糖尿病性腎症の治療用医薬組成物
【課題】糖尿病性腎症の治療に有効な薬剤を提供する。
【解決手段】 下記の式１：
【化１】
によって表される３−（２−メチルカルボキシメチル）−６−メトキシ−８−ヒドロキシイソクマリン、あるいはプロドラッグとしてのその誘導体、を有効成分として含む糖尿病性腎症の治療または予防用医薬組成物。
【解決手段】 下記の式１：
【化１】
によって表される３−（２−メチルカルボキシメチル）−６−メトキシ−８−ヒドロキシイソクマリン、あるいはプロドラッグとしてのその誘導体、を有効成分として含む糖尿病性腎症の治療または予防用医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、糖尿病性腎症の治療または予防用医薬組成物に関する。具体的には、本発明の医薬組成物は、３−（２−メチルカルボキシメチル）−６−メトキシ−８−ヒドロキシイソクマリン（以下「ＮＭ−３」とも称する）またはその誘導体を有効成分として含むことを特徴とする。
【背景技術】
【０００２】
２型糖尿病の発症率は世界的に増加しており、３０〜４０％の患者にて糖尿病性腎症を発症する。現在、我が国において維持透析患者の原因疾患では、糖尿病性腎症が最多であり、糖尿病性腎症の進展機序の解明および新たな治療法の開発は重要な課題である。
【０００３】
糖尿病性腎症では、早期に糸球体過剰濾過・糸球体肥大、引き続いて糸球体基底膜の肥厚・メサンギウム基質の増加や尿中アルブミン排泄増加が認められ、最終的には糸球体硬化に到る（非特許文献１）。腎症早期の段階で、糸球体係蹄数の増加・既存の血管の伸長等の血管新生様の現象が認められる。１型及び２型糖尿病の進展にＴＧＦ−β１，ＩＧＦ−１等の種々の増殖因子が関与するが、血管新生促進因子である血管内皮細胞増殖因子（ｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ：ＶＥＧＦ） の関与も報告された。
【０００４】
血管新生の進展過程では、最初に血管基底膜がＭＭＰ−２，９等のプロテアーゼにより分解される。次に血管内皮細胞が血管外に遊走・増殖する。この過程でＶＥＧＦ，塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ），アンギオポエチン（ａｎｇｉｏｐｏｉｅｔｉｎ）−２等の因子が関与する。次に、血管内皮細胞が管腔を形成し間葉系細胞が付着する。その後、アンギオポエチン−１の作用により間葉系細胞が周皮細胞（ｐｅｒｉｃｙｔｅ）に分化し、新生血管が安定化する。
【０００５】
ストレプトゾトシン（ｓｔｒｅｐｔｏｚｏｔｏｃｉｎ）誘発糖尿病性腎症ラットモデル（１型糖尿病モデル）にてＶＥＧＦ発現が早期（３週）にて糸球体上皮細胞（ｐｏｄｏｃｙｔｅ）で増加し、進展期（８３週）においてＶＥＧＦ受容体のｆｌｋ−１が糸球体内皮細胞にて増加することが報告された（非特許文献２）。一方、２型糖尿病モデルのＯＬＥＴＦラットでは９，２０，６８週にてすなわち早期及び進展期にてＶＥＧＦの糸球体での発現が増加した。そして、ａｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎ変換酵素阻害剤投与にてＶＥＧＦ発現が抑制された（非特許文献３）。また、ｓｔｒｅｐｔｏｚｏｔｏｃｉｎ誘発糖尿病性腎症ラットモデルおよびｄｂ／ｄｂマウス（２型糖尿病モデル）にて中和型抗ＶＥＧＦ抗体投与により、糸球体過剰濾過、糸球体肥大、アルブミン尿ならびに進展期のメサンギウム基質増加が有意に抑制された（非特許文献４、５）。また、抗ＶＥＧＦ抗体を有効成分として含む糖尿病性腎症診断剤も報告されている（特許文献１）。また、糖尿病性腎症において糸球体係蹄（毛細血管）数の増加、糸球体毛細血管の伸長により糸球体濾過表面積の増加がおこることが糖尿病性腎症ラットモデルにて報告された（非特許文献６）。
【０００６】
サイトゲニン（Ｃｙｔｏｇｅｎｉｎ；８-ヒドロキシ-３-ヒドロキシメチル-６-メトキシイソクマリン）はストレプトベルチシリウム・ユーロシジカム（Ｓｔｒｅｐｔｏｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ ｅｕｒｏｃｉｄｉｃｕｍ）の培養濾液より分離された物質であるが、関節炎モデルにおける治療効果・抗血管新生作用をもつ。サイトゲニンは生体内で速やかに代謝されるが、その類似合成物質であるＮＭ−３は、経口投与可能でサイトゲニンに比して安定である。ＮＭ−３はマウスｄｏｒｓａｌ ａｉｒ ｓａｃ ｓｙｓｔｅｍを用いた実験系で抗血管新生活性をもつことが報告された（非特許文献７）。ＩＩ型コラーゲン誘発関節炎マウスモデルにおいて、ＮＭ−３経口投与による関節炎すなわち浮腫等の炎症性変化並びに骨破壊の抑制効果が報告されている（非特許文献８）。ＮＭ−３はヒト臍帯静脈内皮細胞の増殖・遊走を抑制し、発芽的血管新生・管腔形成を抑制し、腫瘍内血管新生を抑制する作用がある（非特許文献９）。また、ＮＭ−３と抗癌化学療法剤パクリタキセル（ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ）との併用による相乗的抗腫瘍効果がヒト乳癌モデルマウスを用いて報告されている（非特許文献９）。また、放射線療法との併用による抗腫瘍効果も報告されている（非特許文献１０）。最近、デキサメサゾン誘発ヒト多発性骨髄腫細胞のアポトーシスをＮＭ−３が促進する作用が報告された（非特許文献１１）。以前、米国ＩＬＥＸ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ社が固形腫瘍患者を対照とした第一相臨床試験を行った。経口投与にて１５０−２０００ｍｇ／ｍ２を投与されているが、毒性は認めず一部患者にて進行抑制効果を認めた（非特許文献１２）。また、経口投与時の半減期は６時間で、組織への移行も良好であった（非特許文献１３）。
【０００７】
【特許文献１】特開平０８−２４５４２４号公報
【非特許文献１】Ｍａｋｉｎｏ,Ｈ.ら，Ｄｉａｂｅｔｅｓ，４５：４８８−４９５（１９９６）
【非特許文献２】Ｃｏｏｐｅｒ，Ｍ．Ｅ．ら，Ｄｉａｂｅｔｅｓ,４８：２２２９（１９９９）
【非特許文献３】Ｔｓｕｃｈｉｄａ，Ｋ．ら，Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉａ,４２：５７９（１９９９）
【非特許文献４】Ｄｅ Ｖｒｉｅｓｅ，Ａ．Ｓ．ら，Ｊ Ａｍ Ｓｏｃ Ｎｅｐｈｒｏｌ，１２：９９３（２００１）
【非特許文献５】Ｆｌｙｖｂｊｅｒｇ，Ａ．ら，Ｄｉａｂｅｔｅｓ,５１：３０９０（２００３）
【非特許文献６】Ｎｙｅｎｇａａｒｄ，Ｊ．Ｒ．ら，Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉａ,３６：１８９（１９９３）
【非特許文献７】Ｎａｋａｓｈｉｍａ,Ｔ．ら，Ｊ Ａｎｔｉｂｉｏｔ（Ｔｏｋｙｏ）， ５２：４２６−４２８（１９９９）
【非特許文献８】Ａｇａｔａ,Ｎ．ら，Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ Ｍｏｌ Ｐａｔｈｏｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ，１０８：２９７−３０９（２０００）
【非特許文献９】Ｒｅｉｍｅｒ,Ｃ．Ｌ．ら，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ，６２：７８９−７９５（２００２）
【非特許文献１０】Ｓａｌｌｏｕｍ,Ｒ．Ｍ．ら，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ，６０：６９５８−６９６３（２０００）
【非特許文献１１】Ａｇａｔａ,Ｎ．ら，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ，６４：８５１２−８５１６（２００４）
【非特許文献１２】Ｓｏｕｌｉｅ，Ｐ．ら，Ｐｒｏｃ Ａｍ Ｓｏｃ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ,２２：１９４（ａｂｓｔｒ）（２００３）
【非特許文献１３】Ｂｏｎａｔｅ，Ｐ．Ｌ．ら，Ｐｒｏｃ Ａｍ Ｓｏｃ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ,２２：１３４（ａｂｓｔｒ）（２００３）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
糖尿病患者の著しい増加に伴い、糖尿病性腎症の進展機序の解明および有効な治療法の開発が緊急の課題である。腎症へのＶＥＧＦの関与が報告されているが、複雑な生体系でこの特定の因子のみが疾患に関わるとは考え難い。一方、ＮＭ−３については、これまで抗癌剤としての使用例はあるが、糖尿病性腎症に有効であるかどうかは不明であった。これまでに、糖尿病性腎症の治療を目的とした、ＮＭ−３の糸球体内皮細胞への作用や腎における血管新生誘導因子もしくは制御因子発現への作用に関する検討はなされていなかった。
【０００９】
本発明は、糖尿病性腎症の治療に有効な薬剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は、以下の特徴を有する。
すなわち、本発明は、下記の式１：
【００１１】
【化１】
によって表される３−（２−メチルカルボキシメチル）−６−メトキシ−８−ヒドロキシイソクマリン、あるいはプロドラッグとしてのその誘導体、を有効成分として含む糖尿病性腎症の治療または予防用医薬組成物を提供する。
【００１２】
第１の実施形態において、上記式１の化合物が、光学活性体である。
第２の実施形態において、前記式１の化合物が、ラセミ体である。
第３の実施形態において、前記式１の化合物が、エナンチオマーの混合物である。
第４の実施形態において、前記誘導体が、式１の化合物の塩、エステル化物、アミド化物またはアシル化物である。
【発明の効果】
【００１３】
本発明は、糖尿病性腎症の予防または治療に有効である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
本発明は、上記のとおり、糖尿病性腎症の治療または予防に有効な医薬組成物を提供する。その治療または予防に有効な成分は、ＮＭ−３、またはプロドラッグとしてのその誘導体、である。
【００１５】
糖尿病性腎症は、早期に糸球体過剰濾過、糸球体肥大、それに続いて糸球体基底膜の肥厚、メサンギウム基質の増加、尿中アルブミン排泄増加が認められ、最終的には糸球体硬化に到る疾患である。本発明のＮＭ−３は、糖尿病性腎症の治療または予防のために有効であり、腎症を改善または緩和する作用効果を有する。具体的には、ＮＭ−３は次のような作用効果を示す。
【００１６】
（ａ）尿中アルブミン・クレアチニン比（ＵＡＣＲ）が減少する（図１Ｂ）。
（ｂ）クレアチニンクリアランスが低下する（図１Ａ）。
（ｃ）糸球体容積が減少する（図２Ｄ）。
（ｄ）メサンギウム領域が減少する（図２Ｅ）。
（ｅ）腎皮質における血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）およびアンギオポエチン−２蛋白質発現が抑制される（図３Ａ，Ｂ，Ｄ）。
【００１７】
本発明において、糖尿病とは、インスリン不足により引き起こされるグルコース代謝異常の疾患であり、インスリン依存型糖尿病（１型）およびインスリン非依存型糖尿病（２型）の両方が含まれる。１型糖尿病は、すい臓ランゲルハンス氏島のβ細胞の破壊のためにインスリン分泌が欠乏し、インスリンの絶対的不足によって発症する疾患である。一方、２型糖尿病は、インスリン分泌異常かあるいはインスリン抵抗性のために発症する疾患である。糖尿病患者の約８５〜９０％が２型糖尿病に罹患しているといわれている。糖尿病患者の約３０％以上の患者は合併症の１つとして糖尿病性腎症を発症する。
【００１８】
上記のとおり、本発明の医薬組成物は、糖尿病自体を改善するものではないが、この１型、２型糖尿病性腎症の予防または治療に有効である。
【００１９】
本明細書で使用する「予防」または「予防する」とは、目的の疾患の発症を抑制または阻止することを意味する。
【００２０】
本明細書で使用する「治療」または「治療する」とは、目的の疾患を治癒、軽減または抑制することを意味する。
【００２１】
本発明の医薬組成物の有効成分は、ＮＭ−３、またはプロドラッグとしてのその誘導体、であり、腎臓での血管新生抑制活性を有するものである。
【００２２】
本明細書で使用する「血管新生抑制活性」とは、アンギオポエチン−２／ＶＥＧＦ発現の抑制作用を指す。
【００２３】
本明細書で使用する「プロドラッグ」とは、被験者の体内に投与されたときに例えば生体内酵素または体液によってＮＭ−３に変換されうる前駆体薬剤を意味する。本発明におけるプロドラッグは、それ自体が糖尿病性腎症に対して治療効果を示してもよいし、あるいはそのような効果を示さなくてもよいものとする。
【００２４】
本発明の有効成分であるＮＭ−３は、ＩＬＥＸ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ社（テキサス、ＵＳＡ）から市販されており入手可能である。
【００２５】
ＮＭ−３は、哺乳類肉腫細胞系Ｓ−１８０が誘導する血管新生を抑制することは知られていた（非特許文献７）が、糖尿病性腎症の治療および予防のために有効であることは、今回本発明者らによって初めて見出された。
【００２６】
本発明で使用可能なＮＭ−３は、その３位の置換基（すなわち、２−メチルカルボキシメチル基）に不斉炭素原子を含むため、光学活性体であってもよいし、あるいはエナンチオマー混合物またはラセミ体であることもできる。
【００２７】
エナンチオマー混合物は、ＮＭ−３の２つの光学活性エナンチオマー（すなわち、鏡像異性体）の混合物であり、そのいずれか一方の含有量が他方より多いものをいう。例えばエナンチオマーＡとＢの混合比は、５０超：５０未満、例えば６０：４０、７０：３０、８０：２０、９０：１０、９５：５、９８：２、９９：１、あるいは逆に、５０未満：５０超、例えば４０：６０、３０：７０、２０：８０、１０：９０、５：９５，２：９８、１：９９などである。また、２つのエナンチオマーが５０：５０の比で含まれる場合、ＮＭ−３はラセミ体であるという。糖尿病性腎症の治療または予防効果が得られるならば、いかなるエナンチオマーの混合比のエナンチオマー混合物またはラセミ体であってもよい。
【００２８】
本発明ではさらに、ＮＭ−３のプロドラッグ誘導体も有効成分として使用しうる。そのような誘導体は、被験者に投与されたときに、その生体内で例えば酵素的にまたは体液によって分解されてＮＭ−３に変換されるようなものである。生体内酵素には、エステラーゼ、アミダーゼ、プロテアーゼ、アシラーゼなどが含まれる。体液には、血液、消化液（例えば胃液、膵液、腸液など）などが含まれる。
【００２９】
本発明の実施形態により、そのようなＮＭ−３誘導体には、ＮＭ−３の塩、エステル化物、アミド化物またはアシル化物が含まれる。
【００３０】
塩には、ＮＭ−３のカルボキシル基と、製薬上許容可能な無機塩基または有機塩基との塩が含まれる。そのような塩には、例えばアルカリ金属、アルカリ土類金属などの金属との塩、脂肪族アミン、芳香族アミン、環状アミンなどのアミンとの塩、リジン、アルギニンなどのアミノ酸との塩などが含まれる。
【００３１】
エステル化物には、ＮＭ−３のカルボキシル基とアルコールとのエステル化反応によって得られるエステル類が含まれる。アルコールは、一般式Ｒ−ＯＨを有し、ここでＲ基には、脂肪族基、芳香族基、脂環式基、ヘテロ環式基、またはそれらの組み合わせが含まれ、例えば、置換または未置換の、アルキル基、アルキルアリール基、ヘテロアリール基、シクロアルキル基などである。アルキル基は、分枝状または未分枝状であってもよいし、ならびに／あるいは、飽和または不飽和であってもよい。アルコールは、例えば、エタノール、プロパノール、桂皮アルコール、ベンジルアルコール、糖アルコール、グリコールなどを含む。
【００３２】
アミド化物には、ＮＭ−３のカルボキシル基とアミノ化合物とのアミド化反応によって得られるアミド類が含まれる。アミノ化合物は、脂肪族アミン、芳香族アミン、脂環式アミン、ヘテロ環式アミン、アミノ酸（例えばリシン）、またはそれらの組み合わせが含まれ、例えば、プロピルアミン、ジエチルアミン、アミノ酸、アミノピリミジン、ベンズアミド、プリン、シクロヘキシルメチルアミンなどが挙げられる。
【００３３】
アシル化物には、ＮＭ−３のカルボキシル基と、例えばハロゲン化アシル化合物とのアシル化反応によって得られるものが含まれる。アシル化物は、−ＣＯ−Ｏ−ＣＯ−Ｒの構造を含む。Ｒ基は、脂肪族基、芳香族基、脂環式基、ヘテロ環式基、またはそれらの組み合わせが含まれ、例えば、置換または未置換の、アルキル基、アルキルアリール基、ヘテロアリール基、シクロアルキル基などである。アルキル基は、分枝状または未分枝状であってもよいし、ならびに／あるいは、飽和または不飽和であってもよい。ハロゲン化アシル化合物の例は、酢酸、クエン酸、コハク酸、リンゴ酸、シュウ酸、酒石酸、安息香酸、脂肪酸などのカルボン酸の酸ハロゲン化物、例えば酸塩化物である。
【００３４】
ＮＭ−３の塩、エステル化物、アミド化物またはアシル化物は、当業界で公知の化学合成技術を用いて作製することができる。
【００３５】
エステル化物は、適当な溶媒中、例えば酸触媒の存在下で加熱しながらＮＭ−３とアルコールとを反応させるか、あるいはＮＭ−３を塩化チオニルと反応させて酸塩化物を形成したのち、塩基の存在下でアルコールと反応させることによって得ることができる。
【００３６】
アミド化物は、適当な溶媒中、ＮＭ−３の酸塩化物または酸無水物とアミンとの反応によって得ることができる。
【００３７】
アシル化物は、適当な溶媒中、塩基の存在下でＮＭ−３とカルボン酸塩化物との反応によって得ることができる。
【００３８】
本発明の医薬組成物は、ＮＭ−３、またはプロドラッグとしてのその誘導体、を有効成分として含み、糖尿病性腎症の治療および予防のために使用される。
【００３９】
本発明の医薬組成物の形態は、特に限定されないが、例えば錠剤、丸剤、顆粒剤、散剤、溶液剤、懸濁剤、座剤、カプセル剤などである。好ましい形態は、溶液剤、懸濁剤などの液剤である。これらの製剤は、当業界で一般的に知られる方法によって作製することができる。
【００４０】
さらに、本発明の医薬組成物は、多層被覆構造の遅延放出製剤、胃溶性もしくは腸溶性製剤などの剤型としうる。このような製剤は、例えばアルキルセルロース（例えば、エチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート、ヒドロキシプロピルメチルセルロースアセテートスクシネート、セルロースアセテートフタレート）、アクリルポリマー（例えば、アクリル酸とメタクリル酸のコポリマー、ポリメタクリレート、ポリアクリレート、ポリアミノアルキルメタクリレート）などのポリマーで、有効成分を含むコアを被覆することによって作製されうる。
【００４１】
本発明の医薬組成物は、上記の有効成分の他に、担体（賦形剤、希釈剤）を含み、必要ならば添加剤を含むことができる。添加剤には、溶解補助剤、保存剤、安定化剤、懸濁化剤、崩壊剤、滑沢剤、結合剤、等張化剤、風味剤、着色剤、甘味剤、乳化剤などが含まれるが、これらに限定されない。このような担体および添加剤は、医薬上許容されうるものであり、当業界で慣用されるものを使用することができる。以下に、担体、溶解補助剤、安定化剤、懸濁化剤、懸濁化剤、崩壊剤、滑沢剤、乳化剤、等張化剤の具体例を記載する。
【００４２】
担体には、例えば、乳糖、ステアリン酸マグネシウム、デンプン、タルク、ゼラチン、寒天、ペクチン、アラビアゴム、オリーブ油、ゴマ油、カカオバター、エチレングリコール、水、生理食塩液、エタノール、その他常用されるものが含まれる。
【００４３】
溶解補助剤には、例えば、グルタミン酸、アスパラギン酸、その他常用されるものが含まれる。
【００４４】
結合剤には、例えば、ポリビニルピロリドン、ショ糖、ゼラチン、アラビアゴム、その他常用されるものが含まれる。
【００４５】
安定化剤には、例えば、メチオニンなどのアミノ酸類、糖類、その他常用されるものが含まれる。
【００４６】
懸濁化剤には、例えば、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、植物油、アルコール類、ポリソルベート８０（登録商標）、その他常用されるものが含まれる。
【００４７】
崩壊剤には、例えば、繊維素グリコール酸カルシウム、デンプン、アルギン酸、その他常用されるものが含まれる。
【００４８】
滑沢剤には、例えば、ステアリン酸マグネシウム、タルク、その他常用されるものが含まれる。
【００４９】
乳化剤には、例えば、ショ糖界面活性剤、ラウリル硫酸ナトリウム、その他常用されるものが含まれる。
等張化剤には、例えば、塩化ナトリウム、その他常用されるものが含まれる。
【００５０】
本発明の医薬組成物中に、有効成分が例えば１〜７０重量％、１〜５０重量％、５〜３０重量％などの量で含まれるが、有効成分量は効能の程度や患者の年齢等に応じて変えることができる。
【００５１】
ＮＭ−３またはその誘導体の投与量は、約１５０〜約２０００ｍｇ／ｍ２／日であるが、これらに限定されないものとする。投与量は、患者または被験者の性別、年齢、体重、状態などに応じて変わるので、効能や副作用（毒性）の程度をも考慮しながら決定されるべきである。なお、ＮＭ−３またはその誘導体は上記の用量範囲であれば毒性がないといわれている。
【００５２】
投与経路は、非経口または経口投与であるが、好ましくは非経口投与、より好ましくは静脈内投与である。非経口投与には、例えば静脈内、動脈内、腹腔内、筋肉内、局所、皮内、皮下、経粘膜、経直腸などの投与が含まれる。
【００５３】
本発明はさらに、糖尿病を患っている、あるいは糖尿病の兆候を示しつつある患者において、本発明のＮＭ−３、またはプロドラッグとしてのその誘導体、を投与することを含む、患者の糖尿病性腎症を予防または治療する方法も提供する。
患者は、哺乳類、好ましくはヒトである。
【００５４】
以下に実施例を挙げて本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は実施例によって制限されないものとする。
【実施例１】
【００５５】
血管新生抑制物質ＮＭ−３を２型糖尿病モデルであるｄｂ／ｄｂマウス（C57BL/KsJ-db Jcl; Clea Japan, Inc.）に投与し腎症進展制御効果を調べた。ｄｂ／ｄｂマウスは、食欲調節・肥満に関与するレプチン（ｌｅｐｔｉｎ）の受容体を欠損し、肥満・高血糖・高インスリン血症を呈する。
【００５６】
（方法）
方法１：雌のｄｂ／ｄｂマウス（２型糖尿病モデル）と、対照群のｄｂ／ｍマウス（C57BL/KsJ-db /+m Jcl; Clea Japan, Inc.）（正常血糖マウス）を実験に用いた。高血糖を認めた８週齢のｄｂ／ｄｂマウスにＰＢＳ（対照群）もしくはＮＭ−３（１５０ｍｇ／ｋｇ）を連日８週間にわたり腹腔内投与した（ｎ＝６）。グループ１は正常コントロール（ｄｂ／ｍ）であり、グループ２は糖尿病群（ｄｂ／ｄｂ）にビヒクルバッファ（ｖｅｈｉｃｌｅ ｂｕｆｆｅｒ）（ＰＢＳ）を８週間投与した群であり、グループ３は糖尿病群（ｄｂ／ｄｂ）にＮＭ−３ （１５０ｍｇ／ｋｇ） を８週間投与した群である。ＮＭ−３はＰＢＳに溶解し、１回あたり１００μＬずつ腹腔内投与した。
【００５７】
方法２：腎臓、肝臓、心臓の重量、体重、血糖を測定した。２４時間蓄尿にて尿中アルブミン・クレアチニン比（ＵＡＣＲ）（治療開始２，３，４週後）、クレアチニンクリアランス（治療開始４週後）を測定した。ＰＡＳ染色腎組織像にて糸球体容積、メサンギウム基質インデックスを画像解析を行い測定した。
【００５８】
方法３：腎皮質部からＲＩＰＡ ｂｕｆｆｅｒを用いて蛋白を抽出し、ウエスタンブロット（ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ）を行い、ＶＥＧＦ，アンギオポエチン（Ａｎｇｉｏｐｏｉｅｔｉｎ）−１，アンギオポエチン−２，アクチン（ａｃｔｉｎ）の発現を検討した。統計学的解析にはＳｃｈｅｆｆｅ’ｓ ｔｅｓｔ（ＳｔａｔＶｉｅｗ，Ａｂａｃｕｓ Ｃｏｎｃｅｐｔｓ社のソフトウェア）を用いた。
【００５９】
（結果）
投与０週目および８週目における各群のマウスの体重、血糖値および食餌量を調べた結果を表１に示す。
【００６０】
【表１】
【００６１】
表１から、体重はｄｂ／ｍ非糖尿病マウスに比してｄｂ／ｄｂマウスにて、投与０週目（ｗｅｅｋ ０）及び８週目（ｗｅｅｋ ８）にて増加しており、ＮＭ−３投与による影響は認めなかった。血糖値は、ｄｂ／ｄｂマウスにてｄｂ／ｍマウスに比して高値であったが、ＮＭ−３投与群、およびｖｅｈｉｃｌｅ ｂｕｆｆｅｒ対照群にて差を認めなかった。同様に食餌量もｄｂ／ｄｂ群にて増加していた。
【００６２】
投与８週目における各群のマウスの血清インスリン、肝臓重量、心臓重量、腎臓重量を測定した結果を表２に示す。血清インスリンはＥＬＩＳＡ法 （モリナガ、超高感度インスリン測定キット） にて測定した。
【００６３】
【表２】
【００６４】
血清インスリンはｄｂ／ｍ非糖尿病マウスに比してｄｂ／ｄｂマウスにて８週目にて高値を示したが、ＮＭ−３投与による影響は認めなかった。肝臓重量及び腎重量は、ｄｂ／ｄｂマウスにてｄｂ／ｍマウスに比して有意に高値であったが、ＮＭ−３投与群にて有意な抑制効果は認めなかった。心重量はｄｂ／ｍ群とｄｂ／ｄｂ群間で有意差を認めなかった。
【００６５】
次に、図１〜図３の結果について説明する。
図１Ａから、ｄｂ／ｄｂ糖尿病群にて認められた２４時間クレアチニンクリアランスの増加は、ＮＭ−３投与群ではｖｅｈｉｃｌｅ ｂｕｆｆｅｒ対照群に比して有意に抑制された。
【００６６】
図１Ｂは、一日尿中アルブミン量／クレアチニン比（ＵＡＣＲ）を示す。ＵＡＣＲは、ｄｂ／ｄｂ糖尿病群でｄｂ／ｍ非糖尿病群に比して増加したが、ＮＭ−３投与群ではｖｅｈｉｃｌｅ ｂｕｆｆｅｒ対照群に比して増加が有意に抑制された。
【００６７】
上記の結果より、ｄｂ／ｄｂ糖尿病マウスにおける糸球体過剰濾過がＮＭ−３投与により有意に抑制されたものと考えられた。
【００６８】
図２Ａ〜Ｃは、腎糸球体凍結切片のＰＡＳ染色像（４週投与後、４００倍）を示す。Ａはｄｂ／ｍ、Ｂはｖｅｈｉｃｌｅ ｂｕｆｆｅｒ投与ｄｂ／ｄｂ群、ＣはＮＭ−３投与ｄｂ／ｄｂ群である。糖尿病対照群（Ｂ）にて糸球体肥大・メサンギウム領域の拡大を認めたが、ＮＭ−３投与群にて（Ｃ）上記の組織学的変化が抑制された。Ｄに示されるように、ｄｂ／ｄｂ糖尿病群における糸球体容積の増加は、ＮＭ−３投与群にて有意に抑制された。Ｅに示されるように、ｄｂ／ｄｂ糖尿病群におけるメサンギウム基質ｉｎｄｅｘの増加は、ＮＭ−３投与群にて有意に抑制された。
【００６９】
図３は、治療開始８週後のマウス腎皮質より蛋白を抽出しウエスタンブロットを行った結果を示す。Ａは、ＶＥＧＦ、アンギオポエチン−１（Ａｎｇ１）、アンギオポエチン−２（Ａｎｇ２）およびアクチン（ａｃｔｉｎ）の発現レベルを検討した結果である。ＶＥＧＦ，Ａｎｇ１，Ａｎｇ２の免疫ブロットを行った後に、同じ膜を用いてｓｔｒｉｐｐｉｎｇ後アクチンの免疫ブロットを行った。Ｂは、ＶＥＧＦとａｃｔｉｎのバンドをデンシトメトリーにて数値化し、その比を算定した結果である。ｄｂ／ｍ群を１として各群における相対的数値をグラフ化した。ＶＥＧＦ蛋白レベルはｖｅｈｉｃｌｅ−ｄｂ／ｄｂ群においてｄｂ／ｍ群に比して有意に増加したが、ＮＭ−３投与群ではｖｅｈｉｃｌｅ投与群に比して有意な抑制効果を認めた。Ｃに示されるように、Ａｎｇｉｏｐｏｉｅｔｉｎ−１蛋白レベルはｄｂ／ｄｂ群においてｄｂ／ｍ群と差がなかった。ＮＭ−３投与群でも特に変化を認めなかった。Ｄに示されるように、Ａｎｇｉｏｐｏｉｅｔｉｎ−２蛋白レベルはｖｅｈｉｃｌｅ−ｄｂ／ｄｂ群においてｄｂ／ｍ群に比して有意に増加したが、ＮＭ−３投与群ではｖｅｈｉｃｌｅ投与群に比して有意な抑制効果を認めた。
【００７０】
以上の結果から、Ａｎｇｉｏｐｏｉｅｔｉｎ−２はＶＥＧＦ存在下にて血管新生を誘導することより、ＮＭ−３投与による糖尿病性腎症における過剰の血管新生促進作用の抑制効果が示唆された。
【００７１】
上記の結果から、糖尿病性腎症モデルにて正常マウスに比してＡｎｇｉｏｐｏｉｅｔｉｎ−２発現が増加し、Ａｎｇｉｏｐｏｉｅｔｉｎ−１／２比が低下してＴｉｅ−２受容体を介した血管安定化シグナルが減少し、ＶＥＧＦ増加も相乗的に作用して血管透過性亢進をきたし、アルブミン尿増加に至ったと考えられた。ＮＭ−３投与にてＡｎｇｉｏｐｏｉｅｔｉｎ−２発現増加の抑制、ＶＥＧＦ発現増加の抑制作用を介してアルブミン尿増加が抑制されたと考えられた。ＮＭ−３は血管新生抑制作用を介して糖尿病性腎症における糸球体濾過面積の増加を有意に抑制し、したがって糖尿病性腎症の進展を有意に抑制し得たものと考えられた。
【産業上の利用可能性】
【００７２】
本発明により、これまで有効な治療法がなかった糖尿病性腎症に対して該腎症の進展を有意に抑制することが可能となった。したがって、本発明は、糖尿病性腎症の治療または予防のために有用である。
【図面の簡単な説明】
【００７３】
【図１】２型糖尿病ｄｂ／ｄｂマウスにＮＭ−３（１５０ｍｇ／ｋｇ）を連日８週間にわたり投与したときの、Ａ：２４時間クレアチニンクリアランス（＊Ｐ＜０．０１ｖｓ．ｄｂ／ｍまたはｖｅｈｉｃｌｅ−ｄｂ／ｄｂ，＃Ｐ＜０．０５ｖｓ．ｄｂ／ｍ）、およびＢ： 一日尿中アルブミン量／クレアチニン比（ＵＡＣＲ）（＊Ｐ＜０．０１ｖｓ．ｄｂ／ｍまたはｖｅｈｉｃｌｅ−ｄｂ／ｄｂ，＃Ｐ＜０．０５ｖｓ．ｄｂ／ｍ）を示す。陰性対照は正常ｄｂ／ｍマウス、陽性対照はビヒクル（ＰＢＳ）投与のｄｂ／ｄｂマウスである。
【図２】２型糖尿病ｄｂ／ｄｂマウスにＮＭ−３（１５０ｍｇ／ｋｇ）を連日８週間にわたり投与したときの、腎糸球体のＰＡＳ染色像（４週投与後、４００倍）を示す。Ａ： ｄｂ／ｍ、Ｂ：ｖｅｈｉｃｌｅ ｂｕｆｆｅｒ投与ｄｂ／ｄｂ群、Ｃ：ＮＭ−３投与ｄｂ／ｄｂ群。Ｄは、各群における％糸球体容積（＊Ｐ＜０．０１ｖｓ．ｄｂ／ｍ，＃Ｐ＜０．０５ｖｓ．ｄｂ／ｍ またはｖｅｈｉｃｌｅ−ｄｂ／ｄｂ）、Ｅは、各群におけるメサンギウム基質インデックス（＊Ｐ＜０．０１ｖｓ.ｄｂ／ｍ，＃Ｐ＜０．０５ｖｓ．ｖｅｈｉｃｌｅ−ｄｂ／ｄｂ）をそれぞれ示す。
【図３】２型糖尿病ｄｂ／ｄｂマウスにＮＭ−３（１５０ｍｇ／ｋｇ）を連日８週間にわたり投与したときの、治療開始８週後のマウス腎皮質から抽出した蛋白のウエスタンブロットを示す。Ａ：ＶＥＧＦ、アンギオポエチン−１（Ａｎｇ１）、アンギオポエチン−２（Ａｎｇ２）およびアクチン（ａｃｔｉｎ）の各発現レベルを示す。Ｂ：ＶＥＧＦ／ａｃｔｉｎ比（＊Ｐ＜０．０１ｖｓ．ｄｂ／ｍ，＃Ｐ＜０．０５ｖｓ．ｄｂ／ｍ，＊＊Ｐ＜０．０１ｖｓ．ｖｅｈｉｃｌｅ−ｄｂ／ｄｂ）を示す。Ｃ：Ａｎｇｉｏｐｏｉｅｔｉｎ−１／ａｃｔｉｎ比を示す。Ｄ：Ａｎｇｉｏｐｏｉｅｔｉｎ−２／ａｃｔｉｎ比（＊Ｐ＜０．０１ｖｓ．ｄｂ／ｍ，＃Ｐ＜０．０５ｖｓ．ｄｂ／ｍ，＊＊Ｐ＜０．０１ｖｓ．ｖｅｈｉｃｌｅ−ｄｂ／ｄｂ）を示す。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、糖尿病性腎症の治療または予防用医薬組成物に関する。具体的には、本発明の医薬組成物は、３−（２−メチルカルボキシメチル）−６−メトキシ−８−ヒドロキシイソクマリン（以下「ＮＭ−３」とも称する）またはその誘導体を有効成分として含むことを特徴とする。
【背景技術】
【０００２】
２型糖尿病の発症率は世界的に増加しており、３０〜４０％の患者にて糖尿病性腎症を発症する。現在、我が国において維持透析患者の原因疾患では、糖尿病性腎症が最多であり、糖尿病性腎症の進展機序の解明および新たな治療法の開発は重要な課題である。
【０００３】
糖尿病性腎症では、早期に糸球体過剰濾過・糸球体肥大、引き続いて糸球体基底膜の肥厚・メサンギウム基質の増加や尿中アルブミン排泄増加が認められ、最終的には糸球体硬化に到る（非特許文献１）。腎症早期の段階で、糸球体係蹄数の増加・既存の血管の伸長等の血管新生様の現象が認められる。１型及び２型糖尿病の進展にＴＧＦ−β１，ＩＧＦ−１等の種々の増殖因子が関与するが、血管新生促進因子である血管内皮細胞増殖因子（ｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ：ＶＥＧＦ） の関与も報告された。
【０００４】
血管新生の進展過程では、最初に血管基底膜がＭＭＰ−２，９等のプロテアーゼにより分解される。次に血管内皮細胞が血管外に遊走・増殖する。この過程でＶＥＧＦ，塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ），アンギオポエチン（ａｎｇｉｏｐｏｉｅｔｉｎ）−２等の因子が関与する。次に、血管内皮細胞が管腔を形成し間葉系細胞が付着する。その後、アンギオポエチン−１の作用により間葉系細胞が周皮細胞（ｐｅｒｉｃｙｔｅ）に分化し、新生血管が安定化する。
【０００５】
ストレプトゾトシン（ｓｔｒｅｐｔｏｚｏｔｏｃｉｎ）誘発糖尿病性腎症ラットモデル（１型糖尿病モデル）にてＶＥＧＦ発現が早期（３週）にて糸球体上皮細胞（ｐｏｄｏｃｙｔｅ）で増加し、進展期（８３週）においてＶＥＧＦ受容体のｆｌｋ−１が糸球体内皮細胞にて増加することが報告された（非特許文献２）。一方、２型糖尿病モデルのＯＬＥＴＦラットでは９，２０，６８週にてすなわち早期及び進展期にてＶＥＧＦの糸球体での発現が増加した。そして、ａｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎ変換酵素阻害剤投与にてＶＥＧＦ発現が抑制された（非特許文献３）。また、ｓｔｒｅｐｔｏｚｏｔｏｃｉｎ誘発糖尿病性腎症ラットモデルおよびｄｂ／ｄｂマウス（２型糖尿病モデル）にて中和型抗ＶＥＧＦ抗体投与により、糸球体過剰濾過、糸球体肥大、アルブミン尿ならびに進展期のメサンギウム基質増加が有意に抑制された（非特許文献４、５）。また、抗ＶＥＧＦ抗体を有効成分として含む糖尿病性腎症診断剤も報告されている（特許文献１）。また、糖尿病性腎症において糸球体係蹄（毛細血管）数の増加、糸球体毛細血管の伸長により糸球体濾過表面積の増加がおこることが糖尿病性腎症ラットモデルにて報告された（非特許文献６）。
【０００６】
サイトゲニン（Ｃｙｔｏｇｅｎｉｎ；８-ヒドロキシ-３-ヒドロキシメチル-６-メトキシイソクマリン）はストレプトベルチシリウム・ユーロシジカム（Ｓｔｒｅｐｔｏｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ ｅｕｒｏｃｉｄｉｃｕｍ）の培養濾液より分離された物質であるが、関節炎モデルにおける治療効果・抗血管新生作用をもつ。サイトゲニンは生体内で速やかに代謝されるが、その類似合成物質であるＮＭ−３は、経口投与可能でサイトゲニンに比して安定である。ＮＭ−３はマウスｄｏｒｓａｌ ａｉｒ ｓａｃ ｓｙｓｔｅｍを用いた実験系で抗血管新生活性をもつことが報告された（非特許文献７）。ＩＩ型コラーゲン誘発関節炎マウスモデルにおいて、ＮＭ−３経口投与による関節炎すなわち浮腫等の炎症性変化並びに骨破壊の抑制効果が報告されている（非特許文献８）。ＮＭ−３はヒト臍帯静脈内皮細胞の増殖・遊走を抑制し、発芽的血管新生・管腔形成を抑制し、腫瘍内血管新生を抑制する作用がある（非特許文献９）。また、ＮＭ−３と抗癌化学療法剤パクリタキセル（ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ）との併用による相乗的抗腫瘍効果がヒト乳癌モデルマウスを用いて報告されている（非特許文献９）。また、放射線療法との併用による抗腫瘍効果も報告されている（非特許文献１０）。最近、デキサメサゾン誘発ヒト多発性骨髄腫細胞のアポトーシスをＮＭ−３が促進する作用が報告された（非特許文献１１）。以前、米国ＩＬＥＸ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ社が固形腫瘍患者を対照とした第一相臨床試験を行った。経口投与にて１５０−２０００ｍｇ／ｍ２を投与されているが、毒性は認めず一部患者にて進行抑制効果を認めた（非特許文献１２）。また、経口投与時の半減期は６時間で、組織への移行も良好であった（非特許文献１３）。
【０００７】
【特許文献１】特開平０８−２４５４２４号公報
【非特許文献１】Ｍａｋｉｎｏ,Ｈ.ら，Ｄｉａｂｅｔｅｓ，４５：４８８−４９５（１９９６）
【非特許文献２】Ｃｏｏｐｅｒ，Ｍ．Ｅ．ら，Ｄｉａｂｅｔｅｓ,４８：２２２９（１９９９）
【非特許文献３】Ｔｓｕｃｈｉｄａ，Ｋ．ら，Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉａ,４２：５７９（１９９９）
【非特許文献４】Ｄｅ Ｖｒｉｅｓｅ，Ａ．Ｓ．ら，Ｊ Ａｍ Ｓｏｃ Ｎｅｐｈｒｏｌ，１２：９９３（２００１）
【非特許文献５】Ｆｌｙｖｂｊｅｒｇ，Ａ．ら，Ｄｉａｂｅｔｅｓ,５１：３０９０（２００３）
【非特許文献６】Ｎｙｅｎｇａａｒｄ，Ｊ．Ｒ．ら，Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉａ,３６：１８９（１９９３）
【非特許文献７】Ｎａｋａｓｈｉｍａ,Ｔ．ら，Ｊ Ａｎｔｉｂｉｏｔ（Ｔｏｋｙｏ）， ５２：４２６−４２８（１９９９）
【非特許文献８】Ａｇａｔａ,Ｎ．ら，Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ Ｍｏｌ Ｐａｔｈｏｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ，１０８：２９７−３０９（２０００）
【非特許文献９】Ｒｅｉｍｅｒ,Ｃ．Ｌ．ら，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ，６２：７８９−７９５（２００２）
【非特許文献１０】Ｓａｌｌｏｕｍ,Ｒ．Ｍ．ら，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ，６０：６９５８−６９６３（２０００）
【非特許文献１１】Ａｇａｔａ,Ｎ．ら，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ，６４：８５１２−８５１６（２００４）
【非特許文献１２】Ｓｏｕｌｉｅ，Ｐ．ら，Ｐｒｏｃ Ａｍ Ｓｏｃ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ,２２：１９４（ａｂｓｔｒ）（２００３）
【非特許文献１３】Ｂｏｎａｔｅ，Ｐ．Ｌ．ら，Ｐｒｏｃ Ａｍ Ｓｏｃ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ,２２：１３４（ａｂｓｔｒ）（２００３）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
糖尿病患者の著しい増加に伴い、糖尿病性腎症の進展機序の解明および有効な治療法の開発が緊急の課題である。腎症へのＶＥＧＦの関与が報告されているが、複雑な生体系でこの特定の因子のみが疾患に関わるとは考え難い。一方、ＮＭ−３については、これまで抗癌剤としての使用例はあるが、糖尿病性腎症に有効であるかどうかは不明であった。これまでに、糖尿病性腎症の治療を目的とした、ＮＭ−３の糸球体内皮細胞への作用や腎における血管新生誘導因子もしくは制御因子発現への作用に関する検討はなされていなかった。
【０００９】
本発明は、糖尿病性腎症の治療に有効な薬剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は、以下の特徴を有する。
すなわち、本発明は、下記の式１：
【００１１】
【化１】
によって表される３−（２−メチルカルボキシメチル）−６−メトキシ−８−ヒドロキシイソクマリン、あるいはプロドラッグとしてのその誘導体、を有効成分として含む糖尿病性腎症の治療または予防用医薬組成物を提供する。
【００１２】
第１の実施形態において、上記式１の化合物が、光学活性体である。
第２の実施形態において、前記式１の化合物が、ラセミ体である。
第３の実施形態において、前記式１の化合物が、エナンチオマーの混合物である。
第４の実施形態において、前記誘導体が、式１の化合物の塩、エステル化物、アミド化物またはアシル化物である。
【発明の効果】
【００１３】
本発明は、糖尿病性腎症の予防または治療に有効である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
本発明は、上記のとおり、糖尿病性腎症の治療または予防に有効な医薬組成物を提供する。その治療または予防に有効な成分は、ＮＭ−３、またはプロドラッグとしてのその誘導体、である。
【００１５】
糖尿病性腎症は、早期に糸球体過剰濾過、糸球体肥大、それに続いて糸球体基底膜の肥厚、メサンギウム基質の増加、尿中アルブミン排泄増加が認められ、最終的には糸球体硬化に到る疾患である。本発明のＮＭ−３は、糖尿病性腎症の治療または予防のために有効であり、腎症を改善または緩和する作用効果を有する。具体的には、ＮＭ−３は次のような作用効果を示す。
【００１６】
（ａ）尿中アルブミン・クレアチニン比（ＵＡＣＲ）が減少する（図１Ｂ）。
（ｂ）クレアチニンクリアランスが低下する（図１Ａ）。
（ｃ）糸球体容積が減少する（図２Ｄ）。
（ｄ）メサンギウム領域が減少する（図２Ｅ）。
（ｅ）腎皮質における血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）およびアンギオポエチン−２蛋白質発現が抑制される（図３Ａ，Ｂ，Ｄ）。
【００１７】
本発明において、糖尿病とは、インスリン不足により引き起こされるグルコース代謝異常の疾患であり、インスリン依存型糖尿病（１型）およびインスリン非依存型糖尿病（２型）の両方が含まれる。１型糖尿病は、すい臓ランゲルハンス氏島のβ細胞の破壊のためにインスリン分泌が欠乏し、インスリンの絶対的不足によって発症する疾患である。一方、２型糖尿病は、インスリン分泌異常かあるいはインスリン抵抗性のために発症する疾患である。糖尿病患者の約８５〜９０％が２型糖尿病に罹患しているといわれている。糖尿病患者の約３０％以上の患者は合併症の１つとして糖尿病性腎症を発症する。
【００１８】
上記のとおり、本発明の医薬組成物は、糖尿病自体を改善するものではないが、この１型、２型糖尿病性腎症の予防または治療に有効である。
【００１９】
本明細書で使用する「予防」または「予防する」とは、目的の疾患の発症を抑制または阻止することを意味する。
【００２０】
本明細書で使用する「治療」または「治療する」とは、目的の疾患を治癒、軽減または抑制することを意味する。
【００２１】
本発明の医薬組成物の有効成分は、ＮＭ−３、またはプロドラッグとしてのその誘導体、であり、腎臓での血管新生抑制活性を有するものである。
【００２２】
本明細書で使用する「血管新生抑制活性」とは、アンギオポエチン−２／ＶＥＧＦ発現の抑制作用を指す。
【００２３】
本明細書で使用する「プロドラッグ」とは、被験者の体内に投与されたときに例えば生体内酵素または体液によってＮＭ−３に変換されうる前駆体薬剤を意味する。本発明におけるプロドラッグは、それ自体が糖尿病性腎症に対して治療効果を示してもよいし、あるいはそのような効果を示さなくてもよいものとする。
【００２４】
本発明の有効成分であるＮＭ−３は、ＩＬＥＸ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ社（テキサス、ＵＳＡ）から市販されており入手可能である。
【００２５】
ＮＭ−３は、哺乳類肉腫細胞系Ｓ−１８０が誘導する血管新生を抑制することは知られていた（非特許文献７）が、糖尿病性腎症の治療および予防のために有効であることは、今回本発明者らによって初めて見出された。
【００２６】
本発明で使用可能なＮＭ−３は、その３位の置換基（すなわち、２−メチルカルボキシメチル基）に不斉炭素原子を含むため、光学活性体であってもよいし、あるいはエナンチオマー混合物またはラセミ体であることもできる。
【００２７】
エナンチオマー混合物は、ＮＭ−３の２つの光学活性エナンチオマー（すなわち、鏡像異性体）の混合物であり、そのいずれか一方の含有量が他方より多いものをいう。例えばエナンチオマーＡとＢの混合比は、５０超：５０未満、例えば６０：４０、７０：３０、８０：２０、９０：１０、９５：５、９８：２、９９：１、あるいは逆に、５０未満：５０超、例えば４０：６０、３０：７０、２０：８０、１０：９０、５：９５，２：９８、１：９９などである。また、２つのエナンチオマーが５０：５０の比で含まれる場合、ＮＭ−３はラセミ体であるという。糖尿病性腎症の治療または予防効果が得られるならば、いかなるエナンチオマーの混合比のエナンチオマー混合物またはラセミ体であってもよい。
【００２８】
本発明ではさらに、ＮＭ−３のプロドラッグ誘導体も有効成分として使用しうる。そのような誘導体は、被験者に投与されたときに、その生体内で例えば酵素的にまたは体液によって分解されてＮＭ−３に変換されるようなものである。生体内酵素には、エステラーゼ、アミダーゼ、プロテアーゼ、アシラーゼなどが含まれる。体液には、血液、消化液（例えば胃液、膵液、腸液など）などが含まれる。
【００２９】
本発明の実施形態により、そのようなＮＭ−３誘導体には、ＮＭ−３の塩、エステル化物、アミド化物またはアシル化物が含まれる。
【００３０】
塩には、ＮＭ−３のカルボキシル基と、製薬上許容可能な無機塩基または有機塩基との塩が含まれる。そのような塩には、例えばアルカリ金属、アルカリ土類金属などの金属との塩、脂肪族アミン、芳香族アミン、環状アミンなどのアミンとの塩、リジン、アルギニンなどのアミノ酸との塩などが含まれる。
【００３１】
エステル化物には、ＮＭ−３のカルボキシル基とアルコールとのエステル化反応によって得られるエステル類が含まれる。アルコールは、一般式Ｒ−ＯＨを有し、ここでＲ基には、脂肪族基、芳香族基、脂環式基、ヘテロ環式基、またはそれらの組み合わせが含まれ、例えば、置換または未置換の、アルキル基、アルキルアリール基、ヘテロアリール基、シクロアルキル基などである。アルキル基は、分枝状または未分枝状であってもよいし、ならびに／あるいは、飽和または不飽和であってもよい。アルコールは、例えば、エタノール、プロパノール、桂皮アルコール、ベンジルアルコール、糖アルコール、グリコールなどを含む。
【００３２】
アミド化物には、ＮＭ−３のカルボキシル基とアミノ化合物とのアミド化反応によって得られるアミド類が含まれる。アミノ化合物は、脂肪族アミン、芳香族アミン、脂環式アミン、ヘテロ環式アミン、アミノ酸（例えばリシン）、またはそれらの組み合わせが含まれ、例えば、プロピルアミン、ジエチルアミン、アミノ酸、アミノピリミジン、ベンズアミド、プリン、シクロヘキシルメチルアミンなどが挙げられる。
【００３３】
アシル化物には、ＮＭ−３のカルボキシル基と、例えばハロゲン化アシル化合物とのアシル化反応によって得られるものが含まれる。アシル化物は、−ＣＯ−Ｏ−ＣＯ−Ｒの構造を含む。Ｒ基は、脂肪族基、芳香族基、脂環式基、ヘテロ環式基、またはそれらの組み合わせが含まれ、例えば、置換または未置換の、アルキル基、アルキルアリール基、ヘテロアリール基、シクロアルキル基などである。アルキル基は、分枝状または未分枝状であってもよいし、ならびに／あるいは、飽和または不飽和であってもよい。ハロゲン化アシル化合物の例は、酢酸、クエン酸、コハク酸、リンゴ酸、シュウ酸、酒石酸、安息香酸、脂肪酸などのカルボン酸の酸ハロゲン化物、例えば酸塩化物である。
【００３４】
ＮＭ−３の塩、エステル化物、アミド化物またはアシル化物は、当業界で公知の化学合成技術を用いて作製することができる。
【００３５】
エステル化物は、適当な溶媒中、例えば酸触媒の存在下で加熱しながらＮＭ−３とアルコールとを反応させるか、あるいはＮＭ−３を塩化チオニルと反応させて酸塩化物を形成したのち、塩基の存在下でアルコールと反応させることによって得ることができる。
【００３６】
アミド化物は、適当な溶媒中、ＮＭ−３の酸塩化物または酸無水物とアミンとの反応によって得ることができる。
【００３７】
アシル化物は、適当な溶媒中、塩基の存在下でＮＭ−３とカルボン酸塩化物との反応によって得ることができる。
【００３８】
本発明の医薬組成物は、ＮＭ−３、またはプロドラッグとしてのその誘導体、を有効成分として含み、糖尿病性腎症の治療および予防のために使用される。
【００３９】
本発明の医薬組成物の形態は、特に限定されないが、例えば錠剤、丸剤、顆粒剤、散剤、溶液剤、懸濁剤、座剤、カプセル剤などである。好ましい形態は、溶液剤、懸濁剤などの液剤である。これらの製剤は、当業界で一般的に知られる方法によって作製することができる。
【００４０】
さらに、本発明の医薬組成物は、多層被覆構造の遅延放出製剤、胃溶性もしくは腸溶性製剤などの剤型としうる。このような製剤は、例えばアルキルセルロース（例えば、エチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート、ヒドロキシプロピルメチルセルロースアセテートスクシネート、セルロースアセテートフタレート）、アクリルポリマー（例えば、アクリル酸とメタクリル酸のコポリマー、ポリメタクリレート、ポリアクリレート、ポリアミノアルキルメタクリレート）などのポリマーで、有効成分を含むコアを被覆することによって作製されうる。
【００４１】
本発明の医薬組成物は、上記の有効成分の他に、担体（賦形剤、希釈剤）を含み、必要ならば添加剤を含むことができる。添加剤には、溶解補助剤、保存剤、安定化剤、懸濁化剤、崩壊剤、滑沢剤、結合剤、等張化剤、風味剤、着色剤、甘味剤、乳化剤などが含まれるが、これらに限定されない。このような担体および添加剤は、医薬上許容されうるものであり、当業界で慣用されるものを使用することができる。以下に、担体、溶解補助剤、安定化剤、懸濁化剤、懸濁化剤、崩壊剤、滑沢剤、乳化剤、等張化剤の具体例を記載する。
【００４２】
担体には、例えば、乳糖、ステアリン酸マグネシウム、デンプン、タルク、ゼラチン、寒天、ペクチン、アラビアゴム、オリーブ油、ゴマ油、カカオバター、エチレングリコール、水、生理食塩液、エタノール、その他常用されるものが含まれる。
【００４３】
溶解補助剤には、例えば、グルタミン酸、アスパラギン酸、その他常用されるものが含まれる。
【００４４】
結合剤には、例えば、ポリビニルピロリドン、ショ糖、ゼラチン、アラビアゴム、その他常用されるものが含まれる。
【００４５】
安定化剤には、例えば、メチオニンなどのアミノ酸類、糖類、その他常用されるものが含まれる。
【００４６】
懸濁化剤には、例えば、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、植物油、アルコール類、ポリソルベート８０（登録商標）、その他常用されるものが含まれる。
【００４７】
崩壊剤には、例えば、繊維素グリコール酸カルシウム、デンプン、アルギン酸、その他常用されるものが含まれる。
【００４８】
滑沢剤には、例えば、ステアリン酸マグネシウム、タルク、その他常用されるものが含まれる。
【００４９】
乳化剤には、例えば、ショ糖界面活性剤、ラウリル硫酸ナトリウム、その他常用されるものが含まれる。
等張化剤には、例えば、塩化ナトリウム、その他常用されるものが含まれる。
【００５０】
本発明の医薬組成物中に、有効成分が例えば１〜７０重量％、１〜５０重量％、５〜３０重量％などの量で含まれるが、有効成分量は効能の程度や患者の年齢等に応じて変えることができる。
【００５１】
ＮＭ−３またはその誘導体の投与量は、約１５０〜約２０００ｍｇ／ｍ２／日であるが、これらに限定されないものとする。投与量は、患者または被験者の性別、年齢、体重、状態などに応じて変わるので、効能や副作用（毒性）の程度をも考慮しながら決定されるべきである。なお、ＮＭ−３またはその誘導体は上記の用量範囲であれば毒性がないといわれている。
【００５２】
投与経路は、非経口または経口投与であるが、好ましくは非経口投与、より好ましくは静脈内投与である。非経口投与には、例えば静脈内、動脈内、腹腔内、筋肉内、局所、皮内、皮下、経粘膜、経直腸などの投与が含まれる。
【００５３】
本発明はさらに、糖尿病を患っている、あるいは糖尿病の兆候を示しつつある患者において、本発明のＮＭ−３、またはプロドラッグとしてのその誘導体、を投与することを含む、患者の糖尿病性腎症を予防または治療する方法も提供する。
患者は、哺乳類、好ましくはヒトである。
【００５４】
以下に実施例を挙げて本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は実施例によって制限されないものとする。
【実施例１】
【００５５】
血管新生抑制物質ＮＭ−３を２型糖尿病モデルであるｄｂ／ｄｂマウス（C57BL/KsJ-db Jcl; Clea Japan, Inc.）に投与し腎症進展制御効果を調べた。ｄｂ／ｄｂマウスは、食欲調節・肥満に関与するレプチン（ｌｅｐｔｉｎ）の受容体を欠損し、肥満・高血糖・高インスリン血症を呈する。
【００５６】
（方法）
方法１：雌のｄｂ／ｄｂマウス（２型糖尿病モデル）と、対照群のｄｂ／ｍマウス（C57BL/KsJ-db /+m Jcl; Clea Japan, Inc.）（正常血糖マウス）を実験に用いた。高血糖を認めた８週齢のｄｂ／ｄｂマウスにＰＢＳ（対照群）もしくはＮＭ−３（１５０ｍｇ／ｋｇ）を連日８週間にわたり腹腔内投与した（ｎ＝６）。グループ１は正常コントロール（ｄｂ／ｍ）であり、グループ２は糖尿病群（ｄｂ／ｄｂ）にビヒクルバッファ（ｖｅｈｉｃｌｅ ｂｕｆｆｅｒ）（ＰＢＳ）を８週間投与した群であり、グループ３は糖尿病群（ｄｂ／ｄｂ）にＮＭ−３ （１５０ｍｇ／ｋｇ） を８週間投与した群である。ＮＭ−３はＰＢＳに溶解し、１回あたり１００μＬずつ腹腔内投与した。
【００５７】
方法２：腎臓、肝臓、心臓の重量、体重、血糖を測定した。２４時間蓄尿にて尿中アルブミン・クレアチニン比（ＵＡＣＲ）（治療開始２，３，４週後）、クレアチニンクリアランス（治療開始４週後）を測定した。ＰＡＳ染色腎組織像にて糸球体容積、メサンギウム基質インデックスを画像解析を行い測定した。
【００５８】
方法３：腎皮質部からＲＩＰＡ ｂｕｆｆｅｒを用いて蛋白を抽出し、ウエスタンブロット（ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ）を行い、ＶＥＧＦ，アンギオポエチン（Ａｎｇｉｏｐｏｉｅｔｉｎ）−１，アンギオポエチン−２，アクチン（ａｃｔｉｎ）の発現を検討した。統計学的解析にはＳｃｈｅｆｆｅ’ｓ ｔｅｓｔ（ＳｔａｔＶｉｅｗ，Ａｂａｃｕｓ Ｃｏｎｃｅｐｔｓ社のソフトウェア）を用いた。
【００５９】
（結果）
投与０週目および８週目における各群のマウスの体重、血糖値および食餌量を調べた結果を表１に示す。
【００６０】
【表１】
【００６１】
表１から、体重はｄｂ／ｍ非糖尿病マウスに比してｄｂ／ｄｂマウスにて、投与０週目（ｗｅｅｋ ０）及び８週目（ｗｅｅｋ ８）にて増加しており、ＮＭ−３投与による影響は認めなかった。血糖値は、ｄｂ／ｄｂマウスにてｄｂ／ｍマウスに比して高値であったが、ＮＭ−３投与群、およびｖｅｈｉｃｌｅ ｂｕｆｆｅｒ対照群にて差を認めなかった。同様に食餌量もｄｂ／ｄｂ群にて増加していた。
【００６２】
投与８週目における各群のマウスの血清インスリン、肝臓重量、心臓重量、腎臓重量を測定した結果を表２に示す。血清インスリンはＥＬＩＳＡ法 （モリナガ、超高感度インスリン測定キット） にて測定した。
【００６３】
【表２】
【００６４】
血清インスリンはｄｂ／ｍ非糖尿病マウスに比してｄｂ／ｄｂマウスにて８週目にて高値を示したが、ＮＭ−３投与による影響は認めなかった。肝臓重量及び腎重量は、ｄｂ／ｄｂマウスにてｄｂ／ｍマウスに比して有意に高値であったが、ＮＭ−３投与群にて有意な抑制効果は認めなかった。心重量はｄｂ／ｍ群とｄｂ／ｄｂ群間で有意差を認めなかった。
【００６５】
次に、図１〜図３の結果について説明する。
図１Ａから、ｄｂ／ｄｂ糖尿病群にて認められた２４時間クレアチニンクリアランスの増加は、ＮＭ−３投与群ではｖｅｈｉｃｌｅ ｂｕｆｆｅｒ対照群に比して有意に抑制された。
【００６６】
図１Ｂは、一日尿中アルブミン量／クレアチニン比（ＵＡＣＲ）を示す。ＵＡＣＲは、ｄｂ／ｄｂ糖尿病群でｄｂ／ｍ非糖尿病群に比して増加したが、ＮＭ−３投与群ではｖｅｈｉｃｌｅ ｂｕｆｆｅｒ対照群に比して増加が有意に抑制された。
【００６７】
上記の結果より、ｄｂ／ｄｂ糖尿病マウスにおける糸球体過剰濾過がＮＭ−３投与により有意に抑制されたものと考えられた。
【００６８】
図２Ａ〜Ｃは、腎糸球体凍結切片のＰＡＳ染色像（４週投与後、４００倍）を示す。Ａはｄｂ／ｍ、Ｂはｖｅｈｉｃｌｅ ｂｕｆｆｅｒ投与ｄｂ／ｄｂ群、ＣはＮＭ−３投与ｄｂ／ｄｂ群である。糖尿病対照群（Ｂ）にて糸球体肥大・メサンギウム領域の拡大を認めたが、ＮＭ−３投与群にて（Ｃ）上記の組織学的変化が抑制された。Ｄに示されるように、ｄｂ／ｄｂ糖尿病群における糸球体容積の増加は、ＮＭ−３投与群にて有意に抑制された。Ｅに示されるように、ｄｂ／ｄｂ糖尿病群におけるメサンギウム基質ｉｎｄｅｘの増加は、ＮＭ−３投与群にて有意に抑制された。
【００６９】
図３は、治療開始８週後のマウス腎皮質より蛋白を抽出しウエスタンブロットを行った結果を示す。Ａは、ＶＥＧＦ、アンギオポエチン−１（Ａｎｇ１）、アンギオポエチン−２（Ａｎｇ２）およびアクチン（ａｃｔｉｎ）の発現レベルを検討した結果である。ＶＥＧＦ，Ａｎｇ１，Ａｎｇ２の免疫ブロットを行った後に、同じ膜を用いてｓｔｒｉｐｐｉｎｇ後アクチンの免疫ブロットを行った。Ｂは、ＶＥＧＦとａｃｔｉｎのバンドをデンシトメトリーにて数値化し、その比を算定した結果である。ｄｂ／ｍ群を１として各群における相対的数値をグラフ化した。ＶＥＧＦ蛋白レベルはｖｅｈｉｃｌｅ−ｄｂ／ｄｂ群においてｄｂ／ｍ群に比して有意に増加したが、ＮＭ−３投与群ではｖｅｈｉｃｌｅ投与群に比して有意な抑制効果を認めた。Ｃに示されるように、Ａｎｇｉｏｐｏｉｅｔｉｎ−１蛋白レベルはｄｂ／ｄｂ群においてｄｂ／ｍ群と差がなかった。ＮＭ−３投与群でも特に変化を認めなかった。Ｄに示されるように、Ａｎｇｉｏｐｏｉｅｔｉｎ−２蛋白レベルはｖｅｈｉｃｌｅ−ｄｂ／ｄｂ群においてｄｂ／ｍ群に比して有意に増加したが、ＮＭ−３投与群ではｖｅｈｉｃｌｅ投与群に比して有意な抑制効果を認めた。
【００７０】
以上の結果から、Ａｎｇｉｏｐｏｉｅｔｉｎ−２はＶＥＧＦ存在下にて血管新生を誘導することより、ＮＭ−３投与による糖尿病性腎症における過剰の血管新生促進作用の抑制効果が示唆された。
【００７１】
上記の結果から、糖尿病性腎症モデルにて正常マウスに比してＡｎｇｉｏｐｏｉｅｔｉｎ−２発現が増加し、Ａｎｇｉｏｐｏｉｅｔｉｎ−１／２比が低下してＴｉｅ−２受容体を介した血管安定化シグナルが減少し、ＶＥＧＦ増加も相乗的に作用して血管透過性亢進をきたし、アルブミン尿増加に至ったと考えられた。ＮＭ−３投与にてＡｎｇｉｏｐｏｉｅｔｉｎ−２発現増加の抑制、ＶＥＧＦ発現増加の抑制作用を介してアルブミン尿増加が抑制されたと考えられた。ＮＭ−３は血管新生抑制作用を介して糖尿病性腎症における糸球体濾過面積の増加を有意に抑制し、したがって糖尿病性腎症の進展を有意に抑制し得たものと考えられた。
【産業上の利用可能性】
【００７２】
本発明により、これまで有効な治療法がなかった糖尿病性腎症に対して該腎症の進展を有意に抑制することが可能となった。したがって、本発明は、糖尿病性腎症の治療または予防のために有用である。
【図面の簡単な説明】
【００７３】
【図１】２型糖尿病ｄｂ／ｄｂマウスにＮＭ−３（１５０ｍｇ／ｋｇ）を連日８週間にわたり投与したときの、Ａ：２４時間クレアチニンクリアランス（＊Ｐ＜０．０１ｖｓ．ｄｂ／ｍまたはｖｅｈｉｃｌｅ−ｄｂ／ｄｂ，＃Ｐ＜０．０５ｖｓ．ｄｂ／ｍ）、およびＢ： 一日尿中アルブミン量／クレアチニン比（ＵＡＣＲ）（＊Ｐ＜０．０１ｖｓ．ｄｂ／ｍまたはｖｅｈｉｃｌｅ−ｄｂ／ｄｂ，＃Ｐ＜０．０５ｖｓ．ｄｂ／ｍ）を示す。陰性対照は正常ｄｂ／ｍマウス、陽性対照はビヒクル（ＰＢＳ）投与のｄｂ／ｄｂマウスである。
【図２】２型糖尿病ｄｂ／ｄｂマウスにＮＭ−３（１５０ｍｇ／ｋｇ）を連日８週間にわたり投与したときの、腎糸球体のＰＡＳ染色像（４週投与後、４００倍）を示す。Ａ： ｄｂ／ｍ、Ｂ：ｖｅｈｉｃｌｅ ｂｕｆｆｅｒ投与ｄｂ／ｄｂ群、Ｃ：ＮＭ−３投与ｄｂ／ｄｂ群。Ｄは、各群における％糸球体容積（＊Ｐ＜０．０１ｖｓ．ｄｂ／ｍ，＃Ｐ＜０．０５ｖｓ．ｄｂ／ｍ またはｖｅｈｉｃｌｅ−ｄｂ／ｄｂ）、Ｅは、各群におけるメサンギウム基質インデックス（＊Ｐ＜０．０１ｖｓ.ｄｂ／ｍ，＃Ｐ＜０．０５ｖｓ．ｖｅｈｉｃｌｅ−ｄｂ／ｄｂ）をそれぞれ示す。
【図３】２型糖尿病ｄｂ／ｄｂマウスにＮＭ−３（１５０ｍｇ／ｋｇ）を連日８週間にわたり投与したときの、治療開始８週後のマウス腎皮質から抽出した蛋白のウエスタンブロットを示す。Ａ：ＶＥＧＦ、アンギオポエチン−１（Ａｎｇ１）、アンギオポエチン−２（Ａｎｇ２）およびアクチン（ａｃｔｉｎ）の各発現レベルを示す。Ｂ：ＶＥＧＦ／ａｃｔｉｎ比（＊Ｐ＜０．０１ｖｓ．ｄｂ／ｍ，＃Ｐ＜０．０５ｖｓ．ｄｂ／ｍ，＊＊Ｐ＜０．０１ｖｓ．ｖｅｈｉｃｌｅ−ｄｂ／ｄｂ）を示す。Ｃ：Ａｎｇｉｏｐｏｉｅｔｉｎ−１／ａｃｔｉｎ比を示す。Ｄ：Ａｎｇｉｏｐｏｉｅｔｉｎ−２／ａｃｔｉｎ比（＊Ｐ＜０．０１ｖｓ．ｄｂ／ｍ，＃Ｐ＜０．０５ｖｓ．ｄｂ／ｍ，＊＊Ｐ＜０．０１ｖｓ．ｖｅｈｉｃｌｅ−ｄｂ／ｄｂ）を示す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の式１：
【化１】
によって表される３−（２−メチルカルボキシメチル）−６−メトキシ−８−ヒドロキシイソクマリン、あるいはプロドラッグとしてのその誘導体、を有効成分として含む糖尿病性腎症の治療または予防用医薬組成物。
【請求項２】
前記式１の化合物が、光学活性体である、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３】
前記式１の化合物が、ラセミ体である、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項４】
前記式１の化合物が、エナンチオマーの混合物である、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項５】
前記誘導体が、式１の化合物の塩、エステル化物、アミド化物またはアシル化物である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項１】
下記の式１：
【化１】
によって表される３−（２−メチルカルボキシメチル）−６−メトキシ−８−ヒドロキシイソクマリン、あるいはプロドラッグとしてのその誘導体、を有効成分として含む糖尿病性腎症の治療または予防用医薬組成物。
【請求項２】
前記式１の化合物が、光学活性体である、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３】
前記式１の化合物が、ラセミ体である、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項４】
前記式１の化合物が、エナンチオマーの混合物である、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項５】
前記誘導体が、式１の化合物の塩、エステル化物、アミド化物またはアシル化物である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【図１】
【図２】
【図３】
【図２】
【図３】
【公開番号】特開２００６−２６５１４５（Ｐ２００６−２６５１４５Ａ）
【公開日】平成１８年１０月５日（２００６．１０．５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００５−８４２１８（Ｐ２００５−８４２１８）
【出願日】平成１７年３月２３日（２００５．３．２３）
【出願人】（５０４１４７２４３）国立大学法人 岡山大学 (444)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１８年１０月５日（２００６．１０．５）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年３月２３日（２００５．３．２３）
【出願人】（５０４１４７２４３）国立大学法人 岡山大学 (444)
【Ｆターム（参考）】
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