突然変異ＩｇＧＦｃフラグメントと融合した単一ＩＦＮ−ベータ
本発明は、２つのサブユニットを含む突然変異ＩｇＧ Ｆｃドメインと融合した単一ＩＦＮ−ベータを含むタンパク質タンパク質に関し、該第一のサブユニットがＩＦＮ−ベータタンパク質と連結していない突然変異ＩｇＧ Ｆｃ腕部を含み、第二のサブユニットが単一ＩＦＮ−ベータタンパク質と連結した突然変異ＩｇＧ Ｆｃ腕部を含み、そして該突然変異ＩｇＧ Ｆｃドメインがイムノグロブリンガンマ−１ Ｆｃドメインであり、更に該Ｆｃドメインが少なくとも５つの突然変異を有する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、突然変異ＩｇＧ Ｆｃフラグメントと融合した単一（ｓｉｎｇｌｅ）ＩＦＮ−ベータ（以下、ｓＩＦＮベータ−ＩｇＧＦｃｍｕｔと称する）、これをコードするヌクレオチド、これを含むベクター及び発現ベクター、これを用いて形質転換した宿主細胞、並びにこれらの医薬としての使用、及び特にこれらの多発性硬化症治療における使用に関する。該突然変異ＩｇＧ Ｆｃフラグメントと融合した単一ＩＦＮ−ベータは２つのサブユニットを有し、第一のサブユニットはＩＦＮ−ベータタンパク質と連結していない突然変異ＩｇＧ Ｆｃ腕部を含み、そして第二のサブユニットは単一ＩＦＮ−ベータタンパク質と連結した突然変異ＩｇＧ Ｆｃ腕部を含む。
【背景技術】
【０００２】
所望のタンパク質、例えばエリスロポエチン（ＥＰＯ）等と連結したイムノグロブリン（Ｉｇ）のＦｃフラグメントを含むタンパク質が、恐らく、成人肺に存在し、イムノグロブリンのＦｃフラグメントを認識し、これと結合し、これを捕えるＭＨＣクラスＩ型Ｆｃ受容体のＦｃＲｎとの結合を通じて、吸入投与に供されることが報告されている（ｃｆ Ｓｐｉｅｋｅｒｍａｎｎ ＧＭ ｅｔ ａｌ． ２００２）。タンパク質をイムノグロブリンＦｃフラグメントと融合することにより、ＦｃＲｎにより認識され得るハイブリッドタンパク質が得られる。前記イムノグロブリンＦｃフラグメントは、抗体重鎖のヒンジ領域（Ｈ）並びに第二ドメイン（ＣＨ２）及び第三ドメイン（ＣＨ３）を含む２つの同一の腕部から構成される。
【０００３】
ＦｃＲｎは、成体（ヒトは該当するが、げっ歯類は該当しない）上皮組織において活性であり、小腸内腔、肺気道、鼻腔表面、膣表面、結腸及び直腸表面において発現している（ＵＳ ６，４８５，７２６）。ＦｃＲｎ結合パートナーを含むタンパク質（例えばＩｇＧ、Ｆｃフラグメントを含む融合タンパク質）は、ＦｃＲｎにより上皮障壁を通過して効率的に輸送され、それにより、所望の治療用分子の非襲侵的な全身投与方法が提供される。
【０００４】
イムノグロブリン（例えばＩｇＧ）のＦｃフラグメント（Ｆｃドメインとも称される）は、イムノグロブリン（ＩｇＧ）又は前記Ｆｃドメインを含む融合タンパク質（ＩｇＧＦｃ）の投与に関与する、いわゆるエフェクター作用に寄与することが知られている。そのようなエフェクター作用は、Ｆｃ受容体（ＦｃγＲ）との相互作用を解する、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）、及び補体成分１ｑ（Ｃ１ｑ）との結合による補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）を含む。ＩｇＧアイソフォームは、異なるレベルのエフェクター作用をもたらす。ヒトＩｇＧ１及びＩｇＧ３は強力なＡＤＣＣ及びＣＤＣ効果を有するが、ヒトＩｇＧ２は弱いＡＤＣＣ及びＣＤＣ効果をもたらす。ヒトＩｇＧ４は、ＡＤＣＣ効果が弱く、ＣＤＣ効果は生じない。
【０００５】
ＡＤＣＣにおいて、抗体（例えばＩｇＧ）のＦｃ領域は、ナチュラルキラー細胞及びマクロファージ等の免疫エフェクター差異簿の表面のＦｃ受容体（ＦｃγＲ）と結合し、標的細胞のファゴサイトーシス又は溶解を引き起こす。
【０００６】
ＣＤＣにおいて、抗体（例えばＩｇＧ）は、細胞表面の補体カスケードを起動することにより、標的細胞を殺傷する。ＩｇＧアイソフォームの作用又は機能のレベルは、ＩｇＧ４＜ＩｇＧ２＜ＩｇＧ１＜ＩｇＧ３の順に増大する。
【０００７】
インターフェロンは、感染細胞が天然に分泌し、１９５７年に初めて同定された。それらの名称は、ウイルスの複製及び生産を「妨げる（インターフェア）」ことに由来する。インターフェロンベータは、現在多発性硬化症の治療に使用される周知のインターフェロンである。
【０００８】
例えば２個のＦｃＲｎ結合パートナー等の２個のイムノグロブリン定常領域の部分に対して１個の生体活性分子を有するモノマー−ダイマーハイブリッドが既に報告されている（ＷＯ ２００５／００１０２５）が、ホモダイマー（本明細書中では単にダイマーとも称される）又は２コピー以上の生体活性分子を有するより高次のマルチマーよりも効果的に機能及び輸送され得る。インターフェロンベータのモノマー−ダイマーハイブリッドは、ＷＯ ２００５／００１０２５に開示されている。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００９】
第一の側面において、本発明は、変異ＩｇＧ Ｆｃドメインと融合した単一ＩＦＮ−ベータ（以下本明細書中でｓＩＦＮベータ−ＩｇＧＦｃｍｕｔと称する）を提供する。本発明のｓＩＦＮベータ−ＩｇＧＦｃｍｕｔは２つのサブユニットで構成され、第一のサブユニットがＩＦＮ−ベータタンパク質と連結していない突然変異ＩｇＧＦｃ腕部（Ｆｃｍｕｔ腕部）を含み、そして第二のサブユニットが単一ＩＦＮ−ベータタンパク質と連結している突然変異ＩｇＧ Ｆｃ腕部（ｓＩＦＮベータ−Ｆｃｍｕｔ腕部）を含み、該突然変異ＩｇＧ Ｆｃドメイン（ＩｇＧＦｃｍｕｔ）が、イムノグロブリンガンマ（ＩｇＧ）−１ Ｆｃドメインであり、Ｋａｂａｔらにより定義されたＥＵインデックスの位置表記（Ｋａｂａｔ， Ｅ． Ａ． ｅｔ ａｌ． １９９１）で２３４、２３５、２３７、３３０、及び３３１が突然変異している。該突然変異の導入は、ＡＤＣＣ及びＣＤＣの低下を引き起こす。好ましい態様において、前記突然変異はＬ２３４Ａ、Ｌ２３５Ｅ、Ｇ２３７Ａ、Ａ３３０Ｓ及びＰ３３１Ｓである。もう一つの側面において、本発明は、本発明のｓＩＦＮベータ−ＩｇＧＦｃｍｕｔをコードする、例えばＤＮＡ等のポリヌクレオチド、該ＤＮＡを含むベクター、及びより具体的には発現ベクターを提供する。
【００１０】
もう一つの側面において、本発明は、例えばトランスフェクション等により、本発明のベクター、特に発現ベクターを含有するものとなった宿主細胞、好ましくはＣＨＯ細胞を提供する。
【００１１】
もう一つの側面において、本発明は、本発明のｓＩＦＮベータ−ＩｇＧＦｃｍｕｔを含む医薬組成物、及びその医薬としての、特に多発性硬化症治療のための使用を提供する。
【００１２】
もう一つの側面において、本発明は、有毛細胞白血病、カポジ肉腫、慢性骨髄性白血病、多発性硬化症、Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、ＨＩＶ並びに／又はエプスタイン・バー（Ｅｐｓｔｅｉｎ Ｂａｒｒ）、ヘルペスウイルス、及び／若しくはパピローマウイルスから選択されるウイルスにより引き起こされる感染の予防及び／又は治療用の医薬の製造における、本発明のｓＩＦＮベータ−ＩｇＧＦｃｍｕｔの使用を提供する。
【００１３】
もう一つの側面において、本発明は、本発明のｓＩＦＮベータ−ＩｇＧＦｃｍｕｔの製造方法を提供し、該方法は、本発明の宿主細胞、好ましくはＣＨＯ細胞の培養、及び本発明のｓＩＦＮベータ−ＩｇＧＦｃｍｕｔの単離を含む。
【００１４】
発明の詳細な説明
本発明は、肺を通じて、経口的に、又は皮下的に取り込まれて送達され得る、突然変異ＩｇＧ Ｆｃドメインと融合した単一ＩＦＮ−ベータ（以下、ｓＩＦＮベータ−ＩｇＧＦｃｍｕｔと称する）に関する。本発明のｓＩＦＮベータ−ＩｇＧＦｃｍｕｔは、循環系の中でなおも高い血清レベル及び半減期を維持しつつ、Ｆｃエフェクター作用を低下させ、良好な生体活性を示す。
【００１５】
第一の側面において、本発明は、２つのサブユニットを含むｓＩＦＮベータ−ＩｇＧＦｃｍｕｔを提供し、第一のサブユニットがＩＦＮ−ベータタンパク質と連結していない突然変異ＩｇＧＦｃ腕部（Ｆｃｍｕｔ腕部）を含み、そして第二のサブユニットが単一ＩＦＮ−ベータタンパク質と連結している突然変異ＩｇＧ Ｆｃ腕部（ｓＩＦＮベータ−Ｆｃｍｕｔ腕部）を含み、そして第二のサブユニットが単一ＩＦＮ−ベータタンパク質と連結している突然変異ＩｇＧ Ｆｃ腕部（ｓＩＦＮベータ−Ｆｃｍｕｔ腕部）を含み、該突然変異ＩｇＧ Ｆｃドメイン（ＩｇＧＦｃｍｕｔ）が、イムノグロブリンガンマ（ＩｇＧ）−１ Ｆｃドメインであり、Ｋａｂａｔらにより定義されたＥＵインデックスの位置表記（Ｋａｂａｔ， Ｅ． Ａ． ｅｔ ａｌ． １９９１）で２３４、２３５、２３７、３３０、及び３３１が突然変異している。該突然変異の導入は、ＡＤＣＣ及びＣＤＣの低下を引き起こす。好ましい態様において、前記突然変異はＬ２３４Ａ、Ｌ２３５Ｅ、Ｇ２３７Ａ、Ａ３３０Ｓ及びＰ３３１Ｓである。突然変異の位置を表す値の混乱を避けるため、以下の表１において、本発明の幾つかの配列番号とＥＵインデックスとの間のアミノ酸の位置の対応を記載する。
【００１６】
【表１】
【００１７】
集団中で異なるアロタイプのＩｇＧ１が見出される。配列番号１に挙げられるヒトＩｇＧ１の重鎖定常領域は、Ｕｎｉｐｒｏｔにおいて、「Ｇ１Ｍ（ｎｏｎ−１）マーカー」と称されるアロタイプである（受入番号Ｐ０１８５７）。本発明に記載される突然変異は、集団中に見出される全ての異なるアロタイプについで作製され得る。従って、本発明は、特定のアロタイプに限定されるべきではない。本発明において、Ｆｃドメインは「Ｇ１Ｍ（ｎｏｎ−１）マーカー」アロタイプに由来するものであった（実施例１を参照）が、そのＦｃドメインは、他のいずれのアロタイプに由来するものであってもよい。
【００１８】
ＡＤＣＣ及びＣＤＣを低下させるために、ＥＵインデックスの位置表記で少なくとも２３４、２３５、２３７、３３０、及び３３１を突然変異させたイムノグロブリンガンマ（ＩｇＧ）−１ Ｆｃドメインを、本明細書中で、ＩｇＧＦｃｍｕｔと称する場合がある。ＩＦＮ−ベータタンパク質と連結していないＩｇＧＦｃｍｕｔの腕部を、本明細書中で、Ｆｃｍｕｔ腕部と称する場合がある。単一ＩＦＮ−ベータタンパク質と連結しているＩｇＧＦｃｍｕｔの腕部を、ＩＦＮベータ−Ｆｃｍｕｔ腕部と称する場合がある（図１）。好ましい態様において、ＩｇＧＦｃｍｕｔにおける突然変異は、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ｅ、Ｇ２３７Ａ、Ａ３３０Ｓ及びＰ３３１Ｓである。
【００１９】
本明細書中で、Ｆｃドメインは、Ｆｃフラグメント、Ｆｃ−部分又はＦｃ領域と称される場合画ある。本明細書中で、「Ｆｃドメイン」、「Ｆｃフラグメント」、「Ｆｃ−部分」、又は「Ｆｃ領域」という用語は相互置換可能であり、同一の意味を有するものとして解釈されるべきである。
【００２０】
本発明のｓＩＦＮベータ−ＩｇＧＦｃｍｕｔは、ＷＯ ２００５／００１０２５に記載のＩＦＮ−ベータのモノマー−ダイマータンパク質と同様の生体活性を示す。ＩＦＮ−ベータの生体活性は、典型的には、例えば実施例５に記載される抗ウイルスアッセイにおいて測定される。
【００２１】
本発明のｓＩＦＮベータ−ＩｇＧＦｃｍｕｔは、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）及び補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）を低下又は阻害する。例えば、本発明のｓＩＦＮベータ−ＩｇＧＦｃｍｕｔは、Ｆｃ受容体であるＦｃγＲＩ、ＣＤ６４、ＩＩＡ、ＩＩＢ、ＩＩＩＡ及び／又はＩＩＩＢとの結合を低下又は阻害し、及び／又はＣ１ｑとの結合を低下又は阻害する。更に、本発明のｓＩＦＮベータ−ＩｇＧＦｃｍｕｔは、ＦｃＲｎの結合特性（又は親和性）を維持している。本発明のｓＩＦＮベータ−ＩｇＧＦｃｍｕｔがＡＤＣＣ及びＣＤＣを低下又は阻害しつつＦｃＲｎ結合が維持されるのは、Ｆｃドメインに５つの突然変異が存在するためである。本発明は、ＡＤＣＣ及びＣＤＣを低下又は阻害しつつ、同等の生体活性及び同等の結合特性を示すｓＩＦＮベータ−ＩｇＧＦｃｍｕｔを提供する。
【００２２】
本発明のｓＩＦＮベータ−ＩｇＧＦｃｍｕｔは、吸入により、又は皮下投与により投与され得る。
【００２３】
本発明のｓＩＦＮベータ−ＩｇＧＦｃｍｕｔは、循環系中の血清レベル及び半減期が高い（生体液中の存在時間が延長する）ため、皮下ルートが好ましい投与方法となる。
【００２４】
本発明のｓＩＦＮベータ−ＩｇＧＦｃｍｕｔは、プロテインＡ又はプロテインＧアフィニティーグロマトグラフィーを使用することにより精製することができる。
【００２５】
本発明のｓＩＦＮベータ−ＩｇＧＦｃｍｕｔは、Ｆｃ領域中に少なくとも５つの突然変異を含む。この態様において、ＡＤＣＣ及びＣＤＣが顕著に阻害され、又は顕著に低下する。
【００２６】
本発明は、２つのサブユニットを含むｓＩＦＮベータ−ＩｇＧＦｃｍｕｔを提供し、該第一のサブユニットがＩＦＮ−ベータタンパク質と連結していない突然変異ＩｇＧ Ｆｃ腕部（Ｆｃｍｕｔ腕部）を含み、第二のサブユニットが単一ＩＦＮ−ベータタンパク質と連結した同一のＩｇＧ Ｆｃドメインの突然変異Ｆｃ腕部（ＩＦＮベータ−Ｆｃｍｕｔ腕部）を含み、該突然変異ＩｇＧ Ｆｃドメイン（ＩｇＧＦｃｍｕｔ）が、イムノグロブリンガンマ（ＩｇＧ）−１ Ｆｃドメインであり、ＥＵインデックスの位置表記で少なくとも２３４、２３５、２３７、３３０、及び３３１が突然変異している。該突然変異の導入は、ＡＤＣＣ及びＣＤＣの低下を引き起こす。好ましい態様において、前記突然変異はＬ２３４Ａ、Ｌ２３５Ｅ、Ｇ２３７Ａ、Ａ３３０Ｓ及びＰ３３１Ｓである。
【００２７】
好ましい態様において、Ｆｃドメインは、ＥＵインデックスの位置表記で２９７に該当するアミノ酸のＮがＡに突然変異したものを含まない。一つの態様において、本発明は、２つのサブユニットを含むｓＩＦＮベータ−ＩｇＧＦｃｍｕｔを提供し、該第一のサブユニットがＩＦＮ−ベータタンパク質と連結していない突然変異ＩｇＧ Ｆｃ腕部（Ｆｃｍｕｔ腕部）を含み、第二のサブユニットが単一ＩＦＮ−ベータタンパク質と連結した突然変異ＩｇＧ Ｆｃ腕部（ＩＦＮベータ−Ｆｃｍｕｔ腕部）を含み、該Ｆｃドメインが、本発明のＩｇＧＦｃｍｕｔであり、該ＩＦＮベータ−Ｆｃｍｕｔ腕部がＩＦＮ−ベータと直接連結した突然変異ＩｇＧ Ｆｃ腕部を含む。本態様において、本発明のｓＩＦＮベータ−ＩｇＧＦｃｍｕｔは、ＩｇＧＦｃｍｕｔとＩＦＮ−ベータとの間にリンカーを含まない。
【００２８】
もう一つの態様において、本発明は、２つのサブユニットを含むｓＩＦＮベータ−ＩｇＧＦｃｍｕｔを提供し、該第一のサブユニットがＩＦＮ−ベータタンパク質と連結していない突然変異ＩｇＧ Ｆｃ腕部（Ｆｃｍｕｔ腕部）を含み、第二のサブユニットが単一ＩＦＮ−ベータタンパク質と連結した突然変異ＩｇＧ Ｆｃ腕部（ＩＦＮベータ−Ｆｃｍｕｔ腕部）を含み、該Ｆｃドメインが、本発明のＩｇＧＦｃｍｕｔであり、該ＩＦＮベータ−Ｆｃｍｕｔ腕部がＩＦＮ−ベータと直接連結していない突然変異ＩｇＧ Ｆｃ腕部を含む。
【００２９】
更なる好ましい態様において、ＩｇＧＦｃｍｕｔは、ＥＵインデックスの位置表記で２９７に該当するアミノ酸のＮがＡに突然変異したものを含まない。従って、本発明のＩｇＧＦｃｍｕｔの位置２９７には、アミノ酸Ｎが存在する。本発明のｓＩＦＮベータ−ＩｇＧＦｃｍｕｔは、ＩｇＧＦｃｍｕｔとＩＦＮ−ベータとの間に、リンカーを含む場合がある。
【００３０】
前記ＩｇＧ１ Ｆｃドメインは、ＥＵインデックスの位置表記でＬ２３４Ａ、Ｌ２３５Ｅ、Ｇ２３７Ａ、Ａ３３０Ｓ及びＰ３３１Ｓから選択される少なくとも５つの突然変異、又はＦｃドメインの他のいずれかの同等の位置に少なくともこれらの５つの突然変異を含む。故に、上記突然変異は、いずれのＩｇＧ１アロタイプのＦｃドメインにおいても作製することができる。
【００３１】
２３４（例えばＬ２３４Ａ）、２３５（例えばＬ２３５Ｅ）及び２３７（例えばＧ２３７Ａ）の３つの突然変異は、ＡＤＣＣを低下又は阻害するために設定され；３３０（例えばＡ３３０Ｓ）及び３３１（例えばＰ３３１Ｓ）は、ＣＤＣを低下又は阻害するために設定される。
【００３２】
幾つかの態様において、本発明のＦｃドメインは、ＣＨ２ドメイン及び／又はＣＨ３ドメイン、及び任意でＣＨ１ドメイン、ヒンジ領域、若しくはそれらのフラグメント、又はそれらの任意の組合せを含み、又はそれらから構成される。好ましくは、前記Ｆｃドメインは、ヒンジ領域若しくはそのフラグメント、ＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメインを含み、又はそれらから構成される。一つの態様において、前記Ｆｃドメインは、ＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメインを含み、又はそれらから構成される。
【００３３】
本明細書中で定義されるいわゆる「ヒンジ領域」は、ＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメインの間に位置する特定の領域である。ヒンジ領域は、タンパク質分解開裂に特に感受性で；そのようなタンパク質分解により、正確な開裂部位により、２つ又は３つのフラグメントが得られる。
【００３４】
一つの態様において、ヒンジ領域のフラグメントは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は１１アミノ酸で構成される。
【００３５】
もう一つの態様において、ヒンジ領域のフラグメントは、７アミノ酸で構成される。好ましくは、該ヒンジ領域は、配列番号２の配列（ＤＫＴＨＴＣＰ）を含み、又はこれから構成される。
【００３６】
より好ましくは、ＩｇＧＦｃｍｕｔは、配列番号３の配列を含み、又はこれから構成されるＦｃｍｕｔ腕部、並びに配列番号８の配列を含み、又はこれから構成されるｓＩＦＮベータ−ＩｇＧＦｃｍｕｔ腕部の１６７〜３９３アミノ酸残基部分により構成される（図１）。配列番号３の配列は、Ｌ１４Ａ、Ｌ１５Ｅ、Ｇ１７Ａ、Ａ１１０Ｓ及びＰ１１１Ｓの突然変異を含み、これらはそれぞれ、ＥＵインデックスの位置表記でＩｇＧ１突然変異のＬ２３４Ａ、Ｌ２３５Ｅ、Ｇ２３７Ａ、Ａ３３０Ｓ及びＰ３３１Ｓに対応する。配列番号８は、Ｌ１８０Ａ、Ｌ１８１Ｅ、Ｇ１８３Ａ、Ａ２７６Ｓ及びＰ２７７Ｓの突然変異を含み、これらはそれぞれ、ＥＵインデックスの位置表示に従い、ＩｇＧ１突然変異のＬ２３４Ａ、Ｌ２３５Ｅ、Ｇ２３７Ａ、Ａ３３０Ｓ及びＰ３３１Ｓに対応する。本発明のＦｃドメインは、エフェクター作用を低下又は阻害するために、更に改変される場合もある。
【００３７】
以下のＦｃ突然変異が、ＩｇＧ１ Ｆｃドメイン中ＥＵインデックス位置表示で以下の位置に更に導入される場合がある：
Ｔ２５０Ｑ及び／又はＭ４２８Ｌ、
Ｍ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ、Ｔ２５６Ｅ、Ｈ４３３Ｋ及び／又はＮ４３４Ｆ、
Ｅ２３３Ｐ、Ｌ２３４Ｖ、Ｌ２３５Ａ、ΔＧ２３６、Ａ３２７Ｇ、Ａ３３０Ｓ及び／又はＰ３３１Ｓ、
Ｅ３３３Ａ及び／又はＫ３２２Ａ。
【００３８】
Ｔ２５０Ｑ及び／又はＭ４２８Ｌ突然変異は、タンパク質の血清半減期を増大させ得る。
【００３９】
Ｍ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ、Ｔ２５６Ｅ、Ｈ４３３Ｋ及び／又はＮ４３４Ｆ突然変異は、タンパク質の血清半減期を増大させ得る。
【００４０】
Ｅ２３３Ｐ、Ｌ２３４Ｖ、Ｌ２３５Ａ、ΔＧ２３６、Ａ３２７Ｇ、Ａ３３０Ｓ及び／又はＰ３３１Ｓ突然変異は、ＡＤＣＣ及びＣＤＣを低下又は阻害し得る。
【００４１】
更に、Ｆｃ突然変異は、ＥＵインデックス位置表記で３３０、３３１ 、２３４、又は２３５、又はそれらの組合せから選択される位置における置換であり得る。更に、ＥＵインデックス位置表記で２２０のシステイン残基も、セリン残基で置換され得て、イムノグロブリン軽鎖定常領域とジスルフィド結合を通常形成するシステイン残基が排除される。
【００４２】
一つの態様において、本発明のｓＩＦＮベータ−ＩｇＧＦｃｍｕｔは、更に、Ｆｃドメインとサイトカインとの間にリンカーを含む。一つの態様において、該リンカーは、アミノ酸残基１〜３個の短いペプチド、又は例えば長さ１３アミノ酸残基の長いペプチドである。
【００４３】
前記リンカーは、サイトカインとイムノグロブリン配列との間に導入される、例えばＥＦＭ（Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ｍｅｔ）トリペプチド配列、又はＦＧＡＧＬＶＬＧＧＱＦＭ（ＧＩｕ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ｐｈｅ−Ｍｅｔ）を含む１３アミノ酸リンカー配列であり得る。好ましくは、該リンカーは、配列番号１３の配列（ＥＦＡＧＡＡＡＶ）を含み、又はこれから構成される。
【００４４】
好ましくは、前記ＩＦＮはヒトＩＦＮ−ベータ（ＩＦＮ−β）であり、より好ましくは組換えヒトＩＦＮ−ベータである。インターフェロンベータ−１ａは、分子量約２２，５００ドルトンの精製された１６６アミノ酸の糖タンパク質である。これは、一般に、ヒトインターフェロンベータ遺伝子を導入した遺伝子改変チャイニーズハムスター卵巣細胞を使用する組換えＤＮＡ技術により生産される。
【００４５】
好ましくは、前記ＩＦＮは、ＣＨＯ細胞由来等タンパクを有する組換えヒトＩＦＮ−ベータである。好ましくは、ＩＦＮ−β部分及びＦｃ鎖のいずれもグリコシル化されている。より好ましくは、該ＩＦＮ−ベータは、配列番号７の配列から構成される。
【００４６】
Ｒｅｂｉｆ（登録商標）及びＡｖｏｎｅｘ（登録商標）は、ＣＨＯ由来インターフェロンベータ−１ａの市販調製物の２つの例である。
【００４７】
Ｂｅｔａｓｅｒｏｎ（登録商標）は、Ｅ． ｃｏｌｉ由来インターフェロンベータ−１ｂの市販調製物の例である。
【００４８】
好ましくは、ＩＦＮ−ベータタンパク質と連結していない突然変異ＩｇＧ Ｆｃ腕部（Ｆｃｍｕｔ腕部）を含むｓＩＦＮベータ−ＩｇＧＦｃｍｕｔの第一のサブユニットは、配列番号３の配列を含み、又はこれから構成される。配列番号３の配列及びそのシグナルペプチド（マウスＩｇｋ軽鎖のシグナルペプチド−実施例１を参照されたい）は、配列番号５に挙げられている。
【００４９】
好ましくは、単一ＩＦＮ−ベータタンパク質と連結した突然変異ＩｇＧ Ｆｃ腕部（ＩＦＮベータ−Ｆｃｍｕｔ腕部）を含むｓＩＦＮベータ−ＩｇＧＦｃｍｕｔの第二のサブユニットは、配列番号８の配列を含み、又はこれから構成される。配列番号８の配列及びそのシグナルペプチド（ＩＦＮ−ベータシグナルペプチド）は、配列番号１０に挙げられている。
【００５０】
ｓＩＦＮベータ−ＩｇＧＦｃｍｕｔの例は、本明細書中で「コンパウンド１」と称されるタンパク質である。コンパウンドは、好ましくは本発明のｓＩＦＮベータ−ＩｇＧＦｃｍｕｔであり、配列番号３の配列及び配列番号８の配列から構成される。コンパウンド１は、Ｆｃドメインに５つの突然変異：Ｌ２３４Ａ（配列番号３及び５のＬ１４Ａ；配列番号８及び１０のＬ１８０Ａ）、Ｌ２３５Ｅ（配列番号３及び５のＬ１５Ｅ；配列番号８及び１０のＬ１８１Ｅ）、Ｇ２３７Ａ（配列番号３及び５のＧ１７Ａ；配列番号８及び１０のＧ１８３Ａ）、Ａ３３０Ｓ（配列番号３及び５のＡ１１０Ｓ；配列番号８及び１０のＡ２７６Ｓ）、Ｐ３３１Ｓ（配列番号３及び５のＰ１１１Ｓ；配列番号８及び１０のＰ２７７Ｓ）（標準的なヒトＩｇＧ重鎖ドメイン又はＥＵインデックス位置表記に従い番号を振られている）を有することにより、ＡＤＣＣ及びＣＤＣ活性を阻害する。コンパウンド１のＦｃドメインは、「Ｇ１Ｍ（ｎｏｎ−１）マーカー」アロタイプに由来する（実施例１を参照されたい）。
【００５１】
もう一つの側面において、本発明は、本発明のｓＩＦＮベータ−ＩｇＧＦｃｍｕｔをコードするＤＮＡ、該ポリヌクレオチドを含むベクター、及びより好ましくは発現ベクターを提供する。
【００５２】
一つの態様において、前記ポリヌクレオチドは、配列番号３、８、５、又は１０の配列をコードする。好ましくは、ポリヌクレオチドは、ｓＩＦＮベータ−ＩｇＧＦｃｍｕｔの第一のサブユニット（Ｆｃｍｕｔ腕部）をコードする配列番号４の配列を含み、又はこれから構成される。好ましくは、ポリヌクレオチドは、ｓＩＦＮベータ−ＩｇＧＦｃｍｕｔの第二のサブユニット（ＩＦＮベータ−Ｆｃｍｕｔ腕部）をコードする配列番号９の配列を含み、又はこれから構成される。好ましくは、ポリヌクレオチドは、ｓＩＦＮベータ−ＩｇＧＦｃｍｕｔの第一のサブユニット（Ｆｃｍｕｔ腕部）及びシグナルペプチド（即ちマウスＩｇｋ軽鎖のシグナルペプチド）をコードする配列番号６の配列を含み、又はこれから構成される。好ましくは、ｓＩＦＮベータ−ＩｇＧＦｃｍｕｔの第二のサブユニット（ＩＦＮベータ−Ｆｃｍｕｔ腕部）及びシグナルペプチド（即ちヒトＩＦＮ−ベータのシグナルペプチド）をコードする配列番号９の配列を含み、又はこれから構成される。
【００５３】
一つの態様において、本発明のＤＮＡは、双方向性プロモーターを含む。好ましくは、該双方向性プロモーターは、マウス双方向性ＣＭＶプロモーターである。
【００５４】
より好ましくは、本発明のポリヌクレオチドは、配列番号１２の配列を含み、又はこれから構成され、本明細書ではＣ３７０ベクターとも称される（図１１）。そのようなベクターは、コンパウンド１（即ち、配列番号６及び１１）をコードするＤＮＡ配列を含む。
【００５５】
もう一つの側面において、本発明は、例えば本発明のベクター、又は本発明のポリヌクレオチドをトランスフェクションして生じる、宿主細胞を提供する。
【００５６】
もう一つの側面において、本発明は、本発明のｓＩＦＮベータ−ＩｇＧＦｃｍｕｔを含む医薬組成物及びその医薬として、特に多発性硬化症治療のための使用を提供する。
【００５７】
本発明の医薬組成物は、多発性硬化症の診断、予防、及び／又は治療（局所的又は全身的）において有用である。
【００５８】
本発明の文脈中で、「治療」という用語は、疾患発症後の病理学的発達の減衰、低下、減少又は縮小を含む、疾患の進行に対する任意の有益な効果を指す。
【００５９】
本発明の医薬組成物は、医薬として許容される担体と共に投与されてもよい。
【００６０】
「医薬として許容される」という用語は、有効成分の生体活性の有効性に干渉せず、投与を受ける対象に毒性ではない任意の担体を含むことを意味する。例えば、非経口投与において、有効タンパク質は、生理食塩水、デキストロース溶液、血清アルブミン及びリンゲル溶液等のビヒクル中で、注射用単位剤形に製剤化され得る。
【００６１】
もう一つの側面において、本発明は、医薬として使用するための本発明の医薬組成物を提供する。もう一つの側面において、本発明は、患者に本発明の医薬組成物を投与することを含む、患者の疾患を治療する方法を提供する。好ましくは、前記疾患は、有毛細胞白血病、カポジ肉腫、慢性骨髄性白血病、多発性硬化症、Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、ＨＩＶ並びに／又はエプスタイン・バー（Ｅｐｓｔｅｉｎ Ｂａｒｒ）、ヘルペスウイルス、及び／若しくはパピローマウイルスから選択されるウイルスにより引き起こされる感染から選択される。より好ましくは、前記疾患は多発性硬化症である。一つの態様において、前記疾患は、寛解再発型多発性硬化症（ＲＲＭＳ）である。
【００６２】
もう一つの側面において、本発明は、本発明のｓＩＦＮベータ−ＩｇＧＦｃｍｕｔの、有毛細胞白血病、カポジ肉腫、慢性骨髄性白血病、多発性硬化症、Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、ＨＩＶ並びに／又はエプスタイン・バー（Ｅｐｓｔｅｉｎ Ｂａｒｒ）、ヘルペスウイルス、及び／若しくはパピローマウイルスから選択されるウイルスにより引き起こされる感染の予防及び／又は治療のための医薬を製造するための使用を提供する。
【００６３】
本発明の第一の使用において、本発明の医薬組成物は、肺投与される。
【００６４】
本発明の第二の使用において、本発明の医薬組成物は、鼻腔内投与される。
【００６５】
本発明の第三の使用において、本発明の医薬組成物は、吸入により投与される。
【００６６】
本発明の第四の使用において、本発明の医薬組成物は、経口投与されうる。
【００６７】
本発明の第五の使用において、本発明の医薬組成物は、血管内投与又は筋肉内投与される。
【００６８】
好ましい態様において、本発明の使用において、本発明の医薬組成物は、皮下投与される。
【００６９】
本発明の医薬組成物は、毎日、又は２日置きに、上記経路のいずれかに従い投与される。
【００７０】
皮下投与又は筋肉内投与が行われたとすると、本発明の医薬組成物は、１週間に１回、２回、又は３回投与されるが、より好ましくは、２週間置きに投与される。
【００７１】
非経口（例えば、血管内、皮下、筋肉内）投与において、本発明の医薬組成物は、医薬として許容される非経口ビヒクル（例えば水、生理食塩水、デキストロース溶液）、及び等張性（例えばマンニトール）又は化学的安定性（例えば保存料及び緩衝液）を維持する添加物と組み合わせた溶液、懸濁物、エマルジョン、又は凍結乾燥粉末として製剤化され得る。該製剤は、通常使用される技術により滅菌される。
【００７２】
本発明の医薬組成物の有効成分は、様々な方法で、個体に投与され得る。投与の経路として、皮内、経皮（例えば徐放製剤で）、筋肉内、腹膜内、血管内、皮下、硬膜外、局所、経口経路が挙げられ、そして好ましくは、エアロゾル投与、鼻腔内経路又は吸入により投与される。他の任意の治療的に効果的な投与径路が使用され得て、例えば上皮又は内皮を通じた吸収、又は遺伝子治療による投与が挙げられる。遺伝子治療において、前記有効成分をコードするＤＮＡ分子が患者に投与（例えばベクターを用いて）され、これがインビボでの前記有効成分の発現を引き起こす。加えて、本発明に係る医薬組成物は、医薬として許容される界面活性剤、賦形剤、単体、希釈剤、及びビヒクル等の他の生体有効成分と共に投与され得る。
【００７３】
好ましくは、本発明の使用において、本発明の医薬組成物は、スプレー装置、エアロゾルスプレー、又は吸入器により送達される。一つの態様において、本発明の医薬組成物は、既知の装置を使用して投与され得る。単一バイアル系（ｓｉｎｇｌｅ ｖｉａｌ ｓｙｓｔｅｍ）を含む例として、Ｒｅｂｉｊｅｃｔ（登録商標）等の溶液の送達用の自動注入器又はペン型注入器を含む。
【００７４】
もう一つの側面において、本発明は、本発明の医薬組成物を含む装置を提供する。好ましくは、該装置はスプレー装置である。
【００７５】
単発又は複数回投与として個体に投与される用量は、薬物動態的特性、投与径路、患者の状態及び特徴（性別、年齢、体重、健康状態、伸長）、症状の程度、併用療法、治療の頻度、及び所望の効果を含む様々な要素に依存して変化し得る。
【００７６】
「複数回投与使用」という表現は、複数回、例えば２、３、４、５、６回以上注入及び／又は吸入用の、医薬組成物、本発明のｓＩＦＮベータ−ＩｇＧＦｃｍｕｔの単一バイアル、アンプル、又はカートリッジの使用を含むことを意図する。該注入及び／又は吸入は、少なくとも、又は約１２時間、２４時間、４８時間等の時間にわたり、好ましくは１２日間に及んでなされる。該注入及び／又は吸入は、例えば、６、１２、２４、４８、又は７２時間等の間隔でなされ得る。
【００７７】
一つの態様において、本発明の使用において、本発明の医薬組成物は、対象あたり一日に約３０〜１２０μｇの用量でｓＩＦＮベータ−ＩｇＧＦｃｍｕｔが投与される。
【００７８】
好ましくは、本発明の使用において、本発明の医薬組成物は、吸入あたり約１、５、８、１０、１２、１５、２０、又はそれ以上の用量でｓＩＦＮベータ−ＩｇＧＦｃｍｕｔが投与される。
【００７９】
好ましくは、本発明の使用において、本発明の医薬組成物は、対象あたり一日に約３０〜１０，０００μｇの用量でｓＩＦＮベータ−ＩｇＧＦｃｍｕｔが投与され、又は対象あたり一日に約６０〜２０００μｇの用量でｓＩＦＮベータ−ＩｇＧＦｃｍｕｔが投与され、又は対象あたり一日に約９０〜１，０００μｇの用量でｓＩＦＮベータ−ＩｇＧＦｃｍｕｔが投与される。
【００８０】
一つの態様において、本発明の使用において、本発明の医薬組成物は、一回に少なくとも１０７μｇ、より好ましくは少なくとも１５７μｇの用量でｓＩＦＮベータ−ＩｇＧＦｃｍｕｔが投与される。
【００８１】
ｓＩＦＮベータ−ＩｇＧＦｃｍｕｔの重量（μｇ）に代えて、用量は、ＩＦＮ−ベータの当量で計算され得る。
【００８２】
もう一つの側面において、本発明は、本発明のｓＩＦＮベータ−ＩｇＧＦｃｍｕｔの製造方法を提供し、該方法は、本発明の宿主細胞の培養、及び本発明のｓＩＦＮベータ−ＩｇＧＦｃｍｕｔの単離を含む。
【００８３】
学術論文又は概説、公開又は未公開の米国又は外国の特許出願、又は他の任意の参考文献を含む、本明細書中に引用した全ての参考文献は、これらの引用される参考文献中に表されている全てのデータ、表、図及び文章を含め、全て本明細書中に参照により援用される。加えて、本明細書中に引用されるそれらの参考文献中に引用される参考文献の全ての内容も、全て参照により援用される。
【００８４】
前記具体的な態様の記載は、過度な実験を行うことなく、本発明の一般的概念から逸脱することなく、そのような具体的態様を適用するために、他者が、当該技術分野の通常の知識（本明細書中に引用される参考文献の内容を含む）を利用して、容易に改変及び／又は適応が可能となるように、本発明の一般的本質を全て明らかにするものである。従って、そのような適応及び改変は、本明細書中に表される教示及び誘導に基づいて、開示される態様の均等の意義の範囲内であると意図される。本明細書中の表現（ｐｈｒａｓｅｏｌｏｇｙ）又は用語（ｔｅｒｍｉｎｏｌｏｇｙ）は、記載を目的とするものであり、限定を目的とするものではない。
【図面の簡単な説明】
【００８５】
【図１】本発明の一つの態様を記載するものであり、ｓＩＦＮベータ−ＩｇＧＦｃｍｕｔの２つのサブユニットの模式図である。図１ａは、ｓＩＦＮベータ−ＩｇＧＦｃｍｕｔのＦｃ腕部における５つの突然変異を示し、それらにはＥＵインデックスの位置表記で番号が振られ、及びその機能が記載されている。図１ｂはｓＩＦＮベータ−ＩｇＧＦｃｍｕｔを表し、サブユニットの名称を明示している。
【００８６】
【図２】本発明の１つの態様を記載し、部位指向的突然変異生成によりコンパウンド１（即ち配列番号３）のＦｃｍｕｔ腕部内に導入されるアミノ酸突然変異と、ＭＧＣ／Ｉｍａｇｅ共同体クローン（ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ ｃｌｏｎｅ）から得たｃＤＮＡクローン由来のＦｃドメイン（ＰＥＡＫ８由来ｈＦｃ；「Ｃ１Ｍ（ｎｏｎ−１）マーカー」アロタイプ）の相等部分とを比較した、配列アラインメントを表している。番号付けは、配列番号３に基づく。最初の３つの突然変異はＡＤＣＣを低下させ、一方最後の２つはＣＤＣを低下させる。突然変異Ｌ１４Ａ（即ちＥＵインデックスのＬ２３４Ａ）、Ｌ１５Ｅ（即ちＥＵインデックスのＬ２３５Ｅ）及びＧ１７Ｅ（即ちＥＵインデックスのＧ２３７Ｅ）は、Ｆｃ受容体ＦｃγＲＩ、ＩＩＡ、ＩＩＢ及びＩＩＩＡとの結合を遮り、一方Ａ１１０Ｓ（即ちＥＵインデックスのＡ３３０Ｓ）及びＰ１１１Ｓ（即ちＥＵインデックスのＰ３３１Ｓ）は、補体カスケードイニシエータータンパク質Ｃ１ｑとの結合を遮る。
【００８７】
【図３】本発明の一つの態様を記載したものであり、コンパウンド１のＦｃｍｕｔ腕部（即ち配列番号３）、コンパウンド２の対応する部分（即ち配列番号１４を指す。コンパウンド２は、ＩＦＮ−βとＦｃドメインとの間に８アミノ酸のリンカー配列を含むモノマー−ダイマータンパク質であり、Ｆｃドメインに１つだけ突然変異を含む）、及び「Ｇ１Ｍ（ｎｏｎ−１）マーカー」アロタイプの定常領域重鎖（即ち配列番号１）の間の配列アラインメントを表す。「．」は、配列番号３が配列番号１及び１４と異なっているアミノ酸の位置を示す。「：」は、配列番号１４が配列番号１及び３と異なっているアミノ酸の位置を示す。
【００８８】
【図４】本発明の一つの態様を記載したものであり、コンパウンド１のＩＦＮベータ−Ｆｃｍｕｔ腕部（即ち配列番号８）、コンパウンド２の対応する部分（即ち配列番号１５）、及びヒトＩＦＮ−ベータ（ＵｎｉＰｒｏｔ受入番号Ｐ０１５７４）の間の配列アラインメントを表す。「（下矢印）」は、ＩＦＮ−ベータ−Ｆｃｍｕｔ腕部が突然変異している位置を示す。「（シャープ）」は、配列番号１５が突然変異している位置を示す。「（センテンス）」は、コンパウンド１及び２が構成されている２つの異なるアロタイプを特徴づける位置を示す。
【００８９】
【図５】本発明の一つの態様を記載したものであり、抗ウイルスアッセイのＷＩＳＨ／ＶＳＶ法（水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）の細胞変性作用（ＣＰＥ）に対する羊膜細胞株由来ＷＩＳＨ細胞の耐性試験）の結果を表す。曲線は、コンパウンド１、コンパウンド２及び組換えヒトＩＦＮ−β−１ａの用量応答曲線に対応する。データは、細胞変性作用の阻害のパーセンテージとして表される。
【００９０】
【図６】本発明の一つの態様を記載したものであり、ＷＩＳＨ細胞における抗増殖アッセイの結果を表す。曲線は、コンパウンド１、コンパウンド２及び組換えヒトＩＦＮ−β−１ａの用量応答曲線に対応する。データは、細胞増殖のパーセンテージとして表される。
【００９１】
【図７】本発明の一つの態様を記載したものであり、ベロ細胞におけるレポーター遺伝子アッセイ（ＲＧＡ）の結果を表す。曲線は、コンパウンド１、コンパウンド２及び組換えヒトＩＦＮ−β−１ａの用量応答曲線に対応する。データは、毎秒カウント（ｃｐｓ）として表される。
【００９２】
【図８】本発明の一つの態様を記載したものであり、コンパウンド１及びコンパウンド２と、ＣＤ６４をトランスフェクションしたＩＩＡ１．６細胞との相対的な結合を表す。
【００９３】
【図９】本発明の一つの態様を記載したものであり、コンパウンド１及びコンパウンド２とＣ１ｑとの結合を表す。図９ａはＩｇＧ１を含み、そして図９ｂはＩｇＧ１を除外している。
【００９４】
【図１０】本発明の一つの態様を記載したものであり、平均（ＳＤ）ＩＦＮ−β、コンパウンド１又はコンパウンド２の血清プロフィールを示す。曲線は、５５ｐＭｏｌ／ｋｇのＲｅｂｉｆ（登録商標）皮下投与後のＩＦＮ−β血清レベル；表面付着用量１３８ ｐＭｏｌ／ｋｇで吸入経路によりコンパウンド１を投与した後のコンパウンド１の血清レベル；及び表面付着用量１３８ ｐＭｏｌ／ｋｇで吸入経路によりコンパウンド２を投与した後のコンパウンド２の血清レベルに対応する。
【００９５】
【図１１】本発明の一つの態様を記載したものであり、コンパウンド１を生産するために使用される、Ｃ３７０発現ベクターを図示する。
【実施例】
【００９６】
以下において、本発明は、以下の実施例により例証されるが、これは、本発明の範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。
【００９７】
特定に使用される解析プロトコル
１．ＲＰ−ＨＰＬＣ
ＨＰＬＣ： Ａｇｉｌｅｎｔ １１００ Ｓｅｒｉｅｓシステム（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）
カラム： Ａｑｕａｐｏｒｅ ＢＵ−３００ ３０ｘ２．１ｍｍ（Ｂｒｏｗｎｌｅｅ ０７１１−００６２）
溶媒Ａ： 水中０．１％ＴＦＡ
溶媒Ｂ： ９０％アセトニトリル中０．１％ＴＦＡ
勾配（Ｇｒａｄｉｅｎｔ）： ＰｒｏｔＣ４
【００９８】
試料調製：
１５μｌ注入する。タンパク質を、最終体積が１００μｌとなるように溶媒Ａに溶解する。
【００９９】
２．ＳＤＳ−ＰＡＧＥ
ゲル： ＮｕＰａｇｅ ４−１２％ Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ＮＰ０３２２）
緩衝剤： ＮｕＰａｇｅ ＭＥＳ ＳＤＳ 泳動緩衝剤（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ＮＰ０００２）及び１０ｘ濃縮サンプル緩衝剤を使用する。還元条件にするため、１０ｍＭのＤＴＴを添加する。
泳動条件： ２００Ｖで４０分間泳動する。
【０１００】
試料調製：
１０μｌを充填する。タンパク質を、最終体積が２０μｌとなるように１０ｘサンプル緩衝剤に溶解する。９５℃で５分間加熱する。０．１％クーマシーブルー、３０％メタノール、１０％酢酸中で、４５分間染色する。３０％メタノール、１０％酢酸中で脱染色する。
【０１０１】
３．ＩＥＦ
ゲル： ｐＨ３〜１０ ＩＥＦゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ＥＣＣ６６５５Ａ）
緩衝剤： ＩＥＦ Ａｎｏｄｅ緩衝剤（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ＬＣ５３００）、ＩＥＦ Ｃａｔｈｏｄｅ緩衝剤（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ＬＣ５３１０）、ＩＥＦ ｐＨ３〜１０ サンプル緩衝剤（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ＬＣ５３１１）
【０１０２】
試料調製：１０μｌを充填する。試料を、１容のサンプル緩衝剤で希釈する（試料を加熱しない）。
泳動条件： １００ｖで１時間、２００ｖで１時間、４００ｖで１時間とする。
３０％メタノール、１０％酢酸で３０分間２回固定する。０．１％クーマシーブルー、３０％メタノール、１０％酢酸中で、４５分間染色する。３０％メタノール、１０％酢酸中で脱染色する。
【０１０３】
ウエスタンブロット
ブロッキング溶液： ＰＢＳ／０．１％、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ１００、５％ミルク
洗浄溶液： ＰＢＳ／０．１％、ＴｒｉｔｏｎＸ１００
抗体溶液： 洗浄溶液で抗体を希釈する。
【０１０４】
室温で１時間、又は４℃で一昼夜ブロッキングする。５分間３回洗浄する。室温で１時間一次抗体でインキュベーションし、３０分間洗浄する。室温で１時間一次抗体でインキュベーションし、少なくとも１時間洗浄する。
ＥＣＬによるウエスタンブロッティング： 試薬に付属している手順に従う。
【０１０５】
抗体
抗Ｆｃ抗体＝ヤギ抗ヒトＩｇＧ、ＦｃフラグメントＨＲＰ（１，０００ｘ希釈）（Ｊａｃｋｓｏｎ １０９−０３６−０９８）
抗ＩＦＮ−ベータ＝
一次抗体＝抗ＩＦＮ−ベータ−ｍａｂ １１７．１ ０．１μｇ／ｍｌ
二次抗体＝ヤギ抗マウスＩｇＧ ＨＲＰ（１，０００ｘ希釈）（Ｄａｋｏ Ｐ０４４７）
【０１０６】
５．脱グリコシル化
Ｎ−グリコシダーゼＦ（Ｒｏｃｈｅ １１ ３６５ １９３ ００１）
リン酸緩衝剤ｐＨ７．５／１０％アセトアミド中に１０μｇのｓＩＦＮベータ−ＩｇＧＦｃｍｕｔを添加する。これに５ＵのＰＮＧａｓｅ Ｆを添加して、３７℃で一昼夜インキュベーションする。
【０１０７】
６．脱グリコシル化後の還元
試料を、４ＭグアニジンＨＣＬ、１０ｍＭ ＤＴＴ中で、５６℃で１時間インキュベーションする。
【０１０８】
７．Ｎ末端シークエンシング
２００ピコモルを充填する。シークエンシングの前に、試料をＰｒｏｓｏｂカートリッジ（ＡＢＩ ４０２０５２）に充填する（Ｐｒｏｓｏｒｂカートリッジは、シークエンシングに適したマトリックス（ＰＶＤＦ膜）上に希釈したタンパク質試料を迅速に濃縮及び洗浄するために設計されている）。
装置：
Ｍｉｃｒｏｇｒａｄｉｅｎｔ １４０Ｃ ＨＰＬＣ （Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）と接続したＭｏｄｅｌ ４９４ Ｐｒｏｃｉｓｅマイクロシークエンシングシステム。
【０１０９】
８．アミノ酸解析
アミノ酸解析は、真空下窒素中の気相加水分解により実行される。１ｍｇ／ｍｌのフェノールを含む６Ｎ ＨＣｌ中で、１１２℃で２４時間処理（Ａｔｍｏｓｐｈｅｒｅ）する。アルファアミノ駱酸（ＡＡｂＡ）を、内部標準として加水分解産物中に含ませる。試料を２回解析する。加水分解したアミノ酸を、Ｗａｔｅｒｓ ＡＣＣＱ． Ｔａｇ化学パッケージを使用して定量する。
【０１１０】
Ｗａｔｅｒｓ ＡｃｃＱ． Ｔａｇ
これは、カラム前誘導体化技術である。ＡＡ誘導体をＲＰ−ＨＰＬＣで分画し、そして蛍光検出により定量する。Ａ３レベルの較正が得られる（２０、５０、及び１００ピコモル）。
【０１１１】
材料
ｉ）タンパク質加水分解：
反応バイアル集合（ａｓｓｅｍｂｌｙ）（ Ｗａｔｅｒｓ ＷＡＴ００７３６３）
試料チューブ（Ｗａｔｅｒｓ ＷＡＴ００７５７１）
Ｐｉｃｏ． Ｔａｇ ワークステーション（Ｗａｔｅｒｓ ＷＡＴ００７３７０）
【０１１２】
ｉｉ）ＡＡＡ誘導体化、分画及び定量：
ＨＰＬＣ： Ａｇｉｌｅｎｔ １０９０ Ｓｅｒｉｅｓシステム（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）
検出器： ＦＬＤ Ｇ１３２１Ａ Ａｇｉｌｅｎｔ １１００シリーズ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）
励起： ２５０ｎｍ
放射： ３９５ｎｍ
カラム： ＡｃｃＱ．Ｔａｇ Ｃ１８４μｍ ３．９ｘ１５０ｍｍ（Ｗａｔｅｒｓ ＷＡＴ０５２８２５）
溶媒Ａ： ９００ｍｌ Ｈ２Ｏ＋９０ｍｌ ＡｃｃＱ．Ｔａｇ Ｅｌｕｅｎｔ Ａ Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅ （ＷＡＴ０５２８９０）
溶媒Ｂ： 水中６０％アセトニトリル（Ｂａｋｅｒ ９０１７）
【０１１３】
【表２】
【０１１４】
９．ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ
マススペクトロメトリー解析は、リニアモードで操作するＶｏｙａｇｅｒ ＤＥ−ＰＲＯ ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦマススペクトロメーター（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）で実行された。エネルギー吸収分子として、シナピン酸を使用した。精製されたタンパク質試料を、１ｍｇ／ｍｌの濃度の０．１％ＴＦＡ溶液中に懸濁した。試料標的上に、１ｍｇのタンパク質をスポットした。該タンパク質液滴上に１μｌの飽和シナピン酸溶液（Ｈ２Ｏ＋０．１％ＴＦＡ中５０％アセトニトリル）を重層し、室温で感想させた。ＡＢＩの較正標準を使用して、各解析において質量較正を行った。
【０１１５】
１０．ＳＥ−ＨＰＬＣ法
ＨＰＬＣ： Ｗａｔｅｒｓ Ａｌｌｉａｎｃｅ ２６９５
移動相： 最終ｐＨ７．５の５ＯｍＭリン酸ナトリウム＋ＮａＣｌ ５００ｍＭ
カラム： 室温のＳｕｐｅｒｄｅｘ ２００ １０／３００ＧＬ。カラムは、垂直に使用しなければならない。
流速： ５００μＬ／分〜７５０μＬ／分（圧力は最高で２１０ｐｓｉ）
オートサンプラー： ５℃のＷａｔｅｒｓ Ａｌｌｉａｎｃｅ ２６９５
検出： Ｗａｔｅｒｓ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ２４７５（Ｅｍｐｏｗｅｒ Ｓｏｆｔｗａｒｅのエミュレーション４７４を用いる）を、励起波長２８０ｎｍ、放射波長３４８ｎｍ、ウインドウ１８ｎｍ、ゲイン１００， 減衰１で使用する。
【０１１６】
実施例１
本発明の好ましいタンパク質は、コンパウンド１と称される、ｓＩＦＮベータ−ＩｇＧＦｃｍｕｔである。コンパウンド１において、１つのサブユニット（ＩＦＮベータ−Ｆｃｍｕｔ腕部、配列番号８）は、ＩＦＮ−βと、ヒトＩｇＧ１ Ｆｃドメインの突然変異Ｆｃドメインとの融合産物である。他のサブユニット（Ｆｃｍｕｔ腕部、配列番号３）は、前記第一のサブユニットのＦｃ部分単独と同一である。両サブユニット中に存在するＦｃ部分の配列は、イムノグロブリンエフェクター機能を低下させるべく、「Ｇ１Ｍ（ｎｏｎ−１）マーカー」アロタイプの５つのアミノ酸を置換することにより改変されている（図１、３及び４）。比較のために、本明細書中で「コンパウンド２」と称される、ＷＯ ２００５／００１０２５に開示される、ＩＦＮ−ベータのモノマー−ダイマータンパク質が調製される。コンパウンド２は、ＩＦＮ−ベータとＦｃドメインとの間に８アミノ酸のリンカー配列を含み、異なるＩｇＧ１アロタイプと比較して、Ｆｃドメインにおいて１つだけ突然変異（即ち、ＥＵインデックス位置表記でＮ２９７Ｅ）を含む（図４）。
【０１１７】
ＩＦＮ−ベータと連結していないコンパウンド２のサブユニットは、配列番号１５に記載されている。８アミノ酸のリンカーを介してＩＦＮ−ベータと連結しているコンパウンド２のサブユニットは、配列番号１６に記載されている。
【０１１８】
コンパウンド１の生産は、血清不存在下で培養したＣＨＯ−Ｓ細胞のクローンの作製により構築される。ＣＨＯ−Ｓ細胞はチャイニーズハムスター卵巣細胞に由来し、無血清懸濁培養条件に適応している（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ／Ｇｉｂｃｏ， Ｌａ Ｊｏｌｌａ， ＣＡ）。
【０１１９】
１．クローニング
コンパウンド１の生産に使用される発現ベクターＣ３７０（図１１；Ｃ３７０ベクターの配列は、配列番号１２に記載される）は、双方向性マウスＣＭＶプロモーター（ＩＥ１及びＩＥ２）を含む。ＩＦＮ−ベータをコードする配列は、ヒトゲノムＤＮＡに由来するものであった。ＩｇＧ１重鎖ｃＤＮＡクローン（「Ｇ１Ｍ（ｎｏｎ−１）マーカー」アロタイプ）は、ヒト脾臓ｃＤＮＡライブラリーに由来するＭＧＣ／Ｉｍａｇｅ共同体クローンから取得されるものであった。突然変異ヒトＩｇＧ１ Ｆｃドメイン（ＩｇＧＦｃｍｕｔ）は、「Ｇ１Ｍ（ｎｏｎ−１）マーカー」アロタイプに由来するＦｃドメインを含むＰＥＡＫ８プラスミドからＰＣＲにより取得されるものであった。ここで該Ｆｃドメインは、Ｑｕｉｋ ｃｈａｎｇｅ ＩＩ突然変異生成システム（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を使用する２つの工程において突然変異したものであった。幾つかの単アミノ酸置換をＦｃドメインに導入することにより、ＡＤＣＣ／ＣＤＣを媒介するのに重要なアミノ酸を突然変異させた（図２〜４）。第一の工程において、配列番号１の１１７ＬＬＧＧ１２０（即ちＥＵインデックスの２３４ＬＬＧＧ２３７）アミノ酸をコードする配列を、１１７ＡＥＧＡ１２０に突然変異させた。第二の工程において、配列番号１のＡ２１３（ＥＵインデックスのＡ３３０）及びＰ２１４（ＥＵインデックスのＰ３３１）アミノ酸をコードする配列を、Ｓ２１３及びＳ２１４に突然変異させた。ｓＩＦＮベータ−ＩｇＧＦｍｕｔのＦｃ腕部とフレームを合わせた同種シグナルペプチド配列を含んで、ＩＦＮ−ベータをコードするｃＤＮＡを、オーバーラッピングＰＣＲ（ｏｖｅｒｌａｐｐｉｎｇ ＰＣＲ）により作製し、そしてＩＥ１プロモーターの下流をサブクローニングした。他の突然変異ｓＩＦＮベータ−ＩｇＧＦｍｕｔのＦｃ腕部の配列をコードする配列と融合したマウスＩｇｋ軽鎖のシグナルペプチド配列をコードするｃＤＮＡをＰＣＲにより作製し、ＩＥ２プロモーターの下流をサブクローニングした（図１１）。
【０１２０】
２．発現ベクターコンストラクト
それから、組換えＰＣＲによりＩＦＮベータ−Ｆｍｕｔ腕部融合遺伝子を作製し、これをＣＨＯ細胞内で高いレベルで恒常的に発現する発現ベクターにクローニングした。最終的なベクターＣ３７０は、マウス双方向性ＣＭＶプロモーターを含む。
【０１２１】
ＩＦＮ−ベータダイマーとｓＩＦＮベータ−ＩｇＧＦｍｕｔとの比率のバランスが望ましいものとなるように、Ｆｃｍｕｔ腕部コード配列を選択圧（ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｐｒｅｓｓｕｒｅ）に関連付けた。これにより、ＤＳＰ精製の過程でより容易にＩＦＮ−ベータダイマーを排除できる。前記マウスＣＭＶ双方向性プロモーターは、コンパウンド１の２つの鎖の発現を駆動する。ポリオウイルス内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）を使用して、前記選択（ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ）をＦｃｍｕｔ腕部と連動させる。インスレーター配列を使用することにより、クロマチン近傍部位へのランダム挿入で起こり得る発現単位の抑制が遮蔽される。
【０１２２】
３．トランスフェクション用ＤＮＡの調製
ステーブルトランスフェクションの水準を保証するために、トランスフェクション用プラスミドＤＮＡを調製した。ＤＨ５α細菌（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ， Ｃａｔ． ＃１８２６５−０１７）を、供給元のプロトコルに従って、オリジナルプラスミドＤＮＡを用いて形質転換し、アンピシリン１００μｇ／ｍｌの選択圧下で選択した。単一コロニーを拾い；細胞をアンピシリン１００μｇ／ｍｌを含む１ｍｌのＬＢ中で細胞を一昼夜培養して、それから１００ｍｌの培養で一昼夜増幅した。プラスミドは、Ｎｕｃｌｅｏｂｏｎｄ ＰＣ ５００ ＥＦキット（Ｍａｃｈｅｒｅｙ−Ｎａｇｅｌ， Ｃａｔ． ＃７４０５５０）のプロトコルに従って単離した。単離したプラスミドの水準は、ＯＤ２６０ｎｍ及びＯＤ２８０ｎｍを測定し、そしてＯＤ２６０ｎｍ／ＯＤ２８０ｎｍの比率が１．８を超えていることを測定することにより評価した。プラスミドの同一性は、４つの制限酵素を独立した反応で用いるＤＮＡ消化により評価した。Ｆｃｍｕｔ腕部及びＩＦＮベータ−Ｆｍｕｔ腕部のコード領域は、トランスフェクションに先立って両方向からシークエンシングされた。更に、プラスミドＤＮＡは、元のベクターを切断する適切な酵素を用いて直鎖にされた。本ベクターＣ３７０は、ＣｌａＩ（１．２５５ μｇ／μｌ）を用いて直鎖化された。
【０１２３】
４．宿主細胞の起源及び標準的な培養手順
前記ＣＨＯ−Ｓ細胞は、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから入手した。トランスフェクションしていないＣＨＯ−Ｓ細胞は、Ｌ−グルタミン（Ｓｉｇｍａ， Ｃａｔ． ＃Ｇ７５１３）を４．５ｍＭ添加したＰｒｏＣＨＯ５培地（Ｂｉｏ Ｗｈｉｔｔａｋｅｒ， Ｃａｔ． ＃１２−７６６０）中で培養した。トランスフェクションは、前記培地中で行った。選択において、４．５ｍＭのＬ−グルタミン及び１０μｇ／ｍｌのピューロマイシン（Ｓｉｇｍａ， Ｃａｔ． ＃Ｐ−７２５５）を添加したＰｒｏＣＨＯ５培地を使用した。１３０ｒｐｍで振盪するＴ７５フラスコ又はＥｒｌｅｎｍｅｙｅｒ（１３５ ｍｌ）フラスコ中で懸濁条件下の前記細胞株を培養し、これを５％ＣＯ２を含む３７℃インキュベーター中でインキュベーションした。基本的に、週２〜３回の頻度で、０．２ｘ１０６生存細胞／ウェルに希釈して、細胞を継代した。
【０１２４】
５．細胞の凍結、融解及び培養
通常、バイアル当り５〜１０ｘ１０６生存細胞の密度で細胞を凍結した。必要な量の細胞を遠心分離し、それから０．５ｍｌのＰｒｏＣＨＯ５培地に再懸濁した。次に、ＤＭＳＯ（Ｓｉｇｍａ）を１５％添加した０．５ｍｌのＰｒｏＣＨＯ５凍結培地（Ｂｉｏ Ｗｈｉｔｔａｋｅｒ， Ｃａｔ． ＃１２−７６８Ｅ）を添加した。この細胞を−８０℃で凍結し、それから窒素で冷却した保存タンクに移した。
【０１２５】
融解において、アンプルを３７℃のウォーターバスに置いた。次に、温めておいたＰｒｏＣＨＯ５培地１０ｍｌに細胞を移し、８００ｇで３分間遠心分離し、それからこれを、Ｔ７５フラスコ中の新鮮な培地に、０．２〜０．４ｘ１０６細胞／ｍｌで再懸濁した。週２〜３回の頻度で、０．２ｘ１０６生存細胞／ｍｌに希釈して、細胞を継代した。Ｔ７５フラスコにおいては１０〜２０ｍｌの培地で、Ｅｒｌｍｅｙｅｒフラスコにおいては３５ｍｌの培地で、細胞を培養した。
【０１２６】
６．ステーブルトランスフェクション
トランスフェクションの前日に、４．５ｍＭのＬ−グルタミンを添加したＰｒｏＣＨＯ５培地中で培養していたＣＨＯ−Ｓ細胞を、０．７ｘ１０６生存細胞／ｍｌに希釈した。トランスフェクションは、１２ｍｌｎのＣＨＯ−Ｓ及び１０μｇ（８μｌ）のＣ３７０を用いて、エレクトロポレーションにより実行した。
【０１２７】
７．選択
トランスフェクションの４８時間後、細胞を計数し、遠心分離により培地を除去し、それから細胞を選択培地（Ｌ−グルタミン４．５ｍＭ及びピューロマイシン１０μｇ／ｍｌを添加したＰｒｏＣＨＯ５）中で０．５ｘ１０６生存細胞／ｍｌに希釈した。培地は、２日置きに交換した。期間中、細胞密度をモニタリングし、生存細胞の数が０．１ｘ１０６生存細胞／ｍｌを下回ったときは、細胞をより小さい体積にまとめた。あるいは、生存細胞の数が増大したときは、細胞を０．４〜０．５ｘ１０６生存細胞／ｍｌに希釈した。この手順を、プールの生存率が９０％に達するまで繰り返した。取得されたプールの生産率（タイター及び１日の細胞あたりのピコグラム（ｐｃｄ））、及び生体活性（バイオアッセイ）が試験され、これらを単離プロトクローン（ｐｒｏｔｏｃｌｏｎｅ）に直接使用する。
【０１２８】
８．プロトクローンの単離
ステーブルトランスフェクション細胞のプールを、０．３％（ｖ／ｖ）の０．５％フェノールレッド溶液（Ｓｉｇｍａ， Ｃａｔ． ＃Ｐ０２９０）を添加した選択培地で、ウェルあたり（７０μｌ）１個の細胞が含まれるように希釈し、これを、Ｍｕｌｔｉｄｒｏｐ分注ロボット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｌａｂｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて、３８４ウェルにプレーティングした。播種の２週間後、単一のプロトクローンを拾い、これを選択剤を含まない適切な培地２００μｌに懸濁し、これを９６ウェルに再播種した。Ｂｅｃｋｍａｎ Ｂｉｏｍｅｋ ２０００ロボットを用いて、細胞を、１週間に１回２０倍に希釈した。
【０１２９】
９．クローンの単離及び評価
前記培養プロトクローンを、０．３％（ｖ／ｖ）のフェノールレッド溶液を添加した適切な培地で、０．４細胞／ウェル（７０μｌ）の濃度に希釈し、これを、Ｍｕｌｔｉｄｒｏｐ分注ロボットを用いて３８４ウェルにプレーティングした。播種の４、５日後、各ウェル中の増殖を検鏡し、単一のクローンのみ増殖しているウェルにマークを付けた。クローン性を確認するために、増殖細胞を有するウェルの数を計数し、これがプレート全体の３３％未満となるように維持した。培養の１５日後、選択されたクローンを２４ウェルプレートに移し、これを増殖させ、それから、定量Ｂｉａｃｏｒｅアッセイを用いて最初のプロトクローンのそれぞれにおける６つのクローンの生産性を更に解析した。Ｔ７５フラスコ中で、タイター及び特定の生産性（Ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐｒｏｄｕｃｔｉｖｉｔｙ）を、２４時間ごとに評価した。最良のクローンを４つ選択し、更に振盪フラスコ実験において解析した。あるいは、Ｂｉａｃｏｒｅ法に代えて、ＲＰ−ＨＰＬＣ及びＳＥ−ＨＰＬＣを、解析法として使用する場合がある。
【０１３０】
１０．生産性測定
タンパク質濃度及び特定の生産性を、２４時間ごとに測定した。このために、細胞を、１０ｍｌの新鮮な培地（６０ｒｐｍで攪拌するＴ７５フラスコ中）中に０．８ｘ１０６生存細胞／ｍｌで再懸濁した。２４時間後、細胞を計数し、１ｍｌの培養液を回収し、ＩＦＮ−β特異的Ｂｉａｃｏｒｅアッセイに供した。特定の生産性（１日の細胞あたりのピコグラム（ｐｃｄ）で表される）は、タイター（ｍｇ／ｌ）／期間の始まりから終わりまでの間の平均細胞密度／期間の長さ（１日）として、計算した。攪拌フラスコ実験において、ｐｃｄは、所定の期間にわたるＩＶＣの機能として計算した。
【０１３１】
１１．ＳＤＳ−ウェスタンブロット解析
培養上澄を、ウェスタンブロット解析に供した。簡単に述べると、タンパク質試料を厚さ１ｍｍの８〜１８％濃度勾配アクリルアミドゲルを使用して、４℃で交流（３０ｍＡ）のＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、その後、これをＰＶＤＦ膜に転写した。抗ＩＦＮβ又はＦｃモノクローナル抗体を、エピトープ検出に使用した。
【０１３２】
ノザンブロット解析
ＲＮｅａｓｙ ＭｉｎｉＫｉｔのプロトコル（Ｑｉａｇｅｎ， Ｃａｔ． ＃７４１０４）に従い、８ｘ１０６細胞からＲＮＡを単離した。製造者のプロトコルに従い、ＮｏｒｔｈｅｍＭａｘ（登録商標）−Ｇｌｙ ｋｉｔ（Ａｍｂｉｏｎ， Ｃａｔ． ＃１９４６）を使用して、ノザンブロットを実行した。ウェルあたり１００ｎｇのＲＮＡをウェルに注入し、これをアガロースゲル電気泳動（１％アガロース）により分離し、それからＴｕｒｂｏｂｌｏｔｔｅｒキット（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ ＆ Ｓｃｈｕｅｌｌ， Ｃａｔ． ＃１０４１６３２８）を使用して、これをＢｒｉｇｈｔＳｔａｒ−Ｐｌｕｓ膜（Ａｍｂｉｏｎ， Ｃａｔ． ＃１０１０２）に転写した。１０μｇのＲＮＡラダー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ， Ｃａｔ． ＃１５６２０−０１６）をサイズマーカーとして使用した。ＵＶ架橋（Ｓｔｒａｔａリンカー）によりＲＮＡを不動化し、そして焼き固めた（１０分、７０℃）。供給者のプロトコルに従い、ＤＩＧ Ｎｏｒｔｈｅｒｎ Ｓｔａｒｔｅｒ Ｋｉｔ （Ｒｏｃｈｅ， Ｃａｔ． ＃２０３９６７２）を使用して、ＤＩＧを用いたプローブ標識及びハイブリダイゼーション（６８℃）を実行した。ハイブリダイゼーションには、１００ｎｇ／ｍｌのＲＮＡプローブを使用した。Ｔ３ ＲＮＡポリメラーゼを用いる標準的なインビトロ転写プロトコルを使用して、プローブを調製した。
【０１３３】
取得されたパターンは、Ｈｙｐｅｒ Ｆｉｌｍ （Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ， Ｃａｔ． ＃ＲＰＮ２１０３Ｋ）に前記膜を曝露し、又はＣｈｅｍｉ Ｄｏｃ （ＢｉｏＲａｄ）を用いて画像を取得することにより検出された。
【０１３４】
実施例２
１．発現
６０ｍｇのコンパウンド１を生産するために、５Ｌスケールのバイオリアクター中で、一般的培養プロセスを実行した。使用する細胞株（クローン）はＣＨＯ−Ｓであり、これを、「ボーラス流加培養」法（単一添加物を用いたバッチ培養）中、無血清条件下で培養した。所望の量を生産するには、これを２回行う必要がある。
【０１３５】
各バイオリアクターの接種材料を作るために、細胞を振盪フラスコ中で増幅した。増幅は、１２５ｍｌ、５００ｍｌ、及び１，０００ｍｌのフラスコに、それぞれ３０ｍｌ、２００ｍｌ、及び５００ｍｌの培地を入れて行った。５Ｌのバイオリアクターは、接種材料や栄養分の体積を含めて、最終的に３Ｌの内容物を含んでいた。
【０１３６】
全ての段階で使用される維持培地は、４．５ｍＭのＬ−グルタミンを添加した、Ｃａｍｂｒｅｘ （Ｂｅｌｇｉｕｍ）製ＰｒｏＣＨＯ５であった。
【０１３７】
２つのボーラスが添加された。第一のボーラスは、０．６８ｇ／Ｌのヒポキサンチン、０．１９４ｇ／Ｌとなるチミジン０．５６ ｇ、４２ｍｇ／ＬのＬ−システイン−ＨＣＩ、０．５ｍＭの葉酸及び４．５ｍＭのＬ−グルタミン（最終濃度）を含むＦ１であった。ボーラスＦ２は、５ｍｇ／Ｌグルコースを含み、又は含まない４．５ｍＭ Ｌ−グルタミン（最終濃度）から構成された。培地中のグルコース量が３ｇ／Ｌを下回ったときにのみ、Ｆ２にグルコースを添加した。
【０１３８】
培養条件は、以下のように設定した。
−温度＝３７℃、細胞密度が最大になったときは３２℃に下げる。
−攪拌＝１００ｒｐｍ、最初のボーラス添加後、１２０〜１３０ｒｐｍに上げる。
−最高ｐＨ＝７．３．ＣＯ２インキュベーションにより、アルカリ化を制御した。
ＰＯ２＝飽和濃度の５０％とした。
【０１３９】
播種時点及び培養６週間後の培養試料の細胞濃度は、それぞれ４．０ｘ１０５及び３．４ｘ１０６であり、最終的な生存率は約７２％であった。
【０１４０】
培養のパラメーターはオンラインで測定され、制御された。細胞計数、Ｔｒｙｐａｎ Ｂｌｕｅによる生存率の評価、残留グルコース濃度（ＹＳＩ ａｎａｌｙｚｅｒ， Ｙｅｌｌｏｗ Ｓｐｒｉｎｇｓ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）及び定性的タンパク質発現パターンが、オフラインで測定された。
【０１４１】
２．精製
生産される他の形態からｓＩＦＮベータ−ＩｇＧＦｃｍｕｔタンパク質を効果的に単離する精製プロトコルが開発された。最初のＣＨＯプールの培養により生産される材料を用いて、精製プロセスが構築された。これを直接スケールアップし、プロトクローンから細胞培養上澄を精製するのに使用した。
【０１４２】
ここで、Ｆｃ−タグを付した分子は、以下のように称する：
−「遊離Ｆｃダイマー」（Ｆｃｍｕｔ腕部／Ｆｃｍｕｔ腕部）
−「ｓＩＦＮベータ−ＩｇＧＦｃｍｕｔ」（Ｆｃｍｕｔ腕部／ＩＦＮベータ−Ｆｃｍｕｔ腕部ヘテロダイマー）
−「ＩＦＮ−ベータダイマー」（ＩＦＮベータ−Ｆｃｍｕｔ腕部／ＩＦＮベータ−Ｆｃｍｕｔ腕部ホモダイマー）。
【０１４３】
精製工程は、前記上澄中に存在する「ｓＩＦＮベータ−ＩｇＧＦｃｍｕｔ」を濃縮しつつ、殆どの関連する含有物（「遊離Ｆｃダイマー」、「ＩＦＮ−ベータダイマー」、切断形態及び凝縮形態）及び非関連生産物（培地に由来するタンパク質及びＣＨＯ細胞により分泌されるタンパク質）を排除することを本質とする。プロテインＡによる最初の捕捉工程は、Ｆｃ−タグが付された全ての分子と結合する。それから、流出物は、ＩＦＮ−タグが付された分子と優勢に結合するＢｌｕｅ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅゲルに注入され、これによりほとんどの「遊離Ｆｃダイマー」を分離する。
【０１４４】
最後の２つの工程は、洗浄工程として機能し、「ＩＦＮ−ベータダイマー」及び高分子量分子の大部分を除去する、イオン交換クロマトグラフィー及びその後のサイズ排除クロマトグラフィーである。該プロセスは２回行われ、各回に開始材料として３Ｌの細胞培養上澄を使用して、所望の量のコンパウンド１を生産した。
【０１４５】
２．１．プロテインＡの捕捉工程
５３ｍｌのＭａｂ Ｓｅｌｅｃｔ Ｓｕｒｅ （ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を充填したカラムをＰＢＳで平衡化した後、線流速を３５ｃｍ／ｈまで低下させることにより、カラム上に一昼夜前記試料を注入した。それから、アウトプットシグナルがベースラインまで後退するまで、該カラムをＰＢＳで洗浄した。１００％の０．１Ｍグリシン（ｐＨ２．７）を用いて、溶出は単一の工程で行われた。溶出ピークがプールされ、１ｍｇ／ｍｌの濃度に相当するＡ［280］＝１．３８ＡＵをもたらすモル吸光係数１１０２３０を使用するＵＶにより定量された。
【０１４６】
溶出物（ｓＩＦＮベータ−ＩｇＧＦｃｍｕｔ、ＩＦＮ−ベータダイマー及びＦｃダイマー）の最も豊富な分子種のモル吸光係数は類似しているため、ＵＶ光度分析による直接の定量が可能である。それから、該溶液は０．１Ｍグリシン（ｐＨ２．７）で１．３ｍｇ／ｍｌに希釈され、すぐに２０％（ｖ／ｖ）の１Ｍトリス（ｐＨ８）を添加して中和された。
【０１４７】
２．２．Ｂｌｕｅ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅによる精製
Ｇ２５の緩衝剤交換工程の後、タンパク質の内容を定量し、そして該溶液を、Ｂｌｕｅ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ６ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗゲル（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に注入した。これを２回並行して行った。ｓＩＦＮベータ−ＩｇＧＦｃｍｕｔはこの媒体と容易に結合するが、遊離Ｆｃダイマーの殆どは、フロースルー分画に回収される。
【０１４８】
５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．５）を用いた第一の洗浄により、残留遊離Ｆｃダイマー種が除去され、そして５６％の５０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．５）及び４４％の４５％プロピレングリコール＋１．４Ｍ ＮａＣｌ＋５０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．５）溶液を用いた溶出工程により、一部の凝集物大美ＩＦＮ−ベータダイマーが除去された。１００％の４５％プロピレングリコール＋１．４Ｍ ＮａＣｌ＋５０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．５）緩衝液を用いた第二の溶出工程の溶出液は、大部分がｓＩＦＮベータ−ＩｇＧＦｃｍｕｔで、若干のＩＦＮ−ベータダイマーを含んでいた。
【０１４９】
２．３．Ｑ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗによる精製
Ｂｌｕｅ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ工程で得られた溶出物を、５０ｍＭのトリス（ｐＨ８．５）で緩衝剤交換し、これをＱ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗカラムに注入した。５０ｍＭのトリス（ｐＨ８．５）で洗浄した後、０．５ＭのＮａＣｌ＋５０ｍＭのトリス（ｐＨ８．５）に達する塩勾配を適用した。ｓＩＦＮベータ−ＩｇＧＦｃｍｕｔを含む強い主要なピークを回収し、ＵＶ−光度分析により定量した。
【０１５０】
それから、この溶出物を１０ｋＤａ Ｃｅｎｔｒｉｐｒｅｐフィルターユニット（Ａｍｉｃｏｎ）に注入し、次の最終工程の前に材料を濃縮した。
【０１５１】
２．４．Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００による精製
前記タンパク質溶液は、サイズ排除クロマトグラフィーに付された。高い分解能を維持するために、注入する体積を最小にし、故に、複数回の注入が必要であった。前記タンパク質を５０ｍＭトリス＋５００ｍＭ ＮａＣｌ＋１０％グリセロール（ｐＨ７．５）中で製剤化する旨が明記されていたので、ゲル濾過に使用された緩衝剤は、５０ｍＭトリス（ｐＨ７．５）＋５００ｍＭＮａＣｌであった。所望のタンパク質中に凝集物やＩＦＮ−ベータダイマーが入り込まないように、鋭いピークの中央部分のみを回収した。それから、カットオフが１０ｋＤａのＣｅｎｔｒｉｐｒｅｐフィルターを用いて前記タンパク質を１ｍｇ／ｍｌにまで濃縮し、１０％グリセロールを添加した。最後に、この溶液を、０．２２μｍ膜で滅菌し、分注した。バイアルを、−８０℃で保存した。
【０１５２】
最終的に精製されたタンパク質は、本質的に、ｓＩＦＮベータ−ＩｇＧＦｃｍｕｔで構成される。遊離Ｆｃダイマーは殆ど含まない。
【０１５３】
前記精製プロトコルは、ＣＨＯプロトクローンの細胞培養上澄３Ｌから、約６０ｍｇの精製コンパウンド１を取得できる。
【０１５４】
ｓＩＦＮベータ−ＩｇＧＦｃｍｕｔのＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析は、該タンパク質の両ポリペプチドがグリコステロイド（Ｆｃドメイン及びＩＦＮ−ベータ）であり、それらはジスルフィド結合により連結されている。従って、コンパウンド１の精製度及び活性の程度は高い。最終的な精製タンパク質は、本質的に、ｓＩＦＮベータ−ＩｇＧＦｃｍｕｔで構成される（遊離Ｆｃダイマーは殆ど含まない）。
【０１５５】
実施例３−生産能力
実施例１及び２に従い、コンパウンド１を発現するプールの生産が実行された。トランスフェクション及び選択の後、ＩＦＮ−βを測定するために開発されたＢｉａｃｏｒｅアッセイを用いて、前記分子の発現を試験した。
【０１５６】
ＰｒｏＣＨ５培地を使用して、前記プールの、２４時間の周期中の分泌を試験した。より高い特異的な生産性は、低温で取得された。
【０１５７】
標準的な１細胞／ウェルのアレイから、プロトクローンを単離した。約３００のプロトクローンを選択し、ＨＴＳフォーマットにおける生産能力を試験した。
【０１５８】
ＨＴＳアッセイの試験結果が最も良好な１５のプロトクローンを６ウェル及びＴ７５フラスコにおいて、２４時間周期のＨＴＳアッセイに付して、３つの候補プロトクローンを選択した。これらの３つのプロトクローンを、０．４細胞／ウェルのアレイによりクローニングした。各プロトクローンにおいて、２０クローンを選択するが、この際、それらが選択された元のプレートが、統計的なクローニングの基準（視覚的検査の後、２つのコロニーを有する任意のウェルを除き、回収率が３３％未満である）に適合することを確認する。
【０１５９】
まず、前記クローンを、ＨＴＳアッセイにおいてスクリーニングし、各プロトクローンを起源とするものから最良のクローン５つを、更に振盪フラスコ中のバッチ培養において試験した。最初の播種は、３７℃のＰｒｏＣＨＯ５に０．２ｘ１０６生存細胞／ｍｌで行った。振盪は、１３０ｒｐｍで行った。前記培養物は、生存率が低下し始める頃のＷＤ７で停止した。培養物は、細胞数、生存率、タイターが試験され、そしてＳＤＳ−ＷＢを実行して、異常な分子サイズ及び挿入を示すクローンを排除した。２つの最良のクローンは、３７℃でタイターが４０ｍｇ／ｌｔ、及びＰＣＤが４付近を示した。細胞密度は正常で、増殖は強力で、早期の細胞死の兆候も無く、ＳＤＳ−ＷＢブロットの検出では、完全な分子を発現していた。
【０１６０】
前記２つの最良のクローンを選択し、更に温度シフトを用いて、振盪フラスコ中で再試験した。それらの結果は、振盪フラスコ中で取得された最初の結果を補強するものであった。
【０１６１】
ＩＦＮ−ベータ特異的Ｂｉａｃｏｒｅアッセイによる検出において、１２０ｍｇ／ｌｔに達するタイターが、温度を下げることにより取得された。これは、コンパウンド１が由来する特定のクローンを使用して取得された。その細胞は、バッチ中、強力な増殖及び極めて良好な生存率を示した。特定の生産性は、１２ｐｃｄに達した。よって、このクローンは、有利なプロフィール、及び医薬品質管理基準／優良試験所基準（Ｇｏｏｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ／Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ Ｐｒａｃｔｉｃｅ （ＧＬＰ／ＧＭＰ））を満たす材料を生産するためのプロセス開発における非常に良好な可能性を示した。標準的なプロトコルに従い、回答後の生存率及び細胞増殖を評価した。ＦＤＡ準拠プロトコルを使用して、マイコプラズマ及び無菌性試験を行った。
【０１６２】
実施例４−安定性及び溶解度
４．１．使用されるバッチ
コンパウンド１を、前記元の緩衝剤：５ＯｍＭリン酸ナトリウム＋ＮａＣｌ ５００ｍＭ＋１０％グリセロール（ｐＨ７．５）で１：２に希釈した。試験に供されるタンパク質は、０．６６ｍｇ／ｍｌであった。
【０１６３】
４．２．試験条件
ＳＥ−ＨＰＬＣによる熱安定性：
−１週間４０℃
−１ヶ月５℃
−２５℃で１ヶ月２５℃
１サイクル及び５サイクル凍結／融解（−２０℃）後の安定性を、ＳＥ−ＨＰＬＣで測定した。
【０１６４】
４．３．結果
ｔ＝０の時点で、試料は、ｓＩＦＮベータ−ＩｇＧＦｃｍｕｔの濃度は９８．５％以上で、ＨＭＷは２％未満であった。
【０１６５】
１週間４０℃の後、ｓＩＦＮベータ−ＩｇＧＦｃｍｕｔの濃度は約８１％に低下し、ＨＭＷは約１９％となる。
【０１６６】
１ヶ月５℃の後、ｓＩＦＮベータ−ＩｇＧＦｃｍｕｔの濃度は約９９％であり、ＨＭＷは僅かに減少する。
【０１６７】
１ヶ月２５℃のインキュベーション後、２つの試料のいずれも沈殿が生じた。ＳＥＣ解析によると、予想されるｓＩＦＮベータ−ＩｇＧＦｃｍｕｔのピークは、より長い保留時間を経て溶出され、他のより低分子量のピークが存在していた。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びＮ−末端シークエンシング（ＳＤＳ−ゲル電気エイド後にＰＶＤＦ膜に転写する）による更なる解析の結果、融合部位付近が加水分解されるという仮説が確認され、そしてＩＦＮ−βの痕跡は何も見出されなかった。
【０１６８】
１回及び５回の凍結／融解の後、ｓＩＦＮベータ−ＩｇＧＦｃｍｕｔの含有量は、約９８％であった。
【０１６９】
４．４．凍結融解実験
試料を試験濃度に希釈し、４℃で少なくとも２４時間保管して平衡化する。それから、ｔ＝０時点でのＳＥＣプロフィールを測定した後、試料を少なくとも１日−２０℃で保管し、それから＋４℃で（少なくとも１日）溶解して、これをＳＥＣで解析する。
【０１７０】
４．５．凍結／融解実験（５サイクル）
試料を試験濃度まで希釈し、これを４℃で少なくとも２４時間保管して平衡化する。それから、ｔ＝０時点でのＳＥＣプロフィールを測定した後、試料を少なくとも１日−２０℃で保管し、それから＋４℃で（少なくとも１日）溶解して、これと同じ手順でこのサイクルを５回繰り返して凍結／融解する。最後に、５回目の融解の終了時（及び少なくとも２４時間４℃の再平衡化の時点）試料をＳＥＣにより解析する。
【０１７１】
４．６．溶解度
タンパク質を、５０ｍＭリン酸ナトリウム＋５００ｍＭ ＮａＣｌ＋１０％グリセロール（ｐＨ７．５）からなる緩衝剤（予備調製）中で、−８０℃で保存した。該パッチは、１．３２ｍｇ／ｍｌの濃度のコンパウンド１を含んでいた。保存緩衝液中のこのバッチについて、安定性及びＦ／Ｔ試験を行った。
【０１７２】
実施例５−２つのＩＦＮ−β−Ｆｃヘテロダイマータンパク質：コンパウンド１及びコンパウンド２の生物学的挙動
５．１．導入
ＩＦＮ−β１ａ（参照調製物３ＭＩＵ／ｍＬ、１１μｇ／ｍＬ）と比較して、ＩＦＮ−β−Ｆｃヘテロダイマータンパク質の２つの調製物、コンパウンド１及びコンパウンド２の生物学的挙動を、抗ウイルス性（ＷＩＳＨＡ／ＳＶ、図５）及び抗増殖性（ＷＩＳＨ細胞、図６）、及びレポーター遺伝子アッセイ（ｐＭｘ−ＬｕｃでトランスフェクションしたサルＶｅｒａ細胞）の観点から評価した。
【０１７３】
５．２．方法
５．２．１抗ウイルスアッセイ
ＩＦＮ−β−Ｆｃヘテロダイマータンパク質の抗ウイルス活性を、ＷＩＳＨ細胞（羊膜）にＩＦＮ−β分子が及ぼす、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ； Ｒｕｂｉｎｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ． １９８１）による細胞変性作用（ＣＰＥ）に対する防御効果を測定することにより研究された。
【０１７４】
ＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ中で増殖するＷＩＳＨ細胞を、８つ連続で１：１．５に希釈していったＩＦＮ−β試料（０．７ｎｇ／ｍＬで開始する）を含む９６ウェルマイクロタイターの各ウェル中に、ＭＥＭ＋５％ＦＢＳ中４ｘ１０４細胞の密度で播種した。そして、細胞を、３７℃、５％ＣＯ２で、１８〜２２時間インキュベーションした。このインキュベーション時間の最後に、ＶＳＶ懸濁物（ＭＥＭ＋２．５％ＦＢＳ中）を添加し、更に３７℃、５％ＣＯ２で２０〜２５時間インキュベーションした。それから細胞をＭＴＴ（３−［４，５−ジメチルチアゾール−２−イル］−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロマイド）で染色し、マルチウェル走査型分光光度計により、各ウェル中の光学密度（５９５ｎｍのＯ．Ｄ．）を測定した。
【０１７５】
前記ＩＦＮ−β−Ｆｃ調製物は、２つの独立した実験を経て、並行して試験された。故に、作成された用量応答曲線は、Ｓ字状（勾配が変化する）用量応答曲線により補間された（Ｇｒａｐｈ Ｐａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ）。濃度（ｐＭ）をｘ軸上に、そしてコントロールウイルス及びコントロール細胞（０％及び１００％増殖）で正規化した関連する吸光度（ＯＤ）の値を、細胞変性作用の阻害パーセントとしてｙ軸上に表した。
【０１７６】
５．２．２．抗増殖性アッセイ
ＭＥＭ＋５％ＦＢＳ中のＷＩＳＨ細胞を、９つ連続で１：２に希釈していったＩＦＮ−β試料（４０ｎｇ／ｍＬで開始する）を含む９６ウェルマイクロタイタープレートの各ウェル中に、１ｘ１０４細胞の密度で播種して、細胞を、３７℃、５％ＣＯ２で、７２時間インキュベーションした。このインキュベーション時間の最後に、細胞をＭＴＴで染色し、マルチウェル走査型分光光度計により、各ウェル中の光学密度（５９５ｎｍのＯ．Ｄ．）を測定した。
【０１７７】
前記ＩＦＮ−β−Ｆｃ調製物は、２つの独立した実験を経て、並行して試験された。故に、作成された用量応答曲線は、Ｓ字状（勾配が変化する）用量応答曲線により補間された（Ｇｒａｐｈ Ｐａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ）。濃度（ｐＭ）をｘ軸上に、そしてコントロール細胞（ＩＦＮ−β無添加、１００％増殖）で正規化したＯＤの値を、細胞増殖のパーセントとしてｙ軸上に表した。
【０１７８】
異なる細胞／ウイルス系（例えば（Ａ５４９／ＥＭＣＶ）及び異なる細胞株（Ｈｓ２９４Ｔ）も、抗ウイルス及び抗増殖活性の測定に使用され得る。
【０１７９】
５．２．３．レポーター遺伝子アッセイ
レポーター遺伝子アッセイ（ＲＧＡ）は、ＩＦＮ−β活性をモニタリングするための高度に特異的かつ高感度のインビトロバイオアッセイとして開発された。内性的ＩＦＮ−α及びＩＦＮ−βが欠損しているＶｅｒｏ細胞（アフリカミドリザル腎臓細胞、ＡＴＣＣ， ＣＣＬ ８１）に、ＩＦＮ−α／β誘導性マウスＭｘ１プロモーターの制御下にあるルシフェラーゼ（Ｌｕｃ）遺伝子を担持するｐＭｘ−Ｌｕｃプラスミドを用いてステーブルトランスフェクションした。ＩＦＮ−βによるＬｕｃ誘導性に基づき、１つのクローンを選択した（Ｃａｎｏｓｉ ｅｔ ａｌ． １９９６）。
【０１８０】
前記アッセイは、ルシフェラーゼによるルシフェリンの酸化により放出される光の測定に基づく。
【０１８１】
トランスフェクションされたサルＶｅｒａ細胞により生じるルシフェラーゼの量は、添加されたＩＦＮ−βの量に対応し、ソフトウェアに接続したルミノメーターにより自動的に測定される。
【０１８２】
最初の濃度が２３４ｐｇ／ｍＬで、これを７つ連続で１：２に希釈していったＩＦＮ−β試料を含む９６ウェルマイクロタイタープレートの各ウェル中に、前記Ｖｅｒａ細胞をを播種した（４０，０００細胞）。インキュベーション（３７℃、５％ＣＯ２）の約２１時間後、アッセイプレートを逆さにして内容物を除去し；各ウェル中の細胞層をＰＢＳで洗浄し、細胞溶解緩衝剤を添加した。プレートを室温で１５分放置し、それからＶｉｃｔｏｒ Ｌｉｇｈｔ １４２０中にセットし、ここでルシフェラーゼアッセイ試薬（ＬＡＲ）が自動的に各ウェルに注入され、ルシフェラーゼによるルシフェリンの酸化により光が発生し、１秒あたりのカウント（ｃｐｓ）が測定される。
【０１８３】
前記ＩＦＮ−β−Ｆｃ調製物は、２つの独立した実験を経て、並行して試験された。故に、各アッセイにおいて作成された用量応答曲線は、Ｓ字状（勾配が変化する）用量応答曲線により補間された（Ｇｒａｐｈ Ｐａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ）。ここで、質量として表されるＩＦＮ−β活性（ｐｇ／ｍＬ）をｘ軸上に、そして基底値及び最高値（０％及び１００％増殖）で正規化した関連するｃｐｓの値を、ｃｐｓのパーセントとしてｙ軸上に表した。
【０１８４】
細胞に加えられた実際のＩＮＮ−β濃度を計算するために、ＴＦＮ−β−Ｆｃ中のＩＦＮ−β質量が考慮された：
−コンパウンド１：０．９４ｍｇ／ｍｌ ＩＦＮ−β−Ｆｃ＝０．２６ｍｇ／ｍＬ ＩＦＮ−β、
−コンパウンド２：１．１０ｍｇ／ｍｌ ＩＦＮ−β−Ｆｃ＝０．３１ｍｇ／ｍＬ ＩＦＮ−β。
【０１８５】
５．２．４．結果及び結論
使用される細胞の種類に拘らず、ｓＩＦＮβ−ＩｇＧＦｃｍｕｔ（コンパウンド１）は、ＥＵインデックスの位置表記で２９７がＮからＡに突然変異しているモノマー−ダイマータンパク質（コンパウンド２；図５〜７）、及びヒト組換えＩＦＮ−β調製物と比較可能な生体活性を示した。
【０１８６】
実施例６−バイオアッセイ
コンパウンド１及びコンパウンド２のタイターは、理論に基づいて計算され、そしてＩＦＮ−βのタイター決定に現在利用されている標準的な方法（ＶＳＶ−ＷＩＳＨ）を使用して決定された。その結果を、表２にまとめる。
【０１８７】
【表３】
【０１８８】
理論的な活性は、以下の考慮に基づく：
ＩＦＮ−β（２２ｋＤ）において、ＭＩＵからμｇへの変換係数は３．６６である。ゆえに、１ＭＩＵは、３．６６μｇに対応する。
【０１８９】
ＩＦＮ−β−Ｆｃ（７７ｋＤ）において、質量特異的活性が線形であると仮定すると、上記係数は３．５倍、つまり１２．８となる。ゆえに、１ＭＩＵは１２．８μｇに対応する。
【０１９０】
実施例７−Ｆｃ受容体／補体結合アッセイ
７．１．導入
ＩＦＮ−β融合タンパク質は後退Ｆｃ部分を有しているため、抗体に関連するエフェクター作用：抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）及び補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）を引き起こす可能性を有する。
【０１９１】
ＡＤＣＣにおいて、抗原特異的抗体（例えばＩｇＧ）は、抗原を発現する細胞を殺傷するためのＦｃガンマ受容体（ＦｃγＲ）を発現する、自然免疫系の免疫エフェクター細胞を指向する。ＦｃγＲは、ＮＫ細胞、好中球、単球／マクロファージ、樹状細胞及びＢ細胞において発現し、ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩ（ＣＤ３２）及びＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）の３つのクラスを構成する。ヒトにおいて、ＦｃγＲＩＩ及びＦｃγＲＩＩＩは、更にＦｃγＲＩＩａ、ＦｃγＲＩＩｂ、ＦｃγＲＩＩＩａ及びγＲＩＩＩｂに区別される。これらの受容体は、様々なＩｇＧサブクラスとの親和性が相異しており、高親和性、中親和性、又は低親和性受容体に分けられる。項親和性受容体（ＣＤ６４）はモノマーＩｇＧと結合し、通常血清中のＩｇＧが結合部位を埋めている。中親和性及び低親和性受容体（それぞれＣＤ１６及びＣＤ３２）は、凝集したＩｇＧ 及びＩｇＧ含有免疫複合体と結合する。ＮＫ細胞は、ＡＤＣＣの主役であると信じられているが、単球−マクロファージ及び好中球も一定の役割を果たし、ＮＫ細胞が発現するＣＤ１６は、「ＡＤＣＣ受容体」と称されている。ＮＫ細胞は、細胞傷害性顆粒（パーフォリン（ｐｅｒｆｏｒｉｎ）、グラニュリシン（ｇｒａｎｕｌｙｓｉｎ）及びグランザイム（ｇｒａｎｚｙｍｅ））の放出を通じて、標的細胞を殺傷する。
【０１９２】
いわゆる「古典的経路」を介した補体活性化は、抗原と複合体を形成したイムノグロブリン、ＩｇＧ又はＩｇＭのＦｃドメインにＣ１ｑが結合することにより生じる。Ｃ１ｑはヒト結成中におよそ７０μｇ／ｍＬの濃度で存在する、約４１０ｋＤａの巨大な糖タンパク質複合体である。
【０１９３】
Ｃ１ｒ及びＣ１ｓの２つのセリンプロテアーゼと共に、Ｃ１ｑは、第一の補体の構成要素であるＣ１複合体を形成する。４つのヒトＩｇＧサブクラス（モノマー形態）のＣ１ｑと結合する能力は、ｌｇＧ３＞ｌｇＧ１＞ｌｇＧ２＞ｌｇＧ４の順に低下する（ＩｇＧ４は補体を活性化しない）。ヒンジ依存的Ｆａｂ−Ｆａｂ及びＦａｂ−Ｆｃの柔軟性は、Ｃ１ｑと結合する補体結合部位の接触性を規定するので、ヒトＩｇＧサブクラス中でヒンジが最も長いＩｇＧ３は、補体活性化において最も効果的なサブクラスである。ＩｇＧ４が補体を活性化できないのは、Ｆｃフラグメントの構造及びＦａｂ腕部による補体結合部位の立体障害による。
【０１９４】
コンパウンド１は、「エフェクター作用」、即ちＦｃγ受容体及びＣ１ｑとの結合を低下させる改変を含む。これらの突然変異の有効性を形式的に実証するために、コンパウンド１とコンパウンド２との間で、Ｆｃγ受容体の１つであるＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）及びＣ１ｑとの結合能力を比較する研究が実行された。細胞ベースのフローサイトメトリー及びＥＬＩＳＡ結合法を採用した。
【０１９５】
７．２．結果
コンパウンド１及びコンパウンド２は、ヒトＩｇＧ１と比較して、ＣＤ６４（ＦｃγＲＩ）との結合能力の低下を示す。
【０１９６】
ＩｇＧ４及びＩｇＧ１のいずれも、トランスフェクションされたＡＩＩ１．６細胞の表面に発現するＣＤ６４と、用量依存的に結合した。ＩｇＧ４は、ＩｇＧ１と比較して、僅かに結合が弱かった。対照的に、コンパウンド２は、ヒトＩｇＧ１よりも実質的に結合が弱く、コンパウンド１は、結合の更なる低下を示し、そのレベルは陰性対照により得られるレベルと同等であった（図８）。トランスフェクションしていないＩＩＡ１．６細胞とは、いずれの分子も結合しなかった。
【０１９７】
コンパウンド１及びコンパウンド２とＣ１ｑとの結合を特定するために、ＥＬＩＳＡ−Ｃ１ｑ結合アッセイを実行した。その結果を、図９に示す（図９ａ及び図９ｂ）。ＩｇＧ１は高度なＣ１ｑ結合活性を示し、一方化合物１、又は陰性対照（Ｎｅｇ及びＩｇＧ４）は、結合が検出されなかった。化合物２の結合は極めて僅かであり、ＩｇＧ２は、これらの実験条件下では、Ｃ１ｑと結合しなかった。
【０１９８】
コンパウンド１及びコンパウンド２のＣ１ｑとの結合能力を更に調査するために、表面プラズモン共鳴センサーを使用して、これらの分子のＣ１ｑとの親和性を測定した。ＩｇＧ１は陽性対照とみなされ、一方ＩｇＧ４は陰性対照に含まれた。
【０１９９】
デキストラン表面への第一級アミン基の架橋により、ＣＭ５チップ上にＩＦＮ−β−Ｆｃ分子及び前記対照を個別に不動化した。Ｂｉａｃｏｒｅ ３０００バイオセンサー中で、不動化タンパク質とＣ１ｑとの結合及び解離をリアルタイムでモニタリングした。Ｃ１ｑとＩｇＧ１との結合は、センサーグラムの結合相の間の応答の鋭い増大、及び解離相における緩慢な低下により特徴付けられた。コンパウンド２は、Ｃ１ｑとは殆ど結合を示さず、一方コンパウンド１は、結合を示さなかった。
【０２００】
よって、コンパウンド１に含まれる突然変異は、コンパウンド１とＣ１ｑとの結合を完全に遮断する（図９）。上記研究は、コンパウンド１のＦｃ部分に導入された突然変異が、コンパウンド２と比較して、ＣＤ６４（ＦｃγＲ１）−トランスフェクション細胞に対する該分子の結合を効果的に低下させるのみならず、Ｃ１ｑに対するコンパウンド１の結合を無効化することを実証する。内性的ＣＤ６４を発現するトランスフェクションしていないＵ９３７ヒト単球細胞においても、同様の結果が得られた。ＣＤ６４トランスフェクション細胞の場合、結合のレベルは、陰性対照を用いて得られるレベルと同一であった。
【０２０１】
要するに、取得されたデータは、コンパウンド１が、この研究で採用した実験条件下でＣ１ｑと結合しないのに対して、コンパウンド２が僅かに結合能力を保持していることを実証する。
【０２０２】
実施例８−サルにおけるＰＫ／ＰＤ試験
ヒトＩＦＮ−βにヒトとほぼ同レベルで応答する唯一の動物であるサルにおいて、薬物動態／薬力学（ＰＫ／ＰＤ）試験を実行した。
【０２０３】
コンパウンド１及びコンパウンド２のいずれも、サルにおけるＩＦＮ−β血清レベルの解析用の酵素免疫アッセイ（ＦｕｊｉＲｅｂｉｏ製、サル血清中のＩＦＮ−ベータ解析用に改変及び認証された）を使用して、血清試料の解析を行った。
【０２０４】
ＩＦＮ−β標準に代えて、コンパウンド１及びコンパウンド２を、較正曲線の構築に使用した。
【０２０５】
８．１．導入
コンパウンド１は、Ｆｃγ受容体及びＣ１ｑとの結合を低下させるための幾つかの突然変異を含む。これらの突然変異がコンパウン１のＰＫ／ＰＤ能力を変化させるか否かをチェックするために、ヒトＩＦＮ−ベータに応答する唯一の動物種であるサルにおけるインビボ研究を実行した。第一の群は、参照として、皮下投与により５５ ｐＭｏｌ／ｋｇのＲｅｂｉｆ（登録商標）の投与を受けた。第二のサル群はコンパウンド２の投与を受け、一方第三のサル群はコンパウンド１の投与を受け、これらはいずれも、１３８ｐＭｏｌ／ｋｇの用量が肺に沈着するように吸入投与されたものである。ＩＦＮ−β、コンパウンド１及びコンパウンド２は、ネオプテリンと共に、血清レベルが測定された。非コンパートメント解析に従い、投与前に既に存在していた濃度を差し引いた後、ＰＫ及びＰＤ解析を実行する。
【０２０６】
８．２．薬物動態の結果
皮下経路で５５ｐＭｏｌ／ｋｇのＲｅｂｉｆ（登録商標）を投与した後のＩＦＮβの血清レベル、平均沈着用量が１３８ｐＭｏｌ／ｋｇとなるように吸入経路で投与した後のコンパウンド１の血清レベル、そして平均沈着用量が１３８ｐＭｏｌ／ｋｇとなるように吸入経路で投与した後のコンパウンド２の血清レベルの平均血清プロフィールを、図１０に示す。コンパウンド１及びコンパウンド２の平均沈着用量が１３８ｐＭｏｌ／ｋｇとなるように吸入投与した後、平均Ｃｍａｘは、中央時間の８時間において、２２．５１＋７．４３ｐＭｏｌ／Ｌ（コンパウンド２）及び１６．３６＋６．９４ｐＭｏｌ／Ｌであり、これらは、Ｒｅｂｉｆ（登録商標）の平均Ｃｍａｘが、中央ｔｍａｘの３時間の時点で１．４０±１．１０ｐＭｏｌ／Ｌに達したことと対比されるべきである。ＡＵＣｌａｓｔは、コンパウンド２において８８６＋３９３ｈ．ｐＭｏｌ／Ｌであり、コンパウンド１において５０５＋３２２ｈ．ｐＭｏｌ／Ｌであり、これらは、Ｒｅｂｉｆの平均ＡＵＣｌａｓｔが１２．５＋２０．０ｈ．ｐＭｏｌ／Ｌであったことと対比されるべきである。
【０２０７】
明確な排除半減期は、コンパウンド２では２７＋４．５ｈであり、コンパウンド１では２４．１＋８．４ｈであった。コンパウンド１及びコンパウンド２のいずれも、通常の、定常的な血清レベルを示し、ＩＦＮ−βにおいて検出される数値より大分高かった。実際に、いずれも、注入されたＲｅｂｉｆ（登録商標）と比較して、遥かに高い累積曝露を示した。
【０２０８】
ネオプテリン血清レベルのベースライン補正された平均（ＳＤ）血清プロフィールは、皮下経路で５５ｐＭｏｌ／ｋｇのＲｅｂｉｆ（登録商標）を投与した後、平均沈着用量が１３８ｐＭｏｌ／ｋｇとなるように吸入経路でコンパウンド１を投与した後、及び平均沈着用量が１３８ｐＭｏｌ／ｋｇとなるように吸入経路でコンパウンド２を投与した後に計算された。主要な薬力学パラメーターを、表３に示す。
【０２０９】
【表４】
【０２１０】
哺乳類において、通常約１ｎｇ／ｍＬの数値に対して、投与前のネオプテリンレベルは１．１１〜５．０６ｎｇ／ｍＬである。この事実は考慮されるべきである。なぜなら、投与前レベルが高いと、ネオプテリンの更なる増大を観察する機会を逸する場合があるからである。Ｒｅｂｉｆ（登録商標）の皮下投与の後、予想通り、５匹中４匹のサルにおいてネオプテリンの増大が観察された。１匹のサルはネオプテリンの増大を示さなかった。このサルはネオプテリンのレベルが最高であり（４．４ｎｇ／ｍＬ）、ＩＦＮ−βは測定できなかった。これらの２つの要素（ネオプテリンが高く、恐らく投与量が少なかった）が、応答の欠如をもたらしたと考えられる。これは、検出可能なＩＦＮ−βレベルを示す血清サンプルが１つだけであったという事実に拘らず、もう１匹のサルが明確なネオプテリン応答を示していたという検討により支持される。このサルにおいて、投与前の濃度は２．０ｎｇ／ｍＬであった。コンパウンド１又はコンパウンド２を沈着用量が１３８ｐＭｏｌ／ｋｇとなるように吸入投与した後、殆どの動物は、ネオプテリンレベルの僅かな増大を示した。この僅かな増大は一部の動物においてより明確であり、一方その他の動物は、明確なＩＦＮ−β−Ｆｃ ＰＫプロフィールを有しているにも拘らず、ベースライン濃度を超える血清試料が殆ど無かった。全体的に、コンパウンド１及びコンパウンド２のいずれも、類似のＰＫ及びＰＤ挙動を示した。
【０２１１】
以下の表４は、配列表及び本テキスト全体に記載されている配列の同一性を明らかにしている。
【０２１２】
【表５】
【０２１３】
参照一覧
１． Ｃａｎｏｓｉ Ｕ．， Ｍ． Ｍａｓｃｉａ， Ｌ． Ｇａｚｚａ， Ｏ． Ｓｅｒｌｕｐｉ−Ｃｒｅｓｃｅｎｚｉ， Ｓ． Ｄｏｎｉｎｉ， Ｆ． Ａｎｔｏｎｅｔｔｉ， Ｇ． Ｇａｌｌｉ， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈｏｄｓ， １９９， ６９−７６ （１９９６）．
２． Ｋａｂａｔ， Ｅ． Ａ．， Ｗｕ， Ｔ． Ｔ．， Ｐｅｒｒｙ， Ｈ． Ｍ．， Ｇｏｔｔｅｓｍａｎ， Ｋ． Ｓ．， ａｎｄ Ｆｏｅｌｌｅｒ， Ｃ． （１９９１）， Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ， ５ｔｈ Ｅｄ．， Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ， Ｂｅｔｈｅｓｄａ， ＭＤ．
３． Ｒｕｂｉｎｓｔｅｉｎ， Ｓ．，Ｆａｍｉｌｌｅｔｔｉ， Ｐ． Ｃ， ａｎｄ Ｐｅｓｔｋａ， Ｓ． Ｃｏｎｖｅｎｉｅｎｔ Ａｓｓａｙ ｆｏｒ Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎｓ． Ｊ． Ｖｉｒｏｌ １９８１ ； ３７， ７５５−７５８．
４． Ｓｐｉｅｋｅｒｍａｎｎ ＧＭ， Ｆｉｎｎ ＰＷ， Ｗａｒｄ ＥＳ， Ｄｕｍｏｎｔ Ｊ， Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ＢＬ， Ｂｌｕｍｂｅｒｇ ＲＳ， Ｌｅｎｃｅｒ ＷＩ． Ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ Ｇ ｔｒａｎｓｐｏｒｔ ａｃｒｏｓｓ ｍｕｃｏｓａｌ ｂａｒｒｉｅｒｓ ｉｎ ａｄｕｌｔ ｌｉｆｅ： ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ＦｃＲｎ ｉｎ ｔｈｅ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｌｕｎｇ． Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ． ２００２ Ａｕｇ ５；１９６（３）：３０３−１０．
５． ＷＯ ２００５／００１０２５
６． ＵＳ ６，４８５，７２６
【技術分野】
【０００１】
本発明は、突然変異ＩｇＧ Ｆｃフラグメントと融合した単一（ｓｉｎｇｌｅ）ＩＦＮ−ベータ（以下、ｓＩＦＮベータ−ＩｇＧＦｃｍｕｔと称する）、これをコードするヌクレオチド、これを含むベクター及び発現ベクター、これを用いて形質転換した宿主細胞、並びにこれらの医薬としての使用、及び特にこれらの多発性硬化症治療における使用に関する。該突然変異ＩｇＧ Ｆｃフラグメントと融合した単一ＩＦＮ−ベータは２つのサブユニットを有し、第一のサブユニットはＩＦＮ−ベータタンパク質と連結していない突然変異ＩｇＧ Ｆｃ腕部を含み、そして第二のサブユニットは単一ＩＦＮ−ベータタンパク質と連結した突然変異ＩｇＧ Ｆｃ腕部を含む。
【背景技術】
【０００２】
所望のタンパク質、例えばエリスロポエチン（ＥＰＯ）等と連結したイムノグロブリン（Ｉｇ）のＦｃフラグメントを含むタンパク質が、恐らく、成人肺に存在し、イムノグロブリンのＦｃフラグメントを認識し、これと結合し、これを捕えるＭＨＣクラスＩ型Ｆｃ受容体のＦｃＲｎとの結合を通じて、吸入投与に供されることが報告されている（ｃｆ Ｓｐｉｅｋｅｒｍａｎｎ ＧＭ ｅｔ ａｌ． ２００２）。タンパク質をイムノグロブリンＦｃフラグメントと融合することにより、ＦｃＲｎにより認識され得るハイブリッドタンパク質が得られる。前記イムノグロブリンＦｃフラグメントは、抗体重鎖のヒンジ領域（Ｈ）並びに第二ドメイン（ＣＨ２）及び第三ドメイン（ＣＨ３）を含む２つの同一の腕部から構成される。
【０００３】
ＦｃＲｎは、成体（ヒトは該当するが、げっ歯類は該当しない）上皮組織において活性であり、小腸内腔、肺気道、鼻腔表面、膣表面、結腸及び直腸表面において発現している（ＵＳ ６，４８５，７２６）。ＦｃＲｎ結合パートナーを含むタンパク質（例えばＩｇＧ、Ｆｃフラグメントを含む融合タンパク質）は、ＦｃＲｎにより上皮障壁を通過して効率的に輸送され、それにより、所望の治療用分子の非襲侵的な全身投与方法が提供される。
【０００４】
イムノグロブリン（例えばＩｇＧ）のＦｃフラグメント（Ｆｃドメインとも称される）は、イムノグロブリン（ＩｇＧ）又は前記Ｆｃドメインを含む融合タンパク質（ＩｇＧＦｃ）の投与に関与する、いわゆるエフェクター作用に寄与することが知られている。そのようなエフェクター作用は、Ｆｃ受容体（ＦｃγＲ）との相互作用を解する、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）、及び補体成分１ｑ（Ｃ１ｑ）との結合による補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）を含む。ＩｇＧアイソフォームは、異なるレベルのエフェクター作用をもたらす。ヒトＩｇＧ１及びＩｇＧ３は強力なＡＤＣＣ及びＣＤＣ効果を有するが、ヒトＩｇＧ２は弱いＡＤＣＣ及びＣＤＣ効果をもたらす。ヒトＩｇＧ４は、ＡＤＣＣ効果が弱く、ＣＤＣ効果は生じない。
【０００５】
ＡＤＣＣにおいて、抗体（例えばＩｇＧ）のＦｃ領域は、ナチュラルキラー細胞及びマクロファージ等の免疫エフェクター差異簿の表面のＦｃ受容体（ＦｃγＲ）と結合し、標的細胞のファゴサイトーシス又は溶解を引き起こす。
【０００６】
ＣＤＣにおいて、抗体（例えばＩｇＧ）は、細胞表面の補体カスケードを起動することにより、標的細胞を殺傷する。ＩｇＧアイソフォームの作用又は機能のレベルは、ＩｇＧ４＜ＩｇＧ２＜ＩｇＧ１＜ＩｇＧ３の順に増大する。
【０００７】
インターフェロンは、感染細胞が天然に分泌し、１９５７年に初めて同定された。それらの名称は、ウイルスの複製及び生産を「妨げる（インターフェア）」ことに由来する。インターフェロンベータは、現在多発性硬化症の治療に使用される周知のインターフェロンである。
【０００８】
例えば２個のＦｃＲｎ結合パートナー等の２個のイムノグロブリン定常領域の部分に対して１個の生体活性分子を有するモノマー−ダイマーハイブリッドが既に報告されている（ＷＯ ２００５／００１０２５）が、ホモダイマー（本明細書中では単にダイマーとも称される）又は２コピー以上の生体活性分子を有するより高次のマルチマーよりも効果的に機能及び輸送され得る。インターフェロンベータのモノマー−ダイマーハイブリッドは、ＷＯ ２００５／００１０２５に開示されている。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００９】
第一の側面において、本発明は、変異ＩｇＧ Ｆｃドメインと融合した単一ＩＦＮ−ベータ（以下本明細書中でｓＩＦＮベータ−ＩｇＧＦｃｍｕｔと称する）を提供する。本発明のｓＩＦＮベータ−ＩｇＧＦｃｍｕｔは２つのサブユニットで構成され、第一のサブユニットがＩＦＮ−ベータタンパク質と連結していない突然変異ＩｇＧＦｃ腕部（Ｆｃｍｕｔ腕部）を含み、そして第二のサブユニットが単一ＩＦＮ−ベータタンパク質と連結している突然変異ＩｇＧ Ｆｃ腕部（ｓＩＦＮベータ−Ｆｃｍｕｔ腕部）を含み、該突然変異ＩｇＧ Ｆｃドメイン（ＩｇＧＦｃｍｕｔ）が、イムノグロブリンガンマ（ＩｇＧ）−１ Ｆｃドメインであり、Ｋａｂａｔらにより定義されたＥＵインデックスの位置表記（Ｋａｂａｔ， Ｅ． Ａ． ｅｔ ａｌ． １９９１）で２３４、２３５、２３７、３３０、及び３３１が突然変異している。該突然変異の導入は、ＡＤＣＣ及びＣＤＣの低下を引き起こす。好ましい態様において、前記突然変異はＬ２３４Ａ、Ｌ２３５Ｅ、Ｇ２３７Ａ、Ａ３３０Ｓ及びＰ３３１Ｓである。もう一つの側面において、本発明は、本発明のｓＩＦＮベータ−ＩｇＧＦｃｍｕｔをコードする、例えばＤＮＡ等のポリヌクレオチド、該ＤＮＡを含むベクター、及びより具体的には発現ベクターを提供する。
【００１０】
もう一つの側面において、本発明は、例えばトランスフェクション等により、本発明のベクター、特に発現ベクターを含有するものとなった宿主細胞、好ましくはＣＨＯ細胞を提供する。
【００１１】
もう一つの側面において、本発明は、本発明のｓＩＦＮベータ−ＩｇＧＦｃｍｕｔを含む医薬組成物、及びその医薬としての、特に多発性硬化症治療のための使用を提供する。
【００１２】
もう一つの側面において、本発明は、有毛細胞白血病、カポジ肉腫、慢性骨髄性白血病、多発性硬化症、Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、ＨＩＶ並びに／又はエプスタイン・バー（Ｅｐｓｔｅｉｎ Ｂａｒｒ）、ヘルペスウイルス、及び／若しくはパピローマウイルスから選択されるウイルスにより引き起こされる感染の予防及び／又は治療用の医薬の製造における、本発明のｓＩＦＮベータ−ＩｇＧＦｃｍｕｔの使用を提供する。
【００１３】
もう一つの側面において、本発明は、本発明のｓＩＦＮベータ−ＩｇＧＦｃｍｕｔの製造方法を提供し、該方法は、本発明の宿主細胞、好ましくはＣＨＯ細胞の培養、及び本発明のｓＩＦＮベータ−ＩｇＧＦｃｍｕｔの単離を含む。
【００１４】
発明の詳細な説明
本発明は、肺を通じて、経口的に、又は皮下的に取り込まれて送達され得る、突然変異ＩｇＧ Ｆｃドメインと融合した単一ＩＦＮ−ベータ（以下、ｓＩＦＮベータ−ＩｇＧＦｃｍｕｔと称する）に関する。本発明のｓＩＦＮベータ−ＩｇＧＦｃｍｕｔは、循環系の中でなおも高い血清レベル及び半減期を維持しつつ、Ｆｃエフェクター作用を低下させ、良好な生体活性を示す。
【００１５】
第一の側面において、本発明は、２つのサブユニットを含むｓＩＦＮベータ−ＩｇＧＦｃｍｕｔを提供し、第一のサブユニットがＩＦＮ−ベータタンパク質と連結していない突然変異ＩｇＧＦｃ腕部（Ｆｃｍｕｔ腕部）を含み、そして第二のサブユニットが単一ＩＦＮ−ベータタンパク質と連結している突然変異ＩｇＧ Ｆｃ腕部（ｓＩＦＮベータ−Ｆｃｍｕｔ腕部）を含み、そして第二のサブユニットが単一ＩＦＮ−ベータタンパク質と連結している突然変異ＩｇＧ Ｆｃ腕部（ｓＩＦＮベータ−Ｆｃｍｕｔ腕部）を含み、該突然変異ＩｇＧ Ｆｃドメイン（ＩｇＧＦｃｍｕｔ）が、イムノグロブリンガンマ（ＩｇＧ）−１ Ｆｃドメインであり、Ｋａｂａｔらにより定義されたＥＵインデックスの位置表記（Ｋａｂａｔ， Ｅ． Ａ． ｅｔ ａｌ． １９９１）で２３４、２３５、２３７、３３０、及び３３１が突然変異している。該突然変異の導入は、ＡＤＣＣ及びＣＤＣの低下を引き起こす。好ましい態様において、前記突然変異はＬ２３４Ａ、Ｌ２３５Ｅ、Ｇ２３７Ａ、Ａ３３０Ｓ及びＰ３３１Ｓである。突然変異の位置を表す値の混乱を避けるため、以下の表１において、本発明の幾つかの配列番号とＥＵインデックスとの間のアミノ酸の位置の対応を記載する。
【００１６】
【表１】
【００１７】
集団中で異なるアロタイプのＩｇＧ１が見出される。配列番号１に挙げられるヒトＩｇＧ１の重鎖定常領域は、Ｕｎｉｐｒｏｔにおいて、「Ｇ１Ｍ（ｎｏｎ−１）マーカー」と称されるアロタイプである（受入番号Ｐ０１８５７）。本発明に記載される突然変異は、集団中に見出される全ての異なるアロタイプについで作製され得る。従って、本発明は、特定のアロタイプに限定されるべきではない。本発明において、Ｆｃドメインは「Ｇ１Ｍ（ｎｏｎ−１）マーカー」アロタイプに由来するものであった（実施例１を参照）が、そのＦｃドメインは、他のいずれのアロタイプに由来するものであってもよい。
【００１８】
ＡＤＣＣ及びＣＤＣを低下させるために、ＥＵインデックスの位置表記で少なくとも２３４、２３５、２３７、３３０、及び３３１を突然変異させたイムノグロブリンガンマ（ＩｇＧ）−１ Ｆｃドメインを、本明細書中で、ＩｇＧＦｃｍｕｔと称する場合がある。ＩＦＮ−ベータタンパク質と連結していないＩｇＧＦｃｍｕｔの腕部を、本明細書中で、Ｆｃｍｕｔ腕部と称する場合がある。単一ＩＦＮ−ベータタンパク質と連結しているＩｇＧＦｃｍｕｔの腕部を、ＩＦＮベータ−Ｆｃｍｕｔ腕部と称する場合がある（図１）。好ましい態様において、ＩｇＧＦｃｍｕｔにおける突然変異は、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ｅ、Ｇ２３７Ａ、Ａ３３０Ｓ及びＰ３３１Ｓである。
【００１９】
本明細書中で、Ｆｃドメインは、Ｆｃフラグメント、Ｆｃ−部分又はＦｃ領域と称される場合画ある。本明細書中で、「Ｆｃドメイン」、「Ｆｃフラグメント」、「Ｆｃ−部分」、又は「Ｆｃ領域」という用語は相互置換可能であり、同一の意味を有するものとして解釈されるべきである。
【００２０】
本発明のｓＩＦＮベータ−ＩｇＧＦｃｍｕｔは、ＷＯ ２００５／００１０２５に記載のＩＦＮ−ベータのモノマー−ダイマータンパク質と同様の生体活性を示す。ＩＦＮ−ベータの生体活性は、典型的には、例えば実施例５に記載される抗ウイルスアッセイにおいて測定される。
【００２１】
本発明のｓＩＦＮベータ−ＩｇＧＦｃｍｕｔは、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）及び補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）を低下又は阻害する。例えば、本発明のｓＩＦＮベータ−ＩｇＧＦｃｍｕｔは、Ｆｃ受容体であるＦｃγＲＩ、ＣＤ６４、ＩＩＡ、ＩＩＢ、ＩＩＩＡ及び／又はＩＩＩＢとの結合を低下又は阻害し、及び／又はＣ１ｑとの結合を低下又は阻害する。更に、本発明のｓＩＦＮベータ−ＩｇＧＦｃｍｕｔは、ＦｃＲｎの結合特性（又は親和性）を維持している。本発明のｓＩＦＮベータ−ＩｇＧＦｃｍｕｔがＡＤＣＣ及びＣＤＣを低下又は阻害しつつＦｃＲｎ結合が維持されるのは、Ｆｃドメインに５つの突然変異が存在するためである。本発明は、ＡＤＣＣ及びＣＤＣを低下又は阻害しつつ、同等の生体活性及び同等の結合特性を示すｓＩＦＮベータ−ＩｇＧＦｃｍｕｔを提供する。
【００２２】
本発明のｓＩＦＮベータ−ＩｇＧＦｃｍｕｔは、吸入により、又は皮下投与により投与され得る。
【００２３】
本発明のｓＩＦＮベータ−ＩｇＧＦｃｍｕｔは、循環系中の血清レベル及び半減期が高い（生体液中の存在時間が延長する）ため、皮下ルートが好ましい投与方法となる。
【００２４】
本発明のｓＩＦＮベータ−ＩｇＧＦｃｍｕｔは、プロテインＡ又はプロテインＧアフィニティーグロマトグラフィーを使用することにより精製することができる。
【００２５】
本発明のｓＩＦＮベータ−ＩｇＧＦｃｍｕｔは、Ｆｃ領域中に少なくとも５つの突然変異を含む。この態様において、ＡＤＣＣ及びＣＤＣが顕著に阻害され、又は顕著に低下する。
【００２６】
本発明は、２つのサブユニットを含むｓＩＦＮベータ−ＩｇＧＦｃｍｕｔを提供し、該第一のサブユニットがＩＦＮ−ベータタンパク質と連結していない突然変異ＩｇＧ Ｆｃ腕部（Ｆｃｍｕｔ腕部）を含み、第二のサブユニットが単一ＩＦＮ−ベータタンパク質と連結した同一のＩｇＧ Ｆｃドメインの突然変異Ｆｃ腕部（ＩＦＮベータ−Ｆｃｍｕｔ腕部）を含み、該突然変異ＩｇＧ Ｆｃドメイン（ＩｇＧＦｃｍｕｔ）が、イムノグロブリンガンマ（ＩｇＧ）−１ Ｆｃドメインであり、ＥＵインデックスの位置表記で少なくとも２３４、２３５、２３７、３３０、及び３３１が突然変異している。該突然変異の導入は、ＡＤＣＣ及びＣＤＣの低下を引き起こす。好ましい態様において、前記突然変異はＬ２３４Ａ、Ｌ２３５Ｅ、Ｇ２３７Ａ、Ａ３３０Ｓ及びＰ３３１Ｓである。
【００２７】
好ましい態様において、Ｆｃドメインは、ＥＵインデックスの位置表記で２９７に該当するアミノ酸のＮがＡに突然変異したものを含まない。一つの態様において、本発明は、２つのサブユニットを含むｓＩＦＮベータ−ＩｇＧＦｃｍｕｔを提供し、該第一のサブユニットがＩＦＮ−ベータタンパク質と連結していない突然変異ＩｇＧ Ｆｃ腕部（Ｆｃｍｕｔ腕部）を含み、第二のサブユニットが単一ＩＦＮ−ベータタンパク質と連結した突然変異ＩｇＧ Ｆｃ腕部（ＩＦＮベータ−Ｆｃｍｕｔ腕部）を含み、該Ｆｃドメインが、本発明のＩｇＧＦｃｍｕｔであり、該ＩＦＮベータ−Ｆｃｍｕｔ腕部がＩＦＮ−ベータと直接連結した突然変異ＩｇＧ Ｆｃ腕部を含む。本態様において、本発明のｓＩＦＮベータ−ＩｇＧＦｃｍｕｔは、ＩｇＧＦｃｍｕｔとＩＦＮ−ベータとの間にリンカーを含まない。
【００２８】
もう一つの態様において、本発明は、２つのサブユニットを含むｓＩＦＮベータ−ＩｇＧＦｃｍｕｔを提供し、該第一のサブユニットがＩＦＮ−ベータタンパク質と連結していない突然変異ＩｇＧ Ｆｃ腕部（Ｆｃｍｕｔ腕部）を含み、第二のサブユニットが単一ＩＦＮ−ベータタンパク質と連結した突然変異ＩｇＧ Ｆｃ腕部（ＩＦＮベータ−Ｆｃｍｕｔ腕部）を含み、該Ｆｃドメインが、本発明のＩｇＧＦｃｍｕｔであり、該ＩＦＮベータ−Ｆｃｍｕｔ腕部がＩＦＮ−ベータと直接連結していない突然変異ＩｇＧ Ｆｃ腕部を含む。
【００２９】
更なる好ましい態様において、ＩｇＧＦｃｍｕｔは、ＥＵインデックスの位置表記で２９７に該当するアミノ酸のＮがＡに突然変異したものを含まない。従って、本発明のＩｇＧＦｃｍｕｔの位置２９７には、アミノ酸Ｎが存在する。本発明のｓＩＦＮベータ−ＩｇＧＦｃｍｕｔは、ＩｇＧＦｃｍｕｔとＩＦＮ−ベータとの間に、リンカーを含む場合がある。
【００３０】
前記ＩｇＧ１ Ｆｃドメインは、ＥＵインデックスの位置表記でＬ２３４Ａ、Ｌ２３５Ｅ、Ｇ２３７Ａ、Ａ３３０Ｓ及びＰ３３１Ｓから選択される少なくとも５つの突然変異、又はＦｃドメインの他のいずれかの同等の位置に少なくともこれらの５つの突然変異を含む。故に、上記突然変異は、いずれのＩｇＧ１アロタイプのＦｃドメインにおいても作製することができる。
【００３１】
２３４（例えばＬ２３４Ａ）、２３５（例えばＬ２３５Ｅ）及び２３７（例えばＧ２３７Ａ）の３つの突然変異は、ＡＤＣＣを低下又は阻害するために設定され；３３０（例えばＡ３３０Ｓ）及び３３１（例えばＰ３３１Ｓ）は、ＣＤＣを低下又は阻害するために設定される。
【００３２】
幾つかの態様において、本発明のＦｃドメインは、ＣＨ２ドメイン及び／又はＣＨ３ドメイン、及び任意でＣＨ１ドメイン、ヒンジ領域、若しくはそれらのフラグメント、又はそれらの任意の組合せを含み、又はそれらから構成される。好ましくは、前記Ｆｃドメインは、ヒンジ領域若しくはそのフラグメント、ＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメインを含み、又はそれらから構成される。一つの態様において、前記Ｆｃドメインは、ＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメインを含み、又はそれらから構成される。
【００３３】
本明細書中で定義されるいわゆる「ヒンジ領域」は、ＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメインの間に位置する特定の領域である。ヒンジ領域は、タンパク質分解開裂に特に感受性で；そのようなタンパク質分解により、正確な開裂部位により、２つ又は３つのフラグメントが得られる。
【００３４】
一つの態様において、ヒンジ領域のフラグメントは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は１１アミノ酸で構成される。
【００３５】
もう一つの態様において、ヒンジ領域のフラグメントは、７アミノ酸で構成される。好ましくは、該ヒンジ領域は、配列番号２の配列（ＤＫＴＨＴＣＰ）を含み、又はこれから構成される。
【００３６】
より好ましくは、ＩｇＧＦｃｍｕｔは、配列番号３の配列を含み、又はこれから構成されるＦｃｍｕｔ腕部、並びに配列番号８の配列を含み、又はこれから構成されるｓＩＦＮベータ−ＩｇＧＦｃｍｕｔ腕部の１６７〜３９３アミノ酸残基部分により構成される（図１）。配列番号３の配列は、Ｌ１４Ａ、Ｌ１５Ｅ、Ｇ１７Ａ、Ａ１１０Ｓ及びＰ１１１Ｓの突然変異を含み、これらはそれぞれ、ＥＵインデックスの位置表記でＩｇＧ１突然変異のＬ２３４Ａ、Ｌ２３５Ｅ、Ｇ２３７Ａ、Ａ３３０Ｓ及びＰ３３１Ｓに対応する。配列番号８は、Ｌ１８０Ａ、Ｌ１８１Ｅ、Ｇ１８３Ａ、Ａ２７６Ｓ及びＰ２７７Ｓの突然変異を含み、これらはそれぞれ、ＥＵインデックスの位置表示に従い、ＩｇＧ１突然変異のＬ２３４Ａ、Ｌ２３５Ｅ、Ｇ２３７Ａ、Ａ３３０Ｓ及びＰ３３１Ｓに対応する。本発明のＦｃドメインは、エフェクター作用を低下又は阻害するために、更に改変される場合もある。
【００３７】
以下のＦｃ突然変異が、ＩｇＧ１ Ｆｃドメイン中ＥＵインデックス位置表示で以下の位置に更に導入される場合がある：
Ｔ２５０Ｑ及び／又はＭ４２８Ｌ、
Ｍ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ、Ｔ２５６Ｅ、Ｈ４３３Ｋ及び／又はＮ４３４Ｆ、
Ｅ２３３Ｐ、Ｌ２３４Ｖ、Ｌ２３５Ａ、ΔＧ２３６、Ａ３２７Ｇ、Ａ３３０Ｓ及び／又はＰ３３１Ｓ、
Ｅ３３３Ａ及び／又はＫ３２２Ａ。
【００３８】
Ｔ２５０Ｑ及び／又はＭ４２８Ｌ突然変異は、タンパク質の血清半減期を増大させ得る。
【００３９】
Ｍ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ、Ｔ２５６Ｅ、Ｈ４３３Ｋ及び／又はＮ４３４Ｆ突然変異は、タンパク質の血清半減期を増大させ得る。
【００４０】
Ｅ２３３Ｐ、Ｌ２３４Ｖ、Ｌ２３５Ａ、ΔＧ２３６、Ａ３２７Ｇ、Ａ３３０Ｓ及び／又はＰ３３１Ｓ突然変異は、ＡＤＣＣ及びＣＤＣを低下又は阻害し得る。
【００４１】
更に、Ｆｃ突然変異は、ＥＵインデックス位置表記で３３０、３３１ 、２３４、又は２３５、又はそれらの組合せから選択される位置における置換であり得る。更に、ＥＵインデックス位置表記で２２０のシステイン残基も、セリン残基で置換され得て、イムノグロブリン軽鎖定常領域とジスルフィド結合を通常形成するシステイン残基が排除される。
【００４２】
一つの態様において、本発明のｓＩＦＮベータ−ＩｇＧＦｃｍｕｔは、更に、Ｆｃドメインとサイトカインとの間にリンカーを含む。一つの態様において、該リンカーは、アミノ酸残基１〜３個の短いペプチド、又は例えば長さ１３アミノ酸残基の長いペプチドである。
【００４３】
前記リンカーは、サイトカインとイムノグロブリン配列との間に導入される、例えばＥＦＭ（Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ｍｅｔ）トリペプチド配列、又はＦＧＡＧＬＶＬＧＧＱＦＭ（ＧＩｕ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ｐｈｅ−Ｍｅｔ）を含む１３アミノ酸リンカー配列であり得る。好ましくは、該リンカーは、配列番号１３の配列（ＥＦＡＧＡＡＡＶ）を含み、又はこれから構成される。
【００４４】
好ましくは、前記ＩＦＮはヒトＩＦＮ−ベータ（ＩＦＮ−β）であり、より好ましくは組換えヒトＩＦＮ−ベータである。インターフェロンベータ−１ａは、分子量約２２，５００ドルトンの精製された１６６アミノ酸の糖タンパク質である。これは、一般に、ヒトインターフェロンベータ遺伝子を導入した遺伝子改変チャイニーズハムスター卵巣細胞を使用する組換えＤＮＡ技術により生産される。
【００４５】
好ましくは、前記ＩＦＮは、ＣＨＯ細胞由来等タンパクを有する組換えヒトＩＦＮ−ベータである。好ましくは、ＩＦＮ−β部分及びＦｃ鎖のいずれもグリコシル化されている。より好ましくは、該ＩＦＮ−ベータは、配列番号７の配列から構成される。
【００４６】
Ｒｅｂｉｆ（登録商標）及びＡｖｏｎｅｘ（登録商標）は、ＣＨＯ由来インターフェロンベータ−１ａの市販調製物の２つの例である。
【００４７】
Ｂｅｔａｓｅｒｏｎ（登録商標）は、Ｅ． ｃｏｌｉ由来インターフェロンベータ−１ｂの市販調製物の例である。
【００４８】
好ましくは、ＩＦＮ−ベータタンパク質と連結していない突然変異ＩｇＧ Ｆｃ腕部（Ｆｃｍｕｔ腕部）を含むｓＩＦＮベータ−ＩｇＧＦｃｍｕｔの第一のサブユニットは、配列番号３の配列を含み、又はこれから構成される。配列番号３の配列及びそのシグナルペプチド（マウスＩｇｋ軽鎖のシグナルペプチド−実施例１を参照されたい）は、配列番号５に挙げられている。
【００４９】
好ましくは、単一ＩＦＮ−ベータタンパク質と連結した突然変異ＩｇＧ Ｆｃ腕部（ＩＦＮベータ−Ｆｃｍｕｔ腕部）を含むｓＩＦＮベータ−ＩｇＧＦｃｍｕｔの第二のサブユニットは、配列番号８の配列を含み、又はこれから構成される。配列番号８の配列及びそのシグナルペプチド（ＩＦＮ−ベータシグナルペプチド）は、配列番号１０に挙げられている。
【００５０】
ｓＩＦＮベータ−ＩｇＧＦｃｍｕｔの例は、本明細書中で「コンパウンド１」と称されるタンパク質である。コンパウンドは、好ましくは本発明のｓＩＦＮベータ−ＩｇＧＦｃｍｕｔであり、配列番号３の配列及び配列番号８の配列から構成される。コンパウンド１は、Ｆｃドメインに５つの突然変異：Ｌ２３４Ａ（配列番号３及び５のＬ１４Ａ；配列番号８及び１０のＬ１８０Ａ）、Ｌ２３５Ｅ（配列番号３及び５のＬ１５Ｅ；配列番号８及び１０のＬ１８１Ｅ）、Ｇ２３７Ａ（配列番号３及び５のＧ１７Ａ；配列番号８及び１０のＧ１８３Ａ）、Ａ３３０Ｓ（配列番号３及び５のＡ１１０Ｓ；配列番号８及び１０のＡ２７６Ｓ）、Ｐ３３１Ｓ（配列番号３及び５のＰ１１１Ｓ；配列番号８及び１０のＰ２７７Ｓ）（標準的なヒトＩｇＧ重鎖ドメイン又はＥＵインデックス位置表記に従い番号を振られている）を有することにより、ＡＤＣＣ及びＣＤＣ活性を阻害する。コンパウンド１のＦｃドメインは、「Ｇ１Ｍ（ｎｏｎ−１）マーカー」アロタイプに由来する（実施例１を参照されたい）。
【００５１】
もう一つの側面において、本発明は、本発明のｓＩＦＮベータ−ＩｇＧＦｃｍｕｔをコードするＤＮＡ、該ポリヌクレオチドを含むベクター、及びより好ましくは発現ベクターを提供する。
【００５２】
一つの態様において、前記ポリヌクレオチドは、配列番号３、８、５、又は１０の配列をコードする。好ましくは、ポリヌクレオチドは、ｓＩＦＮベータ−ＩｇＧＦｃｍｕｔの第一のサブユニット（Ｆｃｍｕｔ腕部）をコードする配列番号４の配列を含み、又はこれから構成される。好ましくは、ポリヌクレオチドは、ｓＩＦＮベータ−ＩｇＧＦｃｍｕｔの第二のサブユニット（ＩＦＮベータ−Ｆｃｍｕｔ腕部）をコードする配列番号９の配列を含み、又はこれから構成される。好ましくは、ポリヌクレオチドは、ｓＩＦＮベータ−ＩｇＧＦｃｍｕｔの第一のサブユニット（Ｆｃｍｕｔ腕部）及びシグナルペプチド（即ちマウスＩｇｋ軽鎖のシグナルペプチド）をコードする配列番号６の配列を含み、又はこれから構成される。好ましくは、ｓＩＦＮベータ−ＩｇＧＦｃｍｕｔの第二のサブユニット（ＩＦＮベータ−Ｆｃｍｕｔ腕部）及びシグナルペプチド（即ちヒトＩＦＮ−ベータのシグナルペプチド）をコードする配列番号９の配列を含み、又はこれから構成される。
【００５３】
一つの態様において、本発明のＤＮＡは、双方向性プロモーターを含む。好ましくは、該双方向性プロモーターは、マウス双方向性ＣＭＶプロモーターである。
【００５４】
より好ましくは、本発明のポリヌクレオチドは、配列番号１２の配列を含み、又はこれから構成され、本明細書ではＣ３７０ベクターとも称される（図１１）。そのようなベクターは、コンパウンド１（即ち、配列番号６及び１１）をコードするＤＮＡ配列を含む。
【００５５】
もう一つの側面において、本発明は、例えば本発明のベクター、又は本発明のポリヌクレオチドをトランスフェクションして生じる、宿主細胞を提供する。
【００５６】
もう一つの側面において、本発明は、本発明のｓＩＦＮベータ−ＩｇＧＦｃｍｕｔを含む医薬組成物及びその医薬として、特に多発性硬化症治療のための使用を提供する。
【００５７】
本発明の医薬組成物は、多発性硬化症の診断、予防、及び／又は治療（局所的又は全身的）において有用である。
【００５８】
本発明の文脈中で、「治療」という用語は、疾患発症後の病理学的発達の減衰、低下、減少又は縮小を含む、疾患の進行に対する任意の有益な効果を指す。
【００５９】
本発明の医薬組成物は、医薬として許容される担体と共に投与されてもよい。
【００６０】
「医薬として許容される」という用語は、有効成分の生体活性の有効性に干渉せず、投与を受ける対象に毒性ではない任意の担体を含むことを意味する。例えば、非経口投与において、有効タンパク質は、生理食塩水、デキストロース溶液、血清アルブミン及びリンゲル溶液等のビヒクル中で、注射用単位剤形に製剤化され得る。
【００６１】
もう一つの側面において、本発明は、医薬として使用するための本発明の医薬組成物を提供する。もう一つの側面において、本発明は、患者に本発明の医薬組成物を投与することを含む、患者の疾患を治療する方法を提供する。好ましくは、前記疾患は、有毛細胞白血病、カポジ肉腫、慢性骨髄性白血病、多発性硬化症、Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、ＨＩＶ並びに／又はエプスタイン・バー（Ｅｐｓｔｅｉｎ Ｂａｒｒ）、ヘルペスウイルス、及び／若しくはパピローマウイルスから選択されるウイルスにより引き起こされる感染から選択される。より好ましくは、前記疾患は多発性硬化症である。一つの態様において、前記疾患は、寛解再発型多発性硬化症（ＲＲＭＳ）である。
【００６２】
もう一つの側面において、本発明は、本発明のｓＩＦＮベータ−ＩｇＧＦｃｍｕｔの、有毛細胞白血病、カポジ肉腫、慢性骨髄性白血病、多発性硬化症、Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、ＨＩＶ並びに／又はエプスタイン・バー（Ｅｐｓｔｅｉｎ Ｂａｒｒ）、ヘルペスウイルス、及び／若しくはパピローマウイルスから選択されるウイルスにより引き起こされる感染の予防及び／又は治療のための医薬を製造するための使用を提供する。
【００６３】
本発明の第一の使用において、本発明の医薬組成物は、肺投与される。
【００６４】
本発明の第二の使用において、本発明の医薬組成物は、鼻腔内投与される。
【００６５】
本発明の第三の使用において、本発明の医薬組成物は、吸入により投与される。
【００６６】
本発明の第四の使用において、本発明の医薬組成物は、経口投与されうる。
【００６７】
本発明の第五の使用において、本発明の医薬組成物は、血管内投与又は筋肉内投与される。
【００６８】
好ましい態様において、本発明の使用において、本発明の医薬組成物は、皮下投与される。
【００６９】
本発明の医薬組成物は、毎日、又は２日置きに、上記経路のいずれかに従い投与される。
【００７０】
皮下投与又は筋肉内投与が行われたとすると、本発明の医薬組成物は、１週間に１回、２回、又は３回投与されるが、より好ましくは、２週間置きに投与される。
【００７１】
非経口（例えば、血管内、皮下、筋肉内）投与において、本発明の医薬組成物は、医薬として許容される非経口ビヒクル（例えば水、生理食塩水、デキストロース溶液）、及び等張性（例えばマンニトール）又は化学的安定性（例えば保存料及び緩衝液）を維持する添加物と組み合わせた溶液、懸濁物、エマルジョン、又は凍結乾燥粉末として製剤化され得る。該製剤は、通常使用される技術により滅菌される。
【００７２】
本発明の医薬組成物の有効成分は、様々な方法で、個体に投与され得る。投与の経路として、皮内、経皮（例えば徐放製剤で）、筋肉内、腹膜内、血管内、皮下、硬膜外、局所、経口経路が挙げられ、そして好ましくは、エアロゾル投与、鼻腔内経路又は吸入により投与される。他の任意の治療的に効果的な投与径路が使用され得て、例えば上皮又は内皮を通じた吸収、又は遺伝子治療による投与が挙げられる。遺伝子治療において、前記有効成分をコードするＤＮＡ分子が患者に投与（例えばベクターを用いて）され、これがインビボでの前記有効成分の発現を引き起こす。加えて、本発明に係る医薬組成物は、医薬として許容される界面活性剤、賦形剤、単体、希釈剤、及びビヒクル等の他の生体有効成分と共に投与され得る。
【００７３】
好ましくは、本発明の使用において、本発明の医薬組成物は、スプレー装置、エアロゾルスプレー、又は吸入器により送達される。一つの態様において、本発明の医薬組成物は、既知の装置を使用して投与され得る。単一バイアル系（ｓｉｎｇｌｅ ｖｉａｌ ｓｙｓｔｅｍ）を含む例として、Ｒｅｂｉｊｅｃｔ（登録商標）等の溶液の送達用の自動注入器又はペン型注入器を含む。
【００７４】
もう一つの側面において、本発明は、本発明の医薬組成物を含む装置を提供する。好ましくは、該装置はスプレー装置である。
【００７５】
単発又は複数回投与として個体に投与される用量は、薬物動態的特性、投与径路、患者の状態及び特徴（性別、年齢、体重、健康状態、伸長）、症状の程度、併用療法、治療の頻度、及び所望の効果を含む様々な要素に依存して変化し得る。
【００７６】
「複数回投与使用」という表現は、複数回、例えば２、３、４、５、６回以上注入及び／又は吸入用の、医薬組成物、本発明のｓＩＦＮベータ−ＩｇＧＦｃｍｕｔの単一バイアル、アンプル、又はカートリッジの使用を含むことを意図する。該注入及び／又は吸入は、少なくとも、又は約１２時間、２４時間、４８時間等の時間にわたり、好ましくは１２日間に及んでなされる。該注入及び／又は吸入は、例えば、６、１２、２４、４８、又は７２時間等の間隔でなされ得る。
【００７７】
一つの態様において、本発明の使用において、本発明の医薬組成物は、対象あたり一日に約３０〜１２０μｇの用量でｓＩＦＮベータ−ＩｇＧＦｃｍｕｔが投与される。
【００７８】
好ましくは、本発明の使用において、本発明の医薬組成物は、吸入あたり約１、５、８、１０、１２、１５、２０、又はそれ以上の用量でｓＩＦＮベータ−ＩｇＧＦｃｍｕｔが投与される。
【００７９】
好ましくは、本発明の使用において、本発明の医薬組成物は、対象あたり一日に約３０〜１０，０００μｇの用量でｓＩＦＮベータ−ＩｇＧＦｃｍｕｔが投与され、又は対象あたり一日に約６０〜２０００μｇの用量でｓＩＦＮベータ−ＩｇＧＦｃｍｕｔが投与され、又は対象あたり一日に約９０〜１，０００μｇの用量でｓＩＦＮベータ−ＩｇＧＦｃｍｕｔが投与される。
【００８０】
一つの態様において、本発明の使用において、本発明の医薬組成物は、一回に少なくとも１０７μｇ、より好ましくは少なくとも１５７μｇの用量でｓＩＦＮベータ−ＩｇＧＦｃｍｕｔが投与される。
【００８１】
ｓＩＦＮベータ−ＩｇＧＦｃｍｕｔの重量（μｇ）に代えて、用量は、ＩＦＮ−ベータの当量で計算され得る。
【００８２】
もう一つの側面において、本発明は、本発明のｓＩＦＮベータ−ＩｇＧＦｃｍｕｔの製造方法を提供し、該方法は、本発明の宿主細胞の培養、及び本発明のｓＩＦＮベータ−ＩｇＧＦｃｍｕｔの単離を含む。
【００８３】
学術論文又は概説、公開又は未公開の米国又は外国の特許出願、又は他の任意の参考文献を含む、本明細書中に引用した全ての参考文献は、これらの引用される参考文献中に表されている全てのデータ、表、図及び文章を含め、全て本明細書中に参照により援用される。加えて、本明細書中に引用されるそれらの参考文献中に引用される参考文献の全ての内容も、全て参照により援用される。
【００８４】
前記具体的な態様の記載は、過度な実験を行うことなく、本発明の一般的概念から逸脱することなく、そのような具体的態様を適用するために、他者が、当該技術分野の通常の知識（本明細書中に引用される参考文献の内容を含む）を利用して、容易に改変及び／又は適応が可能となるように、本発明の一般的本質を全て明らかにするものである。従って、そのような適応及び改変は、本明細書中に表される教示及び誘導に基づいて、開示される態様の均等の意義の範囲内であると意図される。本明細書中の表現（ｐｈｒａｓｅｏｌｏｇｙ）又は用語（ｔｅｒｍｉｎｏｌｏｇｙ）は、記載を目的とするものであり、限定を目的とするものではない。
【図面の簡単な説明】
【００８５】
【図１】本発明の一つの態様を記載するものであり、ｓＩＦＮベータ−ＩｇＧＦｃｍｕｔの２つのサブユニットの模式図である。図１ａは、ｓＩＦＮベータ−ＩｇＧＦｃｍｕｔのＦｃ腕部における５つの突然変異を示し、それらにはＥＵインデックスの位置表記で番号が振られ、及びその機能が記載されている。図１ｂはｓＩＦＮベータ−ＩｇＧＦｃｍｕｔを表し、サブユニットの名称を明示している。
【００８６】
【図２】本発明の１つの態様を記載し、部位指向的突然変異生成によりコンパウンド１（即ち配列番号３）のＦｃｍｕｔ腕部内に導入されるアミノ酸突然変異と、ＭＧＣ／Ｉｍａｇｅ共同体クローン（ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ ｃｌｏｎｅ）から得たｃＤＮＡクローン由来のＦｃドメイン（ＰＥＡＫ８由来ｈＦｃ；「Ｃ１Ｍ（ｎｏｎ−１）マーカー」アロタイプ）の相等部分とを比較した、配列アラインメントを表している。番号付けは、配列番号３に基づく。最初の３つの突然変異はＡＤＣＣを低下させ、一方最後の２つはＣＤＣを低下させる。突然変異Ｌ１４Ａ（即ちＥＵインデックスのＬ２３４Ａ）、Ｌ１５Ｅ（即ちＥＵインデックスのＬ２３５Ｅ）及びＧ１７Ｅ（即ちＥＵインデックスのＧ２３７Ｅ）は、Ｆｃ受容体ＦｃγＲＩ、ＩＩＡ、ＩＩＢ及びＩＩＩＡとの結合を遮り、一方Ａ１１０Ｓ（即ちＥＵインデックスのＡ３３０Ｓ）及びＰ１１１Ｓ（即ちＥＵインデックスのＰ３３１Ｓ）は、補体カスケードイニシエータータンパク質Ｃ１ｑとの結合を遮る。
【００８７】
【図３】本発明の一つの態様を記載したものであり、コンパウンド１のＦｃｍｕｔ腕部（即ち配列番号３）、コンパウンド２の対応する部分（即ち配列番号１４を指す。コンパウンド２は、ＩＦＮ−βとＦｃドメインとの間に８アミノ酸のリンカー配列を含むモノマー−ダイマータンパク質であり、Ｆｃドメインに１つだけ突然変異を含む）、及び「Ｇ１Ｍ（ｎｏｎ−１）マーカー」アロタイプの定常領域重鎖（即ち配列番号１）の間の配列アラインメントを表す。「．」は、配列番号３が配列番号１及び１４と異なっているアミノ酸の位置を示す。「：」は、配列番号１４が配列番号１及び３と異なっているアミノ酸の位置を示す。
【００８８】
【図４】本発明の一つの態様を記載したものであり、コンパウンド１のＩＦＮベータ−Ｆｃｍｕｔ腕部（即ち配列番号８）、コンパウンド２の対応する部分（即ち配列番号１５）、及びヒトＩＦＮ−ベータ（ＵｎｉＰｒｏｔ受入番号Ｐ０１５７４）の間の配列アラインメントを表す。「（下矢印）」は、ＩＦＮ−ベータ−Ｆｃｍｕｔ腕部が突然変異している位置を示す。「（シャープ）」は、配列番号１５が突然変異している位置を示す。「（センテンス）」は、コンパウンド１及び２が構成されている２つの異なるアロタイプを特徴づける位置を示す。
【００８９】
【図５】本発明の一つの態様を記載したものであり、抗ウイルスアッセイのＷＩＳＨ／ＶＳＶ法（水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）の細胞変性作用（ＣＰＥ）に対する羊膜細胞株由来ＷＩＳＨ細胞の耐性試験）の結果を表す。曲線は、コンパウンド１、コンパウンド２及び組換えヒトＩＦＮ−β−１ａの用量応答曲線に対応する。データは、細胞変性作用の阻害のパーセンテージとして表される。
【００９０】
【図６】本発明の一つの態様を記載したものであり、ＷＩＳＨ細胞における抗増殖アッセイの結果を表す。曲線は、コンパウンド１、コンパウンド２及び組換えヒトＩＦＮ−β−１ａの用量応答曲線に対応する。データは、細胞増殖のパーセンテージとして表される。
【００９１】
【図７】本発明の一つの態様を記載したものであり、ベロ細胞におけるレポーター遺伝子アッセイ（ＲＧＡ）の結果を表す。曲線は、コンパウンド１、コンパウンド２及び組換えヒトＩＦＮ−β−１ａの用量応答曲線に対応する。データは、毎秒カウント（ｃｐｓ）として表される。
【００９２】
【図８】本発明の一つの態様を記載したものであり、コンパウンド１及びコンパウンド２と、ＣＤ６４をトランスフェクションしたＩＩＡ１．６細胞との相対的な結合を表す。
【００９３】
【図９】本発明の一つの態様を記載したものであり、コンパウンド１及びコンパウンド２とＣ１ｑとの結合を表す。図９ａはＩｇＧ１を含み、そして図９ｂはＩｇＧ１を除外している。
【００９４】
【図１０】本発明の一つの態様を記載したものであり、平均（ＳＤ）ＩＦＮ−β、コンパウンド１又はコンパウンド２の血清プロフィールを示す。曲線は、５５ｐＭｏｌ／ｋｇのＲｅｂｉｆ（登録商標）皮下投与後のＩＦＮ−β血清レベル；表面付着用量１３８ ｐＭｏｌ／ｋｇで吸入経路によりコンパウンド１を投与した後のコンパウンド１の血清レベル；及び表面付着用量１３８ ｐＭｏｌ／ｋｇで吸入経路によりコンパウンド２を投与した後のコンパウンド２の血清レベルに対応する。
【００９５】
【図１１】本発明の一つの態様を記載したものであり、コンパウンド１を生産するために使用される、Ｃ３７０発現ベクターを図示する。
【実施例】
【００９６】
以下において、本発明は、以下の実施例により例証されるが、これは、本発明の範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。
【００９７】
特定に使用される解析プロトコル
１．ＲＰ−ＨＰＬＣ
ＨＰＬＣ： Ａｇｉｌｅｎｔ １１００ Ｓｅｒｉｅｓシステム（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）
カラム： Ａｑｕａｐｏｒｅ ＢＵ−３００ ３０ｘ２．１ｍｍ（Ｂｒｏｗｎｌｅｅ ０７１１−００６２）
溶媒Ａ： 水中０．１％ＴＦＡ
溶媒Ｂ： ９０％アセトニトリル中０．１％ＴＦＡ
勾配（Ｇｒａｄｉｅｎｔ）： ＰｒｏｔＣ４
【００９８】
試料調製：
１５μｌ注入する。タンパク質を、最終体積が１００μｌとなるように溶媒Ａに溶解する。
【００９９】
２．ＳＤＳ−ＰＡＧＥ
ゲル： ＮｕＰａｇｅ ４−１２％ Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ＮＰ０３２２）
緩衝剤： ＮｕＰａｇｅ ＭＥＳ ＳＤＳ 泳動緩衝剤（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ＮＰ０００２）及び１０ｘ濃縮サンプル緩衝剤を使用する。還元条件にするため、１０ｍＭのＤＴＴを添加する。
泳動条件： ２００Ｖで４０分間泳動する。
【０１００】
試料調製：
１０μｌを充填する。タンパク質を、最終体積が２０μｌとなるように１０ｘサンプル緩衝剤に溶解する。９５℃で５分間加熱する。０．１％クーマシーブルー、３０％メタノール、１０％酢酸中で、４５分間染色する。３０％メタノール、１０％酢酸中で脱染色する。
【０１０１】
３．ＩＥＦ
ゲル： ｐＨ３〜１０ ＩＥＦゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ＥＣＣ６６５５Ａ）
緩衝剤： ＩＥＦ Ａｎｏｄｅ緩衝剤（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ＬＣ５３００）、ＩＥＦ Ｃａｔｈｏｄｅ緩衝剤（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ＬＣ５３１０）、ＩＥＦ ｐＨ３〜１０ サンプル緩衝剤（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ＬＣ５３１１）
【０１０２】
試料調製：１０μｌを充填する。試料を、１容のサンプル緩衝剤で希釈する（試料を加熱しない）。
泳動条件： １００ｖで１時間、２００ｖで１時間、４００ｖで１時間とする。
３０％メタノール、１０％酢酸で３０分間２回固定する。０．１％クーマシーブルー、３０％メタノール、１０％酢酸中で、４５分間染色する。３０％メタノール、１０％酢酸中で脱染色する。
【０１０３】
ウエスタンブロット
ブロッキング溶液： ＰＢＳ／０．１％、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ１００、５％ミルク
洗浄溶液： ＰＢＳ／０．１％、ＴｒｉｔｏｎＸ１００
抗体溶液： 洗浄溶液で抗体を希釈する。
【０１０４】
室温で１時間、又は４℃で一昼夜ブロッキングする。５分間３回洗浄する。室温で１時間一次抗体でインキュベーションし、３０分間洗浄する。室温で１時間一次抗体でインキュベーションし、少なくとも１時間洗浄する。
ＥＣＬによるウエスタンブロッティング： 試薬に付属している手順に従う。
【０１０５】
抗体
抗Ｆｃ抗体＝ヤギ抗ヒトＩｇＧ、ＦｃフラグメントＨＲＰ（１，０００ｘ希釈）（Ｊａｃｋｓｏｎ １０９−０３６−０９８）
抗ＩＦＮ−ベータ＝
一次抗体＝抗ＩＦＮ−ベータ−ｍａｂ １１７．１ ０．１μｇ／ｍｌ
二次抗体＝ヤギ抗マウスＩｇＧ ＨＲＰ（１，０００ｘ希釈）（Ｄａｋｏ Ｐ０４４７）
【０１０６】
５．脱グリコシル化
Ｎ−グリコシダーゼＦ（Ｒｏｃｈｅ １１ ３６５ １９３ ００１）
リン酸緩衝剤ｐＨ７．５／１０％アセトアミド中に１０μｇのｓＩＦＮベータ−ＩｇＧＦｃｍｕｔを添加する。これに５ＵのＰＮＧａｓｅ Ｆを添加して、３７℃で一昼夜インキュベーションする。
【０１０７】
６．脱グリコシル化後の還元
試料を、４ＭグアニジンＨＣＬ、１０ｍＭ ＤＴＴ中で、５６℃で１時間インキュベーションする。
【０１０８】
７．Ｎ末端シークエンシング
２００ピコモルを充填する。シークエンシングの前に、試料をＰｒｏｓｏｂカートリッジ（ＡＢＩ ４０２０５２）に充填する（Ｐｒｏｓｏｒｂカートリッジは、シークエンシングに適したマトリックス（ＰＶＤＦ膜）上に希釈したタンパク質試料を迅速に濃縮及び洗浄するために設計されている）。
装置：
Ｍｉｃｒｏｇｒａｄｉｅｎｔ １４０Ｃ ＨＰＬＣ （Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）と接続したＭｏｄｅｌ ４９４ Ｐｒｏｃｉｓｅマイクロシークエンシングシステム。
【０１０９】
８．アミノ酸解析
アミノ酸解析は、真空下窒素中の気相加水分解により実行される。１ｍｇ／ｍｌのフェノールを含む６Ｎ ＨＣｌ中で、１１２℃で２４時間処理（Ａｔｍｏｓｐｈｅｒｅ）する。アルファアミノ駱酸（ＡＡｂＡ）を、内部標準として加水分解産物中に含ませる。試料を２回解析する。加水分解したアミノ酸を、Ｗａｔｅｒｓ ＡＣＣＱ． Ｔａｇ化学パッケージを使用して定量する。
【０１１０】
Ｗａｔｅｒｓ ＡｃｃＱ． Ｔａｇ
これは、カラム前誘導体化技術である。ＡＡ誘導体をＲＰ−ＨＰＬＣで分画し、そして蛍光検出により定量する。Ａ３レベルの較正が得られる（２０、５０、及び１００ピコモル）。
【０１１１】
材料
ｉ）タンパク質加水分解：
反応バイアル集合（ａｓｓｅｍｂｌｙ）（ Ｗａｔｅｒｓ ＷＡＴ００７３６３）
試料チューブ（Ｗａｔｅｒｓ ＷＡＴ００７５７１）
Ｐｉｃｏ． Ｔａｇ ワークステーション（Ｗａｔｅｒｓ ＷＡＴ００７３７０）
【０１１２】
ｉｉ）ＡＡＡ誘導体化、分画及び定量：
ＨＰＬＣ： Ａｇｉｌｅｎｔ １０９０ Ｓｅｒｉｅｓシステム（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）
検出器： ＦＬＤ Ｇ１３２１Ａ Ａｇｉｌｅｎｔ １１００シリーズ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）
励起： ２５０ｎｍ
放射： ３９５ｎｍ
カラム： ＡｃｃＱ．Ｔａｇ Ｃ１８４μｍ ３．９ｘ１５０ｍｍ（Ｗａｔｅｒｓ ＷＡＴ０５２８２５）
溶媒Ａ： ９００ｍｌ Ｈ２Ｏ＋９０ｍｌ ＡｃｃＱ．Ｔａｇ Ｅｌｕｅｎｔ Ａ Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅ （ＷＡＴ０５２８９０）
溶媒Ｂ： 水中６０％アセトニトリル（Ｂａｋｅｒ ９０１７）
【０１１３】
【表２】
【０１１４】
９．ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ
マススペクトロメトリー解析は、リニアモードで操作するＶｏｙａｇｅｒ ＤＥ−ＰＲＯ ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦマススペクトロメーター（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）で実行された。エネルギー吸収分子として、シナピン酸を使用した。精製されたタンパク質試料を、１ｍｇ／ｍｌの濃度の０．１％ＴＦＡ溶液中に懸濁した。試料標的上に、１ｍｇのタンパク質をスポットした。該タンパク質液滴上に１μｌの飽和シナピン酸溶液（Ｈ２Ｏ＋０．１％ＴＦＡ中５０％アセトニトリル）を重層し、室温で感想させた。ＡＢＩの較正標準を使用して、各解析において質量較正を行った。
【０１１５】
１０．ＳＥ−ＨＰＬＣ法
ＨＰＬＣ： Ｗａｔｅｒｓ Ａｌｌｉａｎｃｅ ２６９５
移動相： 最終ｐＨ７．５の５ＯｍＭリン酸ナトリウム＋ＮａＣｌ ５００ｍＭ
カラム： 室温のＳｕｐｅｒｄｅｘ ２００ １０／３００ＧＬ。カラムは、垂直に使用しなければならない。
流速： ５００μＬ／分〜７５０μＬ／分（圧力は最高で２１０ｐｓｉ）
オートサンプラー： ５℃のＷａｔｅｒｓ Ａｌｌｉａｎｃｅ ２６９５
検出： Ｗａｔｅｒｓ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ２４７５（Ｅｍｐｏｗｅｒ Ｓｏｆｔｗａｒｅのエミュレーション４７４を用いる）を、励起波長２８０ｎｍ、放射波長３４８ｎｍ、ウインドウ１８ｎｍ、ゲイン１００， 減衰１で使用する。
【０１１６】
実施例１
本発明の好ましいタンパク質は、コンパウンド１と称される、ｓＩＦＮベータ−ＩｇＧＦｃｍｕｔである。コンパウンド１において、１つのサブユニット（ＩＦＮベータ−Ｆｃｍｕｔ腕部、配列番号８）は、ＩＦＮ−βと、ヒトＩｇＧ１ Ｆｃドメインの突然変異Ｆｃドメインとの融合産物である。他のサブユニット（Ｆｃｍｕｔ腕部、配列番号３）は、前記第一のサブユニットのＦｃ部分単独と同一である。両サブユニット中に存在するＦｃ部分の配列は、イムノグロブリンエフェクター機能を低下させるべく、「Ｇ１Ｍ（ｎｏｎ−１）マーカー」アロタイプの５つのアミノ酸を置換することにより改変されている（図１、３及び４）。比較のために、本明細書中で「コンパウンド２」と称される、ＷＯ ２００５／００１０２５に開示される、ＩＦＮ−ベータのモノマー−ダイマータンパク質が調製される。コンパウンド２は、ＩＦＮ−ベータとＦｃドメインとの間に８アミノ酸のリンカー配列を含み、異なるＩｇＧ１アロタイプと比較して、Ｆｃドメインにおいて１つだけ突然変異（即ち、ＥＵインデックス位置表記でＮ２９７Ｅ）を含む（図４）。
【０１１７】
ＩＦＮ−ベータと連結していないコンパウンド２のサブユニットは、配列番号１５に記載されている。８アミノ酸のリンカーを介してＩＦＮ−ベータと連結しているコンパウンド２のサブユニットは、配列番号１６に記載されている。
【０１１８】
コンパウンド１の生産は、血清不存在下で培養したＣＨＯ−Ｓ細胞のクローンの作製により構築される。ＣＨＯ−Ｓ細胞はチャイニーズハムスター卵巣細胞に由来し、無血清懸濁培養条件に適応している（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ／Ｇｉｂｃｏ， Ｌａ Ｊｏｌｌａ， ＣＡ）。
【０１１９】
１．クローニング
コンパウンド１の生産に使用される発現ベクターＣ３７０（図１１；Ｃ３７０ベクターの配列は、配列番号１２に記載される）は、双方向性マウスＣＭＶプロモーター（ＩＥ１及びＩＥ２）を含む。ＩＦＮ−ベータをコードする配列は、ヒトゲノムＤＮＡに由来するものであった。ＩｇＧ１重鎖ｃＤＮＡクローン（「Ｇ１Ｍ（ｎｏｎ−１）マーカー」アロタイプ）は、ヒト脾臓ｃＤＮＡライブラリーに由来するＭＧＣ／Ｉｍａｇｅ共同体クローンから取得されるものであった。突然変異ヒトＩｇＧ１ Ｆｃドメイン（ＩｇＧＦｃｍｕｔ）は、「Ｇ１Ｍ（ｎｏｎ−１）マーカー」アロタイプに由来するＦｃドメインを含むＰＥＡＫ８プラスミドからＰＣＲにより取得されるものであった。ここで該Ｆｃドメインは、Ｑｕｉｋ ｃｈａｎｇｅ ＩＩ突然変異生成システム（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を使用する２つの工程において突然変異したものであった。幾つかの単アミノ酸置換をＦｃドメインに導入することにより、ＡＤＣＣ／ＣＤＣを媒介するのに重要なアミノ酸を突然変異させた（図２〜４）。第一の工程において、配列番号１の１１７ＬＬＧＧ１２０（即ちＥＵインデックスの２３４ＬＬＧＧ２３７）アミノ酸をコードする配列を、１１７ＡＥＧＡ１２０に突然変異させた。第二の工程において、配列番号１のＡ２１３（ＥＵインデックスのＡ３３０）及びＰ２１４（ＥＵインデックスのＰ３３１）アミノ酸をコードする配列を、Ｓ２１３及びＳ２１４に突然変異させた。ｓＩＦＮベータ−ＩｇＧＦｍｕｔのＦｃ腕部とフレームを合わせた同種シグナルペプチド配列を含んで、ＩＦＮ−ベータをコードするｃＤＮＡを、オーバーラッピングＰＣＲ（ｏｖｅｒｌａｐｐｉｎｇ ＰＣＲ）により作製し、そしてＩＥ１プロモーターの下流をサブクローニングした。他の突然変異ｓＩＦＮベータ−ＩｇＧＦｍｕｔのＦｃ腕部の配列をコードする配列と融合したマウスＩｇｋ軽鎖のシグナルペプチド配列をコードするｃＤＮＡをＰＣＲにより作製し、ＩＥ２プロモーターの下流をサブクローニングした（図１１）。
【０１２０】
２．発現ベクターコンストラクト
それから、組換えＰＣＲによりＩＦＮベータ−Ｆｍｕｔ腕部融合遺伝子を作製し、これをＣＨＯ細胞内で高いレベルで恒常的に発現する発現ベクターにクローニングした。最終的なベクターＣ３７０は、マウス双方向性ＣＭＶプロモーターを含む。
【０１２１】
ＩＦＮ−ベータダイマーとｓＩＦＮベータ−ＩｇＧＦｍｕｔとの比率のバランスが望ましいものとなるように、Ｆｃｍｕｔ腕部コード配列を選択圧（ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｐｒｅｓｓｕｒｅ）に関連付けた。これにより、ＤＳＰ精製の過程でより容易にＩＦＮ−ベータダイマーを排除できる。前記マウスＣＭＶ双方向性プロモーターは、コンパウンド１の２つの鎖の発現を駆動する。ポリオウイルス内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）を使用して、前記選択（ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ）をＦｃｍｕｔ腕部と連動させる。インスレーター配列を使用することにより、クロマチン近傍部位へのランダム挿入で起こり得る発現単位の抑制が遮蔽される。
【０１２２】
３．トランスフェクション用ＤＮＡの調製
ステーブルトランスフェクションの水準を保証するために、トランスフェクション用プラスミドＤＮＡを調製した。ＤＨ５α細菌（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ， Ｃａｔ． ＃１８２６５−０１７）を、供給元のプロトコルに従って、オリジナルプラスミドＤＮＡを用いて形質転換し、アンピシリン１００μｇ／ｍｌの選択圧下で選択した。単一コロニーを拾い；細胞をアンピシリン１００μｇ／ｍｌを含む１ｍｌのＬＢ中で細胞を一昼夜培養して、それから１００ｍｌの培養で一昼夜増幅した。プラスミドは、Ｎｕｃｌｅｏｂｏｎｄ ＰＣ ５００ ＥＦキット（Ｍａｃｈｅｒｅｙ−Ｎａｇｅｌ， Ｃａｔ． ＃７４０５５０）のプロトコルに従って単離した。単離したプラスミドの水準は、ＯＤ２６０ｎｍ及びＯＤ２８０ｎｍを測定し、そしてＯＤ２６０ｎｍ／ＯＤ２８０ｎｍの比率が１．８を超えていることを測定することにより評価した。プラスミドの同一性は、４つの制限酵素を独立した反応で用いるＤＮＡ消化により評価した。Ｆｃｍｕｔ腕部及びＩＦＮベータ−Ｆｍｕｔ腕部のコード領域は、トランスフェクションに先立って両方向からシークエンシングされた。更に、プラスミドＤＮＡは、元のベクターを切断する適切な酵素を用いて直鎖にされた。本ベクターＣ３７０は、ＣｌａＩ（１．２５５ μｇ／μｌ）を用いて直鎖化された。
【０１２３】
４．宿主細胞の起源及び標準的な培養手順
前記ＣＨＯ−Ｓ細胞は、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから入手した。トランスフェクションしていないＣＨＯ−Ｓ細胞は、Ｌ−グルタミン（Ｓｉｇｍａ， Ｃａｔ． ＃Ｇ７５１３）を４．５ｍＭ添加したＰｒｏＣＨＯ５培地（Ｂｉｏ Ｗｈｉｔｔａｋｅｒ， Ｃａｔ． ＃１２−７６６０）中で培養した。トランスフェクションは、前記培地中で行った。選択において、４．５ｍＭのＬ−グルタミン及び１０μｇ／ｍｌのピューロマイシン（Ｓｉｇｍａ， Ｃａｔ． ＃Ｐ−７２５５）を添加したＰｒｏＣＨＯ５培地を使用した。１３０ｒｐｍで振盪するＴ７５フラスコ又はＥｒｌｅｎｍｅｙｅｒ（１３５ ｍｌ）フラスコ中で懸濁条件下の前記細胞株を培養し、これを５％ＣＯ２を含む３７℃インキュベーター中でインキュベーションした。基本的に、週２〜３回の頻度で、０．２ｘ１０６生存細胞／ウェルに希釈して、細胞を継代した。
【０１２４】
５．細胞の凍結、融解及び培養
通常、バイアル当り５〜１０ｘ１０６生存細胞の密度で細胞を凍結した。必要な量の細胞を遠心分離し、それから０．５ｍｌのＰｒｏＣＨＯ５培地に再懸濁した。次に、ＤＭＳＯ（Ｓｉｇｍａ）を１５％添加した０．５ｍｌのＰｒｏＣＨＯ５凍結培地（Ｂｉｏ Ｗｈｉｔｔａｋｅｒ， Ｃａｔ． ＃１２−７６８Ｅ）を添加した。この細胞を−８０℃で凍結し、それから窒素で冷却した保存タンクに移した。
【０１２５】
融解において、アンプルを３７℃のウォーターバスに置いた。次に、温めておいたＰｒｏＣＨＯ５培地１０ｍｌに細胞を移し、８００ｇで３分間遠心分離し、それからこれを、Ｔ７５フラスコ中の新鮮な培地に、０．２〜０．４ｘ１０６細胞／ｍｌで再懸濁した。週２〜３回の頻度で、０．２ｘ１０６生存細胞／ｍｌに希釈して、細胞を継代した。Ｔ７５フラスコにおいては１０〜２０ｍｌの培地で、Ｅｒｌｍｅｙｅｒフラスコにおいては３５ｍｌの培地で、細胞を培養した。
【０１２６】
６．ステーブルトランスフェクション
トランスフェクションの前日に、４．５ｍＭのＬ−グルタミンを添加したＰｒｏＣＨＯ５培地中で培養していたＣＨＯ−Ｓ細胞を、０．７ｘ１０６生存細胞／ｍｌに希釈した。トランスフェクションは、１２ｍｌｎのＣＨＯ−Ｓ及び１０μｇ（８μｌ）のＣ３７０を用いて、エレクトロポレーションにより実行した。
【０１２７】
７．選択
トランスフェクションの４８時間後、細胞を計数し、遠心分離により培地を除去し、それから細胞を選択培地（Ｌ−グルタミン４．５ｍＭ及びピューロマイシン１０μｇ／ｍｌを添加したＰｒｏＣＨＯ５）中で０．５ｘ１０６生存細胞／ｍｌに希釈した。培地は、２日置きに交換した。期間中、細胞密度をモニタリングし、生存細胞の数が０．１ｘ１０６生存細胞／ｍｌを下回ったときは、細胞をより小さい体積にまとめた。あるいは、生存細胞の数が増大したときは、細胞を０．４〜０．５ｘ１０６生存細胞／ｍｌに希釈した。この手順を、プールの生存率が９０％に達するまで繰り返した。取得されたプールの生産率（タイター及び１日の細胞あたりのピコグラム（ｐｃｄ））、及び生体活性（バイオアッセイ）が試験され、これらを単離プロトクローン（ｐｒｏｔｏｃｌｏｎｅ）に直接使用する。
【０１２８】
８．プロトクローンの単離
ステーブルトランスフェクション細胞のプールを、０．３％（ｖ／ｖ）の０．５％フェノールレッド溶液（Ｓｉｇｍａ， Ｃａｔ． ＃Ｐ０２９０）を添加した選択培地で、ウェルあたり（７０μｌ）１個の細胞が含まれるように希釈し、これを、Ｍｕｌｔｉｄｒｏｐ分注ロボット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｌａｂｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて、３８４ウェルにプレーティングした。播種の２週間後、単一のプロトクローンを拾い、これを選択剤を含まない適切な培地２００μｌに懸濁し、これを９６ウェルに再播種した。Ｂｅｃｋｍａｎ Ｂｉｏｍｅｋ ２０００ロボットを用いて、細胞を、１週間に１回２０倍に希釈した。
【０１２９】
９．クローンの単離及び評価
前記培養プロトクローンを、０．３％（ｖ／ｖ）のフェノールレッド溶液を添加した適切な培地で、０．４細胞／ウェル（７０μｌ）の濃度に希釈し、これを、Ｍｕｌｔｉｄｒｏｐ分注ロボットを用いて３８４ウェルにプレーティングした。播種の４、５日後、各ウェル中の増殖を検鏡し、単一のクローンのみ増殖しているウェルにマークを付けた。クローン性を確認するために、増殖細胞を有するウェルの数を計数し、これがプレート全体の３３％未満となるように維持した。培養の１５日後、選択されたクローンを２４ウェルプレートに移し、これを増殖させ、それから、定量Ｂｉａｃｏｒｅアッセイを用いて最初のプロトクローンのそれぞれにおける６つのクローンの生産性を更に解析した。Ｔ７５フラスコ中で、タイター及び特定の生産性（Ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐｒｏｄｕｃｔｉｖｉｔｙ）を、２４時間ごとに評価した。最良のクローンを４つ選択し、更に振盪フラスコ実験において解析した。あるいは、Ｂｉａｃｏｒｅ法に代えて、ＲＰ−ＨＰＬＣ及びＳＥ−ＨＰＬＣを、解析法として使用する場合がある。
【０１３０】
１０．生産性測定
タンパク質濃度及び特定の生産性を、２４時間ごとに測定した。このために、細胞を、１０ｍｌの新鮮な培地（６０ｒｐｍで攪拌するＴ７５フラスコ中）中に０．８ｘ１０６生存細胞／ｍｌで再懸濁した。２４時間後、細胞を計数し、１ｍｌの培養液を回収し、ＩＦＮ−β特異的Ｂｉａｃｏｒｅアッセイに供した。特定の生産性（１日の細胞あたりのピコグラム（ｐｃｄ）で表される）は、タイター（ｍｇ／ｌ）／期間の始まりから終わりまでの間の平均細胞密度／期間の長さ（１日）として、計算した。攪拌フラスコ実験において、ｐｃｄは、所定の期間にわたるＩＶＣの機能として計算した。
【０１３１】
１１．ＳＤＳ−ウェスタンブロット解析
培養上澄を、ウェスタンブロット解析に供した。簡単に述べると、タンパク質試料を厚さ１ｍｍの８〜１８％濃度勾配アクリルアミドゲルを使用して、４℃で交流（３０ｍＡ）のＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、その後、これをＰＶＤＦ膜に転写した。抗ＩＦＮβ又はＦｃモノクローナル抗体を、エピトープ検出に使用した。
【０１３２】
ノザンブロット解析
ＲＮｅａｓｙ ＭｉｎｉＫｉｔのプロトコル（Ｑｉａｇｅｎ， Ｃａｔ． ＃７４１０４）に従い、８ｘ１０６細胞からＲＮＡを単離した。製造者のプロトコルに従い、ＮｏｒｔｈｅｍＭａｘ（登録商標）−Ｇｌｙ ｋｉｔ（Ａｍｂｉｏｎ， Ｃａｔ． ＃１９４６）を使用して、ノザンブロットを実行した。ウェルあたり１００ｎｇのＲＮＡをウェルに注入し、これをアガロースゲル電気泳動（１％アガロース）により分離し、それからＴｕｒｂｏｂｌｏｔｔｅｒキット（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ ＆ Ｓｃｈｕｅｌｌ， Ｃａｔ． ＃１０４１６３２８）を使用して、これをＢｒｉｇｈｔＳｔａｒ−Ｐｌｕｓ膜（Ａｍｂｉｏｎ， Ｃａｔ． ＃１０１０２）に転写した。１０μｇのＲＮＡラダー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ， Ｃａｔ． ＃１５６２０−０１６）をサイズマーカーとして使用した。ＵＶ架橋（Ｓｔｒａｔａリンカー）によりＲＮＡを不動化し、そして焼き固めた（１０分、７０℃）。供給者のプロトコルに従い、ＤＩＧ Ｎｏｒｔｈｅｒｎ Ｓｔａｒｔｅｒ Ｋｉｔ （Ｒｏｃｈｅ， Ｃａｔ． ＃２０３９６７２）を使用して、ＤＩＧを用いたプローブ標識及びハイブリダイゼーション（６８℃）を実行した。ハイブリダイゼーションには、１００ｎｇ／ｍｌのＲＮＡプローブを使用した。Ｔ３ ＲＮＡポリメラーゼを用いる標準的なインビトロ転写プロトコルを使用して、プローブを調製した。
【０１３３】
取得されたパターンは、Ｈｙｐｅｒ Ｆｉｌｍ （Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ， Ｃａｔ． ＃ＲＰＮ２１０３Ｋ）に前記膜を曝露し、又はＣｈｅｍｉ Ｄｏｃ （ＢｉｏＲａｄ）を用いて画像を取得することにより検出された。
【０１３４】
実施例２
１．発現
６０ｍｇのコンパウンド１を生産するために、５Ｌスケールのバイオリアクター中で、一般的培養プロセスを実行した。使用する細胞株（クローン）はＣＨＯ−Ｓであり、これを、「ボーラス流加培養」法（単一添加物を用いたバッチ培養）中、無血清条件下で培養した。所望の量を生産するには、これを２回行う必要がある。
【０１３５】
各バイオリアクターの接種材料を作るために、細胞を振盪フラスコ中で増幅した。増幅は、１２５ｍｌ、５００ｍｌ、及び１，０００ｍｌのフラスコに、それぞれ３０ｍｌ、２００ｍｌ、及び５００ｍｌの培地を入れて行った。５Ｌのバイオリアクターは、接種材料や栄養分の体積を含めて、最終的に３Ｌの内容物を含んでいた。
【０１３６】
全ての段階で使用される維持培地は、４．５ｍＭのＬ−グルタミンを添加した、Ｃａｍｂｒｅｘ （Ｂｅｌｇｉｕｍ）製ＰｒｏＣＨＯ５であった。
【０１３７】
２つのボーラスが添加された。第一のボーラスは、０．６８ｇ／Ｌのヒポキサンチン、０．１９４ｇ／Ｌとなるチミジン０．５６ ｇ、４２ｍｇ／ＬのＬ−システイン−ＨＣＩ、０．５ｍＭの葉酸及び４．５ｍＭのＬ−グルタミン（最終濃度）を含むＦ１であった。ボーラスＦ２は、５ｍｇ／Ｌグルコースを含み、又は含まない４．５ｍＭ Ｌ−グルタミン（最終濃度）から構成された。培地中のグルコース量が３ｇ／Ｌを下回ったときにのみ、Ｆ２にグルコースを添加した。
【０１３８】
培養条件は、以下のように設定した。
−温度＝３７℃、細胞密度が最大になったときは３２℃に下げる。
−攪拌＝１００ｒｐｍ、最初のボーラス添加後、１２０〜１３０ｒｐｍに上げる。
−最高ｐＨ＝７．３．ＣＯ２インキュベーションにより、アルカリ化を制御した。
ＰＯ２＝飽和濃度の５０％とした。
【０１３９】
播種時点及び培養６週間後の培養試料の細胞濃度は、それぞれ４．０ｘ１０５及び３．４ｘ１０６であり、最終的な生存率は約７２％であった。
【０１４０】
培養のパラメーターはオンラインで測定され、制御された。細胞計数、Ｔｒｙｐａｎ Ｂｌｕｅによる生存率の評価、残留グルコース濃度（ＹＳＩ ａｎａｌｙｚｅｒ， Ｙｅｌｌｏｗ Ｓｐｒｉｎｇｓ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）及び定性的タンパク質発現パターンが、オフラインで測定された。
【０１４１】
２．精製
生産される他の形態からｓＩＦＮベータ−ＩｇＧＦｃｍｕｔタンパク質を効果的に単離する精製プロトコルが開発された。最初のＣＨＯプールの培養により生産される材料を用いて、精製プロセスが構築された。これを直接スケールアップし、プロトクローンから細胞培養上澄を精製するのに使用した。
【０１４２】
ここで、Ｆｃ−タグを付した分子は、以下のように称する：
−「遊離Ｆｃダイマー」（Ｆｃｍｕｔ腕部／Ｆｃｍｕｔ腕部）
−「ｓＩＦＮベータ−ＩｇＧＦｃｍｕｔ」（Ｆｃｍｕｔ腕部／ＩＦＮベータ−Ｆｃｍｕｔ腕部ヘテロダイマー）
−「ＩＦＮ−ベータダイマー」（ＩＦＮベータ−Ｆｃｍｕｔ腕部／ＩＦＮベータ−Ｆｃｍｕｔ腕部ホモダイマー）。
【０１４３】
精製工程は、前記上澄中に存在する「ｓＩＦＮベータ−ＩｇＧＦｃｍｕｔ」を濃縮しつつ、殆どの関連する含有物（「遊離Ｆｃダイマー」、「ＩＦＮ−ベータダイマー」、切断形態及び凝縮形態）及び非関連生産物（培地に由来するタンパク質及びＣＨＯ細胞により分泌されるタンパク質）を排除することを本質とする。プロテインＡによる最初の捕捉工程は、Ｆｃ−タグが付された全ての分子と結合する。それから、流出物は、ＩＦＮ−タグが付された分子と優勢に結合するＢｌｕｅ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅゲルに注入され、これによりほとんどの「遊離Ｆｃダイマー」を分離する。
【０１４４】
最後の２つの工程は、洗浄工程として機能し、「ＩＦＮ−ベータダイマー」及び高分子量分子の大部分を除去する、イオン交換クロマトグラフィー及びその後のサイズ排除クロマトグラフィーである。該プロセスは２回行われ、各回に開始材料として３Ｌの細胞培養上澄を使用して、所望の量のコンパウンド１を生産した。
【０１４５】
２．１．プロテインＡの捕捉工程
５３ｍｌのＭａｂ Ｓｅｌｅｃｔ Ｓｕｒｅ （ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を充填したカラムをＰＢＳで平衡化した後、線流速を３５ｃｍ／ｈまで低下させることにより、カラム上に一昼夜前記試料を注入した。それから、アウトプットシグナルがベースラインまで後退するまで、該カラムをＰＢＳで洗浄した。１００％の０．１Ｍグリシン（ｐＨ２．７）を用いて、溶出は単一の工程で行われた。溶出ピークがプールされ、１ｍｇ／ｍｌの濃度に相当するＡ［280］＝１．３８ＡＵをもたらすモル吸光係数１１０２３０を使用するＵＶにより定量された。
【０１４６】
溶出物（ｓＩＦＮベータ−ＩｇＧＦｃｍｕｔ、ＩＦＮ−ベータダイマー及びＦｃダイマー）の最も豊富な分子種のモル吸光係数は類似しているため、ＵＶ光度分析による直接の定量が可能である。それから、該溶液は０．１Ｍグリシン（ｐＨ２．７）で１．３ｍｇ／ｍｌに希釈され、すぐに２０％（ｖ／ｖ）の１Ｍトリス（ｐＨ８）を添加して中和された。
【０１４７】
２．２．Ｂｌｕｅ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅによる精製
Ｇ２５の緩衝剤交換工程の後、タンパク質の内容を定量し、そして該溶液を、Ｂｌｕｅ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ６ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗゲル（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に注入した。これを２回並行して行った。ｓＩＦＮベータ−ＩｇＧＦｃｍｕｔはこの媒体と容易に結合するが、遊離Ｆｃダイマーの殆どは、フロースルー分画に回収される。
【０１４８】
５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．５）を用いた第一の洗浄により、残留遊離Ｆｃダイマー種が除去され、そして５６％の５０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．５）及び４４％の４５％プロピレングリコール＋１．４Ｍ ＮａＣｌ＋５０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．５）溶液を用いた溶出工程により、一部の凝集物大美ＩＦＮ−ベータダイマーが除去された。１００％の４５％プロピレングリコール＋１．４Ｍ ＮａＣｌ＋５０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．５）緩衝液を用いた第二の溶出工程の溶出液は、大部分がｓＩＦＮベータ−ＩｇＧＦｃｍｕｔで、若干のＩＦＮ−ベータダイマーを含んでいた。
【０１４９】
２．３．Ｑ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗによる精製
Ｂｌｕｅ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ工程で得られた溶出物を、５０ｍＭのトリス（ｐＨ８．５）で緩衝剤交換し、これをＱ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗカラムに注入した。５０ｍＭのトリス（ｐＨ８．５）で洗浄した後、０．５ＭのＮａＣｌ＋５０ｍＭのトリス（ｐＨ８．５）に達する塩勾配を適用した。ｓＩＦＮベータ−ＩｇＧＦｃｍｕｔを含む強い主要なピークを回収し、ＵＶ−光度分析により定量した。
【０１５０】
それから、この溶出物を１０ｋＤａ Ｃｅｎｔｒｉｐｒｅｐフィルターユニット（Ａｍｉｃｏｎ）に注入し、次の最終工程の前に材料を濃縮した。
【０１５１】
２．４．Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００による精製
前記タンパク質溶液は、サイズ排除クロマトグラフィーに付された。高い分解能を維持するために、注入する体積を最小にし、故に、複数回の注入が必要であった。前記タンパク質を５０ｍＭトリス＋５００ｍＭ ＮａＣｌ＋１０％グリセロール（ｐＨ７．５）中で製剤化する旨が明記されていたので、ゲル濾過に使用された緩衝剤は、５０ｍＭトリス（ｐＨ７．５）＋５００ｍＭＮａＣｌであった。所望のタンパク質中に凝集物やＩＦＮ−ベータダイマーが入り込まないように、鋭いピークの中央部分のみを回収した。それから、カットオフが１０ｋＤａのＣｅｎｔｒｉｐｒｅｐフィルターを用いて前記タンパク質を１ｍｇ／ｍｌにまで濃縮し、１０％グリセロールを添加した。最後に、この溶液を、０．２２μｍ膜で滅菌し、分注した。バイアルを、−８０℃で保存した。
【０１５２】
最終的に精製されたタンパク質は、本質的に、ｓＩＦＮベータ−ＩｇＧＦｃｍｕｔで構成される。遊離Ｆｃダイマーは殆ど含まない。
【０１５３】
前記精製プロトコルは、ＣＨＯプロトクローンの細胞培養上澄３Ｌから、約６０ｍｇの精製コンパウンド１を取得できる。
【０１５４】
ｓＩＦＮベータ−ＩｇＧＦｃｍｕｔのＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析は、該タンパク質の両ポリペプチドがグリコステロイド（Ｆｃドメイン及びＩＦＮ−ベータ）であり、それらはジスルフィド結合により連結されている。従って、コンパウンド１の精製度及び活性の程度は高い。最終的な精製タンパク質は、本質的に、ｓＩＦＮベータ−ＩｇＧＦｃｍｕｔで構成される（遊離Ｆｃダイマーは殆ど含まない）。
【０１５５】
実施例３−生産能力
実施例１及び２に従い、コンパウンド１を発現するプールの生産が実行された。トランスフェクション及び選択の後、ＩＦＮ−βを測定するために開発されたＢｉａｃｏｒｅアッセイを用いて、前記分子の発現を試験した。
【０１５６】
ＰｒｏＣＨ５培地を使用して、前記プールの、２４時間の周期中の分泌を試験した。より高い特異的な生産性は、低温で取得された。
【０１５７】
標準的な１細胞／ウェルのアレイから、プロトクローンを単離した。約３００のプロトクローンを選択し、ＨＴＳフォーマットにおける生産能力を試験した。
【０１５８】
ＨＴＳアッセイの試験結果が最も良好な１５のプロトクローンを６ウェル及びＴ７５フラスコにおいて、２４時間周期のＨＴＳアッセイに付して、３つの候補プロトクローンを選択した。これらの３つのプロトクローンを、０．４細胞／ウェルのアレイによりクローニングした。各プロトクローンにおいて、２０クローンを選択するが、この際、それらが選択された元のプレートが、統計的なクローニングの基準（視覚的検査の後、２つのコロニーを有する任意のウェルを除き、回収率が３３％未満である）に適合することを確認する。
【０１５９】
まず、前記クローンを、ＨＴＳアッセイにおいてスクリーニングし、各プロトクローンを起源とするものから最良のクローン５つを、更に振盪フラスコ中のバッチ培養において試験した。最初の播種は、３７℃のＰｒｏＣＨＯ５に０．２ｘ１０６生存細胞／ｍｌで行った。振盪は、１３０ｒｐｍで行った。前記培養物は、生存率が低下し始める頃のＷＤ７で停止した。培養物は、細胞数、生存率、タイターが試験され、そしてＳＤＳ−ＷＢを実行して、異常な分子サイズ及び挿入を示すクローンを排除した。２つの最良のクローンは、３７℃でタイターが４０ｍｇ／ｌｔ、及びＰＣＤが４付近を示した。細胞密度は正常で、増殖は強力で、早期の細胞死の兆候も無く、ＳＤＳ−ＷＢブロットの検出では、完全な分子を発現していた。
【０１６０】
前記２つの最良のクローンを選択し、更に温度シフトを用いて、振盪フラスコ中で再試験した。それらの結果は、振盪フラスコ中で取得された最初の結果を補強するものであった。
【０１６１】
ＩＦＮ−ベータ特異的Ｂｉａｃｏｒｅアッセイによる検出において、１２０ｍｇ／ｌｔに達するタイターが、温度を下げることにより取得された。これは、コンパウンド１が由来する特定のクローンを使用して取得された。その細胞は、バッチ中、強力な増殖及び極めて良好な生存率を示した。特定の生産性は、１２ｐｃｄに達した。よって、このクローンは、有利なプロフィール、及び医薬品質管理基準／優良試験所基準（Ｇｏｏｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ／Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ Ｐｒａｃｔｉｃｅ （ＧＬＰ／ＧＭＰ））を満たす材料を生産するためのプロセス開発における非常に良好な可能性を示した。標準的なプロトコルに従い、回答後の生存率及び細胞増殖を評価した。ＦＤＡ準拠プロトコルを使用して、マイコプラズマ及び無菌性試験を行った。
【０１６２】
実施例４−安定性及び溶解度
４．１．使用されるバッチ
コンパウンド１を、前記元の緩衝剤：５ＯｍＭリン酸ナトリウム＋ＮａＣｌ ５００ｍＭ＋１０％グリセロール（ｐＨ７．５）で１：２に希釈した。試験に供されるタンパク質は、０．６６ｍｇ／ｍｌであった。
【０１６３】
４．２．試験条件
ＳＥ−ＨＰＬＣによる熱安定性：
−１週間４０℃
−１ヶ月５℃
−２５℃で１ヶ月２５℃
１サイクル及び５サイクル凍結／融解（−２０℃）後の安定性を、ＳＥ−ＨＰＬＣで測定した。
【０１６４】
４．３．結果
ｔ＝０の時点で、試料は、ｓＩＦＮベータ−ＩｇＧＦｃｍｕｔの濃度は９８．５％以上で、ＨＭＷは２％未満であった。
【０１６５】
１週間４０℃の後、ｓＩＦＮベータ−ＩｇＧＦｃｍｕｔの濃度は約８１％に低下し、ＨＭＷは約１９％となる。
【０１６６】
１ヶ月５℃の後、ｓＩＦＮベータ−ＩｇＧＦｃｍｕｔの濃度は約９９％であり、ＨＭＷは僅かに減少する。
【０１６７】
１ヶ月２５℃のインキュベーション後、２つの試料のいずれも沈殿が生じた。ＳＥＣ解析によると、予想されるｓＩＦＮベータ−ＩｇＧＦｃｍｕｔのピークは、より長い保留時間を経て溶出され、他のより低分子量のピークが存在していた。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びＮ−末端シークエンシング（ＳＤＳ−ゲル電気エイド後にＰＶＤＦ膜に転写する）による更なる解析の結果、融合部位付近が加水分解されるという仮説が確認され、そしてＩＦＮ−βの痕跡は何も見出されなかった。
【０１６８】
１回及び５回の凍結／融解の後、ｓＩＦＮベータ−ＩｇＧＦｃｍｕｔの含有量は、約９８％であった。
【０１６９】
４．４．凍結融解実験
試料を試験濃度に希釈し、４℃で少なくとも２４時間保管して平衡化する。それから、ｔ＝０時点でのＳＥＣプロフィールを測定した後、試料を少なくとも１日−２０℃で保管し、それから＋４℃で（少なくとも１日）溶解して、これをＳＥＣで解析する。
【０１７０】
４．５．凍結／融解実験（５サイクル）
試料を試験濃度まで希釈し、これを４℃で少なくとも２４時間保管して平衡化する。それから、ｔ＝０時点でのＳＥＣプロフィールを測定した後、試料を少なくとも１日−２０℃で保管し、それから＋４℃で（少なくとも１日）溶解して、これと同じ手順でこのサイクルを５回繰り返して凍結／融解する。最後に、５回目の融解の終了時（及び少なくとも２４時間４℃の再平衡化の時点）試料をＳＥＣにより解析する。
【０１７１】
４．６．溶解度
タンパク質を、５０ｍＭリン酸ナトリウム＋５００ｍＭ ＮａＣｌ＋１０％グリセロール（ｐＨ７．５）からなる緩衝剤（予備調製）中で、−８０℃で保存した。該パッチは、１．３２ｍｇ／ｍｌの濃度のコンパウンド１を含んでいた。保存緩衝液中のこのバッチについて、安定性及びＦ／Ｔ試験を行った。
【０１７２】
実施例５−２つのＩＦＮ−β−Ｆｃヘテロダイマータンパク質：コンパウンド１及びコンパウンド２の生物学的挙動
５．１．導入
ＩＦＮ−β１ａ（参照調製物３ＭＩＵ／ｍＬ、１１μｇ／ｍＬ）と比較して、ＩＦＮ−β−Ｆｃヘテロダイマータンパク質の２つの調製物、コンパウンド１及びコンパウンド２の生物学的挙動を、抗ウイルス性（ＷＩＳＨＡ／ＳＶ、図５）及び抗増殖性（ＷＩＳＨ細胞、図６）、及びレポーター遺伝子アッセイ（ｐＭｘ−ＬｕｃでトランスフェクションしたサルＶｅｒａ細胞）の観点から評価した。
【０１７３】
５．２．方法
５．２．１抗ウイルスアッセイ
ＩＦＮ−β−Ｆｃヘテロダイマータンパク質の抗ウイルス活性を、ＷＩＳＨ細胞（羊膜）にＩＦＮ−β分子が及ぼす、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ； Ｒｕｂｉｎｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ． １９８１）による細胞変性作用（ＣＰＥ）に対する防御効果を測定することにより研究された。
【０１７４】
ＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ中で増殖するＷＩＳＨ細胞を、８つ連続で１：１．５に希釈していったＩＦＮ−β試料（０．７ｎｇ／ｍＬで開始する）を含む９６ウェルマイクロタイターの各ウェル中に、ＭＥＭ＋５％ＦＢＳ中４ｘ１０４細胞の密度で播種した。そして、細胞を、３７℃、５％ＣＯ２で、１８〜２２時間インキュベーションした。このインキュベーション時間の最後に、ＶＳＶ懸濁物（ＭＥＭ＋２．５％ＦＢＳ中）を添加し、更に３７℃、５％ＣＯ２で２０〜２５時間インキュベーションした。それから細胞をＭＴＴ（３−［４，５−ジメチルチアゾール−２−イル］−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロマイド）で染色し、マルチウェル走査型分光光度計により、各ウェル中の光学密度（５９５ｎｍのＯ．Ｄ．）を測定した。
【０１７５】
前記ＩＦＮ−β−Ｆｃ調製物は、２つの独立した実験を経て、並行して試験された。故に、作成された用量応答曲線は、Ｓ字状（勾配が変化する）用量応答曲線により補間された（Ｇｒａｐｈ Ｐａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ）。濃度（ｐＭ）をｘ軸上に、そしてコントロールウイルス及びコントロール細胞（０％及び１００％増殖）で正規化した関連する吸光度（ＯＤ）の値を、細胞変性作用の阻害パーセントとしてｙ軸上に表した。
【０１７６】
５．２．２．抗増殖性アッセイ
ＭＥＭ＋５％ＦＢＳ中のＷＩＳＨ細胞を、９つ連続で１：２に希釈していったＩＦＮ−β試料（４０ｎｇ／ｍＬで開始する）を含む９６ウェルマイクロタイタープレートの各ウェル中に、１ｘ１０４細胞の密度で播種して、細胞を、３７℃、５％ＣＯ２で、７２時間インキュベーションした。このインキュベーション時間の最後に、細胞をＭＴＴで染色し、マルチウェル走査型分光光度計により、各ウェル中の光学密度（５９５ｎｍのＯ．Ｄ．）を測定した。
【０１７７】
前記ＩＦＮ−β−Ｆｃ調製物は、２つの独立した実験を経て、並行して試験された。故に、作成された用量応答曲線は、Ｓ字状（勾配が変化する）用量応答曲線により補間された（Ｇｒａｐｈ Ｐａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ）。濃度（ｐＭ）をｘ軸上に、そしてコントロール細胞（ＩＦＮ−β無添加、１００％増殖）で正規化したＯＤの値を、細胞増殖のパーセントとしてｙ軸上に表した。
【０１７８】
異なる細胞／ウイルス系（例えば（Ａ５４９／ＥＭＣＶ）及び異なる細胞株（Ｈｓ２９４Ｔ）も、抗ウイルス及び抗増殖活性の測定に使用され得る。
【０１７９】
５．２．３．レポーター遺伝子アッセイ
レポーター遺伝子アッセイ（ＲＧＡ）は、ＩＦＮ−β活性をモニタリングするための高度に特異的かつ高感度のインビトロバイオアッセイとして開発された。内性的ＩＦＮ−α及びＩＦＮ−βが欠損しているＶｅｒｏ細胞（アフリカミドリザル腎臓細胞、ＡＴＣＣ， ＣＣＬ ８１）に、ＩＦＮ−α／β誘導性マウスＭｘ１プロモーターの制御下にあるルシフェラーゼ（Ｌｕｃ）遺伝子を担持するｐＭｘ−Ｌｕｃプラスミドを用いてステーブルトランスフェクションした。ＩＦＮ−βによるＬｕｃ誘導性に基づき、１つのクローンを選択した（Ｃａｎｏｓｉ ｅｔ ａｌ． １９９６）。
【０１８０】
前記アッセイは、ルシフェラーゼによるルシフェリンの酸化により放出される光の測定に基づく。
【０１８１】
トランスフェクションされたサルＶｅｒａ細胞により生じるルシフェラーゼの量は、添加されたＩＦＮ−βの量に対応し、ソフトウェアに接続したルミノメーターにより自動的に測定される。
【０１８２】
最初の濃度が２３４ｐｇ／ｍＬで、これを７つ連続で１：２に希釈していったＩＦＮ−β試料を含む９６ウェルマイクロタイタープレートの各ウェル中に、前記Ｖｅｒａ細胞をを播種した（４０，０００細胞）。インキュベーション（３７℃、５％ＣＯ２）の約２１時間後、アッセイプレートを逆さにして内容物を除去し；各ウェル中の細胞層をＰＢＳで洗浄し、細胞溶解緩衝剤を添加した。プレートを室温で１５分放置し、それからＶｉｃｔｏｒ Ｌｉｇｈｔ １４２０中にセットし、ここでルシフェラーゼアッセイ試薬（ＬＡＲ）が自動的に各ウェルに注入され、ルシフェラーゼによるルシフェリンの酸化により光が発生し、１秒あたりのカウント（ｃｐｓ）が測定される。
【０１８３】
前記ＩＦＮ−β−Ｆｃ調製物は、２つの独立した実験を経て、並行して試験された。故に、各アッセイにおいて作成された用量応答曲線は、Ｓ字状（勾配が変化する）用量応答曲線により補間された（Ｇｒａｐｈ Ｐａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ）。ここで、質量として表されるＩＦＮ−β活性（ｐｇ／ｍＬ）をｘ軸上に、そして基底値及び最高値（０％及び１００％増殖）で正規化した関連するｃｐｓの値を、ｃｐｓのパーセントとしてｙ軸上に表した。
【０１８４】
細胞に加えられた実際のＩＮＮ−β濃度を計算するために、ＴＦＮ−β−Ｆｃ中のＩＦＮ−β質量が考慮された：
−コンパウンド１：０．９４ｍｇ／ｍｌ ＩＦＮ−β−Ｆｃ＝０．２６ｍｇ／ｍＬ ＩＦＮ−β、
−コンパウンド２：１．１０ｍｇ／ｍｌ ＩＦＮ−β−Ｆｃ＝０．３１ｍｇ／ｍＬ ＩＦＮ−β。
【０１８５】
５．２．４．結果及び結論
使用される細胞の種類に拘らず、ｓＩＦＮβ−ＩｇＧＦｃｍｕｔ（コンパウンド１）は、ＥＵインデックスの位置表記で２９７がＮからＡに突然変異しているモノマー−ダイマータンパク質（コンパウンド２；図５〜７）、及びヒト組換えＩＦＮ−β調製物と比較可能な生体活性を示した。
【０１８６】
実施例６−バイオアッセイ
コンパウンド１及びコンパウンド２のタイターは、理論に基づいて計算され、そしてＩＦＮ−βのタイター決定に現在利用されている標準的な方法（ＶＳＶ−ＷＩＳＨ）を使用して決定された。その結果を、表２にまとめる。
【０１８７】
【表３】
【０１８８】
理論的な活性は、以下の考慮に基づく：
ＩＦＮ−β（２２ｋＤ）において、ＭＩＵからμｇへの変換係数は３．６６である。ゆえに、１ＭＩＵは、３．６６μｇに対応する。
【０１８９】
ＩＦＮ−β−Ｆｃ（７７ｋＤ）において、質量特異的活性が線形であると仮定すると、上記係数は３．５倍、つまり１２．８となる。ゆえに、１ＭＩＵは１２．８μｇに対応する。
【０１９０】
実施例７−Ｆｃ受容体／補体結合アッセイ
７．１．導入
ＩＦＮ−β融合タンパク質は後退Ｆｃ部分を有しているため、抗体に関連するエフェクター作用：抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）及び補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）を引き起こす可能性を有する。
【０１９１】
ＡＤＣＣにおいて、抗原特異的抗体（例えばＩｇＧ）は、抗原を発現する細胞を殺傷するためのＦｃガンマ受容体（ＦｃγＲ）を発現する、自然免疫系の免疫エフェクター細胞を指向する。ＦｃγＲは、ＮＫ細胞、好中球、単球／マクロファージ、樹状細胞及びＢ細胞において発現し、ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩ（ＣＤ３２）及びＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）の３つのクラスを構成する。ヒトにおいて、ＦｃγＲＩＩ及びＦｃγＲＩＩＩは、更にＦｃγＲＩＩａ、ＦｃγＲＩＩｂ、ＦｃγＲＩＩＩａ及びγＲＩＩＩｂに区別される。これらの受容体は、様々なＩｇＧサブクラスとの親和性が相異しており、高親和性、中親和性、又は低親和性受容体に分けられる。項親和性受容体（ＣＤ６４）はモノマーＩｇＧと結合し、通常血清中のＩｇＧが結合部位を埋めている。中親和性及び低親和性受容体（それぞれＣＤ１６及びＣＤ３２）は、凝集したＩｇＧ 及びＩｇＧ含有免疫複合体と結合する。ＮＫ細胞は、ＡＤＣＣの主役であると信じられているが、単球−マクロファージ及び好中球も一定の役割を果たし、ＮＫ細胞が発現するＣＤ１６は、「ＡＤＣＣ受容体」と称されている。ＮＫ細胞は、細胞傷害性顆粒（パーフォリン（ｐｅｒｆｏｒｉｎ）、グラニュリシン（ｇｒａｎｕｌｙｓｉｎ）及びグランザイム（ｇｒａｎｚｙｍｅ））の放出を通じて、標的細胞を殺傷する。
【０１９２】
いわゆる「古典的経路」を介した補体活性化は、抗原と複合体を形成したイムノグロブリン、ＩｇＧ又はＩｇＭのＦｃドメインにＣ１ｑが結合することにより生じる。Ｃ１ｑはヒト結成中におよそ７０μｇ／ｍＬの濃度で存在する、約４１０ｋＤａの巨大な糖タンパク質複合体である。
【０１９３】
Ｃ１ｒ及びＣ１ｓの２つのセリンプロテアーゼと共に、Ｃ１ｑは、第一の補体の構成要素であるＣ１複合体を形成する。４つのヒトＩｇＧサブクラス（モノマー形態）のＣ１ｑと結合する能力は、ｌｇＧ３＞ｌｇＧ１＞ｌｇＧ２＞ｌｇＧ４の順に低下する（ＩｇＧ４は補体を活性化しない）。ヒンジ依存的Ｆａｂ−Ｆａｂ及びＦａｂ−Ｆｃの柔軟性は、Ｃ１ｑと結合する補体結合部位の接触性を規定するので、ヒトＩｇＧサブクラス中でヒンジが最も長いＩｇＧ３は、補体活性化において最も効果的なサブクラスである。ＩｇＧ４が補体を活性化できないのは、Ｆｃフラグメントの構造及びＦａｂ腕部による補体結合部位の立体障害による。
【０１９４】
コンパウンド１は、「エフェクター作用」、即ちＦｃγ受容体及びＣ１ｑとの結合を低下させる改変を含む。これらの突然変異の有効性を形式的に実証するために、コンパウンド１とコンパウンド２との間で、Ｆｃγ受容体の１つであるＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）及びＣ１ｑとの結合能力を比較する研究が実行された。細胞ベースのフローサイトメトリー及びＥＬＩＳＡ結合法を採用した。
【０１９５】
７．２．結果
コンパウンド１及びコンパウンド２は、ヒトＩｇＧ１と比較して、ＣＤ６４（ＦｃγＲＩ）との結合能力の低下を示す。
【０１９６】
ＩｇＧ４及びＩｇＧ１のいずれも、トランスフェクションされたＡＩＩ１．６細胞の表面に発現するＣＤ６４と、用量依存的に結合した。ＩｇＧ４は、ＩｇＧ１と比較して、僅かに結合が弱かった。対照的に、コンパウンド２は、ヒトＩｇＧ１よりも実質的に結合が弱く、コンパウンド１は、結合の更なる低下を示し、そのレベルは陰性対照により得られるレベルと同等であった（図８）。トランスフェクションしていないＩＩＡ１．６細胞とは、いずれの分子も結合しなかった。
【０１９７】
コンパウンド１及びコンパウンド２とＣ１ｑとの結合を特定するために、ＥＬＩＳＡ−Ｃ１ｑ結合アッセイを実行した。その結果を、図９に示す（図９ａ及び図９ｂ）。ＩｇＧ１は高度なＣ１ｑ結合活性を示し、一方化合物１、又は陰性対照（Ｎｅｇ及びＩｇＧ４）は、結合が検出されなかった。化合物２の結合は極めて僅かであり、ＩｇＧ２は、これらの実験条件下では、Ｃ１ｑと結合しなかった。
【０１９８】
コンパウンド１及びコンパウンド２のＣ１ｑとの結合能力を更に調査するために、表面プラズモン共鳴センサーを使用して、これらの分子のＣ１ｑとの親和性を測定した。ＩｇＧ１は陽性対照とみなされ、一方ＩｇＧ４は陰性対照に含まれた。
【０１９９】
デキストラン表面への第一級アミン基の架橋により、ＣＭ５チップ上にＩＦＮ−β−Ｆｃ分子及び前記対照を個別に不動化した。Ｂｉａｃｏｒｅ ３０００バイオセンサー中で、不動化タンパク質とＣ１ｑとの結合及び解離をリアルタイムでモニタリングした。Ｃ１ｑとＩｇＧ１との結合は、センサーグラムの結合相の間の応答の鋭い増大、及び解離相における緩慢な低下により特徴付けられた。コンパウンド２は、Ｃ１ｑとは殆ど結合を示さず、一方コンパウンド１は、結合を示さなかった。
【０２００】
よって、コンパウンド１に含まれる突然変異は、コンパウンド１とＣ１ｑとの結合を完全に遮断する（図９）。上記研究は、コンパウンド１のＦｃ部分に導入された突然変異が、コンパウンド２と比較して、ＣＤ６４（ＦｃγＲ１）−トランスフェクション細胞に対する該分子の結合を効果的に低下させるのみならず、Ｃ１ｑに対するコンパウンド１の結合を無効化することを実証する。内性的ＣＤ６４を発現するトランスフェクションしていないＵ９３７ヒト単球細胞においても、同様の結果が得られた。ＣＤ６４トランスフェクション細胞の場合、結合のレベルは、陰性対照を用いて得られるレベルと同一であった。
【０２０１】
要するに、取得されたデータは、コンパウンド１が、この研究で採用した実験条件下でＣ１ｑと結合しないのに対して、コンパウンド２が僅かに結合能力を保持していることを実証する。
【０２０２】
実施例８−サルにおけるＰＫ／ＰＤ試験
ヒトＩＦＮ−βにヒトとほぼ同レベルで応答する唯一の動物であるサルにおいて、薬物動態／薬力学（ＰＫ／ＰＤ）試験を実行した。
【０２０３】
コンパウンド１及びコンパウンド２のいずれも、サルにおけるＩＦＮ−β血清レベルの解析用の酵素免疫アッセイ（ＦｕｊｉＲｅｂｉｏ製、サル血清中のＩＦＮ−ベータ解析用に改変及び認証された）を使用して、血清試料の解析を行った。
【０２０４】
ＩＦＮ−β標準に代えて、コンパウンド１及びコンパウンド２を、較正曲線の構築に使用した。
【０２０５】
８．１．導入
コンパウンド１は、Ｆｃγ受容体及びＣ１ｑとの結合を低下させるための幾つかの突然変異を含む。これらの突然変異がコンパウン１のＰＫ／ＰＤ能力を変化させるか否かをチェックするために、ヒトＩＦＮ−ベータに応答する唯一の動物種であるサルにおけるインビボ研究を実行した。第一の群は、参照として、皮下投与により５５ ｐＭｏｌ／ｋｇのＲｅｂｉｆ（登録商標）の投与を受けた。第二のサル群はコンパウンド２の投与を受け、一方第三のサル群はコンパウンド１の投与を受け、これらはいずれも、１３８ｐＭｏｌ／ｋｇの用量が肺に沈着するように吸入投与されたものである。ＩＦＮ−β、コンパウンド１及びコンパウンド２は、ネオプテリンと共に、血清レベルが測定された。非コンパートメント解析に従い、投与前に既に存在していた濃度を差し引いた後、ＰＫ及びＰＤ解析を実行する。
【０２０６】
８．２．薬物動態の結果
皮下経路で５５ｐＭｏｌ／ｋｇのＲｅｂｉｆ（登録商標）を投与した後のＩＦＮβの血清レベル、平均沈着用量が１３８ｐＭｏｌ／ｋｇとなるように吸入経路で投与した後のコンパウンド１の血清レベル、そして平均沈着用量が１３８ｐＭｏｌ／ｋｇとなるように吸入経路で投与した後のコンパウンド２の血清レベルの平均血清プロフィールを、図１０に示す。コンパウンド１及びコンパウンド２の平均沈着用量が１３８ｐＭｏｌ／ｋｇとなるように吸入投与した後、平均Ｃｍａｘは、中央時間の８時間において、２２．５１＋７．４３ｐＭｏｌ／Ｌ（コンパウンド２）及び１６．３６＋６．９４ｐＭｏｌ／Ｌであり、これらは、Ｒｅｂｉｆ（登録商標）の平均Ｃｍａｘが、中央ｔｍａｘの３時間の時点で１．４０±１．１０ｐＭｏｌ／Ｌに達したことと対比されるべきである。ＡＵＣｌａｓｔは、コンパウンド２において８８６＋３９３ｈ．ｐＭｏｌ／Ｌであり、コンパウンド１において５０５＋３２２ｈ．ｐＭｏｌ／Ｌであり、これらは、Ｒｅｂｉｆの平均ＡＵＣｌａｓｔが１２．５＋２０．０ｈ．ｐＭｏｌ／Ｌであったことと対比されるべきである。
【０２０７】
明確な排除半減期は、コンパウンド２では２７＋４．５ｈであり、コンパウンド１では２４．１＋８．４ｈであった。コンパウンド１及びコンパウンド２のいずれも、通常の、定常的な血清レベルを示し、ＩＦＮ−βにおいて検出される数値より大分高かった。実際に、いずれも、注入されたＲｅｂｉｆ（登録商標）と比較して、遥かに高い累積曝露を示した。
【０２０８】
ネオプテリン血清レベルのベースライン補正された平均（ＳＤ）血清プロフィールは、皮下経路で５５ｐＭｏｌ／ｋｇのＲｅｂｉｆ（登録商標）を投与した後、平均沈着用量が１３８ｐＭｏｌ／ｋｇとなるように吸入経路でコンパウンド１を投与した後、及び平均沈着用量が１３８ｐＭｏｌ／ｋｇとなるように吸入経路でコンパウンド２を投与した後に計算された。主要な薬力学パラメーターを、表３に示す。
【０２０９】
【表４】
【０２１０】
哺乳類において、通常約１ｎｇ／ｍＬの数値に対して、投与前のネオプテリンレベルは１．１１〜５．０６ｎｇ／ｍＬである。この事実は考慮されるべきである。なぜなら、投与前レベルが高いと、ネオプテリンの更なる増大を観察する機会を逸する場合があるからである。Ｒｅｂｉｆ（登録商標）の皮下投与の後、予想通り、５匹中４匹のサルにおいてネオプテリンの増大が観察された。１匹のサルはネオプテリンの増大を示さなかった。このサルはネオプテリンのレベルが最高であり（４．４ｎｇ／ｍＬ）、ＩＦＮ−βは測定できなかった。これらの２つの要素（ネオプテリンが高く、恐らく投与量が少なかった）が、応答の欠如をもたらしたと考えられる。これは、検出可能なＩＦＮ−βレベルを示す血清サンプルが１つだけであったという事実に拘らず、もう１匹のサルが明確なネオプテリン応答を示していたという検討により支持される。このサルにおいて、投与前の濃度は２．０ｎｇ／ｍＬであった。コンパウンド１又はコンパウンド２を沈着用量が１３８ｐＭｏｌ／ｋｇとなるように吸入投与した後、殆どの動物は、ネオプテリンレベルの僅かな増大を示した。この僅かな増大は一部の動物においてより明確であり、一方その他の動物は、明確なＩＦＮ−β−Ｆｃ ＰＫプロフィールを有しているにも拘らず、ベースライン濃度を超える血清試料が殆ど無かった。全体的に、コンパウンド１及びコンパウンド２のいずれも、類似のＰＫ及びＰＤ挙動を示した。
【０２１１】
以下の表４は、配列表及び本テキスト全体に記載されている配列の同一性を明らかにしている。
【０２１２】
【表５】
【０２１３】
参照一覧
１． Ｃａｎｏｓｉ Ｕ．， Ｍ． Ｍａｓｃｉａ， Ｌ． Ｇａｚｚａ， Ｏ． Ｓｅｒｌｕｐｉ−Ｃｒｅｓｃｅｎｚｉ， Ｓ． Ｄｏｎｉｎｉ， Ｆ． Ａｎｔｏｎｅｔｔｉ， Ｇ． Ｇａｌｌｉ， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈｏｄｓ， １９９， ６９−７６ （１９９６）．
２． Ｋａｂａｔ， Ｅ． Ａ．， Ｗｕ， Ｔ． Ｔ．， Ｐｅｒｒｙ， Ｈ． Ｍ．， Ｇｏｔｔｅｓｍａｎ， Ｋ． Ｓ．， ａｎｄ Ｆｏｅｌｌｅｒ， Ｃ． （１９９１）， Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ， ５ｔｈ Ｅｄ．， Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ， Ｂｅｔｈｅｓｄａ， ＭＤ．
３． Ｒｕｂｉｎｓｔｅｉｎ， Ｓ．，Ｆａｍｉｌｌｅｔｔｉ， Ｐ． Ｃ， ａｎｄ Ｐｅｓｔｋａ， Ｓ． Ｃｏｎｖｅｎｉｅｎｔ Ａｓｓａｙ ｆｏｒ Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎｓ． Ｊ． Ｖｉｒｏｌ １９８１ ； ３７， ７５５−７５８．
４． Ｓｐｉｅｋｅｒｍａｎｎ ＧＭ， Ｆｉｎｎ ＰＷ， Ｗａｒｄ ＥＳ， Ｄｕｍｏｎｔ Ｊ， Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ＢＬ， Ｂｌｕｍｂｅｒｇ ＲＳ， Ｌｅｎｃｅｒ ＷＩ． Ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ Ｇ ｔｒａｎｓｐｏｒｔ ａｃｒｏｓｓ ｍｕｃｏｓａｌ ｂａｒｒｉｅｒｓ ｉｎ ａｄｕｌｔ ｌｉｆｅ： ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ＦｃＲｎ ｉｎ ｔｈｅ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｌｕｎｇ． Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ． ２００２ Ａｕｇ ５；１９６（３）：３０３−１０．
５． ＷＯ ２００５／００１０２５
６． ＵＳ ６，４８５，７２６
【特許請求の範囲】
【請求項１】
２つのサブユニットを含む突然変異ＩｇＧ Ｆｃドメインと融合した単一ＩＦＮ−ベータ（ｓｉｎｇｌｅ ＩＦＮ−ｂｅｔａ）を含むタンパク質であり、第一のサブユニットがＩＦＮ−ベータタンパク質と連結していない突然変異ＩｇＧ Ｆｃ腕部を含み、第二のサブユニットが単一ＩＦＮ−ベータタンパク質と連結した突然変異ＩｇＧ Ｆｃ腕部を含み、該ＩｇＧ ＦｃドメインがＩｇＧ１ Ｆｃドメインであり、少なくとも以下のアミノ酸位置：ＥＵインデックスの位置表記で２３４、２３５、２３７、３３０、及び３３１が突然変異していることを特徴とする前記タンパク質。
【請求項２】
前記ＩｇＧ１ Ｆｃドメインにおける５個のアミノ酸突然変異が、ＡＤＣＣ及びＣＤＣの低下又は阻害を目的としたものである、請求項１に記載のタンパク質。
【請求項３】
前記ＩｇＧ１ Ｆｃドメインにおける５個のアミノ酸突然変異が、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ｅ、Ｇ２３７Ａ、Ａ３３０Ｓ、及びＰ３３１Ｓである、請求項１及び２のいずれか１項に記載のタンパク質。
【請求項４】
前記ＩｇＧ１ Ｆｃドメインが、ＥＵインデックスの位置表記で２９７に該当するアミノ酸のＮがＡに突然変異したものを含まない、前記請求項のいずれか１項に記載のタンパク質。
【請求項５】
前記ＩｇＧ１ Ｆｃドメインが、２９７の位置にアミノ酸Ｎが存在するものである、前記請求項のいずれか１項に記載のタンパク質。
【請求項６】
前記第二のサブユニットが、Ｆｃ腕部と単一ＩＦＮ−ベータタンパク質との間にリンカーを含み得る、前記請求項のいずれか１項に記載のタンパク質。
【請求項７】
前記リンカーが配列番号１３の配列を含み、又はこの配列からなる、請求項６に記載のタンパク質。
【請求項８】
前記第一のサブユニットが配列番号３の配列を含み、又はこの配列からなる、請求項１〜６のいずれかに記載のタンパク質。
【請求項９】
前記第二のサブユニットが配列番号８の配列を含み、又はこの配列からなる、請求項１〜６のいずれかに記載のタンパク質。
【請求項１０】
配列番号３の配列及び配列番号８の配列からなる、請求項１〜６のいずれかに記載のタンパク質。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれかに記載のタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【請求項１２】
配列番号４の配列若しくは配列番号９の配列を含み、又はこれらの配列からなる、請求項１１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１３】
配列番号１２の配列を含み、又はこの配列からなる、請求項１１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１４】
請求項１１〜１３のいずれかに記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
【請求項１５】
請求項１４に記載のベクターを用いて形質転換した宿主細胞。
【請求項１６】
ＣＨＯ細胞である、請求項１５に記載の宿主細胞。
【請求項１７】
請求項１〜１０のいずれかに記載のタンパク質を含む医薬組成物。
【請求項１８】
医薬として使用される請求項１７に記載の医薬組成物。
【請求項１９】
多発性硬化症治療用の医薬を調製するための、請求項１８に記載の医薬組成物の使用。
【請求項２０】
請求項１〜１０のいずれかに記載のタンパク質の製造方法であって、請求項１５又は１６に記載の宿主細胞の培養、及び前記タンパク質の単離を含む方法。
【請求項１】
２つのサブユニットを含む突然変異ＩｇＧ Ｆｃドメインと融合した単一ＩＦＮ−ベータ（ｓｉｎｇｌｅ ＩＦＮ−ｂｅｔａ）を含むタンパク質であり、第一のサブユニットがＩＦＮ−ベータタンパク質と連結していない突然変異ＩｇＧ Ｆｃ腕部を含み、第二のサブユニットが単一ＩＦＮ−ベータタンパク質と連結した突然変異ＩｇＧ Ｆｃ腕部を含み、該ＩｇＧ ＦｃドメインがＩｇＧ１ Ｆｃドメインであり、少なくとも以下のアミノ酸位置：ＥＵインデックスの位置表記で２３４、２３５、２３７、３３０、及び３３１が突然変異していることを特徴とする前記タンパク質。
【請求項２】
前記ＩｇＧ１ Ｆｃドメインにおける５個のアミノ酸突然変異が、ＡＤＣＣ及びＣＤＣの低下又は阻害を目的としたものである、請求項１に記載のタンパク質。
【請求項３】
前記ＩｇＧ１ Ｆｃドメインにおける５個のアミノ酸突然変異が、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ｅ、Ｇ２３７Ａ、Ａ３３０Ｓ、及びＰ３３１Ｓである、請求項１及び２のいずれか１項に記載のタンパク質。
【請求項４】
前記ＩｇＧ１ Ｆｃドメインが、ＥＵインデックスの位置表記で２９７に該当するアミノ酸のＮがＡに突然変異したものを含まない、前記請求項のいずれか１項に記載のタンパク質。
【請求項５】
前記ＩｇＧ１ Ｆｃドメインが、２９７の位置にアミノ酸Ｎが存在するものである、前記請求項のいずれか１項に記載のタンパク質。
【請求項６】
前記第二のサブユニットが、Ｆｃ腕部と単一ＩＦＮ−ベータタンパク質との間にリンカーを含み得る、前記請求項のいずれか１項に記載のタンパク質。
【請求項７】
前記リンカーが配列番号１３の配列を含み、又はこの配列からなる、請求項６に記載のタンパク質。
【請求項８】
前記第一のサブユニットが配列番号３の配列を含み、又はこの配列からなる、請求項１〜６のいずれかに記載のタンパク質。
【請求項９】
前記第二のサブユニットが配列番号８の配列を含み、又はこの配列からなる、請求項１〜６のいずれかに記載のタンパク質。
【請求項１０】
配列番号３の配列及び配列番号８の配列からなる、請求項１〜６のいずれかに記載のタンパク質。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれかに記載のタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【請求項１２】
配列番号４の配列若しくは配列番号９の配列を含み、又はこれらの配列からなる、請求項１１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１３】
配列番号１２の配列を含み、又はこの配列からなる、請求項１１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１４】
請求項１１〜１３のいずれかに記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
【請求項１５】
請求項１４に記載のベクターを用いて形質転換した宿主細胞。
【請求項１６】
ＣＨＯ細胞である、請求項１５に記載の宿主細胞。
【請求項１７】
請求項１〜１０のいずれかに記載のタンパク質を含む医薬組成物。
【請求項１８】
医薬として使用される請求項１７に記載の医薬組成物。
【請求項１９】
多発性硬化症治療用の医薬を調製するための、請求項１８に記載の医薬組成物の使用。
【請求項２０】
請求項１〜１０のいずれかに記載のタンパク質の製造方法であって、請求項１５又は１６に記載の宿主細胞の培養、及び前記タンパク質の単離を含む方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【公表番号】特表２０１１−５０００７３（Ｐ２０１１−５０００７３Ａ）
【公表日】平成２３年１月６日（２０１１．１．６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−５３０４３２（Ｐ２０１０−５３０４３２）
【出願日】平成２０年１０月２１日（２００８．１０．２１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００８／０６４２２４
【国際公開番号】ＷＯ２００９／０５３３６８
【国際公開日】平成２１年４月３０日（２００９．４．３０）
【出願人】（３０９０２５５２４）メルク セローノ ソシエテ アノニム (49)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２３年１月６日（２０１１．１．６）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年１０月２１日（２００８．１０．２１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００８／０６４２２４
【国際公開番号】ＷＯ２００９／０５３３６８
【国際公開日】平成２１年４月３０日（２００９．４．３０）
【出願人】（３０９０２５５２４）メルク セローノ ソシエテ アノニム (49)
【Ｆターム（参考）】
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