神経疾患の治療薬およびそのスクリーニング方法
【課題】 神経疾患の治療薬およびそのスクリーニング方法
【解決手段】 被検化合物の存在下および非存在下のそれぞれの条件において、細胞を培養する工程と、それぞれの培養した細胞中のＬＭＯ３遺伝子の発現量を測定する工程と、被検化合物の存在下において培養した細胞中のＬＭＯ３遺伝子の発現量が、被検化合物の非存在下において培養した細胞中のＬＭＯ３遺伝子の発現量よりも低い場合に、当該被検化合物を神経疾患の治療薬と判定する工程と、を備える、神経疾患の治療薬のスクリーニング方法を提供する。
【解決手段】 被検化合物の存在下および非存在下のそれぞれの条件において、細胞を培養する工程と、それぞれの培養した細胞中のＬＭＯ３遺伝子の発現量を測定する工程と、被検化合物の存在下において培養した細胞中のＬＭＯ３遺伝子の発現量が、被検化合物の非存在下において培養した細胞中のＬＭＯ３遺伝子の発現量よりも低い場合に、当該被検化合物を神経疾患の治療薬と判定する工程と、を備える、神経疾患の治療薬のスクリーニング方法を提供する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、神経疾患の治療薬およびそのスクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
パーキンソン病は、アルツハイマー病についで患者数が多い神経変性疾患であり、振戦、協調運動障害や筋肉硬直などの症状が徐々にあらわれて進行し、数年後には寝たきりとなり、やがては死にいたる難病である。神経伝達物質ドパミンの生成に関わる中脳の黒質の神経細胞が変性脱落し、脳内のドパミン不足とアセチルコリンの相対的増加とを病態とする。原因不明、治療方法未確立であり、経過が慢性にわたり、また精神的にも負担の大きい疾病であることから特定疾患に指定されており、難病対策推進のため調査研究の対象になっている。
【０００３】
これまでに、若年で発症する常染色体劣性若年性パーキンソン病においては、原因遺伝子としてＰＡＲＫ２遺伝子が同定され、その原因遺伝子産物はＰａｒｋｉｎと名付けられた（非特許文献１）。また、Ｐａｒｋｉｎは、ユビキチンリガーゼ（Ｅ３）としての活性をもつことが明らかにされている（非特許文献２）。
【０００４】
神経芽腫は交感神経系（傍脊椎交感神経幹と副腎髄質神経細胞）から発生する腫瘍である。神経芽腫は最も高頻度な小児悪性腫瘍でありながら、予後不良例と予後良好例が混在している臨床的にも極めて興味深い腫瘍で、発症年齢が１歳未満の症例では神経芽腫の明らかな自然退縮や成熟化がみられる一方、発症年齢が１歳以上の症例では腫瘍の転移および増殖が急速に進行し、治療の困難な予後不良症例となる。
【０００５】
本発明者らは、ヒト神経芽腫の予後良好群に比べて、予後不良群において高発現する新規遺伝子の一つとして、ＬＩＭドメインを有する転写制御因子ＬＭＯ３をコードする遺伝子を同定した。ＬＭＯ３は転写因子Ｍａｓｈ１遺伝子の発現を制御することが判明している。しかしながら、神経芽腫などの神経疾患におけるＬＭＯ３の分子機構は未だ明らかになっていない。
【０００６】
【非特許文献１】Ｋｉｔａｄａ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３９２(６６７６) ６０５−６０８（１９９８）
【非特許文献２】Ｓｈｉｍｕｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ． Ｇｅｎｅｔ． ２５， ３０２−３０５（２０００）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
パーキンソン病の治療法は、化学療法としてドパミンを補いその作用を助ける薬の服用が多く適用されている。しかし、この治療法は症状を改善するが、ドパミン神経の変性そのものを抑制する方法ではない。また、パーキンソン病の主因は、中脳黒質のドパミン神経細胞の選択的変性によることが病理学的に解明されているが、その神経細胞変性の原因は明らかになっておらず、詳しい発病機構はほとんど分かっていない。したがって、神経変性を抑制する方法はまだ見つかっていない。
【０００８】
また、神経芽腫の従来の治療法は化学療法・放射線療法・外科的切除を組み合わせた集学的治療法であるが、１歳以上の進行症例では予後不良であり、生存率の顕著な改善は見られていない。
【０００９】
パーキンソン病の原因遺伝子産物Ｐａｒｋｉｎおよび神経芽腫の予後不良群に高発現するＬＭＯ３の神経細胞における分子機構を解明することができれば、パーキンソン病および神経芽腫などの神経疾患発症の機構を明らかにすることができ、新たな機構に基づく治療薬の開発につながる。そこで、本発明は、ＰａｒｋｉｎおよびＬＭＯ３の分子機構を明らかにし、神経疾患の治療薬およびそのスクリーニング方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、ユビキチンリガーゼであるＰａｒｋｉｎが未知の基質を介して神経細胞の機能制御に重要な役割を担っており、Ｐａｒｋｉｎおよび／または未知の基質の異常によって、神経変性が誘導されるのではないかと考えた。また本発明者らは、神経芽腫の予後に相関するＬＭＯ３の分子機構を明らかにすることが、神経細胞の機能制御の解明につながると考えた。この仮定に基づき鋭意研究した結果、本発明者らは、本願における知見を見出した。すなわち、Ｐａｒｋｉｎ新規基質としてＬＭＯ３を同定した。そして、ＰａｒｋｉｎがＬＭＯ３を介して神経細胞の機能制御に関与している可能性を見出した。
【００１１】
具体的には、ＰａｒｋｉｎがＭａｓｈ１遺伝子の転写を抑制することを本発明者らは見出した。またこの時、Ｐａｒｋｉｎは細胞増殖能を抑制することが新たに判明した。さらに、ＰａｒｋｉｎがＬＭＯ３によるＭａｓｈ１遺伝子の転写促進を抑制することを本発明者らは明らかにした。加えて、Ｐａｒｋｉｎ変異体においてはその抑制活性が減弱することを本発明者らは見出した。このことは、ＰａｒｋｉｎがＬＭＯ３を介して神経細胞の機能制御に重要な役割を担っている可能性を示唆している。以上の知見から、本発明者らは本発明を完成するに至った。
【００１２】
すなわち、本発明は、被検化合物の存在下および非存在下のそれぞれの条件において、細胞を培養する工程と、それぞれの培養した細胞中のＬＭＯ３遺伝子の発現量を測定する工程と、被検化合物の存在下において培養した細胞中のＬＭＯ３遺伝子の発現量が、被検化合物の非存在下において培養した細胞中のＬＭＯ３遺伝子の発現量よりも低い場合に、当該被検化合物を神経疾患の治療薬と判定する工程と、を備える、神経疾患の治療薬のスクリーニング方法を提供する。
【００１３】
本発明のスクリーニング方法は、ＬＭＯ３遺伝子の発現レベルが神経芽腫の予後不良と相関し、ＰａｒｋｉｎがＬＭＯ３を介して神経細胞の機能制御に重要な役割を担っているという本発明者が新たに発見した知見に基づくものである。これによって、神経疾患、特にパーキンソン病および神経芽腫の治療薬の開発が可能となる。
【００１４】
本発明のスクリーニング方法は、被検化合物の存在下および非存在下のそれぞれの条件において、細胞を培養する工程と、それぞれの培養した細胞中のＬＭＯ３遺伝子およびＭａｓｈ１遺伝子の発現量を測定する工程と、被検化合物の存在下において培養した細胞中のＬＭＯ３遺伝子およびＭａｓｈ１遺伝子の発現量が、被検化合物の非存在下において培養した細胞中のＬＭＯ３遺伝子およびＭａｓｈ１遺伝子の発現量よりも低い場合に、当該被検化合物を神経疾患の治療薬と判定する工程と、を備えることを特徴とする。
【００１５】
本発明のスクリーニング方法は、ＰａｒｋｉｎがＬＭＯ３を介してＭａｓｈ１遺伝子の転写を制御するという本発明における知見を応用したものである。これによって、Ｐａｒｋｉｎ、ＬＭＯ３およびＭａｓｈ１による神経細胞の機能制御機構に基づく、新たな神経疾患の治療薬の開発が可能となる。
【００１６】
また本発明のスクリーニング方法は、被検化合物の存在下および非存在下のそれぞれの条件において、細胞を培養する工程と、それぞれの培養した細胞中のＰａｒｋｉｎ蛋白質とＬＭＯ３蛋白質との相互作用および／またはＬＭＯ３蛋白質のユビキチン化量を測定する工程と、被検化合物の非存在下よりも被検化合物の存在下において、培養した細胞中のＰａｒｋｉｎ蛋白質とＬＭＯ３蛋白質との相互作用が強く、および／または、培養した細胞中のＬＭＯ３蛋白質のユビキチン化量が高い場合に、当該被検化合物を神経疾患の治療薬と判定する工程と、を備えることを特徴とする。
【００１７】
本発明のスクリーニング方法は、ＰａｒｋｉｎがＬＭＯ３と相互作用し、ユビキチン化してＬＭＯ３の機能を阻害するという、本発明者が新たに発見した知見に基づくものである。上記構成によって、神経疾患、特にパーキンソン病および神経芽腫の治療薬の開発が可能となる。
【００１８】
本発明のスクリーニング方法にかかる細胞は、神経組織由来の培養細胞であることが好ましく、また、神経芽腫細胞であることが好ましく、ヒト神経芽腫の臨床サンプル由来の細胞であることが好ましい。これによって、神経疾患の治療薬を開発することができる。
【００１９】
本発明は、また、配列番号５に記載の塩基配列からなるｓｉＲＮＡを含む、神経芽種の治療薬を提供する。ここで、配列番号５に記載の塩基配列からなるｓｉＲＮＡは、ＬＭＯ３遺伝子に特異的なｓｉＲＮＡに相当する。なお、ＬＭＯ３遺伝子（配列番号１）およびＬＭＯ３（配列番号２）のＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．は、ＮＭ＿００１００１３９５である。ＬＭＯ３遺伝子の機能阻害をすることによって、神経細胞の機能を調整し、神経疾患症状が改善されることが期待できる。
【発明の効果】
【００２０】
本発明のスクリーニング方法によれば、今までとは作用機序の異なる、神経疾患の治療薬を開発することができる。また、本発明の治療薬により、神経疾患症状の改善が期待できる。特に、パーキンソン病および神経芽腫において、疾患の進行遅延および症状の改善が期待できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】
以下、本発明の好適な実施形態について詳細に説明する。
【００２２】
（治療薬のスクリーニング方法）
本実施形態における治療薬のスクリーニング方法には、ＬＭＯ３遺伝子の発現量を指標とする、第一および第二の治療薬のスクリーニング方法と、ＬＭＯ３蛋白質量および／またはユビキチン化量を指標とする第三の治療薬のスクリーニング方法とがある。
【００２３】
まず、ＬＭＯ３遺伝子の発現量を指標とする治療薬のスクリーニング方法を説明する。第一の治療薬のスクリーニング方法は、被検化合物の存在下および非存在下のそれぞれの条件において、細胞を培養する工程と、それぞれの培養した細胞中のＬＭＯ３遺伝子の発現量を測定する工程と、被検化合物の存在下において培養した細胞中のＬＭＯ３遺伝子の発現量が、被検化合物の非存在下において培養した細胞中のＬＭＯ３遺伝子の発現量よりも低い場合に、当該被検化合物を神経疾患の治療薬と判定する工程と、を備える。
【００２４】
ここで、遺伝子の発現量とは、遺伝子の転写産物であるｍＲＮＡの発現量および／またはその翻訳産物である蛋白質の発現量を指す。ｍＲＮＡの発現量の測定は、当業者にとって公知の測定系を用いて行えばよく、具体的には、定量的ＲＴ−ＰＣＲ法、定量的ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ ＲＴ−ＰＣＲ法、定量的ノザンブロッティング法、定量的リボヌクレアーゼプロテクション法などが挙げられる。蛋白質の発現量の測定は、当業者にとって公知の測定系を用いて行えばよく、例えば、定量的ウエスタンブロッティング法、ＥＬＩＳＡ法などが挙げられる。コントロールとして、ハウスキーピング遺伝子であるＧＡＤＰＨや、ベータアクチンなどのｍＲＮＡおよび／または蛋白質の発現量を用い、ＬＭＯ３遺伝子などの目的の遺伝子の発現量を標準化する。また、同一の実験条件における複数のサンプルおよび／または同一のサンプルに由来するアリコットにおける目的遺伝子および／またはコントロール遺伝子の発現量を測定し、それぞれの平均値から発現量を求めてもよい。これら方法を用いることによって、遺伝子発現を定量的に測定することが可能である。
【００２５】
被検化合物の存在下のＬＭＯ３遺伝子の発現量が、被検化合物の非存在下のＬＭＯ３遺伝子の発現量よりも低い場合に、その被検化合物を神経疾患の治療薬と判定することができる。治療薬とは、神経疾患の症状を改善するものであることが最も好ましいが、神経疾患の進行を遅延するものであれば本発明の目的に適うものである。
【００２６】
第二の治療薬のスクリーニング方法では、ＬＭＯ３遺伝子の発現量に加え、神経細胞の機能制御に関わるＭａｓｈ１遺伝子の発現量を解析することが好ましい。さらに別の実施形態では、ＰａｒｋｉｎをコードするＰＡＲＫ２遺伝子の発現量を同時に解析してもよい。
【００２７】
スクリーニングに用いる細胞は、例えば、サル腎臓細胞由来のＣＯＳ１などの培養細胞でもよく、神経組織由来の培養細胞でもよい。また、神経芽腫由来の培養細胞が好ましく、ヒト神経芽腫の臨床サンプル由来の細胞であることがより好ましい。
【００２８】
被検化合物は、低分子化合物、ペプチド、蛋白質、核酸（ＤＮＡ，ＲＮＡ，ＰＮＡ）などが挙げられるが、これらに限定しない。また、スクリーニングには、任意のスクリーニング用化合物ライブラリーを用いてもよい。なお、細胞の培養条件および被検化合物の投与条件は、当業者であれば、適宜調整することが可能である。
【００２９】
次に、ＬＭＯ３蛋白質量および／またはユビキチン化量を指標とする第三の治療薬のスクリーニング方法を説明する。第三の治療薬のスクリーニング方法は、被検化合物の存在下および非存在下のそれぞれの条件において、細胞を培養する工程と、それぞれの培養した細胞中のＰａｒｋｉｎ蛋白質とＬＭＯ３蛋白質との相互作用および／またはＬＭＯ３蛋白質のユビキチン化量を測定する工程と、被検化合物の非存在下よりも被検化合物の存在下において、培養した細胞中のＰａｒｋｉｎ蛋白質とＬＭＯ３蛋白質との相互作用が強く、および／または、培養した細胞中のＬＭＯ３蛋白質のユビキチン化量が高い場合に、当該被検化合物を神経疾患の治療薬と判定する工程と、を備える。
【００３０】
細胞中に発現するＰａｒｋｉｎおよびＬＭＯ３は、内在性であることが好ましいが、形質導入によって強制的に発現させてもよく、その場合、ＰａｒｋｉｎおよびＬＭＯ３は、ＭｙｃやＦＬＡＧなどのタグが融合されていてもよく、蛍光蛋白質によって標識されていてもよい。相互作用とは、蛋白質間の直接的および／または間接的な相互作用を指し、この場合、ＰａｒｋｉｎおよびＬＭＯ３が複合体を形成しているか、または、機能的に連携するように近接して存在していることを指す。相互作用の測定は、当業者にとって公知の蛋白質の相互作用を測定する系が利用可能であり、具体的には、共免疫沈降法による測定や、蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）を応用した測定などが挙げられる。得られた定量的な測定値を、被検化合物の存在下と非存在下との間で比較し、被検化合物の神経疾患の治療薬としての効用を判定する。
【００３１】
（治療薬）
また、本発明の実施形態にかかる神経疾患の治療薬は、ＬＭＯ３遺伝子に特異的なｓｉＲＮＡを含む。ｓｉＲＮＡは、配列番号５に記載の塩基配列からなるｓｉＲＮＡであることが好ましい。
【００３２】
ここで、ｓｉＲＮＡとは、ｓｈｏｒｔ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡの略称であり、人工的に化学合成されるかまたは生化学的に合成されたものか、あるいは生物体内で合成されたものか、あるいは約４０塩基以上の二本鎖ＲＮＡが体内で分解されてできた１０塩基対以上の二本鎖ＲＮＡを指す。ｓｉＲＮＡの長さは、一般的には１０〜３０塩基、好ましくは約１５〜２５塩基、より好ましくは１９〜２３塩基程度である。ｓｉＲＮＡは、通常、５'−リン酸、３'−ＯＨの構造を有しており、３'末端は約２塩基突出している。
【００３３】
ｓｉＲＮＡを細胞に投与すると、ＲＮＡｉ効果によりＬＭＯ３の発現を特異的に抑制することができる。すなわち、ｓｉＲＮＡが細胞に導入されると、このｓｉＲＮＡに特異的なタンパク質が結合して、ＲＩＳＣ（ＲＮＡ−ｉｎｄｕｃｅｄ−ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ−ｃｏｍｐｌｅｘ）が形成される。この複合体は、ｓｉＲＮＡと同じ配列を有するｍＲＮＡを認識して結合し、ＲＮａｓｅＩＩＩ様の酵素活性によってｓｉＲＮＡの中央部でｍＲＮＡを切断する。上記のように、ｓｉＲＮＡは、ｓｉＲＮＡと相同な配列を有するｍＲＮＡを分解することにより、その標的となる遺伝子（本発明においては、ＬＭＯ３遺伝子）の発現を抑制することができる。このような現象をＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）という。ＲＮＡｉ現象は、線虫、昆虫、原虫、ヒドラ、植物、脊椎動物（哺乳動物を含む）において見られる現象である。
【００３４】
本発明では、ｓｉＲＮＡとして配列番号５の塩基配列を有する核酸を含む二本鎖ＲＮＡを用いてもよいし、また、ＬＭＯ３遺伝子に特異的な二本鎖ＲＮＡを用いてもよい。さらに、当該ｓｉＲＮＡを生成するようなｓｈＲＮＡ（ｓｈｏｒｔ ｈａｉｒｐｉｎ ＲＮＡ）、ｄｓＲＮＡ（ｄｏｕｂｌｅ ｓｔｒａｎｄ ＲＮＡ）またはそれらを発現できる発現ベクターを用いることができる。本発明のｓｈＲＮＡ、ｄｓＲＮＡまたはそれらの発現ベクターを細胞に投与すると、細胞内でｓｉＲＮＡが生成する。ＲＮＡ発現ベクターのプロモーターには、Ｕ６ＲＮＡまたはＨ１ＲＮＡの転写系であるＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ（ＰｏｌＩＩＩ）のプロモーターを用いることができる。
【００３５】
さらなる実施形態では、本発明の実施形態にかかる神経疾患の治療薬は、ＰＡＲＫ２遺伝子（配列番号３）を有するベクターをさらに含んでも良い。また別の実施形態では、治療薬はＰａｒｋｉｎ（配列番号４）をコードする核酸を有するベクターをさらに含んでも良い。
【００３６】
ベクターは、ＤＮＡまたはＲＮＡウイルスをもとに作製できる。ＭｏＭＬＶベクター、ヘルペスウイルスベクター、アデノウイルスベクター、ＡＡＶベクター、ＨＩＶベクター、ＳＩＶベクター、センダイウイルスベクター等のいかなるウイルスベクターであっても良い。また、ウイルスベクターの構成タンパク質群のうち１つ以上を、異種ウイルスの構成タンパク質に置換する、もしくは、遺伝子情報を構成する塩基配列のうち一部を異種ウイルスの塩基配列に置換する、シュードタイプ型のウイルスベクターも本発明に使用できる。例えば、ＨＩＶの外皮タンパク質であるＥｎｖタンパク質を、小水痘性口内炎ウイルス（Ｖｅｓｉｃｕｌａｒｓｔｏｍａｔｉｔｉｓ Ｖｉｒｕｓ：ＶＳＶ）の外皮タンパク質であるＶＳＶ−Ｇタンパク質に置換したシュードタイプウイルスベクターが挙げられる。さらに、治療効果を持つウイルスであれば、ヒト以外の宿主域を持つウイルスもウイルスベクターとして使用可能である。ウイルス以外のベクターとしてはリン酸カルシウムと核酸の複合体、リポソーム、カチオン脂質複合体、センダイウイルスリポソーム、ポリカチオンを主鎖とする高分子キャリアー等が使用可能である。
【００３７】
さらに、ベクター中の遺伝子の発現のために用いられる発現カセットは、標的細胞内で遺伝子を発現させることができるものであれば、特に制限されることなく用いることができる。当業者はそのような発現カセットを容易に選択することができる。好ましくは、動物由来の細胞内で遺伝子発現が可能な発現カセットであり、より好ましくは、哺乳類由来の細胞内で遺伝子発現が可能な発現カセットであり、特に好ましくは、ヒト由来の細胞内で遺伝子発現が可能な発現カセットである。発現カセットに用いられる遺伝子プロモーターは、例えばアデノウイルス、サイトメガロウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、シミアンウイルス４０、ラウス肉腫ウイルス、単純ヘルペスウイルス、マウス白血病ウイルス、シンビスウイルス、Ａ型肝炎ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、パピローマウイルス、ヒトＴ細胞白血病ウイルス、インフルエンザウイルス、日本脳炎ウイルス、ＪＣウイルス、パルボウイルスＢ１９、ポリオウイルス等のウイルス由来のプロモーター、アルブミン、ＳＲα、熱ショック蛋白質、エロンゲーション因子等の哺乳類由来のプロモーター、ＣＡＧプロモーター等のキメラ型プロモーター、テトラサイクリン、ステロイド等によって発現が誘導されるプロモーターを含む。
【実施例】
【００３８】
以下、実施例を挙げて本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００３９】
（実験材料）
抗Ｍｙｃ抗体は、ＣＥＬＬ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社から購入した。抗ＦＬＡＧ抗体は、Ｓｉｇｍａ社から購入した。抗ＨＡ抗体は、Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ社から購入した。また、培養細胞への遺伝子導入には、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いて、添付のマニュアルを参考にして適宜実験系の最適化を行った。ＭＴＴアッセイに用いるテトラゾリウム塩（ＷＳＴ−８）は、同仁化学研究所から購入した。
【００４０】
ＬＭＯ３遺伝子（配列番号１）およびＬＭＯ３（配列番号２）のＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．は、ＮＭ＿００１００１３９５である。また、ＰＡＲＫ２遺伝子（配列番号３）およびＰａｒｋｉｎ（配列番号４）のＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．は、ＡＢ００９９７３である。
【００４１】
ＬＭＯ３の機能阻害に用いたｓｉＲＮＡは以下の通りである。
５’−ＧＴＡＧＴＡＡＧＣＴＣＡＴＣＣＣＴＧＣ−３’ （配列番号５）
【００４２】
ＲＴ−ＰＣＲ法に用いた各種プライマーは以下の通りである。
ｈｕｍａｎ ＬＭＯ３：
ｆｏｒｗａｒｄ ５’−ＡＴＧＣＴＣＴＣＡＧＴＣＣＡＧＣＣＡＧＡ−３’ （配列番号６）
ｒｅｖｅｒｓｅ ５’−ＴＣＡＧＣＧＡＡＣＣＴＧＧＧＧＴＧＣＡＴ−３’ （配列番号７）
ｈｕｍａｎ Ｍａｓｈ１：
ｆｏｒｗａｒｄ ５’−ＧＣＧＴＴＣＡＧＣＡＣＴＧＡＣＴＴＴＴＧ−３’ （配列番号８）
ｒｅｖｅｒｓｅ ５’−ＣＣＣＣＧＧＧＡＧＡＣＴＴＣＴＴＡＧＡＧ−３’ （配列番号９）
ｈｕｍａｎ ｇｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅｓ−３−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ （ＧＡＰＤＨ）：
ｆｏｒｗａｒｄ ５’−ＡＣＣＴＧＡＣＣＴＧＣＣＧＴＣＴＡＧＡＡ−３’ （配列番号１０）
ｒｅｖｅｒｓｅ ５’−ＴＣＣＡＣＣＡＣＣＣＴＧＴＴＧＣＴＧＴＡ−３’ （配列番号１１）
【００４３】
（実験方法）
以下の方法は各文献に沿って行なった。
免疫沈降法及びＲＴ−ＰＣＲ法は、Ａｏｙａｍａ Ｍ ｅｔ ａｌ．，（２００５）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ６５，４５８７−４５９７．に記載の方法と同様の方法を用い、適宜実験系の最適化を行った。レポーターアッセイは、Ｐｒｏｍｅｇａ社のＤｕａｌ−Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ｒｅｐｏｒｔｅｒ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍを用い、添付のマニュアルを参考にして行った。
【００４４】
（実施例１：Ｐａｒｋｉｎの相互作用因子の同定）
本発明者らは、ユビキチンリガーゼであるＰａｒｋｉｎが未知の基質を介して神経変性の制御に重要な役割を担っており、Ｐａｒｋｉｎおよび／または未知の基質の異常によって、神経変性が誘導されるのではないかとの仮定に基づき、以下の実験を行った。まず、Ｐａｒｋｉｎと相互作用する因子をｙｅａｓｔ ｔｗｏ ｈｙｂｒｉｄ法において検索した。その結果、単離した陽性遺伝子産物の中には、転写制御因子であるＬＭＯ３（ＬＩＭ ｄｏｍａｉｎ ｏｎｌｙ ｐｒｏｔｅｉｎ ３）が存在することが分かった。
【００４５】
そこで次に、ＰａｒｋｉｎとＬＭＯ３の相互作用を免疫沈降実験により調べた。なお、ＬＭＯファミリーであるＬＭＯ１〜４を同時に解析に用いた。具体的には、ＣＯＳ１細胞にＭｙｃタグを融合したＰａｒｋｉｎと共に、ＦＬＡＧタグを融合したＬＭＯ１〜４をそれぞれ共発現させた。プロテアソームインヒビターであるＭＧ１３２存在下において３時間培養した後、細胞懸濁液を回収して抗ＦＬＡＧ抗体で免疫沈降を行った。得られたサンプルを用いて抗Ｍｙｃ抗体および抗ＦＬＡＧ抗体でウエスタンブロットし、ＰａｒｋｉｎとＬＭＯ１〜４を検出した。図１に結果を示す。図１は、ＬＭＯファミリー蛋白質とＰａｒｋｉｎ蛋白質との相互作用を示す免疫沈降実験後のウエスタンブロット像である。その結果、Ｐａｒｌｉｎは、ＬＭＯ１〜４のいずれの分子とも培養細胞内で相互作用することが明らかになった。
【００４６】
（実施例２：ＰａｒｋｉｎによるＬＭＯ３ユビキチン化の影響）
さらに、ＬＭＯ３がユビキチンリガーゼであるＰａｒｋｉｎの基質となり得るかを調べるために、以下の方法でユビキチン化検定を行った。ＣＯＳ１細胞にＭｙｃタグ融合Ｐａｒｋｉｎ、ＦＬＡＧタグ融合ＬＭＯ３、ＨＡタグ融合ユビキチン（Ｕｂ）を共発現させた。ＭＧ１３２存在下において１．５時間培養した後、細胞懸濁液を回収して抗ＦＬＡＧ抗体で免疫沈降を行った。得られたサンプルを用いてウエスタンブロットした。なお、正常型のＰａｒｋｉｎと併せて、Ｐａｒｋｉｎ病因変異体を同時に解析に用いた。Ｐａｒｋｉｎ病因変異体には、Ｐａｒｋｉｎの２４０番目のアミノ酸がＴからＲに変異したＰａｒｋｉｎＴ２４０Ｒ変異体と、Ｐａｒｋｉｎの４１５番目のアミノ酸がＴからＮに変異したＰａｒｋｉｎＴ４１５Ｎ変異体とを用いた。図２にユビキチン化検定の結果を示す。その結果、Ｐａｒｋｉｎ存在下においてＬＭＯ３のユビキチン化が促進されることを見出した。また、ＰａｒｋｉｎＴ４１５Ｎにおいては、その活性が減弱することが分かった。
【００４７】
これらの解析により、出願人らは、Ｐａｒｋｉｎの新規基質としてＬＭＯ３を同定した。またＰａｒｋｉｎ病因変異体Ｔ４１５Ｎにおいては、その活性が減弱したことから、ＬＭＯ３は常染色体劣性若年性パーキンソン病やＰａｒｋｉｎの変性による神経変性に関与している可能性が示唆された。
【００４８】
（実施例３：内在性Ｍａｓｈ１遺伝子の発現に対するＰａｒｋｉｎの効果）
内在性Ｍａｓｈ１の転写に対するＰａｒｋｉｎの効果を検討するために、以下の解析を行った。ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞にＭｙｃ−Ｐａｒｋｉｎまたはその変異体（Ｍｙｃ−ＰａｒｋｉｎＴ４１５Ｎ、Ｍｙｃ−ＰａｒｋｉｎＴ２４０Ｒ）を発現するコンストラクトを導入した。４８時間培養した後、ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞からＲＮＡを調製し、ＲＴ−ＰＣＲによりＭａｓｈ１ ｍＲＮＡの発現量を調べた。なお、ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞はヒト神経芽腫由来の培養細胞株であり、Ｍａｓｈ１遺伝子およびＬＭＯ３遺伝子が内在的に発現している。図３に結果を示す。図３は、内在性Ｍａｓｈ１遺伝子の発現に対するＰａｒｋｉｎ蛋白質の効果を示すＤＮＡ電気泳動像である。この解析により、ＰａｒｋｉｎによってＭａｓｈ１ ｍＲＮＡの発現量は減少することが判明した。なお、Ｐａｒｋｉｎ変異体ではＭａｓｈ１ ｍＲＮＡの発現量の顕著な減少は観察されなかった。
【００４９】
（実施例４：Ｍａｓｈ１遺伝子の転写に対するＰａｒｋｉｎの効果）
ＰａｒｋｉｎのＭａｓｈ１転写への効果を検討するために、ヒトＭａｓｈ１プロモーターを使ってレポーターアッセイを行なった。Ｍｙｃ−Ｐａｒｋｉｎ発現コンストラクト量を段階的に設定し、ヒトＭａｓｈ１プロモーター（約１．３ｋｂ、配列番号１２）をルシフェラーゼ遺伝子の上流につないだコンストラクトと共にＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞に導入した。４８時間培養した後、レポーター活性を検出した。図４にレポーターアッセイの結果を示す。その結果、Ｍａｓｈ１遺伝子の転写はＰａｒｋｉｎによって濃度依存性に抑制されることが明らかとなった。
【００５０】
（実施例５：ＬＭＯ３によるＭａｓｈ１転写促進に対するＰａｒｋｉｎの効果）
ＰａｒｋｉｎによるＭａｓｈ１の転写制御が、ＬＭＯ３を介している可能性を調べるために、以下の実験を行った。Ｎｅｕｒｏ２ａ細胞にレポーターコンストラクトと共に発現コンストラクトを導入し、Ｍｙｃ−Ｐａｒｋｉｎおよび／またはＨＡ−ＬＭＯ３を発現させた。４８時間培養した後、レポーター活性を検出した。図５にレポーターアッセイの結果を示す。その結果、ＬＭＯ３によってＭａｓｈ１の転写は促進したが、このＬＭＯ３によるＭａｓｈ１転写活性の増加はＰａｒｋｉｎ蛋白質によって抑制されることが分かった。
【００５１】
これらの結果から、神経細胞および神経芽種細胞においてもＰａｒｋｉｎとＬＭＯ３とが相互作用している可能性が示唆された。また、ＰａｒｋｉｎおよびＬＭＯ３がＭａｓｈ１遺伝子の転写制御に関与していることが明らかとなり、ＰａｒｋｉｎによるＭａｓｈ１遺伝子の転写制御が、ＬＭＯ３を介している可能性が示唆された。Ｍａｓｈ１は、神経発生や神経分化に重要な役割を果たすｂＨＬＨ型の転写因子である。したがって、ＰａｒｋｉｎおよびＬＭＯ３によるＭａｓｈ１遺伝子の転写制御は、神経細胞の分化や機能維持などに深く関与している可能性が考えられる。
【００５２】
（実施例６：ＰａｒｋｉｎがＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞の増殖能に与える影響）
ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞ではＬＭＯ３とＭａｓｈ１が恒常的に発現しており、細胞増殖能が増加していることが示唆されている。そこで、ＰａｒｋｉｎによってＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞内在性Ｍａｓｈ１の発現が抑制された時の細胞増殖能をＭＴＴアッセイによって調べた。図６にＭＴＴアッセイの結果を示す。この解析より、ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞の増殖はＰａｒｋｉｎによって抑制されることが分かった。
【００５３】
（実施例７：Ｍａｓｈ１遺伝子の転写に対するＰａｒｋｉｎ変異体の効果）
ＰａｒｋｉｎとＰａｒｋｉｎ変異体とで、Ｍａｓｈ１転写抑制効果をレポーターアッセイにより比較した。なお、細胞はマウス神経芽腫細胞であるＮｅｕｒｏ２ａ細胞を使用した。図７にレポーターアッセイの結果を示す。その結果、Ｐａｒｋｉｎ変異体（ＰａｒｋｉｎＴ４１５ＮおよびＰａｒｋｉｎＴ２４０Ｒ）ではＰａｒｋｉｎのように顕著なＭａｓｈ１転写の抑制効果はみられないことが明らかとなった。
【００５４】
また、ＰａｒｋｉｎとＰａｒｋｉｎ変異体とで、Ｍａｓｈ１転写抑制効果をレポーターアッセイにより経時的に比較した（図８）。その結果、形質導入４８時間後のＭａｓｈ１転写活性において、Ｐａｒｋｉｎ変異体とＰａｒｋｉｎとの間に顕著な差が見られた。
【００５５】
さらに、ＰａｒｋｉｎとＰａｒｋｉｎ変異体との発現コンストラクト量を段階的に設定した条件で、Ｍａｓｈ１転写抑制効果をレポーターアッセイにより比較した（図９）。その結果、Ｐａｒｋｉｎ変異体（ＰａｒｋｉｎＴ４１５ＮおよびＰａｒｋｉｎＴ２４０Ｒ）ではＰａｒｋｉｎのように顕著なＭａｓｈ１転写の抑制効果はみられないことが明らかとなった。
【００５６】
Ｐａｒｋｉｎ変異体を用いたこれらの解析より、Ｐａｒｋｉｎ変異体を用いた場合には、ＰａｒｋｉｎによるＬＭＯ３を介したＭａｓｈ１遺伝子発現について、異なる制御機構が働くことが強く示唆された。これによって、遺伝子変異や蛋白質の変性などによってＰａｒｋｉｎに異常が生じた場合には、Ｍａｓｈ１遺伝子の発現制御が正常に行われない可能性があり、神経細胞の機能制御に異常をきたすことが推測される。
【００５７】
（実施例８：ＬＭＯ３の機能阻害がＭａｓｈ１遺伝子の発現に与える影響）
ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞に発現しているＬＭＯ３の機能阻害がＭａｓｈ１遺伝子の発現に与える影響を調べるために、以下の実験を行った。まず、ＬＭＯ３に特異的なｓｉＲＮＡを選定した。次に、得られたｓｉＲＮＡ（配列番号５）をＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞に導入して培養した後に、その効果をＲＴ−ＰＣＲ法（Ａ）とヒトＭａｓｈ１プロモーターを使ったレポーターアッセー（Ｂ）により調べた。結果を図１０に示す。この解析の結果、ＬＭＯ３に特異的なｓｉＲＮＡ（配列番号５）の導入により、ＬＭＯ３のｍＲＮＡ量が減少し、ＬＭＯ３の機能阻害が起きていることが確認できた。この条件において、Ｍａｓｈ１のｍＲＮＡ量は減少することが明らかとなった。また、レポーターアッセイの結果からも、ＬＭＯ３の機能阻害によってＭａｓｈ１遺伝子の転写が抑制されることが判明した。
【００５８】
（実施例９：ＬＭＯ３の機能阻害がＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞の増殖能に与える影響）
ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞に発現しているＬＭＯ３の機能阻害がＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞の増殖能に与える影響を調べるために、以下の実験を行った。ＬＭＯ３のｓｉＲＮＡ（配列番号５）をＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞に導入して培養した後に、細胞数をカウントして細胞増殖を調べた。結果を図１１に示す。この結果より、内在性のＬＭＯ３の発現が抑制された条件において、細胞の増殖は抑制されることが分かった。また、恒常的に発現しているＬＭＯ３は細胞増殖の促進に働いていることが確認された。
【００５９】
ＬＭＯ３機能阻害の解析結果から、ＬＭＯ３の機能阻害を行うことによって、Ｍａｓｈ１遺伝子の転写が抑制され、また、細胞の増殖も抑制されることが分かった。ＰａｒｋｉｎによるＬＭＯ３の機能阻害によっても、このようなＭａｓｈ１遺伝子の発現制御および細胞増殖の制御が起こることが考えられる。
【００６０】
以上の実施例１〜９の結果から、図１２に示すモデルを出願人らは導いた。図１３は、Ｐａｒｋｉｎ、ＬＭＯ３およびＭａｓｈ１の分子制御メカニズムのモデルを模式的に表した図である。ＰａｒｋｉｎはＬＭＯ３と結合し、その機能を阻害する。また、ＬＭＯ３は、Ｍａｓｈ１遺伝子の転写を正に制御しているが、Ｐａｒｋｉｎ存在下においては、ＬＭＯ３による転写活性化は抑制される。このような分子機構によって、神経細胞の分化や機能が制御されていると推測される。
【００６１】
例えば、予後不良な神経芽腫の場合、正常細胞よりも過剰に発現するＬＭＯ３などによって、Ｍａｓｈ１遺伝子の転写制御機構が異常になり、恒常的にＭａｓｈ１遺伝子が発現する結果、細胞増殖能などの神経細胞の機能異常が発生するものと考えられる。一方、正常な神経発生ではＭａｓｈ１の一過性の高発現が神経分化を誘導することが知られている。この従来の知見に加え、本発明により得られた知見から、異常なＰａｒｋｉｎがＬＭＯ３ひいてはＭａｓｈ１の転写制御を介して正常な神経発生過程に干渉することを示唆している。例えば、常染色体劣性若年性パーキンソン病やＰａｒｋｉｎの変性などによる異常なＰａｒｋｉｎの存在下においては、Ｐａｒｋｉｎ、ＬＭＯ３およびＭａｓｈ１の分子制御に異常をきたし、神経細胞の変性や脱落などが起こる可能性が想定される。
【図面の簡単な説明】
【００６２】
【図１】ＬＭＯファミリー蛋白質とＰａｒｋｉｎ蛋白質との相互作用を示す免疫沈降実験のウエスタンブロット像に対応する図である。ＷＢ：ウエスタンブロット、ＩＰ：免疫沈降、ｖｅｃｔｏｒ：コントロールのベクター。
【図２】ＰａｒｋｉｎによるＬＭＯ３ユビキチン化の影響を示すユビキチン化検定の結果に対応する図である。ＷＢ：ウエスタンブロット、ＩＰ：免疫沈降。
【図３】内在性Ｍａｓｈ１遺伝子の発現に対するＰａｒｋｉｎ蛋白質の効果を示すＤＮＡ電気泳動像に対応する図である。
【図４】（Ａ）ヒトＭａｓｈ１のプロモーター約１．３ｋｂをルシフェラーゼ遺伝子の上流につないだコンストラクトを模式的に表した図である。（Ｂ）Ｍａｓｈ１遺伝子の転写に対するＰａｒｋｉｎ蛋白質の効果を示すレポーターアッセイの結果に対応する図である。
【図５】ＬＭＯ３蛋白質によるＭａｓｈ１転写促進に対するＰａｒｋｉｎ蛋白質の効果を示すレポーターアッセイの結果に対応する図である。
【図６】Ｐａｒｋｉｎ蛋白質がＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞の増殖能に与える影響を示すＭＴＴアッセイの結果に対応する図である。「吸収」は、細胞数（相対値）に相当する。ｐｃＤＮＡ３は発現ベクターであり、コントロールとして用いた。
【図７】ＰａｒｋｉｎとＰａｒｋｉｎ変異体とで、Ｍａｓｈ１転写抑制効果をレポーターアッセイにより比較した結果に対応する図である。
【図８】ＰａｒｋｉｎとＰａｒｋｉｎ変異体とで、Ｍａｓｈ１転写抑制効果をレポーターアッセイにより経時的に比較した結果に対応する図である。ｐｃＤＮＡ３は発現ベクターであり、コントロールとして用いた。
【図９】ＰａｒｋｉｎとＰａｒｋｉｎ変異体との用量依存的なＭａｓｈ１転写抑制効果をレポーターアッセイにより比較した結果に対応する図である。
【図１０】ＬＭＯ３の機能阻害がＭａｓｈ１遺伝子の発現に与える影響をＲＴ−ＰＣＲ法（Ａ）およびヒトＭａｓｈ１プロモーターを使ったレポーターアッセー（Ｂ）により検討した結果に対応する図である。
【図１１】ＬＭＯ３の機能阻害がＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞の増殖能に与える影響を示す細胞数をカウントした結果に対応する図である。ｐｃＤＮＡ３は発現ベクターであり、コントロールとして用いた。
【図１２】Ｐａｒｋｉｎ、ＬＭＯ３およびＭａｓｈ１の分子制御メカニズムのモデルを模式的に表した図である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、神経疾患の治療薬およびそのスクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
パーキンソン病は、アルツハイマー病についで患者数が多い神経変性疾患であり、振戦、協調運動障害や筋肉硬直などの症状が徐々にあらわれて進行し、数年後には寝たきりとなり、やがては死にいたる難病である。神経伝達物質ドパミンの生成に関わる中脳の黒質の神経細胞が変性脱落し、脳内のドパミン不足とアセチルコリンの相対的増加とを病態とする。原因不明、治療方法未確立であり、経過が慢性にわたり、また精神的にも負担の大きい疾病であることから特定疾患に指定されており、難病対策推進のため調査研究の対象になっている。
【０００３】
これまでに、若年で発症する常染色体劣性若年性パーキンソン病においては、原因遺伝子としてＰＡＲＫ２遺伝子が同定され、その原因遺伝子産物はＰａｒｋｉｎと名付けられた（非特許文献１）。また、Ｐａｒｋｉｎは、ユビキチンリガーゼ（Ｅ３）としての活性をもつことが明らかにされている（非特許文献２）。
【０００４】
神経芽腫は交感神経系（傍脊椎交感神経幹と副腎髄質神経細胞）から発生する腫瘍である。神経芽腫は最も高頻度な小児悪性腫瘍でありながら、予後不良例と予後良好例が混在している臨床的にも極めて興味深い腫瘍で、発症年齢が１歳未満の症例では神経芽腫の明らかな自然退縮や成熟化がみられる一方、発症年齢が１歳以上の症例では腫瘍の転移および増殖が急速に進行し、治療の困難な予後不良症例となる。
【０００５】
本発明者らは、ヒト神経芽腫の予後良好群に比べて、予後不良群において高発現する新規遺伝子の一つとして、ＬＩＭドメインを有する転写制御因子ＬＭＯ３をコードする遺伝子を同定した。ＬＭＯ３は転写因子Ｍａｓｈ１遺伝子の発現を制御することが判明している。しかしながら、神経芽腫などの神経疾患におけるＬＭＯ３の分子機構は未だ明らかになっていない。
【０００６】
【非特許文献１】Ｋｉｔａｄａ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３９２(６６７６) ６０５−６０８（１９９８）
【非特許文献２】Ｓｈｉｍｕｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ． Ｇｅｎｅｔ． ２５， ３０２−３０５（２０００）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
パーキンソン病の治療法は、化学療法としてドパミンを補いその作用を助ける薬の服用が多く適用されている。しかし、この治療法は症状を改善するが、ドパミン神経の変性そのものを抑制する方法ではない。また、パーキンソン病の主因は、中脳黒質のドパミン神経細胞の選択的変性によることが病理学的に解明されているが、その神経細胞変性の原因は明らかになっておらず、詳しい発病機構はほとんど分かっていない。したがって、神経変性を抑制する方法はまだ見つかっていない。
【０００８】
また、神経芽腫の従来の治療法は化学療法・放射線療法・外科的切除を組み合わせた集学的治療法であるが、１歳以上の進行症例では予後不良であり、生存率の顕著な改善は見られていない。
【０００９】
パーキンソン病の原因遺伝子産物Ｐａｒｋｉｎおよび神経芽腫の予後不良群に高発現するＬＭＯ３の神経細胞における分子機構を解明することができれば、パーキンソン病および神経芽腫などの神経疾患発症の機構を明らかにすることができ、新たな機構に基づく治療薬の開発につながる。そこで、本発明は、ＰａｒｋｉｎおよびＬＭＯ３の分子機構を明らかにし、神経疾患の治療薬およびそのスクリーニング方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、ユビキチンリガーゼであるＰａｒｋｉｎが未知の基質を介して神経細胞の機能制御に重要な役割を担っており、Ｐａｒｋｉｎおよび／または未知の基質の異常によって、神経変性が誘導されるのではないかと考えた。また本発明者らは、神経芽腫の予後に相関するＬＭＯ３の分子機構を明らかにすることが、神経細胞の機能制御の解明につながると考えた。この仮定に基づき鋭意研究した結果、本発明者らは、本願における知見を見出した。すなわち、Ｐａｒｋｉｎ新規基質としてＬＭＯ３を同定した。そして、ＰａｒｋｉｎがＬＭＯ３を介して神経細胞の機能制御に関与している可能性を見出した。
【００１１】
具体的には、ＰａｒｋｉｎがＭａｓｈ１遺伝子の転写を抑制することを本発明者らは見出した。またこの時、Ｐａｒｋｉｎは細胞増殖能を抑制することが新たに判明した。さらに、ＰａｒｋｉｎがＬＭＯ３によるＭａｓｈ１遺伝子の転写促進を抑制することを本発明者らは明らかにした。加えて、Ｐａｒｋｉｎ変異体においてはその抑制活性が減弱することを本発明者らは見出した。このことは、ＰａｒｋｉｎがＬＭＯ３を介して神経細胞の機能制御に重要な役割を担っている可能性を示唆している。以上の知見から、本発明者らは本発明を完成するに至った。
【００１２】
すなわち、本発明は、被検化合物の存在下および非存在下のそれぞれの条件において、細胞を培養する工程と、それぞれの培養した細胞中のＬＭＯ３遺伝子の発現量を測定する工程と、被検化合物の存在下において培養した細胞中のＬＭＯ３遺伝子の発現量が、被検化合物の非存在下において培養した細胞中のＬＭＯ３遺伝子の発現量よりも低い場合に、当該被検化合物を神経疾患の治療薬と判定する工程と、を備える、神経疾患の治療薬のスクリーニング方法を提供する。
【００１３】
本発明のスクリーニング方法は、ＬＭＯ３遺伝子の発現レベルが神経芽腫の予後不良と相関し、ＰａｒｋｉｎがＬＭＯ３を介して神経細胞の機能制御に重要な役割を担っているという本発明者が新たに発見した知見に基づくものである。これによって、神経疾患、特にパーキンソン病および神経芽腫の治療薬の開発が可能となる。
【００１４】
本発明のスクリーニング方法は、被検化合物の存在下および非存在下のそれぞれの条件において、細胞を培養する工程と、それぞれの培養した細胞中のＬＭＯ３遺伝子およびＭａｓｈ１遺伝子の発現量を測定する工程と、被検化合物の存在下において培養した細胞中のＬＭＯ３遺伝子およびＭａｓｈ１遺伝子の発現量が、被検化合物の非存在下において培養した細胞中のＬＭＯ３遺伝子およびＭａｓｈ１遺伝子の発現量よりも低い場合に、当該被検化合物を神経疾患の治療薬と判定する工程と、を備えることを特徴とする。
【００１５】
本発明のスクリーニング方法は、ＰａｒｋｉｎがＬＭＯ３を介してＭａｓｈ１遺伝子の転写を制御するという本発明における知見を応用したものである。これによって、Ｐａｒｋｉｎ、ＬＭＯ３およびＭａｓｈ１による神経細胞の機能制御機構に基づく、新たな神経疾患の治療薬の開発が可能となる。
【００１６】
また本発明のスクリーニング方法は、被検化合物の存在下および非存在下のそれぞれの条件において、細胞を培養する工程と、それぞれの培養した細胞中のＰａｒｋｉｎ蛋白質とＬＭＯ３蛋白質との相互作用および／またはＬＭＯ３蛋白質のユビキチン化量を測定する工程と、被検化合物の非存在下よりも被検化合物の存在下において、培養した細胞中のＰａｒｋｉｎ蛋白質とＬＭＯ３蛋白質との相互作用が強く、および／または、培養した細胞中のＬＭＯ３蛋白質のユビキチン化量が高い場合に、当該被検化合物を神経疾患の治療薬と判定する工程と、を備えることを特徴とする。
【００１７】
本発明のスクリーニング方法は、ＰａｒｋｉｎがＬＭＯ３と相互作用し、ユビキチン化してＬＭＯ３の機能を阻害するという、本発明者が新たに発見した知見に基づくものである。上記構成によって、神経疾患、特にパーキンソン病および神経芽腫の治療薬の開発が可能となる。
【００１８】
本発明のスクリーニング方法にかかる細胞は、神経組織由来の培養細胞であることが好ましく、また、神経芽腫細胞であることが好ましく、ヒト神経芽腫の臨床サンプル由来の細胞であることが好ましい。これによって、神経疾患の治療薬を開発することができる。
【００１９】
本発明は、また、配列番号５に記載の塩基配列からなるｓｉＲＮＡを含む、神経芽種の治療薬を提供する。ここで、配列番号５に記載の塩基配列からなるｓｉＲＮＡは、ＬＭＯ３遺伝子に特異的なｓｉＲＮＡに相当する。なお、ＬＭＯ３遺伝子（配列番号１）およびＬＭＯ３（配列番号２）のＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．は、ＮＭ＿００１００１３９５である。ＬＭＯ３遺伝子の機能阻害をすることによって、神経細胞の機能を調整し、神経疾患症状が改善されることが期待できる。
【発明の効果】
【００２０】
本発明のスクリーニング方法によれば、今までとは作用機序の異なる、神経疾患の治療薬を開発することができる。また、本発明の治療薬により、神経疾患症状の改善が期待できる。特に、パーキンソン病および神経芽腫において、疾患の進行遅延および症状の改善が期待できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】
以下、本発明の好適な実施形態について詳細に説明する。
【００２２】
（治療薬のスクリーニング方法）
本実施形態における治療薬のスクリーニング方法には、ＬＭＯ３遺伝子の発現量を指標とする、第一および第二の治療薬のスクリーニング方法と、ＬＭＯ３蛋白質量および／またはユビキチン化量を指標とする第三の治療薬のスクリーニング方法とがある。
【００２３】
まず、ＬＭＯ３遺伝子の発現量を指標とする治療薬のスクリーニング方法を説明する。第一の治療薬のスクリーニング方法は、被検化合物の存在下および非存在下のそれぞれの条件において、細胞を培養する工程と、それぞれの培養した細胞中のＬＭＯ３遺伝子の発現量を測定する工程と、被検化合物の存在下において培養した細胞中のＬＭＯ３遺伝子の発現量が、被検化合物の非存在下において培養した細胞中のＬＭＯ３遺伝子の発現量よりも低い場合に、当該被検化合物を神経疾患の治療薬と判定する工程と、を備える。
【００２４】
ここで、遺伝子の発現量とは、遺伝子の転写産物であるｍＲＮＡの発現量および／またはその翻訳産物である蛋白質の発現量を指す。ｍＲＮＡの発現量の測定は、当業者にとって公知の測定系を用いて行えばよく、具体的には、定量的ＲＴ−ＰＣＲ法、定量的ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ ＲＴ−ＰＣＲ法、定量的ノザンブロッティング法、定量的リボヌクレアーゼプロテクション法などが挙げられる。蛋白質の発現量の測定は、当業者にとって公知の測定系を用いて行えばよく、例えば、定量的ウエスタンブロッティング法、ＥＬＩＳＡ法などが挙げられる。コントロールとして、ハウスキーピング遺伝子であるＧＡＤＰＨや、ベータアクチンなどのｍＲＮＡおよび／または蛋白質の発現量を用い、ＬＭＯ３遺伝子などの目的の遺伝子の発現量を標準化する。また、同一の実験条件における複数のサンプルおよび／または同一のサンプルに由来するアリコットにおける目的遺伝子および／またはコントロール遺伝子の発現量を測定し、それぞれの平均値から発現量を求めてもよい。これら方法を用いることによって、遺伝子発現を定量的に測定することが可能である。
【００２５】
被検化合物の存在下のＬＭＯ３遺伝子の発現量が、被検化合物の非存在下のＬＭＯ３遺伝子の発現量よりも低い場合に、その被検化合物を神経疾患の治療薬と判定することができる。治療薬とは、神経疾患の症状を改善するものであることが最も好ましいが、神経疾患の進行を遅延するものであれば本発明の目的に適うものである。
【００２６】
第二の治療薬のスクリーニング方法では、ＬＭＯ３遺伝子の発現量に加え、神経細胞の機能制御に関わるＭａｓｈ１遺伝子の発現量を解析することが好ましい。さらに別の実施形態では、ＰａｒｋｉｎをコードするＰＡＲＫ２遺伝子の発現量を同時に解析してもよい。
【００２７】
スクリーニングに用いる細胞は、例えば、サル腎臓細胞由来のＣＯＳ１などの培養細胞でもよく、神経組織由来の培養細胞でもよい。また、神経芽腫由来の培養細胞が好ましく、ヒト神経芽腫の臨床サンプル由来の細胞であることがより好ましい。
【００２８】
被検化合物は、低分子化合物、ペプチド、蛋白質、核酸（ＤＮＡ，ＲＮＡ，ＰＮＡ）などが挙げられるが、これらに限定しない。また、スクリーニングには、任意のスクリーニング用化合物ライブラリーを用いてもよい。なお、細胞の培養条件および被検化合物の投与条件は、当業者であれば、適宜調整することが可能である。
【００２９】
次に、ＬＭＯ３蛋白質量および／またはユビキチン化量を指標とする第三の治療薬のスクリーニング方法を説明する。第三の治療薬のスクリーニング方法は、被検化合物の存在下および非存在下のそれぞれの条件において、細胞を培養する工程と、それぞれの培養した細胞中のＰａｒｋｉｎ蛋白質とＬＭＯ３蛋白質との相互作用および／またはＬＭＯ３蛋白質のユビキチン化量を測定する工程と、被検化合物の非存在下よりも被検化合物の存在下において、培養した細胞中のＰａｒｋｉｎ蛋白質とＬＭＯ３蛋白質との相互作用が強く、および／または、培養した細胞中のＬＭＯ３蛋白質のユビキチン化量が高い場合に、当該被検化合物を神経疾患の治療薬と判定する工程と、を備える。
【００３０】
細胞中に発現するＰａｒｋｉｎおよびＬＭＯ３は、内在性であることが好ましいが、形質導入によって強制的に発現させてもよく、その場合、ＰａｒｋｉｎおよびＬＭＯ３は、ＭｙｃやＦＬＡＧなどのタグが融合されていてもよく、蛍光蛋白質によって標識されていてもよい。相互作用とは、蛋白質間の直接的および／または間接的な相互作用を指し、この場合、ＰａｒｋｉｎおよびＬＭＯ３が複合体を形成しているか、または、機能的に連携するように近接して存在していることを指す。相互作用の測定は、当業者にとって公知の蛋白質の相互作用を測定する系が利用可能であり、具体的には、共免疫沈降法による測定や、蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）を応用した測定などが挙げられる。得られた定量的な測定値を、被検化合物の存在下と非存在下との間で比較し、被検化合物の神経疾患の治療薬としての効用を判定する。
【００３１】
（治療薬）
また、本発明の実施形態にかかる神経疾患の治療薬は、ＬＭＯ３遺伝子に特異的なｓｉＲＮＡを含む。ｓｉＲＮＡは、配列番号５に記載の塩基配列からなるｓｉＲＮＡであることが好ましい。
【００３２】
ここで、ｓｉＲＮＡとは、ｓｈｏｒｔ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡの略称であり、人工的に化学合成されるかまたは生化学的に合成されたものか、あるいは生物体内で合成されたものか、あるいは約４０塩基以上の二本鎖ＲＮＡが体内で分解されてできた１０塩基対以上の二本鎖ＲＮＡを指す。ｓｉＲＮＡの長さは、一般的には１０〜３０塩基、好ましくは約１５〜２５塩基、より好ましくは１９〜２３塩基程度である。ｓｉＲＮＡは、通常、５'−リン酸、３'−ＯＨの構造を有しており、３'末端は約２塩基突出している。
【００３３】
ｓｉＲＮＡを細胞に投与すると、ＲＮＡｉ効果によりＬＭＯ３の発現を特異的に抑制することができる。すなわち、ｓｉＲＮＡが細胞に導入されると、このｓｉＲＮＡに特異的なタンパク質が結合して、ＲＩＳＣ（ＲＮＡ−ｉｎｄｕｃｅｄ−ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ−ｃｏｍｐｌｅｘ）が形成される。この複合体は、ｓｉＲＮＡと同じ配列を有するｍＲＮＡを認識して結合し、ＲＮａｓｅＩＩＩ様の酵素活性によってｓｉＲＮＡの中央部でｍＲＮＡを切断する。上記のように、ｓｉＲＮＡは、ｓｉＲＮＡと相同な配列を有するｍＲＮＡを分解することにより、その標的となる遺伝子（本発明においては、ＬＭＯ３遺伝子）の発現を抑制することができる。このような現象をＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）という。ＲＮＡｉ現象は、線虫、昆虫、原虫、ヒドラ、植物、脊椎動物（哺乳動物を含む）において見られる現象である。
【００３４】
本発明では、ｓｉＲＮＡとして配列番号５の塩基配列を有する核酸を含む二本鎖ＲＮＡを用いてもよいし、また、ＬＭＯ３遺伝子に特異的な二本鎖ＲＮＡを用いてもよい。さらに、当該ｓｉＲＮＡを生成するようなｓｈＲＮＡ（ｓｈｏｒｔ ｈａｉｒｐｉｎ ＲＮＡ）、ｄｓＲＮＡ（ｄｏｕｂｌｅ ｓｔｒａｎｄ ＲＮＡ）またはそれらを発現できる発現ベクターを用いることができる。本発明のｓｈＲＮＡ、ｄｓＲＮＡまたはそれらの発現ベクターを細胞に投与すると、細胞内でｓｉＲＮＡが生成する。ＲＮＡ発現ベクターのプロモーターには、Ｕ６ＲＮＡまたはＨ１ＲＮＡの転写系であるＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ（ＰｏｌＩＩＩ）のプロモーターを用いることができる。
【００３５】
さらなる実施形態では、本発明の実施形態にかかる神経疾患の治療薬は、ＰＡＲＫ２遺伝子（配列番号３）を有するベクターをさらに含んでも良い。また別の実施形態では、治療薬はＰａｒｋｉｎ（配列番号４）をコードする核酸を有するベクターをさらに含んでも良い。
【００３６】
ベクターは、ＤＮＡまたはＲＮＡウイルスをもとに作製できる。ＭｏＭＬＶベクター、ヘルペスウイルスベクター、アデノウイルスベクター、ＡＡＶベクター、ＨＩＶベクター、ＳＩＶベクター、センダイウイルスベクター等のいかなるウイルスベクターであっても良い。また、ウイルスベクターの構成タンパク質群のうち１つ以上を、異種ウイルスの構成タンパク質に置換する、もしくは、遺伝子情報を構成する塩基配列のうち一部を異種ウイルスの塩基配列に置換する、シュードタイプ型のウイルスベクターも本発明に使用できる。例えば、ＨＩＶの外皮タンパク質であるＥｎｖタンパク質を、小水痘性口内炎ウイルス（Ｖｅｓｉｃｕｌａｒｓｔｏｍａｔｉｔｉｓ Ｖｉｒｕｓ：ＶＳＶ）の外皮タンパク質であるＶＳＶ−Ｇタンパク質に置換したシュードタイプウイルスベクターが挙げられる。さらに、治療効果を持つウイルスであれば、ヒト以外の宿主域を持つウイルスもウイルスベクターとして使用可能である。ウイルス以外のベクターとしてはリン酸カルシウムと核酸の複合体、リポソーム、カチオン脂質複合体、センダイウイルスリポソーム、ポリカチオンを主鎖とする高分子キャリアー等が使用可能である。
【００３７】
さらに、ベクター中の遺伝子の発現のために用いられる発現カセットは、標的細胞内で遺伝子を発現させることができるものであれば、特に制限されることなく用いることができる。当業者はそのような発現カセットを容易に選択することができる。好ましくは、動物由来の細胞内で遺伝子発現が可能な発現カセットであり、より好ましくは、哺乳類由来の細胞内で遺伝子発現が可能な発現カセットであり、特に好ましくは、ヒト由来の細胞内で遺伝子発現が可能な発現カセットである。発現カセットに用いられる遺伝子プロモーターは、例えばアデノウイルス、サイトメガロウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、シミアンウイルス４０、ラウス肉腫ウイルス、単純ヘルペスウイルス、マウス白血病ウイルス、シンビスウイルス、Ａ型肝炎ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、パピローマウイルス、ヒトＴ細胞白血病ウイルス、インフルエンザウイルス、日本脳炎ウイルス、ＪＣウイルス、パルボウイルスＢ１９、ポリオウイルス等のウイルス由来のプロモーター、アルブミン、ＳＲα、熱ショック蛋白質、エロンゲーション因子等の哺乳類由来のプロモーター、ＣＡＧプロモーター等のキメラ型プロモーター、テトラサイクリン、ステロイド等によって発現が誘導されるプロモーターを含む。
【実施例】
【００３８】
以下、実施例を挙げて本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００３９】
（実験材料）
抗Ｍｙｃ抗体は、ＣＥＬＬ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社から購入した。抗ＦＬＡＧ抗体は、Ｓｉｇｍａ社から購入した。抗ＨＡ抗体は、Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ社から購入した。また、培養細胞への遺伝子導入には、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いて、添付のマニュアルを参考にして適宜実験系の最適化を行った。ＭＴＴアッセイに用いるテトラゾリウム塩（ＷＳＴ−８）は、同仁化学研究所から購入した。
【００４０】
ＬＭＯ３遺伝子（配列番号１）およびＬＭＯ３（配列番号２）のＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．は、ＮＭ＿００１００１３９５である。また、ＰＡＲＫ２遺伝子（配列番号３）およびＰａｒｋｉｎ（配列番号４）のＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．は、ＡＢ００９９７３である。
【００４１】
ＬＭＯ３の機能阻害に用いたｓｉＲＮＡは以下の通りである。
５’−ＧＴＡＧＴＡＡＧＣＴＣＡＴＣＣＣＴＧＣ−３’ （配列番号５）
【００４２】
ＲＴ−ＰＣＲ法に用いた各種プライマーは以下の通りである。
ｈｕｍａｎ ＬＭＯ３：
ｆｏｒｗａｒｄ ５’−ＡＴＧＣＴＣＴＣＡＧＴＣＣＡＧＣＣＡＧＡ−３’ （配列番号６）
ｒｅｖｅｒｓｅ ５’−ＴＣＡＧＣＧＡＡＣＣＴＧＧＧＧＴＧＣＡＴ−３’ （配列番号７）
ｈｕｍａｎ Ｍａｓｈ１：
ｆｏｒｗａｒｄ ５’−ＧＣＧＴＴＣＡＧＣＡＣＴＧＡＣＴＴＴＴＧ−３’ （配列番号８）
ｒｅｖｅｒｓｅ ５’−ＣＣＣＣＧＧＧＡＧＡＣＴＴＣＴＴＡＧＡＧ−３’ （配列番号９）
ｈｕｍａｎ ｇｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅｓ−３−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ （ＧＡＰＤＨ）：
ｆｏｒｗａｒｄ ５’−ＡＣＣＴＧＡＣＣＴＧＣＣＧＴＣＴＡＧＡＡ−３’ （配列番号１０）
ｒｅｖｅｒｓｅ ５’−ＴＣＣＡＣＣＡＣＣＣＴＧＴＴＧＣＴＧＴＡ−３’ （配列番号１１）
【００４３】
（実験方法）
以下の方法は各文献に沿って行なった。
免疫沈降法及びＲＴ−ＰＣＲ法は、Ａｏｙａｍａ Ｍ ｅｔ ａｌ．，（２００５）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ６５，４５８７−４５９７．に記載の方法と同様の方法を用い、適宜実験系の最適化を行った。レポーターアッセイは、Ｐｒｏｍｅｇａ社のＤｕａｌ−Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ｒｅｐｏｒｔｅｒ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍを用い、添付のマニュアルを参考にして行った。
【００４４】
（実施例１：Ｐａｒｋｉｎの相互作用因子の同定）
本発明者らは、ユビキチンリガーゼであるＰａｒｋｉｎが未知の基質を介して神経変性の制御に重要な役割を担っており、Ｐａｒｋｉｎおよび／または未知の基質の異常によって、神経変性が誘導されるのではないかとの仮定に基づき、以下の実験を行った。まず、Ｐａｒｋｉｎと相互作用する因子をｙｅａｓｔ ｔｗｏ ｈｙｂｒｉｄ法において検索した。その結果、単離した陽性遺伝子産物の中には、転写制御因子であるＬＭＯ３（ＬＩＭ ｄｏｍａｉｎ ｏｎｌｙ ｐｒｏｔｅｉｎ ３）が存在することが分かった。
【００４５】
そこで次に、ＰａｒｋｉｎとＬＭＯ３の相互作用を免疫沈降実験により調べた。なお、ＬＭＯファミリーであるＬＭＯ１〜４を同時に解析に用いた。具体的には、ＣＯＳ１細胞にＭｙｃタグを融合したＰａｒｋｉｎと共に、ＦＬＡＧタグを融合したＬＭＯ１〜４をそれぞれ共発現させた。プロテアソームインヒビターであるＭＧ１３２存在下において３時間培養した後、細胞懸濁液を回収して抗ＦＬＡＧ抗体で免疫沈降を行った。得られたサンプルを用いて抗Ｍｙｃ抗体および抗ＦＬＡＧ抗体でウエスタンブロットし、ＰａｒｋｉｎとＬＭＯ１〜４を検出した。図１に結果を示す。図１は、ＬＭＯファミリー蛋白質とＰａｒｋｉｎ蛋白質との相互作用を示す免疫沈降実験後のウエスタンブロット像である。その結果、Ｐａｒｌｉｎは、ＬＭＯ１〜４のいずれの分子とも培養細胞内で相互作用することが明らかになった。
【００４６】
（実施例２：ＰａｒｋｉｎによるＬＭＯ３ユビキチン化の影響）
さらに、ＬＭＯ３がユビキチンリガーゼであるＰａｒｋｉｎの基質となり得るかを調べるために、以下の方法でユビキチン化検定を行った。ＣＯＳ１細胞にＭｙｃタグ融合Ｐａｒｋｉｎ、ＦＬＡＧタグ融合ＬＭＯ３、ＨＡタグ融合ユビキチン（Ｕｂ）を共発現させた。ＭＧ１３２存在下において１．５時間培養した後、細胞懸濁液を回収して抗ＦＬＡＧ抗体で免疫沈降を行った。得られたサンプルを用いてウエスタンブロットした。なお、正常型のＰａｒｋｉｎと併せて、Ｐａｒｋｉｎ病因変異体を同時に解析に用いた。Ｐａｒｋｉｎ病因変異体には、Ｐａｒｋｉｎの２４０番目のアミノ酸がＴからＲに変異したＰａｒｋｉｎＴ２４０Ｒ変異体と、Ｐａｒｋｉｎの４１５番目のアミノ酸がＴからＮに変異したＰａｒｋｉｎＴ４１５Ｎ変異体とを用いた。図２にユビキチン化検定の結果を示す。その結果、Ｐａｒｋｉｎ存在下においてＬＭＯ３のユビキチン化が促進されることを見出した。また、ＰａｒｋｉｎＴ４１５Ｎにおいては、その活性が減弱することが分かった。
【００４７】
これらの解析により、出願人らは、Ｐａｒｋｉｎの新規基質としてＬＭＯ３を同定した。またＰａｒｋｉｎ病因変異体Ｔ４１５Ｎにおいては、その活性が減弱したことから、ＬＭＯ３は常染色体劣性若年性パーキンソン病やＰａｒｋｉｎの変性による神経変性に関与している可能性が示唆された。
【００４８】
（実施例３：内在性Ｍａｓｈ１遺伝子の発現に対するＰａｒｋｉｎの効果）
内在性Ｍａｓｈ１の転写に対するＰａｒｋｉｎの効果を検討するために、以下の解析を行った。ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞にＭｙｃ−Ｐａｒｋｉｎまたはその変異体（Ｍｙｃ−ＰａｒｋｉｎＴ４１５Ｎ、Ｍｙｃ−ＰａｒｋｉｎＴ２４０Ｒ）を発現するコンストラクトを導入した。４８時間培養した後、ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞からＲＮＡを調製し、ＲＴ−ＰＣＲによりＭａｓｈ１ ｍＲＮＡの発現量を調べた。なお、ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞はヒト神経芽腫由来の培養細胞株であり、Ｍａｓｈ１遺伝子およびＬＭＯ３遺伝子が内在的に発現している。図３に結果を示す。図３は、内在性Ｍａｓｈ１遺伝子の発現に対するＰａｒｋｉｎ蛋白質の効果を示すＤＮＡ電気泳動像である。この解析により、ＰａｒｋｉｎによってＭａｓｈ１ ｍＲＮＡの発現量は減少することが判明した。なお、Ｐａｒｋｉｎ変異体ではＭａｓｈ１ ｍＲＮＡの発現量の顕著な減少は観察されなかった。
【００４９】
（実施例４：Ｍａｓｈ１遺伝子の転写に対するＰａｒｋｉｎの効果）
ＰａｒｋｉｎのＭａｓｈ１転写への効果を検討するために、ヒトＭａｓｈ１プロモーターを使ってレポーターアッセイを行なった。Ｍｙｃ−Ｐａｒｋｉｎ発現コンストラクト量を段階的に設定し、ヒトＭａｓｈ１プロモーター（約１．３ｋｂ、配列番号１２）をルシフェラーゼ遺伝子の上流につないだコンストラクトと共にＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞に導入した。４８時間培養した後、レポーター活性を検出した。図４にレポーターアッセイの結果を示す。その結果、Ｍａｓｈ１遺伝子の転写はＰａｒｋｉｎによって濃度依存性に抑制されることが明らかとなった。
【００５０】
（実施例５：ＬＭＯ３によるＭａｓｈ１転写促進に対するＰａｒｋｉｎの効果）
ＰａｒｋｉｎによるＭａｓｈ１の転写制御が、ＬＭＯ３を介している可能性を調べるために、以下の実験を行った。Ｎｅｕｒｏ２ａ細胞にレポーターコンストラクトと共に発現コンストラクトを導入し、Ｍｙｃ−Ｐａｒｋｉｎおよび／またはＨＡ−ＬＭＯ３を発現させた。４８時間培養した後、レポーター活性を検出した。図５にレポーターアッセイの結果を示す。その結果、ＬＭＯ３によってＭａｓｈ１の転写は促進したが、このＬＭＯ３によるＭａｓｈ１転写活性の増加はＰａｒｋｉｎ蛋白質によって抑制されることが分かった。
【００５１】
これらの結果から、神経細胞および神経芽種細胞においてもＰａｒｋｉｎとＬＭＯ３とが相互作用している可能性が示唆された。また、ＰａｒｋｉｎおよびＬＭＯ３がＭａｓｈ１遺伝子の転写制御に関与していることが明らかとなり、ＰａｒｋｉｎによるＭａｓｈ１遺伝子の転写制御が、ＬＭＯ３を介している可能性が示唆された。Ｍａｓｈ１は、神経発生や神経分化に重要な役割を果たすｂＨＬＨ型の転写因子である。したがって、ＰａｒｋｉｎおよびＬＭＯ３によるＭａｓｈ１遺伝子の転写制御は、神経細胞の分化や機能維持などに深く関与している可能性が考えられる。
【００５２】
（実施例６：ＰａｒｋｉｎがＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞の増殖能に与える影響）
ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞ではＬＭＯ３とＭａｓｈ１が恒常的に発現しており、細胞増殖能が増加していることが示唆されている。そこで、ＰａｒｋｉｎによってＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞内在性Ｍａｓｈ１の発現が抑制された時の細胞増殖能をＭＴＴアッセイによって調べた。図６にＭＴＴアッセイの結果を示す。この解析より、ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞の増殖はＰａｒｋｉｎによって抑制されることが分かった。
【００５３】
（実施例７：Ｍａｓｈ１遺伝子の転写に対するＰａｒｋｉｎ変異体の効果）
ＰａｒｋｉｎとＰａｒｋｉｎ変異体とで、Ｍａｓｈ１転写抑制効果をレポーターアッセイにより比較した。なお、細胞はマウス神経芽腫細胞であるＮｅｕｒｏ２ａ細胞を使用した。図７にレポーターアッセイの結果を示す。その結果、Ｐａｒｋｉｎ変異体（ＰａｒｋｉｎＴ４１５ＮおよびＰａｒｋｉｎＴ２４０Ｒ）ではＰａｒｋｉｎのように顕著なＭａｓｈ１転写の抑制効果はみられないことが明らかとなった。
【００５４】
また、ＰａｒｋｉｎとＰａｒｋｉｎ変異体とで、Ｍａｓｈ１転写抑制効果をレポーターアッセイにより経時的に比較した（図８）。その結果、形質導入４８時間後のＭａｓｈ１転写活性において、Ｐａｒｋｉｎ変異体とＰａｒｋｉｎとの間に顕著な差が見られた。
【００５５】
さらに、ＰａｒｋｉｎとＰａｒｋｉｎ変異体との発現コンストラクト量を段階的に設定した条件で、Ｍａｓｈ１転写抑制効果をレポーターアッセイにより比較した（図９）。その結果、Ｐａｒｋｉｎ変異体（ＰａｒｋｉｎＴ４１５ＮおよびＰａｒｋｉｎＴ２４０Ｒ）ではＰａｒｋｉｎのように顕著なＭａｓｈ１転写の抑制効果はみられないことが明らかとなった。
【００５６】
Ｐａｒｋｉｎ変異体を用いたこれらの解析より、Ｐａｒｋｉｎ変異体を用いた場合には、ＰａｒｋｉｎによるＬＭＯ３を介したＭａｓｈ１遺伝子発現について、異なる制御機構が働くことが強く示唆された。これによって、遺伝子変異や蛋白質の変性などによってＰａｒｋｉｎに異常が生じた場合には、Ｍａｓｈ１遺伝子の発現制御が正常に行われない可能性があり、神経細胞の機能制御に異常をきたすことが推測される。
【００５７】
（実施例８：ＬＭＯ３の機能阻害がＭａｓｈ１遺伝子の発現に与える影響）
ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞に発現しているＬＭＯ３の機能阻害がＭａｓｈ１遺伝子の発現に与える影響を調べるために、以下の実験を行った。まず、ＬＭＯ３に特異的なｓｉＲＮＡを選定した。次に、得られたｓｉＲＮＡ（配列番号５）をＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞に導入して培養した後に、その効果をＲＴ−ＰＣＲ法（Ａ）とヒトＭａｓｈ１プロモーターを使ったレポーターアッセー（Ｂ）により調べた。結果を図１０に示す。この解析の結果、ＬＭＯ３に特異的なｓｉＲＮＡ（配列番号５）の導入により、ＬＭＯ３のｍＲＮＡ量が減少し、ＬＭＯ３の機能阻害が起きていることが確認できた。この条件において、Ｍａｓｈ１のｍＲＮＡ量は減少することが明らかとなった。また、レポーターアッセイの結果からも、ＬＭＯ３の機能阻害によってＭａｓｈ１遺伝子の転写が抑制されることが判明した。
【００５８】
（実施例９：ＬＭＯ３の機能阻害がＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞の増殖能に与える影響）
ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞に発現しているＬＭＯ３の機能阻害がＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞の増殖能に与える影響を調べるために、以下の実験を行った。ＬＭＯ３のｓｉＲＮＡ（配列番号５）をＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞に導入して培養した後に、細胞数をカウントして細胞増殖を調べた。結果を図１１に示す。この結果より、内在性のＬＭＯ３の発現が抑制された条件において、細胞の増殖は抑制されることが分かった。また、恒常的に発現しているＬＭＯ３は細胞増殖の促進に働いていることが確認された。
【００５９】
ＬＭＯ３機能阻害の解析結果から、ＬＭＯ３の機能阻害を行うことによって、Ｍａｓｈ１遺伝子の転写が抑制され、また、細胞の増殖も抑制されることが分かった。ＰａｒｋｉｎによるＬＭＯ３の機能阻害によっても、このようなＭａｓｈ１遺伝子の発現制御および細胞増殖の制御が起こることが考えられる。
【００６０】
以上の実施例１〜９の結果から、図１２に示すモデルを出願人らは導いた。図１３は、Ｐａｒｋｉｎ、ＬＭＯ３およびＭａｓｈ１の分子制御メカニズムのモデルを模式的に表した図である。ＰａｒｋｉｎはＬＭＯ３と結合し、その機能を阻害する。また、ＬＭＯ３は、Ｍａｓｈ１遺伝子の転写を正に制御しているが、Ｐａｒｋｉｎ存在下においては、ＬＭＯ３による転写活性化は抑制される。このような分子機構によって、神経細胞の分化や機能が制御されていると推測される。
【００６１】
例えば、予後不良な神経芽腫の場合、正常細胞よりも過剰に発現するＬＭＯ３などによって、Ｍａｓｈ１遺伝子の転写制御機構が異常になり、恒常的にＭａｓｈ１遺伝子が発現する結果、細胞増殖能などの神経細胞の機能異常が発生するものと考えられる。一方、正常な神経発生ではＭａｓｈ１の一過性の高発現が神経分化を誘導することが知られている。この従来の知見に加え、本発明により得られた知見から、異常なＰａｒｋｉｎがＬＭＯ３ひいてはＭａｓｈ１の転写制御を介して正常な神経発生過程に干渉することを示唆している。例えば、常染色体劣性若年性パーキンソン病やＰａｒｋｉｎの変性などによる異常なＰａｒｋｉｎの存在下においては、Ｐａｒｋｉｎ、ＬＭＯ３およびＭａｓｈ１の分子制御に異常をきたし、神経細胞の変性や脱落などが起こる可能性が想定される。
【図面の簡単な説明】
【００６２】
【図１】ＬＭＯファミリー蛋白質とＰａｒｋｉｎ蛋白質との相互作用を示す免疫沈降実験のウエスタンブロット像に対応する図である。ＷＢ：ウエスタンブロット、ＩＰ：免疫沈降、ｖｅｃｔｏｒ：コントロールのベクター。
【図２】ＰａｒｋｉｎによるＬＭＯ３ユビキチン化の影響を示すユビキチン化検定の結果に対応する図である。ＷＢ：ウエスタンブロット、ＩＰ：免疫沈降。
【図３】内在性Ｍａｓｈ１遺伝子の発現に対するＰａｒｋｉｎ蛋白質の効果を示すＤＮＡ電気泳動像に対応する図である。
【図４】（Ａ）ヒトＭａｓｈ１のプロモーター約１．３ｋｂをルシフェラーゼ遺伝子の上流につないだコンストラクトを模式的に表した図である。（Ｂ）Ｍａｓｈ１遺伝子の転写に対するＰａｒｋｉｎ蛋白質の効果を示すレポーターアッセイの結果に対応する図である。
【図５】ＬＭＯ３蛋白質によるＭａｓｈ１転写促進に対するＰａｒｋｉｎ蛋白質の効果を示すレポーターアッセイの結果に対応する図である。
【図６】Ｐａｒｋｉｎ蛋白質がＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞の増殖能に与える影響を示すＭＴＴアッセイの結果に対応する図である。「吸収」は、細胞数（相対値）に相当する。ｐｃＤＮＡ３は発現ベクターであり、コントロールとして用いた。
【図７】ＰａｒｋｉｎとＰａｒｋｉｎ変異体とで、Ｍａｓｈ１転写抑制効果をレポーターアッセイにより比較した結果に対応する図である。
【図８】ＰａｒｋｉｎとＰａｒｋｉｎ変異体とで、Ｍａｓｈ１転写抑制効果をレポーターアッセイにより経時的に比較した結果に対応する図である。ｐｃＤＮＡ３は発現ベクターであり、コントロールとして用いた。
【図９】ＰａｒｋｉｎとＰａｒｋｉｎ変異体との用量依存的なＭａｓｈ１転写抑制効果をレポーターアッセイにより比較した結果に対応する図である。
【図１０】ＬＭＯ３の機能阻害がＭａｓｈ１遺伝子の発現に与える影響をＲＴ−ＰＣＲ法（Ａ）およびヒトＭａｓｈ１プロモーターを使ったレポーターアッセー（Ｂ）により検討した結果に対応する図である。
【図１１】ＬＭＯ３の機能阻害がＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞の増殖能に与える影響を示す細胞数をカウントした結果に対応する図である。ｐｃＤＮＡ３は発現ベクターであり、コントロールとして用いた。
【図１２】Ｐａｒｋｉｎ、ＬＭＯ３およびＭａｓｈ１の分子制御メカニズムのモデルを模式的に表した図である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
被検化合物の存在下および非存在下のそれぞれの条件において、細胞を培養する工程と、
それぞれの培養した細胞中のＬＭＯ３遺伝子の発現量を測定する工程と、
被検化合物の存在下において培養した細胞中のＬＭＯ３遺伝子の発現量が、被検化合物の非存在下において培養した細胞中のＬＭＯ３遺伝子の発現量よりも低い場合に、当該被検化合物を神経疾患の治療薬と判定する工程と、
を備える、神経疾患の治療薬のスクリーニング方法。
【請求項２】
被検化合物の存在下および非存在下のそれぞれの条件において、細胞を培養する工程と、
それぞれの培養した細胞中のＬＭＯ３遺伝子およびＭａｓｈ１遺伝子の発現量を測定する工程と、
被検化合物の存在下において培養した細胞中のＬＭＯ３遺伝子およびＭａｓｈ１遺伝子の発現量が、被検化合物の非存在下において培養した細胞中のＬＭＯ３遺伝子およびＭａｓｈ１遺伝子の発現量よりも低い場合に、当該被検化合物を神経疾患の治療薬と判定する工程と、
を備える、神経疾患の治療薬のスクリーニング方法。
【請求項３】
被検化合物の存在下および非存在下のそれぞれの条件において、細胞を培養する工程と、
それぞれの培養した細胞中のＰａｒｋｉｎ蛋白質とＬＭＯ３蛋白質との相互作用および／またはＬＭＯ３蛋白質のユビキチン化量を測定する工程と、
被検化合物の非存在下よりも被検化合物の存在下において、培養した細胞中のＰａｒｋｉｎ蛋白質とＬＭＯ３蛋白質との相互作用が強く、および／または、培養した細胞中のＬＭＯ３蛋白質のユビキチン化量が高い場合に、当該被検化合物を神経疾患の治療薬と判定する工程と、
を備える、神経疾患の治療薬のスクリーニング方法。
【請求項４】
細胞が、神経組織由来の培養細胞である、請求項１〜３のいずれか一項に記載のスクリーニング方法。
【請求項５】
細胞が、ヒト神経芽腫の臨床サンプル由来の細胞である、請求項１〜３のいずれか一項に記載のスクリーニング方法。
【請求項６】
配列番号５に記載の塩基配列からなるｓｉＲＮＡを有する、神経疾患の治療薬。
【請求項１】
被検化合物の存在下および非存在下のそれぞれの条件において、細胞を培養する工程と、
それぞれの培養した細胞中のＬＭＯ３遺伝子の発現量を測定する工程と、
被検化合物の存在下において培養した細胞中のＬＭＯ３遺伝子の発現量が、被検化合物の非存在下において培養した細胞中のＬＭＯ３遺伝子の発現量よりも低い場合に、当該被検化合物を神経疾患の治療薬と判定する工程と、
を備える、神経疾患の治療薬のスクリーニング方法。
【請求項２】
被検化合物の存在下および非存在下のそれぞれの条件において、細胞を培養する工程と、
それぞれの培養した細胞中のＬＭＯ３遺伝子およびＭａｓｈ１遺伝子の発現量を測定する工程と、
被検化合物の存在下において培養した細胞中のＬＭＯ３遺伝子およびＭａｓｈ１遺伝子の発現量が、被検化合物の非存在下において培養した細胞中のＬＭＯ３遺伝子およびＭａｓｈ１遺伝子の発現量よりも低い場合に、当該被検化合物を神経疾患の治療薬と判定する工程と、
を備える、神経疾患の治療薬のスクリーニング方法。
【請求項３】
被検化合物の存在下および非存在下のそれぞれの条件において、細胞を培養する工程と、
それぞれの培養した細胞中のＰａｒｋｉｎ蛋白質とＬＭＯ３蛋白質との相互作用および／またはＬＭＯ３蛋白質のユビキチン化量を測定する工程と、
被検化合物の非存在下よりも被検化合物の存在下において、培養した細胞中のＰａｒｋｉｎ蛋白質とＬＭＯ３蛋白質との相互作用が強く、および／または、培養した細胞中のＬＭＯ３蛋白質のユビキチン化量が高い場合に、当該被検化合物を神経疾患の治療薬と判定する工程と、
を備える、神経疾患の治療薬のスクリーニング方法。
【請求項４】
細胞が、神経組織由来の培養細胞である、請求項１〜３のいずれか一項に記載のスクリーニング方法。
【請求項５】
細胞が、ヒト神経芽腫の臨床サンプル由来の細胞である、請求項１〜３のいずれか一項に記載のスクリーニング方法。
【請求項６】
配列番号５に記載の塩基配列からなるｓｉＲＮＡを有する、神経疾患の治療薬。
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１１】
【図１２】
【図１】
【図２】
【図３】
【図１０】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１１】
【図１２】
【図１】
【図２】
【図３】
【図１０】
【公開番号】特開２００８−１４２００８（Ｐ２００８−１４２００８Ａ）
【公開日】平成２０年６月２６日（２００８．６．２６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−３３２５２８（Ｐ２００６−３３２５２８）
【出願日】平成１８年１２月８日（２００６．１２．８）
【出願人】（０００１６０５２２）久光製薬株式会社 (121)
【出願人】（５９１０１４７１０）千葉県 (49)
【出願人】（５０２２８５４５７）学校法人順天堂 (64)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２０年６月２６日（２００８．６．２６）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年１２月８日（２００６．１２．８）
【出願人】（０００１６０５２２）久光製薬株式会社 (121)
【出願人】（５９１０１４７１０）千葉県 (49)
【出願人】（５０２２８５４５７）学校法人順天堂 (64)
【Ｆターム（参考）】
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