全に溶けておらず、不均質な溶液となり、よって、全タンパク質濃度の過小評価に至ったためであり得る。データ変動は高く、２回分析した６つの突然変異体の相対標準偏差は２.６％(Ｍｙｃ １３８)〜４２.９％(Ｍｙｃ １３３)の範囲であった。
【０１１４】
再折りたたみ後の回収率％は７２％(Ｍｙｃ １３８)〜９９％(Ｍｙｃ １３４)の間であった。予測回収率は１００％である(可溶化後の回収率と同じ)。再折りたたみ後の回収率は全て１００％より低く、分散は可溶化後の回収率ほど大きくなかった。これは、ＩＢ.ＳＯＬおよびＲＥＦ.ｅｎｄサンプル中のタンパク質濃度の概算がＩＢ.ＲＥＳサンプルよりも精度が高いことを示す。しかしながら、回収率の計算は、主として、可溶化実験および再折りたたみ実験の対照として役立つ。
【０１１５】
８Ｍ尿素または６Ｍ ＧｕＨＣｌを可溶化剤として用いた場合の可溶化溶液ＩＢ.ＳＯＬおよびＩＢ懸濁液ＩＢ.ＲＥＳに関する再折りたたみ収率を図４に示す。
【０１１６】
回収率は、おそらくサンプリング前の均質性が不十分なために、特にＩＢ.ＳＯＬおよびＩＢ.ＲＥＳサンプルで、タンパク質濃度の測定に伴う問題を反映して４４％から２３０％まで様々である。
【０１１７】
尿素可溶化後のＲＥＦ.ＥＮＤサンプル中の濃度は、平均倍率で１.２倍高いが、ＧｕＨＣｌ可溶化後のＲＥＦ.ＥＮＤ中の濃度に匹敵した(表６および７参照)。よって、希釈は一貫していた。
【０１１８】
実施例６ 可溶化時間
ＮＬＳを用いた場合の可溶化時間を全ての突然変異体について試験した。溶液が透明になり始めるまでの時間とそれ以上の透明化が見られなくなるまでの時間を記録し、図５に示す。
２％ＮＬＳを用いるのに対し、尿素＋／−ＤＴＴおよびＧｕＨＣｌ＋／−ＤＴＴによる可溶化は２〜３倍速かった。
【０１１９】
システインの数と透明化が始まるのに要した時間との間には相関が見られた。突然変異体１３４(システイン５個)を除き、４個のシステイン残基を有する突然変異体は５個のシステイン残基を有する突然変異体よりも速く可溶化した。図６は、透明化の開始［分］が、Ｎ末端における重鎖または軽鎖フラグメントのアライメント、リンカーエレメントおよびシステイン残基の数、の３つのカテゴリーに対してプロットされている変数チャートを示す。図６の１で示されたＭｙｃ １３４を除き、システイン４個のカテゴリーのデータ点は、システイン５個のカテゴリーのデータ点に比べて、早い可溶化開始時間に分散している。
【０１２０】
回帰モデル(Ｍｙｃ １３４を除いてＲ２＝０.７２)では、５個ではなく４個のシステインを有するMycograb構築物では、可溶化の開始が２０分から１１.３分に短縮されることを予測した(モデルは示されていない)。
【０１２１】
実施例７ ＲＰＣ ２−ＮＬＳ再折りたたみ
Ｂｉｏｍｅｖａ適合プロセス(実施例４に記載)に従って可溶化および再折りたたみされたMycograb ＲＥＦ.ＥＮＤサンプル突然変異体をＲＰＣ ２により分析した。
【０１２２】
野生型(ＭＹＣ １２３)を含む全ての試験した突然変異体からのＲＥＦ.ＥＮＤサンプルを重ね合わせたものを図７および図８に示す。最初に突然変異体Ｍｙｃ １１６をｌａｂ ＤＳＰ−ＤＥＶ １でスクリーニングし、比較のためにこの重ね合わせに含めた。
【０１２３】
図７では、ベンチスケールで単離されたＩＢから作成されたＲＥＦ.ＥＮＤサンプルのクロマトグラムを、図８では、パイロットプラントにおいてより大規模に単離されたＩＢから作成されたＲＥＦ.ＥＮＤサンプルのクロマトグラムを示す。
【０１２４】
溶出プロフィールを、
１. ピーク１保持時間(疎水性を反映)、
２. ピーク１の形状(ピークが鋭い場合には、二量体の存在および単量体の均質性を反映)
３. 凝集塊／不純物ピーク(ピーク２)に対する単量体／二量体ピーク(ピーク１)の面積比(凝集塊／不純物含量を反映)
【０１２５】
保持時間ピーク１(疎水性を反映)
試験した突然変異体の単量体／二量体ピークの保持時間を表８に示す。
【表９】
【０１２６】
保持時間は分子構築物によって大きく異なる。予測通り、保持時間(疎水性を反映)がリンカー長とともに長くなるという傾向はない。１つのリンカーエレメントは４つのグリシンと１つのセリン残基からなる。グリシンは、親水性であるセリンとは対照的に疎水性である。しかしながら、リンカー中のグリシン含量は４倍高いので、ＲＰＣ２において保持時間により測定して、疎水性は有意に高まらないと思われる。
【０１２７】
Ｍｙｃ １３０の保持時間は、残りの突然変異体よりも短い。１０個のアミノ酸がより親水性の高い(セリン５個)性質のアミノ酸で置換されたことから、分子の疎水性が低下し、その結果、保持時間は短くなる。このデータ点を統計分析から除くと、ＶＬの配向がＮ末端である場合に、配向がＣ末端である場合に比べて保持時間に有意な違いを示すモデルが得られる。ＶＬエレメントがＮ末端に位置する場合、それがＣ末端に位置する場合に比べて保持時間が０.４１分増す。図９は、このモデルのスケール化評価値と予測プロファイラーを、因子としてのシステインの数、リンカー長および鎖フラグメントの配向と応答としての保持時間ともに示す。
【０１２８】
このモデルからはＭｙｃ １３０の保持時間が除かれていることに注意すべきである。図１０に示されているリンカー長に対する保持時間のプロットは、この構築物の保持時間が、上述のようにより親水性の高い性質をもたらす点突然変異のために、残りの突然変異体と比べて短いことを示す。
【０１２９】
ピーク１の形状
ショルダーが無いか、またはわずかしか無い鋭いピーク１は単量体Mycograbの均質性を反映する。ピークの形状は、全ての突然変異体からのＲＥＦ.ＥｎｄサンプルのＲＰＣ ２クロマトグラムの重ね合わせにより評価し、突然変異体Ｍｙｃ １３７、Ｍｙｃ １３８およびＭｙｃ １３９に関して最も鋭いピークを決定した。ピーク１は野生型Ｍｙｃ １２３よりも鋭く、ピーク１と２はほとんどベースラインで分離した。これは、これらの構築物が野生型より均質性の高い単量体／二量体タンパク質を発現することを示し得る。
【０１３０】
単量体／二量体ピークの面積比
図７(Ｍｙｃ １２３ ｗｔ)に示される通り、Ｍｙｃ １１６およびＭＹＣ１２３についての単量体／二量体に関する不純物／凝集塊含量が最も低かった。しかしながら、これらの２つのサンプルの分析は、別の研究室により３か月早く行われ、ピーク２の増加は経時的に顕著になった。試験した突然変異体のＲＥＦ.Ｅｎｄサンプルと同じ月に調製および分析されたＭｙｃ １２３からのＲＥＦ.Ｅｎｄサンプルのクロマトグラムを図８に示す。図７に示されているＭＹＣ １２３のクロマトグラムと図８に示されているものとの比較から、サンプル調製と分析法が厳密に再現性があるわけではないという結論に至る。
【０１３１】
凝集塊ピークに対する単量体／二量体ピークの面積比は、ピーク１を同じピーク極大に対して標準化することにより求めた。標準化後のピーク２のピーク面積は、視覚により面積評価を用い、大きさの増加に従ってランク付けした。標準化した概要を図１１に示す。
【０１３２】
次のランク付けを確立した：Ｍｙｃ １１６、Ｍｙｃ １３９、Ｍｙｃ １３６＜Ｍｙｃ １１９、Ｍｙｃ １２、Ｍｙｃ１４０＜Ｍｙｃ１３７、Ｍｙｃ １３５、Ｍｙｃ１３８＜Ｍｙｃ １０６＜Ｍｙｃ １３０＜Ｍｙｃ １３４＜Ｍｙｃ１１８＜Ｍｙｃ１３３。
【０１３３】
突然変異体Ｍｙｃ １０６、１３４、１３６〜１３９のＩＢから作成したＲＥＦ.ＥｎｄサンプルのＲＰＣ ２クロマトグラムをパイロットプラントで処理したところ、ベンチスケールで単離された突然変異体Ｍｙｃ １１８〜１３５のＩＢよりも低い不純物／凝集塊ピークを示した(図８参照)。
【０１３４】
実施例８ ＲＰＣ ２尿素／ＧｕＨＣｌ再折りたたみ
突然変異体Ｍｙｃ １１８、１１９、１３０およびＭｙｃ １３３を７.６Ｍ尿素＋／−ＤＴＴおよび５.６Ｍ ＧｕＨＣｌ＋／−ＤＴＴを用いて溶解させ、再折りたたみバッファーで希釈することにより再折りたたみを開始させた。
【０１３５】
ＲＥＦ.Ｅｎｄサンプルは全て、ＲＰＣ ２において単量体／二量体ピーク(ピーク１)を示さなかった。凝集塊および不純物であると思われる大きなピーク２が優勢である。突然変異体Ｍｙｃ １１９からの再折りたたみ終了サンプルの代表的なＲＰ ＨＰＬＣクロマトグラムを図１２に示す。このサンプルは実施例４に記載の通り調製した。
【０１３６】
単量体はおよそ１０.５分に溶出すると予測された。それより早く溶出するピークは同定されず、０.５％ＮＬＳでの再折りたたみでは見られなかった。大きなピーク２は強い凝集を示す。尿素／ＧｕＨＣｌ可溶化後の全てのＲＥＦ.Ｅｎｄサンプルで、同様の溶出プロフィールが得られた。
【０１３７】
２０ｍＭ Ｔｒｉｓ／塩基、０.５Ｍ Ｌ−アルギニンおよび２ｍＭ シスチンを含有するバッファーｐＨ９.０で１：１０希釈することにより再折りたたみを行った場合にも同様の溶出プロフィールが得られた。代表的なクロマトグラムを図１３に示す。
【０１３８】
この強い凝集傾向を非還元条件下でのＳＤＳ−Ｐａｇｅにより確認し、ＲＥＦ.Ｅｎｄサンプルでは大きな強いＨＭＷスミア(smear)が検出され、尿素可溶化後、目に見える単量体バンドは無かった。その後、このスミアは、サンプルが還元され、単量体Mycograbバンドが現れた際に消失した。図１４では、尿素可溶化後の還元および非還元ＲＥＦ.ＥｎｄサンプルのＳＤＳ Ｐａｇｅ分析を示す。レーン４〜７は、非還元条件下、２種類の異なる濃度でのＭＹＣ １１９のＲＥＦ.ＩＭサンプルとＲＥＦ.Ｅｎｄサンプルを示す。レーン１０〜１３は、還元条件下での同じサンプルを示す。この凝集塊スミアは、このサンプルが還元され、単量体ならびに二量体バンドは目に見えるようになった際に消失した。
【０１３９】
尿素およびＧｕＨＣｌは、タンパク質の凝集を避けることができない低濃度(尿素では、１：５０希釈の場合０.１４Ｍ、１：１０希釈の場合０.７２Ｍ；ＧｕＨＣｌでは、１：５０希釈の場合０.１１Ｍ、１：１０希釈の場合０.５６Ｍであった)で再折りたたみ溶液中に存在した。図１２に示される通り、ＤＴＴの使用は、比較可能であると見られるＤＴＴを用いても用いなくても、ＲＰ−ＨＰＬＣクロマトグラム(ＲＰＣ ２)として凝集に有意な影響を及ぼすとは思われない。
【０１４０】
ＲＥＦ.Ｅｎｄサンプルとは対照的に、尿素で溶解させたＩＢ.ＳＯＬサンプルのＲＰＣ ２クロマトグラムは、２％ＮＬＳに溶解させたＩＢ.ＳＯＬサンプルと、ピーク形状に関して比較可能であった。図１５はＨＰＬＣクロマトグラムの重ね合わせを示す。
【０１４１】
非還元ＩＢ.ＳＯＬサンプルのＳＤＳ−Ｐａｇｅ分析は、サンプルを尿素で溶解させたとき、２％ＮＬＳに溶解させたＩＢ.ＳＯＬサンプルの場合よりも強いＨＭＷバンドを示した。これは図１４に示され、レーン３では、サンプルは尿素で可溶化し、レーン８では、サンプルは２％ＮＬＳで可溶化した。ＩＢ.ＳＯＬサンプルのクロマトグラムのピーク２の重ね合わせはＮＬＳ中よりも尿素中の方がいっそう小さいので、ＲＰ−ＨＰＬＣのピーク２からは凝集塊含量についての示唆が得られないと結論付けることができる。
【０１４２】
その後の再折りたたみでは単量体ピークは得られず、タンパク質は完全に凝集する。
【０１４３】
実施例９ 還元および非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ
還元および非還元ＳＤＳ−Ｐａｇｅを行い、ＲＥＦ.Ｅｎｄサンプル中の不純物および凝集塊含量を求めた。還元ＳＤＳ−Ｐａｇｅを用いた場合、Mycograb種は単量体および二量体バンドを現し、サンプル中の宿主細胞不純物含量は、非還元ＳＤＳ−Ｐａｇｅゲルと比べた場合、凝集種から識別可能であった。非還元ＳＤＳ Ｐａｇｅは、単量体、二量体および凝集塊を示した。非還元ＳＤＳ−Ｐａｇｅの銀染色ゲルを還元ＳＤＳ−Ｐａｇｅ分析と比較すると、凝集種の量が半定量的に評価することができた。全ての試験した突然変異体のＲＥＦ.ＥＮＤサンプルの還元および非還元ＳＤＳ−Ｐａｇｅを図１６および図１７に示す。
【０１４４】
図１６の左側のゲルは、突然変異体ＭＹＣ １１８、１１９、１３０、１３３、１３４、１３５、１３７からのＲＥＦ.Ｅｎｄサンプルの還元ＳＤＳ−Ｐａｇｅを示す。３０ｋＤａのバンドは単量体Mycograbであり、これは全サンプルで優勢であった。この単量体バンドの移動によれば、突然変異体ＭＹＣ １３４で発現されたMycograbはこのゲルで分析された他の突然変異体よりも大きな分子量を有するものと予測された。程度は低いが、同様のことがＭＹＣ １３５でも検出された。表９によれば、ＭＹＣ １３４は図１６に示されている突然変異体の中で最も大きな理論的分子量を有し、ＭＹＣ １３５がこれに次いだ。
【０１４５】
非還元ＳＤＳ−Ｐａｇｅゲルでは、凝集種ならびに二量体が確認された。レーン１３(ＭＹＣ １３４)および１５(ＭＹＣ １３７)では、ＨＭＷバンドが他のレーンの場合よりも弱い。これは最も低い凝集種含量を示すが、この単量体のバンドもより弱い。
【０１４６】
図１６に示されているＭｙｃ １３３を除いた全ての突然変異体で、互いに比較した際に移動時間と強度の異なる二本のバンドが見られた。これらのバンドの同定は難しかったが、これは天然様構造のMycograb単量体であったと推測された。
【０１４７】
図１７は、突然変異体ＭＹＣ １０６、１３６、１３８、１３９、１４０および野生型ＭＹＣ １２３のＲＥＦ.Ｅｎｄサンプルの還元および非還元ＳＤＳ Ｐａｇｅを示す。異なる構築物のＭＷの違いは単量体バンドの移動の違いによって同定できた。レーン５および７のバンドは、レーン２、３、６および表９に挙げられている理論的ＭＷと一致する４のバンドよりもやや小さいＭＷで現れた。
【０１４８】
ゲルに適用されたタンパク質の質量は一貫しておらず、ＲＥＦ.Ｅｎｄサンプル中の濃度測定は精度が十分でなかったために単量体バンドの強度は様々であった。よって、不純物含量の半定量的分析は不可能であった。しかしながら、単量体バンドの濃さがＭｙｃ １４０の一つと同等であるが、他のバンドの強度が幾分高いため、Ｍｙｃ １０６のＲＥＦ.ｅｎｄサンプルの不純物含量がさらに高いことは明らかであった。
【０１４９】
ＳＤＳ−Ｐａｇｅ分析は、Ｍｙｃ １０６ ｏｒｉｇａｍｉのＲＥＦ.Ｅｎｄサンプルがより高いＨＣＰおよび生成物関連の不純物を含有していることを示した。しかしながら、これはＲＰＣ２分析法によっては確認されず、ピーク２の面積は他の突然変異体と同じ範囲であった。
【０１５０】
実施例１０ ＳＥＣ ０.５％ＮＬＳ：ＲＥＦ.ＲＮＤサンプルにおけるMycograb種の分子量の測定
適合されたＢｉｏｍｅｖａ法(実施例４参照)に従って調製された全ＲＥＦ.ＥＮＤサンプルを０.５％ＮＬＳ中、ＳＥＣ−ＨＰＬＣで分析し、平均分子量を求めた。ＳＥＣクロマトグラムの重ね合わせを図１８および図１９に示す。
【０１５１】
平均分子量は４８.６ｋＤａ〜６５.８ｋＤａの範囲であった。ピークの幅の広さはサンプルの種の不均質性を反映する。ＲＥＦ.Ｅｎｄサンプルにおいて生成物のおよそ８０％が単量体であったが、二量体およびさらにＭＷの大きな種、ならびに非生成物関連の不純物が存在しており、その結果、幅広の溶出ピークとなった。
【０１５２】
図１８では、Ｍｙｃ １３０の溶出プロフィールは、他の試験したサンプルと比較して前に来ていたために目立った。これは、構築物の性質(親水性が高い)によるサンプルの高い不均質性のため、または偶発的にサンプルの処理が異なったためである可能性があった。
【０１５３】
図１８に示されているサンプルは同時に調製し、分析まで４℃で５日間保存した。図１９に示されているサンプルも同時に調製し、４℃で分析まで一晩保存した。これらの構築物のＭＷは同様の範囲内であったので、サンプルは４℃で安定であるものと思われた。
【０１５４】
Ｍｙｃ １３０が前に来ていたのは、他の検討サンプルと比較して凝集種の量が多いためである可能性がある。しかしながら、対応するＲＰＣ ２クロマトグラムのピーク２は目立って大きいものではないが、ＳＥＣ ０.５％ＮＬＳにより測定された高い分子量とＲＰＣ２で測定された大きなピーク２のピーク面積の間にはときどき相関があるだけであることが認められた。
【０１５５】
さらに、Ｍｙｃ １３０のＳＤＳ−ｐａｇｅは、サンプルのより高い不純物含量および不均質性の増加は示さなかった。カラムの過負荷および分析中の温度の上昇などのＳＥＣの前進をもたらす他の要因は、全サンプルを同じ日に分析したので除外可能である。
ＲＰＣ２においてＭｙｃ １３０では保持時間が極めて短かった。
【０１５６】
ＲＥＦ.Ｅｎｄサンプルの平均ＭＷは二量体、凝集塊および不純物の量が増すにつれ大きくなった。種々の突然変異体で発現された単量体Mycograbの計算ＭＷは、異なるリンカー長および他の突然変異のために２６〜２７ｋＤａの間であった。アミノ酸から計算された理論ＭＷ、ＳＥＣにより決定されたＲＥＦ.ＥｎｄサンプルのＭＷ、アミノ酸の数、リンカー長、およびシステインの数を挙げた表が表９に示されている。
【表１０】
【０１５７】
理論的ＭＷを、ＳＥＣにより決定されたＭＷに対してプロットし、Ｍｙｃ １３０のデータ点を除いた際の相関係数０.７７を有する直線関係を見出した。
【０１５８】
図２０の下の破線の右側に点で現される突然変異体Ｍｙｃ １０６、Ｍｙｃ １３８およびＭｙｃ １３５は、野生型よりも小さな平均ＭＷを有していた。上の破線の左側に点で現される突然変異体Ｍｙｃ １３３、１３６および１３９は、野生型よりも大きな平均ＭＷを有していた。しかしながら、アッセイの変動性は考慮しなければならない。さらに、図１９から、注入されるタンパク質の量はいくつかのサンプルでピーク面積と常に同じとは限らなかった。共有結合的凝集塊の形成は、５つのシステインを有するMycograbに比べて４つのシステインを有する突然変異体では、分子間ＳＳ端の形成後に、４つのシステインを有する突然変異体の遊離のシステインに使用可能なものはないので、低下するはずである。システインを４つだけ有する突然変異体であっても再折りたたみの際に分子間共有結合的凝集塊が形成されるが、おそらくその量は５つのシステインを有する突然変異体でよりも少ない。
【０１５９】
実施例１１ ＳＥＣ形成：凝集傾向を評価するための再折りたたみ溶液からのＵＦ／ＤＦによるＮＬＳ除去
Mycograb突然変異体の凝集傾向を評価するため、ＮＬＳ濃度は、攪拌細胞を用いた限外濾過／ダイアフィルトレーションによるＲＥＦ.Ｅｎｄ溶液より平均５分の１だけ低下した。ダイアフィルトレーションの際に用いた全バッファー量を保持液量で割ったものがダイアファクターであり、２.５であった。
【０１６０】
この実験の原理は、溶解剤ＮＬＳが、凝集がそれ以上回避できない濃度まで低下される際の突然変異体の凝集傾向を調べることであった。
【０１６１】
凝集塊の形成はＳＥＣ−ＨＰＬＣ方式で評価可能であると予想された。溶出バッファーは０.５Ｍ尿素バッファーを含んだが、ＮＬＳは凝集を抑制しなかった。
分子量の増加を凝集傾向の指標として用いたところ、突然変異体の比較が可能であった。
【０１６２】
第一の実験セットに関して突然変異体Ｍｙｃ １３７、Ｍｙｃ １０６、Ｍｙｃ １１９および野生型Ｍｙｃ １２３を選択した。表１０は、ＵＦＤＦ前後のフォーミュレーションバッファーにてＳＥＣ−ＨＰＬＣ実施により測定された分子量(ＭＷ)(ｋＤａ)と突然変異体ＭＹＣ １１９、１３７、１０６およびＭＹＣ １２３からのＲＥＦ.ＥｎｄサンプルのＲＰ−ＨＰＬＣにより測定されたＮＬＳ濃度(％)を示す。ＮＬＳ低下倍率は、ＵＦＤＦ前のサンプルのＮＬＳ濃度(＃２)をＵＦＤＦ後のＮＬＳ濃度(＃３)で割ることで計算した。ＳＥＣ ＨＰＬＣ ０.５％ＮＬＳに基づくＭＷ増加率％は、それぞれの突然変異体で、ＲＥＦ.ＥＮＤサンプル(＃１)のＭＷとＵＦＤＦ後のＭＷ(＃３)から計算した。
【表１１】
＊分子量は、流れるバッファー中に０.％ＮＬＳを含有する分析的ＳＥＣ ＨＰＬＣ法(ＳＥＣ ＨＰＬＣ ０.５％ ＮＬＳ)で測定した。
＊＊表９からのデータ
【０１６３】
ＵＦＤＦ前のサンプルのＳＥＣ ＨＰＬＣ(フォーミュレーションバッファーで流す)により測定された見掛けの高分子量は、分析中のタンパク質の凝集によるものであった。
【０１６４】
ＵＦＤＦ前のサンプルはなお０.５％ＮＬＳを含んでいた。サンプルがカラムを移動するにつれ、ＮＬＳはこのタンパク質よりも強く保持されるようになり、結果として凝集が起こった。よって、この分析法は、ＮＬＳを含有するサンプルの分子量の決定に適していなかった。
【０１６５】
ＲＥＦ.Ｅｎｄサンプル中のMycograbの分子量を測定するためには、流れるバッファー中０.５％ＮＬＳを用いたＳＥＣ ＨＰＬＣを使用した。ＵＦＤＦによりＲＥＦ.Ｅｎｄサンプル中のＮＬＳを除去した後のＭＷの増加は、表１０に関して上記の通り計算した。値は表１０の６行目に示されている。ＭＹＣ １２３は最小のＭＷ増加を示し、ＭＹＣ １１９は４００％という最大の増加を示した。
【０１６６】
これらのデータに基づけば、ＭＹＣ １２３はＭＹＣ １１９より凝集傾向が小さい。しかしながら、分析的ＳＥＣ ＨＰＬＣはタンパク質構造と凝集塊の形成に影響を及ぼし得ると考えなければならない。さらに、ＭＷの増加は２つの異なる分析法から得られたデータから計算され、サンプルのＭＷは、２つの方法で決定される場合に同じであるかどうかは評価することはできない。
【０１６７】
表１１では、突然変異体を、突然変異と共にＮＬＳ除去後のＭＷの増加に従ってランク付けした。３×リンカーエレメントを有する２つの突然変異体が、４×リンカーエレメントを有する突然変異体に比べて有意に低いＭＷ増加率％を有することは、注意すべきである。
【表１２】
【０１６８】
図２１は、ＵＦＤＦ前と各容量再構成後のサンプルから得られたＳＥＣ ＨＰＬＣクロマトグラムの重ね合わせを示す。溶出ピークの形状は、ＮＬＳ濃度の低下によって有意に変化しなかった。結論として、サンプルのＭＷもＮＬＳが少なくなっても一定のままであった。これは、それ未満では凝集が誘発されるがそれ以上進行しない界面活性剤の濃度下限界があることを示唆し得る。しかしながら、サンプルのＭＷに対する分析法の影響は分かっておらず、それはなぜ全てのサンプルが類似のＭＷを有するかという理由であるかもしれない。
【０１６９】
ＮＬＳ濃度は、２.５のダイアボリュームに相当する５倍量再構成の後、平均(ｎ＝５)０.１２４％の濃度まで低下した。理論上、ＮＬＳのＲ＝０では、計算された残留ＮＬＳ濃度は０.０２０％であるはずである。理論的に残留するＮＬＳ濃度の計算には式３を用いた。
【数３】
式中、ｃｒｅｔｅｎｔａｔは保持液のＮＬＳ濃度であり、ｃｆｅｅｄは供給溶液のＮＬＳ濃度である。Ｒは保持物、すなわち、膜によって保持される溶質の画分である。ＶＣＦは、容量濃縮倍率であり、Ｎは、ダイアフィルトレーションの際に操作に導入された全バッファー量である２倍容量を保持液量で割ったものである。
【０１７０】
保持物中のＮＬＳの理論濃度と測定濃度の間の矛盾は、膜によるＮＬＳの保持が０より大きいということを示す。これはＮＬＳとタンパク質、膜および／またはその他の成分の間の相互作用によるものであり得る。変形する能力も望ましくない保持をもたらし得る。
【０１７１】
実施例１２ Ｐｅｐ−Ｍａｐ分析
全突然変異体のＲＥＦ.Ｅｎｄサンプルを、ペプチドマップを用いてジスルフィド架橋に関して分析した。分析前に、サンプルをヨードアセトアミドでアルキル化し、トリプシンで消化し、ＬＣ−ＭＳを行った。単一ペプチドのＵＶピークを、質量分析を用いて同定した。遊離のＳＨ基を有するペプチドは適切、また不適切にＳ−Ｓ結合を形成するとともに、二量体ペプチドは、可能であればいつでも半定量的に測定した。
【０１７２】
５つのシステインを有する適切に折りたたまされた構築物は、それぞれＴ３およびＴ９に相当するＣｙｓ ２３およびＣｙｓ ９７の間でＳ−Ｓ結合を形成する。このＴ３−Ｔ９結合は軽鎖に存在する。他のジスルフィド結合は、Ｔ１２およびＴ１７に相当する重鎖のＣｙｓ １５９とＣｙｓ ２２４の間にある。５番目のシステインはＣｙｓ２８上にあり、Ｔ４ペプチドに相当する。
【０１７３】
４つのシステインを有する構築物は常にＣｙｓ ２８残基を欠き、適切なＳ−Ｓ橋は５つのシステインを有する構築物の場合と同様である。
【０１７４】
突然変異体１１８、１１９、１３０、１３５、１３３、１３４、１３７およびＣ２８Ｙ＋ＨＩＳ(１０６)ならびにＣ２８Ｙ−ＨＩＳ(１０８)をｌａｂ ＡＬ１で分析した。突然変異体１０６ ｏｒｉｇａｍｉ、１３６、１３８、１３９、１４０および野生型１２３は、異なるデバイスを用いて分析的ｌａｂ ＡＬ２で分析した。ＡＬ１の質量分析計の感度はＡＬ２の場合よりも大きく、従って、ＡＬ２で分析された突然変異体の半定量的分析は得ることができなかった。しかしながら、適切に形成されたＳ−Ｓ橋が存在するかどうかは決定することができた。
【０１７５】
得られたデータのまとめを表１２に示す。これらの結果は、ＳＨ、架橋システインおよび二量体システインの３つのカテゴリーからなる。遊離システインは、ジスルフィド結合を形成しなかったＳＨ基を示す。架橋システインは分子内ジスルフィド結合であり、二量体システインは分子間ジスルフィドを表す。Ｗは個々のペプチドの弱いシグナルが検出されたことを示し、Ｘは強いシグナルを与えるペプチドを表す。ＡＬ ２で分析した突然変異体に＊を付す。
【表１３】
【０１７６】
「適切に」折りたたまれた、５つのシステインを有するMycograbは、Ｔ４ペプチドにおける遊離ＳＨの有意なシグナルを与えるはずである。さらに、適切なジスルフィドＴ３−Ｔ９およびＴ１２−Ｔ１７の強いシグナルが予測され、不適切なＳＳ結合は存在しないはずである。最後に、分子間ＳＳ結合も存在しないはずである。
【０１７７】
「適切に」折りたたまれた、４つのシステインを有するMycograbは、遊離ＳＨ基を含まないはずである。適切なＳ−Ｓ結合Ｔ３−Ｔ９およびＴ１２−Ｔ１７だけが検出されるはずである。さらに、分子間ＳＳ結合は存在しないはずである。
【０１７８】
表１２は、野生型もいずれの突然変異体も適切なＳ−Ｓ結合の強いシグナルだけを示すわけではなかった。ＲＥＦ.Ｅｎｄサンプルは様々な折りたたみで、共有結合的に凝集した集団からなり、従って、ジスルフィド結合と遊離ＳＨ基の、全ての可能な組合せの混合物が存在すると考えるべきである。しかしながら、有望な突然変異体は、ＭＹＣ １３７に場合である適切なＳ−Ｓ橋と突然変異体Ｃ２８Ｙ＋ＨＩＳおよびＣ２８Ｙ−ＨＩＳの双方の有意なシグナルを少なくとも示すはずである。
【０１７９】
５例では、不適切なＳ−Ｓ結合のみが見られ、適切なジスルフィド結合に対するシグナルは得られないか、または弱いものに過ぎなかった。
【０１８０】
ＭＹＣ １２３、ＭＹＣ １３８、ＭＹＣ １３９およびＭＹＣ １４０のシグナルは極めて弱く、これらのサンプルを再分析しても高いシグナルは得られなかった。Mycograb特異的ペプチドが見られたが、システイン含有ペプチドはシグナルを生じなかったか、または弱いシグナルしか生じなかった。これは、切断部位が構造的に遮断されているためにトリプシンによるタンパク質の個々の部分に消化が不十分であることによる可能性がある。また、リンカー長が長い(３×に対して５×および６×)突然変異体ほど消化しにくくなり、結果として、溶出の遅いペプチドのシグナルは検出できないか、または検出するのが困難になるということも注意すべきである。
【０１８１】
興味深いことに、共有結合的ジスルフィドは、１つの例外があるが、Ｃｙｓ ９７残基に相当する２つのＴ９ペプチド間でのみ形成された。
【０１８２】
突然変異体Ｍｙｃ １１８、１１９、１３０、１３３、１３７ならびに突然変異体Ｃ２８Ｙ＋ＨＩＳおよびＣ２８Ｙ−ＨＩＳは、野生型よりも適切なＳ−Ｓ結合に対して強いシグナルを生じた。しかしながら、Ｍｙｃ １２３は感度の低い違う質量分析計で分析されたので、シグナル強度は比較できないと考えるべきである。Ｍｙｃ １２３のペプチドからのシグナルは、突然変異体１０６ ｏｒｉｇａｍｉ、１３６、１３８、１３９および１４０からのシグナルと比較可能である。これらの構築物の中に適切なジスルフィド橋が得られたものはなかった。不適切ジスルフィドのシグナルのみが見られた。
【０１８３】
Ｍｙｃ １３７、Ｍｙｃ Ｃ２８Ｙ＋ＨＩＳおよびＭｙｃ Ｃ２８Ｙ−ＨＩＳのＰｅｐマップ結果が、適切な両ジスルフィド橋の有意なシグナルを伴い、最も有望であった。突然変異体Ｍｙｃ １１８、Ｍｙｃ １１９およびＭｙｃ １３３もまた、ジスルフィド橋様の一定量の天然型を示したが、Ｔ１２−Ｔ１７のシグナルは弱かった。
【０１８４】
突然変異体Ｍｙｃ １３０はＴ１２−Ｔ１７ ＳＳ結合の強いシグナルを示したが、第二の適切なジスルフィドは見られなかった。
【０１８５】
結論
分析結果の相関
Ｐｏｒｏｓカラム(ＲＰＣ１)を用いた力価アッセイによって測定して、再折りたたみ後の最良の回収率はＭＹＣ １２３(ｗｔ)およびＭＹＣ １３４で得られた。
【０１８６】
カオトロピック剤によるＩＢの可溶化はＮＬＳによる可溶化よりも速かった。尿素またはＮＬＳで可溶化したＩＢのＲＰＣ ２クロマトグラムを比較した。しかしながら、ＳＤＳ Ｐａｇｅは、尿素で可溶化されたＩＢに比べて凝集塊スミアが減ったことから、ＮＬＳの強い溶解力を示した(図１４参照)。
【０１８７】
カオトロピック剤による可溶化後の希釈およびシステイン、Ｌ−アルギニン、１％ＮＬＳおよび低濃度の尿素／ＧｕＨＣｌなどの種々の添加剤の使用による再折りたたみはＲＰＣ ２において単量体ピークを示さなかった(図１２および図１３参照)。ＳＤＳ Ｐａｇｅ、非還元およびＲＰＣ ２クロマトグラムにより確認された完全に凝集したタンパク質は大きなピーク２を示した。
【０１８８】
ＳＥＣ ＨＰＬＣ ０.５％ＮＬＳによるＭＷの測定は、１つの外れ値を除いたとき、理論的に計算されたＭＷとＲ２ ０.７７で相関していた。ＳＤＳ ＰＡＧＥの解像度はＭＷの微妙な違いを全て検出するには不十分であったが、理論的には０.６ｋＤａ、ｋＳＥＣ ＨＰＬＣ(それぞれＭＹＣ １３４およびＭＹＣ １１８)で測定する場合は１４ｋＤａ異なるＭＷの２つの突然変異体の間で移動時間の違いが見られた。
【０１８９】
ＲＰＣ ２クロマトグラフィーは、１０個の疎水性アミノ酸がより親水性の高いもので置換された突然変異体(ＭＹＣ １３０)の疎水性の低下を確認することができた。このリンカーエレメントは固定相の結合部位には容易に接近することができないので、保持挙動には影響を及ぼさなかった。また、リンカー長の長い構築物のＰｅｐマップ分析では、リンカー長の短い構築物に比べて対象ペプチドに対して弱いシグナルしか得られないことも認められた。リンカーエレメントは消化酵素には容易には接近できないことが明らかであった。
【０１９０】
ＭＹＣ １３７、１３８および１３９のＲＰＣ２クロマトグラムは、他の試験した突然変異体に比べてMycograb単量体に当たる最も鋭いピークを示し、このサンプルの高い均質性を示唆した。
【０１９１】
Ｐｅｐマップ分析は、４つのシステインを有する突然変異体のＲＥＦ.Ｅｎｄサンプルには遊離ＳＨ基がほとんど存在しないことを示した。これは、ジスルフィド橋(不適切なものおよび適切なもの)のほぼ完全な形成ならびに共有結合的凝集塊の形成を示す。５つのシステインを有する突然変異体では、種々の遊離ＳＨ基に関して弱いシグナルが得られたが、突然変異体Ｍｙｃ １１８、Ｍｙｃ １１９およびＭｙｃ １３３だけは、「天然」単量体においては依然として還元されているはずの５番目のシステインの位置、すなわちＴ４に遊離ＳＨ基を有していた。このことは、５つのシステインを有する突然変異体は全て遊離ＳＨ基のシグナルを生じるが、そのうち３つだけで、遊離ＳＨ基が検出されたことから、Ｔ４ペプチド上のＳＨ基はＳＳ結合を好ましく形成するということを示す。
【０１９２】
ＳＥＣ ＨＰＬＣによって測定されたＭＷは、サンプル中のバッファーマトリックスに極めて依存的である。ＳＥＣ ＨＰＬＣ法の組合せはサンプルのバッファーと同様に流れるバッファーによって確立しなければならなかった。ＭＷのマトリックス依存性は、処理工程間でのＭＷの比較を困難にする(表１０)。
【０１９３】
ＵＦＤＦ実験は、ＮＬＳがある程度、サンプル溶液に保持され、効率的に除去できないことを示した。
【０１９４】
突然変異体ＭＹＣ Ｃ２８Ｙ ＋ＨＩＳ、Ｃ２８Ｙ−ＨＩＳおよびＭＹＣ １３７のＰｅｐマップで得られた結果は特に有望であった。これらの結果は、ＨＩＳタグとシステインを４つだけ有する突然変異体が特に好ましいことを示す。このＨＩＳタグは、効率の高い精製ステップであるＩＭＡＣを用いた精製に必要である。システインを４つだけ有する構築物は適切なジスルフィドとより少ない共有結合的凝集塊を形成する可能性が高い。
【０１９５】
突然変異の効果
突然変異の最も有益な効果は５番目のシステインの除去に起因し得る。適切なジスルフィド結合の数は５つのシステインを有する構築物に比べて増加した。さらに、ＩＢの溶解度も５つのシステインを有する構築物に比べて高まった。
【０１９６】
重鎖フラグメントと軽鎖フラグメントの配向を入れ替えると、ＲＰＣ ２における保持時間に小さな影響があり、ＶＬエレメントがＣ末端にある場合には、Ｎ末端配向の場合に比べて保持時間が短くなった。
【０１９７】
ＮＬＳ除去後のペプチドの凝集傾向は、リンカーエレメントの数とともに高まる可能性がある。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
アミノ酸スペーサーにより連結されたＶＨドメインとＶＬドメインを含み、該ＶＨドメインが配列番号６４の配列と少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含み、そして該ＶＬドメインが配列番号６６の配列と少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含むｓｃＦｖペプチドであって、ＶＨドメインのＣ２８に相当する位置にアミノ酸置換または欠失を含む、ｓｃＦｖペプチド。
【請求項２】
ＶＨドメインのアミノ酸置換がＣ２８Ｙである、請求項１に記載のｓｃＦｖペプチド。
【請求項３】
アミノ酸スペーサーが配列(ＧＧＧＧＳ)ｎを含む、請求項１または２に記載のｓｃＦｖペプチド。
【請求項４】
Ｃ末端に精製タグ、好ましくは６ヒスチジン残基の配列をさらに含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載のｓｃＦｖペプチド。
【請求項５】
配列番号８、１０、１４、１８および２２(配列中、Ｘａａはシステイン以外のアミノ酸残基を表し、Ｎ末端メチオニン残基は所望により切断されていてもよく、好ましくは、Ｘａａはチロシン残基を表す)からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載のｓｃＦｖペプチド。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか一項に記載のｓｃＦｖペプチドをコードする配列を含む、核酸分子。
【請求項７】
ｓｃＦｖペプチドをコードする配列の３’末端に位置する配列(ｔａａ)ｎ(ｎは１または２である)をさらに含む、請求項６に記載の核酸分子。
【請求項８】
配列番号７、９、１３、１７および２１(配列中、ｎｎｎはシステイン残基以外のアミノ酸をコードするコドンである)からなる群から選択される配列を含む、請求項６または７に記載の核酸分子。
【請求項９】
ＤＮＡまたはＲＮＡ分子である、請求項６〜８のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項１０】
請求項１〜５のいずれか一項に記載のｓｃＦｖペプチドを薬学上許容される賦形剤、希釈剤または担体と組み合わせて含む、医薬組成物。
【請求項１１】
請求項１〜５のいずれか一項に記載のｓｃＦｖペプチドと抗真菌剤または抗癌剤を含む、組合せ製剤。
【請求項１２】
請求項１〜５のいずれか一項に記載のｓｃＦｖペプチドと抗真菌剤または抗癌剤を含む、組成物。
【請求項１３】
患者に有効量の請求項１〜５のいずれか一項に記載のｓｃＦｖペプチドを投与することを含む、真菌感染患者の処置方法。
【請求項１４】
患者に有効量の抗真菌剤を投与する工程をさらに含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
真菌感染の処置に用いるための請求項１〜５のいずれか一項に記載のｓｃＦｖペプチド。
【請求項１６】
真菌感染がカンジダ、クリプトコッカス、ヒストプラズマ、アスペルギルス、トルロプシス、ムコール症、ブラストミセス症、コクシジオイデス症またはパラコクシジオイデス症の生物体によるものである、請求項１３もしくは１４に記載の方法または請求項１５に記載のｓｃＦｖペプチド。
【請求項１７】
抗真菌剤がアゾール抗真菌剤、好ましくは、イトラコナゾール、ボリコナゾール、イサブコナゾール、フルコナゾール、ミコナゾール、ケトコナゾールおよびポサコナゾールからなる群から選択される、請求項１１に記載の組合せ製剤、請求項１２に記載の組成物、請求項１３、１４もしくは１６に記載の方法または請求項１５もしくは１６に記載のｓｃＦｖペプチド。
【請求項１８】
抗真菌剤がポリエン抗真菌剤およびエキノカンディン抗真菌剤からなる群から選択される、請求項１１に記載の組合せ製剤、請求項１２に記載の組成物、請求項１３、１４もしくは１６に記載の方法または請求項１４もしくは１６に記載のｓｃＦｖペプチド。
【請求項１９】
ポリエン抗真菌剤がアムホテリシンＢまたはその誘導体を含む、請求項１８に記載の組合せ製剤、組成物、方法またはｓｃＦｖペプチド。
【請求項２０】
処置を必要とする患者に請求項１〜５に記載の有効量のｓｃＦｖペプチドを投与することを含む、癌疾患患者の処置方法。
【請求項２１】
患者に有効量の少なくとも１つの他の抗癌剤を投与する工程をさらに含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
癌疾患の処置に用いるための、請求項１〜５のいずれか一項に記載のｓｃＦｖペプチド。
【請求項２３】
抗癌剤がドキソルビシン、ダウノルビシン、エピルビシン、ハーセプチン、ドセタキセル、シスプラチン、イマチニブ、パクリタキセル、ドセタキセル、ヒドロキシ尿素、５−フルオロウラシル、オキサリプラチン、イリノテカン、シタラビンおよびラルチトレキセドからなる群から選択される、請求項１１に記載の組合せ製剤、請求項１２に記載の組成物、請求項２０もしくは２１に記載の方法または請求項２２に記載のｓｃＦｖペプチド。
【請求項２４】
患者に有効量の請求項１〜５のいずれか一項に記載のｓｃＦｖペプチドを投与することを含む、高レベルのＴＮＦαおよび／またはＩＬ−６が関与する症状を有する患者の処置方法。
【請求項２５】
高レベルのＴＮＦαおよび／またはＩＬ−６が関与する症状の処置に用いるための請求項１〜５のいずれか一項に記載のｓｃＦｖペプチド。
【請求項２６】
高レベルのＴＮＦαおよび／またはＩＬ−６が関与する症状が敗血症、ＳＩＲＳおよび自己免疫疾患からなる群から選択される、請求項２４に記載の方法、または請求項２５に記載のｓｃＦｖペプチド。
【請求項２７】
自己免疫疾患がクローン病、関節リウマチ、潰瘍性大腸炎および全身性紅斑性狼瘡からなる群から選択される、請求項２６に記載の方法またはｓｃＦｖペプチド。
【請求項２８】
請求項６〜９のいずれか一項に記載のヌクレオチド配列を含む、ベクター分子。
【請求項２９】
請求項２８に記載のベクター分子を含む、宿主細胞。
【請求項３０】
好適な転写制御エレメントの制御下に請求項６〜９のいずれか一項に記載の核酸分子を含む発現ベクターがその中に組み込まれている宿主細胞を、宿主細胞中での該ペプチドの発現に十分な条件下で培養し、それにより該ペプチドを産生させ、そして該細胞により産生されたペプチドを回収することを含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載のｓｃＦｖペプチドの産生方法。
【請求項１】
アミノ酸スペーサーにより連結されたＶＨドメインとＶＬドメインを含み、該ＶＨドメインが配列番号６４の配列と少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含み、そして該ＶＬドメインが配列番号６６の配列と少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含むｓｃＦｖペプチドであって、ＶＨドメインのＣ２８に相当する位置にアミノ酸置換または欠失を含む、ｓｃＦｖペプチド。
【請求項２】
ＶＨドメインのアミノ酸置換がＣ２８Ｙである、請求項１に記載のｓｃＦｖペプチド。
【請求項３】
アミノ酸スペーサーが配列(ＧＧＧＧＳ)ｎを含む、請求項１または２に記載のｓｃＦｖペプチド。
【請求項４】
Ｃ末端に精製タグ、好ましくは６ヒスチジン残基の配列をさらに含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載のｓｃＦｖペプチド。
【請求項５】
配列番号８、１０、１４、１８および２２(配列中、Ｘａａはシステイン以外のアミノ酸残基を表し、Ｎ末端メチオニン残基は所望により切断されていてもよく、好ましくは、Ｘａａはチロシン残基を表す)からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載のｓｃＦｖペプチド。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか一項に記載のｓｃＦｖペプチドをコードする配列を含む、核酸分子。
【請求項７】
ｓｃＦｖペプチドをコードする配列の３’末端に位置する配列(ｔａａ)ｎ(ｎは１または２である)をさらに含む、請求項６に記載の核酸分子。
【請求項８】
配列番号７、９、１３、１７および２１(配列中、ｎｎｎはシステイン残基以外のアミノ酸をコードするコドンである)からなる群から選択される配列を含む、請求項６または７に記載の核酸分子。
【請求項９】
ＤＮＡまたはＲＮＡ分子である、請求項６〜８のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項１０】
請求項１〜５のいずれか一項に記載のｓｃＦｖペプチドを薬学上許容される賦形剤、希釈剤または担体と組み合わせて含む、医薬組成物。
【請求項１１】
請求項１〜５のいずれか一項に記載のｓｃＦｖペプチドと抗真菌剤または抗癌剤を含む、組合せ製剤。
【請求項１２】
請求項１〜５のいずれか一項に記載のｓｃＦｖペプチドと抗真菌剤または抗癌剤を含む、組成物。
【請求項１３】
患者に有効量の請求項１〜５のいずれか一項に記載のｓｃＦｖペプチドを投与することを含む、真菌感染患者の処置方法。
【請求項１４】
患者に有効量の抗真菌剤を投与する工程をさらに含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
真菌感染の処置に用いるための請求項１〜５のいずれか一項に記載のｓｃＦｖペプチド。
【請求項１６】
真菌感染がカンジダ、クリプトコッカス、ヒストプラズマ、アスペルギルス、トルロプシス、ムコール症、ブラストミセス症、コクシジオイデス症またはパラコクシジオイデス症の生物体によるものである、請求項１３もしくは１４に記載の方法または請求項１５に記載のｓｃＦｖペプチド。
【請求項１７】
抗真菌剤がアゾール抗真菌剤、好ましくは、イトラコナゾール、ボリコナゾール、イサブコナゾール、フルコナゾール、ミコナゾール、ケトコナゾールおよびポサコナゾールからなる群から選択される、請求項１１に記載の組合せ製剤、請求項１２に記載の組成物、請求項１３、１４もしくは１６に記載の方法または請求項１５もしくは１６に記載のｓｃＦｖペプチド。
【請求項１８】
抗真菌剤がポリエン抗真菌剤およびエキノカンディン抗真菌剤からなる群から選択される、請求項１１に記載の組合せ製剤、請求項１２に記載の組成物、請求項１３、１４もしくは１６に記載の方法または請求項１４もしくは１６に記載のｓｃＦｖペプチド。
【請求項１９】
ポリエン抗真菌剤がアムホテリシンＢまたはその誘導体を含む、請求項１８に記載の組合せ製剤、組成物、方法またはｓｃＦｖペプチド。
【請求項２０】
処置を必要とする患者に請求項１〜５に記載の有効量のｓｃＦｖペプチドを投与することを含む、癌疾患患者の処置方法。
【請求項２１】
患者に有効量の少なくとも１つの他の抗癌剤を投与する工程をさらに含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
癌疾患の処置に用いるための、請求項１〜５のいずれか一項に記載のｓｃＦｖペプチド。
【請求項２３】
抗癌剤がドキソルビシン、ダウノルビシン、エピルビシン、ハーセプチン、ドセタキセル、シスプラチン、イマチニブ、パクリタキセル、ドセタキセル、ヒドロキシ尿素、５−フルオロウラシル、オキサリプラチン、イリノテカン、シタラビンおよびラルチトレキセドからなる群から選択される、請求項１１に記載の組合せ製剤、請求項１２に記載の組成物、請求項２０もしくは２１に記載の方法または請求項２２に記載のｓｃＦｖペプチド。
【請求項２４】
患者に有効量の請求項１〜５のいずれか一項に記載のｓｃＦｖペプチドを投与することを含む、高レベルのＴＮＦαおよび／またはＩＬ−６が関与する症状を有する患者の処置方法。
【請求項２５】
高レベルのＴＮＦαおよび／またはＩＬ−６が関与する症状の処置に用いるための請求項１〜５のいずれか一項に記載のｓｃＦｖペプチド。
【請求項２６】
高レベルのＴＮＦαおよび／またはＩＬ−６が関与する症状が敗血症、ＳＩＲＳおよび自己免疫疾患からなる群から選択される、請求項２４に記載の方法、または請求項２５に記載のｓｃＦｖペプチド。
【請求項２７】
自己免疫疾患がクローン病、関節リウマチ、潰瘍性大腸炎および全身性紅斑性狼瘡からなる群から選択される、請求項２６に記載の方法またはｓｃＦｖペプチド。
【請求項２８】
請求項６〜９のいずれか一項に記載のヌクレオチド配列を含む、ベクター分子。
【請求項２９】
請求項２８に記載のベクター分子を含む、宿主細胞。
【請求項３０】
好適な転写制御エレメントの制御下に請求項６〜９のいずれか一項に記載の核酸分子を含む発現ベクターがその中に組み込まれている宿主細胞を、宿主細胞中での該ペプチドの発現に十分な条件下で培養し、それにより該ペプチドを産生させ、そして該細胞により産生されたペプチドを回収することを含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載のｓｃＦｖペプチドの産生方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１−１】
【図２１−２】
【図２２−１】
【図２２−２】
【図２２−３】
【図２２−４】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１−１】
【図２１−２】
【図２２−１】
【図２２−２】
【図２２−３】
【図２２−４】
【公表番号】特表２０１０−５２４４８５（Ｐ２０１０−５２４４８５Ａ）
【公表日】平成２２年７月２２日（２０１０．７．２２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−５０４６８９（Ｐ２０１０−５０４６８９）
【出願日】平成２０年４月２４日（２００８．４．２４）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００８／０５５００６
【国際公開番号】ＷＯ２００８／１３２１３４
【国際公開日】平成２０年１１月６日（２００８．１１．６）
【出願人】（５０４３８９９９１）ノバルティス アーゲー (806)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２２年７月２２日（２０１０．７．２２）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年４月２４日（２００８．４．２４）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００８／０５５００６
【国際公開番号】ＷＯ２００８／１３２１３４
【国際公開日】平成２０年１１月６日（２００８．１１．６）
【出願人】（５０４３８９９９１）ノバルティス アーゲー (806)
【Ｆターム（参考）】
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