移植用細胞保護溶液及び被覆保護細胞体
【課題】移植用の細胞を適切に保護する移植用細胞保護溶液を提供する。
【解決手段】移植用細胞保護溶液１３は、移植用の細胞を適切に保護すると共に、その機能を活性化させるものであって、移植用の細胞の機能を直接的又は間接的に活性化させるｅｘｅｎｄｉｎ−４等の細胞保護物質１５と、細胞保護物質１５に緩徐かつ持続的な薬理効果を与える共に、経時的に体内に吸収される性質を有するコラーゲン等の被覆物質１４とを含む。
【解決手段】移植用細胞保護溶液１３は、移植用の細胞を適切に保護すると共に、その機能を活性化させるものであって、移植用の細胞の機能を直接的又は間接的に活性化させるｅｘｅｎｄｉｎ−４等の細胞保護物質１５と、細胞保護物質１５に緩徐かつ持続的な薬理効果を与える共に、経時的に体内に吸収される性質を有するコラーゲン等の被覆物質１４とを含む。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この発明は、細胞保護物質を含有する移植用細胞保護溶液、及び移植用細胞保護溶液で保護された被覆保護細胞体に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
インスリン依存状態糖尿病（以下、単に「糖尿病」という）の多くは、膵島におけるβ細胞の消失、若しくは膵臓の喪失によってインスリン分泌が枯渇することにより生じる。このような糖尿病患者は、生命維持のためにインスリン注射を行い、血糖をコントロールする必要がある。
【０００３】
また、糖尿病の他の治療法として、インスリンを分泌するβ細胞を含む膵島組織を、患者の体内に移植する方法（膵島移植）が知られている（特許文献１を参照）。例えば、膵島組織を点滴等で患者の門脈に注入すれば、肝臓内に生着した膵島細胞からインスリンが分泌され、血糖のコントロールが可能となる。
【０００４】
この場合の生着とは、膵島組織内に豊富に存在する毛細血管網と肝臓から伸びてきた毛細血管とが吻合して膵島組織内への血流が再開し、もともと膵臓に存在していたように肝臓の門脈内で血糖の変動に応じて適量のインスリンが適時に分泌されるようになった状態のことをいう。
【０００５】
生着する移植膵島量が充分な場合、インスリン注射をしなくとも血糖値をコントロールできるようになると考えられている（この状態を「インスリン離脱」という）。また、この方法はメジャーサージェリーを必要としないので、患者の身体的負担が少ないという利点がある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２００１−２９９９０８号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
図１０は移植された膵島細胞の量の経時変化を示す概念図であって、実線は門脈内に移植した場合の膵島量の推移を、破線は本発明によって可能となる膵島量の推移を示す。門脈内に移植された膵島細胞は、移植後急性期（６時間程度）で５０％以上が死滅する。これは、門脈内の膵島細胞が血小板や白血球等からの攻撃に晒されることが一因であると考えられている。
【０００８】
このため、現行の門脈内への膵島移植手技では、インスリン離脱を達成するために、ドナー１人から分離した膵島量では充分ではなく、複数のドナーからの膵島を使用する必要がある。また、膵島組織は一旦生着した後も種々のストレス（高血糖、免疫担当細胞による攻撃、免疫抑制剤など）によってその数は徐々に少なくなる。
【０００９】
このため、長期のインスリン離脱を可能とするためには、移植後早期においてできるだけ多くの膵島の生着を可能とする必要がある。すなわち、移植膵島細胞の生着率が高くなり、生着膵島細胞量が多くなればなるほどインスリン離脱の可能性は高くなり、かつインスリン離脱期間は長期になると期待される。
【００１０】
そこで、この発明は、このような状況に鑑みてなされたものであり、移植用の細胞を適切に保護する移植用細胞保護溶液、及び生着率の高い被覆保護細胞体を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
この発明に係る移植用細胞保護溶液は、移植用の細胞の機能を直接的又は間接的に活性化させる細胞保護物質と、前記細胞保護物質に緩徐かつ持続的な薬理効果を与えると共に、経時的に体内に吸収される性質を有する被覆物質とを含む。
【００１２】
上記組成の移植用細胞保護溶液において、被覆物質は、細胞保護物質を細胞に対して緩徐かつ持続的に作用させる性質を有する。その結果、酸素や栄養素の不足しがちな部位に細胞移植を行う場合でも、細胞のストレスを軽減することができる。一方、血小板、白血球、又は免疫担当細胞等からの攻撃を受けやすい部位に細胞移植を行う場合には、被覆物質は細胞をこれらの攻撃から保護する保護物質としても機能し得る。
【００１３】
ただし、被覆物質は、細胞と血管とが結びつくのを妨げたり、細胞から分泌される物質の拡散を妨げたりする障壁としても作用する。そこで、移植直後の所定期間は細胞を保護し、その後は消滅して細胞を露出させるのが望ましい。
【００１４】
前記被覆物質は、雰囲気（体内組織）に直接暴露されているのが望ましい。上記と同様の理由から、細胞を被覆する物質は必要最小限であることが望まれる。つまり、被覆物質は他の物質で覆われておらず、雰囲気に直接接しているのが望ましい。
【００１５】
前記被覆物質は、コラーゲンが望ましい。コラーゲンは、細胞保護物質に緩徐かつ持続的な薬理効果を与え、細胞との親和性が高く、かつ抗原性が極めて低いので、被覆物質として好適である。
【００１６】
また、前記被覆物質は、血管新生能を有する血管新生誘導因子をさらに含有してもよい。これにより、細胞と血管とが結びつきやすくなるので、細胞の生着率が向上する。前記血管新生誘導因子は、血管内皮細胞増殖因子、塩基性線維芽細胞増殖因子、酸性線維芽細胞増殖因子、血小板由来増殖因子、トランスフォーミング増殖因子−β、オステオネクチン、アンジオポイエチン、肝細胞増殖因子からなる群より選択された物質である。
【００１７】
この発明に係る被覆保護細胞体は、移植に用いられる細胞と、前記細胞を被覆する上記のいずれかに記載の移植用細胞保護溶液とを備える。一例として、前記細胞は腸間膜下への移植に用いられる膵島細胞であり、前記細胞保護物質はｅｘｅｎｄｉｎ−４、ＧＬＰ−１、及びリラグルチドのうちのいずれかである。
【００１８】
腸間膜下に移植される膵島細胞は、血液に直接接する機会が少ないので、血小板や白血球等の攻撃に晒されない代わりに、酸素や栄養の不足によるストレスが大きい。そこで、移植用細胞保護溶液を用いて、膵島細胞に対して細胞保護物質を緩徐かつ持続的に作用させることにより、移植直後における膵島細胞の生存率を飛躍的に向上させることができる。
【００１９】
なお、移植部位が血管以外の場所（例えば、腹腔内等）であれば、上記と同様の効果を得ることができる。しかしながら、腸間膜は門脈を介して肝臓とつながっているので、膵島細胞を腸間膜下に移植することにより、分泌されたインスリンを効率的に肝臓に供給することができる。
【００２０】
前記細胞保護物質はｅｘｅｎｄｉｎ−４であり、その含有濃度は１ｎｍｏｌ／Ｌ以上である。ｅｘｅｎｄｉｎ−４の含有濃度が１ｎｍｏｌ／Ｌを下回ると膵島細胞を十分に活性化させることができないからである。
【発明の効果】
【００２１】
この発明によれば、移植後の細胞を適切に保護できる移植用細胞保護溶液、及び生着率の高い被覆保護細胞体を得ることができる。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】この発明の一実施形態に係る被覆保護細胞体を示す概略図である。
【図２】図１の他の実施形態を示す図である。
【図３】アテロコラーゲンの徐効性能を確認する実験の結果を示す図である。
【図４】人体の内部組織の概略図である。
【図５】膵島細胞の移植部位と耐糖能との関係を示す図である。
【図６】４００個の膵島細胞を含む被覆保護細胞体を腸間膜下に移植した際の血糖値の変化を示す図である。
【図７】１５０個の膵島細胞を含む被覆保護細胞体を腸間膜下に移植した際の血糖値の変化を示す図である。
【図８】移植用細胞保護溶液の効果を確認する実験の結果を示す図である。
【図９】アテロコラーゲンの適正濃度を確認する実験の結果を示す図である。
【図１０】門脈内に移植された膵島細胞の数の経時変化を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
図１及び図２を参照して、この発明の一実施形態に係る被覆保護細胞体１１及び移植用細胞保護溶液１３を説明する。なお、図１は１つの細胞を保護する例を示す図、図２は複数の細胞を纏めて保護する例を示す図である。また、移植用細胞として膵島細胞１２を例にとって説明する。
【００２４】
図１に示されるように、被覆保護細胞体１１は、膵島細胞１２と、膵島細胞１２を被覆する移植用細胞保護溶液１３とで構成される。また、移植用細胞保護溶液１３は、膵島細胞１２を被覆する被覆物質１４と、被覆物質１４に添加される細胞保護物質１５とを少なくとも含んでいる。
【００２５】
膵島細胞１２は、膵臓内に存在する直径が５０〜７００μｍの細胞塊であり、血糖量を低下させるホルモンであるインスリンを分泌する。膵島細胞１２を得る方法としては、従来から知られている方法を用いることができる。例えば、まず、脳死ドナー、心停止ドナー、又は健常ドナーから膵臓の一部又は全部を摘出する。次に、消化酵素を用いて膵臓から膵島細胞を分離する。さらに、遠心分離によって膵島を純化することによって移植用の膵島細胞１２を得ることができる。
【００２６】
被覆物質１４は、膵島細胞１２、細胞保護物質１５、及びその他の添加剤を包含する物質である。また、細胞保護物質１５等を膵島細胞１２に対して緩徐かつ持続的に作用させる性質を有する。また、時間の経過に伴って徐々に体内に吸収される性質を有する。さらに、膵島細胞１２の足場となる基質（スカフォールド）としても機能する。なお、被覆物質１４の状態は特に限定されないが、体内では膵島細胞１２を安定して保持するためにゲル状であることが望ましい。
【００２７】
この被覆物質１４の具体例としては、ゼラチン、コラーゲン（天然型、組換え型、合成型）、ヒアルロン酸、及びポリ乳酸グリコール酸（Ｐｏｌｙ Ｌａｃｔｉｃ ａｃｉｄ／Ｇｌｙｃｏｌｉｃ Ａｃｉｄ：ＰＬＧＡ）等を挙げることができる。さらに、コラーゲンの一例として、アテロコラーゲンを挙げることができる。
【００２８】
アテロコラーゲンは、ウシ真皮からプロテアーゼ処理によって抽出されたコラーゲンであり、細胞保護物質１５に緩徐かつ持続的な薬理効果を与える。このアテロコラーゲンは、常温ではゾル状態であるが、体温下（３７℃前後）ではゲル化して固まる性質を有している。このため、移植細胞を容易に被覆することができ、かつ移植方法にも柔軟性を持たせることが可能となる。
【００２９】
また、蛋白質の両末端に存在するテロペプチドと呼ばれる抗原部位が除去されているので、ヒトに投与しても抗原性は示されず、免疫反応が起こらない。さらに、蛋白質構造の類似性から種間差に関係なく高い生体親和性を持ち、かつ生分解性を有する。こうした性質から既に医療機器として承認を受けており、皮内注入剤として２０年以上に亘って臨床使用されている。
【００３０】
上記の例のように、被覆物質１４としては、徐放性を有する公知の物質を採用することができる。ただし、この発明における被覆物質１４は、内部に保持している膵島細胞１２に対して細胞保護物質１５を緩徐かつ持続的に作用させるものであり、従来のように、薬剤を外部に徐放する徐放性剤とは用途が全く異なる。
【００３１】
なお、移植直後の細胞は、移植部位によって酸素や栄養の不足、あるいは患者の免疫活動等の様々なストレスに晒されるので、移植直後からの所定期間（少なくとも１ヶ月間）は被覆物質１４によって膵島細胞１２を保護することは極めて重要である。これにより、移植直後における膵島細胞１２の破壊を効果的に抑制することができる。
【００３２】
一方、移植された膵島細胞１２は、細胞間の毛細血管と患者の血管とが結びつくことによってインスリン分泌能が活性化される。また、分泌されたインスリンは、血管を通じて速やかに肝臓に供給される必要がある。しかしながら、被覆物質１４は、膵島細胞１２と患者の体内組織との間に立ちはだかって、細胞間の毛細血管と患者の血管とが結びつくのを妨げたり、膵島細胞１２から分泌されたインスリンの拡散を妨げたりする障壁としても作用する。
【００３３】
そこで、被覆物質１４は、アテロコラーゲンのように時間の経過に伴って徐々に体内に吸収され、一定期間経過後には消滅してしまう物質である必要がある。なお、被覆物質１４が膵島細胞１２を被覆保護する期間としては、少なくとも１ヶ月、より好ましくは３ヶ月の期間が必要である。
【００３４】
これにより、移植後急性期には膵島細胞１２を適切に保護することができ、その後は徐々に消滅して障壁としての作用を減じていく。また、上記と同様の理由から膵島細胞１２を被覆する物質は必要最小限であることが望まれる。すなわち、被覆物質１４は他の物質で覆われておらず、被覆保護細胞体１１の外郭を構成する（体内組織に直接暴露されている）のが望ましい。
【００３５】
細胞保護物質１５は、膵島細胞１２の機能を直接的又は間接的に活性化させる物質である。直接的因子の具体例としては、例えば、ｅｘｅｎｄｉｎ−４、ＧＬＰ−１（グルカゴン様ペプチド）、リラグルチド（ｌｉｒａｇｌｕｔｉｄｅ）等を挙げることができる。ｅｘｅｎｄｉｎ−４は、ドクトカゲの唾液腺において生成されるペプチドであって、膵島細胞１２によるインスリン分泌を促進する機能を有する。一方、間接的因子の具体例としては、例えば、抗炎症因子、抗アポトーシス因子、免疫抑制剤等を挙げることができる。
【００３６】
なお、細胞保護物質１５としてのｅｘｅｎｄｉｎ−４の被覆物質１４に対する含有濃度は、少なくとも１ｎｍｏｌ／Ｌ以上とするのが望ましい。含有濃度が１ｎｍｏｌ／Ｌを下回ると、膵島細胞１２を十分に活性化することができないからである。
【００３７】
上記構成の被覆保護細胞体１１は、被覆物質１４に含有される細胞保護物質１５が膵島細胞１２に対して緩徐かつ持続的に作用するので、酸素や栄養の不足しがちな部位に移植されても、膵島細胞１２の機能を長期間に亘って維持することができる。一方、血小板や白血球等の攻撃に晒される部位（例えば、血管内）に移植された場合には、被覆物質１４がこれらの攻撃から膵島細胞１２を保護する役割を担う。その結果、膵島細胞１２を移植する部位の選択肢が広がる。
【００３８】
なお、被覆物質１４は、細胞保護物質１５の他に、他の物質又は因子を含有していてもよい。例えば、血管新生誘導因子を含有させてもよい。血管新生とは、既存の血管から新たな血管枝が分岐して血管網を構築する生理現象であり、血管新生誘導因子はこの現象を促進する機能を有する。
【００３９】
血管新生誘導因子を含有させることにより、膵島細胞１２が血管と結び付き易くなるので、血管から酸素や栄養の供給を受けることができる。ただし、膵島細胞１２と血管とが結び付くにはある程度の時間（約数十日間）を必要とするので、細胞保護物質１５と併用するのが望ましい。つまり、移植の初期段階では被覆物質１４中の細胞保護物質１５が緩徐かつ持続的に作用し、その後は血管から酸素や栄養の供給を受けることにより、膵島細胞１２の機能を長期間に亘って維持することができる。
【００４０】
なお、血管新生誘導因子としては、例えば、血管内皮細胞増殖因子、塩基性線維芽細胞増殖因子、酸性線維芽細胞増殖因子、血小板由来増殖因子、トランスフォーミング増殖因子−β、オステオネクチン、アンジオポイエチン、及び肝細胞増殖因子等が挙げられる。
【００４１】
次に、図３を参照して、被覆物質１４による細胞保護物質１５の徐効性能を検証する。なお、「徐効性能」とは、細胞保護物質１５を緩徐かつ持続的に作用させる性能をさすものとする。
【００４２】
まず、アテロコラーゲン（被覆物質１４）とeｘｅｎｄｉｎ−４（細胞保護物質１５）とを混合した移植用細胞保護溶液１３を１００μｌずつ６本のテストチューブに分取する。なお、この移植用細胞保護溶液１３に含まれるアテロコラーゲンの濃度を３％、eｘｅｎｄｉｎ−４の濃度を１００ｎｍｏｌ／ｍｌとする。
【００４３】
次に、上記のテストチューブを４℃に保ち、１３００ｒｐｍで４分間遠心分離する。これにより、内部の気泡を除去することができる。そして、このテストチューブを３７℃に保ち、一晩静置する。これにより、アテロコラーゲンがゲル化する。
【００４４】
次に、上記のテストチューブにリン酸緩衝液生理食塩水（ＰＢＳ）を３００μｌ加え、３７℃に保った状態で所定の期間静置する。図３は、上記のテストチューブから０時間後、１時間後、５時間後、１日後、３日後、９日後に上清（３００μｌのＰＢＳ）を採取し、上清中のeｘｅｎｄｉｎ−４の濃度を測定した結果を示す図である。
【００４５】
図３を参照すれば、上澄み中にはほとんどeｘｅｎｄｉｎ−４が含まれておらず、９日後でも０．４２ｎｍｏｌ／ｍｌしか検出されなかったことが確認できる。これは、移植用細胞保護溶液１３に当初含まれていた量の約１．２６％に過ぎない。
【００４６】
上記の結果より、膵島細胞１２を上記の移植用細胞保護溶液１３で被覆すれば、細胞保護物質１５の薬理効果が膵島細胞１２に対して持続的に作用すると推測することができる。
【００４７】
次に、図４〜図９を参照して、膵島細胞１２の適切な移植部位を検討する。まず、図４を参照して、膵臓１０６から分泌されるインスリンは、門脈１０１を経由して肝臓１０５に供給される。門脈１０１は、上腸間膜静脈１０２、下腸間膜静脈１０３及び脾静脈１０４が合流し、肝臓１０５に向かう血管である。
【００４８】
そこで、従来と同様に門脈１０１に移植する場合と、門脈１０１及び門脈１０１より上流の血管（上腸間膜静脈１０２や下腸間膜静脈１０３等）に隣接する腸間膜下に移植する場合とにおけるマウスの耐糖能を測定した。
【００４９】
図５は、膵島細胞１２の移植部位とインスリン抵抗性との関係を示す図である。具体的には、ワイルドタイプと、膵島細胞１２を門脈内に移植した場合と、膵島細胞１２を腸間膜下に移植した場合とにおいて、インスリン抵抗性の指標であるＨＯＭＡ−ＩＲ（HOmeostasis Model Assessment as an index of Insulin Resistance）を比較した。
【００５０】
なお、ＨＯＭＡ−ＩＲは、空腹時血糖値（ｍｇ／ｄｌ）×空腹時インスリン濃度（Ｕ／ｍｌ）／４０５の計算式により計算される値である。また、この実験は、移植部位による差異を比較するために、被覆物質１４で覆われていない膵島細胞１２を用いて行った。
【００５１】
図５によれば、膵島細胞１２を門脈内に移植した場合のＨＯＭＡ−ＩＲは約２．２であるのに対し、腸間膜下に移植した場合のＨＯＭＡ−ＩＲは約１．３であった。つまり、膵島細胞１２を腸間膜下に移植した場合の耐糖能は、門脈内に移植した場合の約１．７倍高いことが明らかとなった。
【００５２】
上記の結果は、門脈１０１に移植された膵島細胞１２の多くが、血流に乗って門脈１０１の本管を通過し、門脈１０１の末梢部分に生着することに起因する。つまり、門脈１０１の末梢部分に生着する膵島細胞１２から分泌されるインスリンは、その近傍の極僅かの肝細胞にしか届かない。
【００５３】
一方、腸間膜と肝臓１０５とは門脈１０１でつながっているので、腸間膜下に生着した膵島細胞１２から分泌されるインスリンは、門脈１０１の本管を通って肝臓１０５全体に供給される。その結果、膵島細胞１２が分泌したインスリンを効率的に肝臓１０５に供給することができる。
【００５４】
インスリン抵抗性が低いとは、より少量のインスリン分泌で耐糖能を維持できるということであり、移植された膵島細胞１２の負荷が少ないということである。このことは、間接的に細胞保護にもつながる点で大きな意味を持っている。
【００５５】
したがって、耐糖能を向上させる観点からは、門脈１０１内よりも腸間膜下に膵島細胞１２を移植するのが望ましい。また、腸間膜下は門脈１０１内よりも生着床が広いので、生着率の向上も期待できる。
【００５６】
さらに、血管を閉塞する心配がないので、肝細胞障害等の発生を防止することも可能である。特に、ゲル状の被覆物質１４は血管を閉塞させる危険性が高いので、この発明の被覆保護細胞体１１は血管以外の部位に移植するのが望ましい。ここで、血管以外の移植部位として腹腔内等も候補に挙げることができるが、門脈１０１を介して肝臓１０５とつながっている腸間膜下が膵島細胞１２の移植部位として最も適していると考えられる。
【００５７】
ここで、被覆保護細胞体１１を腸間膜下に移植する方法を説明する。まず、細胞保護物質１５を含む被覆物質１４を腸間膜下に注入する。具体的には、３．０％のアテロコラーゲン（「被覆物質１４」に相当）と粉末状のｅｘｅｎｄｉｎ−４（「細胞保護物質１５」に相当）とを混合した３．０％アテロコラーゲン溶液（「移植用細胞保護溶液１３」に相当）を注入する。次に、腸間膜下の３．０％アテロコラーゲン溶液に膵島細胞１２（膵島の組織塊）を注入する。このとき、膵島細胞１２からできるだけ水分を除去しておくのが望ましい。
【００５８】
アテロコラーゲンは、常温下ではゾル状態であるが、体温下（３７℃前後）ではゲル化して固まる性質を有する。そのため、アテロコラーゲン注入直後（アテロコラーゲンがまだ固まる前）に膵島細胞１２を注入することによって、ゾル状態のアテロコラーゲン内に膵島細胞１２を均一に分布させることが可能となる。この後アテロコラーゲンはゲル化し、膵島細胞１２とｅｘｅｎｄｉｎ−４とを保持して腸間膜下に留まる。このとき、アテロコラーゲンの中は、局所的にｅｘｅｎｄｉｎ−４の濃度が高い領域となっている。このｅｘｅｎｄｉｎ−４は膵島細胞１２に対して徐々に薬効を示すので、膵島細胞１２の機能を持続的に活性化させることができる。
【００５９】
なお、被覆保護細胞体１１を移植する方法は、上記の方法に限定されない。すなわち、予めｅｘｅｎｄｉｎ−４を含む３．０％アテロコラーゲン溶液で膵島細胞１２を被覆しておき、これを患者の体内に移植するようにしてもよい。
【００６０】
次に、図６及び図７を参照して、腸間膜下に移植した被覆保護細胞体１１の効果を検証する。図６は、ワイルドタイプ（□）と、１００μｌの移植用細胞保護溶液１３で被覆した４００個の膵島細胞１２を腸間膜下に移植したマウス（○）との血糖値の変化を比較する図である。なお、移植用細胞保護溶液１３に含まれるアテロコラーゲンの濃度を３．０％、eｘｅｎｄｉｎ−４の濃度を１．４３×１０-10ｍｏｌ／ｍｌとする。また、図７は、移植する膵島細胞１２を１５０個とした以外は、図６と同じ条件である。
【００６１】
図６及び図７に示されるように、被覆保護細胞体１１を腸間膜下に移植すれば、血糖値の変化がワイルドタイプと同等の挙動を示すことが確認できる。つまり、移植した膵島細胞１２が生着し、十分な量のインスリンを分泌していることが分かる。
【００６２】
次に、図８を参照して、移植用細胞保護溶液１３の効果を検証する。図８は、移植用細胞保護溶液１３で被覆された１５０個の膵島細胞１２を腸間膜下に移植した場合（◇）、及び１５０個の膵島細胞１２を単体で腸間膜下に移植すると共に、eｘｅｎｄｉｎ−４を腹腔内に投与した場合（△）の血糖値の変化を示す図である。
【００６３】
図８を参照すれば、移植用細胞保護溶液１３で被覆した膵島細胞１２を移植した場合（◇）には、正常血糖値に達している。一方、膵島細胞１２を単体で移植した場合（△）には、血糖値の減少は確認されなかった。
【００６４】
つまり、膵島細胞１２を被覆物質１４で覆うことにより、生着率が大幅に向上することが確認された。また、細胞保護物質１５（ｅｘｅｎｄｉｎ−４）を膵島細胞１２とは別に投与しても顕著な効果は得られず、被覆物質１４に含有させて膵島細胞１２に緩徐かつ持続的に作用させることによって初めて生着率向上に寄与することが確認された。
【００６５】
次に、図９を参照して、被覆物質１４の適正濃度を検証する。図９は、４００個の膵島細胞１２を単体で門脈に移植した場合（○）、１．７５％のアテロコラーゲンで被覆した４００個の膵島細胞１２を腸間膜下に移植した場合（□）、eｘｅｎｄｉｎ−４を添加した１．７５％のアテロコラーゲンで被覆した４００個の膵島細胞１２を腸間膜下に移植した場合（◇）、及びeｘｅｎｄｉｎ−４を添加した３．０％のアテロコラーゲンで被覆した４００個の膵島細胞１２を腸間膜下に移植した場合（△）の血糖値の変化を示す図である。なお、eｘｅｎｄｉｎ−４の濃度は、１．４３×１０-10ｍｏｌ／ｍｌである。
【００６６】
図９を参照すれば、アテロコラーゲンの濃度を３．０％とした場合（△）には、門脈に移植した場合（○）と比較して正常血糖値に達するまでの時間は僅かに長いものの、正常血糖値に達していることが確認できる。一方、アテロコラーゲンの濃度を１．７５％とした場合（□、◇）には、正常血糖値に達することはなかった。
【００６７】
上記の結果より、アテロコラーゲンの濃度が低すぎると、膵島細胞１２の生着率が低下することが確認された。一方、アテロコラーゲンの濃度が高すぎると、移植用細胞保護溶液１３がゲル状となって移植が難しくなる。そこで、アテロコラーゲンの濃度は、２．０％〜５．０％、より好ましくは、２．５％〜３．５％程度とするのが適切である。
【００６８】
以上の結果は、適切な因子を組み合わせて被覆物質１４で覆うことによって、従来よりも少ない膵島量でインスリン離脱を達成できる可能性を示している。
【００６９】
なお、上記の実施形態においては、移植用の細胞として膵島細胞１２の例を説明したが、これに限ることなく、他の移植用の細胞にも適用することができる。つまり、細胞保護物質１５を含んだ被覆物質１４で細胞を覆うことにより、細胞保護物質１５の濃度が局所的に高い領域に細胞を保持し、細胞保護物質１５を緩徐かつ持続的に作用させることができる。その結果、細胞移植医療において対象となる付着系の機能細胞の生体への生着効率を向上させることができる。なお、「付着系の機能細胞」とは、糖尿病に対する膵島細胞１２の他に、パーキンソン病に対する黒質細胞や、脊髄損傷に対する神経細胞等を指す。このとき、細胞保護物質１５は、移植細胞に合わせて適切に選択する必要がある。
【００７０】
以上、図面を参照してこの発明の実施形態を説明したが、この発明は、図示した実施形態のものに限定されない。図示した実施形態に対して、この発明と同一の範囲内において、あるいは均等の範囲内において、種々の修正や変形を加えることが可能である。
【産業上の利用可能性】
【００７１】
この発明は、特に移植用の細胞に有利に利用される。
【符号の説明】
【００７２】
１１ 被覆保護細胞体
１２ 膵島細胞
１３ 移植用細胞保護溶液
１４ 被覆物質
１５ 細胞保護物質
１０１ 門脈
１０２ 上腸間膜静脈
１０３ 下腸間膜静脈
１０４ 脾静脈
１０５ 肝臓
１０６ 膵臓
【技術分野】
【０００１】
この発明は、細胞保護物質を含有する移植用細胞保護溶液、及び移植用細胞保護溶液で保護された被覆保護細胞体に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
インスリン依存状態糖尿病（以下、単に「糖尿病」という）の多くは、膵島におけるβ細胞の消失、若しくは膵臓の喪失によってインスリン分泌が枯渇することにより生じる。このような糖尿病患者は、生命維持のためにインスリン注射を行い、血糖をコントロールする必要がある。
【０００３】
また、糖尿病の他の治療法として、インスリンを分泌するβ細胞を含む膵島組織を、患者の体内に移植する方法（膵島移植）が知られている（特許文献１を参照）。例えば、膵島組織を点滴等で患者の門脈に注入すれば、肝臓内に生着した膵島細胞からインスリンが分泌され、血糖のコントロールが可能となる。
【０００４】
この場合の生着とは、膵島組織内に豊富に存在する毛細血管網と肝臓から伸びてきた毛細血管とが吻合して膵島組織内への血流が再開し、もともと膵臓に存在していたように肝臓の門脈内で血糖の変動に応じて適量のインスリンが適時に分泌されるようになった状態のことをいう。
【０００５】
生着する移植膵島量が充分な場合、インスリン注射をしなくとも血糖値をコントロールできるようになると考えられている（この状態を「インスリン離脱」という）。また、この方法はメジャーサージェリーを必要としないので、患者の身体的負担が少ないという利点がある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２００１−２９９９０８号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
図１０は移植された膵島細胞の量の経時変化を示す概念図であって、実線は門脈内に移植した場合の膵島量の推移を、破線は本発明によって可能となる膵島量の推移を示す。門脈内に移植された膵島細胞は、移植後急性期（６時間程度）で５０％以上が死滅する。これは、門脈内の膵島細胞が血小板や白血球等からの攻撃に晒されることが一因であると考えられている。
【０００８】
このため、現行の門脈内への膵島移植手技では、インスリン離脱を達成するために、ドナー１人から分離した膵島量では充分ではなく、複数のドナーからの膵島を使用する必要がある。また、膵島組織は一旦生着した後も種々のストレス（高血糖、免疫担当細胞による攻撃、免疫抑制剤など）によってその数は徐々に少なくなる。
【０００９】
このため、長期のインスリン離脱を可能とするためには、移植後早期においてできるだけ多くの膵島の生着を可能とする必要がある。すなわち、移植膵島細胞の生着率が高くなり、生着膵島細胞量が多くなればなるほどインスリン離脱の可能性は高くなり、かつインスリン離脱期間は長期になると期待される。
【００１０】
そこで、この発明は、このような状況に鑑みてなされたものであり、移植用の細胞を適切に保護する移植用細胞保護溶液、及び生着率の高い被覆保護細胞体を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
この発明に係る移植用細胞保護溶液は、移植用の細胞の機能を直接的又は間接的に活性化させる細胞保護物質と、前記細胞保護物質に緩徐かつ持続的な薬理効果を与えると共に、経時的に体内に吸収される性質を有する被覆物質とを含む。
【００１２】
上記組成の移植用細胞保護溶液において、被覆物質は、細胞保護物質を細胞に対して緩徐かつ持続的に作用させる性質を有する。その結果、酸素や栄養素の不足しがちな部位に細胞移植を行う場合でも、細胞のストレスを軽減することができる。一方、血小板、白血球、又は免疫担当細胞等からの攻撃を受けやすい部位に細胞移植を行う場合には、被覆物質は細胞をこれらの攻撃から保護する保護物質としても機能し得る。
【００１３】
ただし、被覆物質は、細胞と血管とが結びつくのを妨げたり、細胞から分泌される物質の拡散を妨げたりする障壁としても作用する。そこで、移植直後の所定期間は細胞を保護し、その後は消滅して細胞を露出させるのが望ましい。
【００１４】
前記被覆物質は、雰囲気（体内組織）に直接暴露されているのが望ましい。上記と同様の理由から、細胞を被覆する物質は必要最小限であることが望まれる。つまり、被覆物質は他の物質で覆われておらず、雰囲気に直接接しているのが望ましい。
【００１５】
前記被覆物質は、コラーゲンが望ましい。コラーゲンは、細胞保護物質に緩徐かつ持続的な薬理効果を与え、細胞との親和性が高く、かつ抗原性が極めて低いので、被覆物質として好適である。
【００１６】
また、前記被覆物質は、血管新生能を有する血管新生誘導因子をさらに含有してもよい。これにより、細胞と血管とが結びつきやすくなるので、細胞の生着率が向上する。前記血管新生誘導因子は、血管内皮細胞増殖因子、塩基性線維芽細胞増殖因子、酸性線維芽細胞増殖因子、血小板由来増殖因子、トランスフォーミング増殖因子−β、オステオネクチン、アンジオポイエチン、肝細胞増殖因子からなる群より選択された物質である。
【００１７】
この発明に係る被覆保護細胞体は、移植に用いられる細胞と、前記細胞を被覆する上記のいずれかに記載の移植用細胞保護溶液とを備える。一例として、前記細胞は腸間膜下への移植に用いられる膵島細胞であり、前記細胞保護物質はｅｘｅｎｄｉｎ−４、ＧＬＰ−１、及びリラグルチドのうちのいずれかである。
【００１８】
腸間膜下に移植される膵島細胞は、血液に直接接する機会が少ないので、血小板や白血球等の攻撃に晒されない代わりに、酸素や栄養の不足によるストレスが大きい。そこで、移植用細胞保護溶液を用いて、膵島細胞に対して細胞保護物質を緩徐かつ持続的に作用させることにより、移植直後における膵島細胞の生存率を飛躍的に向上させることができる。
【００１９】
なお、移植部位が血管以外の場所（例えば、腹腔内等）であれば、上記と同様の効果を得ることができる。しかしながら、腸間膜は門脈を介して肝臓とつながっているので、膵島細胞を腸間膜下に移植することにより、分泌されたインスリンを効率的に肝臓に供給することができる。
【００２０】
前記細胞保護物質はｅｘｅｎｄｉｎ−４であり、その含有濃度は１ｎｍｏｌ／Ｌ以上である。ｅｘｅｎｄｉｎ−４の含有濃度が１ｎｍｏｌ／Ｌを下回ると膵島細胞を十分に活性化させることができないからである。
【発明の効果】
【００２１】
この発明によれば、移植後の細胞を適切に保護できる移植用細胞保護溶液、及び生着率の高い被覆保護細胞体を得ることができる。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】この発明の一実施形態に係る被覆保護細胞体を示す概略図である。
【図２】図１の他の実施形態を示す図である。
【図３】アテロコラーゲンの徐効性能を確認する実験の結果を示す図である。
【図４】人体の内部組織の概略図である。
【図５】膵島細胞の移植部位と耐糖能との関係を示す図である。
【図６】４００個の膵島細胞を含む被覆保護細胞体を腸間膜下に移植した際の血糖値の変化を示す図である。
【図７】１５０個の膵島細胞を含む被覆保護細胞体を腸間膜下に移植した際の血糖値の変化を示す図である。
【図８】移植用細胞保護溶液の効果を確認する実験の結果を示す図である。
【図９】アテロコラーゲンの適正濃度を確認する実験の結果を示す図である。
【図１０】門脈内に移植された膵島細胞の数の経時変化を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
図１及び図２を参照して、この発明の一実施形態に係る被覆保護細胞体１１及び移植用細胞保護溶液１３を説明する。なお、図１は１つの細胞を保護する例を示す図、図２は複数の細胞を纏めて保護する例を示す図である。また、移植用細胞として膵島細胞１２を例にとって説明する。
【００２４】
図１に示されるように、被覆保護細胞体１１は、膵島細胞１２と、膵島細胞１２を被覆する移植用細胞保護溶液１３とで構成される。また、移植用細胞保護溶液１３は、膵島細胞１２を被覆する被覆物質１４と、被覆物質１４に添加される細胞保護物質１５とを少なくとも含んでいる。
【００２５】
膵島細胞１２は、膵臓内に存在する直径が５０〜７００μｍの細胞塊であり、血糖量を低下させるホルモンであるインスリンを分泌する。膵島細胞１２を得る方法としては、従来から知られている方法を用いることができる。例えば、まず、脳死ドナー、心停止ドナー、又は健常ドナーから膵臓の一部又は全部を摘出する。次に、消化酵素を用いて膵臓から膵島細胞を分離する。さらに、遠心分離によって膵島を純化することによって移植用の膵島細胞１２を得ることができる。
【００２６】
被覆物質１４は、膵島細胞１２、細胞保護物質１５、及びその他の添加剤を包含する物質である。また、細胞保護物質１５等を膵島細胞１２に対して緩徐かつ持続的に作用させる性質を有する。また、時間の経過に伴って徐々に体内に吸収される性質を有する。さらに、膵島細胞１２の足場となる基質（スカフォールド）としても機能する。なお、被覆物質１４の状態は特に限定されないが、体内では膵島細胞１２を安定して保持するためにゲル状であることが望ましい。
【００２７】
この被覆物質１４の具体例としては、ゼラチン、コラーゲン（天然型、組換え型、合成型）、ヒアルロン酸、及びポリ乳酸グリコール酸（Ｐｏｌｙ Ｌａｃｔｉｃ ａｃｉｄ／Ｇｌｙｃｏｌｉｃ Ａｃｉｄ：ＰＬＧＡ）等を挙げることができる。さらに、コラーゲンの一例として、アテロコラーゲンを挙げることができる。
【００２８】
アテロコラーゲンは、ウシ真皮からプロテアーゼ処理によって抽出されたコラーゲンであり、細胞保護物質１５に緩徐かつ持続的な薬理効果を与える。このアテロコラーゲンは、常温ではゾル状態であるが、体温下（３７℃前後）ではゲル化して固まる性質を有している。このため、移植細胞を容易に被覆することができ、かつ移植方法にも柔軟性を持たせることが可能となる。
【００２９】
また、蛋白質の両末端に存在するテロペプチドと呼ばれる抗原部位が除去されているので、ヒトに投与しても抗原性は示されず、免疫反応が起こらない。さらに、蛋白質構造の類似性から種間差に関係なく高い生体親和性を持ち、かつ生分解性を有する。こうした性質から既に医療機器として承認を受けており、皮内注入剤として２０年以上に亘って臨床使用されている。
【００３０】
上記の例のように、被覆物質１４としては、徐放性を有する公知の物質を採用することができる。ただし、この発明における被覆物質１４は、内部に保持している膵島細胞１２に対して細胞保護物質１５を緩徐かつ持続的に作用させるものであり、従来のように、薬剤を外部に徐放する徐放性剤とは用途が全く異なる。
【００３１】
なお、移植直後の細胞は、移植部位によって酸素や栄養の不足、あるいは患者の免疫活動等の様々なストレスに晒されるので、移植直後からの所定期間（少なくとも１ヶ月間）は被覆物質１４によって膵島細胞１２を保護することは極めて重要である。これにより、移植直後における膵島細胞１２の破壊を効果的に抑制することができる。
【００３２】
一方、移植された膵島細胞１２は、細胞間の毛細血管と患者の血管とが結びつくことによってインスリン分泌能が活性化される。また、分泌されたインスリンは、血管を通じて速やかに肝臓に供給される必要がある。しかしながら、被覆物質１４は、膵島細胞１２と患者の体内組織との間に立ちはだかって、細胞間の毛細血管と患者の血管とが結びつくのを妨げたり、膵島細胞１２から分泌されたインスリンの拡散を妨げたりする障壁としても作用する。
【００３３】
そこで、被覆物質１４は、アテロコラーゲンのように時間の経過に伴って徐々に体内に吸収され、一定期間経過後には消滅してしまう物質である必要がある。なお、被覆物質１４が膵島細胞１２を被覆保護する期間としては、少なくとも１ヶ月、より好ましくは３ヶ月の期間が必要である。
【００３４】
これにより、移植後急性期には膵島細胞１２を適切に保護することができ、その後は徐々に消滅して障壁としての作用を減じていく。また、上記と同様の理由から膵島細胞１２を被覆する物質は必要最小限であることが望まれる。すなわち、被覆物質１４は他の物質で覆われておらず、被覆保護細胞体１１の外郭を構成する（体内組織に直接暴露されている）のが望ましい。
【００３５】
細胞保護物質１５は、膵島細胞１２の機能を直接的又は間接的に活性化させる物質である。直接的因子の具体例としては、例えば、ｅｘｅｎｄｉｎ−４、ＧＬＰ−１（グルカゴン様ペプチド）、リラグルチド（ｌｉｒａｇｌｕｔｉｄｅ）等を挙げることができる。ｅｘｅｎｄｉｎ−４は、ドクトカゲの唾液腺において生成されるペプチドであって、膵島細胞１２によるインスリン分泌を促進する機能を有する。一方、間接的因子の具体例としては、例えば、抗炎症因子、抗アポトーシス因子、免疫抑制剤等を挙げることができる。
【００３６】
なお、細胞保護物質１５としてのｅｘｅｎｄｉｎ−４の被覆物質１４に対する含有濃度は、少なくとも１ｎｍｏｌ／Ｌ以上とするのが望ましい。含有濃度が１ｎｍｏｌ／Ｌを下回ると、膵島細胞１２を十分に活性化することができないからである。
【００３７】
上記構成の被覆保護細胞体１１は、被覆物質１４に含有される細胞保護物質１５が膵島細胞１２に対して緩徐かつ持続的に作用するので、酸素や栄養の不足しがちな部位に移植されても、膵島細胞１２の機能を長期間に亘って維持することができる。一方、血小板や白血球等の攻撃に晒される部位（例えば、血管内）に移植された場合には、被覆物質１４がこれらの攻撃から膵島細胞１２を保護する役割を担う。その結果、膵島細胞１２を移植する部位の選択肢が広がる。
【００３８】
なお、被覆物質１４は、細胞保護物質１５の他に、他の物質又は因子を含有していてもよい。例えば、血管新生誘導因子を含有させてもよい。血管新生とは、既存の血管から新たな血管枝が分岐して血管網を構築する生理現象であり、血管新生誘導因子はこの現象を促進する機能を有する。
【００３９】
血管新生誘導因子を含有させることにより、膵島細胞１２が血管と結び付き易くなるので、血管から酸素や栄養の供給を受けることができる。ただし、膵島細胞１２と血管とが結び付くにはある程度の時間（約数十日間）を必要とするので、細胞保護物質１５と併用するのが望ましい。つまり、移植の初期段階では被覆物質１４中の細胞保護物質１５が緩徐かつ持続的に作用し、その後は血管から酸素や栄養の供給を受けることにより、膵島細胞１２の機能を長期間に亘って維持することができる。
【００４０】
なお、血管新生誘導因子としては、例えば、血管内皮細胞増殖因子、塩基性線維芽細胞増殖因子、酸性線維芽細胞増殖因子、血小板由来増殖因子、トランスフォーミング増殖因子−β、オステオネクチン、アンジオポイエチン、及び肝細胞増殖因子等が挙げられる。
【００４１】
次に、図３を参照して、被覆物質１４による細胞保護物質１５の徐効性能を検証する。なお、「徐効性能」とは、細胞保護物質１５を緩徐かつ持続的に作用させる性能をさすものとする。
【００４２】
まず、アテロコラーゲン（被覆物質１４）とeｘｅｎｄｉｎ−４（細胞保護物質１５）とを混合した移植用細胞保護溶液１３を１００μｌずつ６本のテストチューブに分取する。なお、この移植用細胞保護溶液１３に含まれるアテロコラーゲンの濃度を３％、eｘｅｎｄｉｎ−４の濃度を１００ｎｍｏｌ／ｍｌとする。
【００４３】
次に、上記のテストチューブを４℃に保ち、１３００ｒｐｍで４分間遠心分離する。これにより、内部の気泡を除去することができる。そして、このテストチューブを３７℃に保ち、一晩静置する。これにより、アテロコラーゲンがゲル化する。
【００４４】
次に、上記のテストチューブにリン酸緩衝液生理食塩水（ＰＢＳ）を３００μｌ加え、３７℃に保った状態で所定の期間静置する。図３は、上記のテストチューブから０時間後、１時間後、５時間後、１日後、３日後、９日後に上清（３００μｌのＰＢＳ）を採取し、上清中のeｘｅｎｄｉｎ−４の濃度を測定した結果を示す図である。
【００４５】
図３を参照すれば、上澄み中にはほとんどeｘｅｎｄｉｎ−４が含まれておらず、９日後でも０．４２ｎｍｏｌ／ｍｌしか検出されなかったことが確認できる。これは、移植用細胞保護溶液１３に当初含まれていた量の約１．２６％に過ぎない。
【００４６】
上記の結果より、膵島細胞１２を上記の移植用細胞保護溶液１３で被覆すれば、細胞保護物質１５の薬理効果が膵島細胞１２に対して持続的に作用すると推測することができる。
【００４７】
次に、図４〜図９を参照して、膵島細胞１２の適切な移植部位を検討する。まず、図４を参照して、膵臓１０６から分泌されるインスリンは、門脈１０１を経由して肝臓１０５に供給される。門脈１０１は、上腸間膜静脈１０２、下腸間膜静脈１０３及び脾静脈１０４が合流し、肝臓１０５に向かう血管である。
【００４８】
そこで、従来と同様に門脈１０１に移植する場合と、門脈１０１及び門脈１０１より上流の血管（上腸間膜静脈１０２や下腸間膜静脈１０３等）に隣接する腸間膜下に移植する場合とにおけるマウスの耐糖能を測定した。
【００４９】
図５は、膵島細胞１２の移植部位とインスリン抵抗性との関係を示す図である。具体的には、ワイルドタイプと、膵島細胞１２を門脈内に移植した場合と、膵島細胞１２を腸間膜下に移植した場合とにおいて、インスリン抵抗性の指標であるＨＯＭＡ−ＩＲ（HOmeostasis Model Assessment as an index of Insulin Resistance）を比較した。
【００５０】
なお、ＨＯＭＡ−ＩＲは、空腹時血糖値（ｍｇ／ｄｌ）×空腹時インスリン濃度（Ｕ／ｍｌ）／４０５の計算式により計算される値である。また、この実験は、移植部位による差異を比較するために、被覆物質１４で覆われていない膵島細胞１２を用いて行った。
【００５１】
図５によれば、膵島細胞１２を門脈内に移植した場合のＨＯＭＡ−ＩＲは約２．２であるのに対し、腸間膜下に移植した場合のＨＯＭＡ−ＩＲは約１．３であった。つまり、膵島細胞１２を腸間膜下に移植した場合の耐糖能は、門脈内に移植した場合の約１．７倍高いことが明らかとなった。
【００５２】
上記の結果は、門脈１０１に移植された膵島細胞１２の多くが、血流に乗って門脈１０１の本管を通過し、門脈１０１の末梢部分に生着することに起因する。つまり、門脈１０１の末梢部分に生着する膵島細胞１２から分泌されるインスリンは、その近傍の極僅かの肝細胞にしか届かない。
【００５３】
一方、腸間膜と肝臓１０５とは門脈１０１でつながっているので、腸間膜下に生着した膵島細胞１２から分泌されるインスリンは、門脈１０１の本管を通って肝臓１０５全体に供給される。その結果、膵島細胞１２が分泌したインスリンを効率的に肝臓１０５に供給することができる。
【００５４】
インスリン抵抗性が低いとは、より少量のインスリン分泌で耐糖能を維持できるということであり、移植された膵島細胞１２の負荷が少ないということである。このことは、間接的に細胞保護にもつながる点で大きな意味を持っている。
【００５５】
したがって、耐糖能を向上させる観点からは、門脈１０１内よりも腸間膜下に膵島細胞１２を移植するのが望ましい。また、腸間膜下は門脈１０１内よりも生着床が広いので、生着率の向上も期待できる。
【００５６】
さらに、血管を閉塞する心配がないので、肝細胞障害等の発生を防止することも可能である。特に、ゲル状の被覆物質１４は血管を閉塞させる危険性が高いので、この発明の被覆保護細胞体１１は血管以外の部位に移植するのが望ましい。ここで、血管以外の移植部位として腹腔内等も候補に挙げることができるが、門脈１０１を介して肝臓１０５とつながっている腸間膜下が膵島細胞１２の移植部位として最も適していると考えられる。
【００５７】
ここで、被覆保護細胞体１１を腸間膜下に移植する方法を説明する。まず、細胞保護物質１５を含む被覆物質１４を腸間膜下に注入する。具体的には、３．０％のアテロコラーゲン（「被覆物質１４」に相当）と粉末状のｅｘｅｎｄｉｎ−４（「細胞保護物質１５」に相当）とを混合した３．０％アテロコラーゲン溶液（「移植用細胞保護溶液１３」に相当）を注入する。次に、腸間膜下の３．０％アテロコラーゲン溶液に膵島細胞１２（膵島の組織塊）を注入する。このとき、膵島細胞１２からできるだけ水分を除去しておくのが望ましい。
【００５８】
アテロコラーゲンは、常温下ではゾル状態であるが、体温下（３７℃前後）ではゲル化して固まる性質を有する。そのため、アテロコラーゲン注入直後（アテロコラーゲンがまだ固まる前）に膵島細胞１２を注入することによって、ゾル状態のアテロコラーゲン内に膵島細胞１２を均一に分布させることが可能となる。この後アテロコラーゲンはゲル化し、膵島細胞１２とｅｘｅｎｄｉｎ−４とを保持して腸間膜下に留まる。このとき、アテロコラーゲンの中は、局所的にｅｘｅｎｄｉｎ−４の濃度が高い領域となっている。このｅｘｅｎｄｉｎ−４は膵島細胞１２に対して徐々に薬効を示すので、膵島細胞１２の機能を持続的に活性化させることができる。
【００５９】
なお、被覆保護細胞体１１を移植する方法は、上記の方法に限定されない。すなわち、予めｅｘｅｎｄｉｎ−４を含む３．０％アテロコラーゲン溶液で膵島細胞１２を被覆しておき、これを患者の体内に移植するようにしてもよい。
【００６０】
次に、図６及び図７を参照して、腸間膜下に移植した被覆保護細胞体１１の効果を検証する。図６は、ワイルドタイプ（□）と、１００μｌの移植用細胞保護溶液１３で被覆した４００個の膵島細胞１２を腸間膜下に移植したマウス（○）との血糖値の変化を比較する図である。なお、移植用細胞保護溶液１３に含まれるアテロコラーゲンの濃度を３．０％、eｘｅｎｄｉｎ−４の濃度を１．４３×１０-10ｍｏｌ／ｍｌとする。また、図７は、移植する膵島細胞１２を１５０個とした以外は、図６と同じ条件である。
【００６１】
図６及び図７に示されるように、被覆保護細胞体１１を腸間膜下に移植すれば、血糖値の変化がワイルドタイプと同等の挙動を示すことが確認できる。つまり、移植した膵島細胞１２が生着し、十分な量のインスリンを分泌していることが分かる。
【００６２】
次に、図８を参照して、移植用細胞保護溶液１３の効果を検証する。図８は、移植用細胞保護溶液１３で被覆された１５０個の膵島細胞１２を腸間膜下に移植した場合（◇）、及び１５０個の膵島細胞１２を単体で腸間膜下に移植すると共に、eｘｅｎｄｉｎ−４を腹腔内に投与した場合（△）の血糖値の変化を示す図である。
【００６３】
図８を参照すれば、移植用細胞保護溶液１３で被覆した膵島細胞１２を移植した場合（◇）には、正常血糖値に達している。一方、膵島細胞１２を単体で移植した場合（△）には、血糖値の減少は確認されなかった。
【００６４】
つまり、膵島細胞１２を被覆物質１４で覆うことにより、生着率が大幅に向上することが確認された。また、細胞保護物質１５（ｅｘｅｎｄｉｎ−４）を膵島細胞１２とは別に投与しても顕著な効果は得られず、被覆物質１４に含有させて膵島細胞１２に緩徐かつ持続的に作用させることによって初めて生着率向上に寄与することが確認された。
【００６５】
次に、図９を参照して、被覆物質１４の適正濃度を検証する。図９は、４００個の膵島細胞１２を単体で門脈に移植した場合（○）、１．７５％のアテロコラーゲンで被覆した４００個の膵島細胞１２を腸間膜下に移植した場合（□）、eｘｅｎｄｉｎ−４を添加した１．７５％のアテロコラーゲンで被覆した４００個の膵島細胞１２を腸間膜下に移植した場合（◇）、及びeｘｅｎｄｉｎ−４を添加した３．０％のアテロコラーゲンで被覆した４００個の膵島細胞１２を腸間膜下に移植した場合（△）の血糖値の変化を示す図である。なお、eｘｅｎｄｉｎ−４の濃度は、１．４３×１０-10ｍｏｌ／ｍｌである。
【００６６】
図９を参照すれば、アテロコラーゲンの濃度を３．０％とした場合（△）には、門脈に移植した場合（○）と比較して正常血糖値に達するまでの時間は僅かに長いものの、正常血糖値に達していることが確認できる。一方、アテロコラーゲンの濃度を１．７５％とした場合（□、◇）には、正常血糖値に達することはなかった。
【００６７】
上記の結果より、アテロコラーゲンの濃度が低すぎると、膵島細胞１２の生着率が低下することが確認された。一方、アテロコラーゲンの濃度が高すぎると、移植用細胞保護溶液１３がゲル状となって移植が難しくなる。そこで、アテロコラーゲンの濃度は、２．０％〜５．０％、より好ましくは、２．５％〜３．５％程度とするのが適切である。
【００６８】
以上の結果は、適切な因子を組み合わせて被覆物質１４で覆うことによって、従来よりも少ない膵島量でインスリン離脱を達成できる可能性を示している。
【００６９】
なお、上記の実施形態においては、移植用の細胞として膵島細胞１２の例を説明したが、これに限ることなく、他の移植用の細胞にも適用することができる。つまり、細胞保護物質１５を含んだ被覆物質１４で細胞を覆うことにより、細胞保護物質１５の濃度が局所的に高い領域に細胞を保持し、細胞保護物質１５を緩徐かつ持続的に作用させることができる。その結果、細胞移植医療において対象となる付着系の機能細胞の生体への生着効率を向上させることができる。なお、「付着系の機能細胞」とは、糖尿病に対する膵島細胞１２の他に、パーキンソン病に対する黒質細胞や、脊髄損傷に対する神経細胞等を指す。このとき、細胞保護物質１５は、移植細胞に合わせて適切に選択する必要がある。
【００７０】
以上、図面を参照してこの発明の実施形態を説明したが、この発明は、図示した実施形態のものに限定されない。図示した実施形態に対して、この発明と同一の範囲内において、あるいは均等の範囲内において、種々の修正や変形を加えることが可能である。
【産業上の利用可能性】
【００７１】
この発明は、特に移植用の細胞に有利に利用される。
【符号の説明】
【００７２】
１１ 被覆保護細胞体
１２ 膵島細胞
１３ 移植用細胞保護溶液
１４ 被覆物質
１５ 細胞保護物質
１０１ 門脈
１０２ 上腸間膜静脈
１０３ 下腸間膜静脈
１０４ 脾静脈
１０５ 肝臓
１０６ 膵臓
【特許請求の範囲】
【請求項１】
移植用の細胞の機能を直接的又は間接的に活性化させる細胞保護物質と、
前記細胞保護物質に緩徐かつ持続的な薬理効果を与えると共に、経時的に体内に吸収される性質を有する被覆物質と
を含む移植用細胞保護溶液。
【請求項２】
前記被覆物質は、雰囲気に直接暴露されている
請求項１に記載の移植用細胞保護溶液。
【請求項３】
前記被覆物質は、コラーゲンである
請求項１又は２に記載の移植用細胞保護溶液。
【請求項４】
前記被覆物質は、血管新性能を有する血管新生誘導因子をさらに含有する
請求項１〜３のいずれか１項に記載の移植用細胞保護溶液。
【請求項５】
前記血管新生誘導因子は、血管内皮細胞増殖因子、塩基性線維芽細胞増殖因子、酸性線維芽細胞増殖因子、血小板由来増殖因子、トランスフォーミング増殖因子−β、オステオネクチン、アンジオポイエチン、肝細胞増殖因子からなる群より選択された物質である
請求項４に記載の移植用細胞保護溶液。
【請求項６】
移植に用いられる細胞と、
前記細胞を被覆する請求項１〜５のいずれか１項に記載の移植用細胞保護溶液と
を備える被覆保護細胞体。
【請求項７】
前記細胞は、腸間膜下への移植に用いられる膵島細胞であり、
前記細胞保護物質は、ｅｘｅｎｄｉｎ−４、ＧＬＰ−１、及びリラグルチドのうちのいずれかである
請求項６に記載の被覆保護細胞体。
【請求項８】
前記細胞保護物質はｅｘｅｎｄｉｎ−４であり、
その含有濃度は、１ｎｍｏｌ／Ｌ以上である
請求項７に記載の被覆保護細胞体。
【請求項１】
移植用の細胞の機能を直接的又は間接的に活性化させる細胞保護物質と、
前記細胞保護物質に緩徐かつ持続的な薬理効果を与えると共に、経時的に体内に吸収される性質を有する被覆物質と
を含む移植用細胞保護溶液。
【請求項２】
前記被覆物質は、雰囲気に直接暴露されている
請求項１に記載の移植用細胞保護溶液。
【請求項３】
前記被覆物質は、コラーゲンである
請求項１又は２に記載の移植用細胞保護溶液。
【請求項４】
前記被覆物質は、血管新性能を有する血管新生誘導因子をさらに含有する
請求項１〜３のいずれか１項に記載の移植用細胞保護溶液。
【請求項５】
前記血管新生誘導因子は、血管内皮細胞増殖因子、塩基性線維芽細胞増殖因子、酸性線維芽細胞増殖因子、血小板由来増殖因子、トランスフォーミング増殖因子−β、オステオネクチン、アンジオポイエチン、肝細胞増殖因子からなる群より選択された物質である
請求項４に記載の移植用細胞保護溶液。
【請求項６】
移植に用いられる細胞と、
前記細胞を被覆する請求項１〜５のいずれか１項に記載の移植用細胞保護溶液と
を備える被覆保護細胞体。
【請求項７】
前記細胞は、腸間膜下への移植に用いられる膵島細胞であり、
前記細胞保護物質は、ｅｘｅｎｄｉｎ−４、ＧＬＰ−１、及びリラグルチドのうちのいずれかである
請求項６に記載の被覆保護細胞体。
【請求項８】
前記細胞保護物質はｅｘｅｎｄｉｎ−４であり、
その含有濃度は、１ｎｍｏｌ／Ｌ以上である
請求項７に記載の被覆保護細胞体。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【公開番号】特開２０１１−２０７８４２（Ｐ２０１１−２０７８４２Ａ）
【公開日】平成２３年１０月２０日（２０１１．１０．２０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−７９２６６（Ｐ２０１０−７９２６６）
【出願日】平成２２年３月３０日（２０１０．３．３０）
【出願人】（５０４１３２２７２）国立大学法人京都大学 (1,269)
【出願人】（５９１０７１１０４）株式会社高研 (38)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２３年１０月２０日（２０１１．１０．２０）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年３月３０日（２０１０．３．３０）
【出願人】（５０４１３２２７２）国立大学法人京都大学 (1,269)
【出願人】（５９１０７１１０４）株式会社高研 (38)
【Ｆターム（参考）】
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