破骨細胞の分化・増殖阻害剤
【課題】
破骨細胞の分化及び／又は増殖に対する阻害作用を有する医薬及び食品を提供する。
【解決手段】
破骨細胞の分化及び／又は増殖に対する阻害作用を有する医薬又は食品であって、下記の式（１）で表される化合物を有効成分として含む医薬又は食品。
【化１】
破骨細胞の分化及び／又は増殖に対する阻害作用を有する医薬及び食品を提供する。
【解決手段】
破骨細胞の分化及び／又は増殖に対する阻害作用を有する医薬又は食品であって、下記の式（１）で表される化合物を有効成分として含む医薬又は食品。
【化１】
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、破骨細胞の分化及び／又は増殖を抑制する活性を有する化合物を有効成分として含む医薬及び該化合物を含む健康食品に関する。
【背景技術】
【０００２】
日本では２００６年９月には高齢化率が２０％を突破し、平均寿命も２２年間世界一の高齢化社会を維持している。７５歳以上に限っていえばその２／３は女性である。今後も高齢化率は上昇し続け、２０２５年には３０％程度になると予想されている。この急激な高齢化に伴い老化によるさまざまな慢性疾患が急増している。特に高齢者の生活の質を脅かす骨折とその原因となる骨粗鬆症の予防に関心が寄せられている。日本の骨粗鬆症患者は１０００万人を超え、その多くが閉経後骨粗鬆症であり、骨折の発生率は年間約１０％である。又、寝たきり高齢者の２０％が骨折を原因とすると言われている。
【０００３】
骨は常時、骨芽細胞による骨形成と破骨細胞による骨吸収を繰り返しながら一定の骨量を保ち、強度、形態を維持するといったリモデリングという営みを行っている臓器である。骨粗鬆症は、この骨リモデリングのバランスの破綻という骨代謝異常により発症する疾患である。閉経後骨粗鬆症とはエストロゲンの減少により、骨形成に比較し骨吸収の優位な亢進が生じる高回転代謝型の骨粗鬆症である。
【０００４】
破骨細胞は造血系の幹細胞に由来し、単球・マクロファージ系の前駆細胞から分化する巨細胞である。破骨細胞は正常な骨組織の発達及びリモデリングに関与しているが、骨粗鬆症における骨量減少、慢性関節リウマチにおける骨関節破壊、及び悪性腫瘍の骨転移などの病態に破骨細胞が重要な役割を果たしていることが知られている（非特許文献１及び２）。
【０００５】
進行性の悪性腫瘍はしばしば骨転移をきたし、患者のＱＯＬを損なう。骨転移の初期には、先ず破骨細胞が骨基質の破壊を促進し、そこに悪性腫瘍細胞が生着すると言われている。また、悪性腫瘍の成長に重要な血管新生促進因子と破骨細胞の骨吸収活性との間に強い因果関係があることが示唆されている（非特許文献３、４、５、及び６）。
【０００６】
これまで、骨粗鬆症治療薬としてはカルシウム製剤、エストロゲン製剤、イソフラボン製剤、カルシトニン製剤、ビスホスフォネート製剤、活性型ビタミンＤ製剤、選択的エストロゲン受容体モジュレーター（ＳＥＲＭ）製剤及びビタミンＫ製剤が使用されているが、副作用や、骨折予防効果がないなどの問題を抱えている。微生物由来の物質としてリベロマイシンＡ（特許文献１）、植物由来の物質として大豆やクローバーのイソフラボンやマチョエキス（特許文献２）が知られている。また、破骨細胞の分化及び増殖を抑制する医薬及び食品が提供されている（特許文献３及び４）。
【特許文献１】 特許第１９０５３３０号
【特許文献２】 特開２００３−３１３１３７号公報
【特許文献３】 国際公開ＷＯ２００５／０８７２４８
【特許文献４】 特願２００６−１９３７７２号
【非特許文献１】 Ｗｏｏｄｈｏｕｓｅ，Ｅ．Ｃ．，Ｃａｎｃｅｒ，８０（８Ｓｕｐｐｌ），ｐｐ．１５２９−１５３７，１９９７
【非特許文献２】 Ｐａｌｅｏｌｏｇ，Ｅ．Ｍ．，Ｊ．Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ．，３５，ｐｐ．９１７−９１９，１９９６
【非特許文献３】 Ｌｅｕｎｇ，Ｄ．Ｗ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４６，ｐｐ．１３０６−１３０９，１９８９
【非特許文献４】 Ｇｏａｄ，Ｄ．Ｌ．，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ，１３７，ｐｐ．２２６２−２２６８，１９９６
【非特許文献５】 Ｇｅｒｂｅｒ，Ｈ．Ｐ．，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．，５，ｐｐ．６２３−６２８，１９９９
【非特許文献６】 Ｎｉｉｄａ，Ｓ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１９０，ｐｐ．２９３−２９８，１９９９
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の課題は、骨粗鬆症における骨量減少の抑制や慢性関節リウマチにおける骨関節破壊、あるいは悪性腫瘍の骨転移などの予防及び／又は治療のために有用な医薬又は食品を提供することにある。より具体的には、破骨細胞の分化又は増殖に対して抑制作用を有する物質を有効成分として含む医薬又は食品を提供することが本発明の課題である。さらに、破骨細胞の分化又は増殖に対して抑制作用を有する物質であって、安全性の高い物質を提供することも本発明の課題である。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者は、安全性の高い物質を大量かつ安価に入手すべく、長い食習慣を有する食材としての茸に着目した。そして、上記の課題を解決すべく鋭意研究を行なった結果、茸粉砕物、茸抽出物などの茸の加工物が破骨細胞の分化又は増殖を抑制する作用を有することを見出した。そして、下記の式（１）で表される化合物が骨粗鬆症における骨量減少の抑制、慢性関節リウマチにおける骨関節破壊、又は悪性腫瘍の骨転移などの破骨細胞の分化又は増殖が関与する疾患の予防及び／又は治療のための医薬の有効成分として優れた作用を有していること、及び下記の式（１）で表される化合物を含む食品が上記疾患の予防及び／又は治療のための健康食品として有用であることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００９】
すなわち、本発明により、破骨細胞の分化及び／又は増殖が関与する疾患の予防及び／又は治療のための医薬であって、下記の式（１）：
【化１】
で表される化合物を有効成分として含む医薬が提供される。
【００１０】
上記発明の好ましい態様によれば、破骨細胞の分化及び／又は増殖が関与する疾患が、骨粗鬆症、慢性関節リウマチ、及び悪性腫瘍からなる群から選ばれる疾患である上記の医薬、及び骨粗鬆症における骨量減少の抑制、慢性関節リウマチにおける骨関節破壊、又は悪性腫瘍の骨転移の予防及び／又は治療のために用いる上記の医薬が提供される。
【００１１】
別の観点からは、破骨細胞の分化及び／又は増殖に対する阻害作用を有する医薬であって、上記式（１）で表される化合物を有効成分として含む医薬；及び、上記式（１）で表される化合物を有効成分として含む破骨細胞の分化及び／又は増殖の阻害剤が提供される。
また、上記の医薬の製造のための上記式（１）で表される化合物の使用、及びヒトを含む哺乳類動物の体内において破骨細胞の分化及び／又は増殖を阻害する方法であって、上記式（１）で表される化合物を該動物に投与する工程を含む方法、破骨細胞の分化及び／又は増殖が関与する疾患の予防及び／又は治療方法であって、上記式（１）で表される化合物をヒトを含む哺乳類動物に投与する工程を含む方法が本発明により提供される。
【００１２】
さらに別の観点からは、破骨細胞の分化及び／又は増殖に対する阻害作用を有する食品であって、上記式（１）で表される化合物を有効成分として含む食品が本発明により提供される。上記発明の好ましい態様によれば、飲食品の形態の上記食品も本発明により提供される。
【発明の効果】
【００１３】
本発明の医薬は、破骨細胞の分化及び／又は増殖に対する阻害作用を有しており、破骨細胞の分化及び／又は増殖が関与する疾患（例えば、骨粗鬆症、慢性関節リウマチ、又は悪性腫瘍など）の予防及び／又は治療のための医薬として有用である。上記の医薬は、特に骨粗鬆症における骨量減少の抑制、慢性関節リウマチにおける骨関節破壊、又は悪性腫瘍の骨転移の予防及び／又は治療のために用いることができる。
【００１４】
また、本発明の食品は、破骨細胞の分化及び／又は増殖に対する阻害作用を有しており、例えば骨粗鬆症における骨量減少の抑制、慢性関節リウマチにおける骨関節破壊、又は悪性腫瘍の骨転移の予防及び／又は治療などを目的とする健康食品として用いることができる。
さらに、本発明により提供される上記式（１）で表される化合物は、上記の医薬又は上記食品の有効成分として有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
本発明により提供される医薬及び食品の有効成分である上記式（１）で表される化合物は酸化エルゴステロールで既知化合物である。しかし、上記式（１）で表される酸化エルゴステロールが破骨細胞の分化及び／又は増殖に対して抑制作用を有していることは知られていない。
【００１６】
上記式（１）で表される化合物は、例えば本明細書の実施例に具体的に記載された方法に従って、茶樹茸から分離・精製することができるが、茶樹茸に限定されるものではなく、上記式（１）で表される化合物を含むあらゆる茸類を用いることができる。また、化学合成手段により製造することも可能であり、エルゴステロールを酵素的あるいは非酵素的に酸化することにより上記式（１）で表される化合物を製造することもできる。
【００１７】
エルゴステロールは骨形成にかかわるのに対して、その分解物である上記式（１）で表される化合物が破骨細胞の分化及び／又は増殖に対して阻害作用を呈することを発見した。また、下記式（２）及び式（３）で表される化合物（式中、Ｒ１及びＲ２は水素原子、アルキル基、又はアルカノイル基を示し、式中の立体配置は絶対配置を示す）が同様の活性を有することが知られている（上記特許文献４）。本発明者は、これらの下記式（２）及び式（３）で表される化合物は上記式（１）で表される化合物を分解して得られることを発見している。すなわち、容易に入手できるエルゴステロールを分解して、これらの物質の製造方法を提供できる。
【化２】
【００１８】
本発明の医薬は、破骨細胞の分化及び／又は増殖に対して抑制作用を有している。この作用はインビトロで破骨細胞活性に対する直接作用を調べることにより当業者が容易に確認することができ、例えば本明細書の実施例に具体的に説明された方法に従って確認することができる。
【００１９】
本発明の医薬は、破骨細胞の分化及び／又は増殖が関与する疾患の予防及び／又は治療のための医薬として用いることができる。上記疾患としては、例えば、骨粗鬆症、慢性関節リウマチ、又は悪性腫瘍などを挙げることができるが、本発明の医薬の適用疾患はこれらの疾患に限定されることはない。より具体的には、本発明の医薬は、骨粗鬆症における骨量減少の抑制、慢性関節リウマチにおける骨関節破壊、又は悪性腫瘍の骨転移の予防及び／又は治療のための医薬として好ましく用いられる。
【００２０】
本発明の医薬としては、有効成分である上記式（１）で表される化合物、又はそれらの混合物を単独で投与してもよいが、骨組織と親和性の強い化合物、たんぱく質、又はペプチドなどの物質と組み合わせた医薬組成物、又はこれらの物質と上記式（１）で表される化合物とを結合させた有効成分を含む医薬を調製して投与することもできる。医薬組成物として調製する場合には、医薬の製造に通常用いられる１種又は２種以上の製剤用添加物（例えば賦形剤、崩壊剤、結合剤、滑沢剤、分散化剤、又は香料など）を用いることができ、常法により、液剤、錠剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤、ドライシロップ剤、チュアブル剤等の経口投与用の医薬組成物を調製することができる。また、注射剤や坐剤などの非経口投与用の医薬組成物を調製してもよい。
【００２１】
本発明の医薬の投与量は特に限定されず、患者の体重、性別、及び年齢等の条件、予防又は治療の目的、対象疾患の種類などの条件に応じて適宜選択できる。通常は、有効成分である上記式（１）で表される化合物の重量として成人１日あたり１〜１，０００ｍｇ程度である。
【００２２】
本発明により提供される食品は、破骨細胞の分化及び／又は増殖に対する阻害作用を有する食品であって、上記式（１）で表される化合物を有効成分として含むことを特徴としている。本発明の食品の種類は特に限定されず、例えば、健康飲料、菓子類、加工食品などに適宜の量の上記式（１）で表される化合物を配合することが可能である。本発明の食品は、骨量減少の抑制や骨関節破壊などの予防を目的とした健康食品として用いることができるが、本発明の食品の使用目的は上記に例示した目的に限定されることはない。
【実施例】
【００２３】
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明の範囲は下記の実施例に限定されることはない。
【００２４】
（１）抽出法
茶樹茸の乾燥粉末１００ｇをクロロホルム：メタノール（Ｃ−Ｍ）混液（２：１）１，０００ｍｌで１昼夜、室温にて抽出した。ろ過後、残渣をＣ−Ｍ混液（１：２）１，０００ｍｌで更に２昼夜、室温抽出し、２：１抽出液と混合して溶媒を減圧留去した。乾燥後、Ｃ−Ｍ混液（２：１）８００ｍｌに溶解し、水２００ｍｌ加えて振とうした。放置すると２層に分離するので、上層（高極性画分）と下層（低極性画分）に分け、下層の溶媒を減圧留去し、乾燥して４．０８ｇを得た。乾燥した下層抽出物をＣ−Ｍ−水（Ｗ）（９５：５：０．１）に溶解し、粒状シリカゲル（Ｉａｔｏｒｏｂｅａｄｓ、６０μ、ヤトロン社）クロマトグラフィー（２．５ｘ６０ｃｍ）を行った。
【００２５】
（２）脾臓細胞を用いた破骨細胞の誘導
８週齢のＣ５７ＢＬ６雌マウスより脾臓を採取し、細切後充分にピペッティングして細胞を採取し、１０％牛胎児血清入りＲＰＭＩ培養液にて２回洗浄する。得られた細胞を１ｘ１０６／ｍｌに浮遊し、ＭＣＳＦ（ＳＩＧＭＡ社）を終濃度１５ｎｇ／ｍｌに添加し１６時間培養する。培養後、細胞を上記培養液にて２回洗浄後、２ｘ１０６／ｍｌの細胞浮遊液を作成し、ＭＣＳＦ３０ｎｇ／ｍｌ ＲＡＮＫＬ５０ｎｇ／ｍｌ（Ｒ＆Ｄ社）になるように添加する。細胞浮遊液を１００μｌずつ９６穴培養プレートに播種する。つづいて（１）のクロマトグラフィーの各分画をＤＭＳＯにて溶解したものを終濃度１００ｐｐｍから２倍段階希釈した溶液を１００μｌずつ培養プレートに添加する。３７℃にて７日間培養する。
【００２６】
（３）毒性試験
（２）にて７日間培養した細胞に細胞活性測定ＭＴＴアッセイ変法であるＷＳＴ−１法（ＷＳＴ−１キット、宝バイオ）試薬５０ｍｌ添加し２時間培養器にて培養後、エライザプレートリーダー（波長４７０ｎｍ）にて測定した。陰性コントロールとして培養液のみのプレート、陽性コントロールとして界面活性剤Ｔｗｅｅｎ−２０を終濃度２％になるように添加したものを用いた。その結果、いずれの分画にも有意な毒性は認められなかった。
【００２７】
（４）酒石酸抵抗性酸フォスファターゼ（ＴＲＡＰ）活性定量
破骨細胞の活性測定を目的として培養細胞中のＴＲＡＰ活性を、活性測定した。Ｌｕ−Ｐｉｎｇら（Ａｃａｔａ Ｐｈａｒｍａ ａｃｏｌ Ｓｉｎ２００３，２４（２），１８１−１８６）の方法に従った。培養ウエルに１０μｌのＴｒｉｔｏｎＸ−１００を添加し１０分間細胞を融解した。その後ＴＲＡＰアッセイ液（０．４ｇｐ−ｎｉｔｒｏ−ｄｉｓｏｄｉｕｍ ｐｈｅｎｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｅ、２ｇ ｐｏｔｔｓｓｉｕｍ ｔａｒｔｒａｔｅを１５０ｍｌの純水に溶解後塩酸にてｐＨ３．５に調整し、最終的に２００ｍｌに純水にて作成）を細胞溶解液に１００μｌ添加３７℃にて３０分反応させたのち１規定の水酸化ナトリウムにて反応を停止し、吸光度を４０５ｎｍにて測定した。（１）のクロマトグラフィーの各分画について検討したところ、第９分画に強い活性が１００、１０ｐｐｍの濃度で認められた。同分画の再分画にて第２分画に再現性良く強い抑制活性が認められた。さらに再分画して検討したところ第１３分画に２ｐｐｍという低濃度で強い抑制活性を認めた。同分画（分画９−２−１３）の動物での活性を検討すべく卵巣摘除マウスに投与する実験に進んだ。
【００２８】
（５）卵巣摘除マウスの作成
８−２０週齢の雌マウスを用いた。マウスを１０％ネンブタールにて麻酔したのち、後腹膜を開放し、卵巣を確認した。その後、卵管采子宮側に４−０絹糸を用いて結紮し、卵巣周囲脂肪組織と一塊に卵巣を摘除した。コントロールとして卵巣を確認した後閉腹させたものを同様に作成した。
【００２９】
（６）骨レントゲン写真撮影
Ｓｏｆｒｏｎ Ｔｙｐｅ ＳＲＯ−Ｍ５０（ＳＰＯＫＥＮ社）にて撮影した。
【００３０】
（７）骨カルシウム含量の定量（ＤＥＸＡ法：Ｄｕａｌ−ｅｎｅｒｇｙ−Ｘ−ｒａｙ−ａｂｓｏｒｐｔｉｏｍｅｔｒｙ）
骨塩量の測定をＤＥＸＡ法にておこなった。ＱＤＲ−１０００ｗ ｐｌｕｓ Ｄｅｎｓｉｔｏｍｅｔｅｒ（ＨＯＬＯＧＩＣ社）をヒト腰椎ファントムにてキャリブレーションした後に、７０％エタノールにて固定したマウス大腿骨および頚骨の骨塩量を定量した。骨は卵巣摘除後、１、２、３、４週にて採取したものを用いた。スキャンは直径１．２７０ｍｍのｃｏｌｌｉｍａｔｏｒ、０．７６２ｍｍのｌｉｎｅ Ｓｐａｃｉｎｇ、０．３８０ｍｍのｐｏｉｎｔ ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎにて行い、ａｑｕｉｓｉｔｉｏｎ ｔｉｍｅは９分とした。得られた値をＢＭＤ（ｂｏｎｅ ｍｉｎｅｒａｌ ｄｅｎｓｉｔｙ）ｍｇ／ｃｍ２として表出した。
【００３１】
（８）血漿コラーゲンテロペプチド（ＣＴＸ：Ｃ−ｔｅｒｍｉｎａｌ ｔｅｌｏｐｅｐｔｉｄｅ ｏｆ ｔｙｐｅ Ｉ ｃｏｌｌａｇｅｎ）の測定
ＮＯＲＤＩＣ社製造ＣＴＸ定量キットを用いて血漿ＣＴＸ濃度を定量した。
【００３２】
（９）骨形態計測
骨形態計測はＢｏｎｅ ｍｏｒｐｈｏｍｅｔｒｙ ｓｏｆｔｗｅａｒ（Ｓｙｓｔｅｍ Ｓｕｐｐｌｙ社）を装備したデジタイザー連結ニコンＬａｂｐｈｏｔｏ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅにて計測した。データはＡＳＢＭＲ（Ａｍｅｒｉｃａｎ ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ ｂｏｎｅ ａｎｄ ｍｉｎｅｒａｌ ｒｅｓｅａｒｃｈ）の規約に従って計算した。（Ｐａｒｔｉｆ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｏｎｅ Ｍｉｎｅｒ Ｒｅｓ １９８７，７（２），５９５−６１０）
【００３３】
（１０）統計解析
Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ−ｔｅｓｔを用いて実験群およびコントロール群の優位差を検討した。Ｐ＜０．０５を閾値として優位とした。
【００３４】
（１１）卵巣摘除マウスを用いた分画９−２−１３の抑制活性の検討
マウスに１０ｐｐｍの濃度となるように調整した分画９−２−１３を浸透圧ポンプを用いて２週間投与した。卵巣除去後初めの２週間および後半の２週間投与し、血漿および骨を採取した。血漿ではＣＴＸ濃度に変化はなかった。骨エックス線の検討でも優位な差はなかった。ＢＭＤにても差は認められなかった。つぎに骨形態計測をＨＥ染色大腿骨標本にて検討した。分画９−２−１３は、Ｔｒａｂｅｃｕｌａｒ ｂｏｎｅ ｖｏｌｕｍｅおよびＴｒａｂｅｃｕｌａｒ ｔｈｉｃｋｎｅｓｓに有意な抑制活性を示した。しかし皮質骨の形態には有意な差は認められなかった。
【００３５】
以上の結果により、分画９−２−１３にインビトロおよびインビボにて骨吸収抑制活性が認められた。とくに閉経後骨粗鬆症のモデルである卵巣摘除マウスにおける骨吸収抑制活性は重要な知見を与えた。
【００３６】
【表１】
【００３７】
（１２）構造解析
茶樹茸より得られた分画９−２−１３の構造解析を行った。質量分析（ＥＩ−ＭＳ）により、ｍ／ｚ４２８（分子量）、ｍ／ｚ４１０（脱水ピーク）、ｍ／ｚ３９６（脱酸素ピーク）が観測された。また、ミリマスによる元素分析の結果、Ｃ２６Ｈ４４０３の組成式を持つことが明らかになった。このことから、不飽和数７が計算される。
【００３８】
一次元プロトンＮＭＲスペクトルより、プロトン数とメチル基の数および質量分析の結果からこの物質はトリテルペンあるいはステロイド系と予測された。２重結合は２組存在すること、一組（δ５．１５ｐｐｍ）はトランス型で他の一組（δ６．３５ｐｐｍ）はシス型であることが判明した。
また、この化合物をアセチル化してＮＭＲを測定したところ、δ３．９０ｐｐｍのｍｕｌｔｉｐｌｅｔがδ５．００ｐｐｍに低磁場シフトすることから、δ３．９０ｐｐｍのピークは二級水酸基の付け根の水素であることが証明された。
２次元ＣＯＳＹスペクトルから、シス−二重結合は孤立二重結合であり、トランスのそれは１、２−２置換であることが明らかである。
１次元Ｃａｒｂｏｎ−ＮＭＲより、四級炭素に結合するメチル基が２個、メチンに結合するメチル基が４個であることが明らかである。更に、メチンが６個、メチレンが６個、四級炭素が４個検出された。以下に帰属した炭素を示す（ＣＤＣ１３、室温、１２５．７６Ｈｚ）。Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｈｉｆｔ（ｐｐｍ）：３０．１０（１Ｃ）、３４．６８（２Ｃ）、６６．４３（３Ｃ）、３９．３３（４Ｃ）、８２．１３（５Ｃ）、１３５．１８（６Ｃ）、１３０．７３（７Ｃ）、７９．３９（８Ｃ）、５１．０８（９Ｃ）、３６．９４（１０Ｃ）、２０．６１（１１Ｃ）、３６．９１（１２Ｃ）、４４．５４（１３Ｃ）、５１．６７（１４Ｃ）、２３．３８（１５Ｃ）、２８．６２（１６Ｃ）、５６．１９（１７Ｃ）、１２．８５（１８Ｃ）、１８．１５（１９Ｃ）、３９．７０（２０Ｃ）、２０．８５（２１Ｃ）、１３５．４０（２２Ｃ）、１３２．３０（２３Ｃ）、４２．７５（２４Ｃ）、３３．０４（２５Ｃ）、１９．９２（２６Ｃ）、１９．６２（２７Ｃ）、１７．５４（２８Ｃ）。
また、ＨＳＱＣ−ＴＯＣＳＹでは炭素と水素の結合状態（ＨＳＱＣ）や隣接する水素や遠隔水素間および水素−炭素間のカップリングが観測される（ＴＯＣＳＹ）ため、炭素と水素の帰属が完全となった。
【００３９】
以上の結果より、茶樹茸から得られた酸化エルゴステロールは構造既知の学名２２Ｅ，２４Ｅ−５α，８α−ｅｐｉｄｉｏｘｙｅｒｕｇｏｓｔａ−６，２２−ｄｉｅｎｅ−３β−ｏｌであった。本物質はエルゴステロールが酵素的あるいは非酵素的に生体内で酸化されたものと推定される。これはプロビタミンＤであるエルゴステロールが紫外線によってビタミンＤ前駆体になるように、紫外線やその他の活性物質に反応性が高いことに起因する。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、破骨細胞の分化及び／又は増殖を抑制する活性を有する化合物を有効成分として含む医薬及び該化合物を含む健康食品に関する。
【背景技術】
【０００２】
日本では２００６年９月には高齢化率が２０％を突破し、平均寿命も２２年間世界一の高齢化社会を維持している。７５歳以上に限っていえばその２／３は女性である。今後も高齢化率は上昇し続け、２０２５年には３０％程度になると予想されている。この急激な高齢化に伴い老化によるさまざまな慢性疾患が急増している。特に高齢者の生活の質を脅かす骨折とその原因となる骨粗鬆症の予防に関心が寄せられている。日本の骨粗鬆症患者は１０００万人を超え、その多くが閉経後骨粗鬆症であり、骨折の発生率は年間約１０％である。又、寝たきり高齢者の２０％が骨折を原因とすると言われている。
【０００３】
骨は常時、骨芽細胞による骨形成と破骨細胞による骨吸収を繰り返しながら一定の骨量を保ち、強度、形態を維持するといったリモデリングという営みを行っている臓器である。骨粗鬆症は、この骨リモデリングのバランスの破綻という骨代謝異常により発症する疾患である。閉経後骨粗鬆症とはエストロゲンの減少により、骨形成に比較し骨吸収の優位な亢進が生じる高回転代謝型の骨粗鬆症である。
【０００４】
破骨細胞は造血系の幹細胞に由来し、単球・マクロファージ系の前駆細胞から分化する巨細胞である。破骨細胞は正常な骨組織の発達及びリモデリングに関与しているが、骨粗鬆症における骨量減少、慢性関節リウマチにおける骨関節破壊、及び悪性腫瘍の骨転移などの病態に破骨細胞が重要な役割を果たしていることが知られている（非特許文献１及び２）。
【０００５】
進行性の悪性腫瘍はしばしば骨転移をきたし、患者のＱＯＬを損なう。骨転移の初期には、先ず破骨細胞が骨基質の破壊を促進し、そこに悪性腫瘍細胞が生着すると言われている。また、悪性腫瘍の成長に重要な血管新生促進因子と破骨細胞の骨吸収活性との間に強い因果関係があることが示唆されている（非特許文献３、４、５、及び６）。
【０００６】
これまで、骨粗鬆症治療薬としてはカルシウム製剤、エストロゲン製剤、イソフラボン製剤、カルシトニン製剤、ビスホスフォネート製剤、活性型ビタミンＤ製剤、選択的エストロゲン受容体モジュレーター（ＳＥＲＭ）製剤及びビタミンＫ製剤が使用されているが、副作用や、骨折予防効果がないなどの問題を抱えている。微生物由来の物質としてリベロマイシンＡ（特許文献１）、植物由来の物質として大豆やクローバーのイソフラボンやマチョエキス（特許文献２）が知られている。また、破骨細胞の分化及び増殖を抑制する医薬及び食品が提供されている（特許文献３及び４）。
【特許文献１】 特許第１９０５３３０号
【特許文献２】 特開２００３−３１３１３７号公報
【特許文献３】 国際公開ＷＯ２００５／０８７２４８
【特許文献４】 特願２００６−１９３７７２号
【非特許文献１】 Ｗｏｏｄｈｏｕｓｅ，Ｅ．Ｃ．，Ｃａｎｃｅｒ，８０（８Ｓｕｐｐｌ），ｐｐ．１５２９−１５３７，１９９７
【非特許文献２】 Ｐａｌｅｏｌｏｇ，Ｅ．Ｍ．，Ｊ．Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ．，３５，ｐｐ．９１７−９１９，１９９６
【非特許文献３】 Ｌｅｕｎｇ，Ｄ．Ｗ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４６，ｐｐ．１３０６−１３０９，１９８９
【非特許文献４】 Ｇｏａｄ，Ｄ．Ｌ．，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ，１３７，ｐｐ．２２６２−２２６８，１９９６
【非特許文献５】 Ｇｅｒｂｅｒ，Ｈ．Ｐ．，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．，５，ｐｐ．６２３−６２８，１９９９
【非特許文献６】 Ｎｉｉｄａ，Ｓ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１９０，ｐｐ．２９３−２９８，１９９９
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の課題は、骨粗鬆症における骨量減少の抑制や慢性関節リウマチにおける骨関節破壊、あるいは悪性腫瘍の骨転移などの予防及び／又は治療のために有用な医薬又は食品を提供することにある。より具体的には、破骨細胞の分化又は増殖に対して抑制作用を有する物質を有効成分として含む医薬又は食品を提供することが本発明の課題である。さらに、破骨細胞の分化又は増殖に対して抑制作用を有する物質であって、安全性の高い物質を提供することも本発明の課題である。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者は、安全性の高い物質を大量かつ安価に入手すべく、長い食習慣を有する食材としての茸に着目した。そして、上記の課題を解決すべく鋭意研究を行なった結果、茸粉砕物、茸抽出物などの茸の加工物が破骨細胞の分化又は増殖を抑制する作用を有することを見出した。そして、下記の式（１）で表される化合物が骨粗鬆症における骨量減少の抑制、慢性関節リウマチにおける骨関節破壊、又は悪性腫瘍の骨転移などの破骨細胞の分化又は増殖が関与する疾患の予防及び／又は治療のための医薬の有効成分として優れた作用を有していること、及び下記の式（１）で表される化合物を含む食品が上記疾患の予防及び／又は治療のための健康食品として有用であることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００９】
すなわち、本発明により、破骨細胞の分化及び／又は増殖が関与する疾患の予防及び／又は治療のための医薬であって、下記の式（１）：
【化１】
で表される化合物を有効成分として含む医薬が提供される。
【００１０】
上記発明の好ましい態様によれば、破骨細胞の分化及び／又は増殖が関与する疾患が、骨粗鬆症、慢性関節リウマチ、及び悪性腫瘍からなる群から選ばれる疾患である上記の医薬、及び骨粗鬆症における骨量減少の抑制、慢性関節リウマチにおける骨関節破壊、又は悪性腫瘍の骨転移の予防及び／又は治療のために用いる上記の医薬が提供される。
【００１１】
別の観点からは、破骨細胞の分化及び／又は増殖に対する阻害作用を有する医薬であって、上記式（１）で表される化合物を有効成分として含む医薬；及び、上記式（１）で表される化合物を有効成分として含む破骨細胞の分化及び／又は増殖の阻害剤が提供される。
また、上記の医薬の製造のための上記式（１）で表される化合物の使用、及びヒトを含む哺乳類動物の体内において破骨細胞の分化及び／又は増殖を阻害する方法であって、上記式（１）で表される化合物を該動物に投与する工程を含む方法、破骨細胞の分化及び／又は増殖が関与する疾患の予防及び／又は治療方法であって、上記式（１）で表される化合物をヒトを含む哺乳類動物に投与する工程を含む方法が本発明により提供される。
【００１２】
さらに別の観点からは、破骨細胞の分化及び／又は増殖に対する阻害作用を有する食品であって、上記式（１）で表される化合物を有効成分として含む食品が本発明により提供される。上記発明の好ましい態様によれば、飲食品の形態の上記食品も本発明により提供される。
【発明の効果】
【００１３】
本発明の医薬は、破骨細胞の分化及び／又は増殖に対する阻害作用を有しており、破骨細胞の分化及び／又は増殖が関与する疾患（例えば、骨粗鬆症、慢性関節リウマチ、又は悪性腫瘍など）の予防及び／又は治療のための医薬として有用である。上記の医薬は、特に骨粗鬆症における骨量減少の抑制、慢性関節リウマチにおける骨関節破壊、又は悪性腫瘍の骨転移の予防及び／又は治療のために用いることができる。
【００１４】
また、本発明の食品は、破骨細胞の分化及び／又は増殖に対する阻害作用を有しており、例えば骨粗鬆症における骨量減少の抑制、慢性関節リウマチにおける骨関節破壊、又は悪性腫瘍の骨転移の予防及び／又は治療などを目的とする健康食品として用いることができる。
さらに、本発明により提供される上記式（１）で表される化合物は、上記の医薬又は上記食品の有効成分として有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
本発明により提供される医薬及び食品の有効成分である上記式（１）で表される化合物は酸化エルゴステロールで既知化合物である。しかし、上記式（１）で表される酸化エルゴステロールが破骨細胞の分化及び／又は増殖に対して抑制作用を有していることは知られていない。
【００１６】
上記式（１）で表される化合物は、例えば本明細書の実施例に具体的に記載された方法に従って、茶樹茸から分離・精製することができるが、茶樹茸に限定されるものではなく、上記式（１）で表される化合物を含むあらゆる茸類を用いることができる。また、化学合成手段により製造することも可能であり、エルゴステロールを酵素的あるいは非酵素的に酸化することにより上記式（１）で表される化合物を製造することもできる。
【００１７】
エルゴステロールは骨形成にかかわるのに対して、その分解物である上記式（１）で表される化合物が破骨細胞の分化及び／又は増殖に対して阻害作用を呈することを発見した。また、下記式（２）及び式（３）で表される化合物（式中、Ｒ１及びＲ２は水素原子、アルキル基、又はアルカノイル基を示し、式中の立体配置は絶対配置を示す）が同様の活性を有することが知られている（上記特許文献４）。本発明者は、これらの下記式（２）及び式（３）で表される化合物は上記式（１）で表される化合物を分解して得られることを発見している。すなわち、容易に入手できるエルゴステロールを分解して、これらの物質の製造方法を提供できる。
【化２】
【００１８】
本発明の医薬は、破骨細胞の分化及び／又は増殖に対して抑制作用を有している。この作用はインビトロで破骨細胞活性に対する直接作用を調べることにより当業者が容易に確認することができ、例えば本明細書の実施例に具体的に説明された方法に従って確認することができる。
【００１９】
本発明の医薬は、破骨細胞の分化及び／又は増殖が関与する疾患の予防及び／又は治療のための医薬として用いることができる。上記疾患としては、例えば、骨粗鬆症、慢性関節リウマチ、又は悪性腫瘍などを挙げることができるが、本発明の医薬の適用疾患はこれらの疾患に限定されることはない。より具体的には、本発明の医薬は、骨粗鬆症における骨量減少の抑制、慢性関節リウマチにおける骨関節破壊、又は悪性腫瘍の骨転移の予防及び／又は治療のための医薬として好ましく用いられる。
【００２０】
本発明の医薬としては、有効成分である上記式（１）で表される化合物、又はそれらの混合物を単独で投与してもよいが、骨組織と親和性の強い化合物、たんぱく質、又はペプチドなどの物質と組み合わせた医薬組成物、又はこれらの物質と上記式（１）で表される化合物とを結合させた有効成分を含む医薬を調製して投与することもできる。医薬組成物として調製する場合には、医薬の製造に通常用いられる１種又は２種以上の製剤用添加物（例えば賦形剤、崩壊剤、結合剤、滑沢剤、分散化剤、又は香料など）を用いることができ、常法により、液剤、錠剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤、ドライシロップ剤、チュアブル剤等の経口投与用の医薬組成物を調製することができる。また、注射剤や坐剤などの非経口投与用の医薬組成物を調製してもよい。
【００２１】
本発明の医薬の投与量は特に限定されず、患者の体重、性別、及び年齢等の条件、予防又は治療の目的、対象疾患の種類などの条件に応じて適宜選択できる。通常は、有効成分である上記式（１）で表される化合物の重量として成人１日あたり１〜１，０００ｍｇ程度である。
【００２２】
本発明により提供される食品は、破骨細胞の分化及び／又は増殖に対する阻害作用を有する食品であって、上記式（１）で表される化合物を有効成分として含むことを特徴としている。本発明の食品の種類は特に限定されず、例えば、健康飲料、菓子類、加工食品などに適宜の量の上記式（１）で表される化合物を配合することが可能である。本発明の食品は、骨量減少の抑制や骨関節破壊などの予防を目的とした健康食品として用いることができるが、本発明の食品の使用目的は上記に例示した目的に限定されることはない。
【実施例】
【００２３】
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明の範囲は下記の実施例に限定されることはない。
【００２４】
（１）抽出法
茶樹茸の乾燥粉末１００ｇをクロロホルム：メタノール（Ｃ−Ｍ）混液（２：１）１，０００ｍｌで１昼夜、室温にて抽出した。ろ過後、残渣をＣ−Ｍ混液（１：２）１，０００ｍｌで更に２昼夜、室温抽出し、２：１抽出液と混合して溶媒を減圧留去した。乾燥後、Ｃ−Ｍ混液（２：１）８００ｍｌに溶解し、水２００ｍｌ加えて振とうした。放置すると２層に分離するので、上層（高極性画分）と下層（低極性画分）に分け、下層の溶媒を減圧留去し、乾燥して４．０８ｇを得た。乾燥した下層抽出物をＣ−Ｍ−水（Ｗ）（９５：５：０．１）に溶解し、粒状シリカゲル（Ｉａｔｏｒｏｂｅａｄｓ、６０μ、ヤトロン社）クロマトグラフィー（２．５ｘ６０ｃｍ）を行った。
【００２５】
（２）脾臓細胞を用いた破骨細胞の誘導
８週齢のＣ５７ＢＬ６雌マウスより脾臓を採取し、細切後充分にピペッティングして細胞を採取し、１０％牛胎児血清入りＲＰＭＩ培養液にて２回洗浄する。得られた細胞を１ｘ１０６／ｍｌに浮遊し、ＭＣＳＦ（ＳＩＧＭＡ社）を終濃度１５ｎｇ／ｍｌに添加し１６時間培養する。培養後、細胞を上記培養液にて２回洗浄後、２ｘ１０６／ｍｌの細胞浮遊液を作成し、ＭＣＳＦ３０ｎｇ／ｍｌ ＲＡＮＫＬ５０ｎｇ／ｍｌ（Ｒ＆Ｄ社）になるように添加する。細胞浮遊液を１００μｌずつ９６穴培養プレートに播種する。つづいて（１）のクロマトグラフィーの各分画をＤＭＳＯにて溶解したものを終濃度１００ｐｐｍから２倍段階希釈した溶液を１００μｌずつ培養プレートに添加する。３７℃にて７日間培養する。
【００２６】
（３）毒性試験
（２）にて７日間培養した細胞に細胞活性測定ＭＴＴアッセイ変法であるＷＳＴ−１法（ＷＳＴ−１キット、宝バイオ）試薬５０ｍｌ添加し２時間培養器にて培養後、エライザプレートリーダー（波長４７０ｎｍ）にて測定した。陰性コントロールとして培養液のみのプレート、陽性コントロールとして界面活性剤Ｔｗｅｅｎ−２０を終濃度２％になるように添加したものを用いた。その結果、いずれの分画にも有意な毒性は認められなかった。
【００２７】
（４）酒石酸抵抗性酸フォスファターゼ（ＴＲＡＰ）活性定量
破骨細胞の活性測定を目的として培養細胞中のＴＲＡＰ活性を、活性測定した。Ｌｕ−Ｐｉｎｇら（Ａｃａｔａ Ｐｈａｒｍａ ａｃｏｌ Ｓｉｎ２００３，２４（２），１８１−１８６）の方法に従った。培養ウエルに１０μｌのＴｒｉｔｏｎＸ−１００を添加し１０分間細胞を融解した。その後ＴＲＡＰアッセイ液（０．４ｇｐ−ｎｉｔｒｏ−ｄｉｓｏｄｉｕｍ ｐｈｅｎｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｅ、２ｇ ｐｏｔｔｓｓｉｕｍ ｔａｒｔｒａｔｅを１５０ｍｌの純水に溶解後塩酸にてｐＨ３．５に調整し、最終的に２００ｍｌに純水にて作成）を細胞溶解液に１００μｌ添加３７℃にて３０分反応させたのち１規定の水酸化ナトリウムにて反応を停止し、吸光度を４０５ｎｍにて測定した。（１）のクロマトグラフィーの各分画について検討したところ、第９分画に強い活性が１００、１０ｐｐｍの濃度で認められた。同分画の再分画にて第２分画に再現性良く強い抑制活性が認められた。さらに再分画して検討したところ第１３分画に２ｐｐｍという低濃度で強い抑制活性を認めた。同分画（分画９−２−１３）の動物での活性を検討すべく卵巣摘除マウスに投与する実験に進んだ。
【００２８】
（５）卵巣摘除マウスの作成
８−２０週齢の雌マウスを用いた。マウスを１０％ネンブタールにて麻酔したのち、後腹膜を開放し、卵巣を確認した。その後、卵管采子宮側に４−０絹糸を用いて結紮し、卵巣周囲脂肪組織と一塊に卵巣を摘除した。コントロールとして卵巣を確認した後閉腹させたものを同様に作成した。
【００２９】
（６）骨レントゲン写真撮影
Ｓｏｆｒｏｎ Ｔｙｐｅ ＳＲＯ−Ｍ５０（ＳＰＯＫＥＮ社）にて撮影した。
【００３０】
（７）骨カルシウム含量の定量（ＤＥＸＡ法：Ｄｕａｌ−ｅｎｅｒｇｙ−Ｘ−ｒａｙ−ａｂｓｏｒｐｔｉｏｍｅｔｒｙ）
骨塩量の測定をＤＥＸＡ法にておこなった。ＱＤＲ−１０００ｗ ｐｌｕｓ Ｄｅｎｓｉｔｏｍｅｔｅｒ（ＨＯＬＯＧＩＣ社）をヒト腰椎ファントムにてキャリブレーションした後に、７０％エタノールにて固定したマウス大腿骨および頚骨の骨塩量を定量した。骨は卵巣摘除後、１、２、３、４週にて採取したものを用いた。スキャンは直径１．２７０ｍｍのｃｏｌｌｉｍａｔｏｒ、０．７６２ｍｍのｌｉｎｅ Ｓｐａｃｉｎｇ、０．３８０ｍｍのｐｏｉｎｔ ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎにて行い、ａｑｕｉｓｉｔｉｏｎ ｔｉｍｅは９分とした。得られた値をＢＭＤ（ｂｏｎｅ ｍｉｎｅｒａｌ ｄｅｎｓｉｔｙ）ｍｇ／ｃｍ２として表出した。
【００３１】
（８）血漿コラーゲンテロペプチド（ＣＴＸ：Ｃ−ｔｅｒｍｉｎａｌ ｔｅｌｏｐｅｐｔｉｄｅ ｏｆ ｔｙｐｅ Ｉ ｃｏｌｌａｇｅｎ）の測定
ＮＯＲＤＩＣ社製造ＣＴＸ定量キットを用いて血漿ＣＴＸ濃度を定量した。
【００３２】
（９）骨形態計測
骨形態計測はＢｏｎｅ ｍｏｒｐｈｏｍｅｔｒｙ ｓｏｆｔｗｅａｒ（Ｓｙｓｔｅｍ Ｓｕｐｐｌｙ社）を装備したデジタイザー連結ニコンＬａｂｐｈｏｔｏ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅにて計測した。データはＡＳＢＭＲ（Ａｍｅｒｉｃａｎ ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ ｂｏｎｅ ａｎｄ ｍｉｎｅｒａｌ ｒｅｓｅａｒｃｈ）の規約に従って計算した。（Ｐａｒｔｉｆ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｏｎｅ Ｍｉｎｅｒ Ｒｅｓ １９８７，７（２），５９５−６１０）
【００３３】
（１０）統計解析
Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ−ｔｅｓｔを用いて実験群およびコントロール群の優位差を検討した。Ｐ＜０．０５を閾値として優位とした。
【００３４】
（１１）卵巣摘除マウスを用いた分画９−２−１３の抑制活性の検討
マウスに１０ｐｐｍの濃度となるように調整した分画９−２−１３を浸透圧ポンプを用いて２週間投与した。卵巣除去後初めの２週間および後半の２週間投与し、血漿および骨を採取した。血漿ではＣＴＸ濃度に変化はなかった。骨エックス線の検討でも優位な差はなかった。ＢＭＤにても差は認められなかった。つぎに骨形態計測をＨＥ染色大腿骨標本にて検討した。分画９−２−１３は、Ｔｒａｂｅｃｕｌａｒ ｂｏｎｅ ｖｏｌｕｍｅおよびＴｒａｂｅｃｕｌａｒ ｔｈｉｃｋｎｅｓｓに有意な抑制活性を示した。しかし皮質骨の形態には有意な差は認められなかった。
【００３５】
以上の結果により、分画９−２−１３にインビトロおよびインビボにて骨吸収抑制活性が認められた。とくに閉経後骨粗鬆症のモデルである卵巣摘除マウスにおける骨吸収抑制活性は重要な知見を与えた。
【００３６】
【表１】
【００３７】
（１２）構造解析
茶樹茸より得られた分画９−２−１３の構造解析を行った。質量分析（ＥＩ−ＭＳ）により、ｍ／ｚ４２８（分子量）、ｍ／ｚ４１０（脱水ピーク）、ｍ／ｚ３９６（脱酸素ピーク）が観測された。また、ミリマスによる元素分析の結果、Ｃ２６Ｈ４４０３の組成式を持つことが明らかになった。このことから、不飽和数７が計算される。
【００３８】
一次元プロトンＮＭＲスペクトルより、プロトン数とメチル基の数および質量分析の結果からこの物質はトリテルペンあるいはステロイド系と予測された。２重結合は２組存在すること、一組（δ５．１５ｐｐｍ）はトランス型で他の一組（δ６．３５ｐｐｍ）はシス型であることが判明した。
また、この化合物をアセチル化してＮＭＲを測定したところ、δ３．９０ｐｐｍのｍｕｌｔｉｐｌｅｔがδ５．００ｐｐｍに低磁場シフトすることから、δ３．９０ｐｐｍのピークは二級水酸基の付け根の水素であることが証明された。
２次元ＣＯＳＹスペクトルから、シス−二重結合は孤立二重結合であり、トランスのそれは１、２−２置換であることが明らかである。
１次元Ｃａｒｂｏｎ−ＮＭＲより、四級炭素に結合するメチル基が２個、メチンに結合するメチル基が４個であることが明らかである。更に、メチンが６個、メチレンが６個、四級炭素が４個検出された。以下に帰属した炭素を示す（ＣＤＣ１３、室温、１２５．７６Ｈｚ）。Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｈｉｆｔ（ｐｐｍ）：３０．１０（１Ｃ）、３４．６８（２Ｃ）、６６．４３（３Ｃ）、３９．３３（４Ｃ）、８２．１３（５Ｃ）、１３５．１８（６Ｃ）、１３０．７３（７Ｃ）、７９．３９（８Ｃ）、５１．０８（９Ｃ）、３６．９４（１０Ｃ）、２０．６１（１１Ｃ）、３６．９１（１２Ｃ）、４４．５４（１３Ｃ）、５１．６７（１４Ｃ）、２３．３８（１５Ｃ）、２８．６２（１６Ｃ）、５６．１９（１７Ｃ）、１２．８５（１８Ｃ）、１８．１５（１９Ｃ）、３９．７０（２０Ｃ）、２０．８５（２１Ｃ）、１３５．４０（２２Ｃ）、１３２．３０（２３Ｃ）、４２．７５（２４Ｃ）、３３．０４（２５Ｃ）、１９．９２（２６Ｃ）、１９．６２（２７Ｃ）、１７．５４（２８Ｃ）。
また、ＨＳＱＣ−ＴＯＣＳＹでは炭素と水素の結合状態（ＨＳＱＣ）や隣接する水素や遠隔水素間および水素−炭素間のカップリングが観測される（ＴＯＣＳＹ）ため、炭素と水素の帰属が完全となった。
【００３９】
以上の結果より、茶樹茸から得られた酸化エルゴステロールは構造既知の学名２２Ｅ，２４Ｅ−５α，８α−ｅｐｉｄｉｏｘｙｅｒｕｇｏｓｔａ−６，２２−ｄｉｅｎｅ−３β−ｏｌであった。本物質はエルゴステロールが酵素的あるいは非酵素的に生体内で酸化されたものと推定される。これはプロビタミンＤであるエルゴステロールが紫外線によってビタミンＤ前駆体になるように、紫外線やその他の活性物質に反応性が高いことに起因する。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
破骨細胞の分化及び／又は増殖が関与する疾患の予防及び／又は治療のための医薬であって、下記の式（１）：
【化１】
で表される化合物を有効成分として含む医薬。
【請求項２】
破骨細胞の分化及び／又は増殖が関与する疾患が、骨粗鬆症、慢性関節リウマチ、及び悪性腫瘍からなる群から選ばれる疾患である請求項１に記載の医薬。
【請求項３】
骨粗鬆症における骨量減少の抑制、慢性関節リウマチにおける骨関節破壊、又は悪性腫瘍の骨転移の予防及び／又は治療のために用いる請求項２に記載の医薬。
【請求項４】
請求項１に記載の式（１）で表される化合物を含む破骨細胞の分化及び／又は増殖に対する阻害剤。
【請求項５】
破骨細胞の分化及び／又は増殖に対する阻害作用を有する食品であって、請求項１に記載の式（１）で表される化合物を有効成分として含む食品。
【請求項６】
飲食品の形態の請求項５に記載の食品。
【請求項７】
エルゴステロールを原料として得られる請求項１に記載の式（１）で表される化合物を製造する方法。
【請求項８】
エルゴステロールを原料として得られる下記式（２）あるいは式（３）で表される化合物（式中、Ｒ１及びＲ２は水素原子、アルキル基、又はアルカノイル基を示し、式中の立体配置は絶対配置を示す）を製造する方法。
【化２】
【請求項１】
破骨細胞の分化及び／又は増殖が関与する疾患の予防及び／又は治療のための医薬であって、下記の式（１）：
【化１】
で表される化合物を有効成分として含む医薬。
【請求項２】
破骨細胞の分化及び／又は増殖が関与する疾患が、骨粗鬆症、慢性関節リウマチ、及び悪性腫瘍からなる群から選ばれる疾患である請求項１に記載の医薬。
【請求項３】
骨粗鬆症における骨量減少の抑制、慢性関節リウマチにおける骨関節破壊、又は悪性腫瘍の骨転移の予防及び／又は治療のために用いる請求項２に記載の医薬。
【請求項４】
請求項１に記載の式（１）で表される化合物を含む破骨細胞の分化及び／又は増殖に対する阻害剤。
【請求項５】
破骨細胞の分化及び／又は増殖に対する阻害作用を有する食品であって、請求項１に記載の式（１）で表される化合物を有効成分として含む食品。
【請求項６】
飲食品の形態の請求項５に記載の食品。
【請求項７】
エルゴステロールを原料として得られる請求項１に記載の式（１）で表される化合物を製造する方法。
【請求項８】
エルゴステロールを原料として得られる下記式（２）あるいは式（３）で表される化合物（式中、Ｒ１及びＲ２は水素原子、アルキル基、又はアルカノイル基を示し、式中の立体配置は絶対配置を示す）を製造する方法。
【化２】
【公開番号】特開２００８−１２７３７８（Ｐ２００８−１２７３７８Ａ）
【公開日】平成２０年６月５日（２００８．６．５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−３３７６０１（Ｐ２００６−３３７６０１）
【出願日】平成１８年１１月１７日（２００６．１１．１７）
【出願人】（５０６４１５６４３）ＳＥＩＲＹＵ Ｂｉｏ株式会社 (2)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２０年６月５日（２００８．６．５）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年１１月１７日（２００６．１１．１７）
【出願人】（５０６４１５６４３）ＳＥＩＲＹＵ Ｂｉｏ株式会社 (2)
【Ｆターム（参考）】
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