神経細胞の酸化的損傷のマーカー及びその利用
【課題】ＤＨＡやＡＡなどの高度不飽和脂肪酸から生成する脂質ヒドロペルオキシドによる神経細胞の酸化的損傷を検出するのに適したマーカーを提供する。
【解決手段】神経細胞における酸化的損傷マーカー化合物として以下の式（１）で表される化合物を用いる。
（式（１）中、Ｒは、ヘキサノイル基、グルタロイル基、プロパノイル基又はスクシニル基を表す。）
【解決手段】神経細胞における酸化的損傷マーカー化合物として以下の式（１）で表される化合物を用いる。
（式（１）中、Ｒは、ヘキサノイル基、グルタロイル基、プロパノイル基又はスクシニル基を表す。）
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、神経細胞における酸化的損傷の程度を検出することのできるマーカー及びその利用に関し、詳しくは、該マーカーを特異的に認識する抗体、測定キット、酸化的損傷の測定方法、炎症反応に関連する化合物のスクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
アルツハイマーやパーキンソン病などの神経変性疾患についてはその病因は明らかになっているわけではない。一方、こうした神経変性疾患に係る神経細胞の有する種々の異常について報告がなされている。例えば、アルツハイマー病患者の脳内ＤＨＡ含有量は正常人の２分の１まで減少していることが報告されている（非特許文献１）。また、ドーパミンは、アミノ基を有するカテコールアミン系神経伝達物質であり、ドーパミンの減少がパーキンソン病のような神経変性疾患と深く関与していることも報告されている（非特許文献２）。
【０００３】
ここに、ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）やアラキドン酸（ＡＡ）は、生体内において、大脳や網膜などの神経組織や母乳などに多く含まれ、様々な生理活性を示すことが知られている。また、これらの脂肪酸は、二重結合を多く有する多価不飽和脂肪酸であるため、生体内で酸化されて脂質ペルオキシドを生成する可能性があることも知られている（非特許文献３）。
【非特許文献１】Lipids 26, 421(1991)
【非特許文献２】J. Med. Chem. 1997,40,2211-2216
【非特許文献３】「現代の食品化学」三共出版 並木満夫
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかしながら、ＤＨＡやＡＡとドーパミンとの関係、さらには神経変性疾患との関係については何ら検討もされておらず、報告もなされていない。
【０００５】
そこで、本発明は、ＤＨＡやＡＡなどの高度不飽和脂肪酸から生成する脂質ヒドロペルオキシドによる神経細胞の酸化的損傷を検出するのに適したマーカー、当該マーカーを利用した前記損傷の測定方法、当該マーカーに特異的な抗体及び当該マーカーを利用したスクリーニング方法を提供することを一つの目的とする。また、本発明は、神経変性疾患の発症予測、神経変性疾患に罹患しているかどうかの診断、神経変性疾患の進行程度など予防、治療、診断等に有効なマーカー、当該マーカーを利用した神経変性疾患の発症診断、疾患診断等の診断方法、当該マーカーに特異的な抗体及び当該マーカーを利用したスクリーニング方法を提供することを他の一つの目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、神経細胞の酸化的損傷を検出するのに有用なマーカー及び該マーカーを利用した検査方法等に関している。本発明者らは、脳内に多量に存在するＤＨＡやＡＡなどの多価不飽和脂肪酸とドーパミンとに着目した。そして、生体内における酸化ストレスによって、これらの多価賦飽和脂肪酸から生成される脂質ヒドロペプチドルオキシドが、脳内のドーパミン量の低下に関連があることを見出した。さらに、本発明者らは、これらの脂質ヒドロペルオキシド又はその分解物がドーパミンと反応して生成するドーパミンの修飾体の量を測定することで、脳内のＤＨＡ若しくはＡＡ又はドーパミンの濃度低下を容易に検出することができ、神経細胞の酸化的損傷の程度や神経変性疾患の診断やその前段階状態にあるかどうかの診断のための有用なマーカーとなりえることを見出した。すなわち、本発明によれば、以下の手段が提供される。
【０００７】
本発明の一つの形態によれば、以下の式（１）で表される、神経細胞における酸化的損傷マーカー化合物が提供される。
【化７】
（式（１）中、Ｒは、ヘキサノイル基、グルタロイル基、プロパノイル基又はスクシニル基を表す。）
【０００８】
このマーカー化合物においては、前記式（１）中、Ｒは、ヘキサノイル基又はグルタロイル基で表すことができ、また、前記式（１）中、Ｒは、プロパノイル基又はスクシニル基で表していてもよい。さらに、前記式（１）中、Ｒはヘキサノイル基又はプロパノイル基で表されることが好ましい。
【０００９】
本発明の一つの形態によれば、神経細胞における酸化的損傷の検査方法であって、動物から採取される被験試料中の請求項１〜４のいずれかに記載の酸化的損傷マーカー化合物の量を測定する工程を備える、検査方法が提供される。
【００１０】
前記測定工程における前記被験試料は、脊髄液又は脳髄液であることが好ましい。また、前記測定工程は、前記酸化的損傷マーカー化合物を特異的に認識する抗体を用いる工程であることが好ましい。さらに、前記測定工程は、ＥＬＩＳＡ法によって実施することが好ましい。
【００１１】
本発明の一つの形態によれば、神経細胞の老化程度の検査方法であって、動物から採取される被験試料中の請求項１〜４のいずれかに記載の酸化的損傷マーカー化合物の量を測定する工程と、前記測定工程の測定結果に基づいて前記動物の神経細胞の老化程度を判定する工程を備える、検査方法が提供される。
【００１２】
本発明の一つの形態によれば、神経細胞の酸化的損傷に関連する疾患に関する診断方法であって、動物から採取される被験試料中の請求項１〜４のいずれかに記載の酸化的損傷マーカー化合物の量を測定する工程と、前記測定工程の測定結果に基づいて前記動物の前記疾患の発症リスク、前記疾患に罹患しているかどうかの診断及び前記疾患の進行程度のいずれかを診断する診断工程と、を備える、診断方法が提供される。この診断方法において、前記疾患は、神経変性疾患とすることができる。
【００１３】
本発明の一つの形態によれば、以下の式（１）で表される化合物から選択されるいずれかの化合物を特異的に認識する抗体が提供される。
【化８】
（式（１）中、Ｒは、ヘキサノイル基、グルタロイル基、プロパノイル基又はスクシニル基を表す。）
【００１４】
本発明の一つの形態によれば、以下の式（２）及び（３）で表される化合物から選択される、上記抗体を作製するための化合物が提供される。
【化９】
（式（２）中、Ｒは、ヘキサノイル基、グルタロイル基、プロパノイル基又はスクシニル基を表す。）
【化１０】
（式（３）中、Ｒは、ヘキサノイル基、グルタロイル基、プロパノイル基又はスクシニル基を表す。）
【００１５】
本発明の一つの形態によれば、以下の式（４）及び（５）で表される化合物から選択される、請求項１２に記載の抗体を作製するための抗原用化合物が提供される。
【化１１】
（式（４）中、Ｒは、ヘキサノイル基、グルタロイル基、プロパノイル基又はスクシニル基を表し、Ｘはキャリアタンパク質から一アミノ基を除いた残部を表す。）
【化１２】
（式（５）中、Ｒは、ヘキサノイル基、グルタロイル基、プロパノイル基又はスクシニル基を表し、Ｘはキャリアタンパク質から一アミノ基を除いた残部を表す。）
【００１６】
本発明の一つの形態によれば、神経細胞における酸化的損傷を抑制する化合物のスクリーニング方法であって、非ヒト動物に１種又は２種以上の試験化合物を投与する工程と、前記試験化合物を投与した前記非ヒト動物から採取される被験試料中の上記いずれかの神経細胞の酸化的損傷マーカー化合物の量を測定する工程と、を備える、スクリーニング方法が提供される。
【００１７】
本発明の一つの形態によれば、神経細胞における酸化的損傷を抑制する食品のスクリーニング方法であって、非ヒト動物に１種又は２種以上の食品を投与する工程と、前記食品を投与した前記非ヒト動物から採取される被験試料中の上記いずれかの神経細胞の酸化的損傷マーカー化合物の量を測定する工程と、を備える、スクリーニング方法が提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
以下、本発明の一つの実施形態である神経細胞の酸化的損傷のマーカー化合物、上記式（１）で表される化合物である。このマーカー化合物は、脳などの脂肪酸組成において主要な脂肪酸の一つであるＡＡやＤＨＡのヒドロペルオキシドとドーパミンとの反応生成物である。このため、神経細胞の酸化的損傷を検出するための有効なマーカー化合物である。以下、本発明の一つの形態である酸化的損傷マーカー化合物について説明するとともに、他の実施形態である神経細胞の酸化的損傷の検査方法、マーカーを特異的に認識する抗体、測定キット、神経細胞の老化程度の検査方法、神経細胞の酸化的損傷が関連する疾患の各種診断方法、スクリーニング方法等について説明する。
【００１９】
（神経細胞の酸化的損傷マーカー化合物）
本発明の神経細胞の酸化的損傷マーカー化合物は、上記式（１）で表される。上記式（１）中、Ｒがヘキサノイル基であるマーカー化合物Ｉ及びＲがグルタロイル基であるマーカー化合物ＩＩは、いずれもＡＡ由来のヒドロペルオキシドとドーパミンとの反応生成物であると考えられる。アラキドン酸とこれらの化合物Ｉ、ＩＩとの関係を図１に示す。マーカー化合物Ｉは、ＡＡの非カルボキシ末端由来であり、マーカー化合物ＩＩは、ＡＡのカルボキシル末端由来であると考えられる。これらのマーカー化合物Ｉ、ＩＩはＡＡの酸化、ＡＡ含有量の低下、ＡＡによるドーパミン含有量の低下など、神経細胞におけるＡＡに関連する各種の酸化的損傷を検出するのに有用である。
【００２０】
また、式（１）中、Ｒがプロパノイル基であるマーカー化合物ＩＩＩ及びＲがスクシニル基であるマーカー化合物ＩＶは、いずれもＤＨＡ由来のヒドロペルオキシドとドーパミンとの反応生成物と考えられる。ＤＨＡとこれらの化合物ＩＩＩ、ＩＶとの関係を図２に示す。マーカー化合物ＩＩＩは、ＤＨＡの非カルボキシ末端由来であり、マーカー化合物ＩＶは、ＤＨＡのカルボキシル末端由来であると考えられる。これらのマーカー化合物ＩＩＩ、ＩＶはＤＨＡの酸化、ＤＨＡ含有量の低下、ＤＨＡによるドーパミン含有量の低下など、神経細胞におけるＤＨＡに関連する各種の酸化的損傷を検出するのに有用である。
【００２１】
これらのなかでも、マーカー化合物Ｉ及びＩＩＩが、アポトーシス誘導能が高いためマーカー化合物として有用である。
【００２２】
マーカー化合物Ｉは、例えば、等モル量のドーパミンと無水ヘキサノイル酸とを、リン酸塩緩衝液（ｐＨ７．４）とＤＭＦとの混液（１：１）に溶解して、室温で４時間程度反応させることにより得ることができる。また、マーカー化合物ＩＩは、例えば、等モル量のドーパミンと無水グルタル酸とをリン酸塩緩衝液（ｐＨ７．４）と飽和酢酸ナトリウム溶液との混液（１：１）に溶解して、室温で１時間程度反応させることにより得ることができる。マーカー化合物ＩＩＩは、例えば、等モル量のドーパミンと無水プロピオン酸とを、リン酸塩緩衝液（ｐＨ７．４）と飽和酢酸ナトリウム溶液との混液（１：１）に溶解して、室温で１時間程度反応させることにより得ることができる。また、マーカー化合物ＩＶは、例えば、等モル量のドーパミンと無水スクシニル酸とをリン酸塩緩衝液（ｐＨ７．４）と飽和酢酸ナトリウム溶液との混液（１：１）に溶解して、室温で１時間程度反応させることにより得ることができる。
【００２３】
本発明のマーカー化合物は、神経細胞の酸化的損傷に関連する研究用途、検査用途、診断用途、有用な薬剤や食品などのスクリーニング用途に用いることができる。
【００２４】
（神経細胞の酸化的損傷の検査方法）
本発明の検査方法は、動物から採取される被験試料を検査対象としている。本明細書において、動物とは、ヒトの他、ヒト以外の異種の温血動物が挙げられ、例えば、マウス、ハムスター、ラット、モルモット、ウサギ、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ニワトリが挙げられる。また、被験試料は、動物から採取される血液、血漿、血清、尿、脊髄液、脳髄液などの液体試料が挙げられるが、好ましくは、脊髄液、脳髄液である。また、被験試料としては、動物の神経組織等から採取される細胞や組織等の固形試料が挙げられる。細胞や組織などの固形試料に対しては免疫組織化学染色法により、細胞内又は組織におけるドーパミン修飾体の局在を検出することができる。組織やこうした被験試料は、その種類及び必要に応じて適宜前処理がなされる。
【００２５】
本検査方法では、被験試料中の本発明の酸化的損傷マーカー化合物を測定する工程を備えている。本測定工程におけるマーカー化合物の量の測定方法は特に限定されないが、被験試料が生体試料であることを考慮すると、被験試料の夾雑物からこれらのマーカー化合物を分離した上で検出（同定）することが好ましい。こうした分析方法としては、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）などの各種液体クロマトグラフィー（ＬＣ）を用いることができる。また、液体クロマトグラフィーと質量分析法を組み合わせたＬＣ／ＭＳやＬＣ／ＭＳ／ＭＳなども用いることができる。
【００２６】
また、マーカー化合物を特異的に認識する抗体、好ましくはモノクローナル抗体を用いて、マーカー化合物の量を測定することもできる。
【００２７】
（マーカー化合物を特異的に認識する抗体）
本発明の抗体は、上記式（１）で表されるマーカー化合物Ｉ〜ＩＶから選択されるいずれかのマーカー化合物を特異的に認識する抗体である。本発明の抗体は、ポリクローナル抗体であってもよいが、モノクローナル抗体であることが好ましい。
【００２８】
（抗体の作製）
こうしたマーカー化合物に対する抗体作製方法について説明する。
（１）抗原の調製
本発明の抗体を作製するための抗原としては、マーカー化合物とタンパク質などの適当なキャリアとを結合させた結合体を用いることが好ましい。キャリアタンパク質としては、従来公知のキャリアタンパク質が用いられるが、なかでもウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、卵白アルブミン、リポプロテイン、ヘモシアニンなどが好ましく用いられる。より好ましくは、カギアナカサガイのヘモシアニン（ＫＬＨ）である。こうしたキャリアタンパク質は、商業的に容易に入手可能である。なお、キャリアとしては、ポリアミノ酸、ポリスチレン、ポリアクリル酸、ポリビニルなどの重合体又は共重合体等の合成高分子を用いることができる。
【００２９】
マーカー化合物とキャリアタンパク質との結合体を得る方法としては、特に限定しないが、適当な溶媒中で、マーカー化合物にカルボキシル基を導入したカルボキシル付加体とキャリアタンパク質とを適当な架橋剤の存在下で反応させて酸アミド結合を形成させる方法が挙げられる。カルボキシル付加体としては、マーカー化合物Ｉ〜ＩＶの芳香環の５位の炭素原子にシステインを導入して得られる上記式（２）で表される化合物が挙げられる。また、式（３）で表される化合物が挙げられる。なお、式（２）及び式（３）におけるＲは、ヘキサノイル基、グルタロイル基、プロパノイル基及びスクシニル基のいずれかを表しており、それぞれマーカー化合物Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ及びＩＶに対応している。
【００３０】
上記式（２）で表されるカルボキシル付加体は、例えば、図３に示すように、酢酸アンモニウム緩衝液（０．１Ｍ、ｐＨ５．８）中、１００ｍＭのマーカー化合物、１００ｍＭのシステインと１ｍｇ／ｍｌのチロシナーゼを室温で７時間程度反応させることにより得ることができる。このカルボキシル付加体のシステインのカルボキシル基にキャリアタンパク質のアミノ基との酸アミド結合の結合を介してキャリアタンパク質と結合させることで式（４）で表される抗原用化合物を得ることができる。
【００３１】
また、上記式（３）で表されるカルボキシル付加体は、例えば、図４に示すように、３，４−ジヒドロキシ−Ｌ−フェニルアラニンを出発物質として、マーカー化合物を合成するときと同様にして修飾体を合成することで得ることができる。このカルボキシル付加体のフェニルアラニン由来のカルボキシル基とキャリアタンパク質とのアミノ基とから酸アミド結合を形成してキャリアタンパク質と結合させることで上記式（５）で表される抗原用化合物を得ることができる。
【００３２】
なお、グルタロイル基及びスクシニル基を有するマーカー化合物についてのカルボキシル付加体については、予めこれらのカルボキシル基をメチルエステル化などして保護しておき、その後ドーパミンと反応させ、さらにタンパク質を導入させた後、水酸化ナトリウムなどによって加水分解してカルボキシル基に戻すようにすることが好ましい。
【００３３】
式（４）及び式（５）におけるＲは、ヘキサノイル基、グルタロイル基、プロパノイル基及びスクシニル基のいずれかを表しており、Ｘは、キャリアタンパク質から一アミノ基を除いた残部を表す。なお、該アミノ基は、カルボキシル付加体のカルボキシル基との酸アミド結合を形成している。キャリアタンパク質としては、好ましくは、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、卵白アルブミン、リポプロテイン及びヘモシアニンであり、より好ましくは、カギアナカサガイのヘモシアニン（ＫＬＨ）である。
【００３４】
なお、カルボキシル付加体とキャリアタンパク質との結合反応は、架橋剤としてＥＤＣ（１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドハイドロクロライド）などの水溶性カルボジイミドを使用することができる。なお、他の架橋剤を用いてもよい。結合反応のための溶媒としては、トリス（Ｔｒｉｓ）、リン酸塩、炭酸塩、酢酸塩等の緩衝液を用いることができ、例えば、１ｍＭ〜０．５Ｍ、より好ましくは１０ｍＭ〜１００ｍＭのリン酸緩衝液が挙げられる。ｐＨは、結合反応が進行する限り限定しないが、好ましくはｐＨ６〜１１、より好ましくはｐＨ７〜９である。反応時間は、例えば、２５〜６０℃で１時間以上、好ましくは３０〜４０℃で５〜４０時間である。得られた結合体は、最終的にはカラムによる分離精製、透析などの一般的なタンパク質の分離精製方法を単独であるいは組み合わせて採用して抗原として用いることができる。
【００３５】
効率的に結合体を得るには、カルボキシル基付加体をＥＤＣなどの水溶性カルボジイミドと反応させた後、さらにｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイミド）と反応させてアミン反応性スルホ−ＮＨＳエステルとした上で、スルホ−ＮＨＳエステルとキャリアタンパク質と反応させることができる。この場合、スルホ−ＮＨＳエステルを得るための反応溶媒としては、水と混和可能な有機溶媒であれば特に限定されないが、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）及びエタノールを単独であるいは組み合わせて用いることができる。反応条件は、２０〜６０℃で５〜４０時間、好ましくは、２０〜４０℃で２０〜３０時間程度である。次に、スルホ−ＮＨＳエステルを含む反応液を次いでキャリアタンパク質溶液と混合して結合反応を進行させる。キャリアタンパク質を溶解する溶液としては、既に説明した結合反応のための溶媒を好ましく用いることができ、ｐＨも同様である。また、反応時間は、１時間以上、好ましくは２〜１０時間程度とすることができる。
【００３６】
また、この他、キャリアタンパク質とマーカー化合物とを、グルタルアルデヒド等のジアルデヒドや、ヘキサメチレンジイソシアネート等のジイソシアネートとによって反応させてもよい。
【００３７】
（２）抗体の作製
こうして調製した抗原で温血動物を免疫し、最終的に、目的とする抗体を産生するハイブリドーマをスクリーニングし、このハイブリドーマの産生する抗体を精製することにより本発明の抗体を得ることができる。温血動物としては、特に、限定しないで、マウス、ハムスター、ラット、モルモット、ウサギ、イヌ、ニワトリ等を用いることができる。ハイブリドーマとして用いる細胞が限定されている場合、当該ミエローマの由来動物と同一の動物を用いることが好ましく、通常用いられるミエローマはマウス由来であることから、温血動物としてはマウスを用いることが好ましい。
【００３８】
抗原で温血動物を免疫するには、従来公知の方法を採用できる。例えば、抗原を、温血動物に対して皮下注射、皮内注射、腹膜腔内注射、静脈内注射、筋肉内注射等から選択される１又は２以上の投与経路で、７〜３０日、好ましくは１２〜１６日間間隔で合計２〜１０回程度投与する。
【００３９】
なお、抗原は適当な緩衝液、例えばフロイントの完全アジュバント、フロイントの不完全アジュバント、水酸化アルミニウム等の通常用いられるアジュバントの１種を含有するリン酸緩衝液、生理食塩水等に溶解して用いることができるが、こうしたアジュバントを必ずしも使用する必要はない。ここで、アジュバントとは抗原と共に投与したとき、非特異的に抗原に対する免疫反応を増強する物質を意味する。
【００４０】
抗原を免疫した温血動物を７〜３０日間処置せずに放置した後、該温血動物の血清を少量採取し、抗体価を測定する。抗体価の上昇に応じて、抗原の追加投与を適当回数行うこともできる。例えば、０．０１〜１ｍｇ、特に、０．０５〜０．５ｍｇの投与量で１回もしくは２回の追加投与が行われる。なお、抗体価の測定方法としては、酵素免疫測定法、ウエスタンブロット法、凝集法、一元放射状免疫拡散法等から選ばれた測定法を用いることができるが、酵素免疫測定法が好ましい。
【００４１】
抗体価が認められた温血合物への最後の投与の１〜３０日後、特に好ましくは１〜７日後に免疫した温血動物から脾臓又はリンパ節を摘出し、この組織から抗体産生細胞を採取し、継代培養可能な骨髄腫由来細胞（ミエローマ）と融合させることにより、抗体産生ハイブリドーマを得ることができる。
【００４２】
ハイブリドーマは、例えば、「単クローン抗体実験操作入門」（講談社サイエンティフィック安藤民衛ら １９９１）等に記載されている方法を用いることができる。すなわち、抗体産生細胞とミエローマとを融合させる。誘導促進剤としては、センダイウイルスやポリエチレングリコールが用いられる。ミエローマとしては、抗体産生細胞の由来動物と同一の動物とすることが好ましい。
【００４３】
実際に用いられる細胞融合の方法としては、公知の技術（Ｊ ＩｍｍｕｎｏｌＭｅｔｈｏｄ ３９：２８５−３０８，１９８０）を用いることができる。例えば、免疫されたマウスから得られた脾臓細胞等とマウスミエローマ細胞をポリエチレングリコール存在下で融合を行い、ハイブリッド細胞のみが生育可能であるＨＡＴ培地（ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン添加培地）により選択的にハイブリッド細胞を増殖させ、ハイブリッド細胞がコロニーを形成した後、培養上清中の抗体をスクリーニングすることで目的の抗体を産生するハイブリドーマを得ることができる。本発明によれば、こうした抗体を産生するハイブリドーマも提供される。
【００４４】
抗体産生ハイブリドーマのスクリーニング方法としては、種々の方法が採用できる。抗体価の測定には、例えば、上記した抗体価の測定と同様の方法を採用できる。好ましくは酵素免疫測定法である。具体的には、マーカー化合物を直接あるいは担体とともに吸着させた固相（例、マイクロプレート）にハイブリドーマ培養上清を添加し、次に放射性物質や酵素などで標識した抗免疫グロブリン抗体（細胞融合に用いられる細胞がマウスの場合、抗マウス免疫グロブリン抗体が用いられる）またはプロテインＡを加え、固相に結合したモノクローナル抗体を検出する方法、抗免疫グロブリン抗体またはプロテインＡを吸着させた固相にハイブリドーマ培養上清を添加し、放射性物質や酵素などで標識したマーカー化合物を加え、固相に結合したモノクローナル抗体を検出する方法などがあげられる。また、限界希釈法を繰り返すことにより、本発明の抗体を産生する単一のハイブリドーマを得ることができる。
【００４５】
こうしてスクリーニングされたハイブリドーマを、モノクローナル抗体を産生する環境下（温血動物の生体外又は生体内）で培養して、体液又は培養液から抗体を採取することにより、本発明の抗体を製造することができる。本発明の抗体は、通常のポリクローナル抗体の分離精製と同様に行うことができる。すなわち、免疫グロブリンの分離精製法、例えば、塩析法、アルコール沈澱法、等電点沈澱法、電気泳動法、イオン交換体（例、DEAE）による吸脱着法、超遠心法、ゲルろ過法、抗原結合固相あるいはプロテインＡあるいはプロテインＧなどの活性吸着剤により抗体のみを採取し、結合を解離させて抗体を得る特異的精製法などに従って行われる。
【００４６】
なお、マーカー化合物に対する高い反応特異性を有する抗体を産生するハイブリドーマをスクリーニングするには、間接競合ＥＬＩＳＡ又は直接競合ＥＬＩＳＡによってマーカー化合物に対する特異性と類似化合物に対する交差反応性を調べることが好ましい。
【００４７】
本発明のモノクローナル抗体はヒトのマーカー化合物Ｉ〜ＩＶの検出だけでなく、ヒト以外の異種の温血動物、例えばマウス、ハムスター、ラット、モルモット、ウサギ、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ニワトリ等の生体中に存在するマーカー化合物Ｉ〜ＩＶの検出にも応用することができる。
【００４８】
抗体を用いたマーカー化合物の測定方法としては、通常の抗原−抗体反応を利用する方法であれば特に制限されず、放射性同位元素免疫測定法（ＲＩＡ）、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）、免疫組織化学法、蛍光もしくは発光測定法、凝集法、イムノブロット法、イムノクロマト法等（Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．， ９２， １４７−５２３（１９８３）， Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ｖｏｌ．ＩＩ ＩＲＬ ＰｒｅｓｓＯｘｆｏｒｄ （１９８９）） が挙げられるが、感度や簡便性等の点からＥＬＩＳＡが好ましい。ＥＬＩＳＡに用いる酵素としては、ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ等が挙げられる。
【００４９】
ＥＬＩＳＡによる測定法は、間接競合ＥＬＩＳＡまたは直接競合ＥＬＩＳＡなどがあげられる。例えば、間接競合ＥＬＩＳＡは、以下のような手順により行うことができる。
【００５０】
（１）固相化用抗原である上記抗原化合物を担体に固相化する。用いる担体は、９６穴、４８穴、１９２穴等のマイクロタイタープレートを用いることができる。固相化は、例えば、固相化用抗原を含む緩衝液を担体上に載せ、インキュベーションすればよい。緩衝液中の抗原の濃度は、通常０．０１μｇ／ｍｌから１００μｇ／ｍｌ程度である。緩衝液としては、検出手段に応じて公知のものを使用することができる。
【００５１】
（２）担体の固相表面へのタンパク質の非特異的吸着を防止するため、固相化用抗原が吸着していない固相表面部分を、抗原と無関係なタンパク質等によりブロッキングする。ブロッキング剤としては、ＢＳＡもしくはスキムミルク溶液、または市販のブロックエース（大日本製薬社製）等を使用することができる。ブロッキングは、前記ブロッキング剤を担体に添加し、例えば、約４℃で一晩インキュベーションした後、洗浄液で洗浄することにより行われる。洗浄液としては特に制限はないが、前記（１）と同じ緩衝液を使用することができる。
【００５２】
（３）前記（１）および（２）で処理された固相表面に各種濃度の抗原用化合物を含む被験試料および本発明の抗体溶液を加え、該抗体を前記固相化抗原および被験試料中のマーカー化合物に競合的に反応させて、固相化抗原−抗体複合体およびマーカー化合物−抗体複合体を生成させる。反応は、１０℃〜４０℃、好ましくは２５℃〜３７℃で０．５〜数時間程度で行うことができる。
【００５３】
（４）固相化抗原−抗体複合体の量を測定することにより、予め作成した検量線から試料中のマーカー化合物量を決定することができる。固相化抗原−抗体複合体の量は、酵素標識した二次抗体（本発明の抗体を認識する抗体）を添加して測定することができる。例えば本発明の抗体としてマウスモノクローナル抗体を用いる場合、酵素標識（例えば、ペルオキシダーゼまたはアルカリホスファターゼ等）した抗マウス−ヤギ抗体を用いて、担体に結合した本発明の抗体と反応させるのが望ましい。反応は、前記（３）と同様の条件下で行えばよい。反応後、緩衝液で洗浄する。
【００５４】
（５）担体に結合した二次抗体の標識酵素と反応する発色基質溶液を加え、吸光度を測定することによって検量線からマーカー化合物の量を算出することができる。二次抗体に結合する酵素としてペルオキシダーゼを使用する場合には、例えば、過酸化水素と、３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジンまたはｏ−フェニレンジアミンを含む発色基質溶液を使用することができる。通常、発色基質溶液を加えて室温で約１０分程度反応させた後、硫酸を加えることにより酵素反応を停止させる。３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジンを使用する場合、４５０ｎｍの吸光度を測定する。ｏ−フェニレンジアミンを使用する場合、４９２ｎｍの吸光度を測定する。なお、バックグランド値を補正するため、６３０ｎｍの吸光度も同時に測定することが望ましい。二次抗体に結合する酵素としてアルカリホスファターゼを使用する場合には、例えばｐ−ニトロフェニルリン酸を基質として発色させ、ＮａＯＨ溶液を加えて酵素反応を止め、４１５ｎｍでの吸光度を測定する方法があげられる。
【００５５】
マーカー化合物を添加しない反応溶液の吸光度に対して、マーカー化合物を添加して抗体と反応させた溶液の吸光度の減少率を阻害率として計算する。既知の濃度のアラクロールを添加した反応液の阻害率により予め作成しておいた検量線を用いて、試料中のマーカー化合物濃度を算出することができる。
【００５６】
また、マーカー化合物は、以下のようにして直接競合ＥＬＩＳＡにより測定できる。すなわち、固相化抗原に替えて、本発明の抗体を担体に固相化し、被験試料と混合する抗体に替えてマーカー化合物と酵素を結合させた酵素結合ハプテンを用い、二次抗体を用いないで固相化抗体と結合しなかった酵素結合ハプテンを除去した上、固相化抗体−酵素結合ハプテン複合体の量を間接競合ＥＬＩＳＡと同様の方法により発色させて吸光度を測定することにより、予め作成した検量線から被験試料中のマーカー化合物の量を決定することができる。
【００５７】
なお、本発明の測定方法においては、被験試料に応じた前処理をして試料とした後、間接競合ＥＬＩＳＡ、直接競合ＥＬＩＳＡやその他の測定方法に供せられる。
【００５８】
以上説明したように、被験試料中のこうしたマーカー化合物の量を測定することにより、ＤＨＡ及び／又はＡＡの酸化程度や含有量の低下、ドーパミン含有量の低下など神経細胞における各種の酸化的損傷状態を検出することができる。したがって、本発明の検査方法を利用することで、神経細胞の老化程度の検査方法、診断用途、有用な薬剤や食品などのスクリーニング方法が提供される。
【００５９】
（神経細胞の老化程度の検査方法等）
例えば、本検査方法における本測定工程と、本測定工程の測定結果に基づいて動物の神経細胞の老化程度を判定する判定工程と、を備える検査方法が提供される。本発明者らによれば、こうした神経細胞における各種態様の酸化的損傷の程度（マーカー化合物の量）は神経細胞の老化程度に関連していると考えられる。すなわち、マーカー化合物の量が多ければより老化が進行しているといえるからである。老化程度の判定にあたっては、例えば、ヒトなど被験動物の年齢若しくは年代とマーカー量との関係を予め取得しておき、被験試料から検出されたマーカー化合物量と被験動物の年齢に相当するマーカー化合物量とを対比することで老化がより進行しているか、あるいは老化の進行が遅いかを判定できる。また、例えば、被験動物について定期的にマーカー化合物量を測定することで、神経細胞において老化の進行があったかどうか等を判定できる。さらに、被験動物個体の神経細胞の老化程度を判定することにより、酸化的損傷の生じている生理的状態を改善し又は予防するアンチエージング的な措置や治療が可能となる。
【００６０】
また、本測定工程と、動物における神経細胞の酸化的損傷が関連する疾患の発症リスク、前記疾患に罹患しているかどうか及び前記疾患の進行程度のいずれかを診断する診断工程と、を備える診断方法が提供される。本発明者らによれば、こうした神経細胞における各種態様の酸化的損傷の程度（マーカー化合物の量）は、これらの損傷が関連する疾患、換言すれば、マーカー化合物が関連する疾患の発症や進行に関連していると考えられる。すなわち、マーカー化合物の量が多ければ、発症リスクが高いか、既に罹患しているか、あるいは疾患がかなり進行しているということができる。こうした疾患としては、神経変性疾患が挙げられ、例えば、アルツハイマー病、ピック病、パーキンソン症候群（パーキンソン病、症候性パーキンソニズム）、進行性核上性麻痺、ハンチントン舞踏病、シドナム舞踏病、多系統萎縮症、遺伝性脊髄小脳変性疾患、皮質性小脳萎縮症、晩発性皮質性小脳I縮小などの脊髄小脳変性症、筋萎縮性側索硬化症、進行性球麻痺、脊髄性筋萎縮症、亜急性連合性脊髄変性症、球脊髄性筋萎縮症などが挙げられる。なかでも、アルツハイマー病やパーキンソン症候群が挙げられる。
【００６１】
疾患の発症リスク、疾患診断及び病状の進行程度の診断にあたっては、例えば、ヒトなどにおいて、疾患の有無（正常人と疾患罹患者）とマーカー化合物量との関係、年代（年齢）とマーカー化合物量との関係、性差とマーカー化合物量との関係、疾患の進行程度（軽症、中程度、重症）とマーカー化合物量との関係等を予め取得しておき、被験試料から検出されたマーカー化合物量と被験動物の年齢、症状の有無、性差、進行程度等を考慮して対比すべきマーカー化合物量を選択し、対比することで発症リスク、疾患の有無、病状の進行程度を診断できる。また、例えば、被験者について定期的にマーカー化合物量を測定することで、発症リスク、発症、病状の進行に変化があったかどうか等を診断することができる。
【００６２】
（スクリーニング方法）
本発明の神経細胞における酸化的損傷を抑制又は促進する化合物のスクリーニング方法は、非ヒト動物に１種又は２種以上の試験化合物を投与する工程と、前記試験化合物を投与した前記非ヒト動物から採取される被験試料中のマーカー化合物Ｉ〜ＩＶから選択されるいずれかの化合物の量を測定する工程と、を備えている。このスクリーニング方法によれば、非ヒト動物に試験化合物を投与したとき、マーカー化合物Ｉ〜ＩＶ量の増大又は減少を検出することができる。このため、試験化合物が神経細胞の酸化的損傷を促進するのか抑制するのかを評価することができる。この結果、本発明のスクリーニング方法によれば、神経細胞の酸化的損傷に調節（抑制又は促進）する化合物をスクリーニングすることができる。
【００６３】
特に、本スクリーニング方法によって得られる神経細胞の酸化的損傷を抑制する化合物は、マーカー化合物Ｉ〜ＩＶが関連する疾患又は神経細胞の酸化的損傷が関連する疾患の予防用又は治療用の薬剤として用いることができる。
【００６４】
また、本発明の神経細胞における酸化的損傷を抑制する食品のスクリーニング方法であって、非ヒト動物に１種又は２種以上の食品を投与する工程と、前記試験化合物を投与した前記非ヒト動物から採取される被験試料中のマーカー化合物Ｉ〜ＩＶから選択されるいずれかの化合物の量を測定する工程と、を備えている。このスクリーニング方法によれば、非ヒト動物に食品を投与したとき、マーカー化合物Ｉ〜ＩＶの量の増大又は減少を検出して、投与した食品が神経細胞の酸化的損傷を促進するのか抑制するのかを評価できる。この結果、神経細胞の酸化的損傷を抑制できる食品をスクリーニングすることができる。こうした食品は、神経細胞の酸化的損傷によって引き起こされる生理的状態や疾患を予防し改善する食品として提供される。
【００６５】
なお、こうしたスクリーニング方法においては、神経細胞の酸化的損傷を抑制する化合物や食品のスクリーニングには、非ヒト動物として、神経細胞の酸化的損傷が促進された非ヒト動物を用いることが好ましい。こうした非ヒト動物は、遺伝子工学的な改変、人為的な交配又は突然変異体からの探索などにより取得することができる。典型的には、アルツハイマーモデルマウスやパーキンソンモデルマウス等が挙げられる。
【００６６】
（測定キット）
本発明の測定キットは、本発明のマーカー化合物を特異的に認識する抗体を含んでいる。このため、被験試料中のマーカー化合物を簡便に測定することができる。本測定キットは、さらに、測定法に応じて、標識された二次抗体もしくは標識されたマーカー化合物ハプテン（抗原）、緩衝液、検出試薬および／またはマーカー化合物標準溶液等を含む。好ましいキットは、ＥＬＩＳＡ法に用いられうるものであり、固相化抗原を保持する担体、本発明の抗体、酵素標識された二次抗体および検出試薬などを含むことができる。
【００６７】
本発明の抗体が特異的に認識するマーカー化合物は、ＡＡやＤＨＡの過酸化物であるヒドロペルオキシドとドーパミンとの反応により生成されるものであるので、本測定キットによれば、被験試料中のマーカー化合物を測定することで被験試料の採取部位又は採取個体における神経細胞の酸化的損傷及びその程度を検出することができる。
【００６８】
（固定化体）
本発明の固定化体は、固相担体と、該固相担体に固定化される本発明の抗体とを備えている。固相担体は、基板状、ビーズ状等特に形態を限定しないし、その材質も、ガラス、セラミックス、プラスチック、金属など従来公知の材料を用いることができる。さらに、多孔質であっても緻密質であってもよい。本発明の抗体の固相担体への固定化形態は特に限定しないで共有結合、静電的結合など、抗体などのタンパク質を固相に保持できる従来公知の手法で固定化されていればよい。本発明の固定化体は、本発明の抗体を、基板状の固相担体上に他の抗体とともに予め位置情報を伴って固定化されていることが好ましい。こうした本発明の固定化体は、複数個の抗体が一つの基板状の固相担体に固定化された抗体チップの形態を採ることができる。
【実施例】
【００６９】
以下、本発明の具体例を実施例として説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
（実施例１）
本実施例は、本発明のマーカー化合物であるヘキサノイルドーパミン（ＨＥＤ：下式（６））、グルタロイルドーパミン（ＧＬＤ：下式（７））、プロパノイルドーパミン（ＰＲＤ：下式（８））及びスクシニルドーパミン（ＳＵＤ：下式（９））をそれぞれ合成した。
【化１３】
【化１４】
【化１５】
【化１６】
【００７０】
（１）ＨＥＤ
ドーパミン６３．９ｍｇ（０．３３７ｍｍｏｌ）と無水ヘキサノイル酸７２．３ｍｇ（０．３３７ｍｍｏｌ）をＤＭＦ・リン酸塩緩衝液（ｐＨ７．４）混液（１：１）４．４ｍｌに加えた後、スターラーを用いて室温で４時間反応させた。この反応液をＬＣ／ＭＳ／ＭＳを用いて分離し、分子量の確認を行った（ｍ／ｚ２５２．２→１３７．２）。また、１Ｈ−ＮＭＲおよび１３Ｃ−ＮＭＲを用いて構造を決定した。結果を表１に示す。
【表１】
【００７１】
（２）ＧＬＤ
ドーパミン９５ｍｇ（０．５ｍｍｏｌ）をリン酸塩緩衝液（ｐＨ７．４）・飽和酢酸ナトリウム水溶液混液（１：１）５ｍｌに加えた後、少量のピリジンに溶かした無水グルタル酸５７ｍｇ（０．５ｍｍｏｌ）を１滴／秒で加えた。そして、スターラーを用いて室温で１時間反応させた。この反応液にメタノールを加えてエヴァポレーターを用いてピリジンをとばした後、ＨＰＬＣを用いて分取した。さらに、分取物について、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳを用いて分子量の確認を行った（ｍ／ｚ２６８．２→１３７．２）。また、１Ｈ−ＮＭＲおよび１３Ｃ−ＮＭＲを用いて構造を決定した。結果を表２に示す。
【表２】
【００７２】
（３）ＰＲＤ
ドーパミン９５ｍｇ（０．５ｍｍｏｌ）をリン酸塩緩衝液（ｐＨ７．４）・飽和酢酸ナトリウム水溶液混液（１：１）５ｍｌに加えた後、少量のピリジンに溶かした無水プロピオン酸６５ｍｇ（０．５ｍｍｏｌ）を１滴／秒で加えた。そして、スターラーを用いて室温で１時間反応させた。この反応液にメタノールを加えてエヴァポレーターを用いてピリジンをとばした後、ＨＰＬＣを用いて分取した。さらに、分取物について、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳを用いて分子量の確認を行った（ｍ／ｚ２１０．１→１３７．２）。また、１Ｈ−ＮＭＲおよび１３Ｃ−ＮＭＲを用いて構造を決定した。結果を表３に示す。
【表３】
【００７３】
（４）ＳＵＤ
ドーパミン９５ｍｇ（０．５ｍｍｏｌ）をリン酸塩緩衝液（ｐＨ７．４）・飽和酢酸ナトリウム水溶液混液（１：１）５ｍｌに加えた後、少量のピリジンに溶かした無水コハク酸４９ｍｇ（０．５ｍｍｏｌ）を１滴／秒で加えた。そして、スターラーを用いて室温で１時間反応させた。この反応液にメタノールを加えてエヴァポレーターを用いてピリジンをとばした後、ＨＰＬＣを用いて分取した。さらに、分取物について、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳを用いて分子量の確認を行った（ｍ／ｚ２５４．１→１３７．２）。また、１Ｈ−ＮＭＲおよび１３Ｃ−ＮＭＲを用いて構造を決定した。結果を表４に示す。
【表４】
【００７４】
なお、これらのマーカー化合物の同定に際し、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ（Applied Biosystem API2000 HPLC-MS/MS system）の条件は以下のとおりであった。
［HED, GLDのLC-MS/MS条件］
カラム：Develosil ODS-HG-3 (2 φ×50 mm)
移動相：A；100％ H2O / 0.1％ HCOOH
B；100％CH3CN / 0.1％ HCOOH
流速 ：0.2 ml /min
イオン源：Turbo Spray Ionization positive（スプレーイオン化法）
グラジエントプログラム
【表５】
【００７５】
［PRD ,SUDのLC-MS/MS条件］
グラジエントプログラム及びフラグメント検出のための設定以外はＨＥＤ等の同定のためのＬＣ−ＭＳ／ＭＳ条件と同様とした。
グラジエントプログラム
【表６】
【００７６】
（実施例２）
(インビトロにおけるマーカー化合物の生成反応)
本実施例では、各種マーカー化合物が脂質ヒドロペルオキシドとドーパミンから生成されるかどうかをインビトロで確認した。なお、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ条件は、実施例１におけるのと同様の条件を用いた。
（１）ＨＥＤ
ＨＥＤはアラキドン酸を含むω−６系の多価不飽和脂肪酸から生成するため、ω−６系のリノール酸由来の脂質ヒドロペルオキシドである１３−ｈｙｄｒｏｐｅｒｏｘｙｏｃｔａｄｅｃａｄｉｅｎｏｉｃａｃｉｄ（１３−ＨＰＯＤＥ）を用いた。終濃度１０ｍＭ１３−ＨＰＯＤＥおよび２ｍＭドーパミンとなるようにリン酸塩緩衝液（ｐＨ７．４）中において３７℃で反応させ、−８０℃で反応停止とした。反応液について、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳを行ったところ、ＨＥＤを検出できた。
【００７７】
（２）ＧＬＤ
１００ｍＭアラキドン酸１００μｌ、リポキシゲナーゼ０．８ｍｇ、ホウ酸緩衝液（ｐＨ９．０）１１ｍｇを混合した後、酸素を吹き付けながら３０分間攪拌をした。１ＮＨＣｌを加えることによってｐＨ４．０以下にした後、クロロホルム・メタノール混液（１：１）２０ｍｌで抽出し、クロロホルム層を回収し、脱水して乾固した。これに１００μｌエタノールで再溶解し、１００ｍＭアラキドン酸ヒドロペルオキシド画分とした。
【００７８】
反応は、終濃度１０ｍＭアラキドン酸ヒドロペルオキシド画分および２ｍＭドーパミンとなるようにリン酸塩緩衝液（ｐＨ７．４）中において３７℃で反応させ、−８０℃で反応停止とした。反応液について、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳを行ったところ、ＧＬＤを検出できた。
【００７９】
(３)ＰＲＤ
反応は、終濃度１０ｍＭＤＨＡおよび２ｍＭドーパミンとなるようにリン酸塩緩衝液（ｐＨ７．４）中において３７℃で反応させ、−８０℃で反応停止とした。反応液について、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳを行ったところ、ＰＲＤを検出できた。
【００８０】
（４）ＳＵＤ
反応は、終濃度１０ｍＭＤＨＡおよび２ｍＭドーパミンとなるようにリン酸塩緩衝液（ｐＨ７．４）中において３７℃で反応させ、−８０℃で反応停止とした。反応液について、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳを行ったところ、ＳＵＤを検出できた。
【００８１】
（実施例３）
本実施例では、ラット脳中における各種マーカー化合物の存在を確認した。
（試料調製）
６週齢のｗｉｓｔｅｒ ｒａｔの雌を用いた。脳を摘出し、全脳の半分をホモジネート用とした。ホモジネート用の脳を、その湿重量に対して４倍量の抽出液（メタノール：５ｍＭＢＨＴ：２５０ｍＭＥＤＴＡ混液（体積比で９０：５：５）に加えた後、ホモジネートを行い、メタノール層を回収した。メタノールを留去して乾固させ、乾固物を再びメタノールで再溶解させた。これをＨＰＬＣによりマーカー化合物の検出時間付近を分取したのち、分取した画分を乾固して再びメタノールで再溶解させたものをＬＣ／ＭＳ／ＭＳを用いてマーカー化合物の有無を分析した。結果を図５に示す。
【００８２】
なお、分取のためのＨＰＬＣ条件は、以下の条件で行い、及びＬＣ−ＭＳ／ＭＳは、実施例１と同様の条件を採用するとともに、内部標準物質を利用して実施した。また、以下の同定に用いた内部標準物質の構造等を図６及び図７に示す。
【００８３】
[分取ＨＰＬＣ条件]
カラム：Develosil ODS-HG-5 (4.6 φ × 250 mm)
移動相：A；100% H2O / 0.01% CH3COOH
B；100% CH3CN / 0.01% CH3COOH
流速 ：0.8 ml /min
検出器（UV）：280 nm
グランジエントプログラム
【表７】
【００８４】
図５に示すように、ラット脳からはＨＥＤ、ＧＬＤ、ＰＲＤ及びＳＵＤの全てのマーカー化合物が検出された。以上のことから、これらのマーカー化合物が生体内においても生成されていることが確認できた。
【００８５】
（実施例４）
本実施例では、各種マーカー化合物のアポトーシス誘導活性について評価した。
評価には、ヒト神経芽細胞腫由来培養細胞株（ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞）を用いた。おおよそ５×１０５ｃｅｌｌｓ／ウェルになるように６ウェルフラスコに細胞を播き、一晩インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２）に入れて培養した後、それぞれのマーカー化合物を含んだ培地に交換した。それぞれの培地はマーカー化合物濃度が終濃度で１００μＭになるように調製した。２４時間後に核染色を行うことにより細胞毒性評価した。核染色にはＰｒｏｐｉｄｉｕｍＩｏｄｉｄｅ（ＰＩ）とＨｏｅｃｈｓｔ３３２５８，ｐｅｎｔａｈｙｄｒａｔｅ（ｂｉｓ−ｂｅｎｚｉｍｉｄｅ）を用いた。ＰＩでは死細胞を評価し、Ｈｏｅｃｈｓｔでは死細胞と生細胞の両方を評価した。そこで、ＰＩ／Ｈｏｅｃｈｓｔを求めることにより細胞毒性評価した。評価方法は顕微鏡で観察することにより行い、それぞれ試薬で染色させた細胞数をカウントすることで評価した。なお、ＤＭＳＯ及びＤＡをマーカー化合物に替えて添加したもの及び無添加の培地で同様に評価した。結果を図８に示す。
【００８６】
図８に示すように、ＨＥＤではＰＩ／Ｈｏｅｃｈｓｔが６０％以上であり、ＰＲＤでは３０％程度であった。
【図面の簡単な説明】
【００８７】
【図１】アラキドン酸ヒドロペルオキシドとドーパミンとの反応によるマーカー化合物Ｉ及びＩＩとの関係を示す図である。
【図２】ドコサヘキサエン酸ヒドロペルオキシドとドーパミンとの反応によるマーカー化合物ＩＩＩ及びＩＶとの関係を示す図である。
【図３】式（２）で表されるカルボキシル付加体から式（４）で表される抗原用化合物を得るスキームを示す図である。
【図４】式（３）で表されるカルボキシル付加体から式（５）で表される抗原用化合物を得るスキームを示す図である。
【図５】合成ラット脳中におけるマーカー化合物を検出したＬＣ／ＭＳ／ＭＳチャートを示す図である。
【図６】ＨＥＤ及びＧＬＤに対する内部標準物質を示す図である。
【図７】ＰＲＤ及びＳＵＤに対する内部標準物質を示す図である。
【図８】マーカー化合物のアポトーシス誘導活性を評価したグラフ図である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、神経細胞における酸化的損傷の程度を検出することのできるマーカー及びその利用に関し、詳しくは、該マーカーを特異的に認識する抗体、測定キット、酸化的損傷の測定方法、炎症反応に関連する化合物のスクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
アルツハイマーやパーキンソン病などの神経変性疾患についてはその病因は明らかになっているわけではない。一方、こうした神経変性疾患に係る神経細胞の有する種々の異常について報告がなされている。例えば、アルツハイマー病患者の脳内ＤＨＡ含有量は正常人の２分の１まで減少していることが報告されている（非特許文献１）。また、ドーパミンは、アミノ基を有するカテコールアミン系神経伝達物質であり、ドーパミンの減少がパーキンソン病のような神経変性疾患と深く関与していることも報告されている（非特許文献２）。
【０００３】
ここに、ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）やアラキドン酸（ＡＡ）は、生体内において、大脳や網膜などの神経組織や母乳などに多く含まれ、様々な生理活性を示すことが知られている。また、これらの脂肪酸は、二重結合を多く有する多価不飽和脂肪酸であるため、生体内で酸化されて脂質ペルオキシドを生成する可能性があることも知られている（非特許文献３）。
【非特許文献１】Lipids 26, 421(1991)
【非特許文献２】J. Med. Chem. 1997,40,2211-2216
【非特許文献３】「現代の食品化学」三共出版 並木満夫
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかしながら、ＤＨＡやＡＡとドーパミンとの関係、さらには神経変性疾患との関係については何ら検討もされておらず、報告もなされていない。
【０００５】
そこで、本発明は、ＤＨＡやＡＡなどの高度不飽和脂肪酸から生成する脂質ヒドロペルオキシドによる神経細胞の酸化的損傷を検出するのに適したマーカー、当該マーカーを利用した前記損傷の測定方法、当該マーカーに特異的な抗体及び当該マーカーを利用したスクリーニング方法を提供することを一つの目的とする。また、本発明は、神経変性疾患の発症予測、神経変性疾患に罹患しているかどうかの診断、神経変性疾患の進行程度など予防、治療、診断等に有効なマーカー、当該マーカーを利用した神経変性疾患の発症診断、疾患診断等の診断方法、当該マーカーに特異的な抗体及び当該マーカーを利用したスクリーニング方法を提供することを他の一つの目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、神経細胞の酸化的損傷を検出するのに有用なマーカー及び該マーカーを利用した検査方法等に関している。本発明者らは、脳内に多量に存在するＤＨＡやＡＡなどの多価不飽和脂肪酸とドーパミンとに着目した。そして、生体内における酸化ストレスによって、これらの多価賦飽和脂肪酸から生成される脂質ヒドロペプチドルオキシドが、脳内のドーパミン量の低下に関連があることを見出した。さらに、本発明者らは、これらの脂質ヒドロペルオキシド又はその分解物がドーパミンと反応して生成するドーパミンの修飾体の量を測定することで、脳内のＤＨＡ若しくはＡＡ又はドーパミンの濃度低下を容易に検出することができ、神経細胞の酸化的損傷の程度や神経変性疾患の診断やその前段階状態にあるかどうかの診断のための有用なマーカーとなりえることを見出した。すなわち、本発明によれば、以下の手段が提供される。
【０００７】
本発明の一つの形態によれば、以下の式（１）で表される、神経細胞における酸化的損傷マーカー化合物が提供される。
【化７】
（式（１）中、Ｒは、ヘキサノイル基、グルタロイル基、プロパノイル基又はスクシニル基を表す。）
【０００８】
このマーカー化合物においては、前記式（１）中、Ｒは、ヘキサノイル基又はグルタロイル基で表すことができ、また、前記式（１）中、Ｒは、プロパノイル基又はスクシニル基で表していてもよい。さらに、前記式（１）中、Ｒはヘキサノイル基又はプロパノイル基で表されることが好ましい。
【０００９】
本発明の一つの形態によれば、神経細胞における酸化的損傷の検査方法であって、動物から採取される被験試料中の請求項１〜４のいずれかに記載の酸化的損傷マーカー化合物の量を測定する工程を備える、検査方法が提供される。
【００１０】
前記測定工程における前記被験試料は、脊髄液又は脳髄液であることが好ましい。また、前記測定工程は、前記酸化的損傷マーカー化合物を特異的に認識する抗体を用いる工程であることが好ましい。さらに、前記測定工程は、ＥＬＩＳＡ法によって実施することが好ましい。
【００１１】
本発明の一つの形態によれば、神経細胞の老化程度の検査方法であって、動物から採取される被験試料中の請求項１〜４のいずれかに記載の酸化的損傷マーカー化合物の量を測定する工程と、前記測定工程の測定結果に基づいて前記動物の神経細胞の老化程度を判定する工程を備える、検査方法が提供される。
【００１２】
本発明の一つの形態によれば、神経細胞の酸化的損傷に関連する疾患に関する診断方法であって、動物から採取される被験試料中の請求項１〜４のいずれかに記載の酸化的損傷マーカー化合物の量を測定する工程と、前記測定工程の測定結果に基づいて前記動物の前記疾患の発症リスク、前記疾患に罹患しているかどうかの診断及び前記疾患の進行程度のいずれかを診断する診断工程と、を備える、診断方法が提供される。この診断方法において、前記疾患は、神経変性疾患とすることができる。
【００１３】
本発明の一つの形態によれば、以下の式（１）で表される化合物から選択されるいずれかの化合物を特異的に認識する抗体が提供される。
【化８】
（式（１）中、Ｒは、ヘキサノイル基、グルタロイル基、プロパノイル基又はスクシニル基を表す。）
【００１４】
本発明の一つの形態によれば、以下の式（２）及び（３）で表される化合物から選択される、上記抗体を作製するための化合物が提供される。
【化９】
（式（２）中、Ｒは、ヘキサノイル基、グルタロイル基、プロパノイル基又はスクシニル基を表す。）
【化１０】
（式（３）中、Ｒは、ヘキサノイル基、グルタロイル基、プロパノイル基又はスクシニル基を表す。）
【００１５】
本発明の一つの形態によれば、以下の式（４）及び（５）で表される化合物から選択される、請求項１２に記載の抗体を作製するための抗原用化合物が提供される。
【化１１】
（式（４）中、Ｒは、ヘキサノイル基、グルタロイル基、プロパノイル基又はスクシニル基を表し、Ｘはキャリアタンパク質から一アミノ基を除いた残部を表す。）
【化１２】
（式（５）中、Ｒは、ヘキサノイル基、グルタロイル基、プロパノイル基又はスクシニル基を表し、Ｘはキャリアタンパク質から一アミノ基を除いた残部を表す。）
【００１６】
本発明の一つの形態によれば、神経細胞における酸化的損傷を抑制する化合物のスクリーニング方法であって、非ヒト動物に１種又は２種以上の試験化合物を投与する工程と、前記試験化合物を投与した前記非ヒト動物から採取される被験試料中の上記いずれかの神経細胞の酸化的損傷マーカー化合物の量を測定する工程と、を備える、スクリーニング方法が提供される。
【００１７】
本発明の一つの形態によれば、神経細胞における酸化的損傷を抑制する食品のスクリーニング方法であって、非ヒト動物に１種又は２種以上の食品を投与する工程と、前記食品を投与した前記非ヒト動物から採取される被験試料中の上記いずれかの神経細胞の酸化的損傷マーカー化合物の量を測定する工程と、を備える、スクリーニング方法が提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
以下、本発明の一つの実施形態である神経細胞の酸化的損傷のマーカー化合物、上記式（１）で表される化合物である。このマーカー化合物は、脳などの脂肪酸組成において主要な脂肪酸の一つであるＡＡやＤＨＡのヒドロペルオキシドとドーパミンとの反応生成物である。このため、神経細胞の酸化的損傷を検出するための有効なマーカー化合物である。以下、本発明の一つの形態である酸化的損傷マーカー化合物について説明するとともに、他の実施形態である神経細胞の酸化的損傷の検査方法、マーカーを特異的に認識する抗体、測定キット、神経細胞の老化程度の検査方法、神経細胞の酸化的損傷が関連する疾患の各種診断方法、スクリーニング方法等について説明する。
【００１９】
（神経細胞の酸化的損傷マーカー化合物）
本発明の神経細胞の酸化的損傷マーカー化合物は、上記式（１）で表される。上記式（１）中、Ｒがヘキサノイル基であるマーカー化合物Ｉ及びＲがグルタロイル基であるマーカー化合物ＩＩは、いずれもＡＡ由来のヒドロペルオキシドとドーパミンとの反応生成物であると考えられる。アラキドン酸とこれらの化合物Ｉ、ＩＩとの関係を図１に示す。マーカー化合物Ｉは、ＡＡの非カルボキシ末端由来であり、マーカー化合物ＩＩは、ＡＡのカルボキシル末端由来であると考えられる。これらのマーカー化合物Ｉ、ＩＩはＡＡの酸化、ＡＡ含有量の低下、ＡＡによるドーパミン含有量の低下など、神経細胞におけるＡＡに関連する各種の酸化的損傷を検出するのに有用である。
【００２０】
また、式（１）中、Ｒがプロパノイル基であるマーカー化合物ＩＩＩ及びＲがスクシニル基であるマーカー化合物ＩＶは、いずれもＤＨＡ由来のヒドロペルオキシドとドーパミンとの反応生成物と考えられる。ＤＨＡとこれらの化合物ＩＩＩ、ＩＶとの関係を図２に示す。マーカー化合物ＩＩＩは、ＤＨＡの非カルボキシ末端由来であり、マーカー化合物ＩＶは、ＤＨＡのカルボキシル末端由来であると考えられる。これらのマーカー化合物ＩＩＩ、ＩＶはＤＨＡの酸化、ＤＨＡ含有量の低下、ＤＨＡによるドーパミン含有量の低下など、神経細胞におけるＤＨＡに関連する各種の酸化的損傷を検出するのに有用である。
【００２１】
これらのなかでも、マーカー化合物Ｉ及びＩＩＩが、アポトーシス誘導能が高いためマーカー化合物として有用である。
【００２２】
マーカー化合物Ｉは、例えば、等モル量のドーパミンと無水ヘキサノイル酸とを、リン酸塩緩衝液（ｐＨ７．４）とＤＭＦとの混液（１：１）に溶解して、室温で４時間程度反応させることにより得ることができる。また、マーカー化合物ＩＩは、例えば、等モル量のドーパミンと無水グルタル酸とをリン酸塩緩衝液（ｐＨ７．４）と飽和酢酸ナトリウム溶液との混液（１：１）に溶解して、室温で１時間程度反応させることにより得ることができる。マーカー化合物ＩＩＩは、例えば、等モル量のドーパミンと無水プロピオン酸とを、リン酸塩緩衝液（ｐＨ７．４）と飽和酢酸ナトリウム溶液との混液（１：１）に溶解して、室温で１時間程度反応させることにより得ることができる。また、マーカー化合物ＩＶは、例えば、等モル量のドーパミンと無水スクシニル酸とをリン酸塩緩衝液（ｐＨ７．４）と飽和酢酸ナトリウム溶液との混液（１：１）に溶解して、室温で１時間程度反応させることにより得ることができる。
【００２３】
本発明のマーカー化合物は、神経細胞の酸化的損傷に関連する研究用途、検査用途、診断用途、有用な薬剤や食品などのスクリーニング用途に用いることができる。
【００２４】
（神経細胞の酸化的損傷の検査方法）
本発明の検査方法は、動物から採取される被験試料を検査対象としている。本明細書において、動物とは、ヒトの他、ヒト以外の異種の温血動物が挙げられ、例えば、マウス、ハムスター、ラット、モルモット、ウサギ、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ニワトリが挙げられる。また、被験試料は、動物から採取される血液、血漿、血清、尿、脊髄液、脳髄液などの液体試料が挙げられるが、好ましくは、脊髄液、脳髄液である。また、被験試料としては、動物の神経組織等から採取される細胞や組織等の固形試料が挙げられる。細胞や組織などの固形試料に対しては免疫組織化学染色法により、細胞内又は組織におけるドーパミン修飾体の局在を検出することができる。組織やこうした被験試料は、その種類及び必要に応じて適宜前処理がなされる。
【００２５】
本検査方法では、被験試料中の本発明の酸化的損傷マーカー化合物を測定する工程を備えている。本測定工程におけるマーカー化合物の量の測定方法は特に限定されないが、被験試料が生体試料であることを考慮すると、被験試料の夾雑物からこれらのマーカー化合物を分離した上で検出（同定）することが好ましい。こうした分析方法としては、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）などの各種液体クロマトグラフィー（ＬＣ）を用いることができる。また、液体クロマトグラフィーと質量分析法を組み合わせたＬＣ／ＭＳやＬＣ／ＭＳ／ＭＳなども用いることができる。
【００２６】
また、マーカー化合物を特異的に認識する抗体、好ましくはモノクローナル抗体を用いて、マーカー化合物の量を測定することもできる。
【００２７】
（マーカー化合物を特異的に認識する抗体）
本発明の抗体は、上記式（１）で表されるマーカー化合物Ｉ〜ＩＶから選択されるいずれかのマーカー化合物を特異的に認識する抗体である。本発明の抗体は、ポリクローナル抗体であってもよいが、モノクローナル抗体であることが好ましい。
【００２８】
（抗体の作製）
こうしたマーカー化合物に対する抗体作製方法について説明する。
（１）抗原の調製
本発明の抗体を作製するための抗原としては、マーカー化合物とタンパク質などの適当なキャリアとを結合させた結合体を用いることが好ましい。キャリアタンパク質としては、従来公知のキャリアタンパク質が用いられるが、なかでもウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、卵白アルブミン、リポプロテイン、ヘモシアニンなどが好ましく用いられる。より好ましくは、カギアナカサガイのヘモシアニン（ＫＬＨ）である。こうしたキャリアタンパク質は、商業的に容易に入手可能である。なお、キャリアとしては、ポリアミノ酸、ポリスチレン、ポリアクリル酸、ポリビニルなどの重合体又は共重合体等の合成高分子を用いることができる。
【００２９】
マーカー化合物とキャリアタンパク質との結合体を得る方法としては、特に限定しないが、適当な溶媒中で、マーカー化合物にカルボキシル基を導入したカルボキシル付加体とキャリアタンパク質とを適当な架橋剤の存在下で反応させて酸アミド結合を形成させる方法が挙げられる。カルボキシル付加体としては、マーカー化合物Ｉ〜ＩＶの芳香環の５位の炭素原子にシステインを導入して得られる上記式（２）で表される化合物が挙げられる。また、式（３）で表される化合物が挙げられる。なお、式（２）及び式（３）におけるＲは、ヘキサノイル基、グルタロイル基、プロパノイル基及びスクシニル基のいずれかを表しており、それぞれマーカー化合物Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ及びＩＶに対応している。
【００３０】
上記式（２）で表されるカルボキシル付加体は、例えば、図３に示すように、酢酸アンモニウム緩衝液（０．１Ｍ、ｐＨ５．８）中、１００ｍＭのマーカー化合物、１００ｍＭのシステインと１ｍｇ／ｍｌのチロシナーゼを室温で７時間程度反応させることにより得ることができる。このカルボキシル付加体のシステインのカルボキシル基にキャリアタンパク質のアミノ基との酸アミド結合の結合を介してキャリアタンパク質と結合させることで式（４）で表される抗原用化合物を得ることができる。
【００３１】
また、上記式（３）で表されるカルボキシル付加体は、例えば、図４に示すように、３，４−ジヒドロキシ−Ｌ−フェニルアラニンを出発物質として、マーカー化合物を合成するときと同様にして修飾体を合成することで得ることができる。このカルボキシル付加体のフェニルアラニン由来のカルボキシル基とキャリアタンパク質とのアミノ基とから酸アミド結合を形成してキャリアタンパク質と結合させることで上記式（５）で表される抗原用化合物を得ることができる。
【００３２】
なお、グルタロイル基及びスクシニル基を有するマーカー化合物についてのカルボキシル付加体については、予めこれらのカルボキシル基をメチルエステル化などして保護しておき、その後ドーパミンと反応させ、さらにタンパク質を導入させた後、水酸化ナトリウムなどによって加水分解してカルボキシル基に戻すようにすることが好ましい。
【００３３】
式（４）及び式（５）におけるＲは、ヘキサノイル基、グルタロイル基、プロパノイル基及びスクシニル基のいずれかを表しており、Ｘは、キャリアタンパク質から一アミノ基を除いた残部を表す。なお、該アミノ基は、カルボキシル付加体のカルボキシル基との酸アミド結合を形成している。キャリアタンパク質としては、好ましくは、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、卵白アルブミン、リポプロテイン及びヘモシアニンであり、より好ましくは、カギアナカサガイのヘモシアニン（ＫＬＨ）である。
【００３４】
なお、カルボキシル付加体とキャリアタンパク質との結合反応は、架橋剤としてＥＤＣ（１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドハイドロクロライド）などの水溶性カルボジイミドを使用することができる。なお、他の架橋剤を用いてもよい。結合反応のための溶媒としては、トリス（Ｔｒｉｓ）、リン酸塩、炭酸塩、酢酸塩等の緩衝液を用いることができ、例えば、１ｍＭ〜０．５Ｍ、より好ましくは１０ｍＭ〜１００ｍＭのリン酸緩衝液が挙げられる。ｐＨは、結合反応が進行する限り限定しないが、好ましくはｐＨ６〜１１、より好ましくはｐＨ７〜９である。反応時間は、例えば、２５〜６０℃で１時間以上、好ましくは３０〜４０℃で５〜４０時間である。得られた結合体は、最終的にはカラムによる分離精製、透析などの一般的なタンパク質の分離精製方法を単独であるいは組み合わせて採用して抗原として用いることができる。
【００３５】
効率的に結合体を得るには、カルボキシル基付加体をＥＤＣなどの水溶性カルボジイミドと反応させた後、さらにｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイミド）と反応させてアミン反応性スルホ−ＮＨＳエステルとした上で、スルホ−ＮＨＳエステルとキャリアタンパク質と反応させることができる。この場合、スルホ−ＮＨＳエステルを得るための反応溶媒としては、水と混和可能な有機溶媒であれば特に限定されないが、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）及びエタノールを単独であるいは組み合わせて用いることができる。反応条件は、２０〜６０℃で５〜４０時間、好ましくは、２０〜４０℃で２０〜３０時間程度である。次に、スルホ−ＮＨＳエステルを含む反応液を次いでキャリアタンパク質溶液と混合して結合反応を進行させる。キャリアタンパク質を溶解する溶液としては、既に説明した結合反応のための溶媒を好ましく用いることができ、ｐＨも同様である。また、反応時間は、１時間以上、好ましくは２〜１０時間程度とすることができる。
【００３６】
また、この他、キャリアタンパク質とマーカー化合物とを、グルタルアルデヒド等のジアルデヒドや、ヘキサメチレンジイソシアネート等のジイソシアネートとによって反応させてもよい。
【００３７】
（２）抗体の作製
こうして調製した抗原で温血動物を免疫し、最終的に、目的とする抗体を産生するハイブリドーマをスクリーニングし、このハイブリドーマの産生する抗体を精製することにより本発明の抗体を得ることができる。温血動物としては、特に、限定しないで、マウス、ハムスター、ラット、モルモット、ウサギ、イヌ、ニワトリ等を用いることができる。ハイブリドーマとして用いる細胞が限定されている場合、当該ミエローマの由来動物と同一の動物を用いることが好ましく、通常用いられるミエローマはマウス由来であることから、温血動物としてはマウスを用いることが好ましい。
【００３８】
抗原で温血動物を免疫するには、従来公知の方法を採用できる。例えば、抗原を、温血動物に対して皮下注射、皮内注射、腹膜腔内注射、静脈内注射、筋肉内注射等から選択される１又は２以上の投与経路で、７〜３０日、好ましくは１２〜１６日間間隔で合計２〜１０回程度投与する。
【００３９】
なお、抗原は適当な緩衝液、例えばフロイントの完全アジュバント、フロイントの不完全アジュバント、水酸化アルミニウム等の通常用いられるアジュバントの１種を含有するリン酸緩衝液、生理食塩水等に溶解して用いることができるが、こうしたアジュバントを必ずしも使用する必要はない。ここで、アジュバントとは抗原と共に投与したとき、非特異的に抗原に対する免疫反応を増強する物質を意味する。
【００４０】
抗原を免疫した温血動物を７〜３０日間処置せずに放置した後、該温血動物の血清を少量採取し、抗体価を測定する。抗体価の上昇に応じて、抗原の追加投与を適当回数行うこともできる。例えば、０．０１〜１ｍｇ、特に、０．０５〜０．５ｍｇの投与量で１回もしくは２回の追加投与が行われる。なお、抗体価の測定方法としては、酵素免疫測定法、ウエスタンブロット法、凝集法、一元放射状免疫拡散法等から選ばれた測定法を用いることができるが、酵素免疫測定法が好ましい。
【００４１】
抗体価が認められた温血合物への最後の投与の１〜３０日後、特に好ましくは１〜７日後に免疫した温血動物から脾臓又はリンパ節を摘出し、この組織から抗体産生細胞を採取し、継代培養可能な骨髄腫由来細胞（ミエローマ）と融合させることにより、抗体産生ハイブリドーマを得ることができる。
【００４２】
ハイブリドーマは、例えば、「単クローン抗体実験操作入門」（講談社サイエンティフィック安藤民衛ら １９９１）等に記載されている方法を用いることができる。すなわち、抗体産生細胞とミエローマとを融合させる。誘導促進剤としては、センダイウイルスやポリエチレングリコールが用いられる。ミエローマとしては、抗体産生細胞の由来動物と同一の動物とすることが好ましい。
【００４３】
実際に用いられる細胞融合の方法としては、公知の技術（Ｊ ＩｍｍｕｎｏｌＭｅｔｈｏｄ ３９：２８５−３０８，１９８０）を用いることができる。例えば、免疫されたマウスから得られた脾臓細胞等とマウスミエローマ細胞をポリエチレングリコール存在下で融合を行い、ハイブリッド細胞のみが生育可能であるＨＡＴ培地（ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン添加培地）により選択的にハイブリッド細胞を増殖させ、ハイブリッド細胞がコロニーを形成した後、培養上清中の抗体をスクリーニングすることで目的の抗体を産生するハイブリドーマを得ることができる。本発明によれば、こうした抗体を産生するハイブリドーマも提供される。
【００４４】
抗体産生ハイブリドーマのスクリーニング方法としては、種々の方法が採用できる。抗体価の測定には、例えば、上記した抗体価の測定と同様の方法を採用できる。好ましくは酵素免疫測定法である。具体的には、マーカー化合物を直接あるいは担体とともに吸着させた固相（例、マイクロプレート）にハイブリドーマ培養上清を添加し、次に放射性物質や酵素などで標識した抗免疫グロブリン抗体（細胞融合に用いられる細胞がマウスの場合、抗マウス免疫グロブリン抗体が用いられる）またはプロテインＡを加え、固相に結合したモノクローナル抗体を検出する方法、抗免疫グロブリン抗体またはプロテインＡを吸着させた固相にハイブリドーマ培養上清を添加し、放射性物質や酵素などで標識したマーカー化合物を加え、固相に結合したモノクローナル抗体を検出する方法などがあげられる。また、限界希釈法を繰り返すことにより、本発明の抗体を産生する単一のハイブリドーマを得ることができる。
【００４５】
こうしてスクリーニングされたハイブリドーマを、モノクローナル抗体を産生する環境下（温血動物の生体外又は生体内）で培養して、体液又は培養液から抗体を採取することにより、本発明の抗体を製造することができる。本発明の抗体は、通常のポリクローナル抗体の分離精製と同様に行うことができる。すなわち、免疫グロブリンの分離精製法、例えば、塩析法、アルコール沈澱法、等電点沈澱法、電気泳動法、イオン交換体（例、DEAE）による吸脱着法、超遠心法、ゲルろ過法、抗原結合固相あるいはプロテインＡあるいはプロテインＧなどの活性吸着剤により抗体のみを採取し、結合を解離させて抗体を得る特異的精製法などに従って行われる。
【００４６】
なお、マーカー化合物に対する高い反応特異性を有する抗体を産生するハイブリドーマをスクリーニングするには、間接競合ＥＬＩＳＡ又は直接競合ＥＬＩＳＡによってマーカー化合物に対する特異性と類似化合物に対する交差反応性を調べることが好ましい。
【００４７】
本発明のモノクローナル抗体はヒトのマーカー化合物Ｉ〜ＩＶの検出だけでなく、ヒト以外の異種の温血動物、例えばマウス、ハムスター、ラット、モルモット、ウサギ、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ニワトリ等の生体中に存在するマーカー化合物Ｉ〜ＩＶの検出にも応用することができる。
【００４８】
抗体を用いたマーカー化合物の測定方法としては、通常の抗原−抗体反応を利用する方法であれば特に制限されず、放射性同位元素免疫測定法（ＲＩＡ）、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）、免疫組織化学法、蛍光もしくは発光測定法、凝集法、イムノブロット法、イムノクロマト法等（Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．， ９２， １４７−５２３（１９８３）， Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ｖｏｌ．ＩＩ ＩＲＬ ＰｒｅｓｓＯｘｆｏｒｄ （１９８９）） が挙げられるが、感度や簡便性等の点からＥＬＩＳＡが好ましい。ＥＬＩＳＡに用いる酵素としては、ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ等が挙げられる。
【００４９】
ＥＬＩＳＡによる測定法は、間接競合ＥＬＩＳＡまたは直接競合ＥＬＩＳＡなどがあげられる。例えば、間接競合ＥＬＩＳＡは、以下のような手順により行うことができる。
【００５０】
（１）固相化用抗原である上記抗原化合物を担体に固相化する。用いる担体は、９６穴、４８穴、１９２穴等のマイクロタイタープレートを用いることができる。固相化は、例えば、固相化用抗原を含む緩衝液を担体上に載せ、インキュベーションすればよい。緩衝液中の抗原の濃度は、通常０．０１μｇ／ｍｌから１００μｇ／ｍｌ程度である。緩衝液としては、検出手段に応じて公知のものを使用することができる。
【００５１】
（２）担体の固相表面へのタンパク質の非特異的吸着を防止するため、固相化用抗原が吸着していない固相表面部分を、抗原と無関係なタンパク質等によりブロッキングする。ブロッキング剤としては、ＢＳＡもしくはスキムミルク溶液、または市販のブロックエース（大日本製薬社製）等を使用することができる。ブロッキングは、前記ブロッキング剤を担体に添加し、例えば、約４℃で一晩インキュベーションした後、洗浄液で洗浄することにより行われる。洗浄液としては特に制限はないが、前記（１）と同じ緩衝液を使用することができる。
【００５２】
（３）前記（１）および（２）で処理された固相表面に各種濃度の抗原用化合物を含む被験試料および本発明の抗体溶液を加え、該抗体を前記固相化抗原および被験試料中のマーカー化合物に競合的に反応させて、固相化抗原−抗体複合体およびマーカー化合物−抗体複合体を生成させる。反応は、１０℃〜４０℃、好ましくは２５℃〜３７℃で０．５〜数時間程度で行うことができる。
【００５３】
（４）固相化抗原−抗体複合体の量を測定することにより、予め作成した検量線から試料中のマーカー化合物量を決定することができる。固相化抗原−抗体複合体の量は、酵素標識した二次抗体（本発明の抗体を認識する抗体）を添加して測定することができる。例えば本発明の抗体としてマウスモノクローナル抗体を用いる場合、酵素標識（例えば、ペルオキシダーゼまたはアルカリホスファターゼ等）した抗マウス−ヤギ抗体を用いて、担体に結合した本発明の抗体と反応させるのが望ましい。反応は、前記（３）と同様の条件下で行えばよい。反応後、緩衝液で洗浄する。
【００５４】
（５）担体に結合した二次抗体の標識酵素と反応する発色基質溶液を加え、吸光度を測定することによって検量線からマーカー化合物の量を算出することができる。二次抗体に結合する酵素としてペルオキシダーゼを使用する場合には、例えば、過酸化水素と、３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジンまたはｏ−フェニレンジアミンを含む発色基質溶液を使用することができる。通常、発色基質溶液を加えて室温で約１０分程度反応させた後、硫酸を加えることにより酵素反応を停止させる。３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジンを使用する場合、４５０ｎｍの吸光度を測定する。ｏ−フェニレンジアミンを使用する場合、４９２ｎｍの吸光度を測定する。なお、バックグランド値を補正するため、６３０ｎｍの吸光度も同時に測定することが望ましい。二次抗体に結合する酵素としてアルカリホスファターゼを使用する場合には、例えばｐ−ニトロフェニルリン酸を基質として発色させ、ＮａＯＨ溶液を加えて酵素反応を止め、４１５ｎｍでの吸光度を測定する方法があげられる。
【００５５】
マーカー化合物を添加しない反応溶液の吸光度に対して、マーカー化合物を添加して抗体と反応させた溶液の吸光度の減少率を阻害率として計算する。既知の濃度のアラクロールを添加した反応液の阻害率により予め作成しておいた検量線を用いて、試料中のマーカー化合物濃度を算出することができる。
【００５６】
また、マーカー化合物は、以下のようにして直接競合ＥＬＩＳＡにより測定できる。すなわち、固相化抗原に替えて、本発明の抗体を担体に固相化し、被験試料と混合する抗体に替えてマーカー化合物と酵素を結合させた酵素結合ハプテンを用い、二次抗体を用いないで固相化抗体と結合しなかった酵素結合ハプテンを除去した上、固相化抗体−酵素結合ハプテン複合体の量を間接競合ＥＬＩＳＡと同様の方法により発色させて吸光度を測定することにより、予め作成した検量線から被験試料中のマーカー化合物の量を決定することができる。
【００５７】
なお、本発明の測定方法においては、被験試料に応じた前処理をして試料とした後、間接競合ＥＬＩＳＡ、直接競合ＥＬＩＳＡやその他の測定方法に供せられる。
【００５８】
以上説明したように、被験試料中のこうしたマーカー化合物の量を測定することにより、ＤＨＡ及び／又はＡＡの酸化程度や含有量の低下、ドーパミン含有量の低下など神経細胞における各種の酸化的損傷状態を検出することができる。したがって、本発明の検査方法を利用することで、神経細胞の老化程度の検査方法、診断用途、有用な薬剤や食品などのスクリーニング方法が提供される。
【００５９】
（神経細胞の老化程度の検査方法等）
例えば、本検査方法における本測定工程と、本測定工程の測定結果に基づいて動物の神経細胞の老化程度を判定する判定工程と、を備える検査方法が提供される。本発明者らによれば、こうした神経細胞における各種態様の酸化的損傷の程度（マーカー化合物の量）は神経細胞の老化程度に関連していると考えられる。すなわち、マーカー化合物の量が多ければより老化が進行しているといえるからである。老化程度の判定にあたっては、例えば、ヒトなど被験動物の年齢若しくは年代とマーカー量との関係を予め取得しておき、被験試料から検出されたマーカー化合物量と被験動物の年齢に相当するマーカー化合物量とを対比することで老化がより進行しているか、あるいは老化の進行が遅いかを判定できる。また、例えば、被験動物について定期的にマーカー化合物量を測定することで、神経細胞において老化の進行があったかどうか等を判定できる。さらに、被験動物個体の神経細胞の老化程度を判定することにより、酸化的損傷の生じている生理的状態を改善し又は予防するアンチエージング的な措置や治療が可能となる。
【００６０】
また、本測定工程と、動物における神経細胞の酸化的損傷が関連する疾患の発症リスク、前記疾患に罹患しているかどうか及び前記疾患の進行程度のいずれかを診断する診断工程と、を備える診断方法が提供される。本発明者らによれば、こうした神経細胞における各種態様の酸化的損傷の程度（マーカー化合物の量）は、これらの損傷が関連する疾患、換言すれば、マーカー化合物が関連する疾患の発症や進行に関連していると考えられる。すなわち、マーカー化合物の量が多ければ、発症リスクが高いか、既に罹患しているか、あるいは疾患がかなり進行しているということができる。こうした疾患としては、神経変性疾患が挙げられ、例えば、アルツハイマー病、ピック病、パーキンソン症候群（パーキンソン病、症候性パーキンソニズム）、進行性核上性麻痺、ハンチントン舞踏病、シドナム舞踏病、多系統萎縮症、遺伝性脊髄小脳変性疾患、皮質性小脳萎縮症、晩発性皮質性小脳I縮小などの脊髄小脳変性症、筋萎縮性側索硬化症、進行性球麻痺、脊髄性筋萎縮症、亜急性連合性脊髄変性症、球脊髄性筋萎縮症などが挙げられる。なかでも、アルツハイマー病やパーキンソン症候群が挙げられる。
【００６１】
疾患の発症リスク、疾患診断及び病状の進行程度の診断にあたっては、例えば、ヒトなどにおいて、疾患の有無（正常人と疾患罹患者）とマーカー化合物量との関係、年代（年齢）とマーカー化合物量との関係、性差とマーカー化合物量との関係、疾患の進行程度（軽症、中程度、重症）とマーカー化合物量との関係等を予め取得しておき、被験試料から検出されたマーカー化合物量と被験動物の年齢、症状の有無、性差、進行程度等を考慮して対比すべきマーカー化合物量を選択し、対比することで発症リスク、疾患の有無、病状の進行程度を診断できる。また、例えば、被験者について定期的にマーカー化合物量を測定することで、発症リスク、発症、病状の進行に変化があったかどうか等を診断することができる。
【００６２】
（スクリーニング方法）
本発明の神経細胞における酸化的損傷を抑制又は促進する化合物のスクリーニング方法は、非ヒト動物に１種又は２種以上の試験化合物を投与する工程と、前記試験化合物を投与した前記非ヒト動物から採取される被験試料中のマーカー化合物Ｉ〜ＩＶから選択されるいずれかの化合物の量を測定する工程と、を備えている。このスクリーニング方法によれば、非ヒト動物に試験化合物を投与したとき、マーカー化合物Ｉ〜ＩＶ量の増大又は減少を検出することができる。このため、試験化合物が神経細胞の酸化的損傷を促進するのか抑制するのかを評価することができる。この結果、本発明のスクリーニング方法によれば、神経細胞の酸化的損傷に調節（抑制又は促進）する化合物をスクリーニングすることができる。
【００６３】
特に、本スクリーニング方法によって得られる神経細胞の酸化的損傷を抑制する化合物は、マーカー化合物Ｉ〜ＩＶが関連する疾患又は神経細胞の酸化的損傷が関連する疾患の予防用又は治療用の薬剤として用いることができる。
【００６４】
また、本発明の神経細胞における酸化的損傷を抑制する食品のスクリーニング方法であって、非ヒト動物に１種又は２種以上の食品を投与する工程と、前記試験化合物を投与した前記非ヒト動物から採取される被験試料中のマーカー化合物Ｉ〜ＩＶから選択されるいずれかの化合物の量を測定する工程と、を備えている。このスクリーニング方法によれば、非ヒト動物に食品を投与したとき、マーカー化合物Ｉ〜ＩＶの量の増大又は減少を検出して、投与した食品が神経細胞の酸化的損傷を促進するのか抑制するのかを評価できる。この結果、神経細胞の酸化的損傷を抑制できる食品をスクリーニングすることができる。こうした食品は、神経細胞の酸化的損傷によって引き起こされる生理的状態や疾患を予防し改善する食品として提供される。
【００６５】
なお、こうしたスクリーニング方法においては、神経細胞の酸化的損傷を抑制する化合物や食品のスクリーニングには、非ヒト動物として、神経細胞の酸化的損傷が促進された非ヒト動物を用いることが好ましい。こうした非ヒト動物は、遺伝子工学的な改変、人為的な交配又は突然変異体からの探索などにより取得することができる。典型的には、アルツハイマーモデルマウスやパーキンソンモデルマウス等が挙げられる。
【００６６】
（測定キット）
本発明の測定キットは、本発明のマーカー化合物を特異的に認識する抗体を含んでいる。このため、被験試料中のマーカー化合物を簡便に測定することができる。本測定キットは、さらに、測定法に応じて、標識された二次抗体もしくは標識されたマーカー化合物ハプテン（抗原）、緩衝液、検出試薬および／またはマーカー化合物標準溶液等を含む。好ましいキットは、ＥＬＩＳＡ法に用いられうるものであり、固相化抗原を保持する担体、本発明の抗体、酵素標識された二次抗体および検出試薬などを含むことができる。
【００６７】
本発明の抗体が特異的に認識するマーカー化合物は、ＡＡやＤＨＡの過酸化物であるヒドロペルオキシドとドーパミンとの反応により生成されるものであるので、本測定キットによれば、被験試料中のマーカー化合物を測定することで被験試料の採取部位又は採取個体における神経細胞の酸化的損傷及びその程度を検出することができる。
【００６８】
（固定化体）
本発明の固定化体は、固相担体と、該固相担体に固定化される本発明の抗体とを備えている。固相担体は、基板状、ビーズ状等特に形態を限定しないし、その材質も、ガラス、セラミックス、プラスチック、金属など従来公知の材料を用いることができる。さらに、多孔質であっても緻密質であってもよい。本発明の抗体の固相担体への固定化形態は特に限定しないで共有結合、静電的結合など、抗体などのタンパク質を固相に保持できる従来公知の手法で固定化されていればよい。本発明の固定化体は、本発明の抗体を、基板状の固相担体上に他の抗体とともに予め位置情報を伴って固定化されていることが好ましい。こうした本発明の固定化体は、複数個の抗体が一つの基板状の固相担体に固定化された抗体チップの形態を採ることができる。
【実施例】
【００６９】
以下、本発明の具体例を実施例として説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
（実施例１）
本実施例は、本発明のマーカー化合物であるヘキサノイルドーパミン（ＨＥＤ：下式（６））、グルタロイルドーパミン（ＧＬＤ：下式（７））、プロパノイルドーパミン（ＰＲＤ：下式（８））及びスクシニルドーパミン（ＳＵＤ：下式（９））をそれぞれ合成した。
【化１３】
【化１４】
【化１５】
【化１６】
【００７０】
（１）ＨＥＤ
ドーパミン６３．９ｍｇ（０．３３７ｍｍｏｌ）と無水ヘキサノイル酸７２．３ｍｇ（０．３３７ｍｍｏｌ）をＤＭＦ・リン酸塩緩衝液（ｐＨ７．４）混液（１：１）４．４ｍｌに加えた後、スターラーを用いて室温で４時間反応させた。この反応液をＬＣ／ＭＳ／ＭＳを用いて分離し、分子量の確認を行った（ｍ／ｚ２５２．２→１３７．２）。また、１Ｈ−ＮＭＲおよび１３Ｃ−ＮＭＲを用いて構造を決定した。結果を表１に示す。
【表１】
【００７１】
（２）ＧＬＤ
ドーパミン９５ｍｇ（０．５ｍｍｏｌ）をリン酸塩緩衝液（ｐＨ７．４）・飽和酢酸ナトリウム水溶液混液（１：１）５ｍｌに加えた後、少量のピリジンに溶かした無水グルタル酸５７ｍｇ（０．５ｍｍｏｌ）を１滴／秒で加えた。そして、スターラーを用いて室温で１時間反応させた。この反応液にメタノールを加えてエヴァポレーターを用いてピリジンをとばした後、ＨＰＬＣを用いて分取した。さらに、分取物について、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳを用いて分子量の確認を行った（ｍ／ｚ２６８．２→１３７．２）。また、１Ｈ−ＮＭＲおよび１３Ｃ−ＮＭＲを用いて構造を決定した。結果を表２に示す。
【表２】
【００７２】
（３）ＰＲＤ
ドーパミン９５ｍｇ（０．５ｍｍｏｌ）をリン酸塩緩衝液（ｐＨ７．４）・飽和酢酸ナトリウム水溶液混液（１：１）５ｍｌに加えた後、少量のピリジンに溶かした無水プロピオン酸６５ｍｇ（０．５ｍｍｏｌ）を１滴／秒で加えた。そして、スターラーを用いて室温で１時間反応させた。この反応液にメタノールを加えてエヴァポレーターを用いてピリジンをとばした後、ＨＰＬＣを用いて分取した。さらに、分取物について、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳを用いて分子量の確認を行った（ｍ／ｚ２１０．１→１３７．２）。また、１Ｈ−ＮＭＲおよび１３Ｃ−ＮＭＲを用いて構造を決定した。結果を表３に示す。
【表３】
【００７３】
（４）ＳＵＤ
ドーパミン９５ｍｇ（０．５ｍｍｏｌ）をリン酸塩緩衝液（ｐＨ７．４）・飽和酢酸ナトリウム水溶液混液（１：１）５ｍｌに加えた後、少量のピリジンに溶かした無水コハク酸４９ｍｇ（０．５ｍｍｏｌ）を１滴／秒で加えた。そして、スターラーを用いて室温で１時間反応させた。この反応液にメタノールを加えてエヴァポレーターを用いてピリジンをとばした後、ＨＰＬＣを用いて分取した。さらに、分取物について、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳを用いて分子量の確認を行った（ｍ／ｚ２５４．１→１３７．２）。また、１Ｈ−ＮＭＲおよび１３Ｃ−ＮＭＲを用いて構造を決定した。結果を表４に示す。
【表４】
【００７４】
なお、これらのマーカー化合物の同定に際し、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ（Applied Biosystem API2000 HPLC-MS/MS system）の条件は以下のとおりであった。
［HED, GLDのLC-MS/MS条件］
カラム：Develosil ODS-HG-3 (2 φ×50 mm)
移動相：A；100％ H2O / 0.1％ HCOOH
B；100％CH3CN / 0.1％ HCOOH
流速 ：0.2 ml /min
イオン源：Turbo Spray Ionization positive（スプレーイオン化法）
グラジエントプログラム
【表５】
【００７５】
［PRD ,SUDのLC-MS/MS条件］
グラジエントプログラム及びフラグメント検出のための設定以外はＨＥＤ等の同定のためのＬＣ−ＭＳ／ＭＳ条件と同様とした。
グラジエントプログラム
【表６】
【００７６】
（実施例２）
(インビトロにおけるマーカー化合物の生成反応)
本実施例では、各種マーカー化合物が脂質ヒドロペルオキシドとドーパミンから生成されるかどうかをインビトロで確認した。なお、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ条件は、実施例１におけるのと同様の条件を用いた。
（１）ＨＥＤ
ＨＥＤはアラキドン酸を含むω−６系の多価不飽和脂肪酸から生成するため、ω−６系のリノール酸由来の脂質ヒドロペルオキシドである１３−ｈｙｄｒｏｐｅｒｏｘｙｏｃｔａｄｅｃａｄｉｅｎｏｉｃａｃｉｄ（１３−ＨＰＯＤＥ）を用いた。終濃度１０ｍＭ１３−ＨＰＯＤＥおよび２ｍＭドーパミンとなるようにリン酸塩緩衝液（ｐＨ７．４）中において３７℃で反応させ、−８０℃で反応停止とした。反応液について、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳを行ったところ、ＨＥＤを検出できた。
【００７７】
（２）ＧＬＤ
１００ｍＭアラキドン酸１００μｌ、リポキシゲナーゼ０．８ｍｇ、ホウ酸緩衝液（ｐＨ９．０）１１ｍｇを混合した後、酸素を吹き付けながら３０分間攪拌をした。１ＮＨＣｌを加えることによってｐＨ４．０以下にした後、クロロホルム・メタノール混液（１：１）２０ｍｌで抽出し、クロロホルム層を回収し、脱水して乾固した。これに１００μｌエタノールで再溶解し、１００ｍＭアラキドン酸ヒドロペルオキシド画分とした。
【００７８】
反応は、終濃度１０ｍＭアラキドン酸ヒドロペルオキシド画分および２ｍＭドーパミンとなるようにリン酸塩緩衝液（ｐＨ７．４）中において３７℃で反応させ、−８０℃で反応停止とした。反応液について、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳを行ったところ、ＧＬＤを検出できた。
【００７９】
(３)ＰＲＤ
反応は、終濃度１０ｍＭＤＨＡおよび２ｍＭドーパミンとなるようにリン酸塩緩衝液（ｐＨ７．４）中において３７℃で反応させ、−８０℃で反応停止とした。反応液について、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳを行ったところ、ＰＲＤを検出できた。
【００８０】
（４）ＳＵＤ
反応は、終濃度１０ｍＭＤＨＡおよび２ｍＭドーパミンとなるようにリン酸塩緩衝液（ｐＨ７．４）中において３７℃で反応させ、−８０℃で反応停止とした。反応液について、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳを行ったところ、ＳＵＤを検出できた。
【００８１】
（実施例３）
本実施例では、ラット脳中における各種マーカー化合物の存在を確認した。
（試料調製）
６週齢のｗｉｓｔｅｒ ｒａｔの雌を用いた。脳を摘出し、全脳の半分をホモジネート用とした。ホモジネート用の脳を、その湿重量に対して４倍量の抽出液（メタノール：５ｍＭＢＨＴ：２５０ｍＭＥＤＴＡ混液（体積比で９０：５：５）に加えた後、ホモジネートを行い、メタノール層を回収した。メタノールを留去して乾固させ、乾固物を再びメタノールで再溶解させた。これをＨＰＬＣによりマーカー化合物の検出時間付近を分取したのち、分取した画分を乾固して再びメタノールで再溶解させたものをＬＣ／ＭＳ／ＭＳを用いてマーカー化合物の有無を分析した。結果を図５に示す。
【００８２】
なお、分取のためのＨＰＬＣ条件は、以下の条件で行い、及びＬＣ−ＭＳ／ＭＳは、実施例１と同様の条件を採用するとともに、内部標準物質を利用して実施した。また、以下の同定に用いた内部標準物質の構造等を図６及び図７に示す。
【００８３】
[分取ＨＰＬＣ条件]
カラム：Develosil ODS-HG-5 (4.6 φ × 250 mm)
移動相：A；100% H2O / 0.01% CH3COOH
B；100% CH3CN / 0.01% CH3COOH
流速 ：0.8 ml /min
検出器（UV）：280 nm
グランジエントプログラム
【表７】
【００８４】
図５に示すように、ラット脳からはＨＥＤ、ＧＬＤ、ＰＲＤ及びＳＵＤの全てのマーカー化合物が検出された。以上のことから、これらのマーカー化合物が生体内においても生成されていることが確認できた。
【００８５】
（実施例４）
本実施例では、各種マーカー化合物のアポトーシス誘導活性について評価した。
評価には、ヒト神経芽細胞腫由来培養細胞株（ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞）を用いた。おおよそ５×１０５ｃｅｌｌｓ／ウェルになるように６ウェルフラスコに細胞を播き、一晩インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２）に入れて培養した後、それぞれのマーカー化合物を含んだ培地に交換した。それぞれの培地はマーカー化合物濃度が終濃度で１００μＭになるように調製した。２４時間後に核染色を行うことにより細胞毒性評価した。核染色にはＰｒｏｐｉｄｉｕｍＩｏｄｉｄｅ（ＰＩ）とＨｏｅｃｈｓｔ３３２５８，ｐｅｎｔａｈｙｄｒａｔｅ（ｂｉｓ−ｂｅｎｚｉｍｉｄｅ）を用いた。ＰＩでは死細胞を評価し、Ｈｏｅｃｈｓｔでは死細胞と生細胞の両方を評価した。そこで、ＰＩ／Ｈｏｅｃｈｓｔを求めることにより細胞毒性評価した。評価方法は顕微鏡で観察することにより行い、それぞれ試薬で染色させた細胞数をカウントすることで評価した。なお、ＤＭＳＯ及びＤＡをマーカー化合物に替えて添加したもの及び無添加の培地で同様に評価した。結果を図８に示す。
【００８６】
図８に示すように、ＨＥＤではＰＩ／Ｈｏｅｃｈｓｔが６０％以上であり、ＰＲＤでは３０％程度であった。
【図面の簡単な説明】
【００８７】
【図１】アラキドン酸ヒドロペルオキシドとドーパミンとの反応によるマーカー化合物Ｉ及びＩＩとの関係を示す図である。
【図２】ドコサヘキサエン酸ヒドロペルオキシドとドーパミンとの反応によるマーカー化合物ＩＩＩ及びＩＶとの関係を示す図である。
【図３】式（２）で表されるカルボキシル付加体から式（４）で表される抗原用化合物を得るスキームを示す図である。
【図４】式（３）で表されるカルボキシル付加体から式（５）で表される抗原用化合物を得るスキームを示す図である。
【図５】合成ラット脳中におけるマーカー化合物を検出したＬＣ／ＭＳ／ＭＳチャートを示す図である。
【図６】ＨＥＤ及びＧＬＤに対する内部標準物質を示す図である。
【図７】ＰＲＤ及びＳＵＤに対する内部標準物質を示す図である。
【図８】マーカー化合物のアポトーシス誘導活性を評価したグラフ図である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の式（１）で表される、神経細胞における酸化的損傷マーカー化合物。
【化１】
（式（１）中、Ｒは、ヘキサノイル基、グルタロイル基、プロパノイル基又はスクシニル基を表す。）
【請求項２】
前記式（１）中、Ｒは、ヘキサノイル基又はグルタロイル基で表される、請求項１に記載の酸化的損傷マーカー化合物。
【請求項３】
前記式（１）中、Ｒは、プロパノイル基又はスクシニル基で表される、請求項１に記載の酸化的損傷マーカー化合物。
【請求項４】
前記式（１）中、Ｒはヘキサノイル基又はプロパノイル基で表される、請求項１に記載の酸化的損傷マーカー化合物。
【請求項５】
神経細胞における酸化的損傷の検査方法であって、
動物から採取される被験試料中の請求項１〜４のいずれかに記載の酸化的損傷マーカー化合物の量を測定する工程を備える、検査方法。
【請求項６】
前記測定工程における前記被験試料は、脊髄液又は脳髄液である、請求項５に記載の検査方法。
【請求項７】
前記測定工程は、前記酸化的損傷マーカー化合物を特異的に認識する抗体を用いる工程である、請求項５又は６に記載の検査方法。
【請求項８】
前記測定工程は、ＥＬＩＳＡ法によって実施する、請求項７に記載の検査方法。
【請求項９】
神経細胞の老化程度の検査方法であって、
動物から採取される被験試料中の請求項１〜４のいずれかに記載の酸化的損傷マーカー化合物の量を測定する工程と、
前記測定工程の測定結果に基づいて前記動物の神経細胞の老化程度を判定する工程を備える、検査方法。
【請求項１０】
神経細胞の酸化的損傷に関連する疾患に関する診断方法であって、
動物から採取される被験試料中の請求項１〜４のいずれかに記載の酸化的損傷マーカー化合物の量を測定する工程と、
前記測定工程の測定結果に基づいて前記動物の前記疾患の発症リスク、前記疾患に罹患しているかどうか及び前記疾患の進行程度のいずれかを診断する診断工程と、
を備える、診断方法。
【請求項１１】
前記疾患は、神経変性疾患である、請求項１０に記載の診断方法。
【請求項１２】
以下の式（１）で表される化合物から選択されるいずれかの化合物を特異的に認識する抗体。
【化２】
（式（１）中、Ｒは、ヘキサノイル基、グルタロイル基、プロパノイル基又はスクシニル基を表す。）
【請求項１３】
以下の式（２）及び（３）で表される化合物から選択される、請求項１２に記載の抗体を作製するための化合物。
【化３】
（式（２）中、Ｒは、ヘキサノイル基、グルタロイル基、プロパノイル基又はスクシニル基を表す。）
【化４】
（式（３）中、Ｒは、ヘキサノイル基、グルタロイル基、プロパノイル基又はスクシニル基を表す。）
【請求項１４】
以下の式（４）及び（５）で表される化合物から選択される、請求項１２に記載の抗体を作製するための抗原用化合物。
【化５】
（式（４）中、Ｒは、ヘキサノイル基、グルタロイル基、プロパノイル基又はスクシニル基を表す、Ｘはキャリアタンパク質から一アミノ基を除いた残部を表す。）
【化６】
（式（５）中、Ｒは、ヘキサノイル基、グルタロイル基、プロパノイル基又はスクシニル基を表し、Ｘはキャリアタンパク質から一アミノ基を除いた残部を表す。）
【請求項１５】
神経細胞における酸化的損傷を抑制する化合物のスクリーニング方法であって、
非ヒト動物に１種又は２種以上の試験化合物を投与する工程と、
前記試験化合物を投与した前記非ヒト動物から採取される被験試料中の請求項１〜４のいずれかに記載の神経細胞の酸化的損傷マーカー化合物の量を測定する工程と、
を備える、スクリーニング方法。
【請求項１６】
神経細胞における酸化的損傷を抑制する食品のスクリーニング方法であって、
非ヒト動物に１種又は２種以上の食品を投与する工程と、
前記食品を投与した前記非ヒト動物から採取される被験試料中の請求項１〜４のいずれかに記載の神経細胞の酸化的損傷マーカー化合物の量を測定する工程と、
を備える、スクリーニング方法。
【請求項１】
以下の式（１）で表される、神経細胞における酸化的損傷マーカー化合物。
【化１】
（式（１）中、Ｒは、ヘキサノイル基、グルタロイル基、プロパノイル基又はスクシニル基を表す。）
【請求項２】
前記式（１）中、Ｒは、ヘキサノイル基又はグルタロイル基で表される、請求項１に記載の酸化的損傷マーカー化合物。
【請求項３】
前記式（１）中、Ｒは、プロパノイル基又はスクシニル基で表される、請求項１に記載の酸化的損傷マーカー化合物。
【請求項４】
前記式（１）中、Ｒはヘキサノイル基又はプロパノイル基で表される、請求項１に記載の酸化的損傷マーカー化合物。
【請求項５】
神経細胞における酸化的損傷の検査方法であって、
動物から採取される被験試料中の請求項１〜４のいずれかに記載の酸化的損傷マーカー化合物の量を測定する工程を備える、検査方法。
【請求項６】
前記測定工程における前記被験試料は、脊髄液又は脳髄液である、請求項５に記載の検査方法。
【請求項７】
前記測定工程は、前記酸化的損傷マーカー化合物を特異的に認識する抗体を用いる工程である、請求項５又は６に記載の検査方法。
【請求項８】
前記測定工程は、ＥＬＩＳＡ法によって実施する、請求項７に記載の検査方法。
【請求項９】
神経細胞の老化程度の検査方法であって、
動物から採取される被験試料中の請求項１〜４のいずれかに記載の酸化的損傷マーカー化合物の量を測定する工程と、
前記測定工程の測定結果に基づいて前記動物の神経細胞の老化程度を判定する工程を備える、検査方法。
【請求項１０】
神経細胞の酸化的損傷に関連する疾患に関する診断方法であって、
動物から採取される被験試料中の請求項１〜４のいずれかに記載の酸化的損傷マーカー化合物の量を測定する工程と、
前記測定工程の測定結果に基づいて前記動物の前記疾患の発症リスク、前記疾患に罹患しているかどうか及び前記疾患の進行程度のいずれかを診断する診断工程と、
を備える、診断方法。
【請求項１１】
前記疾患は、神経変性疾患である、請求項１０に記載の診断方法。
【請求項１２】
以下の式（１）で表される化合物から選択されるいずれかの化合物を特異的に認識する抗体。
【化２】
（式（１）中、Ｒは、ヘキサノイル基、グルタロイル基、プロパノイル基又はスクシニル基を表す。）
【請求項１３】
以下の式（２）及び（３）で表される化合物から選択される、請求項１２に記載の抗体を作製するための化合物。
【化３】
（式（２）中、Ｒは、ヘキサノイル基、グルタロイル基、プロパノイル基又はスクシニル基を表す。）
【化４】
（式（３）中、Ｒは、ヘキサノイル基、グルタロイル基、プロパノイル基又はスクシニル基を表す。）
【請求項１４】
以下の式（４）及び（５）で表される化合物から選択される、請求項１２に記載の抗体を作製するための抗原用化合物。
【化５】
（式（４）中、Ｒは、ヘキサノイル基、グルタロイル基、プロパノイル基又はスクシニル基を表す、Ｘはキャリアタンパク質から一アミノ基を除いた残部を表す。）
【化６】
（式（５）中、Ｒは、ヘキサノイル基、グルタロイル基、プロパノイル基又はスクシニル基を表し、Ｘはキャリアタンパク質から一アミノ基を除いた残部を表す。）
【請求項１５】
神経細胞における酸化的損傷を抑制する化合物のスクリーニング方法であって、
非ヒト動物に１種又は２種以上の試験化合物を投与する工程と、
前記試験化合物を投与した前記非ヒト動物から採取される被験試料中の請求項１〜４のいずれかに記載の神経細胞の酸化的損傷マーカー化合物の量を測定する工程と、
を備える、スクリーニング方法。
【請求項１６】
神経細胞における酸化的損傷を抑制する食品のスクリーニング方法であって、
非ヒト動物に１種又は２種以上の食品を投与する工程と、
前記食品を投与した前記非ヒト動物から採取される被験試料中の請求項１〜４のいずれかに記載の神経細胞の酸化的損傷マーカー化合物の量を測定する工程と、
を備える、スクリーニング方法。
【図６】
【図７】
【図８】
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図７】
【図８】
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【公開番号】特開２００７−９９７３７（Ｐ２００７−９９７３７Ａ）
【公開日】平成１９年４月１９日（２００７．４．１９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００５−２９５０４９（Ｐ２００５−２９５０４９）
【出願日】平成１７年１０月７日（２００５．１０．７）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り 発行者名 日本過酸化脂質・フリーラジカル学会 刊行物名 過酸化脂質研究 第２９巻 発行年月日 平成１７年１０月１日
【出願人】（５０４１３９６６２）国立大学法人名古屋大学 (996)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１９年４月１９日（２００７．４．１９）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年１０月７日（２００５．１０．７）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り 発行者名 日本過酸化脂質・フリーラジカル学会 刊行物名 過酸化脂質研究 第２９巻 発行年月日 平成１７年１０月１日
【出願人】（５０４１３９６６２）国立大学法人名古屋大学 (996)
【Ｆターム（参考）】
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