神経成長促進剤
【課題】神経成長因子産生促進作用及び神経突起伸展促進作用を有する、黒霊芝の抽出物を含有することを特徴とする神経成長促進剤を提供する。
【構成】本発明は、黒霊芝の抽出物を含有することを特徴とする神経成長促進剤である。本発明の黒霊芝の抽出物は、２８０〜３３０ｎｍに吸収の極大を示し、分子内に芳香環を含有し、酢酸エチル可溶分の溶液は、着色性であるといった特徴がある。さらにこの神経成長促進剤は、安全性が高く、優れた神経成長因子産生促進作用及び神経突起伸展促進作用を示した。
【構成】本発明は、黒霊芝の抽出物を含有することを特徴とする神経成長促進剤である。本発明の黒霊芝の抽出物は、２８０〜３３０ｎｍに吸収の極大を示し、分子内に芳香環を含有し、酢酸エチル可溶分の溶液は、着色性であるといった特徴がある。さらにこの神経成長促進剤は、安全性が高く、優れた神経成長因子産生促進作用及び神経突起伸展促進作用を示した。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、神経成長因子産生促進作用及び神経突起伸展促進作用を有する黒霊芝の抽出物を含有する神経成長促進剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
神経成長因子（ｎｅｒｖｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ）は、末梢神経及び中枢神経細胞の分化や機能維持、シナプスの形成や損傷の修復等に重要な役割を演じる蛋白質であり、神経損傷時の神経細胞の変性を防ぐ作用を有する(非特許文献１)。しかし、神経成長因子は分子量１万以上の高分子蛋白質であり、治療剤として用いる場合にその投与方法が制約され、安全性の面からも問題がある。
【０００３】
そこで、生体内の神経成長因子の産生を促進すべく、種々の神経成長因子産生促進剤が提案されている。例えば、神経成長因子産生促進作用を有するものとしてフミヅキタケ属キノコ菌糸体培養上清（特許文献１）やシメジ属キノコ抽出物（特許文献２）等が開示されている。しかし、何れも効果の面において充分ではない。
【０００４】
神経細胞は、細胞体と突起を有しており、突起には神経情報を他の神経細胞に伝える軸索と、他の神経細胞からの情報を受け取る樹状突起の２種類が存在する。神経細胞は、神経成長因子による刺激や外部環境の影響を受けて神経突起を伸ばして神経回路を形成する。
その結果、神経終末と他のニューロンの神経細胞の樹状突起との間にシナプスが形成され、信号伝達が行われる。又、記憶障害又は認知症等の患者において神経突起の消失が見られることから、神経突起の伸長に伴うシナプス形成は記憶と密接な関係があると考えられている。
【０００５】
神経突起伸展を促進することは、種々の障害により破綻した神経細胞同士のシナプス応答を再編、増強することができ、神経変性により低下した機能の回復を期待できることから、種々の神経突起伸展促進剤が提案されている。
例えば、神経突起伸展促進作用を有する組成物としてシトラール等の香料成分（特許文献３）、ペプチド（特許文献４、５）、ビスマス、ヒ素等の重金属を含むヘテロポリ酸（特許文献６）等が開示されている。しかし、これらは何れも安全性や安定性の面で問題がある。
【０００６】
神経成長因子産生促進作用及び神経突起伸展促進作用を持つ物質として、ポリエン系化合物が開示されている（特許文献７）。この物質は両作用を有するため、前述の神経成長因子産生促進剤や神経突起伸展促進剤より有効な神経成長促進剤となり得る。しかし、該ポリエン化合物は特定の微生物が産生する新規物質であり、安全面において問題がある。
この様な状況下、神経成長因子産生促進作用及び神経突起伸展促進作用を併せ持ち、且つ安全な神経成長促進剤の開発が待望されていた。
【０００７】
黒霊芝は、マンネンタケ科（Ｇａｎｏｄｅｒｍａｔａｃｅａｅ）、マンネンタケ属（Ｇａｎｏｄｅｒｍａ）に属するキノコで、学名はＧ．ａｔｒｕｍ、Ｇ．ｊａｐｏｎｉｃｕｍ、Ｇ．ｓｉｎｅｎｓｅである（非特許文献２）。マンネンタケ属のキノコとしては、一般に赤霊芝（Ｇ．ｌｕｃｉｄｕｍ）が広く知られており、マンネンタケ或いは霊芝を赤霊芝の通称として用いることもある。黒霊芝と赤霊芝は形状が類似するが、黒霊芝は赤霊芝に特有の苦味トリテルペン成分（ガノデリン酸類）を含まない為、両者の味は全く異なる(非特許文献３)。又、外観色も黒霊芝が黒褐色であるのに対して赤霊芝は赤褐色を呈し、両キノコは全く別種と解されている。
【０００８】
黒霊芝に関しては、高血圧抑制剤（特許文献８）、抗血栓剤（特許文献９）、及び脳機能改善剤（特許文献１０）の発明が開示されている。しかし、前述の高血圧抑制剤はアンジオテンシン変換酵素の阻害作用、抗血栓剤は血小板凝集抑制作用、脳機能改善剤はアセチルコリントランスフェラーゼ及びプロリルエンドペプチダーゼの阻害作用に基づくものである。即ち、黒霊芝に関し、本願の神経成長促進剤に係る神経成長因子産生促進作用及び神経突起伸展促進作用は全く報告されていない。又、神経成長因子産生促進作用及び神経突起伸展促進作用と、前述のアセチルコリントランスフェラーゼ阻害作用等とは全く異なる概念である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】特開２００７−２３０９２７号
【特許文献２】特開２００７−１３７８７８号
【特許文献３】特開２００７−３０２５７２号
【特許文献４】特開２００６−４２６８４号
【特許文献５】特開２００５−２３９７１２号
【特許文献６】特開２００７−９９６３４号
【特許文献７】特開平８−３１９２８９号
【特許文献８】特開２００８−２５５０４１
【特許文献９】特開２００５−１６２６２７
【特許文献１０】特開２００８−１５６２４０
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】薬学雑誌、１１６（４）、２８６−３０８、１９９６
【非特許文献２】今関六也編著 「原色日本新菌類図鑑（ＩＩ）」保育社、１９８９年
【非特許文献３】日本醸造協会誌、８５（６）、３８５−３９２、１９９０
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明の目的は、神経成長因子産生促進作用及び神経突起伸展促進作用を併せ持ち、且つ安全な神経成長促進剤を提供し、脳虚血性疾患、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン舞踏病等の予防・治療に資することである。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者らは黒霊芝の作用について鋭意研究検討した結果、黒霊芝の抽出物が高い神経成長因子産生促進作用及び神経突起伸展促進作用を有することを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１３】
即ち、本発明は、神経成長因子産生促進作用及び神経突起伸展促進作用を有する黒霊芝の抽出物を含有することを特徴とする神経成長促進剤、黒霊芝の抽出物が溶媒分画及び／又は吸着による精製物であって且つ所定の物性を有する神経成長促進剤、並びにこれらの神経成長促進剤を配合した米飯用組成物に関する。
【００１４】
本発明に用いられる黒霊芝は、中国や日本市場等で流通しているものを用いることができる。又、自生品や自家栽培品を用いても良い。
【００１５】
本発明に用いられる黒霊芝は、子実体、菌糸体、天産物、栽培物、培養物等を問わず使用することができる。又、必要に応じてそのままの状態、破砕物、乾燥物等を適宜選択して抽出操作に付することができる。
【００１６】
本発明に係る神経成長促進剤は、黒霊芝の子実体を溶媒抽出することにより得ることができる。抽出する溶媒としては、例えば、水、低級アルコール類（メタノール、エタノール、１−プロパノール、２−プロパノール、１−ブタノール、２−ブタノール等）、多価アルコール（１，３−ブチレングリコール、プロピレングリコール、グリセリン等）、ケトン類（アセトン、メチルエチルケトン等）、アセトニトリル、エステル類（酢酸エチル、酢酸ブチル等）、炭化水素類（ヘキサン、ヘプタン、石油エーテル等）、エーテル類（エチルエーテル、テトラヒドロフラン、プロピルエーテル等）が挙げられる。好ましくは、水、低級アルコール、ケトン類、アセトニトリル、エステル類等や、これら有機溶媒の含水溶媒が良く、特に好ましくは、安全性の面から水、エタノール、又は含水エタノールが良い。これらの溶媒は一種でも二種以上を混合して用いても良い。又、塩基性下で抽出することも好ましい。
【００１７】
黒霊芝の抽出物をさらに精製するには、黒霊芝抽出物又は後述の吸着精製物を互いに混合しない溶媒で液・液分配抽出して精製する方法がある。
【００１８】
液・液分配抽出に用いる溶媒としては、前述の溶媒を用いることが可能である。例えば、（水又は含水アルコール）・炭化水素系、（水又は含水アルコール）・エーテル系、（水又は含水アルコール）・エステル系、水・ブタノール系等を採用できる。これらにとらわれず、互いに混合しない溶媒系であれば採用できる。好ましくは、前述の黒霊芝抽出物に含水低級アルコールと炭化水素溶媒を加えて抽出し、炭化水素溶媒可溶分を除去した残液にエステル溶媒を加えて抽出することにより黒霊芝の抽出物の精製物を得ることができる。又、酸や塩基による分別抽出を行うこともできる。
【００１９】
黒霊芝の抽出物をさらに精製するには、黒霊芝抽出物又は前述の溶媒分画物を吸着剤に吸着させ、吸着されたものを溶媒で溶出する方法がある。
【００２０】
吸着剤としては、例えば、スチレン−ジビニルベンゼン系の合成吸着樹脂、イオン交換樹脂、オクタデシル化シリカゲル、シリカゲル、セルロース、デキストラン、修飾デキストラン等の吸着剤が挙げられる。中でも、スチレン−ジビニルベンゼン系の合成吸着樹脂やオクタデシル化シリカゲルが好ましい。
【００２１】
吸着方法としては、吸着剤をカラムに充填し、これに抽出物の溶液を通す方法や、抽出物の溶液に吸着剤をそのまま混合する方法等があるが、特に限定されない。
【００２２】
吸着剤の溶出溶媒としては、各吸着剤の特性により選択できるが、例えば、水、低級アルコール類（メタノール、エタノール、１−プロパノール、２−プロパノール、１−ブタノール、２−ブタノール等）、液状多価アルコール（１，３−ブチレングリコール、プロピレングリコール、グリセリン等）、ケトン類（アセトン、メチルエチルケトン等）、アセトニトリル、エステル類（酢酸エチル、酢酸ブチル等）、炭化水素類（ヘキサン、ヘプタン、石油エーテル等）、エーテル類（エチルエーテル、テトラヒドロフラン、プロピルエーテル等）が挙げられる。好ましくは、水、低級アルコール等の溶媒が良く、特に好ましくは、水やエタノールが良い。これらの溶媒は一種でも二種以上を混合して用いても良い。更に、上記溶出溶媒に酸やアルカリを添加してｐＨ調整して用いても良い。
【００２３】
本発明に係る黒霊芝の抽出物には、次の事項によって特徴付けられる成分が含まれている(以下、黒霊芝の特定成分と記す)。該特定成分は、黒霊芝の抽出物を前述の溶媒分画、吸着、又は溶媒分画と吸着の組み合わせによる精製で得ることができる。
（１）赤外吸収スペクトルを測定すると（ＫＢｒ法）、２９２５、１７００、１６００、１４５５、１１７０、８３５ｃｍ−１に吸収の極大を示す。
（２）上記黒霊芝の成分をエタノールに溶解し、紫外吸収スペクトルを測定すると、２８０〜３３０ｎｍに吸収の極大を示す。
（３）分子内に芳香環を含有する。
（４）本成分に酢酸エチルを加えたとき、酢酸エチル可溶分の溶液は着色性であり、主として茶色〜赤褐色を示す。
【００２４】
上記のうち、（３）は１Ｈ、１３Ｃ−ＮＭＲ分析により判別可能である。即ち、溶媒として重メタノール（ＣＤ３ＯＤ）を用いて測定した場合、６〜８ｐｐｍ（１Ｈ−ＮＭＲ）、１００〜１５０ｐｐｍ（１３Ｃ−ＮＭＲ）に芳香族に置換した水素原子のスペクトル吸収が認められる。上記のスペクトル分析値は分析器、手法、ピークの幅広さ等により、若干数値の誤差がある場合がある。（４）については、本成分約１〜１０ｍｇに酢酸エチル１ｍＬを加えることで着色性を判別できる。
【００２５】
又、黒霊芝の特定成分は、定法により加水分解を行うと、ヒドロキシケイヒ酸を遊離する性質がある。例えば、水酸化ナトリウム水溶液等を用いた定法より加水分解でき、ＨＰＬＣ等で分析することで確認できる。
【００２６】
黒霊芝の特定成分は、以下に示した高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により確認できる（図１参照）。黒霊芝の特定成分のＨＰＬＣチャートを示す。横軸は保持時間（分）、縦軸は強度を示す。本分析によれば、保持時間が約１０〜２５分の幅広のピーク群が黒霊芝の特定成分である。
（Ａ）カラム：オクタデシル化シリカゲル（内径４．５ｍｍ×２５０ｍｍ）
（Ｂ）カラム温度：４０℃
（Ｃ）展開溶媒：０．２％リン酸／０．２％リン酸を含有するアセトニトリルを用い、０．２％リン酸を含有するアセトニトリルを２０％〜１００％に２０分かけて直線的に溶媒を変化させ、１００％で２５分保持する（計４５分分析）。
（Ｄ）流速：１ｍＬ／分
（Ｅ）検出：３１３ｎｍ
（Ｆ）試料：１０ｍｇ／ｍＬのエタノール溶液を０．０２ｍＬ導入
【００２７】
黒霊芝の抽出物や溶媒分画又は吸着による精製物は、抽出した溶液のまま用いても良く、必要に応じて濃縮、希釈、ろ過、活性炭等による脱色、脱臭、エタノール沈殿等の処理をして用いても良い。更に、抽出や精製した溶液を濃縮乾固、噴霧乾燥、凍結乾燥等の処理を行い、乾燥物として用いても良い。又、黒霊芝の抽出物や精製物は、単独又は組み合わせて用いることができる。
【００２８】
本発明の神経成長促進剤は、黒霊芝の抽出物や溶媒分画又は吸着による精製物をそのまま使用しても良く、必要に応じて賦形剤、増量剤、結合剤、湿潤剤、崩壊剤、界面活性剤、滑沢剤、分散剤、緩衝剤、香料、保存料、溶解補助剤、及び溶剤等を加えて用いることもできる。具体的には、乳糖、ショ糖、ソルビット、マンニット、澱粉、沈降性炭酸カルシウム、重質酸化マグネシウム、タルク、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、セルロース又はその誘導体、アミロペクチン、ポリビニルアルコール、ゼラチン、界面活性剤、水、生理食塩水、エタノール、グリセリン、プロピレングリコール、カカオ脂、ラウリン脂、ワセリン、パラフィン、高級アルコール等を用いることができる。
【００２９】
本発明の神経成長促進剤は、食品、医薬部外品又は医薬品の何れにも用いることができる。経口用としては、例えば散剤、顆粒剤、錠剤、糖衣錠剤、カプセル剤、シロップ剤、丸剤、懸濁剤、液剤、乳剤、米飯用組成物等が挙げられる。非経口用としては、注射液又は座薬等として用いることができる。
【００３０】
本発明の神経成長促進剤の摂取量は、投与形態、使用目的、年齢、体重等によって異なるが黒霊芝の抽出物又は溶媒分画若しくは吸着による精製物を０．１〜５，０００ｍｇ／日、好ましくは１〜３０００ｍｇ／日の範囲で１日１回から数回投与できる。尚、投与方法や投与量は種々の条件で変動するので、上記投与範囲より少ない量で十分な場合もあるし、該範囲を超えて投与する場合もある。又、製剤化における神経成長促進剤の添加法については、予め加えておいても、製造途中で添加しても良く、作業性を考えて適宜選択すれば良い。
【発明の効果】
【００３１】
本発明に係る神経成長促進剤は、優れた神経成長因子産生促進作用及び神経突起伸展作用を発揮し、且つ安全性の高いものである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３２】
本発明を詳細に説明するため、実施例として本発明に用いる抽出物の製造例、本発明の処方例及び実験例を挙げるが、本発明はこれに限定されるものではない。実施例に示す配合量の部とは重量部をし、％は重量％を示す。
【実施例１】
【００３３】
製造例１ 黒霊芝の熱水抽出物１
黒霊芝子実体の乾燥物１００ｇに２Ｌの精製水を加え、９５〜１００℃で２時間抽出した後、濾過し、その濾液を濃縮後、凍結乾燥して、黒霊芝の熱水抽出物を５．４ｇ得た。
【００３４】
製造例２ 黒霊芝の５０％エタノール抽出物
黒霊芝子実体の乾燥物１００ｇに精製水１Ｌ及びエタノール１Ｌを加え、常温で７日間抽出した後、濾過し、その濾液を濃縮し、凍結乾燥して黒霊芝の５０％エタノール抽出物を２．９ｇ得た。
【００３５】
製造例３ 黒霊芝のエタノール抽出物
黒霊芝子実体の乾燥物１ｋｇにエタノール１５Ｌを加え、常温で７日間抽出した後、濾過し、その濾液を濃縮乾固して、黒霊芝のエタノール抽出物を２０ｇ得た。
【００３６】
製造例４ 黒霊芝のカラム精製物
製造例１の黒霊芝子実体の熱水抽出物１０．０ｇを精製水に溶解し、スチレン−ジビニルベンゼン系の合成吸着樹脂５００ｍＬを充填したカラムに通液した。次いで、精製水、１０、２０、５０、８０、９０、１００％エタノール各１Ｌで溶出させた後、８０％以上のエタノール画分をまとめ、それぞれを濃縮乾固して黒霊芝のカラム精製物を約０．４０ｇ得た。
【００３７】
製造例５ 黒霊芝の溶媒分画精製物
製造例３の黒霊芝のエタノール抽出物２．００ｇをエタノール３５０ｍＬに溶解し、同容量の精製水とヘキサンを加えて抽出した。水層部分を１／２に濃縮し、同容量の酢酸エチルを加えて抽出した後、濃縮乾固し、ヘキサン画分０．８４ｇ、酢酸エチル画分０．５６ｇ、水画分０．６０ｇ得た。このうち、酢酸エチル画分を黒霊芝の溶媒分画精製物とした。
【００３８】
製造例６ 黒霊芝のＨＰＬＣ精製物
製造例３の黒霊芝のエタノール抽出物０．５０ｇを分取ＨＰＬＣにより精製し、黒霊芝のＨＰＬＣ精製物を０．２１ｇ得た。
＜ＨＰＬＣ分画条件＞
（Ａ）充填剤：オクタデシル化シリカゲル（内径２０ｍｍ×長さ２５０ｍｍ）
（Ｂ）展開溶媒：０．２％リン酸／０．２％リン酸を含有するアセトニトリルを用い、０．２％リン酸を含有するアセトニトリルを２０％から１００％を２０分かけて直線的に溶媒を変化させ、１００％で２５分保持する。
（Ｃ）流速：１０ｍＬ／分
（Ｄ）検出：３５０ｎｍ
【００３９】
製造例７ 黒霊芝の溶媒分画・カラム精製物
製造例３の黒霊芝のエタノール抽出物２．０ｇをエタノール３５０ｍＬに溶解し、同容量の精製水とヘキサンを加えて抽出した。水層部分を１／２に濃縮し、同容量の酢酸エチルを加えて抽出した後、濃縮乾固し、酢酸エチル画分０．５６ｇを得た。これを５０％エタノールに溶解し、スチレン−ジビニルベンゼン系の合成吸着樹脂１００ｍＬを充填したカラムに通液した。次いで、精製水、１０、２０、５０、８０、９０、１００％エタノール各１Ｌを溶出させた後、８０％以上のエタノール画分をまとめ、黒霊芝の溶媒分画・カラム精製物を０．２４ｇ得た。
【００４０】
＜製造例６及び７のスペクトル解析＞
赤外吸収スペクトル解析
製造例６の黒霊芝のＨＰＬＣ精製物及び製造例７の黒霊芝の溶媒分画・カラム精製物をＫＢｒ法で赤外吸収スペクトルを測定した。その結果、３２９４、２９２６、１６９８、１６０４、１４５６、１１６９、８２３ｃｍ−１に吸収の極大を示した。
紫外吸収スペクトル分析
製造例６の黒霊芝のＨＰＬＣ精製物及び製造例７の黒霊芝の溶媒分画・カラム精製物の５ｍｇを１００ｍＬのエタノールに溶解し、紫外吸収スペクトルを測定した。その結果、２９５．３ｎｍに吸収の極大を示した。
ＮＭＲスペクトル分析
製造例６の黒霊芝のＨＰＬＣ精製物及び製造例７の黒霊芝の溶媒分画・カラム精製物を用い、定法により１Ｈ、１３Ｃ−ＮＭＲ分析した結果、６．６〜７．６ｐｐｍ（１Ｈ−ＮＭＲ）、１００〜１５０ｐｐｍ（１３Ｃ−ＮＭＲ）にスペクトル吸収を認め、芳香環の存在が確認された。なお、溶媒は重メタノール（ＣＤ３ＯＤ）を用いた。
溶液の色
製造例６の黒霊芝のＨＰＬＣ精製物及び製造例７の黒霊芝の溶媒分画・カラム精製物の１０ｍｇに５ｍＬの酢酸エチルを加えた。酢酸エチル可溶分を濾過した後、溶液の色を目視にて確認した。その結果、溶液の色は、赤褐色を示した。
【００４１】
製造例８ 黒霊芝の熱水抽出物２
黒霊芝子実体の乾燥物２５０ｋｇに５ｋＬの精製水を加え、９５〜１００℃で２時間抽出した後、濾過して固形分濃度を測定した。該固形分に相当するデキストリンを加えて濃縮し、スプレー乾燥して黒霊芝の熱水抽出物を２５ｋｇ得た。
【００４２】
比較製造例１ 赤霊芝の熱水抽出物
赤霊芝子実体の乾燥物１００ｇに２Ｌの精製水を加え、９５〜１００℃で２時間抽出した後、濾過し、その濾液を濃縮後、凍結乾燥して、赤霊芝の熱水抽出物を６．０ｇ得た。
【００４３】
比較製造例２ 赤霊芝の溶媒分画精製物
製造例５の黒霊芝を赤霊芝に変えて同様に行い、酢酸エチル画分（溶媒分画精製物）を０．６４ｇ得た。
【実施例２】
【００４４】
本発明の神経成長促進剤は、処方例として下記の製剤化を行うことができる。
【００４５】
処方例１ 散剤
処方 配合量
１．黒霊芝のＨＰＬＣ精製物（製造例６） ２０部
２．乾燥コーンスターチ ３０
３．微結晶セルロース ５０
[製法]成分１〜３を混合し、散剤とする。
【００４６】
処方例２ 錠剤
処方 配合量
１．黒霊芝の溶媒分画・カラム精製物（製造例７） ５部
２．乾燥コーンスターチ ２５
３．カルボキシメチルセルロースカルシウム ２０
４．微結晶セルロース ４０
５．ポリビニルピロリドン ７
６．タルク ３
[製法]成分１〜５を混合し、次いで１０％の水を結合剤として加えて、押出し造粒後乾燥する。成形した顆粒に成分６を加えて混合し打錠する。１錠０．５２ｇとする。
【００４７】
処方例３ 錠菓
処方 配合量
１．黒霊芝のエタノール抽出物（製造例３） １．５部
２．乾燥コーンスターチ ５０．０
３．エリスリトール ４０．０
４．クエン酸 ５．０
５．ショ糖脂肪酸エステル ３．４
６．香料 ０．１
[製法]成分１〜４を混合し、１０％の水を結合剤として加え流動層増粒する。成形した顆粒に成分５及び６を加えて混合し打錠する。１粒１．０ｇとする。
【００４８】
処方例４ 飲料
処方 配合量
１．黒霊芝の熱水抽出物２（製造例８） １．０部
２．赤霊芝の熱水抽出物（比較製造例１） ０．３
３．ステビア ０．０２
４．マルチトール ３．６
５．グルコン酸液(５０％) ０．６
６．香料 ０．２
７．水 ９４．３
[製法]成分１〜６を成分７の一部の水に撹拌溶解する。次いで、成分７の残りの水を加えて混合する。
【００４９】
処方例５ 米飯添加物
処方 配合量
１．黒霊芝の熱水抽出物２（製造例８） １０．０部
２．デキストリン ８９．０
３．微粒子二酸化ケイ素 １．０
［製法］成分１〜３を混合して米飯添加物を得る。使用に当たっては、加水時に米１合に対して該添加物を２．０ｇ加えて炊飯する。
【実施例３】
【００５０】
次に、本発明の効果を詳細に説明するため、実験例を挙げる。
【００５１】
実験例１ 神経成長因子産生促進作用
中西らの方法（Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ., ６５９, ｐ１６９，１９９４）に従い、哺乳１日齢ラットの大脳皮質から調製した初代アストロサイトを１０％牛胎児血清含有ダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）中、１ｘ１０５個/ウェルの細胞密度にて、１２ウェルプレートへ播種した。２〜３日ごとに培地交換を行い、７日間培養した。コンフルエントに達したところで、試料を添加し、更に２４時間培養を行った。試料添加は、終濃度の１０００倍濃度のＤＭＳＯ（ジメチルスルフォキシド）溶液を調整し、０．５％牛胎児血清を含むＤＭＥＭにて１０００倍希釈したものに培地交換することで行った。対照群は、０．５％牛胎児血清を含むＤＭＥＭにてＤＭＳＯを１０００倍希釈したものを用いた。
【００５２】
培養後、その培養上清を回収し、Ｐｒｏｍｅｇａ社製ＮＧＦ Ｅｍａｘ ＩｍｍｕｎｏＡｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍを用い、付属の手順書に従い測定した。ウェルプレートは、ＮａｌｇｅｎＮｕｎｃ社製ＭａｘｉＳｏｒｐを用いた。測定は、各試験群につき３ウェルを用いた。
【００５３】
表１に示すように、黒霊芝の抽出物、カラム精製物、溶媒分画精製物、ＨＰＬＣ精製物、及び溶媒分画・カラム精製物は、赤霊芝の熱水抽出物や溶媒分画精製物と比べて高い神経成長因子産生促進作用を示した。
【００５４】
【表１】
【００５５】
実験例２ 神経突起伸展促進作用
神経突起伸展促進剤は、神経成長因子の神経突起形成作用を増強すると考えられている。そこで、神経細胞様の挙動を示し、神経のモデル細胞として広く用いられているラット副腎髄質褐色細胞腫由来細胞株であるＰＣ１２細胞（独立行政法人 理化学研究所より入手）を用い、各試料の神経成長因子共存下における神経突起伸展促進作用を評価した。
【００５６】
ＰＣ１２細胞をポリ−Ｄ−リシンコート２４穴プレートに５×１０４個/ウェルで播種し、５％ウマ血清、１０％牛胎児血清を含むＤＭＥＭ中にて２日間培養した。次いで、ＩＴＳ（インスリン＜終濃度１０μｇ／ｍＬ>、Ｓｏｄｉｕｍ Ｓｅｌｅｎｉｔｅ＜終濃度６．７ｎｇ／ｍＬ＞、トランスフェリン＜終濃度５．５μｇ／ｍＬ＞）を添加したＤＭＥＭ／Ｆ−１２培地（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で３回洗浄を行った。試料溶液は、ＩＴＳ（前述の濃度）およびＮＧＦ（マウス７Ｓ＜終濃度１０ｎｇ／ｍＬ＞）を含むＤＭＥＭ／Ｆ−１２培地に溶解させ、０．２μｍの滅菌フィルターを通したものを用い、各ウェルに１ｍＬ添加した。培地は２日おきに交換を行った。試料添加から５日後に細胞をメタノールで固定し、細胞の形態を位相差顕微鏡（１００倍）にて観察した。各処理群につき３ウェルを用いた。神経突起伸展促進作用は、以下の基準にて各処理群の細胞をスコア化し、各細胞のスコアの総和を細胞数で序した値を各試験群のスコアとした。
０：神経突起なし又は神経突起が細胞の直径より短い、１：神経突起が細胞の直径と同じ長さ、２：神経突起が細胞の直径の２〜３倍の長さ、３：神経突起が細胞の直径の３倍以上の長さ
【００５７】
表２に示すように、黒霊芝の抽出物、カラム精製物、溶媒分画精製物、ＨＰＬＣ精製物、及び溶媒分画・カラム精製物は、赤霊芝の熱水抽出物や溶媒分画精製物と比べて高い神経突起伸展促進作用を示した。
【００５８】
【表２】
【００５９】
処方例４の飲料を２５〜６０歳の男女２３名が１日３０ｍＬ摂取し、１ヶ月後に血液を検査した。中性脂肪値、総コレステロール値、血圧等に低下が認められたが、肝臓機能等を示す血液検査項目は何れのパネラーも正常値の範囲内であり、高い安全性を有することが確認された。
【産業上の利用可能性】
【００６０】
本発明に係る黒霊芝の抽出物は、優れた神経成長因子産生促進作用及び神経突起伸展作用を有し、且つ安全性の高い神経成長促進剤である。従って、医薬品、食品、及び医薬部外品としての利用が期待される。
【図面の簡単な説明】
【００６１】
【図１】黒霊芝の特定成分のＨＰＬＣチャートを示す。横軸は保持時間（分）、縦軸は強度を示す。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、神経成長因子産生促進作用及び神経突起伸展促進作用を有する黒霊芝の抽出物を含有する神経成長促進剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
神経成長因子（ｎｅｒｖｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ）は、末梢神経及び中枢神経細胞の分化や機能維持、シナプスの形成や損傷の修復等に重要な役割を演じる蛋白質であり、神経損傷時の神経細胞の変性を防ぐ作用を有する(非特許文献１)。しかし、神経成長因子は分子量１万以上の高分子蛋白質であり、治療剤として用いる場合にその投与方法が制約され、安全性の面からも問題がある。
【０００３】
そこで、生体内の神経成長因子の産生を促進すべく、種々の神経成長因子産生促進剤が提案されている。例えば、神経成長因子産生促進作用を有するものとしてフミヅキタケ属キノコ菌糸体培養上清（特許文献１）やシメジ属キノコ抽出物（特許文献２）等が開示されている。しかし、何れも効果の面において充分ではない。
【０００４】
神経細胞は、細胞体と突起を有しており、突起には神経情報を他の神経細胞に伝える軸索と、他の神経細胞からの情報を受け取る樹状突起の２種類が存在する。神経細胞は、神経成長因子による刺激や外部環境の影響を受けて神経突起を伸ばして神経回路を形成する。
その結果、神経終末と他のニューロンの神経細胞の樹状突起との間にシナプスが形成され、信号伝達が行われる。又、記憶障害又は認知症等の患者において神経突起の消失が見られることから、神経突起の伸長に伴うシナプス形成は記憶と密接な関係があると考えられている。
【０００５】
神経突起伸展を促進することは、種々の障害により破綻した神経細胞同士のシナプス応答を再編、増強することができ、神経変性により低下した機能の回復を期待できることから、種々の神経突起伸展促進剤が提案されている。
例えば、神経突起伸展促進作用を有する組成物としてシトラール等の香料成分（特許文献３）、ペプチド（特許文献４、５）、ビスマス、ヒ素等の重金属を含むヘテロポリ酸（特許文献６）等が開示されている。しかし、これらは何れも安全性や安定性の面で問題がある。
【０００６】
神経成長因子産生促進作用及び神経突起伸展促進作用を持つ物質として、ポリエン系化合物が開示されている（特許文献７）。この物質は両作用を有するため、前述の神経成長因子産生促進剤や神経突起伸展促進剤より有効な神経成長促進剤となり得る。しかし、該ポリエン化合物は特定の微生物が産生する新規物質であり、安全面において問題がある。
この様な状況下、神経成長因子産生促進作用及び神経突起伸展促進作用を併せ持ち、且つ安全な神経成長促進剤の開発が待望されていた。
【０００７】
黒霊芝は、マンネンタケ科（Ｇａｎｏｄｅｒｍａｔａｃｅａｅ）、マンネンタケ属（Ｇａｎｏｄｅｒｍａ）に属するキノコで、学名はＧ．ａｔｒｕｍ、Ｇ．ｊａｐｏｎｉｃｕｍ、Ｇ．ｓｉｎｅｎｓｅである（非特許文献２）。マンネンタケ属のキノコとしては、一般に赤霊芝（Ｇ．ｌｕｃｉｄｕｍ）が広く知られており、マンネンタケ或いは霊芝を赤霊芝の通称として用いることもある。黒霊芝と赤霊芝は形状が類似するが、黒霊芝は赤霊芝に特有の苦味トリテルペン成分（ガノデリン酸類）を含まない為、両者の味は全く異なる(非特許文献３)。又、外観色も黒霊芝が黒褐色であるのに対して赤霊芝は赤褐色を呈し、両キノコは全く別種と解されている。
【０００８】
黒霊芝に関しては、高血圧抑制剤（特許文献８）、抗血栓剤（特許文献９）、及び脳機能改善剤（特許文献１０）の発明が開示されている。しかし、前述の高血圧抑制剤はアンジオテンシン変換酵素の阻害作用、抗血栓剤は血小板凝集抑制作用、脳機能改善剤はアセチルコリントランスフェラーゼ及びプロリルエンドペプチダーゼの阻害作用に基づくものである。即ち、黒霊芝に関し、本願の神経成長促進剤に係る神経成長因子産生促進作用及び神経突起伸展促進作用は全く報告されていない。又、神経成長因子産生促進作用及び神経突起伸展促進作用と、前述のアセチルコリントランスフェラーゼ阻害作用等とは全く異なる概念である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】特開２００７−２３０９２７号
【特許文献２】特開２００７−１３７８７８号
【特許文献３】特開２００７−３０２５７２号
【特許文献４】特開２００６−４２６８４号
【特許文献５】特開２００５−２３９７１２号
【特許文献６】特開２００７−９９６３４号
【特許文献７】特開平８−３１９２８９号
【特許文献８】特開２００８−２５５０４１
【特許文献９】特開２００５−１６２６２７
【特許文献１０】特開２００８−１５６２４０
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】薬学雑誌、１１６（４）、２８６−３０８、１９９６
【非特許文献２】今関六也編著 「原色日本新菌類図鑑（ＩＩ）」保育社、１９８９年
【非特許文献３】日本醸造協会誌、８５（６）、３８５−３９２、１９９０
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明の目的は、神経成長因子産生促進作用及び神経突起伸展促進作用を併せ持ち、且つ安全な神経成長促進剤を提供し、脳虚血性疾患、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン舞踏病等の予防・治療に資することである。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者らは黒霊芝の作用について鋭意研究検討した結果、黒霊芝の抽出物が高い神経成長因子産生促進作用及び神経突起伸展促進作用を有することを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１３】
即ち、本発明は、神経成長因子産生促進作用及び神経突起伸展促進作用を有する黒霊芝の抽出物を含有することを特徴とする神経成長促進剤、黒霊芝の抽出物が溶媒分画及び／又は吸着による精製物であって且つ所定の物性を有する神経成長促進剤、並びにこれらの神経成長促進剤を配合した米飯用組成物に関する。
【００１４】
本発明に用いられる黒霊芝は、中国や日本市場等で流通しているものを用いることができる。又、自生品や自家栽培品を用いても良い。
【００１５】
本発明に用いられる黒霊芝は、子実体、菌糸体、天産物、栽培物、培養物等を問わず使用することができる。又、必要に応じてそのままの状態、破砕物、乾燥物等を適宜選択して抽出操作に付することができる。
【００１６】
本発明に係る神経成長促進剤は、黒霊芝の子実体を溶媒抽出することにより得ることができる。抽出する溶媒としては、例えば、水、低級アルコール類（メタノール、エタノール、１−プロパノール、２−プロパノール、１−ブタノール、２−ブタノール等）、多価アルコール（１，３−ブチレングリコール、プロピレングリコール、グリセリン等）、ケトン類（アセトン、メチルエチルケトン等）、アセトニトリル、エステル類（酢酸エチル、酢酸ブチル等）、炭化水素類（ヘキサン、ヘプタン、石油エーテル等）、エーテル類（エチルエーテル、テトラヒドロフラン、プロピルエーテル等）が挙げられる。好ましくは、水、低級アルコール、ケトン類、アセトニトリル、エステル類等や、これら有機溶媒の含水溶媒が良く、特に好ましくは、安全性の面から水、エタノール、又は含水エタノールが良い。これらの溶媒は一種でも二種以上を混合して用いても良い。又、塩基性下で抽出することも好ましい。
【００１７】
黒霊芝の抽出物をさらに精製するには、黒霊芝抽出物又は後述の吸着精製物を互いに混合しない溶媒で液・液分配抽出して精製する方法がある。
【００１８】
液・液分配抽出に用いる溶媒としては、前述の溶媒を用いることが可能である。例えば、（水又は含水アルコール）・炭化水素系、（水又は含水アルコール）・エーテル系、（水又は含水アルコール）・エステル系、水・ブタノール系等を採用できる。これらにとらわれず、互いに混合しない溶媒系であれば採用できる。好ましくは、前述の黒霊芝抽出物に含水低級アルコールと炭化水素溶媒を加えて抽出し、炭化水素溶媒可溶分を除去した残液にエステル溶媒を加えて抽出することにより黒霊芝の抽出物の精製物を得ることができる。又、酸や塩基による分別抽出を行うこともできる。
【００１９】
黒霊芝の抽出物をさらに精製するには、黒霊芝抽出物又は前述の溶媒分画物を吸着剤に吸着させ、吸着されたものを溶媒で溶出する方法がある。
【００２０】
吸着剤としては、例えば、スチレン−ジビニルベンゼン系の合成吸着樹脂、イオン交換樹脂、オクタデシル化シリカゲル、シリカゲル、セルロース、デキストラン、修飾デキストラン等の吸着剤が挙げられる。中でも、スチレン−ジビニルベンゼン系の合成吸着樹脂やオクタデシル化シリカゲルが好ましい。
【００２１】
吸着方法としては、吸着剤をカラムに充填し、これに抽出物の溶液を通す方法や、抽出物の溶液に吸着剤をそのまま混合する方法等があるが、特に限定されない。
【００２２】
吸着剤の溶出溶媒としては、各吸着剤の特性により選択できるが、例えば、水、低級アルコール類（メタノール、エタノール、１−プロパノール、２−プロパノール、１−ブタノール、２−ブタノール等）、液状多価アルコール（１，３−ブチレングリコール、プロピレングリコール、グリセリン等）、ケトン類（アセトン、メチルエチルケトン等）、アセトニトリル、エステル類（酢酸エチル、酢酸ブチル等）、炭化水素類（ヘキサン、ヘプタン、石油エーテル等）、エーテル類（エチルエーテル、テトラヒドロフラン、プロピルエーテル等）が挙げられる。好ましくは、水、低級アルコール等の溶媒が良く、特に好ましくは、水やエタノールが良い。これらの溶媒は一種でも二種以上を混合して用いても良い。更に、上記溶出溶媒に酸やアルカリを添加してｐＨ調整して用いても良い。
【００２３】
本発明に係る黒霊芝の抽出物には、次の事項によって特徴付けられる成分が含まれている(以下、黒霊芝の特定成分と記す)。該特定成分は、黒霊芝の抽出物を前述の溶媒分画、吸着、又は溶媒分画と吸着の組み合わせによる精製で得ることができる。
（１）赤外吸収スペクトルを測定すると（ＫＢｒ法）、２９２５、１７００、１６００、１４５５、１１７０、８３５ｃｍ−１に吸収の極大を示す。
（２）上記黒霊芝の成分をエタノールに溶解し、紫外吸収スペクトルを測定すると、２８０〜３３０ｎｍに吸収の極大を示す。
（３）分子内に芳香環を含有する。
（４）本成分に酢酸エチルを加えたとき、酢酸エチル可溶分の溶液は着色性であり、主として茶色〜赤褐色を示す。
【００２４】
上記のうち、（３）は１Ｈ、１３Ｃ−ＮＭＲ分析により判別可能である。即ち、溶媒として重メタノール（ＣＤ３ＯＤ）を用いて測定した場合、６〜８ｐｐｍ（１Ｈ−ＮＭＲ）、１００〜１５０ｐｐｍ（１３Ｃ−ＮＭＲ）に芳香族に置換した水素原子のスペクトル吸収が認められる。上記のスペクトル分析値は分析器、手法、ピークの幅広さ等により、若干数値の誤差がある場合がある。（４）については、本成分約１〜１０ｍｇに酢酸エチル１ｍＬを加えることで着色性を判別できる。
【００２５】
又、黒霊芝の特定成分は、定法により加水分解を行うと、ヒドロキシケイヒ酸を遊離する性質がある。例えば、水酸化ナトリウム水溶液等を用いた定法より加水分解でき、ＨＰＬＣ等で分析することで確認できる。
【００２６】
黒霊芝の特定成分は、以下に示した高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により確認できる（図１参照）。黒霊芝の特定成分のＨＰＬＣチャートを示す。横軸は保持時間（分）、縦軸は強度を示す。本分析によれば、保持時間が約１０〜２５分の幅広のピーク群が黒霊芝の特定成分である。
（Ａ）カラム：オクタデシル化シリカゲル（内径４．５ｍｍ×２５０ｍｍ）
（Ｂ）カラム温度：４０℃
（Ｃ）展開溶媒：０．２％リン酸／０．２％リン酸を含有するアセトニトリルを用い、０．２％リン酸を含有するアセトニトリルを２０％〜１００％に２０分かけて直線的に溶媒を変化させ、１００％で２５分保持する（計４５分分析）。
（Ｄ）流速：１ｍＬ／分
（Ｅ）検出：３１３ｎｍ
（Ｆ）試料：１０ｍｇ／ｍＬのエタノール溶液を０．０２ｍＬ導入
【００２７】
黒霊芝の抽出物や溶媒分画又は吸着による精製物は、抽出した溶液のまま用いても良く、必要に応じて濃縮、希釈、ろ過、活性炭等による脱色、脱臭、エタノール沈殿等の処理をして用いても良い。更に、抽出や精製した溶液を濃縮乾固、噴霧乾燥、凍結乾燥等の処理を行い、乾燥物として用いても良い。又、黒霊芝の抽出物や精製物は、単独又は組み合わせて用いることができる。
【００２８】
本発明の神経成長促進剤は、黒霊芝の抽出物や溶媒分画又は吸着による精製物をそのまま使用しても良く、必要に応じて賦形剤、増量剤、結合剤、湿潤剤、崩壊剤、界面活性剤、滑沢剤、分散剤、緩衝剤、香料、保存料、溶解補助剤、及び溶剤等を加えて用いることもできる。具体的には、乳糖、ショ糖、ソルビット、マンニット、澱粉、沈降性炭酸カルシウム、重質酸化マグネシウム、タルク、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、セルロース又はその誘導体、アミロペクチン、ポリビニルアルコール、ゼラチン、界面活性剤、水、生理食塩水、エタノール、グリセリン、プロピレングリコール、カカオ脂、ラウリン脂、ワセリン、パラフィン、高級アルコール等を用いることができる。
【００２９】
本発明の神経成長促進剤は、食品、医薬部外品又は医薬品の何れにも用いることができる。経口用としては、例えば散剤、顆粒剤、錠剤、糖衣錠剤、カプセル剤、シロップ剤、丸剤、懸濁剤、液剤、乳剤、米飯用組成物等が挙げられる。非経口用としては、注射液又は座薬等として用いることができる。
【００３０】
本発明の神経成長促進剤の摂取量は、投与形態、使用目的、年齢、体重等によって異なるが黒霊芝の抽出物又は溶媒分画若しくは吸着による精製物を０．１〜５，０００ｍｇ／日、好ましくは１〜３０００ｍｇ／日の範囲で１日１回から数回投与できる。尚、投与方法や投与量は種々の条件で変動するので、上記投与範囲より少ない量で十分な場合もあるし、該範囲を超えて投与する場合もある。又、製剤化における神経成長促進剤の添加法については、予め加えておいても、製造途中で添加しても良く、作業性を考えて適宜選択すれば良い。
【発明の効果】
【００３１】
本発明に係る神経成長促進剤は、優れた神経成長因子産生促進作用及び神経突起伸展作用を発揮し、且つ安全性の高いものである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３２】
本発明を詳細に説明するため、実施例として本発明に用いる抽出物の製造例、本発明の処方例及び実験例を挙げるが、本発明はこれに限定されるものではない。実施例に示す配合量の部とは重量部をし、％は重量％を示す。
【実施例１】
【００３３】
製造例１ 黒霊芝の熱水抽出物１
黒霊芝子実体の乾燥物１００ｇに２Ｌの精製水を加え、９５〜１００℃で２時間抽出した後、濾過し、その濾液を濃縮後、凍結乾燥して、黒霊芝の熱水抽出物を５．４ｇ得た。
【００３４】
製造例２ 黒霊芝の５０％エタノール抽出物
黒霊芝子実体の乾燥物１００ｇに精製水１Ｌ及びエタノール１Ｌを加え、常温で７日間抽出した後、濾過し、その濾液を濃縮し、凍結乾燥して黒霊芝の５０％エタノール抽出物を２．９ｇ得た。
【００３５】
製造例３ 黒霊芝のエタノール抽出物
黒霊芝子実体の乾燥物１ｋｇにエタノール１５Ｌを加え、常温で７日間抽出した後、濾過し、その濾液を濃縮乾固して、黒霊芝のエタノール抽出物を２０ｇ得た。
【００３６】
製造例４ 黒霊芝のカラム精製物
製造例１の黒霊芝子実体の熱水抽出物１０．０ｇを精製水に溶解し、スチレン−ジビニルベンゼン系の合成吸着樹脂５００ｍＬを充填したカラムに通液した。次いで、精製水、１０、２０、５０、８０、９０、１００％エタノール各１Ｌで溶出させた後、８０％以上のエタノール画分をまとめ、それぞれを濃縮乾固して黒霊芝のカラム精製物を約０．４０ｇ得た。
【００３７】
製造例５ 黒霊芝の溶媒分画精製物
製造例３の黒霊芝のエタノール抽出物２．００ｇをエタノール３５０ｍＬに溶解し、同容量の精製水とヘキサンを加えて抽出した。水層部分を１／２に濃縮し、同容量の酢酸エチルを加えて抽出した後、濃縮乾固し、ヘキサン画分０．８４ｇ、酢酸エチル画分０．５６ｇ、水画分０．６０ｇ得た。このうち、酢酸エチル画分を黒霊芝の溶媒分画精製物とした。
【００３８】
製造例６ 黒霊芝のＨＰＬＣ精製物
製造例３の黒霊芝のエタノール抽出物０．５０ｇを分取ＨＰＬＣにより精製し、黒霊芝のＨＰＬＣ精製物を０．２１ｇ得た。
＜ＨＰＬＣ分画条件＞
（Ａ）充填剤：オクタデシル化シリカゲル（内径２０ｍｍ×長さ２５０ｍｍ）
（Ｂ）展開溶媒：０．２％リン酸／０．２％リン酸を含有するアセトニトリルを用い、０．２％リン酸を含有するアセトニトリルを２０％から１００％を２０分かけて直線的に溶媒を変化させ、１００％で２５分保持する。
（Ｃ）流速：１０ｍＬ／分
（Ｄ）検出：３５０ｎｍ
【００３９】
製造例７ 黒霊芝の溶媒分画・カラム精製物
製造例３の黒霊芝のエタノール抽出物２．０ｇをエタノール３５０ｍＬに溶解し、同容量の精製水とヘキサンを加えて抽出した。水層部分を１／２に濃縮し、同容量の酢酸エチルを加えて抽出した後、濃縮乾固し、酢酸エチル画分０．５６ｇを得た。これを５０％エタノールに溶解し、スチレン−ジビニルベンゼン系の合成吸着樹脂１００ｍＬを充填したカラムに通液した。次いで、精製水、１０、２０、５０、８０、９０、１００％エタノール各１Ｌを溶出させた後、８０％以上のエタノール画分をまとめ、黒霊芝の溶媒分画・カラム精製物を０．２４ｇ得た。
【００４０】
＜製造例６及び７のスペクトル解析＞
赤外吸収スペクトル解析
製造例６の黒霊芝のＨＰＬＣ精製物及び製造例７の黒霊芝の溶媒分画・カラム精製物をＫＢｒ法で赤外吸収スペクトルを測定した。その結果、３２９４、２９２６、１６９８、１６０４、１４５６、１１６９、８２３ｃｍ−１に吸収の極大を示した。
紫外吸収スペクトル分析
製造例６の黒霊芝のＨＰＬＣ精製物及び製造例７の黒霊芝の溶媒分画・カラム精製物の５ｍｇを１００ｍＬのエタノールに溶解し、紫外吸収スペクトルを測定した。その結果、２９５．３ｎｍに吸収の極大を示した。
ＮＭＲスペクトル分析
製造例６の黒霊芝のＨＰＬＣ精製物及び製造例７の黒霊芝の溶媒分画・カラム精製物を用い、定法により１Ｈ、１３Ｃ−ＮＭＲ分析した結果、６．６〜７．６ｐｐｍ（１Ｈ−ＮＭＲ）、１００〜１５０ｐｐｍ（１３Ｃ−ＮＭＲ）にスペクトル吸収を認め、芳香環の存在が確認された。なお、溶媒は重メタノール（ＣＤ３ＯＤ）を用いた。
溶液の色
製造例６の黒霊芝のＨＰＬＣ精製物及び製造例７の黒霊芝の溶媒分画・カラム精製物の１０ｍｇに５ｍＬの酢酸エチルを加えた。酢酸エチル可溶分を濾過した後、溶液の色を目視にて確認した。その結果、溶液の色は、赤褐色を示した。
【００４１】
製造例８ 黒霊芝の熱水抽出物２
黒霊芝子実体の乾燥物２５０ｋｇに５ｋＬの精製水を加え、９５〜１００℃で２時間抽出した後、濾過して固形分濃度を測定した。該固形分に相当するデキストリンを加えて濃縮し、スプレー乾燥して黒霊芝の熱水抽出物を２５ｋｇ得た。
【００４２】
比較製造例１ 赤霊芝の熱水抽出物
赤霊芝子実体の乾燥物１００ｇに２Ｌの精製水を加え、９５〜１００℃で２時間抽出した後、濾過し、その濾液を濃縮後、凍結乾燥して、赤霊芝の熱水抽出物を６．０ｇ得た。
【００４３】
比較製造例２ 赤霊芝の溶媒分画精製物
製造例５の黒霊芝を赤霊芝に変えて同様に行い、酢酸エチル画分（溶媒分画精製物）を０．６４ｇ得た。
【実施例２】
【００４４】
本発明の神経成長促進剤は、処方例として下記の製剤化を行うことができる。
【００４５】
処方例１ 散剤
処方 配合量
１．黒霊芝のＨＰＬＣ精製物（製造例６） ２０部
２．乾燥コーンスターチ ３０
３．微結晶セルロース ５０
[製法]成分１〜３を混合し、散剤とする。
【００４６】
処方例２ 錠剤
処方 配合量
１．黒霊芝の溶媒分画・カラム精製物（製造例７） ５部
２．乾燥コーンスターチ ２５
３．カルボキシメチルセルロースカルシウム ２０
４．微結晶セルロース ４０
５．ポリビニルピロリドン ７
６．タルク ３
[製法]成分１〜５を混合し、次いで１０％の水を結合剤として加えて、押出し造粒後乾燥する。成形した顆粒に成分６を加えて混合し打錠する。１錠０．５２ｇとする。
【００４７】
処方例３ 錠菓
処方 配合量
１．黒霊芝のエタノール抽出物（製造例３） １．５部
２．乾燥コーンスターチ ５０．０
３．エリスリトール ４０．０
４．クエン酸 ５．０
５．ショ糖脂肪酸エステル ３．４
６．香料 ０．１
[製法]成分１〜４を混合し、１０％の水を結合剤として加え流動層増粒する。成形した顆粒に成分５及び６を加えて混合し打錠する。１粒１．０ｇとする。
【００４８】
処方例４ 飲料
処方 配合量
１．黒霊芝の熱水抽出物２（製造例８） １．０部
２．赤霊芝の熱水抽出物（比較製造例１） ０．３
３．ステビア ０．０２
４．マルチトール ３．６
５．グルコン酸液(５０％) ０．６
６．香料 ０．２
７．水 ９４．３
[製法]成分１〜６を成分７の一部の水に撹拌溶解する。次いで、成分７の残りの水を加えて混合する。
【００４９】
処方例５ 米飯添加物
処方 配合量
１．黒霊芝の熱水抽出物２（製造例８） １０．０部
２．デキストリン ８９．０
３．微粒子二酸化ケイ素 １．０
［製法］成分１〜３を混合して米飯添加物を得る。使用に当たっては、加水時に米１合に対して該添加物を２．０ｇ加えて炊飯する。
【実施例３】
【００５０】
次に、本発明の効果を詳細に説明するため、実験例を挙げる。
【００５１】
実験例１ 神経成長因子産生促進作用
中西らの方法（Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ., ６５９, ｐ１６９，１９９４）に従い、哺乳１日齢ラットの大脳皮質から調製した初代アストロサイトを１０％牛胎児血清含有ダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）中、１ｘ１０５個/ウェルの細胞密度にて、１２ウェルプレートへ播種した。２〜３日ごとに培地交換を行い、７日間培養した。コンフルエントに達したところで、試料を添加し、更に２４時間培養を行った。試料添加は、終濃度の１０００倍濃度のＤＭＳＯ（ジメチルスルフォキシド）溶液を調整し、０．５％牛胎児血清を含むＤＭＥＭにて１０００倍希釈したものに培地交換することで行った。対照群は、０．５％牛胎児血清を含むＤＭＥＭにてＤＭＳＯを１０００倍希釈したものを用いた。
【００５２】
培養後、その培養上清を回収し、Ｐｒｏｍｅｇａ社製ＮＧＦ Ｅｍａｘ ＩｍｍｕｎｏＡｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍを用い、付属の手順書に従い測定した。ウェルプレートは、ＮａｌｇｅｎＮｕｎｃ社製ＭａｘｉＳｏｒｐを用いた。測定は、各試験群につき３ウェルを用いた。
【００５３】
表１に示すように、黒霊芝の抽出物、カラム精製物、溶媒分画精製物、ＨＰＬＣ精製物、及び溶媒分画・カラム精製物は、赤霊芝の熱水抽出物や溶媒分画精製物と比べて高い神経成長因子産生促進作用を示した。
【００５４】
【表１】
【００５５】
実験例２ 神経突起伸展促進作用
神経突起伸展促進剤は、神経成長因子の神経突起形成作用を増強すると考えられている。そこで、神経細胞様の挙動を示し、神経のモデル細胞として広く用いられているラット副腎髄質褐色細胞腫由来細胞株であるＰＣ１２細胞（独立行政法人 理化学研究所より入手）を用い、各試料の神経成長因子共存下における神経突起伸展促進作用を評価した。
【００５６】
ＰＣ１２細胞をポリ−Ｄ−リシンコート２４穴プレートに５×１０４個/ウェルで播種し、５％ウマ血清、１０％牛胎児血清を含むＤＭＥＭ中にて２日間培養した。次いで、ＩＴＳ（インスリン＜終濃度１０μｇ／ｍＬ>、Ｓｏｄｉｕｍ Ｓｅｌｅｎｉｔｅ＜終濃度６．７ｎｇ／ｍＬ＞、トランスフェリン＜終濃度５．５μｇ／ｍＬ＞）を添加したＤＭＥＭ／Ｆ−１２培地（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で３回洗浄を行った。試料溶液は、ＩＴＳ（前述の濃度）およびＮＧＦ（マウス７Ｓ＜終濃度１０ｎｇ／ｍＬ＞）を含むＤＭＥＭ／Ｆ−１２培地に溶解させ、０．２μｍの滅菌フィルターを通したものを用い、各ウェルに１ｍＬ添加した。培地は２日おきに交換を行った。試料添加から５日後に細胞をメタノールで固定し、細胞の形態を位相差顕微鏡（１００倍）にて観察した。各処理群につき３ウェルを用いた。神経突起伸展促進作用は、以下の基準にて各処理群の細胞をスコア化し、各細胞のスコアの総和を細胞数で序した値を各試験群のスコアとした。
０：神経突起なし又は神経突起が細胞の直径より短い、１：神経突起が細胞の直径と同じ長さ、２：神経突起が細胞の直径の２〜３倍の長さ、３：神経突起が細胞の直径の３倍以上の長さ
【００５７】
表２に示すように、黒霊芝の抽出物、カラム精製物、溶媒分画精製物、ＨＰＬＣ精製物、及び溶媒分画・カラム精製物は、赤霊芝の熱水抽出物や溶媒分画精製物と比べて高い神経突起伸展促進作用を示した。
【００５８】
【表２】
【００５９】
処方例４の飲料を２５〜６０歳の男女２３名が１日３０ｍＬ摂取し、１ヶ月後に血液を検査した。中性脂肪値、総コレステロール値、血圧等に低下が認められたが、肝臓機能等を示す血液検査項目は何れのパネラーも正常値の範囲内であり、高い安全性を有することが確認された。
【産業上の利用可能性】
【００６０】
本発明に係る黒霊芝の抽出物は、優れた神経成長因子産生促進作用及び神経突起伸展作用を有し、且つ安全性の高い神経成長促進剤である。従って、医薬品、食品、及び医薬部外品としての利用が期待される。
【図面の簡単な説明】
【００６１】
【図１】黒霊芝の特定成分のＨＰＬＣチャートを示す。横軸は保持時間（分）、縦軸は強度を示す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
神経成長因子産生促進作用及び神経突起伸展促進作用を有する、黒霊芝の抽出物を含有することを特徴とする神経成長促進剤。
【請求項２】
抽出物が溶媒分画及び／又は吸着による精製物であって、且つ（１）〜（４）の物性を有するものである、請求項１記載の神経成長促進剤。
（１）赤外吸収スペクトルを測定すると（ＫＢｒ法）、２９２５、１７００、１６００、１４５５、１１７０、８３５ｃｍ−１に吸収の極大を示し、
（２）本成分をエタノールに溶解し、紫外吸収スペクトルを測定すると、２８０〜３３０ｎｍに吸収の極大を示し、
（３）分子内に芳香環を含有し、
（４）本成分に酢酸エチルを加えたとき、酢酸エチル可溶分の溶液は着色性であり、茶色〜赤褐色を示す。
【請求項３】
請求項１又は請求項２に記載の神経成長促進剤を配合したことを特徴とする米飯用組成物。
【請求項１】
神経成長因子産生促進作用及び神経突起伸展促進作用を有する、黒霊芝の抽出物を含有することを特徴とする神経成長促進剤。
【請求項２】
抽出物が溶媒分画及び／又は吸着による精製物であって、且つ（１）〜（４）の物性を有するものである、請求項１記載の神経成長促進剤。
（１）赤外吸収スペクトルを測定すると（ＫＢｒ法）、２９２５、１７００、１６００、１４５５、１１７０、８３５ｃｍ−１に吸収の極大を示し、
（２）本成分をエタノールに溶解し、紫外吸収スペクトルを測定すると、２８０〜３３０ｎｍに吸収の極大を示し、
（３）分子内に芳香環を含有し、
（４）本成分に酢酸エチルを加えたとき、酢酸エチル可溶分の溶液は着色性であり、茶色〜赤褐色を示す。
【請求項３】
請求項１又は請求項２に記載の神経成長促進剤を配合したことを特徴とする米飯用組成物。
【図１】
【公開番号】特開２０１０−１８９３３０（Ｐ２０１０−１８９３３０Ａ）
【公開日】平成２２年９月２日（２０１０．９．２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−３６３４９（Ｐ２００９−３６３４９）
【出願日】平成２１年２月１９日（２００９．２．１９）
【出願人】（５９２２６２５４３）日本メナード化粧品株式会社 (223)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年９月２日（２０１０．９．２）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年２月１９日（２００９．２．１９）
【出願人】（５９２２６２５４３）日本メナード化粧品株式会社 (223)
【Ｆターム（参考）】
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