糖鎖アスパラギン誘導体、糖鎖アスパラギンおよび糖鎖ならびにそれらの製造法
１１〜７糖を有するα２，３糖鎖アスパラギン誘導体、フッ素を含む１１〜７糖を有するα２，６糖鎖アスパラギン誘導体、及び脂溶性の保護基でアスパラギンのアミノ基窒素が保護された糖鎖アスパラギンの非還元末端側のＮ−アセチルグルコサミンに少なくとも１個以上のフコースを含む糖鎖アスパラギン誘導体、並びにこれらの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
本発明は糖鎖アスパラギン誘導体、糖鎖アスパラギンおよび糖鎖ならびにそれらの製造法に関する。
また本発明はフコースを含む糖鎖アスパラギン誘導体およびその製造方法に関する。
【背景技術】
近年、核酸（ＤＮＡ）、タンパク質に続く第三の鎖状生命分子として、糖鎖分子が注目されてきている。ヒトの体は、約６０兆個の細胞から成っている一大細胞社会であり、全ての細胞表面は糖鎖分子によって覆われている。例えば、ＡＢＯ式血液型は細胞表面の糖鎖の違いにより決定されている。
糖鎖は、細胞間の認識や相互作用に関わる働きをもち、細胞社会を成り立たせる要となっている。細胞社会の乱れは、癌、慢性疾患、感染症、老化などにつながる。
例えば、細胞が癌化すると糖鎖の構造変化が起こることが分かっている。また、コレラ菌やインフルエンザウイルスなどは、ある特定の糖鎖を認識し結合することにより、細胞に侵入し感染することが知られている。
糖鎖機能の解明は、新しい原理に基づく医薬品や食品の開発などをもたらし、病気の予防、治療に貢献するなど、幅広い応用が期待されている。
糖鎖は単糖の配列、結合様式・部位、鎖の長さ・分岐様式、全体の高次構造などの多様性から、核酸やタンパク質の構造と比べると非常に複雑な構造である。従って、その構造に由来する生物学的な情報は核酸やタンパク質に比べて多種多様である。糖鎖は、研究の重要性を認識されながらも、その構造の複雑さや多様性により、核酸やタンパク質に比べて研究の推進が遅れている状況にある。
上記のように細胞膜表面や血清などに存在するタンパク質の多くは糖鎖が結合している。糖鎖がタンパク質に共有結合した分子は糖タンパク質とよばれ、糖とタンパク質との結合様式の違いから２つのグループに分けることができる。一つはアスパラギン（Ａｓｎ）の側鎖のアミノ基と糖鎖が結合したアスパラギン結合型糖鎖（Ｎ−グリコシド結合型）である。もう一方はセリン（Ｓｅｒ）やトレオニン（Ｔｈｒ）のアルコールに糖鎖が結合したムチン結合型糖鎖（Ｏ−グリコシド結合型）である。すべてのアスパラギン結合型糖鎖は５つの糖残基からなる基本骨格をもち、結合する糖鎖の非還元末端の糖残基の種類によって高マンノース型、複合型、混成型のサブグループに分類される。一方ムチン結合型糖鎖は基本骨格（コア）の違いから４グループに分類される。
このように糖鎖は重要な化合物ではあるが、糖鎖の絶対量の不足がある。糖鎖を得る手段として、生体内に存在する糖タンパク質から糖鎖だけを遊離させる方法がある。しかし糖タンパク質から糖鎖を大量に切り出すのは、困難であり、生体内には構造が酷似した糖鎖が多く存在し、単一の糖鎖のみを大量に得るのは難しい。また、生体内に存在しない糖鎖は、大量に入手するのは困難である。
本発明の課題は、少なくとも１種以上のシアル酸あるいはシアル酸の誘導体を非還元末端に含む新規な糖鎖アスパラギン誘導体とその製造方法を提供することにある。
また本発明の課題は、少なくとも１種以上のシアル酸あるいはシアル酸の誘導体を非還元末端に含む新規な糖鎖アスパラギンとその製造方法を提供することにある。
また本発明の課題は、少なくとも１種以上のシアル酸あるいはシアル酸の誘導体を非還元末端に含む新規な糖鎖とその製造方法を提供することにある。
本発明の課題は、脂溶性の保護基でアスパラギンのアミノ基窒素が保護された糖鎖アスパラギンの非還元末端側のＮ−アセチルグルコサミンに少なくとも１個以上のフコースを含む新規な糖鎖アスパラギン誘導体とその製造方法を提供することにある。
【発明の開示】
本発明は、下記の発明に係る。
１．式（１）で表される１１〜７糖を有するα２，３糖鎖アスパラギン誘導体及びその製造法。
〔式中、Ｒ１およびＲ２は、水素原子、式（２）〜（５）で示される基であり、同一でも異なっていてもよい。ただし、Ｒ１およびＲ２の一方は必ず式（２）で示される基である。〕
Ｒ，Ｒ’，Ｒ”は下記の組合せを示す。
（ａ）Ｒ＝Ｆ、Ｒ’＝ＯＨ、Ｒ”＝ＯＨ
（ｂ）Ｒ＝ＯＨ、Ｒ’＝Ｆ、Ｒ”＝ＯＨ
（ｃ）Ｒ＝ＯＨ、Ｒ’＝ＯＨ、Ｒ”＝Ｆ
（ｄ）Ｒ＝ＯＨ、Ｒ’＝ＯＨ、Ｒ”＝ＯＨ
２．式（６）で表されるフッ素を含む１１〜７糖を有するα２，６糖鎖アスパラギン誘導体及びその製造法。
〔式中、ＲＸおよびＲＹは、水素原子、式（７）で示される基、または式（３）〜（５）で示される基である。ただし、ＲＸおよびＲＹの一方は必ず式（７）で示される基である。〕
Ｒ，Ｒ’，Ｒ”は下記の組合せを示す。
（ａ）Ｒ＝Ｆ、Ｒ’＝ＯＨ、Ｒ”＝ＯＨ
（ｂ）Ｒ＝ＯＨ、Ｒ’＝Ｆ、Ｒ”＝ＯＨ
（ｃ）Ｒ＝ＯＨ、Ｒ’＝ＯＨ、Ｒ”＝Ｆ
３．式（８）で表される１１〜７糖を有するα２，３糖鎖アスパラギン及びその製造法。
〔式中、Ｒ１およびＲ２は上記に同じ。〕
４．式（９）で表されるフッ素を含む１１〜７糖を有するα２，６糖鎖アスパラギン及びその製造法。
〔式中、ＲＸおよびＲＹは上記に同じ。〕
５．式（１０）で表される１１〜７糖を有するα２，３糖鎖及びその製造法。
〔式中、Ｒ１およびＲ２は上記に同じ。〕
６．式（１１）で表されるフッ素を含む１１〜７糖を有するα２，６糖鎖及びその製造法。
〔式中、ＲＸおよびＲＹは上記に同じ。〕
７．式（２２）で表される１１糖を有する（α２，３）（α２，６）糖鎖アスパラギン誘導体。
〔式中、Ｒ１は式（２）で示される基であり、ＲＹは下記式（７）で示される基である。〕
Ｒ，Ｒ’，Ｒ”は下記の組合せを示す。
（ａ）Ｒ＝Ｆ、Ｒ’＝ＯＨ、Ｒ”＝ＯＨ
（ｂ）Ｒ＝ＯＨ、Ｒ’＝Ｆ、Ｒ”＝ＯＨ
（ｃ）Ｒ＝ＯＨ、Ｒ’＝ＯＨ、Ｒ”＝Ｆ
（ｄ）Ｒ＝ＯＨ、Ｒ’＝ＯＨ、Ｒ”＝ＯＨ
８．式（２３）で表される１１糖を有する（α２，３）（α２，６）糖鎖アスパラギン誘導体。
〔式中、Ｒ２は式（２）で示される基であり、ＲＸは下記式（７）で示される基である。〕
Ｒ，Ｒ’，Ｒ”は下記の組合せを示す。
（ａ）Ｒ＝Ｆ、Ｒ’＝ＯＨ、Ｒ”＝ＯＨ
（ｂ）Ｒ＝ＯＨ、Ｒ’＝Ｆ、Ｒ”＝ＯＨ
（ｃ）Ｒ＝ＯＨ、Ｒ’＝ＯＨ、Ｒ”＝Ｆ
（ｄ）Ｒ＝ＯＨ、Ｒ’＝ＯＨ、Ｒ”＝ＯＨ
本発明は、脂溶性の保護基でアスパラギンのアミノ基窒素が保護された糖鎖アスパラギンの非還元末端側のＮ−アセチルグルコサミンに少なくとも１個以上のフコースを含む糖鎖アスパラギン誘導体、およびその製造方法に係る。
本発明者は、先に特願２００１−１８５６８５号（以下、先願という）において、種々の単離された糖鎖アスパラギン誘導体を従来に比べて非常に容易かつ大量に得ることができる、糖鎖アスパラギン誘導体、糖鎖アスパラギン、糖鎖の製造方法、更には糖残基が任意に欠失した糖鎖が結合した新規な糖鎖アスパラギン誘導体、糖鎖アスパラギン、糖鎖を開発した。
この先願の方法は例えば
（１） （ａ）１種もしくは２種以上の糖鎖アスパラギンを含む混合物に含まれる該糖鎖アスパラギンに脂溶性の保護基を導入して糖鎖アスパラギン誘導体混合物を得る工程、
ならびに
（ｂ）該糖鎖アスパラギン誘導体混合物または該糖鎖アスパラギン誘導体混合物に含まれる糖鎖アスパラギン誘導体を加水分解して得られる混合物をクロマトグラフィーに供して各糖鎖アスパラギン誘導体を分離する工程、
を含む、糖鎖アスパラギン由来の糖鎖アスパラギン誘導体の製造方法、
（２） （ｂ’）工程（ｂ）で分離された糖鎖アスパラギン誘導体を糖加水分解酵素を用いて加水分解する工程をさらに含む前記（１）記載の糖鎖アスパラギン誘導体の製造方法、
（３） １種もしくは２種以上の糖鎖アスパラギンを含む混合物が、下記式（Ａ）の化合物および／または該化合物において１以上の糖残基が欠失した化合物を含むものである、前記（１）または（２）記載の糖鎖アスパラギン誘導体の製造方法、
（４） 脂溶性の保護基がフルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）基である前記（１）〜（３）いずれか記載の糖鎖アスパラギン誘導体の製造方法、
（５） 工程（ａ）が、非還元末端にシアル酸残基を有する１種もしくは２種以上の糖鎖アスパラギンを含む混合物に含まれる該糖鎖アスパラギンにＦｍｏｃ基を導入し、かつシアル酸残基にベンジル基を導入して糖鎖アスパラギン誘導体混合物を得る工程である、前記（１）〜（３）いずれか記載の糖鎖アスパラギン誘導体の製造方法、
（６） （ａ）１種もしくは２種以上の糖鎖アスパラギンを含む混合物に含まれる該糖鎖アスパラギンに脂溶性の保護基を導入して糖鎖アスパラギン誘導体混合物を得る工程、
（ｂ）該糖鎖アスパラギン誘導体混合物または該糖鎖アスパラギン誘導体混合物に含まれる糖鎖アスパラギン誘導体を加水分解して得られる混合物をクロマトグラフィーに供して各糖鎖アスパラギン誘導体を分離する工程、ならびに
（ｃ）工程（ｂ）で分離された糖鎖アスパラギン誘導体の保護基を除去して糖鎖アスパラギンを得る工程、
を含む、糖鎖アスパラギンの製造方法、
（７） （ｂ’）工程（ｂ）で分離された糖鎖アスパラギン誘導体を糖加水分解酵素を用いて加水分解する工程、および／または
（ｃ’）工程（ｃ）で得られた糖鎖アスパラギンを糖加水分解酵素を用いて加水分解する工程、
をさらに含む、前記（６）記載の糖鎖アスパラギンの製造方法、
（８） １種もしくは２種以上の糖鎖アスパラギンを含む混合物が、下記式（Ａ）の化合物および／または該化合物において１以上の糖残基が欠失した化合物を含むものである、前記（６）または（７）記載の糖鎖アスパラギンの製造方法、
（９） 脂溶性の保護基がＦｍｏｃ基である前記（６）〜（８）いずれか記載の糖鎖アスパラギンの製造方法、
（１０） 工程（ａ）が、非還元末端にシアル酸残基を有する１種もしくは２種以上の糖鎖アスパラギンを含む混合物に含まれる該糖鎖アスパラギンにＦｍｏｃ基を導入し、かつシアル酸残基にベンジル基を導入して糖鎖アスパラギン誘導体混合物を得る工程である、前記（６）〜（８）いずれか記載の糖鎖アスパラギンの製造方法などである。
これら糖鎖アスパラギン誘導体及び糖鎖アスパラギンの製造についての詳細は、上記先願に述べられているので、これを引用する。しかし若干先願の内容について述べると、先願の糖鎖アスパラギン誘導体の製造方法は、たとえば、天然の糖タンパク質に由来する糖鎖アスパラギン、好ましくはアスパラギン結合型糖鎖から得られる糖鎖アスパラギンの混合物に含まれる当該糖鎖アスパラギンに脂溶性の保護基を導入（結合）して糖鎖アスパラギン誘導体の混合物を得た後に当該混合物を各糖鎖アスパラギン誘導体に分離することを１つの大きな特徴とする。なお、本明細書において、「糖鎖アスパラギン」とはアスパラギンが結合した状態の糖鎖をいう。また、「アスパラギン結合型糖鎖」とはタンパク質のポリペプチド中のアスパラギン（Ａｓｎ）の酸アミノ基に、還元末端に存在するＮ−アセチルグルコサミンがＮ−グリコシド結合した糖鎖群であって、Ｍａｎ（β１−４）ＧｌｃＮａｃ（β１−４）ＧｌｃＮａｃを母核とする糖鎖群をいう。「糖鎖アスパラギン誘導体」とはアスパラギン残基に脂溶性の保護基が結合した状態の糖鎖アスパラギンをいう。また、化合物の構造式中、「ＡｃＨＮ」はアセトアミド基を示す。
前記するように、天然の糖タンパク質に由来する糖鎖は非還元末端の糖残基がランダムに欠失した糖鎖の混合物である。本発明者らは、意外にも天然の糖タンパク質に由来する糖鎖、具体的には糖鎖アスパラギンの混合物に含まれる当該糖鎖アスパラギンに脂溶性の保護基を導入することで、当該保護基が導入された糖鎖アスパラギン誘導体の混合物を公知のクロマトグラフィーの手法を用いて容易に個々の糖鎖アスパラギン誘導体に分離することができることを見出した。それにより、種々の構造を有する糖鎖アスパラギン誘導体をそれぞれ大量に調製することが可能となった。たとえば、従来分離が困難であった類似構造の糖鎖アスパラギン誘導体同士の分離が可能となり、それらの化合物を各々、容易かつ大量に調製することができる。また、得られた糖鎖アスパラギン誘導体を元に、たとえば、糖加水分解酵素を順次作用させて糖残基を除去することにより、さらに様々な糖鎖アスパラギン誘導体を合成することもできる。
このように、糖鎖アスパラギンに脂溶性の保護基を導入して誘導体化することにより個々の糖鎖アスパラギン誘導体の分離が可能となったが、これは、脂溶性の保護基を導入したことにより糖鎖アスパラギン誘導体の全体の脂溶性が高まり、たとえば、好適に使用される逆相系カラムとの相互作用が格段に向上し、その結果、より鋭敏に糖鎖構造の差を反映して個々の糖鎖アスパラギン誘導体が分離されるようになったことによると考えられる。
さらに、先願によれば、得られた糖鎖アスパラギン誘導体の保護基を除去することにより種々の糖鎖アスパラギンを、人工的に容易かつ大量に得ることができる。
しかし、上記先願で得られる糖鎖アスパラギン誘導体、糖鎖アスパラギン及び糖鎖はいずれもα２，６結合体のものであった。
また、上記先願で得られる糖鎖アスパラギン誘導体、糖鎖アスパラギン及び糖鎖はいずれもフコースが結合していない糖鎖アスパラギン誘導体であった。
本発明では、上記先願に記載のないα２，３結合体の糖鎖アスパラギン誘導体、糖鎖アスパラギン及び糖鎖、並びにα２，６結合体のもので更にフッ素を含む、いずれも新規な糖鎖アスパラギン誘導体、糖鎖アスパラギン及び糖鎖を得るものである。
また本発明では、上記先願に記載のないフコース結合体の糖鎖アスパラギン誘導体を得るものである。
ここで、α２，３結合体とα２，６結合体の相異について以下に説明する。
α２，３結合体、α２，６結合体とは、シアル酸とガラクトースとの結合様式を表わすものである。前者は、シアル酸の２位の炭素と、ガラクトースの３位の炭素がα結合しているものをいい、後者は、シアル酸の２位の炭素と、ガラクトースの６位の炭素がα結合しているものをいう。これらは、ガラクトースとの結合炭素の違いではある。
しかしながらこの違いは、例えば、インフルエンザウイルスは、シアル酸を末端に持つ糖鎖をレセプターとして認識している。しかし、ヒトとトリのインフルエンザウイルスではレセプター特異性が異なっている。前者は、シアル酸がガラクトースにα２，６結合した糖鎖を、後者はシアル酸がガラクトースにα２，３結合した糖鎖を特異的に認識する。シアル酸−ガラクトース間の結合様式の違い、さらにはシアル酸の相違が、インフルエンザウイルスの宿主域の制限に大きな役割を果たしていることが知られている。
本発明では、このように先願には記載のない新規な糖鎖アスパラギン誘導体、糖鎖アスパラギン及び糖鎖、並びにそれらの製造法に係るものである。
本発明の方法においては先ず、出発化合物である脂溶性の保護基で保護された糖鎖アスパラギン（９糖−Ａｓｎ−Ｆｍｏｃ）をシアル酸転移酵素を用いてシアル酸あるいはシアル酸の誘導体を転移させ、得られた脂溶性の保護基で保護された糖鎖アスパラギンをクロマトグラフィーに供することにより分離し、脂溶性の保護基で保護されたジシアロ糖鎖アスパラギン誘導体および２種のモノシアロ糖鎖アスパラギン誘導体が得られる。
次いで、得られたジシアロ糖鎖アスパラギン誘導体および２種のモノシアロ糖鎖アスパラギン誘導体を糖加水分解することにより、シアル酸あるいはシアル酸誘導体を有する９〜７糖鎖アスパラギン誘導体が得られる。
また、上記で得られた１１〜７糖鎖アスパラギン誘導体やジシアロ糖鎖アスパラギン（α２，６−１１糖−Ａｓｎ−Ｆｍｏｃ）を出発原料としそれを糖加水分解することにより得られる１０〜６糖鎖アスパラギン誘導体に、糖転移酵素によりフコースを転移することによりフコースを含む１３〜７糖鎖アスパラギン誘導体が得られる。
当該保護基としては特に限定されるものではなく、例えば、Ｆｍｏｃ基やｔ−ブチルオキシカルボニル（Ｂｏｃ）基、ベンジル基、アリル基、アリルオキシカルボニル基、アセチル基等の、カーボネート系またはアミド系の保護基等を使用することができる。得られた糖鎖アスパラギン誘導体を直ちに所望の糖ペプチドの合成に使用できるという観点から、当該保護基としては、Ｆｍｏｃ基またはＢｏｃ基などが好ましく、Ｆｍｏｃ基がより好ましい。Ｆｍｏｃ基はシアル酸等比較的酸性条件に不安定な糖が糖鎖に存在する場合に特に有効である。また、保護基の導入は公知の方法（たとえば、Ｐｒｏｔｅｃｔｉｎｇ ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ ＩＮＣ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ １９９１，ＩＳＢＮ ０−４７１−６２３０１−６を参照）に従って行えばよい。
たとえば、Ｆｍｏｃ基を用いる場合、糖鎖アスパラギンに対しアセトンを適量加えた後、さらに９−フルオレニルメチル−Ｎ−スクシニミヂルカーボネートと炭酸水素ナトリウムを加えて溶解し、２５℃にてアスパラギン残基へのＦｍｏｃ基の結合反応を行うことにより、当該糖鎖アスパラギンのアスパラギン残基にＦｍｏｃ基を導入することができる。
以上の操作により、脂溶性の保護基が導入された糖鎖アスパラギン誘導体が得られる。
シアル酸としては、一般に市販されているシアル酸あるいは化学合成したものを用いることができる。
シアル酸の誘導体としては、一般に市販されているシアル酸の誘導体あるいは化学合成したものを用いることができる。具体的には、シアル酸の７位、８位あるいは９位の炭素に結合している水酸基を水素原子あるいはハロゲン原子で置換したものを挙げることができる。ハロゲン原子としては、フッ素、塩素、臭素等を挙げることができるが、好ましくはフッ素がよい。
シアル酸転移酵素としては、一般に市販されているもの、天然由来のもの、遺伝子組換えにより生産されたものを用いることができ、転移させるシアル酸あるいはシアル酸の誘導体の種類により適宜選択することができる。具体的には、α２，３転移酵素であるＲａｔ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ由来のもの、α２，６転移酵素であるＲａｔ Ｌｉｖｅｒ由来のものを挙げることができる。また、シアリターゼをもちいてｐＨ調整等により平衡をずらすことにより、シアル酸あるいはシアル酸の誘導体を転移させてもよい。
上記糖鎖アスパラギン誘導体のクロマトグラフィーによる分離は、適宜、公知のクロマトグラフィーを単独でまたは複数組み合わせて用いることにより行うことができる。
たとえば、得られた糖鎖アスパラギン誘導体混合物をゲル濾過カラムクロマトグラフィーで精製後、ＨＰＬＣを用いて精製する。ＨＰＬＣにおいて用い得るカラムとしては逆相系のカラムが好適であり、たとえば、ＯＤＳ、Ｐｈｅｎｙｌ系、ニトリル系や、陰イオン交換系のカラム、具体的には、たとえば、ファルマシア社製モノＱカラム、イヤトロン社製イアトロビーズカラムなどが利用可能である。分離条件等は適宜、公知の条件を参照して調整すればよい。以上の操作により、糖鎖アスパラギン誘導体混合物から所望の各糖鎖アスパラギン誘導体を得ることができる。
以上の操作により、たとえば、保護基がＦｍｏｃ基である場合、式（１２）、（１３）、（１７）、（１８）、（２２）、（２３）の糖鎖アスパラギン誘導体を単独又は混合物の形で得ることができる。
次に、上記で分離された糖鎖アスパラギン誘導体を加水分解することにより、所望の糖鎖構造を有する糖鎖アスパラギン誘導体を効率的に得ることができる。たとえば、糖鎖アスパラギン誘導体を分離する段階においては混合物に含まれる糖鎖アスパラギン誘導体の種類を制限して糖鎖アスパラギン誘導体を大まかに分離し、次いで加水分解、たとえば、糖加水分解酵素を用いて加水分解することにより所望の糖鎖構造を有する糖鎖アスパラギン誘導体を効率的に得ることができる。なお、加水分解は前記と同様にして行うことができる。特に、所望の糖鎖構造を有する糖鎖アスパラギン誘導体をより効率的に得る観点から、糖残基の切断様式が明確な糖加水分解酵素を用いて加水分解するのが好ましい。
たとえば、ガラクトース残基の除去は、加水分解される化合物を緩衝液（たとえば、リン酸緩衝溶液、酢酸緩衝溶液、グッド緩衝溶液など）に溶かし、公知の条件に従ってガラクトース加水分解酵素を用いてガラクトース残基の切断反応を行うことにより成し得る。なお、加水分解される化合物は各々単離されたものであっても混合物であってもよい。この反応で用いるガラクトース加水分解酵素は市販されている公知のエキソ型の酵素を利用するのが好ましい。また、同様の活性を有するものであれば、新たに単離された酵素、遺伝子工学的に創製された酵素であってもよい。次いで、前記と同様にして、反応後に得られる反応液（糖残基が切断された糖鎖アスパラギン誘導体の混合物）をクロマトグラフィーに供し、各糖鎖アスパラギン誘導体を得ればよい。たとえば、分離はＨＰＬＣ（ＯＤＳカラム、展開溶媒は５０ｍＭ酢酸アンモニウム水溶液：アセトニトリル＝８２：１８）で行うのが好ましい。
Ｎ−アセチルグルコサミン残基の除去は、加水分解される化合物を緩衝液（たとえば、リン酸緩衝溶液、酢酸緩衝溶液、グッド緩衝溶液など）に溶かし、公知の条件に従ってＮ−アセチルグルコサミン加水分解酵素を用いてＮ−アセチルグルコサミン残基の切断反応を行うことにより成し得る。また、Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼ加水分解酵素を用いてもよい。なお、加水分解される化合物は各々単離されたものであっても混合物であってもよい。この反応で用いる各酵素は市販されているエキソ型の酵素を利用するのが好ましい。また、同様の活性を有するものであれば、新たに単離された酵素、遺伝子工学的に創製された酵素であってもよい。次いで、前記と同様にして、反応後に得られる反応液（糖残基が切断された糖鎖アスパラギン誘導体の混合物）をクロマトグラフィーに供し、各糖鎖アスパラギン誘導体を得ればよい。たとえば、分離はＨＰＬＣ（ＯＤＳカラム、展開溶媒は５０ｍＭ酢酸アンモニウム水溶液：メタノール＝６５：３５または５０ｍＭ酢酸アンモニウム水溶液：アセトニトリル＝８２：１８）で行うのが好ましい。
マンノース残基の除去は、加水分解される化合物を緩衝液（たとえば、リン酸緩衝溶液、酢酸緩衝溶液、グッド緩衝溶液など）に溶かし、公知の条件に従ってマンノース加水分解酵素を用いてマンノース残基の切断反応を行うことにより成し得る。なお、加水分解される化合物は各々単離されたものであっても混合物であってもよい。この反応で用いるマンノース加水分解酵素は市販されているエキソ型の酵素を利用するのが好ましい。また、同様の活性を有するものであれば、新たに単離された酵素、遺伝子工学的に創製された酵素であってもよい。次いで、前記と同様にして、反応後に得られる反応液（糖残基が切断された糖鎖アスパラギン誘導体の混合物）をクロマトグラフィーに供し、各糖鎖アスパラギン誘導体を得ればよい。たとえば、分離はＨＰＬＣ（ＯＤＳカラム、展開溶媒は、１０〜２００ｍＭ程度の酢酸アンモニウムなどの緩衝溶液とアセトニトリル、あるいはエタノール、あるいはメタノール、あるいはブタノール、あるいはプロパノールなどの脂溶性のある水溶性有機溶剤を適宜混ぜて用いることができる。ここに例示する場合、展開溶媒としては５０ｍＭ酢酸アンモニウム水溶液：アセトニトリル＝８２：１８が好適である）で行うのが好ましい。
このようにして得られた各糖鎖アスパラギン誘導体を得た後、フコースを転移させることにより本発明の脂溶性の保護基でアスパラギンのアミノ基窒素が保護された糖鎖アスパラギンの非還元末端側のＮ−アセチルグルコサミンに少なくとも１個以上のフコースを含む新規な糖鎖アスパラギン誘導体を製造することができる。
フコースとしては、一般に市販されているフコースあるいは化学合成したものを用いることができる。
フコース転移酵素としては、一般に市販されているもの、天然由来のもの、遺伝子組換えにより生産されたものを用いることができ、転移させるフコースの種類により適宜選択することができる。具体的には、糖鎖アスパラギンの非還元末端側のＮ−アセチルグルコサミンにフコースを転移させる酵素であるＦｕｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ Ｖ（Ｈｕｍａｎ，Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ、血漿由来、血清由来、乳汁由来、肝臓由来）などを挙げることができる。また、フコース加水分解酵素を用いてｐＨ調整等により平衡ずらすことにより、フコースを転移させてもよい。
上記糖鎖アスパラギン誘導体のクロマトグラフィーによる分離は、適宜、公知のクロマトグラフィーを単独でまたは複数組合せて用いることにより行うことができる。
たとえば、得られた糖鎖アスパラギン誘導体混合物をゲル濾過カラムクロマトグラフィーで精製後、ＨＰＬＣを用いて精製する。ＨＰＬＣにおいて用い得るカラムとしては逆相系のカラムが好適であり、たとえば、ＯＤＳ、Ｐｈｅｎｙｌ系、ニトリル系や、陰イオン交換系のカラム、具体的には、たとえば、ファルマシア社製モノＱカラム、イヤトロン社製イアトロビーズカラムなどが利用可能である。分離条件等は適宜、公知の条件を参照して調整すればよい。以上の操作により、糖鎖アスパラギン誘導体混合物から所望の各糖鎖アスパラギン誘導体を得ることができる。
このように、各糖鎖アスパラギン誘導体を得た後、さらに各種糖加水分解酵素等を用いて当該誘導体を加水分解し、糖鎖の非還元末端の糖残基を除去することにより、たとえば、糖鎖の末端の分岐構造が不均一な様々な糖鎖アスパラギン誘導体をそれぞれ単一化合物として得ることができる。また、種々の糖加水分解酵素を用い、加水分解する順番やその種類を変えることで、より多くの種類の糖鎖アスパラギン誘導体を製造することができる。
従来の方法によれば、極限られた糖鎖構造を有する糖鎖アスパラギン誘導体を分析スケールで得るのにさえ膨大な時間とコストが必要であったが、本発明によれば、特別の装置や試薬を必要とすることなく、慣用のゲルろ過カラム、ＨＰＬＣカラムや、少なくとも３種類の糖加水分解酵素（たとえば、ガラクトース加水分解酵素、マンノース加水分解酵素、Ｎ−アセチルグルコサミン加水分解酵素）等を使って、２週間程度で所望の糖鎖構造を有する糖鎖アスパラギン誘導体を１グラム程度調製することが可能である。
以上の操作により、たとえば、保護基がＦｍｏｃ基である場合、式（１４）〜（１６）、（１９）〜（２１）の糖鎖アスパラギン誘導体を単独又は混合物の形で得ることができる。
また本発明は、種々の単離された糖鎖アスパラギンを大量に得ることができる糖鎖アスパラギンの製造方法を提供する。当該方法は、前記糖鎖アスパラギン誘導体の製造方法に従う糖鎖アスパラギン誘導体の製造工程に続き、さらに、得られた糖鎖アスパラギン誘導体から保護基を除去する工程を含むものである。
糖鎖アスパラギン誘導体からの保護基の除去は、公知の方法に従って行うことができる（たとえば、Ｐｒｏｔｅｃｔｉｎｇ ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ ＩＮＣ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ １９９１，ＩＳＢＮ ０−４７１−６２３０１−６を参照）。たとえば、保護基がＦｍｏｃ基である場合、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中、糖鎖アスパラギン誘導体にモルホリンを加えて反応を行うことによりＦｍｏｃ基を除去することができる。また、Ｂｏｃ基は弱酸を反応させることで除去することができる。保護基除去後、所望により適宜、公知の方法、たとえば、ゲル濾過カラム、イオン交換カラムなどを使用する各種クロマトグラフィーや、ＨＰＬＣによる分離という方法によって精製することにより、糖鎖アスパラギンを得てもよい。
以上の操作により、たとえば、式（８）、（９）の糖鎖アスパラギンを単独又は混合物の形で得ることができる。
さらに本発明は、種々の単離された糖鎖を大量に得ることができる糖鎖の製造方法を提供する。当該方法は、前記糖鎖アスパラギンの製造方法に従う糖鎖アスパラギンの製造工程に続き、さらに、得られた糖鎖アスパラギンからアスパラギン残基を除去する工程を含むものである。
糖鎖アスパラギンからのアスパラギン残基の除去は、公知の方法に従って行うことができる。たとえば、糖鎖アスパラギンを無水ヒドラジンと反応させた後、アセチル化することによりアスパラギン残基を除去して糖鎖を得ることができる。また、糖鎖アスパラギンを塩基性水溶液で加熱還流後、アセチル化することによってもアスパラギン残基を除去して糖鎖を得ることができる。アスパラギン残基除去後、所望により適宜、公知の方法、たとえば、ゲル濾過カラム、イオン交換カラムなどを使用する各種クロマトグラフィーや、ＨＰＬＣによる分離という方法によって精製してもよい。
以上の操作により、たとえば、式（１０）、（１１）の糖鎖を単独又は混合物の形で得ることができる。
このように、本発明によれば、所望の糖鎖構造を有する糖鎖アスパラギン誘導体、糖鎖アスパラギンおよび糖鎖（以下、３つ併せて糖鎖類という場合がある）を安価かつ効率的に大量に製造することができる。
かかる糖鎖類は医薬品開発等の分野において非常に有用である。たとえば、医薬品開発における応用例としては、たとえば、ガンのワクチン合成があげられる。細胞がガン化すると体内にはなかった糖鎖が発現することが知られている。また、当該糖鎖を化学的に合成し、ワクチンとして個体に投与すると、ガンの増殖が抑制されることも知られている。そこで、本発明により所望の糖鎖類を製造することができれば、ガンの治療に有効なワクチンの合成を行うことが可能である。また、本発明により得られる糖鎖類を、さらに化学的な反応および糖転移酵素による反応などを組み合わせて新たな糖残基を結合させて誘導体化し、新規なワクチンの合成を行うことも可能である。
【発明を実施するための最良の形態】
以下に参考例、実施例を挙げて説明するが、本発明は何らこれら実施例に限定されるものではない。
参考例１ α２，６−ジシアロ糖鎖アスパラギンの合成
卵由来粗精製ＳＧＰ（シアリルグリコペプチド）２．６ｇをトリス−塩酸・塩化カルシウム緩衝溶液（ＴＲＩＺＭＡ ＢＡＳＥ ０．０５ｍｏｌ／ｌ、塩化カルシウム０．０１ｍｏｌ／ｌ、ｐＨ７．５）１００ｍｌに溶解させた。これにアジ化ナトリウム５８ｍｇ（７７２μｍｏｌ）とアクチナーゼ−Ｅ（科研製薬社製）５２６ｍｇを加え、３７℃で静置した。６５時間後、再びアクチナーゼ−Ｅを２６３ｍｇ加え、更に３７℃で２４時間静置した。この溶液を凍結乾燥した後、残留物をゲル濾過カラムクロマトグラフィー（Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５、２．５φ×１ｍ、展開溶媒は水、流速は１．０ｍｌ／ｍｉｎ）で２回精製し、α２，６−ジシアロ糖鎖アスパラギンを１．３ｇ（５５５μｍｏｌ）得た。
得られたジシアロ糖鎖アスパラギンの物理的データは以下の通りである。
１Ｈ−ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ，３０℃）
δ ５．１３（ｓ，１Ｈ，Ｍａｎ４−Ｈ−１），５．０７（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝９．５Ｈｚ，ＧｌｃＮＡｃ１−Ｈ−１），４．９５（ｓ，１Ｈ，Ｍａｎ４−Ｈ−１），４．７７（ｓ，１Ｈ，Ｍａｎ３−Ｈ−１），４．６１（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，ＧｌｃＮＡｃ２−Ｈ−１），４．６０（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，ＧｌｃＮＡｃ５，５−Ｈ−１），４．４４（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，Ｇａｌ６，６−Ｈ−１），４．２５（ｂｄ，１Ｈ，Ｍａｎ３−Ｈ−２），４．２０（ｂｄｄ，１Ｈ，Ｍａｎ４−Ｈ−２），４．１２（ｂｄ，１Ｈ，Ｍａｎ４−Ｈ−２），２．９４（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．５Ｈｚ，１７．２Ｈｚ，Ａｓｎ−βＣＨ），２．８５（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．０Ｈｚ，１７．２Ｈｚ，Ａｓｎ−βＣＨ），２．６７，２．６６（ｄｄ，２Ｈ，Ｊ＝４．６Ｈｚ，１２．４Ｈｚ，ＮｅｕＡｃ７，７−Ｈ−３ｅｑ），２．０７（ｓ，３Ｈ，Ａｃ），２．０６（ｓ，６Ｈ，Ａｃ×２），２．０２（ｓ，６Ｈ，Ａｃ×２），２．０１（ｓ，３Ｈ，Ａｃ），１．７１（ｄｄ，２Ｈ，Ｊ＝１２．４Ｈｚ，１２．４Ｈｚ，ＮｅｕＡｃ７，７−Ｈ−３ａｘ．）
参考例２ 化合物１、２、３および４の合成
参考例１で得られたα２，６−ジシアロ糖鎖アスパラギン（６０９ｍｇ，２６１μｍｏｌ）を水２０．７ｍｌに溶解させ、さらに０．１規定塩酸１３．８ｍｌを加えた。この溶液を７０℃で３５分間加熱した後速やかに氷冷し、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を加えｐＨ７とした。これを凍結乾燥した後、残留物をゲル濾過カラムクロマトグラフィー（Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５、２．５φ×１ｍ、展開溶媒は水、流速は１．０ｍｌ／ｍｉｎ）で精製したところ、α２，６−ジシアロ糖鎖アスパラギン、２種のα２，６−モノシアロ糖鎖アスパラギンおよびアシアロ糖鎖アスパラギンの混合物５３４ｍｇを得た。この４成分はそれぞれを単離することなく次の工程に進めた。
なお、得られた糖鎖混合物の物理的データは以下の通りである。
１Ｈ−ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ，３０℃）
５．１３（ｓ，Ｍａｎ４−Ｈ１），５．１２（ｓ，Ｍａｎ４−Ｈ１），５．０１（ｄ，ＧｌｃＮＡｃ１−Ｈ１），４．９４（ｓ，Ｍａｎ４’−Ｈ１），４．９３（ｓ，Ｍａｎ４’−Ｈ１），４．８２（ｓ，Ｍａｎ３−Ｈ１），４．６０（ｄ，ＧｌｃＮＡｃ２−Ｈ１），４．５８（ｄ，ＧｌｃＮＡｃ５，５’−Ｈ１），４．４７（ｄｄ，Ｇａｌ６，６’−Ｈ１），４．４４（ｄ，Ｇａｌ６，６’−Ｈ１），４．２４（ｄ，Ｍａｎ３−Ｈ２），４．１９（ｄ，Ｍａｎ４’−Ｈ２），４．１１（ｄ，Ｍａｎ４−Ｈ２），２．９７（ｂｄｄ，ＡｓＮ−βＣＨ），２．７２（ｄｄ，ＮｅｕＡｃ７−Ｈ３ｅｑ，ＮｅｕＡｃ７−Ｈ３ｅｑ），２．６４（ｂｄｄ，ＡｓＮ−βＣＨ），２．１５（ｓ×５，−Ａｃ），１．７９（ｄｄ，ＮｅｕＡｃ７−Ｈ３ａｘ，ＮｅｕＡｃ７’−Ｈ３ａｘ）
得られた糖鎖の混合物４２９ｍｇをアセトン１６．３ｍｌと水１１．２ｍｌに溶解させた。ここに９−フルオレニルメチル−Ｎ−スクシニミジルカーボネート（１５５．７ｍｇ，４６１．７μｍｏｌ）と炭酸水素ナトリウム（８０．４ｍｇ，９５７μｍｏｌ）を加え、室温で２時間攪拌した。この溶液をエバポレーターに供してアセトンを除き、残りの溶液をゲル濾過カラムクロマトグラフィー（Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５、２．５φ×１ｍ、展開溶媒は水、流速は１．０ｍｌ／ｍｉｎ）で精製したところ、化合物１、化合物２および３、化合物４の混合物３０９ｍｇが得られた。この混合物をＨＰＬＣ（ＯＤＳカラム、展開溶媒は５０ｍＭ酢酸アンモニウム水溶液：メタノール＝６５：３５、２．０φ×２５ｃｍ、流速３ｍｌ／ｍｉｎ）を用いて精製したところ、５１分後に化合物１が、６７分後に化合物２および３の混合物が、９３分後に化合物４が溶出した。それぞれを取り分け凍結乾燥を行った後、ゲル濾過カラムクロマトグラフィー（Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５、２．５φ×３０ｃｍ、展開溶媒は水、流速は１．０ｍｌ／ｍｉｎ）で脱塩することで目的の化合物２および３の混合物１５０ｍｇを得た。
なお、得られた化合物１の物理的データは以下の通りである。
１Ｈ−ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ，３０℃）
７．９９（２Ｈ，ｄ，Ｆｍｏｃ），７．７９（２Ｈ，ｄ，Ｆｍｏｃ），７．５５（４Ｈ，ｍ，Ｆｍｏｃ），５．１５（１Ｈ，ｓ，Ｍａｎ４−Ｈ１），５．０６（１Ｈ，ｄ，ＧｌｃＮＡｃ１−Ｈ１），４．９５（１Ｈ，ｓ，Ｍａｎ４’−Ｈ１），４．８２（１Ｈ，ｓ，Ｍａｎ３−Ｈ１），４．６９（１Ｈ，ｄ，ＧｌｃＮＡｃ２−Ｈ１），４．６７（２Ｈ，ｄ，ＧｌｃＮＡｃ５，５’−Ｈ１），４．５３（２Ｈ，ｄ，Ｇａｌ６，６’−Ｈ１），４．３４（１Ｈ，ｄ，Ｍａｎ３−Ｈ２），４．２７（１Ｈ，ｄ，Ｍａｎ４’−Ｈ２），４．１９（１Ｈ，ｄ，Ｍａｎ４−Ｈ２），３．０３（１Ｈ，ｂｄｄ，ＡｓＮ−βＣＨ），３．００（１Ｈ，ｂｄｄ，ＡｓＮ−βＣＨ），２．７６（２Ｈ，ｄｄ，ＮｅｕＡｃ７，７’−Ｈ３ｅｑ），２．１５（１８Ｈ，ｓ×６，−Ａｃ），１．７９（２Ｈ，ｄｄ，ＮｅｕＡｃ７，７’−Ｈ３ａｘ）；ＨＲＭＳ Ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ１０３Ｈ１５４Ｎ８ＮａＯ６６［Ｍ＋Ｎａ＋］２５８１．８８３８，ｆｏｕｎｄ，２５８１．８８２１
上記の糖鎖の構造を記号化すると次のようになる。ここで
ＮｅｕＡｃ：シアル酸 Ｇａｌ：Ｄ−ガラクトース ＧｌｃＮＡｃ：Ｎ−アセチルグルコサミン Ｍａｎ：Ｄ−マンノース Ａｓｎ：アスパラギン を示す。
また、得られた化合物２および３の混合物の物理的データは以下の通りである。
１Ｈ−ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ，３０℃）
７．９９（ｄ，Ｆｍｏｃ），７．７９（ｄ，Ｆｍｏｃ），７．５５（ｍ，Ｆｍｏｃ），５．１４（ｓ，Ｍａｎ４−Ｈ１），５．１２（ｓ，Ｍａｎ４−Ｈ），５．００（ｄ，ＧｌｃＮＡｃ１−Ｈ１），４．９４（ｓ，Ｍａｎ４’−Ｈ１），４．９３（ｓ，Ｍａｎ４’−Ｈ１），４．８２（ｓ，Ｍａｎ３−Ｈ１），４．６０（ｄ，ＧｌｃＮＡｃ２−Ｈ１），４．５８（ｄ，ＧｌｃＮＡｃ５，５’−Ｈ１），４．４６（ｄｄ，Ｇａｌ６，６’−Ｈ１），４．４４（ｄ，Ｇａｌ６，６’−Ｈ１），４．２４（ｄ，Ｍａｎ３−Ｈ２），４．１９（ｄ，Ｍａｎ４’−Ｈ２），４．１１（ｄ，Ｍａｎ４−Ｈ２），２．９７（ｂｄｄ，ＡｓＮ−βＣＨ），２．７２（ｄｄ，ＮｅｕＡｃ７−Ｈ３ｅｑ，ＮｅｕＡｃ７−Ｈ３ｅｑ），２．６４（ｂｄｄ，ＡｓＮ−βＣＨ），２．１５（ｓ×５，−Ａｃ），１．７９（ｄｄ，ＮｅｕＡｃ７−Ｈ３ａｘ，ＮｅｕＡｃ７’−Ｈ３ａｘ）
また、得られた化合物４の物理的データは以下の通りである。
１Ｈ−ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ，３０℃）
７．９９（２Ｈ，ｄ，Ｆｍｏｃ），７．７９（２Ｈ，ｄ，Ｆｍｏｃ），７．５５（４Ｈ，ｍ，Ｆｍｏｃ），５．１２（１Ｈ，ｓ，Ｍａｎ４−Ｈ１），５．０６（１Ｈ，ｄ，ＧｌｃＮＡｃ１−Ｈ１），４．９３（１Ｈ，ｓ，Ｍａｎ４’−Ｈ１），４．８２（１Ｈ，ｓ，Ｍａｎ３−Ｈ１），４．６９（１Ｈ，ｄ，ＧｌｃＮＡｃ２−Ｈ１），４．６７（２Ｈ，ｄ，ＧｌｃＮＡｃ５，５’−Ｈ１），４．５３（２Ｈ，ｄ，Ｇａｌ６，６’−Ｈ１），４．３４（１Ｈ，ｄ，Ｍａｎ３−Ｈ２），４．２７（１Ｈ，ｄ，Ｍａｎ４’−Ｈ２），４．１９（１Ｈ，ｄ，Ｍａｎ４−Ｈ２），３．０３（１Ｈ，ｂｄｄ，ＡｓＮ−βＣＨ），３．００（１Ｈ，ｂｄｄ，ＡｓＮ−βＣＨ），２．１５（１２Ｈ，ｓ×４，−Ａｃ）；ＨＲＭＳ Ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ８１Ｈ１２０Ｎ６ＮａＯ５０［Ｍ＋Ｎａ＋］１９９９．６９３０，ｆｏｕｎｄ，１９９９．６９３９
上記の化合物４の構造の簡略化したものを表２に示す。
参考例３ 化合物２、３の合成および単離
参考例２で得られた化合物２、３の混合物（５．０ｍｇ，２．２μｍｏｌ）を２２０μＬの水に溶解させ、２２ｍＭの炭酸セシウム水溶液を１００μＬ加え、ｐＨ７．０とした。この溶液を凍結乾燥した。乾燥後の固形物にＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミドを４３０μＬ加え、更に６．６μｍｏｌのベンジルブロマイド／Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド溶液を２０μＬ加えた。この溶液をアルゴン雰囲気下で攪拌した。４８時間後、ＴＬＣ（展開溶媒は１Ｍ ＮＨ４ＯＡｃ：イソプロパノール＝１：２を用いた）にて原料の消失を確認した後、４．４ｍＬのジエチルエーテルを加えて化合物を沈殿させた。沈殿した糖鎖を濾過し、残った糖鎖を水に溶解させ凍結乾燥した。凍結乾燥後の残留物を分取ＨＰＬＣ（ＹＭＣ Ｐａｃｋｅｄ Ｃｏｌｕｍｎ Ｄ−ＯＤＳ−５ Ｓ−５ １２０Ａ ＯＤＳ Ｎｏ．２０２０１７８、２０×２５０ｍｍ、展開溶媒は５０ｍＭ酢酸アンモニウム水溶液：アセトニトリル＝７８：２２、流速４．０ｍＬ／ｍｉｎ）で精製したところ、８８分後に化合物３が、９１分後に化合物２が溶出した。それぞれを取り分け、更にＯＤＳカラム（コスモシール７５Ｃ１８−ＯＰＮ、１５×１００ｍｍ、最初にＨ２Ｏを５０ｍＬ流し、次に２５％アセトニトリルを流して溶出させた）で脱塩したところ、目的とする化合物２のベンジル体が１．６ｍｇ、化合物３のベンジル体が１．８ｍｇ得られた。
化合物２のベンジル体（１０糖、１３．６ｍｇ、５．８ｍｍｏｌ）を、氷冷下にＮａＯＨａｑ．（ｐＨ＝１２）１．４ｍｌに溶解させた。反応をＨＰＬＣでモニターしながら約８時間撹拌した。反応の進行が終了した時点で、反応液を４０ｍＭ ＨＣｌにてｐＨ＝７．０に調整した。中和後の液を、メンブランフィルターで濾過した後、濃縮、次いでＨＰＬＣ（ＹＭＣ− Ｐａｃｋ ＯＤＳ−ＡＭ，ＳＨ−３４３−５ＡＭ，２０×２５０ｍｍ，ＡＮ／２５ｍＭ ＡｃＯＮＨ４ ｂｕｆｆｅｒ＝２０／８０，７．０ｍｌ／ｍｉｎ．，ｗａｖｅ ｌｅｎｇｔｈ；２７４ｎｍ）にて分取・精製を行った。分取した液を濃縮後、ＯＤＳカラム（コスモシール ７５Ｃ１８−ＯＰＮ，ナカライテスク社製）にて脱塩処理を行い、濃縮、凍結乾燥を行うと、目的とする化合物２（６．２ｍｇ，４７．４％）が得られた。得られた化合物の物理的データは以下の通りである。化合物２の構造の簡略化したものを表１に示す。
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ，３０℃，ＨＯＤ＝４．８１）
δ ８．００（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝７．２，Ｆｍｏｃ），７．７９（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝７．２，Ｆｍｏｃ），７．５９（ｄｄ，２Ｈ，Ｊ＝７．２，Ｆｍｏｃ），７．５３（ｄｄ，２Ｈ，Ｊ＝７．２，Ｆｍｏｃ），５．２２（ｓ，１Ｈ，Ｍａｎ４−Ｈ１），５．０９（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝９．８，ＧｌｃＮＡｃ１−Ｈ１），５．０１（ｓ，１Ｈ，Ｍａｎ４’−Ｈ−１），４．８５（ｓ，１Ｈ），４．５８−４．７５（ｍ，５Ｈ），４．５７（ｄｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．０），４．３８−４．４８（ｍ，２Ｈ），４．３３（ｓ，１Ｈ），４．２８（ｂｓ，１Ｈ，Ｍａｎ４−Ｈ２），４．１９（ｂｓ，１Ｈ），２．６４−２．８５（ｍ，３Ｈ，Ａｓｎ−βＣＨｘ２，ＮｅｕＡｃ７−Ｈ３ｅｑ），２．１６，２．１３，２．１２（ｅａｃｈｓ，１２Ｈ，Ａｃｘ４），１．９８（ｓ，３Ｈ，Ａｃ）１．８０（ｄｄ，１Ｈ，Ｊａ＝１２．０，Ｊｂ＝１２．０，ＮｅｕＡｃ７−Ｈ３ａｘ）．
化合物３のベンジル体（１０糖、５．０ｍｇ、２．１ｍｍｏｌ）を、氷冷下にＮａＯＨａｑ．（ｐＨ＝１２）２．０ｍｌに溶解させた。反応をＨＰＬＣでモニターしながら約５時間撹拌した。反応の進行が終了した時点で、反応液を４０ｍＭ ＨＣｌにてｐＨ＝７．０に調整した。中和後の液を、メンブランフィルターで濾過した後、濃縮、次いでＨＰＬＣ（ＹＭＣ− Ｐａｃｋ ＯＤＳ−ＡＭ，ＳＨ−３４３−５ＡＭ，２０×２５０ｍｍ，ＡＮ／２５ｍＭ ＡｃＯＮＨ４ ｂｕｆｆｅｒ＝２０／８０，７．０ｍｌ／ｍｉｎ．，ｗａｖｅ ｌｅｎｇｔｈ；２７４ｎｍ）にて分取・精製を行った。分取した液を濃縮後、ＯＤＳカラム（コスモシール ７５Ｃ１８−ＯＰＮ，ナカライテスク社製）にて脱塩処理を行い、濃縮、凍結乾燥を行うと、目的とする化合物３（２．５ｍｇ，５２．０％）が得られた。得られた化合物の物理的データは以下の通りである。化合物３の構造の簡略化したものを表１に示す。
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ，３０℃，ＨＯＤ＝４．８１）
δ ８．０１（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝７．６，Ｆｍｏｃ），７．８０（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝７．６，Ｆｍｏｃ），７．５９（ｄｄ，２Ｈ，Ｊ＝７．６，Ｆｍｏｃ），７．５２（ｄｄ，２Ｈ，Ｊ＝７．６，Ｆｍｏｃ），５．２１（ｓ，１Ｈ，Ｍａｎ４−Ｈ１），５．０９（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝９．５，ＧｌｃＮＡｃ１−Ｈ１），５．０３（ｓ，１Ｈ，Ｍａｎ４’−Ｈ−１），４．５８−４．７１（ｍ，５Ｈ），４．５４（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝７．５），４．４０−４．５０（ｂ，２Ｈ），４．３４（ｓ，１Ｈ），４．２８（ｂｓ，１Ｈ，Ｍａｎ４−Ｈ２），４．１９（ｂｓ，１Ｈ），２．７０−２．８５（ｍ，２Ｈ，Ａｓｎ−βＣＨ，ＮｅｕＡｃ７−Ｈ３ｅｑ），２．５５−２．７０（ｍ，１Ｈ，Ａｓｎ−βＣＨ），２．１６，２．１５，２．１３，２．１１（ｅａｃｈｓ，１２Ｈ，Ａｃｘ４），１．９８（ｓ，３Ｈ，Ａｃ）１．８０（ｄｄ，１Ｈ，Ｊａ＝１２．４，Ｊｂ＝１２．４，ＮｅｕＡｃ７−Ｈ３ａｘ）．
参考例４ 化合物５および６の合成
参考例２で得られた化合物２および３の混合物（２２４ｍｇ，９７μｍｏｌ）とウシ血清アルブミン２４ｍｇをＨＥＰＥＳ緩衝溶液（５０ｍＭ，ｐＨ６．０）２２ｍｌに溶解させ、さらにＤｉｐｌｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ由来β−ガラクトシダーゼ（１．３５Ｕ）を加えた。この溶液を３７℃で１５時間静置した後、凍結乾燥を行った。残留物をＨＰＬＣ（ＯＤＳカラム、２．０φ×２５ｃｍ、展開溶媒は５０ｍＭ酢酸アンモニウム水溶液：アセトニトリル＝８５：１５、流速３ｍｌ／ｍｉｎ）で精製したところ、１２９分後に化合物５が、１３４分後に化合物６が溶出した。それぞれを取り分け、凍結乾燥を行った。続いてＨＰＬＣ〔ＯＤＳカラム、２．０φ×２５ｃｍ、展開溶媒は最初の１５分間が水、１６分後から３０分後までは水：アセトニトリル（容量比）＝１０：０から８５：１５、３１分後から４５分後までは水：アセトニトリル＝８５：１５から８０：２０になるようにグラジエントを掛けた。流速は３．０ｍｌ／ｍｉｎ〕を用いて脱塩処理を行ったところ、目的とする化合物５が８１ｍｇ、化合物６が７５ｍｇ得られた。
なお、得られた化合物５の物理的データは以下の通りである。
１Ｈ−ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ，３０℃）
７．９９（２Ｈ，ｄ，Ｆｍｏｃ），７．７９（２Ｈ，ｄ，Ｆｍｏｃ），７．５５（４Ｈ，ｍ，Ｆｍｏｃ），５．１５（１Ｈ，Ｓ，Ｍａｎ４−Ｈ１），５．０６（１Ｈ，ｄ，ＧｌｃＮＡｃ１−Ｈ１），４．９５（１Ｈ，ｓ，Ｍａｎ４’−Ｈ１），４．８２（１Ｈ，ｓ，Ｍａｎ３−Ｈ１），４．６９（１Ｈ，ｄ，ＧｌｃＮＡｃ２−Ｈ１），４．６７（２Ｈ，ｄ，ＧｌｃＮＡｃ５，５’−Ｈ１），４．５３（１Ｈ，ｄ，Ｇａｌ６’−Ｈ１），４．３４（１Ｈ，ｄ，Ｍａｎ３−Ｈ２），４．２７（１Ｈ，ｄ，Ｍａｎ４’−Ｈ２），４．１９（１Ｈ，ｄ，Ｍａｎ４−Ｈ２），２．９７（１Ｈ，ｂｄｄ，ＡｓＮ−βＣＨ），２．７６（１Ｈ，ｄｄ，ＮｅｕＡｃ７’−Ｈ３ｅｑ），２．６１（１Ｈ，ｂｄｄ，ＡｓＮ−βＣＨ），２．１５（１５Ｈ，ｓ×５，−Ａｃ），１．７９（１Ｈ，ｄｄ，ＮｅｕＡｃ７’−Ｈ３ａｘ）；ＨＲＭＳ Ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ８６Ｈ１２７Ｎ７ＮａＯ５３［Ｍ＋Ｎａ＋］２１２８．７３５６，ｆｏｕｎｄ，２１２８．７３６３
また、得られた化合物６の物理的データは以下の通りである。
１Ｈ−ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ，３０℃）
７．９９（２Ｈ，ｄ，Ｆｍｏｃ），７．７９（２Ｈ，ｄ，Ｆｍｏｃ），７．５５（４Ｈ，ｍ，Ｆｍｏｃ），５．１５（１Ｈ，Ｓ，Ｍａｎ４−Ｈ１），５．０６（１Ｈ，ｄ，ＧｌｃＮＡｃ１−Ｈ１），４．９５（１Ｈ，ｓ，Ｍａｎ４’−Ｈ１），４．８２（１Ｈ，ｓ，Ｍａｎ３−Ｈ１），４．６９（１Ｈ，ｄ，ＧｌｃＮＡｃ２−Ｈ１），４．６７（２Ｈ，ｄ，ＧｌｃＮＡｃ５，５’−Ｈ１），４．５３（１Ｈ，ｄ，Ｇａｌ６−Ｈ１），４．３４（１Ｈ，ｄ，Ｍａｎ３−Ｈ２），４．２７（１Ｈ，ｄ，Ｍａｎ４’−Ｈ２），４．１９（１Ｈ，ｄ，Ｍａｎ４−Ｈ２），２．９７（１Ｈ，ｂｄｄ，ＡｓＮ−βＣＨ），２．７６（１Ｈ，ｄｄ，ＮｅｕＡｃ７−Ｈ３ｅｑ），２．６０（１Ｈ，ｂｄｄ，ＡｓＮ−βＣＨ），２．１５（１５Ｈ，ｓ×５，−Ａｃ），１．７９（１Ｈ，ｄｄ，ＮｅｕＡｃ７−Ｈ３ａｘ）；ＨＲＭＳ Ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ８６Ｈ１２５Ｎ７Ｎａ３Ｏ５３［Ｍ＋Ｎａ＋］２１７２．６９９５，ｆｏｕｎｄ，２１７２．７０８４
参考例５ 化合物７および８の合成
参考例４で得られた化合物５および６の混合物（９０ｍｇ，４７．３μｍｏｌ）をそれぞれ分離することなく、ウシ血清アルブミン８ｍｇと共にＨＥＰＥＳ緩衝溶液（５０ｍＭ，ｐＨ６．０）８．１ｍｌに溶解させ、さらにＢｏｖｉｎｅ ｋｉｄｎｅｙ由来β−グルコサミニダーゼ（シグマアルドリッチ社製、ｆｒｏｍ Ｂｏｖｉｎｅ ｋｉｄｎｅｙ）を２．８８Ｕ加えた。この溶液を３７℃で１８時間静置した後凍結乾燥し、残留物をＨＰＬＣ（ＯＤＳカラム、２．０φ×２５ｃｍ、展開溶媒は５０ｍＭ酢酸アンモニウム水溶液：メタノール＝６５：３５、流速３ｍｌ／ｍｉｎ）で精製したところ、１１７分後に化合物７が、１２７分後に化合物８が溶出した。それぞれを取り分け、凍結乾燥を行った。続いてＨＰＬＣ（ＯＤＳカラム、２．０φ×２５ｃｍ、展開溶媒は最初の１５分間が水、１６分後から３０分後までは水：アセトニトリル＝１０：０から８５：１５、３１分後から４５分後までは水：アセトニトリル＝８５：１５から８０：２０になるようにグラジエントを掛けた。流速は３．０ｍｌ／ｍｉｎ）を用いて脱塩処理を行ったところ、目的とする化合物７が４０ｍｇ、化合物８が３７ｍｇ得られた。
なお、得られた化合物７の物理的データは以下の通りである。
１Ｈ−ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ，３０℃）
８．０１（２Ｈ，ｄ，Ｆｍｏｃ），７．８０（２Ｈ，ｄ，Ｆｍｏｃ），７．５６（４Ｈ，ｍ，Ｆｍｏｃ），５．２２（１Ｈ，ｓ，Ｍａｎ４−Ｈ１），５．０８（１Ｈ，ｄ，ＧｌｃＮＡｃ１−Ｈ１），４．９４（１Ｈ，ｓ，Ｍａｎ４’−Ｈ１），４．８４（１Ｈ，ｓ，Ｍａｎ３−Ｈ１），４．６９（１Ｈ，ｄ，ＧｌｃＮＡｃ２−Ｈ１），４．６７（１Ｈ，ｄ，ＧｌｃＮＡｃ５−Ｈ１），４．５５（１Ｈ，ｄ，Ｇａｌ６−Ｈ１），４．３３（１Ｈ，ｄｄ，Ｍａｎ３−Ｈ２），４．２０（１Ｈ，ｄｄ，Ｍａｎ４−Ｈ２），４．１５（１Ｈ，ｄｄ，Ｍａｎ４’−Ｈ２），２．９７（１Ｈ，ｂｄｄ，ＡｓＮ−βＣＨ），２．７６（２Ｈ，ｄｄ，ＮｅｕＡｃ７，７’−Ｈ３ｅｑ），２．６２（１Ｈ，ｂｄｄ，ＡｓＮ−βＣＨ），２．１５（１２Ｈ，ｓ×４，−Ａｃ），１．７９（２Ｈ，ｄｄ，ＮｅｕＡｃ７，７’−Ｈ３ａｘ）；ＨＲＭＳ Ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ７８Ｈ１１４Ｎ６ＮａＯ４８［Ｍ＋Ｎａ＋］１９２５．６５６２，ｆｏｕｎｄ，１９２５．６５３９
また、得られた化合物８の物理的データは以下の通りである。
１Ｈ−ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ，３０℃）
７．９９（２Ｈ，ｄ，Ｆｍｏｃ），７．７９（２Ｈ，ｄ，Ｆｍｏｃ），７．５５（４Ｈ，ｍ，Ｆｍｏｃ），５．１５（１Ｈ，Ｓ，Ｍａｎ４−Ｈ１），５．０６（１Ｈ，ｄ，ＧｌｃＮＡｃ１−Ｈ１），４．９５（１Ｈ，ｓ，Ｍａｎ４’−Ｈ１），４．８２（１Ｈ，ｓ，Ｍａｎ３−Ｈ１），４．６９（１Ｈ，ｄ，ＧｌｃＮＡｃ２−Ｈ１），４．６７（２Ｈ，ｄ，ＧｌｃＮＡｃ５，５’−Ｈ１），４．５３（２Ｈ，ｄ，Ｇａｌ６，６’−Ｈ１），４．３４（１Ｈ，ｄ，Ｍａｎ３−Ｈ２），４．２７（１Ｈ，ｄ，Ｍａｎ４’−Ｈ２），２．９７（１Ｈ，ｂｄｄ，ＡｓＮ−βＣＨ２），２．７６（１Ｈ，ｄｄ，ＮｅｕＡｃ７’−Ｈ３ｅｑ），２．６１（１Ｈ，ｂｄｄ，ＡｓＮ−βＣＨ２），２．１５（１２Ｈ，ｓ×４，−Ａｃ），１．７９（１Ｈ，ｄｄ，ＮｅｕＡｃ７’−Ｈ３ａｘ）；ＨＲＭＳ Ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ７８Ｈ１１４Ｎ６ＮａＯ４８［Ｍ＋Ｎａ＋］１９２５．６５６２，ｆｏｕｎｄ，１９２５．６５３３
参考例６ 化合物９の合成
参考例５で得られた化合物７（３０ｍｇ，４７３μｍｏｌ）とウシ血清アルブミン３ｍｇをＨＥＰＥＳ緩衝溶液（５０ｍＭ，ｐＨ６．０）６ｍｌに溶解させ、さらにＪａｃｋ Ｂｅａｎｓ由来α−マンノシダーゼを１０Ｕ加えた。この溶液を３７℃で２１時間静置した後凍結乾燥し、続いてＨＰＬＣ（ＯＤＳカラム、２．０φ×２５ｃｍ、展開溶媒は最初の１５分間が水、１６分後から３０分後までは水：アセトニトリル＝１０：０から８５：１５、３１分後から４５分後までは水：アセトニトリル＝８５：１５から８０：２０になるようにグラジエントを掛けた。流速は３．０ｍｌ／ｍｉｎ）を用いて精製したところ、目的とする化合物９が２０ｍｇ得られた。
なお、得られた化合物９の物理的データは以下の通りである。
１Ｈ−ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ，３０℃）
８．０１（２Ｈ，ｄ，Ｆｍｏｃ），７．８０（２Ｈ，ｄ，Ｆｍｏｃ），７．５６（４Ｈ，ｍ，Ｆｍｏｃ），５．００（１Ｈ，ｄ，ＧｌｃＮＡｃ１−Ｈ１），４．９５（１Ｈ，ｓ，Ｍａｎ４’−Ｈ１），４．８４（１Ｈ，ｓ，Ｍａｎ３−Ｈ１），４．６７（１Ｈ，ｄ，ＧｌｃＮＡｃ２−Ｈ１），４．５６（１Ｈ，ｄ，ＧｌｃＮＡｃ５−Ｈ１），４．４４（１Ｈ，ｄ，Ｇａｌ６−Ｈ１），４．１１（１Ｈ，ｄｄ，Ｍａｎ４’−Ｈ２），４．０７（１Ｈ，ｄｄ，Ｍａｎ３−Ｈ２），２．９７（１Ｈ，ｂｄｄ，ＡｓＮ−βＣＨ），２．７６（１Ｈ，ｄｄ，ＮｅｕＡｃ７’−Ｈ３ｅｑ），２．６２（１Ｈ，ｂｄｄ，ＡｓＮ−βＣＨ），２．１５（１２Ｈ，ｓ×４，−Ａｃ），１．７９（２Ｈ，ｄｄ，ＮｅｕＡｃ７’−Ｈ３ａｘ）；ＨＲＭＳ Ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ７２Ｈ１０４Ｎ６ＮａＯ４３［Ｍ＋Ｎａ＋］１７６３．６０３４，ｆｏｕｎｄ，１７６３．６０７４
参考例７ 化合物１０の合成
参考例５で得られた化合物８（４０ｍｇ，６３０μｍｏｌ）とウシ血清アルブミン５ｇをＨＥＰＥＳ緩衝溶液（５０ｍＭ，ｐＨ６．０）７．８ｍｌに溶解させ、Ｊａｃｋ Ｂｅａｎｓ由来α−マンノシダーゼを３８Ｕ加えた。この溶液を３７℃で６３時間静置した後凍結乾燥し、続いてＨＰＬＣ（ＯＤＳカラム、２．０φ×２５ｃｍ、展開溶媒は最初の１５分間が水、１６分後から３０分後までは水：アセトニトリル＝１０：０から８５：１５、３１分後から４５分後までは８５：１５から８０：２０になるようにグラジエントを掛けた。流速は３．０ｍｌ／ｍｉｎ）を用いて精製したところ、目的とする化合物１０が３０ｍｇ得られた。
なお、得られた化合物１０の物理的データは以下の通りである。
１Ｈ−ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ，３０℃）
８．０１（２Ｈ，ｄ，Ｆｍｏｃ），７．８０（２Ｈ，ｄ，Ｆｍｏｃ），７．５６（４Ｈ，ｍ，Ｆｍｏｃ），５．２３（１Ｈ，ｓ，Ｍａｎ４−Ｈ１），５．０８（１Ｈ，ｄ，ＧｌｃＮＡｃ１−Ｈ１），４．５３（１Ｈ，ｄ，Ｇａｌ６−Ｈ１），４．３２（１Ｈ，ｄｄ，Ｍａｎ３−Ｈ２），４．２８（１Ｈ，ｄｄ，Ｍａｎ４−Ｈ２），２．８１（１Ｈ，ｂｄｄ，ＡｓＮ−βＣＨ），２．７６（１Ｈ，ｄｄ，ＮｅｕＡｃ７−Ｈ３ｅｑ），２．５９（１Ｈ，ｂｄｄ，ＡｓＮ−βＣＨ），２．１３（１２Ｈ，ｓ×４，−Ａｃ），１．８０（１Ｈ，ｄｄ，ＮｅｕＡｃ７Ｈ３ａｘ）；ＨＲＭＳ Ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ７２Ｈ１０４Ｎ６ＮａＯ４３［Ｍ＋Ｎａ＋］１７６３．６０３４，ｆｏｕｎｄ，１７６３．６０４１
参考例８ 化合物１１の合成
化合物５（２８ｍｇ，２１．３μｍｏｌ）とウシ血清アルブミン１．０ｍｇをＨＥＰＥＳ緩衝溶液（５０ｍＭ，ｐＨ５．０，４５４μＬ）に溶解させ、ノイラミニダーゼ（シグマアルドリッチ社製、ｆｒｏｍ Ｖｉｂｌｉｏ Ｃｈｏｌｅｒａｅ，１９８ｍＵ）を加えた。この溶液を３７℃で２０時間静置した後、ＨＰＬＣ分析により反応終了を確認した。反応溶液をＨＰＬＣ（ＹＭＣ Ｐａｃｋｅｄ Ｃｏｌｕｍｎ Ｄ−ＯＤＳ−５Ｓ−５ １２０Ａ ＯＤＳ Ｎｏ．２０２０１７８、２０×２５０ｍｍ、展開溶媒は５０ｍＭ酢酸アンモニウム水溶液：アセトニトリル＝８０：２０、流速４ｍＬ／ｍｉｎ）で精製した。更にＯＤＳカラム（コスモシール７５Ｃ１８−ＯＰＮ、１５×１００ｍｍ、最初にＨ２Ｏを５０ｍＬ流し、次に２５％アセトニトリルを流して溶出させた）で脱塩したところ、目的とする化合物１１（１７ｍｇ，収率７０％）が得られた。得られた化合物の物理的データは以下の通りである。
化合物１１の構造の簡略化したものを表２に示す。
１Ｈ−ＮＭＲ（３０℃）
δ ７．９１（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，Ｆｍｏｃ），７．７１（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，Ｆｍｏｃ），７．５１（ｄｄ，２Ｈ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，Ｆｍｏｃ），７．４３（ｄｄ，２Ｈ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，Ｆｍｏｃ），５．１２（ｓ，１Ｈ，Ｍａｎ４−Ｈ−１），４．９９（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝９．５Ｈｚ，ＧｌｃＮＡｃ１−Ｈ−１），４．９２（ｓ，１Ｈ，Ｍａｎ４’−Ｈ−１），４．７６（ｓ，１Ｈ，Ｍａｎ３−Ｈ−１），４．５８（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，ＧｌｃＮＡｃ２−Ｈ−１），４．５５（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，ＧｌｃＮＡｃ５’−Ｈ−１），４．４７（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．８Ｈｚ，Ｇａｌ６’−Ｈ−１），４．３４（ｔ，１Ｈ，Ｆｍｏｃ），４．２４（ｂｄ，１Ｈ，Ｊ＝１．９Ｈｚ，Ｍａｎ３−Ｈ−２），４．１８（ｂｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝１．４Ｈｚ，３．３Ｈｚ，Ｍａｎ４−Ｈ−２），４．１１（ｂｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝１．４Ｈｚ，３．５Ｈｚ，Ｍａｎ４’−Ｈ−２），２．７２（ｂｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝３．０Ｈｚ，１５．７Ｈｚ，ＡｓＮ−βＣＨ），２．５２（ｂｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．７Ｈｚ，１５．７Ｈｚ，ＡｓＮ−βＣＨ），２．０６，２．０５，２．０４，１．８９（ｅａｃｈ ｓ，ｅａｃｈ ３Ｈ，Ａｃ）；ＨＲＭＳ Ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ７５Ｈ１１０Ｎ６ＮａＯ４５［Ｍ＋Ｎａ＋］１８３７．６４０２，ｆｏｕｎｄ １８３７．６４７１
参考例９ 化合物１２の合成
化合物６（２０ｍｇ，９．４μｍｏｌ）とウシ血清アルブミン１．６ｍｇをＨＥＰＥＳ緩衝溶液（５０ｍＭ，ｐＨ５．０，３２３μＬ）に溶解させ、ノイラミニダーゼ（シグマアルドリッチ社製、ｆｒｏｍ Ｖｉｂｌｉｏ Ｃｈｏｌｅｒａｅ，１４１ｍＵ）を加えた。この溶液を３７℃で１８時間静置した後、ＨＰＬＣ分析により反応終了を確認した。続いてＨＰＬＣ（ＹＭＣ Ｐａｃｋｅｄ Ｃｏｌｕｍｎ Ｄ−ＯＤＳ−５ Ｓ−５ １２０Ａ ＯＤＳ Ｎｏ．２０２０１７８、２０×２５０ｍｍ、展開溶媒は５０ｍＭ酢酸アンモニウム水溶液：アセトニトリル＝８０：２０、流速４ｍＬ／ｍｉｎ）で精製した。更にＯＤＳカラム（コスモシール７５Ｃ１８−ＯＰＮ、１５×１００ｍｍ、最初にＨ２Ｏを５０ｍＬ流し、次に２５％アセトニトリルを流して溶出させた）で脱塩したところ、目的とする化合物１２（１３ｍｇ，収率７６％）を得た。得られた化合物の構造は１Ｈ−ＮＭＲが標品と一致したことから確認した。
化合物１２の構造の簡略化したものを表２に示す。
参考例１０ 化合物１３の合成
化合物７（４５ｍｇ，２４μｍｏｌ）とウシ血清アルブミン１．７ｍｇをＨＥＰＥＳ緩衝溶液（５０ｍＭ，ｐＨ５．０，８２０μＬ）に溶解させ、ノイラミニダーゼ（シグマアルドリッチ社製、ｆｒｏｍ Ｖｉｂｌｉｏ Ｃｈｏｌｅｒａｅ，１３４ｍＵ）を加えた。この溶液を３７℃で１４時間静置した後、ＨＰＬＣ分析により反応終了を確認した。続いて、反応溶液をＨＰＬＣ（ＹＭＣ Ｐａｃｋｅｄ Ｃｏｌｕｍｎ Ｄ−ＯＤＳ−５ Ｓ−５ １２０Ａ ＯＤＳ Ｎｏ．２０２０１７８、２０×２５０ｍｍ、展開溶媒は５０ｍＭ酢酸アンモニウム水溶液：アセトニトリル＝８０：２０、流速４ｍＬ／ｍｉｎ）で精製した。更にＯＤＳカラム（コスモシール７５Ｃ１８−ＯＰＮ、１５×１００ｍｍ、最初にＨ２Ｏを５０ｍＬ流し、次に２５％アセトニトリルを流して溶出させた）で脱塩したところ、目的とする化合物１３（２８ｍｇ，収率７４％）が得られた。得られた化合物の物理的データは以下の通りである。
化合物１３の構造の簡略化したものを表２に示す。
１Ｈ−ＮＭＲ（３０℃）
δ ７．９２（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，Ｆｍｏｃ），７．７１（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，Ｆｍｏｃ），７．５１（ｄｄ，２Ｈ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，Ｆｍｏｃ），７．４４（ｄｄ，２Ｈ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，Ｆｍｏｃ），５．１０（ｓ，１Ｈ，Ｍａｎ４−Ｈ−１），４．９９（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝９．５Ｈｚ，ＧｌｃＮＡｃ１−Ｈ−１），４．９２（ｓ，１Ｈ，Ｍａｎ４’−Ｈ−１），４．７６（ｓ，１Ｈ，Ｍａｎ３−Ｈ−１），４．５８（ｄ，２Ｈ，ＧｌｃＮＡｃ２，５’−Ｈ−１），４．４７（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，Ｇａｌ６’−Ｈ−１），４．３５（ｔ，１Ｈ，Ｆｍｏｃ），４．２４（ｂｄ，１Ｈ，Ｊ＝１．９Ｈｚ，Ｍａｎ３−Ｈ−２），４．１１（ｂｓ，１Ｈ，Ｍａｎ４’−Ｈ−２），４．０７（ｂｓ，１Ｈ，Ｍａｎ４−Ｈ−２），２．７２（ｂｄ，１Ｈ，Ｊ＝１５．５Ｈｚ，ＡｓＮ−βＣＨ），２．５２（ｂｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．７Ｈｚ，１５．５Ｈｚ，ＡｓＮ−βＣＨ），２．０６，２．０４，１．８９（ｅａｃｈ ｓ，ｅａｃｈ ３Ｈ，Ａｃ）；ＨＲＭＳ Ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ６７Ｈ９７Ｎ５ＮａＯ４０［Ｍ＋Ｎａ＋ １６３４．５６０８，ｆｏｕｎｄ，１６３４．５５６４
参考例１１ 化合物１４の合成
化合物８（４７ｍｇ，２５μｍｏｌ）とウシ血清アルブミン１．９ｍｇをＨＥＰＥＳ緩衝溶液（５０ｍＭ，ｐＨ５．０，８４０μＬ）に溶解させ、ノイラミニダーゼ（シグマアルドリッチ社製、ｆｒｏｍ Ｖｉｂｌｉｏ Ｃｈｏｌｅｒａｅ，３６９ｍＵ）を加えた。この溶液を３７℃で３７時間静置した後、ＨＰＬＣ分析により反応終了を確認した。反応溶液を凍結乾燥し、続いてＨＰＬＣ（ＹＭＣ Ｐａｃｋｅｄ Ｃｏｌｕｍｎ Ｄ−ＯＤＳ−５ Ｓ−５ １２０Ａ ＯＤＳ Ｎｏ．２０２０１７８、２０×２５０ｍｍ、展開溶媒は５０ｍＭ酢酸アンモニウム水溶液：アセトニトリル＝８０：２０、流速４ｍＬ／ｍｉｎ）で精製した。更にＯＤＳカラム（コスモシール７５Ｃ１８−ＯＰＮ、１５×１００ｍｍ、最初にＨ２Ｏを５０ｍＬ流し、次に２５％アセトニトリルを流して溶出させた）で脱塩したところ、目的とする化合物１４（２６ｍｇ，収率６５％）を得た。得られた化合物の物理的データは以下の通りである。
化合物１４の構造の簡略化したものを表２に示す。
１Ｈ−ＮＭＲ（３０℃）
δ ７．９２（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，Ｆｍｏｃ），７．７１（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，Ｆｍｏｃ），７．５１（ｄｄ，２Ｈ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，Ｆｍｏｃ），７．４３（ｄｄ，２Ｈ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，Ｆｍｏｃ），５．１２（ｓ，１Ｈ，Ｍａｎ４−Ｈ−１），４．９９（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝９．４Ｈｚ，ＧｌｃＮＡｃ１−Ｈ−１），４．９１（ｓ，１Ｈ，Ｍａｎ４’−Ｈ−１），４．７７（ｓ，１Ｈ，Ｍａｎ３−Ｈ−１），４．５７（ｂｄ，２Ｈ，ＧｌｃＮＡｃ２，５’−Ｈ−１），４．４６（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，Ｇａｌ６’−Ｈ−１），４．３４（ｔ，３Ｈ，Ｆｍｏｃ），４．２４（ｂｓ，１Ｈ，Ｍａｎ４’−Ｈ−２），４．１９（ｂｓ，１Ｈ，Ｍａｎ４−Ｈ−２），２．７２（ｂｄ，１Ｈ，Ｊ＝１５．５Ｈｚ，ＡｓＮ−βＣＨ），２．５２（ｂｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝９．２Ｈｚ，１５．５Ｈｚ，ＡｓＮ−βＣＨ），２．０６，２．０５，１．８９（ｅａｃｈ ｓ，ｅａｃｈ ３Ｈ，Ａｃ）；ＨＲＭＳ Ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ６７Ｈ９７Ｎ５ＮａＯ４０［Ｍ＋Ｎａ＋］１６３４．５６０８，ｆｏｕｎｄ，１６３４．５６４４
参考例１２ 化合物１５の合成
化合物９（３２ｍｇ，１８．４μｍｏｌ）とウシ血清アルブミン２．５ｍｇをＨＥＰＥＳ緩衝溶液（５０ｍＭ，ｐＨ５．０，７１３μＬ）に溶解させ、ノイラミニダーゼ（シグマアルドリッチ社製、ｆｒｏｍ Ｖｉｂｌｉｏ Ｃｈｏｌｅｒａｅ，１３４ｍＵ）を加えた。この溶液を３７℃で１７時間静置した後、ＨＰＬＣ分析により反応終了を確認した。続いて、反応溶液をＨＰＬＣ（ＹＭＣ Ｐａｃｋｅｄ Ｃｏｌｕｍｎ Ｄ−ＯＤＳ−５ Ｓ−５ １２０Ａ ＯＤＳ Ｎｏ．２０２０１７８、２０×２５０ｍｍ、展開溶媒は５０ｍＭ酢酸アンモニウム水溶液：アセトニトリル＝８０：２０、流速４ｍＬ／ｍｉｎ）で精製した。更にＯＤＳカラム（コスモシール７５Ｃ１８−ＯＰＮ、１５×１００ｍｍ、最初にＨ２Ｏを５０ｍＬ流し、次に２５％アセトニトリルを流して溶出させた）で脱塩したところ、目的とする化合物１５（１３ｍｇ，収率５２％）が得られた。得られた化合物の物理的データは以下の通りである。
化合物１５の構造の簡略化したものを表２に示す。
１Ｈ−ＮＭＲ（３０℃）
δ ７．９２（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，Ｆｍｏｃ），７．７１（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，Ｆｍｏｃ），７．５１（ｄｄ，２Ｈ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，Ｆｍｏｃ），７．４４（ｄｄ，２Ｈ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，Ｆｍｏｃ），５．００（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝９．９Ｈｚ，ＧｌｃＮＡｃ１−Ｈ−１），４．９２（ｓ，１Ｈ，Ｍａｎ４’−Ｈ−１），４．７５（ｓ，１Ｈ，Ｍａｎ３−Ｈ−１），４．５８（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，ＧｌｃＮＡｃ２，５’−Ｈ−１），４．４７（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．８Ｈｚ，Ｇａｌ６’−Ｈ−１），４．３４（ｔ，１Ｈ，Ｆｍｏｃ），４．１０（ｂｄ，１Ｈ，Ｍａｎ３−Ｈ−２），４．０７（ｂｓ，１Ｈ，Ｍａｎ４’−Ｈ−２），２．７２（ｂｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝１５．５Ｈｚ，ＡｓＮ−βＣＨ），２．５２（ｂｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝９．２Ｈｚ，１５．５Ｈｚ，ＡｓＮ−βＣＨ），２．０７，２．０５，１．８９（ｅａｃｈ ｓ，ｅａｃｈ ３Ｈ，Ａｃ）；ＭＳ（Ｆａｂ），Ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ６１Ｈ８８Ｎ５Ｏ３５［Ｍ＋Ｈ＋］１４５０．５，ｆｏｕｎｄ，１４５０．３
参考例１３ 化合物１６の合成
化合物１０（２８ｍｇ，１６μｍｏｌ）とウシ血清アルブミン１．７ｍｇをＨＥＰＥＳ緩衝溶液（５０ｍＭ，ｐＨ５．０，６２４μＬ）に溶解させ、ノイラミニダーゼ（シグマアルドリッチ社製、ｆｒｏｍ Ｖｉｂｌｉｏ Ｃｈｏｌｅｒａｅ，１１７ｍＵ）を加えた。この溶液を３７℃で１７時間静置した後、ＨＰＬＣ分析により反応終了を確認した。続いて、反応溶液をＨＰＬＣ（ＹＭＣ Ｐａｃｋｅｄ Ｃｏｌｕｍｎ Ｄ−ＯＤＳ−５ Ｓ−５ １２０Ａ ＯＤＳ Ｎｏ．２０２０１７８、２０×２５０ｍｍ、展開溶媒は５０ｍＭ酢酸アンモニウム水溶液：アセトニトリル＝８０：２０、流速４ｍＬ／ｍｉｎ）で精製した。更にＯＤＳカラム（コスモシール７５Ｃ１８−ＯＰＮ、１５×１００ｍｍ。最初にＨ２Ｏを５０ｍＬ流し、次に２５％アセトニトリルを流して溶出させた）で脱塩したところ、目的とする化合物１６（１４．６ｍｇ，収率６８％）が得られた。得られた化合物の物理的データは以下の通りである。
化合物１６の構造の簡略化したものを表２に示す。
１Ｈ−ＮＭＲ（３０℃）
δ ７．９２（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，Ｆｍｏｃ），７．７１（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，Ｆｍｏｃ），７．５０（ｄｄ，２Ｈ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，Ｆｍｏｃ），７．４３（ｄｄ，２Ｈ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，Ｆｍｏｃ），５．１２（ｓ，１Ｈ，Ｍａｎ４−Ｈ−１），４．９９（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝９．５Ｈｚ，ＧｌｃＮＡｃ１−Ｈ−１），４．７７（ｓ，１Ｈ，Ｍａｎ３−Ｈ−１），４．５７（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，ＧｌｃＮＡｃ２−Ｈ−１），４．４６（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．８Ｈｚ，Ｇａｌ６−Ｈ−１），４．３４（ｔ，１Ｈ，Ｆｍｏｃ），４．２２（ｂｄ，１Ｈ，Ｊ＝２．７Ｈｚ，Ｍａｎ３−Ｈ−２），４．１９（ｂ，１Ｈ，Ｍａｎ４−Ｈ−２），２．７２（ｂｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝１５．５Ｈｚ，ＡｓＮ−βＣＨ），２．５２（ｂｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝９．８Ｈｚ，１５．５Ｈｚ，ＡｓＮ−βＣＨ），２．０５（ｓ，６Ｈ，Ａｃ×２），１．８９（ｓ，３Ｈ，Ａｃ）；ＭＳ（Ｆａｂ），Ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ６１Ｈ８８Ｎ５Ｏ３５［Ｍ＋Ｈ＋］１４５０．５，ｆｏｕｎｄ，１４５０．３
参考例１４ （５−アセタミド−３，５，７−トリデオキシ−７−フルオロ−Ｄ−グリセロ−β−Ｄ−ラクト−２−ノヌロピラノシドニック アシッド（７−フルオロシアル酸）
５−Ａｃｅｔａｍｉｄｅ−３，５，７−ｔｒｉｄｅｏｘｙ−７−ｆｌｕｏｒｏ−Ｄ−ｇｌｙｃｅｒｏ−β−Ｄ−ｇａｌａｃｔｏ−２−ｎｏｎｕｌｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｏｎｉｃ ａｃｉｄ ２５の合成）
（１）化合物１７の合成
無水酢酸（６０ｍｌ）に酢酸ナトリウム（５ｇ，６９ｍｍｏｌ）を溶かし、加熱した後にＤ−ガラクトース（Ｇ）（１０ｇ，５５ｍｍｏｌ）を少しずつ加える。２時間加熱還流した後ＴＬＣ（トルエン：酢酸エチル＝５：１）にて反応が終了したことを確認した。反応溶液を室温に戻した後に、氷水３００ｃｃに注ぐ。ろ過して沈殿物を集める。沈殿物をエタノール（１４ｍｌ）の溶かし再結晶を行い、化合物１７を９．０ｇ（収率４１％）得た。
（２）化合物１８の合成
化合物１７（４．３ｇ，１１ｍｍｏｌ）を塩化メチレン（１２０ｍｌ）の溶かした後、アルゴン気流下−２０℃まで冷却した。続いて、反応溶液に四塩化スズ（３．１ｇ，１２ｍｍｏｌ）を加え２０分撹拌した後、ベンジルアルコール（２．３ｇ，２２ｍｍｏｌ）を加え反応温度を室温に戻した。ＴＬＣ（ヘキサン：酢酸エチル＝１：１）で反応終了を確認後、反応溶液を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液に注ぎ、塩化メチレンで抽出した。塩化メチレン層を無水硫酸マグネシウムで乾燥後、ろ過、減圧濃縮した。残渣をデシケータで乾燥後、蒸留したメタノール（８０ｍｌ）に溶かしナトリウムメトキシド（４３１ｍｇ，５．５ｍｍｏｌ）を加えアルゴン気流下撹拌した。ＴＬＣ（酢酸エチル：メタノール：水＝１０：５：１）で反応終了を確認した後、陽イオン交換樹脂ＩＲ−１２０（＋）で中和し反応を終了させた。樹脂をろ過して取り除いた後、濾液を減圧濃縮した。残渣をデシケータで乾燥後、ピリジン（４４ｍｌ）に溶かし、反応溶液を０℃に冷却した。反応溶液にトリメチルアセチルクロリド（４．６ｇ，３８．５ｍｍｏｌ）を加えた後、室温に戻しアルゴン気流下１時間撹拌した。反応終了をＴＬＣ（ヘキサン：酢酸エチル＝２：１）で確認し０℃に冷却後メタノールを加え反応を終了させた。反応溶液をそのまま減圧濃縮した後、残渣を酢酸エチルに溶かし飽和食塩水溶液、水で洗浄し無水硫酸マグネシウムで酢酸エチルを乾燥させた。硫酸マグネシウムをろ過して取り除いた後、濾液を減圧濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（展開溶媒ヘキサン：酢酸エチル＝２：１）で精製し化合物１８（２．８ｇ，収率５８％）を得た。
（３）化合物１９の合成
化合物１８（２００ｍｇ，０．４５５ｍｍｏｌ）をジクロロメタン（７．８ｍｌ）とピリジン（１．３ｍｌ）に溶かし、無水クロロ酢酸（１５５ｍｇ，０．９１ｍｍｏｌ）を加えて、アルゴン気流下−１５℃で攪拌しながら１５分間反応させた。反応終了を確認後、メタノール（５ｍｌ）で無水クロロ酢酸をクエンチし、トルエンで３回共沸しながら減圧濃縮した。残渣を酢酸エチルで抽出し、飽和食塩水で洗浄した。有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥させ、濾過後濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル：ヘキサン＝１：４）で精製し、化合物１９（収量１７２ｍｇ，収率７３．５％）を得た。
１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）
δ ７．３７−７．２９（ｍ，５Ｈ，Ｐｈ），５．３９（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ１，２＝８．０Ｈｚ，Ｊ２，３＝１０．４Ｈｚ，Ｈ−２），４．８９（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ３，４＝３．４Ｈｚ，Ｈ−３），４．８９，４．６２（２ｄ，２Ｈ，Ｊ＝１２．５Ｈｚ，ＯＣＨ２Ｐｈ），４．５３（ｄ，１Ｈ，Ｈ−１），４．３７（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ６ａ，６ｂ＝１１．５Ｈｚ，Ｊ６ａ，５＝６．０Ｈｚ，Ｈ−６ａ），４．３２（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ６ｂ，５＝６．６Ｈｚ，Ｈ−６ｂ），４．００（ｍ，１Ｈ，Ｈ−４），３．９２（ｓ，２Ｈ，ＣＯＣＨ２Ｃｌ），３．７５（ｄｄ，１Ｈ，Ｈ−５），１．２３，１．１９〔２ｓ，１８Ｈ，ＣＯＣ（ＣＨ３）３〕
１３Ｃ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）
δ １７８．３３，１７７．５７，１６５．９２，（Ｃ＝Ｏ），１３６．６６，１２８．４８，１２８．０７，１２７．８９（Ｐｈ），９９．１６（Ｃ−１），７２．８２（Ｃ−３），７２．３５（Ｃ−５），７０．９２（Ｃ−２），７０．４９（ＯＣＨ２Ｐｈ），６７．２９（Ｃ−４），６２．３０（Ｃ−６），４０．４０（ＣＯＣＨ２Ｃｌ），３８．９５，３８．８０〔ＣＯＣ（ＣＨ３）３〕，２７．１４，２６．９８〔ＣＯＣ（ＣＨ３）３〕
１Ｈ−ＮＭＲ、１３Ｃ−ＮＭＲはＢｒｕｋｅｒのＡＶＡＮＣＥ ４００（４００ＭＨｚと表記）で測定した。溶媒が重クロロホルムの時は内部標準としてトリメチルシランを用いた。その他の重溶媒を用いたときは溶媒ピークを基準とした。化学シフトは、δ（ｐｐｍ）で、結合定数はＪ（Ｈｚ）示した。シリカゲルカラムクロマトグラフィーには、Ｍｅｒｃｋ Ｓｉｌｉｃａｇｅｌ６０，７０−２３０ｍｅｓｈ又は２３０−４００ｍｅｓｈを、球状シリカゲルは関東化学社製のＳｉｌｉｃａ Ｇｅｌ ６０（Ｓｐｈｅｒｉｃａｌ）を、反応検出用（以下ＴＬＣ）としてはＥ．Ｍｅｒｋ社製ＤＣ−Ｐｌａｔｔｅｎ Ｋｉｅｓｅｌｇｅｌ ６０Ｆ２５４（Ａｒｔ１，０５７１５）を使用した。高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）のカラムはナカライテスク社製 ＣＯＳＭＯＳＩＬ ５Ｃ１８−ＡＲ Ｐａｃｋｅｄ Ｃｏｌｕｍｎ（φ４．６×１５０ｍｍ），を使用し、分光蛍光光度計は、ＪＡＳＣＯ社製のＦＰ−２１０ Ｓｐｅｃｔｒｏｆｌｕｏｒｏｍｅｔｅｒを用いた。
（４）化合物２０の合成
化合物１９（３００ｍｇ，０．５８３ｍｍｏｌ）をジクロロメタン（５．８ｍｌ）に溶かし、アルゴン気流下−１５℃で攪拌しながらジエチルアミノスルファートリフルオリド（ＤＡＳＴ）を加えた。ＤＡＳＴを加え１０分後室温に戻し１時間反応させた。ＴＬＣで原料消失を確認し、メタノール（３ｍｌ）でＤＡＳＴをクエンチ後減圧濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル：ヘキサン＝１：６）で精製し化合物２０（収量２１１ｍｇ、収率７０％）を得た。
１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）
δ ７．３７−７．２７（ｍ，５Ｈ，Ｐｈ），５．３１（ｄｄｄ，１Ｈ，Ｊ３，Ｆ＝１４．３Ｈｚ，Ｊ３，４＝９．６９Ｈｚ，Ｊ２，３＝９．６３Ｈｚ，Ｈ−３），５．０４（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ１，２＝７．９３Ｈｚ，Ｈ−２），４．８６（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１２．２Ｈｚ，ＯＣＨ２Ｐｈ），４．６０（ｄ，１Ｈ，Ｈ−１），４．５９（ｄ，１Ｈ，ＯＣＨ２Ｐｈ），４．４４（ｄｄｄ，１Ｈ，Ｊ４，５＝９．０４Ｈｚ，Ｊ４，Ｆ＝５０．６Ｈｚ，Ｈ−４），４．４３（ｄｄｄ，１Ｈ，Ｊ６ａ，６ｂ＝１２．１Ｈｚ，Ｊ６ａ，５＝２．４１Ｈｚ，Ｊ６ａ，Ｆ＝２．２３Ｈｚ，Ｈ−６ａ），４．２４（ｄｄｄ，１Ｈ，Ｊ６ｂ，５＝５．６７Ｈｚ，Ｊ６ｂ，Ｆ＝１．２８Ｈｚ，Ｈ−６ｂ），３．９３（ｓ，２Ｈ，ＯＣＯＣＨ２Ｃｌ），３．７５（ｍ，１Ｈ，Ｈ−５），１．２５，１．１８〔２ｓ，１８Ｈ，ＯＣＯＣ（ＣＨ３）３〕
１３Ｃ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）
δ １７７．９４，１１７．４３，１６５．８８（Ｃ＝Ｏ），１３６．３４，１２８．５５，１３８．２３，１２７．９２（Ｐｈ），９８．６８（Ｃ−１），８７．３５（ｄ，Ｊ４，Ｆ＝１８８．６２Ｈｚ，Ｃ−４），７２．６５（ｄ，Ｊ２，Ｆ＝７．９６Ｈｚ，Ｃ−２），７２．０５（ｄ，Ｊ３，Ｆ＝２０．０２Ｈｚ，Ｃ−３），７１．４９（ｄ，Ｊ５，Ｆ＝２３．０９Ｈｚ，Ｃ−５），７０．８０（ＯＣＨ２Ｐｈ），６２．１２（Ｃ−６），４０．３０（ＯＣＯＣＨ２Ｃｌ），３８．８７〔ＯＣＯＣ（ＣＨ３）３〕，２７．１７，２６．９２〔ＯＣＯＣ（ＣＨ３）３〕
（５）化合物２１の合成
化合物２０（６２５ｍｇ，１．２１ｍｍｏｌ）をメタノール（２４．２ｍｌ）に溶かし、アルゴン気流下−１５℃で攪拌しながら、ナトリウムメトキシド（１３．１ｍｇ，０．６ｍｍｏｌ）を加えた。３０分後ＴＬＣで原料消失を確認後陽イオン交換樹脂ＩＲ−１２０（＋）で中和（ｐＨ６−７）し、樹脂を濾過後減圧濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル：ヘキサン＝１：４）で精製し化合物２１（収量３９５ｍｇ，収率７４％）を得た。
１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）
δ ７．３８−７．２９（ｍ，５Ｈ，Ｐｈ），５．１８（ｄｄｄ，１Ｈ，Ｊ３，Ｆ＝１４．８Ｈｚ，Ｊ３，４＝９．５１Ｈｚ，Ｊ２，３＝８．９９Ｈｚ，Ｈ−３），４．９０（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１１．７，ＯＣＨ２Ｐｈ），４．６３（ｄ，１Ｈ，ＯＣＨ２Ｐｈ），４．４７（ｄｄｄ，１Ｈ，Ｊ５，６ａ＝２．４３Ｈｚ，Ｊ６ａ，Ｆ＝２．２Ｈｚ，Ｈ−６ａ），４．４７（ｄ，１Ｈ，Ｊ１，２＝７．７Ｈｚ，Ｈ−１），４．３８（ｄｄｄ，１Ｈ，Ｊ４，５＝８．９６Ｈｚ，Ｊ３，４＝９．６７Ｈｚ，Ｊ４，Ｆ＝５０．８Ｈｚ，Ｈ−４），４．２３（ｄｄｄ，１Ｈ，Ｊ６ａ，６ｂ＝１２．０Ｈｚ，Ｊ６ｂ，５＝６．０５Ｈｚ，Ｊ６ｂ，Ｆ＝１．２６Ｈｚ，Ｈ−６ｂ），３．７５（ｍ，１Ｈ，Ｈ−５），３．５４（ｍ，１Ｈ，Ｊ２，ＯＨ＝２．７０Ｈｚ，Ｈ−２），１．２７，１．２６〔２ｓ，１８Ｈ，ＯＣＯＣ（ＣＨ３）３〕
１３Ｃ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）
δ １７８．１７，１７７．９４（Ｃ＝Ｏ），１３６．５４，１２８．５４，１２８．１７，１２８．１２（Ｐｈ），１０１．３１（Ｃ−１），８７．４５（ｄ，Ｊ４，Ｆ＝１８７．３９Ｈｚ，Ｃ−４），７４．１７（ｄ，Ｊ３，Ｆ＝１８．８８Ｈｚ，Ｃ−３），７２．４５（ｄ，Ｊ２，Ｆ＝７．５６Ｈｚ，Ｃ−２），７１．４５（ｄ，Ｊ５，Ｆ＝２３．２６Ｈｚ，Ｃ−５），７１．０９（ＯＣＨ２Ｐｈ），６２．４４（Ｃ−６），３８．９０，３８．８５〔ＯＣＯＣ（ＣＨ３）３〕，２７．１４，２６．９９〔ＯＣＯＣ（ＣＨ３）３〕
（６）化合物２２の合成
ピリジン（２２．２μｌ，０．２７４ｍｍｏｌ）を溶かしたジクロロメタン（３７０μｌ）溶液に０℃で無水トリフルオロメタンスルフォン酸（４６μｌ，０．２７４ｍｍｏｌ）を滴下し、１５分後、化合物２１をジクロロメタン（１ｍｌ）に溶かしたものを０℃で滴下した。ＴＬＣで原料消失を確認し、反応混合物をジクロロメタンで希釈した。有機層を飽和重曹水、飽和食塩水、水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥後濃縮した。残渣を真空ポンプでさらに乾燥後ベンゼン（１ｍｌ）に溶かし、アルゴン気流下室温でアジ化ナトリウム（１３ｍｇ，０．２０６ｍｍｏｌ）、テトラアンモニウムクロライド（５７ｍｇ，０．２０６ｍｍｏｌ）を加え４０℃で反応させた。２時間後ＴＬＣで原料消失を確認後減圧濃縮した。残渣を酢酸エチルで抽出し、飽和食塩水、水で洗浄し無水硫酸マグネシウムで乾燥後濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル：ヘキサン＝１：４）で精製して化合物２２（収量３０．４ｍｇ，収率９５％）を得た。
１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）
δ ７．３９−７．３２（ｍ，５Ｈ，Ｐｈ），４．９９（ｄｄｄ，１Ｈ，Ｊ３，Ｆ＝１３．１８Ｈｚ，Ｊ３，４＝９．２７Ｈｚ，Ｊ２，３＝３．８７Ｈｚ，Ｈ−３），４．９３（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１２．０７Ｈｚ，ＯＣＨ２Ｐｈ），４．６７（ｄ，１Ｈ，Ｊ１，２＝１．１８Ｈｚ，Ｈ−１），４．６３（ｄ，１Ｈ，ＯＣＨ２Ｐｈ），４．５１（ｄｄｄ，１Ｈ，Ｊ６ａ，６ｂ＝１１．９５Ｈｚ，Ｊ６ａ，５＝２．５４Ｈｚ，Ｊ６ａ，Ｆ＝２．０８Ｈｚ，Ｈ−６ａ），４．２３（ｄｄｄ，１Ｈ，Ｊ６ｂ，５＝６．１４Ｈｚ，Ｊ６ｂ，Ｆ＝１．１４Ｈｚ，Ｈ−６ｂ），４．０８（ｍ，１Ｈ，Ｈ−２），３．６４（ｍ，１Ｈ，Ｈ−５），１．２６〔２ｓ，１８Ｈ，ＯＣＯＣ（ＣＨ３）３〕
１３Ｃ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）
δ １７８．０１，１７７．６８（Ｃ＝Ｏ），１３６．０６，１２８．６３，１２８．３１，１２８．１４（Ｐｈ），９７．２５（Ｃ−１），８５．５１（ｄ，Ｊ４，Ｆ＝１８３．９７，Ｃ−４），７２．０１（ｄ，Ｊ５，Ｆ＝２３．８９，Ｃ−５），７１．７３（ｄ，Ｊ３，Ｆ＝１８．９８，Ｃ−３）
７０．５７（ＯＣＨ２Ｐｈ），６２．４２（Ｃ−２，Ｃ−６），３９．０８，３８．９０〔ＯＣＯＣ（ＣＨ３）３〕，２７．１８，２６．９５〔ＯＣＯＣ（ＣＨ３）３〕
（７）化合物２３の合成
化合物２２（１８０ｍｇ，０．３８７ｍｍｏｌ）をメタノール（８ｍｌ）に溶かしナトリウムメトキシド（９２２ｍｇ，９．６７ｍｍｏｌ）を加え攪拌し４０℃で反応させた。４．５時間後ＴＬＣで１スポットにまとまったことを確認し陽イオン交換樹脂ＩＲ−１２０（＋）で中和後、濾過し濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル：ヘキサン＝１：１）で精製し化合物２３（収量１０５．３ｍｇ，収率９１．６％）を得た。
１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３），
δ ７．４０−７．３１（ｍ，５Ｈ，Ｐｈ），４．９６（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１２．１３Ｈｚ，ＯＣＨ２Ｐｈ），４．７１（ｄ，１Ｈ，Ｊ１，２＝１．３３Ｈｚ，Ｈ−１），４．６９（ｄ，１Ｈ，ＯＣＨ２Ｐｈ），４．４９（ｄｄｄ，１Ｈ，Ｊ４，Ｆ＝５１．０６Ｈｚ，Ｊ４，５＝９．１９Ｈｚ，Ｊ３，４＝９．２０Ｈｚ，Ｈ−４），４．０２（ｍ，１Ｈ，Ｈ−２），３．９３（ｄｄｄｄ，１Ｈ，Ｊ６ａ，６ｂ＝１２．１９Ｈｚ，Ｊ６ａ，５＝２．３１Ｈｚ，Ｊ６ａ，Ｆ＝２．３２Ｈｚ，Ｊ６ａ，ＯＨ＝６．２０Ｈｚ，Ｈ−６ａ），３．８９−３．７７（ｍ，２Ｈ，Ｈ−３，Ｈ−６ｂ），３．３９（ｍ，１Ｈ，Ｈ−５），
１３Ｃ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３），
δ １３６．３９，１２８．６２，１２８．２４，１２７．８３（Ｐｈ），９８．６３（Ｃ−１），８８．１９（ｄ，Ｊ４，Ｆ＝１７８．９１Ｈｚ，Ｃ−４），７３．９５（ｄ，Ｊ５，Ｆ＝２５．４８Ｈｚ，Ｃ−５），７１．１８（ＯＣＨ２Ｐｈ），７１．１６（ｄ，Ｊ３，Ｆ＝１９．６９Ｈｚ，Ｃ−３），６４．４８（ｄ，Ｊ２，Ｆ＝８．４２Ｈｚ，Ｃ−２），６１．３９（Ｃ−６）
（８）化合物２４の合成
化合物２３（１０５ｍｇ，０．３５３ｍｍｏｌ）をメタノール（７ｍｌ）に溶かし無水酢酸（３３３μｌ，３．５３ｍｏｌ）を加えた後、アルゴン気流下で触媒量の１０％ Ｐｄ／Ｃを加え水素置換してから室温で攪拌した。２時間後ＴＬＣで原料消失を確認し、活性炭濾過後濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル：メタノール＝５：１）で精製し化合物２４（収量５７ｍｇ，収率７２％）を得た。
１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ），
δ ５．２３（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ１，２＝２．６９Ｈｚ，Ｊ１，Ｆ＝１．４４Ｈｚ，Ｈ−１−α），４．６５（ｄｄｄ，１Ｈ，Ｊ４，Ｆ＝５０．９４Ｈｚ，Ｊ３，４＝９．０６Ｈｚ，Ｊ４，５＝９．５８Ｈｚ，Ｈ−４−α），４．４７（ｍ，１Ｈ，Ｈ−２−α），４．４３（ｄｄｄ，１Ｈ，Ｊ３，Ｆ＝１４．２８Ｈｚ，Ｊ２，３＝４．９Ｈｚ，Ｈ−３−α），４．１６（ｍ，１Ｈ，Ｈ−５−α），３．９５（ｍ，２Ｈ，Ｈ−６ａ−α，Ｈ−６ｂ−α），２．１４（ｓ，３Ｈ，ＮＨＣＯＣＨ３−α）
１３Ｃ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ），
δ １７５．２７（Ｃ＝Ｏ−α），９３．４６（Ｃ−１−α），８８．３０（ｄ，Ｊ４，Ｆ＝１７７．００Ｈｚ，Ｃ−４−α），６９．９１（ｄ，Ｊ５，Ｆ＝２４．４１Ｈｚ，Ｃ−５−α），６７．６０（ｄ，Ｊ３，Ｆ＝１８．７４Ｈｚ，Ｃ−３−α），６０．３６（Ｃ−６），５４．１２（ｄ，Ｊ２，Ｆ＝８．６８Ｈｚ，Ｃ−２−α），２２．３１（ＮＨＣＯＣＨ３−α）
（９）化合物２５の合成
化合物２４（５０ｍｇ，０．２２４ｍｍｏｌ）ピルビン酸ナトリウム（１２３ｍｇ，１．１２ｍｍｏｌ）と牛血清アルブミン（５ｍｇ）をリン酸ナトリウム緩衝溶液（１００ｍＭ，ｐＨ７．５，３．４ｍｌ）に溶かし、その後シアル酸アルドラーゼ（５０Ｕ）を加え室温で反応を開始した。２４時間後反応溶液を凍結乾燥させ、少量の水に溶かし陰イオン交換樹脂カラム（ＡＧ １−Ｘ８，２００−４００ｍｅｓｈ，ｆｏｒｍａｔｅ ｆｏｒｍ）にのせた。水３００ｍｌ流した後、１Ｍギ酸で目的物を溶出させ減圧濃縮し、ゲル濾過カラム（Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−１５，水）で精製し化合物２５（収量４０ｍｇ，収率５８．９％）を得た。
１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ），
δ ４．６１（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ７，８＝８．９７Ｈｚ，Ｊ７，Ｆ＝４５．５６Ｈｚ，Ｈ−７），４．１８（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ５，６＝１０．６３Ｈｚ，Ｊ６，Ｆ＝２９．８６Ｈｚ，Ｈ−６），４．１５（ｍ，１Ｈ，Ｈ−４），４．０７（ｍ，１Ｈ，Ｈ−８），４．０２（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ４，５＝１０．１０Ｈｚ，Ｈ−５），３．９０（ｄｄｄ，１Ｈ，Ｊ９ａ９ｂ＝１２．１８Ｈｚ，Ｊ９ａ，８＝２．７７Ｈｚ，Ｊ９ａ，Ｆ＝２．８６Ｈｚ，Ｈ−９ａ），３．７６（ｄｄｄ，１Ｈ，Ｊ９ｂ，８＝５．３３Ｈｚ，Ｊ９ｂ，Ｆ＝２．０６Ｈｚ，Ｈ−９ｂ），２．４０（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ３ｅｑ，３ａｘ＝１３．００，Ｊ３ｅｑ，４＝４．８８Ｈｚ，Ｈ−３ｅｑ），２．１５（ｓ，３Ｈ，ＯＣＯＣＨ３），２．００（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ３ａｘ，４＝１１．７０Ｈｚ，Ｈ−３ａｘ），
１３Ｃ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ），
δ １７５．１７，１７３．６８（Ｃ＝Ｏ），９６．０１（Ｃ−１），８９．１２（ｄ，Ｊ７，Ｆ＝１７９．２３Ｈｚ，Ｃ−７），６９．６７（ｄ，Ｊ６，Ｆ＝１７．４１Ｈｚ，Ｃ−６），６８．３１（ｄ，Ｊ８，Ｆ＝２６．５０Ｈｚ，Ｃ−８），６７．２６（Ｃ−４），６２．７０（Ｃ−６），５２．１７（Ｃ−５），３９．１９（Ｃ−３），２２．６１（ＮＨＣＯＣＨ３），
参考例１５（５−アセタミド−３，５，８−トリデオキシ−８−フルオロ−Ｄ−グリセロ−β−Ｄ−ラクト−２−ノヌロピラノシドニック アシッド（８−フルオロシアル酸）
５−Ａｃｅｔａｍｉｄｅ−３，５，８−ｔｒｉｄｅｏｘｙ−８−ｆｌｕｏｒｏ−Ｄ−ｇｌｙｃｅｒｏ−β−Ｄ−ｇａｌａｃｔｏ−２−ｎｏｎｕｌｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｏｎｉｃ ａｃｉｄ ２７の合成）
下記のスキームに従ってシアル酸（２６）から５−アセタミド−３，５，８−トリデオキシ−８−フルオロ−Ｄ−グリセロ−β−Ｄ−ラクト−２−ノヌロピラノシドニック アシッド（２７）を合成した。
８−フルオロシアル酸のＮＭＲデータを以下に示す。
１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ），
δ ４．６９（ｄｄｄｄ，１Ｈ，Ｊ８，Ｆ＝４８．７Ｈｚ，Ｊ８，９ａ＝５．０Ｈｚ，Ｊ８，９ｂ＝３．５Ｈｚ，Ｈ−８），４．０３（ｄｄｄ，１Ｈ，Ｊ４，５＝１０．０Ｈｚ，Ｊ３ａｘ，４＝１１．１Ｈｚ，Ｊ３ｅｑ，４＝４．７Ｈｚ，Ｈ−４），３．９５（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ４，５＝１０．０Ｈｚ，Ｊ５，６＝９．９Ｈｚ，Ｈ−５），３．９４（ｄｄｄ，１Ｈ，Ｊ６，７＝〜０Ｈｚ，Ｊ７，８＝６．８Ｈｚ，Ｊ７，Ｆ＝１４．０Ｈｚ，Ｈ−７），３．８８（ｄｄｄ，１Ｈ，Ｊ９ａ９ｂ＝１３．３Ｈｚ，Ｊ９ａ，８＝３．５Ｈｚ，Ｊ９ｂ，Ｆ＝２８．０Ｈｚ，Ｈ−９ｂ），３．８６（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ５，６＝９．９Ｈｚ，Ｊ６，７＝〜０Ｈｚ，Ｈ−６），３．７２（ｄｄｄ，１Ｈ，Ｊ９ａ，９ｂ＝５．３３Ｈｚ，Ｊ９ａ，８＝５．０Ｈｚ，Ｊ９ａ，Ｆ＝３０．６Ｈｚ，Ｈ−９ａ），２．２８（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ３ｅｑ，３ａｘ＝１３．００，Ｊ３ｅｑ，４＝４．６Ｈｚ，Ｈ−３ｅｑ），２．０５（ｓ，３Ｈ，Ａｃ），１．８７（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ３ａｘ，４＝１１．１Ｈｚ，Ｊ３ｅｑ，３ａｘ＝１３．００，Ｈ−３ａｘ）
参考例１６（５−アセタミド−３，５，９−トリデオキシ−９−フルオロ−Ｄ−グリセロ−β−Ｄ−ラクト−２−ノヌロピラノシドニック アシッド（９−フルオロシアル酸）
５−Ａｃｅｔａｍｉｄｅ−３，５，９−ｔｒｉｄｅｏｘｙ−９−ｆｌｕｏｒｏ−Ｄ−ｇｌｙｃｅｒｏ−β−Ｄ−ｇａｌａｃｔｏ−２−ｎｏｎｕｌｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｏｎｉｃ ａｃｉｄ ２８の合成）
下記のスキームに従ってシアル酸（２６）から５−アセタミド−３，５，９−トリデオキシ−９−フルオロ−Ｄ−グリセロ−β−Ｄ−ラクト−２−ノヌロピラノシドニック アシッド（２８）を合成した。
参考例１７ ＣＭＰ−シアル酸の合成
（ａ）（１）Ｄｏｗｅｘ ５０−Ｘ８，ＭｅＯＨ，（２）Ａｃ２Ｏ，６０％ＨＣｌＯ４；
（ｂ）（１）１Ｈ−Ｔｅｔｒａｚｏｌｅ，ＣＨ３ＣＮ，（２）ｔ−ＢｕＯＯＨ，ＣＨ３ＣＮ，（３）ＤＢＵ，ＣＨ３ＣＮ，（４）ＮａＯＭｅ，ＭｅＯＨ，Ｈ２Ｏ
シアル酸（０．０７４ｍｍｏｌ）を蒸留メタノール（３ｍｌ）に溶かし、アルゴン気流下室温で撹拌しながらＤｏｗｅｘ−５０Ｗ−Ｘ８（６５ｍｇ）を加え、３時間反応させた。反応終了を確認し、濾過後減圧濃縮した。残渣を無水酢酸（２００μｌ）に溶かし、−２０℃で撹拌しながら無水酢酸：６０％過塩素酸＝１５：１溶液（２２μｌ）を加え、１０℃にて４０分反応させた。反応終了を確認後、反応溶液を酢酸エチルで希釈して、飽和重曹水で洗浄した。有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥し、濾過後減圧濃縮して、カルボキシル基が保護されたシアル酸（２９）を含む残渣を得た。残渣とＣＭＰ−５’−ホスホロアミダイト誘導体（３０）（０．２３ｍｍｏｌ）をベンゼンで別々の３回共沸し、蒸留したアセトニトリル（１００μｌ）にそれぞれ溶かし混ぜた。アルゴン気流下氷水中で撹拌しながら１Ｈ−テトラゾール（１７ｍｇ，０．２３ｍｍｏｌ）を加えた。５分後に室温に戻し、さらに１０分間反応させた。反応終了を確認後、溶液を酢酸エチルで希釈し、飽和重曹水、飽和食塩水で洗浄した。有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥させ、濾過後３０℃以下で濃縮した後さらにトルエンで２回共沸し水を取り除いた。残渣に蒸留したアセトニトリル（４００μｌ）を加え、アルゴン気流下氷冷しながら２．５Ｍのｔ−ＢｕＯＯＨトルエン溶液（２９０μｌ）を滴下した。５分後に室温に戻し、さらに２０分間撹拌した。反応終了を確認後、ジメチルスルフィド（５３μｌ）を滴下し１０分間撹拌してｔ−ＢｕＯＯＨをクエンチした。その後、ＤＢＵ（１８μｌ）を滴下して２０分間室温で撹拌した。反応終了を確認後、メタノール（０．６７ｍｌ）、水（１．３５ｍｌ）、ナトリウムメトキシド（３６０ｍｇ）を加え室温で１６時間反応させた。反応終了を確認後水で抽出し、ジクロロメタンで洗浄した。水層を２５℃以下で８ｍｌ程度まで減圧濃縮した。この水溶液をＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−１５（１．８φ×９０ｃｍ）を用いるゲルカラムクロマトグラフィー（展開溶媒：２０ｍＭアンモニア水、流速：０．３ｍｌ／ｍｉｎ）で精製し、ＣＭＰ−シアル酸を得た。
参考例１８ ＣＭＰ−７”−デオキシ−７”−フルオロ−シアル酸の合成
シアル酸の代わりに化合物（２５）を用いた以外は参考例７と同様にしてＣＭＰ−７”−デオキシ−７”−フルオロ−シアル酸を合成した。ＮＭＲデータを以下に示す。
１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，５０ｍＭ ＮＤ４ＤＣＯ３ ｉｎ Ｄ２Ｏ），
δ ８．０４（ｄ，１Ｈ，Ｊ５，６＝７．６Ｈｚ，Ｈ−６），６．２０（ｄ，１Ｈ，Ｊ６，５＝７．６Ｈｚ，Ｈ−５），６．０６（ｄ，１Ｈ，Ｊ１’，２’＝４．５Ｈｚ，Ｈ−１’），４．５４（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ７”，８”＝９．５Ｈｚ，Ｊ７”，Ｆ＝４５．９Ｈｚ，Ｈ−７”），４．４２〜４．２０（ｍ，７Ｈ，Ｈ−２’，Ｈ−３’，Ｈ−４’，Ｈ−５’ａ，Ｈ−５’ｂ，Ｈ−６”，Ｈ−８”），４．１６（ｄｄｄ，１Ｈ，Ｊ４”，３”ｅｑ＝４．７Ｈｚ，Ｊ４”，３”ａｘ＝１１．３Ｈｚ，Ｊ４，５＝１０．３Ｈｚ，Ｈ−４”），４．０３（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ５”，４”＝Ｊ５”，６”＝１０．３Ｈｚ，Ｈ−５”），３．９１（ｄｄｄ，１Ｈ，Ｊ９”ａ，９”ｂ＝１２．２Ｈｚ，Ｊ９”ａ，８”＝２．８Ｈｚ，Ｊ９”ａ，Ｆ＝２．８Ｈｚ，Ｈ−９”ａ），３．７５（ｄｄｄ，１Ｈ，Ｊ９”ａ，９”ｂ＝１２．２Ｈｚ，Ｊ９”ｂ，８”＝５．４Ｈｚ，Ｊ９”ｂ，Ｆ＝２．１Ｈｚ，Ｈ−９”ｂ），２．６１（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ３”ｅｑ，４”＝４．７Ｈｚ，Ｊｇｅｍ＝１３．３Ｈｚ，Ｈ−３”ｅｑ），２．１４（ｓ，３Ｈ，Ａｃ），１．７６（ｄｄｄ，１Ｈ，Ｊ３”ａｘ，４”＝１１．５Ｈｚ，Ｊｇｅｍ＝１３．３Ｈｚ，Ｊ３”ａｘ，Ｐ＝５．６Ｈｚ，Ｈ−３”ａｘ），
参考例１９ ＣＭＰ−８”−デオキシ−８”−フルオロ−シアル酸の合成
シアル酸の代わりに化合物（２７）を用いた以外は参考例７と同様にしてＣＭＰ−８”−デオキシ−８”−フルオロ−シアル酸を合成した。ＮＭＲデータを以下に示す。
１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，５０ｍＭ ＮＤ４ＤＣＯ３ ｉｎ Ｄ２Ｏ），
δ ８．０８（ｄ，１Ｈ，Ｊ５，６＝７．６Ｈｚ，Ｈ−６），６．２０（ｄ，１Ｈ，Ｊ６，５＝７．６Ｈｚ，Ｈ−５），６．０９（ｄ，１Ｈ，Ｊ１’，２’＝４．１Ｈｚ，Ｈ−１’），４．９０（ｍ，１Ｈ，Ｈ−８”），４．４２（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ３’，２’＝Ｊ３’，４’＝４．９Ｈｚ，Ｈ−３’），４．３９（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ２’，１’＝４．１Ｈｚ，Ｊ’２’，３’＝４．９Ｈｚ，Ｈ−２’），４．３１−４．２８（ｍ，３Ｈ，Ｈ−４’，Ｈ−５’ａ，Ｈ−５’ｂ），４．１５（ｄｄｄ，１Ｈ，Ｊ４”，３”ｅｑ＝４．４Ｈｚ，Ｊ４”，３”ａｘ＝１１．５Ｈｚ，Ｊ４，５＝１０．５Ｈｚ，Ｈ−４”），４．１０−３．９０（ｍ，５Ｈ，Ｈ−５”，Ｈ−６”，Ｈ−７”，Ｈ−９”ａ，Ｈ−９”ｂ），２．６０（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ３”ｅｑ，４”＝４．４Ｈｚ，Ｊｇｅｍ＝１３．１Ｈｚ，Ｈ−３”ｅｑ），２．１３（ｓ，３Ｈ，Ａｃ），１．７７（ｄｄｄ，１Ｈ，Ｊ３”ａｘ，４”＝１１．５Ｈｚ，Ｊｇｅｍ＝１３．１Ｈｚ，Ｊ３”ａｘ，Ｐ＝４．５Ｈｚ，Ｈ−３”ａｘ），
参考例２０ ＣＭＰ−９”−デオキシ−９”−フルオロ−シアル酸の合成
シアル酸の代わりに化合物（２８）を用いた以外は参考例７と同様にしてＣＭＰ−９”−デオキシ−９”−フルオロ−シアル酸を合成した。
実施例１ Ｆｍｏｃ基でアスパラギンのアミノ基窒素を保護したジシアロα２，３糖鎖アスパラギン（Ｃ１−１）およびＦｍｏｃ基でアスパラギンのアミノ基窒素を保護した２種のモノシアロα２，３糖鎖アスパラギン（Ｃ１−２及びＣ１−３）の合成
参考例３で得られたＦｍｏｃ基でアスパラギンのアミノ基窒素を保護したアシアロ糖鎖アスパラギンにシアル酸転移酵素を用いてＣＭＰ−シアル酸を転移させた。
シアル酸転移酵素としてα２，３転移酵素である市販のＲａｔ，Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ由来のものを用いた。
参考例３で得られたアシアロ９糖（２０ｍｇ，１０．１μｍｏｌ）を５０ｍＭカコジル酸緩衝液（ｐＨ＝６．０，５ｍｌ）に溶解させた後、牛血清アルブミン（ＢＳＡ，５ｍｇ）を加える。これに、ＣＭＰ−シアル酸（２６ｍｇ，４０．４μｍｏｌ）、Ａｌｋａｌｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（５μｌ，１２５ｕｎｉｔ）を加え均一化する。最後に、α２，３−Ｓｉａｌｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ（ＣＡＬＢＩＯＣＨＥＭ社製、１００μｌ）を加え３７℃で４８時間静置させる。ＨＰＬＣで反応をモニターしながら原料が目的量まで減少した時点で反応を終了させ、反応液をメンブランフィルターにて濾過する。濾液を濃縮し液量を減じた後、ＨＰＬＣ分取カラムにて精製した（ＹＭＣ−Ｐａｃｋ Ｒ＆Ｄ ＯＤＳ，Ｄ−ＯＤＳ−５−Ａ，２０×２５０ｍｍ，ＡＮ／２５ｍＭ ＡｃＯＮＨ４ ｂｕｆｆｅｒ＝１８／８２，７．５ｍｌ／ｍｉｎ．，ｗａｖｅ ｌｅｎｇｔｈ；２７４ｎｍ）ところ、２５分後にジシアロ１１糖 化合物（Ｃ１−１）が、それぞれ３０分後、３４分後に各モノシアロ１０糖 化合物（Ｃ１−２）及び（Ｃ１−３）が溶出してきた。それぞれを分取した後、脱塩処理、次いで凍結乾燥を行うと、各化合物１、２、３がそれぞれ０．７ｍｇ（２．７％）、１．９ｍｇ（８．３％）、３．５ｍｇ（１５．３％）得られた。各化合物のＮＭＲデータは以下のとおりである。
化合物（Ｃ１−１）
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ，３０℃，ＨＯＤ＝４．８１）
δ ７．９０（ｄ，２Ｈ，Ｆｍｏｃ），７．６９（ｄ，２Ｈ，Ｆｍｏｃ），７．４９（ｄｄ，２Ｈ，Ｆｍｏｃ），７．４２（ｄｄ，２Ｈ，Ｆｍｏｃ），５．１０（ｓ，１Ｈ，Ｍａｎ４−Ｈ１），４．９７（ｄ，１Ｈ，ＧｌｃＮＡｃ１−Ｈ１），４．９１（ｓ，１Ｈ，Ｍａｎ４’−Ｈ−１），４．５０−４．６０（ｍ，４Ｈ），４．３４（１Ｈ，Ｆｍｏｃ），４．２４（ｂｓ，１Ｈ，Ｍａｎ３−Ｈ２），４．１８（ｂｓ，１Ｈ，Ｍａｎ４−Ｈ２），４．１０（ｍ，２Ｈ），２．７４（ｍ，３Ｈ，Ａｓｎ−βＣＨ，ＮｅｕＡｃ７，７’−Ｈ３ｅｑ），２．４０−２．６０（ｍ，１Ｈ，Ａｓｎ−βＣＨ），２．０５，２．０３，２．０２（ｅａｃｈ ｓ，Ａｃ），１．７７（ｄｄ，２Ｈ，ＮｅｕＡｃ７，７’−Ｈ３ａｘ）．
化合物（Ｃ１−２）
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ，３０℃，ＨＯＤ＝４．８１）
δ ７．９０（ｄ，２Ｈ，Ｆｍｏｃ），７．６９（ｄ，２Ｈ，Ｆｍｏｃ），７．４９（ｄｄ，２Ｈ，Ｆｍｏｃ），７．４２（ｄｄ，２Ｈ，Ｆｍｏｃ），５．１０（ｓ，１Ｈ，Ｍａｎ４−Ｈ１），４．９７（ｄ，１Ｈ，ＧｌｃＮＡｃ１−Ｈ１），４．９０（ｓ，１Ｈ，Ｍａｎ４’−Ｈ−１），４．４７−４．６０（ｍ），４．４３（ｄ，１Ｈ），４．３２（１Ｈ，Ｆｍｏｃ），４．２２（ｂｓ，２Ｈ），４．１７（ｂｓ，１Ｈ，Ｍａｎ４−Ｈ２），４．０６−４．１３（ｍ，２Ｈ），２．７２（ｍ，２Ｈ，Ａｓｎ−βＣＨ，ＮｅｕＡｃ７−Ｈ３ｅｑ），２．５０−２．６０（ｍ，１Ｈ，Ａｓｎ−βＣＨ），２．０５，２．０３，２．０１（ｅａｃｈ ｓ，Ａｃ），１．７７（ｄｄ，１Ｈ，ＮｅｕＡｃ７−Ｈ３ａｘ）．
化合物（Ｃ１−３）
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ，３０℃，ＨＯＤ＝４．８１）
δ ７．９０（ｄ，２Ｈ，Ｆｍｏｃ），７．６９（ｄ，２Ｈ，Ｆｍｏｃ），７．４９（ｄｄ，２Ｈ，Ｆｍｏｃ），７．４２（ｄｄ，２Ｈ，Ｆｍｏｃ），５．１０（ｓ，１Ｈ，Ｍａｎ４−Ｈ１），４．９７（ｄ，１Ｈ，ＧｌｃＮＡｃ１−Ｈ１），４．９０（ｓ，１Ｈ，Ｍａｎ４’−Ｈ−１），４．５０−４．６０（ｍ），４．４５（ｄ，１Ｈ），４．３３（１Ｈ，Ｆｍｏｃ），４．２２（ｍ，２Ｈ），４．１７（ｂｓ，１Ｈ，Ｍａｎ４−Ｈ２），４．０９（ｍ，２Ｈ），２．７４（ｍ，２Ｈ，Ａｓｎ−βＣＨ，ＮｅｕＡｃ７−Ｈ３ｅｑ），２．４５−２．６０（ｍ，１Ｈ，Ａｓｎ−βＣＨ），２．０５，２．０３，２．０２，２．００（ｅａｃｈ ｓ，Ａｃ），１．７７（ｄｄ，１Ｈ，ＮｅｕＡｃ７−Ｈ３ａｘ）
【実施例２】
実施例１で得られた化合物（Ｃ１−２）（２ｍｇ，０．８８μｍｏｌ）とウシ血清アルブミン１ｍｇをＨＥＰＥＳ緩衝溶液（５０ｍＭ，ｐＨ５．０）１００μｌに溶解させ、さらにβ−ガラクトシダーゼ（生化学工業社製、ｆｒｏｍ Ｊａｃｋ Ｂｅａｎｓ，５μＬ，１００ｍＵ）を加えた。この溶液を３７℃で１５時間静置した後、メンブランフィルターでろ過を行った。ろ液をＨＰＬＣ（ＯＤＳカラム、２．０φ×２５ｃｍ、展開溶媒は５０ｍＭ酢酸アンモニウム水溶液：アセトニトリル＝８２：１８、流速７．５ｍｌ／ｍｉｎ）で精製した後、溶媒を濃縮、次いで凍結乾燥を行った。残留物を水２００μｌに溶解させＯＤＳ−カラムクロマトグラフィー（コスモシール７５Ｃ１８−ｏｐｎ、最初に水で洗浄を行い、次いで２５％アセトニトリル水溶液で溶出させる）を用いて脱塩処理を行ったところ、目的とする化合物（Ｃ２）が０．５μｇ得られた。ＮＭＲデータは以下のとおりである。
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ，３０℃，ＨＯＤ＝４．８１）
δ ７．９０（ｄ，２Ｈ，Ｆｍｏｃ），７．６９（ｄ，２Ｈ，Ｆｍｏｃ），７．４９（ｄｄ，２Ｈ，Ｆｍｏｃ），７．４２（ｄｄ，２Ｈ，Ｆｍｏｃ），５．１０（ｓ，１Ｈ，Ｍａｎ４−Ｈ１），４．９８（ｄ，１Ｈ，ＧｌｃＮＡｃ１−Ｈ１），４．９０（ｓ，１Ｈ，Ｍａｎ４’−Ｈ−１），４．５０−４．６０（ｍ），４．３３（１Ｈ，Ｆｍｏｃ），４．２２（ｍ，２Ｈ），４．１７（ｂｓ，１Ｈ，Ｍａｎ４−Ｈ２），４．１０（ｍ，２Ｈ），２．７４（ｍ，２Ｈ，Ａｓｎ−βＣＨ，ＮｅｕＡｃ７−Ｈ３ｅｑ），２．４５−２．６０（ｍ，１Ｈ，Ａｓｎ−βＣＨ），２．０５，２．０３，２．０１（ｅａｃｈ ｓ，Ａｃ），１．７８（ｄｄ，１Ｈ，ＮｅｕＡｃ７−Ｈ３ａｘ）
【実施例３】
実施例２で得られた化合物（Ｃ２）（１．８ｍｇ，０．８６μｍｏｌ）を、ウシ血清アルブミン１ｍｇと共にＨＥＰＥＳ緩衝溶液（５０ｍＭ，ｐＨ５．０）９０μｌに溶解させ、さらにＮ−アセチル−β−グルコサミニダーゼ（シグマアルドリッチ社製、ｆｒｏｍ Ｊａｃｋ Ｂｅａｎｓ）を４μｌ（２５０ｍＵ）加えた。この溶液を３７℃で２４時間静置した後、メンブランフィルターでろ過を行った。ろ液をＨＰＬＣ（ＯＤＳカラム、２．０φ×２５ｃｍ、展開溶媒は５０ｍＭ酢酸アンモニウム水溶液：アセトニトリル＝８２：１８、流速７．５ｍｌ／ｍｉｎ）で精製した後、溶媒を濃縮、次いで凍結乾燥を行った。残留物を水２００μｌに溶解させＯＤＳ−カラムクロマトグラフィー（コスモシール７５Ｃ１８−ｏｐｎ、最初に水で洗浄を行い、次いで２５％アセトニトリル水溶液で溶出させる）を用いて脱塩処理を行ったところ、目的とする化合物（Ｃ３）が０．９μｇ得られた。
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ，３０℃，ＨＯＤ＝４．８１）
δ ８．０１（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝７．６，Ｆｍｏｃ），７．８０（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝７．６，Ｆｍｏｃ），７．６０（ｄｄ，２Ｈ，Ｊ＝７．６，Ｆｍｏｃ），７．５３（ｄｄ，２Ｈ，Ｊ＝７．６，Ｆｍｏｃ），５．２１（ｓ，１Ｈ，Ｍａｎ４−Ｈ１），５．０９（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．８，ＧｌｃＮＡｃ１−Ｈ１），５．００（ｓ，１Ｈ，Ｍａｎ４’−Ｈ−１），４．８７（ｓ，１Ｈ），４．６０−４．７８（ｍ，５Ｈ），４．４０−４．５０（ｂｍ，２Ｈ），４．３４（ｓ，１Ｈ），４．２８（ｂｓ，１Ｈ，Ｍａｎ４−Ｈ２），４．２０（ｄｄ，１Ｈ，Ｊａ＝３．０，Ｊｂ＝９．９），２．８０−２．９５（ｍ，２Ｈ，Ａｓｎ−βＣＨ，ＮｅｕＡｃ７−Ｈ３ｅｑ），２．６５−２．７５（ｍ，１Ｈ，Ａｓｎ−βＣＨ），２．１６，２．１４，２．１２（ｅａｃｈｓ，Ａｃｘ３），１．９８（ｓ，３Ｈ，Ａｃ），１．８９（ｄｄ，１Ｈ，Ｊａ＝１２．１，Ｊｂ＝１１．９，ＮｅｕＡｃ７−Ｈ３ａｘ）．
【実施例４】
実施例３で得られた化合物（Ｃ３）（０．８ｍｇ，０．４２μｍｏｌ）とウシ血清アルブミン１ｍｇをＨＥＰＥＳ緩衝溶液（５０ｍＭ，ｐＨ５．０）５０μｌに溶解させ、α−マンノシダーゼ（シグマアルドリッチ社製、ｆｒｏｍ Ｊａｃｋ Ｂｅａｎｓ）３０μｌ（２．９Ｕ）加えた。この溶液を３７℃で６３時間静置した後、メンブランフィルターでろ過を行った。ろ液をＨＰＬＣ（ＯＤＳカラム、２．０φ×２５ｃｍ、展開溶媒は５０ｍＭ酢酸アンモニウム水溶液：アセトニトリル＝８０：２０、流速７．５ｍｌ／ｍｉｎ）で精製した後、溶媒を濃縮、次いで凍結乾燥を行った。残留物を水２００μｌに溶解させＯＤＳ−カラムクロマトグラフィー（コスモシール７５Ｃ１８−ｏｐｎ、最初に水で洗浄を行い、次いで２５％アセトニトリル水溶液で溶出させる）を用いて脱塩処理を行ったところ、目的とする化合物（Ｃ４）が０．６μｇ得られた。
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ，３０ｏＣ，ＨＯＤ＝４．８１）
δ ８．００（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝７．２，Ｆｍｏｃ），７．７９（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝７．２，Ｆｍｏｃ），７．５９（ｄｄ，２Ｈ，Ｊ＝７．２，Ｆｍｏｃ），７．５２（ｄｄ，２Ｈ，Ｊ＝７．２，Ｆｍｏｃ），５．２１（ｓ，１Ｈ，Ｍａｎ４−Ｈ１），５．０９（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１０．０，ＧｌｃＮＡｃ１−Ｈ１），４．６０−４．７５（ｍ，），４．４０−４．５０（ｍ，２Ｈ），４．３２（ｂｄ，１Ｈ，Ｊ＝２．３），４．２８（ｂｓ，１Ｈ），４．２２（ｂｄｄ，１Ｈ，Ｊａ＝９．７，Ｊｂ＝２．８，Ｍａｎ４−Ｈ２），２．８０−２．９５（ｍ，２Ｈ，Ａｓｎ−βＣＨ，ＮｅｕＡｃ７−Ｈ３ｅｑ），２．６０−２．７５（ｍ，１Ｈ，Ａｓｎ−βＣＨ），２．１４，２．１４，２．１２（ｅａｃｈｓ，Ａｃｘ３），１．９８（ｓ，３Ｈ，Ａｃ），１．８８（ｄｄ，１Ｈ，Ｊａ＝１２．１，Ｊｂ＝１２．０，ＮｅｕＡｃ７−Ｈ３ａｘ）．
【実施例５】
実施例１で得られた化合物（Ｃ１−３）（１ｍｇ，０．４４μｍｏｌ）とウシ血清アルブミン１ｍｇをＨＥＰＥＳ緩衝溶液（５０ｍＭ，ｐＨ５．０）５０μｌに溶解させ、さらにβ−ガラクトシダーゼ（生化学工業社製、ｆｒｏｍ Ｊａｃｋ Ｂｅａｎｓ，５μＬ，１００ｍＵ）を加えた。この溶液を３７℃で１５時間静置した後、メンブランフィルターでろ過を行った。ろ液をＨＰＬＣ（ＯＤＳカラム、２．０φ×２５ｃｍ、展開溶媒は５０ｍＭ酢酸アンモニウム水溶液：アセトニトリル＝８２：１８、流速７．５ｍｌ／ｍｉｎ）で精製した後、溶媒を濃縮、次いで凍結乾燥を行った。残留物を水２００μｌに溶解させＯＤＳ−カラムクロマトグラフィー（コスモシール７５Ｃ１８−ｏｐｎ、最初に水で洗浄を行い、次いで２５％アセトニトリル水溶液で溶出させる）を用いて脱塩処理を行ったところ、目的とする化合物（Ｃ５）が０．３μｇ得られた。
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ，３０℃，ＨＯＤ＝４．８１）
δ ８．０１（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝７．２，Ｆｍｏｃ），７．８１（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝７．２，Ｆｍｏｃ），７．６０（ｄｄ，２Ｈ，Ｊ＝７．２，Ｆｍｏｃ），７．５３（ｄｄ，２Ｈ，Ｊ＝７．２，Ｆｍｏｃ），５．２１（ｓ，１Ｈ，Ｍａｎ４−Ｈ１），５．０９（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝９．６，ＧｌｃＮＡｃ１−Ｈ１），５．０２（ｓ，１Ｈ，Ｍａｎ４’−Ｈ−１），４．５５−４．７０（ｍ），４．４４（１Ｈ，Ｆｍｏｃ），４．３０−４．３８（ｂｍ，２Ｈ），４．２８（ｂｄ，１Ｈ，Ｍａｎ４−Ｈ２），４．１７−４．２５（ｍ，２Ｈ），２．７８−２．９５（ｍ，２Ｈ，Ａｓｎ−βＣＨ，ＮｅｕＡｃ７−Ｈ３ｅｑ），２．５５−２．７０（ｍ，１Ｈ，Ａｓｎ−βＣＨ），２．１６，２．１５，２．１４，２．１２（ｅａｃｈｓ，１２Ｈ，Ａｃｘ４），１．９８（ｓ，３Ｈ，Ａｃ），１．８９（ｄｄ，１Ｈ，Ｊａ＝１２．２，Ｊｂ＝１２．０，ＮｅｕＡｃ７−Ｈ３ａｘ）．
【実施例６】
実施例５で得られた化合物（Ｃ５）（１．０ｍｇ，０．４８μｍｏｌ）を、ウシ血清アルブミン１ｍｇと共にＨＥＰＥＳ緩衝溶液（５０ｍＭ，ｐＨ５．０）５０μｌに溶解させ、さらにＮ−アセチル−β−グルコサミニダーゼ（シグマアルドリッチ社製、ｆｒｏｍ Ｊａｃｋ Ｂｅａｎｓ）を４μｌ（２５０ｍＵ）加えた。この溶液を３７℃で２２時間静置した後、メンブランフィルターでろ過を行った。ろ液をＨＰＬＣ（ＯＤＳカラム、２．０φ×２５ｃｍ、展開溶媒は５０ｍＭ酢酸アンモニウム水溶液：アセトニトリル＝８２：１８、流速７．５ｍｌ／ｍｉｎ）で精製した後、溶媒を濃縮、次いで凍結乾燥を行った。残留物を水２００μｌに溶解させＯＤＳ−カラムクロマトグラフィー（コスモシール７５Ｃ１８−ｏｐｎ、最初に水で洗浄を行い、次いで２５％アセトニトリル水溶液で溶出させる）を用いて脱塩処理を行ったところ、目的とする化合物（Ｃ６）が０．６μｇ得られた。
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ，３０℃，ＨＯＤ＝４．８１）
δ ８．０１（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝７．６，Ｆｍｏｃ），７．８０（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝７．６，Ｆｍｏｃ），７．６０（ｄｄ，２Ｈ，Ｊ＝７．６，Ｆｍｏｃ），７．５３（ｄｄ，２Ｈ，Ｊ＝７．６，Ｆｍｏｃ），５．１９（ｓ，１Ｈ，Ｍａｎ４−Ｈ１），５．０９（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝９．２，ＧｌｃＮＡｃ１−Ｈ１），５．０２（ｓ，１Ｈ，Ｍａｎ４’−Ｈ−１），４．８５（ｓ，１Ｈ）４．５８−４．７５（ｍ，５Ｈ），４．３８−４．４８（ｍ，２Ｈ，Ｆｍｏｃ），４．４０（ｂｄ，Ｊ＝２．４，１Ｈ），４．１８−４．２５（ｍ，２Ｈ），４．１５（ｍ，１Ｈ），２．８０−２．９５（ｍ，２Ｈ，Ａｓｎ−βＣＨ，ＮｅｕＡｃ７−Ｈ３ｅｑ），２．６５−２．７５（ｍ，１Ｈ，Ａｓｎ−βＣＨ），２．１６，２．１３，２．１２（ｅａｃｈｓ，９Ｈ，Ａｃｘ３），１．９８（ｓ，３Ｈ，Ａｃ），１．８９（ｄｄ，１Ｈ，Ｊａ＝１２．２，Ｊｂ＝１２．０，ＮｅｕＡｃ７−Ｈ３ａｘ）．
【実施例７】
実施例６で得られた化合物（Ｃ６）（１．０ｍｇ，０．５３μｍｏｌ）とウシ血清アルブミン１ｍｇをＨＥＰＥＳ緩衝溶液（５０ｍＭ，ｐＨ５．０）５０μｌに溶解させ、α−マンノシダーゼ（シグマアルドリッチ社製、ｆｒｏｍ Ｊａｃｋ Ｂｅａｎｓ）１０μｌ（０．９Ｕ）加えた。この溶液を３７℃で２０時間静置した後、メンブランフィルターでろ過を行った。ろ液をＨＰＬＣ（ＯＤＳカラム、２．０φ×２５ｃｍ、展開溶媒は５０ｍＭ酢酸アンモニウム水溶液：アセトニトリル＝８０：２０、流速７．５ｍｌ／ｍｉｎ）で精製した後、溶媒を濃縮、次いで凍結乾燥を行った。残留物を水２００μｌに溶解させＯＤＳ−カラムクロマトグラフィー（コスモシール７５Ｃ１８−ｏｐｎ、最初に水で洗浄を行い、次いで２５％アセトニトリル水溶液で溶出させる）を用いて脱塩処理を行ったところ、目的とする化合物（Ｃ７）が０．５μｇ得られた。
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ，３０℃，ＨＯＤ＝４．８１）
δ ８．０１（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝７．６，Ｆｍｏｃ），７．８１（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝７．６，Ｆｍｏｃ），７．６０（ｄｄ，２Ｈ，Ｊ＝７．２，Ｆｍｏｃ），７．５３（ｄｄ，２Ｈ，Ｊ＝７．６，Ｆｍｏｃ），５．０９（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝９．２，ＧｌｃＮＡｃ１−Ｈ１），５．０１（ｓ，１Ｈ，Ｍａｎ４’−Ｈ−１），４．８４（ｓ，１Ｈ），４．５５−４．７０（ｍ，５Ｈ），４．４４（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝６．０，Ｆｍｏｃ），４．３０−４．３８（ｂｓ，１Ｈ），４．１５−４．２５（ｍ，２Ｈ），４．１７（ｓ，１Ｈ），２．８０−２．９５（ｍ，２Ｈ，Ａｓｎ−βＣＨ，ＮｅｕＡｃ７−Ｈ３ｅｑ），２．５５−２．７０（ｍ，１Ｈ，Ａｓｎ−βＣＨ），２．１６，２．１３，２．１２（ｅａｃｈｓ，Ａｃｘ３），１．９８（ｓ，３Ｈ，Ａｃ）１．８９（ｄｄ，１Ｈ，Ｊａ＝１２．２，Ｊｂ＝１２．３，ＮｅｕＡｃ７−Ｈ３ａｘ）．
実施例７Ａ
Ｆｍｏｃ基でアスパラギンのアミノ基窒素を保護したジシアロ（α２，６）（α２，３）糖鎖アスパラギンの合成
参考例３で得られたＦｍｏｃ基でアスパラギンのアミノ基窒素を保護したアシアロ糖鎖アスパラギン（化合物２）にシアル酸転移酵素を用いてＣＭＰ−シアル酸を転移させた。
シアル酸転移酵素としてα２，３転移酵素である市販のＲａｔ，Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ由来のものを用いた。
参考例３で得られた化合物２（１．７ｍｇ，０．７５μｍｏｌ）を５０ｍＭカコジル酸緩衝液（ｐＨ＝５．０，８５μｌ）に溶解させた後、牛血清アルブミン（ＢＳＡ，１ｍｇ）を加える。これに、ＣＭＰ−シアル酸（４．８ｍｇ，７．５μｍｏｌ）、Ａｌｋａｌｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（１μｌ，７５ｕｎｉｔ）を加え均一化する。最後に、α２，３−Ｓｉａｌｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ（ＣＡＬＢＩＯＣＨＥＭ社製、７５μｌ，３４ｍＵ）を加え３７℃で３．５時間静置させる。ＨＰＬＣで反応をモニターしながら原料が消失した時点で反応を終了させ、反応液をメンブランフィルターにて濾過する。濾液を濃縮し液量を減じた後、ＨＰＬＣ分取カラムにて精製した（ＹＭＣ−Ｐａｃｋ Ｒ＆Ｄ ＯＤＳ，Ｄ−ＯＤＳ−５−Ａ，２０×２５０ｍｍ，ＡＮ／２５ｍＭ ＡｃＯＮＨ４ ｂｕｆｆｅｒ＝１８／８２，７．５ｍｌ／ｍｉｎ．，ｗａｖｅ ｌｅｎｇｔｈ；２７４ｎｍ）ところ、２５分後に化合物（Ｃ７Ａ）が溶出してきた。分取した後、脱塩処理、次いで凍結乾燥を行うと、化合物（Ｃ７Ａ）が１．３ｍｇ（６７．８％）得られた。化合物のＮＭＲデータは以下のとおりである。
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ，３０℃，ＨＯＤ＝４．８１）
δ ８．００（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝７．２，Ｆｍｏｃ），７．７９（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝７．２，Ｆｍｏｃ），７．６０（ｄｄ，２Ｈ，Ｊ＝７．２，Ｆｍｏｃ），７．５２（ｄｄ，２Ｈ，Ｊ＝７．２，Ｆｍｏｃ），５．２１（ｓ，１Ｈ，Ｍａｎ４−Ｈ１），５．０９（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．８，ＧｌｃＮＡｃ１−Ｈ１），５．０３（ｓ，１Ｈ，Ｍａｎ４’−Ｈ−１），４．８６（ｓ，１Ｈ），４．５８−４．７２（ｍ，５Ｈ），４．５４（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．０），４．３８−４．４８（ｍ，２Ｈ）４．３４（ｂｓ，１Ｈ），４．２８（ｂｓ，１Ｈ），４．１５−４．２５（ｍ，２Ｈ），２．８０−２．８６（ｄｄ，１Ｈ，Ｊａ＝４．４，Ｊｂ＝１２．４，ＮｅｕＡｃ７−Ｈ３ｅｑ），２．７３−２．８３（ｍ，ｄｄ，３Ｈ，Ｊａ＝４．４，Ｊｂ＝１２．４，Ａｓｎ−βＣＨ，ＮｅｕＡｃ７−Ｈ３ｅｑ），２．６０−２．７２（ｍ，１Ｈ，Ａｓｎ−βＣＨ），２．１６，２．１５，２．１４，２．１２（ｅａｃｈ ｓ，Ａｃ ｘ５），１．９８（ｓ，３Ｈ，Ａｃ），１．８９（ｄｄ，１Ｈ，Ｊａ＝１２．４，Ｊｂ＝１２．０，ＮｅｕＡｃ７−Ｈ３ａｘ），１．８１（ｄｄ，１Ｈ，Ｊａ＝１２．４，Ｊｂ＝１２．０，ＮｅｕＡｃ７−Ｈ３ａｘ）．
実施例７Ｂ
Ｆｍｏｃ基でアスパラギンのアミノ基窒素を保護したジシアロ（α２，３）（α２，６）糖鎖アスパラギンの合成
参考例３で得られたＦｍｏｃ基でアスパラギンのアミノ基窒素を保護したアシアロ糖鎖アスパラギン（化合物３）にシアル酸転移酵素を用いてＣＭＰ−シアル酸を転移させた。
シアル酸転移酵素としてα２，３転移酵素である市販のＲａｔ，Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ由来のものを用いた。
参考例３で得られた化合物３（１．２ｍｇ，０．５３μｍｏｌ）を５０ｍＭカコジル酸緩衝液（ｐＨ＝５．０，６０μｌ）に溶解させた後、牛血清アルブミン（ＢＳＡ，１ｍｇ）を加える。これに、ＣＭＰ−シアル酸（３．４ｍｇ，５．３μｍｏｌ）、Ａｌｋａｌｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（１μｌ，７５ｕｎｉｔ）を加え均一化する。最後に、α２，３−Ｓｉａｌｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ（ＣＡＬＢＩＯＣＨＥＭ社製、５２．９μｌ，２４ｍＵ）を加え３７℃で３時間静置させる。ＨＰＬＣで反応をモニターしながら原料が全て消費された時点で反応を終了させ、反応液をメンブランフィルターにて濾過する。濾液を濃縮し液量を減じた後、ＨＰＬＣ分取カラムにて精製した（ＹＭＣ−Ｐａｃｋ Ｒ＆Ｄ ＯＤＳ，Ｄ−ＯＤＳ−５−Ａ，２０×２５０ｍｍ，ＡＮ／２５ｍＭ ＡｃＯＮＨ４ ｂｕｆｆｅｒ＝１８／８２，７．５ｍｌ／ｍｉｎ．，ｗａｖｅ ｌｅｎｇｔｈ；２７４ｎｍ）ところ、２３分後に化合物（Ｃ７Ｂ）が溶出してきた。分取した後、脱塩処理、次いで凍結乾燥を行うと、各化合物（Ｃ７Ｂ）が１．１ｍｇ（８１．２％）得られた。各化合物のＮＭＲデータは以下のとおりである。
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ，３０℃，ＨＯＤ＝４．８１）
δ ８．００（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝７．６，Ｆｍｏｃ），７．７９（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝７．６，Ｆｍｏｃ），７．５９（ｄｄ，２Ｈ，Ｊ＝７．６，Ｆｍｏｃ），７．５１（ｄｄ，２Ｈ，Ｊ＝７．６，Ｆｍｏｃ），５．２１（ｓ，１Ｈ，Ｍａｎ４−Ｈ１），５．０８（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１０．０，ＧｌｃＮＡｃ１−Ｈ１），５．００（ｓ，１Ｈ，Ｍａｎ４’−Ｈ−１），４．８４（ｓ，１Ｈ），４．６０−４．７２（ｍ，５Ｈ），４．５２（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．６），４．３５−４．４５（ｍ，２Ｈ），４．３３（ｂｓ，１Ｈ），４．２７（ｂｓ，１Ｈ），４．１５−４．２５（ｍ，２Ｈ），２．８０−２．８６（ｄｄ，１Ｈ，Ｊａ＝４．８，Ｊｂ＝１２．４，ＮｅｕＡｃ７−Ｈ３ｅｑ），２．７３−２．８３（ｂｓ，ｄｄ，３Ｈ，Ｊａ＝４．８，Ｊｂ＝１２．４，Ａｓｎ−βＣＨ，ＮｅｕＡｃ７−Ｈ３ｅｑ），２．６０−２．７２（ｍ，１Ｈ，Ａｓｎ−βＣＨ），２．１５，２．１２，２．１０（ｅａｃｈ ｓ，Ａｃ ｘ５），１．９７（ｓ，３Ｈ，Ａｃ），１．８８（ｄｄ，１Ｈ，Ｊａ＝１２．４，Ｊｂ＝１２．４，ＮｅｕＡｃ７−Ｈ３ａｘ），１．８０（ｄｄ，１Ｈ，Ｊａ＝１２．４，Ｊｂ＝１２．４，ＮｅｕＡｃ７−Ｈ３ａｘ）．
実施例８ Ｆｍｏｃ基でアスパラギンのアミノ基窒素を保護したジ７”−デオキシ−７”−フルオロ−シアロα２，３糖鎖アスパラギン（Ｃ８−１）およびＦｍｏｃ基でアスパラギンのアミノ基窒素を保護した２種のモノ７”−デオキシ−７”−フルオロ−シアロα２，３糖鎖アスパラギン（Ｃ８−２及びＣ８−３）の合成
参考例８で得られたＣＭＰ−７”−デオキシ−７”−フルオロ−シアル酸を用いた以外は実施例１と同様にして下記に示すＦｍｏｃ基でアスパラギンのアミノ基窒素を保護したジ７”−デオキシ−７”−フルオロ−シアロα２，３糖鎖アスパラギンおよびＦｍｏｃ基でアスパラギンのアミノ基窒素を保護した２種のモノ７”−デオキシ−７”−フルオロ−シアロα２，３糖鎖アスパラギンを得た。
【実施例９】
実施例２の化合物（Ｃ１−２）の代りに実施例８で得られた化合物（Ｃ８−２）を使用した以外は実施例２と同様にして目的とする化合物（Ｃ９）が得られた。
【実施例１０】
実施例３の化合物（Ｃ２）の代りに実施例９で得られた化合物（Ｃ９）を使用した以外は実施例３と同様にして目的とする化合物（Ｃ１０）が得られた。
【実施例１１】
実施例４の化合物（Ｃ３）の代りに実施例１０で得られた化合物（Ｃ１０）を使用した以外は実施例４と同様にして目的とする化合物（Ｃ１１）が得られた。
【実施例１２】
実施例５の化合物（Ｃ１−３）の代りに実施例８で得られた化合物（Ｃ８−３）を使用した以外は実施例５と同様にして目的とする化合物（Ｃ１２）が得られた。
【実施例１３】
実施例６の化合物（Ｃ５）の代りに実施例１２で得られた化合物（Ｃ１２）を使用した以外は実施例６と同様にして目的とする化合物（Ｃ１３）が得られた。
【実施例１４】
実施例７の化合物（Ｃ６）の代りに実施例１３で得られた化合物（Ｃ１３）を使用した以外は実施例７と同様にして目的とする化合物（Ｃ１４）が得られた。
実施例１５ Ｆｍｏｃ基でアスパラギンのアミノ基窒素を保護したジ８”−デオキシ−８”−フルオロ−シアロα２，３糖鎖アスパラギン（Ｃ１５−１）およびＦｍｏｃ基でアスパラギンのアミノ基窒素を保護した２種のモノ８”−デオキシ−８”−フルオロ−シアロα２，３糖鎖アスパラギン（Ｃ１５−２及びＣ１５−３）の合成
参考例９で得られたＣＭＰ−８”−デオキシ−８”−フルオロ−シアル酸を用いた以外は実施例１と同様にして下記に示すＦｍｏｃ基でアスパラギンのアミノ基窒素を保護したジ８”−デオキシ−８”−フルオロ−シアロα２，３糖鎖アスパラギンおよびＦｍｏｃ基でアスパラギンのアミノ基窒素を保護した２種のモノ８”−デオキシ−８”−フルオロ−シアロα２，３糖鎖アスパラギンを得た。
この糖鎖アスパラギンは式（１）のＲ１＝Ｒ２＝式（２）、Ｒ＝ＯＨ、Ｒ’＝Ｆ、Ｒ”＝ＯＨに相当する。
この糖鎖アスパラギンは式（１）のＲ１＝式（３）、Ｒ２＝式（２）、Ｒ＝ＯＨ、Ｒ’＝Ｆ、Ｒ”＝ＯＨに相当する。
この糖鎖アスパラギンは式（１）のＲ１＝式（２）、Ｒ＝ＯＨ、Ｒ’＝Ｆ、Ｒ”＝ＯＨ、Ｒ２＝式（３）に相当する。
実施例１６ （実施例１５のガラクトース加水分解酵素）
実施例２の化合物（Ｃ１−２）の代りに実施例１５で得られた化合物（Ｃ１５−２）を使用した以外は実施例２と同様にして目的とする化合物（Ｃ１６）が得られた。
この糖鎖アスパラギンは式（１）のＲ１＝式（４）、Ｒ２＝式（２）、Ｒ＝ＯＨ、Ｒ’＝Ｆ、Ｒ”＝ＯＨに相当する。
実施例１７ （実施例１６のＮ−アセチルグルコサミン加水分解酵素）
実施例３の化合物（Ｃ２）の代りに実施例１６で得られた化合物（Ｃ１６）を使用した以外は実施例３と同様にして目的とする化合物（Ｃ１７）が得られた。
この糖鎖アスパラギンは式（１）のＲ１＝式（５）、Ｒ２＝式（２）、Ｒ＝ＯＨ、Ｒ’＝Ｆ、Ｒ”＝ＯＨに相当する。
実施例１８ （実施例１７のマンノース加水分解酵素）
実施例４の化合物（Ｃ３）の代りに実施例１７で得られた化合物（Ｃ１７）を使用した以外は実施例４と同様にして目的とする化合物（Ｃ１８）が得られた。
この糖鎖アスパラギンは式（１）のＲ１＝Ｈ、Ｒ２＝式（２）、Ｒ＝ＯＨ、Ｒ’＝Ｆ、Ｒ”＝ＯＨに相当する。
実施例１９ （実施例１５のガラクトース加水分解酵素）
実施例５の化合物（Ｃ１−３）の代りに実施例１５で得られた化合物（Ｃ１５−３）を使用した以外は実施例５と同様にして目的とする化合物（Ｃ１９）が得られた。
この糖鎖アスパラギンは式（１）のＲ１＝式（２）、Ｒ＝ＯＨ、Ｒ’＝Ｆ、Ｒ”＝ＯＨ、Ｒ２＝式（４）に相当する。
実施例２０ （実施例１９のＮ−アセチルグルコサミン加水分解酵素）
実施例６の化合物（Ｃ５）の代りに実施例１９で得られた化合物（Ｃ１９）を使用した以外は実施例６と同様にして目的とする化合物（Ｃ２０）が得られた。
この糖鎖アスパラギンは式（１）のＲ１＝式（２）、Ｒ＝ＯＨ、Ｒ’＝Ｆ、Ｒ”＝ＯＨ、Ｒ２＝式（５）に相当する。
実施例２１ （実施例２０のマンノース加水分解酵素）
実施例７の化合物（Ｃ６）の代りに実施例２０で得られた化合物（Ｃ２０）を使用した以外は実施例７と同様にして目的とする化合物（Ｃ２１）が得られた。
この糖鎖アスパラギンは式（１）のＲ１＝式（２）、Ｒ＝ＯＨ、Ｒ’＝Ｆ、Ｒ”＝ＯＨ、Ｒ２＝Ｈに相当する。
実施例２２ Ｆｍｏｃ基でアスパラギンのアミノ基窒素を保護したジ９”−デオキシ−９”−フルオロ−シアロα２，３糖鎖アスパラギン（Ｃ２２−１）およびＦｍｏｃ基でアスパラギンのアミノ基窒素を保護した２種のモノ９”−デオキシ−９”−フルオロ−シアロα２，３糖鎖アスパラギン（Ｃ２２−２及びＣ２２−３）の合成
参考例１０で得られたＣＭＰ−９”−デオキシ−９”−フルオロ−シアル酸を用いた以外は実施例１と同様にして上記Ｆｍｏｃ基でアスパラギンのアミノ基窒素を保護したジ９”−デオキシ−９”−フルオロ−シアロα２，３糖鎖アスパラギンおよびＦｍｏｃ基でアスパラギンのアミノ基窒素を保護した２種のモノ９”−デオキシ−９”−フルオロ−シアロα２，３糖鎖アスパラギンを得た。
（Ｃ２２−１）は式（１）のＲ１＝Ｒ２＝式（２）、Ｒ＝ＯＨ、Ｒ’＝ＯＨ、Ｒ”＝Ｆの糖鎖アスパラギンに相当する。
（Ｃ２２−２）は式（１）のＲ１＝式（３）、Ｒ２＝式（２）、Ｒ＝ＯＨ、Ｒ’＝ＯＨ、Ｒ”＝Ｆの糖鎖アスパラギンに相当する。
（Ｃ２２−３）は式（１）のＲ１＝式（２）、Ｒ＝ＯＨ、Ｒ’＝ＯＨ、Ｒ”＝Ｆ、Ｒ２＝式（３）の糖鎖アスパラギンに相当する。
実施例２３ （実施例２２のガラクトース加水分解酵素）
実施例２の化合物（Ｃ１−２）の代りに実施例２２で得られた化合物（Ｃ２２−２）を使用した以外は実施例２と同様にして目的とする化合物（Ｃ２３）が得られた。
（Ｃ２３）は式（１）のＲ１＝式（４）、Ｒ２＝式（２）、Ｒ＝ＯＨ、Ｒ’＝ＯＨ、Ｒ”＝Ｆの糖鎖アスパラギンに相当する。
実施例２４ （実施例２３のＮ−アセチルグルコサミン加水分解酵素）
実施例３の化合物（Ｃ２）の代りに実施例２３で得られた化合物（Ｃ２３）を使用した以外は実施例３と同様にして目的とする化合物（Ｃ２４）が得られた。
（Ｃ２４）は式（１）のＲ１＝式（５）、Ｒ２＝式（２）、Ｒ＝ＯＨ、Ｒ’＝ＯＨ、Ｒ”＝Ｆの糖鎖アスパラギンに相当する。
実施例２５ （実施例２４のマンノース加水分解酵素）
実施例４の化合物（Ｃ３）の代りに実施例２４で得られた化合物（Ｃ２４）を使用した以外は実施例４と同様にして目的とする化合物（Ｃ２５）が得られた。
（Ｃ２５）は式（１）のＲ１＝Ｈ、Ｒ２＝式（２）、Ｒ＝ＯＨ、Ｒ’＝ＯＨ、Ｒ”＝Ｆの糖鎖アスパラギンに相当する。
実施例２６ （実施例２２のガラクトース加水分解酵素）
実施例５の化合物（Ｃ１−３）の代りに実施例２２で得られた化合物（Ｃ２２−３）を使用した以外は実施例５と同様にして目的とする化合物（Ｃ２６）が得られた。
（Ｃ−２６）は式（１）のＲ１＝式（２）、Ｒ＝ＯＨ、Ｒ’＝ＯＨ、Ｒ”＝Ｆ、Ｒ２＝式（４）の糖鎖アスパラギンに相当する。
実施例２７ （実施例２６のＮ−アセチルグルコサミン加水分解酵素）
実施例６の化合物（Ｃ５）の代りに実施例２６で得られた化合物（Ｃ２６）を使用した以外は実施例６と同様にして目的とする化合物（Ｃ２７）が得られた。
（Ｃ２７）は式（１）のＲ１＝式（２）、Ｒ＝ＯＨ、Ｒ’＝ＯＨ、Ｒ”＝Ｆ、Ｒ２＝式（５）の糖鎖アスパラギンに相当する。
実施例２８ （実施例２７のマンノース加水分解酵素）
実施例７の化合物（Ｃ６）の代りに実施例２７で得られた化合物（Ｃ２７）を使用した以外は実施例７と同様にして目的とする化合物（Ｃ２８）が得られた。
（Ｃ２８）は式（１）のＲ１＝式（２）、Ｒ＝ＯＨ、Ｒ’＝ＯＨ、Ｒ”＝Ｆ、Ｒ２＝Ｈの糖鎖アスパラギンに相当する。
実施例２９ Ｆｍｏｃ基でアスパラギンのアミノ基窒素を保護したジ７”−デオキシ−７”−フルオロ−シアロ（２−６）糖鎖アスパラギン（Ｃ２９−１）およびＦｍｏｃ基でアスパラギンのアミノ基窒素を保護した２種のモノ７”−デオキシ−７”−フルオロ−シアロ（２−６）糖鎖アスパラギン（Ｃ２９−２及びＣ２９−３）の合成
参考例７で得られたＣＭＰ−７”−デオキシ−７”−フルオロ−シアル酸を、シアル酸転移酵素としてα２，６転移酵素である市販のＲａｔ Ｌｉｖｅｒ由来のものを用い、カコジル酸緩衝溶液のｐＨを６．０とした以外は実施例１と同様にして下記に示すＦｍｏｃ基でアスパラギンのアミノ基窒素を保護したジ７”−デオキシ−７”−フルオロ−シアロ（２−６）糖鎖アスパラギンおよびＦｍｏｃ基でアスパラギンのアミノ基窒素を保護した２種のモノ７”−デオキシ−７”−フルオロ−シアロ（２−６）糖鎖アスパラギンを得た。（Ｃ２９−１）〜（Ｃ２９−３）の化学式を以下に示す。
実施例３０ （実施例２９のガラクトース加水分解酵素）
実施例２の化合物（Ｃ１−２）の代りに実施例２９で得られた化合物（Ｃ２９−２）を使用した以外は実施例２と同様にして目的とする化合物（Ｃ３０）が得られた。（Ｃ３０）の化学式を以下に示す。
実施例３１ （実施例３０のＮ−アセチルグルコサミン加水分解酵素）
実施例３の化合物（Ｃ２）の代りに実施例３０で得られた化合物（Ｃ３０）を使用した以外は実施例３と同様にして目的とする化合物（Ｃ３１）が得られた。（Ｃ３１）の化学式を以下に示す。
実施例３２ （実施例３１のマンノース加水分解酵素）
実施例４の化合物（Ｃ３）の代りに実施例３１で得られた化合物（Ｃ３１）を使用した以外は実施例４と同様にして目的とする化合物（Ｃ３２）が得られた。（Ｃ３２）の化学式を以下に示す。
実施例３３ （実施例２９のガラクトース加水分解酵素）
実施例５の化合物（Ｃ１−３）の代りに実施例２９で得られた化合物（Ｃ２９−３）を使用した以外は実施例５と同様にして目的とする化合物（Ｃ３３）が得られた。（Ｃ３３）の化学式を以下に示す。
実施例３４ （実施例３３のＮ−アセチルグルコサミン加水分解酵素）
実施例６の化合物（Ｃ５）の代りに実施例３３で得られた化合物（Ｃ３３）を使用した以外は実施例６と同様にして目的とする化合物（Ｃ３４）が得られた。（Ｃ３４）の化学式を以下に示す。
実施例３５ （実施例３４のマンノース加水分解酵素）
実施例７の化合物（Ｃ６）の代りに実施例３４で得られた化合物（Ｃ３４）を使用した以外は実施例７と同様にして目的とする化合物（Ｃ３５）が得られた。（Ｃ３５）の化学式を以下に示す。
【実施例３６〜４９】
以下、同様にして以下に示す糖鎖アスパラギン誘導体を合成した。
尚、代表例として８Ｆα２，６−１１糖−Ａｓｎ−Ｆｍｏｃ（Ｃ３６−１）のＮＭＲデータを以下に示す。
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ，３０℃，ＨＯＤ＝４．８１）
δ ８．０１（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝７．４，Ｆｍｏｃ），７．８０（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝７．４，Ｆｍｏｃ），７．５９（ｄｄ，２Ｈ，Ｊ＝７．４，Ｆｍｏｃ），７．５２（ｂｄｄ，２Ｈ，Ｊ＝７．４，Ｆｍｏｃ），５．２２（ｓ，１Ｈ，Ｍａｎ４−Ｈ１），５．０８（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝９．４，ＧｌｃＮＡｃ１−Ｈ１），５．０５（ｓ，１Ｈ，Ｍａｎ４’−Ｈ−１），４．８５−４．９５（ｍ，１Ｈ），４．５５−４．７５（ｍ），４．５３（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．９），４．４３（ｍ，１Ｈ），４．３５（ｂｓ，２Ｈ，Ｍａｎ３−Ｈ２），４．２８（ｂｓ，１Ｈ，Ｍａｎ４−Ｈ２），４．１０−４．２５（ｍ，２Ｈ），２．７５−２．８５（ｍ，１Ｈ，Ａｓｎ−βＣＨ），２．６３−２．７０（ｄｄ，２Ｈ，Ｊａ＝３．９，Ｊｂ＝１２．０，ＮｅｕＡｃ７，７’−Ｈ３ｅｑ），２．５５−２．６５（ｍ，１Ｈ，Ａｓｎ−βＣＨ），２．１６，２．１１，２．０８（ｅａｃｈｓ，１５Ｈ，Ａｃｘ５），１．８４（ｓ，３Ｈ，Ａｃ），１．７４（ｄｄ，１Ｈ，Ｊａ＝１２．３，Ｊｂ＝１２．２，ＮｅｕＡｃ７−Ｈ３ａｘ）．
実施例５０ （糖鎖アスパラギン誘導体のＦｍｏｃ基の脱保護）
全ての糖鎖アスパラギン誘導体において、以下の手順でＦｍｏｃ基の脱保護を行った。まず、糖鎖アスパラギンＦｍｏｃ体１μｍｏｌあたりに２４０μリットルのＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、１６０μリットルのモルホリンを加え、室温・アルゴン雰囲気下で反応させた。ＴＬＣ（展開溶媒として１Ｍ酢酸アンモニウム：イソプロパノール＝８：５を用いた）にて反応終了を確認した後、氷水で冷却した。ここにジエチルエーテルを反応溶液の１０倍量加えて１５分間攪拌した後、析出した沈殿物をろ別した。得られた残渣を水に溶解させ、３５℃でエバポレートした。更にトルエンを３ｍｌ加えエバポレートするという操作を３回繰り返した。残留物を逆相カラムクロマトグラフィー（コスモシール７５Ｃ１８−ＯＰＮ、１５×１００ｍｍ、展開溶媒は水）により精製して、対応する糖鎖アスパラギンを得た。
実施例５１ （糖鎖アスパラギンのアスパラギン残基の除去）
実施例５０で得られた糖鎖アスパラギンを無水ヒドラジンと反応させた後、アセチル化することによりアスパラギン残基を除去して対応する糖鎖を得た。
【実施例５２〜６９】
参考例２、３、８〜１３、実施例１〜７で製造した各Ｆｍｏｃ−糖鎖アスパラギン ２ｎｍｏｌを、トリス塩酸緩衝液 約１０ｍｌに溶解させた。このものに、ＧＤＰ−フコース２００ｎｍｏｌ、Ｆｕｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ Ｖ（Ｈｕｍａｎ，Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ）０．５ｍＵを加え、３７℃で約２時間静置、反応させた。反応液を超純水２０ｍｌで希釈したのち、キャピラリー電気泳動（ｆｕｓｅｄ ｓｉｌｉｃａ ｃａｐｉｌｌａｒｙ，５０ｍｍ ｉ．ｄ．，６０ｃｍ，ｂｕｆｆｅｒ；１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ｂｏｒａｔｅ，ｐＨ＝８．３，１００ｍＭ Ｈｅｐｔａｎｅ ｓｕｌｆｏｎａｔｅ，印加電圧２７ｋＶ，温度２５℃，２１４ｍｍ）で分離を行い各目的物を得た。
各実施例における原料及び目的物を以下に示す。
【技術分野】
本発明は糖鎖アスパラギン誘導体、糖鎖アスパラギンおよび糖鎖ならびにそれらの製造法に関する。
また本発明はフコースを含む糖鎖アスパラギン誘導体およびその製造方法に関する。
【背景技術】
近年、核酸（ＤＮＡ）、タンパク質に続く第三の鎖状生命分子として、糖鎖分子が注目されてきている。ヒトの体は、約６０兆個の細胞から成っている一大細胞社会であり、全ての細胞表面は糖鎖分子によって覆われている。例えば、ＡＢＯ式血液型は細胞表面の糖鎖の違いにより決定されている。
糖鎖は、細胞間の認識や相互作用に関わる働きをもち、細胞社会を成り立たせる要となっている。細胞社会の乱れは、癌、慢性疾患、感染症、老化などにつながる。
例えば、細胞が癌化すると糖鎖の構造変化が起こることが分かっている。また、コレラ菌やインフルエンザウイルスなどは、ある特定の糖鎖を認識し結合することにより、細胞に侵入し感染することが知られている。
糖鎖機能の解明は、新しい原理に基づく医薬品や食品の開発などをもたらし、病気の予防、治療に貢献するなど、幅広い応用が期待されている。
糖鎖は単糖の配列、結合様式・部位、鎖の長さ・分岐様式、全体の高次構造などの多様性から、核酸やタンパク質の構造と比べると非常に複雑な構造である。従って、その構造に由来する生物学的な情報は核酸やタンパク質に比べて多種多様である。糖鎖は、研究の重要性を認識されながらも、その構造の複雑さや多様性により、核酸やタンパク質に比べて研究の推進が遅れている状況にある。
上記のように細胞膜表面や血清などに存在するタンパク質の多くは糖鎖が結合している。糖鎖がタンパク質に共有結合した分子は糖タンパク質とよばれ、糖とタンパク質との結合様式の違いから２つのグループに分けることができる。一つはアスパラギン（Ａｓｎ）の側鎖のアミノ基と糖鎖が結合したアスパラギン結合型糖鎖（Ｎ−グリコシド結合型）である。もう一方はセリン（Ｓｅｒ）やトレオニン（Ｔｈｒ）のアルコールに糖鎖が結合したムチン結合型糖鎖（Ｏ−グリコシド結合型）である。すべてのアスパラギン結合型糖鎖は５つの糖残基からなる基本骨格をもち、結合する糖鎖の非還元末端の糖残基の種類によって高マンノース型、複合型、混成型のサブグループに分類される。一方ムチン結合型糖鎖は基本骨格（コア）の違いから４グループに分類される。
このように糖鎖は重要な化合物ではあるが、糖鎖の絶対量の不足がある。糖鎖を得る手段として、生体内に存在する糖タンパク質から糖鎖だけを遊離させる方法がある。しかし糖タンパク質から糖鎖を大量に切り出すのは、困難であり、生体内には構造が酷似した糖鎖が多く存在し、単一の糖鎖のみを大量に得るのは難しい。また、生体内に存在しない糖鎖は、大量に入手するのは困難である。
本発明の課題は、少なくとも１種以上のシアル酸あるいはシアル酸の誘導体を非還元末端に含む新規な糖鎖アスパラギン誘導体とその製造方法を提供することにある。
また本発明の課題は、少なくとも１種以上のシアル酸あるいはシアル酸の誘導体を非還元末端に含む新規な糖鎖アスパラギンとその製造方法を提供することにある。
また本発明の課題は、少なくとも１種以上のシアル酸あるいはシアル酸の誘導体を非還元末端に含む新規な糖鎖とその製造方法を提供することにある。
本発明の課題は、脂溶性の保護基でアスパラギンのアミノ基窒素が保護された糖鎖アスパラギンの非還元末端側のＮ−アセチルグルコサミンに少なくとも１個以上のフコースを含む新規な糖鎖アスパラギン誘導体とその製造方法を提供することにある。
【発明の開示】
本発明は、下記の発明に係る。
１．式（１）で表される１１〜７糖を有するα２，３糖鎖アスパラギン誘導体及びその製造法。
〔式中、Ｒ１およびＲ２は、水素原子、式（２）〜（５）で示される基であり、同一でも異なっていてもよい。ただし、Ｒ１およびＲ２の一方は必ず式（２）で示される基である。〕
Ｒ，Ｒ’，Ｒ”は下記の組合せを示す。
（ａ）Ｒ＝Ｆ、Ｒ’＝ＯＨ、Ｒ”＝ＯＨ
（ｂ）Ｒ＝ＯＨ、Ｒ’＝Ｆ、Ｒ”＝ＯＨ
（ｃ）Ｒ＝ＯＨ、Ｒ’＝ＯＨ、Ｒ”＝Ｆ
（ｄ）Ｒ＝ＯＨ、Ｒ’＝ＯＨ、Ｒ”＝ＯＨ
２．式（６）で表されるフッ素を含む１１〜７糖を有するα２，６糖鎖アスパラギン誘導体及びその製造法。
〔式中、ＲＸおよびＲＹは、水素原子、式（７）で示される基、または式（３）〜（５）で示される基である。ただし、ＲＸおよびＲＹの一方は必ず式（７）で示される基である。〕
Ｒ，Ｒ’，Ｒ”は下記の組合せを示す。
（ａ）Ｒ＝Ｆ、Ｒ’＝ＯＨ、Ｒ”＝ＯＨ
（ｂ）Ｒ＝ＯＨ、Ｒ’＝Ｆ、Ｒ”＝ＯＨ
（ｃ）Ｒ＝ＯＨ、Ｒ’＝ＯＨ、Ｒ”＝Ｆ
３．式（８）で表される１１〜７糖を有するα２，３糖鎖アスパラギン及びその製造法。
〔式中、Ｒ１およびＲ２は上記に同じ。〕
４．式（９）で表されるフッ素を含む１１〜７糖を有するα２，６糖鎖アスパラギン及びその製造法。
〔式中、ＲＸおよびＲＹは上記に同じ。〕
５．式（１０）で表される１１〜７糖を有するα２，３糖鎖及びその製造法。
〔式中、Ｒ１およびＲ２は上記に同じ。〕
６．式（１１）で表されるフッ素を含む１１〜７糖を有するα２，６糖鎖及びその製造法。
〔式中、ＲＸおよびＲＹは上記に同じ。〕
７．式（２２）で表される１１糖を有する（α２，３）（α２，６）糖鎖アスパラギン誘導体。
〔式中、Ｒ１は式（２）で示される基であり、ＲＹは下記式（７）で示される基である。〕
Ｒ，Ｒ’，Ｒ”は下記の組合せを示す。
（ａ）Ｒ＝Ｆ、Ｒ’＝ＯＨ、Ｒ”＝ＯＨ
（ｂ）Ｒ＝ＯＨ、Ｒ’＝Ｆ、Ｒ”＝ＯＨ
（ｃ）Ｒ＝ＯＨ、Ｒ’＝ＯＨ、Ｒ”＝Ｆ
（ｄ）Ｒ＝ＯＨ、Ｒ’＝ＯＨ、Ｒ”＝ＯＨ
８．式（２３）で表される１１糖を有する（α２，３）（α２，６）糖鎖アスパラギン誘導体。
〔式中、Ｒ２は式（２）で示される基であり、ＲＸは下記式（７）で示される基である。〕
Ｒ，Ｒ’，Ｒ”は下記の組合せを示す。
（ａ）Ｒ＝Ｆ、Ｒ’＝ＯＨ、Ｒ”＝ＯＨ
（ｂ）Ｒ＝ＯＨ、Ｒ’＝Ｆ、Ｒ”＝ＯＨ
（ｃ）Ｒ＝ＯＨ、Ｒ’＝ＯＨ、Ｒ”＝Ｆ
（ｄ）Ｒ＝ＯＨ、Ｒ’＝ＯＨ、Ｒ”＝ＯＨ
本発明は、脂溶性の保護基でアスパラギンのアミノ基窒素が保護された糖鎖アスパラギンの非還元末端側のＮ−アセチルグルコサミンに少なくとも１個以上のフコースを含む糖鎖アスパラギン誘導体、およびその製造方法に係る。
本発明者は、先に特願２００１−１８５６８５号（以下、先願という）において、種々の単離された糖鎖アスパラギン誘導体を従来に比べて非常に容易かつ大量に得ることができる、糖鎖アスパラギン誘導体、糖鎖アスパラギン、糖鎖の製造方法、更には糖残基が任意に欠失した糖鎖が結合した新規な糖鎖アスパラギン誘導体、糖鎖アスパラギン、糖鎖を開発した。
この先願の方法は例えば
（１） （ａ）１種もしくは２種以上の糖鎖アスパラギンを含む混合物に含まれる該糖鎖アスパラギンに脂溶性の保護基を導入して糖鎖アスパラギン誘導体混合物を得る工程、
ならびに
（ｂ）該糖鎖アスパラギン誘導体混合物または該糖鎖アスパラギン誘導体混合物に含まれる糖鎖アスパラギン誘導体を加水分解して得られる混合物をクロマトグラフィーに供して各糖鎖アスパラギン誘導体を分離する工程、
を含む、糖鎖アスパラギン由来の糖鎖アスパラギン誘導体の製造方法、
（２） （ｂ’）工程（ｂ）で分離された糖鎖アスパラギン誘導体を糖加水分解酵素を用いて加水分解する工程をさらに含む前記（１）記載の糖鎖アスパラギン誘導体の製造方法、
（３） １種もしくは２種以上の糖鎖アスパラギンを含む混合物が、下記式（Ａ）の化合物および／または該化合物において１以上の糖残基が欠失した化合物を含むものである、前記（１）または（２）記載の糖鎖アスパラギン誘導体の製造方法、
（４） 脂溶性の保護基がフルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）基である前記（１）〜（３）いずれか記載の糖鎖アスパラギン誘導体の製造方法、
（５） 工程（ａ）が、非還元末端にシアル酸残基を有する１種もしくは２種以上の糖鎖アスパラギンを含む混合物に含まれる該糖鎖アスパラギンにＦｍｏｃ基を導入し、かつシアル酸残基にベンジル基を導入して糖鎖アスパラギン誘導体混合物を得る工程である、前記（１）〜（３）いずれか記載の糖鎖アスパラギン誘導体の製造方法、
（６） （ａ）１種もしくは２種以上の糖鎖アスパラギンを含む混合物に含まれる該糖鎖アスパラギンに脂溶性の保護基を導入して糖鎖アスパラギン誘導体混合物を得る工程、
（ｂ）該糖鎖アスパラギン誘導体混合物または該糖鎖アスパラギン誘導体混合物に含まれる糖鎖アスパラギン誘導体を加水分解して得られる混合物をクロマトグラフィーに供して各糖鎖アスパラギン誘導体を分離する工程、ならびに
（ｃ）工程（ｂ）で分離された糖鎖アスパラギン誘導体の保護基を除去して糖鎖アスパラギンを得る工程、
を含む、糖鎖アスパラギンの製造方法、
（７） （ｂ’）工程（ｂ）で分離された糖鎖アスパラギン誘導体を糖加水分解酵素を用いて加水分解する工程、および／または
（ｃ’）工程（ｃ）で得られた糖鎖アスパラギンを糖加水分解酵素を用いて加水分解する工程、
をさらに含む、前記（６）記載の糖鎖アスパラギンの製造方法、
（８） １種もしくは２種以上の糖鎖アスパラギンを含む混合物が、下記式（Ａ）の化合物および／または該化合物において１以上の糖残基が欠失した化合物を含むものである、前記（６）または（７）記載の糖鎖アスパラギンの製造方法、
（９） 脂溶性の保護基がＦｍｏｃ基である前記（６）〜（８）いずれか記載の糖鎖アスパラギンの製造方法、
（１０） 工程（ａ）が、非還元末端にシアル酸残基を有する１種もしくは２種以上の糖鎖アスパラギンを含む混合物に含まれる該糖鎖アスパラギンにＦｍｏｃ基を導入し、かつシアル酸残基にベンジル基を導入して糖鎖アスパラギン誘導体混合物を得る工程である、前記（６）〜（８）いずれか記載の糖鎖アスパラギンの製造方法などである。
これら糖鎖アスパラギン誘導体及び糖鎖アスパラギンの製造についての詳細は、上記先願に述べられているので、これを引用する。しかし若干先願の内容について述べると、先願の糖鎖アスパラギン誘導体の製造方法は、たとえば、天然の糖タンパク質に由来する糖鎖アスパラギン、好ましくはアスパラギン結合型糖鎖から得られる糖鎖アスパラギンの混合物に含まれる当該糖鎖アスパラギンに脂溶性の保護基を導入（結合）して糖鎖アスパラギン誘導体の混合物を得た後に当該混合物を各糖鎖アスパラギン誘導体に分離することを１つの大きな特徴とする。なお、本明細書において、「糖鎖アスパラギン」とはアスパラギンが結合した状態の糖鎖をいう。また、「アスパラギン結合型糖鎖」とはタンパク質のポリペプチド中のアスパラギン（Ａｓｎ）の酸アミノ基に、還元末端に存在するＮ−アセチルグルコサミンがＮ−グリコシド結合した糖鎖群であって、Ｍａｎ（β１−４）ＧｌｃＮａｃ（β１−４）ＧｌｃＮａｃを母核とする糖鎖群をいう。「糖鎖アスパラギン誘導体」とはアスパラギン残基に脂溶性の保護基が結合した状態の糖鎖アスパラギンをいう。また、化合物の構造式中、「ＡｃＨＮ」はアセトアミド基を示す。
前記するように、天然の糖タンパク質に由来する糖鎖は非還元末端の糖残基がランダムに欠失した糖鎖の混合物である。本発明者らは、意外にも天然の糖タンパク質に由来する糖鎖、具体的には糖鎖アスパラギンの混合物に含まれる当該糖鎖アスパラギンに脂溶性の保護基を導入することで、当該保護基が導入された糖鎖アスパラギン誘導体の混合物を公知のクロマトグラフィーの手法を用いて容易に個々の糖鎖アスパラギン誘導体に分離することができることを見出した。それにより、種々の構造を有する糖鎖アスパラギン誘導体をそれぞれ大量に調製することが可能となった。たとえば、従来分離が困難であった類似構造の糖鎖アスパラギン誘導体同士の分離が可能となり、それらの化合物を各々、容易かつ大量に調製することができる。また、得られた糖鎖アスパラギン誘導体を元に、たとえば、糖加水分解酵素を順次作用させて糖残基を除去することにより、さらに様々な糖鎖アスパラギン誘導体を合成することもできる。
このように、糖鎖アスパラギンに脂溶性の保護基を導入して誘導体化することにより個々の糖鎖アスパラギン誘導体の分離が可能となったが、これは、脂溶性の保護基を導入したことにより糖鎖アスパラギン誘導体の全体の脂溶性が高まり、たとえば、好適に使用される逆相系カラムとの相互作用が格段に向上し、その結果、より鋭敏に糖鎖構造の差を反映して個々の糖鎖アスパラギン誘導体が分離されるようになったことによると考えられる。
さらに、先願によれば、得られた糖鎖アスパラギン誘導体の保護基を除去することにより種々の糖鎖アスパラギンを、人工的に容易かつ大量に得ることができる。
しかし、上記先願で得られる糖鎖アスパラギン誘導体、糖鎖アスパラギン及び糖鎖はいずれもα２，６結合体のものであった。
また、上記先願で得られる糖鎖アスパラギン誘導体、糖鎖アスパラギン及び糖鎖はいずれもフコースが結合していない糖鎖アスパラギン誘導体であった。
本発明では、上記先願に記載のないα２，３結合体の糖鎖アスパラギン誘導体、糖鎖アスパラギン及び糖鎖、並びにα２，６結合体のもので更にフッ素を含む、いずれも新規な糖鎖アスパラギン誘導体、糖鎖アスパラギン及び糖鎖を得るものである。
また本発明では、上記先願に記載のないフコース結合体の糖鎖アスパラギン誘導体を得るものである。
ここで、α２，３結合体とα２，６結合体の相異について以下に説明する。
α２，３結合体、α２，６結合体とは、シアル酸とガラクトースとの結合様式を表わすものである。前者は、シアル酸の２位の炭素と、ガラクトースの３位の炭素がα結合しているものをいい、後者は、シアル酸の２位の炭素と、ガラクトースの６位の炭素がα結合しているものをいう。これらは、ガラクトースとの結合炭素の違いではある。
しかしながらこの違いは、例えば、インフルエンザウイルスは、シアル酸を末端に持つ糖鎖をレセプターとして認識している。しかし、ヒトとトリのインフルエンザウイルスではレセプター特異性が異なっている。前者は、シアル酸がガラクトースにα２，６結合した糖鎖を、後者はシアル酸がガラクトースにα２，３結合した糖鎖を特異的に認識する。シアル酸−ガラクトース間の結合様式の違い、さらにはシアル酸の相違が、インフルエンザウイルスの宿主域の制限に大きな役割を果たしていることが知られている。
本発明では、このように先願には記載のない新規な糖鎖アスパラギン誘導体、糖鎖アスパラギン及び糖鎖、並びにそれらの製造法に係るものである。
本発明の方法においては先ず、出発化合物である脂溶性の保護基で保護された糖鎖アスパラギン（９糖−Ａｓｎ−Ｆｍｏｃ）をシアル酸転移酵素を用いてシアル酸あるいはシアル酸の誘導体を転移させ、得られた脂溶性の保護基で保護された糖鎖アスパラギンをクロマトグラフィーに供することにより分離し、脂溶性の保護基で保護されたジシアロ糖鎖アスパラギン誘導体および２種のモノシアロ糖鎖アスパラギン誘導体が得られる。
次いで、得られたジシアロ糖鎖アスパラギン誘導体および２種のモノシアロ糖鎖アスパラギン誘導体を糖加水分解することにより、シアル酸あるいはシアル酸誘導体を有する９〜７糖鎖アスパラギン誘導体が得られる。
また、上記で得られた１１〜７糖鎖アスパラギン誘導体やジシアロ糖鎖アスパラギン（α２，６−１１糖−Ａｓｎ−Ｆｍｏｃ）を出発原料としそれを糖加水分解することにより得られる１０〜６糖鎖アスパラギン誘導体に、糖転移酵素によりフコースを転移することによりフコースを含む１３〜７糖鎖アスパラギン誘導体が得られる。
当該保護基としては特に限定されるものではなく、例えば、Ｆｍｏｃ基やｔ−ブチルオキシカルボニル（Ｂｏｃ）基、ベンジル基、アリル基、アリルオキシカルボニル基、アセチル基等の、カーボネート系またはアミド系の保護基等を使用することができる。得られた糖鎖アスパラギン誘導体を直ちに所望の糖ペプチドの合成に使用できるという観点から、当該保護基としては、Ｆｍｏｃ基またはＢｏｃ基などが好ましく、Ｆｍｏｃ基がより好ましい。Ｆｍｏｃ基はシアル酸等比較的酸性条件に不安定な糖が糖鎖に存在する場合に特に有効である。また、保護基の導入は公知の方法（たとえば、Ｐｒｏｔｅｃｔｉｎｇ ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ ＩＮＣ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ １９９１，ＩＳＢＮ ０−４７１−６２３０１−６を参照）に従って行えばよい。
たとえば、Ｆｍｏｃ基を用いる場合、糖鎖アスパラギンに対しアセトンを適量加えた後、さらに９−フルオレニルメチル−Ｎ−スクシニミヂルカーボネートと炭酸水素ナトリウムを加えて溶解し、２５℃にてアスパラギン残基へのＦｍｏｃ基の結合反応を行うことにより、当該糖鎖アスパラギンのアスパラギン残基にＦｍｏｃ基を導入することができる。
以上の操作により、脂溶性の保護基が導入された糖鎖アスパラギン誘導体が得られる。
シアル酸としては、一般に市販されているシアル酸あるいは化学合成したものを用いることができる。
シアル酸の誘導体としては、一般に市販されているシアル酸の誘導体あるいは化学合成したものを用いることができる。具体的には、シアル酸の７位、８位あるいは９位の炭素に結合している水酸基を水素原子あるいはハロゲン原子で置換したものを挙げることができる。ハロゲン原子としては、フッ素、塩素、臭素等を挙げることができるが、好ましくはフッ素がよい。
シアル酸転移酵素としては、一般に市販されているもの、天然由来のもの、遺伝子組換えにより生産されたものを用いることができ、転移させるシアル酸あるいはシアル酸の誘導体の種類により適宜選択することができる。具体的には、α２，３転移酵素であるＲａｔ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ由来のもの、α２，６転移酵素であるＲａｔ Ｌｉｖｅｒ由来のものを挙げることができる。また、シアリターゼをもちいてｐＨ調整等により平衡をずらすことにより、シアル酸あるいはシアル酸の誘導体を転移させてもよい。
上記糖鎖アスパラギン誘導体のクロマトグラフィーによる分離は、適宜、公知のクロマトグラフィーを単独でまたは複数組み合わせて用いることにより行うことができる。
たとえば、得られた糖鎖アスパラギン誘導体混合物をゲル濾過カラムクロマトグラフィーで精製後、ＨＰＬＣを用いて精製する。ＨＰＬＣにおいて用い得るカラムとしては逆相系のカラムが好適であり、たとえば、ＯＤＳ、Ｐｈｅｎｙｌ系、ニトリル系や、陰イオン交換系のカラム、具体的には、たとえば、ファルマシア社製モノＱカラム、イヤトロン社製イアトロビーズカラムなどが利用可能である。分離条件等は適宜、公知の条件を参照して調整すればよい。以上の操作により、糖鎖アスパラギン誘導体混合物から所望の各糖鎖アスパラギン誘導体を得ることができる。
以上の操作により、たとえば、保護基がＦｍｏｃ基である場合、式（１２）、（１３）、（１７）、（１８）、（２２）、（２３）の糖鎖アスパラギン誘導体を単独又は混合物の形で得ることができる。
次に、上記で分離された糖鎖アスパラギン誘導体を加水分解することにより、所望の糖鎖構造を有する糖鎖アスパラギン誘導体を効率的に得ることができる。たとえば、糖鎖アスパラギン誘導体を分離する段階においては混合物に含まれる糖鎖アスパラギン誘導体の種類を制限して糖鎖アスパラギン誘導体を大まかに分離し、次いで加水分解、たとえば、糖加水分解酵素を用いて加水分解することにより所望の糖鎖構造を有する糖鎖アスパラギン誘導体を効率的に得ることができる。なお、加水分解は前記と同様にして行うことができる。特に、所望の糖鎖構造を有する糖鎖アスパラギン誘導体をより効率的に得る観点から、糖残基の切断様式が明確な糖加水分解酵素を用いて加水分解するのが好ましい。
たとえば、ガラクトース残基の除去は、加水分解される化合物を緩衝液（たとえば、リン酸緩衝溶液、酢酸緩衝溶液、グッド緩衝溶液など）に溶かし、公知の条件に従ってガラクトース加水分解酵素を用いてガラクトース残基の切断反応を行うことにより成し得る。なお、加水分解される化合物は各々単離されたものであっても混合物であってもよい。この反応で用いるガラクトース加水分解酵素は市販されている公知のエキソ型の酵素を利用するのが好ましい。また、同様の活性を有するものであれば、新たに単離された酵素、遺伝子工学的に創製された酵素であってもよい。次いで、前記と同様にして、反応後に得られる反応液（糖残基が切断された糖鎖アスパラギン誘導体の混合物）をクロマトグラフィーに供し、各糖鎖アスパラギン誘導体を得ればよい。たとえば、分離はＨＰＬＣ（ＯＤＳカラム、展開溶媒は５０ｍＭ酢酸アンモニウム水溶液：アセトニトリル＝８２：１８）で行うのが好ましい。
Ｎ−アセチルグルコサミン残基の除去は、加水分解される化合物を緩衝液（たとえば、リン酸緩衝溶液、酢酸緩衝溶液、グッド緩衝溶液など）に溶かし、公知の条件に従ってＮ−アセチルグルコサミン加水分解酵素を用いてＮ−アセチルグルコサミン残基の切断反応を行うことにより成し得る。また、Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼ加水分解酵素を用いてもよい。なお、加水分解される化合物は各々単離されたものであっても混合物であってもよい。この反応で用いる各酵素は市販されているエキソ型の酵素を利用するのが好ましい。また、同様の活性を有するものであれば、新たに単離された酵素、遺伝子工学的に創製された酵素であってもよい。次いで、前記と同様にして、反応後に得られる反応液（糖残基が切断された糖鎖アスパラギン誘導体の混合物）をクロマトグラフィーに供し、各糖鎖アスパラギン誘導体を得ればよい。たとえば、分離はＨＰＬＣ（ＯＤＳカラム、展開溶媒は５０ｍＭ酢酸アンモニウム水溶液：メタノール＝６５：３５または５０ｍＭ酢酸アンモニウム水溶液：アセトニトリル＝８２：１８）で行うのが好ましい。
マンノース残基の除去は、加水分解される化合物を緩衝液（たとえば、リン酸緩衝溶液、酢酸緩衝溶液、グッド緩衝溶液など）に溶かし、公知の条件に従ってマンノース加水分解酵素を用いてマンノース残基の切断反応を行うことにより成し得る。なお、加水分解される化合物は各々単離されたものであっても混合物であってもよい。この反応で用いるマンノース加水分解酵素は市販されているエキソ型の酵素を利用するのが好ましい。また、同様の活性を有するものであれば、新たに単離された酵素、遺伝子工学的に創製された酵素であってもよい。次いで、前記と同様にして、反応後に得られる反応液（糖残基が切断された糖鎖アスパラギン誘導体の混合物）をクロマトグラフィーに供し、各糖鎖アスパラギン誘導体を得ればよい。たとえば、分離はＨＰＬＣ（ＯＤＳカラム、展開溶媒は、１０〜２００ｍＭ程度の酢酸アンモニウムなどの緩衝溶液とアセトニトリル、あるいはエタノール、あるいはメタノール、あるいはブタノール、あるいはプロパノールなどの脂溶性のある水溶性有機溶剤を適宜混ぜて用いることができる。ここに例示する場合、展開溶媒としては５０ｍＭ酢酸アンモニウム水溶液：アセトニトリル＝８２：１８が好適である）で行うのが好ましい。
このようにして得られた各糖鎖アスパラギン誘導体を得た後、フコースを転移させることにより本発明の脂溶性の保護基でアスパラギンのアミノ基窒素が保護された糖鎖アスパラギンの非還元末端側のＮ−アセチルグルコサミンに少なくとも１個以上のフコースを含む新規な糖鎖アスパラギン誘導体を製造することができる。
フコースとしては、一般に市販されているフコースあるいは化学合成したものを用いることができる。
フコース転移酵素としては、一般に市販されているもの、天然由来のもの、遺伝子組換えにより生産されたものを用いることができ、転移させるフコースの種類により適宜選択することができる。具体的には、糖鎖アスパラギンの非還元末端側のＮ−アセチルグルコサミンにフコースを転移させる酵素であるＦｕｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ Ｖ（Ｈｕｍａｎ，Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ、血漿由来、血清由来、乳汁由来、肝臓由来）などを挙げることができる。また、フコース加水分解酵素を用いてｐＨ調整等により平衡ずらすことにより、フコースを転移させてもよい。
上記糖鎖アスパラギン誘導体のクロマトグラフィーによる分離は、適宜、公知のクロマトグラフィーを単独でまたは複数組合せて用いることにより行うことができる。
たとえば、得られた糖鎖アスパラギン誘導体混合物をゲル濾過カラムクロマトグラフィーで精製後、ＨＰＬＣを用いて精製する。ＨＰＬＣにおいて用い得るカラムとしては逆相系のカラムが好適であり、たとえば、ＯＤＳ、Ｐｈｅｎｙｌ系、ニトリル系や、陰イオン交換系のカラム、具体的には、たとえば、ファルマシア社製モノＱカラム、イヤトロン社製イアトロビーズカラムなどが利用可能である。分離条件等は適宜、公知の条件を参照して調整すればよい。以上の操作により、糖鎖アスパラギン誘導体混合物から所望の各糖鎖アスパラギン誘導体を得ることができる。
このように、各糖鎖アスパラギン誘導体を得た後、さらに各種糖加水分解酵素等を用いて当該誘導体を加水分解し、糖鎖の非還元末端の糖残基を除去することにより、たとえば、糖鎖の末端の分岐構造が不均一な様々な糖鎖アスパラギン誘導体をそれぞれ単一化合物として得ることができる。また、種々の糖加水分解酵素を用い、加水分解する順番やその種類を変えることで、より多くの種類の糖鎖アスパラギン誘導体を製造することができる。
従来の方法によれば、極限られた糖鎖構造を有する糖鎖アスパラギン誘導体を分析スケールで得るのにさえ膨大な時間とコストが必要であったが、本発明によれば、特別の装置や試薬を必要とすることなく、慣用のゲルろ過カラム、ＨＰＬＣカラムや、少なくとも３種類の糖加水分解酵素（たとえば、ガラクトース加水分解酵素、マンノース加水分解酵素、Ｎ−アセチルグルコサミン加水分解酵素）等を使って、２週間程度で所望の糖鎖構造を有する糖鎖アスパラギン誘導体を１グラム程度調製することが可能である。
以上の操作により、たとえば、保護基がＦｍｏｃ基である場合、式（１４）〜（１６）、（１９）〜（２１）の糖鎖アスパラギン誘導体を単独又は混合物の形で得ることができる。
また本発明は、種々の単離された糖鎖アスパラギンを大量に得ることができる糖鎖アスパラギンの製造方法を提供する。当該方法は、前記糖鎖アスパラギン誘導体の製造方法に従う糖鎖アスパラギン誘導体の製造工程に続き、さらに、得られた糖鎖アスパラギン誘導体から保護基を除去する工程を含むものである。
糖鎖アスパラギン誘導体からの保護基の除去は、公知の方法に従って行うことができる（たとえば、Ｐｒｏｔｅｃｔｉｎｇ ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ ＩＮＣ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ １９９１，ＩＳＢＮ ０−４７１−６２３０１−６を参照）。たとえば、保護基がＦｍｏｃ基である場合、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中、糖鎖アスパラギン誘導体にモルホリンを加えて反応を行うことによりＦｍｏｃ基を除去することができる。また、Ｂｏｃ基は弱酸を反応させることで除去することができる。保護基除去後、所望により適宜、公知の方法、たとえば、ゲル濾過カラム、イオン交換カラムなどを使用する各種クロマトグラフィーや、ＨＰＬＣによる分離という方法によって精製することにより、糖鎖アスパラギンを得てもよい。
以上の操作により、たとえば、式（８）、（９）の糖鎖アスパラギンを単独又は混合物の形で得ることができる。
さらに本発明は、種々の単離された糖鎖を大量に得ることができる糖鎖の製造方法を提供する。当該方法は、前記糖鎖アスパラギンの製造方法に従う糖鎖アスパラギンの製造工程に続き、さらに、得られた糖鎖アスパラギンからアスパラギン残基を除去する工程を含むものである。
糖鎖アスパラギンからのアスパラギン残基の除去は、公知の方法に従って行うことができる。たとえば、糖鎖アスパラギンを無水ヒドラジンと反応させた後、アセチル化することによりアスパラギン残基を除去して糖鎖を得ることができる。また、糖鎖アスパラギンを塩基性水溶液で加熱還流後、アセチル化することによってもアスパラギン残基を除去して糖鎖を得ることができる。アスパラギン残基除去後、所望により適宜、公知の方法、たとえば、ゲル濾過カラム、イオン交換カラムなどを使用する各種クロマトグラフィーや、ＨＰＬＣによる分離という方法によって精製してもよい。
以上の操作により、たとえば、式（１０）、（１１）の糖鎖を単独又は混合物の形で得ることができる。
このように、本発明によれば、所望の糖鎖構造を有する糖鎖アスパラギン誘導体、糖鎖アスパラギンおよび糖鎖（以下、３つ併せて糖鎖類という場合がある）を安価かつ効率的に大量に製造することができる。
かかる糖鎖類は医薬品開発等の分野において非常に有用である。たとえば、医薬品開発における応用例としては、たとえば、ガンのワクチン合成があげられる。細胞がガン化すると体内にはなかった糖鎖が発現することが知られている。また、当該糖鎖を化学的に合成し、ワクチンとして個体に投与すると、ガンの増殖が抑制されることも知られている。そこで、本発明により所望の糖鎖類を製造することができれば、ガンの治療に有効なワクチンの合成を行うことが可能である。また、本発明により得られる糖鎖類を、さらに化学的な反応および糖転移酵素による反応などを組み合わせて新たな糖残基を結合させて誘導体化し、新規なワクチンの合成を行うことも可能である。
【発明を実施するための最良の形態】
以下に参考例、実施例を挙げて説明するが、本発明は何らこれら実施例に限定されるものではない。
参考例１ α２，６−ジシアロ糖鎖アスパラギンの合成
卵由来粗精製ＳＧＰ（シアリルグリコペプチド）２．６ｇをトリス−塩酸・塩化カルシウム緩衝溶液（ＴＲＩＺＭＡ ＢＡＳＥ ０．０５ｍｏｌ／ｌ、塩化カルシウム０．０１ｍｏｌ／ｌ、ｐＨ７．５）１００ｍｌに溶解させた。これにアジ化ナトリウム５８ｍｇ（７７２μｍｏｌ）とアクチナーゼ−Ｅ（科研製薬社製）５２６ｍｇを加え、３７℃で静置した。６５時間後、再びアクチナーゼ−Ｅを２６３ｍｇ加え、更に３７℃で２４時間静置した。この溶液を凍結乾燥した後、残留物をゲル濾過カラムクロマトグラフィー（Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５、２．５φ×１ｍ、展開溶媒は水、流速は１．０ｍｌ／ｍｉｎ）で２回精製し、α２，６−ジシアロ糖鎖アスパラギンを１．３ｇ（５５５μｍｏｌ）得た。
得られたジシアロ糖鎖アスパラギンの物理的データは以下の通りである。
１Ｈ−ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ，３０℃）
δ ５．１３（ｓ，１Ｈ，Ｍａｎ４−Ｈ−１），５．０７（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝９．５Ｈｚ，ＧｌｃＮＡｃ１−Ｈ−１），４．９５（ｓ，１Ｈ，Ｍａｎ４−Ｈ−１），４．７７（ｓ，１Ｈ，Ｍａｎ３−Ｈ−１），４．６１（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，ＧｌｃＮＡｃ２−Ｈ−１），４．６０（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，ＧｌｃＮＡｃ５，５−Ｈ−１），４．４４（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，Ｇａｌ６，６−Ｈ−１），４．２５（ｂｄ，１Ｈ，Ｍａｎ３−Ｈ−２），４．２０（ｂｄｄ，１Ｈ，Ｍａｎ４−Ｈ−２），４．１２（ｂｄ，１Ｈ，Ｍａｎ４−Ｈ−２），２．９４（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．５Ｈｚ，１７．２Ｈｚ，Ａｓｎ−βＣＨ），２．８５（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．０Ｈｚ，１７．２Ｈｚ，Ａｓｎ−βＣＨ），２．６７，２．６６（ｄｄ，２Ｈ，Ｊ＝４．６Ｈｚ，１２．４Ｈｚ，ＮｅｕＡｃ７，７−Ｈ−３ｅｑ），２．０７（ｓ，３Ｈ，Ａｃ），２．０６（ｓ，６Ｈ，Ａｃ×２），２．０２（ｓ，６Ｈ，Ａｃ×２），２．０１（ｓ，３Ｈ，Ａｃ），１．７１（ｄｄ，２Ｈ，Ｊ＝１２．４Ｈｚ，１２．４Ｈｚ，ＮｅｕＡｃ７，７−Ｈ−３ａｘ．）
参考例２ 化合物１、２、３および４の合成
参考例１で得られたα２，６−ジシアロ糖鎖アスパラギン（６０９ｍｇ，２６１μｍｏｌ）を水２０．７ｍｌに溶解させ、さらに０．１規定塩酸１３．８ｍｌを加えた。この溶液を７０℃で３５分間加熱した後速やかに氷冷し、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を加えｐＨ７とした。これを凍結乾燥した後、残留物をゲル濾過カラムクロマトグラフィー（Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５、２．５φ×１ｍ、展開溶媒は水、流速は１．０ｍｌ／ｍｉｎ）で精製したところ、α２，６−ジシアロ糖鎖アスパラギン、２種のα２，６−モノシアロ糖鎖アスパラギンおよびアシアロ糖鎖アスパラギンの混合物５３４ｍｇを得た。この４成分はそれぞれを単離することなく次の工程に進めた。
なお、得られた糖鎖混合物の物理的データは以下の通りである。
１Ｈ−ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ，３０℃）
５．１３（ｓ，Ｍａｎ４−Ｈ１），５．１２（ｓ，Ｍａｎ４−Ｈ１），５．０１（ｄ，ＧｌｃＮＡｃ１−Ｈ１），４．９４（ｓ，Ｍａｎ４’−Ｈ１），４．９３（ｓ，Ｍａｎ４’−Ｈ１），４．８２（ｓ，Ｍａｎ３−Ｈ１），４．６０（ｄ，ＧｌｃＮＡｃ２−Ｈ１），４．５８（ｄ，ＧｌｃＮＡｃ５，５’−Ｈ１），４．４７（ｄｄ，Ｇａｌ６，６’−Ｈ１），４．４４（ｄ，Ｇａｌ６，６’−Ｈ１），４．２４（ｄ，Ｍａｎ３−Ｈ２），４．１９（ｄ，Ｍａｎ４’−Ｈ２），４．１１（ｄ，Ｍａｎ４−Ｈ２），２．９７（ｂｄｄ，ＡｓＮ−βＣＨ），２．７２（ｄｄ，ＮｅｕＡｃ７−Ｈ３ｅｑ，ＮｅｕＡｃ７−Ｈ３ｅｑ），２．６４（ｂｄｄ，ＡｓＮ−βＣＨ），２．１５（ｓ×５，−Ａｃ），１．７９（ｄｄ，ＮｅｕＡｃ７−Ｈ３ａｘ，ＮｅｕＡｃ７’−Ｈ３ａｘ）
得られた糖鎖の混合物４２９ｍｇをアセトン１６．３ｍｌと水１１．２ｍｌに溶解させた。ここに９−フルオレニルメチル−Ｎ−スクシニミジルカーボネート（１５５．７ｍｇ，４６１．７μｍｏｌ）と炭酸水素ナトリウム（８０．４ｍｇ，９５７μｍｏｌ）を加え、室温で２時間攪拌した。この溶液をエバポレーターに供してアセトンを除き、残りの溶液をゲル濾過カラムクロマトグラフィー（Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５、２．５φ×１ｍ、展開溶媒は水、流速は１．０ｍｌ／ｍｉｎ）で精製したところ、化合物１、化合物２および３、化合物４の混合物３０９ｍｇが得られた。この混合物をＨＰＬＣ（ＯＤＳカラム、展開溶媒は５０ｍＭ酢酸アンモニウム水溶液：メタノール＝６５：３５、２．０φ×２５ｃｍ、流速３ｍｌ／ｍｉｎ）を用いて精製したところ、５１分後に化合物１が、６７分後に化合物２および３の混合物が、９３分後に化合物４が溶出した。それぞれを取り分け凍結乾燥を行った後、ゲル濾過カラムクロマトグラフィー（Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５、２．５φ×３０ｃｍ、展開溶媒は水、流速は１．０ｍｌ／ｍｉｎ）で脱塩することで目的の化合物２および３の混合物１５０ｍｇを得た。
なお、得られた化合物１の物理的データは以下の通りである。
１Ｈ−ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ，３０℃）
７．９９（２Ｈ，ｄ，Ｆｍｏｃ），７．７９（２Ｈ，ｄ，Ｆｍｏｃ），７．５５（４Ｈ，ｍ，Ｆｍｏｃ），５．１５（１Ｈ，ｓ，Ｍａｎ４−Ｈ１），５．０６（１Ｈ，ｄ，ＧｌｃＮＡｃ１−Ｈ１），４．９５（１Ｈ，ｓ，Ｍａｎ４’−Ｈ１），４．８２（１Ｈ，ｓ，Ｍａｎ３−Ｈ１），４．６９（１Ｈ，ｄ，ＧｌｃＮＡｃ２−Ｈ１），４．６７（２Ｈ，ｄ，ＧｌｃＮＡｃ５，５’−Ｈ１），４．５３（２Ｈ，ｄ，Ｇａｌ６，６’−Ｈ１），４．３４（１Ｈ，ｄ，Ｍａｎ３−Ｈ２），４．２７（１Ｈ，ｄ，Ｍａｎ４’−Ｈ２），４．１９（１Ｈ，ｄ，Ｍａｎ４−Ｈ２），３．０３（１Ｈ，ｂｄｄ，ＡｓＮ−βＣＨ），３．００（１Ｈ，ｂｄｄ，ＡｓＮ−βＣＨ），２．７６（２Ｈ，ｄｄ，ＮｅｕＡｃ７，７’−Ｈ３ｅｑ），２．１５（１８Ｈ，ｓ×６，−Ａｃ），１．７９（２Ｈ，ｄｄ，ＮｅｕＡｃ７，７’−Ｈ３ａｘ）；ＨＲＭＳ Ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ１０３Ｈ１５４Ｎ８ＮａＯ６６［Ｍ＋Ｎａ＋］２５８１．８８３８，ｆｏｕｎｄ，２５８１．８８２１
上記の糖鎖の構造を記号化すると次のようになる。ここで
ＮｅｕＡｃ：シアル酸 Ｇａｌ：Ｄ−ガラクトース ＧｌｃＮＡｃ：Ｎ−アセチルグルコサミン Ｍａｎ：Ｄ−マンノース Ａｓｎ：アスパラギン を示す。
また、得られた化合物２および３の混合物の物理的データは以下の通りである。
１Ｈ−ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ，３０℃）
７．９９（ｄ，Ｆｍｏｃ），７．７９（ｄ，Ｆｍｏｃ），７．５５（ｍ，Ｆｍｏｃ），５．１４（ｓ，Ｍａｎ４−Ｈ１），５．１２（ｓ，Ｍａｎ４−Ｈ），５．００（ｄ，ＧｌｃＮＡｃ１−Ｈ１），４．９４（ｓ，Ｍａｎ４’−Ｈ１），４．９３（ｓ，Ｍａｎ４’−Ｈ１），４．８２（ｓ，Ｍａｎ３−Ｈ１），４．６０（ｄ，ＧｌｃＮＡｃ２−Ｈ１），４．５８（ｄ，ＧｌｃＮＡｃ５，５’−Ｈ１），４．４６（ｄｄ，Ｇａｌ６，６’−Ｈ１），４．４４（ｄ，Ｇａｌ６，６’−Ｈ１），４．２４（ｄ，Ｍａｎ３−Ｈ２），４．１９（ｄ，Ｍａｎ４’−Ｈ２），４．１１（ｄ，Ｍａｎ４−Ｈ２），２．９７（ｂｄｄ，ＡｓＮ−βＣＨ），２．７２（ｄｄ，ＮｅｕＡｃ７−Ｈ３ｅｑ，ＮｅｕＡｃ７−Ｈ３ｅｑ），２．６４（ｂｄｄ，ＡｓＮ−βＣＨ），２．１５（ｓ×５，−Ａｃ），１．７９（ｄｄ，ＮｅｕＡｃ７−Ｈ３ａｘ，ＮｅｕＡｃ７’−Ｈ３ａｘ）
また、得られた化合物４の物理的データは以下の通りである。
１Ｈ−ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ，３０℃）
７．９９（２Ｈ，ｄ，Ｆｍｏｃ），７．７９（２Ｈ，ｄ，Ｆｍｏｃ），７．５５（４Ｈ，ｍ，Ｆｍｏｃ），５．１２（１Ｈ，ｓ，Ｍａｎ４−Ｈ１），５．０６（１Ｈ，ｄ，ＧｌｃＮＡｃ１−Ｈ１），４．９３（１Ｈ，ｓ，Ｍａｎ４’−Ｈ１），４．８２（１Ｈ，ｓ，Ｍａｎ３−Ｈ１），４．６９（１Ｈ，ｄ，ＧｌｃＮＡｃ２−Ｈ１），４．６７（２Ｈ，ｄ，ＧｌｃＮＡｃ５，５’−Ｈ１），４．５３（２Ｈ，ｄ，Ｇａｌ６，６’−Ｈ１），４．３４（１Ｈ，ｄ，Ｍａｎ３−Ｈ２），４．２７（１Ｈ，ｄ，Ｍａｎ４’−Ｈ２），４．１９（１Ｈ，ｄ，Ｍａｎ４−Ｈ２），３．０３（１Ｈ，ｂｄｄ，ＡｓＮ−βＣＨ），３．００（１Ｈ，ｂｄｄ，ＡｓＮ−βＣＨ），２．１５（１２Ｈ，ｓ×４，−Ａｃ）；ＨＲＭＳ Ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ８１Ｈ１２０Ｎ６ＮａＯ５０［Ｍ＋Ｎａ＋］１９９９．６９３０，ｆｏｕｎｄ，１９９９．６９３９
上記の化合物４の構造の簡略化したものを表２に示す。
参考例３ 化合物２、３の合成および単離
参考例２で得られた化合物２、３の混合物（５．０ｍｇ，２．２μｍｏｌ）を２２０μＬの水に溶解させ、２２ｍＭの炭酸セシウム水溶液を１００μＬ加え、ｐＨ７．０とした。この溶液を凍結乾燥した。乾燥後の固形物にＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミドを４３０μＬ加え、更に６．６μｍｏｌのベンジルブロマイド／Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド溶液を２０μＬ加えた。この溶液をアルゴン雰囲気下で攪拌した。４８時間後、ＴＬＣ（展開溶媒は１Ｍ ＮＨ４ＯＡｃ：イソプロパノール＝１：２を用いた）にて原料の消失を確認した後、４．４ｍＬのジエチルエーテルを加えて化合物を沈殿させた。沈殿した糖鎖を濾過し、残った糖鎖を水に溶解させ凍結乾燥した。凍結乾燥後の残留物を分取ＨＰＬＣ（ＹＭＣ Ｐａｃｋｅｄ Ｃｏｌｕｍｎ Ｄ−ＯＤＳ−５ Ｓ−５ １２０Ａ ＯＤＳ Ｎｏ．２０２０１７８、２０×２５０ｍｍ、展開溶媒は５０ｍＭ酢酸アンモニウム水溶液：アセトニトリル＝７８：２２、流速４．０ｍＬ／ｍｉｎ）で精製したところ、８８分後に化合物３が、９１分後に化合物２が溶出した。それぞれを取り分け、更にＯＤＳカラム（コスモシール７５Ｃ１８−ＯＰＮ、１５×１００ｍｍ、最初にＨ２Ｏを５０ｍＬ流し、次に２５％アセトニトリルを流して溶出させた）で脱塩したところ、目的とする化合物２のベンジル体が１．６ｍｇ、化合物３のベンジル体が１．８ｍｇ得られた。
化合物２のベンジル体（１０糖、１３．６ｍｇ、５．８ｍｍｏｌ）を、氷冷下にＮａＯＨａｑ．（ｐＨ＝１２）１．４ｍｌに溶解させた。反応をＨＰＬＣでモニターしながら約８時間撹拌した。反応の進行が終了した時点で、反応液を４０ｍＭ ＨＣｌにてｐＨ＝７．０に調整した。中和後の液を、メンブランフィルターで濾過した後、濃縮、次いでＨＰＬＣ（ＹＭＣ− Ｐａｃｋ ＯＤＳ−ＡＭ，ＳＨ−３４３−５ＡＭ，２０×２５０ｍｍ，ＡＮ／２５ｍＭ ＡｃＯＮＨ４ ｂｕｆｆｅｒ＝２０／８０，７．０ｍｌ／ｍｉｎ．，ｗａｖｅ ｌｅｎｇｔｈ；２７４ｎｍ）にて分取・精製を行った。分取した液を濃縮後、ＯＤＳカラム（コスモシール ７５Ｃ１８−ＯＰＮ，ナカライテスク社製）にて脱塩処理を行い、濃縮、凍結乾燥を行うと、目的とする化合物２（６．２ｍｇ，４７．４％）が得られた。得られた化合物の物理的データは以下の通りである。化合物２の構造の簡略化したものを表１に示す。
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ，３０℃，ＨＯＤ＝４．８１）
δ ８．００（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝７．２，Ｆｍｏｃ），７．７９（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝７．２，Ｆｍｏｃ），７．５９（ｄｄ，２Ｈ，Ｊ＝７．２，Ｆｍｏｃ），７．５３（ｄｄ，２Ｈ，Ｊ＝７．２，Ｆｍｏｃ），５．２２（ｓ，１Ｈ，Ｍａｎ４−Ｈ１），５．０９（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝９．８，ＧｌｃＮＡｃ１−Ｈ１），５．０１（ｓ，１Ｈ，Ｍａｎ４’−Ｈ−１），４．８５（ｓ，１Ｈ），４．５８−４．７５（ｍ，５Ｈ），４．５７（ｄｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．０），４．３８−４．４８（ｍ，２Ｈ），４．３３（ｓ，１Ｈ），４．２８（ｂｓ，１Ｈ，Ｍａｎ４−Ｈ２），４．１９（ｂｓ，１Ｈ），２．６４−２．８５（ｍ，３Ｈ，Ａｓｎ−βＣＨｘ２，ＮｅｕＡｃ７−Ｈ３ｅｑ），２．１６，２．１３，２．１２（ｅａｃｈｓ，１２Ｈ，Ａｃｘ４），１．９８（ｓ，３Ｈ，Ａｃ）１．８０（ｄｄ，１Ｈ，Ｊａ＝１２．０，Ｊｂ＝１２．０，ＮｅｕＡｃ７−Ｈ３ａｘ）．
化合物３のベンジル体（１０糖、５．０ｍｇ、２．１ｍｍｏｌ）を、氷冷下にＮａＯＨａｑ．（ｐＨ＝１２）２．０ｍｌに溶解させた。反応をＨＰＬＣでモニターしながら約５時間撹拌した。反応の進行が終了した時点で、反応液を４０ｍＭ ＨＣｌにてｐＨ＝７．０に調整した。中和後の液を、メンブランフィルターで濾過した後、濃縮、次いでＨＰＬＣ（ＹＭＣ− Ｐａｃｋ ＯＤＳ−ＡＭ，ＳＨ−３４３−５ＡＭ，２０×２５０ｍｍ，ＡＮ／２５ｍＭ ＡｃＯＮＨ４ ｂｕｆｆｅｒ＝２０／８０，７．０ｍｌ／ｍｉｎ．，ｗａｖｅ ｌｅｎｇｔｈ；２７４ｎｍ）にて分取・精製を行った。分取した液を濃縮後、ＯＤＳカラム（コスモシール ７５Ｃ１８−ＯＰＮ，ナカライテスク社製）にて脱塩処理を行い、濃縮、凍結乾燥を行うと、目的とする化合物３（２．５ｍｇ，５２．０％）が得られた。得られた化合物の物理的データは以下の通りである。化合物３の構造の簡略化したものを表１に示す。
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ，３０℃，ＨＯＤ＝４．８１）
δ ８．０１（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝７．６，Ｆｍｏｃ），７．８０（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝７．６，Ｆｍｏｃ），７．５９（ｄｄ，２Ｈ，Ｊ＝７．６，Ｆｍｏｃ），７．５２（ｄｄ，２Ｈ，Ｊ＝７．６，Ｆｍｏｃ），５．２１（ｓ，１Ｈ，Ｍａｎ４−Ｈ１），５．０９（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝９．５，ＧｌｃＮＡｃ１−Ｈ１），５．０３（ｓ，１Ｈ，Ｍａｎ４’−Ｈ−１），４．５８−４．７１（ｍ，５Ｈ），４．５４（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝７．５），４．４０−４．５０（ｂ，２Ｈ），４．３４（ｓ，１Ｈ），４．２８（ｂｓ，１Ｈ，Ｍａｎ４−Ｈ２），４．１９（ｂｓ，１Ｈ），２．７０−２．８５（ｍ，２Ｈ，Ａｓｎ−βＣＨ，ＮｅｕＡｃ７−Ｈ３ｅｑ），２．５５−２．７０（ｍ，１Ｈ，Ａｓｎ−βＣＨ），２．１６，２．１５，２．１３，２．１１（ｅａｃｈｓ，１２Ｈ，Ａｃｘ４），１．９８（ｓ，３Ｈ，Ａｃ）１．８０（ｄｄ，１Ｈ，Ｊａ＝１２．４，Ｊｂ＝１２．４，ＮｅｕＡｃ７−Ｈ３ａｘ）．
参考例４ 化合物５および６の合成
参考例２で得られた化合物２および３の混合物（２２４ｍｇ，９７μｍｏｌ）とウシ血清アルブミン２４ｍｇをＨＥＰＥＳ緩衝溶液（５０ｍＭ，ｐＨ６．０）２２ｍｌに溶解させ、さらにＤｉｐｌｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ由来β−ガラクトシダーゼ（１．３５Ｕ）を加えた。この溶液を３７℃で１５時間静置した後、凍結乾燥を行った。残留物をＨＰＬＣ（ＯＤＳカラム、２．０φ×２５ｃｍ、展開溶媒は５０ｍＭ酢酸アンモニウム水溶液：アセトニトリル＝８５：１５、流速３ｍｌ／ｍｉｎ）で精製したところ、１２９分後に化合物５が、１３４分後に化合物６が溶出した。それぞれを取り分け、凍結乾燥を行った。続いてＨＰＬＣ〔ＯＤＳカラム、２．０φ×２５ｃｍ、展開溶媒は最初の１５分間が水、１６分後から３０分後までは水：アセトニトリル（容量比）＝１０：０から８５：１５、３１分後から４５分後までは水：アセトニトリル＝８５：１５から８０：２０になるようにグラジエントを掛けた。流速は３．０ｍｌ／ｍｉｎ〕を用いて脱塩処理を行ったところ、目的とする化合物５が８１ｍｇ、化合物６が７５ｍｇ得られた。
なお、得られた化合物５の物理的データは以下の通りである。
１Ｈ−ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ，３０℃）
７．９９（２Ｈ，ｄ，Ｆｍｏｃ），７．７９（２Ｈ，ｄ，Ｆｍｏｃ），７．５５（４Ｈ，ｍ，Ｆｍｏｃ），５．１５（１Ｈ，Ｓ，Ｍａｎ４−Ｈ１），５．０６（１Ｈ，ｄ，ＧｌｃＮＡｃ１−Ｈ１），４．９５（１Ｈ，ｓ，Ｍａｎ４’−Ｈ１），４．８２（１Ｈ，ｓ，Ｍａｎ３−Ｈ１），４．６９（１Ｈ，ｄ，ＧｌｃＮＡｃ２−Ｈ１），４．６７（２Ｈ，ｄ，ＧｌｃＮＡｃ５，５’−Ｈ１），４．５３（１Ｈ，ｄ，Ｇａｌ６’−Ｈ１），４．３４（１Ｈ，ｄ，Ｍａｎ３−Ｈ２），４．２７（１Ｈ，ｄ，Ｍａｎ４’−Ｈ２），４．１９（１Ｈ，ｄ，Ｍａｎ４−Ｈ２），２．９７（１Ｈ，ｂｄｄ，ＡｓＮ−βＣＨ），２．７６（１Ｈ，ｄｄ，ＮｅｕＡｃ７’−Ｈ３ｅｑ），２．６１（１Ｈ，ｂｄｄ，ＡｓＮ−βＣＨ），２．１５（１５Ｈ，ｓ×５，−Ａｃ），１．７９（１Ｈ，ｄｄ，ＮｅｕＡｃ７’−Ｈ３ａｘ）；ＨＲＭＳ Ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ８６Ｈ１２７Ｎ７ＮａＯ５３［Ｍ＋Ｎａ＋］２１２８．７３５６，ｆｏｕｎｄ，２１２８．７３６３
また、得られた化合物６の物理的データは以下の通りである。
１Ｈ−ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ，３０℃）
７．９９（２Ｈ，ｄ，Ｆｍｏｃ），７．７９（２Ｈ，ｄ，Ｆｍｏｃ），７．５５（４Ｈ，ｍ，Ｆｍｏｃ），５．１５（１Ｈ，Ｓ，Ｍａｎ４−Ｈ１），５．０６（１Ｈ，ｄ，ＧｌｃＮＡｃ１−Ｈ１），４．９５（１Ｈ，ｓ，Ｍａｎ４’−Ｈ１），４．８２（１Ｈ，ｓ，Ｍａｎ３−Ｈ１），４．６９（１Ｈ，ｄ，ＧｌｃＮＡｃ２−Ｈ１），４．６７（２Ｈ，ｄ，ＧｌｃＮＡｃ５，５’−Ｈ１），４．５３（１Ｈ，ｄ，Ｇａｌ６−Ｈ１），４．３４（１Ｈ，ｄ，Ｍａｎ３−Ｈ２），４．２７（１Ｈ，ｄ，Ｍａｎ４’−Ｈ２），４．１９（１Ｈ，ｄ，Ｍａｎ４−Ｈ２），２．９７（１Ｈ，ｂｄｄ，ＡｓＮ−βＣＨ），２．７６（１Ｈ，ｄｄ，ＮｅｕＡｃ７−Ｈ３ｅｑ），２．６０（１Ｈ，ｂｄｄ，ＡｓＮ−βＣＨ），２．１５（１５Ｈ，ｓ×５，−Ａｃ），１．７９（１Ｈ，ｄｄ，ＮｅｕＡｃ７−Ｈ３ａｘ）；ＨＲＭＳ Ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ８６Ｈ１２５Ｎ７Ｎａ３Ｏ５３［Ｍ＋Ｎａ＋］２１７２．６９９５，ｆｏｕｎｄ，２１７２．７０８４
参考例５ 化合物７および８の合成
参考例４で得られた化合物５および６の混合物（９０ｍｇ，４７．３μｍｏｌ）をそれぞれ分離することなく、ウシ血清アルブミン８ｍｇと共にＨＥＰＥＳ緩衝溶液（５０ｍＭ，ｐＨ６．０）８．１ｍｌに溶解させ、さらにＢｏｖｉｎｅ ｋｉｄｎｅｙ由来β−グルコサミニダーゼ（シグマアルドリッチ社製、ｆｒｏｍ Ｂｏｖｉｎｅ ｋｉｄｎｅｙ）を２．８８Ｕ加えた。この溶液を３７℃で１８時間静置した後凍結乾燥し、残留物をＨＰＬＣ（ＯＤＳカラム、２．０φ×２５ｃｍ、展開溶媒は５０ｍＭ酢酸アンモニウム水溶液：メタノール＝６５：３５、流速３ｍｌ／ｍｉｎ）で精製したところ、１１７分後に化合物７が、１２７分後に化合物８が溶出した。それぞれを取り分け、凍結乾燥を行った。続いてＨＰＬＣ（ＯＤＳカラム、２．０φ×２５ｃｍ、展開溶媒は最初の１５分間が水、１６分後から３０分後までは水：アセトニトリル＝１０：０から８５：１５、３１分後から４５分後までは水：アセトニトリル＝８５：１５から８０：２０になるようにグラジエントを掛けた。流速は３．０ｍｌ／ｍｉｎ）を用いて脱塩処理を行ったところ、目的とする化合物７が４０ｍｇ、化合物８が３７ｍｇ得られた。
なお、得られた化合物７の物理的データは以下の通りである。
１Ｈ−ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ，３０℃）
８．０１（２Ｈ，ｄ，Ｆｍｏｃ），７．８０（２Ｈ，ｄ，Ｆｍｏｃ），７．５６（４Ｈ，ｍ，Ｆｍｏｃ），５．２２（１Ｈ，ｓ，Ｍａｎ４−Ｈ１），５．０８（１Ｈ，ｄ，ＧｌｃＮＡｃ１−Ｈ１），４．９４（１Ｈ，ｓ，Ｍａｎ４’−Ｈ１），４．８４（１Ｈ，ｓ，Ｍａｎ３−Ｈ１），４．６９（１Ｈ，ｄ，ＧｌｃＮＡｃ２−Ｈ１），４．６７（１Ｈ，ｄ，ＧｌｃＮＡｃ５−Ｈ１），４．５５（１Ｈ，ｄ，Ｇａｌ６−Ｈ１），４．３３（１Ｈ，ｄｄ，Ｍａｎ３−Ｈ２），４．２０（１Ｈ，ｄｄ，Ｍａｎ４−Ｈ２），４．１５（１Ｈ，ｄｄ，Ｍａｎ４’−Ｈ２），２．９７（１Ｈ，ｂｄｄ，ＡｓＮ−βＣＨ），２．７６（２Ｈ，ｄｄ，ＮｅｕＡｃ７，７’−Ｈ３ｅｑ），２．６２（１Ｈ，ｂｄｄ，ＡｓＮ−βＣＨ），２．１５（１２Ｈ，ｓ×４，−Ａｃ），１．７９（２Ｈ，ｄｄ，ＮｅｕＡｃ７，７’−Ｈ３ａｘ）；ＨＲＭＳ Ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ７８Ｈ１１４Ｎ６ＮａＯ４８［Ｍ＋Ｎａ＋］１９２５．６５６２，ｆｏｕｎｄ，１９２５．６５３９
また、得られた化合物８の物理的データは以下の通りである。
１Ｈ−ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ，３０℃）
７．９９（２Ｈ，ｄ，Ｆｍｏｃ），７．７９（２Ｈ，ｄ，Ｆｍｏｃ），７．５５（４Ｈ，ｍ，Ｆｍｏｃ），５．１５（１Ｈ，Ｓ，Ｍａｎ４−Ｈ１），５．０６（１Ｈ，ｄ，ＧｌｃＮＡｃ１−Ｈ１），４．９５（１Ｈ，ｓ，Ｍａｎ４’−Ｈ１），４．８２（１Ｈ，ｓ，Ｍａｎ３−Ｈ１），４．６９（１Ｈ，ｄ，ＧｌｃＮＡｃ２−Ｈ１），４．６７（２Ｈ，ｄ，ＧｌｃＮＡｃ５，５’−Ｈ１），４．５３（２Ｈ，ｄ，Ｇａｌ６，６’−Ｈ１），４．３４（１Ｈ，ｄ，Ｍａｎ３−Ｈ２），４．２７（１Ｈ，ｄ，Ｍａｎ４’−Ｈ２），２．９７（１Ｈ，ｂｄｄ，ＡｓＮ−βＣＨ２），２．７６（１Ｈ，ｄｄ，ＮｅｕＡｃ７’−Ｈ３ｅｑ），２．６１（１Ｈ，ｂｄｄ，ＡｓＮ−βＣＨ２），２．１５（１２Ｈ，ｓ×４，−Ａｃ），１．７９（１Ｈ，ｄｄ，ＮｅｕＡｃ７’−Ｈ３ａｘ）；ＨＲＭＳ Ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ７８Ｈ１１４Ｎ６ＮａＯ４８［Ｍ＋Ｎａ＋］１９２５．６５６２，ｆｏｕｎｄ，１９２５．６５３３
参考例６ 化合物９の合成
参考例５で得られた化合物７（３０ｍｇ，４７３μｍｏｌ）とウシ血清アルブミン３ｍｇをＨＥＰＥＳ緩衝溶液（５０ｍＭ，ｐＨ６．０）６ｍｌに溶解させ、さらにＪａｃｋ Ｂｅａｎｓ由来α−マンノシダーゼを１０Ｕ加えた。この溶液を３７℃で２１時間静置した後凍結乾燥し、続いてＨＰＬＣ（ＯＤＳカラム、２．０φ×２５ｃｍ、展開溶媒は最初の１５分間が水、１６分後から３０分後までは水：アセトニトリル＝１０：０から８５：１５、３１分後から４５分後までは水：アセトニトリル＝８５：１５から８０：２０になるようにグラジエントを掛けた。流速は３．０ｍｌ／ｍｉｎ）を用いて精製したところ、目的とする化合物９が２０ｍｇ得られた。
なお、得られた化合物９の物理的データは以下の通りである。
１Ｈ−ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ，３０℃）
８．０１（２Ｈ，ｄ，Ｆｍｏｃ），７．８０（２Ｈ，ｄ，Ｆｍｏｃ），７．５６（４Ｈ，ｍ，Ｆｍｏｃ），５．００（１Ｈ，ｄ，ＧｌｃＮＡｃ１−Ｈ１），４．９５（１Ｈ，ｓ，Ｍａｎ４’−Ｈ１），４．８４（１Ｈ，ｓ，Ｍａｎ３−Ｈ１），４．６７（１Ｈ，ｄ，ＧｌｃＮＡｃ２−Ｈ１），４．５６（１Ｈ，ｄ，ＧｌｃＮＡｃ５−Ｈ１），４．４４（１Ｈ，ｄ，Ｇａｌ６−Ｈ１），４．１１（１Ｈ，ｄｄ，Ｍａｎ４’−Ｈ２），４．０７（１Ｈ，ｄｄ，Ｍａｎ３−Ｈ２），２．９７（１Ｈ，ｂｄｄ，ＡｓＮ−βＣＨ），２．７６（１Ｈ，ｄｄ，ＮｅｕＡｃ７’−Ｈ３ｅｑ），２．６２（１Ｈ，ｂｄｄ，ＡｓＮ−βＣＨ），２．１５（１２Ｈ，ｓ×４，−Ａｃ），１．７９（２Ｈ，ｄｄ，ＮｅｕＡｃ７’−Ｈ３ａｘ）；ＨＲＭＳ Ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ７２Ｈ１０４Ｎ６ＮａＯ４３［Ｍ＋Ｎａ＋］１７６３．６０３４，ｆｏｕｎｄ，１７６３．６０７４
参考例７ 化合物１０の合成
参考例５で得られた化合物８（４０ｍｇ，６３０μｍｏｌ）とウシ血清アルブミン５ｇをＨＥＰＥＳ緩衝溶液（５０ｍＭ，ｐＨ６．０）７．８ｍｌに溶解させ、Ｊａｃｋ Ｂｅａｎｓ由来α−マンノシダーゼを３８Ｕ加えた。この溶液を３７℃で６３時間静置した後凍結乾燥し、続いてＨＰＬＣ（ＯＤＳカラム、２．０φ×２５ｃｍ、展開溶媒は最初の１５分間が水、１６分後から３０分後までは水：アセトニトリル＝１０：０から８５：１５、３１分後から４５分後までは８５：１５から８０：２０になるようにグラジエントを掛けた。流速は３．０ｍｌ／ｍｉｎ）を用いて精製したところ、目的とする化合物１０が３０ｍｇ得られた。
なお、得られた化合物１０の物理的データは以下の通りである。
１Ｈ−ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ，３０℃）
８．０１（２Ｈ，ｄ，Ｆｍｏｃ），７．８０（２Ｈ，ｄ，Ｆｍｏｃ），７．５６（４Ｈ，ｍ，Ｆｍｏｃ），５．２３（１Ｈ，ｓ，Ｍａｎ４−Ｈ１），５．０８（１Ｈ，ｄ，ＧｌｃＮＡｃ１−Ｈ１），４．５３（１Ｈ，ｄ，Ｇａｌ６−Ｈ１），４．３２（１Ｈ，ｄｄ，Ｍａｎ３−Ｈ２），４．２８（１Ｈ，ｄｄ，Ｍａｎ４−Ｈ２），２．８１（１Ｈ，ｂｄｄ，ＡｓＮ−βＣＨ），２．７６（１Ｈ，ｄｄ，ＮｅｕＡｃ７−Ｈ３ｅｑ），２．５９（１Ｈ，ｂｄｄ，ＡｓＮ−βＣＨ），２．１３（１２Ｈ，ｓ×４，−Ａｃ），１．８０（１Ｈ，ｄｄ，ＮｅｕＡｃ７Ｈ３ａｘ）；ＨＲＭＳ Ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ７２Ｈ１０４Ｎ６ＮａＯ４３［Ｍ＋Ｎａ＋］１７６３．６０３４，ｆｏｕｎｄ，１７６３．６０４１
参考例８ 化合物１１の合成
化合物５（２８ｍｇ，２１．３μｍｏｌ）とウシ血清アルブミン１．０ｍｇをＨＥＰＥＳ緩衝溶液（５０ｍＭ，ｐＨ５．０，４５４μＬ）に溶解させ、ノイラミニダーゼ（シグマアルドリッチ社製、ｆｒｏｍ Ｖｉｂｌｉｏ Ｃｈｏｌｅｒａｅ，１９８ｍＵ）を加えた。この溶液を３７℃で２０時間静置した後、ＨＰＬＣ分析により反応終了を確認した。反応溶液をＨＰＬＣ（ＹＭＣ Ｐａｃｋｅｄ Ｃｏｌｕｍｎ Ｄ−ＯＤＳ−５Ｓ−５ １２０Ａ ＯＤＳ Ｎｏ．２０２０１７８、２０×２５０ｍｍ、展開溶媒は５０ｍＭ酢酸アンモニウム水溶液：アセトニトリル＝８０：２０、流速４ｍＬ／ｍｉｎ）で精製した。更にＯＤＳカラム（コスモシール７５Ｃ１８−ＯＰＮ、１５×１００ｍｍ、最初にＨ２Ｏを５０ｍＬ流し、次に２５％アセトニトリルを流して溶出させた）で脱塩したところ、目的とする化合物１１（１７ｍｇ，収率７０％）が得られた。得られた化合物の物理的データは以下の通りである。
化合物１１の構造の簡略化したものを表２に示す。
１Ｈ−ＮＭＲ（３０℃）
δ ７．９１（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，Ｆｍｏｃ），７．７１（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，Ｆｍｏｃ），７．５１（ｄｄ，２Ｈ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，Ｆｍｏｃ），７．４３（ｄｄ，２Ｈ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，Ｆｍｏｃ），５．１２（ｓ，１Ｈ，Ｍａｎ４−Ｈ−１），４．９９（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝９．５Ｈｚ，ＧｌｃＮＡｃ１−Ｈ−１），４．９２（ｓ，１Ｈ，Ｍａｎ４’−Ｈ−１），４．７６（ｓ，１Ｈ，Ｍａｎ３−Ｈ−１），４．５８（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，ＧｌｃＮＡｃ２−Ｈ−１），４．５５（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，ＧｌｃＮＡｃ５’−Ｈ−１），４．４７（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．８Ｈｚ，Ｇａｌ６’−Ｈ−１），４．３４（ｔ，１Ｈ，Ｆｍｏｃ），４．２４（ｂｄ，１Ｈ，Ｊ＝１．９Ｈｚ，Ｍａｎ３−Ｈ−２），４．１８（ｂｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝１．４Ｈｚ，３．３Ｈｚ，Ｍａｎ４−Ｈ−２），４．１１（ｂｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝１．４Ｈｚ，３．５Ｈｚ，Ｍａｎ４’−Ｈ−２），２．７２（ｂｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝３．０Ｈｚ，１５．７Ｈｚ，ＡｓＮ−βＣＨ），２．５２（ｂｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．７Ｈｚ，１５．７Ｈｚ，ＡｓＮ−βＣＨ），２．０６，２．０５，２．０４，１．８９（ｅａｃｈ ｓ，ｅａｃｈ ３Ｈ，Ａｃ）；ＨＲＭＳ Ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ７５Ｈ１１０Ｎ６ＮａＯ４５［Ｍ＋Ｎａ＋］１８３７．６４０２，ｆｏｕｎｄ １８３７．６４７１
参考例９ 化合物１２の合成
化合物６（２０ｍｇ，９．４μｍｏｌ）とウシ血清アルブミン１．６ｍｇをＨＥＰＥＳ緩衝溶液（５０ｍＭ，ｐＨ５．０，３２３μＬ）に溶解させ、ノイラミニダーゼ（シグマアルドリッチ社製、ｆｒｏｍ Ｖｉｂｌｉｏ Ｃｈｏｌｅｒａｅ，１４１ｍＵ）を加えた。この溶液を３７℃で１８時間静置した後、ＨＰＬＣ分析により反応終了を確認した。続いてＨＰＬＣ（ＹＭＣ Ｐａｃｋｅｄ Ｃｏｌｕｍｎ Ｄ−ＯＤＳ−５ Ｓ−５ １２０Ａ ＯＤＳ Ｎｏ．２０２０１７８、２０×２５０ｍｍ、展開溶媒は５０ｍＭ酢酸アンモニウム水溶液：アセトニトリル＝８０：２０、流速４ｍＬ／ｍｉｎ）で精製した。更にＯＤＳカラム（コスモシール７５Ｃ１８−ＯＰＮ、１５×１００ｍｍ、最初にＨ２Ｏを５０ｍＬ流し、次に２５％アセトニトリルを流して溶出させた）で脱塩したところ、目的とする化合物１２（１３ｍｇ，収率７６％）を得た。得られた化合物の構造は１Ｈ−ＮＭＲが標品と一致したことから確認した。
化合物１２の構造の簡略化したものを表２に示す。
参考例１０ 化合物１３の合成
化合物７（４５ｍｇ，２４μｍｏｌ）とウシ血清アルブミン１．７ｍｇをＨＥＰＥＳ緩衝溶液（５０ｍＭ，ｐＨ５．０，８２０μＬ）に溶解させ、ノイラミニダーゼ（シグマアルドリッチ社製、ｆｒｏｍ Ｖｉｂｌｉｏ Ｃｈｏｌｅｒａｅ，１３４ｍＵ）を加えた。この溶液を３７℃で１４時間静置した後、ＨＰＬＣ分析により反応終了を確認した。続いて、反応溶液をＨＰＬＣ（ＹＭＣ Ｐａｃｋｅｄ Ｃｏｌｕｍｎ Ｄ−ＯＤＳ−５ Ｓ−５ １２０Ａ ＯＤＳ Ｎｏ．２０２０１７８、２０×２５０ｍｍ、展開溶媒は５０ｍＭ酢酸アンモニウム水溶液：アセトニトリル＝８０：２０、流速４ｍＬ／ｍｉｎ）で精製した。更にＯＤＳカラム（コスモシール７５Ｃ１８−ＯＰＮ、１５×１００ｍｍ、最初にＨ２Ｏを５０ｍＬ流し、次に２５％アセトニトリルを流して溶出させた）で脱塩したところ、目的とする化合物１３（２８ｍｇ，収率７４％）が得られた。得られた化合物の物理的データは以下の通りである。
化合物１３の構造の簡略化したものを表２に示す。
１Ｈ−ＮＭＲ（３０℃）
δ ７．９２（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，Ｆｍｏｃ），７．７１（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，Ｆｍｏｃ），７．５１（ｄｄ，２Ｈ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，Ｆｍｏｃ），７．４４（ｄｄ，２Ｈ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，Ｆｍｏｃ），５．１０（ｓ，１Ｈ，Ｍａｎ４−Ｈ−１），４．９９（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝９．５Ｈｚ，ＧｌｃＮＡｃ１−Ｈ−１），４．９２（ｓ，１Ｈ，Ｍａｎ４’−Ｈ−１），４．７６（ｓ，１Ｈ，Ｍａｎ３−Ｈ−１），４．５８（ｄ，２Ｈ，ＧｌｃＮＡｃ２，５’−Ｈ−１），４．４７（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，Ｇａｌ６’−Ｈ−１），４．３５（ｔ，１Ｈ，Ｆｍｏｃ），４．２４（ｂｄ，１Ｈ，Ｊ＝１．９Ｈｚ，Ｍａｎ３−Ｈ−２），４．１１（ｂｓ，１Ｈ，Ｍａｎ４’−Ｈ−２），４．０７（ｂｓ，１Ｈ，Ｍａｎ４−Ｈ−２），２．７２（ｂｄ，１Ｈ，Ｊ＝１５．５Ｈｚ，ＡｓＮ−βＣＨ），２．５２（ｂｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．７Ｈｚ，１５．５Ｈｚ，ＡｓＮ−βＣＨ），２．０６，２．０４，１．８９（ｅａｃｈ ｓ，ｅａｃｈ ３Ｈ，Ａｃ）；ＨＲＭＳ Ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ６７Ｈ９７Ｎ５ＮａＯ４０［Ｍ＋Ｎａ＋ １６３４．５６０８，ｆｏｕｎｄ，１６３４．５５６４
参考例１１ 化合物１４の合成
化合物８（４７ｍｇ，２５μｍｏｌ）とウシ血清アルブミン１．９ｍｇをＨＥＰＥＳ緩衝溶液（５０ｍＭ，ｐＨ５．０，８４０μＬ）に溶解させ、ノイラミニダーゼ（シグマアルドリッチ社製、ｆｒｏｍ Ｖｉｂｌｉｏ Ｃｈｏｌｅｒａｅ，３６９ｍＵ）を加えた。この溶液を３７℃で３７時間静置した後、ＨＰＬＣ分析により反応終了を確認した。反応溶液を凍結乾燥し、続いてＨＰＬＣ（ＹＭＣ Ｐａｃｋｅｄ Ｃｏｌｕｍｎ Ｄ−ＯＤＳ−５ Ｓ−５ １２０Ａ ＯＤＳ Ｎｏ．２０２０１７８、２０×２５０ｍｍ、展開溶媒は５０ｍＭ酢酸アンモニウム水溶液：アセトニトリル＝８０：２０、流速４ｍＬ／ｍｉｎ）で精製した。更にＯＤＳカラム（コスモシール７５Ｃ１８−ＯＰＮ、１５×１００ｍｍ、最初にＨ２Ｏを５０ｍＬ流し、次に２５％アセトニトリルを流して溶出させた）で脱塩したところ、目的とする化合物１４（２６ｍｇ，収率６５％）を得た。得られた化合物の物理的データは以下の通りである。
化合物１４の構造の簡略化したものを表２に示す。
１Ｈ−ＮＭＲ（３０℃）
δ ７．９２（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，Ｆｍｏｃ），７．７１（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，Ｆｍｏｃ），７．５１（ｄｄ，２Ｈ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，Ｆｍｏｃ），７．４３（ｄｄ，２Ｈ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，Ｆｍｏｃ），５．１２（ｓ，１Ｈ，Ｍａｎ４−Ｈ−１），４．９９（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝９．４Ｈｚ，ＧｌｃＮＡｃ１−Ｈ−１），４．９１（ｓ，１Ｈ，Ｍａｎ４’−Ｈ−１），４．７７（ｓ，１Ｈ，Ｍａｎ３−Ｈ−１），４．５７（ｂｄ，２Ｈ，ＧｌｃＮＡｃ２，５’−Ｈ−１），４．４６（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，Ｇａｌ６’−Ｈ−１），４．３４（ｔ，３Ｈ，Ｆｍｏｃ），４．２４（ｂｓ，１Ｈ，Ｍａｎ４’−Ｈ−２），４．１９（ｂｓ，１Ｈ，Ｍａｎ４−Ｈ−２），２．７２（ｂｄ，１Ｈ，Ｊ＝１５．５Ｈｚ，ＡｓＮ−βＣＨ），２．５２（ｂｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝９．２Ｈｚ，１５．５Ｈｚ，ＡｓＮ−βＣＨ），２．０６，２．０５，１．８９（ｅａｃｈ ｓ，ｅａｃｈ ３Ｈ，Ａｃ）；ＨＲＭＳ Ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ６７Ｈ９７Ｎ５ＮａＯ４０［Ｍ＋Ｎａ＋］１６３４．５６０８，ｆｏｕｎｄ，１６３４．５６４４
参考例１２ 化合物１５の合成
化合物９（３２ｍｇ，１８．４μｍｏｌ）とウシ血清アルブミン２．５ｍｇをＨＥＰＥＳ緩衝溶液（５０ｍＭ，ｐＨ５．０，７１３μＬ）に溶解させ、ノイラミニダーゼ（シグマアルドリッチ社製、ｆｒｏｍ Ｖｉｂｌｉｏ Ｃｈｏｌｅｒａｅ，１３４ｍＵ）を加えた。この溶液を３７℃で１７時間静置した後、ＨＰＬＣ分析により反応終了を確認した。続いて、反応溶液をＨＰＬＣ（ＹＭＣ Ｐａｃｋｅｄ Ｃｏｌｕｍｎ Ｄ−ＯＤＳ−５ Ｓ−５ １２０Ａ ＯＤＳ Ｎｏ．２０２０１７８、２０×２５０ｍｍ、展開溶媒は５０ｍＭ酢酸アンモニウム水溶液：アセトニトリル＝８０：２０、流速４ｍＬ／ｍｉｎ）で精製した。更にＯＤＳカラム（コスモシール７５Ｃ１８−ＯＰＮ、１５×１００ｍｍ、最初にＨ２Ｏを５０ｍＬ流し、次に２５％アセトニトリルを流して溶出させた）で脱塩したところ、目的とする化合物１５（１３ｍｇ，収率５２％）が得られた。得られた化合物の物理的データは以下の通りである。
化合物１５の構造の簡略化したものを表２に示す。
１Ｈ−ＮＭＲ（３０℃）
δ ７．９２（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，Ｆｍｏｃ），７．７１（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，Ｆｍｏｃ），７．５１（ｄｄ，２Ｈ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，Ｆｍｏｃ），７．４４（ｄｄ，２Ｈ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，Ｆｍｏｃ），５．００（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝９．９Ｈｚ，ＧｌｃＮＡｃ１−Ｈ−１），４．９２（ｓ，１Ｈ，Ｍａｎ４’−Ｈ−１），４．７５（ｓ，１Ｈ，Ｍａｎ３−Ｈ−１），４．５８（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，ＧｌｃＮＡｃ２，５’−Ｈ−１），４．４７（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．８Ｈｚ，Ｇａｌ６’−Ｈ−１），４．３４（ｔ，１Ｈ，Ｆｍｏｃ），４．１０（ｂｄ，１Ｈ，Ｍａｎ３−Ｈ−２），４．０７（ｂｓ，１Ｈ，Ｍａｎ４’−Ｈ−２），２．７２（ｂｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝１５．５Ｈｚ，ＡｓＮ−βＣＨ），２．５２（ｂｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝９．２Ｈｚ，１５．５Ｈｚ，ＡｓＮ−βＣＨ），２．０７，２．０５，１．８９（ｅａｃｈ ｓ，ｅａｃｈ ３Ｈ，Ａｃ）；ＭＳ（Ｆａｂ），Ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ６１Ｈ８８Ｎ５Ｏ３５［Ｍ＋Ｈ＋］１４５０．５，ｆｏｕｎｄ，１４５０．３
参考例１３ 化合物１６の合成
化合物１０（２８ｍｇ，１６μｍｏｌ）とウシ血清アルブミン１．７ｍｇをＨＥＰＥＳ緩衝溶液（５０ｍＭ，ｐＨ５．０，６２４μＬ）に溶解させ、ノイラミニダーゼ（シグマアルドリッチ社製、ｆｒｏｍ Ｖｉｂｌｉｏ Ｃｈｏｌｅｒａｅ，１１７ｍＵ）を加えた。この溶液を３７℃で１７時間静置した後、ＨＰＬＣ分析により反応終了を確認した。続いて、反応溶液をＨＰＬＣ（ＹＭＣ Ｐａｃｋｅｄ Ｃｏｌｕｍｎ Ｄ−ＯＤＳ−５ Ｓ−５ １２０Ａ ＯＤＳ Ｎｏ．２０２０１７８、２０×２５０ｍｍ、展開溶媒は５０ｍＭ酢酸アンモニウム水溶液：アセトニトリル＝８０：２０、流速４ｍＬ／ｍｉｎ）で精製した。更にＯＤＳカラム（コスモシール７５Ｃ１８−ＯＰＮ、１５×１００ｍｍ。最初にＨ２Ｏを５０ｍＬ流し、次に２５％アセトニトリルを流して溶出させた）で脱塩したところ、目的とする化合物１６（１４．６ｍｇ，収率６８％）が得られた。得られた化合物の物理的データは以下の通りである。
化合物１６の構造の簡略化したものを表２に示す。
１Ｈ−ＮＭＲ（３０℃）
δ ７．９２（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，Ｆｍｏｃ），７．７１（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，Ｆｍｏｃ），７．５０（ｄｄ，２Ｈ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，Ｆｍｏｃ），７．４３（ｄｄ，２Ｈ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，Ｆｍｏｃ），５．１２（ｓ，１Ｈ，Ｍａｎ４−Ｈ−１），４．９９（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝９．５Ｈｚ，ＧｌｃＮＡｃ１−Ｈ−１），４．７７（ｓ，１Ｈ，Ｍａｎ３−Ｈ−１），４．５７（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，ＧｌｃＮＡｃ２−Ｈ−１），４．４６（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．８Ｈｚ，Ｇａｌ６−Ｈ−１），４．３４（ｔ，１Ｈ，Ｆｍｏｃ），４．２２（ｂｄ，１Ｈ，Ｊ＝２．７Ｈｚ，Ｍａｎ３−Ｈ−２），４．１９（ｂ，１Ｈ，Ｍａｎ４−Ｈ−２），２．７２（ｂｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝１５．５Ｈｚ，ＡｓＮ−βＣＨ），２．５２（ｂｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝９．８Ｈｚ，１５．５Ｈｚ，ＡｓＮ−βＣＨ），２．０５（ｓ，６Ｈ，Ａｃ×２），１．８９（ｓ，３Ｈ，Ａｃ）；ＭＳ（Ｆａｂ），Ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ６１Ｈ８８Ｎ５Ｏ３５［Ｍ＋Ｈ＋］１４５０．５，ｆｏｕｎｄ，１４５０．３
参考例１４ （５−アセタミド−３，５，７−トリデオキシ−７−フルオロ−Ｄ−グリセロ−β−Ｄ−ラクト−２−ノヌロピラノシドニック アシッド（７−フルオロシアル酸）
５−Ａｃｅｔａｍｉｄｅ−３，５，７−ｔｒｉｄｅｏｘｙ−７−ｆｌｕｏｒｏ−Ｄ−ｇｌｙｃｅｒｏ−β−Ｄ−ｇａｌａｃｔｏ−２−ｎｏｎｕｌｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｏｎｉｃ ａｃｉｄ ２５の合成）
（１）化合物１７の合成
無水酢酸（６０ｍｌ）に酢酸ナトリウム（５ｇ，６９ｍｍｏｌ）を溶かし、加熱した後にＤ−ガラクトース（Ｇ）（１０ｇ，５５ｍｍｏｌ）を少しずつ加える。２時間加熱還流した後ＴＬＣ（トルエン：酢酸エチル＝５：１）にて反応が終了したことを確認した。反応溶液を室温に戻した後に、氷水３００ｃｃに注ぐ。ろ過して沈殿物を集める。沈殿物をエタノール（１４ｍｌ）の溶かし再結晶を行い、化合物１７を９．０ｇ（収率４１％）得た。
（２）化合物１８の合成
化合物１７（４．３ｇ，１１ｍｍｏｌ）を塩化メチレン（１２０ｍｌ）の溶かした後、アルゴン気流下−２０℃まで冷却した。続いて、反応溶液に四塩化スズ（３．１ｇ，１２ｍｍｏｌ）を加え２０分撹拌した後、ベンジルアルコール（２．３ｇ，２２ｍｍｏｌ）を加え反応温度を室温に戻した。ＴＬＣ（ヘキサン：酢酸エチル＝１：１）で反応終了を確認後、反応溶液を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液に注ぎ、塩化メチレンで抽出した。塩化メチレン層を無水硫酸マグネシウムで乾燥後、ろ過、減圧濃縮した。残渣をデシケータで乾燥後、蒸留したメタノール（８０ｍｌ）に溶かしナトリウムメトキシド（４３１ｍｇ，５．５ｍｍｏｌ）を加えアルゴン気流下撹拌した。ＴＬＣ（酢酸エチル：メタノール：水＝１０：５：１）で反応終了を確認した後、陽イオン交換樹脂ＩＲ−１２０（＋）で中和し反応を終了させた。樹脂をろ過して取り除いた後、濾液を減圧濃縮した。残渣をデシケータで乾燥後、ピリジン（４４ｍｌ）に溶かし、反応溶液を０℃に冷却した。反応溶液にトリメチルアセチルクロリド（４．６ｇ，３８．５ｍｍｏｌ）を加えた後、室温に戻しアルゴン気流下１時間撹拌した。反応終了をＴＬＣ（ヘキサン：酢酸エチル＝２：１）で確認し０℃に冷却後メタノールを加え反応を終了させた。反応溶液をそのまま減圧濃縮した後、残渣を酢酸エチルに溶かし飽和食塩水溶液、水で洗浄し無水硫酸マグネシウムで酢酸エチルを乾燥させた。硫酸マグネシウムをろ過して取り除いた後、濾液を減圧濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（展開溶媒ヘキサン：酢酸エチル＝２：１）で精製し化合物１８（２．８ｇ，収率５８％）を得た。
（３）化合物１９の合成
化合物１８（２００ｍｇ，０．４５５ｍｍｏｌ）をジクロロメタン（７．８ｍｌ）とピリジン（１．３ｍｌ）に溶かし、無水クロロ酢酸（１５５ｍｇ，０．９１ｍｍｏｌ）を加えて、アルゴン気流下−１５℃で攪拌しながら１５分間反応させた。反応終了を確認後、メタノール（５ｍｌ）で無水クロロ酢酸をクエンチし、トルエンで３回共沸しながら減圧濃縮した。残渣を酢酸エチルで抽出し、飽和食塩水で洗浄した。有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥させ、濾過後濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル：ヘキサン＝１：４）で精製し、化合物１９（収量１７２ｍｇ，収率７３．５％）を得た。
１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）
δ ７．３７−７．２９（ｍ，５Ｈ，Ｐｈ），５．３９（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ１，２＝８．０Ｈｚ，Ｊ２，３＝１０．４Ｈｚ，Ｈ−２），４．８９（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ３，４＝３．４Ｈｚ，Ｈ−３），４．８９，４．６２（２ｄ，２Ｈ，Ｊ＝１２．５Ｈｚ，ＯＣＨ２Ｐｈ），４．５３（ｄ，１Ｈ，Ｈ−１），４．３７（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ６ａ，６ｂ＝１１．５Ｈｚ，Ｊ６ａ，５＝６．０Ｈｚ，Ｈ−６ａ），４．３２（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ６ｂ，５＝６．６Ｈｚ，Ｈ−６ｂ），４．００（ｍ，１Ｈ，Ｈ−４），３．９２（ｓ，２Ｈ，ＣＯＣＨ２Ｃｌ），３．７５（ｄｄ，１Ｈ，Ｈ−５），１．２３，１．１９〔２ｓ，１８Ｈ，ＣＯＣ（ＣＨ３）３〕
１３Ｃ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）
δ １７８．３３，１７７．５７，１６５．９２，（Ｃ＝Ｏ），１３６．６６，１２８．４８，１２８．０７，１２７．８９（Ｐｈ），９９．１６（Ｃ−１），７２．８２（Ｃ−３），７２．３５（Ｃ−５），７０．９２（Ｃ−２），７０．４９（ＯＣＨ２Ｐｈ），６７．２９（Ｃ−４），６２．３０（Ｃ−６），４０．４０（ＣＯＣＨ２Ｃｌ），３８．９５，３８．８０〔ＣＯＣ（ＣＨ３）３〕，２７．１４，２６．９８〔ＣＯＣ（ＣＨ３）３〕
１Ｈ−ＮＭＲ、１３Ｃ−ＮＭＲはＢｒｕｋｅｒのＡＶＡＮＣＥ ４００（４００ＭＨｚと表記）で測定した。溶媒が重クロロホルムの時は内部標準としてトリメチルシランを用いた。その他の重溶媒を用いたときは溶媒ピークを基準とした。化学シフトは、δ（ｐｐｍ）で、結合定数はＪ（Ｈｚ）示した。シリカゲルカラムクロマトグラフィーには、Ｍｅｒｃｋ Ｓｉｌｉｃａｇｅｌ６０，７０−２３０ｍｅｓｈ又は２３０−４００ｍｅｓｈを、球状シリカゲルは関東化学社製のＳｉｌｉｃａ Ｇｅｌ ６０（Ｓｐｈｅｒｉｃａｌ）を、反応検出用（以下ＴＬＣ）としてはＥ．Ｍｅｒｋ社製ＤＣ−Ｐｌａｔｔｅｎ Ｋｉｅｓｅｌｇｅｌ ６０Ｆ２５４（Ａｒｔ１，０５７１５）を使用した。高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）のカラムはナカライテスク社製 ＣＯＳＭＯＳＩＬ ５Ｃ１８−ＡＲ Ｐａｃｋｅｄ Ｃｏｌｕｍｎ（φ４．６×１５０ｍｍ），を使用し、分光蛍光光度計は、ＪＡＳＣＯ社製のＦＰ−２１０ Ｓｐｅｃｔｒｏｆｌｕｏｒｏｍｅｔｅｒを用いた。
（４）化合物２０の合成
化合物１９（３００ｍｇ，０．５８３ｍｍｏｌ）をジクロロメタン（５．８ｍｌ）に溶かし、アルゴン気流下−１５℃で攪拌しながらジエチルアミノスルファートリフルオリド（ＤＡＳＴ）を加えた。ＤＡＳＴを加え１０分後室温に戻し１時間反応させた。ＴＬＣで原料消失を確認し、メタノール（３ｍｌ）でＤＡＳＴをクエンチ後減圧濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル：ヘキサン＝１：６）で精製し化合物２０（収量２１１ｍｇ、収率７０％）を得た。
１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）
δ ７．３７−７．２７（ｍ，５Ｈ，Ｐｈ），５．３１（ｄｄｄ，１Ｈ，Ｊ３，Ｆ＝１４．３Ｈｚ，Ｊ３，４＝９．６９Ｈｚ，Ｊ２，３＝９．６３Ｈｚ，Ｈ−３），５．０４（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ１，２＝７．９３Ｈｚ，Ｈ−２），４．８６（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１２．２Ｈｚ，ＯＣＨ２Ｐｈ），４．６０（ｄ，１Ｈ，Ｈ−１），４．５９（ｄ，１Ｈ，ＯＣＨ２Ｐｈ），４．４４（ｄｄｄ，１Ｈ，Ｊ４，５＝９．０４Ｈｚ，Ｊ４，Ｆ＝５０．６Ｈｚ，Ｈ−４），４．４３（ｄｄｄ，１Ｈ，Ｊ６ａ，６ｂ＝１２．１Ｈｚ，Ｊ６ａ，５＝２．４１Ｈｚ，Ｊ６ａ，Ｆ＝２．２３Ｈｚ，Ｈ−６ａ），４．２４（ｄｄｄ，１Ｈ，Ｊ６ｂ，５＝５．６７Ｈｚ，Ｊ６ｂ，Ｆ＝１．２８Ｈｚ，Ｈ−６ｂ），３．９３（ｓ，２Ｈ，ＯＣＯＣＨ２Ｃｌ），３．７５（ｍ，１Ｈ，Ｈ−５），１．２５，１．１８〔２ｓ，１８Ｈ，ＯＣＯＣ（ＣＨ３）３〕
１３Ｃ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）
δ １７７．９４，１１７．４３，１６５．８８（Ｃ＝Ｏ），１３６．３４，１２８．５５，１３８．２３，１２７．９２（Ｐｈ），９８．６８（Ｃ−１），８７．３５（ｄ，Ｊ４，Ｆ＝１８８．６２Ｈｚ，Ｃ−４），７２．６５（ｄ，Ｊ２，Ｆ＝７．９６Ｈｚ，Ｃ−２），７２．０５（ｄ，Ｊ３，Ｆ＝２０．０２Ｈｚ，Ｃ−３），７１．４９（ｄ，Ｊ５，Ｆ＝２３．０９Ｈｚ，Ｃ−５），７０．８０（ＯＣＨ２Ｐｈ），６２．１２（Ｃ−６），４０．３０（ＯＣＯＣＨ２Ｃｌ），３８．８７〔ＯＣＯＣ（ＣＨ３）３〕，２７．１７，２６．９２〔ＯＣＯＣ（ＣＨ３）３〕
（５）化合物２１の合成
化合物２０（６２５ｍｇ，１．２１ｍｍｏｌ）をメタノール（２４．２ｍｌ）に溶かし、アルゴン気流下−１５℃で攪拌しながら、ナトリウムメトキシド（１３．１ｍｇ，０．６ｍｍｏｌ）を加えた。３０分後ＴＬＣで原料消失を確認後陽イオン交換樹脂ＩＲ−１２０（＋）で中和（ｐＨ６−７）し、樹脂を濾過後減圧濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル：ヘキサン＝１：４）で精製し化合物２１（収量３９５ｍｇ，収率７４％）を得た。
１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）
δ ７．３８−７．２９（ｍ，５Ｈ，Ｐｈ），５．１８（ｄｄｄ，１Ｈ，Ｊ３，Ｆ＝１４．８Ｈｚ，Ｊ３，４＝９．５１Ｈｚ，Ｊ２，３＝８．９９Ｈｚ，Ｈ−３），４．９０（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１１．７，ＯＣＨ２Ｐｈ），４．６３（ｄ，１Ｈ，ＯＣＨ２Ｐｈ），４．４７（ｄｄｄ，１Ｈ，Ｊ５，６ａ＝２．４３Ｈｚ，Ｊ６ａ，Ｆ＝２．２Ｈｚ，Ｈ−６ａ），４．４７（ｄ，１Ｈ，Ｊ１，２＝７．７Ｈｚ，Ｈ−１），４．３８（ｄｄｄ，１Ｈ，Ｊ４，５＝８．９６Ｈｚ，Ｊ３，４＝９．６７Ｈｚ，Ｊ４，Ｆ＝５０．８Ｈｚ，Ｈ−４），４．２３（ｄｄｄ，１Ｈ，Ｊ６ａ，６ｂ＝１２．０Ｈｚ，Ｊ６ｂ，５＝６．０５Ｈｚ，Ｊ６ｂ，Ｆ＝１．２６Ｈｚ，Ｈ−６ｂ），３．７５（ｍ，１Ｈ，Ｈ−５），３．５４（ｍ，１Ｈ，Ｊ２，ＯＨ＝２．７０Ｈｚ，Ｈ−２），１．２７，１．２６〔２ｓ，１８Ｈ，ＯＣＯＣ（ＣＨ３）３〕
１３Ｃ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）
δ １７８．１７，１７７．９４（Ｃ＝Ｏ），１３６．５４，１２８．５４，１２８．１７，１２８．１２（Ｐｈ），１０１．３１（Ｃ−１），８７．４５（ｄ，Ｊ４，Ｆ＝１８７．３９Ｈｚ，Ｃ−４），７４．１７（ｄ，Ｊ３，Ｆ＝１８．８８Ｈｚ，Ｃ−３），７２．４５（ｄ，Ｊ２，Ｆ＝７．５６Ｈｚ，Ｃ−２），７１．４５（ｄ，Ｊ５，Ｆ＝２３．２６Ｈｚ，Ｃ−５），７１．０９（ＯＣＨ２Ｐｈ），６２．４４（Ｃ−６），３８．９０，３８．８５〔ＯＣＯＣ（ＣＨ３）３〕，２７．１４，２６．９９〔ＯＣＯＣ（ＣＨ３）３〕
（６）化合物２２の合成
ピリジン（２２．２μｌ，０．２７４ｍｍｏｌ）を溶かしたジクロロメタン（３７０μｌ）溶液に０℃で無水トリフルオロメタンスルフォン酸（４６μｌ，０．２７４ｍｍｏｌ）を滴下し、１５分後、化合物２１をジクロロメタン（１ｍｌ）に溶かしたものを０℃で滴下した。ＴＬＣで原料消失を確認し、反応混合物をジクロロメタンで希釈した。有機層を飽和重曹水、飽和食塩水、水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥後濃縮した。残渣を真空ポンプでさらに乾燥後ベンゼン（１ｍｌ）に溶かし、アルゴン気流下室温でアジ化ナトリウム（１３ｍｇ，０．２０６ｍｍｏｌ）、テトラアンモニウムクロライド（５７ｍｇ，０．２０６ｍｍｏｌ）を加え４０℃で反応させた。２時間後ＴＬＣで原料消失を確認後減圧濃縮した。残渣を酢酸エチルで抽出し、飽和食塩水、水で洗浄し無水硫酸マグネシウムで乾燥後濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル：ヘキサン＝１：４）で精製して化合物２２（収量３０．４ｍｇ，収率９５％）を得た。
１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）
δ ７．３９−７．３２（ｍ，５Ｈ，Ｐｈ），４．９９（ｄｄｄ，１Ｈ，Ｊ３，Ｆ＝１３．１８Ｈｚ，Ｊ３，４＝９．２７Ｈｚ，Ｊ２，３＝３．８７Ｈｚ，Ｈ−３），４．９３（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１２．０７Ｈｚ，ＯＣＨ２Ｐｈ），４．６７（ｄ，１Ｈ，Ｊ１，２＝１．１８Ｈｚ，Ｈ−１），４．６３（ｄ，１Ｈ，ＯＣＨ２Ｐｈ），４．５１（ｄｄｄ，１Ｈ，Ｊ６ａ，６ｂ＝１１．９５Ｈｚ，Ｊ６ａ，５＝２．５４Ｈｚ，Ｊ６ａ，Ｆ＝２．０８Ｈｚ，Ｈ−６ａ），４．２３（ｄｄｄ，１Ｈ，Ｊ６ｂ，５＝６．１４Ｈｚ，Ｊ６ｂ，Ｆ＝１．１４Ｈｚ，Ｈ−６ｂ），４．０８（ｍ，１Ｈ，Ｈ−２），３．６４（ｍ，１Ｈ，Ｈ−５），１．２６〔２ｓ，１８Ｈ，ＯＣＯＣ（ＣＨ３）３〕
１３Ｃ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）
δ １７８．０１，１７７．６８（Ｃ＝Ｏ），１３６．０６，１２８．６３，１２８．３１，１２８．１４（Ｐｈ），９７．２５（Ｃ−１），８５．５１（ｄ，Ｊ４，Ｆ＝１８３．９７，Ｃ−４），７２．０１（ｄ，Ｊ５，Ｆ＝２３．８９，Ｃ−５），７１．７３（ｄ，Ｊ３，Ｆ＝１８．９８，Ｃ−３）
７０．５７（ＯＣＨ２Ｐｈ），６２．４２（Ｃ−２，Ｃ−６），３９．０８，３８．９０〔ＯＣＯＣ（ＣＨ３）３〕，２７．１８，２６．９５〔ＯＣＯＣ（ＣＨ３）３〕
（７）化合物２３の合成
化合物２２（１８０ｍｇ，０．３８７ｍｍｏｌ）をメタノール（８ｍｌ）に溶かしナトリウムメトキシド（９２２ｍｇ，９．６７ｍｍｏｌ）を加え攪拌し４０℃で反応させた。４．５時間後ＴＬＣで１スポットにまとまったことを確認し陽イオン交換樹脂ＩＲ−１２０（＋）で中和後、濾過し濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル：ヘキサン＝１：１）で精製し化合物２３（収量１０５．３ｍｇ，収率９１．６％）を得た。
１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３），
δ ７．４０−７．３１（ｍ，５Ｈ，Ｐｈ），４．９６（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１２．１３Ｈｚ，ＯＣＨ２Ｐｈ），４．７１（ｄ，１Ｈ，Ｊ１，２＝１．３３Ｈｚ，Ｈ−１），４．６９（ｄ，１Ｈ，ＯＣＨ２Ｐｈ），４．４９（ｄｄｄ，１Ｈ，Ｊ４，Ｆ＝５１．０６Ｈｚ，Ｊ４，５＝９．１９Ｈｚ，Ｊ３，４＝９．２０Ｈｚ，Ｈ−４），４．０２（ｍ，１Ｈ，Ｈ−２），３．９３（ｄｄｄｄ，１Ｈ，Ｊ６ａ，６ｂ＝１２．１９Ｈｚ，Ｊ６ａ，５＝２．３１Ｈｚ，Ｊ６ａ，Ｆ＝２．３２Ｈｚ，Ｊ６ａ，ＯＨ＝６．２０Ｈｚ，Ｈ−６ａ），３．８９−３．７７（ｍ，２Ｈ，Ｈ−３，Ｈ−６ｂ），３．３９（ｍ，１Ｈ，Ｈ−５），
１３Ｃ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３），
δ １３６．３９，１２８．６２，１２８．２４，１２７．８３（Ｐｈ），９８．６３（Ｃ−１），８８．１９（ｄ，Ｊ４，Ｆ＝１７８．９１Ｈｚ，Ｃ−４），７３．９５（ｄ，Ｊ５，Ｆ＝２５．４８Ｈｚ，Ｃ−５），７１．１８（ＯＣＨ２Ｐｈ），７１．１６（ｄ，Ｊ３，Ｆ＝１９．６９Ｈｚ，Ｃ−３），６４．４８（ｄ，Ｊ２，Ｆ＝８．４２Ｈｚ，Ｃ−２），６１．３９（Ｃ−６）
（８）化合物２４の合成
化合物２３（１０５ｍｇ，０．３５３ｍｍｏｌ）をメタノール（７ｍｌ）に溶かし無水酢酸（３３３μｌ，３．５３ｍｏｌ）を加えた後、アルゴン気流下で触媒量の１０％ Ｐｄ／Ｃを加え水素置換してから室温で攪拌した。２時間後ＴＬＣで原料消失を確認し、活性炭濾過後濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル：メタノール＝５：１）で精製し化合物２４（収量５７ｍｇ，収率７２％）を得た。
１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ），
δ ５．２３（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ１，２＝２．６９Ｈｚ，Ｊ１，Ｆ＝１．４４Ｈｚ，Ｈ−１−α），４．６５（ｄｄｄ，１Ｈ，Ｊ４，Ｆ＝５０．９４Ｈｚ，Ｊ３，４＝９．０６Ｈｚ，Ｊ４，５＝９．５８Ｈｚ，Ｈ−４−α），４．４７（ｍ，１Ｈ，Ｈ−２−α），４．４３（ｄｄｄ，１Ｈ，Ｊ３，Ｆ＝１４．２８Ｈｚ，Ｊ２，３＝４．９Ｈｚ，Ｈ−３−α），４．１６（ｍ，１Ｈ，Ｈ−５−α），３．９５（ｍ，２Ｈ，Ｈ−６ａ−α，Ｈ−６ｂ−α），２．１４（ｓ，３Ｈ，ＮＨＣＯＣＨ３−α）
１３Ｃ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ），
δ １７５．２７（Ｃ＝Ｏ−α），９３．４６（Ｃ−１−α），８８．３０（ｄ，Ｊ４，Ｆ＝１７７．００Ｈｚ，Ｃ−４−α），６９．９１（ｄ，Ｊ５，Ｆ＝２４．４１Ｈｚ，Ｃ−５−α），６７．６０（ｄ，Ｊ３，Ｆ＝１８．７４Ｈｚ，Ｃ−３−α），６０．３６（Ｃ−６），５４．１２（ｄ，Ｊ２，Ｆ＝８．６８Ｈｚ，Ｃ−２−α），２２．３１（ＮＨＣＯＣＨ３−α）
（９）化合物２５の合成
化合物２４（５０ｍｇ，０．２２４ｍｍｏｌ）ピルビン酸ナトリウム（１２３ｍｇ，１．１２ｍｍｏｌ）と牛血清アルブミン（５ｍｇ）をリン酸ナトリウム緩衝溶液（１００ｍＭ，ｐＨ７．５，３．４ｍｌ）に溶かし、その後シアル酸アルドラーゼ（５０Ｕ）を加え室温で反応を開始した。２４時間後反応溶液を凍結乾燥させ、少量の水に溶かし陰イオン交換樹脂カラム（ＡＧ １−Ｘ８，２００−４００ｍｅｓｈ，ｆｏｒｍａｔｅ ｆｏｒｍ）にのせた。水３００ｍｌ流した後、１Ｍギ酸で目的物を溶出させ減圧濃縮し、ゲル濾過カラム（Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−１５，水）で精製し化合物２５（収量４０ｍｇ，収率５８．９％）を得た。
１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ），
δ ４．６１（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ７，８＝８．９７Ｈｚ，Ｊ７，Ｆ＝４５．５６Ｈｚ，Ｈ−７），４．１８（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ５，６＝１０．６３Ｈｚ，Ｊ６，Ｆ＝２９．８６Ｈｚ，Ｈ−６），４．１５（ｍ，１Ｈ，Ｈ−４），４．０７（ｍ，１Ｈ，Ｈ−８），４．０２（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ４，５＝１０．１０Ｈｚ，Ｈ−５），３．９０（ｄｄｄ，１Ｈ，Ｊ９ａ９ｂ＝１２．１８Ｈｚ，Ｊ９ａ，８＝２．７７Ｈｚ，Ｊ９ａ，Ｆ＝２．８６Ｈｚ，Ｈ−９ａ），３．７６（ｄｄｄ，１Ｈ，Ｊ９ｂ，８＝５．３３Ｈｚ，Ｊ９ｂ，Ｆ＝２．０６Ｈｚ，Ｈ−９ｂ），２．４０（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ３ｅｑ，３ａｘ＝１３．００，Ｊ３ｅｑ，４＝４．８８Ｈｚ，Ｈ−３ｅｑ），２．１５（ｓ，３Ｈ，ＯＣＯＣＨ３），２．００（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ３ａｘ，４＝１１．７０Ｈｚ，Ｈ−３ａｘ），
１３Ｃ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ），
δ １７５．１７，１７３．６８（Ｃ＝Ｏ），９６．０１（Ｃ−１），８９．１２（ｄ，Ｊ７，Ｆ＝１７９．２３Ｈｚ，Ｃ−７），６９．６７（ｄ，Ｊ６，Ｆ＝１７．４１Ｈｚ，Ｃ−６），６８．３１（ｄ，Ｊ８，Ｆ＝２６．５０Ｈｚ，Ｃ−８），６７．２６（Ｃ−４），６２．７０（Ｃ−６），５２．１７（Ｃ−５），３９．１９（Ｃ−３），２２．６１（ＮＨＣＯＣＨ３），
参考例１５（５−アセタミド−３，５，８−トリデオキシ−８−フルオロ−Ｄ−グリセロ−β−Ｄ−ラクト−２−ノヌロピラノシドニック アシッド（８−フルオロシアル酸）
５−Ａｃｅｔａｍｉｄｅ−３，５，８−ｔｒｉｄｅｏｘｙ−８−ｆｌｕｏｒｏ−Ｄ−ｇｌｙｃｅｒｏ−β−Ｄ−ｇａｌａｃｔｏ−２−ｎｏｎｕｌｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｏｎｉｃ ａｃｉｄ ２７の合成）
下記のスキームに従ってシアル酸（２６）から５−アセタミド−３，５，８−トリデオキシ−８−フルオロ−Ｄ−グリセロ−β−Ｄ−ラクト−２−ノヌロピラノシドニック アシッド（２７）を合成した。
８−フルオロシアル酸のＮＭＲデータを以下に示す。
１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ），
δ ４．６９（ｄｄｄｄ，１Ｈ，Ｊ８，Ｆ＝４８．７Ｈｚ，Ｊ８，９ａ＝５．０Ｈｚ，Ｊ８，９ｂ＝３．５Ｈｚ，Ｈ−８），４．０３（ｄｄｄ，１Ｈ，Ｊ４，５＝１０．０Ｈｚ，Ｊ３ａｘ，４＝１１．１Ｈｚ，Ｊ３ｅｑ，４＝４．７Ｈｚ，Ｈ−４），３．９５（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ４，５＝１０．０Ｈｚ，Ｊ５，６＝９．９Ｈｚ，Ｈ−５），３．９４（ｄｄｄ，１Ｈ，Ｊ６，７＝〜０Ｈｚ，Ｊ７，８＝６．８Ｈｚ，Ｊ７，Ｆ＝１４．０Ｈｚ，Ｈ−７），３．８８（ｄｄｄ，１Ｈ，Ｊ９ａ９ｂ＝１３．３Ｈｚ，Ｊ９ａ，８＝３．５Ｈｚ，Ｊ９ｂ，Ｆ＝２８．０Ｈｚ，Ｈ−９ｂ），３．８６（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ５，６＝９．９Ｈｚ，Ｊ６，７＝〜０Ｈｚ，Ｈ−６），３．７２（ｄｄｄ，１Ｈ，Ｊ９ａ，９ｂ＝５．３３Ｈｚ，Ｊ９ａ，８＝５．０Ｈｚ，Ｊ９ａ，Ｆ＝３０．６Ｈｚ，Ｈ−９ａ），２．２８（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ３ｅｑ，３ａｘ＝１３．００，Ｊ３ｅｑ，４＝４．６Ｈｚ，Ｈ−３ｅｑ），２．０５（ｓ，３Ｈ，Ａｃ），１．８７（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ３ａｘ，４＝１１．１Ｈｚ，Ｊ３ｅｑ，３ａｘ＝１３．００，Ｈ−３ａｘ）
参考例１６（５−アセタミド−３，５，９−トリデオキシ−９−フルオロ−Ｄ−グリセロ−β−Ｄ−ラクト−２−ノヌロピラノシドニック アシッド（９−フルオロシアル酸）
５−Ａｃｅｔａｍｉｄｅ−３，５，９−ｔｒｉｄｅｏｘｙ−９−ｆｌｕｏｒｏ−Ｄ−ｇｌｙｃｅｒｏ−β−Ｄ−ｇａｌａｃｔｏ−２−ｎｏｎｕｌｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｏｎｉｃ ａｃｉｄ ２８の合成）
下記のスキームに従ってシアル酸（２６）から５−アセタミド−３，５，９−トリデオキシ−９−フルオロ−Ｄ−グリセロ−β−Ｄ−ラクト−２−ノヌロピラノシドニック アシッド（２８）を合成した。
参考例１７ ＣＭＰ−シアル酸の合成
（ａ）（１）Ｄｏｗｅｘ ５０−Ｘ８，ＭｅＯＨ，（２）Ａｃ２Ｏ，６０％ＨＣｌＯ４；
（ｂ）（１）１Ｈ−Ｔｅｔｒａｚｏｌｅ，ＣＨ３ＣＮ，（２）ｔ−ＢｕＯＯＨ，ＣＨ３ＣＮ，（３）ＤＢＵ，ＣＨ３ＣＮ，（４）ＮａＯＭｅ，ＭｅＯＨ，Ｈ２Ｏ
シアル酸（０．０７４ｍｍｏｌ）を蒸留メタノール（３ｍｌ）に溶かし、アルゴン気流下室温で撹拌しながらＤｏｗｅｘ−５０Ｗ−Ｘ８（６５ｍｇ）を加え、３時間反応させた。反応終了を確認し、濾過後減圧濃縮した。残渣を無水酢酸（２００μｌ）に溶かし、−２０℃で撹拌しながら無水酢酸：６０％過塩素酸＝１５：１溶液（２２μｌ）を加え、１０℃にて４０分反応させた。反応終了を確認後、反応溶液を酢酸エチルで希釈して、飽和重曹水で洗浄した。有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥し、濾過後減圧濃縮して、カルボキシル基が保護されたシアル酸（２９）を含む残渣を得た。残渣とＣＭＰ−５’−ホスホロアミダイト誘導体（３０）（０．２３ｍｍｏｌ）をベンゼンで別々の３回共沸し、蒸留したアセトニトリル（１００μｌ）にそれぞれ溶かし混ぜた。アルゴン気流下氷水中で撹拌しながら１Ｈ−テトラゾール（１７ｍｇ，０．２３ｍｍｏｌ）を加えた。５分後に室温に戻し、さらに１０分間反応させた。反応終了を確認後、溶液を酢酸エチルで希釈し、飽和重曹水、飽和食塩水で洗浄した。有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥させ、濾過後３０℃以下で濃縮した後さらにトルエンで２回共沸し水を取り除いた。残渣に蒸留したアセトニトリル（４００μｌ）を加え、アルゴン気流下氷冷しながら２．５Ｍのｔ−ＢｕＯＯＨトルエン溶液（２９０μｌ）を滴下した。５分後に室温に戻し、さらに２０分間撹拌した。反応終了を確認後、ジメチルスルフィド（５３μｌ）を滴下し１０分間撹拌してｔ−ＢｕＯＯＨをクエンチした。その後、ＤＢＵ（１８μｌ）を滴下して２０分間室温で撹拌した。反応終了を確認後、メタノール（０．６７ｍｌ）、水（１．３５ｍｌ）、ナトリウムメトキシド（３６０ｍｇ）を加え室温で１６時間反応させた。反応終了を確認後水で抽出し、ジクロロメタンで洗浄した。水層を２５℃以下で８ｍｌ程度まで減圧濃縮した。この水溶液をＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−１５（１．８φ×９０ｃｍ）を用いるゲルカラムクロマトグラフィー（展開溶媒：２０ｍＭアンモニア水、流速：０．３ｍｌ／ｍｉｎ）で精製し、ＣＭＰ−シアル酸を得た。
参考例１８ ＣＭＰ−７”−デオキシ−７”−フルオロ−シアル酸の合成
シアル酸の代わりに化合物（２５）を用いた以外は参考例７と同様にしてＣＭＰ−７”−デオキシ−７”−フルオロ−シアル酸を合成した。ＮＭＲデータを以下に示す。
１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，５０ｍＭ ＮＤ４ＤＣＯ３ ｉｎ Ｄ２Ｏ），
δ ８．０４（ｄ，１Ｈ，Ｊ５，６＝７．６Ｈｚ，Ｈ−６），６．２０（ｄ，１Ｈ，Ｊ６，５＝７．６Ｈｚ，Ｈ−５），６．０６（ｄ，１Ｈ，Ｊ１’，２’＝４．５Ｈｚ，Ｈ−１’），４．５４（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ７”，８”＝９．５Ｈｚ，Ｊ７”，Ｆ＝４５．９Ｈｚ，Ｈ−７”），４．４２〜４．２０（ｍ，７Ｈ，Ｈ−２’，Ｈ−３’，Ｈ−４’，Ｈ−５’ａ，Ｈ−５’ｂ，Ｈ−６”，Ｈ−８”），４．１６（ｄｄｄ，１Ｈ，Ｊ４”，３”ｅｑ＝４．７Ｈｚ，Ｊ４”，３”ａｘ＝１１．３Ｈｚ，Ｊ４，５＝１０．３Ｈｚ，Ｈ−４”），４．０３（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ５”，４”＝Ｊ５”，６”＝１０．３Ｈｚ，Ｈ−５”），３．９１（ｄｄｄ，１Ｈ，Ｊ９”ａ，９”ｂ＝１２．２Ｈｚ，Ｊ９”ａ，８”＝２．８Ｈｚ，Ｊ９”ａ，Ｆ＝２．８Ｈｚ，Ｈ−９”ａ），３．７５（ｄｄｄ，１Ｈ，Ｊ９”ａ，９”ｂ＝１２．２Ｈｚ，Ｊ９”ｂ，８”＝５．４Ｈｚ，Ｊ９”ｂ，Ｆ＝２．１Ｈｚ，Ｈ−９”ｂ），２．６１（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ３”ｅｑ，４”＝４．７Ｈｚ，Ｊｇｅｍ＝１３．３Ｈｚ，Ｈ−３”ｅｑ），２．１４（ｓ，３Ｈ，Ａｃ），１．７６（ｄｄｄ，１Ｈ，Ｊ３”ａｘ，４”＝１１．５Ｈｚ，Ｊｇｅｍ＝１３．３Ｈｚ，Ｊ３”ａｘ，Ｐ＝５．６Ｈｚ，Ｈ−３”ａｘ），
参考例１９ ＣＭＰ−８”−デオキシ−８”−フルオロ−シアル酸の合成
シアル酸の代わりに化合物（２７）を用いた以外は参考例７と同様にしてＣＭＰ−８”−デオキシ−８”−フルオロ−シアル酸を合成した。ＮＭＲデータを以下に示す。
１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，５０ｍＭ ＮＤ４ＤＣＯ３ ｉｎ Ｄ２Ｏ），
δ ８．０８（ｄ，１Ｈ，Ｊ５，６＝７．６Ｈｚ，Ｈ−６），６．２０（ｄ，１Ｈ，Ｊ６，５＝７．６Ｈｚ，Ｈ−５），６．０９（ｄ，１Ｈ，Ｊ１’，２’＝４．１Ｈｚ，Ｈ−１’），４．９０（ｍ，１Ｈ，Ｈ−８”），４．４２（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ３’，２’＝Ｊ３’，４’＝４．９Ｈｚ，Ｈ−３’），４．３９（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ２’，１’＝４．１Ｈｚ，Ｊ’２’，３’＝４．９Ｈｚ，Ｈ−２’），４．３１−４．２８（ｍ，３Ｈ，Ｈ−４’，Ｈ−５’ａ，Ｈ−５’ｂ），４．１５（ｄｄｄ，１Ｈ，Ｊ４”，３”ｅｑ＝４．４Ｈｚ，Ｊ４”，３”ａｘ＝１１．５Ｈｚ，Ｊ４，５＝１０．５Ｈｚ，Ｈ−４”），４．１０−３．９０（ｍ，５Ｈ，Ｈ−５”，Ｈ−６”，Ｈ−７”，Ｈ−９”ａ，Ｈ−９”ｂ），２．６０（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ３”ｅｑ，４”＝４．４Ｈｚ，Ｊｇｅｍ＝１３．１Ｈｚ，Ｈ−３”ｅｑ），２．１３（ｓ，３Ｈ，Ａｃ），１．７７（ｄｄｄ，１Ｈ，Ｊ３”ａｘ，４”＝１１．５Ｈｚ，Ｊｇｅｍ＝１３．１Ｈｚ，Ｊ３”ａｘ，Ｐ＝４．５Ｈｚ，Ｈ−３”ａｘ），
参考例２０ ＣＭＰ−９”−デオキシ−９”−フルオロ−シアル酸の合成
シアル酸の代わりに化合物（２８）を用いた以外は参考例７と同様にしてＣＭＰ−９”−デオキシ−９”−フルオロ−シアル酸を合成した。
実施例１ Ｆｍｏｃ基でアスパラギンのアミノ基窒素を保護したジシアロα２，３糖鎖アスパラギン（Ｃ１−１）およびＦｍｏｃ基でアスパラギンのアミノ基窒素を保護した２種のモノシアロα２，３糖鎖アスパラギン（Ｃ１−２及びＣ１−３）の合成
参考例３で得られたＦｍｏｃ基でアスパラギンのアミノ基窒素を保護したアシアロ糖鎖アスパラギンにシアル酸転移酵素を用いてＣＭＰ−シアル酸を転移させた。
シアル酸転移酵素としてα２，３転移酵素である市販のＲａｔ，Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ由来のものを用いた。
参考例３で得られたアシアロ９糖（２０ｍｇ，１０．１μｍｏｌ）を５０ｍＭカコジル酸緩衝液（ｐＨ＝６．０，５ｍｌ）に溶解させた後、牛血清アルブミン（ＢＳＡ，５ｍｇ）を加える。これに、ＣＭＰ−シアル酸（２６ｍｇ，４０．４μｍｏｌ）、Ａｌｋａｌｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（５μｌ，１２５ｕｎｉｔ）を加え均一化する。最後に、α２，３−Ｓｉａｌｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ（ＣＡＬＢＩＯＣＨＥＭ社製、１００μｌ）を加え３７℃で４８時間静置させる。ＨＰＬＣで反応をモニターしながら原料が目的量まで減少した時点で反応を終了させ、反応液をメンブランフィルターにて濾過する。濾液を濃縮し液量を減じた後、ＨＰＬＣ分取カラムにて精製した（ＹＭＣ−Ｐａｃｋ Ｒ＆Ｄ ＯＤＳ，Ｄ−ＯＤＳ−５−Ａ，２０×２５０ｍｍ，ＡＮ／２５ｍＭ ＡｃＯＮＨ４ ｂｕｆｆｅｒ＝１８／８２，７．５ｍｌ／ｍｉｎ．，ｗａｖｅ ｌｅｎｇｔｈ；２７４ｎｍ）ところ、２５分後にジシアロ１１糖 化合物（Ｃ１−１）が、それぞれ３０分後、３４分後に各モノシアロ１０糖 化合物（Ｃ１−２）及び（Ｃ１−３）が溶出してきた。それぞれを分取した後、脱塩処理、次いで凍結乾燥を行うと、各化合物１、２、３がそれぞれ０．７ｍｇ（２．７％）、１．９ｍｇ（８．３％）、３．５ｍｇ（１５．３％）得られた。各化合物のＮＭＲデータは以下のとおりである。
化合物（Ｃ１−１）
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ，３０℃，ＨＯＤ＝４．８１）
δ ７．９０（ｄ，２Ｈ，Ｆｍｏｃ），７．６９（ｄ，２Ｈ，Ｆｍｏｃ），７．４９（ｄｄ，２Ｈ，Ｆｍｏｃ），７．４２（ｄｄ，２Ｈ，Ｆｍｏｃ），５．１０（ｓ，１Ｈ，Ｍａｎ４−Ｈ１），４．９７（ｄ，１Ｈ，ＧｌｃＮＡｃ１−Ｈ１），４．９１（ｓ，１Ｈ，Ｍａｎ４’−Ｈ−１），４．５０−４．６０（ｍ，４Ｈ），４．３４（１Ｈ，Ｆｍｏｃ），４．２４（ｂｓ，１Ｈ，Ｍａｎ３−Ｈ２），４．１８（ｂｓ，１Ｈ，Ｍａｎ４−Ｈ２），４．１０（ｍ，２Ｈ），２．７４（ｍ，３Ｈ，Ａｓｎ−βＣＨ，ＮｅｕＡｃ７，７’−Ｈ３ｅｑ），２．４０−２．６０（ｍ，１Ｈ，Ａｓｎ−βＣＨ），２．０５，２．０３，２．０２（ｅａｃｈ ｓ，Ａｃ），１．７７（ｄｄ，２Ｈ，ＮｅｕＡｃ７，７’−Ｈ３ａｘ）．
化合物（Ｃ１−２）
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ，３０℃，ＨＯＤ＝４．８１）
δ ７．９０（ｄ，２Ｈ，Ｆｍｏｃ），７．６９（ｄ，２Ｈ，Ｆｍｏｃ），７．４９（ｄｄ，２Ｈ，Ｆｍｏｃ），７．４２（ｄｄ，２Ｈ，Ｆｍｏｃ），５．１０（ｓ，１Ｈ，Ｍａｎ４−Ｈ１），４．９７（ｄ，１Ｈ，ＧｌｃＮＡｃ１−Ｈ１），４．９０（ｓ，１Ｈ，Ｍａｎ４’−Ｈ−１），４．４７−４．６０（ｍ），４．４３（ｄ，１Ｈ），４．３２（１Ｈ，Ｆｍｏｃ），４．２２（ｂｓ，２Ｈ），４．１７（ｂｓ，１Ｈ，Ｍａｎ４−Ｈ２），４．０６−４．１３（ｍ，２Ｈ），２．７２（ｍ，２Ｈ，Ａｓｎ−βＣＨ，ＮｅｕＡｃ７−Ｈ３ｅｑ），２．５０−２．６０（ｍ，１Ｈ，Ａｓｎ−βＣＨ），２．０５，２．０３，２．０１（ｅａｃｈ ｓ，Ａｃ），１．７７（ｄｄ，１Ｈ，ＮｅｕＡｃ７−Ｈ３ａｘ）．
化合物（Ｃ１−３）
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ，３０℃，ＨＯＤ＝４．８１）
δ ７．９０（ｄ，２Ｈ，Ｆｍｏｃ），７．６９（ｄ，２Ｈ，Ｆｍｏｃ），７．４９（ｄｄ，２Ｈ，Ｆｍｏｃ），７．４２（ｄｄ，２Ｈ，Ｆｍｏｃ），５．１０（ｓ，１Ｈ，Ｍａｎ４−Ｈ１），４．９７（ｄ，１Ｈ，ＧｌｃＮＡｃ１−Ｈ１），４．９０（ｓ，１Ｈ，Ｍａｎ４’−Ｈ−１），４．５０−４．６０（ｍ），４．４５（ｄ，１Ｈ），４．３３（１Ｈ，Ｆｍｏｃ），４．２２（ｍ，２Ｈ），４．１７（ｂｓ，１Ｈ，Ｍａｎ４−Ｈ２），４．０９（ｍ，２Ｈ），２．７４（ｍ，２Ｈ，Ａｓｎ−βＣＨ，ＮｅｕＡｃ７−Ｈ３ｅｑ），２．４５−２．６０（ｍ，１Ｈ，Ａｓｎ−βＣＨ），２．０５，２．０３，２．０２，２．００（ｅａｃｈ ｓ，Ａｃ），１．７７（ｄｄ，１Ｈ，ＮｅｕＡｃ７−Ｈ３ａｘ）
【実施例２】
実施例１で得られた化合物（Ｃ１−２）（２ｍｇ，０．８８μｍｏｌ）とウシ血清アルブミン１ｍｇをＨＥＰＥＳ緩衝溶液（５０ｍＭ，ｐＨ５．０）１００μｌに溶解させ、さらにβ−ガラクトシダーゼ（生化学工業社製、ｆｒｏｍ Ｊａｃｋ Ｂｅａｎｓ，５μＬ，１００ｍＵ）を加えた。この溶液を３７℃で１５時間静置した後、メンブランフィルターでろ過を行った。ろ液をＨＰＬＣ（ＯＤＳカラム、２．０φ×２５ｃｍ、展開溶媒は５０ｍＭ酢酸アンモニウム水溶液：アセトニトリル＝８２：１８、流速７．５ｍｌ／ｍｉｎ）で精製した後、溶媒を濃縮、次いで凍結乾燥を行った。残留物を水２００μｌに溶解させＯＤＳ−カラムクロマトグラフィー（コスモシール７５Ｃ１８−ｏｐｎ、最初に水で洗浄を行い、次いで２５％アセトニトリル水溶液で溶出させる）を用いて脱塩処理を行ったところ、目的とする化合物（Ｃ２）が０．５μｇ得られた。ＮＭＲデータは以下のとおりである。
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ，３０℃，ＨＯＤ＝４．８１）
δ ７．９０（ｄ，２Ｈ，Ｆｍｏｃ），７．６９（ｄ，２Ｈ，Ｆｍｏｃ），７．４９（ｄｄ，２Ｈ，Ｆｍｏｃ），７．４２（ｄｄ，２Ｈ，Ｆｍｏｃ），５．１０（ｓ，１Ｈ，Ｍａｎ４−Ｈ１），４．９８（ｄ，１Ｈ，ＧｌｃＮＡｃ１−Ｈ１），４．９０（ｓ，１Ｈ，Ｍａｎ４’−Ｈ−１），４．５０−４．６０（ｍ），４．３３（１Ｈ，Ｆｍｏｃ），４．２２（ｍ，２Ｈ），４．１７（ｂｓ，１Ｈ，Ｍａｎ４−Ｈ２），４．１０（ｍ，２Ｈ），２．７４（ｍ，２Ｈ，Ａｓｎ−βＣＨ，ＮｅｕＡｃ７−Ｈ３ｅｑ），２．４５−２．６０（ｍ，１Ｈ，Ａｓｎ−βＣＨ），２．０５，２．０３，２．０１（ｅａｃｈ ｓ，Ａｃ），１．７８（ｄｄ，１Ｈ，ＮｅｕＡｃ７−Ｈ３ａｘ）
【実施例３】
実施例２で得られた化合物（Ｃ２）（１．８ｍｇ，０．８６μｍｏｌ）を、ウシ血清アルブミン１ｍｇと共にＨＥＰＥＳ緩衝溶液（５０ｍＭ，ｐＨ５．０）９０μｌに溶解させ、さらにＮ−アセチル−β−グルコサミニダーゼ（シグマアルドリッチ社製、ｆｒｏｍ Ｊａｃｋ Ｂｅａｎｓ）を４μｌ（２５０ｍＵ）加えた。この溶液を３７℃で２４時間静置した後、メンブランフィルターでろ過を行った。ろ液をＨＰＬＣ（ＯＤＳカラム、２．０φ×２５ｃｍ、展開溶媒は５０ｍＭ酢酸アンモニウム水溶液：アセトニトリル＝８２：１８、流速７．５ｍｌ／ｍｉｎ）で精製した後、溶媒を濃縮、次いで凍結乾燥を行った。残留物を水２００μｌに溶解させＯＤＳ−カラムクロマトグラフィー（コスモシール７５Ｃ１８−ｏｐｎ、最初に水で洗浄を行い、次いで２５％アセトニトリル水溶液で溶出させる）を用いて脱塩処理を行ったところ、目的とする化合物（Ｃ３）が０．９μｇ得られた。
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ，３０℃，ＨＯＤ＝４．８１）
δ ８．０１（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝７．６，Ｆｍｏｃ），７．８０（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝７．６，Ｆｍｏｃ），７．６０（ｄｄ，２Ｈ，Ｊ＝７．６，Ｆｍｏｃ），７．５３（ｄｄ，２Ｈ，Ｊ＝７．６，Ｆｍｏｃ），５．２１（ｓ，１Ｈ，Ｍａｎ４−Ｈ１），５．０９（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．８，ＧｌｃＮＡｃ１−Ｈ１），５．００（ｓ，１Ｈ，Ｍａｎ４’−Ｈ−１），４．８７（ｓ，１Ｈ），４．６０−４．７８（ｍ，５Ｈ），４．４０−４．５０（ｂｍ，２Ｈ），４．３４（ｓ，１Ｈ），４．２８（ｂｓ，１Ｈ，Ｍａｎ４−Ｈ２），４．２０（ｄｄ，１Ｈ，Ｊａ＝３．０，Ｊｂ＝９．９），２．８０−２．９５（ｍ，２Ｈ，Ａｓｎ−βＣＨ，ＮｅｕＡｃ７−Ｈ３ｅｑ），２．６５−２．７５（ｍ，１Ｈ，Ａｓｎ−βＣＨ），２．１６，２．１４，２．１２（ｅａｃｈｓ，Ａｃｘ３），１．９８（ｓ，３Ｈ，Ａｃ），１．８９（ｄｄ，１Ｈ，Ｊａ＝１２．１，Ｊｂ＝１１．９，ＮｅｕＡｃ７−Ｈ３ａｘ）．
【実施例４】
実施例３で得られた化合物（Ｃ３）（０．８ｍｇ，０．４２μｍｏｌ）とウシ血清アルブミン１ｍｇをＨＥＰＥＳ緩衝溶液（５０ｍＭ，ｐＨ５．０）５０μｌに溶解させ、α−マンノシダーゼ（シグマアルドリッチ社製、ｆｒｏｍ Ｊａｃｋ Ｂｅａｎｓ）３０μｌ（２．９Ｕ）加えた。この溶液を３７℃で６３時間静置した後、メンブランフィルターでろ過を行った。ろ液をＨＰＬＣ（ＯＤＳカラム、２．０φ×２５ｃｍ、展開溶媒は５０ｍＭ酢酸アンモニウム水溶液：アセトニトリル＝８０：２０、流速７．５ｍｌ／ｍｉｎ）で精製した後、溶媒を濃縮、次いで凍結乾燥を行った。残留物を水２００μｌに溶解させＯＤＳ−カラムクロマトグラフィー（コスモシール７５Ｃ１８−ｏｐｎ、最初に水で洗浄を行い、次いで２５％アセトニトリル水溶液で溶出させる）を用いて脱塩処理を行ったところ、目的とする化合物（Ｃ４）が０．６μｇ得られた。
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ，３０ｏＣ，ＨＯＤ＝４．８１）
δ ８．００（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝７．２，Ｆｍｏｃ），７．７９（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝７．２，Ｆｍｏｃ），７．５９（ｄｄ，２Ｈ，Ｊ＝７．２，Ｆｍｏｃ），７．５２（ｄｄ，２Ｈ，Ｊ＝７．２，Ｆｍｏｃ），５．２１（ｓ，１Ｈ，Ｍａｎ４−Ｈ１），５．０９（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１０．０，ＧｌｃＮＡｃ１−Ｈ１），４．６０−４．７５（ｍ，），４．４０−４．５０（ｍ，２Ｈ），４．３２（ｂｄ，１Ｈ，Ｊ＝２．３），４．２８（ｂｓ，１Ｈ），４．２２（ｂｄｄ，１Ｈ，Ｊａ＝９．７，Ｊｂ＝２．８，Ｍａｎ４−Ｈ２），２．８０−２．９５（ｍ，２Ｈ，Ａｓｎ−βＣＨ，ＮｅｕＡｃ７−Ｈ３ｅｑ），２．６０−２．７５（ｍ，１Ｈ，Ａｓｎ−βＣＨ），２．１４，２．１４，２．１２（ｅａｃｈｓ，Ａｃｘ３），１．９８（ｓ，３Ｈ，Ａｃ），１．８８（ｄｄ，１Ｈ，Ｊａ＝１２．１，Ｊｂ＝１２．０，ＮｅｕＡｃ７−Ｈ３ａｘ）．
【実施例５】
実施例１で得られた化合物（Ｃ１−３）（１ｍｇ，０．４４μｍｏｌ）とウシ血清アルブミン１ｍｇをＨＥＰＥＳ緩衝溶液（５０ｍＭ，ｐＨ５．０）５０μｌに溶解させ、さらにβ−ガラクトシダーゼ（生化学工業社製、ｆｒｏｍ Ｊａｃｋ Ｂｅａｎｓ，５μＬ，１００ｍＵ）を加えた。この溶液を３７℃で１５時間静置した後、メンブランフィルターでろ過を行った。ろ液をＨＰＬＣ（ＯＤＳカラム、２．０φ×２５ｃｍ、展開溶媒は５０ｍＭ酢酸アンモニウム水溶液：アセトニトリル＝８２：１８、流速７．５ｍｌ／ｍｉｎ）で精製した後、溶媒を濃縮、次いで凍結乾燥を行った。残留物を水２００μｌに溶解させＯＤＳ−カラムクロマトグラフィー（コスモシール７５Ｃ１８−ｏｐｎ、最初に水で洗浄を行い、次いで２５％アセトニトリル水溶液で溶出させる）を用いて脱塩処理を行ったところ、目的とする化合物（Ｃ５）が０．３μｇ得られた。
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ，３０℃，ＨＯＤ＝４．８１）
δ ８．０１（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝７．２，Ｆｍｏｃ），７．８１（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝７．２，Ｆｍｏｃ），７．６０（ｄｄ，２Ｈ，Ｊ＝７．２，Ｆｍｏｃ），７．５３（ｄｄ，２Ｈ，Ｊ＝７．２，Ｆｍｏｃ），５．２１（ｓ，１Ｈ，Ｍａｎ４−Ｈ１），５．０９（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝９．６，ＧｌｃＮＡｃ１−Ｈ１），５．０２（ｓ，１Ｈ，Ｍａｎ４’−Ｈ−１），４．５５−４．７０（ｍ），４．４４（１Ｈ，Ｆｍｏｃ），４．３０−４．３８（ｂｍ，２Ｈ），４．２８（ｂｄ，１Ｈ，Ｍａｎ４−Ｈ２），４．１７−４．２５（ｍ，２Ｈ），２．７８−２．９５（ｍ，２Ｈ，Ａｓｎ−βＣＨ，ＮｅｕＡｃ７−Ｈ３ｅｑ），２．５５−２．７０（ｍ，１Ｈ，Ａｓｎ−βＣＨ），２．１６，２．１５，２．１４，２．１２（ｅａｃｈｓ，１２Ｈ，Ａｃｘ４），１．９８（ｓ，３Ｈ，Ａｃ），１．８９（ｄｄ，１Ｈ，Ｊａ＝１２．２，Ｊｂ＝１２．０，ＮｅｕＡｃ７−Ｈ３ａｘ）．
【実施例６】
実施例５で得られた化合物（Ｃ５）（１．０ｍｇ，０．４８μｍｏｌ）を、ウシ血清アルブミン１ｍｇと共にＨＥＰＥＳ緩衝溶液（５０ｍＭ，ｐＨ５．０）５０μｌに溶解させ、さらにＮ−アセチル−β−グルコサミニダーゼ（シグマアルドリッチ社製、ｆｒｏｍ Ｊａｃｋ Ｂｅａｎｓ）を４μｌ（２５０ｍＵ）加えた。この溶液を３７℃で２２時間静置した後、メンブランフィルターでろ過を行った。ろ液をＨＰＬＣ（ＯＤＳカラム、２．０φ×２５ｃｍ、展開溶媒は５０ｍＭ酢酸アンモニウム水溶液：アセトニトリル＝８２：１８、流速７．５ｍｌ／ｍｉｎ）で精製した後、溶媒を濃縮、次いで凍結乾燥を行った。残留物を水２００μｌに溶解させＯＤＳ−カラムクロマトグラフィー（コスモシール７５Ｃ１８−ｏｐｎ、最初に水で洗浄を行い、次いで２５％アセトニトリル水溶液で溶出させる）を用いて脱塩処理を行ったところ、目的とする化合物（Ｃ６）が０．６μｇ得られた。
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ，３０℃，ＨＯＤ＝４．８１）
δ ８．０１（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝７．６，Ｆｍｏｃ），７．８０（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝７．６，Ｆｍｏｃ），７．６０（ｄｄ，２Ｈ，Ｊ＝７．６，Ｆｍｏｃ），７．５３（ｄｄ，２Ｈ，Ｊ＝７．６，Ｆｍｏｃ），５．１９（ｓ，１Ｈ，Ｍａｎ４−Ｈ１），５．０９（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝９．２，ＧｌｃＮＡｃ１−Ｈ１），５．０２（ｓ，１Ｈ，Ｍａｎ４’−Ｈ−１），４．８５（ｓ，１Ｈ）４．５８−４．７５（ｍ，５Ｈ），４．３８−４．４８（ｍ，２Ｈ，Ｆｍｏｃ），４．４０（ｂｄ，Ｊ＝２．４，１Ｈ），４．１８−４．２５（ｍ，２Ｈ），４．１５（ｍ，１Ｈ），２．８０−２．９５（ｍ，２Ｈ，Ａｓｎ−βＣＨ，ＮｅｕＡｃ７−Ｈ３ｅｑ），２．６５−２．７５（ｍ，１Ｈ，Ａｓｎ−βＣＨ），２．１６，２．１３，２．１２（ｅａｃｈｓ，９Ｈ，Ａｃｘ３），１．９８（ｓ，３Ｈ，Ａｃ），１．８９（ｄｄ，１Ｈ，Ｊａ＝１２．２，Ｊｂ＝１２．０，ＮｅｕＡｃ７−Ｈ３ａｘ）．
【実施例７】
実施例６で得られた化合物（Ｃ６）（１．０ｍｇ，０．５３μｍｏｌ）とウシ血清アルブミン１ｍｇをＨＥＰＥＳ緩衝溶液（５０ｍＭ，ｐＨ５．０）５０μｌに溶解させ、α−マンノシダーゼ（シグマアルドリッチ社製、ｆｒｏｍ Ｊａｃｋ Ｂｅａｎｓ）１０μｌ（０．９Ｕ）加えた。この溶液を３７℃で２０時間静置した後、メンブランフィルターでろ過を行った。ろ液をＨＰＬＣ（ＯＤＳカラム、２．０φ×２５ｃｍ、展開溶媒は５０ｍＭ酢酸アンモニウム水溶液：アセトニトリル＝８０：２０、流速７．５ｍｌ／ｍｉｎ）で精製した後、溶媒を濃縮、次いで凍結乾燥を行った。残留物を水２００μｌに溶解させＯＤＳ−カラムクロマトグラフィー（コスモシール７５Ｃ１８−ｏｐｎ、最初に水で洗浄を行い、次いで２５％アセトニトリル水溶液で溶出させる）を用いて脱塩処理を行ったところ、目的とする化合物（Ｃ７）が０．５μｇ得られた。
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ，３０℃，ＨＯＤ＝４．８１）
δ ８．０１（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝７．６，Ｆｍｏｃ），７．８１（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝７．６，Ｆｍｏｃ），７．６０（ｄｄ，２Ｈ，Ｊ＝７．２，Ｆｍｏｃ），７．５３（ｄｄ，２Ｈ，Ｊ＝７．６，Ｆｍｏｃ），５．０９（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝９．２，ＧｌｃＮＡｃ１−Ｈ１），５．０１（ｓ，１Ｈ，Ｍａｎ４’−Ｈ−１），４．８４（ｓ，１Ｈ），４．５５−４．７０（ｍ，５Ｈ），４．４４（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝６．０，Ｆｍｏｃ），４．３０−４．３８（ｂｓ，１Ｈ），４．１５−４．２５（ｍ，２Ｈ），４．１７（ｓ，１Ｈ），２．８０−２．９５（ｍ，２Ｈ，Ａｓｎ−βＣＨ，ＮｅｕＡｃ７−Ｈ３ｅｑ），２．５５−２．７０（ｍ，１Ｈ，Ａｓｎ−βＣＨ），２．１６，２．１３，２．１２（ｅａｃｈｓ，Ａｃｘ３），１．９８（ｓ，３Ｈ，Ａｃ）１．８９（ｄｄ，１Ｈ，Ｊａ＝１２．２，Ｊｂ＝１２．３，ＮｅｕＡｃ７−Ｈ３ａｘ）．
実施例７Ａ
Ｆｍｏｃ基でアスパラギンのアミノ基窒素を保護したジシアロ（α２，６）（α２，３）糖鎖アスパラギンの合成
参考例３で得られたＦｍｏｃ基でアスパラギンのアミノ基窒素を保護したアシアロ糖鎖アスパラギン（化合物２）にシアル酸転移酵素を用いてＣＭＰ−シアル酸を転移させた。
シアル酸転移酵素としてα２，３転移酵素である市販のＲａｔ，Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ由来のものを用いた。
参考例３で得られた化合物２（１．７ｍｇ，０．７５μｍｏｌ）を５０ｍＭカコジル酸緩衝液（ｐＨ＝５．０，８５μｌ）に溶解させた後、牛血清アルブミン（ＢＳＡ，１ｍｇ）を加える。これに、ＣＭＰ−シアル酸（４．８ｍｇ，７．５μｍｏｌ）、Ａｌｋａｌｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（１μｌ，７５ｕｎｉｔ）を加え均一化する。最後に、α２，３−Ｓｉａｌｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ（ＣＡＬＢＩＯＣＨＥＭ社製、７５μｌ，３４ｍＵ）を加え３７℃で３．５時間静置させる。ＨＰＬＣで反応をモニターしながら原料が消失した時点で反応を終了させ、反応液をメンブランフィルターにて濾過する。濾液を濃縮し液量を減じた後、ＨＰＬＣ分取カラムにて精製した（ＹＭＣ−Ｐａｃｋ Ｒ＆Ｄ ＯＤＳ，Ｄ−ＯＤＳ−５−Ａ，２０×２５０ｍｍ，ＡＮ／２５ｍＭ ＡｃＯＮＨ４ ｂｕｆｆｅｒ＝１８／８２，７．５ｍｌ／ｍｉｎ．，ｗａｖｅ ｌｅｎｇｔｈ；２７４ｎｍ）ところ、２５分後に化合物（Ｃ７Ａ）が溶出してきた。分取した後、脱塩処理、次いで凍結乾燥を行うと、化合物（Ｃ７Ａ）が１．３ｍｇ（６７．８％）得られた。化合物のＮＭＲデータは以下のとおりである。
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ，３０℃，ＨＯＤ＝４．８１）
δ ８．００（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝７．２，Ｆｍｏｃ），７．７９（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝７．２，Ｆｍｏｃ），７．６０（ｄｄ，２Ｈ，Ｊ＝７．２，Ｆｍｏｃ），７．５２（ｄｄ，２Ｈ，Ｊ＝７．２，Ｆｍｏｃ），５．２１（ｓ，１Ｈ，Ｍａｎ４−Ｈ１），５．０９（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．８，ＧｌｃＮＡｃ１−Ｈ１），５．０３（ｓ，１Ｈ，Ｍａｎ４’−Ｈ−１），４．８６（ｓ，１Ｈ），４．５８−４．７２（ｍ，５Ｈ），４．５４（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．０），４．３８−４．４８（ｍ，２Ｈ）４．３４（ｂｓ，１Ｈ），４．２８（ｂｓ，１Ｈ），４．１５−４．２５（ｍ，２Ｈ），２．８０−２．８６（ｄｄ，１Ｈ，Ｊａ＝４．４，Ｊｂ＝１２．４，ＮｅｕＡｃ７−Ｈ３ｅｑ），２．７３−２．８３（ｍ，ｄｄ，３Ｈ，Ｊａ＝４．４，Ｊｂ＝１２．４，Ａｓｎ−βＣＨ，ＮｅｕＡｃ７−Ｈ３ｅｑ），２．６０−２．７２（ｍ，１Ｈ，Ａｓｎ−βＣＨ），２．１６，２．１５，２．１４，２．１２（ｅａｃｈ ｓ，Ａｃ ｘ５），１．９８（ｓ，３Ｈ，Ａｃ），１．８９（ｄｄ，１Ｈ，Ｊａ＝１２．４，Ｊｂ＝１２．０，ＮｅｕＡｃ７−Ｈ３ａｘ），１．８１（ｄｄ，１Ｈ，Ｊａ＝１２．４，Ｊｂ＝１２．０，ＮｅｕＡｃ７−Ｈ３ａｘ）．
実施例７Ｂ
Ｆｍｏｃ基でアスパラギンのアミノ基窒素を保護したジシアロ（α２，３）（α２，６）糖鎖アスパラギンの合成
参考例３で得られたＦｍｏｃ基でアスパラギンのアミノ基窒素を保護したアシアロ糖鎖アスパラギン（化合物３）にシアル酸転移酵素を用いてＣＭＰ−シアル酸を転移させた。
シアル酸転移酵素としてα２，３転移酵素である市販のＲａｔ，Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ由来のものを用いた。
参考例３で得られた化合物３（１．２ｍｇ，０．５３μｍｏｌ）を５０ｍＭカコジル酸緩衝液（ｐＨ＝５．０，６０μｌ）に溶解させた後、牛血清アルブミン（ＢＳＡ，１ｍｇ）を加える。これに、ＣＭＰ−シアル酸（３．４ｍｇ，５．３μｍｏｌ）、Ａｌｋａｌｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（１μｌ，７５ｕｎｉｔ）を加え均一化する。最後に、α２，３−Ｓｉａｌｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ（ＣＡＬＢＩＯＣＨＥＭ社製、５２．９μｌ，２４ｍＵ）を加え３７℃で３時間静置させる。ＨＰＬＣで反応をモニターしながら原料が全て消費された時点で反応を終了させ、反応液をメンブランフィルターにて濾過する。濾液を濃縮し液量を減じた後、ＨＰＬＣ分取カラムにて精製した（ＹＭＣ−Ｐａｃｋ Ｒ＆Ｄ ＯＤＳ，Ｄ−ＯＤＳ−５−Ａ，２０×２５０ｍｍ，ＡＮ／２５ｍＭ ＡｃＯＮＨ４ ｂｕｆｆｅｒ＝１８／８２，７．５ｍｌ／ｍｉｎ．，ｗａｖｅ ｌｅｎｇｔｈ；２７４ｎｍ）ところ、２３分後に化合物（Ｃ７Ｂ）が溶出してきた。分取した後、脱塩処理、次いで凍結乾燥を行うと、各化合物（Ｃ７Ｂ）が１．１ｍｇ（８１．２％）得られた。各化合物のＮＭＲデータは以下のとおりである。
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ，３０℃，ＨＯＤ＝４．８１）
δ ８．００（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝７．６，Ｆｍｏｃ），７．７９（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝７．６，Ｆｍｏｃ），７．５９（ｄｄ，２Ｈ，Ｊ＝７．６，Ｆｍｏｃ），７．５１（ｄｄ，２Ｈ，Ｊ＝７．６，Ｆｍｏｃ），５．２１（ｓ，１Ｈ，Ｍａｎ４−Ｈ１），５．０８（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１０．０，ＧｌｃＮＡｃ１−Ｈ１），５．００（ｓ，１Ｈ，Ｍａｎ４’−Ｈ−１），４．８４（ｓ，１Ｈ），４．６０−４．７２（ｍ，５Ｈ），４．５２（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．６），４．３５−４．４５（ｍ，２Ｈ），４．３３（ｂｓ，１Ｈ），４．２７（ｂｓ，１Ｈ），４．１５−４．２５（ｍ，２Ｈ），２．８０−２．８６（ｄｄ，１Ｈ，Ｊａ＝４．８，Ｊｂ＝１２．４，ＮｅｕＡｃ７−Ｈ３ｅｑ），２．７３−２．８３（ｂｓ，ｄｄ，３Ｈ，Ｊａ＝４．８，Ｊｂ＝１２．４，Ａｓｎ−βＣＨ，ＮｅｕＡｃ７−Ｈ３ｅｑ），２．６０−２．７２（ｍ，１Ｈ，Ａｓｎ−βＣＨ），２．１５，２．１２，２．１０（ｅａｃｈ ｓ，Ａｃ ｘ５），１．９７（ｓ，３Ｈ，Ａｃ），１．８８（ｄｄ，１Ｈ，Ｊａ＝１２．４，Ｊｂ＝１２．４，ＮｅｕＡｃ７−Ｈ３ａｘ），１．８０（ｄｄ，１Ｈ，Ｊａ＝１２．４，Ｊｂ＝１２．４，ＮｅｕＡｃ７−Ｈ３ａｘ）．
実施例８ Ｆｍｏｃ基でアスパラギンのアミノ基窒素を保護したジ７”−デオキシ−７”−フルオロ−シアロα２，３糖鎖アスパラギン（Ｃ８−１）およびＦｍｏｃ基でアスパラギンのアミノ基窒素を保護した２種のモノ７”−デオキシ−７”−フルオロ−シアロα２，３糖鎖アスパラギン（Ｃ８−２及びＣ８−３）の合成
参考例８で得られたＣＭＰ−７”−デオキシ−７”−フルオロ−シアル酸を用いた以外は実施例１と同様にして下記に示すＦｍｏｃ基でアスパラギンのアミノ基窒素を保護したジ７”−デオキシ−７”−フルオロ−シアロα２，３糖鎖アスパラギンおよびＦｍｏｃ基でアスパラギンのアミノ基窒素を保護した２種のモノ７”−デオキシ−７”−フルオロ−シアロα２，３糖鎖アスパラギンを得た。
【実施例９】
実施例２の化合物（Ｃ１−２）の代りに実施例８で得られた化合物（Ｃ８−２）を使用した以外は実施例２と同様にして目的とする化合物（Ｃ９）が得られた。
【実施例１０】
実施例３の化合物（Ｃ２）の代りに実施例９で得られた化合物（Ｃ９）を使用した以外は実施例３と同様にして目的とする化合物（Ｃ１０）が得られた。
【実施例１１】
実施例４の化合物（Ｃ３）の代りに実施例１０で得られた化合物（Ｃ１０）を使用した以外は実施例４と同様にして目的とする化合物（Ｃ１１）が得られた。
【実施例１２】
実施例５の化合物（Ｃ１−３）の代りに実施例８で得られた化合物（Ｃ８−３）を使用した以外は実施例５と同様にして目的とする化合物（Ｃ１２）が得られた。
【実施例１３】
実施例６の化合物（Ｃ５）の代りに実施例１２で得られた化合物（Ｃ１２）を使用した以外は実施例６と同様にして目的とする化合物（Ｃ１３）が得られた。
【実施例１４】
実施例７の化合物（Ｃ６）の代りに実施例１３で得られた化合物（Ｃ１３）を使用した以外は実施例７と同様にして目的とする化合物（Ｃ１４）が得られた。
実施例１５ Ｆｍｏｃ基でアスパラギンのアミノ基窒素を保護したジ８”−デオキシ−８”−フルオロ−シアロα２，３糖鎖アスパラギン（Ｃ１５−１）およびＦｍｏｃ基でアスパラギンのアミノ基窒素を保護した２種のモノ８”−デオキシ−８”−フルオロ−シアロα２，３糖鎖アスパラギン（Ｃ１５−２及びＣ１５−３）の合成
参考例９で得られたＣＭＰ−８”−デオキシ−８”−フルオロ−シアル酸を用いた以外は実施例１と同様にして下記に示すＦｍｏｃ基でアスパラギンのアミノ基窒素を保護したジ８”−デオキシ−８”−フルオロ−シアロα２，３糖鎖アスパラギンおよびＦｍｏｃ基でアスパラギンのアミノ基窒素を保護した２種のモノ８”−デオキシ−８”−フルオロ−シアロα２，３糖鎖アスパラギンを得た。
この糖鎖アスパラギンは式（１）のＲ１＝Ｒ２＝式（２）、Ｒ＝ＯＨ、Ｒ’＝Ｆ、Ｒ”＝ＯＨに相当する。
この糖鎖アスパラギンは式（１）のＲ１＝式（３）、Ｒ２＝式（２）、Ｒ＝ＯＨ、Ｒ’＝Ｆ、Ｒ”＝ＯＨに相当する。
この糖鎖アスパラギンは式（１）のＲ１＝式（２）、Ｒ＝ＯＨ、Ｒ’＝Ｆ、Ｒ”＝ＯＨ、Ｒ２＝式（３）に相当する。
実施例１６ （実施例１５のガラクトース加水分解酵素）
実施例２の化合物（Ｃ１−２）の代りに実施例１５で得られた化合物（Ｃ１５−２）を使用した以外は実施例２と同様にして目的とする化合物（Ｃ１６）が得られた。
この糖鎖アスパラギンは式（１）のＲ１＝式（４）、Ｒ２＝式（２）、Ｒ＝ＯＨ、Ｒ’＝Ｆ、Ｒ”＝ＯＨに相当する。
実施例１７ （実施例１６のＮ−アセチルグルコサミン加水分解酵素）
実施例３の化合物（Ｃ２）の代りに実施例１６で得られた化合物（Ｃ１６）を使用した以外は実施例３と同様にして目的とする化合物（Ｃ１７）が得られた。
この糖鎖アスパラギンは式（１）のＲ１＝式（５）、Ｒ２＝式（２）、Ｒ＝ＯＨ、Ｒ’＝Ｆ、Ｒ”＝ＯＨに相当する。
実施例１８ （実施例１７のマンノース加水分解酵素）
実施例４の化合物（Ｃ３）の代りに実施例１７で得られた化合物（Ｃ１７）を使用した以外は実施例４と同様にして目的とする化合物（Ｃ１８）が得られた。
この糖鎖アスパラギンは式（１）のＲ１＝Ｈ、Ｒ２＝式（２）、Ｒ＝ＯＨ、Ｒ’＝Ｆ、Ｒ”＝ＯＨに相当する。
実施例１９ （実施例１５のガラクトース加水分解酵素）
実施例５の化合物（Ｃ１−３）の代りに実施例１５で得られた化合物（Ｃ１５−３）を使用した以外は実施例５と同様にして目的とする化合物（Ｃ１９）が得られた。
この糖鎖アスパラギンは式（１）のＲ１＝式（２）、Ｒ＝ＯＨ、Ｒ’＝Ｆ、Ｒ”＝ＯＨ、Ｒ２＝式（４）に相当する。
実施例２０ （実施例１９のＮ−アセチルグルコサミン加水分解酵素）
実施例６の化合物（Ｃ５）の代りに実施例１９で得られた化合物（Ｃ１９）を使用した以外は実施例６と同様にして目的とする化合物（Ｃ２０）が得られた。
この糖鎖アスパラギンは式（１）のＲ１＝式（２）、Ｒ＝ＯＨ、Ｒ’＝Ｆ、Ｒ”＝ＯＨ、Ｒ２＝式（５）に相当する。
実施例２１ （実施例２０のマンノース加水分解酵素）
実施例７の化合物（Ｃ６）の代りに実施例２０で得られた化合物（Ｃ２０）を使用した以外は実施例７と同様にして目的とする化合物（Ｃ２１）が得られた。
この糖鎖アスパラギンは式（１）のＲ１＝式（２）、Ｒ＝ＯＨ、Ｒ’＝Ｆ、Ｒ”＝ＯＨ、Ｒ２＝Ｈに相当する。
実施例２２ Ｆｍｏｃ基でアスパラギンのアミノ基窒素を保護したジ９”−デオキシ−９”−フルオロ−シアロα２，３糖鎖アスパラギン（Ｃ２２−１）およびＦｍｏｃ基でアスパラギンのアミノ基窒素を保護した２種のモノ９”−デオキシ−９”−フルオロ−シアロα２，３糖鎖アスパラギン（Ｃ２２−２及びＣ２２−３）の合成
参考例１０で得られたＣＭＰ−９”−デオキシ−９”−フルオロ−シアル酸を用いた以外は実施例１と同様にして上記Ｆｍｏｃ基でアスパラギンのアミノ基窒素を保護したジ９”−デオキシ−９”−フルオロ−シアロα２，３糖鎖アスパラギンおよびＦｍｏｃ基でアスパラギンのアミノ基窒素を保護した２種のモノ９”−デオキシ−９”−フルオロ−シアロα２，３糖鎖アスパラギンを得た。
（Ｃ２２−１）は式（１）のＲ１＝Ｒ２＝式（２）、Ｒ＝ＯＨ、Ｒ’＝ＯＨ、Ｒ”＝Ｆの糖鎖アスパラギンに相当する。
（Ｃ２２−２）は式（１）のＲ１＝式（３）、Ｒ２＝式（２）、Ｒ＝ＯＨ、Ｒ’＝ＯＨ、Ｒ”＝Ｆの糖鎖アスパラギンに相当する。
（Ｃ２２−３）は式（１）のＲ１＝式（２）、Ｒ＝ＯＨ、Ｒ’＝ＯＨ、Ｒ”＝Ｆ、Ｒ２＝式（３）の糖鎖アスパラギンに相当する。
実施例２３ （実施例２２のガラクトース加水分解酵素）
実施例２の化合物（Ｃ１−２）の代りに実施例２２で得られた化合物（Ｃ２２−２）を使用した以外は実施例２と同様にして目的とする化合物（Ｃ２３）が得られた。
（Ｃ２３）は式（１）のＲ１＝式（４）、Ｒ２＝式（２）、Ｒ＝ＯＨ、Ｒ’＝ＯＨ、Ｒ”＝Ｆの糖鎖アスパラギンに相当する。
実施例２４ （実施例２３のＮ−アセチルグルコサミン加水分解酵素）
実施例３の化合物（Ｃ２）の代りに実施例２３で得られた化合物（Ｃ２３）を使用した以外は実施例３と同様にして目的とする化合物（Ｃ２４）が得られた。
（Ｃ２４）は式（１）のＲ１＝式（５）、Ｒ２＝式（２）、Ｒ＝ＯＨ、Ｒ’＝ＯＨ、Ｒ”＝Ｆの糖鎖アスパラギンに相当する。
実施例２５ （実施例２４のマンノース加水分解酵素）
実施例４の化合物（Ｃ３）の代りに実施例２４で得られた化合物（Ｃ２４）を使用した以外は実施例４と同様にして目的とする化合物（Ｃ２５）が得られた。
（Ｃ２５）は式（１）のＲ１＝Ｈ、Ｒ２＝式（２）、Ｒ＝ＯＨ、Ｒ’＝ＯＨ、Ｒ”＝Ｆの糖鎖アスパラギンに相当する。
実施例２６ （実施例２２のガラクトース加水分解酵素）
実施例５の化合物（Ｃ１−３）の代りに実施例２２で得られた化合物（Ｃ２２−３）を使用した以外は実施例５と同様にして目的とする化合物（Ｃ２６）が得られた。
（Ｃ−２６）は式（１）のＲ１＝式（２）、Ｒ＝ＯＨ、Ｒ’＝ＯＨ、Ｒ”＝Ｆ、Ｒ２＝式（４）の糖鎖アスパラギンに相当する。
実施例２７ （実施例２６のＮ−アセチルグルコサミン加水分解酵素）
実施例６の化合物（Ｃ５）の代りに実施例２６で得られた化合物（Ｃ２６）を使用した以外は実施例６と同様にして目的とする化合物（Ｃ２７）が得られた。
（Ｃ２７）は式（１）のＲ１＝式（２）、Ｒ＝ＯＨ、Ｒ’＝ＯＨ、Ｒ”＝Ｆ、Ｒ２＝式（５）の糖鎖アスパラギンに相当する。
実施例２８ （実施例２７のマンノース加水分解酵素）
実施例７の化合物（Ｃ６）の代りに実施例２７で得られた化合物（Ｃ２７）を使用した以外は実施例７と同様にして目的とする化合物（Ｃ２８）が得られた。
（Ｃ２８）は式（１）のＲ１＝式（２）、Ｒ＝ＯＨ、Ｒ’＝ＯＨ、Ｒ”＝Ｆ、Ｒ２＝Ｈの糖鎖アスパラギンに相当する。
実施例２９ Ｆｍｏｃ基でアスパラギンのアミノ基窒素を保護したジ７”−デオキシ−７”−フルオロ−シアロ（２−６）糖鎖アスパラギン（Ｃ２９−１）およびＦｍｏｃ基でアスパラギンのアミノ基窒素を保護した２種のモノ７”−デオキシ−７”−フルオロ−シアロ（２−６）糖鎖アスパラギン（Ｃ２９−２及びＣ２９−３）の合成
参考例７で得られたＣＭＰ−７”−デオキシ−７”−フルオロ−シアル酸を、シアル酸転移酵素としてα２，６転移酵素である市販のＲａｔ Ｌｉｖｅｒ由来のものを用い、カコジル酸緩衝溶液のｐＨを６．０とした以外は実施例１と同様にして下記に示すＦｍｏｃ基でアスパラギンのアミノ基窒素を保護したジ７”−デオキシ−７”−フルオロ−シアロ（２−６）糖鎖アスパラギンおよびＦｍｏｃ基でアスパラギンのアミノ基窒素を保護した２種のモノ７”−デオキシ−７”−フルオロ−シアロ（２−６）糖鎖アスパラギンを得た。（Ｃ２９−１）〜（Ｃ２９−３）の化学式を以下に示す。
実施例３０ （実施例２９のガラクトース加水分解酵素）
実施例２の化合物（Ｃ１−２）の代りに実施例２９で得られた化合物（Ｃ２９−２）を使用した以外は実施例２と同様にして目的とする化合物（Ｃ３０）が得られた。（Ｃ３０）の化学式を以下に示す。
実施例３１ （実施例３０のＮ−アセチルグルコサミン加水分解酵素）
実施例３の化合物（Ｃ２）の代りに実施例３０で得られた化合物（Ｃ３０）を使用した以外は実施例３と同様にして目的とする化合物（Ｃ３１）が得られた。（Ｃ３１）の化学式を以下に示す。
実施例３２ （実施例３１のマンノース加水分解酵素）
実施例４の化合物（Ｃ３）の代りに実施例３１で得られた化合物（Ｃ３１）を使用した以外は実施例４と同様にして目的とする化合物（Ｃ３２）が得られた。（Ｃ３２）の化学式を以下に示す。
実施例３３ （実施例２９のガラクトース加水分解酵素）
実施例５の化合物（Ｃ１−３）の代りに実施例２９で得られた化合物（Ｃ２９−３）を使用した以外は実施例５と同様にして目的とする化合物（Ｃ３３）が得られた。（Ｃ３３）の化学式を以下に示す。
実施例３４ （実施例３３のＮ−アセチルグルコサミン加水分解酵素）
実施例６の化合物（Ｃ５）の代りに実施例３３で得られた化合物（Ｃ３３）を使用した以外は実施例６と同様にして目的とする化合物（Ｃ３４）が得られた。（Ｃ３４）の化学式を以下に示す。
実施例３５ （実施例３４のマンノース加水分解酵素）
実施例７の化合物（Ｃ６）の代りに実施例３４で得られた化合物（Ｃ３４）を使用した以外は実施例７と同様にして目的とする化合物（Ｃ３５）が得られた。（Ｃ３５）の化学式を以下に示す。
【実施例３６〜４９】
以下、同様にして以下に示す糖鎖アスパラギン誘導体を合成した。
尚、代表例として８Ｆα２，６−１１糖−Ａｓｎ−Ｆｍｏｃ（Ｃ３６−１）のＮＭＲデータを以下に示す。
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ，３０℃，ＨＯＤ＝４．８１）
δ ８．０１（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝７．４，Ｆｍｏｃ），７．８０（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝７．４，Ｆｍｏｃ），７．５９（ｄｄ，２Ｈ，Ｊ＝７．４，Ｆｍｏｃ），７．５２（ｂｄｄ，２Ｈ，Ｊ＝７．４，Ｆｍｏｃ），５．２２（ｓ，１Ｈ，Ｍａｎ４−Ｈ１），５．０８（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝９．４，ＧｌｃＮＡｃ１−Ｈ１），５．０５（ｓ，１Ｈ，Ｍａｎ４’−Ｈ−１），４．８５−４．９５（ｍ，１Ｈ），４．５５−４．７５（ｍ），４．５３（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．９），４．４３（ｍ，１Ｈ），４．３５（ｂｓ，２Ｈ，Ｍａｎ３−Ｈ２），４．２８（ｂｓ，１Ｈ，Ｍａｎ４−Ｈ２），４．１０−４．２５（ｍ，２Ｈ），２．７５−２．８５（ｍ，１Ｈ，Ａｓｎ−βＣＨ），２．６３−２．７０（ｄｄ，２Ｈ，Ｊａ＝３．９，Ｊｂ＝１２．０，ＮｅｕＡｃ７，７’−Ｈ３ｅｑ），２．５５−２．６５（ｍ，１Ｈ，Ａｓｎ−βＣＨ），２．１６，２．１１，２．０８（ｅａｃｈｓ，１５Ｈ，Ａｃｘ５），１．８４（ｓ，３Ｈ，Ａｃ），１．７４（ｄｄ，１Ｈ，Ｊａ＝１２．３，Ｊｂ＝１２．２，ＮｅｕＡｃ７−Ｈ３ａｘ）．
実施例５０ （糖鎖アスパラギン誘導体のＦｍｏｃ基の脱保護）
全ての糖鎖アスパラギン誘導体において、以下の手順でＦｍｏｃ基の脱保護を行った。まず、糖鎖アスパラギンＦｍｏｃ体１μｍｏｌあたりに２４０μリットルのＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、１６０μリットルのモルホリンを加え、室温・アルゴン雰囲気下で反応させた。ＴＬＣ（展開溶媒として１Ｍ酢酸アンモニウム：イソプロパノール＝８：５を用いた）にて反応終了を確認した後、氷水で冷却した。ここにジエチルエーテルを反応溶液の１０倍量加えて１５分間攪拌した後、析出した沈殿物をろ別した。得られた残渣を水に溶解させ、３５℃でエバポレートした。更にトルエンを３ｍｌ加えエバポレートするという操作を３回繰り返した。残留物を逆相カラムクロマトグラフィー（コスモシール７５Ｃ１８−ＯＰＮ、１５×１００ｍｍ、展開溶媒は水）により精製して、対応する糖鎖アスパラギンを得た。
実施例５１ （糖鎖アスパラギンのアスパラギン残基の除去）
実施例５０で得られた糖鎖アスパラギンを無水ヒドラジンと反応させた後、アセチル化することによりアスパラギン残基を除去して対応する糖鎖を得た。
【実施例５２〜６９】
参考例２、３、８〜１３、実施例１〜７で製造した各Ｆｍｏｃ−糖鎖アスパラギン ２ｎｍｏｌを、トリス塩酸緩衝液 約１０ｍｌに溶解させた。このものに、ＧＤＰ−フコース２００ｎｍｏｌ、Ｆｕｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ Ｖ（Ｈｕｍａｎ，Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ）０．５ｍＵを加え、３７℃で約２時間静置、反応させた。反応液を超純水２０ｍｌで希釈したのち、キャピラリー電気泳動（ｆｕｓｅｄ ｓｉｌｉｃａ ｃａｐｉｌｌａｒｙ，５０ｍｍ ｉ．ｄ．，６０ｃｍ，ｂｕｆｆｅｒ；１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ｂｏｒａｔｅ，ｐＨ＝８．３，１００ｍＭ Ｈｅｐｔａｎｅ ｓｕｌｆｏｎａｔｅ，印加電圧２７ｋＶ，温度２５℃，２１４ｍｍ）で分離を行い各目的物を得た。
各実施例における原料及び目的物を以下に示す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式（１）で表される１１〜７糖を有するα２，３糖鎖アスパラギン誘導体。
〔式中、Ｒ１およびＲ２は、水素原子、式（２）〜（５）で示される基であり、同一でも異なっていてもよい。ただし、Ｒ１およびＲ２の一方は必ず式（２）で示される基である。〕
Ｒ，Ｒ’，Ｒ”は下記の組合せを示す。
（ａ）Ｒ＝Ｆ、Ｒ’＝ＯＨ、Ｒ”＝ＯＨ
（ｂ）Ｒ＝ＯＨ、Ｒ’＝Ｆ、Ｒ”＝ＯＨ
（ｃ）Ｒ＝ＯＨ、Ｒ’＝ＯＨ、Ｒ”＝Ｆ
（ｄ）Ｒ＝ＯＨ、Ｒ’＝ＯＨ、Ｒ”＝ＯＨ
【請求項２】
下記式（６）で表されるフッ素を含む１１〜７糖を有するα２，６糖鎖アスパラギン誘導体。
〔式中、ＲＸおよびＲＹは、水素原子、式（７）で示される基、または式（３）〜（５）で示される基である。ただし、ＲＸおよびＲＹの一方は必ず式（７）で示される基である。〕
Ｒ，Ｒ’，Ｒ”は下記の組合せを示す。
（ａ）Ｒ＝Ｆ、Ｒ’＝ＯＨ、Ｒ”＝ＯＨ
（ｂ）Ｒ＝ＯＨ、Ｒ’＝Ｆ、Ｒ”＝ＯＨ
（ｃ）Ｒ＝ＯＨ、Ｒ’＝ＯＨ、Ｒ”＝Ｆ
【請求項３】
下記式（８）で表される１１〜７糖を有するα２，３糖鎖アスパラギン。
〔式中、Ｒ１およびＲ２は上記に同じ。〕
【請求項４】
下記式（９）で表されるフッ素を含む１１〜７糖を有するα２，６糖鎖アスパラギン。
〔式中、ＲＸおよびＲＹは上記に同じ。〕
【請求項５】
下記式（１０）で表される１１〜７糖を有するα２，３糖鎖。
〔式中、Ｒ１およびＲ２は上記に同じ。〕
【請求項６】
下記式（１１）で表されるフッ素を含む１１〜７糖を有するα２，６糖鎖。
〔式中、ＲＸおよびＲＹは上記に同じ。〕
【請求項７】
脂溶性の保護基で保護された糖鎖アスパラギンをシアル酸転移酵素を用いてシアル酸あるいはシアル酸の誘導体を転移させ、得られた脂溶性の保護基で保護された糖鎖アスパラギンをクロマトグラフィーに供することにより分離することを特徴とする下記式（１２）で表される１１糖を有するα２，３ジシアロ糖鎖アスパラギン誘導体の製造法。
〔式中、Ｒ１およびＲ２は、共に式（２）で示される基である。〕
【請求項８】
脂溶性の保護基で保護された糖鎖アスパラギンをシアル酸転移酵素を用いてシアル酸あるいはシアル酸の誘導体を転移させ、得られた脂溶性の保護基で保護された糖鎖アスパラギンをクロマトグラフィーに供することにより分離することを特徴とする下記式（１３）で表される１０糖を有するα２，３モノシアロ糖鎖アスパラギン誘導体の製造法。
〔式中、Ｒ１、Ｒ２の一方は式（２）で示される基、他方は式（３）で示される基である。〕
【請求項９】
式（１３）で表されるモノシアロ糖鎖アスパラギン誘導体をガラクトース加水分解酵素を用いて加水分解することを特徴とする下記式（１４）で表される９糖を有するα２，３モノシアロ糖鎖アスパラギン誘導体の製造法。
〔式中、Ｒ１、Ｒ２の一方は式（２）で示される基、他方は式（４）で示される基である。〕
【請求項１０】
式（１４）で表されるモノシアロ糖鎖アスパラギン誘導体をＮ−アセチルグルコサミン加水分解酵素を用いて加水分解することを特徴とする下記式（１５）で表される８糖を有するα２，３モノシアロ糖鎖アスパラギン誘導体の製造法。
〔式中、Ｒ１、Ｒ２の一方は式（２）で示される基、他方は式（５）で示される基である。〕
【請求項１１】
式（１５）で表されるモノシアロ糖鎖アスパラギン誘導体をマンノース加水分解酵素を用いて加水分解することを特徴とする下記式（１６）で表される７糖を有するα２，３モノシアロ糖鎖アスパラギン誘導体の製造法。
〔式中、Ｒ１、Ｒ２の一方は式（２）で示される基、他方は水素原子である。〕
【請求項１２】
脂溶性の保護基で保護された糖鎖アスパラギンをシアル酸転移酵素を用いてシアル酸あるいはシアル酸の誘導体を転移させ、得られた脂溶性の保護基で保護された糖鎖アスパラギンをクロマトグラフィーに供することにより分離することを特徴とする下記式（１７）で表される１１糖を有するα２，６ジシアロ糖鎖アスパラギン誘導体の製造法。
〔式中、ＲＸおよびＲＹは、共に式（７）で示される基である。〕
【請求項１３】
脂溶性の保護基で保護された糖鎖アスパラギンをシアル酸転移酵素を用いてシアル酸あるいはシアル酸の誘導体を転移させ、得られた脂溶性の保護基で保護された糖鎖アスパラギンをクロマトグラフィーに供することにより分離することを特徴とする下記式（１８）で表される１０糖を有するα２，６モノシアロ糖鎖アスパラギン誘導体の製造法。
〔式中、ＲＸおよびＲＹの一方は式（７）で示される基、他方は式（３）で示される基である。〕
【請求項１４】
式（１８）で表されるモノシアロ糖鎖アスパラギン誘導体をガラクトース加水分解酵素を用いて加水分解することを特徴とする下記式（１９）で表される９糖を有するα２，６モノシアロ糖鎖アスパラギン誘導体の製造法。
〔式中、ＲＸおよびＲＹの一方は式（７）で示される基、他方は式（４）で示される基である。〕
【請求項１５】
式（１９）で表されるモノシアロ糖鎖アスパラギン誘導体をＮ−アセチルグルコサミン加水分解酵素を用いて加水分解することを特徴とする下記式（２０）で表される８糖を有するα２，６モノシアロ糖鎖アスパラギン誘導体の製造法。
〔式中、ＲＸおよびＲＹの一方は式（７）で示される基、他方は式（５）で示される基である。〕
【請求項１６】
式（２０）で表されるモノシアロ糖鎖アスパラギン誘導体をマンノース加水分解酵素を用いて加水分解することを特徴とする下記式（２１）で表される７糖を有するα２，６モノシアロ糖鎖アスパラギン誘導体の製造法。
〔式中、ＲＸおよびＲＹの一方は式（７）で示される基、他方は水素原子である。〕
【請求項１７】
式（１）で表される１１〜７糖を有するα２，３糖鎖アスパラギン誘導体の保護基を除去することを特徴とする式（８）で表される１１〜７糖を有するα２，３糖鎖アスパラギンの製造法。
【請求項１８】
式（６）で表される１１〜７糖を有するα２，６糖鎖アスパラギン誘導体の保護基を除去することを特徴とする式（９）で表される１１〜７糖を有するα２，６糖鎖アスパラギンの製造法。
【請求項１９】
式（８）で表される１１〜７糖を有するα２，３糖鎖アスパラギンのアスパラギン残基を除去することを特徴とする式（１０）で表される１１〜７糖を有するα２，３糖鎖の製造法。
【請求項２０】
式（９）で表される１１〜７糖を有するα２，６糖鎖アスパラギンのアスパラギン残基を除去することを特徴とする式（１１）で表される１１〜７糖を有するα２，６糖鎖の製造法。
【請求項２１】
下記式（２２）で表される１１糖を有する（α２，３）（α２，６）糖鎖アスパラギン誘導体。
〔式中、Ｒ１は式（２）で示される基であり、ＲＹは下記式（７）で示される基である。〕
Ｒ，Ｒ’，Ｒ”は下記の組合せを示す。
（ａ）Ｒ＝Ｆ、Ｒ’＝ＯＨ、Ｒ”＝ＯＨ
（ｂ）Ｒ＝ＯＨ、Ｒ’＝Ｆ、Ｒ”＝ＯＨ
（ｃ）Ｒ＝ＯＨ、Ｒ’＝ＯＨ、Ｒ”＝Ｆ
（ｄ）Ｒ＝ＯＨ、Ｒ’＝ＯＨ、Ｒ”＝ＯＨ
【請求項２２】
下記式（２３）で表される１１糖を有する（α２，３）（α２，６）糖鎖アスパラギン誘導体。
〔式中、Ｒ２は式（２）で示される基であり、ＲＸは下記式（７）で示される基である。〕
Ｒ，Ｒ’，Ｒ”は下記の組合せを示す。
（ａ）Ｒ＝Ｆ、Ｒ’＝ＯＨ、Ｒ”＝ＯＨ
（ｂ）Ｒ＝ＯＨ、Ｒ’＝Ｆ、Ｒ”＝ＯＨ
（ｃ）Ｒ＝ＯＨ、Ｒ’＝ＯＨ、Ｒ”＝Ｆ
（ｄ）Ｒ＝ＯＨ、Ｒ’＝ＯＨ、Ｒ”＝ＯＨ
【請求項２３】
脂溶性の保護基でアスパラギンのアミノ基窒素が保護された糖鎖アスパラギンの非還元末端側のＮ−アセチルグルコサミンに少なくとも１個以上のフコースを含む糖鎖アスパラギン誘導体。
【請求項２４】
脂溶性の保護基でアスパラギンのアミノ基窒素が保護された糖鎖アスパラギンが、式（１）で表される１１〜７糖を有するα２，３糖鎖アスパラギン誘導体である請求の範囲第２３項に記載のフコースを含む糖鎖アスパラギン誘導体。
【請求項２５】
脂溶性の保護基でアスパラギンのアミノ基窒素が保護された糖鎖アスパラギンが、式（６）で表されるフッ素を含む１１〜７糖を有するα２，６糖鎖アスパラギン誘導体である請求の範囲第２３項に記載のフコースを含む糖鎖アスパラギン誘導体。
【請求項２６】
脂溶性の保護基でアスパラギンのアミノ基窒素が保護された糖鎖アスパラギンが、下記式（６）で表される１１〜６糖を有するα２，６糖鎖アスパラギン誘導体である請求の範囲第２３項に記載のフコースを含む糖鎖アスパラギン誘導体。
〔式中、ＲＸおよびＲＹは、水素原子、下記式（７）で示される基、または上記式（３）〜（５）で示される基である。ただし、ＲＸおよびＲＹの一方は必ず式（７）あるいは式（３）で示される基である。〕
ただし、Ｒ＝ＯＨ、Ｒ’＝ＯＨ、Ｒ”＝ＯＨである。
【請求項２７】
脂溶性の保護基でアスパラギンのアミノ基窒素が保護された糖鎖アスパラギンをフコース転移酵素を用いてフコースを転移させ、得られた脂溶性の保護基で保護された糖鎖アスパラギンをグロマトグラフィーに供することにより分離することを特徴とする脂溶性の保護基でアスパラギンのアミノ基窒素が保護された糖鎖アスパラギンの非還元末端側のＮ−アセチルグルコサミンに少なくとも１個以上のフコースを含む糖鎖アスパラギン誘導体の製造方法。
【請求項１】
下記式（１）で表される１１〜７糖を有するα２，３糖鎖アスパラギン誘導体。
〔式中、Ｒ１およびＲ２は、水素原子、式（２）〜（５）で示される基であり、同一でも異なっていてもよい。ただし、Ｒ１およびＲ２の一方は必ず式（２）で示される基である。〕
Ｒ，Ｒ’，Ｒ”は下記の組合せを示す。
（ａ）Ｒ＝Ｆ、Ｒ’＝ＯＨ、Ｒ”＝ＯＨ
（ｂ）Ｒ＝ＯＨ、Ｒ’＝Ｆ、Ｒ”＝ＯＨ
（ｃ）Ｒ＝ＯＨ、Ｒ’＝ＯＨ、Ｒ”＝Ｆ
（ｄ）Ｒ＝ＯＨ、Ｒ’＝ＯＨ、Ｒ”＝ＯＨ
【請求項２】
下記式（６）で表されるフッ素を含む１１〜７糖を有するα２，６糖鎖アスパラギン誘導体。
〔式中、ＲＸおよびＲＹは、水素原子、式（７）で示される基、または式（３）〜（５）で示される基である。ただし、ＲＸおよびＲＹの一方は必ず式（７）で示される基である。〕
Ｒ，Ｒ’，Ｒ”は下記の組合せを示す。
（ａ）Ｒ＝Ｆ、Ｒ’＝ＯＨ、Ｒ”＝ＯＨ
（ｂ）Ｒ＝ＯＨ、Ｒ’＝Ｆ、Ｒ”＝ＯＨ
（ｃ）Ｒ＝ＯＨ、Ｒ’＝ＯＨ、Ｒ”＝Ｆ
【請求項３】
下記式（８）で表される１１〜７糖を有するα２，３糖鎖アスパラギン。
〔式中、Ｒ１およびＲ２は上記に同じ。〕
【請求項４】
下記式（９）で表されるフッ素を含む１１〜７糖を有するα２，６糖鎖アスパラギン。
〔式中、ＲＸおよびＲＹは上記に同じ。〕
【請求項５】
下記式（１０）で表される１１〜７糖を有するα２，３糖鎖。
〔式中、Ｒ１およびＲ２は上記に同じ。〕
【請求項６】
下記式（１１）で表されるフッ素を含む１１〜７糖を有するα２，６糖鎖。
〔式中、ＲＸおよびＲＹは上記に同じ。〕
【請求項７】
脂溶性の保護基で保護された糖鎖アスパラギンをシアル酸転移酵素を用いてシアル酸あるいはシアル酸の誘導体を転移させ、得られた脂溶性の保護基で保護された糖鎖アスパラギンをクロマトグラフィーに供することにより分離することを特徴とする下記式（１２）で表される１１糖を有するα２，３ジシアロ糖鎖アスパラギン誘導体の製造法。
〔式中、Ｒ１およびＲ２は、共に式（２）で示される基である。〕
【請求項８】
脂溶性の保護基で保護された糖鎖アスパラギンをシアル酸転移酵素を用いてシアル酸あるいはシアル酸の誘導体を転移させ、得られた脂溶性の保護基で保護された糖鎖アスパラギンをクロマトグラフィーに供することにより分離することを特徴とする下記式（１３）で表される１０糖を有するα２，３モノシアロ糖鎖アスパラギン誘導体の製造法。
〔式中、Ｒ１、Ｒ２の一方は式（２）で示される基、他方は式（３）で示される基である。〕
【請求項９】
式（１３）で表されるモノシアロ糖鎖アスパラギン誘導体をガラクトース加水分解酵素を用いて加水分解することを特徴とする下記式（１４）で表される９糖を有するα２，３モノシアロ糖鎖アスパラギン誘導体の製造法。
〔式中、Ｒ１、Ｒ２の一方は式（２）で示される基、他方は式（４）で示される基である。〕
【請求項１０】
式（１４）で表されるモノシアロ糖鎖アスパラギン誘導体をＮ−アセチルグルコサミン加水分解酵素を用いて加水分解することを特徴とする下記式（１５）で表される８糖を有するα２，３モノシアロ糖鎖アスパラギン誘導体の製造法。
〔式中、Ｒ１、Ｒ２の一方は式（２）で示される基、他方は式（５）で示される基である。〕
【請求項１１】
式（１５）で表されるモノシアロ糖鎖アスパラギン誘導体をマンノース加水分解酵素を用いて加水分解することを特徴とする下記式（１６）で表される７糖を有するα２，３モノシアロ糖鎖アスパラギン誘導体の製造法。
〔式中、Ｒ１、Ｒ２の一方は式（２）で示される基、他方は水素原子である。〕
【請求項１２】
脂溶性の保護基で保護された糖鎖アスパラギンをシアル酸転移酵素を用いてシアル酸あるいはシアル酸の誘導体を転移させ、得られた脂溶性の保護基で保護された糖鎖アスパラギンをクロマトグラフィーに供することにより分離することを特徴とする下記式（１７）で表される１１糖を有するα２，６ジシアロ糖鎖アスパラギン誘導体の製造法。
〔式中、ＲＸおよびＲＹは、共に式（７）で示される基である。〕
【請求項１３】
脂溶性の保護基で保護された糖鎖アスパラギンをシアル酸転移酵素を用いてシアル酸あるいはシアル酸の誘導体を転移させ、得られた脂溶性の保護基で保護された糖鎖アスパラギンをクロマトグラフィーに供することにより分離することを特徴とする下記式（１８）で表される１０糖を有するα２，６モノシアロ糖鎖アスパラギン誘導体の製造法。
〔式中、ＲＸおよびＲＹの一方は式（７）で示される基、他方は式（３）で示される基である。〕
【請求項１４】
式（１８）で表されるモノシアロ糖鎖アスパラギン誘導体をガラクトース加水分解酵素を用いて加水分解することを特徴とする下記式（１９）で表される９糖を有するα２，６モノシアロ糖鎖アスパラギン誘導体の製造法。
〔式中、ＲＸおよびＲＹの一方は式（７）で示される基、他方は式（４）で示される基である。〕
【請求項１５】
式（１９）で表されるモノシアロ糖鎖アスパラギン誘導体をＮ−アセチルグルコサミン加水分解酵素を用いて加水分解することを特徴とする下記式（２０）で表される８糖を有するα２，６モノシアロ糖鎖アスパラギン誘導体の製造法。
〔式中、ＲＸおよびＲＹの一方は式（７）で示される基、他方は式（５）で示される基である。〕
【請求項１６】
式（２０）で表されるモノシアロ糖鎖アスパラギン誘導体をマンノース加水分解酵素を用いて加水分解することを特徴とする下記式（２１）で表される７糖を有するα２，６モノシアロ糖鎖アスパラギン誘導体の製造法。
〔式中、ＲＸおよびＲＹの一方は式（７）で示される基、他方は水素原子である。〕
【請求項１７】
式（１）で表される１１〜７糖を有するα２，３糖鎖アスパラギン誘導体の保護基を除去することを特徴とする式（８）で表される１１〜７糖を有するα２，３糖鎖アスパラギンの製造法。
【請求項１８】
式（６）で表される１１〜７糖を有するα２，６糖鎖アスパラギン誘導体の保護基を除去することを特徴とする式（９）で表される１１〜７糖を有するα２，６糖鎖アスパラギンの製造法。
【請求項１９】
式（８）で表される１１〜７糖を有するα２，３糖鎖アスパラギンのアスパラギン残基を除去することを特徴とする式（１０）で表される１１〜７糖を有するα２，３糖鎖の製造法。
【請求項２０】
式（９）で表される１１〜７糖を有するα２，６糖鎖アスパラギンのアスパラギン残基を除去することを特徴とする式（１１）で表される１１〜７糖を有するα２，６糖鎖の製造法。
【請求項２１】
下記式（２２）で表される１１糖を有する（α２，３）（α２，６）糖鎖アスパラギン誘導体。
〔式中、Ｒ１は式（２）で示される基であり、ＲＹは下記式（７）で示される基である。〕
Ｒ，Ｒ’，Ｒ”は下記の組合せを示す。
（ａ）Ｒ＝Ｆ、Ｒ’＝ＯＨ、Ｒ”＝ＯＨ
（ｂ）Ｒ＝ＯＨ、Ｒ’＝Ｆ、Ｒ”＝ＯＨ
（ｃ）Ｒ＝ＯＨ、Ｒ’＝ＯＨ、Ｒ”＝Ｆ
（ｄ）Ｒ＝ＯＨ、Ｒ’＝ＯＨ、Ｒ”＝ＯＨ
【請求項２２】
下記式（２３）で表される１１糖を有する（α２，３）（α２，６）糖鎖アスパラギン誘導体。
〔式中、Ｒ２は式（２）で示される基であり、ＲＸは下記式（７）で示される基である。〕
Ｒ，Ｒ’，Ｒ”は下記の組合せを示す。
（ａ）Ｒ＝Ｆ、Ｒ’＝ＯＨ、Ｒ”＝ＯＨ
（ｂ）Ｒ＝ＯＨ、Ｒ’＝Ｆ、Ｒ”＝ＯＨ
（ｃ）Ｒ＝ＯＨ、Ｒ’＝ＯＨ、Ｒ”＝Ｆ
（ｄ）Ｒ＝ＯＨ、Ｒ’＝ＯＨ、Ｒ”＝ＯＨ
【請求項２３】
脂溶性の保護基でアスパラギンのアミノ基窒素が保護された糖鎖アスパラギンの非還元末端側のＮ−アセチルグルコサミンに少なくとも１個以上のフコースを含む糖鎖アスパラギン誘導体。
【請求項２４】
脂溶性の保護基でアスパラギンのアミノ基窒素が保護された糖鎖アスパラギンが、式（１）で表される１１〜７糖を有するα２，３糖鎖アスパラギン誘導体である請求の範囲第２３項に記載のフコースを含む糖鎖アスパラギン誘導体。
【請求項２５】
脂溶性の保護基でアスパラギンのアミノ基窒素が保護された糖鎖アスパラギンが、式（６）で表されるフッ素を含む１１〜７糖を有するα２，６糖鎖アスパラギン誘導体である請求の範囲第２３項に記載のフコースを含む糖鎖アスパラギン誘導体。
【請求項２６】
脂溶性の保護基でアスパラギンのアミノ基窒素が保護された糖鎖アスパラギンが、下記式（６）で表される１１〜６糖を有するα２，６糖鎖アスパラギン誘導体である請求の範囲第２３項に記載のフコースを含む糖鎖アスパラギン誘導体。
〔式中、ＲＸおよびＲＹは、水素原子、下記式（７）で示される基、または上記式（３）〜（５）で示される基である。ただし、ＲＸおよびＲＹの一方は必ず式（７）あるいは式（３）で示される基である。〕
ただし、Ｒ＝ＯＨ、Ｒ’＝ＯＨ、Ｒ”＝ＯＨである。
【請求項２７】
脂溶性の保護基でアスパラギンのアミノ基窒素が保護された糖鎖アスパラギンをフコース転移酵素を用いてフコースを転移させ、得られた脂溶性の保護基で保護された糖鎖アスパラギンをグロマトグラフィーに供することにより分離することを特徴とする脂溶性の保護基でアスパラギンのアミノ基窒素が保護された糖鎖アスパラギンの非還元末端側のＮ−アセチルグルコサミンに少なくとも１個以上のフコースを含む糖鎖アスパラギン誘導体の製造方法。
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０５８９８４
【国際公開日】平成１６年７月１５日（２００４．７．１５）
【発行日】平成１８年４月２７日（２００６．４．２７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００５−５０９７４４（Ｐ２００５−５０９７４４）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＪＰ２００３／０１６５２３
【国際出願日】平成１５年１２月２４日（２００３．１２．２４）
【出願人】（５０２２４４２５８）
【出願人】（３０２０６０３０６）大塚化学株式会社 (88)
【Ｆターム（参考）】
【国際公開日】平成１６年７月１５日（２００４．７．１５）
【発行日】平成１８年４月２７日（２００６．４．２７）
【国際特許分類】
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＪＰ２００３／０１６５２３
【国際出願日】平成１５年１２月２４日（２００３．１２．２４）
【出願人】（５０２２４４２５８）
【出願人】（３０２０６０３０６）大塚化学株式会社 (88)
【Ｆターム（参考）】
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