糖尿病前症及び２型糖尿病におけるアポリポタンパク質ＣＩＩＩ
本発明は、ＡｐｏＣＩＩＩ及びその変異体のレベル及び調節を検出することにより、２型糖尿病、糖尿病前症、インスリン抵抗性、及びそれらの関連状態を、診断、判定、及び／又はモニターすることに関する。また、本発明は、ＡｐｏＣＩＩＩ及びその変異体をモニターすることにより、２型糖尿病、糖尿病前症、インスリン抵抗性、及びそれらの関連状態の治療的処置を特定及び評価する方法に関する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アポリポタンパク質ＣＩＩＩ（ＡｐｏＣＩＩＩ）及びその関連変異体のレベル及び調節を検出することにより、糖尿病前症、２型糖尿病、インスリン抵抗性、及びそれらの関連状態を、判定、診断、及び／又は評価する方法に関する。本発明は、ＡｐｏＣＩＩＩ及びその関連変異体を調節する分子をスクリーニングする方法、並びに糖尿病前症、２型糖尿病、インスリン抵抗性、及びそれらの関連状態と関連する症状の治療及び／又は改善におけるそれらの使用にも関する。
【背景技術】
【０００２】
２型糖尿病（２型真性糖尿病、インスリン非依存性糖尿病又は成人発症性糖尿病としても知られている）は、高血糖を特徴とする代謝障害である。この状態は、体内で産生されるインスリンの欠如又は体内の細胞によるインスリン抵抗性の発生（インスリン抵抗性）のいずれかの結果である。インスリンは、血液から糖を吸収するのに不可欠であるため、インスリン恒常性における異常は、最終的に血糖調節の喪失及び糖尿病状態の発症を結果としてもたらす。管理しないでおくと、過剰な血糖は、最終的に、これらに限定されないが、失明、皮膚潰瘍形成、切断、心臓病、及び腎臓病を含む多数の合併症に結びつくことになる。血糖調節の喪失に関係する多数の合併症が伴うことに関して、多くの理論的提案が存在するが、これら多数の経路が相互作用する機序は、依然として判明していない。
【０００３】
２００７年時点で、疾病管理センターは、米国人口の７．８％（２３６０万人）が２型糖尿病を有していると断定しており、２０％を超える米国人が前糖尿病性であると推測されている。これらの状態の性質が衰弱性であり、それらの治療に費用が伴うため、より有効でより効率的な早期発見方法は、米国民衆の健康及び西洋文明にとって重要である。血糖調節のレベルを評価するための「至適基準」は、経口グルコース負荷試験（ＯＧＴＴ）である。この試験には、個体又は患者の空腹時血糖を測定し、その後経口グルコース溶液の投与２時間後に、血糖測定値を取得することが必要である。現行のガイドラインでは、正常耐糖能（ＮＧＴ）は、２時間グルコースレベルが１４０ｍｇ／ｄＬ以下と規定されている。２型糖尿病（ＤＭ）の基準は、２時間グルコースが２００ｍｇ／ｄＬ以上であり、耐糖能異常（ＩＧＴ又は糖尿病前症）の定義は、１４０〜２００ｍｇ／ｄＬである。米国糖尿病協会及び世界保健機構は両方ともこれら基準を承認しているが、これら値には臨床的誤差がないわけではないか又は解釈の余地がある。
【０００４】
糖尿病医療の最近の発展には、糖尿病及び糖尿病前症の診断にタンパク質バイオマーカーであるヘモグロビンＡ１Ｃ（ＨｂＡ１Ｃ）を使用するためのガイドラインが採用されたことが含まれる。ヘモグロビンは、血中での寿命が長いため、血糖管理の長期的尺度としての役目を果たす。患者の糖尿病治療が十分か否かのバイオマーカーとして長く使用されているが、矛盾するデータがあるため、以前は糖尿病判定にＨｂＡ１Ｃを使用することが妨げられていた。これら新しいガイドラインを受け入れ、標準的ＯＧＴＴ基準及び空腹時血糖レベルと併用してそれらを使用する場合でさえ、糖尿病前症又は２型糖尿病の診断は、依然として最終的には、診断する医師の解釈及び判断に依存している。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
２型糖尿病、糖尿病前症、インスリン抵抗性、及びそれらの関連合併症の発症には汎流行的な性質があるため、できるだけ早期の介入を可能にし、ライフスタイルの変化及び／又は薬物治療による治療の有効性を評価するための手段を提供する更なる発見／診断／評価方法が、世界的に必要とされている。これら関連状態に伴う問題及び症状を緩和又は改
善する治療を開発するための更なる代謝性又は内分泌性標的に対する必要性も存在する。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本明細書において初めて示されたように、ＡｐｏＣＩＩＩ及びその関連変異体の濃度は、ＯＧＴＴを適用し、ある代謝疾患状態を臨床診断した後で得られる２時間グルコース値と相関する。これらの知見により、ＡｐｏＣＩＩＩ及びその関連変異体が、２型糖尿病、糖尿病前症、インスリン抵抗性、及びそれらの関連状態の臨床的評価／診断用のバイオマーカーとして特定される。また、これらの知見は、ＡｐｏＣＩＩＩ及びその関連変異体が、これら疾患状態の開始／発症及び病理に機械的に寄与する場合もあり、従って、疾患症状又は状態を改善及び／又は治療するための治療標的としての有用性を有する場合もあることの根拠を示す。
【０００７】
本発明の１つの目的は、２型糖尿病、糖尿病前症、インスリン抵抗性、及びそれらの関連状態をｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏで発見及び／又は診断するためにＡｐｏＣＩＩＩを分析するための新しい標的及びスクリーニング法を提供することである。
【０００８】
本発明の別の目的は、２型糖尿病、糖尿病前症、インスリン抵抗性、及びそれらの関連状態をｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏで発見及び／又は診断するための新しい標的及びスクリーニング法として、ＡｐｏＣＩＩＩ変異体を使用することである。
【０００９】
本発明の更なる目的は、ＡｐｏＣＩＩＩを調節する分子の新しい標的として、及び／又は２型糖尿病、糖尿病前症、インスリン抵抗性、及びそれらの関連状態の治療における、その発現、活性、及び／又は排除のｉｎ ｖｉｔｒｏ及び／又はｉｎ ｖｉｖｏ調節を目的とする分子のスクリーニングに、ＡｐｏＣＩＩＩを使用することである。
【００１０】
本発明のなお更なる目的は、ＡｐｏＣＩＩＩ変異体を調節する分子の新しい標的として、及び／又は２型糖尿病、糖尿病前症、インスリン抵抗性、及びそれらの関連状態の治療における、その発現、活性、及び／又は排除のｉｎ ｖｉｔｒｏ及び／又はｉｎ ｖｉｖｏ調節を目的とする分子のスクリーニングに、ＡｐｏＣＩＩＩ変異体を使用することである。
【００１１】
本発明の特徴とみなされる幾つかの新規な特徴は、特に特許請求の範囲に示されている。しかしながら、本発明自体は、その更なる目的及び利点と共にその構造及びその作用の両方に関して、添付の図面と共に読むと、本発明の例示的実施形態に関する以下の説明から最もよく理解されるだろう。特に記載がない限り、本明細書及び特許請求の範囲にある単語及び語句には、当技術（複数可）の応用における当業者にとって通常の慣用的な意味が付与されている。任意の他の意味が意図されている場合、特別の意味が単語又は語句に適用されていることを具体的に本明細書に記載するものとする。同様に、好ましい実施形態の説明における「機能」又は「手段」という単語の使用は、本発明を規定するために、米国特許法第１１２条第６項の特別規定を引用する要望を示すことを意図しない。逆に、本発明（複数可）を規定するために、米国特許法第１１２条第６項の規定を引用することが求められる場合、特許請求の範囲には、その機能を支援するいかなる構造、物質、又は行為をそのような語句に記載することもなく、「〜ための手段」又は「〜ためのステップ」という語句及び機能が、具体的に記載されるものとする。ある機能を実施する「ための手段」又は「ためのステップ」が、特許請求の範囲に記載されている場合、それらに、その手段又はステップを支援する任意の構造、物質、又は行為もまた記載されているとしても、米国特許法第１１２条第６項の規定を引用することは意図されていない。更に、米国特許法第１１２条第６項の規定が、本発明を規定するために引用される場合であっても、本発明は、好ましい実施形態に記述されている特定の構造、物質、又は行為にのみ限定されず、加えて、特許請求されている機能を実施する全ての構造、物質、又は行為が、特許請求されている機能を実施するためのあらゆる公知の又は後発の等価な構造、物質、又は行為と共に含まれることが意図されている。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
本発明の目的及び特徴は、以下の詳細な説明及び図面を参照すると、より良好に理解されるだろう。
【図１】質量分析イムノアッセイを使用した、ヒト血漿試料由来のＡｐｏＣＩＩＩ並びにそのアイソフォーム及び変異体の分析の代表的な質量スペクトルの結果を例示する図である。
【図２】図１で分析及び示された、正常耐糖能（ＮＧＴ）を示す患者及び耐糖能異常（ＩＧＴ、糖尿病前症）を示す患者由来のヒト血漿試料に由来する観察された総ＡｐｏＣＩＩＩ存在量のドットヒストグラムである。
【図３】図１で分析及び示された、正常耐糖能（ＮＧＴ）を示す患者及び２型糖尿病（ＤＭ）を示す患者由来のヒト血漿試料に由来する観察された総ＡｐｏＣＩＩＩ存在量のドットヒストグラムである。
【図４】図１で分析及び示された、各試料集団、すなわち正常耐糖能（ＮＧＴ）を示す患者由来のヒト血漿試料、耐糖能異常（ＩＧＴ、糖尿病前症）の患者由来のヒト血漿試料、及び２型糖尿病（ＤＭ）の患者由来のヒト血漿試料から得られた質量スペクトル総ＡｐｏＣＩＩＩ存在量データから確立された、その結果生じたＲＯＣ曲線を示す図である。
【図５】ＡｐｏＣＩＩＩ変異体の存在量、すなわち、図１で分析及び示された、正常耐糖能（ＮＧＴ）を示す患者及び耐糖能異常（ＩＧＴ、糖尿病前症）を示す患者由来のヒト血漿試料に由来する観察された総ＡｐｏＣＩＩＩ（１）存在量のドットヒストグラムである。
【図６】図１で分析及び示された、正常耐糖能（ＮＧＴ）を示す患者及び２型糖尿病（ＤＭ）を示す患者由来のヒト血漿試料に由来する観察された総ＡｐｏＣＩＩＩ（１）存在量のドットヒストグラムである。
【図７】図１で分析及び示された、各試料集団、すなわち正常耐糖能（ＮＧＴ）を示す患者由来のヒト血漿試料、耐糖能異常（ＩＧＴ、糖尿病前症）の患者由来のヒト血漿試料、及び２型糖尿病（ＤＭ）の患者由来のヒト血漿試料から得られた質量スペクトル総ＡｐｏＣＩＩＩ（１）存在量データから確立された、その結果生じたＲＯＣ曲線を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
ＡｐｏＣＩＩＩ及びその関連変異体は、糖尿病前症及び２型糖尿病疾患状態の両方の臨床診断と相関することが、本発明で初めて実証されている。また、ＡｐｏＣＩＩＩ及びその関連変異体の濃度の調節は、ＯＧＴＴの結果と同様であることが、初めて実証されている。この観察された現象は、２型糖尿病、糖尿病前症、インスリン抵抗性、及び／又はそれらの関連状態若しくは合併症に関係するため、この新規マーカーの有用性を直接的に示している。
【００１４】
本発明は、２型糖尿病、糖尿病前症、インスリン抵抗性、及び／又はそれらの関連状態若しくは合併症をｉｎ ｖｉｔｒｏ及び／又はｉｎ ｖｉｖｏで判定／診断／評価するためのバイオマーカーとしての総ＡｐｏＣＩＩＩの使用を包含する。本発明は、同目的のために特定のＡｐｏＣＩＩＩ変異体（複数可）を使用することも含む。
【００１５】
加えて、本発明は、糖尿病前症、２型糖尿病、インスリン抵抗性、及び／又はそれらの関連状態若しくは合併症に伴う症状を治療又は低減するために、ＡｐｏＣＩＩＩの発現、活性、及び／又は排除を調節することを目的とした、化合物のｉｎ ｖｉｔｒｏ及び／又はｉｎ ｖｉｖｏスクリーニングのマーカーとしてのＡｐｏＣＩＩＩの使用を含む。本発明は、同目的のために特定のＡｐｏＣＩＩＩ変異体（複数可）を使用することも含む。
【００１６】
本発明は、２型糖尿病、糖尿病前症、インスリン抵抗性、及び／又はそれらの関連状態若しくは合併症を判定／診断／評価するために、生体試料由来のＡｐｏＣＩＩＩ及びその関連変異体を測定する方法も含む。
【００１７】
また、本発明は、糖尿病前症、２型糖尿病、インスリン抵抗性、及び／又はそれらの関連状態若しくは合併症に伴う症状を治療又は低減するために、ＡｐｏＣＩＩＩ及びその関連変異体の発現、活性、及び／又は排除を調節することを目的として、化合物をスクリーニングするために、ＡｐｏＣＩＩＩ及びその関連変異体を測定するこれら方法を拡張する。
【００１８】
定義
本明細書で使用されている技術用語及び科学用語は全て、別様に定義されていない限り、本発明が関する分野の当業者が一般的に理解する意味を有する。本明細書で使用される場合、以下の用語は、別様に指定されていない限り、それらに帰すべき意味を有する。
【００１９】
本明細書で使用される場合、「ＡｐｏＣＩＩＩ」は、遺伝子ＡＰＯＣ３により発現されたアポリポタンパク質を記述する総称である。ＡｐｏＣＩＩＩは、ＶＬＤＬのタンパク質画分の５０％、及びＨＤＬのタンパク質画分の２％を構成する。その既知の機能は、リポタンパク質リパーゼ及び肝性リパーゼを阻害することである。ＡｐｏＣＩＩＩレベルの上昇は、高トリグリセリド血症の発症を誘導することが、以前に示されている。
【００２０】
本明細書で使用される場合、「変異体」は、生体試料に見出されるＡｐｏＣＩＩＩの異なるイソ形態又はサブ形態を指す。そのようなサブ形態は、一次構造からのアミノ酸の短縮、関連グリカンにおける糖の変更又は非存在、酸化付加物、又は遺伝子突然変異の発現の結果であってもよい。
【００２１】
本明細書で使用される場合、「ＡｐｏＣＩＩＩ（０）」は、グリカン構造の末端シアル酸残基が存在しない特定のＡｐｏＣＩＩＩ変異体を指す。
【００２２】
本明細書で使用される場合、「ＡｐｏＣＩＩＩ（１）」は、グリカン構造に単一で唯一の末端シアル酸残基が存在する特定のＡｐｏＣＩＩＩ変異体を指す。
【００２３】
本明細書で使用される場合、「ＡｐｏＣＩＩＩ（２）」は、グリカン構造に両末端シアル酸残基が存在する特定のＡｐｏＣＩＩＩ変異体を指す。
【００２４】
本明細書で使用される場合、「分析」は、生体試料に由来するＡｐｏＣＩＩＩ及び／又はその変異体の活性又は濃度の測定を指す。
【００２５】
本明細書で使用される場合、「生体試料」は、複数の成分を有する液体又は抽出物を指す。複合媒体には、これらに限定されないが、組織、細胞抽出物、核抽出物、細胞溶解産物及び排出物、血液、血清、血漿、唾液、尿、痰、関節液、脳脊髄液、涙、糞便、唾液、膜抽出物、及び産業液体等が含まれていてもよい。
【００２６】
本明細書で使用される場合、「２型糖尿病（ＤＭ）」は、過剰な血糖により定義される臨床状態である。臨床判定を支援する基準範囲は、１２６ｍｇ／ｄＬ以上の空腹時血糖値、及び／又は２００ｍｇ／ｄＬ以上の２時間経口グルコース負荷試験値である。
【００２７】
本明細書で使用される場合、「糖尿病前症、耐糖能異常（ＩＧＴ）」は、血中に存在する正常量のグルコースを上回ることにより定義される臨床状態である。臨床判定を支援す
る基準範囲は、１１０〜１２５ｍｇ／ｄＬの空腹時血糖値、及び／又は１４０〜１９９ｍｇ／ｄＬの２時間経口グルコース負荷試験値である。
【００２８】
本明細書で使用される場合、「正常耐糖能（ＮＧＴ）」は、血糖レベルが正常濃度範囲内にある場合の臨床判定である。臨床判定を支援する基準範囲は、１１０ｍｇ／ｄＬ未満の空腹時血糖値、及び／又は１４０ｍｇ／ｄＬ未満の２時間経口グルコース負荷試験値である。
【００２９】
本明細書で使用される場合、「インスリン抵抗性」は、ホルモンであるインスリンが、血糖レベルの低下にそれほど有効でなくなる身体状態である。インスリン抵抗性を評価するための至適基準は、高インスリン性正常血糖クランプ法の実施である。
【００３０】
本明細書で使用される場合、「関連状態又は合併症」は、２型糖尿病の発症及び進行に一般的に関連する様々な病弊と定義される。これらの病弊の幾つかには、これらに限定されないが、心臓発作、皮膚潰瘍形成、失明、切断、及び腎不全が含まれる。
【００３１】
本明細書で使用される場合、「質量分析」は、被検体を揮発／イオン化して、気相イオンを形成し、それらの絶対分子質量又は相対分子質量を決定する能力を指す。揮発／イオン化の好適な形態は、レーザー／光、熱、電気、及び微粒化／噴霧等、又はそれらの組合せである。
【００３２】
質量分析の好適な形態には、これらに限定されないが、マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ）、又はエレクトロスプレー（又はナノスプレー）イオン化（ＥＳＩ）質量分析等、又はそれらの組合せが含まれる。
【００３３】
本明細書で使用される場合、「対象体」は、そこから得られる生体試料中に測定可能なレベルのＡｐｏＣＩＩＩ及び／又はＡｐｏＣＩＩＩ変異体を有する、あらゆるヒト、動物、又は他の生命体を指す。
【００３４】
本発明では、ＡｐｏＣＩＩＩ及び／又はその変異体の活性又は濃度を測定する方法は、生体試料（生物学的マトリックス）を使用して実施される。考え得る生物学的マトリックスには、これらに限定されないが、組織、全血、血清、血漿、唾液、脳脊髄液、又は尿が含まれる。また、試料は、遊離していてもよく又は固体担体に固定されていてもよい。固体担体の例には、これらに限定されないが、ろ紙、ビーズ、アレイ等が含まれる。当技術分野で公知の任意の固体担体物質を、試料の固定に使用することができる。また、試料は、形態が天然であってもよく、又はこれらに限定されないが、変性、還元、及びタンパク質分解消化等を含む処理を受けていてもよい。
【００３５】
ＡｐｏＣＩＩＩ及び／又はその変異体を測定するために、本発明では、生体試料からバイオマーカーを単離又は精製する分離又は精製ステップを使用することができる。この分離は、これらに限定されないが、クロマトグラフィー、遠心分離、親和性相互作用、化学的方法、染色法、及びゲル電気泳動法を含む幾つかの手段により実施することができる。クロマトグラフィー技術には、これらに限定されないが、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）、ペーパークロマトグラフィー（ＰＣ）、アフィニティークロマトグラフィー、サイズ排除、イオン交換、逆相等が含まれる。親和性相互作用では、ある分子が、適切な適合する立体構造を有する別の分子と結合する能力を使用する。使用されるアフィニティー法には、これらに限定されないが、抗体（Ａｂ）、抗体断片（Ｆａｂ）、アプタマー、タンパク質、ペプチド、レクチン等を使用する親和性相互作用が含まれていてもよい。サンドイッチアッセイの場合、一次及び二次親和性リガンドの組合せを使用してもよい。ゲル電気泳動法方法には、これらに限定されないが、アクリルアミド、アガロース等が含まれていてもよい。化学的方法には、これらに限定されないが、アミノ酸分析、配列決定等が含まれていてもよい。染色法には、これらに限定されないが、ＡｐｏＣＩＩＩ及びその変異体と直接結合するか、又はＡｐｏＣＩＩＩ及びその変異体と結合する分子と結合する任意の染料等の使用が含まれていてもよい。
【００３６】
ＡｐｏＣＩＩＩ及び／又はＡｐｏＣＩＩＩ変異体を測定する方法では、単離されたバイオマーカー（つまり、単離されたＡｐｏＣＩＩＩ及び／又はＡｐｏＣＩＩＩ変異体（複数可））の検出技術を使用することになる。検出方法は、性質が直接的であってもよく又は間接的であってもよい。検出技術には、これらに限定されないが、染色、分光法、スペクトロメトロスコピー、分光光度法、比色法、蛍光、ルミネセンス、磁気、放射性同位元素、核磁気共鳴法、Ｘ線結晶法、表面プラズモン共鳴、質量分析等が含まれる。生体試料の状態に応じて、検出されるＡｐｏＣＩＩＩ又はＡｐｏＣＩＩＩ変異体形態は、完全なものであってもよく又はその断片であってもよい。
【実施例】
【００３７】
バイオマーカー有用性を実証する分析
実施例
ヒト血漿に由来するアポリポタンパク質ＣＩＩＩ及びその変異体の分析
本発明の１つの例示的実施形態は、臨床的に規定された試料の集団を区別するバイオマーカー（複数可）として使用するためのＡｐｏＣＩＩＩ及びその変異体の濃度測定である。この例示的実施形態の分析を、質量分析イムノアッセイ（ＭＳＩＡ）技術を使用して実施した。
【００３８】
この例では、分析は、ＮＧＴ、ＩＧＴ、又はＤＭを有すると新たに診断され臨床的に規定された患者から得たヒトシトラート血漿試料に対して実施した。ＮＧＴ個体から得た３６０個の血漿試料、ＩＧＴの患者から得た９８個の血漿試料、及びＤＭの患者に由来する２５個の血漿試料があり、それらを全て同じ様式で分析した。
【００３９】
ＭＳＩＡは、親和性ピペットチップを使用して実施した。親和性ピペットチップは、ピペッター先端の入口に取り付けられている小型の多孔性マイクロカラムで作られている。マイクロカラムは、親和性リガンドで誘導体化されている。親和性ピペットを誘導体化するために使用された親和性リガンドは、抗ＡｐｏＣＩＩＩ抗体だった。試料調製には、ＡｐｏＣＩＩＩを半定量的に測定するための内部基準標準物質（ＩＲＳ）の添加を必要とした。各試料混合物は、２５μＬの１０倍希釈（緩衝液を用いて）ヒト血漿、３０μＬのカニクイザル血漿（カニクイザルＡｐｏＣＩＩＩはＩＲＳである）、及び１％のｔｗｅｅｎ２０を有する１４５μＬのＨＥＰＥＳ緩衝食塩水からなっていた。調製した試料は、親和性ピペットを通して試料を反復排出することにより、抗ＡｐｏＣＩＩＩ親和性ピペットチップを用いて調査した。精製プロセスでは、ＨＥＰＥＳ緩衝食塩水を使用し、水ですすいだ後、ＡｐｏＣＩＩＩ親和性回収を行った。その後、濃縮及び精製されたタンパク質を、シナピン酸ＭＡＬＤＩマトリックスを用いて親和性ピペットから溶出し、その後の質量分析検出用にＭＡＬＤＩ質量分析計標的に直接のせた。
【００４０】
その結果得られた質量スペクトルを検討すると、ＩＲＳと同様に、ヒト血漿中に存在するＡｐｏＣＩＩＩの複数形態に由来するシグナルが示された。各スペクトルを、ＩＲＳから得られたＡｐｏＣＩＩＩシグナルの積分値に正規化した。各質量スペクトル内では、ヒトＡｐｏＣＩＩＩの質量移動変異体が明らかに分離されており、大多数の試料においてＡｐｏＣＩＩＩ（１）アイソフォームが最も豊富であった。多数のＡｐｏＣＩＩＩ変異体が各試料から検出されたが、この例では、３つの最も豊富な形態：すなわち、ＡｐｏＣＩＩＩ（０）、ＡｐｏＣＩＩＩ（１）、及びＡｐｏＣＩＩＩ（２）に注目する。正規化されたスペクトルは、ＡｐｏＣＩＩＩ（０）、ＡｐｏＣＩＩＩ（１）、及びＡｐｏＣＩＩＩ（２
）が、異なる試料間で調節されていることを明白に示す。図１には、ＡｐｏＣＩＩＩ及びその変異体の存在量が、正常耐糖能（ＮＧＴ）を示す患者、耐糖能異常（ＩＧＴ、糖尿病前症）の患者、及び２型糖尿病（ＤＭ）の患者に由来するヒト血漿試料で異なることが例示されている。図１には、ＩＧＴ及びＤＭと診断された患者由来の試料において、ＡｐｏＣＩＩＩ変異体は全て増加したことが示されている。
【００４１】
その結果得られた質量分析データにより、ＮＧＴ患者及びＩＧＴ／ＤＭ患者に由来する試料を区別することができることが示された。図２に示されているように、総ＡｐｏＣＩＩＩをＩＧＴのバイオマーカーとして使用して、ＩＧＴを判定するためのカットオフ値が２．６０９０であることを確立した。各集団の平均値及び１標準偏差も図２に表示されている。図３に示されているように、総ＡｐｏＣＩＩＩをＤＭのバイオマーカーとして使用して、ＤＭを判定するためのカットオフ値が２．７８９０であることを確立した。各集団の平均値及び１標準偏差も図３に示されている。
【００４２】
ＡｐｏＣＩＩＩの臨床的感度及び特異性も決定した。これらの値は、下記の表１に示されている。
【００４３】
【表１】
【００４４】
疾患症例と正常症例とを識別する試験の正確性を、受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線分析を使用して評価する。比較のために、ＩＧＴ及びＤＭに関する総ＡｐｏＣＩＩＩの受信者動作特徴（ＲＯＣ）曲線もプロットした。これらのプロットは図４に示されている。表示されているプロットは、ＩＧＴ及びＤＭの両方を判定／診断する際の、ＡｐｏＣＩＩＩバイオマーカーの臨床的有用性を例示している。各プロットの曲線下面積の計算値は、それぞれ０．８４９２及び０．９７９６である。
【００４５】
その後、試料中のＡｐｏＣＩＩＩ（１）変異体の質量分析イムノアッセイ測定データを使用して、同データ評価を実施した。図５に示されているように、ＡｐｏＣＩＩＩ（１）をＩＧＴのバイオマーカーとして使用して、ＩＧＴを２集団間で判定するためのカットオフ値が１．６６００であることを確立した。各集団の平均値及び１標準偏差も図５に示されている。図６は、同様のドットヒストグラムを示すが、その代わりに、ＮＧＴ及びＤＭ試料内のＡｐｏＣＩＩＩ（１）存在量を表示する。ＡｐｏＣＩＩＩ（１）をＤＭのバイオマーカーとして使用して、ＤＭを２群間で区別するためのカットオフ値が１．９１４１であることを確立した。各集団の平均値及び１標準偏差も図６に示されている。
【００４６】
ＡｐｏＣＩＩＩ（１）変異体の分析は、総ＡｐｏＣＩＩＩ値の応用よりも臨床的有用性の向上を示した。総ＡｐｏＣＩＩＩ値と比較したＡｐｏＣＩＩＩ（１）変異体の臨床的感
度及び特異性は、上記の表１に示されている。
【００４７】
ＩＧＴ及びＤＭに関するＡｐｏＣＩＩＩ（１）のＲＯＣ曲線もプロットした。それは図７に示されている。この曲線は、ＩＧＴ及びＤＭの両方を判定／診断する際の、ＡｐｏＣＩＩＩ（１）バイオマーカーの臨床的有用性を示している。各プロットの曲線下面積の計算値は、それぞれ０．９０９０及び０．９８８６である。
【００４８】
最後に、ＡｐｏＣＩＩＩ（１）変異体データセットのアルゴリズム支援バイオ統計学評価を実施し、その結果、ＩＧＴ及びＤＭの両方を判定／診断するための臨床的感度及び特異性の向上が示された。このデータは、下記の表２に示されている。
【００４９】
【表２】
【００５０】
また、上記に示されている及び／又は上述されている全て分析を、他のＡｐｏＣＩＩＩ変異体に対して実施するか及び／又は種々の観察されたＡｐｏＣＩＩＩ変異体の組合せに対して適用して、ＩＧＴ、ＤＭ、及びそれらの関連状態を判定するための更なるバイオマーカー又はバイオマーカーの群化を決定することができる。
【００５１】
本発明の好ましい実施形態は、図面及び例示的実施形態の説明に上述されている。これら説明は、上記の実施形態を直接的に説明するが、当業者であれば、本明細書に表示及び記述されている特定の実施形態の改変及び／又は変異を考え付くことができることが理解される。この説明の範囲以内にあるあらゆるそのような改変又は変異は、同様に本明細書に含まれることが意図されている。特に記載がない限り、本明細書及び特許請求の範囲にある単語及び語句には、当該技術（複数可）における当業者にとって通常の慣用的な意味が付与されていることが、本発明者らの意図である。本出願の出願時に本出願人に知られていた本発明の好ましい実施形態及び最好の態様に関する先述の説明は、例示及び説明のために提示されており、例示及び説明のためであることが意図されている。網羅的であること、又は開示された詳細な形態に本発明を限定することは意図されておらず、上記の教示に照らして、多くの改変及び変異が可能である。例示的な実施形態は、本発明の原理及びその実用的応用を最もよく説明するために、並びに当業者が、種々の実施形態で及び企図された特定の使用に好適な種々の改変をして、本発明を最も良く使用することができるように選択及び説明された。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アポリポタンパク質ＣＩＩＩ（ＡｐｏＣＩＩＩ）及びその関連変異体のレベル及び調節を検出することにより、糖尿病前症、２型糖尿病、インスリン抵抗性、及びそれらの関連状態を、判定、診断、及び／又は評価する方法に関する。本発明は、ＡｐｏＣＩＩＩ及びその関連変異体を調節する分子をスクリーニングする方法、並びに糖尿病前症、２型糖尿病、インスリン抵抗性、及びそれらの関連状態と関連する症状の治療及び／又は改善におけるそれらの使用にも関する。
【背景技術】
【０００２】
２型糖尿病（２型真性糖尿病、インスリン非依存性糖尿病又は成人発症性糖尿病としても知られている）は、高血糖を特徴とする代謝障害である。この状態は、体内で産生されるインスリンの欠如又は体内の細胞によるインスリン抵抗性の発生（インスリン抵抗性）のいずれかの結果である。インスリンは、血液から糖を吸収するのに不可欠であるため、インスリン恒常性における異常は、最終的に血糖調節の喪失及び糖尿病状態の発症を結果としてもたらす。管理しないでおくと、過剰な血糖は、最終的に、これらに限定されないが、失明、皮膚潰瘍形成、切断、心臓病、及び腎臓病を含む多数の合併症に結びつくことになる。血糖調節の喪失に関係する多数の合併症が伴うことに関して、多くの理論的提案が存在するが、これら多数の経路が相互作用する機序は、依然として判明していない。
【０００３】
２００７年時点で、疾病管理センターは、米国人口の７．８％（２３６０万人）が２型糖尿病を有していると断定しており、２０％を超える米国人が前糖尿病性であると推測されている。これらの状態の性質が衰弱性であり、それらの治療に費用が伴うため、より有効でより効率的な早期発見方法は、米国民衆の健康及び西洋文明にとって重要である。血糖調節のレベルを評価するための「至適基準」は、経口グルコース負荷試験（ＯＧＴＴ）である。この試験には、個体又は患者の空腹時血糖を測定し、その後経口グルコース溶液の投与２時間後に、血糖測定値を取得することが必要である。現行のガイドラインでは、正常耐糖能（ＮＧＴ）は、２時間グルコースレベルが１４０ｍｇ／ｄＬ以下と規定されている。２型糖尿病（ＤＭ）の基準は、２時間グルコースが２００ｍｇ／ｄＬ以上であり、耐糖能異常（ＩＧＴ又は糖尿病前症）の定義は、１４０〜２００ｍｇ／ｄＬである。米国糖尿病協会及び世界保健機構は両方ともこれら基準を承認しているが、これら値には臨床的誤差がないわけではないか又は解釈の余地がある。
【０００４】
糖尿病医療の最近の発展には、糖尿病及び糖尿病前症の診断にタンパク質バイオマーカーであるヘモグロビンＡ１Ｃ（ＨｂＡ１Ｃ）を使用するためのガイドラインが採用されたことが含まれる。ヘモグロビンは、血中での寿命が長いため、血糖管理の長期的尺度としての役目を果たす。患者の糖尿病治療が十分か否かのバイオマーカーとして長く使用されているが、矛盾するデータがあるため、以前は糖尿病判定にＨｂＡ１Ｃを使用することが妨げられていた。これら新しいガイドラインを受け入れ、標準的ＯＧＴＴ基準及び空腹時血糖レベルと併用してそれらを使用する場合でさえ、糖尿病前症又は２型糖尿病の診断は、依然として最終的には、診断する医師の解釈及び判断に依存している。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
２型糖尿病、糖尿病前症、インスリン抵抗性、及びそれらの関連合併症の発症には汎流行的な性質があるため、できるだけ早期の介入を可能にし、ライフスタイルの変化及び／又は薬物治療による治療の有効性を評価するための手段を提供する更なる発見／診断／評価方法が、世界的に必要とされている。これら関連状態に伴う問題及び症状を緩和又は改
善する治療を開発するための更なる代謝性又は内分泌性標的に対する必要性も存在する。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本明細書において初めて示されたように、ＡｐｏＣＩＩＩ及びその関連変異体の濃度は、ＯＧＴＴを適用し、ある代謝疾患状態を臨床診断した後で得られる２時間グルコース値と相関する。これらの知見により、ＡｐｏＣＩＩＩ及びその関連変異体が、２型糖尿病、糖尿病前症、インスリン抵抗性、及びそれらの関連状態の臨床的評価／診断用のバイオマーカーとして特定される。また、これらの知見は、ＡｐｏＣＩＩＩ及びその関連変異体が、これら疾患状態の開始／発症及び病理に機械的に寄与する場合もあり、従って、疾患症状又は状態を改善及び／又は治療するための治療標的としての有用性を有する場合もあることの根拠を示す。
【０００７】
本発明の１つの目的は、２型糖尿病、糖尿病前症、インスリン抵抗性、及びそれらの関連状態をｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏで発見及び／又は診断するためにＡｐｏＣＩＩＩを分析するための新しい標的及びスクリーニング法を提供することである。
【０００８】
本発明の別の目的は、２型糖尿病、糖尿病前症、インスリン抵抗性、及びそれらの関連状態をｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏで発見及び／又は診断するための新しい標的及びスクリーニング法として、ＡｐｏＣＩＩＩ変異体を使用することである。
【０００９】
本発明の更なる目的は、ＡｐｏＣＩＩＩを調節する分子の新しい標的として、及び／又は２型糖尿病、糖尿病前症、インスリン抵抗性、及びそれらの関連状態の治療における、その発現、活性、及び／又は排除のｉｎ ｖｉｔｒｏ及び／又はｉｎ ｖｉｖｏ調節を目的とする分子のスクリーニングに、ＡｐｏＣＩＩＩを使用することである。
【００１０】
本発明のなお更なる目的は、ＡｐｏＣＩＩＩ変異体を調節する分子の新しい標的として、及び／又は２型糖尿病、糖尿病前症、インスリン抵抗性、及びそれらの関連状態の治療における、その発現、活性、及び／又は排除のｉｎ ｖｉｔｒｏ及び／又はｉｎ ｖｉｖｏ調節を目的とする分子のスクリーニングに、ＡｐｏＣＩＩＩ変異体を使用することである。
【００１１】
本発明の特徴とみなされる幾つかの新規な特徴は、特に特許請求の範囲に示されている。しかしながら、本発明自体は、その更なる目的及び利点と共にその構造及びその作用の両方に関して、添付の図面と共に読むと、本発明の例示的実施形態に関する以下の説明から最もよく理解されるだろう。特に記載がない限り、本明細書及び特許請求の範囲にある単語及び語句には、当技術（複数可）の応用における当業者にとって通常の慣用的な意味が付与されている。任意の他の意味が意図されている場合、特別の意味が単語又は語句に適用されていることを具体的に本明細書に記載するものとする。同様に、好ましい実施形態の説明における「機能」又は「手段」という単語の使用は、本発明を規定するために、米国特許法第１１２条第６項の特別規定を引用する要望を示すことを意図しない。逆に、本発明（複数可）を規定するために、米国特許法第１１２条第６項の規定を引用することが求められる場合、特許請求の範囲には、その機能を支援するいかなる構造、物質、又は行為をそのような語句に記載することもなく、「〜ための手段」又は「〜ためのステップ」という語句及び機能が、具体的に記載されるものとする。ある機能を実施する「ための手段」又は「ためのステップ」が、特許請求の範囲に記載されている場合、それらに、その手段又はステップを支援する任意の構造、物質、又は行為もまた記載されているとしても、米国特許法第１１２条第６項の規定を引用することは意図されていない。更に、米国特許法第１１２条第６項の規定が、本発明を規定するために引用される場合であっても、本発明は、好ましい実施形態に記述されている特定の構造、物質、又は行為にのみ限定されず、加えて、特許請求されている機能を実施する全ての構造、物質、又は行為が、特許請求されている機能を実施するためのあらゆる公知の又は後発の等価な構造、物質、又は行為と共に含まれることが意図されている。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
本発明の目的及び特徴は、以下の詳細な説明及び図面を参照すると、より良好に理解されるだろう。
【図１】質量分析イムノアッセイを使用した、ヒト血漿試料由来のＡｐｏＣＩＩＩ並びにそのアイソフォーム及び変異体の分析の代表的な質量スペクトルの結果を例示する図である。
【図２】図１で分析及び示された、正常耐糖能（ＮＧＴ）を示す患者及び耐糖能異常（ＩＧＴ、糖尿病前症）を示す患者由来のヒト血漿試料に由来する観察された総ＡｐｏＣＩＩＩ存在量のドットヒストグラムである。
【図３】図１で分析及び示された、正常耐糖能（ＮＧＴ）を示す患者及び２型糖尿病（ＤＭ）を示す患者由来のヒト血漿試料に由来する観察された総ＡｐｏＣＩＩＩ存在量のドットヒストグラムである。
【図４】図１で分析及び示された、各試料集団、すなわち正常耐糖能（ＮＧＴ）を示す患者由来のヒト血漿試料、耐糖能異常（ＩＧＴ、糖尿病前症）の患者由来のヒト血漿試料、及び２型糖尿病（ＤＭ）の患者由来のヒト血漿試料から得られた質量スペクトル総ＡｐｏＣＩＩＩ存在量データから確立された、その結果生じたＲＯＣ曲線を示す図である。
【図５】ＡｐｏＣＩＩＩ変異体の存在量、すなわち、図１で分析及び示された、正常耐糖能（ＮＧＴ）を示す患者及び耐糖能異常（ＩＧＴ、糖尿病前症）を示す患者由来のヒト血漿試料に由来する観察された総ＡｐｏＣＩＩＩ（１）存在量のドットヒストグラムである。
【図６】図１で分析及び示された、正常耐糖能（ＮＧＴ）を示す患者及び２型糖尿病（ＤＭ）を示す患者由来のヒト血漿試料に由来する観察された総ＡｐｏＣＩＩＩ（１）存在量のドットヒストグラムである。
【図７】図１で分析及び示された、各試料集団、すなわち正常耐糖能（ＮＧＴ）を示す患者由来のヒト血漿試料、耐糖能異常（ＩＧＴ、糖尿病前症）の患者由来のヒト血漿試料、及び２型糖尿病（ＤＭ）の患者由来のヒト血漿試料から得られた質量スペクトル総ＡｐｏＣＩＩＩ（１）存在量データから確立された、その結果生じたＲＯＣ曲線を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
ＡｐｏＣＩＩＩ及びその関連変異体は、糖尿病前症及び２型糖尿病疾患状態の両方の臨床診断と相関することが、本発明で初めて実証されている。また、ＡｐｏＣＩＩＩ及びその関連変異体の濃度の調節は、ＯＧＴＴの結果と同様であることが、初めて実証されている。この観察された現象は、２型糖尿病、糖尿病前症、インスリン抵抗性、及び／又はそれらの関連状態若しくは合併症に関係するため、この新規マーカーの有用性を直接的に示している。
【００１４】
本発明は、２型糖尿病、糖尿病前症、インスリン抵抗性、及び／又はそれらの関連状態若しくは合併症をｉｎ ｖｉｔｒｏ及び／又はｉｎ ｖｉｖｏで判定／診断／評価するためのバイオマーカーとしての総ＡｐｏＣＩＩＩの使用を包含する。本発明は、同目的のために特定のＡｐｏＣＩＩＩ変異体（複数可）を使用することも含む。
【００１５】
加えて、本発明は、糖尿病前症、２型糖尿病、インスリン抵抗性、及び／又はそれらの関連状態若しくは合併症に伴う症状を治療又は低減するために、ＡｐｏＣＩＩＩの発現、活性、及び／又は排除を調節することを目的とした、化合物のｉｎ ｖｉｔｒｏ及び／又はｉｎ ｖｉｖｏスクリーニングのマーカーとしてのＡｐｏＣＩＩＩの使用を含む。本発明は、同目的のために特定のＡｐｏＣＩＩＩ変異体（複数可）を使用することも含む。
【００１６】
本発明は、２型糖尿病、糖尿病前症、インスリン抵抗性、及び／又はそれらの関連状態若しくは合併症を判定／診断／評価するために、生体試料由来のＡｐｏＣＩＩＩ及びその関連変異体を測定する方法も含む。
【００１７】
また、本発明は、糖尿病前症、２型糖尿病、インスリン抵抗性、及び／又はそれらの関連状態若しくは合併症に伴う症状を治療又は低減するために、ＡｐｏＣＩＩＩ及びその関連変異体の発現、活性、及び／又は排除を調節することを目的として、化合物をスクリーニングするために、ＡｐｏＣＩＩＩ及びその関連変異体を測定するこれら方法を拡張する。
【００１８】
定義
本明細書で使用されている技術用語及び科学用語は全て、別様に定義されていない限り、本発明が関する分野の当業者が一般的に理解する意味を有する。本明細書で使用される場合、以下の用語は、別様に指定されていない限り、それらに帰すべき意味を有する。
【００１９】
本明細書で使用される場合、「ＡｐｏＣＩＩＩ」は、遺伝子ＡＰＯＣ３により発現されたアポリポタンパク質を記述する総称である。ＡｐｏＣＩＩＩは、ＶＬＤＬのタンパク質画分の５０％、及びＨＤＬのタンパク質画分の２％を構成する。その既知の機能は、リポタンパク質リパーゼ及び肝性リパーゼを阻害することである。ＡｐｏＣＩＩＩレベルの上昇は、高トリグリセリド血症の発症を誘導することが、以前に示されている。
【００２０】
本明細書で使用される場合、「変異体」は、生体試料に見出されるＡｐｏＣＩＩＩの異なるイソ形態又はサブ形態を指す。そのようなサブ形態は、一次構造からのアミノ酸の短縮、関連グリカンにおける糖の変更又は非存在、酸化付加物、又は遺伝子突然変異の発現の結果であってもよい。
【００２１】
本明細書で使用される場合、「ＡｐｏＣＩＩＩ（０）」は、グリカン構造の末端シアル酸残基が存在しない特定のＡｐｏＣＩＩＩ変異体を指す。
【００２２】
本明細書で使用される場合、「ＡｐｏＣＩＩＩ（１）」は、グリカン構造に単一で唯一の末端シアル酸残基が存在する特定のＡｐｏＣＩＩＩ変異体を指す。
【００２３】
本明細書で使用される場合、「ＡｐｏＣＩＩＩ（２）」は、グリカン構造に両末端シアル酸残基が存在する特定のＡｐｏＣＩＩＩ変異体を指す。
【００２４】
本明細書で使用される場合、「分析」は、生体試料に由来するＡｐｏＣＩＩＩ及び／又はその変異体の活性又は濃度の測定を指す。
【００２５】
本明細書で使用される場合、「生体試料」は、複数の成分を有する液体又は抽出物を指す。複合媒体には、これらに限定されないが、組織、細胞抽出物、核抽出物、細胞溶解産物及び排出物、血液、血清、血漿、唾液、尿、痰、関節液、脳脊髄液、涙、糞便、唾液、膜抽出物、及び産業液体等が含まれていてもよい。
【００２６】
本明細書で使用される場合、「２型糖尿病（ＤＭ）」は、過剰な血糖により定義される臨床状態である。臨床判定を支援する基準範囲は、１２６ｍｇ／ｄＬ以上の空腹時血糖値、及び／又は２００ｍｇ／ｄＬ以上の２時間経口グルコース負荷試験値である。
【００２７】
本明細書で使用される場合、「糖尿病前症、耐糖能異常（ＩＧＴ）」は、血中に存在する正常量のグルコースを上回ることにより定義される臨床状態である。臨床判定を支援す
る基準範囲は、１１０〜１２５ｍｇ／ｄＬの空腹時血糖値、及び／又は１４０〜１９９ｍｇ／ｄＬの２時間経口グルコース負荷試験値である。
【００２８】
本明細書で使用される場合、「正常耐糖能（ＮＧＴ）」は、血糖レベルが正常濃度範囲内にある場合の臨床判定である。臨床判定を支援する基準範囲は、１１０ｍｇ／ｄＬ未満の空腹時血糖値、及び／又は１４０ｍｇ／ｄＬ未満の２時間経口グルコース負荷試験値である。
【００２９】
本明細書で使用される場合、「インスリン抵抗性」は、ホルモンであるインスリンが、血糖レベルの低下にそれほど有効でなくなる身体状態である。インスリン抵抗性を評価するための至適基準は、高インスリン性正常血糖クランプ法の実施である。
【００３０】
本明細書で使用される場合、「関連状態又は合併症」は、２型糖尿病の発症及び進行に一般的に関連する様々な病弊と定義される。これらの病弊の幾つかには、これらに限定されないが、心臓発作、皮膚潰瘍形成、失明、切断、及び腎不全が含まれる。
【００３１】
本明細書で使用される場合、「質量分析」は、被検体を揮発／イオン化して、気相イオンを形成し、それらの絶対分子質量又は相対分子質量を決定する能力を指す。揮発／イオン化の好適な形態は、レーザー／光、熱、電気、及び微粒化／噴霧等、又はそれらの組合せである。
【００３２】
質量分析の好適な形態には、これらに限定されないが、マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ）、又はエレクトロスプレー（又はナノスプレー）イオン化（ＥＳＩ）質量分析等、又はそれらの組合せが含まれる。
【００３３】
本明細書で使用される場合、「対象体」は、そこから得られる生体試料中に測定可能なレベルのＡｐｏＣＩＩＩ及び／又はＡｐｏＣＩＩＩ変異体を有する、あらゆるヒト、動物、又は他の生命体を指す。
【００３４】
本発明では、ＡｐｏＣＩＩＩ及び／又はその変異体の活性又は濃度を測定する方法は、生体試料（生物学的マトリックス）を使用して実施される。考え得る生物学的マトリックスには、これらに限定されないが、組織、全血、血清、血漿、唾液、脳脊髄液、又は尿が含まれる。また、試料は、遊離していてもよく又は固体担体に固定されていてもよい。固体担体の例には、これらに限定されないが、ろ紙、ビーズ、アレイ等が含まれる。当技術分野で公知の任意の固体担体物質を、試料の固定に使用することができる。また、試料は、形態が天然であってもよく、又はこれらに限定されないが、変性、還元、及びタンパク質分解消化等を含む処理を受けていてもよい。
【００３５】
ＡｐｏＣＩＩＩ及び／又はその変異体を測定するために、本発明では、生体試料からバイオマーカーを単離又は精製する分離又は精製ステップを使用することができる。この分離は、これらに限定されないが、クロマトグラフィー、遠心分離、親和性相互作用、化学的方法、染色法、及びゲル電気泳動法を含む幾つかの手段により実施することができる。クロマトグラフィー技術には、これらに限定されないが、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）、ペーパークロマトグラフィー（ＰＣ）、アフィニティークロマトグラフィー、サイズ排除、イオン交換、逆相等が含まれる。親和性相互作用では、ある分子が、適切な適合する立体構造を有する別の分子と結合する能力を使用する。使用されるアフィニティー法には、これらに限定されないが、抗体（Ａｂ）、抗体断片（Ｆａｂ）、アプタマー、タンパク質、ペプチド、レクチン等を使用する親和性相互作用が含まれていてもよい。サンドイッチアッセイの場合、一次及び二次親和性リガンドの組合せを使用してもよい。ゲル電気泳動法方法には、これらに限定されないが、アクリルアミド、アガロース等が含まれていてもよい。化学的方法には、これらに限定されないが、アミノ酸分析、配列決定等が含まれていてもよい。染色法には、これらに限定されないが、ＡｐｏＣＩＩＩ及びその変異体と直接結合するか、又はＡｐｏＣＩＩＩ及びその変異体と結合する分子と結合する任意の染料等の使用が含まれていてもよい。
【００３６】
ＡｐｏＣＩＩＩ及び／又はＡｐｏＣＩＩＩ変異体を測定する方法では、単離されたバイオマーカー（つまり、単離されたＡｐｏＣＩＩＩ及び／又はＡｐｏＣＩＩＩ変異体（複数可））の検出技術を使用することになる。検出方法は、性質が直接的であってもよく又は間接的であってもよい。検出技術には、これらに限定されないが、染色、分光法、スペクトロメトロスコピー、分光光度法、比色法、蛍光、ルミネセンス、磁気、放射性同位元素、核磁気共鳴法、Ｘ線結晶法、表面プラズモン共鳴、質量分析等が含まれる。生体試料の状態に応じて、検出されるＡｐｏＣＩＩＩ又はＡｐｏＣＩＩＩ変異体形態は、完全なものであってもよく又はその断片であってもよい。
【実施例】
【００３７】
バイオマーカー有用性を実証する分析
実施例
ヒト血漿に由来するアポリポタンパク質ＣＩＩＩ及びその変異体の分析
本発明の１つの例示的実施形態は、臨床的に規定された試料の集団を区別するバイオマーカー（複数可）として使用するためのＡｐｏＣＩＩＩ及びその変異体の濃度測定である。この例示的実施形態の分析を、質量分析イムノアッセイ（ＭＳＩＡ）技術を使用して実施した。
【００３８】
この例では、分析は、ＮＧＴ、ＩＧＴ、又はＤＭを有すると新たに診断され臨床的に規定された患者から得たヒトシトラート血漿試料に対して実施した。ＮＧＴ個体から得た３６０個の血漿試料、ＩＧＴの患者から得た９８個の血漿試料、及びＤＭの患者に由来する２５個の血漿試料があり、それらを全て同じ様式で分析した。
【００３９】
ＭＳＩＡは、親和性ピペットチップを使用して実施した。親和性ピペットチップは、ピペッター先端の入口に取り付けられている小型の多孔性マイクロカラムで作られている。マイクロカラムは、親和性リガンドで誘導体化されている。親和性ピペットを誘導体化するために使用された親和性リガンドは、抗ＡｐｏＣＩＩＩ抗体だった。試料調製には、ＡｐｏＣＩＩＩを半定量的に測定するための内部基準標準物質（ＩＲＳ）の添加を必要とした。各試料混合物は、２５μＬの１０倍希釈（緩衝液を用いて）ヒト血漿、３０μＬのカニクイザル血漿（カニクイザルＡｐｏＣＩＩＩはＩＲＳである）、及び１％のｔｗｅｅｎ２０を有する１４５μＬのＨＥＰＥＳ緩衝食塩水からなっていた。調製した試料は、親和性ピペットを通して試料を反復排出することにより、抗ＡｐｏＣＩＩＩ親和性ピペットチップを用いて調査した。精製プロセスでは、ＨＥＰＥＳ緩衝食塩水を使用し、水ですすいだ後、ＡｐｏＣＩＩＩ親和性回収を行った。その後、濃縮及び精製されたタンパク質を、シナピン酸ＭＡＬＤＩマトリックスを用いて親和性ピペットから溶出し、その後の質量分析検出用にＭＡＬＤＩ質量分析計標的に直接のせた。
【００４０】
その結果得られた質量スペクトルを検討すると、ＩＲＳと同様に、ヒト血漿中に存在するＡｐｏＣＩＩＩの複数形態に由来するシグナルが示された。各スペクトルを、ＩＲＳから得られたＡｐｏＣＩＩＩシグナルの積分値に正規化した。各質量スペクトル内では、ヒトＡｐｏＣＩＩＩの質量移動変異体が明らかに分離されており、大多数の試料においてＡｐｏＣＩＩＩ（１）アイソフォームが最も豊富であった。多数のＡｐｏＣＩＩＩ変異体が各試料から検出されたが、この例では、３つの最も豊富な形態：すなわち、ＡｐｏＣＩＩＩ（０）、ＡｐｏＣＩＩＩ（１）、及びＡｐｏＣＩＩＩ（２）に注目する。正規化されたスペクトルは、ＡｐｏＣＩＩＩ（０）、ＡｐｏＣＩＩＩ（１）、及びＡｐｏＣＩＩＩ（２
）が、異なる試料間で調節されていることを明白に示す。図１には、ＡｐｏＣＩＩＩ及びその変異体の存在量が、正常耐糖能（ＮＧＴ）を示す患者、耐糖能異常（ＩＧＴ、糖尿病前症）の患者、及び２型糖尿病（ＤＭ）の患者に由来するヒト血漿試料で異なることが例示されている。図１には、ＩＧＴ及びＤＭと診断された患者由来の試料において、ＡｐｏＣＩＩＩ変異体は全て増加したことが示されている。
【００４１】
その結果得られた質量分析データにより、ＮＧＴ患者及びＩＧＴ／ＤＭ患者に由来する試料を区別することができることが示された。図２に示されているように、総ＡｐｏＣＩＩＩをＩＧＴのバイオマーカーとして使用して、ＩＧＴを判定するためのカットオフ値が２．６０９０であることを確立した。各集団の平均値及び１標準偏差も図２に表示されている。図３に示されているように、総ＡｐｏＣＩＩＩをＤＭのバイオマーカーとして使用して、ＤＭを判定するためのカットオフ値が２．７８９０であることを確立した。各集団の平均値及び１標準偏差も図３に示されている。
【００４２】
ＡｐｏＣＩＩＩの臨床的感度及び特異性も決定した。これらの値は、下記の表１に示されている。
【００４３】
【表１】
【００４４】
疾患症例と正常症例とを識別する試験の正確性を、受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線分析を使用して評価する。比較のために、ＩＧＴ及びＤＭに関する総ＡｐｏＣＩＩＩの受信者動作特徴（ＲＯＣ）曲線もプロットした。これらのプロットは図４に示されている。表示されているプロットは、ＩＧＴ及びＤＭの両方を判定／診断する際の、ＡｐｏＣＩＩＩバイオマーカーの臨床的有用性を例示している。各プロットの曲線下面積の計算値は、それぞれ０．８４９２及び０．９７９６である。
【００４５】
その後、試料中のＡｐｏＣＩＩＩ（１）変異体の質量分析イムノアッセイ測定データを使用して、同データ評価を実施した。図５に示されているように、ＡｐｏＣＩＩＩ（１）をＩＧＴのバイオマーカーとして使用して、ＩＧＴを２集団間で判定するためのカットオフ値が１．６６００であることを確立した。各集団の平均値及び１標準偏差も図５に示されている。図６は、同様のドットヒストグラムを示すが、その代わりに、ＮＧＴ及びＤＭ試料内のＡｐｏＣＩＩＩ（１）存在量を表示する。ＡｐｏＣＩＩＩ（１）をＤＭのバイオマーカーとして使用して、ＤＭを２群間で区別するためのカットオフ値が１．９１４１であることを確立した。各集団の平均値及び１標準偏差も図６に示されている。
【００４６】
ＡｐｏＣＩＩＩ（１）変異体の分析は、総ＡｐｏＣＩＩＩ値の応用よりも臨床的有用性の向上を示した。総ＡｐｏＣＩＩＩ値と比較したＡｐｏＣＩＩＩ（１）変異体の臨床的感
度及び特異性は、上記の表１に示されている。
【００４７】
ＩＧＴ及びＤＭに関するＡｐｏＣＩＩＩ（１）のＲＯＣ曲線もプロットした。それは図７に示されている。この曲線は、ＩＧＴ及びＤＭの両方を判定／診断する際の、ＡｐｏＣＩＩＩ（１）バイオマーカーの臨床的有用性を示している。各プロットの曲線下面積の計算値は、それぞれ０．９０９０及び０．９８８６である。
【００４８】
最後に、ＡｐｏＣＩＩＩ（１）変異体データセットのアルゴリズム支援バイオ統計学評価を実施し、その結果、ＩＧＴ及びＤＭの両方を判定／診断するための臨床的感度及び特異性の向上が示された。このデータは、下記の表２に示されている。
【００４９】
【表２】
【００５０】
また、上記に示されている及び／又は上述されている全て分析を、他のＡｐｏＣＩＩＩ変異体に対して実施するか及び／又は種々の観察されたＡｐｏＣＩＩＩ変異体の組合せに対して適用して、ＩＧＴ、ＤＭ、及びそれらの関連状態を判定するための更なるバイオマーカー又はバイオマーカーの群化を決定することができる。
【００５１】
本発明の好ましい実施形態は、図面及び例示的実施形態の説明に上述されている。これら説明は、上記の実施形態を直接的に説明するが、当業者であれば、本明細書に表示及び記述されている特定の実施形態の改変及び／又は変異を考え付くことができることが理解される。この説明の範囲以内にあるあらゆるそのような改変又は変異は、同様に本明細書に含まれることが意図されている。特に記載がない限り、本明細書及び特許請求の範囲にある単語及び語句には、当該技術（複数可）における当業者にとって通常の慣用的な意味が付与されていることが、本発明者らの意図である。本出願の出願時に本出願人に知られていた本発明の好ましい実施形態及び最好の態様に関する先述の説明は、例示及び説明のために提示されており、例示及び説明のためであることが意図されている。網羅的であること、又は開示された詳細な形態に本発明を限定することは意図されておらず、上記の教示に照らして、多くの改変及び変異が可能である。例示的な実施形態は、本発明の原理及びその実用的応用を最もよく説明するために、並びに当業者が、種々の実施形態で及び企図された特定の使用に好適な種々の改変をして、本発明を最も良く使用することができるように選択及び説明された。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
１つ又は複数の対象体の２型糖尿病、糖尿病前症、インスリン抵抗性、及びそれらの関連状態のうちの少なくとも１つを判定、診断、及びモニターすることのうちの少なくとも１つをする方法であって、ＡｐｏＣＩＩＩ及びその変異体のうちの少なくとも１つを分析するステップを含む方法。
【請求項２】
前記ＡｐｏＣＩＩＩ及びその変異体を分析するステップが、ＡｐｏＣＩＩＩ（０）、ＡｐｏＣＩＩＩ（１）、及びＡｐｏＣＩＩＩ（２）のうちの少なくとも１つを分析するステップを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ＡｐｏＣＩＩＩ及びその変異体のうちの少なくとも１つを分析するステップが、質量分析、クロマトグラフィー、親和性反応、ゲル電気泳動法、遠心分離、化学的方法、及び染色法のうちの少なくとも１つを実施するステップを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記ＡｐｏＣＩＩＩを分析するステップが、単一のアッセイを実施するステップを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
単一の質量分析を実施するステップを更に含む、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
対象体の糖尿病前症を診断する方法であって、前記対象体の生体試料中のＡｐｏＣＩＩＩ及びその変異体のうちの少なくとも１つのレベルを検出するステップと、前記ＡｐｏＣＩＩＩ及びその変異体のうちの少なくとも１つのレベルが、正常耐糖能を有する１つ又は複数の対象体に存在するレベルから統計的に有意な量調節されている場合に、糖尿病前症を有すると前記対象体を診断するステップとを含む方法。
【請求項７】
前記糖尿病前症を有すると前記対象体を診断するステップが、前記ＡｐｏＣＩＩＩ及びその変異体のうちの少なくとも１つのレベルが、正常耐糖能を有する１つ又は複数の対象体に存在するレベルを超えて統計的有意な量増加されている場合に、糖尿病前症を有すると前記対象体を診断するステップを含む、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記ＡｐｏＣＩＩＩ及びその変異体のうちの少なくとも１つのレベルを検出するステップが、ＡｐｏＣＩＩＩ（１）のレベルを検出するステップと、前記ＡｐｏＣＩＩＩ（１）のレベルが、正常耐糖能を有する１つ又は複数の対象体に存在するＡｐｏＣＩＩＩ（１）のレベルから統計的に有意な量調節されている場合に、糖尿病前症を有すると前記対象体を診断するステップとを含む、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
前記糖尿病前症を有すると前記対象体を診断するステップが、前記ＡｐｏＣＩＩＩ（１）のレベルが、正常耐糖能を有する１つ又は複数の対象体に存在するレベルを超えて統計的有意な量増加されている場合に、糖尿病前症を有すると前記対象体を診断するステップを含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
対象体の２型糖尿病を診断する方法であって、前記対象体の生体試料中のＡｐｏＣＩＩＩ及びその変異体のうちの少なくとも１つのレベルを検出するステップと、前記ＡｐｏＣＩＩＩ及びその変異体のうちの少なくとも１つのレベルが、正常耐糖能を有する１つ又は複数の対象体に存在するレベルから統計的に有意な量調節されている場合に、２型糖尿病を有すると前記対象体を診断するステップとを含む方法。
【請求項１１】
前記２型糖尿病前症を有すると前記対象体を診断するステップが、前記ＡｐｏＣＩＩＩ及びその変異体のうちの少なくとも１つのレベルが、正常耐糖能を有する１つ又は複数の
対象体に存在するレベルを超えて統計的に有意な量増加されている場合に、２型糖尿病を有すると前記対象体を診断するステップを含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記ＡｐｏＣＩＩＩ及びその変異体のうちの少なくとも１つのレベルを検出するステップが、ＡｐｏＣＩＩＩ（１）のレベルを検出するステップと、前記ＡｐｏＣＩＩＩ（１）のレベルが、正常耐糖能を有する１つ又は複数の対象体に存在するＡｐｏＣＩＩＩ（１）のレベルから統計的に有意な量調節されている場合に、２型糖尿病を有すると前記対象体を診断するステップとを含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
前記２型糖尿病前症を有すると前記対象体を診断するステップが、前記ＡｐｏＣＩＩＩ（１）のレベルが、正常耐糖能を有する１つ又は複数の対象体に存在するＡｐｏＣＩＩＩ（１）のレベルを超えて統計的に有意な量増加されている場合に、２型糖尿病を有すると前記対象体を診断するステップを含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
１つ又は複数の対象体の２型糖尿病、糖尿病前症、インスリン抵抗性、及びそれらの関連状態のうちの少なくとも１つの治療的処置を評価する方法であって、前記１つ又は複数の対象体に由来する生体試料中のＡｐｏＣＩＩＩ及びその変異体のうちの少なくとも１つをモニターするステップを含む方法。
【請求項１５】
前記ＡｐｏＣＩＩＩ及びその変異体のうちの少なくとも１つをモニターするステップが、ＡｐｏＣＩＩＩ（０）、ＡｐｏＣＩＩＩ（１）、及びＡｐｏＣＩＩＩ（２）のうちの少なくとも１つをモニターするステップを含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
２型糖尿病、糖尿病前症、インスリン抵抗性、及びそれらの関連状態のうちの少なくとも１つの治療的処置を特定する方法であって、前記治療的処置が、対象体内のＡｐｏＣＩＩＩ及びその変異体のうちの少なくとも１つの活性又は濃度を調節することができるかどうかを決定するステップを含む方法。
【請求項１７】
前記治療的処置がＡｐｏＣＩＩＩ及びその変異体のうちの少なくとも１つの活性又は濃度を調節することができるかどうかを判断するステップが、前記治療的処置がＡｐｏＣＩＩＩ（０）、ＡｐｏＣＩＩＩ（１）、及びＡｐｏＣＩＩＩ（２）のうちの少なくとも１つの活性又は濃度を調節することができるかどうかを判断するステップを含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１】
１つ又は複数の対象体の２型糖尿病、糖尿病前症、インスリン抵抗性、及びそれらの関連状態のうちの少なくとも１つを判定、診断、及びモニターすることのうちの少なくとも１つをする方法であって、ＡｐｏＣＩＩＩ及びその変異体のうちの少なくとも１つを分析するステップを含む方法。
【請求項２】
前記ＡｐｏＣＩＩＩ及びその変異体を分析するステップが、ＡｐｏＣＩＩＩ（０）、ＡｐｏＣＩＩＩ（１）、及びＡｐｏＣＩＩＩ（２）のうちの少なくとも１つを分析するステップを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ＡｐｏＣＩＩＩ及びその変異体のうちの少なくとも１つを分析するステップが、質量分析、クロマトグラフィー、親和性反応、ゲル電気泳動法、遠心分離、化学的方法、及び染色法のうちの少なくとも１つを実施するステップを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記ＡｐｏＣＩＩＩを分析するステップが、単一のアッセイを実施するステップを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
単一の質量分析を実施するステップを更に含む、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
対象体の糖尿病前症を診断する方法であって、前記対象体の生体試料中のＡｐｏＣＩＩＩ及びその変異体のうちの少なくとも１つのレベルを検出するステップと、前記ＡｐｏＣＩＩＩ及びその変異体のうちの少なくとも１つのレベルが、正常耐糖能を有する１つ又は複数の対象体に存在するレベルから統計的に有意な量調節されている場合に、糖尿病前症を有すると前記対象体を診断するステップとを含む方法。
【請求項７】
前記糖尿病前症を有すると前記対象体を診断するステップが、前記ＡｐｏＣＩＩＩ及びその変異体のうちの少なくとも１つのレベルが、正常耐糖能を有する１つ又は複数の対象体に存在するレベルを超えて統計的有意な量増加されている場合に、糖尿病前症を有すると前記対象体を診断するステップを含む、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記ＡｐｏＣＩＩＩ及びその変異体のうちの少なくとも１つのレベルを検出するステップが、ＡｐｏＣＩＩＩ（１）のレベルを検出するステップと、前記ＡｐｏＣＩＩＩ（１）のレベルが、正常耐糖能を有する１つ又は複数の対象体に存在するＡｐｏＣＩＩＩ（１）のレベルから統計的に有意な量調節されている場合に、糖尿病前症を有すると前記対象体を診断するステップとを含む、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
前記糖尿病前症を有すると前記対象体を診断するステップが、前記ＡｐｏＣＩＩＩ（１）のレベルが、正常耐糖能を有する１つ又は複数の対象体に存在するレベルを超えて統計的有意な量増加されている場合に、糖尿病前症を有すると前記対象体を診断するステップを含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
対象体の２型糖尿病を診断する方法であって、前記対象体の生体試料中のＡｐｏＣＩＩＩ及びその変異体のうちの少なくとも１つのレベルを検出するステップと、前記ＡｐｏＣＩＩＩ及びその変異体のうちの少なくとも１つのレベルが、正常耐糖能を有する１つ又は複数の対象体に存在するレベルから統計的に有意な量調節されている場合に、２型糖尿病を有すると前記対象体を診断するステップとを含む方法。
【請求項１１】
前記２型糖尿病前症を有すると前記対象体を診断するステップが、前記ＡｐｏＣＩＩＩ及びその変異体のうちの少なくとも１つのレベルが、正常耐糖能を有する１つ又は複数の
対象体に存在するレベルを超えて統計的に有意な量増加されている場合に、２型糖尿病を有すると前記対象体を診断するステップを含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記ＡｐｏＣＩＩＩ及びその変異体のうちの少なくとも１つのレベルを検出するステップが、ＡｐｏＣＩＩＩ（１）のレベルを検出するステップと、前記ＡｐｏＣＩＩＩ（１）のレベルが、正常耐糖能を有する１つ又は複数の対象体に存在するＡｐｏＣＩＩＩ（１）のレベルから統計的に有意な量調節されている場合に、２型糖尿病を有すると前記対象体を診断するステップとを含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
前記２型糖尿病前症を有すると前記対象体を診断するステップが、前記ＡｐｏＣＩＩＩ（１）のレベルが、正常耐糖能を有する１つ又は複数の対象体に存在するＡｐｏＣＩＩＩ（１）のレベルを超えて統計的に有意な量増加されている場合に、２型糖尿病を有すると前記対象体を診断するステップを含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
１つ又は複数の対象体の２型糖尿病、糖尿病前症、インスリン抵抗性、及びそれらの関連状態のうちの少なくとも１つの治療的処置を評価する方法であって、前記１つ又は複数の対象体に由来する生体試料中のＡｐｏＣＩＩＩ及びその変異体のうちの少なくとも１つをモニターするステップを含む方法。
【請求項１５】
前記ＡｐｏＣＩＩＩ及びその変異体のうちの少なくとも１つをモニターするステップが、ＡｐｏＣＩＩＩ（０）、ＡｐｏＣＩＩＩ（１）、及びＡｐｏＣＩＩＩ（２）のうちの少なくとも１つをモニターするステップを含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
２型糖尿病、糖尿病前症、インスリン抵抗性、及びそれらの関連状態のうちの少なくとも１つの治療的処置を特定する方法であって、前記治療的処置が、対象体内のＡｐｏＣＩＩＩ及びその変異体のうちの少なくとも１つの活性又は濃度を調節することができるかどうかを決定するステップを含む方法。
【請求項１７】
前記治療的処置がＡｐｏＣＩＩＩ及びその変異体のうちの少なくとも１つの活性又は濃度を調節することができるかどうかを判断するステップが、前記治療的処置がＡｐｏＣＩＩＩ（０）、ＡｐｏＣＩＩＩ（１）、及びＡｐｏＣＩＩＩ（２）のうちの少なくとも１つの活性又は濃度を調節することができるかどうかを判断するステップを含む、請求項１６に記載の方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【公表番号】特表２０１２−５３３０６６（Ｐ２０１２−５３３０６６Ａ）
【公表日】平成２４年１２月２０日（２０１２．１２．２０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−５１９６５２（Ｐ２０１２−５１９６５２）
【出願日】平成２２年７月３日（２０１０．７．３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０４０９９８
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／００５７１８
【国際公開日】平成２３年１月１３日（２０１１．１．１３）
【出願人】（５１２００７３８４）イントリンジック バイオプローブズ，インコーポレイテッド (2)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２４年１２月２０日（２０１２．１２．２０）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年７月３日（２０１０．７．３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０４０９９８
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／００５７１８
【国際公開日】平成２３年１月１３日（２０１１．１．１３）
【出願人】（５１２００７３８４）イントリンジック バイオプローブズ，インコーポレイテッド (2)
【Ｆターム（参考）】
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