神経成長因子産生促進剤
【課題】ベータNGF産生促進作用を有するキノコ類の菌糸体培養上清を好ましくは摂取して認知症や神経障害を防止又は改善する。
【解決手段】フミヅキタケ属のキノコ類、好ましくはヤナギマツタケの菌糸体をＭＹＧ液体培地にて２５℃、１３０ｒｐｍ、７日間振とう培養し、培養後培養液をろ別して得られる培養液上清を有効成分として含む神経成長因子産生促進活性を有する組成物、その組成物を含有する神経成長因子産生促進剤、神経成長因子産生促進活性を有する飲食品及び神経成長因子産生促進活性を有する飼料。
【解決手段】フミヅキタケ属のキノコ類、好ましくはヤナギマツタケの菌糸体をＭＹＧ液体培地にて２５℃、１３０ｒｐｍ、７日間振とう培養し、培養後培養液をろ別して得られる培養液上清を有効成分として含む神経成長因子産生促進活性を有する組成物、その組成物を含有する神経成長因子産生促進剤、神経成長因子産生促進活性を有する飲食品及び神経成長因子産生促進活性を有する飼料。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、神経成長因子（beta nerve growth factor、以下「ベータNGF」と略記）産生促進活性を有する組成物及びその製造方法並びにベータNGF産生促進剤などに関するものであり、さらに詳しくは、神経系の老化予防や神経障害の進行防止、あるいはこれら疾患の改善等に有効な安全性の高いベータNGF産生促進活性を有する組成物に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
高齢化社会への移行に伴って老年型認知症が増加する傾向にあり、社会的な問題となりつつある。老年型認知症の原因となる疾患は数多く知られ、脳器質性障害による認知症、脳以外の臓器疾患に付随した認知症、およびストレスによる身体疾患に起因する認知症に分類される。また、脳器質性障害による認知症は、原因の違いにより脳血管性認知症とアルツハイマー型認知症とに分類される。
【０００３】
現在、脳血管性認知症に対しては脳血管拡張薬などがある程度の効果を示すことが知られているが、アルツハイマー型認知症に対しては、その発症原因が今なお不明であり、適切な治療方法も明らかになっていない。そのため、脳器質性障害による認知症、特にアルツハイマー型認知症に対して有用な医薬や食品の開発が所望されている。
【０００４】
近年、神経細胞から分泌されるベータNGFなどの神経栄養因子が神経変性疾患に対して優れた効果を示すことが見出され、注目を集めている。ベータNGFは、神経組織の成長および機能維持にとって重要かつ必要な因子である。ベータNGFは、末梢神経における知覚および交感神経の、ならびに中枢神経における大細胞性コリン作動性ニューロンの、成熟、分化、および生命維持に不可欠であり、脳損傷時の神経細胞の変性を防ぐという作用を示す。これにより、生体内においてベータNGFレベルを上昇させることは、アルツハイマー型認知症及び脳血管性認知症のような中枢機能障害、精髄障害、末梢神経損傷、糖尿病性神経障害、並びに筋萎縮変性側索硬化症のような抹消機能障害の治療に有用であると考えられる。
【０００５】
しかし、ベータNGFはモノマーで１３０００又はダイマーでは２６０００もの分子量を有するタンパク質であり、血液脳関門を通過することができない。そのため、例えば中枢機能障害の治療を目的とした場合には、脳室内投与が必要となる。さらに、ベータNGFの大量調製も困難である。このようにベータNGF自体の使用には多くの問題があり、ベータNGF自体を用いることは非常に困難である。
【０００６】
ベータNGFが、末梢神経系においては胎生期の知覚および交感神経節神経細胞の分化及び成長を促進し、神経細胞突起の伸長を促すペプチドであること、さらに成熟交感神経細胞にとっては一生を通じて生存および機能維持に不可欠なペプチドであることが知られている。たとえば、幼若動物に抗ベータNGF抗体を連続投与してベータNGFの生理活性を中和した場合には、交感神経節の顕著な萎縮や神経節神経細胞の死滅が観察されている（非特許文献１、２）。この現象は不可逆的であり、ベータNGFの生理的役割の重要性を証明するものである。また、ベータNGFの作用に関する応用研究も行なわれており、ベータNGFが神経軸索の再生にも有効であることが明らかにされている（非特許文献３）。
【０００７】
一方、中枢神経系におけるベータNGFの重要性も知られており、たとえば、中隔から海馬へ投射している神経路を切断したラットの脳室内にベータNGFを投与することによって、中隔のコリン作動性神経細胞の変性、脱落が抑制されること（非特許文献４、５）、老齢ラットの学習、記憶能力がベータNGFの脳室内投与で改善されること（非特許文献６）、脳虚血後に見られる海馬の錐体細胞の遅延性細胞死がベータNGFの前投与により抑制されること（非特許文献７）等が報告されている。
【０００８】
このように、ベータNGFが神経細胞の生存に不可欠な因子であることから、神経疾患や神経細胞障害の進行防止ないしは治療を目的として、ベータNGFの産生を促進する物質の検索が行なわれている。その結果、これまでにカテコールアミン類（非特許文献８）、コリン作動性アゴニスト（特許文献１）、桂皮酸アミド化合物（特許文献２）、ベンゾキノン誘導体（非特許文献９）及びプロペントフィリン（非特許文献１０）にベータNGF産生促進作用のあることが報告されている。また、線維芽細胞成長因子（fibroblast growth factor）、血小板由来成長因子（platelet-derived growth factor）、トランスフォーミング成長因子アルファ及びベータ（transforming growth factor αand β）、上皮細胞成長因子（epidermal growth factor）及びインシュリン様成長因子（insulin-like growth factor）等のいわゆる細胞増殖因子にもベータNGFの産生を促進する活性が認められている（非特許文献１１）。
【０００９】
ベータNGF産生を促進する食品由来の物質又は抽出物としては、ホップ又はアシタバから得られる破砕物又は抽出物（特許文献３）、ローズマリー由来のカルノジン酸（特許文献４）、緑茶由来のテアニン（特許文献５）、ガゴメコンブ由来のフコイダン（特許文献６）、白子由来のプロタミン（特許文献７）などが知られている。またキノコ類についてはブナハリタケの子実体由来のシクロペンテノン誘導体（非特許文献１２、特許文献８）、ヤマブシタケの子実体又は菌糸体抽出物（特許文献９）、ケロウジ子実体由来のシアタン誘導体（特許文献１０）などが知られている。またハラタケ目とヒダナシタケ目の子実体及び菌糸体の乾燥物の水性抽出画分にベータＮＧＦ産生促進活性があることが知られている。（特許文献１１）いずれもベータNGF産生促進活性が認められるのは子実体及び菌糸体乾燥物を溶媒で抽出した画分のみであり、菌糸体培養上清にベータNGF産生促進活性があることは全く報告されていない。
【００１０】
ヤナギマツタケ（Ａｇｒｏｃｙｂｅ ｃｙｌｉｎｄｒａｃｅａ）はハラタケ目オキナタケ科フミヅキタケ属の木材腐朽菌であり、春から秋にかけて広葉樹の枯れ木や生木の腐朽部に発生する。まれに街路樹のポプラ、ハコヤナギ、カエデなどの木の根元に束生しているのを見かけることがある馴染みの高いキノコである。ヤナギマツタケは別名カエデモタシとも呼ばれ、ヨーロッパでは美味な食用キノコとして珍重されている。近年、その食感や味の良さから、国内でも人工栽培の研究が行われて栽培技術が確立され、特定のメーカーから一般に販売されているキノコである。（特許文献１２）
ヤナギマツタケに含まれる成分の機能性については、子実体や菌糸体の溶媒抽出物に抗突然変異性（非特許文献１６）、抗カビ活性（非特許文献１７）、抗酸化活性（非特許文献１８）、白血病細胞の増殖抑制活性（特許文献１３）、抗菌活性（特許文献１４）、皮膚疾患改善作用（特許文献１５）が知られているが、ベータＮＧＦ産生促進活性などの脳機能改善効果については全く知られていなかった。
【非特許文献１】R. Levi‐Montalcina他、Physiological Review,48, 534−569, 1968
【非特許文献２】H. Thoenen他、Physiological Review, 60, 1284−1335, 1980
【非特許文献３】Rich他、Experimental Neurology, 105, 162−170, 1989
【非特許文献４】F. Hefti, Journal of Ncuroscience, 6, 2155−2162, 1986 : L. F.Kromer, Science, 235, 214−216, 1987
【非特許文献５】L. R. Williams他、Proceedings of National Academy of Sciences U. S. A. 83, 9231−9235, 1986
【非特許文献６】W. Fisher他、Nature, 329, 65−68, 1987
【非特許文献７】茂野他、医学のあゆみ、第145巻、579−580, 1988
【非特許文献８】Y.Furukawa他、Journal of Biological Chemistry, 261, 6039−6047,1986
【特許文献１】特開昭６３−８３０２０号公報
【特許文献２】特開平２−１０４５６８号公報
【非特許文献９】R. Takeuchi他、FEBS Letter, 261, 63-66, 1990
【非特許文献１０】I. Shinoda他、Biochemical Pharmacology, 39, 1813−1816, 1990
【非特許文献１１】篠田他、生化学、第６２巻、835頁、1990年
【特許文献３】再表２００３−００６０３７号公報
【特許文献４】特開２００１−２３３８３５号公報
【特許文献５】特開平７−１７３０５９号公報
【特許文献６】再表２０００−０６２７８５号公報
【特許文献７】特開平５−５１３２５号公報
【非特許文献１２】OkuyamaS他、NutrNeurosci. 7, 741-47,2004
【特許文献８】特開平９−１２４５４１号公報
【特許文献９】特開平９−２４１２９１号公報
【特許文献１０】ＷＯ２００３／００７９７７
【特許文献１１】特開平１１−２６９１２５号公報
【非特許文献１３】平成8年 食品試験研究成績 計画概要旨集 p109-110
【非特許文献１４】Drug metab. Rev.,2000, 32;395-411
【非特許文献１５】PNAS,1994, 91: 3147-50
【非特許文献１６】TairaK, Miyashita Y他、MutatRes. 2005 Oct 3;586(2):115-23.
【非特許文献１７】NgaiPH, Zhao Z, Ng TB.、Peptides. 2005 Feb;26(2):191-6.
【非特許文献１８】Kim WG, Lee IK他、J Nat Prod. 1997 Jul;60(7):721-3.
【特許文献１２】特開平６−２４５６４５号公報
【特許文献１３】特開２０００−１９１５４７号公報
【特許文献１４】特開２００２−２１２１３７号公報
【特許文献１５】特開２００５−８９３８９０号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
豊富な食経験があり、ベータNGF産生促進作用を有する食品由来成分を好ましくは摂取して認知症や神経障害の防止又は改善が可能となることが期待されている。
【００１２】
本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであり、ベータNGFの産生を高めることにより神経細胞の生存と機能維持を促して神経系の老化を予防ないし改善し、また障害を受けた神経細胞に対してはその細胞自身の変成脱落を予防し、神経障害の進行を防止ないし改善する、ベータNGF産生促進活性を有するフミヅキタケ属の菌糸体培養上清を提供することを課題としている。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明者らは、ベータNGF産生促進作用を有するキノコ類の菌糸体培養上清の検討を鋭意行い、フミヅキタケ属の菌糸体培養液に強いベータNGF産生促進活性があることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１４】
すなわち本発明の第一は、フミヅキタケ属のキノコ類の菌糸体培養上清から得られることを特徴とするベータNGF産生促進活性を有する組成物を要旨とするものであり、好ましくは、フミヅキタケ属のキノコがヤナギマツタケである。
本発明の第二は、フミヅキタケ属の菌糸体培養上清からベータNGF産生促進活性を有する組成物を取得することを特徴とする神経成長因子産生促進活性を有する組成物の製造方法である。
【００１５】
本発明の第三は、前記したベータNGF産生促進活性を有する組成物を有効成分とすることを特徴とする神経成長因子産生促進剤を要旨とするものである。
【００１６】
さらに別の本発明は、前記したベータNGF産生促進活性を有する組成物を含有することを特徴とする神経成長因子産生促進活性を有する飲食品、飼料を要旨とするものである。
なお本発明における菌糸体培養上清とは、菌糸体培養液から公知の方法で菌糸体を除去した培養液の上清を指すだけでなく、上清を各種溶媒により分画した画分、エバポレーターなどで濃縮した液、カラムを用いてさらに分画、精製した画分なども含む。
【発明の効果】
【００１７】
本発明によれば、フミヅキタケ属のキノコ類の菌糸体培養液上清を薬学的組成物や食品組成物、飼料として利用することにより、神経系の老化予防や神経障害の進行防止、あるいはこれら疾患の改善が期待できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１９】
本発明におけるフミヅキタケ属にはフミヅキタケ（Ａｇｒｏｃｙｂｅ ｐｒａｅｃｏｘ）、ツバナシフミヅキタケ（Ａｇｒｏｃｙｂｅ ｆａｒｉｎａｃｅａ）、ハタケキノコ（Ａｇｒｏｃｙｂｅ ｓｅｍｉｏｒｂｉｃｕｌａｒｉｓ）、タマムクエタケ（Ａｇｒｏｃｙｂｅ ａｒｖａｌｉｓ）、ツチナメコ（Ａｇｒｏｃｙｂｅ ｅｒｅｂｉａ）、ヤナギマツタケ（Ａｇｒｏｃｙｂｅ ｃｙｌｉｎｄｒａｃｅａ）が挙げられるが最も好ましくはヤナギマツタケである。
【００２０】
本発明において、フミヅキタケ属のキノコ類の菌糸体培養液上清は公知の純粋液体培養法によって得ることができる。培地に使用する炭素源としては、グルコースなどの単糖の他、デキストリン、グリセロールなど通常用いられる炭素源が使用できる。また、窒素源としては無機又は有機窒素源が使用できるが、生育速度の観点からは有機窒素源を用いるほうが好ましい。また、必要に応じて微量元素やビタミン等の生育因子を添加することは通常の培養と何ら変わりはない。さらに必要に応じては、植物破砕物や微生物発酵物を窒素現や炭素現に用いて培養しても良い。
【００２１】
培養温度は１５℃〜３０℃、好ましくは１８℃〜２８℃、２０℃〜２５℃が最も好ましい。ｐＨは２．５〜８．０、好ましくは３．０〜７．０、３．５〜５．０が最も好ましい。培地成分には不溶成分を添加することが均一に生育させることができ、菌糸体を除去する観点から好ましい。培養期間は菌株により、数日から数週間程度に設定されうる。
【００２２】
本発明における菌糸体培養液上清とは、菌糸体培養液からろ過や遠心分離など公知の方法で菌糸体を除去した上清のみを指すだけでなく、その上清をエバポレーターなどの公知の方法で濃縮した濃縮液や希釈液、該抽出液や濃縮液をさらに種々の溶媒を用いて分画した画分、シリカゲルクロマトグラフィーなどのカラムを用いて公知の方法によりさらに精製した画分や、スプレードライ法などの公知の方法でそれらを乾燥した乾燥物などが含まれる。
【００２３】
以上のようにして得られたフミヅキタケ属のキノコ類の菌糸体培養液上清は、そのままで、あるいは必要に応じて他の成分を加えることで本発明のベータNGF産生促進活性を有する組成物となる。また必要に応じて、菌糸体を上清に再度加えてもなんら問題はない。
【００２４】
本発明における組成物に含まれ得る他の成分としては、本発明におけるベータＮＧＦ産生促進活性を低下させないものであれば混合することが可能であり、例えば従来から用いられている薬学的に許容された界面活性剤、溶媒、増粘剤、安定剤、保存料、酸化防止剤、香味料などの添加剤、他のベータＮＧＦ産生促進活性を有する成分や化合物、別の機能性（血流改善効果や血圧上昇抑制効果など）を有する成分や化合物などと混合して用いることが出来る。
【００２５】
組成物の形態としては、錠剤、液体、カプセル、軟カプセル、ペースト若しくはトローチ、ガム、又は飲用可能な溶液若しくは乳濁液、ドライ経口サプリメント、ウェット経口サプリメントなどが挙げられるがこれらに限定されるものではない。また、これらの形態は従来から知られている方法によって作製することができる。
【００２６】
本発明のベータNGF産生促進剤は、上記した本発明のベータNGF産生促進活性を有する組成物を有効成分として含むものである。有効成分の含有量としては、摂取する対象者の年齢、体重などによって変わり得るが、成人１日あたり0.01〜100mg/kg服用できるように含有するのが好ましく、さらに0.1〜10mg/kgが好ましく、0.5〜5mg/kgが最も好ましい。
【００２７】
本発明のベータNGF産生促進剤に含まれる各種添加剤としては、界面活性剤、賦形剤、着色料、保存料、コーティング助剤ならびにこれらの組合せが挙げられる。これら添加剤は、通常の医薬品製造における添加剤であれば特に限定されず、より具体的な例としては、ラクトース、デキストリン、スクロース、マンニトール、コーンスターチ、ソルビトール、結晶性セルロース、ポリビニルピロリドン、デキストリン、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース塩、ステアリン酸及びその塩、タルクなどの添加剤であり、これらの組合せが挙げられる。さらに、香辛料、甘味料などを添加してもよい。またさらに、必要に応じて他の薬剤や食品粉砕物、食品抽出物を添加してもよい。
【００２８】
本発明のベータNGF産生促進剤の投与剤形も特に限定されず、日本薬局方に従って適切な剤形に製造される。具体的には、カプセル剤、錠剤、粉剤、除放剤などの剤形に製造される。
【００２９】
本発明のベータNGF産生促進活性を有する飲食品は、上記した本発明のベータNGF産生促進活性を有する組成物を含有するものである。有効成分の含有量は1日あたりの摂取量が0.01〜100mg/kgになるようそれぞれの飲食品の形態に合わせて設定すればよく、さらには0.1〜10mg/kgが好ましく、0.5〜5mg/kgが最も好ましい。
【００３０】
本発明のベータNGF産生促進活性を有する飲食品に混合され得る他の材料としては、一般に食品用材料として使用され得るものである。例としては、米、小麦、トウモロコシ、ジャガイモ、昆布などから得られる多糖類、大豆や乳製品、動物原料などから得られるタンパク質、グルコース、ラクトース、フルクトース、スクロース、マンニトール、キシリトールや各種オリゴ糖などの糖類、ならびにこれらの組合せが挙げられる。さらに、香辛料、着色料、甘味料、酸味料、食用油、ビタミンや他の食品破砕物、食品抽出物などを添加してもよい。これら適切な材料および添加剤は単独または組合せて使用される。またさらに、必要に応じて水を添加して所望の形状に加工してもよい。
【００３１】
飲食品の具体例としては、菓子類（ガム、キャンディー、キャラメル、チョコレート、クッキー、スナック菓子、ゼリー、グミ、錠菓等）、麺類（そば、うどん、ラーメン等）、乳製品（ミルク、アイスクリーム、ヨーグルト等）、調味料（味噌、醤油等）、スープ類、飲料（ジュース、コーヒー、紅茶、茶、炭酸飲料、スポーツ飲料等）をはじめとする一般食品や健康食品（錠剤、カプセル等）、栄養補助食品（栄養ドリンク等）などが挙げられるがこれらに限定されるものではない。また、インスタント食品に本発明の抽出物を添加しても良い。例えば、抽出物を粉末セルロースとともにスプレードライまたは凍結乾燥したものを、粉末、顆粒、打錠または溶液にすることで容易に飲食品に含有させることができる。
【００３２】
本発明のベータNGF産生促進活性を有する飼料は、上記した本発明のベータNGF産生促進活性を有する組成物を含有するものであり、すべての家畜や家禽、愛玩動物に適用することが可能である。本発明の飼料を適用し得る家畜や家禽類としては、ウシ、ブタ、ウマ、ヤギ、ヒツジ、ウサギ等の家畜、ニワトリ、七面鳥、カモ、ウズラ等の産業上飼育する動物のことである。また本発明を適用しうる愛玩動物とは犬、猫、ハムスターや小型の鳥類等の個人の趣味で飼育する動物や鳥類のことである。飼料組成物としてこれ単独で投与しても良く、さらには飼料に直接添加しても良く、この使用形態は特に限定されない。飼料に添加する場合、添加方法、添加時期等は特に限定されるものではない。
本発明の飼料に含まれる有効成分の含有量は、1日あたりの有効成分の給餌量として0.01〜100mg/kgになるようそれぞれの飼料の形態に合わせて設定すればよく、さらには0.1〜10mg/kgが好ましく、0.5〜5mg/kgが最も好ましい。
【００３３】
本発明の飼料に混合され得る他の材料としては、例えばトウモロコシ、マイロ、大豆、大豆粕、小麦、大麦、米、燕麦、魚粉、脱脂粉乳、ビートパルプペレット、ふすまペレット、グレインスクリーニングペレット、アルファルファペレット、タピオカペレット、コーンコブミール、コットンハルペレット、甘藷チップ、ホミニフィード、ビール粕、ヘイキューブ、ミニキューブ、アルファルファベールドヘイ、スーダングラス、稲わら、ライグラスストロー、フェスキューストロー、バミューダストロー、チモシーヘイ、オーツヘイ、糖蜜、ルーピン、カノーラ、菜種粕、綿実、コーングルテンミール、コーングルテンフィード、ソイハルペレット、ホエイパウダー、ビール酵母、コレステロールなどのほか、薬学的に許容され得るビタミン類やミネラル類、飼料添加物、動物医薬品などが挙げられ、特に限定されるものではない。
【実施例】
【００３４】
以下、本発明を試験例によりさらに詳細に説明する。
【００３５】
なお、ベータNGF産生促進活性の測定は以下のようにして行なった。
〔ヒトグリオブラストーマによるベータNGFの産生〕
終濃度が10％ＦＢＳ（ウシ胎児血清）、110mg/mlピルビン酸ナトリウム、１％ＮＥＡＡ（非必須アミノ酸溶液：インビトロジェン株式会社）を含むＥＭＥＭ培地に、12.5 x10^4細胞/mlの濃度になるよう調製したヒトグリオブラストーマ（神経膠芽腫）Ｔ９８Ｇ細胞懸濁液を、２４穴マルチプレートの各穴に接種し、３日間培養した。その後、5mg/mlのＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）を含むOpti-MEM培地に交換し、さらに４日間培養した。再度培地交換し、各菌糸体培養上清（２倍希釈液）の１２μＬを各穴に添加し、4日間培養した。培養上清を回収し、ベータNGF量を測定した。
【００３６】
〔培養上清中のベータNGFの測定法〕
ベータNGFの測定はR&Dシステム社の「ベータNGF、Human, DuoSet Kit」を使用した。ポリスチレン製の９６穴マルチプレートに、Capture Antibodyとしてマウス抗ヒトベータNGF抗体溶液を各穴に１００μlづつ分注し、室温で一夜放置した。マイクロプレートに吸着されなかった抗体を除去後、Wash Buffer（0.05% Tween20を含むPBS）で各穴を３回洗浄した。各穴に300μｌのReagent Diluent（１％BSAを含むPBS）を加えて1時間以上、室温でブロッキングをし、Wash Buffer（0.05% Tween20を含むPBS）で各穴を３回洗浄した。標準溶液としてのヒト組み換えベータNGF溶液あるいは、上記の実験により得られた各培養上清１００μlを各穴に分注し、室温で２時間放置した後、標準溶液あるいは、培養上清を除去した。さらに各穴を３回づつ洗浄した。Detection Antibodyとしてヒツジ抗ヒトベータNGF抗体溶液を各穴に１００μlづつ分注し、室温で２時間放置した後、ホースラーディッシュ由来パーオキシダーゼを各穴に１００μｌづつ加えて遮光して室温で２０分間静置し、Wash Buffer（0.05% Tween20を含むPBS）で各穴を３回洗浄した。各穴にSubstrate Solution（過酸化水素とテトラメチルベンジジンの混合液）を１００μｌづつ加え室温で２０分間反応させた。Stop Solutionとして２Nの硫酸を５０μｌづつ加え、直ちに吸光度計にて450/540nmの吸光度を測定し、標準曲線よりベータNGF量を算出した。
【００３７】
実施例１
〔菌糸体培養上清の調製〕
ハラタケ目のヒラタケ科ヒラタケ属のシイタケ、キシメジ科ナラタケ属のナラタケ、モエギタケ科クリタケ属のクリタケ、オキナタケ科フミヅキタケ属のヤナギマツタケとフミヅキタケ、ハラタケ科ハラタケ属のハラタケ、ヒダナシタケ目エゾハリタケ科エゾハリタケ属のブナハリタケ、サンゴハリタケ科のヤマブシタケ、アンズタケ科アンズタケ属のアンズタケ、マンネンタケ科マンネンタケ属のマンネンタケ、ニセショウロ目ホコリタケ科ホコリタケ属のホコリタケの子実体から内部の組織を無菌的に切り出した。この組織をポテトデキストロース寒天培地又は、ポテトスクロース寒天培地、ペプトンデキストロース寒天培地に移し、２５℃で２０日間培養した。２０日後成長した菌糸体 を寒天培地に継代培養した。この操作を２度繰り返し、得られた菌糸体をＭＹＧ液体培地（麦芽エキス２％、酵母エキス０．２％、グルコース２％、ｐＨ５．５）の４０ｍｌに移植し、２５℃、１３０ｒｐｍにて７日間振盪培養した。７日後、培養上清と菌糸体をろ紙を用いてろ別した。脱イオン水を用いて該培養上清を２倍希釈し、ベータNGF産生促進活性を試験した。ブランクとしては未使用のＭＹＧ培地を脱イオン水で２倍希釈したものを用いた。
【００３８】
結果、表１に見られるように、フミヅキタケ属のキノコ類の菌糸体培上清にはブランクに比べて３０倍以上のベータＮＧＦ産生促進活性が認められた。
【００３９】
【表１】
【００４０】
実施例２
[ベータＮＧＦ産生促進活性物質の分画]
実施例１と同様の方法でヤナギマツタケを7日間、振盪培養法で液体培養し、培養終了後にろ別により菌糸体と上清とに分離した。菌糸体は洗浄後に３０℃で熱風乾燥して粉砕し、その全量を50%アセトン水４０ｍｌに懸濁して一夜静置した。その後、懸濁液をろ過して菌糸体抽出液を得た。
【００４１】
上清と菌糸体抽出液のベータＮＧＦ産生促進活性について実施例１と同様の方法で測定した。なお、ベータＮＧＦ産生促進活性測定時において、上清に対するブランクとしては未使用の液体培地、菌糸体抽出液に対するブランクとしては50%アセトン水を用い、各画分のベータＮＧＦ産生促進活性を各ブランクと比較することによりベータＮＧＦ産生促進活性を比較した。
【００４２】
結果、表２に示したように、上清に明らかに高いベータＮＧＦ産生促進活性があることが判明した。
【００４３】
【表２】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、神経成長因子（beta nerve growth factor、以下「ベータNGF」と略記）産生促進活性を有する組成物及びその製造方法並びにベータNGF産生促進剤などに関するものであり、さらに詳しくは、神経系の老化予防や神経障害の進行防止、あるいはこれら疾患の改善等に有効な安全性の高いベータNGF産生促進活性を有する組成物に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
高齢化社会への移行に伴って老年型認知症が増加する傾向にあり、社会的な問題となりつつある。老年型認知症の原因となる疾患は数多く知られ、脳器質性障害による認知症、脳以外の臓器疾患に付随した認知症、およびストレスによる身体疾患に起因する認知症に分類される。また、脳器質性障害による認知症は、原因の違いにより脳血管性認知症とアルツハイマー型認知症とに分類される。
【０００３】
現在、脳血管性認知症に対しては脳血管拡張薬などがある程度の効果を示すことが知られているが、アルツハイマー型認知症に対しては、その発症原因が今なお不明であり、適切な治療方法も明らかになっていない。そのため、脳器質性障害による認知症、特にアルツハイマー型認知症に対して有用な医薬や食品の開発が所望されている。
【０００４】
近年、神経細胞から分泌されるベータNGFなどの神経栄養因子が神経変性疾患に対して優れた効果を示すことが見出され、注目を集めている。ベータNGFは、神経組織の成長および機能維持にとって重要かつ必要な因子である。ベータNGFは、末梢神経における知覚および交感神経の、ならびに中枢神経における大細胞性コリン作動性ニューロンの、成熟、分化、および生命維持に不可欠であり、脳損傷時の神経細胞の変性を防ぐという作用を示す。これにより、生体内においてベータNGFレベルを上昇させることは、アルツハイマー型認知症及び脳血管性認知症のような中枢機能障害、精髄障害、末梢神経損傷、糖尿病性神経障害、並びに筋萎縮変性側索硬化症のような抹消機能障害の治療に有用であると考えられる。
【０００５】
しかし、ベータNGFはモノマーで１３０００又はダイマーでは２６０００もの分子量を有するタンパク質であり、血液脳関門を通過することができない。そのため、例えば中枢機能障害の治療を目的とした場合には、脳室内投与が必要となる。さらに、ベータNGFの大量調製も困難である。このようにベータNGF自体の使用には多くの問題があり、ベータNGF自体を用いることは非常に困難である。
【０００６】
ベータNGFが、末梢神経系においては胎生期の知覚および交感神経節神経細胞の分化及び成長を促進し、神経細胞突起の伸長を促すペプチドであること、さらに成熟交感神経細胞にとっては一生を通じて生存および機能維持に不可欠なペプチドであることが知られている。たとえば、幼若動物に抗ベータNGF抗体を連続投与してベータNGFの生理活性を中和した場合には、交感神経節の顕著な萎縮や神経節神経細胞の死滅が観察されている（非特許文献１、２）。この現象は不可逆的であり、ベータNGFの生理的役割の重要性を証明するものである。また、ベータNGFの作用に関する応用研究も行なわれており、ベータNGFが神経軸索の再生にも有効であることが明らかにされている（非特許文献３）。
【０００７】
一方、中枢神経系におけるベータNGFの重要性も知られており、たとえば、中隔から海馬へ投射している神経路を切断したラットの脳室内にベータNGFを投与することによって、中隔のコリン作動性神経細胞の変性、脱落が抑制されること（非特許文献４、５）、老齢ラットの学習、記憶能力がベータNGFの脳室内投与で改善されること（非特許文献６）、脳虚血後に見られる海馬の錐体細胞の遅延性細胞死がベータNGFの前投与により抑制されること（非特許文献７）等が報告されている。
【０００８】
このように、ベータNGFが神経細胞の生存に不可欠な因子であることから、神経疾患や神経細胞障害の進行防止ないしは治療を目的として、ベータNGFの産生を促進する物質の検索が行なわれている。その結果、これまでにカテコールアミン類（非特許文献８）、コリン作動性アゴニスト（特許文献１）、桂皮酸アミド化合物（特許文献２）、ベンゾキノン誘導体（非特許文献９）及びプロペントフィリン（非特許文献１０）にベータNGF産生促進作用のあることが報告されている。また、線維芽細胞成長因子（fibroblast growth factor）、血小板由来成長因子（platelet-derived growth factor）、トランスフォーミング成長因子アルファ及びベータ（transforming growth factor αand β）、上皮細胞成長因子（epidermal growth factor）及びインシュリン様成長因子（insulin-like growth factor）等のいわゆる細胞増殖因子にもベータNGFの産生を促進する活性が認められている（非特許文献１１）。
【０００９】
ベータNGF産生を促進する食品由来の物質又は抽出物としては、ホップ又はアシタバから得られる破砕物又は抽出物（特許文献３）、ローズマリー由来のカルノジン酸（特許文献４）、緑茶由来のテアニン（特許文献５）、ガゴメコンブ由来のフコイダン（特許文献６）、白子由来のプロタミン（特許文献７）などが知られている。またキノコ類についてはブナハリタケの子実体由来のシクロペンテノン誘導体（非特許文献１２、特許文献８）、ヤマブシタケの子実体又は菌糸体抽出物（特許文献９）、ケロウジ子実体由来のシアタン誘導体（特許文献１０）などが知られている。またハラタケ目とヒダナシタケ目の子実体及び菌糸体の乾燥物の水性抽出画分にベータＮＧＦ産生促進活性があることが知られている。（特許文献１１）いずれもベータNGF産生促進活性が認められるのは子実体及び菌糸体乾燥物を溶媒で抽出した画分のみであり、菌糸体培養上清にベータNGF産生促進活性があることは全く報告されていない。
【００１０】
ヤナギマツタケ（Ａｇｒｏｃｙｂｅ ｃｙｌｉｎｄｒａｃｅａ）はハラタケ目オキナタケ科フミヅキタケ属の木材腐朽菌であり、春から秋にかけて広葉樹の枯れ木や生木の腐朽部に発生する。まれに街路樹のポプラ、ハコヤナギ、カエデなどの木の根元に束生しているのを見かけることがある馴染みの高いキノコである。ヤナギマツタケは別名カエデモタシとも呼ばれ、ヨーロッパでは美味な食用キノコとして珍重されている。近年、その食感や味の良さから、国内でも人工栽培の研究が行われて栽培技術が確立され、特定のメーカーから一般に販売されているキノコである。（特許文献１２）
ヤナギマツタケに含まれる成分の機能性については、子実体や菌糸体の溶媒抽出物に抗突然変異性（非特許文献１６）、抗カビ活性（非特許文献１７）、抗酸化活性（非特許文献１８）、白血病細胞の増殖抑制活性（特許文献１３）、抗菌活性（特許文献１４）、皮膚疾患改善作用（特許文献１５）が知られているが、ベータＮＧＦ産生促進活性などの脳機能改善効果については全く知られていなかった。
【非特許文献１】R. Levi‐Montalcina他、Physiological Review,48, 534−569, 1968
【非特許文献２】H. Thoenen他、Physiological Review, 60, 1284−1335, 1980
【非特許文献３】Rich他、Experimental Neurology, 105, 162−170, 1989
【非特許文献４】F. Hefti, Journal of Ncuroscience, 6, 2155−2162, 1986 : L. F.Kromer, Science, 235, 214−216, 1987
【非特許文献５】L. R. Williams他、Proceedings of National Academy of Sciences U. S. A. 83, 9231−9235, 1986
【非特許文献６】W. Fisher他、Nature, 329, 65−68, 1987
【非特許文献７】茂野他、医学のあゆみ、第145巻、579−580, 1988
【非特許文献８】Y.Furukawa他、Journal of Biological Chemistry, 261, 6039−6047,1986
【特許文献１】特開昭６３−８３０２０号公報
【特許文献２】特開平２−１０４５６８号公報
【非特許文献９】R. Takeuchi他、FEBS Letter, 261, 63-66, 1990
【非特許文献１０】I. Shinoda他、Biochemical Pharmacology, 39, 1813−1816, 1990
【非特許文献１１】篠田他、生化学、第６２巻、835頁、1990年
【特許文献３】再表２００３−００６０３７号公報
【特許文献４】特開２００１−２３３８３５号公報
【特許文献５】特開平７−１７３０５９号公報
【特許文献６】再表２０００−０６２７８５号公報
【特許文献７】特開平５−５１３２５号公報
【非特許文献１２】OkuyamaS他、NutrNeurosci. 7, 741-47,2004
【特許文献８】特開平９−１２４５４１号公報
【特許文献９】特開平９−２４１２９１号公報
【特許文献１０】ＷＯ２００３／００７９７７
【特許文献１１】特開平１１−２６９１２５号公報
【非特許文献１３】平成8年 食品試験研究成績 計画概要旨集 p109-110
【非特許文献１４】Drug metab. Rev.,2000, 32;395-411
【非特許文献１５】PNAS,1994, 91: 3147-50
【非特許文献１６】TairaK, Miyashita Y他、MutatRes. 2005 Oct 3;586(2):115-23.
【非特許文献１７】NgaiPH, Zhao Z, Ng TB.、Peptides. 2005 Feb;26(2):191-6.
【非特許文献１８】Kim WG, Lee IK他、J Nat Prod. 1997 Jul;60(7):721-3.
【特許文献１２】特開平６−２４５６４５号公報
【特許文献１３】特開２０００−１９１５４７号公報
【特許文献１４】特開２００２−２１２１３７号公報
【特許文献１５】特開２００５−８９３８９０号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
豊富な食経験があり、ベータNGF産生促進作用を有する食品由来成分を好ましくは摂取して認知症や神経障害の防止又は改善が可能となることが期待されている。
【００１２】
本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであり、ベータNGFの産生を高めることにより神経細胞の生存と機能維持を促して神経系の老化を予防ないし改善し、また障害を受けた神経細胞に対してはその細胞自身の変成脱落を予防し、神経障害の進行を防止ないし改善する、ベータNGF産生促進活性を有するフミヅキタケ属の菌糸体培養上清を提供することを課題としている。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明者らは、ベータNGF産生促進作用を有するキノコ類の菌糸体培養上清の検討を鋭意行い、フミヅキタケ属の菌糸体培養液に強いベータNGF産生促進活性があることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１４】
すなわち本発明の第一は、フミヅキタケ属のキノコ類の菌糸体培養上清から得られることを特徴とするベータNGF産生促進活性を有する組成物を要旨とするものであり、好ましくは、フミヅキタケ属のキノコがヤナギマツタケである。
本発明の第二は、フミヅキタケ属の菌糸体培養上清からベータNGF産生促進活性を有する組成物を取得することを特徴とする神経成長因子産生促進活性を有する組成物の製造方法である。
【００１５】
本発明の第三は、前記したベータNGF産生促進活性を有する組成物を有効成分とすることを特徴とする神経成長因子産生促進剤を要旨とするものである。
【００１６】
さらに別の本発明は、前記したベータNGF産生促進活性を有する組成物を含有することを特徴とする神経成長因子産生促進活性を有する飲食品、飼料を要旨とするものである。
なお本発明における菌糸体培養上清とは、菌糸体培養液から公知の方法で菌糸体を除去した培養液の上清を指すだけでなく、上清を各種溶媒により分画した画分、エバポレーターなどで濃縮した液、カラムを用いてさらに分画、精製した画分なども含む。
【発明の効果】
【００１７】
本発明によれば、フミヅキタケ属のキノコ類の菌糸体培養液上清を薬学的組成物や食品組成物、飼料として利用することにより、神経系の老化予防や神経障害の進行防止、あるいはこれら疾患の改善が期待できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１９】
本発明におけるフミヅキタケ属にはフミヅキタケ（Ａｇｒｏｃｙｂｅ ｐｒａｅｃｏｘ）、ツバナシフミヅキタケ（Ａｇｒｏｃｙｂｅ ｆａｒｉｎａｃｅａ）、ハタケキノコ（Ａｇｒｏｃｙｂｅ ｓｅｍｉｏｒｂｉｃｕｌａｒｉｓ）、タマムクエタケ（Ａｇｒｏｃｙｂｅ ａｒｖａｌｉｓ）、ツチナメコ（Ａｇｒｏｃｙｂｅ ｅｒｅｂｉａ）、ヤナギマツタケ（Ａｇｒｏｃｙｂｅ ｃｙｌｉｎｄｒａｃｅａ）が挙げられるが最も好ましくはヤナギマツタケである。
【００２０】
本発明において、フミヅキタケ属のキノコ類の菌糸体培養液上清は公知の純粋液体培養法によって得ることができる。培地に使用する炭素源としては、グルコースなどの単糖の他、デキストリン、グリセロールなど通常用いられる炭素源が使用できる。また、窒素源としては無機又は有機窒素源が使用できるが、生育速度の観点からは有機窒素源を用いるほうが好ましい。また、必要に応じて微量元素やビタミン等の生育因子を添加することは通常の培養と何ら変わりはない。さらに必要に応じては、植物破砕物や微生物発酵物を窒素現や炭素現に用いて培養しても良い。
【００２１】
培養温度は１５℃〜３０℃、好ましくは１８℃〜２８℃、２０℃〜２５℃が最も好ましい。ｐＨは２．５〜８．０、好ましくは３．０〜７．０、３．５〜５．０が最も好ましい。培地成分には不溶成分を添加することが均一に生育させることができ、菌糸体を除去する観点から好ましい。培養期間は菌株により、数日から数週間程度に設定されうる。
【００２２】
本発明における菌糸体培養液上清とは、菌糸体培養液からろ過や遠心分離など公知の方法で菌糸体を除去した上清のみを指すだけでなく、その上清をエバポレーターなどの公知の方法で濃縮した濃縮液や希釈液、該抽出液や濃縮液をさらに種々の溶媒を用いて分画した画分、シリカゲルクロマトグラフィーなどのカラムを用いて公知の方法によりさらに精製した画分や、スプレードライ法などの公知の方法でそれらを乾燥した乾燥物などが含まれる。
【００２３】
以上のようにして得られたフミヅキタケ属のキノコ類の菌糸体培養液上清は、そのままで、あるいは必要に応じて他の成分を加えることで本発明のベータNGF産生促進活性を有する組成物となる。また必要に応じて、菌糸体を上清に再度加えてもなんら問題はない。
【００２４】
本発明における組成物に含まれ得る他の成分としては、本発明におけるベータＮＧＦ産生促進活性を低下させないものであれば混合することが可能であり、例えば従来から用いられている薬学的に許容された界面活性剤、溶媒、増粘剤、安定剤、保存料、酸化防止剤、香味料などの添加剤、他のベータＮＧＦ産生促進活性を有する成分や化合物、別の機能性（血流改善効果や血圧上昇抑制効果など）を有する成分や化合物などと混合して用いることが出来る。
【００２５】
組成物の形態としては、錠剤、液体、カプセル、軟カプセル、ペースト若しくはトローチ、ガム、又は飲用可能な溶液若しくは乳濁液、ドライ経口サプリメント、ウェット経口サプリメントなどが挙げられるがこれらに限定されるものではない。また、これらの形態は従来から知られている方法によって作製することができる。
【００２６】
本発明のベータNGF産生促進剤は、上記した本発明のベータNGF産生促進活性を有する組成物を有効成分として含むものである。有効成分の含有量としては、摂取する対象者の年齢、体重などによって変わり得るが、成人１日あたり0.01〜100mg/kg服用できるように含有するのが好ましく、さらに0.1〜10mg/kgが好ましく、0.5〜5mg/kgが最も好ましい。
【００２７】
本発明のベータNGF産生促進剤に含まれる各種添加剤としては、界面活性剤、賦形剤、着色料、保存料、コーティング助剤ならびにこれらの組合せが挙げられる。これら添加剤は、通常の医薬品製造における添加剤であれば特に限定されず、より具体的な例としては、ラクトース、デキストリン、スクロース、マンニトール、コーンスターチ、ソルビトール、結晶性セルロース、ポリビニルピロリドン、デキストリン、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース塩、ステアリン酸及びその塩、タルクなどの添加剤であり、これらの組合せが挙げられる。さらに、香辛料、甘味料などを添加してもよい。またさらに、必要に応じて他の薬剤や食品粉砕物、食品抽出物を添加してもよい。
【００２８】
本発明のベータNGF産生促進剤の投与剤形も特に限定されず、日本薬局方に従って適切な剤形に製造される。具体的には、カプセル剤、錠剤、粉剤、除放剤などの剤形に製造される。
【００２９】
本発明のベータNGF産生促進活性を有する飲食品は、上記した本発明のベータNGF産生促進活性を有する組成物を含有するものである。有効成分の含有量は1日あたりの摂取量が0.01〜100mg/kgになるようそれぞれの飲食品の形態に合わせて設定すればよく、さらには0.1〜10mg/kgが好ましく、0.5〜5mg/kgが最も好ましい。
【００３０】
本発明のベータNGF産生促進活性を有する飲食品に混合され得る他の材料としては、一般に食品用材料として使用され得るものである。例としては、米、小麦、トウモロコシ、ジャガイモ、昆布などから得られる多糖類、大豆や乳製品、動物原料などから得られるタンパク質、グルコース、ラクトース、フルクトース、スクロース、マンニトール、キシリトールや各種オリゴ糖などの糖類、ならびにこれらの組合せが挙げられる。さらに、香辛料、着色料、甘味料、酸味料、食用油、ビタミンや他の食品破砕物、食品抽出物などを添加してもよい。これら適切な材料および添加剤は単独または組合せて使用される。またさらに、必要に応じて水を添加して所望の形状に加工してもよい。
【００３１】
飲食品の具体例としては、菓子類（ガム、キャンディー、キャラメル、チョコレート、クッキー、スナック菓子、ゼリー、グミ、錠菓等）、麺類（そば、うどん、ラーメン等）、乳製品（ミルク、アイスクリーム、ヨーグルト等）、調味料（味噌、醤油等）、スープ類、飲料（ジュース、コーヒー、紅茶、茶、炭酸飲料、スポーツ飲料等）をはじめとする一般食品や健康食品（錠剤、カプセル等）、栄養補助食品（栄養ドリンク等）などが挙げられるがこれらに限定されるものではない。また、インスタント食品に本発明の抽出物を添加しても良い。例えば、抽出物を粉末セルロースとともにスプレードライまたは凍結乾燥したものを、粉末、顆粒、打錠または溶液にすることで容易に飲食品に含有させることができる。
【００３２】
本発明のベータNGF産生促進活性を有する飼料は、上記した本発明のベータNGF産生促進活性を有する組成物を含有するものであり、すべての家畜や家禽、愛玩動物に適用することが可能である。本発明の飼料を適用し得る家畜や家禽類としては、ウシ、ブタ、ウマ、ヤギ、ヒツジ、ウサギ等の家畜、ニワトリ、七面鳥、カモ、ウズラ等の産業上飼育する動物のことである。また本発明を適用しうる愛玩動物とは犬、猫、ハムスターや小型の鳥類等の個人の趣味で飼育する動物や鳥類のことである。飼料組成物としてこれ単独で投与しても良く、さらには飼料に直接添加しても良く、この使用形態は特に限定されない。飼料に添加する場合、添加方法、添加時期等は特に限定されるものではない。
本発明の飼料に含まれる有効成分の含有量は、1日あたりの有効成分の給餌量として0.01〜100mg/kgになるようそれぞれの飼料の形態に合わせて設定すればよく、さらには0.1〜10mg/kgが好ましく、0.5〜5mg/kgが最も好ましい。
【００３３】
本発明の飼料に混合され得る他の材料としては、例えばトウモロコシ、マイロ、大豆、大豆粕、小麦、大麦、米、燕麦、魚粉、脱脂粉乳、ビートパルプペレット、ふすまペレット、グレインスクリーニングペレット、アルファルファペレット、タピオカペレット、コーンコブミール、コットンハルペレット、甘藷チップ、ホミニフィード、ビール粕、ヘイキューブ、ミニキューブ、アルファルファベールドヘイ、スーダングラス、稲わら、ライグラスストロー、フェスキューストロー、バミューダストロー、チモシーヘイ、オーツヘイ、糖蜜、ルーピン、カノーラ、菜種粕、綿実、コーングルテンミール、コーングルテンフィード、ソイハルペレット、ホエイパウダー、ビール酵母、コレステロールなどのほか、薬学的に許容され得るビタミン類やミネラル類、飼料添加物、動物医薬品などが挙げられ、特に限定されるものではない。
【実施例】
【００３４】
以下、本発明を試験例によりさらに詳細に説明する。
【００３５】
なお、ベータNGF産生促進活性の測定は以下のようにして行なった。
〔ヒトグリオブラストーマによるベータNGFの産生〕
終濃度が10％ＦＢＳ（ウシ胎児血清）、110mg/mlピルビン酸ナトリウム、１％ＮＥＡＡ（非必須アミノ酸溶液：インビトロジェン株式会社）を含むＥＭＥＭ培地に、12.5 x10^4細胞/mlの濃度になるよう調製したヒトグリオブラストーマ（神経膠芽腫）Ｔ９８Ｇ細胞懸濁液を、２４穴マルチプレートの各穴に接種し、３日間培養した。その後、5mg/mlのＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）を含むOpti-MEM培地に交換し、さらに４日間培養した。再度培地交換し、各菌糸体培養上清（２倍希釈液）の１２μＬを各穴に添加し、4日間培養した。培養上清を回収し、ベータNGF量を測定した。
【００３６】
〔培養上清中のベータNGFの測定法〕
ベータNGFの測定はR&Dシステム社の「ベータNGF、Human, DuoSet Kit」を使用した。ポリスチレン製の９６穴マルチプレートに、Capture Antibodyとしてマウス抗ヒトベータNGF抗体溶液を各穴に１００μlづつ分注し、室温で一夜放置した。マイクロプレートに吸着されなかった抗体を除去後、Wash Buffer（0.05% Tween20を含むPBS）で各穴を３回洗浄した。各穴に300μｌのReagent Diluent（１％BSAを含むPBS）を加えて1時間以上、室温でブロッキングをし、Wash Buffer（0.05% Tween20を含むPBS）で各穴を３回洗浄した。標準溶液としてのヒト組み換えベータNGF溶液あるいは、上記の実験により得られた各培養上清１００μlを各穴に分注し、室温で２時間放置した後、標準溶液あるいは、培養上清を除去した。さらに各穴を３回づつ洗浄した。Detection Antibodyとしてヒツジ抗ヒトベータNGF抗体溶液を各穴に１００μlづつ分注し、室温で２時間放置した後、ホースラーディッシュ由来パーオキシダーゼを各穴に１００μｌづつ加えて遮光して室温で２０分間静置し、Wash Buffer（0.05% Tween20を含むPBS）で各穴を３回洗浄した。各穴にSubstrate Solution（過酸化水素とテトラメチルベンジジンの混合液）を１００μｌづつ加え室温で２０分間反応させた。Stop Solutionとして２Nの硫酸を５０μｌづつ加え、直ちに吸光度計にて450/540nmの吸光度を測定し、標準曲線よりベータNGF量を算出した。
【００３７】
実施例１
〔菌糸体培養上清の調製〕
ハラタケ目のヒラタケ科ヒラタケ属のシイタケ、キシメジ科ナラタケ属のナラタケ、モエギタケ科クリタケ属のクリタケ、オキナタケ科フミヅキタケ属のヤナギマツタケとフミヅキタケ、ハラタケ科ハラタケ属のハラタケ、ヒダナシタケ目エゾハリタケ科エゾハリタケ属のブナハリタケ、サンゴハリタケ科のヤマブシタケ、アンズタケ科アンズタケ属のアンズタケ、マンネンタケ科マンネンタケ属のマンネンタケ、ニセショウロ目ホコリタケ科ホコリタケ属のホコリタケの子実体から内部の組織を無菌的に切り出した。この組織をポテトデキストロース寒天培地又は、ポテトスクロース寒天培地、ペプトンデキストロース寒天培地に移し、２５℃で２０日間培養した。２０日後成長した菌糸体 を寒天培地に継代培養した。この操作を２度繰り返し、得られた菌糸体をＭＹＧ液体培地（麦芽エキス２％、酵母エキス０．２％、グルコース２％、ｐＨ５．５）の４０ｍｌに移植し、２５℃、１３０ｒｐｍにて７日間振盪培養した。７日後、培養上清と菌糸体をろ紙を用いてろ別した。脱イオン水を用いて該培養上清を２倍希釈し、ベータNGF産生促進活性を試験した。ブランクとしては未使用のＭＹＧ培地を脱イオン水で２倍希釈したものを用いた。
【００３８】
結果、表１に見られるように、フミヅキタケ属のキノコ類の菌糸体培上清にはブランクに比べて３０倍以上のベータＮＧＦ産生促進活性が認められた。
【００３９】
【表１】
【００４０】
実施例２
[ベータＮＧＦ産生促進活性物質の分画]
実施例１と同様の方法でヤナギマツタケを7日間、振盪培養法で液体培養し、培養終了後にろ別により菌糸体と上清とに分離した。菌糸体は洗浄後に３０℃で熱風乾燥して粉砕し、その全量を50%アセトン水４０ｍｌに懸濁して一夜静置した。その後、懸濁液をろ過して菌糸体抽出液を得た。
【００４１】
上清と菌糸体抽出液のベータＮＧＦ産生促進活性について実施例１と同様の方法で測定した。なお、ベータＮＧＦ産生促進活性測定時において、上清に対するブランクとしては未使用の液体培地、菌糸体抽出液に対するブランクとしては50%アセトン水を用い、各画分のベータＮＧＦ産生促進活性を各ブランクと比較することによりベータＮＧＦ産生促進活性を比較した。
【００４２】
結果、表２に示したように、上清に明らかに高いベータＮＧＦ産生促進活性があることが判明した。
【００４３】
【表２】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
フミヅキタケ属に属するキノコの菌糸体培養上清から得られることを特徴とする神経成長因子産生促進活性を有する組成物。
【請求項２】
フミヅキタケ属に属するキノコが、ヤナギマツタケである請求項１記載の神経成長因子産生促進活性を有する組成物。
【請求項３】
フミヅキタケ属に属するキノコを、液体培地で菌糸体培養を行い、菌糸体培養液の上清から神経成長因子産生促進活性を有する組成物を取得することを特徴とする神経成長因子産生促進活性を有する組成物の製造方法。
【請求項４】
請求項１又は２記載の組成物を有効成分として含有することを特徴とする神経成長因子産生促進剤。
【請求項５】
請求項１又は２記載の組成物を有効成分として含有することを特徴とする神経成長因子産生促進活性を有する飲食品。
【請求項６】
請求項１又は２記載の組成物を有効成分として含有することを特徴とする神経成長因子産生促進活性を有する飼料。
【請求項１】
フミヅキタケ属に属するキノコの菌糸体培養上清から得られることを特徴とする神経成長因子産生促進活性を有する組成物。
【請求項２】
フミヅキタケ属に属するキノコが、ヤナギマツタケである請求項１記載の神経成長因子産生促進活性を有する組成物。
【請求項３】
フミヅキタケ属に属するキノコを、液体培地で菌糸体培養を行い、菌糸体培養液の上清から神経成長因子産生促進活性を有する組成物を取得することを特徴とする神経成長因子産生促進活性を有する組成物の製造方法。
【請求項４】
請求項１又は２記載の組成物を有効成分として含有することを特徴とする神経成長因子産生促進剤。
【請求項５】
請求項１又は２記載の組成物を有効成分として含有することを特徴とする神経成長因子産生促進活性を有する飲食品。
【請求項６】
請求項１又は２記載の組成物を有効成分として含有することを特徴とする神経成長因子産生促進活性を有する飼料。
【公開番号】特開２００７−２３０９２７（Ｐ２００７−２３０９２７Ａ）
【公開日】平成１９年９月１３日（２００７．９．１３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−５５６５６（Ｐ２００６−５５６５６）
【出願日】平成１８年３月２日（２００６．３．２）
【出願人】（０００００４５０３）ユニチカ株式会社 (1,214)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１９年９月１３日（２００７．９．１３）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年３月２日（２００６．３．２）
【出願人】（０００００４５０３）ユニチカ株式会社 (1,214)
【Ｆターム（参考）】
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