第ＶＩＩ因子遺伝子の発現を阻害するための組成物および方法
本発明は、第ＶＩＩ因子遺伝子の発現を阻害するための二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）に関する。本発明は、また、それをコードするｄｓＲＮＡまたは核酸分子またはベクターを薬学的に許容される担体と一緒に含む薬学的組成物；該薬学的組成物を用いて、第ＶＩＩ因子遺伝子の発現によって引き起こされる疾患を処置するための方法；および細胞における第ＶＩＩ因子の発現を阻害するための方法に関する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）、および第ＶＩＩ因子遺伝子の発現を阻害するためのＲＮＡ干渉を仲介することにおける、特に肝臓での第ＶＩＩ因子チモーゲンの発現阻害における、続いて第ＶＩＩ因子チモーゲンの血漿レベルを低下させることにおけるそれらの使用に関する。さらに、動脈および静脈血栓症のような第ＶＩＩａ、ＩＸａ、Ｘａ、ＸＩＩａ凝固因子、トロンビンの活性化に関連する広範囲の血栓塞栓性疾患／障害、炎症、動脈硬化症ならびにガンを治療／予防するための該ｄｓＲＮＡの使用は、本発明の一部である。
【０００２】
第ＶＩＩ因子（ＦＶＩＩ）は、血液凝固の外因性経路の開始に関与するビタミンＫ依存性糖タンパク質である。ＦＶＩＩは、肝臓で合成され、主に血漿中で不活性一本鎖チモーゲンとして循環する。ＦＶＩＩは、血管損傷により露出した組織因子（ＴＦ）に結合すると、１個のペプチド結合の切断によって切断されてその２本鎖活性型（ＦＶＩＩａ）となり、２０kDaの軽鎖および３０kDaの重鎖を生じる。ＦＶＩＩａの軽鎖は、二つの上皮増殖因子様（ＥＧＦ−１、ＥＧＦ−２）ドメインおよびγ−カルボキシグルタミン酸（Ｇｌａ）ドメインを含み、Ｇｌａドメインは、カルシウムを結合可能にし、分子内にコンフォメーション変化を起こし、新規なエピトープを露出させ、それが続いてＴＦに結合するのを容易にする。重鎖は、他の凝固のセリンプロテアーゼに構造的に相同な触媒ドメインを有する。ＴＦ：ＦＶＩＩａ複合体は、今度はタンパク質限定加水分解性切断によってＦＩＸおよびＦＸを活性化し、トロンビンの形成および最終的にフィブリンクロットに導く。
【０００３】
ヒトＦＶＩＩ遺伝子は、肝細胞に発現しているが、ＦＶＩＩ ｍＲＮＡの定常状態レベルは非常に低い。ヒトＦＶＩＩの完全配列は、全長ｃＤＮＡクローンから推論されている（Hagen F. S., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1986) 83:2412-2416）。高レベルのＦＶＩＩは、心血管疾患の発生についての独立したリスク因子に関連している。高コレステロール血症の患者では、ＦＶＩＩレベルは、Ｃ反応性タンパク質（ＣＲＰ）またはサイトカイン（ＩＬ−６）などの炎症促進性可変因子と独立して相関した。しかし、全ての研究がＦＶＩＩを冠動脈心疾患における独立リスク因子として確認したわけではない（Lowe G. D. O. et al., Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. (2004) 24:1529-1534）。
【０００４】
ＴＦ：ＦＶＩＩａ複合体は、凝固と炎症反応の間の複雑なクロストークに重大な役割を果たす。それが凝固に果たす十分に確立された役割に加えて、ＴＦ：ＦＶＩＩａ複合体は、炎症、血管形成などの細胞過程ならびにガンおよびアテローム性動脈硬化症の病態生理に影響するシグナル伝達などの細胞内変化もまた誘導する。
【０００５】
動物モデルにおける概念実証実験から、ＦＶＩＩａの特異的阻害またはＦＶＩＩチモーゲンの血漿中濃度の減少が、出血傾向を高めずに抗血栓および抗炎症効果を招くことが実証されている（Xu H., et al., J. Pathol. (2006) 210:488-496）。敗血症モデルにおいて、エンドトキシン誘導性凝固活性化の阻害、炎症性メディエーターであるインターロイキン−６（Ｉｌ−６）、ＩＬ−８の発現減少、および死亡率の抑制が、活性部位を不活性化されたＦＶＩＩａ（Taylor F. et al., Blood. (1998) 91:1609-1615）またはＦＶＩＩ／ＶＩＩａに対するモノクローナルＦａｂフラグメント（Biemond B. J. et al., Thromb. Haemost. (1995) 73:223-230）のいずれかで処置されたサルにおいて観察された。活性部位を不活性化されたＦＶＩＩａは、また、実験的急性膵炎において、肺、回腸および結腸における好中球の組織浸潤を抑制し、ＩＬ−６およびマクロファージ炎症性タンパク質−２（ＭＩＰ−２）などの炎症マーカーを減少させて、強力な抗炎症性を示した（Andersson E. et al., Scand. J. Gastroenterology (2007) 42: 765-770）。
【０００６】
さらに、マウスへのＴＦ：ＦＶＩＩａ複合体の関節内注射により、滑膜組織への単球浸潤が誘導され、続いて軟骨および骨が破壊される。ＴＦ突然変異マウスでは関節炎の重症度が有意に低下したが、これは、関節リウマチ患者の関節の関節内にしばしば見られるＴＦ／ＦＶＩＩ複合体が、慢性破壊性関節炎の誘導と進行の両方に重要な成分であることを示している。（Yang Y. H. et al., Am. J. Pathol. (2004) 164:109-117）。
【０００７】
抗ＴＦモノクローナル抗体（Mueller B. M. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1992) 89:11832-11836）、組織因子経路阻害剤（Amirkhosravi A. et al., Semin. Thromb. Hemost. (2007) 33:643-652）または特異的ＴＦ ｓｉＲＮＡによるＴＦ発現のノックダウンのいずれかによるＴＦ：ＦＶＩＩａ複合体の遮断により、実験的肺転移が阻害され（Amarzguioui M. et al., Clin. Cancer Res. (2006) 12:4055-4061）、これは、ＴＦ：ＦＶＩＩａ複合体が、腫瘍の成長および転移の促進にも関与することを示唆し、さらに、ＴＦ：ＦＶＩＩａ複合体の阻害が、ガンの処置のための臨床的に実行可能な戦略であることを示唆している。
【０００８】
血栓および炎症障害の処置における著しい進歩にかかわらず、例えば冠動脈疾患、アテローム性動脈硬化症、関節リウマチ、ガン／転移のような増殖障害の現在の理解によると、抗血栓性と抗炎症性の両方を有する治療的に活性で安全な物質が、標準的な治療法より改良されたものであることが示唆される。
【０００９】
二本鎖ＲＮＡ分子（ｄｓＲＮＡ）は、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）として知られている高度に保存された調節メカニズムで遺伝子発現を遮断することが示されている。本発明は、ＦＶＩＩの発現を選択的かつ効率的に減少させることができる二本鎖リボ核酸分子（ｄｓＲＮＡ）を提供する。ＦＶＩＩ ＲＮＡｉの使用は、ＦＶＩＩａ、ＴＦ−ＦＶＩＩａ複合体、ＩＸａ、Ｘａ、ＸＩＩａおよびトロンビンのような凝固因子、ＦＶＩＩａおよびＴＦによって直接または間接的に活性化される、サイトカインおよびＣ反応性タンパク質（ＣＲＰ）のような炎症因子の形成に関連する疾患／障害の治療的および／または予防的処置のための方法を提供する。特定の疾患／障害状態には、動脈および静脈血栓症、深部静脈血栓症、不安定狭心症、急性冠動脈症候群、心筋梗塞、心房細動による発作、肺塞栓、脳塞栓、腎塞栓、重症肢虚血、急性肢虚血、播種性血管内凝固（例えば細菌、ウイルス疾患、ガン、敗血症、多発外傷によって起こるもの）、壊疽、鎌状赤血球症、結節性動脈周囲炎（periateritis nodosale）、川崎病、バージャー病、抗リン脂質症候群、非限定的に急性または慢性アテローム性動脈硬化症、関節リウマチ、ガン／転移のような増殖障害、膵炎を含めた炎症反応の治療的および／または予防的処置が含まれ、その方法は、ヒトまたは動物にＦＶＩＩをターゲティングするｄｓＲＮＡを投与することを含む。本発明の化合物は、また、血液が体内の医療機器（例えば機械および生体人工心臓弁、血管ステント、血管カテーテル、代用血管）または体外の医療機器（例えば血液透析、人工心肺）に接触している場合の血栓症の予防に使用することができる。
【００１０】
本発明は、ＦＶＩＩ遺伝子をサイレンシングすることによって肝細胞でのＦＶＩＩの発現を選択的かつ効率的に減少させ、そのことにより肝臓で合成されるＦＶＩＩタンパク質のレベルを減少させ、最終的に血漿中のＦＶＩＩ活性を低下させることのできる二本鎖リボ核酸分子（ｄｓＲＮＡ）を提供する。好ましい一態様では、記載されたｄｓＲＮＡ分子は、ＦＶＩＩ遺伝子の発現を少なくとも７０％阻害することができる。本発明は、また、ＦＶＩＩ遺伝子の発現によって引き起こされる上記を含めた病状および疾患を処置するために、肝臓をＦＶＩＩ ｄｓＲＮＡで特異的にターゲティングするための組成物および方法を提供する。
【００１１】
一態様では、本発明は、第ＶＩＩ因子の発現、特に哺乳動物またはヒト第ＶＩＩ因子遺伝子の発現を阻害するための二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）分子を提供する。ｄｓＲＮＡは、相互に相補的な少なくとも二つの配列を含む。ｄｓＲＮＡは、第１の配列を含むセンス鎖を含み、アンチセンス鎖は第２の配列を含むことがあり、添付の表１、４、６および７における特異的ｄｓＲＮＡ対の提供も参照されたい。一態様では、センス鎖は、ＦＶＩＩをコードするｍＲＮＡの少なくとも一部に少なくとも９０％の同一性を有する配列を含む。該配列は、アンチセンス鎖に対するセンス鎖の相補的領域に位置する。好ましい一態様では、ｄｓＲＮＡは、特にヒト第ＶＩＩ因子遺伝子をターゲティングし、なお別の好ましい態様では、ｄｓＲＮＡは、モルモット（Cavia porcellus）またはラット（Rattus norvegicus）第ＶＩＩ因子遺伝子をターゲティングする。
【００１２】
一態様では、アンチセンス鎖は、該第ＶＩＩ因子遺伝子をコードするｍＲＮＡの少なくとも一部に実質的に相補的なヌクレオチド配列を含み、相補的領域は、最も好ましくは３０ヌクレオチド長未満である。さらに、本明細書に記載の本発明のｄｓ分子の長さ（二重鎖長）は、約１６〜３０個のヌクレオチドの範囲、特に約１８〜２８個のヌクレオチドの範囲であることが好ましい。本発明に関して特に有用なのは、約１９、２０、２１、２２、２３または２４個のヌクレオチドの二重鎖長である。最も好ましいのは、１９、２１または２３個のヌクレオチドの二重鎖ストレッチである。そのｄｓＲＮＡは、第ＶＩＩ因子遺伝子を発現している細胞と接触すると、in vitroで第ＶＩＩ因子遺伝子の発現を少なくとも７０％阻害する。
【００１３】
選択されたｄｓＲＮＡ分子を添付の表６および７に提供するが、配列番号４１３、４１４、４１５、４１６、４１７、４１８、４１９、４２０、４２１、４２２、４２３、４２４、４２５、４２６、４２７、４２８、４２９、４３０、４３１、４３２、４３３、４３４、４３５、４３６、４３７および４３８のヌクレオチド第１〜１９位を含むｄｓＲＮＡ分子が好ましい。
【００１４】
一態様では、該ｄｓＲＮＡ分子は、１〜５ヌクレオチド長、好ましくは１〜２ヌクレオチド長の３’オーバーハングを有するアンチセンス鎖を含む。好ましくは、アンチセンス鎖の該オーバーハングは、ウラシル、または第ＶＩＩ因子をコードするｍＲＮＡに少なくとも９０％相補的なヌクレオチドを含む。
【００１５】
別の好ましい態様では、該ｄｓＲＮＡ分子は、１〜５ヌクレオチド長、好ましくは１〜２ヌクレオチド長の３’オーバーハングを有するセンス鎖を含む。好ましくは、センス鎖の該オーバーハングは、ウラシル、または第ＶＩＩ因子をコードするｍＲＮＡに少なくとも９０％同一なヌクレオチドを含む。
【００１６】
別の好ましい態様では、該ｄｓＲＮＡ分子は、１〜５ヌクレオチド長、好ましくは１〜２ヌクレオチド長の３’オーバーハングを有するセンス鎖、および１〜５ヌクレオチド長、好ましくは１〜２ヌクレオチド長の３’オーバーハングを有するアンチセンス鎖を含む。好ましくは、センス鎖の該オーバーハングは、ウラシル、または第ＶＩＩ因子をコードするｍＲＮＡに少なくとも９０％同一なヌクレオチド含み、アンチセンス鎖の該オーバーハングは、ウラシル、または第ＶＩＩ因子をコードするｍＲＮＡに少なくとも９０％相補的なヌクレオチドを含む。
【００１７】
好ましいｄｓＲＮＡ分子において、とりわけ好ましくはセンス鎖は、配列番号４１３、４１５、４１７、４１９、４２１、４２３、４２５、４２７、４２９、４３１、４３３、４３５、および４３７に示される核酸配列から成る群より選択され、アンチセンス鎖は、配列番号４１４、４１６、４１８、４２０、４２２、４２４、４２６、４２８、４３０、４３２、４３４、４３６および４３８に示される核酸配列から成る群より選択される。したがって、本発明のｄｓＲＮＡ分子は、とりわけ、配列番号４１３／４１４、４１５／４１６、４１７／４１８、４１９／４２０、４２１／４２２、４２３／４２４、４２５／４２６、４２７／４２８、４２９／４３０、４３１／４３２、４３３／４３４、４３５／４３６および４３７／４３８から成る群より選択される配列対を含んでもよい。本明細書に提供される特異的ｄｓＲＮＡ分子に関連して、配列番号の対は、添付の表にも示されるような、対応するセンス鎖およびアンチセンス鎖配列（５’から３’）に関する。
【００１８】
また、改変されたｄｓＲＮＡ分子が本明細書に提供され、特に添付の表１および４に開示され、本発明の改変されたｄｓＲＮＡ分子の説明に役立つ実例を提供している。
【００１９】
表２および３は、本発明の特定のｄｓＲＮＡ分子の選択的な生物学的、臨床的および薬学的に関連するパラメーターを提供するものである。
【００２０】
本明細書上記に指摘したように、表１は、本発明の改変されたｄｓＲＮＡｓの説明に役立つ実例を提供する（対応するセンス鎖およびアンチセンス鎖をこの表に提供する）。なお、本発明のｄｓＲＮＡのこれらの構成成分の例示的改変は、改変例として本明細書に提供される。これらのｄｓＲＮＡ（およびその構成成分）のさらなる改変もまた、本発明の一態様として含まれる。対応する例を、本発明のさらに詳細な説明に提供する。
【００２１】
添付の表４および７は、また、本発明に関連して有用なさらなるｓｉＲＮＡ分子／ｄｓＲＮＡを提供し、ここで、表４は、表７に示されるような本発明の改変されたｓｉＲＮＡ分子／ｄｓＲＮＡ分子の、特定の生物学的および／または臨床的に関連する驚くべき特徴を提供する。これらのＲＮＡ分子は、例示的なヌクレオチド改変を含む。
【００２２】
最も好ましいｄｓＲＮＡ分子は、添付の表１および４に提供され、ここで、とりわけ好ましくは、センス鎖は、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３および２５に示される核酸配列から成る群より選択され、アンチセンス鎖は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４および２６に示される核酸配列から成る群より選択される。したがって、本発明のｄｓＲＮＡ分子は、とりわけ、配列番号１／２、３／４、５／６、７／８、９／１０、１１／１２、１３／１４、１５／１６、１７／１８、１９／２０、２１／２２、２３／２４および２５／２６から成る群より選択される配列対を含んでもよい。最も好ましいｄｓＲＮＡ分子は、配列対１９／２０および１１／１２を含む。本明細書に提供される特異的ｄｓＲＮＡ分子に関連して、配列番号の対は、添付および包含される表にも示されるような、対応するセンスおよびアンチセンス鎖配列（５’から３’）に関する。
【００２３】
一態様では、本発明のｄｓＲＮＡ分子は、センスおよびアンチセンス鎖から成り、ここで、該鎖の少なくとも一方は、少なくとも２４時間の半減期を有する。別の態様では、本発明のｄｓＲＮＡ分子は、非免疫刺激性であり、例えばin vitroでＩＮＦ−αおよびＴＮＦ−αを刺激しない。
【００２４】
本発明のｄｓＲＮＡ分子は、天然ヌクレオチドから成ることがあるか、または２’−Ｏ−メチル改変ヌクレオチド、５’−ホスホロチオエート基を含むヌクレオチド、およびコレステリル誘導体またはドデカン酸ビスデシルアミド基に連結された末端ヌクレオチドなどの少なくとも１個の改変ヌクレオチドから成ることがある。２’改変ヌクレオチドは、本発明のｄｓＲＮＡ分子がin vivoで、例えば医学的状況で使用される場合に、特定の免疫刺激因子またはサイトカインが抑制されるというさらなる利点を有しうる。または、そして非限定的に、改変ヌクレオチドは、２’−デオキシ−２’−フルオロ改変ヌクレオチド、２’−デオキシ改変ヌクレオチド、ロックされたヌクレオチド、脱塩基ヌクレオチド、２’−アミノ改変ヌクレオチド、２’−アルキル改変ヌクレオチド、モルホリノヌクレオチド、ホスホルアミデート、および非天然塩基を含むヌクレオチドの群より選択してもよい。好ましい一態様では、ｄｓＲＮＡ分子は、以下の改変ヌクレオチド：２’−Ｏ−メチル改変ヌクレオチド、５’−ホスホロチオエート基を含むヌクレオチド、およびデオキシチミジンの少なくとも一つを含む。改変ヌクレオチドを含む好ましいｄｓＲＮＡ分子を表１および４に示す。
【００２５】
本発明は、また、本発明の少なくとも一つのｄｓＲＮＡを含む細胞を提供する。細胞は、好ましくはヒト細胞などの哺乳動物細胞である。さらに、本明細書に定義されるｄｓＲＮＡ分子を含む組織および／または非ヒト生物もまた、本発明に含まれ、ここで、該非ヒト生物は、特に研究目的にまたは研究ツールとして、例えば薬物の試験にも有用である。
【００２６】
さらに、本発明は、以下の段階：
（ａ）本明細書において定義の二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）を細胞、組織または生物に導入すること；
（ｂ）段階（ａ）で作製した該細胞、組織または生物を、ＦＶＩＩ遺伝子のｍＲＮＡ転写物が分解されるために十分な時間維持することによって、所与の細胞におけるＦＶＩＩ遺伝子の発現を阻害すること
を含む、細胞、組織または生物におけるＦＶＩＩ遺伝子、特に哺乳動物またはヒトＦＶＩＩ遺伝子の発現を阻害するための方法に関する。
【００２７】
本発明は、また、本発明のｄｓＲＮＡを含む薬学的組成物に関する。これらの薬学的組成物は、特に、細胞、組織または生物におけるＦＶＩＩ遺伝子の発現の阻害に有用である。本発明の一つまたは複数のｄｓＲＮＡを含む薬学的組成物は、また、薬学的に許容される担体、希釈剤および／または賦形剤を含んでもよい。
【００２８】
別の態様では、本発明は、凝固因子の活性化、炎症または増殖障害に関連する血栓障害を治療、予防または管理するための方法であって、そのような治療、予防または管理の必要のある対象に治療または予防有効量の本発明の一つまたは複数のｄｓＲＮＡを投与することを含む方法を提供する。好ましくは、該対象は、哺乳動物であり、最も好ましくはヒト患者である。
【００２９】
一態様では、本発明は、第ＶＩＩ因子遺伝子の発現により仲介される病状を有する対象を処置するための方法を提供する。そのような状態は、血栓塞栓障害、望まれない炎症イベントまたは増殖障害および上記のような障害を含む。この態様では、ｄｓＲＮＡは、第ＶＩＩ因子遺伝子の発現をコントロールするための治療剤として作用する。その方法は、第ＶＩＩ因子遺伝子の発現がサイレンシングされるように、患者（例えばヒト）に本発明の薬学的組成物を投与することを含む。それらの高い特異性が原因で、本発明のｄｓＲＮＡは、第ＶＩＩ因子遺伝子のｍＲＮＡを特異的にターゲティングする。好ましい一態様では、記載されたｄｓＲＮＡは、ＦＶＩＩ ｍＲＮＡレベルを特異的に減少させ、細胞中のオフターゲット遺伝子の発現および／またはｍＲＮＡレベルに直接には影響しない。
【００３０】
好ましい一態様では、記載されたｄｓＲＮＡは、肝臓中の第ＶＩＩ因子ｍＲＮＡレベルをin vivoで少なくとも８０％減少させ、血漿中の第ＶＩＩ因子チモーゲンレベルをin vivoで少なくとも９５％減少させる。別の態様では、記載されたｄｓＲＮＡは、プロトロンビン時間を延長し、トロンビン生成および血栓形成をin vivoで阻害する。なお別の好ましい態様では、記載されたｄｓＲＮＡ分子によって仲介されるこれらの抗血栓効果は、減少したin vivo血漿ＦＶＩＩレベルおよび減少したin vivo肝臓ＦＶＩＩ ｍＲＮＡレベルに関連する。
【００３１】
一態様では、記載されたｄｓＲＮＡ分子は、血液凝固時間をin vivoで少なくとも２倍に増加させる。
【００３２】
治療用ｄｓＲＮＡに関して特に有用なのは、モルモットまたは細胞培養モデルで個別のｄｓＲＮＡについての毒性、治療有効性および有効薬用量およびin vivo半減期を推定するために使用することができる、モルモット第ＶＩＩ因子をターゲティングするｄｓＲＮＡセットである。
【００３３】
別の態様では、本発明は、細胞における第ＶＩＩ因子遺伝子の発現、特に本発明のｄｓＲＮＡの一つの少なくとも１本の鎖をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結された調節配列を含む第ＶＩＩ因子遺伝子の発現を阻害するためのベクターを提供する。
【００３４】
別の態様では、本発明は、細胞における第ＶＩＩ因子遺伝子の発現を阻害するためのベクターを含む細胞を提供する。該ベクターは、本発明のｄｓＲＮＡの一つの少なくとも１本の鎖をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結された調節配列を含む。なお、該ベクターが、該調節配列以外に本発明のｄｓＲＮＡの少なくとも１本の「センス鎖」および該ｄｓＲＮＡの少なくとも１本の「アンチセンス鎖」をコードする配列を含むことが好ましい。請求された細胞が、該調節配列以外に本発明のｄｓＲＮＡの一つの少なくとも１本の鎖をコードする、本明細書に定義される配列を含む二つ以上のベクターを含むことも予想される。
【００３５】
一態様では、その方法は、ｄｓＲＮＡを含む組成物を投与することを含み、ここで、そのｄｓＲＮＡは、処置される哺乳動物の第ＶＩＩ因子遺伝子のＲＮＡ転写物の少なくとも一部に相補的なヌクレオチド配列を含む。上に指摘したように、本明細書に定義されるｄｓＲＮＡ分子の少なくとも１本の鎖をコードする核酸分子を含むベクターおよび細胞もまた、薬学的組成物として使用することができ、したがって、本明細書に開示された医学的介入の必要のある対象を処置する方法に使用することもできる。薬学的組成物および対応する（ヒト）対象を処置する方法に関するこれらの態様が、また、遺伝子治療アプローチのようなアプローチに関することも注目すべきである。本明細書に提供されるような第ＶＩＩ因子特異的ｄｓＲＮＡ分子または本発明のｄｓＲＮＡ分子の個別の鎖をコードする核酸分子を、また、ベクターに挿入し、ヒト患者のための遺伝子治療ベクターとして使用してもよい。遺伝子治療ベクターは、例えば静脈内注射、局所投与（米国特許第５，３２８，４７０号参照）または定位注射（例えばChen et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:3054-3057参照）によって対象に送達することができる。遺伝子治療ベクターの医薬製剤は、許容される希釈剤中に遺伝子治療ベクターを含むことがあるか、または遺伝子送達ビヒクルが埋め込まれている徐放マトリックスを含むことがある。または、リコンビナント細胞から完全な遺伝子送達ベクター、例えばレトロウイルスベクターをインタクトに産生できる場合、その医薬製剤は、遺伝子送達システムを産生する一つまたは複数の細胞を包含してもよい。
【００３６】
本発明の別の局面では、第ＶＩＩ因子遺伝子の発現活性をモデュレーションする第ＶＩＩ因子特異的ｄｓＲＮＡ分子は、ＤＮＡまたはＲＮＡベクターに挿入された転写ユニットから発現される（例えば、Skillern, A.ら、ＰＣＴ国際公開公報第００／２２１１３号参照）。これらの導入遺伝子は、直鎖構築物、環状プラスミド、またはウイルスベクターとして導入することができ、それらは、ホストゲノムに組込まれる導入遺伝子として組入れおよび遺伝することができる。導入遺伝子は、また、それが染色体外プラスミドとして遺伝可能なように構築することができる（Gassmann, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1995) 92:1292）。
【００３７】
ｄｓＲＮＡの個別の鎖を、二つの別々の発現ベクター上のプロモーターによって転写させて、ターゲット細胞に同時トランスフェクションすることができる。または、ｄｓＲＮＡの各個別の鎖を、どちらも同じ発現プラスミド上に位置するプロモーターによって転写させることができる。好ましい態様では、ｄｓＲＮＡは、ステムアンドループ構造を有するようにリンカーポリヌクレオチド配列によって結合した逆方向反復配列として発現される。
【００３８】
リコンビナントｄｓＲＮＡ発現ベクターは、好ましくはＤＮＡプラスミドまたはウイルスベクターである。ｄｓＲＮＡを発現しているウイルスベクターは、非限定的にアデノ随伴ウイルス（総説についてはMuzyczka, et al., Curr. Topics Micro. Immunol. (1992) 158:97-129)参照）；アデノウイルス（例えば、Berkner, et al., BioTechniques (1998) 6:616)、Rosenfeld et al. (1991, Science 252:431-434)、およびRosenfeld et al. (1992), Cell 68:143-155)参照）；またはアルファウイルスおよび当技術分野で公知の他のウイルスに基づき構築することができる。レトロウイルスは、上皮細胞を含めた多数の異なる種類の細胞に、in vitroおよび／またはin vivoで多様な遺伝子を導入するために使用されている（例えば、Danos and Mulligan, Proc. NatI. Acad. Sci. USA (1998) 85:6460-6464参照）。細胞のゲノムに挿入された遺伝子をトランスダクションおよび発現することができるリコンビナント−レトロウイルスベクターは、ＰＡ３１７およびＰｓｉ−ＣＲＩＰなどの適切なパッケージング細胞系にリコンビナント−レトロウイルスゲノムをトランスフェクションすることによって産生することができる（Comette et al., 1991, Human Gene Therapy 2:5-10; Cone et al., 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6349）。リコンビナント−アデノウイルスベクターは、感受性ホスト（例えばラット、ハムスター、イヌおよびチンパンジー）の多種多様な細胞および組織に感染させるために使用することができ（Hsu et al., 1992, J. Infectious Disease, 166:769）、感染に有糸分裂活性細胞を必要としないという利点ももつ。
【００３９】
本発明のＤＮＡプラスミドまたはウイルスベクターのいずれかにおけるｄｓＲＮＡ発現を駆動するプロモーターは、真核生物ＲＮＡポリメラーゼＩプロモーター（例えばリボソームＲＮＡプロモーター）、ＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーター（例えばＣＭＶ初期プロモーターまたはアクチンプロモーターまたはＵ１ ｓｎＲＮＡプロモーター）または好ましくはＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーター（例えば Ｕ６ ｓｎＲＮＡまたは７ＳＫ ＲＮＡプロモーター）または原核生物プロモーター、例えばＴ７プロモーター（発現プラスミドが、Ｔ７プロモーターからの転写に必要なＴ７ ＲＮＡポリメラーゼもまたコードする場合）でありうる。プロモーターは、また、膵臓に導入遺伝子の発現を指令することができる（例えば膵臓についてのインスリン調節配列参照（Bucchini et al., 1986, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:2511-2515））。
【００４０】
加えて導入遺伝子の発現は、例えば、特定の生理学的レギュレーターに、例えば循環グルコースレベルまたはホルモンに、感受性の調節配列などの誘導性調節配列および発現システムを使用することによって正確にレギュレーションすることができる（Docherty et al., 1994, FASEB J. 8:20-24）。細胞または哺乳動物における導入遺伝子発現のコントロールに適した、そのような誘導性発現システムには、エクジソン、エストロゲン、プロゲステロン、テトラサイクリン、二量体形成の化学誘導因子、およびイソプロピル−β−Ｄ１−チオガラクトピラノシド（ＥＰＴＧ）によるレギュレーションが含まれる。当業者は、意図されるｄｓＲＮＡ導入遺伝子の使用に基づいて適切な調節／プロモーター配列を選択できよう。
【００４１】
好ましくは、ｄｓＲＮＡ分子を発現することができるリコンビナントベクターは、下記のように送達され、ターゲット細胞中に長く残る。または、ｄｓＲＮＡ分子の一過性発現を提供するウイルスベクターを使用することができる。必要に応じてそのようなベクターを繰り返し投与することができる。ｄｓＲＮＡは、いったん発現したならばターゲットＲＮＡに結合し、その機能または発現をモデュレーションする。ｄｓＲＮＡ発現ベクターの送達は、静脈内または筋肉内投与による、患者から外植されたターゲット細胞に投与後にその患者に再導入することによる、または所望のターゲット細胞への導入を可能にする他の手段によるなどの、全身的でありうる。
【００４２】
ｄｓＲＮＡ発現ＤＮＡプラスミドは、典型的には陽イオン性脂質担体（例えばオリゴフェクタミン）または非陽イオン性脂質系担体（例えばTransit-TKO（商標））との複合体としてターゲット細胞にトランスフェクションされる。単一のＡ第ＶＩＩ因子遺伝子または複数のＡ第ＶＩＩ因子遺伝子の異なる領域をターゲティングするｄｓＲＮＡ介在性ノックダウンのための１週間以上にわたる複数回の脂質トランスフェクションもまた、本発明によって考えられている。本発明のベクターがホスト細胞にうまく導入されたことは、様々な公知の方法を使用してモニタリングすることができる。例えば、一過性トランスフェクションは、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）などの蛍光マーカーのようなレポーターを用いてシグナルを発生させることができる。エックスビボ細胞の安定トランスフェクションは、トランスフェクションされた細胞に、ハイグロマイシンＢ耐性などの特異的環境因子（例えば抗生物質および薬物）に対する耐性を有することを示すマーカーを使用して確認することができる。
【００４３】
以下の詳細な説明は、ｄｓＲＮＡを製造および使用する方法、ならびにターゲット第ＶＩＩ因子遺伝子の発現を阻害するｄｓＲＮＡを含有する組成物、加えて該第ＶＩＩ因子遺伝子の発現によって引き起こされる疾患および障害を処置するための組成物および方法を開示する。
【００４４】
定義
便宜上、明細書、実施例、および添付の特許請求の範囲に使用される特定の用語および語句の意味を下記に提供する。この明細書の他の部分での用語の使用と本節に提供されたその定義との間に明らかな矛盾がある場合は、本節の定義が優先されるものとする。
【００４５】
それぞれ「Ｇ」、「Ｃ」、「Ａ」、「Ｕ」および「Ｔ」または「ｄＴ」は、それぞれ一般的に、塩基としてそれぞれグアニン、シトシン、アデニン、ウラシルおよびデオキシチミジンを有するヌクレオチドを意味する。しかし、「リボヌクレオチド」または「ヌクレオチド」という用語は、また、下記にさらに詳述するような改変ヌクレオチドまたは代替置換部分を表わすことがある。そのような置換部分を含む配列は、本発明の態様である。下記に詳述するように、本明細書に記載されたｄｓＲＮＡ分子は、また「オーバーハング」、すなわち対になっていない、突出したヌクレオチドであって、本明細書において定義された「センス鎖」および「アンチセンス鎖」の対によって通常形成されるＲＮＡ二重らせん構造に直接には関与しないヌクレオチドを含むことがある。多くの場合に、そのような突出したストレッチは、３’末端にデオキシチミジンヌクレオチドを、大部分の態様では２個のデオキシチミジンを含む。そのようなオーバーハングを下記に説明および例示する。
【００４６】
本明細書に使用されるような「第ＶＩＩ因子」または「ＦＶＩＩ」という用語は、特に第ＶＩＩ凝固因子（以前は「プロコンバーチン」または「血清プロトロンビン転化促進因子」とも記載された）に関し、該用語は、対応する遺伝子、コードされるｍＲＮＡ、コードされるタンパク質／ポリペプチドに加えて、その機能的フラグメントに関する。「第ＶＩＩ因子遺伝子／配列」という用語は、野生型配列だけでなく、該遺伝子／配列に含まれうる突然変異および変化にも関する。したがって、本発明は、本明細書に提供される特異的ｄｓＲＮＡ分子に限定されない。本発明は、また、そのような突然変異／変化を含む第ＶＩＩ因子遺伝子のＲＮＡ転写物の対応するヌクレオチドストレッチに少なくとも８５％相補的なアンチセンス鎖を含むｄｓＲＮＡ分子に関する。
【００４７】
本明細書に使用されるような「ターゲット配列」は、一次転写産物のＲＮＡプロセシングの産物であるｍＲＮＡを含めた、第ＶＩＩ因子遺伝子の転写中に形成されるｍＲＮＡ分子のヌクレオチド配列の連続する部分を表す。
【００４８】
本明細書に使用されるような「配列を含む鎖」という用語は、標準的なヌクレオチドの命名法を使用して表される配列によって記載されるヌクレオチドの鎖を含むオリゴヌクレオチドを表す。しかし、本明細書に詳述されるような「配列を含む鎖」は、また、改変ヌクレオチドのように改変を含んでもよい。
【００４９】
本明細書に使用されるように、そして特に指摘しない限り、第１のヌクレオチド配列を第２のヌクレオチド配列に比較して記載するために使用される場合の「相補的」という用語は、第１のヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドが、特定の条件で第２のヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドとハイブリダイゼーションして二重鎖構造を形成する能力を表す。本明細書に使用されるような「相補的」配列は、それらがハイブリダイゼーションする能力に関する上記要件が満たされる限り、非Watson-Crick塩基対ならびに／または非天然および改変ヌクレオチドから形成された塩基対を含むか、またはそれらから完全に形成されていてもよい。
【００５０】
「完全に相補的」と称される配列は、第１および第２のヌクレオチド配列の全長にわたり、第２のヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドへの、第１のヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの塩基対形成を含む。
【００５１】
しかし、本明細書において第１の配列が第２の配列に対して「実質的に相補的」と称される場合に、これら二つの配列は、完全に相補的でありうるか、またはハイブリダイゼーションしたときに一つまたは複数の、しかし好ましくは４、３または２個以下の、ミスマッチ塩基対を形成しうる。
【００５２】
本明細書における「相補的」「完全に相補的」および「実質的に相補的」という用語は、その使用の状況から理解されるように、ｄｓＲＮＡのセンス鎖とアンチセンス鎖との間、またはｄｓＲＮＡのアンチセンス鎖とターゲット配列との間の塩基のマッチングに関して使用することができる。
【００５３】
本明細書に使用されるような「二本鎖ＲＮＡ」または「ｄｓＲＮＡ」という用語は、２本の逆平行で実質的に相補的な核酸鎖を含む二重鎖構造を有するリボ核酸分子、またはリボ核酸分子複合体を表す。二重鎖構造を形成している２本の鎖は、一つのより大きなＲＮＡ分子の異なる部分であってもよいか、またはそれらは、別々のＲＮＡ分子であってもよい。これらの２本の鎖が一つのより大きな分子の一部であるために、一方の鎖の３’末端と対する他方の鎖の５’末端との間で分断されないヌクレオチド鎖によって連結されて二重鎖構造を形成している場合に、その連結をしているＲＮＡ鎖を「ヘアピンループ」と呼ぶ。２本の鎖が、一方の鎖の３’末端と対する他方の鎖の５’末端との間で、分断されないヌクレオチド鎖以外の手段によって共有結合されて二重鎖構造を形成している場合に、その連結している構造を「リンカー」と呼ぶ。ＲＮＡ鎖は、同じまたは異なる数のヌクレオチドを有してもよい。二重鎖構造に加えて、ｄｓＲＮＡは、一つまたは複数のヌクレオチドオーバーハングを含んでもよい。該「オーバーハング」中のヌクレオチドは、０〜５個のヌクレオチドを含んでもよく、ここで、「０」は、「オーバーハング」を形成する追加的なヌクレオチドがないことを意味し、一方で「５」は、ｄｓＲＮＡ二重鎖の個別の鎖に５個の追加的なヌクレオチドがあることを意味する。これらの任意の「オーバーハング」は、個別の鎖の３’末端に位置する。下記に詳述するように、２本の鎖の１本だけに「オーバーハング」を含むｄｓＲＮＡ分子も、本発明に関連して有用であり、有利でさえありうる。「オーバーハング」は、好ましくは０〜２個のヌクレオチドを含む。最も好ましくは、２個の「ｄＴ」（デオキシチミジン）ヌクレオチドが、ｄｓＲＮＡの両方の鎖の３’末端に見られる。したがって、「ヌクレオチドオーバーハング」は、ｄｓＲＮＡの１本の鎖の３’末端が他方の鎖の５’末端を超えて伸長するか、またはその逆の場合に、ｄｓＲＮＡの二重鎖構造から突出する一つまたは複数の不対ヌクレオチドを表す。「平滑」または「平滑末端」は、ｄｓＲＮＡのその末端に不対ヌクレオチドがないこと、すなわちヌクレオチドオーバーハングがないことを意味する。「平滑末端の」ｄｓＲＮＡは、その全長にわたり二本鎖であるｄｓＲＮＡであり、すなわちその分子のどちらの末端にもヌクレオチドオーバーハングがないｄｓＲＮＡである。
【００５４】
「アンチセンス鎖」という用語は、ターゲット配列に実質的に相補的な領域を含むｄｓＲＮＡ鎖を表す。本明細書に使用されるような「相補的領域」という用語は、配列、例えばターゲット配列に実質的に相補的なアンチセンス鎖上の領域を表す。相補的領域がターゲット配列に完全には相補的でない場合に、ミスマッチは、末端領域で最も許容され、存在する場合は好ましくは一つまたは複数の末端領域にあり、例えば５’および／または３’末端から６、５、４、３、または２個のヌクレオチド以内にある。
【００５５】
本明細書に使用されるような「センス鎖」という用語は、アンチセンス鎖の領域に実質的に相補的な領域を含むｄｓＲＮＡの鎖を表す。「実質的に相補的」は、好ましくは、センスおよびアンチセンス鎖におけるオーバーラップしているヌクレオチドの少なくとも８５％が相補的であることを意味する。
【００５６】
ｄｓＲＮＡに関して使われる場合の「細胞に導入する」は、当業者に理解されているように、細胞への取込みまたは吸収を促進することを意味する。ｄｓＲＮＡの吸収または取込みは、受動（unaided）拡散過程もしくは能動細胞過程を介して、または補助剤もしくは装置によって行うことができる。この用語の意味は、in vitroの細胞に限定されず、ｄｓＲＮＡを、生物の一部である「細胞に導入」してもよい。その場合、細胞への導入は、生物への送達を含むであろう。例えば、in vivo送達について、ｄｓＲＮＡは、組織部位に注射することができるか、または全身投与することができる。例えば、医学的介入を必要とする対象に本発明のｄｓＲＮＡ分子が投与されることが予想されている。そのような投与は、該対象の罹患部に、例えば肝臓組織／細胞に、または肝ガン組織のようなガン組織／細胞に、本発明のｄｓＲＮＡ、ベクターまたは細胞を注射することを含んでもよい。しかし、罹患組織近傍への注射も予想されている。細胞へのin vitro導入には、エレクトロポレーションおよびリポフェクションなどの当技術分野で公知の方法が含まれる。
【００５７】
「サイレンシングする」、「発現を阻害する」および「ノックダウンする」という用語は、それらが第ＶＩＩ因子遺伝子に言及するかぎり、本明細書において、第１の細胞または細胞群（第ＶＩＩ因子遺伝子が転写される細胞であって、第ＶＩＩ因子遺伝子の発現が阻害されるように処理されたもの）から単離することができる、第ＶＩＩ因子遺伝子から転写されたｍＲＮＡの量が、第２の細胞または細胞群（第１の細胞または細胞群と実質的に同一であるが、そのように処理されなかったもの（対照細胞））に比べて減少したことを表す、第ＶＩＩ因子遺伝子の発現の少なくとも部分的な抑制を表す。阻害度は、通常次式により表される。
【００５８】
【数１】
【００５９】
または、阻害度は、第ＶＩＩ因子遺伝子の転写に機能的に関連しているパラメーター（例えば細胞によって分泌される、第ＶＩＩ因子遺伝子によってコードされるタンパク質の量、または特定の表現型を提示している細胞数）の減少によって示してもよい。
【００６０】
添付の実施例および本明細書に提供される添付の表に例示されるように、本発明のｄｓＲＮＡ分子は、in vitroアッセイにおいて、すなわちin vitroで、ヒト第ＶＩＩ因子の発現を少なくとも約７０％阻害することができる。別の態様では、本発明のｄｓＲＮＡ分子は、モルモット第ＶＩＩ因子の発現を少なくとも７０％阻害することができ、このことは顕著なin vivo抗血栓効果にも導く。当業者は、特に本明細書に提供されるアッセイを考慮に入れて、そのような阻害速度および関連効果を容易に決定することができる。特に好ましいｄｓＲＮＡを、例えば添付の表１の、特に順位１〜１３に提供する（そこに提供されるセンス鎖およびアンチセンス鎖の配列は、５’から３’方向である）。
【００６１】
本明細書に使用されるような「オフターゲット」という用語は、in silico法によって、記載されたｄｓＲＮＡに配列相補性に基づきハイブリダイゼーションすると予測されるトランスクリプトームの全ての非ターゲットｍＲＮＡを表す。本発明のｄｓＲＮＡは、好ましくは、第ＶＩＩ因子の発現を特異的に阻害し、すなわちどのオフターゲットの発現も阻害しない。
【００６２】
本明細書に使用されるような「半減期」という用語は、化合物または分子の安定性の尺度であって、特に本明細書に提供されるアッセイを考慮に入れて、当業者に公知の方法によって評価することができる。
【００６３】
本明細書に使用されるような「非免疫刺激性」という用語は、本発明のｄｓＲＮＡ分子による免疫反応の任意の誘導がないことを表す。免疫反応を決定する方法は、当業者に周知であり、例えば実施例の節に記載されているようにサイトカインの放出を評価することによる。
【００６４】
「処置する」、「処置」などの用語は、本発明に関連して血栓塞栓障害／疾患、炎症または増殖障害のような、第ＶＩＩ因子の発現に関係する障害の軽減または緩和を意味する。
【００６５】
本明細書に使用されるような「薬学的組成物」は、薬理学的有効量のｄｓＲＮＡおよび薬学的に許容される担体を含む。しかし、そのような「薬学的組成物」は、また、そのようなｄｓＲＮＡ分子の個別の鎖、または本発明のｄｓＲＮＡに含まれるセンスもしくはアンチセンス鎖の少なくとも１本をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結された調節配列を含む、本明細書に記載されたベクターを含んでもよい。本明細書に定義されたｄｓＲＮＡを発現するか、または含む細胞、組織または単離された器官を「薬学的組成物」として使用してもよいことも予想される。本明細書に使用されるような「薬理学的有効量」、「治療有効量」または単に「有効量」は、意図される薬理学的、治療的または予防的結果を生じるために有効なＲＮＡの量を表す。
【００６６】
「薬学的に許容される担体」という用語は、治療剤の投与のための担体を表す。そのような担体には、非限定的に、食塩水、緩衝食塩水、デキストロース、水、グリセロール、エタノール、およびその組合せが挙げられる。具体的には、この用語に細胞培養用培地は入らない。経口投与される薬物について、薬学的に許容される担体には、非限定的に、当業者に公知のような不活性希釈剤、崩壊剤、結合剤、滑沢剤、甘味料、香味料、着色料および保存料などの薬学的に許容される賦形剤が挙げられる。
【００６７】
薬学的に許容される担体が本発明のｄｓＲＮＡ、ベクターまたは細胞の全身投与を可能にすることが、特に予想される。経腸投与も予想されるが、非経口投与および経皮または経粘膜（例えば吹入、口内、膣、肛門）投与に加えて、薬物の吸入が、医学的介入を必要とする患者に本発明の化合物を投与する実現可能な方法である。非経口投与を採用する場合に、これは、罹患組織または少なくともその近傍への本発明の化合物の直接注射を含むことがある。しかし、本発明の化合物の静脈内、動脈内、皮下、筋肉内、腹腔内、皮内、くも膜下腔内および他の投与もまた、技術者、例えば担当医師の技術の範囲内である。
【００６８】
筋肉内、皮下および静脈内使用のために、本発明の薬学的組成物は、一般に、滅菌水溶液または懸濁物中に提供され、適切なｐＨおよび等張性に緩衝化されるであろう。好ましい態様では、担体は、水性緩衝液のみから成る。これに関連して、「のみ」は、第ＶＩＩ因子遺伝子を発現する細胞におけるｄｓＲＮＡの取込みに影響または取込みを仲介しうる補助剤も封入物質もないことを意味する。本発明による水性懸濁剤は、セルロース誘導体、アルギン酸ナトリウム、ポリビニルピロリドンおよびトラガカントゴムなどの懸濁化剤、ならびにレシチンなどの湿潤剤を含みうる。水性懸濁剤用の適切な保存料には、ｐ−ヒドロキシ安息香酸エチルおよびｐ−ヒドロキシ安息香酸プロピルが挙げられる。本発明による有用な薬学的組成物には、また、インプラントおよび微小封入デリバリーシステムを含めた徐放剤などの、身体からｄｓＲＮＡが急速に排泄されるのを防ぐ封入製剤が挙げられる。エチレン酢酸ビニル、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、およびポリ乳酸などの生分解性で生体適合性のポリマーを使用することができる。そのような製剤を調製するための方法は、当業者に明らかであろう。リポソーム懸濁剤もまた、薬学的に許容される担体として使用することができる。これらは、当業者に公知の方法により、例えば参照により本明細書に組入れられるＰＣＴ国際公開公報第９１／０６３０９号に記載されているように調製することができる。
【００６９】
本明細書に使用されるような「トランスフォーメーションされた細胞」は、ｄｓＲＮＡ分子またはそのようなｄｓＲＮＡ分子の少なくとも１本の鎖を発現させることができる、少なくとも一つのベクターが導入された細胞である。そのようなベクターは、好ましくは、本発明のｄｓＲＮＡに含まれるセンス鎖またはアンチセンス鎖の少なくとも一つをコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結された調節配列を含むベクターである。
【００７０】
表１および４の配列の一つの一方または両方の末端から少数のヌクレオチドだけを除いた短いｄｓＲＮＡが、上記ｄｓＲＮＡと同様に有効でありうると合理的に予想することができる。上に指摘したように、本発明の大部分の態様では、本明細書に提供されたｄｓＲＮＡ分子は、約１６〜約３０個のヌクレオチドの二重鎖長（すなわち「オーバーハング」なし）を含む。特に有用なｄｓＲＮＡ二重鎖長は、約１９〜約２５個のヌクレオチドである。最も好ましいのは、１９ヌクレオチド長の二重鎖構造である。本発明のｄｓＲＮＡ分子では、アンチセンス鎖は、センス鎖に少なくとも部分的に相補的である。
【００７１】
本発明のｄｓＲＮＡは、ターゲット配列に１個または複数個のミスマッチを有しうる。好ましい態様では、本発明のｄｓＲＮＡは、最大３個のミスマッチを有する。ｄｓＲＮＡのアンチセンス鎖がターゲット配列に対するミスマッチを有する場合に、ミスマッチ領域が相補的領域の中心に位置しないことが好ましい。ｄｓＲＮＡのアンチセンス鎖がターゲット配列に対するミスマッチを有する場合に、そのミスマッチが、末端領域に、好ましくは５’および／または３’末端から６、５、４、３または２個のヌクレオチド以内に、限られることが好ましい。例えば、第ＶＩＩ因子遺伝子の領域に相補的な２３個のヌクレオチドのｄｓＲＮＡ鎖について、ｄｓＲＮＡは、好ましくは中央の１３個のヌクレオチド内に全くミスマッチを有さない。
【００７２】
上述のように、ｄｓＲＮＡの少なくとも一つの末端／鎖は、１〜５個、好ましくは１または２個のヌクレオチドの一本鎖ヌクレオチドオーバーハングを有してもよい。少なくとも一つのヌクレオチドオーバーハングを有するｄｓＲＮＡは、その平滑末端の対応物よりも予想外に優れた阻害性を有する。さらに、本発明者らは、１個のヌクレオチドオーバーハングの存在のみが、ｄｓＲＮＡの干渉活性を強化するが、その全体的な安定性には影響しないことを発見した。オーバーハングを１個だけ有するｄｓＲＮＡがin vivoで、ならびに様々な細胞、細胞培養用培地、血液および血清中で特に安定で有効なことが証明された。好ましくは、一本鎖オーバーハングは、アンチセンス鎖の３’末端またはその代わりにセンス鎖の３’末端に位置する。ｄｓＲＮＡは、また、好ましくはアンチセンス鎖の５’末端に位置する平滑末端を有してもよい。好ましくは、ｄｓＲＮＡのアンチセンス鎖は、３’末端にヌクレオチドオーバーハングを有し、５’末端は平滑である。別の態様では、オーバーハング中の一つまたは複数のヌクレオチドは、ヌクレオシドチオリン酸エステルと置換されている。
【００７３】
また、安定性を高めるために、本発明のｄｓＲＮＡを化学的に改変してもよい。本発明の核酸は、参照により本明細書に組入れられる"Current protocols in nucleic acid chemistry", Beaucage, S.L. et al. (Edrs.), John Wiley & Sons, Inc., New York, NY, USAに記載されているような、当技術分野で十分に確立された方法により合成および／または改変してもよい。化学的改変には、非限定的に、２’改変、非天然塩基の導入、リガンドへの共有結合、およびリン酸結合からチオリン酸結合への置換を挙げることができる。この態様では、二重鎖構造の完全性は、少なくとも一つ、好ましくは二つの化学結合によって強化される。化学結合形成は、多様な周知の技法のいずれかによって、例えば共有結合、イオン結合または水素結合；疎水性相互作用、ファンデルワールスまたはスタッキング相互作用によって；金属イオン配位によって、またはプリンアナログの使用を介して達成してもよい。好ましくは、ｄｓＲＮＡを改変するために使用することのできる化学基には、非限定的にメチレンブルー；二官能基、好ましくはビス−（２−クロロエチル）アミン；Ｎ−アセチル−Ｎ’−（ｐ−グリオキシルベンゾイル）シスタミン；４−チオウラシル；およびソラレンが挙げられる。好ましい一態様では、リンカーは、ヘキサエチレングリコールリンカーである。この場合、ｄｓＲＮＡは、固相合成により生成され、ヘキサエチレングリコールリンカーは、標準法により組入れられる（例えばWilliams, D.J., and K.B. Hall, Biochem. (1996) 35:14665-14670）。特定の態様では、アンチセンス鎖の５’末端とセンス鎖の３’末端とは、ヘキサエチレングリコールリンカーを介して化学結合している。別の態様では、ｄｓＲＮＡの少なくとも１個のヌクレオチドは、ホスホロチオエート基またはホスホロジチオエート基を含む。ｄｓＲＮＡ末端の化学結合は、好ましくは三重らせん結合によって形成される。
【００７４】
特定の態様では、化学結合は、１個または数個の結合基によって形成されてもよく、ここで、そのような結合基は、好ましくはポリ−（オキシホスフィニコオキシ−１，３−プロパンジオール）鎖および／またはポリエチレングリコール鎖である。他の態様では、化学結合は、また、プリンの代わりに二本鎖構造に導入されたプリンアナログによって形成されてもよい。さらなる態様では、化学結合は、二本鎖構造に導入されたアザベンゼン−ユニットによって形成されてもよい。なおさらなる態様では、化学結合は、二本鎖構造に導入されたヌクレオチドの代わりに分岐ヌクレオチドアナログによって形成されてもよい。特定の態様では、化学結合は、紫外線によって誘導されてもよい。
【００７５】
なお別の態様では、二つの１本鎖の一方または両方のヌクレオチドを改変して、細胞酵素、例えば特定のヌクレアーゼの活性化を抑制または阻害してもよい。細胞酵素の活性化を阻害するための技法は、当技術分野で公知であり、例えば非限定的に２’−アミノ改変、２’−アミノ糖改変、２’−Ｆ糖改変、２’−Ｆ改変、２’−アルキル糖改変、非荷電骨格改変、モルホリノ改変、２’−Ｏ−メチル改変、およびホスホルアミデートである（例えばWagner, Nat. Med. (1995) 1:1116-8参照）。したがって、ｄｓＲＮＡ上のヌクレオチドの少なくとも一つの２’−ヒドロキシル基が、化学基、好ましくは２’−アミノ基または２’−メチル基により置換される。また、少なくとも１個のヌクレオチドを改変して、ロックされたヌクレオチドを形成させてもよい。そのようなロックされたヌクレオチドは、リボースの２’−酸素とリボースの４’−炭素を連結するメチレン架橋を有する。オリゴヌクレオチドへのロックされたヌクレオチドの導入により、相補的配列に対する親和性が向上し、融解温度が数度増加する。
【００７６】
本明細書に提供されたｄｓＲＮＡ分子の改変は、in vivoに加えてin vitroでその安定性にプラスの影響を与え、（罹患した）ターゲット部へのその送達も向上しうる。さらに、そのような構造的および化学的改変は、投与時のｄｓＲＮＡ分子に対する生理学的反応に、例えばサイトカイン放出（好ましくは抑制される）に、プラスの影響を与えうる。そのような化学的および構造的改変は、当技術分野において公知であり、とりわけNawrot (2006) Current Topics in Med Chem, 6, 913-925に例示されている。
【００７７】
ｄｓＲＮＡにリガンドをコンジュゲーションすることで、その細胞吸収に加えて特定組織へのターゲティングを高めることができる。場合によっては、細胞膜の直接透過性を促進するために疎水性リガンドがｄｓＲＮＡにコンジュゲーションされる。または、ｄｓＲＮＡにコンジュゲーションしたリガンドは、レセプター介在性エンドサイトーシスについての基質である。これらのアプローチは、アンチセンスオリゴヌクレオチドの細胞透過を促進するために使用されている。例えば、コレステロールが、様々なアンチセンスオリゴヌクレオチドとコンジュゲーションされて、コンジュゲーションしていないアナログよりも実質的に活性な化合物を生じた。M. Manoharan Antisense & Nucleic Acid Drug Development 2002, 12, 103参照。オリゴヌクレオチドとコンジュゲーションされた他の親油性化合物には、１−ピレン酪酸、１，３−ビス−Ｏ−（ヘキサデシル）グリセロール、およびメントールが挙げられる。レセプター介在性エンドサイトーシスについてのリガンドの一例は、葉酸である。葉酸は、葉酸レセプター介在性エンドサイトーシスにより細胞に進入する。葉酸と結合したｄｓＲＮＡ化合物は、葉酸レセプター介在性エンドサイトーシスにより細胞に効率的に輸送されるであろう。オリゴヌクレオチドの３’末端への葉酸の結合は、オリゴヌクレオチドの細胞取込みの増加を招く（Li, S.; Deshmukh, H. M.; Huang, L. Pharm. Res. 1998, 15, 1540）。オリゴヌクレオチドにコンジュゲーションされた他のリガンドには、ポリエチレングリコール、糖質クラスター、架橋剤、ポルフィリンコンジュゲート、および送達ペプチドが挙げられる。
【００７８】
場合によっては、オリゴヌクレオチドへの陽イオン性リガンドのコンジュゲーションは、多くの場合にヌクレアーゼ耐性の改善を招く。陽イオン性リガンドの代表例は、プロピルアンモニウムおよびジメチルプロピルアンモニウムである。興味深いことに、陽イオン性リガンドがアンチセンスオリゴヌクレオチド全体に分散した場合に、そのオリゴヌクレオチドは、ｍＲＮＡに対するその高い結合親和性を保持することが報告された。M. Manoharan Antisense & Nucleic Acid Drug Development 2002, 12, 103および本明細書における参考文献を参照されたい。
【００７９】
リガンドとコンジュゲーションした本発明のｄｓＲＮＡは、ｄｓＲＮＡへの連結分子の結合から誘導されるような反応性ペンダント官能基を有するｄｓＲＮＡの使用によって合成することができる。この反応性オリゴヌクレオチドは、市販のリガンド、多様な保護基のいずれかを有する、合成されたリガンド、または連結部分が結合したリガンドと直接反応させてもよい。本発明の方法は、リガンドとコンジュゲーションしたｄｓＲＮＡの合成を、いくつかの好ましい態様においてリガンドと適切にコンジュゲーションされたヌクレオシドモノマーであって、固体支持材料にさらに結合されてもよいヌクレオシドモノマーの使用により、容易にする。場合により固体支持材料に接着した、そのようなリガンド−ヌクレオシドコンジュゲートは、選択された血清結合性リガンドと、ヌクレオシドまたはオリゴヌクレオチドの５’位に位置する連結部分との反応を介して、本発明の方法のいくつかの好ましい態様により調製される。場合によっては、ｄｓＲＮＡの３’末端に結合したアラルキルリガンドを有するｄｓＲＮＡは、長鎖アミノアルキル基を介して多孔性（controlled-pore）ガラス支持体にモノマー構成要素を最初に共有結合させることによって調製される。次に、標準的な固相合成技法により、固体支持体に結合したモノマー構成要素にヌクレオチドを結合させる。モノマー構成要素は、固相合成に適したのヌクレオシドまたは他の有機化合物であってもよい。
【００８０】
本発明のコンジュゲートに使用されるｄｓＲＮＡは、周知の固相合成技法により簡便かつ日常的に製造することができる。ホスホロチオエートおよびアルキル化誘導体などの、他のオリゴヌクレオチドを調製する類似の方法を使用することも公知である。
【００８１】
特に改変されたオリゴヌクレオチドの合成に関する教示は、以下の米国特許に見出すことができる：ポリアミンとコンジュゲーションしたオリゴヌクレオチドに関して記載された米国特許第５，２１８，１０５号；改変された骨格を有するオリゴヌクレオチドに関して記載された米国特許第５，５４１，３０７号；キラルリン結合を有するオリゴヌクレオチドの調製方法に関して記載された米国特許第５，５２１，３０２号；ペプチド核酸に関して記載された米国特許第５，５３９，０８２号；β−ラクタム骨格を有するオリゴヌクレオチドに関して記載された米国特許第５，５５４，７４６号；オリゴヌクレオチドを合成するための方法および材料に関して記載された米国特許第５，５７１，９０２号；アルキルチオ基（そのような基は、ヌクレオシドの多様な位置のいずれかに結合した他の部分へのリンカーとして使用することができる）を有するヌクレオシドに関して記載された米国特許第５，５７８，７１８号；高キラル純度のホスホロチオエート結合を有するオリゴヌクレオチドに関して記載された米国特許第５，５８７，３６１号；２’−Ｏ−アルキルグアノシンおよび２，６−ジアミノプリン化合物を含めた関連化合物の調製方法に関して記載された米国特許第５，５０６，３５１号；Ｎ−２置換プリンを有するオリゴヌクレオチドに関して記載された米国特許第５，５８７，４６９号；３−デアザプリンを有するオリゴヌクレオチドに関して記載された米国特許第５，５８７，４７０号；共にコンジュゲーションした４’−デスメチルヌクレオシドアナログに関して記載された米国特許第５，６０８，０４６号；骨格改変オリゴヌクレオチドアナログに関して記載された米国特許第５，６１０，２８９号；とりわけ２’−フルオロ−オリゴヌクレオチドの合成方法に関して記載された米国特許第６，２６２，２４１号。
【００８２】
本発明のリガンドとコンジュゲーションしたｄｓＲＮＡおよびリガンド分子を有する配列特異的連結ヌクレオシドにおいて、標準的なヌクレオチドもしくはヌクレオシド前駆体、または連結部分を既に有するヌクレオチドまたはヌクレオシドコンジュゲート前駆体、リガンド分子を既に有するリガンド−ヌクレオチドもしくはヌクレオシド−コンジュゲート前駆体、または非ヌクレオシドリガンドを有する構成要素を利用して、オリゴヌクレオチドおよびオリゴヌクレオシドを適切なＤＮＡ合成装置で作製することができる。
【００８３】
典型的に連結部分を既に有するヌクレオチド−コンジュゲート前駆体を使用する場合に、配列特異的連結ヌクレオシドの合成は、完了し、次に、リガンド分子が連結部分と反応し、リガンドとコンジュゲーションしたオリゴヌクレオチドを形成する。ステロイド、ビタミン、脂質およびレポーター分子などの多様な分子を有するオリゴヌクレオチドコンジュゲートは、以前に記載されている（Manoharanら、ＰＣＴ国際公開公報第９３／０７８８３号参照）。好ましい態様では、本発明のオリゴヌクレオチドまたは連結ヌクレオシドは、市販のホスホルアミダイトに加えて、リガンド−ヌクレオシドコンジュゲート由来のホスホルアミダイトを使用して自動合成装置により合成される。
【００８４】
オリゴヌクレオシドのヌクレオシドへの２’−Ｏ−メチル、２’−Ｏ−エチル、２’−Ｏ−プロピル、２’−Ｏ−アリル、２’−Ｏ−アミノアルキルまたは２’−デオキシ−２’−フルオロ基の導入は、そのオリゴヌクレオチドに高いハイブリダイゼーション性を付与する。さらに、ホスホロチオエート骨格を有するオリゴヌクレオチドは、高いヌクレアーゼ安定性を有する。したがって、本発明の官能基化された連結ヌクレオシドは、ホスホロチオエート骨格または２’−Ｏ−メチル、２’−Ｏ−エチル、２’−Ｏ−プロピル、２’−Ｏ−アミノアルキル、２’−Ｏ−アリルもしくは２’−デオキシ−２’−フルオロ基のいずれかまたは両方を含むように強化することができる。
【００８５】
いくつかの好ましい態様では、５’末端にアミノ基を有する本発明の官能化ヌクレオシド配列は、ＤＮＡ合成装置を使用して調製し、次に、選択されたリガンドの活性エステル誘導体と反応する。活性エステル誘導体は、当業者に周知である。代表的な活性エステルには、Ｎ−ヒドロスクシンイミドエステル、テトラフルオロフェノールエステル、ペンタフルオロフェノールエステルおよびペンタクロロフェノールエステルが挙げられる。アミノ基と活性エステルとの反応により、選択されたリガンドが連結基を介して５’位に結合しているオリゴヌクレオチドが生成する。５’末端のアミノ基は、５’−アミノ改変剤であるＣ６試薬を使用して調製することができる。好ましい態様では、リガンド分子を、リガンドがリンカーを介して５’−ヒドロキシ基に直接または間接的に連結しているリガンド−ヌクレオシドホスホルアミダイトの使用によって５’位でオリゴヌクレオチドにコンジュゲーションさせてもよい。そのようなリガンド−ヌクレオシドホスホルアミダイトは、典型的には自動化合成手順の最後に使用されて、５’末端にリガンドを有する、リガンドとコンジュゲーションしたオリゴヌクレオチドを提供する。
【００８６】
本発明の方法の好ましい一態様では、リガンドとコンジュゲーションしたオリゴヌクレオチドの調製は、上にリガンド分子を構築する適切な前駆体分子の選択することから始まる。典型的には、前駆体は、通例使用されるヌクレオシドの適切に保護された誘導体である。例えば、本発明のリガンドとコンジュゲーションしたオリゴヌクレオチドの合成のための合成前駆体には、非限定的に、分子の核酸塩基部分で保護されていてもよい２’−アミノアルコキシ−５’−ＯＤＭＴ−ヌクレオシド、２’−６−アミノアルキルアミノ−５’−ＯＤＭＴ−ヌクレオシド、５’−６−アミノアルコキシ−２’−デオキシ−ヌクレオシド、５’−６−アミノアルコキシ−２−保護−ヌクレオシド、３’−６−アミノアルコキシ−５’−ＯＤＭＴ−ヌクレオシド、および３’−アミノアルキルアミノ−５’−ＯＤＭＴ−ヌクレオシドが挙げられる。そのような保護されたアミノ連結ヌクレオシド前駆体の合成方法は、当業者に公知である。
【００８７】
多くの場合に、本発明の化合物の調製時に保護基が使用される。本明細書に使用されるような「保護」という用語は、表示された部分に保護基が付属されていることを意味する。本発明のいくつかの好ましい態様では、化合物は、一つまたは複数の保護基を有する。多種多様な保護基を本発明の方法に使用することができる。一般に保護基は、化学官能基を特定の反応条件下で不活性にし、分子の残りを実質的に損傷することなしに分子中のそのような官能基に付属させ、そしてその官能基から除去することができる。
【００８８】
代表的なヒドロキシル保護基に加えて他の代表的な保護基は、Greene and Wuts, Protective Groups in Organic Synthesis, Chapter 2, 2d ed., John Wiley & Sons, New York, 1991、およびOligonucleotides And Analogues A Practical Approach, Ekstein, F. Ed., IRL Press, N.Y, 1991に開示されている。
【００８９】
酸処理に安定なアミノ保護基は、塩基処理で選択的に除去され、反応性アミノ基を置換に選択的に利用可能にするために使用される。そのような基の例は、Ｆｍｏｃ（E. Atherton and R. C. Sheppard、出典：The Peptides, S. Udenfriend, J. Meienhofer, Eds., Academic Press, Orlando, 1987, volume 9, p.1）およびＮｓｃ基により例示される様々な置換スルホニルエチルカルバメートである（Samukov et al., Tetrahedron Lett., 1994, 35:7821。
【００９０】
追加的なアミノ保護基には、非限定的に２−トリメチルシリルエトキシカルボニル（Ｔｅｏｃ）、１−メチル−１−（４−ビフェニリル）エトキシカルボニル（Ｂｐｏｃ）、ｔ−ブトキシカルボニル（ＢＯＣ）、アリルオキシカルボニル（Ａｌｌｏｃ）、９−フルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）、およびベンジルオキシカルボニル（Ｃｂｚ）などのカルバメート保護基；ホルミル、アセチル、トリハロアセチル、ベンゾイル、およびニトロフェニルアセチルなどのアミド保護基；２−ニトロベンゼンスルホニルなどのスルホンアミド保護基；ならびにフタルイミドおよびジチアスクシノイルなどのイミンおよび環状イミド保護基が挙げられる。これらのアミノ保護基の等価体もまた、本発明の化合物および方法に包含される。
【００９１】
多数の固体支持体が市販されており、当業者は、固相合成段階に使用される固体支持体を容易に選択することができる。特定の態様では、ユニバーサル支持体が使用される。ユニバーサル支持体は、オリゴヌクレオチドの３’末端に位置する特異なヌクレオチドまたは改変ヌクレオチドを有するオリゴヌクレオチドの調製を可能にする。ユニバーサル支持体に関するさらなる詳細については、Scott et al., Innovations and Perspectives in solid-phase Synthesis, 3rd International Symposium, 1994, Ed. Roger Epton, Mayflower Worldwide, 115-124］を参照されたい。加えて、より容易に塩基性加水分解を受けるｓｙｎ−１，２−アセトキシリン酸基を介してオリゴヌクレオチドが固体支持体に結合している場合に、より温和な反応条件でオリゴヌクレオチドをユニバーサル支持体から切断することができることが報告されている。Guzaev, A. I.; Manoharan, M. J. Am. Chem. Soc. 2003, 125, 2380を参照されたい。
【００９２】
ヌクレオシドは、リン含有またはリン不含のヌクレオシド間共有結合によって結合している。同定のために、そのようなコンジュゲーションしたヌクレオシドは、リガンド結合ヌクレオシドまたはリガンド−ヌクレオシドコンジュゲートとして特徴づけることができる。配列内にヌクレオシドにコンジュゲーションしたアラルキルリガンドを有する、連結ヌクレオシドは、コンジュゲーションしていない同様のｄｓＲＮＡ化合物と比べた場合に、高いｄｓＲＮＡ活性を実証するであろう。
【００９３】
本発明のアラルキル−リガンドとコンジュゲーションしたオリゴヌクレオチドには、また、オリゴヌクレオチドおよび連結ヌクレオシドのコンジュゲートが含まれ、ここで、リガンドは、中間にリンカー基を挟まずにヌクレオシドまたはヌクレオチドに直接結合している。リガンドは、好ましくはリガンドのカルボキシル、アミノまたはオキソ基で連結基を介して結合してもよい。典型的な連結基は、エステル、アミドまたはカルバメート基でありうる。
【００９４】
本発明のリガンドとコンジュゲーションしたオリゴヌクレオチドに使用するために想定される、好ましい改変オリゴヌクレオチドの具体例には、改変された骨格および非天然ヌクレオシド間結合を有するオリゴヌクレオチドが含まれる。改変された骨格またはヌクレオシド間結合を有する、本明細書において定義するようなオリゴヌクレオチドには、骨格にリン原子を保持するものおよび骨格にリン原子を有さないものが含まれる。本発明のために、糖間骨格にリン原子を有さない改変オリゴヌクレオチドもまた、オリゴヌクレオシドと見なすことができる。
【００９５】
特定のオリゴヌクレオチドの化学的改変を、下記に説明する。所与の化合物の全位置が一様に改変される必要はない。逆に、一つを超える改変を単一のｄｓＲＮＡ化合物に、またはその単一のヌクレオチドにさえも導入することができる。
【００９６】
好ましい改変されたヌクレオシド間結合または骨格には、例えば、ホスホロチオエート、キラルホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホトリエステル、アミノアルキルホスホトリエステル、３’−アルキレンホスホネートおよびキラルホスホネートを含めたメチルホスホネートおよび他のアルキルホスホネート、ホスフィネート、３’−アミノホスホルアミデートおよびアミノアルキルホスホルアミデートを含めたホスホルアミデート、チオノホスホルアミデート、チオノアルキルホスホネート、チオノアルキルホスホトリエステル、および通常の３’−５’結合を有するボラノホスフェート、これらの２’−５’結合アナログ、および隣接するヌクレオシドユニットの対が３’−５’から５’−３’または２’−５’から５’−２’に結合している逆極性を有するものが挙げられる。様々な塩、混合された塩および遊離酸形態もまた含まれる。
【００９７】
上記リン原子含有結合の調製に関する代表的な米国特許には、非限定的に、米国特許第４，４６９，８６３号；第５，０２３，２４３号；第５，２６４，４２３号；第５，３２１，１３１号；第５，３９９，６７６号；第５，４０５，９３９号；第５，４５３，４９６号；第５，４５５，２３３号および第５，４６６，６７７号が挙げられ、そのそれぞれは、参照により本明細書に組入れられる。
【００９８】
中にリン原子を含まない好ましい改変されたヌクレオシド間結合または骨格（すなわちオリゴヌクレオシド）は、短鎖アルキルまたはシクロアルキル糖間結合、混合されたヘテロ原子およびアルキルまたはシクロアルキル糖間結合、または一つもしくは複数の短鎖ヘテロ原子もしくは複素環式糖間結合によって形成される骨格を有する。これらには、モルホリノ結合（部分的にヌクレオシドの糖部分から形成される）；シロキサン骨格；スルフィド、スルホキシドおよびスルホン骨格；ホルムアセチルおよびチオホルムアセチル骨格；メチレンホルムアセチルおよびチオホルムアセチル骨格；アルケン含有骨格；スルファメート骨格；メチレンイミノおよびメチレンヒドラジノ骨格；スルホネートおよびスルホンアミド骨格；アミド骨格；ならびにＮ、Ｏ、ＳおよびＣＨ２の混合成分部分を有するその他を有するものが含まれる。
【００９９】
上記オリゴヌクレオシドの調製に関係する代表的な米国特許には、非限定的に米国特許第５，０３４，５０６号；第５，２１４，１３４号；第５，２１６，１４１号；第５，２６４，５６２号；第５，４６６，６７７号；第５，４７０，９６７号；第５，４８９，６７７号；第５，６０２，２４０号および第５，６６３，３１２号が含まれ、そのそれぞれは、参照により本明細書に組入れられる。
【０１００】
他の好ましいオリゴヌクレオチド模倣体では、ヌクレオシドユニットの糖およびヌクレオシド間結合、すなわち骨格の両方が、新規な基に置換される。核酸塩基ユニットは、適切な核酸ターゲット化合物とのハイブリダイゼーションのために保持される。優れたハイブリダイゼーション性を有することが示されている、そのようなオリゴヌクレオチドの一つであるオリゴヌクレオチド模倣体は、ペプチド核酸（ＰＮＡ）と呼ばれる。ＰＮＡ化合物では、オリゴヌクレオチドの糖骨格は、アミド含有骨格、特にアミノエチルグリシン骨格に置換される。核酸塩基は保持され、その骨格のアミド部分の原子に直接または間接的に結合する。ＰＮＡ化合物の教示は、例えば米国特許第５，５３９，０８２号に見いだすことができる。
【０１０１】
本発明のいくつかの好ましい態様は、ホスホロチオエート結合を有するオリゴヌクレオチドおよびヘテロ原子骨格を有するオリゴヌクレオシド、特に、上記に参照した米国特許第５，４８９，６７７号の−ＣＨ２−ＮＨ−Ｏ−ＣＨ２−、−ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）−Ｏ−ＣＨ２−［メチレン（メチルイミノ）またはＭＭＩ骨格としても知られている］、−ＣＨ２−Ｏ−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ２−、−ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ２−、および−Ｏ−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ２−ＣＨ２−［式中、ネイティブなホスホジエステル骨格は、−Ｏ−Ｐ−Ｏ−ＣＨ２−として表される］、および上記に参照した米国特許第５，６０２，２４０号のアミド骨格を使用する。同様に好ましいのは、上記に参照した米国特許第５，０３４，５０６号のモルホリノ骨格構造を有するオリゴヌクレオチドである。
【０１０２】
本発明のリガンドにコンジュゲーションしたオリゴヌクレオチドに使用されたオリゴヌクレオチドは、追加的または代替的に核酸塩基（当技術分野において単に「塩基」と呼ばれることが多い）の改変または置換を含んでもよい。本明細書に使用されるような「非改変」または「天然」核酸塩基には、プリン塩基であるアデニン（Ａ）およびグアニン（Ｇ）、ならびにピリミジン塩基であるチミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）、およびウラシル（Ｕ）が含まれる。改変された核酸塩基には、５−メチルシトシン（５−ｍｅ−Ｃ）、５−ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、２−アミノアデニン、アデニンおよびグアニンの６−メチル誘導体および他のアルキル誘導体、アデニンおよびグアニンの２−プロピル誘導体および他のアルキル誘導体、２−チオウラシル、２−チオチミンおよび２−チオシトシン、５−ハロウラシルおよび５−ハロシトシン、５−プロピニルウラシルおよび５−プロピニルシトシン、６−アゾウラシル、６−アゾシトシンおよび６−アゾチミン、５−ウラシル（シュードウラシル）、４−チオウラシル、８−ハロ、８−アミノ、８−チオール、８−チオアルキル、８−ヒドロキシルおよび他の８−置換アデニンおよびグアニン、５−ハロ、特に５−ブロモ、５−トリフルオロメチルおよび他の５−置換ウラシルおよびシトシン、７−メチルグアニンおよび７−メチルアデニン、８−アザグアニンおよび８−アザアデニン、７−デアザグアニンおよび７−デアザアデニンおよび３−デアザグアニンおよび３−デアザアデニンなどの他の合成および天然核酸塩基が挙げられる。
【０１０３】
さらなる核酸塩基には、米国特許第３，６８７，８０８号に開示されたもの、Concise Encyclopedia Of Polymer Science And Engineering, pages 858-859, Kroschwitz, J. I., ed. John Wiley & Sons, 1990に開示されたもの、Englisch et al., Angewandte Chemie, International Edition, 1991, 30, 613によって開示されたもの、およびSanghvi, Y. S., Chapter 15, Antisense Research and Applications, pages 289-302, Crooke, S. T. and Lebleu, B., ed., CRC Press, 1993によって開示されたものが挙げられる。これらの特定の核酸塩基は、本発明のオリゴヌクレオチドの結合親和性を増加させるために特に有用である。これらには、５−置換ピリミジン、６−アザピリミジンならびに２−アミノプロピルアデニン、５−プロピニルウラシルおよび５−プロピニルシトシンを含めたＮ−２、Ｎ−６およびＯ−６置換プリンが挙げられる。５−メチルシトシン置換は、核酸二重鎖の安定性を０．６〜１．２℃増加させることが示され（同上、２７６〜２７８頁）、現在好ましい塩基置換であるが、なおさらに２’−メトキシエチル糖改変と組合せた場合に、特に好ましい。
【０１０４】
特定の上記改変核酸塩基に加えて、他の改変核酸塩基の調製に関係する代表的な米国特許には、非限定的に、上記の米国特許第３，６８７，８０８号に加えて、米国特許第５，１３４，０６６号；第５，４５９，２５５号；第５，５５２，５４０号；第５，５９４，１２１号および第５，５９６，０９１号が挙げられ、それらの全ては、参照により本明細書に組入れられる。
【０１０５】
特定の態様では、本発明のリガンドにコンジュゲーションしたオリゴヌクレオチドに使用されるオリゴヌクレオチドは、追加的または代替的に、一つまたは複数の置換糖部分を含んでもよい。好ましいオリゴヌクレオチドは、２’位に以下の一つを含む：ＯＨ；Ｆ；Ｏ−、Ｓ−、もしくはＮ−アルキル、Ｏ−、Ｓ−、もしくはＮ−アルケニル、またはＯ、Ｓ−もしくはＮ−アルキニル（ここで、アルキル、アルケニルおよびアルキニルは、置換または非置換のＣ１〜Ｃ１０のアルキルまたはＣ２〜Ｃ１０のアルケニルおよびアルキニルであってもよい）。特に好ましいのは、Ｏ［（ＣＨ２）ｎＯ］ｍＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＮＨ２、Ｏ（ＣＨ２）ｎＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＮＨ２、およびＯ（ＣＨ２）ｎＯＮ［（ＣＨ２）ｎＣＨ３）］２であり、ここで、ｎおよびｍは、１〜約１０である。他の好ましいオリゴヌクレオチドは、２’位に以下の一つを含む：Ｃ１〜Ｃ１０の低級アルキル、置換低級アルキル、アルカリール、アラルキル、Ｏ−アルカリールまたはＯ−アラルキル、ＳＨ、ＳＣＨ３、ＯＣＮ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＮ、ＣＦ３、ＯＣＦ３、ＳＯＣＨ３、ＳＯ２ ＣＨ３、ＯＮＯ２、ＮＯ２、Ｎ３、ＮＨ２、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルカリール、アミノアルキルアミノ、ポリアルキルアミノ、置換シリル、ＲＮＡ切断基、レポーター基、インターカレーター、オリゴヌクレオチドの薬物動態特性を改善するための基、またはオリゴヌクレオチドの薬力学特性を改善するための基、および類似の特性を有する他の置換基。好ましい改変には、２’−メトキシエトキシ［２’−Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３、２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）または２’−ＭＯＥとしても知られている］、すなわちアルコキシアルコキシ基が挙げられる。さらに好ましい改変には、１９９８年１月３０日に出願された米国特許第６，１２７，５３３号に記載されているような２’−ジメチルアミノオキシエトキシ、すなわちＯ（ＣＨ２）２ＯＮ（ＣＨ３）２基（２’−ＤＭＡＯＥとしても知られている）が挙げられ、その内容は、参照により組入れられる。
【０１０６】
他の好ましい改変には、２’−メトキシ（２’−Ｏ−ＣＨ３）、２’−アミノプロポキシ（２’−ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２）および２’−フルオロ（２’−Ｆ）が挙げられる。類似の改変を、また、オリゴヌクレオチド上の他の位置に、特に、３’末端ヌクレオチド上または２’−５’結合オリゴヌクレオチド中の糖の３’位に行ってもよい。
【０１０７】
本明細書に使用されるような「糖置換基」または「２’−置換基」という用語には、酸素原子と共にまたは酸素原子なしにリボフラノシル部分の２’位に結合した基が含まれる。糖置換基には、非限定的に、フルオロ、Ｏ−アルキル、Ｏ−アルキルアミノ、Ｏ−アルキルアルコキシ、保護されたＯ−アルキルアミノ、Ｏ−アルキルアミノアルキル、Ｏ−アルキルイミダゾールおよび式（Ｏ−アルキル）ｍのポリエーテル（式中、ｍは１〜約１０である）が挙げられる。これらのポリエーテルの中で好ましいのは、直鎖および環状ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、およびクラウンエーテルなどの（ＰＥＧ）−含有基、とりわけDelgardoら（Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems 1992, 9:249、参照によりその全体が本明細書に組入れられる）によって開示されたものである。さらなる糖の改変は、Cook（Anti-fibrosis Drug Design, 1991, 6:585-607）によって開示されている。フルオロ、Ｏ−アルキル、Ｏ−アルキルアミノ、Ｏ−アルキルイミダゾール、Ｏ−アルキルアミノアルキル、およびアルキルアミノ置換は、その全体が参照により本明細書に組入れられる「Oligomeric Compounds having Pyrimidine Nucleotide(s) with 2' and 5' Substitutions」という名称の米国特許第６，１６６，１９７号に記載されている。
【０１０８】
本発明に受け入れられる追加的な糖置換基には、２’−ＳＲおよび２’−ＮＲ２基（式中、各Ｒは、独立して水素、保護基または置換もしくは非置換のアルキル、アルケニル、もしくはアルキニルである）が挙げられる。２’−ＳＲヌクレオシドは、その全体が参照により本明細書に組入れられる米国特許第５，６７０，６３３号に開示されている。２’−ＳＲモノマー出発材料の組入れは、Hammら（J. Org. Chem., 1997, 62:3415-3420）に開示されている。２’−ＮＲヌクレオシドは、Goettingen, M., J. Org. Chem., 1996, 61, 6273-6281；およびPolushin et al., Tetrahedron Lett., 1996, 37, 3227-3230によって開示されている。本発明に受け入れられるさらなる代表的な２’−置換基には、式ＩまたはＩＩ：
【０１０９】
【化１】
［式中、
Ｅは、Ｃ１−Ｃ１０アルキル、Ｎ（Ｑ３）（Ｑ４）またはＮ＝Ｃ（Ｑ３）（Ｑ４）であり；各Ｑ３およびＱ４は、独立してＨ、Ｃ１−Ｃ１０アルキル、ジアルキルアミノアルキル、窒素保護基、テザーもしくは非テザーコンジュゲート基、固体支持体へのリンカーであるか；またはＱ３およびＱ４は、一緒になって窒素保護基もしくは場合によりＮおよびＯより選択される少なくとも１個の追加的なヘテロ原子を含む環構造を形成し；
ｑ１は、１〜１０の整数であり；
ｑ２は、１〜１０の整数であり；
ｑ３は、０または１であり；
ｑ４は、０、１または２であり；
各Ｚ１、Ｚ２およびＺ３は、独立して、Ｃ４−Ｃ７シクロアルキル、Ｃ５−Ｃ１４アリールまたはＣ３−Ｃ１５ヘテロシクリルであり、ここで、該ヘテロシクリル基のヘテロ原子は、酸素、窒素および硫黄より選択され；
Ｚ４は、ＯＭ１、ＳＭ１、またはＮ（Ｍ１）２であり；各Ｍ１は、独立してＨ、Ｃ１−Ｃ８アルキル、Ｃ１−Ｃ８ハロアルキル、Ｃ（＝ＮＨ）Ｎ（Ｈ）Ｍ２、Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｈ）Ｍ２またはＯＣ（＝Ｏ）Ｎ（Ｈ）Ｍ２であり；Ｍ２は、ＨまたはＣ１−Ｃ８アルキルであり；
Ｚ５は、Ｃ１−Ｃ１０アルキル、Ｃ１−Ｃ１０ハロアルキル、Ｃ２−Ｃ１０アルケニル、Ｃ２−Ｃ１０アルキニル、Ｃ６−Ｃ１４アリール、Ｎ（Ｑ３）（Ｑ４）、ＯＱ３、ハロ、ＳＱ３またはＣＮである］の一つを有するものが挙げられる。
【０１１０】
式Ｉで示される代表的な２’−Ｏ−糖置換基は、その全体が参照により本明細書に組入れられる「Capped 2'-Oxyethoxy Oligonucleotides」という名称の米国特許第６，１７２，２０９号に開示されている。式ＩＩで示される代表的な環状２’−Ｏ−糖置換基は、その全体が参照により本明細書に組入れられる「RNA Targeted 2'-Modified Oligonucleotides that are Conformationally Preorganized」という名称の米国特許第６，２７１，３５８号に開示されている。
【０１１１】
リボシル環にＯ−置換を有する糖もまた、本発明に受け入れられる。環Ｏについての代表的な置換には、非限定的にＳ、ＣＨ２、ＣＨＦ、およびＣＦ２が挙げられる。
【０１１２】
オリゴヌクレオチドは、また、ペントフラノシル糖の代わりにシクロブチル部分などの糖模倣体を有してもよい。そのような改変された糖の調製に関する代表的な米国特許には、非限定的に、米国特許第５，３５９，０４４号；第５，４６６，７８６号；第５，５１９，１３４号；第５，５９１，７２２号；第５，５９７，９０９号；第５，６４６，２６５号および第５，７００，９２０号が挙げられ、それらの全ては、参照により本明細書に組入れられる。
【０１１３】
追加的な改変は、オリゴヌクレオチド上の他の位置に、特に３’末端ヌクレオチド上の糖の３’位に行ってもよい。例えば、本発明のリガンドにコンジュゲーションしたオリゴヌクレオチドの追加的な一改変は、オリゴヌクレオチドの活性、細胞分布または細胞取込みを高める一つまたは複数の追加的な非リガンド部分またはコンジュゲートをオリゴヌクレオチドに化学結合させることを伴う。そのような部分には、非限定的に、コレステロール部分などの脂質部分（Letsinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1989, 86, 6553）、コール酸（Manoharan et al., Bioorg. Med. Chem. Lett., 1994, 4, 1053）、チオエーテル、例えばヘキシル−Ｓ−トリチルチオール（Manoharan et al., Ann. N.Y. Acad. Sci., 1992, 660, 306; Manoharan et al., Bioorg. Med. Chem. Let., 1993, 3, 2765）、チオコレステロール（Oberhauser et al., Nucl. Acids Res., 1992, 20, 533）、脂肪族鎖、例えばドデカンジオールもしくはウンデシル残基（Saison-Behmoaras et al., EMBO J., 1991, 10, 111; Kabanov et al., FEBS Lett., 1990, 259, 327; Svinarchuk et al., Biochimie, 1993, 75, 49）、リン脂質、例えばジ−ヘキサデシル−ｒａｃ−グリセロールもしくはトリエチルアンモニウム１，２−ジ−Ｏ−ヘキサデシル−ｒａｃ−グリセロ−３−Ｈ−ホスホネート（Manoharan et al., Tetrahedron Lett., 1995, 36, 3651; Shea et al., Nucl. Acids Res., 1990, 18, 3777）、ポリアミンもしくはポリエチレングリコール鎖（Manoharan et al., Nucleosides & Nucleotides, 1995, 14, 969）、またはアダマンタン酢酸（Manoharan et al., Tetrahedron Lett., 1995, 36, 3651）、パルミチル部分（Mishra et al., Biochim. Biophys. Acta, 1995, 1264, 229）、またはオクタデシルアミンもしくはヘキシルアミノ−カルボニル−オキシコレステロール部分（Crooke et al., J. Pharmacol. Exp. Ther., 1996, 277, 923）が挙げられる。
【０１１４】
本発明には、また、オリゴヌクレオチド内の特定の位置に関して実質的にキラル純粋なオリゴヌクレオチドを使用している組成物が含まれる。実質的にキラル純粋なオリゴヌクレオチドの例には、非限定的に、少なくとも７５％ＳｐまたはＲｐのホスホロチオエート結合を有するもの（Cookら、米国特許第５，５８７，３６１号）および実質的にキラル純粋な（ＳｐまたはＲｐ）アルキルホスホネート、ホスホルアミデートまたはホスホトリエステル結合を有するもの（Cook、米国特許第５，２１２，２９５号および第５，５２１，３０２号）が挙げられる。
【０１１５】
場合によっては、オリゴヌクレオチドを、非リガンド基により改変してもよい。いくつかの非リガンド分子は、オリゴヌクレオチドの活性、細胞分布または細胞取込みを高めるためにオリゴヌクレオチドにコンジュゲーションされており、そのようなコンジュゲーションを行う手順は、科学文献から利用することができる。そのような非リガンド部分には、コレステロールなどの脂質部分（Letsinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1989, 86:6553）、コール酸（Manoharan et al., Bioorg. Med. Chem. Lett., 1994, 4:1053）、チオエーテル、例えばヘキシル−Ｓ−トリチルチオール（Manoharan et al., Ann. N.Y. Acad. Sci., 1992, 660:306; Manoharan et al., Bioorg. Med. Chem. Let., 1993, 3:2765）、チオコレステロール（Oberhauser et al., Nucl. Acids Res., 1992, 20:533）、脂肪族鎖、例えばドデカンジオールもしくはウンデシル残基（Saison-Behmoaras et al., EMBO J., 1991, 10:111; Kabanov et al., FEBS Lett., 1990, 259:327; Svinarchuk et al., Biochimie, 1993, 75:49）、リン脂質、例えばジ−ヘキサデシル−ｒａｃ−グリセロールもしくはトリエチルアンモニウム１，２−ジ−Ｏ−ヘキサデシル−ｒａｃ−グリセロ−３−Ｈ−ホスホネート（Manoharan et al., Tetrahedron Lett., 1995, 36:3651; Shea et al., Nucl. Acids Res., 1990, 18:3777）、ポリアミンもしくはポリエチレングリコール鎖（Manoharan et al., Nucleosides & Nucleotides, 1995, 14:969）、またはアダマンタン酢酸（Manoharan et al., Tetrahedron Lett., 1995, 36:3651）、パルミチル部分（Mishra et al., Biochim. Biophys. Acta, 1995, 1264:229）、またはオクタデシルアミンもしくはヘキシルアミノ−カルボニル−オキシコレステロール部分（Crooke et al., J. Pharmacol. Exp. Ther., 1996, 277:923）が含まれた。典型的なコンジュゲーションプロトコールは、配列の一つまたは複数の位置にアミノリンカーを有するオリゴヌクレオチドの合成を伴う。次に、適切なカップリング試薬または活性化試薬を使用して、コンジュゲーションされる分子とアミノ基を反応させる。コンジュゲーション反応は、まだ固体支持体に結合しているオリゴヌクレオチドと共に、または液相中の切断後のオリゴヌクレオチドのいずれかで行ってもよい。ＨＰＬＣによるオリゴヌクレオチドコンジュゲートの精製により、典型的には純粋なコンジュゲートが得られる。コレステロールコンジュゲートの使用は、そのような部分が第ＶＩＩ因子タンパク質産生部位である肝臓中の組織へのターゲティングを増加させることができることから、特に好ましい。
【０１１６】
または、コンジュゲーションされる分子は、分子に存在するアルコール基を介して、またはリン酸化されうるアルコール基を有するリンカーの結合によって、ホスホルアミダイトなどの構成要素に変換してもよい。
【０１１７】
重要なことには、リガンドにコンジュゲーションしたオリゴヌクレオチドを合成するために、これらのアプローチのそれぞれを使用することができる。アミノ連結オリゴヌクレオチドを、カップリング試薬の使用によりリガンドと直接カップリングさせてもよく、またはリガンドをＮＨＳもしくはペンタフルオロフェノレート（pentfluorophenolate）エステルとして活性化後に、カップリングさせてもよい。リガンドのホスホルアミダイトは、カルボキシル基の一つにアミノヘキサノールリンカーを結合させ、続いて末端アルコール官能基を亜リン酸エステル化することによって合成してもよい。システアミンなどの他のリンカーを、また、合成されたオリゴヌクレオチド上に存在するクロロアセチルリンカーへのコンジュゲーションに利用してもよい。
【０１１８】
本発明の主な要旨の一つは、本発明のｄｓＲＮＡ分子を含む薬学的組成物の提供である。そのような薬学的組成物は、また、本発明のｄｓＲＮＡ分子に含まれるセンス鎖またはアンチセンス鎖の少なくとも一つをコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結された調節配列を含む、そのようなｄｓＲＮＡ分子またはベクターの個別の鎖を含んでもよい。また、本明細書に定義されたｄｓＲＮＡ分子を発現するか、または含む細胞および組織を、薬学的組成物として使用してもよい。そのような細胞または組織は、特に移植アプローチに有用でありうる。これらのアプローチは、また、異種移植を含んでもよい。
【０１１９】
一態様では、本発明は、本明細書に記載されるようなｄｓＲＮＡおよび薬学的に許容される担体を含む薬学的組成物を提供する。ｄｓＲＮＡを含む薬学的組成物は、血栓塞栓障害などのＦＶＩＩ遺伝子の発現または活性に関連する疾患または障害を処置するために有用である。
【０１２０】
本発明の薬学的組成物は、ＦＶＩＩ遺伝子の発現を阻害するために十分な薬用量で投与される。本発明者らは、それらの改善された有効性のおかげで、本発明のｄｓＲＮＡを含む組成物を低薬用量で投与できることを見出した。
【０１２１】
一般に、ｄｓＲＮＡの適切な用量は、１日にレシピエントの体重１kgあたり０．０１〜５．０ミリグラム、好ましくは１日に体重１kgあたり０．１〜２００マイクログラム、さらに好ましくは１日に体重１kgあたり０．１〜１００マイクログラム、いっそうさらに好ましくは１日に体重１kgあたり１．０〜５０マイクログラム、最も好ましくは１日に体重１kgあたり１．０〜２５マイクログラムであろう。薬学的組成物は、１日１回投与してもよいか、またはｄｓＲＮＡは、２、３、４、５、６またはそれを超える分割用量として１日を通して適切な間隔で、またはさらに連続注入も利用して、投与してもよい。その場合、総１日薬用量に達するように、各分割用量に含有されるｄｓＲＮＡは、それに応じて少量でなければならない。単位薬用量は、また、例えば数日間かけてｄｓＲＮＡを徐放する従来の徐放製剤を使用して、数日間かけて送達するために配合することができる。徐放製剤は、当技術分野において周知である。この態様では、単位薬用量は、１日用量の倍数に対応する量を含有する。
【０１２２】
熟練者は、非限定的に疾患または障害の重症度、過去の処置、対象の全身の健康状態および／または年齢、ならびに存在する他の疾患を含めたある種の要因が、対象を効果的に処置するために必要な薬用量およびタイミングに影響するおそれがあることを認識しているであろう。さらに、治療有効量の組成物を用いた対象の処置には、単回処置または一連の処置が含むことができる。本発明により包含される個別のｄｓＲＮＡについての有効薬用量およびin vivo半減期の推定は、従来の方法を用いて、または適切な動物モデルを使用したin vivo試験に基づいて行うことができる。
【０１２３】
そのような化合物の毒性および治療有効性は、例えばＬＤ５０（集団の５０％に致死的な用量）およびＥＤ５０（集団の５０％に治療的に有効な用量）を決定するための、細胞培養または実験動物における標準的な薬学的手順によって決定することができる。毒性作用と治療効果の間の用量比は治療指数であり、それを比ＬＤ５０／ＥＤ５０で表わすことができる。高い治療指数を示す化合物が好ましい。
【０１２４】
細胞培養アッセイおよび動物研究から得られたデータは、ヒトに使用するための様々な薬用量の処方に使用することができる。本発明の組成物の薬用量は、好ましくはほとんどまたは全く毒性を有さない、ＥＤ５０を含む様々な循環濃度範囲にある。薬用量は、使用される剤形および利用される投与経路に依存して、この範囲内で変動しうる。本発明の方法に使用される任意の化合物について、治療有効用量は、細胞培養アッセイから最初推定することができる。化合物の、または適切であればターゲット配列のポリペプチド産物（例えば減少した濃度のポリペプチドを得る）の、循環血漿濃度範囲を達成する動物モデルで、用量を設定してもよいが、その範囲は、細胞培養で決定されたようなＩＣ５０（すなわち症状の最大半値阻害を達成する被験化合物濃度）を含む。そのような情報は、ヒトに有用な用量をより正確に決定するために使用することができる。血漿レベルは、例えば、高速液体クロマトグラフィーによって測定してもよい。
【０１２５】
前述のように個別にまたは複数でそれらを投与することに加えて、本発明のｄｓＲＮＡは、他の公知の薬剤と組合せて投与することができる。いずれにしても、投与を行う医師は、当技術分野で公知の、または本明細書に記載された標準的な有効性尺度を利用して、観察された結果に基づきｄｓＲＮＡを投与する量およびタイミングを調整することができる。
【０１２６】
本発明により包含される薬学的組成物は、非限定的に、経口経路、または静脈内、筋肉内、腹腔内、皮下、経皮、気道（エアロゾル）、鼻腔、直腸、膣および局所（口腔および舌下を含む）投与、ならびに硬膜外投与を含めた非経口経路などの、当技術分野で公知の任意の手段によって投与することができる。好ましい態様では、薬学的組成物は、注入または注射によって静脈内投与される。
【０１２７】
特に定義されない限り、本明細書に使用される全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する分野の通常の技術者に一般に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に記載されるものに類似または等価の方法および材料を本発明の実施または試験に使用することができるが、適切な方法および材料を下に記載する。本明細書に言及された全ての刊行物、特許出願、特許および他の参照は、その全体が参照により本明細書に組入れられる。相反する場合、定義を含め本明細書に基づくものとする。加えて、材料、方法および実施例は、例示だけを目的とし、限定を意図しない。
【０１２８】
上に提供された態様および本発明の項目をこれから以下の非限定的な実施例を用いて例示する。
【図面の簡単な説明】
【０１２９】
図および添付の表の説明：
【図１ａ】配列番号対２５９／２６０を含む、ＦＶＩＩ ｄｓＲＮＡ（図１ａ）および配列番号対２５３／２５４を含むｄｓＲＮＡ（図１ｂ）をＬＮＰ０１（１：１４）リポソーム製剤中に４mg/kgでｉ．ｖ．注射後のモルモットにおけるＦＶＩＩ血漿濃度に及ぼすＦＶＩＩをターゲティングするｄｓＲＮＡ（「ＦＶＩＩ ｄｓＲＮＡ」）の効果。ルシフェラーゼｄｓＲＮＡ（配列番号対４１１／４１２）／ＬＮＰ０１およびＰＢＳは、対照である。結果は個別の動物からのものである。
【図１ｂ】配列番号対２５９／２６０を含む、ＦＶＩＩ ｄｓＲＮＡ（図１ａ）および配列番号対２５３／２５４を含むｄｓＲＮＡ（図１ｂ）をＬＮＰ０１（１：１４）リポソーム製剤中に４mg/kgでｉ．ｖ．注射後のモルモットにおけるＦＶＩＩ血漿濃度に及ぼすＦＶＩＩをターゲティングするｄｓＲＮＡ（「ＦＶＩＩ ｄｓＲＮＡ」）の効果。ルシフェラーゼｄｓＲＮＡ（配列番号対４１１／４１２）／ＬＮＰ０１およびＰＢＳは、対照である。結果は個別の動物からのものである。
【図２ａ】配列番号対２５９／２６０を含むＦＶＩＩ ｄｓＲＮＡ（「ＦＶＩＩ ｓｉＲＮＡ」）をＬＮＰ０１（１：１４）リポソーム製剤中に１、２、３、４、５mg/kgでｉ．ｖ．注射後の、肝臓ＦＶＩＩ ｍＲＮＡレベル（２ａ）および血漿ＦＶＩＩレベル（２ｂ）に及ぼすモルモットにおけるＦＶＩＩ ｄｓＲＮＡの効果。全ての測定は、注射後４８時間または７２時間に行った。ｍＲＮＡの結果は、ＰＢＳ処置群に対するパーセントで表し；ＦＶＩＩチモーゲンの結果は、処置前値に対するパーセントで表す。ルシフェラーゼｄｓＲＮＡ（配列番号対４１１／４１２；「Ｌｕｃ ｓｉＲＮＡ」）／ＬＮＰ０１およびＰＢＳは対照である。統計：平均±ｓｅｍ；＊はＡＮＯＶＡ、事後Ｄｕｎｎｅｔｔ検定；‡は多重ｔ検定。
【図２ｂ】配列番号対２５９／２６０を含むＦＶＩＩ ｄｓＲＮＡ（「ＦＶＩＩ ｓｉＲＮＡ」）をＬＮＰ０１（１：１４）リポソーム製剤中に１、２、３、４、５mg/kgでｉ．ｖ．注射後の、肝臓ＦＶＩＩ ｍＲＮＡレベル（２ａ）および血漿ＦＶＩＩレベル（２ｂ）に及ぼすモルモットにおけるＦＶＩＩ ｄｓＲＮＡの効果。全ての測定は、注射後４８時間または７２時間に行った。ｍＲＮＡの結果は、ＰＢＳ処置群に対するパーセントで表し；ＦＶＩＩチモーゲンの結果は、処置前値に対するパーセントで表す。ルシフェラーゼｄｓＲＮＡ（配列番号対４１１／４１２；「Ｌｕｃ ｓｉＲＮＡ」）／ＬＮＰ０１およびＰＢＳは対照である。統計：平均±ｓｅｍ；＊はＡＮＯＶＡ、事後Ｄｕｎｎｅｔｔ検定；‡は多重ｔ検定。
【図３】配列番号対２５９／２６０を含むＦＶＩＩ ｄｓＲＮＡ（「ＦＶＩＩ ｓｉＲＮＡ」）をＬＮＰ０１（１：１４）リポソーム製剤中に１、２、３、４、５mg/kgでｉ．ｖ．注射後のモルモットのプロトロンビン時間（ＰＴ）に及ぼすＦＶＩＩ ｄｓＲＮＡの効果。ＦＶＩＩ ｄｓＲＮＡのｉ．ｖ．注射直前（ベースライン）および注射の４８時間後または７２時間後に血液を採取した。処置前値に対する延長倍率で結果を表す（平均±ｓｅｍ）。ルシフェラーゼｄｓＲＮＡ（配列番号対４１１／４１２；「Ｌｕｃ ｓｉＲＮＡ」）／ＬＮＰ０１およびＰＢＳは、対照である。
【図４】配列番号対２５９／２６０を含むＦＶＩＩ ｄｓＲＮＡ（「ＦＶＩＩ ｄｓＲＮＡ」）をＬＮＰ０１（１：１４）リポソーム製剤中に１、２、３、４、５mg/kgでｉ．ｖ．注射後の、モルモット動脈血栓症モデルにおけるＦＶＩＩ ｄｓＲＮＡの抗血栓効果。全ての測定は、麻酔した動物において注射の４８時間後または７２時間後に行った（方法参照）。結果をＰＢＳ処置群に対するパーセントで表す。ルシフェラーゼｄｓＲＮＡ（配列番号対４１１／４１２；「Ｌｕｃ ｄｓＲＮＡ」）／ＬＮＰ０１およびＰＢＳは対照である。統計：平均±ｓｅｍ；＊はＡＮＯＶＡ、事後Ｄｕｎｎｅｔｔ検定；‡は多重ｔ検定。
【図５】配列番号対２５９／２６０を含むＦＶＩＩ ｄｓＲＮＡ（「ｓｉＦＶＩＩ」）をＳＮＡＬＰ−Ｌ製剤中に１、２、３、４、５mg/kgでｉ．ｖ．注射後の、肝臓ＦＶＩＩ ｍＲＮＡレベル（ａ）および血漿ＦＶＩＩレベル（ｂ）に及ぼすモルモットにおけるＦＶＩＩ ｄｓＲＮＡの効果。ルシフェラーゼｄｓＲＮＡ（配列番号対４１１／４１２；「ｓｉＬｕｃ」）／ＳＮＡＬＰ−ＬおよびＰＢＳは対照である。
【図６ａ】ＳＮＡＬＰ−Ｌ製剤中に配列番号対２５９／２６０を含むＦＶＩＩ ｄｓＲＮＡのｉ．ｖ．注射後のモルモットにおける（ａ）外科的失血および（ｂ）爪上皮出血時間に及ぼすＦＶＩＩ ｄｓＲＮＡの効果。結果は、ＰＢＳ処置群に対する増加倍率（外科的失血）および延長倍率（上皮出血時間）で表した。全ての測定は、注射後７２時間に行った。ＳＮＡＬＰ−Ｌ製剤中のルシフェラーゼｄｓＲＮＡ（配列番号対４１１／４１２）（Ｌｕｃ ｄｓＲＮＡ）およびＰＢＳは対照である。最大９５％のＦＶＩＩのダウンレギュレーションで（０．０５mg/kg〜２mg/kgのＦＶＩＩ ｄｓＲＮＡ）、両モデルにおいて出血傾向の増加は観察されなかった。
【図６ｂ】ＳＮＡＬＰ−Ｌ製剤中に配列番号対２５９／２６０を含むＦＶＩＩ ｄｓＲＮＡのｉ．ｖ．注射後のモルモットにおける（ａ）外科的失血および（ｂ）爪上皮出血時間に及ぼすＦＶＩＩ ｄｓＲＮＡの効果。結果は、ＰＢＳ処置群に対する増加倍率（外科的失血）および延長倍率（上皮出血時間）で表した。全ての測定は、注射後７２時間に行った。ＳＮＡＬＰ−Ｌ製剤中のルシフェラーゼｄｓＲＮＡ（配列番号対４１１／４１２）（Ｌｕｃ ｄｓＲＮＡ）およびＰＢＳは対照である。最大９５％のＦＶＩＩのダウンレギュレーションで（０．０５mg/kg〜２mg/kgのＦＶＩＩ ｄｓＲＮＡ）、両モデルにおいて出血傾向の増加は観察されなかった。
【図７】−血漿中ＦＶＩＩ活性とＰＴ延長の間の相関。ＦＶＩＩ ｄｓＲＮＡのｉｖ注射後のＦＶＩＩ活性の減少（ＬＮＰ０１およびＳＮＡＬＰ−Ｌ中に製剤化されたＦＶＩＩ ｄｓＲＮＡからのデータを合同したもの）は、ＦＶＩＩ依存性凝固パラメーターＰＴとよく相関した。
【図８】ルシフェラーゼｄｓＲＮＡ（配列番号対４１１／４１２）またはＦＶＩＩ ｄｓＲＮＡ（配列番号１９／２０）の単回ｉｖボーラス注射の投薬前ならびに２４時間後および４８時間後に発色アッセイによって３回測定された、カニクイザル血漿中のＦＶＩＩ活性。ｄｓＲＮＡに関する用量を各群についてmg/kgで示す。Ｎ＝２匹の雌性カニクイザル。各個別のサルの投薬前ＦＶＩＩ活性値の平均に対して値を標準化し、標準偏差を示すエラーバーを付ける。
【図９】ＳＮＡＬＰ製剤中のルシフェラーゼｄｓＲＮＡ（ｓｉＬＵＣ）（配列番号対４１１／４１２）またはＳＮＡＬＰ製剤中のＦＶＩＩ ｄｓＲＮＡ（ｓｉＦＶＩＩ）（配列番号１９／２０）の単回ｉｖボーラス注射の投薬前ならびに２４時間後および４８時間後に３回測定された、カニクイザル血漿中のプロトロンビン時間（ＰＴ）。ｄｓＲＮＡに関する用量を各群についてmg/kgで示す。Ｎ＝２匹の雌性カニクイザル。各個別のサルの投薬前ＰＴの平均に対して標準化した変化倍率として値を示し、標準偏差を示すエラーバーを付ける。
【図１０】ＳＮＡＬＰ製剤中のルシフェラーゼｄｓＲＮＡ（ｓｉＬＵＣ）（配列番号対４１１／４１２）またはＳＮＡＬＰ製剤中のＦＶＩＩ ｄｓＲＮＡ（ｓｉＦＶＩＩ）（配列番号１９／２０）の単回ｉｖボーラス注射の投薬前ならびに２４時間後および４８時間後に発色アッセイによって３回測定された、カニクイザル血漿中のＦＶＩＩ活性。ｄｓＲＮＡに関する用量を各群についてmg/kgで示した。Ｎ＝２匹の雄性カニクイザル、１mg/kgのＦＶＩＩ ｄｓＲＮＡ群（ｎ＝３匹の雄性カニクイザル）および３mg/kgのルシフェラーゼｄｓＲＮＡ群（ｎ＝２匹の雌性カニクイザル）を例外とする。１００％に設定した各個別のサルの投薬前ＦＶＩＩ活性値の平均に対して値を標準化した。エラーバーは、各群におけるサルの最小／最大値を示す。
【図１１】ＳＮＡＬＰ製剤中のルシフェラーゼｄｓＲＮＡ（ｓｉＬＵＣ）（配列番号対４１１／４１２）またはＳＮＡＬＰ製剤中のＦＶＩＩ ｄｓＲＮＡ（ｓｉＦＶＩＩ）（配列番号１９／２０）の単回ｉｖボーラス注射の投薬前ならびに２４時間後および４８時間後に３回測定されたカニクイザル血漿中のプロトロンビン時間（ＰＴ）。ｄｓＲＮＡに関する用量を各群についてmg/kgで示す。Ｎ＝２匹の雄性カニクイザル、１mg/kgのＦＶＩＩ ｄｓＲＮＡ群（ｎ＝３匹の雄性カニクイザル）および３mg/kgのルシフェラーゼｄｓＲＮＡ群（ｎ＝２匹の雌性カニクイザル）を例外とする。１に設定した各個別のサルの投薬前ＰＴ値の平均に対して標準化したＰＴ変化倍率として値を示す。エラーバーは、各群におけるサルの最小／最大値を示す。
【図１２】ＳＮＡＬＰ製剤中のルシフェラーゼｄｓＲＮＡ（ｓｉＬＵＣ）（配列番号対４１１／４１２）またはＳＮＡＬＰ製剤中のＦＶＩＩ ｄｓＲＮＡ（ｓｉＦＶＩＩ）（配列番号１９／２０）の単回ｉｖボーラス注射前後に経時的に、カニクイザル血清中のＦＶＩＩ活性を追跡した。ＦＶＩＩ活性は、投薬前および投薬後の表示時点に３回発色アッセイによって測定した。ｄｓＲＮＡに関する用量は、各動物についてmg/kgで表し、数字は、試験における個別の動物の番号を示す。注射した日に１００％に設定した各動物の投薬前の平均に対して曲線を標準化する。
【図１３】カニクイザル血漿中のプロトロンビン時間（ＰＴ）を、ＳＮＡＬＰ製剤中のルシフェラーゼｄｓＲＮＡ（ｓｉＬＵＣ）（配列番号対４１１／４１２）またはＳＮＡＬＰ製剤中のＦＶＩＩ ｄｓＲＮＡ（ｓｉＦＶＩＩ）（配列番号１９／２０）の単回ｉｖボーラス注射前後に経時的に追跡した。ＰＴは、投薬前および投薬後の表示時点に３回測定した。ｄｓＲＮＡに関する用量は、各動物についてmg/kgで示し、数字は、試験における個別の動物の番号を表示する。値はＰＴの変化倍率として示し、曲線は、注射の日に１に設定した各動物の投薬前の平均に対して標準化する。
【図１４】カニクイザル血漿中のＦＶＩＩ活性を、ＳＮＡＬＰ製剤中のＦＶＩＩ ｄｓＲＮＡ（ｓｉＦＶＩＩ）（配列番号１９／２０）を３mg/kgで反復ｉｖボーラス注射前後に経時的に追跡した。ＦＶＩＩ活性を、投薬前および投薬後の表示時点に３回発色アッセイによって測定した。最初に注射した日に１００％に設定した各動物の投薬前の平均に対して曲線を標準化する。
【図１５】カニクイザル血漿におけるプロトロンビン時間（ＰＴ）を、ＳＮＡＬＰ製剤中のＦＶＩＩ ｄｓＲＮＡ（ｓｉＦＶＩＩ）（配列番号１９／２０）の反復ｉｖボーラス注射前後に経時的に追跡した。３mg/kgを投薬前および投薬後の表示時点に３回ＰＴを測定した。値をＰＴ変化倍率として示し、曲線を、注射した日に１に設定した各動物の投薬前の平均に対して標準化する。
【図１６】オフターゲット配列のサイレンシングに及ぼす、配列番号対１３／１４を含むＦＶＩＩ ｄｓＲＮＡの効果。ＦＶＩＩ ｍＲＮＡの１９塩基長ターゲット部位（「ｏｎ」）またはin silicoで予測されたオフターゲット配列（「ｏｆｆ１」〜「ｏｆｆ１０」；「ｏｆｆ１」〜「ｏｆｆ８」はアンチセンス鎖オフターゲットであり、「ｏｆｆ９」〜「ｏｆｆ１０」はセンス鎖オフターゲットである）のいずれかを表わすデュアルルシフェラーゼ構築物を発現しているＣＯＳ７細胞に５０nMのＦＶＩＩ ｄｓＲＮＡをトランスフェクション後のウミシイタケルシフェラーゼタンパク質の発現。完全にマッチするオフターゲットｄｓＲＮＡは、対応するターゲット部位の機能的サイレンシングについての陽性対照である。
【図１７】オフターゲット配列のサイレンシングに及ぼす、配列番号対１９／２０を含むＦＶＩＩ ｄｓＲＮＡの効果。ＦＶＩＩ ｍＲＮＡの１９塩基長ターゲット部位（「ｏｎ」）またはインシリコで予測されたオフターゲット配列（「ｏｆｆ１」〜「ｏｆｆ１７」；「ｏｆｆ１」〜「ｏｆｆ１４」はアンチセンス鎖オフターゲットであり、「ｏｆｆ１５」〜「ｏｆｆ１７」はセンス鎖オフターゲットである）のいずれかを表わすデュアルルシフェラーゼ構築物を発現しているＣＯＳ７細胞に５０nMのＦＶＩＩ ｄｓＲＮＡをトランスフェクション後のウミシイタケルシフェラーゼタンパク質の発現。完全にマッチするオフターゲットｄｓＲＮＡは、対応するターゲット部位の機能的サイレンシングについての陽性対照である。ｏｆｆ１１と同じ１０個のヌクレオチドを上流および下流に有する、第ＶＩＩ因子ｍＲＮＡのターゲット部位をクローニングし、機能的ターゲット部位を作製した。
【図１８】オフターゲット配列のサイレンシングに及ぼす、配列番号対１１／１２を含むＦＶＩＩ ｄｓＲＮＡの効果。ＦＶＩＩ ｍＲＮＡの１９塩基長ターゲット部位（「ｏｎ」）またはin silicoで予測されたオフターゲット配列（「ｏｆｆ１」〜「ｏｆｆ１６」；「ｏｆｆ１」〜「ｏｆｆ１３」はアンチセンス鎖オフターゲットであり、「ｏｆｆ１４」〜「ｏｆｆ１６」は、センス鎖オフターゲットである）のいずれかを表わすデュアルルシフェラーゼ構築物を発現しているＣＯＳ７細胞に５０nMのＦＶＩＩ ｄｓＲＮＡをトランスフェクション後のウミシイタケルシフェラーゼタンパク質の発現。完全にマッチするオフターゲットｄｓＲＮＡは、対応するターゲット部位の機能的サイレンシングについての陽性対照である。配列番号対１９／２０についてｏｆｆ１１と同じ１０個のヌクレオチドを上流および下流に有する第ＶＩＩ因子ｍＲＮＡのターゲット部位をクローニングし、機能的ターゲット部位を作製した。
【０１３０】
表１ − ヒト第ＶＩＩ因子遺伝子をターゲティングするｄｓＲＮＡ。大文字はＲＮＡヌクレオチドを表し、小文字「ｃ」、「ｇ」、「ａ」および「ｕ」は、２’−Ｏ−メチル−改変ヌクレオチドを表し、「ｓ」はホスホロチオエートを、そして「ｄＴ」はデオキシチミジンを表す。
表２ − ヒト第ＶＩＩ因子をターゲティングするｄｓＲＮＡの特徴付け：Ｈｕｈ７細胞における用量反応についての活性試験。ＩＣ５０：５０％阻害濃度。
表３ − ヒト第ＶＩＩ因子をターゲティングするｄｓＲＮＡの特徴づけ：安定性およびサイトカイン誘導。ｔ１／２：実施例において同義の鎖半減期、ＰＢＭＣ：ヒト末梢血単核細胞。
表４ − モルモット第ＶＩＩ因子遺伝子をターゲティングするｄｓＲＮＡ。大文字はＲＮＡヌクレオチドを表し、小文字「ｃ」、「ｇ」、「ａ」および「ｕ」は、２’−Ｏ−メチル−改変ヌクレオチドを表し、「ｓ」はホスホロチオエートを、そして「ｄＴ」はデオキシチミジンを表す。「ｆ」は、前述のヌクレオチドの２’−フルオロ改変を表す。
表５ − モルモット第ＶＩＩ因子をターゲティングするｄｓＲＮＡの特徴づけ。ＩＣ５０：５０％阻害濃度、ＰＢＭＣ：ヒト末梢血単核細胞。
表６ − ヒト第ＶＩＩ因子遺伝子をターゲティングするｄｓＲＮＡ。大文字はＲＮＡヌクレオチドを表し、「Ｔ」はデオキシチミジンを表す。
表７ − モルモット第ＶＩＩ因子遺伝子をターゲティングするｄｓＲＮＡ。大文字はＲＮＡヌクレオチドを表し、「Ｔ」はデオキシチミジンを表す。
表８ − 配列番号対１３／１４を含む、ヒトＦＶＩＩをターゲティングするｄｓＲＮＡの選択されたオフターゲット。
表９ − 配列番号対１９／２０を含む、ヒトＦＶＩＩをターゲティングするｄｓＲＮＡの選択されたオフターゲット。
表１０ − 配列番号対１１／１２を含む、ヒトＦＶＩＩをターゲティングするｄｓＲＮＡの選択されたオフターゲット。
【０１３１】
実施例
治療用途のｄｓＲＮＡの同定
ヒト第ＶＩＩ因子を特異的にターゲティングする治療用途のｄｓＲＮＡを同定するために、ｄｓＲＮＡの設計を実施した。まず、ヒト（Homo sapiens）第ＶＩＩ因子の既知のｍＲＮＡ配列（配列番号４０６および配列番号４０７として記載されたＮＭ＿０１９６１６およびＮＭ＿０００１３１．３）をコンピューター解析によって調査し、これらの配列の間で交差反応性のＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）作用物質を生成する１９個のヌクレオチドの相同配列を同定した。
【０１３２】
ＲＮＡｉ作用物質の同定にあたり、ｆａｓｔＡアルゴリズムを用いて、ヒトＲｅｆＳｅｑデータベース（リリース２５）（広範なヒトトランスクリプトームを表わすと仮定した）における任意の他の配列に対して少なくとも２個のミスマッチを有する１９塩基長配列に限って選択を行った。
【０１３３】
１６匹のサルからＲＴ−ＰＣＲ増幅後に、カニクイザル（Macaca fascicularis）第ＶＩＩ因子遺伝子のＣＤＳ（コード配列）を配列決定した。この配列をＮＣＢＩ ＥＳＴ／ＥＭＢＬ ＢＢ８８５０５９ ＥＳＴ（配列番号４０８）の逆相補体と一緒に使用して、カニクイザル第ＶＩＩ因子についての代表的なコンセンサス配列（配列番号４０９参照）を作製させた。
【０１３４】
ヒトに加えてカニクイザルの第ＶＩＩ因子に交差反応性のｄｓＲＮＡを、治療用途に最も好ましいと決定した。４個以上の連続するＧ’（ポリ−Ｇ配列）を有する全ての配列を合成から除外した。
【０１３５】
このように同定された配列は、表１および６におけるＲＮＡｉ作用物質を合成するための基礎とした。
【０１３６】
in vivo概念実証研究のためのｄｓＲＮＡの同定
in vivo概念実証実験のための、モルモット（Cavia porcellus）第ＶＩＩ因子に加えて、前述のin vitroスクリーニング目的のヒト第ＶＩＩ因子をターゲティングするｄｓＲＮＡを同定するために、ｄｓＲＮＡの設計を実施した。まず、モルモット第ＶＩＩ因子について予測される転写物ＥＮＳＥＭＢＬ（ＥＮＳＣＰＯＴ０００００００５３５３、配列番号４１０）およびヒト第ＶＩＩ因子のどちらも既知のｍＲＮＡ配列（配列番号４０６および配列番号４０７として記載されたＮＭ＿０１９６１６およびＮＭ＿０００１３１．３）を、コンピューター解析によって調査し、これらの配列の間で交差反応性のＲＮＡｉ作用物質を生成する１９個のヌクレオチドの相同配列を同定した。
【０１３７】
４個以上の連続するＧ（ポリ−Ｇ配列）を有する全ての配列を合成から除外した。このように同定された配列は、表４および７におけるＲＮＡｉ作用物質を合成するための基礎とした。
【０１３８】
ｄｓＲＮＡの合成
本明細書において試薬の入手源を具体的に示さない場合、そのような試薬は、分子生物学適用基準の品質／純度の分子生物学用試薬を供給する任意の供給業者から得ることができる。
【０１３９】
Expedite 8909合成装置（Applied Biosystems、Applera Deutschland GmbH, Darmstadt, Germany）および固体支持体として多孔質ガラス（ＣＰＧ、５００Å、Proligo Biochemie GmbH, Hamburg, Germany）を使用して、１μmolスケールの固相合成によって１本鎖ＲＮＡを作製した。ＲＮＡおよび２’−Ｏ−メチルヌクレオチドを有するＲＮＡを、それぞれ対応するホスホルアミダイトおよび２’−Ｏ−メチルホスホルアミダイトを用いた固相合成に（Proligo Biochemie GmbH, Hamburg, Germany）によって作製した。Current protocols in nucleic acid chemistry, Beaucage, S.L. et al. (Edrs.), John Wiley & Sons, Inc., New York, NY, USAに記載されているような標準的なヌクレオシドホスホルアミダイト化学反応を用いて、オリゴリボヌクレオチド鎖の配列内の選択された部位にこれらの構成要素を導入した。ヨウ素酸化剤溶液をBeaucage試薬（Chruachem Ltd, Glasgow, UK）のアセトニトリル溶液（１％）に交換することによって、ホスホロチオエート結合を導入した。さらなる補助試薬をMallinckrodt Baker（Griesheim, Germany）から得た。
【０１４０】
確立された手順により、陰イオン交換ＨＰＬＣによる粗オリゴリボヌクレオチドの脱保護および精製を実施した。分光光度計（DU 640B, Beckman Coulter GmbH, Unterschleissheim, Germany）を使用して波長２６０nmでそれぞれのＲＮＡの溶液のＵＶ吸収によって収量および濃度を決定した。アニーリング緩衝液（２０mMリン酸ナトリウム、ｐＨ６．８；１００mM塩化ナトリウム）中で等モルの相補鎖溶液を混合し、水浴中、８５〜９０℃で３分間加熱し、３〜４時間室温に冷却することによって二本鎖ＲＮＡを作製した。アニーリングしたＲＮＡ溶液を使用まで−２０℃で保存した。
【０１４１】
活性試験
上記第ＶＩＩ因子−ｄｓＲＮＡの活性をＨｕｈ７細胞で試験した。
【０１４２】
第ＶＩＩ因子特異的ｄｓＲＮＡと共にインキュベーションした細胞から得られた総ｍＲＮＡ中の分岐ＤＮＡによる第ＶＩＩ因子ｍＲＮＡの定量のために培養Ｈｕｈ７細胞を使用した。
【０１４３】
Ｈｕｈ７細胞をAmerican Type Culture Collection（Rockville, Md.、カタログ番号HB-8065）から入手し、５％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）（Gibco Invitrogen、カタログ番号16250-078）、１％ペニシリン／ストレプトマイシン（Gibco Invitrogen、カタログ番号15140-122）を含有するように補充したフェノールレッド不含ＤＭＥＭ／Ｆ−１２（Gibco Invitrogen, Germany、カタログ番号11039-021）中、３７℃の加湿インキュベーター（Heraeus HERAcell, Kendro Laboratory Products, Langenselbold, Germany）中で５％ ＣＯ２雰囲気中で培養した。
【０１４４】
細胞の接種およびｄｓＲＮＡのトランスフェクションを同時に行った。ｄｓＲＮＡをトランスフェクションするために、９６ウェルプレートにＨｕｈ７細胞を２．５×１０４個細胞／ウェルの密度で蒔いた。製造業者によって記載されたように、リポフェクトアミン２０００（Invitrogen GmbH, Karlsruhe, Germany、カタログ番号11668-019）を用いてｄｓＲＮＡのトランスフェクションを実施した。最初の単回投与実験において、ｄｓＲＮＡをＨｕｈ７細胞に３０nMの濃度でトランスフェクションした。各データ点を４連実施で決定した。２回の独立した実験を行った。３０nMの単用量選別により７０％を超えるｍＲＮＡノックダウンを示す最も有効なｄｓＲＮＡを用量反応曲線によってさらに特徴づけた。用量反応曲線に関して、上記単用量選別について記載されたようにトランスフェクションを行ったが、ｄｓＲＮＡ濃度（nM）は、以下：２４、６、１．５、０．３７５、０．０９３８、０．０２３４、０．００５９、０．００１５、０．０００４および０．０００１nMとした。トランスフェクション後に細胞を加湿インキュベーター（Heraeus GmbH, Hanau, Germany）中で３７℃および５％ ＣＯ２で２４時間インキュベーションした。第ＶＩＩ因子ｍＲＮＡを測定するために、ｍＲＮＡのｂＤＮＡ定量にはより高感度のQuantiGene 2.0 Assay Kit（Panomics, Fremont, Calif., USA、カタログ番号QS0011）を使用し、一方、ＧＡＰ−ＤＨ ｍＲＮＡの測定にはQuantiGene 1.0 Assay Kit（Panomics, Fremont, Calif., USA、カタログ番号：QG0004）を使用した。トランスフェクションされたＨｕｈ７細胞を回収し、製造業者が勧める手順により５３℃で溶解させた。５０μlの溶解液をそれぞれヒト第ＶＩＩ因子ｍＲＮＡまたはモルモット第ＶＩＩ因子に特異的なプローブセット（プローブセットの配列は下記参照）と共にインキュベーションし、QuantiGeneについての製造業者のプロトコールに従い処理した。ＧＡＰ−ＤＨ ｍＲＮＡの測定のために、ＧＡＰ−ＤＨ特異的プローブセットを用いて１０μlの細胞溶解液を分析した。Victor2-Light（Perkin Elmer, Wiesbaden, Germany）でＲＬＵ（相対発光量）として化学発光を測定し、ヒト第ＶＩＩ因子プローブセットで得られた値を、各ウェルについてのそれぞれのヒトＧＡＰＤＨ値に対して標準化した。無関係の対照ｄｓＲＮＡを陰性対照として使用した。表２および５に阻害データを示す。
【０１４５】
【表１】
【０１４６】
【表２】
【０１４７】
ｄｓＲＮＡの安定性
各１本鎖の半減期を測定することによってヒト血清またはカニクイザル血漿のいずれかを用いたin vitroアッセイでｄｓＲＮＡの安定性を決定した。
【０１４８】
３０μｌのヒト血清またはカニクイザル血漿（Sigma Aldrich）と混合した３μlの５０μM ｄｓＲＮＡ試料を用いて、各時点について３連で測定を実施した。混合物を３７℃で０分間、３０分間、１時間、３時間、６時間、２４時間、または４８時間のいずれかの時間インキュベーションした。非特異的分解についての対照として、ｄｓＲＮＡを３０μlの１×ＰＢＳ（ｐＨ６．８）と共に４８時間インキュベーションした。４μlのプロテイナーゼＫ（２０mg/ml）、２５μlの「Tissue and Cell Lysis Solution」(Epicentre)および３８μlのMillipore水を６５℃で３０分間添加して反応を停止させた。その後、１４００rpmで８分間、０．２μmの９６ウェルフィルタープレートで試料を遠心濾過し、５５μlのMillipore水で２回洗浄し、再度遠心濾過した。
【０１４９】
１本鎖の分離および残りの全長産物（ＦＬＰ）の分析のために、溶出液Ａとして１０％ ＡＣＮ中の２０mM Ｎａ３ＰＯ４（ｐＨ＝１１）および溶出液Ｂについて溶出液Ａ中の１Ｍ ＮａＢｒを使用して、変性条件でイオン交換Dionex Summit HPLCに試料を流した。
【０１５０】
以下の勾配を加えた：
【０１５１】
【表３】
【０１５２】
各注入について、クロマトグラムをDionex Chromeleon 6.60 HPLCソフトウェアで自動的に積分し、必要に応じて手動で調整した。全てのピーク面積を内部標準（ＩＳ）のピークに対して補正し、ｔ＝０分でのインキュベーションに対して標準化した。ピーク下面積および残留ＦＬＰを各一本鎖および３連実施について別々計算した。３連実施についてＦＬＰの半分が分解した平均時点［ｈ］により鎖半減期（ｔ１／２）を定義した。結果を表３および５に示す。
【０１５３】
サイトカイン誘導
in vitroＰＢＭＣアッセイにおけるＩＮＦ−αおよびＴＮＦ−αの放出を測定することによってｄｓＲＮＡの潜在的サイトカイン誘導を決定した。
【０１５４】
ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、トランスフェクションした日に２人のドナーの血液バフィーコートからFicoll遠心分離によって単離した。細胞にｄｓＲＮＡを４連でトランスフェクションし、Gene Porter 2（ＧＰ２）またはＤＯＴＡＰのいずれかをＯｐｔｉ−ＭＥＭ中で１３０nMの終濃度で使用して３７℃で２４時間培養した。このアッセイにおいてＩＮＦ−αおよびＴＮＦ−αを誘導することが知られているｄｓＲＮＡ配列およびＣｐＧオリゴを陽性対照として使用した。サイトカイン誘導にトランスフェクション試薬を必要としない、化学コンジュゲーションしたｄｓＲＮＡまたはＣｐＧオリゴヌクレオチドを培地中に５００nMの濃度でインキュベーションした。インキュベーションの終了時に、４連で培養上清をプールした。
【０１５５】
次に、これらのプールした上清中のＩＮＦ−αおよびＴＮＦ−αを、標準的なサンドイッチＥＬＩＳＡによってプール１個あたり２個のデータ点で測定した。サイトカイン誘導度は、０〜５の評点を利用して陽性対照と比較して表し、５は最大誘導を示した。結果を表３及び５に示す。
【０１５６】
ＦＶＩＩをターゲティングするｄｓＲＮＡのin vivo効果（モルモット）
抗血栓効果
新規な抗血栓薬のin vivo効力を評価するために以前に開発された検証済みモルモット動脈血栓症モデルで上記ＦＶＩＩ ｄｓＲＮＡの活性を試験した（Himber J. et al., Thromb Haemost. (2001); 85:475-481）。
【０１５７】
雄性モルモット（３５０〜４５０ｇ、ＣＲＬ：（ＨＡ）ＢＲ、Charles River(Germany）を、ケタミン−ＨＣｌ ９０mg/kgおよびキシラジン２％ １０mg/kgによるｉ．ｍ．誘導に続く連続ガス麻酔によって麻酔した。吸入器を介し、麻酔薬を供給し、同時に過剰の蒸気を除去するダブル吸入マスクからＯ２／空気４０：６０中に１〜３Vol％のイソフルランを注入した（Provet AG, Switzerland）。体温をサーモスタットで３８℃に保った。
【０１５８】
モルモットを仰臥位にし、採血用に右大腿動脈にカテーテル（TriCath In 22G、０．８mm×３０mm, Codan Steritex ApS, Espergaerde, Denmark）を留置した。右頸動脈を解剖して露出させ、Transit Time流量計モジュール（TS420, Transonic Systems Inc. Ithaca, NY,USA）に連結された血管周囲超音波流量プローブ（Transonic 0.7 PSB 232）を頸動脈周辺に配置し、血流速度をモニタリングした。頸動脈血流速度をGraphtec LinearレコーダーVII（Model WR 3101, Hugo Sachs, March-Hugstetten, Germany）で記録した。
【０１５９】
５〜１５分間の血流を安定させた後で、ゴム被覆鉗子を用いて、解剖された頸動脈の１mm部分を１０秒間ピッチングすることによって流量プローブから２mm遠位に内皮下層の損傷を起こした。損傷後に、血流の緩徐な減少が起こり、完全な血管閉塞が起こった。流量がゼロに達した場合は、損傷領域の頸動脈を軽く揺り動かし、閉塞性血栓を除去し、流量を回復させ、周期的流量変化（ＣＦＶ）を生じさせた。ＣＦＶが８分間観察されなかった場合、最初の損傷部位でピンチングを繰り返した。ＣＦＶが起こらなかった場合は、同じ手順を８分毎に繰り返した。最終的に、ＣＦＶが起こるために必要なピンチの回数を４０分の観察時間にわたり計数した。このプロトコールを用いて、各ＣＦＶの平均周期は、対照動物において約３〜５分/サイクルであった。ピンチの回数に対するＣＦＶ数の比として血栓症指数を計算した。
【０１６０】
血管壁損傷の４８または７２時間前に、麻酔したモルモットの頸静脈に上記ＦＶＩＩ ｄｓＲＮＡを注射した。採取した血液を１０８mMクエン酸ナトリウム溶液に（１：１０の容量で）加えてから、薬物の注射を開始し、血管壁を損傷させた。
【０１６１】
出血時間および失血
以前に記載されたように爪上皮出血時間（ＮＣＢＴ）の試験を行った（Himber J. et al., Thromb Haemost. (1997) 78:1142-1149）。機械的損傷によって誘導した動脈血栓症の試験を行ったのと同じ動物でＮＣＢＴを評価した。麻酔したモルモットにおいて、爪切りを用いて前肢の爪上皮頂端に標準的な切断を行い、足を３７℃の水面と接触させたままにし、水中に流血させた。出血時間は、出血が完全に停止した上皮切断後の時間として定義した。２分以内に再度出血した場合は、出血時間を初回出血時間と合計した。４０分の実験的血栓症時間の直後にこの操作を同時に３回行った。結果を対照群の値に対する延長倍率で表す。
【０１６２】
外科的失血（ＳＢＬ）もまた、ＮＣＢＴの直後に同じ動物から測定した。麻酔したモルモットを背臥位にし、頸を剃毛し、外科用メス（AESCULAP BB 524）で耳から肩甲骨まで正中切開（長さ４０〜５０mm、深さ５mm）を行った。切開の直後に、傷に縦にあてた歯科用ガーゼロール（No.1-14 111 00, φ８mm、長さ４０mm、Internationale Verbandstoff Fabrik, Neuhausen, Switzerland）に血液を染みこませた。歯科用ロールを傷に５分間あてる前後に秤量し、重量差を５分あたりの失血量（mg）と定義した。１時間評価した総失血量は、１時間の測定時間内に傷にあてられた１２個の歯科用ロールに染みこんだ血液の合計量に対応する。
【０１６３】
続いてペントバルビタール（１００mg/kg）のｉ．ｖ．注射により動物を安楽死させ、肝臓を素早く取り出した。肝臓１ｇを液体窒素中でショック凍結し、下記のようにＦＶＩＩ ｍＲＮＡを測定した。
【０１６４】
血漿のアッセイ
市販の発色アッセイ（BIOPHEN FVII kit; ref 221304, HYPHEN BioMed, France）を使用して、モルモット血漿中のＦＶＩＩレベルを決定した。処置前レベルに対するパーセントでＦＶＩＩレベルを表した。凝固傾向および出血傾向のマーカーとして使用されるプロトロンビン時間（ＰＴ）は、活性化因子としてヒトリコンビナント−ヒト組織因子（Dade Innovin, Dade Behring, Marburg, Germany）を使用して決定し、活性化部分トロンボプラスチン時間（ａＰＴＴ）は、活性化因子としてリン脂質を使用することにより決定した（Dade Actin, Dade Behring, Marburg, Germany）。ACL3000plus Coagulation Systems Analyzerを使用してＰＴおよびａＰＴＴを測定し、処置前値に対する延長倍率で表す。Hitachi 912 Automatic Analyser（Boehringer Mannheim, Germany）およびALT Kit No. 10851132216、AST(Asat/Got) Kit No. 10851124216, Roche Diagnostics, Switzerland）を使用してアラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）およびアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）を測定した。
【０１６５】
血球数、血小板およびヘマトクリットを測定するために、採取した血液試料を、ＥＤＴＡの中にも加えた（Cobas Helios VET, F. Hoffmann-La Roche, Basel, Switzerland）。
【０１６６】
以前に記載されたように、ｄｓＲＮＡをＬＮＰ０１に入れて製剤化した（Akinc, A. et al., Nature Biotech 2008, 26(5):561-9）。加えて、ＳＮＡＬＰ−Ｌに入れて製剤化されたｄｓＲＮＡを試験した（Judge A.D. et al., J. Clinic. Invest. 2009, 119(3):661-73）。
【０１６７】
【表４】
【０１６８】
【表５】
【０１６９】
モルモット肝臓組織中のＦＶＩＩ ｍＲＮＡの測定：
QuantiGene 1.0 branched DNA (bDNA) Assay Kit（Panomics, Fremont, Calif., USA、カタログ番号：QG0004）を使用して肝臓組織からのＦＶＩＩ ｍＲＮＡの測定を行った。
【０１７０】
剖検時に１〜２ｇの肝臓組織を液体窒素中で急速凍結した。乳鉢および乳棒を用いて凍結組織をドライアイス上で粉末化した。冷却した１．５ml反応チューブに１５〜２５mgの組織を移し、Lysis Mixtureを１：３でMilliQ水に予備希釈したもの１mlおよび３．３μl プロテイナーゼＫ（５０μg/μl）を添加し、３０〜５０％出力の超音波処理（HD2070, Bandelin, Berlin, Germany）を数秒間行うことによって組織を溶解した。分析まで溶解物を−８０℃で保存した。ｍＲＮＡ分析のために、溶解物を解凍し、１０００rpmおよび６５℃で１５分間プロテイナーゼＫで消化した（Thermomixer comfort, Eppendorf, Hamburg, Germany）。ＦＶＩＩおよびＧＡＰＤＨのｍＲＮＡレベルをQuantiGene 1.0 bDNA Assay Kit試薬を使用して製造業者の推奨により決定した。２０μlの溶解物およびモルモット（cavia porcellus）ＦＶＩＩプローブセットを使用してＦＶＩＩの発現を分析し、ＧＡＰＤＨの発現を、４０μlの溶解物およびモルモットと交差反応することが示されたラット（rattus norwegicus）プローブセット（プローブセットの配列は下記参照）を使用して分析した。アッセイ終了時の化学ルミネセンスシグナルは、Victor 2 Light luminescence counter（Perkin Elmer, Wiesbaden, Germany）で相対発光量（ＲＬＵ）として測定した。ＦＶＩＩシグナルを同じ溶解物のＧＡＰＤＨシグナルで除算し、ＧＡＰＤＨに対して標準化したＦＶＩＩの発現として値を示した。
【０１７１】
例として（図１）、ＬＮＰ０１リポソーム製剤中に配列番号対２５９／２６０を含むＦＶＩＩ ｄｓＲＮＡおよび配列番号対２５３／２５４を含むＦＶＩＩ ｄｓＲＮＡ［脂質：ｄｓＲＮＡ比(w/w)１４：１、９６％の封入率、サイズ８０〜８５nm］を４mg/kgでモルモット頸静脈に注射後に、ＦＶＩＩの血漿レベルの経時変化を３および５日間追跡した。最大のＦＶＩＩノックダウンは、注射後２４時間で達成され、少なくとも７２時間継続した。
【０１７２】
モルモット動脈血栓症モデルにおいて、配列番号対２５９／２６０を含むＦＶＩＩ ｄｓＲＮＡ／ＬＮＰ０１（１：１４）を１、２、３、４、５mg/kg、単回ｉ．ｖ．投与で試験した。リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）およびルシフェラーゼｄｓＲＮＡ（配列番号対４１１／４１２）／ＬＮＰ０１（１：１４）を対照として使用した。肝臓のＦＶＩＩ ｍＲＮＡレベル（図２ａ）および血漿ＦＶＩＩチモーゲンレベル（図２ｂ）は、用量依存的に減少し、一方ＰＴは延長した（図３）。
【０１７３】
血漿のＦＶＩＩの８０％を超えるノックダウンは、モルモット動脈血栓症モデルにおいて血栓形成の有意な阻害に関連した。観察されたＩＣ５０は、配列番号対２５９／２６０を含むＦＶＩＩ ｄｓＲＮＡ／ＬＮＰ０１（１：１４）で１〜２mg/kgであった。配列番号対２５９／２６０を含む３、４、５mg/kgのＦＶＩＩ ｄｓＲＮＡ／ＬＮＰ０１（１：１４）でＦＶＩＩ血漿ノックダウン（約９５％）と肝臓ｍＲＮＡのノックダウン（約８０％）とが類似していることは、抗血栓効果が類似していることに関連した（血栓形成の約９０％阻害）（図４）。
【０１７４】
・ １mg/kgは、肝臓においてＦＶＩＩ ｍＲＮＡの５６％のノックダウン、血漿においてＦＶＩＩの６２％のノックダウンを誘導し、ＰＴを１．３倍延長し、トロンビン産生（ピーク高）を４％阻害し、血栓形成を約２６％阻害した。
・ ２mg/kgは、肝臓においてＦＶＩＩ ｍＲＮＡの７３％のノックダウン、血漿においてＦＶＩＩの８４％のノックダウンを誘導し、ＰＴを１．６倍延長し、トロンビン産生（ピーク高）を２２％阻害し、血栓形成を約６２％阻害した。
・ ３mg/kgは、肝臓においてＦＶＩＩ ｍＲＮＡの８１％のノックダウン、血漿においてＦＶＩＩの９３％のノックダウンを誘導し、ＰＴを２．０倍延長し、トロンビン産生（ピーク高）を２７％阻害し、血栓形成を約８２％阻害した。
・ ４mg/kgは、肝臓においてＦＶＩＩ ｍＲＮＡの８０％のノックダウン、血漿においてＦＶＩＩの９３％のノックダウンを誘導し、ＰＴを２．３倍延長し、トロンビン産生（ピーク高）を４３％阻害し、血栓形成を約９１％阻害した。
・ ５mg/kgは、肝臓においてＦＶＩＩ ｍＲＮＡの８０％のノックダウン、血漿においてＦＶＩＩの９５％のノックダウンを誘導し、ＰＴを２．４倍延長し、トロンビン産生（ピーク高）を４０％阻害し、血栓形成を約９２％阻害した。
【０１７５】
爪上皮出血時間および外科的失血によって評価した出血は、配列番号対２５９／２６０の被験ＦＶＩＩ ｄｓＲＮＡ／ＬＮＰ０１（１：１４）の用量（１、２、３、４、５mg/kg）で有意には影響されず、これは、血漿中で正常な止血が最大約９５％のＦＶＩＩノックダウンまで維持されたことを示唆している。
【０１７６】
図５は、配列番号対２５９／２６０を含むＦＶＩＩ ｄｓＲＮＡをＳＮＡＬＰ−Ｌに入れて製剤化した場合の、肝臓のＦＶＩＩ ｍＲＮＡレベル（図５ａ）および血漿のＦＶＩＩ チモーゲンレベル（図５ｂ）を示す。
【０１７７】
図６は、ＳＮＡＬＰ−Ｌ製剤中に配列番号対２５９／２６０を含むＦＶＩＩ ｄｓＲＮＡ（ｓｉＦＶＩＩ）をｉ．ｖ．注射後のモルモットにおける（ａ）外科的失血および（ｂ）爪上皮出血時間に及ぼすＦＶＩＩ ｄｓＲＮＡの効果を示す。
【０１７８】
図７は、血漿のＦＶＩＩ活性とＰＴ延長との相関を示す。ＦＶＩＩ活性は、ＦＶＩＩ ｄｓＲＮＡのｉｖ注射後に減少し（ＬＮＰ０１およびＳＮＡＬＰ−Ｌ中で製剤化したＦＶＩＩ ｄｓＲＮＡからの合併データ）、それは、ＦＶＩＩ依存性凝固パラメーターＰＴとよく相関する。
【０１７９】
ＦＶＩＩをターゲティングするｄｓＲＮＡのin vivo効果（Macaca fascicularis）
以下の研究のために、等張緩衝液中の脂質粒子中のｄｓＲＮＡの滅菌製剤（「安定核酸−脂質粒子」（ＳＮＡＬＰ）技法、Tekmira Pharmaceuticals Corporation, Canada）を使用した。
【０１８０】
サル（Macaca fascicularis）における単回用量設定研究
０．３mg/kg〜１０mg/kgのＦＶＩＩ ｄｓＲＮＡ（配列番号１９／２０）の単回ｉｖボーラス注射をサルに行った。対照群には、脂質粒子によって起こる作用とＲＮＡｉ介在性作用を識別するために、１０mg/kgの高用量のルシフェラーゼｄｓＲＮＡ（配列番号４１１／４１２）を投与した。注射の４８時間後にサルを屠殺した。
【０１８１】
血漿および肝臓において薬理効果をモニタリングした。注射の２４時間後および４８時間後の血漿のＦＶＩＩ活性およびＰＴ値を測定した。注射の４８時間後の屠殺時に肝臓のＦＶＩＩ ｍＲＮＡレベルを測定した。
【０１８２】
ＦＶＩＩ ｄｓＲＮＡ（配列番号１９／２０）処置群は、１mg/kgのｄｓＲＮＡでＦＶＩＩ活性の約５０％の用量依存的減少を示し、３mg/kgのＦＶＩＩ ｄｓＲＮＡ（配列番号１９／２０）でｉｖ注射の２４および４８時間後にＦＶＩＩ活性が＞９０％の減少に達した（図８）。６mg/kgおよび１０mg/kgの用量で、ＦＶＩＩ活性の減少は、３mg/kgのＦＶＩＩ ｄｓＲＮＡ（配列番号１９／２０）で見られたものと同様であった。ＰＴの延長は、３mg/kgから観察された（図９）。ＰＴにおける追加的な延長は、用量が６mg/kgおよび１０mg/kgに増加したときに観察された。ＰＴの延長は、３mg/kgで１．２倍から１０mg/kgで１．４倍までの間であった。
【０１８３】
有効時間および反復投薬を評価するためのサルにおける探索研究
ＦＶＩＩ ｄｓＲＮＡ（配列番号１９／２０）を使用して雄性カニクイザルにおける単回および反復投与を研究した。研究の目的は、ＦＶＩＩ ｄｓＲＮＡ（配列番号１９／２０）の薬理効果の持続時間および動態についてさらに洞察することに加えて、多回投与の安全性および有効性を評価することであった。
【０１８４】
サルにＦＶＩＩ ｄｓＲＮＡ（配列番号１９／２０）を単回または反復投与した。単回投与の目的は、効果の持続時間を検討することであった。単回投与群のサルに３mg/kgおよび６mg/kgのＦＶＩＩ ｄｓＲＮＡ（配列番号１９／２０）のボーラス注射を行った。６mg/kgのルシフェラーゼｄｓＲＮＡ（配列番号４１１／４１２）群をｄｓＲＮＡ配列依存性サイレンシングに関する対照とするために、そして脂質粒子関連作用を評価するために使用した。反復投薬の目的は、用量加算性を研究すること、および脂質粒子の毒性の問題または薬理効果の過剰発現（exaggerated pharmacology）による潜在的出血問題のいずれかにより定義されるような最大耐用量を同定することであった。２種の反復投薬群のサルに１週間に１回ＦＶＩＩ ｄｓＲＮＡ（配列番号１９／２０）のボーラス注射を３mg/kgおよび１０mg/kgで３回行うことを計画した。
【０１８５】
上記サルの単回投与研究における結果のフォローアップとして、低用量での脂質粒子介在性効果の特徴をさらに調べるために３mg/kgのルシフェラーゼｄｓＲＮＡ（配列番号４１１／４１２）の雌性サル群を含めた。研究の間および屠殺時の複数の時点で採取した血漿試料から薬理効果（ＦＶＩＩ活性およびＰＴ）をモニタリングした。
【０１８６】
２４時間および４８時間でのＦＶＩＩ活性についてまとめたデータは、上記単回投与研究からのデータに類似していた（図１０）。ＦＶＩＩ ｄｓＲＮＡ（配列番号１９／２０）は、１mg/kg用量で約５０％、３、６および１０mg/kg用量で約８５％〜９５％、ＦＶＩＩ活性を減少させた。３および６mg/kgのルシフェラーゼｄｓＲＮＡ対照群から、ｄｓＲＮＡ脂質粒子が２４時間でＦＶＩＩ活性に一過性の非特異的な影響を及ぼすことが確認された。４８時間で値は正常に戻った。したがって、３および６mg/kgのＦＶＩＩ ｄｓＲＮＡ（配列番号１９／２０）群において４８時間に認められた活性は、完全にＦＶＩＩ ｄｓＲＮＡの薬理活性に原因があるとすることができる。
【０１８７】
ＰＴ値を図１１に示す。１．２倍のＰＴ延長が３mg/kgで観察され、１０mg/kgでは用量依存的に１．７倍に増加した。
【０１８８】
サルにおける薬理効果の持続時間は、１か月超にわたり追跡した血漿のＦＶＩＩ活性レベルからの外挿に基づくと、約６週間であった（図１２）。ＦＶＩＩ活性の全減少は約１週間持続し、その後ＦＶＩＩ活性が徐々に回復した。類似のサイレンシング動態が３および６mg/kgで観察され、これは、デポー効果がなかったこと、および単なるＦＶＩＩ活性の全阻害に必要な用量よりも高い用量で与えられたＦＶＩＩ ｄｓＲＮＡが、必ずしも薬理効果を延長しないことを示唆している。
【０１８９】
ＰＴ延長は、４週間認められ、処置後１週間で最高値となり、続いて２〜４週間目に直線的に減少した（図１３）。データは、このＦＶＩＩ依存性バイオマーカーに及ぼす効果を認めるために、＞７０％のＦＶＩＩ活性減少が必要であったことを示している。
【０１９０】
３mg/kgで１週間に１回の多回投与を図１４に示す。定常状態の状況を調査するために、そして効力の過剰発現および有毒作用を避けるために、２回目と３回目の投与の間隔を１週間から２週間に広げた。ＦＶＩＩの活性データは、定常状態の間にＦＶＩＩレベルを固定することが実行可能であったことを示した。
【０１９１】
８０％〜９５％のＦＶＩＩ活性減少を維持するために、３mg/kgで２または３週間間隔で投与することが最適と思われた。ＰＴ値は、１．２〜１．８倍の延長に保つことができる。
【０１９２】
８０％〜９５％のＦＶＩＩ活性減少を維持するために、３mg/kgで２または３週間の間隔で投与することが最適と思われた。ＰＴ値を、１．２〜１．８倍の延長時間に保つことができ（図１５）、注射の数日後に顕著なＰＴピークが認められた。これらのピークは、おそらくＦＶＩＩ ｄｓＲＮＡの薬理活性と、脂質粒子からの非特異的作用との相加的作用が原因であった。
【０１９３】
ヒトＦＶＩＩをターゲティングするｄｓＲＮＡのin vitroのオフターゲット分析
ｐｓｉＣＨＥＣＫ（商標）ベクター（Promega）は、ＲＮＡｉ活性をモニタリングするための二つのレポーター遺伝子、すなわち合成版ウミシイタケルシフェラーゼ（ｈＲｌｕｃ）遺伝子および合成ホタルルシフェラーゼ遺伝子（ｈｌｕｃ＋）を有する。ホタルルシフェラーゼ遺伝子は、ホタルルシフェラーゼの発現に対するウミシイタケルシフェラーゼの発現の変化の標準化を可能にする。ウミシイタケおよびホタルルシフェラーゼの活性を、Dual-Glo（登録商標）Luciferase Assay System（Promega）を使用して測定した。本発明のｄｓＲＮＡのオフターゲット効果を分析するためにｐｓｉＣＨＥＣＫ（商標）ベクターを使用するために、予測されるオフターゲット配列を、合成ウミシイタケルシフェラーゼ遺伝子およびその翻訳終止コドンの３’に位置するマルチクローニング領域にクローニングした。クローニング後に、そのベクターを哺乳動物細胞系にトランスフェクションし、続いてＦＶＩＩをターゲティングするｄｓＲＮＡを共トランスフェクションする。ｄｓＲＮＡが予測されるオフターゲットのターゲットＲＮＡに対して効果的にＲＮＡｉ過程を開始するならば、融合されたウミシイタケターゲット遺伝子のｍＲＮＡ配列は分解し、ウミシイタケルシフェラーゼ活性の減少を招くであろう。
【０１９４】
in silicoオフターゲット予測
本発明のｄｓＲＮＡに相同な配列についてヒトゲノムをコンピューター解析により検索した。本発明のｄｓＲＮＡと５個未満のミスマッチを示した相同配列を、可能性のあるオフターゲットとして定義した。in vitroのオフターゲット分析のために選択されたオフターゲットを、添付の表８、９および１０に示す。
【０１９５】
予測されたオフターゲット配列を有するｐｓｉＣＨＥＣＫベクターの産生
ｓｉＲＮＡ有力候補についてのオフターゲット効果を分析するための戦略は、予測されたオフターゲット部位をＸｈｏＩおよびＮｏｔＩ制限部位を介してｐｓｉＣＨＥＣＫ２ベクターシステム（Dual Glo（登録商標）-system, Promega, Braunschweig, Germany、カタログ番号C8021）にクローニングすることを含む。したがって、ｓｉＲＮＡターゲット部位の上流および下流の１０個のヌクレオチドをオフターゲット部位から伸長させる。さらに、フラグメントの挿入を制限分析により確認するために、ＮｈｅＩ制限部位を組込む。１本鎖オリゴヌクレオチドを標準プロトコール（例えばMetabionによるプロトコール）によりMastercycler（Eppendorf）でアニーリングさせ、次に予めＸｈｏＩおよびＮｏｔＩで消化しておいたｐｓｉＣＨＥＣＫ（Promega）にクローニングした。挿入の有無はＮｈｅＩを用いた制限分析に続く陽性クローンの配列決定により検証した。配列決定のための選択されたプライマー（配列番号７６１）は、ベクターｐｓｉＣＨＥＣＫの１４０１位に結合する。クローン産生後に、配列決定によりプラスミドを分析し、次に細胞培養実験に使用した。
【０１９６】
ｄｓＲＮＡのオフターゲット効果の分析
細胞培養：
Ｃｏｓ７細胞は、Deutsche Sammlung fur Mikroorganismen und Zellkulturen（ＤＳＭＺ、Braunschweig, Germany、カタログ番号ACC-60）から得られ、１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）（Biochrom AG, Berlin, Germany、カタログ番号S0115）、ペニシリン１００U/ml、およびストレプトマイシン１００μg/ml（Biochrom AG, Berlin, Germany、カタログ番号A2213）および２mM Ｌ−グルタミン（Biochrom AG, Berlin, Germany、カタログ番号K0283）さらに１２μg/ml重炭酸ナトリウムを含有するように補充されたＤＭＥＭ（Biochrom AG, Berlin, Germany、カタログ番号F0435）に入れて、加湿インキュベーター（Heraeus HERAcell, Kendro Laboratory Products, Langenselbold, Germany）中、３７℃で５％ ＣＯ２雰囲気中で培養した。
【０１９７】
トランスフェクションおよびルシフェラーゼの定量：
プラスミドのトランスフェクションのために、Ｃｏｓ−７細胞を９６ウェルプレート中、２．２５×１０４個細胞／ウェルの密度で蒔き、そのままトランスフェクションした。プラスミドのトランスフェクションは、リポフェクトアミン2000（Invitrogen GmbH, Karlsruhe, Germany、カタログ番号11668-019）を５０ng/ウェルの濃度で用いて製造業者の説明に従い実施した。トランスフェクションの４時間後に、培地を捨て、新鮮培地を添加した。ここで、上記リポフェクトアミン2000を使用してｓｉＲＮＡを５０nMの濃度でトランスフェクションした。ｓｉＲＮＡのトランスフェクションの２４時間後に、製造業者（Dual-GloTM Luciferase Assay system, Promega, Mannheim, Germany、カタログ番号E2980）の説明に従いルシフェラーゼ試薬を使用して細胞を溶解させ、製造業者のプロトコールによりホタルおよびウミシイタケルシフェラーゼを定量した。ウミシイタケルシフェラーゼのタンパク質レベルをホタルルシフェラーゼのレベルに対して標準化した。各ｓｉＲＮＡについて１２個の個別のデータ点を３回の独立した実験で収集した。全てのターゲット部位に関係しないｓｉＲＮＡを、ｓｉＲＮＡ処理細胞におけるウミシイタケルシフェラーゼタンパク質の相対レベルを決定するための対照として使用した。
【０１９８】
結果を図１６、１７および１８に示す。
【０１９９】
【表６】
【０２００】
【表７】
【０２０１】
【表８】
【０２０２】
【表９】
【０２０３】
【表１０】
【０２０４】
【表１１】
【０２０５】
【表１２】
【０２０６】
【表１３】
【０２０７】
【表１４】
【０２０８】
【表１５】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）、および第ＶＩＩ因子遺伝子の発現を阻害するためのＲＮＡ干渉を仲介することにおける、特に肝臓での第ＶＩＩ因子チモーゲンの発現阻害における、続いて第ＶＩＩ因子チモーゲンの血漿レベルを低下させることにおけるそれらの使用に関する。さらに、動脈および静脈血栓症のような第ＶＩＩａ、ＩＸａ、Ｘａ、ＸＩＩａ凝固因子、トロンビンの活性化に関連する広範囲の血栓塞栓性疾患／障害、炎症、動脈硬化症ならびにガンを治療／予防するための該ｄｓＲＮＡの使用は、本発明の一部である。
【０００２】
第ＶＩＩ因子（ＦＶＩＩ）は、血液凝固の外因性経路の開始に関与するビタミンＫ依存性糖タンパク質である。ＦＶＩＩは、肝臓で合成され、主に血漿中で不活性一本鎖チモーゲンとして循環する。ＦＶＩＩは、血管損傷により露出した組織因子（ＴＦ）に結合すると、１個のペプチド結合の切断によって切断されてその２本鎖活性型（ＦＶＩＩａ）となり、２０kDaの軽鎖および３０kDaの重鎖を生じる。ＦＶＩＩａの軽鎖は、二つの上皮増殖因子様（ＥＧＦ−１、ＥＧＦ−２）ドメインおよびγ−カルボキシグルタミン酸（Ｇｌａ）ドメインを含み、Ｇｌａドメインは、カルシウムを結合可能にし、分子内にコンフォメーション変化を起こし、新規なエピトープを露出させ、それが続いてＴＦに結合するのを容易にする。重鎖は、他の凝固のセリンプロテアーゼに構造的に相同な触媒ドメインを有する。ＴＦ：ＦＶＩＩａ複合体は、今度はタンパク質限定加水分解性切断によってＦＩＸおよびＦＸを活性化し、トロンビンの形成および最終的にフィブリンクロットに導く。
【０００３】
ヒトＦＶＩＩ遺伝子は、肝細胞に発現しているが、ＦＶＩＩ ｍＲＮＡの定常状態レベルは非常に低い。ヒトＦＶＩＩの完全配列は、全長ｃＤＮＡクローンから推論されている（Hagen F. S., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1986) 83:2412-2416）。高レベルのＦＶＩＩは、心血管疾患の発生についての独立したリスク因子に関連している。高コレステロール血症の患者では、ＦＶＩＩレベルは、Ｃ反応性タンパク質（ＣＲＰ）またはサイトカイン（ＩＬ−６）などの炎症促進性可変因子と独立して相関した。しかし、全ての研究がＦＶＩＩを冠動脈心疾患における独立リスク因子として確認したわけではない（Lowe G. D. O. et al., Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. (2004) 24:1529-1534）。
【０００４】
ＴＦ：ＦＶＩＩａ複合体は、凝固と炎症反応の間の複雑なクロストークに重大な役割を果たす。それが凝固に果たす十分に確立された役割に加えて、ＴＦ：ＦＶＩＩａ複合体は、炎症、血管形成などの細胞過程ならびにガンおよびアテローム性動脈硬化症の病態生理に影響するシグナル伝達などの細胞内変化もまた誘導する。
【０００５】
動物モデルにおける概念実証実験から、ＦＶＩＩａの特異的阻害またはＦＶＩＩチモーゲンの血漿中濃度の減少が、出血傾向を高めずに抗血栓および抗炎症効果を招くことが実証されている（Xu H., et al., J. Pathol. (2006) 210:488-496）。敗血症モデルにおいて、エンドトキシン誘導性凝固活性化の阻害、炎症性メディエーターであるインターロイキン−６（Ｉｌ−６）、ＩＬ−８の発現減少、および死亡率の抑制が、活性部位を不活性化されたＦＶＩＩａ（Taylor F. et al., Blood. (1998) 91:1609-1615）またはＦＶＩＩ／ＶＩＩａに対するモノクローナルＦａｂフラグメント（Biemond B. J. et al., Thromb. Haemost. (1995) 73:223-230）のいずれかで処置されたサルにおいて観察された。活性部位を不活性化されたＦＶＩＩａは、また、実験的急性膵炎において、肺、回腸および結腸における好中球の組織浸潤を抑制し、ＩＬ−６およびマクロファージ炎症性タンパク質−２（ＭＩＰ−２）などの炎症マーカーを減少させて、強力な抗炎症性を示した（Andersson E. et al., Scand. J. Gastroenterology (2007) 42: 765-770）。
【０００６】
さらに、マウスへのＴＦ：ＦＶＩＩａ複合体の関節内注射により、滑膜組織への単球浸潤が誘導され、続いて軟骨および骨が破壊される。ＴＦ突然変異マウスでは関節炎の重症度が有意に低下したが、これは、関節リウマチ患者の関節の関節内にしばしば見られるＴＦ／ＦＶＩＩ複合体が、慢性破壊性関節炎の誘導と進行の両方に重要な成分であることを示している。（Yang Y. H. et al., Am. J. Pathol. (2004) 164:109-117）。
【０００７】
抗ＴＦモノクローナル抗体（Mueller B. M. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1992) 89:11832-11836）、組織因子経路阻害剤（Amirkhosravi A. et al., Semin. Thromb. Hemost. (2007) 33:643-652）または特異的ＴＦ ｓｉＲＮＡによるＴＦ発現のノックダウンのいずれかによるＴＦ：ＦＶＩＩａ複合体の遮断により、実験的肺転移が阻害され（Amarzguioui M. et al., Clin. Cancer Res. (2006) 12:4055-4061）、これは、ＴＦ：ＦＶＩＩａ複合体が、腫瘍の成長および転移の促進にも関与することを示唆し、さらに、ＴＦ：ＦＶＩＩａ複合体の阻害が、ガンの処置のための臨床的に実行可能な戦略であることを示唆している。
【０００８】
血栓および炎症障害の処置における著しい進歩にかかわらず、例えば冠動脈疾患、アテローム性動脈硬化症、関節リウマチ、ガン／転移のような増殖障害の現在の理解によると、抗血栓性と抗炎症性の両方を有する治療的に活性で安全な物質が、標準的な治療法より改良されたものであることが示唆される。
【０００９】
二本鎖ＲＮＡ分子（ｄｓＲＮＡ）は、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）として知られている高度に保存された調節メカニズムで遺伝子発現を遮断することが示されている。本発明は、ＦＶＩＩの発現を選択的かつ効率的に減少させることができる二本鎖リボ核酸分子（ｄｓＲＮＡ）を提供する。ＦＶＩＩ ＲＮＡｉの使用は、ＦＶＩＩａ、ＴＦ−ＦＶＩＩａ複合体、ＩＸａ、Ｘａ、ＸＩＩａおよびトロンビンのような凝固因子、ＦＶＩＩａおよびＴＦによって直接または間接的に活性化される、サイトカインおよびＣ反応性タンパク質（ＣＲＰ）のような炎症因子の形成に関連する疾患／障害の治療的および／または予防的処置のための方法を提供する。特定の疾患／障害状態には、動脈および静脈血栓症、深部静脈血栓症、不安定狭心症、急性冠動脈症候群、心筋梗塞、心房細動による発作、肺塞栓、脳塞栓、腎塞栓、重症肢虚血、急性肢虚血、播種性血管内凝固（例えば細菌、ウイルス疾患、ガン、敗血症、多発外傷によって起こるもの）、壊疽、鎌状赤血球症、結節性動脈周囲炎（periateritis nodosale）、川崎病、バージャー病、抗リン脂質症候群、非限定的に急性または慢性アテローム性動脈硬化症、関節リウマチ、ガン／転移のような増殖障害、膵炎を含めた炎症反応の治療的および／または予防的処置が含まれ、その方法は、ヒトまたは動物にＦＶＩＩをターゲティングするｄｓＲＮＡを投与することを含む。本発明の化合物は、また、血液が体内の医療機器（例えば機械および生体人工心臓弁、血管ステント、血管カテーテル、代用血管）または体外の医療機器（例えば血液透析、人工心肺）に接触している場合の血栓症の予防に使用することができる。
【００１０】
本発明は、ＦＶＩＩ遺伝子をサイレンシングすることによって肝細胞でのＦＶＩＩの発現を選択的かつ効率的に減少させ、そのことにより肝臓で合成されるＦＶＩＩタンパク質のレベルを減少させ、最終的に血漿中のＦＶＩＩ活性を低下させることのできる二本鎖リボ核酸分子（ｄｓＲＮＡ）を提供する。好ましい一態様では、記載されたｄｓＲＮＡ分子は、ＦＶＩＩ遺伝子の発現を少なくとも７０％阻害することができる。本発明は、また、ＦＶＩＩ遺伝子の発現によって引き起こされる上記を含めた病状および疾患を処置するために、肝臓をＦＶＩＩ ｄｓＲＮＡで特異的にターゲティングするための組成物および方法を提供する。
【００１１】
一態様では、本発明は、第ＶＩＩ因子の発現、特に哺乳動物またはヒト第ＶＩＩ因子遺伝子の発現を阻害するための二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）分子を提供する。ｄｓＲＮＡは、相互に相補的な少なくとも二つの配列を含む。ｄｓＲＮＡは、第１の配列を含むセンス鎖を含み、アンチセンス鎖は第２の配列を含むことがあり、添付の表１、４、６および７における特異的ｄｓＲＮＡ対の提供も参照されたい。一態様では、センス鎖は、ＦＶＩＩをコードするｍＲＮＡの少なくとも一部に少なくとも９０％の同一性を有する配列を含む。該配列は、アンチセンス鎖に対するセンス鎖の相補的領域に位置する。好ましい一態様では、ｄｓＲＮＡは、特にヒト第ＶＩＩ因子遺伝子をターゲティングし、なお別の好ましい態様では、ｄｓＲＮＡは、モルモット（Cavia porcellus）またはラット（Rattus norvegicus）第ＶＩＩ因子遺伝子をターゲティングする。
【００１２】
一態様では、アンチセンス鎖は、該第ＶＩＩ因子遺伝子をコードするｍＲＮＡの少なくとも一部に実質的に相補的なヌクレオチド配列を含み、相補的領域は、最も好ましくは３０ヌクレオチド長未満である。さらに、本明細書に記載の本発明のｄｓ分子の長さ（二重鎖長）は、約１６〜３０個のヌクレオチドの範囲、特に約１８〜２８個のヌクレオチドの範囲であることが好ましい。本発明に関して特に有用なのは、約１９、２０、２１、２２、２３または２４個のヌクレオチドの二重鎖長である。最も好ましいのは、１９、２１または２３個のヌクレオチドの二重鎖ストレッチである。そのｄｓＲＮＡは、第ＶＩＩ因子遺伝子を発現している細胞と接触すると、in vitroで第ＶＩＩ因子遺伝子の発現を少なくとも７０％阻害する。
【００１３】
選択されたｄｓＲＮＡ分子を添付の表６および７に提供するが、配列番号４１３、４１４、４１５、４１６、４１７、４１８、４１９、４２０、４２１、４２２、４２３、４２４、４２５、４２６、４２７、４２８、４２９、４３０、４３１、４３２、４３３、４３４、４３５、４３６、４３７および４３８のヌクレオチド第１〜１９位を含むｄｓＲＮＡ分子が好ましい。
【００１４】
一態様では、該ｄｓＲＮＡ分子は、１〜５ヌクレオチド長、好ましくは１〜２ヌクレオチド長の３’オーバーハングを有するアンチセンス鎖を含む。好ましくは、アンチセンス鎖の該オーバーハングは、ウラシル、または第ＶＩＩ因子をコードするｍＲＮＡに少なくとも９０％相補的なヌクレオチドを含む。
【００１５】
別の好ましい態様では、該ｄｓＲＮＡ分子は、１〜５ヌクレオチド長、好ましくは１〜２ヌクレオチド長の３’オーバーハングを有するセンス鎖を含む。好ましくは、センス鎖の該オーバーハングは、ウラシル、または第ＶＩＩ因子をコードするｍＲＮＡに少なくとも９０％同一なヌクレオチドを含む。
【００１６】
別の好ましい態様では、該ｄｓＲＮＡ分子は、１〜５ヌクレオチド長、好ましくは１〜２ヌクレオチド長の３’オーバーハングを有するセンス鎖、および１〜５ヌクレオチド長、好ましくは１〜２ヌクレオチド長の３’オーバーハングを有するアンチセンス鎖を含む。好ましくは、センス鎖の該オーバーハングは、ウラシル、または第ＶＩＩ因子をコードするｍＲＮＡに少なくとも９０％同一なヌクレオチド含み、アンチセンス鎖の該オーバーハングは、ウラシル、または第ＶＩＩ因子をコードするｍＲＮＡに少なくとも９０％相補的なヌクレオチドを含む。
【００１７】
好ましいｄｓＲＮＡ分子において、とりわけ好ましくはセンス鎖は、配列番号４１３、４１５、４１７、４１９、４２１、４２３、４２５、４２７、４２９、４３１、４３３、４３５、および４３７に示される核酸配列から成る群より選択され、アンチセンス鎖は、配列番号４１４、４１６、４１８、４２０、４２２、４２４、４２６、４２８、４３０、４３２、４３４、４３６および４３８に示される核酸配列から成る群より選択される。したがって、本発明のｄｓＲＮＡ分子は、とりわけ、配列番号４１３／４１４、４１５／４１６、４１７／４１８、４１９／４２０、４２１／４２２、４２３／４２４、４２５／４２６、４２７／４２８、４２９／４３０、４３１／４３２、４３３／４３４、４３５／４３６および４３７／４３８から成る群より選択される配列対を含んでもよい。本明細書に提供される特異的ｄｓＲＮＡ分子に関連して、配列番号の対は、添付の表にも示されるような、対応するセンス鎖およびアンチセンス鎖配列（５’から３’）に関する。
【００１８】
また、改変されたｄｓＲＮＡ分子が本明細書に提供され、特に添付の表１および４に開示され、本発明の改変されたｄｓＲＮＡ分子の説明に役立つ実例を提供している。
【００１９】
表２および３は、本発明の特定のｄｓＲＮＡ分子の選択的な生物学的、臨床的および薬学的に関連するパラメーターを提供するものである。
【００２０】
本明細書上記に指摘したように、表１は、本発明の改変されたｄｓＲＮＡｓの説明に役立つ実例を提供する（対応するセンス鎖およびアンチセンス鎖をこの表に提供する）。なお、本発明のｄｓＲＮＡのこれらの構成成分の例示的改変は、改変例として本明細書に提供される。これらのｄｓＲＮＡ（およびその構成成分）のさらなる改変もまた、本発明の一態様として含まれる。対応する例を、本発明のさらに詳細な説明に提供する。
【００２１】
添付の表４および７は、また、本発明に関連して有用なさらなるｓｉＲＮＡ分子／ｄｓＲＮＡを提供し、ここで、表４は、表７に示されるような本発明の改変されたｓｉＲＮＡ分子／ｄｓＲＮＡ分子の、特定の生物学的および／または臨床的に関連する驚くべき特徴を提供する。これらのＲＮＡ分子は、例示的なヌクレオチド改変を含む。
【００２２】
最も好ましいｄｓＲＮＡ分子は、添付の表１および４に提供され、ここで、とりわけ好ましくは、センス鎖は、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３および２５に示される核酸配列から成る群より選択され、アンチセンス鎖は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４および２６に示される核酸配列から成る群より選択される。したがって、本発明のｄｓＲＮＡ分子は、とりわけ、配列番号１／２、３／４、５／６、７／８、９／１０、１１／１２、１３／１４、１５／１６、１７／１８、１９／２０、２１／２２、２３／２４および２５／２６から成る群より選択される配列対を含んでもよい。最も好ましいｄｓＲＮＡ分子は、配列対１９／２０および１１／１２を含む。本明細書に提供される特異的ｄｓＲＮＡ分子に関連して、配列番号の対は、添付および包含される表にも示されるような、対応するセンスおよびアンチセンス鎖配列（５’から３’）に関する。
【００２３】
一態様では、本発明のｄｓＲＮＡ分子は、センスおよびアンチセンス鎖から成り、ここで、該鎖の少なくとも一方は、少なくとも２４時間の半減期を有する。別の態様では、本発明のｄｓＲＮＡ分子は、非免疫刺激性であり、例えばin vitroでＩＮＦ−αおよびＴＮＦ−αを刺激しない。
【００２４】
本発明のｄｓＲＮＡ分子は、天然ヌクレオチドから成ることがあるか、または２’−Ｏ−メチル改変ヌクレオチド、５’−ホスホロチオエート基を含むヌクレオチド、およびコレステリル誘導体またはドデカン酸ビスデシルアミド基に連結された末端ヌクレオチドなどの少なくとも１個の改変ヌクレオチドから成ることがある。２’改変ヌクレオチドは、本発明のｄｓＲＮＡ分子がin vivoで、例えば医学的状況で使用される場合に、特定の免疫刺激因子またはサイトカインが抑制されるというさらなる利点を有しうる。または、そして非限定的に、改変ヌクレオチドは、２’−デオキシ−２’−フルオロ改変ヌクレオチド、２’−デオキシ改変ヌクレオチド、ロックされたヌクレオチド、脱塩基ヌクレオチド、２’−アミノ改変ヌクレオチド、２’−アルキル改変ヌクレオチド、モルホリノヌクレオチド、ホスホルアミデート、および非天然塩基を含むヌクレオチドの群より選択してもよい。好ましい一態様では、ｄｓＲＮＡ分子は、以下の改変ヌクレオチド：２’−Ｏ−メチル改変ヌクレオチド、５’−ホスホロチオエート基を含むヌクレオチド、およびデオキシチミジンの少なくとも一つを含む。改変ヌクレオチドを含む好ましいｄｓＲＮＡ分子を表１および４に示す。
【００２５】
本発明は、また、本発明の少なくとも一つのｄｓＲＮＡを含む細胞を提供する。細胞は、好ましくはヒト細胞などの哺乳動物細胞である。さらに、本明細書に定義されるｄｓＲＮＡ分子を含む組織および／または非ヒト生物もまた、本発明に含まれ、ここで、該非ヒト生物は、特に研究目的にまたは研究ツールとして、例えば薬物の試験にも有用である。
【００２６】
さらに、本発明は、以下の段階：
（ａ）本明細書において定義の二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）を細胞、組織または生物に導入すること；
（ｂ）段階（ａ）で作製した該細胞、組織または生物を、ＦＶＩＩ遺伝子のｍＲＮＡ転写物が分解されるために十分な時間維持することによって、所与の細胞におけるＦＶＩＩ遺伝子の発現を阻害すること
を含む、細胞、組織または生物におけるＦＶＩＩ遺伝子、特に哺乳動物またはヒトＦＶＩＩ遺伝子の発現を阻害するための方法に関する。
【００２７】
本発明は、また、本発明のｄｓＲＮＡを含む薬学的組成物に関する。これらの薬学的組成物は、特に、細胞、組織または生物におけるＦＶＩＩ遺伝子の発現の阻害に有用である。本発明の一つまたは複数のｄｓＲＮＡを含む薬学的組成物は、また、薬学的に許容される担体、希釈剤および／または賦形剤を含んでもよい。
【００２８】
別の態様では、本発明は、凝固因子の活性化、炎症または増殖障害に関連する血栓障害を治療、予防または管理するための方法であって、そのような治療、予防または管理の必要のある対象に治療または予防有効量の本発明の一つまたは複数のｄｓＲＮＡを投与することを含む方法を提供する。好ましくは、該対象は、哺乳動物であり、最も好ましくはヒト患者である。
【００２９】
一態様では、本発明は、第ＶＩＩ因子遺伝子の発現により仲介される病状を有する対象を処置するための方法を提供する。そのような状態は、血栓塞栓障害、望まれない炎症イベントまたは増殖障害および上記のような障害を含む。この態様では、ｄｓＲＮＡは、第ＶＩＩ因子遺伝子の発現をコントロールするための治療剤として作用する。その方法は、第ＶＩＩ因子遺伝子の発現がサイレンシングされるように、患者（例えばヒト）に本発明の薬学的組成物を投与することを含む。それらの高い特異性が原因で、本発明のｄｓＲＮＡは、第ＶＩＩ因子遺伝子のｍＲＮＡを特異的にターゲティングする。好ましい一態様では、記載されたｄｓＲＮＡは、ＦＶＩＩ ｍＲＮＡレベルを特異的に減少させ、細胞中のオフターゲット遺伝子の発現および／またはｍＲＮＡレベルに直接には影響しない。
【００３０】
好ましい一態様では、記載されたｄｓＲＮＡは、肝臓中の第ＶＩＩ因子ｍＲＮＡレベルをin vivoで少なくとも８０％減少させ、血漿中の第ＶＩＩ因子チモーゲンレベルをin vivoで少なくとも９５％減少させる。別の態様では、記載されたｄｓＲＮＡは、プロトロンビン時間を延長し、トロンビン生成および血栓形成をin vivoで阻害する。なお別の好ましい態様では、記載されたｄｓＲＮＡ分子によって仲介されるこれらの抗血栓効果は、減少したin vivo血漿ＦＶＩＩレベルおよび減少したin vivo肝臓ＦＶＩＩ ｍＲＮＡレベルに関連する。
【００３１】
一態様では、記載されたｄｓＲＮＡ分子は、血液凝固時間をin vivoで少なくとも２倍に増加させる。
【００３２】
治療用ｄｓＲＮＡに関して特に有用なのは、モルモットまたは細胞培養モデルで個別のｄｓＲＮＡについての毒性、治療有効性および有効薬用量およびin vivo半減期を推定するために使用することができる、モルモット第ＶＩＩ因子をターゲティングするｄｓＲＮＡセットである。
【００３３】
別の態様では、本発明は、細胞における第ＶＩＩ因子遺伝子の発現、特に本発明のｄｓＲＮＡの一つの少なくとも１本の鎖をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結された調節配列を含む第ＶＩＩ因子遺伝子の発現を阻害するためのベクターを提供する。
【００３４】
別の態様では、本発明は、細胞における第ＶＩＩ因子遺伝子の発現を阻害するためのベクターを含む細胞を提供する。該ベクターは、本発明のｄｓＲＮＡの一つの少なくとも１本の鎖をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結された調節配列を含む。なお、該ベクターが、該調節配列以外に本発明のｄｓＲＮＡの少なくとも１本の「センス鎖」および該ｄｓＲＮＡの少なくとも１本の「アンチセンス鎖」をコードする配列を含むことが好ましい。請求された細胞が、該調節配列以外に本発明のｄｓＲＮＡの一つの少なくとも１本の鎖をコードする、本明細書に定義される配列を含む二つ以上のベクターを含むことも予想される。
【００３５】
一態様では、その方法は、ｄｓＲＮＡを含む組成物を投与することを含み、ここで、そのｄｓＲＮＡは、処置される哺乳動物の第ＶＩＩ因子遺伝子のＲＮＡ転写物の少なくとも一部に相補的なヌクレオチド配列を含む。上に指摘したように、本明細書に定義されるｄｓＲＮＡ分子の少なくとも１本の鎖をコードする核酸分子を含むベクターおよび細胞もまた、薬学的組成物として使用することができ、したがって、本明細書に開示された医学的介入の必要のある対象を処置する方法に使用することもできる。薬学的組成物および対応する（ヒト）対象を処置する方法に関するこれらの態様が、また、遺伝子治療アプローチのようなアプローチに関することも注目すべきである。本明細書に提供されるような第ＶＩＩ因子特異的ｄｓＲＮＡ分子または本発明のｄｓＲＮＡ分子の個別の鎖をコードする核酸分子を、また、ベクターに挿入し、ヒト患者のための遺伝子治療ベクターとして使用してもよい。遺伝子治療ベクターは、例えば静脈内注射、局所投与（米国特許第５，３２８，４７０号参照）または定位注射（例えばChen et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:3054-3057参照）によって対象に送達することができる。遺伝子治療ベクターの医薬製剤は、許容される希釈剤中に遺伝子治療ベクターを含むことがあるか、または遺伝子送達ビヒクルが埋め込まれている徐放マトリックスを含むことがある。または、リコンビナント細胞から完全な遺伝子送達ベクター、例えばレトロウイルスベクターをインタクトに産生できる場合、その医薬製剤は、遺伝子送達システムを産生する一つまたは複数の細胞を包含してもよい。
【００３６】
本発明の別の局面では、第ＶＩＩ因子遺伝子の発現活性をモデュレーションする第ＶＩＩ因子特異的ｄｓＲＮＡ分子は、ＤＮＡまたはＲＮＡベクターに挿入された転写ユニットから発現される（例えば、Skillern, A.ら、ＰＣＴ国際公開公報第００／２２１１３号参照）。これらの導入遺伝子は、直鎖構築物、環状プラスミド、またはウイルスベクターとして導入することができ、それらは、ホストゲノムに組込まれる導入遺伝子として組入れおよび遺伝することができる。導入遺伝子は、また、それが染色体外プラスミドとして遺伝可能なように構築することができる（Gassmann, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1995) 92:1292）。
【００３７】
ｄｓＲＮＡの個別の鎖を、二つの別々の発現ベクター上のプロモーターによって転写させて、ターゲット細胞に同時トランスフェクションすることができる。または、ｄｓＲＮＡの各個別の鎖を、どちらも同じ発現プラスミド上に位置するプロモーターによって転写させることができる。好ましい態様では、ｄｓＲＮＡは、ステムアンドループ構造を有するようにリンカーポリヌクレオチド配列によって結合した逆方向反復配列として発現される。
【００３８】
リコンビナントｄｓＲＮＡ発現ベクターは、好ましくはＤＮＡプラスミドまたはウイルスベクターである。ｄｓＲＮＡを発現しているウイルスベクターは、非限定的にアデノ随伴ウイルス（総説についてはMuzyczka, et al., Curr. Topics Micro. Immunol. (1992) 158:97-129)参照）；アデノウイルス（例えば、Berkner, et al., BioTechniques (1998) 6:616)、Rosenfeld et al. (1991, Science 252:431-434)、およびRosenfeld et al. (1992), Cell 68:143-155)参照）；またはアルファウイルスおよび当技術分野で公知の他のウイルスに基づき構築することができる。レトロウイルスは、上皮細胞を含めた多数の異なる種類の細胞に、in vitroおよび／またはin vivoで多様な遺伝子を導入するために使用されている（例えば、Danos and Mulligan, Proc. NatI. Acad. Sci. USA (1998) 85:6460-6464参照）。細胞のゲノムに挿入された遺伝子をトランスダクションおよび発現することができるリコンビナント−レトロウイルスベクターは、ＰＡ３１７およびＰｓｉ−ＣＲＩＰなどの適切なパッケージング細胞系にリコンビナント−レトロウイルスゲノムをトランスフェクションすることによって産生することができる（Comette et al., 1991, Human Gene Therapy 2:5-10; Cone et al., 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6349）。リコンビナント−アデノウイルスベクターは、感受性ホスト（例えばラット、ハムスター、イヌおよびチンパンジー）の多種多様な細胞および組織に感染させるために使用することができ（Hsu et al., 1992, J. Infectious Disease, 166:769）、感染に有糸分裂活性細胞を必要としないという利点ももつ。
【００３９】
本発明のＤＮＡプラスミドまたはウイルスベクターのいずれかにおけるｄｓＲＮＡ発現を駆動するプロモーターは、真核生物ＲＮＡポリメラーゼＩプロモーター（例えばリボソームＲＮＡプロモーター）、ＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーター（例えばＣＭＶ初期プロモーターまたはアクチンプロモーターまたはＵ１ ｓｎＲＮＡプロモーター）または好ましくはＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーター（例えば Ｕ６ ｓｎＲＮＡまたは７ＳＫ ＲＮＡプロモーター）または原核生物プロモーター、例えばＴ７プロモーター（発現プラスミドが、Ｔ７プロモーターからの転写に必要なＴ７ ＲＮＡポリメラーゼもまたコードする場合）でありうる。プロモーターは、また、膵臓に導入遺伝子の発現を指令することができる（例えば膵臓についてのインスリン調節配列参照（Bucchini et al., 1986, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:2511-2515））。
【００４０】
加えて導入遺伝子の発現は、例えば、特定の生理学的レギュレーターに、例えば循環グルコースレベルまたはホルモンに、感受性の調節配列などの誘導性調節配列および発現システムを使用することによって正確にレギュレーションすることができる（Docherty et al., 1994, FASEB J. 8:20-24）。細胞または哺乳動物における導入遺伝子発現のコントロールに適した、そのような誘導性発現システムには、エクジソン、エストロゲン、プロゲステロン、テトラサイクリン、二量体形成の化学誘導因子、およびイソプロピル−β−Ｄ１−チオガラクトピラノシド（ＥＰＴＧ）によるレギュレーションが含まれる。当業者は、意図されるｄｓＲＮＡ導入遺伝子の使用に基づいて適切な調節／プロモーター配列を選択できよう。
【００４１】
好ましくは、ｄｓＲＮＡ分子を発現することができるリコンビナントベクターは、下記のように送達され、ターゲット細胞中に長く残る。または、ｄｓＲＮＡ分子の一過性発現を提供するウイルスベクターを使用することができる。必要に応じてそのようなベクターを繰り返し投与することができる。ｄｓＲＮＡは、いったん発現したならばターゲットＲＮＡに結合し、その機能または発現をモデュレーションする。ｄｓＲＮＡ発現ベクターの送達は、静脈内または筋肉内投与による、患者から外植されたターゲット細胞に投与後にその患者に再導入することによる、または所望のターゲット細胞への導入を可能にする他の手段によるなどの、全身的でありうる。
【００４２】
ｄｓＲＮＡ発現ＤＮＡプラスミドは、典型的には陽イオン性脂質担体（例えばオリゴフェクタミン）または非陽イオン性脂質系担体（例えばTransit-TKO（商標））との複合体としてターゲット細胞にトランスフェクションされる。単一のＡ第ＶＩＩ因子遺伝子または複数のＡ第ＶＩＩ因子遺伝子の異なる領域をターゲティングするｄｓＲＮＡ介在性ノックダウンのための１週間以上にわたる複数回の脂質トランスフェクションもまた、本発明によって考えられている。本発明のベクターがホスト細胞にうまく導入されたことは、様々な公知の方法を使用してモニタリングすることができる。例えば、一過性トランスフェクションは、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）などの蛍光マーカーのようなレポーターを用いてシグナルを発生させることができる。エックスビボ細胞の安定トランスフェクションは、トランスフェクションされた細胞に、ハイグロマイシンＢ耐性などの特異的環境因子（例えば抗生物質および薬物）に対する耐性を有することを示すマーカーを使用して確認することができる。
【００４３】
以下の詳細な説明は、ｄｓＲＮＡを製造および使用する方法、ならびにターゲット第ＶＩＩ因子遺伝子の発現を阻害するｄｓＲＮＡを含有する組成物、加えて該第ＶＩＩ因子遺伝子の発現によって引き起こされる疾患および障害を処置するための組成物および方法を開示する。
【００４４】
定義
便宜上、明細書、実施例、および添付の特許請求の範囲に使用される特定の用語および語句の意味を下記に提供する。この明細書の他の部分での用語の使用と本節に提供されたその定義との間に明らかな矛盾がある場合は、本節の定義が優先されるものとする。
【００４５】
それぞれ「Ｇ」、「Ｃ」、「Ａ」、「Ｕ」および「Ｔ」または「ｄＴ」は、それぞれ一般的に、塩基としてそれぞれグアニン、シトシン、アデニン、ウラシルおよびデオキシチミジンを有するヌクレオチドを意味する。しかし、「リボヌクレオチド」または「ヌクレオチド」という用語は、また、下記にさらに詳述するような改変ヌクレオチドまたは代替置換部分を表わすことがある。そのような置換部分を含む配列は、本発明の態様である。下記に詳述するように、本明細書に記載されたｄｓＲＮＡ分子は、また「オーバーハング」、すなわち対になっていない、突出したヌクレオチドであって、本明細書において定義された「センス鎖」および「アンチセンス鎖」の対によって通常形成されるＲＮＡ二重らせん構造に直接には関与しないヌクレオチドを含むことがある。多くの場合に、そのような突出したストレッチは、３’末端にデオキシチミジンヌクレオチドを、大部分の態様では２個のデオキシチミジンを含む。そのようなオーバーハングを下記に説明および例示する。
【００４６】
本明細書に使用されるような「第ＶＩＩ因子」または「ＦＶＩＩ」という用語は、特に第ＶＩＩ凝固因子（以前は「プロコンバーチン」または「血清プロトロンビン転化促進因子」とも記載された）に関し、該用語は、対応する遺伝子、コードされるｍＲＮＡ、コードされるタンパク質／ポリペプチドに加えて、その機能的フラグメントに関する。「第ＶＩＩ因子遺伝子／配列」という用語は、野生型配列だけでなく、該遺伝子／配列に含まれうる突然変異および変化にも関する。したがって、本発明は、本明細書に提供される特異的ｄｓＲＮＡ分子に限定されない。本発明は、また、そのような突然変異／変化を含む第ＶＩＩ因子遺伝子のＲＮＡ転写物の対応するヌクレオチドストレッチに少なくとも８５％相補的なアンチセンス鎖を含むｄｓＲＮＡ分子に関する。
【００４７】
本明細書に使用されるような「ターゲット配列」は、一次転写産物のＲＮＡプロセシングの産物であるｍＲＮＡを含めた、第ＶＩＩ因子遺伝子の転写中に形成されるｍＲＮＡ分子のヌクレオチド配列の連続する部分を表す。
【００４８】
本明細書に使用されるような「配列を含む鎖」という用語は、標準的なヌクレオチドの命名法を使用して表される配列によって記載されるヌクレオチドの鎖を含むオリゴヌクレオチドを表す。しかし、本明細書に詳述されるような「配列を含む鎖」は、また、改変ヌクレオチドのように改変を含んでもよい。
【００４９】
本明細書に使用されるように、そして特に指摘しない限り、第１のヌクレオチド配列を第２のヌクレオチド配列に比較して記載するために使用される場合の「相補的」という用語は、第１のヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドが、特定の条件で第２のヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドとハイブリダイゼーションして二重鎖構造を形成する能力を表す。本明細書に使用されるような「相補的」配列は、それらがハイブリダイゼーションする能力に関する上記要件が満たされる限り、非Watson-Crick塩基対ならびに／または非天然および改変ヌクレオチドから形成された塩基対を含むか、またはそれらから完全に形成されていてもよい。
【００５０】
「完全に相補的」と称される配列は、第１および第２のヌクレオチド配列の全長にわたり、第２のヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドへの、第１のヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの塩基対形成を含む。
【００５１】
しかし、本明細書において第１の配列が第２の配列に対して「実質的に相補的」と称される場合に、これら二つの配列は、完全に相補的でありうるか、またはハイブリダイゼーションしたときに一つまたは複数の、しかし好ましくは４、３または２個以下の、ミスマッチ塩基対を形成しうる。
【００５２】
本明細書における「相補的」「完全に相補的」および「実質的に相補的」という用語は、その使用の状況から理解されるように、ｄｓＲＮＡのセンス鎖とアンチセンス鎖との間、またはｄｓＲＮＡのアンチセンス鎖とターゲット配列との間の塩基のマッチングに関して使用することができる。
【００５３】
本明細書に使用されるような「二本鎖ＲＮＡ」または「ｄｓＲＮＡ」という用語は、２本の逆平行で実質的に相補的な核酸鎖を含む二重鎖構造を有するリボ核酸分子、またはリボ核酸分子複合体を表す。二重鎖構造を形成している２本の鎖は、一つのより大きなＲＮＡ分子の異なる部分であってもよいか、またはそれらは、別々のＲＮＡ分子であってもよい。これらの２本の鎖が一つのより大きな分子の一部であるために、一方の鎖の３’末端と対する他方の鎖の５’末端との間で分断されないヌクレオチド鎖によって連結されて二重鎖構造を形成している場合に、その連結をしているＲＮＡ鎖を「ヘアピンループ」と呼ぶ。２本の鎖が、一方の鎖の３’末端と対する他方の鎖の５’末端との間で、分断されないヌクレオチド鎖以外の手段によって共有結合されて二重鎖構造を形成している場合に、その連結している構造を「リンカー」と呼ぶ。ＲＮＡ鎖は、同じまたは異なる数のヌクレオチドを有してもよい。二重鎖構造に加えて、ｄｓＲＮＡは、一つまたは複数のヌクレオチドオーバーハングを含んでもよい。該「オーバーハング」中のヌクレオチドは、０〜５個のヌクレオチドを含んでもよく、ここで、「０」は、「オーバーハング」を形成する追加的なヌクレオチドがないことを意味し、一方で「５」は、ｄｓＲＮＡ二重鎖の個別の鎖に５個の追加的なヌクレオチドがあることを意味する。これらの任意の「オーバーハング」は、個別の鎖の３’末端に位置する。下記に詳述するように、２本の鎖の１本だけに「オーバーハング」を含むｄｓＲＮＡ分子も、本発明に関連して有用であり、有利でさえありうる。「オーバーハング」は、好ましくは０〜２個のヌクレオチドを含む。最も好ましくは、２個の「ｄＴ」（デオキシチミジン）ヌクレオチドが、ｄｓＲＮＡの両方の鎖の３’末端に見られる。したがって、「ヌクレオチドオーバーハング」は、ｄｓＲＮＡの１本の鎖の３’末端が他方の鎖の５’末端を超えて伸長するか、またはその逆の場合に、ｄｓＲＮＡの二重鎖構造から突出する一つまたは複数の不対ヌクレオチドを表す。「平滑」または「平滑末端」は、ｄｓＲＮＡのその末端に不対ヌクレオチドがないこと、すなわちヌクレオチドオーバーハングがないことを意味する。「平滑末端の」ｄｓＲＮＡは、その全長にわたり二本鎖であるｄｓＲＮＡであり、すなわちその分子のどちらの末端にもヌクレオチドオーバーハングがないｄｓＲＮＡである。
【００５４】
「アンチセンス鎖」という用語は、ターゲット配列に実質的に相補的な領域を含むｄｓＲＮＡ鎖を表す。本明細書に使用されるような「相補的領域」という用語は、配列、例えばターゲット配列に実質的に相補的なアンチセンス鎖上の領域を表す。相補的領域がターゲット配列に完全には相補的でない場合に、ミスマッチは、末端領域で最も許容され、存在する場合は好ましくは一つまたは複数の末端領域にあり、例えば５’および／または３’末端から６、５、４、３、または２個のヌクレオチド以内にある。
【００５５】
本明細書に使用されるような「センス鎖」という用語は、アンチセンス鎖の領域に実質的に相補的な領域を含むｄｓＲＮＡの鎖を表す。「実質的に相補的」は、好ましくは、センスおよびアンチセンス鎖におけるオーバーラップしているヌクレオチドの少なくとも８５％が相補的であることを意味する。
【００５６】
ｄｓＲＮＡに関して使われる場合の「細胞に導入する」は、当業者に理解されているように、細胞への取込みまたは吸収を促進することを意味する。ｄｓＲＮＡの吸収または取込みは、受動（unaided）拡散過程もしくは能動細胞過程を介して、または補助剤もしくは装置によって行うことができる。この用語の意味は、in vitroの細胞に限定されず、ｄｓＲＮＡを、生物の一部である「細胞に導入」してもよい。その場合、細胞への導入は、生物への送達を含むであろう。例えば、in vivo送達について、ｄｓＲＮＡは、組織部位に注射することができるか、または全身投与することができる。例えば、医学的介入を必要とする対象に本発明のｄｓＲＮＡ分子が投与されることが予想されている。そのような投与は、該対象の罹患部に、例えば肝臓組織／細胞に、または肝ガン組織のようなガン組織／細胞に、本発明のｄｓＲＮＡ、ベクターまたは細胞を注射することを含んでもよい。しかし、罹患組織近傍への注射も予想されている。細胞へのin vitro導入には、エレクトロポレーションおよびリポフェクションなどの当技術分野で公知の方法が含まれる。
【００５７】
「サイレンシングする」、「発現を阻害する」および「ノックダウンする」という用語は、それらが第ＶＩＩ因子遺伝子に言及するかぎり、本明細書において、第１の細胞または細胞群（第ＶＩＩ因子遺伝子が転写される細胞であって、第ＶＩＩ因子遺伝子の発現が阻害されるように処理されたもの）から単離することができる、第ＶＩＩ因子遺伝子から転写されたｍＲＮＡの量が、第２の細胞または細胞群（第１の細胞または細胞群と実質的に同一であるが、そのように処理されなかったもの（対照細胞））に比べて減少したことを表す、第ＶＩＩ因子遺伝子の発現の少なくとも部分的な抑制を表す。阻害度は、通常次式により表される。
【００５８】
【数１】
【００５９】
または、阻害度は、第ＶＩＩ因子遺伝子の転写に機能的に関連しているパラメーター（例えば細胞によって分泌される、第ＶＩＩ因子遺伝子によってコードされるタンパク質の量、または特定の表現型を提示している細胞数）の減少によって示してもよい。
【００６０】
添付の実施例および本明細書に提供される添付の表に例示されるように、本発明のｄｓＲＮＡ分子は、in vitroアッセイにおいて、すなわちin vitroで、ヒト第ＶＩＩ因子の発現を少なくとも約７０％阻害することができる。別の態様では、本発明のｄｓＲＮＡ分子は、モルモット第ＶＩＩ因子の発現を少なくとも７０％阻害することができ、このことは顕著なin vivo抗血栓効果にも導く。当業者は、特に本明細書に提供されるアッセイを考慮に入れて、そのような阻害速度および関連効果を容易に決定することができる。特に好ましいｄｓＲＮＡを、例えば添付の表１の、特に順位１〜１３に提供する（そこに提供されるセンス鎖およびアンチセンス鎖の配列は、５’から３’方向である）。
【００６１】
本明細書に使用されるような「オフターゲット」という用語は、in silico法によって、記載されたｄｓＲＮＡに配列相補性に基づきハイブリダイゼーションすると予測されるトランスクリプトームの全ての非ターゲットｍＲＮＡを表す。本発明のｄｓＲＮＡは、好ましくは、第ＶＩＩ因子の発現を特異的に阻害し、すなわちどのオフターゲットの発現も阻害しない。
【００６２】
本明細書に使用されるような「半減期」という用語は、化合物または分子の安定性の尺度であって、特に本明細書に提供されるアッセイを考慮に入れて、当業者に公知の方法によって評価することができる。
【００６３】
本明細書に使用されるような「非免疫刺激性」という用語は、本発明のｄｓＲＮＡ分子による免疫反応の任意の誘導がないことを表す。免疫反応を決定する方法は、当業者に周知であり、例えば実施例の節に記載されているようにサイトカインの放出を評価することによる。
【００６４】
「処置する」、「処置」などの用語は、本発明に関連して血栓塞栓障害／疾患、炎症または増殖障害のような、第ＶＩＩ因子の発現に関係する障害の軽減または緩和を意味する。
【００６５】
本明細書に使用されるような「薬学的組成物」は、薬理学的有効量のｄｓＲＮＡおよび薬学的に許容される担体を含む。しかし、そのような「薬学的組成物」は、また、そのようなｄｓＲＮＡ分子の個別の鎖、または本発明のｄｓＲＮＡに含まれるセンスもしくはアンチセンス鎖の少なくとも１本をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結された調節配列を含む、本明細書に記載されたベクターを含んでもよい。本明細書に定義されたｄｓＲＮＡを発現するか、または含む細胞、組織または単離された器官を「薬学的組成物」として使用してもよいことも予想される。本明細書に使用されるような「薬理学的有効量」、「治療有効量」または単に「有効量」は、意図される薬理学的、治療的または予防的結果を生じるために有効なＲＮＡの量を表す。
【００６６】
「薬学的に許容される担体」という用語は、治療剤の投与のための担体を表す。そのような担体には、非限定的に、食塩水、緩衝食塩水、デキストロース、水、グリセロール、エタノール、およびその組合せが挙げられる。具体的には、この用語に細胞培養用培地は入らない。経口投与される薬物について、薬学的に許容される担体には、非限定的に、当業者に公知のような不活性希釈剤、崩壊剤、結合剤、滑沢剤、甘味料、香味料、着色料および保存料などの薬学的に許容される賦形剤が挙げられる。
【００６７】
薬学的に許容される担体が本発明のｄｓＲＮＡ、ベクターまたは細胞の全身投与を可能にすることが、特に予想される。経腸投与も予想されるが、非経口投与および経皮または経粘膜（例えば吹入、口内、膣、肛門）投与に加えて、薬物の吸入が、医学的介入を必要とする患者に本発明の化合物を投与する実現可能な方法である。非経口投与を採用する場合に、これは、罹患組織または少なくともその近傍への本発明の化合物の直接注射を含むことがある。しかし、本発明の化合物の静脈内、動脈内、皮下、筋肉内、腹腔内、皮内、くも膜下腔内および他の投与もまた、技術者、例えば担当医師の技術の範囲内である。
【００６８】
筋肉内、皮下および静脈内使用のために、本発明の薬学的組成物は、一般に、滅菌水溶液または懸濁物中に提供され、適切なｐＨおよび等張性に緩衝化されるであろう。好ましい態様では、担体は、水性緩衝液のみから成る。これに関連して、「のみ」は、第ＶＩＩ因子遺伝子を発現する細胞におけるｄｓＲＮＡの取込みに影響または取込みを仲介しうる補助剤も封入物質もないことを意味する。本発明による水性懸濁剤は、セルロース誘導体、アルギン酸ナトリウム、ポリビニルピロリドンおよびトラガカントゴムなどの懸濁化剤、ならびにレシチンなどの湿潤剤を含みうる。水性懸濁剤用の適切な保存料には、ｐ−ヒドロキシ安息香酸エチルおよびｐ−ヒドロキシ安息香酸プロピルが挙げられる。本発明による有用な薬学的組成物には、また、インプラントおよび微小封入デリバリーシステムを含めた徐放剤などの、身体からｄｓＲＮＡが急速に排泄されるのを防ぐ封入製剤が挙げられる。エチレン酢酸ビニル、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、およびポリ乳酸などの生分解性で生体適合性のポリマーを使用することができる。そのような製剤を調製するための方法は、当業者に明らかであろう。リポソーム懸濁剤もまた、薬学的に許容される担体として使用することができる。これらは、当業者に公知の方法により、例えば参照により本明細書に組入れられるＰＣＴ国際公開公報第９１／０６３０９号に記載されているように調製することができる。
【００６９】
本明細書に使用されるような「トランスフォーメーションされた細胞」は、ｄｓＲＮＡ分子またはそのようなｄｓＲＮＡ分子の少なくとも１本の鎖を発現させることができる、少なくとも一つのベクターが導入された細胞である。そのようなベクターは、好ましくは、本発明のｄｓＲＮＡに含まれるセンス鎖またはアンチセンス鎖の少なくとも一つをコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結された調節配列を含むベクターである。
【００７０】
表１および４の配列の一つの一方または両方の末端から少数のヌクレオチドだけを除いた短いｄｓＲＮＡが、上記ｄｓＲＮＡと同様に有効でありうると合理的に予想することができる。上に指摘したように、本発明の大部分の態様では、本明細書に提供されたｄｓＲＮＡ分子は、約１６〜約３０個のヌクレオチドの二重鎖長（すなわち「オーバーハング」なし）を含む。特に有用なｄｓＲＮＡ二重鎖長は、約１９〜約２５個のヌクレオチドである。最も好ましいのは、１９ヌクレオチド長の二重鎖構造である。本発明のｄｓＲＮＡ分子では、アンチセンス鎖は、センス鎖に少なくとも部分的に相補的である。
【００７１】
本発明のｄｓＲＮＡは、ターゲット配列に１個または複数個のミスマッチを有しうる。好ましい態様では、本発明のｄｓＲＮＡは、最大３個のミスマッチを有する。ｄｓＲＮＡのアンチセンス鎖がターゲット配列に対するミスマッチを有する場合に、ミスマッチ領域が相補的領域の中心に位置しないことが好ましい。ｄｓＲＮＡのアンチセンス鎖がターゲット配列に対するミスマッチを有する場合に、そのミスマッチが、末端領域に、好ましくは５’および／または３’末端から６、５、４、３または２個のヌクレオチド以内に、限られることが好ましい。例えば、第ＶＩＩ因子遺伝子の領域に相補的な２３個のヌクレオチドのｄｓＲＮＡ鎖について、ｄｓＲＮＡは、好ましくは中央の１３個のヌクレオチド内に全くミスマッチを有さない。
【００７２】
上述のように、ｄｓＲＮＡの少なくとも一つの末端／鎖は、１〜５個、好ましくは１または２個のヌクレオチドの一本鎖ヌクレオチドオーバーハングを有してもよい。少なくとも一つのヌクレオチドオーバーハングを有するｄｓＲＮＡは、その平滑末端の対応物よりも予想外に優れた阻害性を有する。さらに、本発明者らは、１個のヌクレオチドオーバーハングの存在のみが、ｄｓＲＮＡの干渉活性を強化するが、その全体的な安定性には影響しないことを発見した。オーバーハングを１個だけ有するｄｓＲＮＡがin vivoで、ならびに様々な細胞、細胞培養用培地、血液および血清中で特に安定で有効なことが証明された。好ましくは、一本鎖オーバーハングは、アンチセンス鎖の３’末端またはその代わりにセンス鎖の３’末端に位置する。ｄｓＲＮＡは、また、好ましくはアンチセンス鎖の５’末端に位置する平滑末端を有してもよい。好ましくは、ｄｓＲＮＡのアンチセンス鎖は、３’末端にヌクレオチドオーバーハングを有し、５’末端は平滑である。別の態様では、オーバーハング中の一つまたは複数のヌクレオチドは、ヌクレオシドチオリン酸エステルと置換されている。
【００７３】
また、安定性を高めるために、本発明のｄｓＲＮＡを化学的に改変してもよい。本発明の核酸は、参照により本明細書に組入れられる"Current protocols in nucleic acid chemistry", Beaucage, S.L. et al. (Edrs.), John Wiley & Sons, Inc., New York, NY, USAに記載されているような、当技術分野で十分に確立された方法により合成および／または改変してもよい。化学的改変には、非限定的に、２’改変、非天然塩基の導入、リガンドへの共有結合、およびリン酸結合からチオリン酸結合への置換を挙げることができる。この態様では、二重鎖構造の完全性は、少なくとも一つ、好ましくは二つの化学結合によって強化される。化学結合形成は、多様な周知の技法のいずれかによって、例えば共有結合、イオン結合または水素結合；疎水性相互作用、ファンデルワールスまたはスタッキング相互作用によって；金属イオン配位によって、またはプリンアナログの使用を介して達成してもよい。好ましくは、ｄｓＲＮＡを改変するために使用することのできる化学基には、非限定的にメチレンブルー；二官能基、好ましくはビス−（２−クロロエチル）アミン；Ｎ−アセチル−Ｎ’−（ｐ−グリオキシルベンゾイル）シスタミン；４−チオウラシル；およびソラレンが挙げられる。好ましい一態様では、リンカーは、ヘキサエチレングリコールリンカーである。この場合、ｄｓＲＮＡは、固相合成により生成され、ヘキサエチレングリコールリンカーは、標準法により組入れられる（例えばWilliams, D.J., and K.B. Hall, Biochem. (1996) 35:14665-14670）。特定の態様では、アンチセンス鎖の５’末端とセンス鎖の３’末端とは、ヘキサエチレングリコールリンカーを介して化学結合している。別の態様では、ｄｓＲＮＡの少なくとも１個のヌクレオチドは、ホスホロチオエート基またはホスホロジチオエート基を含む。ｄｓＲＮＡ末端の化学結合は、好ましくは三重らせん結合によって形成される。
【００７４】
特定の態様では、化学結合は、１個または数個の結合基によって形成されてもよく、ここで、そのような結合基は、好ましくはポリ−（オキシホスフィニコオキシ−１，３−プロパンジオール）鎖および／またはポリエチレングリコール鎖である。他の態様では、化学結合は、また、プリンの代わりに二本鎖構造に導入されたプリンアナログによって形成されてもよい。さらなる態様では、化学結合は、二本鎖構造に導入されたアザベンゼン−ユニットによって形成されてもよい。なおさらなる態様では、化学結合は、二本鎖構造に導入されたヌクレオチドの代わりに分岐ヌクレオチドアナログによって形成されてもよい。特定の態様では、化学結合は、紫外線によって誘導されてもよい。
【００７５】
なお別の態様では、二つの１本鎖の一方または両方のヌクレオチドを改変して、細胞酵素、例えば特定のヌクレアーゼの活性化を抑制または阻害してもよい。細胞酵素の活性化を阻害するための技法は、当技術分野で公知であり、例えば非限定的に２’−アミノ改変、２’−アミノ糖改変、２’−Ｆ糖改変、２’−Ｆ改変、２’−アルキル糖改変、非荷電骨格改変、モルホリノ改変、２’−Ｏ−メチル改変、およびホスホルアミデートである（例えばWagner, Nat. Med. (1995) 1:1116-8参照）。したがって、ｄｓＲＮＡ上のヌクレオチドの少なくとも一つの２’−ヒドロキシル基が、化学基、好ましくは２’−アミノ基または２’−メチル基により置換される。また、少なくとも１個のヌクレオチドを改変して、ロックされたヌクレオチドを形成させてもよい。そのようなロックされたヌクレオチドは、リボースの２’−酸素とリボースの４’−炭素を連結するメチレン架橋を有する。オリゴヌクレオチドへのロックされたヌクレオチドの導入により、相補的配列に対する親和性が向上し、融解温度が数度増加する。
【００７６】
本明細書に提供されたｄｓＲＮＡ分子の改変は、in vivoに加えてin vitroでその安定性にプラスの影響を与え、（罹患した）ターゲット部へのその送達も向上しうる。さらに、そのような構造的および化学的改変は、投与時のｄｓＲＮＡ分子に対する生理学的反応に、例えばサイトカイン放出（好ましくは抑制される）に、プラスの影響を与えうる。そのような化学的および構造的改変は、当技術分野において公知であり、とりわけNawrot (2006) Current Topics in Med Chem, 6, 913-925に例示されている。
【００７７】
ｄｓＲＮＡにリガンドをコンジュゲーションすることで、その細胞吸収に加えて特定組織へのターゲティングを高めることができる。場合によっては、細胞膜の直接透過性を促進するために疎水性リガンドがｄｓＲＮＡにコンジュゲーションされる。または、ｄｓＲＮＡにコンジュゲーションしたリガンドは、レセプター介在性エンドサイトーシスについての基質である。これらのアプローチは、アンチセンスオリゴヌクレオチドの細胞透過を促進するために使用されている。例えば、コレステロールが、様々なアンチセンスオリゴヌクレオチドとコンジュゲーションされて、コンジュゲーションしていないアナログよりも実質的に活性な化合物を生じた。M. Manoharan Antisense & Nucleic Acid Drug Development 2002, 12, 103参照。オリゴヌクレオチドとコンジュゲーションされた他の親油性化合物には、１−ピレン酪酸、１，３−ビス−Ｏ−（ヘキサデシル）グリセロール、およびメントールが挙げられる。レセプター介在性エンドサイトーシスについてのリガンドの一例は、葉酸である。葉酸は、葉酸レセプター介在性エンドサイトーシスにより細胞に進入する。葉酸と結合したｄｓＲＮＡ化合物は、葉酸レセプター介在性エンドサイトーシスにより細胞に効率的に輸送されるであろう。オリゴヌクレオチドの３’末端への葉酸の結合は、オリゴヌクレオチドの細胞取込みの増加を招く（Li, S.; Deshmukh, H. M.; Huang, L. Pharm. Res. 1998, 15, 1540）。オリゴヌクレオチドにコンジュゲーションされた他のリガンドには、ポリエチレングリコール、糖質クラスター、架橋剤、ポルフィリンコンジュゲート、および送達ペプチドが挙げられる。
【００７８】
場合によっては、オリゴヌクレオチドへの陽イオン性リガンドのコンジュゲーションは、多くの場合にヌクレアーゼ耐性の改善を招く。陽イオン性リガンドの代表例は、プロピルアンモニウムおよびジメチルプロピルアンモニウムである。興味深いことに、陽イオン性リガンドがアンチセンスオリゴヌクレオチド全体に分散した場合に、そのオリゴヌクレオチドは、ｍＲＮＡに対するその高い結合親和性を保持することが報告された。M. Manoharan Antisense & Nucleic Acid Drug Development 2002, 12, 103および本明細書における参考文献を参照されたい。
【００７９】
リガンドとコンジュゲーションした本発明のｄｓＲＮＡは、ｄｓＲＮＡへの連結分子の結合から誘導されるような反応性ペンダント官能基を有するｄｓＲＮＡの使用によって合成することができる。この反応性オリゴヌクレオチドは、市販のリガンド、多様な保護基のいずれかを有する、合成されたリガンド、または連結部分が結合したリガンドと直接反応させてもよい。本発明の方法は、リガンドとコンジュゲーションしたｄｓＲＮＡの合成を、いくつかの好ましい態様においてリガンドと適切にコンジュゲーションされたヌクレオシドモノマーであって、固体支持材料にさらに結合されてもよいヌクレオシドモノマーの使用により、容易にする。場合により固体支持材料に接着した、そのようなリガンド−ヌクレオシドコンジュゲートは、選択された血清結合性リガンドと、ヌクレオシドまたはオリゴヌクレオチドの５’位に位置する連結部分との反応を介して、本発明の方法のいくつかの好ましい態様により調製される。場合によっては、ｄｓＲＮＡの３’末端に結合したアラルキルリガンドを有するｄｓＲＮＡは、長鎖アミノアルキル基を介して多孔性（controlled-pore）ガラス支持体にモノマー構成要素を最初に共有結合させることによって調製される。次に、標準的な固相合成技法により、固体支持体に結合したモノマー構成要素にヌクレオチドを結合させる。モノマー構成要素は、固相合成に適したのヌクレオシドまたは他の有機化合物であってもよい。
【００８０】
本発明のコンジュゲートに使用されるｄｓＲＮＡは、周知の固相合成技法により簡便かつ日常的に製造することができる。ホスホロチオエートおよびアルキル化誘導体などの、他のオリゴヌクレオチドを調製する類似の方法を使用することも公知である。
【００８１】
特に改変されたオリゴヌクレオチドの合成に関する教示は、以下の米国特許に見出すことができる：ポリアミンとコンジュゲーションしたオリゴヌクレオチドに関して記載された米国特許第５，２１８，１０５号；改変された骨格を有するオリゴヌクレオチドに関して記載された米国特許第５，５４１，３０７号；キラルリン結合を有するオリゴヌクレオチドの調製方法に関して記載された米国特許第５，５２１，３０２号；ペプチド核酸に関して記載された米国特許第５，５３９，０８２号；β−ラクタム骨格を有するオリゴヌクレオチドに関して記載された米国特許第５，５５４，７４６号；オリゴヌクレオチドを合成するための方法および材料に関して記載された米国特許第５，５７１，９０２号；アルキルチオ基（そのような基は、ヌクレオシドの多様な位置のいずれかに結合した他の部分へのリンカーとして使用することができる）を有するヌクレオシドに関して記載された米国特許第５，５７８，７１８号；高キラル純度のホスホロチオエート結合を有するオリゴヌクレオチドに関して記載された米国特許第５，５８７，３６１号；２’−Ｏ−アルキルグアノシンおよび２，６−ジアミノプリン化合物を含めた関連化合物の調製方法に関して記載された米国特許第５，５０６，３５１号；Ｎ−２置換プリンを有するオリゴヌクレオチドに関して記載された米国特許第５，５８７，４６９号；３−デアザプリンを有するオリゴヌクレオチドに関して記載された米国特許第５，５８７，４７０号；共にコンジュゲーションした４’−デスメチルヌクレオシドアナログに関して記載された米国特許第５，６０８，０４６号；骨格改変オリゴヌクレオチドアナログに関して記載された米国特許第５，６１０，２８９号；とりわけ２’−フルオロ−オリゴヌクレオチドの合成方法に関して記載された米国特許第６，２６２，２４１号。
【００８２】
本発明のリガンドとコンジュゲーションしたｄｓＲＮＡおよびリガンド分子を有する配列特異的連結ヌクレオシドにおいて、標準的なヌクレオチドもしくはヌクレオシド前駆体、または連結部分を既に有するヌクレオチドまたはヌクレオシドコンジュゲート前駆体、リガンド分子を既に有するリガンド−ヌクレオチドもしくはヌクレオシド−コンジュゲート前駆体、または非ヌクレオシドリガンドを有する構成要素を利用して、オリゴヌクレオチドおよびオリゴヌクレオシドを適切なＤＮＡ合成装置で作製することができる。
【００８３】
典型的に連結部分を既に有するヌクレオチド−コンジュゲート前駆体を使用する場合に、配列特異的連結ヌクレオシドの合成は、完了し、次に、リガンド分子が連結部分と反応し、リガンドとコンジュゲーションしたオリゴヌクレオチドを形成する。ステロイド、ビタミン、脂質およびレポーター分子などの多様な分子を有するオリゴヌクレオチドコンジュゲートは、以前に記載されている（Manoharanら、ＰＣＴ国際公開公報第９３／０７８８３号参照）。好ましい態様では、本発明のオリゴヌクレオチドまたは連結ヌクレオシドは、市販のホスホルアミダイトに加えて、リガンド−ヌクレオシドコンジュゲート由来のホスホルアミダイトを使用して自動合成装置により合成される。
【００８４】
オリゴヌクレオシドのヌクレオシドへの２’−Ｏ−メチル、２’−Ｏ−エチル、２’−Ｏ−プロピル、２’−Ｏ−アリル、２’−Ｏ−アミノアルキルまたは２’−デオキシ−２’−フルオロ基の導入は、そのオリゴヌクレオチドに高いハイブリダイゼーション性を付与する。さらに、ホスホロチオエート骨格を有するオリゴヌクレオチドは、高いヌクレアーゼ安定性を有する。したがって、本発明の官能基化された連結ヌクレオシドは、ホスホロチオエート骨格または２’−Ｏ−メチル、２’−Ｏ−エチル、２’−Ｏ−プロピル、２’−Ｏ−アミノアルキル、２’−Ｏ−アリルもしくは２’−デオキシ−２’−フルオロ基のいずれかまたは両方を含むように強化することができる。
【００８５】
いくつかの好ましい態様では、５’末端にアミノ基を有する本発明の官能化ヌクレオシド配列は、ＤＮＡ合成装置を使用して調製し、次に、選択されたリガンドの活性エステル誘導体と反応する。活性エステル誘導体は、当業者に周知である。代表的な活性エステルには、Ｎ−ヒドロスクシンイミドエステル、テトラフルオロフェノールエステル、ペンタフルオロフェノールエステルおよびペンタクロロフェノールエステルが挙げられる。アミノ基と活性エステルとの反応により、選択されたリガンドが連結基を介して５’位に結合しているオリゴヌクレオチドが生成する。５’末端のアミノ基は、５’−アミノ改変剤であるＣ６試薬を使用して調製することができる。好ましい態様では、リガンド分子を、リガンドがリンカーを介して５’−ヒドロキシ基に直接または間接的に連結しているリガンド−ヌクレオシドホスホルアミダイトの使用によって５’位でオリゴヌクレオチドにコンジュゲーションさせてもよい。そのようなリガンド−ヌクレオシドホスホルアミダイトは、典型的には自動化合成手順の最後に使用されて、５’末端にリガンドを有する、リガンドとコンジュゲーションしたオリゴヌクレオチドを提供する。
【００８６】
本発明の方法の好ましい一態様では、リガンドとコンジュゲーションしたオリゴヌクレオチドの調製は、上にリガンド分子を構築する適切な前駆体分子の選択することから始まる。典型的には、前駆体は、通例使用されるヌクレオシドの適切に保護された誘導体である。例えば、本発明のリガンドとコンジュゲーションしたオリゴヌクレオチドの合成のための合成前駆体には、非限定的に、分子の核酸塩基部分で保護されていてもよい２’−アミノアルコキシ−５’−ＯＤＭＴ−ヌクレオシド、２’−６−アミノアルキルアミノ−５’−ＯＤＭＴ−ヌクレオシド、５’−６−アミノアルコキシ−２’−デオキシ−ヌクレオシド、５’−６−アミノアルコキシ−２−保護−ヌクレオシド、３’−６−アミノアルコキシ−５’−ＯＤＭＴ−ヌクレオシド、および３’−アミノアルキルアミノ−５’−ＯＤＭＴ−ヌクレオシドが挙げられる。そのような保護されたアミノ連結ヌクレオシド前駆体の合成方法は、当業者に公知である。
【００８７】
多くの場合に、本発明の化合物の調製時に保護基が使用される。本明細書に使用されるような「保護」という用語は、表示された部分に保護基が付属されていることを意味する。本発明のいくつかの好ましい態様では、化合物は、一つまたは複数の保護基を有する。多種多様な保護基を本発明の方法に使用することができる。一般に保護基は、化学官能基を特定の反応条件下で不活性にし、分子の残りを実質的に損傷することなしに分子中のそのような官能基に付属させ、そしてその官能基から除去することができる。
【００８８】
代表的なヒドロキシル保護基に加えて他の代表的な保護基は、Greene and Wuts, Protective Groups in Organic Synthesis, Chapter 2, 2d ed., John Wiley & Sons, New York, 1991、およびOligonucleotides And Analogues A Practical Approach, Ekstein, F. Ed., IRL Press, N.Y, 1991に開示されている。
【００８９】
酸処理に安定なアミノ保護基は、塩基処理で選択的に除去され、反応性アミノ基を置換に選択的に利用可能にするために使用される。そのような基の例は、Ｆｍｏｃ（E. Atherton and R. C. Sheppard、出典：The Peptides, S. Udenfriend, J. Meienhofer, Eds., Academic Press, Orlando, 1987, volume 9, p.1）およびＮｓｃ基により例示される様々な置換スルホニルエチルカルバメートである（Samukov et al., Tetrahedron Lett., 1994, 35:7821。
【００９０】
追加的なアミノ保護基には、非限定的に２−トリメチルシリルエトキシカルボニル（Ｔｅｏｃ）、１−メチル−１−（４−ビフェニリル）エトキシカルボニル（Ｂｐｏｃ）、ｔ−ブトキシカルボニル（ＢＯＣ）、アリルオキシカルボニル（Ａｌｌｏｃ）、９−フルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）、およびベンジルオキシカルボニル（Ｃｂｚ）などのカルバメート保護基；ホルミル、アセチル、トリハロアセチル、ベンゾイル、およびニトロフェニルアセチルなどのアミド保護基；２−ニトロベンゼンスルホニルなどのスルホンアミド保護基；ならびにフタルイミドおよびジチアスクシノイルなどのイミンおよび環状イミド保護基が挙げられる。これらのアミノ保護基の等価体もまた、本発明の化合物および方法に包含される。
【００９１】
多数の固体支持体が市販されており、当業者は、固相合成段階に使用される固体支持体を容易に選択することができる。特定の態様では、ユニバーサル支持体が使用される。ユニバーサル支持体は、オリゴヌクレオチドの３’末端に位置する特異なヌクレオチドまたは改変ヌクレオチドを有するオリゴヌクレオチドの調製を可能にする。ユニバーサル支持体に関するさらなる詳細については、Scott et al., Innovations and Perspectives in solid-phase Synthesis, 3rd International Symposium, 1994, Ed. Roger Epton, Mayflower Worldwide, 115-124］を参照されたい。加えて、より容易に塩基性加水分解を受けるｓｙｎ−１，２−アセトキシリン酸基を介してオリゴヌクレオチドが固体支持体に結合している場合に、より温和な反応条件でオリゴヌクレオチドをユニバーサル支持体から切断することができることが報告されている。Guzaev, A. I.; Manoharan, M. J. Am. Chem. Soc. 2003, 125, 2380を参照されたい。
【００９２】
ヌクレオシドは、リン含有またはリン不含のヌクレオシド間共有結合によって結合している。同定のために、そのようなコンジュゲーションしたヌクレオシドは、リガンド結合ヌクレオシドまたはリガンド−ヌクレオシドコンジュゲートとして特徴づけることができる。配列内にヌクレオシドにコンジュゲーションしたアラルキルリガンドを有する、連結ヌクレオシドは、コンジュゲーションしていない同様のｄｓＲＮＡ化合物と比べた場合に、高いｄｓＲＮＡ活性を実証するであろう。
【００９３】
本発明のアラルキル−リガンドとコンジュゲーションしたオリゴヌクレオチドには、また、オリゴヌクレオチドおよび連結ヌクレオシドのコンジュゲートが含まれ、ここで、リガンドは、中間にリンカー基を挟まずにヌクレオシドまたはヌクレオチドに直接結合している。リガンドは、好ましくはリガンドのカルボキシル、アミノまたはオキソ基で連結基を介して結合してもよい。典型的な連結基は、エステル、アミドまたはカルバメート基でありうる。
【００９４】
本発明のリガンドとコンジュゲーションしたオリゴヌクレオチドに使用するために想定される、好ましい改変オリゴヌクレオチドの具体例には、改変された骨格および非天然ヌクレオシド間結合を有するオリゴヌクレオチドが含まれる。改変された骨格またはヌクレオシド間結合を有する、本明細書において定義するようなオリゴヌクレオチドには、骨格にリン原子を保持するものおよび骨格にリン原子を有さないものが含まれる。本発明のために、糖間骨格にリン原子を有さない改変オリゴヌクレオチドもまた、オリゴヌクレオシドと見なすことができる。
【００９５】
特定のオリゴヌクレオチドの化学的改変を、下記に説明する。所与の化合物の全位置が一様に改変される必要はない。逆に、一つを超える改変を単一のｄｓＲＮＡ化合物に、またはその単一のヌクレオチドにさえも導入することができる。
【００９６】
好ましい改変されたヌクレオシド間結合または骨格には、例えば、ホスホロチオエート、キラルホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホトリエステル、アミノアルキルホスホトリエステル、３’−アルキレンホスホネートおよびキラルホスホネートを含めたメチルホスホネートおよび他のアルキルホスホネート、ホスフィネート、３’−アミノホスホルアミデートおよびアミノアルキルホスホルアミデートを含めたホスホルアミデート、チオノホスホルアミデート、チオノアルキルホスホネート、チオノアルキルホスホトリエステル、および通常の３’−５’結合を有するボラノホスフェート、これらの２’−５’結合アナログ、および隣接するヌクレオシドユニットの対が３’−５’から５’−３’または２’−５’から５’−２’に結合している逆極性を有するものが挙げられる。様々な塩、混合された塩および遊離酸形態もまた含まれる。
【００９７】
上記リン原子含有結合の調製に関する代表的な米国特許には、非限定的に、米国特許第４，４６９，８６３号；第５，０２３，２４３号；第５，２６４，４２３号；第５，３２１，１３１号；第５，３９９，６７６号；第５，４０５，９３９号；第５，４５３，４９６号；第５，４５５，２３３号および第５，４６６，６７７号が挙げられ、そのそれぞれは、参照により本明細書に組入れられる。
【００９８】
中にリン原子を含まない好ましい改変されたヌクレオシド間結合または骨格（すなわちオリゴヌクレオシド）は、短鎖アルキルまたはシクロアルキル糖間結合、混合されたヘテロ原子およびアルキルまたはシクロアルキル糖間結合、または一つもしくは複数の短鎖ヘテロ原子もしくは複素環式糖間結合によって形成される骨格を有する。これらには、モルホリノ結合（部分的にヌクレオシドの糖部分から形成される）；シロキサン骨格；スルフィド、スルホキシドおよびスルホン骨格；ホルムアセチルおよびチオホルムアセチル骨格；メチレンホルムアセチルおよびチオホルムアセチル骨格；アルケン含有骨格；スルファメート骨格；メチレンイミノおよびメチレンヒドラジノ骨格；スルホネートおよびスルホンアミド骨格；アミド骨格；ならびにＮ、Ｏ、ＳおよびＣＨ２の混合成分部分を有するその他を有するものが含まれる。
【００９９】
上記オリゴヌクレオシドの調製に関係する代表的な米国特許には、非限定的に米国特許第５，０３４，５０６号；第５，２１４，１３４号；第５，２１６，１４１号；第５，２６４，５６２号；第５，４６６，６７７号；第５，４７０，９６７号；第５，４８９，６７７号；第５，６０２，２４０号および第５，６６３，３１２号が含まれ、そのそれぞれは、参照により本明細書に組入れられる。
【０１００】
他の好ましいオリゴヌクレオチド模倣体では、ヌクレオシドユニットの糖およびヌクレオシド間結合、すなわち骨格の両方が、新規な基に置換される。核酸塩基ユニットは、適切な核酸ターゲット化合物とのハイブリダイゼーションのために保持される。優れたハイブリダイゼーション性を有することが示されている、そのようなオリゴヌクレオチドの一つであるオリゴヌクレオチド模倣体は、ペプチド核酸（ＰＮＡ）と呼ばれる。ＰＮＡ化合物では、オリゴヌクレオチドの糖骨格は、アミド含有骨格、特にアミノエチルグリシン骨格に置換される。核酸塩基は保持され、その骨格のアミド部分の原子に直接または間接的に結合する。ＰＮＡ化合物の教示は、例えば米国特許第５，５３９，０８２号に見いだすことができる。
【０１０１】
本発明のいくつかの好ましい態様は、ホスホロチオエート結合を有するオリゴヌクレオチドおよびヘテロ原子骨格を有するオリゴヌクレオシド、特に、上記に参照した米国特許第５，４８９，６７７号の−ＣＨ２−ＮＨ−Ｏ−ＣＨ２−、−ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）−Ｏ−ＣＨ２−［メチレン（メチルイミノ）またはＭＭＩ骨格としても知られている］、−ＣＨ２−Ｏ−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ２−、−ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ２−、および−Ｏ−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ２−ＣＨ２−［式中、ネイティブなホスホジエステル骨格は、−Ｏ−Ｐ−Ｏ−ＣＨ２−として表される］、および上記に参照した米国特許第５，６０２，２４０号のアミド骨格を使用する。同様に好ましいのは、上記に参照した米国特許第５，０３４，５０６号のモルホリノ骨格構造を有するオリゴヌクレオチドである。
【０１０２】
本発明のリガンドにコンジュゲーションしたオリゴヌクレオチドに使用されたオリゴヌクレオチドは、追加的または代替的に核酸塩基（当技術分野において単に「塩基」と呼ばれることが多い）の改変または置換を含んでもよい。本明細書に使用されるような「非改変」または「天然」核酸塩基には、プリン塩基であるアデニン（Ａ）およびグアニン（Ｇ）、ならびにピリミジン塩基であるチミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）、およびウラシル（Ｕ）が含まれる。改変された核酸塩基には、５−メチルシトシン（５−ｍｅ−Ｃ）、５−ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、２−アミノアデニン、アデニンおよびグアニンの６−メチル誘導体および他のアルキル誘導体、アデニンおよびグアニンの２−プロピル誘導体および他のアルキル誘導体、２−チオウラシル、２−チオチミンおよび２−チオシトシン、５−ハロウラシルおよび５−ハロシトシン、５−プロピニルウラシルおよび５−プロピニルシトシン、６−アゾウラシル、６−アゾシトシンおよび６−アゾチミン、５−ウラシル（シュードウラシル）、４−チオウラシル、８−ハロ、８−アミノ、８−チオール、８−チオアルキル、８−ヒドロキシルおよび他の８−置換アデニンおよびグアニン、５−ハロ、特に５−ブロモ、５−トリフルオロメチルおよび他の５−置換ウラシルおよびシトシン、７−メチルグアニンおよび７−メチルアデニン、８−アザグアニンおよび８−アザアデニン、７−デアザグアニンおよび７−デアザアデニンおよび３−デアザグアニンおよび３−デアザアデニンなどの他の合成および天然核酸塩基が挙げられる。
【０１０３】
さらなる核酸塩基には、米国特許第３，６８７，８０８号に開示されたもの、Concise Encyclopedia Of Polymer Science And Engineering, pages 858-859, Kroschwitz, J. I., ed. John Wiley & Sons, 1990に開示されたもの、Englisch et al., Angewandte Chemie, International Edition, 1991, 30, 613によって開示されたもの、およびSanghvi, Y. S., Chapter 15, Antisense Research and Applications, pages 289-302, Crooke, S. T. and Lebleu, B., ed., CRC Press, 1993によって開示されたものが挙げられる。これらの特定の核酸塩基は、本発明のオリゴヌクレオチドの結合親和性を増加させるために特に有用である。これらには、５−置換ピリミジン、６−アザピリミジンならびに２−アミノプロピルアデニン、５−プロピニルウラシルおよび５−プロピニルシトシンを含めたＮ−２、Ｎ−６およびＯ−６置換プリンが挙げられる。５−メチルシトシン置換は、核酸二重鎖の安定性を０．６〜１．２℃増加させることが示され（同上、２７６〜２７８頁）、現在好ましい塩基置換であるが、なおさらに２’−メトキシエチル糖改変と組合せた場合に、特に好ましい。
【０１０４】
特定の上記改変核酸塩基に加えて、他の改変核酸塩基の調製に関係する代表的な米国特許には、非限定的に、上記の米国特許第３，６８７，８０８号に加えて、米国特許第５，１３４，０６６号；第５，４５９，２５５号；第５，５５２，５４０号；第５，５９４，１２１号および第５，５９６，０９１号が挙げられ、それらの全ては、参照により本明細書に組入れられる。
【０１０５】
特定の態様では、本発明のリガンドにコンジュゲーションしたオリゴヌクレオチドに使用されるオリゴヌクレオチドは、追加的または代替的に、一つまたは複数の置換糖部分を含んでもよい。好ましいオリゴヌクレオチドは、２’位に以下の一つを含む：ＯＨ；Ｆ；Ｏ−、Ｓ−、もしくはＮ−アルキル、Ｏ−、Ｓ−、もしくはＮ−アルケニル、またはＯ、Ｓ−もしくはＮ−アルキニル（ここで、アルキル、アルケニルおよびアルキニルは、置換または非置換のＣ１〜Ｃ１０のアルキルまたはＣ２〜Ｃ１０のアルケニルおよびアルキニルであってもよい）。特に好ましいのは、Ｏ［（ＣＨ２）ｎＯ］ｍＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＮＨ２、Ｏ（ＣＨ２）ｎＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＮＨ２、およびＯ（ＣＨ２）ｎＯＮ［（ＣＨ２）ｎＣＨ３）］２であり、ここで、ｎおよびｍは、１〜約１０である。他の好ましいオリゴヌクレオチドは、２’位に以下の一つを含む：Ｃ１〜Ｃ１０の低級アルキル、置換低級アルキル、アルカリール、アラルキル、Ｏ−アルカリールまたはＯ−アラルキル、ＳＨ、ＳＣＨ３、ＯＣＮ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＮ、ＣＦ３、ＯＣＦ３、ＳＯＣＨ３、ＳＯ２ ＣＨ３、ＯＮＯ２、ＮＯ２、Ｎ３、ＮＨ２、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルカリール、アミノアルキルアミノ、ポリアルキルアミノ、置換シリル、ＲＮＡ切断基、レポーター基、インターカレーター、オリゴヌクレオチドの薬物動態特性を改善するための基、またはオリゴヌクレオチドの薬力学特性を改善するための基、および類似の特性を有する他の置換基。好ましい改変には、２’−メトキシエトキシ［２’−Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３、２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）または２’−ＭＯＥとしても知られている］、すなわちアルコキシアルコキシ基が挙げられる。さらに好ましい改変には、１９９８年１月３０日に出願された米国特許第６，１２７，５３３号に記載されているような２’−ジメチルアミノオキシエトキシ、すなわちＯ（ＣＨ２）２ＯＮ（ＣＨ３）２基（２’−ＤＭＡＯＥとしても知られている）が挙げられ、その内容は、参照により組入れられる。
【０１０６】
他の好ましい改変には、２’−メトキシ（２’−Ｏ−ＣＨ３）、２’−アミノプロポキシ（２’−ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２）および２’−フルオロ（２’−Ｆ）が挙げられる。類似の改変を、また、オリゴヌクレオチド上の他の位置に、特に、３’末端ヌクレオチド上または２’−５’結合オリゴヌクレオチド中の糖の３’位に行ってもよい。
【０１０７】
本明細書に使用されるような「糖置換基」または「２’−置換基」という用語には、酸素原子と共にまたは酸素原子なしにリボフラノシル部分の２’位に結合した基が含まれる。糖置換基には、非限定的に、フルオロ、Ｏ−アルキル、Ｏ−アルキルアミノ、Ｏ−アルキルアルコキシ、保護されたＯ−アルキルアミノ、Ｏ−アルキルアミノアルキル、Ｏ−アルキルイミダゾールおよび式（Ｏ−アルキル）ｍのポリエーテル（式中、ｍは１〜約１０である）が挙げられる。これらのポリエーテルの中で好ましいのは、直鎖および環状ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、およびクラウンエーテルなどの（ＰＥＧ）−含有基、とりわけDelgardoら（Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems 1992, 9:249、参照によりその全体が本明細書に組入れられる）によって開示されたものである。さらなる糖の改変は、Cook（Anti-fibrosis Drug Design, 1991, 6:585-607）によって開示されている。フルオロ、Ｏ−アルキル、Ｏ−アルキルアミノ、Ｏ−アルキルイミダゾール、Ｏ−アルキルアミノアルキル、およびアルキルアミノ置換は、その全体が参照により本明細書に組入れられる「Oligomeric Compounds having Pyrimidine Nucleotide(s) with 2' and 5' Substitutions」という名称の米国特許第６，１６６，１９７号に記載されている。
【０１０８】
本発明に受け入れられる追加的な糖置換基には、２’−ＳＲおよび２’−ＮＲ２基（式中、各Ｒは、独立して水素、保護基または置換もしくは非置換のアルキル、アルケニル、もしくはアルキニルである）が挙げられる。２’−ＳＲヌクレオシドは、その全体が参照により本明細書に組入れられる米国特許第５，６７０，６３３号に開示されている。２’−ＳＲモノマー出発材料の組入れは、Hammら（J. Org. Chem., 1997, 62:3415-3420）に開示されている。２’−ＮＲヌクレオシドは、Goettingen, M., J. Org. Chem., 1996, 61, 6273-6281；およびPolushin et al., Tetrahedron Lett., 1996, 37, 3227-3230によって開示されている。本発明に受け入れられるさらなる代表的な２’−置換基には、式ＩまたはＩＩ：
【０１０９】
【化１】
［式中、
Ｅは、Ｃ１−Ｃ１０アルキル、Ｎ（Ｑ３）（Ｑ４）またはＮ＝Ｃ（Ｑ３）（Ｑ４）であり；各Ｑ３およびＱ４は、独立してＨ、Ｃ１−Ｃ１０アルキル、ジアルキルアミノアルキル、窒素保護基、テザーもしくは非テザーコンジュゲート基、固体支持体へのリンカーであるか；またはＱ３およびＱ４は、一緒になって窒素保護基もしくは場合によりＮおよびＯより選択される少なくとも１個の追加的なヘテロ原子を含む環構造を形成し；
ｑ１は、１〜１０の整数であり；
ｑ２は、１〜１０の整数であり；
ｑ３は、０または１であり；
ｑ４は、０、１または２であり；
各Ｚ１、Ｚ２およびＺ３は、独立して、Ｃ４−Ｃ７シクロアルキル、Ｃ５−Ｃ１４アリールまたはＣ３−Ｃ１５ヘテロシクリルであり、ここで、該ヘテロシクリル基のヘテロ原子は、酸素、窒素および硫黄より選択され；
Ｚ４は、ＯＭ１、ＳＭ１、またはＮ（Ｍ１）２であり；各Ｍ１は、独立してＨ、Ｃ１−Ｃ８アルキル、Ｃ１−Ｃ８ハロアルキル、Ｃ（＝ＮＨ）Ｎ（Ｈ）Ｍ２、Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｈ）Ｍ２またはＯＣ（＝Ｏ）Ｎ（Ｈ）Ｍ２であり；Ｍ２は、ＨまたはＣ１−Ｃ８アルキルであり；
Ｚ５は、Ｃ１−Ｃ１０アルキル、Ｃ１−Ｃ１０ハロアルキル、Ｃ２−Ｃ１０アルケニル、Ｃ２−Ｃ１０アルキニル、Ｃ６−Ｃ１４アリール、Ｎ（Ｑ３）（Ｑ４）、ＯＱ３、ハロ、ＳＱ３またはＣＮである］の一つを有するものが挙げられる。
【０１１０】
式Ｉで示される代表的な２’−Ｏ−糖置換基は、その全体が参照により本明細書に組入れられる「Capped 2'-Oxyethoxy Oligonucleotides」という名称の米国特許第６，１７２，２０９号に開示されている。式ＩＩで示される代表的な環状２’−Ｏ−糖置換基は、その全体が参照により本明細書に組入れられる「RNA Targeted 2'-Modified Oligonucleotides that are Conformationally Preorganized」という名称の米国特許第６，２７１，３５８号に開示されている。
【０１１１】
リボシル環にＯ−置換を有する糖もまた、本発明に受け入れられる。環Ｏについての代表的な置換には、非限定的にＳ、ＣＨ２、ＣＨＦ、およびＣＦ２が挙げられる。
【０１１２】
オリゴヌクレオチドは、また、ペントフラノシル糖の代わりにシクロブチル部分などの糖模倣体を有してもよい。そのような改変された糖の調製に関する代表的な米国特許には、非限定的に、米国特許第５，３５９，０４４号；第５，４６６，７８６号；第５，５１９，１３４号；第５，５９１，７２２号；第５，５９７，９０９号；第５，６４６，２６５号および第５，７００，９２０号が挙げられ、それらの全ては、参照により本明細書に組入れられる。
【０１１３】
追加的な改変は、オリゴヌクレオチド上の他の位置に、特に３’末端ヌクレオチド上の糖の３’位に行ってもよい。例えば、本発明のリガンドにコンジュゲーションしたオリゴヌクレオチドの追加的な一改変は、オリゴヌクレオチドの活性、細胞分布または細胞取込みを高める一つまたは複数の追加的な非リガンド部分またはコンジュゲートをオリゴヌクレオチドに化学結合させることを伴う。そのような部分には、非限定的に、コレステロール部分などの脂質部分（Letsinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1989, 86, 6553）、コール酸（Manoharan et al., Bioorg. Med. Chem. Lett., 1994, 4, 1053）、チオエーテル、例えばヘキシル−Ｓ−トリチルチオール（Manoharan et al., Ann. N.Y. Acad. Sci., 1992, 660, 306; Manoharan et al., Bioorg. Med. Chem. Let., 1993, 3, 2765）、チオコレステロール（Oberhauser et al., Nucl. Acids Res., 1992, 20, 533）、脂肪族鎖、例えばドデカンジオールもしくはウンデシル残基（Saison-Behmoaras et al., EMBO J., 1991, 10, 111; Kabanov et al., FEBS Lett., 1990, 259, 327; Svinarchuk et al., Biochimie, 1993, 75, 49）、リン脂質、例えばジ−ヘキサデシル−ｒａｃ−グリセロールもしくはトリエチルアンモニウム１，２−ジ−Ｏ−ヘキサデシル−ｒａｃ−グリセロ−３−Ｈ−ホスホネート（Manoharan et al., Tetrahedron Lett., 1995, 36, 3651; Shea et al., Nucl. Acids Res., 1990, 18, 3777）、ポリアミンもしくはポリエチレングリコール鎖（Manoharan et al., Nucleosides & Nucleotides, 1995, 14, 969）、またはアダマンタン酢酸（Manoharan et al., Tetrahedron Lett., 1995, 36, 3651）、パルミチル部分（Mishra et al., Biochim. Biophys. Acta, 1995, 1264, 229）、またはオクタデシルアミンもしくはヘキシルアミノ−カルボニル−オキシコレステロール部分（Crooke et al., J. Pharmacol. Exp. Ther., 1996, 277, 923）が挙げられる。
【０１１４】
本発明には、また、オリゴヌクレオチド内の特定の位置に関して実質的にキラル純粋なオリゴヌクレオチドを使用している組成物が含まれる。実質的にキラル純粋なオリゴヌクレオチドの例には、非限定的に、少なくとも７５％ＳｐまたはＲｐのホスホロチオエート結合を有するもの（Cookら、米国特許第５，５８７，３６１号）および実質的にキラル純粋な（ＳｐまたはＲｐ）アルキルホスホネート、ホスホルアミデートまたはホスホトリエステル結合を有するもの（Cook、米国特許第５，２１２，２９５号および第５，５２１，３０２号）が挙げられる。
【０１１５】
場合によっては、オリゴヌクレオチドを、非リガンド基により改変してもよい。いくつかの非リガンド分子は、オリゴヌクレオチドの活性、細胞分布または細胞取込みを高めるためにオリゴヌクレオチドにコンジュゲーションされており、そのようなコンジュゲーションを行う手順は、科学文献から利用することができる。そのような非リガンド部分には、コレステロールなどの脂質部分（Letsinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1989, 86:6553）、コール酸（Manoharan et al., Bioorg. Med. Chem. Lett., 1994, 4:1053）、チオエーテル、例えばヘキシル−Ｓ−トリチルチオール（Manoharan et al., Ann. N.Y. Acad. Sci., 1992, 660:306; Manoharan et al., Bioorg. Med. Chem. Let., 1993, 3:2765）、チオコレステロール（Oberhauser et al., Nucl. Acids Res., 1992, 20:533）、脂肪族鎖、例えばドデカンジオールもしくはウンデシル残基（Saison-Behmoaras et al., EMBO J., 1991, 10:111; Kabanov et al., FEBS Lett., 1990, 259:327; Svinarchuk et al., Biochimie, 1993, 75:49）、リン脂質、例えばジ−ヘキサデシル−ｒａｃ−グリセロールもしくはトリエチルアンモニウム１，２−ジ−Ｏ−ヘキサデシル−ｒａｃ−グリセロ−３−Ｈ−ホスホネート（Manoharan et al., Tetrahedron Lett., 1995, 36:3651; Shea et al., Nucl. Acids Res., 1990, 18:3777）、ポリアミンもしくはポリエチレングリコール鎖（Manoharan et al., Nucleosides & Nucleotides, 1995, 14:969）、またはアダマンタン酢酸（Manoharan et al., Tetrahedron Lett., 1995, 36:3651）、パルミチル部分（Mishra et al., Biochim. Biophys. Acta, 1995, 1264:229）、またはオクタデシルアミンもしくはヘキシルアミノ−カルボニル−オキシコレステロール部分（Crooke et al., J. Pharmacol. Exp. Ther., 1996, 277:923）が含まれた。典型的なコンジュゲーションプロトコールは、配列の一つまたは複数の位置にアミノリンカーを有するオリゴヌクレオチドの合成を伴う。次に、適切なカップリング試薬または活性化試薬を使用して、コンジュゲーションされる分子とアミノ基を反応させる。コンジュゲーション反応は、まだ固体支持体に結合しているオリゴヌクレオチドと共に、または液相中の切断後のオリゴヌクレオチドのいずれかで行ってもよい。ＨＰＬＣによるオリゴヌクレオチドコンジュゲートの精製により、典型的には純粋なコンジュゲートが得られる。コレステロールコンジュゲートの使用は、そのような部分が第ＶＩＩ因子タンパク質産生部位である肝臓中の組織へのターゲティングを増加させることができることから、特に好ましい。
【０１１６】
または、コンジュゲーションされる分子は、分子に存在するアルコール基を介して、またはリン酸化されうるアルコール基を有するリンカーの結合によって、ホスホルアミダイトなどの構成要素に変換してもよい。
【０１１７】
重要なことには、リガンドにコンジュゲーションしたオリゴヌクレオチドを合成するために、これらのアプローチのそれぞれを使用することができる。アミノ連結オリゴヌクレオチドを、カップリング試薬の使用によりリガンドと直接カップリングさせてもよく、またはリガンドをＮＨＳもしくはペンタフルオロフェノレート（pentfluorophenolate）エステルとして活性化後に、カップリングさせてもよい。リガンドのホスホルアミダイトは、カルボキシル基の一つにアミノヘキサノールリンカーを結合させ、続いて末端アルコール官能基を亜リン酸エステル化することによって合成してもよい。システアミンなどの他のリンカーを、また、合成されたオリゴヌクレオチド上に存在するクロロアセチルリンカーへのコンジュゲーションに利用してもよい。
【０１１８】
本発明の主な要旨の一つは、本発明のｄｓＲＮＡ分子を含む薬学的組成物の提供である。そのような薬学的組成物は、また、本発明のｄｓＲＮＡ分子に含まれるセンス鎖またはアンチセンス鎖の少なくとも一つをコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結された調節配列を含む、そのようなｄｓＲＮＡ分子またはベクターの個別の鎖を含んでもよい。また、本明細書に定義されたｄｓＲＮＡ分子を発現するか、または含む細胞および組織を、薬学的組成物として使用してもよい。そのような細胞または組織は、特に移植アプローチに有用でありうる。これらのアプローチは、また、異種移植を含んでもよい。
【０１１９】
一態様では、本発明は、本明細書に記載されるようなｄｓＲＮＡおよび薬学的に許容される担体を含む薬学的組成物を提供する。ｄｓＲＮＡを含む薬学的組成物は、血栓塞栓障害などのＦＶＩＩ遺伝子の発現または活性に関連する疾患または障害を処置するために有用である。
【０１２０】
本発明の薬学的組成物は、ＦＶＩＩ遺伝子の発現を阻害するために十分な薬用量で投与される。本発明者らは、それらの改善された有効性のおかげで、本発明のｄｓＲＮＡを含む組成物を低薬用量で投与できることを見出した。
【０１２１】
一般に、ｄｓＲＮＡの適切な用量は、１日にレシピエントの体重１kgあたり０．０１〜５．０ミリグラム、好ましくは１日に体重１kgあたり０．１〜２００マイクログラム、さらに好ましくは１日に体重１kgあたり０．１〜１００マイクログラム、いっそうさらに好ましくは１日に体重１kgあたり１．０〜５０マイクログラム、最も好ましくは１日に体重１kgあたり１．０〜２５マイクログラムであろう。薬学的組成物は、１日１回投与してもよいか、またはｄｓＲＮＡは、２、３、４、５、６またはそれを超える分割用量として１日を通して適切な間隔で、またはさらに連続注入も利用して、投与してもよい。その場合、総１日薬用量に達するように、各分割用量に含有されるｄｓＲＮＡは、それに応じて少量でなければならない。単位薬用量は、また、例えば数日間かけてｄｓＲＮＡを徐放する従来の徐放製剤を使用して、数日間かけて送達するために配合することができる。徐放製剤は、当技術分野において周知である。この態様では、単位薬用量は、１日用量の倍数に対応する量を含有する。
【０１２２】
熟練者は、非限定的に疾患または障害の重症度、過去の処置、対象の全身の健康状態および／または年齢、ならびに存在する他の疾患を含めたある種の要因が、対象を効果的に処置するために必要な薬用量およびタイミングに影響するおそれがあることを認識しているであろう。さらに、治療有効量の組成物を用いた対象の処置には、単回処置または一連の処置が含むことができる。本発明により包含される個別のｄｓＲＮＡについての有効薬用量およびin vivo半減期の推定は、従来の方法を用いて、または適切な動物モデルを使用したin vivo試験に基づいて行うことができる。
【０１２３】
そのような化合物の毒性および治療有効性は、例えばＬＤ５０（集団の５０％に致死的な用量）およびＥＤ５０（集団の５０％に治療的に有効な用量）を決定するための、細胞培養または実験動物における標準的な薬学的手順によって決定することができる。毒性作用と治療効果の間の用量比は治療指数であり、それを比ＬＤ５０／ＥＤ５０で表わすことができる。高い治療指数を示す化合物が好ましい。
【０１２４】
細胞培養アッセイおよび動物研究から得られたデータは、ヒトに使用するための様々な薬用量の処方に使用することができる。本発明の組成物の薬用量は、好ましくはほとんどまたは全く毒性を有さない、ＥＤ５０を含む様々な循環濃度範囲にある。薬用量は、使用される剤形および利用される投与経路に依存して、この範囲内で変動しうる。本発明の方法に使用される任意の化合物について、治療有効用量は、細胞培養アッセイから最初推定することができる。化合物の、または適切であればターゲット配列のポリペプチド産物（例えば減少した濃度のポリペプチドを得る）の、循環血漿濃度範囲を達成する動物モデルで、用量を設定してもよいが、その範囲は、細胞培養で決定されたようなＩＣ５０（すなわち症状の最大半値阻害を達成する被験化合物濃度）を含む。そのような情報は、ヒトに有用な用量をより正確に決定するために使用することができる。血漿レベルは、例えば、高速液体クロマトグラフィーによって測定してもよい。
【０１２５】
前述のように個別にまたは複数でそれらを投与することに加えて、本発明のｄｓＲＮＡは、他の公知の薬剤と組合せて投与することができる。いずれにしても、投与を行う医師は、当技術分野で公知の、または本明細書に記載された標準的な有効性尺度を利用して、観察された結果に基づきｄｓＲＮＡを投与する量およびタイミングを調整することができる。
【０１２６】
本発明により包含される薬学的組成物は、非限定的に、経口経路、または静脈内、筋肉内、腹腔内、皮下、経皮、気道（エアロゾル）、鼻腔、直腸、膣および局所（口腔および舌下を含む）投与、ならびに硬膜外投与を含めた非経口経路などの、当技術分野で公知の任意の手段によって投与することができる。好ましい態様では、薬学的組成物は、注入または注射によって静脈内投与される。
【０１２７】
特に定義されない限り、本明細書に使用される全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する分野の通常の技術者に一般に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に記載されるものに類似または等価の方法および材料を本発明の実施または試験に使用することができるが、適切な方法および材料を下に記載する。本明細書に言及された全ての刊行物、特許出願、特許および他の参照は、その全体が参照により本明細書に組入れられる。相反する場合、定義を含め本明細書に基づくものとする。加えて、材料、方法および実施例は、例示だけを目的とし、限定を意図しない。
【０１２８】
上に提供された態様および本発明の項目をこれから以下の非限定的な実施例を用いて例示する。
【図面の簡単な説明】
【０１２９】
図および添付の表の説明：
【図１ａ】配列番号対２５９／２６０を含む、ＦＶＩＩ ｄｓＲＮＡ（図１ａ）および配列番号対２５３／２５４を含むｄｓＲＮＡ（図１ｂ）をＬＮＰ０１（１：１４）リポソーム製剤中に４mg/kgでｉ．ｖ．注射後のモルモットにおけるＦＶＩＩ血漿濃度に及ぼすＦＶＩＩをターゲティングするｄｓＲＮＡ（「ＦＶＩＩ ｄｓＲＮＡ」）の効果。ルシフェラーゼｄｓＲＮＡ（配列番号対４１１／４１２）／ＬＮＰ０１およびＰＢＳは、対照である。結果は個別の動物からのものである。
【図１ｂ】配列番号対２５９／２６０を含む、ＦＶＩＩ ｄｓＲＮＡ（図１ａ）および配列番号対２５３／２５４を含むｄｓＲＮＡ（図１ｂ）をＬＮＰ０１（１：１４）リポソーム製剤中に４mg/kgでｉ．ｖ．注射後のモルモットにおけるＦＶＩＩ血漿濃度に及ぼすＦＶＩＩをターゲティングするｄｓＲＮＡ（「ＦＶＩＩ ｄｓＲＮＡ」）の効果。ルシフェラーゼｄｓＲＮＡ（配列番号対４１１／４１２）／ＬＮＰ０１およびＰＢＳは、対照である。結果は個別の動物からのものである。
【図２ａ】配列番号対２５９／２６０を含むＦＶＩＩ ｄｓＲＮＡ（「ＦＶＩＩ ｓｉＲＮＡ」）をＬＮＰ０１（１：１４）リポソーム製剤中に１、２、３、４、５mg/kgでｉ．ｖ．注射後の、肝臓ＦＶＩＩ ｍＲＮＡレベル（２ａ）および血漿ＦＶＩＩレベル（２ｂ）に及ぼすモルモットにおけるＦＶＩＩ ｄｓＲＮＡの効果。全ての測定は、注射後４８時間または７２時間に行った。ｍＲＮＡの結果は、ＰＢＳ処置群に対するパーセントで表し；ＦＶＩＩチモーゲンの結果は、処置前値に対するパーセントで表す。ルシフェラーゼｄｓＲＮＡ（配列番号対４１１／４１２；「Ｌｕｃ ｓｉＲＮＡ」）／ＬＮＰ０１およびＰＢＳは対照である。統計：平均±ｓｅｍ；＊はＡＮＯＶＡ、事後Ｄｕｎｎｅｔｔ検定；‡は多重ｔ検定。
【図２ｂ】配列番号対２５９／２６０を含むＦＶＩＩ ｄｓＲＮＡ（「ＦＶＩＩ ｓｉＲＮＡ」）をＬＮＰ０１（１：１４）リポソーム製剤中に１、２、３、４、５mg/kgでｉ．ｖ．注射後の、肝臓ＦＶＩＩ ｍＲＮＡレベル（２ａ）および血漿ＦＶＩＩレベル（２ｂ）に及ぼすモルモットにおけるＦＶＩＩ ｄｓＲＮＡの効果。全ての測定は、注射後４８時間または７２時間に行った。ｍＲＮＡの結果は、ＰＢＳ処置群に対するパーセントで表し；ＦＶＩＩチモーゲンの結果は、処置前値に対するパーセントで表す。ルシフェラーゼｄｓＲＮＡ（配列番号対４１１／４１２；「Ｌｕｃ ｓｉＲＮＡ」）／ＬＮＰ０１およびＰＢＳは対照である。統計：平均±ｓｅｍ；＊はＡＮＯＶＡ、事後Ｄｕｎｎｅｔｔ検定；‡は多重ｔ検定。
【図３】配列番号対２５９／２６０を含むＦＶＩＩ ｄｓＲＮＡ（「ＦＶＩＩ ｓｉＲＮＡ」）をＬＮＰ０１（１：１４）リポソーム製剤中に１、２、３、４、５mg/kgでｉ．ｖ．注射後のモルモットのプロトロンビン時間（ＰＴ）に及ぼすＦＶＩＩ ｄｓＲＮＡの効果。ＦＶＩＩ ｄｓＲＮＡのｉ．ｖ．注射直前（ベースライン）および注射の４８時間後または７２時間後に血液を採取した。処置前値に対する延長倍率で結果を表す（平均±ｓｅｍ）。ルシフェラーゼｄｓＲＮＡ（配列番号対４１１／４１２；「Ｌｕｃ ｓｉＲＮＡ」）／ＬＮＰ０１およびＰＢＳは、対照である。
【図４】配列番号対２５９／２６０を含むＦＶＩＩ ｄｓＲＮＡ（「ＦＶＩＩ ｄｓＲＮＡ」）をＬＮＰ０１（１：１４）リポソーム製剤中に１、２、３、４、５mg/kgでｉ．ｖ．注射後の、モルモット動脈血栓症モデルにおけるＦＶＩＩ ｄｓＲＮＡの抗血栓効果。全ての測定は、麻酔した動物において注射の４８時間後または７２時間後に行った（方法参照）。結果をＰＢＳ処置群に対するパーセントで表す。ルシフェラーゼｄｓＲＮＡ（配列番号対４１１／４１２；「Ｌｕｃ ｄｓＲＮＡ」）／ＬＮＰ０１およびＰＢＳは対照である。統計：平均±ｓｅｍ；＊はＡＮＯＶＡ、事後Ｄｕｎｎｅｔｔ検定；‡は多重ｔ検定。
【図５】配列番号対２５９／２６０を含むＦＶＩＩ ｄｓＲＮＡ（「ｓｉＦＶＩＩ」）をＳＮＡＬＰ−Ｌ製剤中に１、２、３、４、５mg/kgでｉ．ｖ．注射後の、肝臓ＦＶＩＩ ｍＲＮＡレベル（ａ）および血漿ＦＶＩＩレベル（ｂ）に及ぼすモルモットにおけるＦＶＩＩ ｄｓＲＮＡの効果。ルシフェラーゼｄｓＲＮＡ（配列番号対４１１／４１２；「ｓｉＬｕｃ」）／ＳＮＡＬＰ−ＬおよびＰＢＳは対照である。
【図６ａ】ＳＮＡＬＰ−Ｌ製剤中に配列番号対２５９／２６０を含むＦＶＩＩ ｄｓＲＮＡのｉ．ｖ．注射後のモルモットにおける（ａ）外科的失血および（ｂ）爪上皮出血時間に及ぼすＦＶＩＩ ｄｓＲＮＡの効果。結果は、ＰＢＳ処置群に対する増加倍率（外科的失血）および延長倍率（上皮出血時間）で表した。全ての測定は、注射後７２時間に行った。ＳＮＡＬＰ−Ｌ製剤中のルシフェラーゼｄｓＲＮＡ（配列番号対４１１／４１２）（Ｌｕｃ ｄｓＲＮＡ）およびＰＢＳは対照である。最大９５％のＦＶＩＩのダウンレギュレーションで（０．０５mg/kg〜２mg/kgのＦＶＩＩ ｄｓＲＮＡ）、両モデルにおいて出血傾向の増加は観察されなかった。
【図６ｂ】ＳＮＡＬＰ−Ｌ製剤中に配列番号対２５９／２６０を含むＦＶＩＩ ｄｓＲＮＡのｉ．ｖ．注射後のモルモットにおける（ａ）外科的失血および（ｂ）爪上皮出血時間に及ぼすＦＶＩＩ ｄｓＲＮＡの効果。結果は、ＰＢＳ処置群に対する増加倍率（外科的失血）および延長倍率（上皮出血時間）で表した。全ての測定は、注射後７２時間に行った。ＳＮＡＬＰ−Ｌ製剤中のルシフェラーゼｄｓＲＮＡ（配列番号対４１１／４１２）（Ｌｕｃ ｄｓＲＮＡ）およびＰＢＳは対照である。最大９５％のＦＶＩＩのダウンレギュレーションで（０．０５mg/kg〜２mg/kgのＦＶＩＩ ｄｓＲＮＡ）、両モデルにおいて出血傾向の増加は観察されなかった。
【図７】−血漿中ＦＶＩＩ活性とＰＴ延長の間の相関。ＦＶＩＩ ｄｓＲＮＡのｉｖ注射後のＦＶＩＩ活性の減少（ＬＮＰ０１およびＳＮＡＬＰ−Ｌ中に製剤化されたＦＶＩＩ ｄｓＲＮＡからのデータを合同したもの）は、ＦＶＩＩ依存性凝固パラメーターＰＴとよく相関した。
【図８】ルシフェラーゼｄｓＲＮＡ（配列番号対４１１／４１２）またはＦＶＩＩ ｄｓＲＮＡ（配列番号１９／２０）の単回ｉｖボーラス注射の投薬前ならびに２４時間後および４８時間後に発色アッセイによって３回測定された、カニクイザル血漿中のＦＶＩＩ活性。ｄｓＲＮＡに関する用量を各群についてmg/kgで示す。Ｎ＝２匹の雌性カニクイザル。各個別のサルの投薬前ＦＶＩＩ活性値の平均に対して値を標準化し、標準偏差を示すエラーバーを付ける。
【図９】ＳＮＡＬＰ製剤中のルシフェラーゼｄｓＲＮＡ（ｓｉＬＵＣ）（配列番号対４１１／４１２）またはＳＮＡＬＰ製剤中のＦＶＩＩ ｄｓＲＮＡ（ｓｉＦＶＩＩ）（配列番号１９／２０）の単回ｉｖボーラス注射の投薬前ならびに２４時間後および４８時間後に３回測定された、カニクイザル血漿中のプロトロンビン時間（ＰＴ）。ｄｓＲＮＡに関する用量を各群についてmg/kgで示す。Ｎ＝２匹の雌性カニクイザル。各個別のサルの投薬前ＰＴの平均に対して標準化した変化倍率として値を示し、標準偏差を示すエラーバーを付ける。
【図１０】ＳＮＡＬＰ製剤中のルシフェラーゼｄｓＲＮＡ（ｓｉＬＵＣ）（配列番号対４１１／４１２）またはＳＮＡＬＰ製剤中のＦＶＩＩ ｄｓＲＮＡ（ｓｉＦＶＩＩ）（配列番号１９／２０）の単回ｉｖボーラス注射の投薬前ならびに２４時間後および４８時間後に発色アッセイによって３回測定された、カニクイザル血漿中のＦＶＩＩ活性。ｄｓＲＮＡに関する用量を各群についてmg/kgで示した。Ｎ＝２匹の雄性カニクイザル、１mg/kgのＦＶＩＩ ｄｓＲＮＡ群（ｎ＝３匹の雄性カニクイザル）および３mg/kgのルシフェラーゼｄｓＲＮＡ群（ｎ＝２匹の雌性カニクイザル）を例外とする。１００％に設定した各個別のサルの投薬前ＦＶＩＩ活性値の平均に対して値を標準化した。エラーバーは、各群におけるサルの最小／最大値を示す。
【図１１】ＳＮＡＬＰ製剤中のルシフェラーゼｄｓＲＮＡ（ｓｉＬＵＣ）（配列番号対４１１／４１２）またはＳＮＡＬＰ製剤中のＦＶＩＩ ｄｓＲＮＡ（ｓｉＦＶＩＩ）（配列番号１９／２０）の単回ｉｖボーラス注射の投薬前ならびに２４時間後および４８時間後に３回測定されたカニクイザル血漿中のプロトロンビン時間（ＰＴ）。ｄｓＲＮＡに関する用量を各群についてmg/kgで示す。Ｎ＝２匹の雄性カニクイザル、１mg/kgのＦＶＩＩ ｄｓＲＮＡ群（ｎ＝３匹の雄性カニクイザル）および３mg/kgのルシフェラーゼｄｓＲＮＡ群（ｎ＝２匹の雌性カニクイザル）を例外とする。１に設定した各個別のサルの投薬前ＰＴ値の平均に対して標準化したＰＴ変化倍率として値を示す。エラーバーは、各群におけるサルの最小／最大値を示す。
【図１２】ＳＮＡＬＰ製剤中のルシフェラーゼｄｓＲＮＡ（ｓｉＬＵＣ）（配列番号対４１１／４１２）またはＳＮＡＬＰ製剤中のＦＶＩＩ ｄｓＲＮＡ（ｓｉＦＶＩＩ）（配列番号１９／２０）の単回ｉｖボーラス注射前後に経時的に、カニクイザル血清中のＦＶＩＩ活性を追跡した。ＦＶＩＩ活性は、投薬前および投薬後の表示時点に３回発色アッセイによって測定した。ｄｓＲＮＡに関する用量は、各動物についてmg/kgで表し、数字は、試験における個別の動物の番号を示す。注射した日に１００％に設定した各動物の投薬前の平均に対して曲線を標準化する。
【図１３】カニクイザル血漿中のプロトロンビン時間（ＰＴ）を、ＳＮＡＬＰ製剤中のルシフェラーゼｄｓＲＮＡ（ｓｉＬＵＣ）（配列番号対４１１／４１２）またはＳＮＡＬＰ製剤中のＦＶＩＩ ｄｓＲＮＡ（ｓｉＦＶＩＩ）（配列番号１９／２０）の単回ｉｖボーラス注射前後に経時的に追跡した。ＰＴは、投薬前および投薬後の表示時点に３回測定した。ｄｓＲＮＡに関する用量は、各動物についてmg/kgで示し、数字は、試験における個別の動物の番号を表示する。値はＰＴの変化倍率として示し、曲線は、注射の日に１に設定した各動物の投薬前の平均に対して標準化する。
【図１４】カニクイザル血漿中のＦＶＩＩ活性を、ＳＮＡＬＰ製剤中のＦＶＩＩ ｄｓＲＮＡ（ｓｉＦＶＩＩ）（配列番号１９／２０）を３mg/kgで反復ｉｖボーラス注射前後に経時的に追跡した。ＦＶＩＩ活性を、投薬前および投薬後の表示時点に３回発色アッセイによって測定した。最初に注射した日に１００％に設定した各動物の投薬前の平均に対して曲線を標準化する。
【図１５】カニクイザル血漿におけるプロトロンビン時間（ＰＴ）を、ＳＮＡＬＰ製剤中のＦＶＩＩ ｄｓＲＮＡ（ｓｉＦＶＩＩ）（配列番号１９／２０）の反復ｉｖボーラス注射前後に経時的に追跡した。３mg/kgを投薬前および投薬後の表示時点に３回ＰＴを測定した。値をＰＴ変化倍率として示し、曲線を、注射した日に１に設定した各動物の投薬前の平均に対して標準化する。
【図１６】オフターゲット配列のサイレンシングに及ぼす、配列番号対１３／１４を含むＦＶＩＩ ｄｓＲＮＡの効果。ＦＶＩＩ ｍＲＮＡの１９塩基長ターゲット部位（「ｏｎ」）またはin silicoで予測されたオフターゲット配列（「ｏｆｆ１」〜「ｏｆｆ１０」；「ｏｆｆ１」〜「ｏｆｆ８」はアンチセンス鎖オフターゲットであり、「ｏｆｆ９」〜「ｏｆｆ１０」はセンス鎖オフターゲットである）のいずれかを表わすデュアルルシフェラーゼ構築物を発現しているＣＯＳ７細胞に５０nMのＦＶＩＩ ｄｓＲＮＡをトランスフェクション後のウミシイタケルシフェラーゼタンパク質の発現。完全にマッチするオフターゲットｄｓＲＮＡは、対応するターゲット部位の機能的サイレンシングについての陽性対照である。
【図１７】オフターゲット配列のサイレンシングに及ぼす、配列番号対１９／２０を含むＦＶＩＩ ｄｓＲＮＡの効果。ＦＶＩＩ ｍＲＮＡの１９塩基長ターゲット部位（「ｏｎ」）またはインシリコで予測されたオフターゲット配列（「ｏｆｆ１」〜「ｏｆｆ１７」；「ｏｆｆ１」〜「ｏｆｆ１４」はアンチセンス鎖オフターゲットであり、「ｏｆｆ１５」〜「ｏｆｆ１７」はセンス鎖オフターゲットである）のいずれかを表わすデュアルルシフェラーゼ構築物を発現しているＣＯＳ７細胞に５０nMのＦＶＩＩ ｄｓＲＮＡをトランスフェクション後のウミシイタケルシフェラーゼタンパク質の発現。完全にマッチするオフターゲットｄｓＲＮＡは、対応するターゲット部位の機能的サイレンシングについての陽性対照である。ｏｆｆ１１と同じ１０個のヌクレオチドを上流および下流に有する、第ＶＩＩ因子ｍＲＮＡのターゲット部位をクローニングし、機能的ターゲット部位を作製した。
【図１８】オフターゲット配列のサイレンシングに及ぼす、配列番号対１１／１２を含むＦＶＩＩ ｄｓＲＮＡの効果。ＦＶＩＩ ｍＲＮＡの１９塩基長ターゲット部位（「ｏｎ」）またはin silicoで予測されたオフターゲット配列（「ｏｆｆ１」〜「ｏｆｆ１６」；「ｏｆｆ１」〜「ｏｆｆ１３」はアンチセンス鎖オフターゲットであり、「ｏｆｆ１４」〜「ｏｆｆ１６」は、センス鎖オフターゲットである）のいずれかを表わすデュアルルシフェラーゼ構築物を発現しているＣＯＳ７細胞に５０nMのＦＶＩＩ ｄｓＲＮＡをトランスフェクション後のウミシイタケルシフェラーゼタンパク質の発現。完全にマッチするオフターゲットｄｓＲＮＡは、対応するターゲット部位の機能的サイレンシングについての陽性対照である。配列番号対１９／２０についてｏｆｆ１１と同じ１０個のヌクレオチドを上流および下流に有する第ＶＩＩ因子ｍＲＮＡのターゲット部位をクローニングし、機能的ターゲット部位を作製した。
【０１３０】
表１ − ヒト第ＶＩＩ因子遺伝子をターゲティングするｄｓＲＮＡ。大文字はＲＮＡヌクレオチドを表し、小文字「ｃ」、「ｇ」、「ａ」および「ｕ」は、２’−Ｏ−メチル−改変ヌクレオチドを表し、「ｓ」はホスホロチオエートを、そして「ｄＴ」はデオキシチミジンを表す。
表２ − ヒト第ＶＩＩ因子をターゲティングするｄｓＲＮＡの特徴付け：Ｈｕｈ７細胞における用量反応についての活性試験。ＩＣ５０：５０％阻害濃度。
表３ − ヒト第ＶＩＩ因子をターゲティングするｄｓＲＮＡの特徴づけ：安定性およびサイトカイン誘導。ｔ１／２：実施例において同義の鎖半減期、ＰＢＭＣ：ヒト末梢血単核細胞。
表４ − モルモット第ＶＩＩ因子遺伝子をターゲティングするｄｓＲＮＡ。大文字はＲＮＡヌクレオチドを表し、小文字「ｃ」、「ｇ」、「ａ」および「ｕ」は、２’−Ｏ−メチル−改変ヌクレオチドを表し、「ｓ」はホスホロチオエートを、そして「ｄＴ」はデオキシチミジンを表す。「ｆ」は、前述のヌクレオチドの２’−フルオロ改変を表す。
表５ − モルモット第ＶＩＩ因子をターゲティングするｄｓＲＮＡの特徴づけ。ＩＣ５０：５０％阻害濃度、ＰＢＭＣ：ヒト末梢血単核細胞。
表６ − ヒト第ＶＩＩ因子遺伝子をターゲティングするｄｓＲＮＡ。大文字はＲＮＡヌクレオチドを表し、「Ｔ」はデオキシチミジンを表す。
表７ − モルモット第ＶＩＩ因子遺伝子をターゲティングするｄｓＲＮＡ。大文字はＲＮＡヌクレオチドを表し、「Ｔ」はデオキシチミジンを表す。
表８ − 配列番号対１３／１４を含む、ヒトＦＶＩＩをターゲティングするｄｓＲＮＡの選択されたオフターゲット。
表９ − 配列番号対１９／２０を含む、ヒトＦＶＩＩをターゲティングするｄｓＲＮＡの選択されたオフターゲット。
表１０ − 配列番号対１１／１２を含む、ヒトＦＶＩＩをターゲティングするｄｓＲＮＡの選択されたオフターゲット。
【０１３１】
実施例
治療用途のｄｓＲＮＡの同定
ヒト第ＶＩＩ因子を特異的にターゲティングする治療用途のｄｓＲＮＡを同定するために、ｄｓＲＮＡの設計を実施した。まず、ヒト（Homo sapiens）第ＶＩＩ因子の既知のｍＲＮＡ配列（配列番号４０６および配列番号４０７として記載されたＮＭ＿０１９６１６およびＮＭ＿０００１３１．３）をコンピューター解析によって調査し、これらの配列の間で交差反応性のＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）作用物質を生成する１９個のヌクレオチドの相同配列を同定した。
【０１３２】
ＲＮＡｉ作用物質の同定にあたり、ｆａｓｔＡアルゴリズムを用いて、ヒトＲｅｆＳｅｑデータベース（リリース２５）（広範なヒトトランスクリプトームを表わすと仮定した）における任意の他の配列に対して少なくとも２個のミスマッチを有する１９塩基長配列に限って選択を行った。
【０１３３】
１６匹のサルからＲＴ−ＰＣＲ増幅後に、カニクイザル（Macaca fascicularis）第ＶＩＩ因子遺伝子のＣＤＳ（コード配列）を配列決定した。この配列をＮＣＢＩ ＥＳＴ／ＥＭＢＬ ＢＢ８８５０５９ ＥＳＴ（配列番号４０８）の逆相補体と一緒に使用して、カニクイザル第ＶＩＩ因子についての代表的なコンセンサス配列（配列番号４０９参照）を作製させた。
【０１３４】
ヒトに加えてカニクイザルの第ＶＩＩ因子に交差反応性のｄｓＲＮＡを、治療用途に最も好ましいと決定した。４個以上の連続するＧ’（ポリ−Ｇ配列）を有する全ての配列を合成から除外した。
【０１３５】
このように同定された配列は、表１および６におけるＲＮＡｉ作用物質を合成するための基礎とした。
【０１３６】
in vivo概念実証研究のためのｄｓＲＮＡの同定
in vivo概念実証実験のための、モルモット（Cavia porcellus）第ＶＩＩ因子に加えて、前述のin vitroスクリーニング目的のヒト第ＶＩＩ因子をターゲティングするｄｓＲＮＡを同定するために、ｄｓＲＮＡの設計を実施した。まず、モルモット第ＶＩＩ因子について予測される転写物ＥＮＳＥＭＢＬ（ＥＮＳＣＰＯＴ０００００００５３５３、配列番号４１０）およびヒト第ＶＩＩ因子のどちらも既知のｍＲＮＡ配列（配列番号４０６および配列番号４０７として記載されたＮＭ＿０１９６１６およびＮＭ＿０００１３１．３）を、コンピューター解析によって調査し、これらの配列の間で交差反応性のＲＮＡｉ作用物質を生成する１９個のヌクレオチドの相同配列を同定した。
【０１３７】
４個以上の連続するＧ（ポリ−Ｇ配列）を有する全ての配列を合成から除外した。このように同定された配列は、表４および７におけるＲＮＡｉ作用物質を合成するための基礎とした。
【０１３８】
ｄｓＲＮＡの合成
本明細書において試薬の入手源を具体的に示さない場合、そのような試薬は、分子生物学適用基準の品質／純度の分子生物学用試薬を供給する任意の供給業者から得ることができる。
【０１３９】
Expedite 8909合成装置（Applied Biosystems、Applera Deutschland GmbH, Darmstadt, Germany）および固体支持体として多孔質ガラス（ＣＰＧ、５００Å、Proligo Biochemie GmbH, Hamburg, Germany）を使用して、１μmolスケールの固相合成によって１本鎖ＲＮＡを作製した。ＲＮＡおよび２’−Ｏ−メチルヌクレオチドを有するＲＮＡを、それぞれ対応するホスホルアミダイトおよび２’−Ｏ−メチルホスホルアミダイトを用いた固相合成に（Proligo Biochemie GmbH, Hamburg, Germany）によって作製した。Current protocols in nucleic acid chemistry, Beaucage, S.L. et al. (Edrs.), John Wiley & Sons, Inc., New York, NY, USAに記載されているような標準的なヌクレオシドホスホルアミダイト化学反応を用いて、オリゴリボヌクレオチド鎖の配列内の選択された部位にこれらの構成要素を導入した。ヨウ素酸化剤溶液をBeaucage試薬（Chruachem Ltd, Glasgow, UK）のアセトニトリル溶液（１％）に交換することによって、ホスホロチオエート結合を導入した。さらなる補助試薬をMallinckrodt Baker（Griesheim, Germany）から得た。
【０１４０】
確立された手順により、陰イオン交換ＨＰＬＣによる粗オリゴリボヌクレオチドの脱保護および精製を実施した。分光光度計（DU 640B, Beckman Coulter GmbH, Unterschleissheim, Germany）を使用して波長２６０nmでそれぞれのＲＮＡの溶液のＵＶ吸収によって収量および濃度を決定した。アニーリング緩衝液（２０mMリン酸ナトリウム、ｐＨ６．８；１００mM塩化ナトリウム）中で等モルの相補鎖溶液を混合し、水浴中、８５〜９０℃で３分間加熱し、３〜４時間室温に冷却することによって二本鎖ＲＮＡを作製した。アニーリングしたＲＮＡ溶液を使用まで−２０℃で保存した。
【０１４１】
活性試験
上記第ＶＩＩ因子−ｄｓＲＮＡの活性をＨｕｈ７細胞で試験した。
【０１４２】
第ＶＩＩ因子特異的ｄｓＲＮＡと共にインキュベーションした細胞から得られた総ｍＲＮＡ中の分岐ＤＮＡによる第ＶＩＩ因子ｍＲＮＡの定量のために培養Ｈｕｈ７細胞を使用した。
【０１４３】
Ｈｕｈ７細胞をAmerican Type Culture Collection（Rockville, Md.、カタログ番号HB-8065）から入手し、５％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）（Gibco Invitrogen、カタログ番号16250-078）、１％ペニシリン／ストレプトマイシン（Gibco Invitrogen、カタログ番号15140-122）を含有するように補充したフェノールレッド不含ＤＭＥＭ／Ｆ−１２（Gibco Invitrogen, Germany、カタログ番号11039-021）中、３７℃の加湿インキュベーター（Heraeus HERAcell, Kendro Laboratory Products, Langenselbold, Germany）中で５％ ＣＯ２雰囲気中で培養した。
【０１４４】
細胞の接種およびｄｓＲＮＡのトランスフェクションを同時に行った。ｄｓＲＮＡをトランスフェクションするために、９６ウェルプレートにＨｕｈ７細胞を２．５×１０４個細胞／ウェルの密度で蒔いた。製造業者によって記載されたように、リポフェクトアミン２０００（Invitrogen GmbH, Karlsruhe, Germany、カタログ番号11668-019）を用いてｄｓＲＮＡのトランスフェクションを実施した。最初の単回投与実験において、ｄｓＲＮＡをＨｕｈ７細胞に３０nMの濃度でトランスフェクションした。各データ点を４連実施で決定した。２回の独立した実験を行った。３０nMの単用量選別により７０％を超えるｍＲＮＡノックダウンを示す最も有効なｄｓＲＮＡを用量反応曲線によってさらに特徴づけた。用量反応曲線に関して、上記単用量選別について記載されたようにトランスフェクションを行ったが、ｄｓＲＮＡ濃度（nM）は、以下：２４、６、１．５、０．３７５、０．０９３８、０．０２３４、０．００５９、０．００１５、０．０００４および０．０００１nMとした。トランスフェクション後に細胞を加湿インキュベーター（Heraeus GmbH, Hanau, Germany）中で３７℃および５％ ＣＯ２で２４時間インキュベーションした。第ＶＩＩ因子ｍＲＮＡを測定するために、ｍＲＮＡのｂＤＮＡ定量にはより高感度のQuantiGene 2.0 Assay Kit（Panomics, Fremont, Calif., USA、カタログ番号QS0011）を使用し、一方、ＧＡＰ−ＤＨ ｍＲＮＡの測定にはQuantiGene 1.0 Assay Kit（Panomics, Fremont, Calif., USA、カタログ番号：QG0004）を使用した。トランスフェクションされたＨｕｈ７細胞を回収し、製造業者が勧める手順により５３℃で溶解させた。５０μlの溶解液をそれぞれヒト第ＶＩＩ因子ｍＲＮＡまたはモルモット第ＶＩＩ因子に特異的なプローブセット（プローブセットの配列は下記参照）と共にインキュベーションし、QuantiGeneについての製造業者のプロトコールに従い処理した。ＧＡＰ−ＤＨ ｍＲＮＡの測定のために、ＧＡＰ−ＤＨ特異的プローブセットを用いて１０μlの細胞溶解液を分析した。Victor2-Light（Perkin Elmer, Wiesbaden, Germany）でＲＬＵ（相対発光量）として化学発光を測定し、ヒト第ＶＩＩ因子プローブセットで得られた値を、各ウェルについてのそれぞれのヒトＧＡＰＤＨ値に対して標準化した。無関係の対照ｄｓＲＮＡを陰性対照として使用した。表２および５に阻害データを示す。
【０１４５】
【表１】
【０１４６】
【表２】
【０１４７】
ｄｓＲＮＡの安定性
各１本鎖の半減期を測定することによってヒト血清またはカニクイザル血漿のいずれかを用いたin vitroアッセイでｄｓＲＮＡの安定性を決定した。
【０１４８】
３０μｌのヒト血清またはカニクイザル血漿（Sigma Aldrich）と混合した３μlの５０μM ｄｓＲＮＡ試料を用いて、各時点について３連で測定を実施した。混合物を３７℃で０分間、３０分間、１時間、３時間、６時間、２４時間、または４８時間のいずれかの時間インキュベーションした。非特異的分解についての対照として、ｄｓＲＮＡを３０μlの１×ＰＢＳ（ｐＨ６．８）と共に４８時間インキュベーションした。４μlのプロテイナーゼＫ（２０mg/ml）、２５μlの「Tissue and Cell Lysis Solution」(Epicentre)および３８μlのMillipore水を６５℃で３０分間添加して反応を停止させた。その後、１４００rpmで８分間、０．２μmの９６ウェルフィルタープレートで試料を遠心濾過し、５５μlのMillipore水で２回洗浄し、再度遠心濾過した。
【０１４９】
１本鎖の分離および残りの全長産物（ＦＬＰ）の分析のために、溶出液Ａとして１０％ ＡＣＮ中の２０mM Ｎａ３ＰＯ４（ｐＨ＝１１）および溶出液Ｂについて溶出液Ａ中の１Ｍ ＮａＢｒを使用して、変性条件でイオン交換Dionex Summit HPLCに試料を流した。
【０１５０】
以下の勾配を加えた：
【０１５１】
【表３】
【０１５２】
各注入について、クロマトグラムをDionex Chromeleon 6.60 HPLCソフトウェアで自動的に積分し、必要に応じて手動で調整した。全てのピーク面積を内部標準（ＩＳ）のピークに対して補正し、ｔ＝０分でのインキュベーションに対して標準化した。ピーク下面積および残留ＦＬＰを各一本鎖および３連実施について別々計算した。３連実施についてＦＬＰの半分が分解した平均時点［ｈ］により鎖半減期（ｔ１／２）を定義した。結果を表３および５に示す。
【０１５３】
サイトカイン誘導
in vitroＰＢＭＣアッセイにおけるＩＮＦ−αおよびＴＮＦ−αの放出を測定することによってｄｓＲＮＡの潜在的サイトカイン誘導を決定した。
【０１５４】
ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、トランスフェクションした日に２人のドナーの血液バフィーコートからFicoll遠心分離によって単離した。細胞にｄｓＲＮＡを４連でトランスフェクションし、Gene Porter 2（ＧＰ２）またはＤＯＴＡＰのいずれかをＯｐｔｉ−ＭＥＭ中で１３０nMの終濃度で使用して３７℃で２４時間培養した。このアッセイにおいてＩＮＦ−αおよびＴＮＦ−αを誘導することが知られているｄｓＲＮＡ配列およびＣｐＧオリゴを陽性対照として使用した。サイトカイン誘導にトランスフェクション試薬を必要としない、化学コンジュゲーションしたｄｓＲＮＡまたはＣｐＧオリゴヌクレオチドを培地中に５００nMの濃度でインキュベーションした。インキュベーションの終了時に、４連で培養上清をプールした。
【０１５５】
次に、これらのプールした上清中のＩＮＦ−αおよびＴＮＦ−αを、標準的なサンドイッチＥＬＩＳＡによってプール１個あたり２個のデータ点で測定した。サイトカイン誘導度は、０〜５の評点を利用して陽性対照と比較して表し、５は最大誘導を示した。結果を表３及び５に示す。
【０１５６】
ＦＶＩＩをターゲティングするｄｓＲＮＡのin vivo効果（モルモット）
抗血栓効果
新規な抗血栓薬のin vivo効力を評価するために以前に開発された検証済みモルモット動脈血栓症モデルで上記ＦＶＩＩ ｄｓＲＮＡの活性を試験した（Himber J. et al., Thromb Haemost. (2001); 85:475-481）。
【０１５７】
雄性モルモット（３５０〜４５０ｇ、ＣＲＬ：（ＨＡ）ＢＲ、Charles River(Germany）を、ケタミン−ＨＣｌ ９０mg/kgおよびキシラジン２％ １０mg/kgによるｉ．ｍ．誘導に続く連続ガス麻酔によって麻酔した。吸入器を介し、麻酔薬を供給し、同時に過剰の蒸気を除去するダブル吸入マスクからＯ２／空気４０：６０中に１〜３Vol％のイソフルランを注入した（Provet AG, Switzerland）。体温をサーモスタットで３８℃に保った。
【０１５８】
モルモットを仰臥位にし、採血用に右大腿動脈にカテーテル（TriCath In 22G、０．８mm×３０mm, Codan Steritex ApS, Espergaerde, Denmark）を留置した。右頸動脈を解剖して露出させ、Transit Time流量計モジュール（TS420, Transonic Systems Inc. Ithaca, NY,USA）に連結された血管周囲超音波流量プローブ（Transonic 0.7 PSB 232）を頸動脈周辺に配置し、血流速度をモニタリングした。頸動脈血流速度をGraphtec LinearレコーダーVII（Model WR 3101, Hugo Sachs, March-Hugstetten, Germany）で記録した。
【０１５９】
５〜１５分間の血流を安定させた後で、ゴム被覆鉗子を用いて、解剖された頸動脈の１mm部分を１０秒間ピッチングすることによって流量プローブから２mm遠位に内皮下層の損傷を起こした。損傷後に、血流の緩徐な減少が起こり、完全な血管閉塞が起こった。流量がゼロに達した場合は、損傷領域の頸動脈を軽く揺り動かし、閉塞性血栓を除去し、流量を回復させ、周期的流量変化（ＣＦＶ）を生じさせた。ＣＦＶが８分間観察されなかった場合、最初の損傷部位でピンチングを繰り返した。ＣＦＶが起こらなかった場合は、同じ手順を８分毎に繰り返した。最終的に、ＣＦＶが起こるために必要なピンチの回数を４０分の観察時間にわたり計数した。このプロトコールを用いて、各ＣＦＶの平均周期は、対照動物において約３〜５分/サイクルであった。ピンチの回数に対するＣＦＶ数の比として血栓症指数を計算した。
【０１６０】
血管壁損傷の４８または７２時間前に、麻酔したモルモットの頸静脈に上記ＦＶＩＩ ｄｓＲＮＡを注射した。採取した血液を１０８mMクエン酸ナトリウム溶液に（１：１０の容量で）加えてから、薬物の注射を開始し、血管壁を損傷させた。
【０１６１】
出血時間および失血
以前に記載されたように爪上皮出血時間（ＮＣＢＴ）の試験を行った（Himber J. et al., Thromb Haemost. (1997) 78:1142-1149）。機械的損傷によって誘導した動脈血栓症の試験を行ったのと同じ動物でＮＣＢＴを評価した。麻酔したモルモットにおいて、爪切りを用いて前肢の爪上皮頂端に標準的な切断を行い、足を３７℃の水面と接触させたままにし、水中に流血させた。出血時間は、出血が完全に停止した上皮切断後の時間として定義した。２分以内に再度出血した場合は、出血時間を初回出血時間と合計した。４０分の実験的血栓症時間の直後にこの操作を同時に３回行った。結果を対照群の値に対する延長倍率で表す。
【０１６２】
外科的失血（ＳＢＬ）もまた、ＮＣＢＴの直後に同じ動物から測定した。麻酔したモルモットを背臥位にし、頸を剃毛し、外科用メス（AESCULAP BB 524）で耳から肩甲骨まで正中切開（長さ４０〜５０mm、深さ５mm）を行った。切開の直後に、傷に縦にあてた歯科用ガーゼロール（No.1-14 111 00, φ８mm、長さ４０mm、Internationale Verbandstoff Fabrik, Neuhausen, Switzerland）に血液を染みこませた。歯科用ロールを傷に５分間あてる前後に秤量し、重量差を５分あたりの失血量（mg）と定義した。１時間評価した総失血量は、１時間の測定時間内に傷にあてられた１２個の歯科用ロールに染みこんだ血液の合計量に対応する。
【０１６３】
続いてペントバルビタール（１００mg/kg）のｉ．ｖ．注射により動物を安楽死させ、肝臓を素早く取り出した。肝臓１ｇを液体窒素中でショック凍結し、下記のようにＦＶＩＩ ｍＲＮＡを測定した。
【０１６４】
血漿のアッセイ
市販の発色アッセイ（BIOPHEN FVII kit; ref 221304, HYPHEN BioMed, France）を使用して、モルモット血漿中のＦＶＩＩレベルを決定した。処置前レベルに対するパーセントでＦＶＩＩレベルを表した。凝固傾向および出血傾向のマーカーとして使用されるプロトロンビン時間（ＰＴ）は、活性化因子としてヒトリコンビナント−ヒト組織因子（Dade Innovin, Dade Behring, Marburg, Germany）を使用して決定し、活性化部分トロンボプラスチン時間（ａＰＴＴ）は、活性化因子としてリン脂質を使用することにより決定した（Dade Actin, Dade Behring, Marburg, Germany）。ACL3000plus Coagulation Systems Analyzerを使用してＰＴおよびａＰＴＴを測定し、処置前値に対する延長倍率で表す。Hitachi 912 Automatic Analyser（Boehringer Mannheim, Germany）およびALT Kit No. 10851132216、AST(Asat/Got) Kit No. 10851124216, Roche Diagnostics, Switzerland）を使用してアラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）およびアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）を測定した。
【０１６５】
血球数、血小板およびヘマトクリットを測定するために、採取した血液試料を、ＥＤＴＡの中にも加えた（Cobas Helios VET, F. Hoffmann-La Roche, Basel, Switzerland）。
【０１６６】
以前に記載されたように、ｄｓＲＮＡをＬＮＰ０１に入れて製剤化した（Akinc, A. et al., Nature Biotech 2008, 26(5):561-9）。加えて、ＳＮＡＬＰ−Ｌに入れて製剤化されたｄｓＲＮＡを試験した（Judge A.D. et al., J. Clinic. Invest. 2009, 119(3):661-73）。
【０１６７】
【表４】
【０１６８】
【表５】
【０１６９】
モルモット肝臓組織中のＦＶＩＩ ｍＲＮＡの測定：
QuantiGene 1.0 branched DNA (bDNA) Assay Kit（Panomics, Fremont, Calif., USA、カタログ番号：QG0004）を使用して肝臓組織からのＦＶＩＩ ｍＲＮＡの測定を行った。
【０１７０】
剖検時に１〜２ｇの肝臓組織を液体窒素中で急速凍結した。乳鉢および乳棒を用いて凍結組織をドライアイス上で粉末化した。冷却した１．５ml反応チューブに１５〜２５mgの組織を移し、Lysis Mixtureを１：３でMilliQ水に予備希釈したもの１mlおよび３．３μl プロテイナーゼＫ（５０μg/μl）を添加し、３０〜５０％出力の超音波処理（HD2070, Bandelin, Berlin, Germany）を数秒間行うことによって組織を溶解した。分析まで溶解物を−８０℃で保存した。ｍＲＮＡ分析のために、溶解物を解凍し、１０００rpmおよび６５℃で１５分間プロテイナーゼＫで消化した（Thermomixer comfort, Eppendorf, Hamburg, Germany）。ＦＶＩＩおよびＧＡＰＤＨのｍＲＮＡレベルをQuantiGene 1.0 bDNA Assay Kit試薬を使用して製造業者の推奨により決定した。２０μlの溶解物およびモルモット（cavia porcellus）ＦＶＩＩプローブセットを使用してＦＶＩＩの発現を分析し、ＧＡＰＤＨの発現を、４０μlの溶解物およびモルモットと交差反応することが示されたラット（rattus norwegicus）プローブセット（プローブセットの配列は下記参照）を使用して分析した。アッセイ終了時の化学ルミネセンスシグナルは、Victor 2 Light luminescence counter（Perkin Elmer, Wiesbaden, Germany）で相対発光量（ＲＬＵ）として測定した。ＦＶＩＩシグナルを同じ溶解物のＧＡＰＤＨシグナルで除算し、ＧＡＰＤＨに対して標準化したＦＶＩＩの発現として値を示した。
【０１７１】
例として（図１）、ＬＮＰ０１リポソーム製剤中に配列番号対２５９／２６０を含むＦＶＩＩ ｄｓＲＮＡおよび配列番号対２５３／２５４を含むＦＶＩＩ ｄｓＲＮＡ［脂質：ｄｓＲＮＡ比(w/w)１４：１、９６％の封入率、サイズ８０〜８５nm］を４mg/kgでモルモット頸静脈に注射後に、ＦＶＩＩの血漿レベルの経時変化を３および５日間追跡した。最大のＦＶＩＩノックダウンは、注射後２４時間で達成され、少なくとも７２時間継続した。
【０１７２】
モルモット動脈血栓症モデルにおいて、配列番号対２５９／２６０を含むＦＶＩＩ ｄｓＲＮＡ／ＬＮＰ０１（１：１４）を１、２、３、４、５mg/kg、単回ｉ．ｖ．投与で試験した。リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）およびルシフェラーゼｄｓＲＮＡ（配列番号対４１１／４１２）／ＬＮＰ０１（１：１４）を対照として使用した。肝臓のＦＶＩＩ ｍＲＮＡレベル（図２ａ）および血漿ＦＶＩＩチモーゲンレベル（図２ｂ）は、用量依存的に減少し、一方ＰＴは延長した（図３）。
【０１７３】
血漿のＦＶＩＩの８０％を超えるノックダウンは、モルモット動脈血栓症モデルにおいて血栓形成の有意な阻害に関連した。観察されたＩＣ５０は、配列番号対２５９／２６０を含むＦＶＩＩ ｄｓＲＮＡ／ＬＮＰ０１（１：１４）で１〜２mg/kgであった。配列番号対２５９／２６０を含む３、４、５mg/kgのＦＶＩＩ ｄｓＲＮＡ／ＬＮＰ０１（１：１４）でＦＶＩＩ血漿ノックダウン（約９５％）と肝臓ｍＲＮＡのノックダウン（約８０％）とが類似していることは、抗血栓効果が類似していることに関連した（血栓形成の約９０％阻害）（図４）。
【０１７４】
・ １mg/kgは、肝臓においてＦＶＩＩ ｍＲＮＡの５６％のノックダウン、血漿においてＦＶＩＩの６２％のノックダウンを誘導し、ＰＴを１．３倍延長し、トロンビン産生（ピーク高）を４％阻害し、血栓形成を約２６％阻害した。
・ ２mg/kgは、肝臓においてＦＶＩＩ ｍＲＮＡの７３％のノックダウン、血漿においてＦＶＩＩの８４％のノックダウンを誘導し、ＰＴを１．６倍延長し、トロンビン産生（ピーク高）を２２％阻害し、血栓形成を約６２％阻害した。
・ ３mg/kgは、肝臓においてＦＶＩＩ ｍＲＮＡの８１％のノックダウン、血漿においてＦＶＩＩの９３％のノックダウンを誘導し、ＰＴを２．０倍延長し、トロンビン産生（ピーク高）を２７％阻害し、血栓形成を約８２％阻害した。
・ ４mg/kgは、肝臓においてＦＶＩＩ ｍＲＮＡの８０％のノックダウン、血漿においてＦＶＩＩの９３％のノックダウンを誘導し、ＰＴを２．３倍延長し、トロンビン産生（ピーク高）を４３％阻害し、血栓形成を約９１％阻害した。
・ ５mg/kgは、肝臓においてＦＶＩＩ ｍＲＮＡの８０％のノックダウン、血漿においてＦＶＩＩの９５％のノックダウンを誘導し、ＰＴを２．４倍延長し、トロンビン産生（ピーク高）を４０％阻害し、血栓形成を約９２％阻害した。
【０１７５】
爪上皮出血時間および外科的失血によって評価した出血は、配列番号対２５９／２６０の被験ＦＶＩＩ ｄｓＲＮＡ／ＬＮＰ０１（１：１４）の用量（１、２、３、４、５mg/kg）で有意には影響されず、これは、血漿中で正常な止血が最大約９５％のＦＶＩＩノックダウンまで維持されたことを示唆している。
【０１７６】
図５は、配列番号対２５９／２６０を含むＦＶＩＩ ｄｓＲＮＡをＳＮＡＬＰ−Ｌに入れて製剤化した場合の、肝臓のＦＶＩＩ ｍＲＮＡレベル（図５ａ）および血漿のＦＶＩＩ チモーゲンレベル（図５ｂ）を示す。
【０１７７】
図６は、ＳＮＡＬＰ−Ｌ製剤中に配列番号対２５９／２６０を含むＦＶＩＩ ｄｓＲＮＡ（ｓｉＦＶＩＩ）をｉ．ｖ．注射後のモルモットにおける（ａ）外科的失血および（ｂ）爪上皮出血時間に及ぼすＦＶＩＩ ｄｓＲＮＡの効果を示す。
【０１７８】
図７は、血漿のＦＶＩＩ活性とＰＴ延長との相関を示す。ＦＶＩＩ活性は、ＦＶＩＩ ｄｓＲＮＡのｉｖ注射後に減少し（ＬＮＰ０１およびＳＮＡＬＰ−Ｌ中で製剤化したＦＶＩＩ ｄｓＲＮＡからの合併データ）、それは、ＦＶＩＩ依存性凝固パラメーターＰＴとよく相関する。
【０１７９】
ＦＶＩＩをターゲティングするｄｓＲＮＡのin vivo効果（Macaca fascicularis）
以下の研究のために、等張緩衝液中の脂質粒子中のｄｓＲＮＡの滅菌製剤（「安定核酸−脂質粒子」（ＳＮＡＬＰ）技法、Tekmira Pharmaceuticals Corporation, Canada）を使用した。
【０１８０】
サル（Macaca fascicularis）における単回用量設定研究
０．３mg/kg〜１０mg/kgのＦＶＩＩ ｄｓＲＮＡ（配列番号１９／２０）の単回ｉｖボーラス注射をサルに行った。対照群には、脂質粒子によって起こる作用とＲＮＡｉ介在性作用を識別するために、１０mg/kgの高用量のルシフェラーゼｄｓＲＮＡ（配列番号４１１／４１２）を投与した。注射の４８時間後にサルを屠殺した。
【０１８１】
血漿および肝臓において薬理効果をモニタリングした。注射の２４時間後および４８時間後の血漿のＦＶＩＩ活性およびＰＴ値を測定した。注射の４８時間後の屠殺時に肝臓のＦＶＩＩ ｍＲＮＡレベルを測定した。
【０１８２】
ＦＶＩＩ ｄｓＲＮＡ（配列番号１９／２０）処置群は、１mg/kgのｄｓＲＮＡでＦＶＩＩ活性の約５０％の用量依存的減少を示し、３mg/kgのＦＶＩＩ ｄｓＲＮＡ（配列番号１９／２０）でｉｖ注射の２４および４８時間後にＦＶＩＩ活性が＞９０％の減少に達した（図８）。６mg/kgおよび１０mg/kgの用量で、ＦＶＩＩ活性の減少は、３mg/kgのＦＶＩＩ ｄｓＲＮＡ（配列番号１９／２０）で見られたものと同様であった。ＰＴの延長は、３mg/kgから観察された（図９）。ＰＴにおける追加的な延長は、用量が６mg/kgおよび１０mg/kgに増加したときに観察された。ＰＴの延長は、３mg/kgで１．２倍から１０mg/kgで１．４倍までの間であった。
【０１８３】
有効時間および反復投薬を評価するためのサルにおける探索研究
ＦＶＩＩ ｄｓＲＮＡ（配列番号１９／２０）を使用して雄性カニクイザルにおける単回および反復投与を研究した。研究の目的は、ＦＶＩＩ ｄｓＲＮＡ（配列番号１９／２０）の薬理効果の持続時間および動態についてさらに洞察することに加えて、多回投与の安全性および有効性を評価することであった。
【０１８４】
サルにＦＶＩＩ ｄｓＲＮＡ（配列番号１９／２０）を単回または反復投与した。単回投与の目的は、効果の持続時間を検討することであった。単回投与群のサルに３mg/kgおよび６mg/kgのＦＶＩＩ ｄｓＲＮＡ（配列番号１９／２０）のボーラス注射を行った。６mg/kgのルシフェラーゼｄｓＲＮＡ（配列番号４１１／４１２）群をｄｓＲＮＡ配列依存性サイレンシングに関する対照とするために、そして脂質粒子関連作用を評価するために使用した。反復投薬の目的は、用量加算性を研究すること、および脂質粒子の毒性の問題または薬理効果の過剰発現（exaggerated pharmacology）による潜在的出血問題のいずれかにより定義されるような最大耐用量を同定することであった。２種の反復投薬群のサルに１週間に１回ＦＶＩＩ ｄｓＲＮＡ（配列番号１９／２０）のボーラス注射を３mg/kgおよび１０mg/kgで３回行うことを計画した。
【０１８５】
上記サルの単回投与研究における結果のフォローアップとして、低用量での脂質粒子介在性効果の特徴をさらに調べるために３mg/kgのルシフェラーゼｄｓＲＮＡ（配列番号４１１／４１２）の雌性サル群を含めた。研究の間および屠殺時の複数の時点で採取した血漿試料から薬理効果（ＦＶＩＩ活性およびＰＴ）をモニタリングした。
【０１８６】
２４時間および４８時間でのＦＶＩＩ活性についてまとめたデータは、上記単回投与研究からのデータに類似していた（図１０）。ＦＶＩＩ ｄｓＲＮＡ（配列番号１９／２０）は、１mg/kg用量で約５０％、３、６および１０mg/kg用量で約８５％〜９５％、ＦＶＩＩ活性を減少させた。３および６mg/kgのルシフェラーゼｄｓＲＮＡ対照群から、ｄｓＲＮＡ脂質粒子が２４時間でＦＶＩＩ活性に一過性の非特異的な影響を及ぼすことが確認された。４８時間で値は正常に戻った。したがって、３および６mg/kgのＦＶＩＩ ｄｓＲＮＡ（配列番号１９／２０）群において４８時間に認められた活性は、完全にＦＶＩＩ ｄｓＲＮＡの薬理活性に原因があるとすることができる。
【０１８７】
ＰＴ値を図１１に示す。１．２倍のＰＴ延長が３mg/kgで観察され、１０mg/kgでは用量依存的に１．７倍に増加した。
【０１８８】
サルにおける薬理効果の持続時間は、１か月超にわたり追跡した血漿のＦＶＩＩ活性レベルからの外挿に基づくと、約６週間であった（図１２）。ＦＶＩＩ活性の全減少は約１週間持続し、その後ＦＶＩＩ活性が徐々に回復した。類似のサイレンシング動態が３および６mg/kgで観察され、これは、デポー効果がなかったこと、および単なるＦＶＩＩ活性の全阻害に必要な用量よりも高い用量で与えられたＦＶＩＩ ｄｓＲＮＡが、必ずしも薬理効果を延長しないことを示唆している。
【０１８９】
ＰＴ延長は、４週間認められ、処置後１週間で最高値となり、続いて２〜４週間目に直線的に減少した（図１３）。データは、このＦＶＩＩ依存性バイオマーカーに及ぼす効果を認めるために、＞７０％のＦＶＩＩ活性減少が必要であったことを示している。
【０１９０】
３mg/kgで１週間に１回の多回投与を図１４に示す。定常状態の状況を調査するために、そして効力の過剰発現および有毒作用を避けるために、２回目と３回目の投与の間隔を１週間から２週間に広げた。ＦＶＩＩの活性データは、定常状態の間にＦＶＩＩレベルを固定することが実行可能であったことを示した。
【０１９１】
８０％〜９５％のＦＶＩＩ活性減少を維持するために、３mg/kgで２または３週間間隔で投与することが最適と思われた。ＰＴ値は、１．２〜１．８倍の延長に保つことができる。
【０１９２】
８０％〜９５％のＦＶＩＩ活性減少を維持するために、３mg/kgで２または３週間の間隔で投与することが最適と思われた。ＰＴ値を、１．２〜１．８倍の延長時間に保つことができ（図１５）、注射の数日後に顕著なＰＴピークが認められた。これらのピークは、おそらくＦＶＩＩ ｄｓＲＮＡの薬理活性と、脂質粒子からの非特異的作用との相加的作用が原因であった。
【０１９３】
ヒトＦＶＩＩをターゲティングするｄｓＲＮＡのin vitroのオフターゲット分析
ｐｓｉＣＨＥＣＫ（商標）ベクター（Promega）は、ＲＮＡｉ活性をモニタリングするための二つのレポーター遺伝子、すなわち合成版ウミシイタケルシフェラーゼ（ｈＲｌｕｃ）遺伝子および合成ホタルルシフェラーゼ遺伝子（ｈｌｕｃ＋）を有する。ホタルルシフェラーゼ遺伝子は、ホタルルシフェラーゼの発現に対するウミシイタケルシフェラーゼの発現の変化の標準化を可能にする。ウミシイタケおよびホタルルシフェラーゼの活性を、Dual-Glo（登録商標）Luciferase Assay System（Promega）を使用して測定した。本発明のｄｓＲＮＡのオフターゲット効果を分析するためにｐｓｉＣＨＥＣＫ（商標）ベクターを使用するために、予測されるオフターゲット配列を、合成ウミシイタケルシフェラーゼ遺伝子およびその翻訳終止コドンの３’に位置するマルチクローニング領域にクローニングした。クローニング後に、そのベクターを哺乳動物細胞系にトランスフェクションし、続いてＦＶＩＩをターゲティングするｄｓＲＮＡを共トランスフェクションする。ｄｓＲＮＡが予測されるオフターゲットのターゲットＲＮＡに対して効果的にＲＮＡｉ過程を開始するならば、融合されたウミシイタケターゲット遺伝子のｍＲＮＡ配列は分解し、ウミシイタケルシフェラーゼ活性の減少を招くであろう。
【０１９４】
in silicoオフターゲット予測
本発明のｄｓＲＮＡに相同な配列についてヒトゲノムをコンピューター解析により検索した。本発明のｄｓＲＮＡと５個未満のミスマッチを示した相同配列を、可能性のあるオフターゲットとして定義した。in vitroのオフターゲット分析のために選択されたオフターゲットを、添付の表８、９および１０に示す。
【０１９５】
予測されたオフターゲット配列を有するｐｓｉＣＨＥＣＫベクターの産生
ｓｉＲＮＡ有力候補についてのオフターゲット効果を分析するための戦略は、予測されたオフターゲット部位をＸｈｏＩおよびＮｏｔＩ制限部位を介してｐｓｉＣＨＥＣＫ２ベクターシステム（Dual Glo（登録商標）-system, Promega, Braunschweig, Germany、カタログ番号C8021）にクローニングすることを含む。したがって、ｓｉＲＮＡターゲット部位の上流および下流の１０個のヌクレオチドをオフターゲット部位から伸長させる。さらに、フラグメントの挿入を制限分析により確認するために、ＮｈｅＩ制限部位を組込む。１本鎖オリゴヌクレオチドを標準プロトコール（例えばMetabionによるプロトコール）によりMastercycler（Eppendorf）でアニーリングさせ、次に予めＸｈｏＩおよびＮｏｔＩで消化しておいたｐｓｉＣＨＥＣＫ（Promega）にクローニングした。挿入の有無はＮｈｅＩを用いた制限分析に続く陽性クローンの配列決定により検証した。配列決定のための選択されたプライマー（配列番号７６１）は、ベクターｐｓｉＣＨＥＣＫの１４０１位に結合する。クローン産生後に、配列決定によりプラスミドを分析し、次に細胞培養実験に使用した。
【０１９６】
ｄｓＲＮＡのオフターゲット効果の分析
細胞培養：
Ｃｏｓ７細胞は、Deutsche Sammlung fur Mikroorganismen und Zellkulturen（ＤＳＭＺ、Braunschweig, Germany、カタログ番号ACC-60）から得られ、１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）（Biochrom AG, Berlin, Germany、カタログ番号S0115）、ペニシリン１００U/ml、およびストレプトマイシン１００μg/ml（Biochrom AG, Berlin, Germany、カタログ番号A2213）および２mM Ｌ−グルタミン（Biochrom AG, Berlin, Germany、カタログ番号K0283）さらに１２μg/ml重炭酸ナトリウムを含有するように補充されたＤＭＥＭ（Biochrom AG, Berlin, Germany、カタログ番号F0435）に入れて、加湿インキュベーター（Heraeus HERAcell, Kendro Laboratory Products, Langenselbold, Germany）中、３７℃で５％ ＣＯ２雰囲気中で培養した。
【０１９７】
トランスフェクションおよびルシフェラーゼの定量：
プラスミドのトランスフェクションのために、Ｃｏｓ−７細胞を９６ウェルプレート中、２．２５×１０４個細胞／ウェルの密度で蒔き、そのままトランスフェクションした。プラスミドのトランスフェクションは、リポフェクトアミン2000（Invitrogen GmbH, Karlsruhe, Germany、カタログ番号11668-019）を５０ng/ウェルの濃度で用いて製造業者の説明に従い実施した。トランスフェクションの４時間後に、培地を捨て、新鮮培地を添加した。ここで、上記リポフェクトアミン2000を使用してｓｉＲＮＡを５０nMの濃度でトランスフェクションした。ｓｉＲＮＡのトランスフェクションの２４時間後に、製造業者（Dual-GloTM Luciferase Assay system, Promega, Mannheim, Germany、カタログ番号E2980）の説明に従いルシフェラーゼ試薬を使用して細胞を溶解させ、製造業者のプロトコールによりホタルおよびウミシイタケルシフェラーゼを定量した。ウミシイタケルシフェラーゼのタンパク質レベルをホタルルシフェラーゼのレベルに対して標準化した。各ｓｉＲＮＡについて１２個の個別のデータ点を３回の独立した実験で収集した。全てのターゲット部位に関係しないｓｉＲＮＡを、ｓｉＲＮＡ処理細胞におけるウミシイタケルシフェラーゼタンパク質の相対レベルを決定するための対照として使用した。
【０１９８】
結果を図１６、１７および１８に示す。
【０１９９】
【表６】
【０２００】
【表７】
【０２０１】
【表８】
【０２０２】
【表９】
【０２０３】
【表１０】
【０２０４】
【表１１】
【０２０５】
【表１２】
【０２０６】
【表１３】
【０２０７】
【表１４】
【０２０８】
【表１５】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
第ＶＩＩ因子遺伝子の発現をin vitroで少なくとも７０％阻害可能な二本鎖リボ核酸分子。
【請求項２】
センス鎖およびアンチセンス鎖を含む二本鎖リボ核酸分子であって、該アンチセンス鎖が、該センス鎖に少なくとも部分的に相補的であり、該センス鎖が、第ＶＩＩ因子をコードするｍＲＮＡの少なくとも一部に少なくとも９０％の同一性を有する配列を含み、該配列が、（ｉ）該アンチセンス鎖に対する該センス鎖の相補的領域に位置し；（ｉｉ）該配列が、３０ヌクレオチド長未満である、請求項１記載の二本鎖リボ核酸分子。
【請求項３】
配列番号４１３、４１４、４１５、４１６、４１７、４１８、４１９、４２０、４２１、４２２、４２３、４２４、４２５、４２６、４２７、４２８、４２９、４３０、４３１、４３２、４３３、４３４、４３５、４３６、４３７および４３８のヌクレオチド第１〜１９位を含む、請求項１または２のいずれか記載の二本鎖リボ核酸分子。
【請求項４】
アンチセンス鎖が、さらに、１〜５ヌクレオチド長、好ましくは１〜２ヌクレオチド長の３’オーバーハングを含む、請求項３記載の二本鎖リボ核酸分子。
【請求項５】
アンチセンス鎖のオーバーハングが、ウラシルまたは第ＶＩＩ因子をコードするｍＲＮＡに少なくとも９０％相補的なヌクレオチドを含む、請求項３または４記載の二本鎖リボ核酸分子。
【請求項６】
センス鎖が、さらに、１〜５ヌクレオチド長、好ましくは１〜２ヌクレオチド長の３’オーバーハングを含む、請求項３〜５のいずれか記載の二本鎖リボ核酸分子。
【請求項７】
センス鎖のオーバーハングが、ウラシルまたは第ＶＩＩ因子をコードするｍＲＮＡに少なくとも９０％同一なヌクレオチドを含む、請求項３〜６のいずれか記載の二本鎖リボ核酸分子。
【請求項８】
該センス鎖が、配列番号４１３、４１５、４１７、４１９、４２１、４２３、４２５、４２７、４２９、４３１、４３３、４３５、および４３７に示される核酸配列から成る群より選択され、該アンチセンス鎖が、配列番号４１４、４１６、４１８、４２０、４２２、４２４、４２６、４２８、４３０、４３２、４３４、４３６および４３８に示される核酸配列から成る群より選択される、配列番号４１３／４１４、４１５／４１６、４１７／４１８、４１９／４２０、４２１／４２２、４２３／４２４、４２５／４２６、４２７／４２８、４２９／４３０、４３１／４３２、４３３／４３４、４３５／４３６および４３７／４３８から成る群より選択される配列対を含む、請求項１〜７のいずれか記載の二本鎖リボ核酸分子。
【請求項９】
少なくとも１本の鎖が、少なくとも２４時間の半減期を有する、請求項１〜８のいずれか一項記載の二本鎖リボ核酸分子。
【請求項１０】
非免疫刺激性である、請求項１〜９のいずれか一項記載の二本鎖リボ核酸分子。
【請求項１１】
少なくとも１個の改変ヌクレオチドを含む、請求項１〜１０のいずれか一項記載の二本鎖リボ核酸分子。
【請求項１２】
該改変ヌクレオチドが、２’−Ｏ−メチル改変ヌクレオチド、５’−ホスホロチオエート基を含むヌクレオチド、およびコレステリル誘導体またはドデカン酸ビスデシルアミド基に連結された末端ヌクレオチド、２’−デオキシ−２’−フルオロ改変ヌクレオチド、２’−デオキシ改変ヌクレオチド、ロックしたヌクレオチド、脱塩基ヌクレオチド、２’−アミノ改変ヌクレオチド、２’−アルキル改変ヌクレオチド、モルホリノヌクレオチド、ホスホルアミデート、およびヌクレオチドを含む非天然塩基から成る群より選択される、請求項１１記載の二本鎖リボ核酸分子。
【請求項１３】
該改変ヌクレオチドが、２’−Ｏ−メチル改変ヌクレオチド、５’−ホスホロチオエート基を含むヌクレオチド、およびデオキシチミジンである、請求項１１および１２のいずれか一項記載の二本鎖リボ核酸分子。
【請求項１４】
該センス鎖が、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３および２５に示される核酸配列から成る群より選択され、アンチセンス鎖が、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４および２６に示される核酸配列から成る群より選択される、配列番号１／２、３／４、５／６、７／８、９／１０、１１／１２、１３／１４、１５／１６、１７／１８、１９／２０、２１／２２、２３／２４および２５／２６から成る群より選択される配列対を含む、請求項１〜１３のいずれか記載の二本鎖リボ核酸分子。
【請求項１５】
請求項１〜１４のいずれか一項記載の二本鎖リボ核酸分子に含まれるセンス鎖および／またはアンチセンス鎖をコードする核酸配列。
【請求項１６】
請求項１〜１４のいずれか一項記載の二本鎖リボ核酸分子に含まれるセンス鎖またはアンチセンス鎖の少なくとも一つをコードする、または請求項１５記載の核酸配列を含むヌクレオチド配列に作動可能に連結された調節配列を含むベクター。
【請求項１７】
請求項１〜１４のいずれか一項記載の二本鎖リボ核酸分子、請求項１５記載の核酸分子または請求項１６記載のベクターを含む、細胞、組織または非ヒト生物。
【請求項１８】
請求項１〜１４のいずれか一項記載の二本鎖リボ核酸分子、請求項１５記載の核酸分子請求項１６記載のベクター、または請求項１７記載の細胞もしくは組織を含む薬学的組成物。
【請求項１９】
薬学的に許容され得る担体、安定化剤および／または希釈剤をさらに含む、請求項１８記載の薬学的組成物。
【請求項２０】
以下の工程：
（ａ）該細胞、組織または生物に、請求項１〜１４のいずれか一項記載の二本鎖リボ核酸分子、請求項１５記載の核酸分子、請求項１６記載のベクターを導入すること；および
（ｂ）工程（ａ）において作製された該細胞、組織または生物を、第ＶＩＩ因子遺伝子のｍＲＮＡ転写物が分解されるために十分な時間維持することによって、細胞における第ＶＩＩ因子遺伝子の発現を阻害すること
を含む、細胞、組織または生物における第ＶＩＩ因子遺伝子の発現を阻害するための方法。
【請求項２１】
ＦＶＩＩ遺伝子疾患の発現により引き起こされる病状および疾患を治療、予防または管理する方法であって、該治療、予防または管理を必要とする対象に、請求項１〜１４のいずれか一項記載の二本鎖リボ核酸分子、請求項１５記載の核酸分子、請求項１６記載のベクターおよび／または請求項１８もしくは１９記載の薬学的組成物の治療または予防有効量を投与することを含む方法。
【請求項２２】
該対象がヒトである、請求項２１記載の方法。
【請求項２３】
血栓塞栓障害／疾患、炎症または増殖障害の処置に使用するための、請求項１〜１４のいずれか一項記載の二本鎖リボ核酸分子、請求項１５記載の核酸分子、請求項１６記載のベクターおよび／または請求項１８もしくは１９記載の薬学的組成物。
【請求項２４】
血栓塞栓障害／疾患、炎症または増殖障害の処置のための薬学的組成物を調製するための、請求項１〜１４のいずれか一項記載の二本鎖リボ核酸分子、請求項１５記載の核酸分子、請求項１６記載のベクターおよび／または請求項１７記載の細胞もしくは組織の使用。
【請求項１】
第ＶＩＩ因子遺伝子の発現をin vitroで少なくとも７０％阻害可能な二本鎖リボ核酸分子。
【請求項２】
センス鎖およびアンチセンス鎖を含む二本鎖リボ核酸分子であって、該アンチセンス鎖が、該センス鎖に少なくとも部分的に相補的であり、該センス鎖が、第ＶＩＩ因子をコードするｍＲＮＡの少なくとも一部に少なくとも９０％の同一性を有する配列を含み、該配列が、（ｉ）該アンチセンス鎖に対する該センス鎖の相補的領域に位置し；（ｉｉ）該配列が、３０ヌクレオチド長未満である、請求項１記載の二本鎖リボ核酸分子。
【請求項３】
配列番号４１３、４１４、４１５、４１６、４１７、４１８、４１９、４２０、４２１、４２２、４２３、４２４、４２５、４２６、４２７、４２８、４２９、４３０、４３１、４３２、４３３、４３４、４３５、４３６、４３７および４３８のヌクレオチド第１〜１９位を含む、請求項１または２のいずれか記載の二本鎖リボ核酸分子。
【請求項４】
アンチセンス鎖が、さらに、１〜５ヌクレオチド長、好ましくは１〜２ヌクレオチド長の３’オーバーハングを含む、請求項３記載の二本鎖リボ核酸分子。
【請求項５】
アンチセンス鎖のオーバーハングが、ウラシルまたは第ＶＩＩ因子をコードするｍＲＮＡに少なくとも９０％相補的なヌクレオチドを含む、請求項３または４記載の二本鎖リボ核酸分子。
【請求項６】
センス鎖が、さらに、１〜５ヌクレオチド長、好ましくは１〜２ヌクレオチド長の３’オーバーハングを含む、請求項３〜５のいずれか記載の二本鎖リボ核酸分子。
【請求項７】
センス鎖のオーバーハングが、ウラシルまたは第ＶＩＩ因子をコードするｍＲＮＡに少なくとも９０％同一なヌクレオチドを含む、請求項３〜６のいずれか記載の二本鎖リボ核酸分子。
【請求項８】
該センス鎖が、配列番号４１３、４１５、４１７、４１９、４２１、４２３、４２５、４２７、４２９、４３１、４３３、４３５、および４３７に示される核酸配列から成る群より選択され、該アンチセンス鎖が、配列番号４１４、４１６、４１８、４２０、４２２、４２４、４２６、４２８、４３０、４３２、４３４、４３６および４３８に示される核酸配列から成る群より選択される、配列番号４１３／４１４、４１５／４１６、４１７／４１８、４１９／４２０、４２１／４２２、４２３／４２４、４２５／４２６、４２７／４２８、４２９／４３０、４３１／４３２、４３３／４３４、４３５／４３６および４３７／４３８から成る群より選択される配列対を含む、請求項１〜７のいずれか記載の二本鎖リボ核酸分子。
【請求項９】
少なくとも１本の鎖が、少なくとも２４時間の半減期を有する、請求項１〜８のいずれか一項記載の二本鎖リボ核酸分子。
【請求項１０】
非免疫刺激性である、請求項１〜９のいずれか一項記載の二本鎖リボ核酸分子。
【請求項１１】
少なくとも１個の改変ヌクレオチドを含む、請求項１〜１０のいずれか一項記載の二本鎖リボ核酸分子。
【請求項１２】
該改変ヌクレオチドが、２’−Ｏ−メチル改変ヌクレオチド、５’−ホスホロチオエート基を含むヌクレオチド、およびコレステリル誘導体またはドデカン酸ビスデシルアミド基に連結された末端ヌクレオチド、２’−デオキシ−２’−フルオロ改変ヌクレオチド、２’−デオキシ改変ヌクレオチド、ロックしたヌクレオチド、脱塩基ヌクレオチド、２’−アミノ改変ヌクレオチド、２’−アルキル改変ヌクレオチド、モルホリノヌクレオチド、ホスホルアミデート、およびヌクレオチドを含む非天然塩基から成る群より選択される、請求項１１記載の二本鎖リボ核酸分子。
【請求項１３】
該改変ヌクレオチドが、２’−Ｏ−メチル改変ヌクレオチド、５’−ホスホロチオエート基を含むヌクレオチド、およびデオキシチミジンである、請求項１１および１２のいずれか一項記載の二本鎖リボ核酸分子。
【請求項１４】
該センス鎖が、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３および２５に示される核酸配列から成る群より選択され、アンチセンス鎖が、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４および２６に示される核酸配列から成る群より選択される、配列番号１／２、３／４、５／６、７／８、９／１０、１１／１２、１３／１４、１５／１６、１７／１８、１９／２０、２１／２２、２３／２４および２５／２６から成る群より選択される配列対を含む、請求項１〜１３のいずれか記載の二本鎖リボ核酸分子。
【請求項１５】
請求項１〜１４のいずれか一項記載の二本鎖リボ核酸分子に含まれるセンス鎖および／またはアンチセンス鎖をコードする核酸配列。
【請求項１６】
請求項１〜１４のいずれか一項記載の二本鎖リボ核酸分子に含まれるセンス鎖またはアンチセンス鎖の少なくとも一つをコードする、または請求項１５記載の核酸配列を含むヌクレオチド配列に作動可能に連結された調節配列を含むベクター。
【請求項１７】
請求項１〜１４のいずれか一項記載の二本鎖リボ核酸分子、請求項１５記載の核酸分子または請求項１６記載のベクターを含む、細胞、組織または非ヒト生物。
【請求項１８】
請求項１〜１４のいずれか一項記載の二本鎖リボ核酸分子、請求項１５記載の核酸分子請求項１６記載のベクター、または請求項１７記載の細胞もしくは組織を含む薬学的組成物。
【請求項１９】
薬学的に許容され得る担体、安定化剤および／または希釈剤をさらに含む、請求項１８記載の薬学的組成物。
【請求項２０】
以下の工程：
（ａ）該細胞、組織または生物に、請求項１〜１４のいずれか一項記載の二本鎖リボ核酸分子、請求項１５記載の核酸分子、請求項１６記載のベクターを導入すること；および
（ｂ）工程（ａ）において作製された該細胞、組織または生物を、第ＶＩＩ因子遺伝子のｍＲＮＡ転写物が分解されるために十分な時間維持することによって、細胞における第ＶＩＩ因子遺伝子の発現を阻害すること
を含む、細胞、組織または生物における第ＶＩＩ因子遺伝子の発現を阻害するための方法。
【請求項２１】
ＦＶＩＩ遺伝子疾患の発現により引き起こされる病状および疾患を治療、予防または管理する方法であって、該治療、予防または管理を必要とする対象に、請求項１〜１４のいずれか一項記載の二本鎖リボ核酸分子、請求項１５記載の核酸分子、請求項１６記載のベクターおよび／または請求項１８もしくは１９記載の薬学的組成物の治療または予防有効量を投与することを含む方法。
【請求項２２】
該対象がヒトである、請求項２１記載の方法。
【請求項２３】
血栓塞栓障害／疾患、炎症または増殖障害の処置に使用するための、請求項１〜１４のいずれか一項記載の二本鎖リボ核酸分子、請求項１５記載の核酸分子、請求項１６記載のベクターおよび／または請求項１８もしくは１９記載の薬学的組成物。
【請求項２４】
血栓塞栓障害／疾患、炎症または増殖障害の処置のための薬学的組成物を調製するための、請求項１〜１４のいずれか一項記載の二本鎖リボ核酸分子、請求項１５記載の核酸分子、請求項１６記載のベクターおよび／または請求項１７記載の細胞もしくは組織の使用。
【図１ａ】
【図１ｂ】
【図２ａ】
【図２ｂ】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６ａ】
【図６ｂ】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１ｂ】
【図２ａ】
【図２ｂ】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６ａ】
【図６ｂ】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【公表番号】特表２０１２−５０８５６９（Ｐ２０１２−５０８５６９Ａ）
【公表日】平成２４年４月１２日（２０１２．４．１２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−５３５９９５（Ｐ２０１１−５３５９９５）
【出願日】平成２１年１１月１０日（２００９．１１．１０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００９／０６４９４０
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／０５５０４１
【国際公開日】平成２２年５月２０日（２０１０．５．２０）
【出願人】（５９１００３０１３）エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲー (1,754)
【氏名又は名称原語表記】Ｆ． ＨＯＦＦＭＡＮＮ−ＬＡ ＲＯＣＨＥ ＡＫＴＩＥＮＧＥＳＥＬＬＳＣＨＡＦＴ
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２４年４月１２日（２０１２．４．１２）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年１１月１０日（２００９．１１．１０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００９／０６４９４０
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／０５５０４１
【国際公開日】平成２２年５月２０日（２０１０．５．２０）
【出願人】（５９１００３０１３）エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲー (1,754)
【氏名又は名称原語表記】Ｆ． ＨＯＦＦＭＡＮＮ−ＬＡ ＲＯＣＨＥ ＡＫＴＩＥＮＧＥＳＥＬＬＳＣＨＡＦＴ
【Ｆターム（参考）】
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