糖鎖アレイ用高分子化合物および糖鎖アレイ基板
【課題】
吸着防止剤をコーティングすることなく、検出対象物質の非特異的な吸着・結合を抑制し、糖、糖鎖、糖ペプチド、糖タンパク、糖脂質またはこれらを有する生理活性物質を固定化できるバイオアッセイ用の高分子化合物及びこれを用いた各種糖鎖アレイ基材を提供すること。
【解決手段】
ホスホリルコリン基を有するユニット、疎水性基を有するユニットおよび一級アミノ基を有するユニットを含むことを特徴とする糖鎖捕捉用高分子化合物であり、該高分子化合物を基材に塗布してなるマイクロチップであって、３０種の糖鎖およびその誘導体のうち、少なくとも一つを固定してなるバイオアッセイ用基材。
吸着防止剤をコーティングすることなく、検出対象物質の非特異的な吸着・結合を抑制し、糖、糖鎖、糖ペプチド、糖タンパク、糖脂質またはこれらを有する生理活性物質を固定化できるバイオアッセイ用の高分子化合物及びこれを用いた各種糖鎖アレイ基材を提供すること。
【解決手段】
ホスホリルコリン基を有するユニット、疎水性基を有するユニットおよび一級アミノ基を有するユニットを含むことを特徴とする糖鎖捕捉用高分子化合物であり、該高分子化合物を基材に塗布してなるマイクロチップであって、３０種の糖鎖およびその誘導体のうち、少なくとも一つを固定してなるバイオアッセイ用基材。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アレイ状基材に糖鎖分子等を固定して利用して生体試料等の対象物質の検出および分析に用いる高分子材料およびそれを用いた基板に関する。
【背景技術】
【０００２】
生化学分野において、近年、核酸、タンパク質に続く第三の鎖として糖鎖分子が注目されている。特に細胞の分化や癌化、免疫反応や受精などのかかわりが研究され、新たな医薬や医療材料を創製しようとする試みが続けられている。
また、糖鎖は多くの毒素、ウィルス及びバクテリアなどの受容体であり、また、癌のマーカーとしても注目されており、こちらの分野においても、同様に新たな医薬や医療材料を創製しようとする試みが続けられている。
【０００３】
しかしながら、糖鎖は、研究の重要性を認識されながら、その複雑な構造や多様性から、第一、第二の鎖である核酸、タンパク質に比較して研究の推進が著しく遅れている。
この研究を推進する目的で、糖鎖を精製するための方法が種々開発されている。一方、糖鎖は、それ単独で機能を発揮するというより、細胞レセプターに対するリガンドとして機能する場合も多く確認され、それゆえに糖鎖に対するレセプターの解析に供するために、種々の糖鎖を固定化するための基材が開発されている。
【０００４】
特許文献１には、三官能性スペーサーを用いて、第１に官能基に糖鎖、第２の官能基が固相担体、第３の官能基が発色団と結合させ糖鎖アレイを作製する方法が示されている。また、特許文献２には、スペーサーを介して糖鎖を基材に固定化する方法が記載されておりスペーサーに親水性化合物を用いることで、非特異的吸着を抑制することが示されている。
しかしながら、特許文献１においては、糖鎖固定後に非特異吸着を防ぐために実施例において３％ウシ血清アルブミンを用いたブロッッキング操作が記載されている。
また、特許文献２には、スペーサーを介して糖鎖を基材に固定化する方法が記載されておりスペーサーに親水性化合物を用いることで、非特異的吸着を抑制することが示されている。
しかしながら、該発明においては、固相担体にハロゲン化アセチル基の導入の必要があり、材質がガラスの場合においては、比較的容易であるが、汎用性に乏しい方法である。また、前述のように糖鎖は多くの毒素、ウィルス及びバクテリアなどの受容体の研究にも使用されていることから、廃棄に際しては焼却処理が好ましく、材質がガラスであることは不利である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２００４−１１５６１６号公報
【特許文献２】特開２００６−０７８４１８号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、吸着防止剤をコーティングすることなく、検出対象物質の非特異的な吸着・結合を抑制し、糖、糖鎖、糖ペプチド、糖タンパク、糖脂質またはこれらを有する生理活性物質を固定化できるバイオアッセイ用の高分子化合物及びこれを用いた各種糖鎖アレイ基材を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
このような目的は、下記（１）〜（１５）に記載の本発明により達成される。
（１）糖鎖アレイに用いる糖鎖捕捉用高分子化合物であって、下記一般式〔１〕で表されることを特徴とする糖類捕捉用高分子化合物。
【化１】
（式中Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３は水素原子またはメチル基を、Ｒ４は疎水性基を示す。Ｘは炭素数１〜１０のアルキレンオキシ基を示し、ｐは１〜２０の整数を示す。ｐが２以上２０以下の整数である場合、繰り返されるＸは、同一であっても、または異なっていてもよい。Ｙはアルキレングリコール残基を含むスペーサーであり、Ｚは酸素原子またはＮＨである。ｌ、ｍ、ｎは自然数である。）
（２）前記一般式〔1〕においてYが下記一般式〔2〕又は〔3〕である（１）記載の糖類捕捉用高分子化合物。
【化２】
(式中ｑ、ｒは１〜２０の整数)
【化３】
(式中ｑ、ｒは１〜２０の整数)
（３）前記一級アミノ基がオキシルアミノ基および／またはヒドラジド基である（１）または（２）記載の糖類捕捉用高分子化合物。
（４）オキシルアミノ基および／またはヒドラジド基を有するユニットの含有量が高分子化合物の全ユニットの２０ｍｏｌ％以上４０ｍｏｌ％以下であることを特徴とする（３）記載の糖鎖捕捉用高分子化合物。
（５）前記親水性を保持するためのユニットがホスホリルコリン基を含む（１）〜（４）いずれか記載の糖類捕捉用高分子化合物。
（６）前記一般式〔１〕において、Ｘがエチレンオキシ基である（１）〜（５）いずれか記載の糖類捕捉用高分子化合物
（７）高分子化合物の主鎖が（メタ）アクリル骨格である（１）〜（６）いずれか記載の糖鎖捕捉用高分子化合物。
（８）前記疎水性基、Ｒ４が炭素数２〜１０のアルキル基である（１）〜（７）いずれか記載の糖類捕捉用高分子化合物。
（９）前記疎水性基、Ｒ４が環状アルキル基であることを特徴とすることを特徴とする（１）〜（８）いずれか記載の糖類捕捉用高分子化合物。
（１０）前記環状アルキル基がシクロヘキシル基であることを特徴とすることを特徴とする（１）〜（９）いずれか記載の糖類捕捉用高分子化合物。
（１１）（１）〜（１０）いずれか記載の糖鎖捕捉高分子化合物を基材の表面に形成した糖鎖アレイ用基材
（１２）（１）〜（１０）いずれか記載の糖類捕捉用高分子化合物の製造方法であって、少なくとも、ホスホリルコリン基を有するモノマー、疎水性基を有するモノマー、および一級アミノ基をあらかじめ保護基にて保護したモノマーとをラジカル共重合する工程、該工程により得られた高分子化合物を基材表面に塗布する工程、前記保護具を除去する工程、を含む糖類捕捉用高分子化合物を基材の表面に形成した（１２）記載の糖鎖アレイ用基材
（１３）前記基材の材質がプラスチックである（１１）または（１２）記載の糖鎖アレイ用基材
（１４）前記プラスチックが飽和環状ポリオレフィンまたはポリスチレンを含むものである（１１）〜（１３）いずれか記載の糖鎖アレイ用基材
（１５）前記糖類が糖、単糖、２糖以上の糖鎖、糖アミノ酸、糖ペプチド、糖タンパク質、糖脂質、グリコサミノグリカン、プロテオグリカン、グリコシルホスファチジルイノシトール、ペプチドグリカン、リポ多糖、又はそれらの誘導体、およびこれらを有する生体由来物質から選ばれる少なくとも一つを固定化されていることを特徴とする（１）〜（１４）いずれか記載の糖類捕捉用高分子化合物および糖鎖アレイ。
（１６）（１５）に記載の前記グリコサミノグリカンまたはプロテオグリカンが、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、ケラタン硫酸、ヘパリン、ヘパラン硫酸、ヒアルロン酸、又はそれらの誘導体、およびこれらを有する生体由来物質から選ばれる少なくとも一つを固定化されている糖類捕捉用高分子化合物および糖鎖アレイ。
（１７）（１５）に記載の前記前記糖類が、下表のリスト中の糖鎖、又はそれらの誘導体、及びこれらを有する生体由来物質から選ばれる少なくとも一つを固定化させてなる糖類捕捉用高分子化合物および糖鎖アレイ。
表１
【発明の効果】
【０００８】
本発明の高分子化合物を用いれば、吸着防止剤をコーティングすることなく、検出対象物の非特異的な吸着・結合を抑制し固定化することができ、糖、糖鎖、糖ペプチド、糖タンパク、糖脂質またはこれらを有する生理活性物質を固定したバイオアッセイ用の糖鎖アレイを簡便に作製することが可能となる。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
本発明の高分子化合物は、少なくとも糖類を捕捉するための一級アミノ基を有するユニット、親水性を保持するためのユニットおよび疎水性基を有するユニットからなる高分子化合物である。この高分子化合物は、生理活性物質を固定化する性質と、検出対象物の基材への物理的吸着（非特異敵吸着）を抑制する性質を有する。すなわち、一級アミノ基が糖、糖鎖、糖ペプチド、糖脂質またはこれらを有する生理活性物質を固定する役割を果たし、親水性を保持するためのユニットが検出対象物への基材への物理的吸着（非特異吸着）を抑制する性質を併せ持つ。また、疎水性のユニットは、該高分子化合物のプラスチック基材やガラス基材への吸着に関与している。
【００１０】
本発明の高分子化合物に含まれる親水性のユニットはホスホリルコリン基に代表されるもので、特に構造を限定するものではないが、下記一般式〔１〕のユニットは、構成単位の左部の構成単位で示されように、（メタ）アクリル残基とホスホリルコリン基が炭素数１〜１０のアルキレンオキシ基Ｘの連鎖を介して結合した構造であることが最も好ましい。中でもＸはエチレンオキシ基であることが最も最も好ましい。式中のアルキレンオキシ基の繰り返し数は１〜２０の整数であり、繰り返し数２以上２０以下の場合は、繰り返されるアルキレンオキシ基の炭素数は同一であっても、異なっていてもよい。ｌは本来自然数であるが、各構成成分の組成割合として表記される場合がある。
【００１１】
【化１】
【００１２】
本発明の高分子化合物に含まれるホスホリルコリン基を有するユニットの組成割合は（ｌ，ｍ，ｎの和に対するｌの比率）は、高分子の全ユニットに対して、５〜９８ｍｏｌ％が好ましくより好ましくは１０〜８０ｍｏｌ％、最も好ましくは、１０〜８０％である。組成比が下限値を下回ると親水性が弱くなり非特異吸着が多くなる。一方、上限値を上回ると水溶性が高まり、アッセイ中に高分子化合物が溶出してしまう可能性がある。
【００１３】
本発明の高分子化合物に含まれる疎水性基を有するユニットの組成割合は（ｌ，ｍ，ｎの和に対するｍの比率）は、高分子の全ユニットに対して、１０〜９０ｍｏｌ％が好ましくより好ましくは１０〜８０ｍｏｌ％、最も好ましくは、２０〜８０％である。上限値を上回ると非特異吸着が増加する恐れが出てくる。
【００１４】
本発明の高分子化合物に含まれる一級アミノ基を有するユニットは、特に構造を限定されるものではないが、前記一般式〔１〕の構成単位の右部の構成単位で表されるように、（メタ）アクリル残基とオキシルアミノ残基を含むスペーサーＹを解した構造であることが好ましい。オキシルアミノ基の場合、Ｚは酸素原子を、ヒドラジド基の場合、ＺはＮＨを示す。ｎは本来自然数であるが、各成分の組成割合として標記される場合がある。アルキレングリコール残基を含むスペーサーＹの構造は、特に制限されるものではないが、下記一般式〔２〕または〔３〕であることがこのましく、より好ましくは〔２〕である。
【００１５】
【化２】
【００１６】
【化３】
【００１７】
各成分の組成割合は（ｌ，ｍ，ｎの和に対するｎの比率）は、高分子の全ユニットに対して、１〜９４ｍｏｌ％が好ましくより好ましくは２〜９０ｍｏｌ％、最も好ましくは、２０〜４０％である。組成値が下限地を下回ると糖、糖鎖、および／またはこれらを有する生理活性物質を十分量固定化できなくなる。また、上限値を上回ると非特異吸着が増加する。
【００１８】
本発明の高分子化合物の合成方法は、特に限定されるものではないが、合成の容易さから、少なくともホスホリルコリン基を有するモノマー、疎水性基を有するモノマー、一級アミノ基を予め保護基にて保護したモノマーをラジカル共重合する工程、該工程により得られた高分子化合物から保護基を除去する工程、を含む製造方法が好ましい。あるいは、少なくともホスホリルコリン基を有するモノマー、疎水性基を有するモノマー、および一級アミノ基を導入しうる官能基を有するモノマーをラジカル共重合する工程、該工程により得られた高分子化合物に一級アミノ基を導入する工程、を含む製造方法が好ましい。
【００１９】
ホスホリルコリン基を有する単量体としては、特に構造を限定しないが、例えば２−（メタ）アクリロイルオキシエチルホスホリルコリン、２−（メタ）アクリロイルオキシエトキシエチルホスホリルコリン、６−（メタ）アクリロイルオキシヘキシルホスホリルコリン、１０−（メタ）アクリロイルオキシエトキシノニルホスホリルコリン、２−（メタ）アクリロイルオキシプロピルホスホリルコリン等を挙げられるが、入手性から２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンが好ましい。
【００２０】
疎水性基を有するモノマーの具体的な例としては、ｎ−ブチル（メタ）アクリレート、i s o−ブチル（メタ）アクリレート、s e c−ブチル（メタ）アクリレート、t−ブチル（メタ）アクリレート、ｎ−ネオペンチル（メタ）アクリレート、i s o−ネオペンチル（メタ）アクリレート、s e c−ネオペンチル（メタ）アクリレート、ネオペンチル（メタ）アクリレート、シクロヘキシル（メタ）アクリレート、ｎ−ヘキシル（メタ）アクリレート、i s o−ヘキシル（メタ）アクリレート、ヘプチル（メタ）アクリレート、ｎ−オクチル（メタ）アクリレート、i s o−オクチル（メタ）アクリレート、２−エチルヘキシル（メタ）アクリレート、ｎ−ノニル（メタ）アクリレート、i s o−ノニル（メタ）アクリレート、ｎ−デシル（メタ）アクリレート、is o−デシル（メタ）アクリレート、ｎ−ドデシル（メタ）アクリレート、i s o−ドデシル（メタ）アクリレート、ｎ−トリデシル（メタ） アクリレート、i s o−トリデシル（メタ）アクリレート、ｎ−テトラデシル（メタ） アクリレート、i s o−テトラデシル（メタ）アクリレート、ｎ−ペンタデシル（メタ）アクリレート、i s o−ペンタデシル（メタ）アクリレート、ｎ−ヘキサデシル（メタ）アクリレート、i s o−ヘキサデシル（メタ）アクリレート、ｎ−オクタデシル（メタ）アクリレート、i s o−オクタデシル（メタ）アクリレート、イソボニル（ メタ） アクリレートなどが挙げられる。これらのなかで最も好ましいのが、シクロヘキシル（メタ）アクリレート、ｎ―ブチルメタクリレート、ｎ−ドデシルメタクリレート、ｎ−オクチルメタクリレートである。
【００２１】
一級アミノ基を予め保護基にて保護したモノマーは、特に構造を限定しないが、下記一般式［ ４ ］ （ 式中、Ｒ ３ は水素原子またはメチル基、Ｙ はアルキレングリコール残基を含むスペーサー、Ｚ は酸素原子またはＮ Ｈ 、Ｗ は保護基を示す。） で表されるように、（ メタ） アクリル基と、オキシルアミノ基またはヒドラジド基が、アルキレングリコール残基を含むスペーサーＹ を介した構造であることが好ましい。
【００２２】
【化４】
【００２３】
保護基Ｗ としてはアミノ基を保護基できるものであれば何ら制限を受けるものではなく、任意に用いることができる。なかでもｔ―ブトキシカルボニル基（Ｂｏｃ基）やベンジロキシカルボニル基（Ｚ基、Ｃｂｚ基） 、９−フルオレニルメトキシカルボニル基（Ｆｍｏｃ基） などが好適に用いられる。
【００２４】
具体的なモノマーの例としては、下記式で表されるようなものである。
【００２５】
【化５】
【００２６】
脱保護化は、トリフルオロ酢酸や塩酸、無水フッ化水素を用いれば、一般的な条件で行うことができる。
【００２７】
一方、高分子化合物を重合した後に一級アミノ基を導入する方法としては、何ら制限を受けるものではないが、少なくともホスホリルコリン基を有するモノマー、疎水性基を有するモノマー、およびアルコキシ基を有するモノマーをラジカル共重合した後に、該高分子化合物に導入されたアルコキシ基とヒドラジンを反応させて、ヒドラジド基を生成する方法が簡便で好ましい。アルコキシ基としては、メトキシ基、エトキシ基、プロポキシ基、ｔ−ブトキシ基等が好適である。
【００２８】
具体的なアルコキシ基を有するモノマーの例としては、下記式で表されるようなものである。
【００２９】
【化６】
【００３０】
本発明の高分子化合物の合成溶媒としては、それぞれの単量体が溶解するものであればよく、例えば、メタノール、エタノール、イソプロパノール、ｎ−ブタノール、ｔ−ブチルアルコール、ｎ−ペンタノール等アルコール類、ベンゼン、トルエン、テトラヒドロフラン、ジオキサン、ジクロロメタン、クロロホルム、シクロヘキサノン、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、酢酸メチル、酢酸エチル、酢酸ブチル、メチルエチルケトン、メチルブチルケトン、エチレングリコールモノエチルエーテル、エチレングリコールモノメチルエーテル、エチレングリコールモノブチルエーテル等を挙げることができる。これらの溶媒は、単独または２ 種以上の組み合わせで用いられる。
【００３１】
重合開始剤としては通常のラジカル開始剤ならいずれでもよく、例えば、２，２ ’−アゾビスイソブチルニトリル（ 以下「ＡＩＢＮ」という） 、１，１’−アゾビス（シクロヘキサン−１−カルボニトリル） 等のアゾ化合物、過酸化ベンゾイル、過酸化ラウリル等の有機過酸化物等を挙げることができる。
【００３２】
本発明の高分子化合物の分子量は、高分子化合物と未反応の単量体との分離精製が容易になることから、数平均分子量は５０００以上が好ましく、１００００以上がより好ましい。
【００３３】
脱保護は前述のトリフルオロ酢酸や塩酸、無水フッ化水素を用いれば、一般的な条件で行うことができるが、脱保護の時期に関しては、以下の通りである。
通常は重合が完了し、高分子化合物が作製できた段階で行うことが一般的であり、本発明の高分子化合物を得るには、重合終了後に脱保護を行いうことで該高分子化合物を得ることができる。
【００３４】
一方、本発明においては、基材表面に該高分子化合物を被覆することにより生理活性物質の非特異的吸着を抑制する性質、及び生理活性物質を固定化する性質を容易に付与することが可能であることを示している。
この場合、脱保護を行った一級アミノ基を持つ高分子化合物を被覆することも可能であるが、反応性の高い一級アミノ基を持つ高分子材料を溶液にして皮膜することは、場合によっては作業中に一級アミノ基が反応して不活化することも考えられる。
従って、脱保護する直前で高分子化合物を精製し、基材表面を皮膜して後に、脱保護の反応を行い、基材表面上に一級アミノ基が存在する状態を形成することが望ましい。
【００３５】
基材表面への高分子化合物の被覆は、例えば有機溶剤に高分子化合物を０．０５〜５０重量％濃度になるように溶解した高分子溶液を調製し、浸漬、吹きつけ等の公知の方法で基材表面に塗布した後、室温下ないしは加温下にて乾燥させることにより行われる。
【００３６】
有機溶剤としてはエタノール、メタノール、イソプロパノール、ｎ−ブタノール、ｔ−ブチルアルコール、ｎ−ペンタノール、シクロヘキサノール等アルコール類、ベンゼン、トルエン、テトラヒドロフラン、ジオキサン、ジクロロメタン、クロロホルム、アセトン、酢酸メチル、酢酸エチル、酢酸ブチル、メチルエチルケトン、メチルブチルケトン、エチレングリコールモノエチルエーテル、エチレングリコールモノメチルエーテル、エチレングリコールモノブチルエーテル、シクロヘキサノン等を挙げることができる。これらの溶媒は、単独または２ 種以上の組み合わせで用いられる。中でも、エタノール、メタノール、イソプロパノール、ｎ−ブタノール、ｔ−ブチルアルコール、ｎ−ペンタノールシクロヘキサノール等アルコール類がプラスチック基材を変性させず、乾燥させやすいため好ましい。
【００３７】
本発明に用いる基材としては、スライド形状基板、９ ６ 穴プレート、容器、マイクロフルイディスク基板が好ましい。例えばプラスチック製基板、ガラス製基板、金属蒸着膜を有する基板などがあげられる。プラスチック製基板の具体例としては、ポリスチレン、環状ポリオレフィンポリマー、シクロオレフィンポリマー、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリサルフォン、ポリイミド、ポリカーボネート、ポリメチルメタクリレートを素材とした基板などがあげられる。
【００３８】
特に、蛍光観察に用いる基材としては、環状ポリオレフィンポリマー、シクロオレフィンポリマーが有用である。前記基材を用いる場合においては、前記高分子化合物の疎水基が、シクロヘキシルキ基であると、基材との相互作用が良好で、同じ組成比の高分子材料を他の基材（例えばポリスチレンやガラス基材）に塗布した場合に比べ、吸着量が高くバックグランド値が低い良好な結果となる。
【００３９】
また、環状ポリオレフィンポリマーに、前記高分子物資を塗布する場合、アミノオキシモノマー１００ｍｏｌ％の高分子化合物に関しては、塗布振ることができない。一方、ポリスチレンポリマーにはと不可能であるが、夾雑物の非特異的吸着は抑制されず汎用性に乏しい。
【００４０】
前記高分子化合物を塗布した基材は単糖、２糖以上の糖鎖、糖アミノ酸、糖ペプチド、糖タンパク質、糖脂質、グリコサミノグリカン、プロテオグリカン、グリコシルホスファチジルイノシトール、ペプチドグリカン、リポ多糖、又はそれらの誘導体を固定化することができ、バイオアッセイ用途に好適に用いることができる。生理活性物質としては、糖タンパク質、糖脂質、糖鎖遺伝子などが上げられる。これらの生理活性物質の基材への固定化方法としては、スポッターを使用して生理活性物質が溶解した溶液を点着する方法、生理活性物質が溶解した溶液を容器などに分注して固定化する方法などがある。
【００４１】
単糖、２糖以上の糖鎖、糖アミノ酸、糖ペプチド、糖タンパク質、糖脂質、グリコサミノグリカン、プロテオグリカン、グリコシルホスファチジルイノシトール、ペプチドグリカン、リポ多糖、又はそれらの誘導体を前記の基板表面に固定化するためには、分子中の糖鎖末端部分に還元糖部分を作製する必要がある。使用する酸化剤 としては、特に限定されないが、過ヨウ素酸を使用する。これらの濃度は、０．０４〜０．１６Ｍである。また、該酸化反応の緩衝液としては、通常、重炭酸ナトリウム溶液（ｐＨ８．１）を使用する。このようにして酸化された生理活性物質のアルデヒド基と基板上の一級アミノ基とを反応させ、シッフ塩基を生成することにより、化学的に固定化することが出来る。
【００４２】
また、糖を還元するのではなく結合物質の糖鎖でない部分、すなわち、ペプチド、タンパク質、脂質部分にケトン基を導入して、それを結合点として前記の方法で固定化することも可能である。
結合物質のペプチド部分にケトン基を導入する方法としては、・・・がある。
結合物質のタンパク質部分にケトン基を導入する方法は、前記ペプチド部にケトン基を導入するのと同じ方法を用いることが可能である。
【００４３】
結合物質の脂質部分にケトン基を導入する方法としては、オゾン分解法がある。
具体的には２００μＭの糖脂質のクロロホルム−メタノール（１：１（ｖ／ｖ））溶液２００μＬにオゾンガスを３０分間導入しバブリングする。この後、ガスを窒素ガスに換えて溶存オゾンを除去。１μＬのトリフェニルホスフィン（１Ｍトルエン溶液）でオゾン分解反応を停止。反応溶液を蒸発させた後、ヘキサンを加えて攪拌し糖脂質のオゾン分解生成物をえる。（反応式１）
〔反応式１〕
【００４４】
生理活性物質を溶解する溶液としては各種緩衝材が好適に用いられる。特に限定されないが、たとえば炭酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、リン酸カリウム、リン酸水素二カリウム、トリス塩酸緩衝剤、トリス酢酸緩衝剤、ＰＢＳ緩衝剤、クエン酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、ＨＥＰＥＳ（Ｎ−２−ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｙｌｐｉｐｅｒａｚｉｎe−Ｎ’−ｅｔｈａｎｅｓｕｌｐｈｏｎｉｃ ａｃｉｄ）緩衝剤、ＭＯＰＳ（３−（Ｎ−ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏ）ｐｒｏｐａｎｅｓｕｌｐｈｏｎｉｃａｃｉｄ） 緩衝剤などが用いられる。
【００４５】
生理活性物質を溶解する溶液のｐＨとしては、糖又は糖鎖を溶解する場合はｐＨが２〜８であることが好ましい。糖タンパク質を溶解する場合はｐＨが４〜９であることが好ましい。糖核酸を溶解する場合はｐＨが２〜８であることが好ましい。糖脂質を溶解する場合はｐＨ２〜８ であることが好ましい。
【００４６】
生理活性物質の溶液中の濃度としては特に限定されないが、０．０００１ｍｇ／ｍｌから１０ｍｇ／ｍｌであることが好ましい。
【００４７】
生理活性物質の溶液を固定化する温度としては０℃から１００℃が好ましい。
【００４８】
固定化する糖鎖には、前記のように、単糖、２糖以上の糖鎖、糖アミノ酸、糖ペプチド、糖タンパク質、糖脂質、グリコサミノグリカン、プロテオグリカン、グリコシルホスファチジルイノシトール、ペプチドグリカン、リポ多糖、又はそれらの誘導体を用いることができる。
【００４９】
特に、前記グリコサミノグリカンまたはプロテオグリカンが、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、ケラタン硫酸、ヘパリン、ヘパラン硫酸、ヒアルロン酸、又はそれらの誘導体、およびこれらを有する生体由来物質が、細胞増殖因子との相互作用による因子の安定化や、機能亢進に重要な役割を果たしていることから、これらの物質を固定化したものは、生体内機能の解析や、臨床検査において重要なものである。
【００５０】
また、以下に示す糖鎖構造物は、生体内機能や疾患に関係の深い物質であり、生体内機能の解析や、疾患の研究、臨床検査において重要な物質である。生体内機能と市は、例えば、受精や、発生に関連しており、疾患関係では、癌、感染症に関連しているがこれらに限定されるものではない。以下の糖鎖から選ばれる少なくとも一つを固定化させてなる糖類捕捉用高分子化合物および糖鎖アレイは、生体内機能や疾患の機能解析、検査において有用なツールとなる可能性を有する。
【００５１】
表１
＜実施形態＞
【実施例】
【００５２】
以下、本発明を実施例および比較例に基づいて詳細に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
【００５３】
＜実施例１＞
アミノオキシ基含有量の比較(９６ウェルプレート)
（糖鎖捕捉基材の作製）
糖鎖捕捉高分子材料を表面に形成させる基材として、９６ウェルプレートを使用した。該９６ウェルプレートは住友ベークライトにおいて環状ポリオレフィン樹脂で成形したものを使用した。
糖鎖捕捉高分子化合物として２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン−ブチルメタクリレート−N-(2-(2-(2-(t-ブトキシカルボニルアミノオキシ−アセチルアミノ)エトキシ)エトキシ)エチル)-メタクリルアミド共重合体を用い、該高分子化合物の１．０重量％エタノール溶液１５０ｕＬを９６ウェルプレートの各ウェルに分注して３０分静置した後に溶液を抜き取り乾燥、溶媒を蒸散させて基材表面に塗布した。
用いた高分子化合物はアミノオキシ基の含有量が１４、１６、２０％の３種類を合成して用いた。
乾燥後、２Ｍ ＨＣｌを分注し、３７℃で２時間処理してＢｏｃ基を脱保護し糖鎖捕捉高分子化合物を表面に持つ９６ウェルプレートを作製した。
【００５４】
（糖鎖固定化）
二糖のラクトース(和光純薬、１２４−０００９２)を３００ｍＭの酢酸ナトリウムバッファー(ｐＨ４．０)で１ｍｇ／ｍＬに調製、ラクトース溶液を作製。
作製したラクトース溶液を、前記の糖鎖捕捉用９６ウェルプレートに２００μＬ分注し、６５℃で１６時間反応させた。反応後、溶媒で未反応ラクトースを除去。
【００５５】
（固定糖鎖の検出）
ラクトースと特異的に反応する ＲＣＡ１２０レクチンをビオチン標識したもの（Ｂｉｏｔｉｎ標識ＲＣＡ１２０レクチン（Ｖｅｃｔｏｒ社製、Ｂ−１０８５））を下記の溶媒で０．５μｇ／ｍＬに調製。
溶媒：５０ｍＭ Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ(ｐＨ７．５)、１００ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＣａＣｌ２、ＭｎＣｌ２、ＭｇＣｌ２、０．０５%Ｔｗｅｅｎ２０。
（試薬はすべて和光純薬製）
各ウェルに１００μＬづつ分注して室温で２時間反応。
反応後、下記洗浄液で３回、ウェル内を洗浄した。
洗浄液：５０ｍＭ Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ(ｐＨ７．５)、１００ｍＭ ＮａＣｌ、
１ｍＭ ＣａＣｌ２、ＭｎＣｌ２、ＭｇＣｌ２、
０．０５％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００（試薬はすべて和光純薬製）
ペルオキシダーゼ標識アビジン(ＭＰ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ、１９１３７０)を下記の溶媒で０．５ｕｇ／ｍＬに調製。
溶媒：５０ｍＭ Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ(ｐＨ７．５)、１００ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＣａＣｌ２、ＭｎＣｌ２、ＭｇＣｌ２、０．０５%Ｔｗｅｅｎ２０（試薬はすべて和光純薬製）。
ペルオキシダーゼ溶液１００μＬを、前記のラクトースを固定化した９６ウェルプレートに分注、室温で１時間反応。反応終了後、洗浄液で各ウェルを３回洗浄。
固相化されたぺルオキシダーゼ量を、ペルオキシダーゼ用発色キット（住友ベークライト製、ＭＬ−１１２０Ｔ）を用いて１５分間発色、マイクロプレートリーダー（ＴＥＣＡＮ社製Ｉｎｆｉｎｉｔ２００）で測定波長４５０ｎｍの吸光度を測定した。
結果を下表に示す。
表２
【００５６】
＜実施例２＞疎水性残基の構造比較(バックグランド比較、９６ウェルプレート)
実施例１で用いた環状ポリオレフィン製９６ウェルマイクロプレート（住友ベークライト製）を使用。
実施例１の糖鎖捕捉高分子化合物のブチルメタクリレートを、シクロヘキシルメタクリレートまたはｎ−ヘキシルメタクリレートに変えて合成した高分子化合物を実施例１同様の方法で塗布、Ｂｏｃ基を脱保護した。
Ｂｉｏｔｉｎ標識ＲＣＡ１２０レクチンを反応、さらにペルオキシダーゼ標識アビジンを反応させた後、ペルオキダーゼ発色キットで発色後、吸光度を測定した。
結果を下表に示す。
表３
直鎖アルキル基であるブチル基、ｎ−ヘキシル基においても低バックグランド値であるが、環状アルキル基であるシクロヘキシル基では更に低いバックグランド値を得た。
【００５７】
＜実施例３＞疎水性残基の構造比較(シグナル値比較, ９６ウェルプレート)
実施例１、２で用いた環状ポリオレフィン製９６ウェルマイクロプレート（住友ベークライト製）を使用。
実施例１の糖鎖捕捉高分子化合物のブチルメタクリレートを、シクロヘキシルメタクリレートに変えて合成した高分子化合物を実施例１同様の方法で塗布、Ｂｏｃ基を脱保護した。
（糖鎖固定化）
マンノトリオース（Ｄｅｘｔｒａ、Ｍ３３６）を下記の溶媒を用いて１０μｇ／ｍＬに調製。９６ウェルプレートの各ウェルに１００μＬづつ分注し、８０℃、１時間反応させた。
溶媒：２％ＡｃＯＨ／ＣＨ３ＣＮ：水＝７５：２５
反応終了後、洗浄し未反応のマンノトリオースを除去した。
（固定糖鎖の検出）
マンノトリオースと特異的に反応する Ｂｉｏｔｉｎ標識ＣｏｎＡレクチン(ＳＩＧＭＡ社、C2272)を下記の溶媒で２５０ｎｇ／ｍＬに調製
溶媒：５０ｍＭ Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ(ｐＨ７．５)、１００ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＣａＣｌ２、ＭｎＣｌ２、ＭｇＣｌ２、０．０５%Ｔｗｅｅｎ２０。
各ウェルに１００μＬづつ分注して室温で２時間反応。
反応後、下記洗浄液で３回、ウェル内を洗浄した。
洗浄液：５０ｍＭ Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ(ｐＨ７．５)、１００ｍＭ ＮａＣｌ、
１ｍＭ ＣａＣｌ２、ＭｎＣｌ２、ＭｇＣｌ２、
０５％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００
ペルオキシダーゼ標識アビジン(ＭＰ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ、１９１３７０)を下記の溶媒で０．５ｕｇ／ｍＬに調製。
溶媒：５０ｍＭ Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ(ｐＨ７．５)、１００ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＣａＣｌ２、ＭｎＣｌ２、ＭｇＣｌ２、０．０５%Ｔｗｅｅｎ２０。
ペルオキシダーゼ溶液１００μＬを、前記のラクトースを固定化した９６ウェルプレートに分注、室温で１時間反応。反応終了後、洗浄液で各ウェルを３回洗浄。
固相化されたぺルオキシダーゼ量を、ＴＭＢ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、１７２−１０６７）で１５分発色、４５０ｎｍで吸光度測定した。
結果を下表に示す。
表４
環状アルキル基であるシクロヘキシル基において高い吸光度値を得ることができた。
【００５８】
＜実施例４＞ 糖鎖固定マイクロアレイ
(糖鎖捕捉基材の作製)
マイクロアレイの作製には住友ベークライト製、環状ポリオレフィン樹脂製のスライドガラス形状のプラスチックス基板を使用した。
オキシエチルホスホリルコリン−シクロヘキシルメタクリレート−Ｎ−(２−(２−(２−（ｔ−ブトキシカルボニルアミノオキシアセチルアミノ)エトキシ)エトキシ)エチル)−メタクリルアミド共重合体の１．０重量％エタノール溶液にスライドを浸漬して高分子化合物を塗布した。
塗布後、２Ｍ ＨＣｌで３７℃、２時間処理し、Ｂｏｃ基を脱保護した。
【００５９】
（糖鎖の固定化）
８種類のＮ結合型糖鎖、Ｄｅｘｔｒａ、ＭＣ１１３１、Ｃ０９２０、Ｃ１０２６、ＳＣ１１２０、Ｃ０８４０、Ｃ１１２４、Ｃ１２２４、ＰＲＯＺＹＭＥ、ＧＫＣ−３３５３００（Ｄｅｘｔｒａ社製）を下記溶液で１００ｕｇ／ｍＬに調製し、基板にスポッティング、８０℃、１時間反応させて基板に糖鎖を固定化。
溶液：１００ｍＭ ＮａＯＡｃ ｂｕｆｆｅｒ(ｐＨ５．０)＋０．０１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００（和光純薬、Ａ１６０４６）、０．０１％ＰＶＡ（重合度＝１５００）
【００６０】
（固定糖鎖の検出）
Ｃ１０２６と特異的に結合するレクチンであるＡＡＬレクチンのビオチン標識体であるＢｉｏｔｉｎ標識ＡＡＬレクチン(生化学バイオビジネス社、３００４０６)を下記溶液で１００ｕｇ／ｍＬに調製。
溶液：５０ｍＭ Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ(ｐＨ７．５)、１００ｍＭ ＮａＣｌ、
１ｍＭ ＣａＣｌ２、ＭｎＣｌ２、ＭｇＣｌ２、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０
基板上に溶液を反応させ、室温で２時間反応した。
反応後、前記洗浄剤で洗浄。
Ｃｙ３−Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ（ＧＥヘルスケア、ＰＡ４３００１）を下記溶液で２ｕｇ／ｍＬに調製したものを基板状に展開し、室温で１時間反応。
溶液：５０ｍＭ Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ(ｐＨ７．５)、１００ｍＭ ＮａＣｌ、
１ｍＭ ＣａＣｌ２、ＭｎＣｌ２、ＭｇＣｌ２、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０
反応後、前記洗浄液で洗浄。測定はＸ−１００マイクロアレイリーダー、ＳｃａｎＡｒｒａｙＬｉｔｅ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ製）を用いてＣｙ３の蛍光強度を測定。（Ｌａｓｅｒ＝９０、ＰＭＴ＝６０）
結果を下表に示す。
表５
標識糖鎖が固定化できていることを確認した。
【００６１】
＜実施例５＞ 酸性多糖の固定化（マイクロアレイ）
(糖鎖捕捉基材の作製)
マイクロアレイの作製には住友ベークライト製、環状ポリオレフィン樹脂製のスライドガラス形状のプラスチックス基板を使用した。
【００６２】
２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン−シクロヘキシルメタクリレート−N-（2-（2-（2-（t-ブトキシカルボニルアミノオキシアセチルアミノ）エトキシ）エトキシ）エチル）-メタクリルアミド共重合体の１．０重量％エタノール溶液にスライドを浸漬して高分子化合物を塗布した。
塗布後、２Ｍ ＨＣｌで３７℃、２時間処理し、Ｂｏｃ基を脱保護した。
【００６３】
（糖鎖の固定化）
ヘパリン(Ｉｄｕｒｏｎ社、ＨＥＰ００１）とコンドロイチン硫酸(生化学バイオビジネス社、４００６５０)を下記溶液で１００ｕｇ／ｍＬに調製し、基板にスポッティングし、８０℃、１時間反応させて基板に酸性糖鎖を固定化した。
溶液：１００ｍＭ ＮａＯＡｃ ｂｕｆｆｅｒ(ｐＨ５．０)＋界面活性剤（０．０１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、０．０１％ＰＶＡ（重合度＝１５００））
固定化後、純水で洗浄し、未反応の酸性多糖を除去した。
【００６４】
（固定糖鎖の検出）
ヘパリンと結合する事が報告されているＦＧＦ２（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ社、１００−１８Ｂ）を下記の溶媒で１００ｎｇ／ｍＬに調製した。
溶媒：５０ｍＭ Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ(ｐＨ７．５)、１００ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＣａＣｌ２、ＭｎＣｌ２、ＭｇＣｌ２、０．０５%Ｔｗｅｅｎ２０。
【００６５】
基板上に溶液を反応させ、室温で２時間反応した。
反応後、洗浄液で基板を洗浄し、未反応のＦＧＦ２を除去した。
洗浄液：５０ｍＭ Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ(ｐＨ７．５)、１００ｍＭ ＮａＣｌ、
１ｍＭ ＣａＣｌ２、ＭｎＣｌ２、ＭｇＣｌ２、
０．０５％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００
【００６６】
抗ＦＧＦ２抗体(Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ社、５００−Ｍ３８)を下記の溶媒で２μｇ／ｍＬに調製した。
溶媒：５０ｍＭ Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ(ｐＨ７．５)、１００ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＣａＣｌ２、ＭｎＣｌ２、ＭｇＣｌ２、０．０５%Ｔｗｅｅｎ２０。
基板上に溶液を反応させ、室温で１時間反応した。
反応後、洗浄液で基板を洗浄し、未反応の抗体を除去した。
【００６７】
Ｃｙ３標識された抗マウスＩｇＧ抗体(ＧＥヘルスケア、ＰＡ４３００２)を下記溶液で２ｕｇ／ｍＬに調製した。
溶液：５０ｍＭ Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ(ｐＨ７．５)、１００ｍＭ ＮａＣｌ、
１ｍＭ ＣａＣｌ２、ＭｎＣｌ２、ＭｇＣｌ２、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０
【００６８】
基板上に溶液を反応させ、室温で１時間反応した。
反応後、洗浄液で基板を洗浄し、未反応の抗体を除去した。
【００６９】
Ｘ−１００マイクロアレイリーダー、ＳｃａｎＡｒｒａｙＬｉｔｅ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ製）を用いてＣｙ３の蛍光強度を測定した。（Ｌａｓｅｒ＝９０、ＰＭＴ＝６０）
【００７０】
結果を下表に示す。
表６ 酸性多糖固定化基材測定結果
【００７１】
＜比較例１＞
（固定化基材の作製）
実施例１、２で用いた環状ポリオレフィン製９６ウェルマイクロプレート（住友ベークライト製）を使用。
２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン−ブチルメタクリレート−Ｎ-
（２−（２−（２−(ｔ−ブトキシカルボニルアミノオキシアセチルアミノ)エトキシ）エトキシ）エチル−メタクリルアミド共重合体の１．０重量％エタノール溶液１５０ｕＬを一部のウェルに分注して基材表面にポリマーコート。一部ポリマーコートしていないウェルを１％ＢＳＡ／ＰＢＳでブロッキング、室温で１時間ブロッキング反応させた。
【００７２】
（レクチンの固定化）
実施例１で用いたＢｉｏｔｉｎ標識ＲＣＡ１２０レクチン(Ｖｅｃｔｏｒ社、Ｂ−１０８５)をＰＢＳで５ｕｇ／ｍＬに調製し、各ウェルに１００ｕＬ分注して室温で２時間反応させた。反応後、前記の洗浄液で３回洗浄した。
ペルオキシダーゼ標識アビジン(ＭＰ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ、１９１３７０)を下記の溶媒で０．５ｕｇ／ｍＬに調製。
溶媒：５０ｍＭ Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ(ｐＨ７．５)、１００ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＣａＣｌ２、ＭｎＣｌ２、ＭｇＣｌ２、０．０５%Ｔｗｅｅｎ２０。
ペルオキシダーゼ溶液１００μＬを、前記の９６ウェルプレートに分注、室温で１時間反応。反応終了後、洗浄液で各ウェルを３回洗浄。
固相化されたペルオキシダーゼ量を、ペルオキシダーゼ用発色キット（住友ベークライト製、ＭＬ−１１２０Ｔ）を用いて１５分間発色、測定波長４５０ｎｍで吸光度測定した。
結果を下表に示す。
表７
糖を固定化せず測定を実施し、本発明による高分子化合物存在下においてのみ非特異吸着が抑制できることが明らかとなった。
【００７３】
＜比較例２＞
実施例１、２で用いた環状ポリオレフィン製９６ウェルマイクロプレート（住友ベークライト製）を使用。
２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン−ブチルメタクリレート−Ｎ−（２−（２−（２−（ｔ−ブトキシカルボニルアミノオキシアセチルアミノ）エトキシ）エトキシ）エチル）−メタクリルアミド共重合体の１．０重量％エタノール溶液１５０ｕＬを一部のウェルに分注して基材表面にポリマーコートした。
【００７４】
（糖鎖固定化）
ラクトース(和光純薬、１２４−０００９２)を下記の溶媒を用いて１００μｇ／ｍＬに調製。９６ウェルプレートの各ウェルに１００μＬづつ分注し、８０℃、１時間反応させた。
溶媒：２％ＡｃＯＨ／ＣＨ３ＣＮ：水＝７５：２５
反応終了後、洗浄し未反応のラクトースを除去した。
【００７５】
（レクチンの固定化）
実施例１で用いたＢｉｏｔｉｎ標識ＲＣＡ１２０レクチン(Ｖｅｃｔｏｒ社、Ｂ−１０８５)をＰＢＳで５ｕｇ／ｍＬに調製し、各ウェルに１００ｕＬ分注して室温で２時間反応させた。反応後、前記の洗浄液で３回洗浄した。
ペルオキシダーゼ標識アビジン(ＭＰ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ、１９１３７０)を下記の溶媒で０．５ｕｇ／ｍＬに調製。
溶媒：５０ｍＭ Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ(ｐＨ７．５)、１００ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＣａＣｌ２、ＭｎＣｌ２、ＭｇＣｌ２、０．０５%Ｔｗｅｅｎ２０
ペルオキシダーゼ溶液１００μＬを、前記のラクトースを固定化した９６ウェルプレートに分注、室温で１時間反応。反応終了後、洗浄液で各ウェルを３回洗浄。
固相化されたペルオキシダーゼ量を、ペルオキシダーゼ用発色キット（住友ベークライト製、ＭＬ−１１２０Ｔ）を用いて１５分間発色、測定波長４５０ｎｍで吸光度測定した。
結果を下表に示す。
表８
表７との対比により、本発明による高分子化合物存在下においてのみ非特異吸着が抑制かつ糖鎖を捕捉し測定できることが明らかとなった。
【産業上の利用可能性】
【００７６】
本発明の用いることにより、吸着防止剤をコーティングすることなく、検出対象物質の非特異的な吸着・結合を抑制し、糖、糖鎖、糖ペプチド、糖タンパク、糖脂質またはこれらを有する生理活性物質を固定化できるバイオアッセイ用の高分子化合物及びこれを用いた各種糖鎖アレイ基材を提供することができる。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アレイ状基材に糖鎖分子等を固定して利用して生体試料等の対象物質の検出および分析に用いる高分子材料およびそれを用いた基板に関する。
【背景技術】
【０００２】
生化学分野において、近年、核酸、タンパク質に続く第三の鎖として糖鎖分子が注目されている。特に細胞の分化や癌化、免疫反応や受精などのかかわりが研究され、新たな医薬や医療材料を創製しようとする試みが続けられている。
また、糖鎖は多くの毒素、ウィルス及びバクテリアなどの受容体であり、また、癌のマーカーとしても注目されており、こちらの分野においても、同様に新たな医薬や医療材料を創製しようとする試みが続けられている。
【０００３】
しかしながら、糖鎖は、研究の重要性を認識されながら、その複雑な構造や多様性から、第一、第二の鎖である核酸、タンパク質に比較して研究の推進が著しく遅れている。
この研究を推進する目的で、糖鎖を精製するための方法が種々開発されている。一方、糖鎖は、それ単独で機能を発揮するというより、細胞レセプターに対するリガンドとして機能する場合も多く確認され、それゆえに糖鎖に対するレセプターの解析に供するために、種々の糖鎖を固定化するための基材が開発されている。
【０００４】
特許文献１には、三官能性スペーサーを用いて、第１に官能基に糖鎖、第２の官能基が固相担体、第３の官能基が発色団と結合させ糖鎖アレイを作製する方法が示されている。また、特許文献２には、スペーサーを介して糖鎖を基材に固定化する方法が記載されておりスペーサーに親水性化合物を用いることで、非特異的吸着を抑制することが示されている。
しかしながら、特許文献１においては、糖鎖固定後に非特異吸着を防ぐために実施例において３％ウシ血清アルブミンを用いたブロッッキング操作が記載されている。
また、特許文献２には、スペーサーを介して糖鎖を基材に固定化する方法が記載されておりスペーサーに親水性化合物を用いることで、非特異的吸着を抑制することが示されている。
しかしながら、該発明においては、固相担体にハロゲン化アセチル基の導入の必要があり、材質がガラスの場合においては、比較的容易であるが、汎用性に乏しい方法である。また、前述のように糖鎖は多くの毒素、ウィルス及びバクテリアなどの受容体の研究にも使用されていることから、廃棄に際しては焼却処理が好ましく、材質がガラスであることは不利である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２００４−１１５６１６号公報
【特許文献２】特開２００６−０７８４１８号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、吸着防止剤をコーティングすることなく、検出対象物質の非特異的な吸着・結合を抑制し、糖、糖鎖、糖ペプチド、糖タンパク、糖脂質またはこれらを有する生理活性物質を固定化できるバイオアッセイ用の高分子化合物及びこれを用いた各種糖鎖アレイ基材を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
このような目的は、下記（１）〜（１５）に記載の本発明により達成される。
（１）糖鎖アレイに用いる糖鎖捕捉用高分子化合物であって、下記一般式〔１〕で表されることを特徴とする糖類捕捉用高分子化合物。
【化１】
（式中Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３は水素原子またはメチル基を、Ｒ４は疎水性基を示す。Ｘは炭素数１〜１０のアルキレンオキシ基を示し、ｐは１〜２０の整数を示す。ｐが２以上２０以下の整数である場合、繰り返されるＸは、同一であっても、または異なっていてもよい。Ｙはアルキレングリコール残基を含むスペーサーであり、Ｚは酸素原子またはＮＨである。ｌ、ｍ、ｎは自然数である。）
（２）前記一般式〔1〕においてYが下記一般式〔2〕又は〔3〕である（１）記載の糖類捕捉用高分子化合物。
【化２】
(式中ｑ、ｒは１〜２０の整数)
【化３】
(式中ｑ、ｒは１〜２０の整数)
（３）前記一級アミノ基がオキシルアミノ基および／またはヒドラジド基である（１）または（２）記載の糖類捕捉用高分子化合物。
（４）オキシルアミノ基および／またはヒドラジド基を有するユニットの含有量が高分子化合物の全ユニットの２０ｍｏｌ％以上４０ｍｏｌ％以下であることを特徴とする（３）記載の糖鎖捕捉用高分子化合物。
（５）前記親水性を保持するためのユニットがホスホリルコリン基を含む（１）〜（４）いずれか記載の糖類捕捉用高分子化合物。
（６）前記一般式〔１〕において、Ｘがエチレンオキシ基である（１）〜（５）いずれか記載の糖類捕捉用高分子化合物
（７）高分子化合物の主鎖が（メタ）アクリル骨格である（１）〜（６）いずれか記載の糖鎖捕捉用高分子化合物。
（８）前記疎水性基、Ｒ４が炭素数２〜１０のアルキル基である（１）〜（７）いずれか記載の糖類捕捉用高分子化合物。
（９）前記疎水性基、Ｒ４が環状アルキル基であることを特徴とすることを特徴とする（１）〜（８）いずれか記載の糖類捕捉用高分子化合物。
（１０）前記環状アルキル基がシクロヘキシル基であることを特徴とすることを特徴とする（１）〜（９）いずれか記載の糖類捕捉用高分子化合物。
（１１）（１）〜（１０）いずれか記載の糖鎖捕捉高分子化合物を基材の表面に形成した糖鎖アレイ用基材
（１２）（１）〜（１０）いずれか記載の糖類捕捉用高分子化合物の製造方法であって、少なくとも、ホスホリルコリン基を有するモノマー、疎水性基を有するモノマー、および一級アミノ基をあらかじめ保護基にて保護したモノマーとをラジカル共重合する工程、該工程により得られた高分子化合物を基材表面に塗布する工程、前記保護具を除去する工程、を含む糖類捕捉用高分子化合物を基材の表面に形成した（１２）記載の糖鎖アレイ用基材
（１３）前記基材の材質がプラスチックである（１１）または（１２）記載の糖鎖アレイ用基材
（１４）前記プラスチックが飽和環状ポリオレフィンまたはポリスチレンを含むものである（１１）〜（１３）いずれか記載の糖鎖アレイ用基材
（１５）前記糖類が糖、単糖、２糖以上の糖鎖、糖アミノ酸、糖ペプチド、糖タンパク質、糖脂質、グリコサミノグリカン、プロテオグリカン、グリコシルホスファチジルイノシトール、ペプチドグリカン、リポ多糖、又はそれらの誘導体、およびこれらを有する生体由来物質から選ばれる少なくとも一つを固定化されていることを特徴とする（１）〜（１４）いずれか記載の糖類捕捉用高分子化合物および糖鎖アレイ。
（１６）（１５）に記載の前記グリコサミノグリカンまたはプロテオグリカンが、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、ケラタン硫酸、ヘパリン、ヘパラン硫酸、ヒアルロン酸、又はそれらの誘導体、およびこれらを有する生体由来物質から選ばれる少なくとも一つを固定化されている糖類捕捉用高分子化合物および糖鎖アレイ。
（１７）（１５）に記載の前記前記糖類が、下表のリスト中の糖鎖、又はそれらの誘導体、及びこれらを有する生体由来物質から選ばれる少なくとも一つを固定化させてなる糖類捕捉用高分子化合物および糖鎖アレイ。
表１
【発明の効果】
【０００８】
本発明の高分子化合物を用いれば、吸着防止剤をコーティングすることなく、検出対象物の非特異的な吸着・結合を抑制し固定化することができ、糖、糖鎖、糖ペプチド、糖タンパク、糖脂質またはこれらを有する生理活性物質を固定したバイオアッセイ用の糖鎖アレイを簡便に作製することが可能となる。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
本発明の高分子化合物は、少なくとも糖類を捕捉するための一級アミノ基を有するユニット、親水性を保持するためのユニットおよび疎水性基を有するユニットからなる高分子化合物である。この高分子化合物は、生理活性物質を固定化する性質と、検出対象物の基材への物理的吸着（非特異敵吸着）を抑制する性質を有する。すなわち、一級アミノ基が糖、糖鎖、糖ペプチド、糖脂質またはこれらを有する生理活性物質を固定する役割を果たし、親水性を保持するためのユニットが検出対象物への基材への物理的吸着（非特異吸着）を抑制する性質を併せ持つ。また、疎水性のユニットは、該高分子化合物のプラスチック基材やガラス基材への吸着に関与している。
【００１０】
本発明の高分子化合物に含まれる親水性のユニットはホスホリルコリン基に代表されるもので、特に構造を限定するものではないが、下記一般式〔１〕のユニットは、構成単位の左部の構成単位で示されように、（メタ）アクリル残基とホスホリルコリン基が炭素数１〜１０のアルキレンオキシ基Ｘの連鎖を介して結合した構造であることが最も好ましい。中でもＸはエチレンオキシ基であることが最も最も好ましい。式中のアルキレンオキシ基の繰り返し数は１〜２０の整数であり、繰り返し数２以上２０以下の場合は、繰り返されるアルキレンオキシ基の炭素数は同一であっても、異なっていてもよい。ｌは本来自然数であるが、各構成成分の組成割合として表記される場合がある。
【００１１】
【化１】
【００１２】
本発明の高分子化合物に含まれるホスホリルコリン基を有するユニットの組成割合は（ｌ，ｍ，ｎの和に対するｌの比率）は、高分子の全ユニットに対して、５〜９８ｍｏｌ％が好ましくより好ましくは１０〜８０ｍｏｌ％、最も好ましくは、１０〜８０％である。組成比が下限値を下回ると親水性が弱くなり非特異吸着が多くなる。一方、上限値を上回ると水溶性が高まり、アッセイ中に高分子化合物が溶出してしまう可能性がある。
【００１３】
本発明の高分子化合物に含まれる疎水性基を有するユニットの組成割合は（ｌ，ｍ，ｎの和に対するｍの比率）は、高分子の全ユニットに対して、１０〜９０ｍｏｌ％が好ましくより好ましくは１０〜８０ｍｏｌ％、最も好ましくは、２０〜８０％である。上限値を上回ると非特異吸着が増加する恐れが出てくる。
【００１４】
本発明の高分子化合物に含まれる一級アミノ基を有するユニットは、特に構造を限定されるものではないが、前記一般式〔１〕の構成単位の右部の構成単位で表されるように、（メタ）アクリル残基とオキシルアミノ残基を含むスペーサーＹを解した構造であることが好ましい。オキシルアミノ基の場合、Ｚは酸素原子を、ヒドラジド基の場合、ＺはＮＨを示す。ｎは本来自然数であるが、各成分の組成割合として標記される場合がある。アルキレングリコール残基を含むスペーサーＹの構造は、特に制限されるものではないが、下記一般式〔２〕または〔３〕であることがこのましく、より好ましくは〔２〕である。
【００１５】
【化２】
【００１６】
【化３】
【００１７】
各成分の組成割合は（ｌ，ｍ，ｎの和に対するｎの比率）は、高分子の全ユニットに対して、１〜９４ｍｏｌ％が好ましくより好ましくは２〜９０ｍｏｌ％、最も好ましくは、２０〜４０％である。組成値が下限地を下回ると糖、糖鎖、および／またはこれらを有する生理活性物質を十分量固定化できなくなる。また、上限値を上回ると非特異吸着が増加する。
【００１８】
本発明の高分子化合物の合成方法は、特に限定されるものではないが、合成の容易さから、少なくともホスホリルコリン基を有するモノマー、疎水性基を有するモノマー、一級アミノ基を予め保護基にて保護したモノマーをラジカル共重合する工程、該工程により得られた高分子化合物から保護基を除去する工程、を含む製造方法が好ましい。あるいは、少なくともホスホリルコリン基を有するモノマー、疎水性基を有するモノマー、および一級アミノ基を導入しうる官能基を有するモノマーをラジカル共重合する工程、該工程により得られた高分子化合物に一級アミノ基を導入する工程、を含む製造方法が好ましい。
【００１９】
ホスホリルコリン基を有する単量体としては、特に構造を限定しないが、例えば２−（メタ）アクリロイルオキシエチルホスホリルコリン、２−（メタ）アクリロイルオキシエトキシエチルホスホリルコリン、６−（メタ）アクリロイルオキシヘキシルホスホリルコリン、１０−（メタ）アクリロイルオキシエトキシノニルホスホリルコリン、２−（メタ）アクリロイルオキシプロピルホスホリルコリン等を挙げられるが、入手性から２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンが好ましい。
【００２０】
疎水性基を有するモノマーの具体的な例としては、ｎ−ブチル（メタ）アクリレート、i s o−ブチル（メタ）アクリレート、s e c−ブチル（メタ）アクリレート、t−ブチル（メタ）アクリレート、ｎ−ネオペンチル（メタ）アクリレート、i s o−ネオペンチル（メタ）アクリレート、s e c−ネオペンチル（メタ）アクリレート、ネオペンチル（メタ）アクリレート、シクロヘキシル（メタ）アクリレート、ｎ−ヘキシル（メタ）アクリレート、i s o−ヘキシル（メタ）アクリレート、ヘプチル（メタ）アクリレート、ｎ−オクチル（メタ）アクリレート、i s o−オクチル（メタ）アクリレート、２−エチルヘキシル（メタ）アクリレート、ｎ−ノニル（メタ）アクリレート、i s o−ノニル（メタ）アクリレート、ｎ−デシル（メタ）アクリレート、is o−デシル（メタ）アクリレート、ｎ−ドデシル（メタ）アクリレート、i s o−ドデシル（メタ）アクリレート、ｎ−トリデシル（メタ） アクリレート、i s o−トリデシル（メタ）アクリレート、ｎ−テトラデシル（メタ） アクリレート、i s o−テトラデシル（メタ）アクリレート、ｎ−ペンタデシル（メタ）アクリレート、i s o−ペンタデシル（メタ）アクリレート、ｎ−ヘキサデシル（メタ）アクリレート、i s o−ヘキサデシル（メタ）アクリレート、ｎ−オクタデシル（メタ）アクリレート、i s o−オクタデシル（メタ）アクリレート、イソボニル（ メタ） アクリレートなどが挙げられる。これらのなかで最も好ましいのが、シクロヘキシル（メタ）アクリレート、ｎ―ブチルメタクリレート、ｎ−ドデシルメタクリレート、ｎ−オクチルメタクリレートである。
【００２１】
一級アミノ基を予め保護基にて保護したモノマーは、特に構造を限定しないが、下記一般式［ ４ ］ （ 式中、Ｒ ３ は水素原子またはメチル基、Ｙ はアルキレングリコール残基を含むスペーサー、Ｚ は酸素原子またはＮ Ｈ 、Ｗ は保護基を示す。） で表されるように、（ メタ） アクリル基と、オキシルアミノ基またはヒドラジド基が、アルキレングリコール残基を含むスペーサーＹ を介した構造であることが好ましい。
【００２２】
【化４】
【００２３】
保護基Ｗ としてはアミノ基を保護基できるものであれば何ら制限を受けるものではなく、任意に用いることができる。なかでもｔ―ブトキシカルボニル基（Ｂｏｃ基）やベンジロキシカルボニル基（Ｚ基、Ｃｂｚ基） 、９−フルオレニルメトキシカルボニル基（Ｆｍｏｃ基） などが好適に用いられる。
【００２４】
具体的なモノマーの例としては、下記式で表されるようなものである。
【００２５】
【化５】
【００２６】
脱保護化は、トリフルオロ酢酸や塩酸、無水フッ化水素を用いれば、一般的な条件で行うことができる。
【００２７】
一方、高分子化合物を重合した後に一級アミノ基を導入する方法としては、何ら制限を受けるものではないが、少なくともホスホリルコリン基を有するモノマー、疎水性基を有するモノマー、およびアルコキシ基を有するモノマーをラジカル共重合した後に、該高分子化合物に導入されたアルコキシ基とヒドラジンを反応させて、ヒドラジド基を生成する方法が簡便で好ましい。アルコキシ基としては、メトキシ基、エトキシ基、プロポキシ基、ｔ−ブトキシ基等が好適である。
【００２８】
具体的なアルコキシ基を有するモノマーの例としては、下記式で表されるようなものである。
【００２９】
【化６】
【００３０】
本発明の高分子化合物の合成溶媒としては、それぞれの単量体が溶解するものであればよく、例えば、メタノール、エタノール、イソプロパノール、ｎ−ブタノール、ｔ−ブチルアルコール、ｎ−ペンタノール等アルコール類、ベンゼン、トルエン、テトラヒドロフラン、ジオキサン、ジクロロメタン、クロロホルム、シクロヘキサノン、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、酢酸メチル、酢酸エチル、酢酸ブチル、メチルエチルケトン、メチルブチルケトン、エチレングリコールモノエチルエーテル、エチレングリコールモノメチルエーテル、エチレングリコールモノブチルエーテル等を挙げることができる。これらの溶媒は、単独または２ 種以上の組み合わせで用いられる。
【００３１】
重合開始剤としては通常のラジカル開始剤ならいずれでもよく、例えば、２，２ ’−アゾビスイソブチルニトリル（ 以下「ＡＩＢＮ」という） 、１，１’−アゾビス（シクロヘキサン−１−カルボニトリル） 等のアゾ化合物、過酸化ベンゾイル、過酸化ラウリル等の有機過酸化物等を挙げることができる。
【００３２】
本発明の高分子化合物の分子量は、高分子化合物と未反応の単量体との分離精製が容易になることから、数平均分子量は５０００以上が好ましく、１００００以上がより好ましい。
【００３３】
脱保護は前述のトリフルオロ酢酸や塩酸、無水フッ化水素を用いれば、一般的な条件で行うことができるが、脱保護の時期に関しては、以下の通りである。
通常は重合が完了し、高分子化合物が作製できた段階で行うことが一般的であり、本発明の高分子化合物を得るには、重合終了後に脱保護を行いうことで該高分子化合物を得ることができる。
【００３４】
一方、本発明においては、基材表面に該高分子化合物を被覆することにより生理活性物質の非特異的吸着を抑制する性質、及び生理活性物質を固定化する性質を容易に付与することが可能であることを示している。
この場合、脱保護を行った一級アミノ基を持つ高分子化合物を被覆することも可能であるが、反応性の高い一級アミノ基を持つ高分子材料を溶液にして皮膜することは、場合によっては作業中に一級アミノ基が反応して不活化することも考えられる。
従って、脱保護する直前で高分子化合物を精製し、基材表面を皮膜して後に、脱保護の反応を行い、基材表面上に一級アミノ基が存在する状態を形成することが望ましい。
【００３５】
基材表面への高分子化合物の被覆は、例えば有機溶剤に高分子化合物を０．０５〜５０重量％濃度になるように溶解した高分子溶液を調製し、浸漬、吹きつけ等の公知の方法で基材表面に塗布した後、室温下ないしは加温下にて乾燥させることにより行われる。
【００３６】
有機溶剤としてはエタノール、メタノール、イソプロパノール、ｎ−ブタノール、ｔ−ブチルアルコール、ｎ−ペンタノール、シクロヘキサノール等アルコール類、ベンゼン、トルエン、テトラヒドロフラン、ジオキサン、ジクロロメタン、クロロホルム、アセトン、酢酸メチル、酢酸エチル、酢酸ブチル、メチルエチルケトン、メチルブチルケトン、エチレングリコールモノエチルエーテル、エチレングリコールモノメチルエーテル、エチレングリコールモノブチルエーテル、シクロヘキサノン等を挙げることができる。これらの溶媒は、単独または２ 種以上の組み合わせで用いられる。中でも、エタノール、メタノール、イソプロパノール、ｎ−ブタノール、ｔ−ブチルアルコール、ｎ−ペンタノールシクロヘキサノール等アルコール類がプラスチック基材を変性させず、乾燥させやすいため好ましい。
【００３７】
本発明に用いる基材としては、スライド形状基板、９ ６ 穴プレート、容器、マイクロフルイディスク基板が好ましい。例えばプラスチック製基板、ガラス製基板、金属蒸着膜を有する基板などがあげられる。プラスチック製基板の具体例としては、ポリスチレン、環状ポリオレフィンポリマー、シクロオレフィンポリマー、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリサルフォン、ポリイミド、ポリカーボネート、ポリメチルメタクリレートを素材とした基板などがあげられる。
【００３８】
特に、蛍光観察に用いる基材としては、環状ポリオレフィンポリマー、シクロオレフィンポリマーが有用である。前記基材を用いる場合においては、前記高分子化合物の疎水基が、シクロヘキシルキ基であると、基材との相互作用が良好で、同じ組成比の高分子材料を他の基材（例えばポリスチレンやガラス基材）に塗布した場合に比べ、吸着量が高くバックグランド値が低い良好な結果となる。
【００３９】
また、環状ポリオレフィンポリマーに、前記高分子物資を塗布する場合、アミノオキシモノマー１００ｍｏｌ％の高分子化合物に関しては、塗布振ることができない。一方、ポリスチレンポリマーにはと不可能であるが、夾雑物の非特異的吸着は抑制されず汎用性に乏しい。
【００４０】
前記高分子化合物を塗布した基材は単糖、２糖以上の糖鎖、糖アミノ酸、糖ペプチド、糖タンパク質、糖脂質、グリコサミノグリカン、プロテオグリカン、グリコシルホスファチジルイノシトール、ペプチドグリカン、リポ多糖、又はそれらの誘導体を固定化することができ、バイオアッセイ用途に好適に用いることができる。生理活性物質としては、糖タンパク質、糖脂質、糖鎖遺伝子などが上げられる。これらの生理活性物質の基材への固定化方法としては、スポッターを使用して生理活性物質が溶解した溶液を点着する方法、生理活性物質が溶解した溶液を容器などに分注して固定化する方法などがある。
【００４１】
単糖、２糖以上の糖鎖、糖アミノ酸、糖ペプチド、糖タンパク質、糖脂質、グリコサミノグリカン、プロテオグリカン、グリコシルホスファチジルイノシトール、ペプチドグリカン、リポ多糖、又はそれらの誘導体を前記の基板表面に固定化するためには、分子中の糖鎖末端部分に還元糖部分を作製する必要がある。使用する酸化剤 としては、特に限定されないが、過ヨウ素酸を使用する。これらの濃度は、０．０４〜０．１６Ｍである。また、該酸化反応の緩衝液としては、通常、重炭酸ナトリウム溶液（ｐＨ８．１）を使用する。このようにして酸化された生理活性物質のアルデヒド基と基板上の一級アミノ基とを反応させ、シッフ塩基を生成することにより、化学的に固定化することが出来る。
【００４２】
また、糖を還元するのではなく結合物質の糖鎖でない部分、すなわち、ペプチド、タンパク質、脂質部分にケトン基を導入して、それを結合点として前記の方法で固定化することも可能である。
結合物質のペプチド部分にケトン基を導入する方法としては、・・・がある。
結合物質のタンパク質部分にケトン基を導入する方法は、前記ペプチド部にケトン基を導入するのと同じ方法を用いることが可能である。
【００４３】
結合物質の脂質部分にケトン基を導入する方法としては、オゾン分解法がある。
具体的には２００μＭの糖脂質のクロロホルム−メタノール（１：１（ｖ／ｖ））溶液２００μＬにオゾンガスを３０分間導入しバブリングする。この後、ガスを窒素ガスに換えて溶存オゾンを除去。１μＬのトリフェニルホスフィン（１Ｍトルエン溶液）でオゾン分解反応を停止。反応溶液を蒸発させた後、ヘキサンを加えて攪拌し糖脂質のオゾン分解生成物をえる。（反応式１）
〔反応式１〕
【００４４】
生理活性物質を溶解する溶液としては各種緩衝材が好適に用いられる。特に限定されないが、たとえば炭酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、リン酸カリウム、リン酸水素二カリウム、トリス塩酸緩衝剤、トリス酢酸緩衝剤、ＰＢＳ緩衝剤、クエン酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、ＨＥＰＥＳ（Ｎ−２−ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｙｌｐｉｐｅｒａｚｉｎe−Ｎ’−ｅｔｈａｎｅｓｕｌｐｈｏｎｉｃ ａｃｉｄ）緩衝剤、ＭＯＰＳ（３−（Ｎ−ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏ）ｐｒｏｐａｎｅｓｕｌｐｈｏｎｉｃａｃｉｄ） 緩衝剤などが用いられる。
【００４５】
生理活性物質を溶解する溶液のｐＨとしては、糖又は糖鎖を溶解する場合はｐＨが２〜８であることが好ましい。糖タンパク質を溶解する場合はｐＨが４〜９であることが好ましい。糖核酸を溶解する場合はｐＨが２〜８であることが好ましい。糖脂質を溶解する場合はｐＨ２〜８ であることが好ましい。
【００４６】
生理活性物質の溶液中の濃度としては特に限定されないが、０．０００１ｍｇ／ｍｌから１０ｍｇ／ｍｌであることが好ましい。
【００４７】
生理活性物質の溶液を固定化する温度としては０℃から１００℃が好ましい。
【００４８】
固定化する糖鎖には、前記のように、単糖、２糖以上の糖鎖、糖アミノ酸、糖ペプチド、糖タンパク質、糖脂質、グリコサミノグリカン、プロテオグリカン、グリコシルホスファチジルイノシトール、ペプチドグリカン、リポ多糖、又はそれらの誘導体を用いることができる。
【００４９】
特に、前記グリコサミノグリカンまたはプロテオグリカンが、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、ケラタン硫酸、ヘパリン、ヘパラン硫酸、ヒアルロン酸、又はそれらの誘導体、およびこれらを有する生体由来物質が、細胞増殖因子との相互作用による因子の安定化や、機能亢進に重要な役割を果たしていることから、これらの物質を固定化したものは、生体内機能の解析や、臨床検査において重要なものである。
【００５０】
また、以下に示す糖鎖構造物は、生体内機能や疾患に関係の深い物質であり、生体内機能の解析や、疾患の研究、臨床検査において重要な物質である。生体内機能と市は、例えば、受精や、発生に関連しており、疾患関係では、癌、感染症に関連しているがこれらに限定されるものではない。以下の糖鎖から選ばれる少なくとも一つを固定化させてなる糖類捕捉用高分子化合物および糖鎖アレイは、生体内機能や疾患の機能解析、検査において有用なツールとなる可能性を有する。
【００５１】
表１
＜実施形態＞
【実施例】
【００５２】
以下、本発明を実施例および比較例に基づいて詳細に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
【００５３】
＜実施例１＞
アミノオキシ基含有量の比較(９６ウェルプレート)
（糖鎖捕捉基材の作製）
糖鎖捕捉高分子材料を表面に形成させる基材として、９６ウェルプレートを使用した。該９６ウェルプレートは住友ベークライトにおいて環状ポリオレフィン樹脂で成形したものを使用した。
糖鎖捕捉高分子化合物として２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン−ブチルメタクリレート−N-(2-(2-(2-(t-ブトキシカルボニルアミノオキシ−アセチルアミノ)エトキシ)エトキシ)エチル)-メタクリルアミド共重合体を用い、該高分子化合物の１．０重量％エタノール溶液１５０ｕＬを９６ウェルプレートの各ウェルに分注して３０分静置した後に溶液を抜き取り乾燥、溶媒を蒸散させて基材表面に塗布した。
用いた高分子化合物はアミノオキシ基の含有量が１４、１６、２０％の３種類を合成して用いた。
乾燥後、２Ｍ ＨＣｌを分注し、３７℃で２時間処理してＢｏｃ基を脱保護し糖鎖捕捉高分子化合物を表面に持つ９６ウェルプレートを作製した。
【００５４】
（糖鎖固定化）
二糖のラクトース(和光純薬、１２４−０００９２)を３００ｍＭの酢酸ナトリウムバッファー(ｐＨ４．０)で１ｍｇ／ｍＬに調製、ラクトース溶液を作製。
作製したラクトース溶液を、前記の糖鎖捕捉用９６ウェルプレートに２００μＬ分注し、６５℃で１６時間反応させた。反応後、溶媒で未反応ラクトースを除去。
【００５５】
（固定糖鎖の検出）
ラクトースと特異的に反応する ＲＣＡ１２０レクチンをビオチン標識したもの（Ｂｉｏｔｉｎ標識ＲＣＡ１２０レクチン（Ｖｅｃｔｏｒ社製、Ｂ−１０８５））を下記の溶媒で０．５μｇ／ｍＬに調製。
溶媒：５０ｍＭ Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ(ｐＨ７．５)、１００ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＣａＣｌ２、ＭｎＣｌ２、ＭｇＣｌ２、０．０５%Ｔｗｅｅｎ２０。
（試薬はすべて和光純薬製）
各ウェルに１００μＬづつ分注して室温で２時間反応。
反応後、下記洗浄液で３回、ウェル内を洗浄した。
洗浄液：５０ｍＭ Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ(ｐＨ７．５)、１００ｍＭ ＮａＣｌ、
１ｍＭ ＣａＣｌ２、ＭｎＣｌ２、ＭｇＣｌ２、
０．０５％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００（試薬はすべて和光純薬製）
ペルオキシダーゼ標識アビジン(ＭＰ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ、１９１３７０)を下記の溶媒で０．５ｕｇ／ｍＬに調製。
溶媒：５０ｍＭ Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ(ｐＨ７．５)、１００ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＣａＣｌ２、ＭｎＣｌ２、ＭｇＣｌ２、０．０５%Ｔｗｅｅｎ２０（試薬はすべて和光純薬製）。
ペルオキシダーゼ溶液１００μＬを、前記のラクトースを固定化した９６ウェルプレートに分注、室温で１時間反応。反応終了後、洗浄液で各ウェルを３回洗浄。
固相化されたぺルオキシダーゼ量を、ペルオキシダーゼ用発色キット（住友ベークライト製、ＭＬ−１１２０Ｔ）を用いて１５分間発色、マイクロプレートリーダー（ＴＥＣＡＮ社製Ｉｎｆｉｎｉｔ２００）で測定波長４５０ｎｍの吸光度を測定した。
結果を下表に示す。
表２
【００５６】
＜実施例２＞疎水性残基の構造比較(バックグランド比較、９６ウェルプレート)
実施例１で用いた環状ポリオレフィン製９６ウェルマイクロプレート（住友ベークライト製）を使用。
実施例１の糖鎖捕捉高分子化合物のブチルメタクリレートを、シクロヘキシルメタクリレートまたはｎ−ヘキシルメタクリレートに変えて合成した高分子化合物を実施例１同様の方法で塗布、Ｂｏｃ基を脱保護した。
Ｂｉｏｔｉｎ標識ＲＣＡ１２０レクチンを反応、さらにペルオキシダーゼ標識アビジンを反応させた後、ペルオキダーゼ発色キットで発色後、吸光度を測定した。
結果を下表に示す。
表３
直鎖アルキル基であるブチル基、ｎ−ヘキシル基においても低バックグランド値であるが、環状アルキル基であるシクロヘキシル基では更に低いバックグランド値を得た。
【００５７】
＜実施例３＞疎水性残基の構造比較(シグナル値比較, ９６ウェルプレート)
実施例１、２で用いた環状ポリオレフィン製９６ウェルマイクロプレート（住友ベークライト製）を使用。
実施例１の糖鎖捕捉高分子化合物のブチルメタクリレートを、シクロヘキシルメタクリレートに変えて合成した高分子化合物を実施例１同様の方法で塗布、Ｂｏｃ基を脱保護した。
（糖鎖固定化）
マンノトリオース（Ｄｅｘｔｒａ、Ｍ３３６）を下記の溶媒を用いて１０μｇ／ｍＬに調製。９６ウェルプレートの各ウェルに１００μＬづつ分注し、８０℃、１時間反応させた。
溶媒：２％ＡｃＯＨ／ＣＨ３ＣＮ：水＝７５：２５
反応終了後、洗浄し未反応のマンノトリオースを除去した。
（固定糖鎖の検出）
マンノトリオースと特異的に反応する Ｂｉｏｔｉｎ標識ＣｏｎＡレクチン(ＳＩＧＭＡ社、C2272)を下記の溶媒で２５０ｎｇ／ｍＬに調製
溶媒：５０ｍＭ Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ(ｐＨ７．５)、１００ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＣａＣｌ２、ＭｎＣｌ２、ＭｇＣｌ２、０．０５%Ｔｗｅｅｎ２０。
各ウェルに１００μＬづつ分注して室温で２時間反応。
反応後、下記洗浄液で３回、ウェル内を洗浄した。
洗浄液：５０ｍＭ Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ(ｐＨ７．５)、１００ｍＭ ＮａＣｌ、
１ｍＭ ＣａＣｌ２、ＭｎＣｌ２、ＭｇＣｌ２、
０５％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００
ペルオキシダーゼ標識アビジン(ＭＰ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ、１９１３７０)を下記の溶媒で０．５ｕｇ／ｍＬに調製。
溶媒：５０ｍＭ Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ(ｐＨ７．５)、１００ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＣａＣｌ２、ＭｎＣｌ２、ＭｇＣｌ２、０．０５%Ｔｗｅｅｎ２０。
ペルオキシダーゼ溶液１００μＬを、前記のラクトースを固定化した９６ウェルプレートに分注、室温で１時間反応。反応終了後、洗浄液で各ウェルを３回洗浄。
固相化されたぺルオキシダーゼ量を、ＴＭＢ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、１７２−１０６７）で１５分発色、４５０ｎｍで吸光度測定した。
結果を下表に示す。
表４
環状アルキル基であるシクロヘキシル基において高い吸光度値を得ることができた。
【００５８】
＜実施例４＞ 糖鎖固定マイクロアレイ
(糖鎖捕捉基材の作製)
マイクロアレイの作製には住友ベークライト製、環状ポリオレフィン樹脂製のスライドガラス形状のプラスチックス基板を使用した。
オキシエチルホスホリルコリン−シクロヘキシルメタクリレート−Ｎ−(２−(２−(２−（ｔ−ブトキシカルボニルアミノオキシアセチルアミノ)エトキシ)エトキシ)エチル)−メタクリルアミド共重合体の１．０重量％エタノール溶液にスライドを浸漬して高分子化合物を塗布した。
塗布後、２Ｍ ＨＣｌで３７℃、２時間処理し、Ｂｏｃ基を脱保護した。
【００５９】
（糖鎖の固定化）
８種類のＮ結合型糖鎖、Ｄｅｘｔｒａ、ＭＣ１１３１、Ｃ０９２０、Ｃ１０２６、ＳＣ１１２０、Ｃ０８４０、Ｃ１１２４、Ｃ１２２４、ＰＲＯＺＹＭＥ、ＧＫＣ−３３５３００（Ｄｅｘｔｒａ社製）を下記溶液で１００ｕｇ／ｍＬに調製し、基板にスポッティング、８０℃、１時間反応させて基板に糖鎖を固定化。
溶液：１００ｍＭ ＮａＯＡｃ ｂｕｆｆｅｒ(ｐＨ５．０)＋０．０１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００（和光純薬、Ａ１６０４６）、０．０１％ＰＶＡ（重合度＝１５００）
【００６０】
（固定糖鎖の検出）
Ｃ１０２６と特異的に結合するレクチンであるＡＡＬレクチンのビオチン標識体であるＢｉｏｔｉｎ標識ＡＡＬレクチン(生化学バイオビジネス社、３００４０６)を下記溶液で１００ｕｇ／ｍＬに調製。
溶液：５０ｍＭ Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ(ｐＨ７．５)、１００ｍＭ ＮａＣｌ、
１ｍＭ ＣａＣｌ２、ＭｎＣｌ２、ＭｇＣｌ２、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０
基板上に溶液を反応させ、室温で２時間反応した。
反応後、前記洗浄剤で洗浄。
Ｃｙ３−Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ（ＧＥヘルスケア、ＰＡ４３００１）を下記溶液で２ｕｇ／ｍＬに調製したものを基板状に展開し、室温で１時間反応。
溶液：５０ｍＭ Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ(ｐＨ７．５)、１００ｍＭ ＮａＣｌ、
１ｍＭ ＣａＣｌ２、ＭｎＣｌ２、ＭｇＣｌ２、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０
反応後、前記洗浄液で洗浄。測定はＸ−１００マイクロアレイリーダー、ＳｃａｎＡｒｒａｙＬｉｔｅ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ製）を用いてＣｙ３の蛍光強度を測定。（Ｌａｓｅｒ＝９０、ＰＭＴ＝６０）
結果を下表に示す。
表５
標識糖鎖が固定化できていることを確認した。
【００６１】
＜実施例５＞ 酸性多糖の固定化（マイクロアレイ）
(糖鎖捕捉基材の作製)
マイクロアレイの作製には住友ベークライト製、環状ポリオレフィン樹脂製のスライドガラス形状のプラスチックス基板を使用した。
【００６２】
２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン−シクロヘキシルメタクリレート−N-（2-（2-（2-（t-ブトキシカルボニルアミノオキシアセチルアミノ）エトキシ）エトキシ）エチル）-メタクリルアミド共重合体の１．０重量％エタノール溶液にスライドを浸漬して高分子化合物を塗布した。
塗布後、２Ｍ ＨＣｌで３７℃、２時間処理し、Ｂｏｃ基を脱保護した。
【００６３】
（糖鎖の固定化）
ヘパリン(Ｉｄｕｒｏｎ社、ＨＥＰ００１）とコンドロイチン硫酸(生化学バイオビジネス社、４００６５０)を下記溶液で１００ｕｇ／ｍＬに調製し、基板にスポッティングし、８０℃、１時間反応させて基板に酸性糖鎖を固定化した。
溶液：１００ｍＭ ＮａＯＡｃ ｂｕｆｆｅｒ(ｐＨ５．０)＋界面活性剤（０．０１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、０．０１％ＰＶＡ（重合度＝１５００））
固定化後、純水で洗浄し、未反応の酸性多糖を除去した。
【００６４】
（固定糖鎖の検出）
ヘパリンと結合する事が報告されているＦＧＦ２（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ社、１００−１８Ｂ）を下記の溶媒で１００ｎｇ／ｍＬに調製した。
溶媒：５０ｍＭ Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ(ｐＨ７．５)、１００ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＣａＣｌ２、ＭｎＣｌ２、ＭｇＣｌ２、０．０５%Ｔｗｅｅｎ２０。
【００６５】
基板上に溶液を反応させ、室温で２時間反応した。
反応後、洗浄液で基板を洗浄し、未反応のＦＧＦ２を除去した。
洗浄液：５０ｍＭ Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ(ｐＨ７．５)、１００ｍＭ ＮａＣｌ、
１ｍＭ ＣａＣｌ２、ＭｎＣｌ２、ＭｇＣｌ２、
０．０５％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００
【００６６】
抗ＦＧＦ２抗体(Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ社、５００−Ｍ３８)を下記の溶媒で２μｇ／ｍＬに調製した。
溶媒：５０ｍＭ Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ(ｐＨ７．５)、１００ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＣａＣｌ２、ＭｎＣｌ２、ＭｇＣｌ２、０．０５%Ｔｗｅｅｎ２０。
基板上に溶液を反応させ、室温で１時間反応した。
反応後、洗浄液で基板を洗浄し、未反応の抗体を除去した。
【００６７】
Ｃｙ３標識された抗マウスＩｇＧ抗体(ＧＥヘルスケア、ＰＡ４３００２)を下記溶液で２ｕｇ／ｍＬに調製した。
溶液：５０ｍＭ Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ(ｐＨ７．５)、１００ｍＭ ＮａＣｌ、
１ｍＭ ＣａＣｌ２、ＭｎＣｌ２、ＭｇＣｌ２、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０
【００６８】
基板上に溶液を反応させ、室温で１時間反応した。
反応後、洗浄液で基板を洗浄し、未反応の抗体を除去した。
【００６９】
Ｘ−１００マイクロアレイリーダー、ＳｃａｎＡｒｒａｙＬｉｔｅ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ製）を用いてＣｙ３の蛍光強度を測定した。（Ｌａｓｅｒ＝９０、ＰＭＴ＝６０）
【００７０】
結果を下表に示す。
表６ 酸性多糖固定化基材測定結果
【００７１】
＜比較例１＞
（固定化基材の作製）
実施例１、２で用いた環状ポリオレフィン製９６ウェルマイクロプレート（住友ベークライト製）を使用。
２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン−ブチルメタクリレート−Ｎ-
（２−（２−（２−(ｔ−ブトキシカルボニルアミノオキシアセチルアミノ)エトキシ）エトキシ）エチル−メタクリルアミド共重合体の１．０重量％エタノール溶液１５０ｕＬを一部のウェルに分注して基材表面にポリマーコート。一部ポリマーコートしていないウェルを１％ＢＳＡ／ＰＢＳでブロッキング、室温で１時間ブロッキング反応させた。
【００７２】
（レクチンの固定化）
実施例１で用いたＢｉｏｔｉｎ標識ＲＣＡ１２０レクチン(Ｖｅｃｔｏｒ社、Ｂ−１０８５)をＰＢＳで５ｕｇ／ｍＬに調製し、各ウェルに１００ｕＬ分注して室温で２時間反応させた。反応後、前記の洗浄液で３回洗浄した。
ペルオキシダーゼ標識アビジン(ＭＰ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ、１９１３７０)を下記の溶媒で０．５ｕｇ／ｍＬに調製。
溶媒：５０ｍＭ Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ(ｐＨ７．５)、１００ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＣａＣｌ２、ＭｎＣｌ２、ＭｇＣｌ２、０．０５%Ｔｗｅｅｎ２０。
ペルオキシダーゼ溶液１００μＬを、前記の９６ウェルプレートに分注、室温で１時間反応。反応終了後、洗浄液で各ウェルを３回洗浄。
固相化されたペルオキシダーゼ量を、ペルオキシダーゼ用発色キット（住友ベークライト製、ＭＬ−１１２０Ｔ）を用いて１５分間発色、測定波長４５０ｎｍで吸光度測定した。
結果を下表に示す。
表７
糖を固定化せず測定を実施し、本発明による高分子化合物存在下においてのみ非特異吸着が抑制できることが明らかとなった。
【００７３】
＜比較例２＞
実施例１、２で用いた環状ポリオレフィン製９６ウェルマイクロプレート（住友ベークライト製）を使用。
２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン−ブチルメタクリレート−Ｎ−（２−（２−（２−（ｔ−ブトキシカルボニルアミノオキシアセチルアミノ）エトキシ）エトキシ）エチル）−メタクリルアミド共重合体の１．０重量％エタノール溶液１５０ｕＬを一部のウェルに分注して基材表面にポリマーコートした。
【００７４】
（糖鎖固定化）
ラクトース(和光純薬、１２４−０００９２)を下記の溶媒を用いて１００μｇ／ｍＬに調製。９６ウェルプレートの各ウェルに１００μＬづつ分注し、８０℃、１時間反応させた。
溶媒：２％ＡｃＯＨ／ＣＨ３ＣＮ：水＝７５：２５
反応終了後、洗浄し未反応のラクトースを除去した。
【００７５】
（レクチンの固定化）
実施例１で用いたＢｉｏｔｉｎ標識ＲＣＡ１２０レクチン(Ｖｅｃｔｏｒ社、Ｂ−１０８５)をＰＢＳで５ｕｇ／ｍＬに調製し、各ウェルに１００ｕＬ分注して室温で２時間反応させた。反応後、前記の洗浄液で３回洗浄した。
ペルオキシダーゼ標識アビジン(ＭＰ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ、１９１３７０)を下記の溶媒で０．５ｕｇ／ｍＬに調製。
溶媒：５０ｍＭ Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ(ｐＨ７．５)、１００ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＣａＣｌ２、ＭｎＣｌ２、ＭｇＣｌ２、０．０５%Ｔｗｅｅｎ２０
ペルオキシダーゼ溶液１００μＬを、前記のラクトースを固定化した９６ウェルプレートに分注、室温で１時間反応。反応終了後、洗浄液で各ウェルを３回洗浄。
固相化されたペルオキシダーゼ量を、ペルオキシダーゼ用発色キット（住友ベークライト製、ＭＬ−１１２０Ｔ）を用いて１５分間発色、測定波長４５０ｎｍで吸光度測定した。
結果を下表に示す。
表８
表７との対比により、本発明による高分子化合物存在下においてのみ非特異吸着が抑制かつ糖鎖を捕捉し測定できることが明らかとなった。
【産業上の利用可能性】
【００７６】
本発明の用いることにより、吸着防止剤をコーティングすることなく、検出対象物質の非特異的な吸着・結合を抑制し、糖、糖鎖、糖ペプチド、糖タンパク、糖脂質またはこれらを有する生理活性物質を固定化できるバイオアッセイ用の高分子化合物及びこれを用いた各種糖鎖アレイ基材を提供することができる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
糖鎖アレイに用いる糖鎖捕捉用高分子化合物であって、下記一般式〔１〕で表されることを特徴とする糖類捕捉用高分子化合物。
【化１】
（式中Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３は水素原子またはメチル基を、Ｒ４は疎水性基を示す。Ｘは炭素数１〜１０のアルキレンオキシ基を示し、ｐは１〜２０の整数を示す。ｐが２以上２０以下の整数である場合、繰り返されるＸは、同一であっても、または異なっていてもよい。Ｙはアルキレングリコール残基を含むスペーサーであり、Ｚは酸素原子またはＮＨである。ｌ、ｍ、ｎは自然数である。）
【請求項２】
前記一般式〔１〕においてＹが下記一般式〔２〕又は〔３〕である請求項１記載の糖類捕捉用高分子化合物。
【化２】
(式中ｑ、ｒは１〜２０の整数)
【化３】
(式中ｑ、ｒは１〜２０の整数)
【請求項３】
前記一級アミノ基がオキシルアミノ基および／またはヒドラジド基である請求項１または２記載の糖類捕捉用高分子化合物。
【請求項４】
オキシルアミノ基および／またはヒドラジド基を有するユニットの含有量が高分子化合物の全ユニットの２０ｍｏｌ％以上、４０ｍｏｌ％以下である請求項３記載の糖鎖捕捉用高分子化合物。
【請求項５】
前記親水性を保持するためのユニットがホスホリルコリン基を含む請求項１〜４いずれか記載の糖類捕捉用高分子化合物。
【請求項６】
前記一般式〔１〕において、Ｘがエチレンオキシ基である請求項１〜５いずれか記載の糖類捕捉用高分子化合物
【請求項７】
高分子化合物の主鎖が（メタ）アクリル骨格である請求項１〜６いずれか記載の糖鎖捕捉用高分子化合物。
【請求項８】
前記疎水性基、Ｒ４が炭素数２〜１０のアルキル基である請求項１〜７いずれか記載の糖類捕捉用高分子化合物。
【請求項９】
前記疎水性基、Ｒ４が環状アルキル基であることを特徴とすることを特徴とする請求項１〜８いずれか記載の糖類捕捉用高分子化合物。
【請求項１０】
前記環状アルキル基がシクロヘキシル基であることを特徴とすることを特徴とする請求項１〜９いずれか記載の糖類捕捉用高分子化合物。
【請求項１１】
請求項１〜１０いずれか記載の糖鎖捕捉高分子化合物を基材の表面に形成した糖鎖アレイ用基材
【請求項１２】
請求項１〜１０いずれか記載の糖類捕捉用高分子化合物の製造方法であって、少なくとも、ホスホリルコリン基を有するモノマー、疎水性基を有するモノマー、および一級アミノ基をあらかじめ保護基にて保護したモノマーとをラジカル共重合する工程、該工程により得られた高分子化合物を基材表面に塗布する工程、前記保護具を除去する工程、を含む糖類捕捉用高分子化合物を基材の表面に形成した請求項１２記載の糖鎖アレイ用基材
【請求項１３】
前記基材の材質がプラスチックである請求項１１または１２記載の糖鎖アレイ用基材
【請求項１４】
前記プラスチックが飽和環状ポリオレフィンまたはポリスチレンを含むものである請求項１１〜１３いずれか記載の糖鎖アレイ用基材
【請求項１５】
前記糖類が糖、糖脂質、グリコサミノグリカン、プロテオグリカン、グリコシルホスファチジルイノシトール、ペプチドグリカン、リポ多糖、又はそれらの誘導体、およびこれらを有する生体由来物質から選ばれる少なくとも一つを固定化されていることを特徴とする請求項１〜１４いずれか記載の糖類捕捉用高分子化合物および糖鎖アレイ。
【請求項１６】
請求項１５に記載の前記グリコサミノグリカンまたはプロテオグリカンが、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、ケラタン硫酸、ヘパリン、ヘパラン硫酸、ヒアルロン酸、又はそれらの誘導体、およびこれらを有する生体由来物質から選ばれる少なくとも一つを固定化されている糖類捕捉用高分子化合物および糖鎖アレイ。
【請求項１７】
請求項１５に記載の前記前記糖類が、下表のリスト中の糖鎖、又はそれらの誘導体、及びこれらを有する生体由来物質から選ばれる少なくとも一つを固定化させてなる糖類捕捉用高分子化合物および糖鎖アレイ。
表１
【請求項１】
糖鎖アレイに用いる糖鎖捕捉用高分子化合物であって、下記一般式〔１〕で表されることを特徴とする糖類捕捉用高分子化合物。
【化１】
（式中Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３は水素原子またはメチル基を、Ｒ４は疎水性基を示す。Ｘは炭素数１〜１０のアルキレンオキシ基を示し、ｐは１〜２０の整数を示す。ｐが２以上２０以下の整数である場合、繰り返されるＸは、同一であっても、または異なっていてもよい。Ｙはアルキレングリコール残基を含むスペーサーであり、Ｚは酸素原子またはＮＨである。ｌ、ｍ、ｎは自然数である。）
【請求項２】
前記一般式〔１〕においてＹが下記一般式〔２〕又は〔３〕である請求項１記載の糖類捕捉用高分子化合物。
【化２】
(式中ｑ、ｒは１〜２０の整数)
【化３】
(式中ｑ、ｒは１〜２０の整数)
【請求項３】
前記一級アミノ基がオキシルアミノ基および／またはヒドラジド基である請求項１または２記載の糖類捕捉用高分子化合物。
【請求項４】
オキシルアミノ基および／またはヒドラジド基を有するユニットの含有量が高分子化合物の全ユニットの２０ｍｏｌ％以上、４０ｍｏｌ％以下である請求項３記載の糖鎖捕捉用高分子化合物。
【請求項５】
前記親水性を保持するためのユニットがホスホリルコリン基を含む請求項１〜４いずれか記載の糖類捕捉用高分子化合物。
【請求項６】
前記一般式〔１〕において、Ｘがエチレンオキシ基である請求項１〜５いずれか記載の糖類捕捉用高分子化合物
【請求項７】
高分子化合物の主鎖が（メタ）アクリル骨格である請求項１〜６いずれか記載の糖鎖捕捉用高分子化合物。
【請求項８】
前記疎水性基、Ｒ４が炭素数２〜１０のアルキル基である請求項１〜７いずれか記載の糖類捕捉用高分子化合物。
【請求項９】
前記疎水性基、Ｒ４が環状アルキル基であることを特徴とすることを特徴とする請求項１〜８いずれか記載の糖類捕捉用高分子化合物。
【請求項１０】
前記環状アルキル基がシクロヘキシル基であることを特徴とすることを特徴とする請求項１〜９いずれか記載の糖類捕捉用高分子化合物。
【請求項１１】
請求項１〜１０いずれか記載の糖鎖捕捉高分子化合物を基材の表面に形成した糖鎖アレイ用基材
【請求項１２】
請求項１〜１０いずれか記載の糖類捕捉用高分子化合物の製造方法であって、少なくとも、ホスホリルコリン基を有するモノマー、疎水性基を有するモノマー、および一級アミノ基をあらかじめ保護基にて保護したモノマーとをラジカル共重合する工程、該工程により得られた高分子化合物を基材表面に塗布する工程、前記保護具を除去する工程、を含む糖類捕捉用高分子化合物を基材の表面に形成した請求項１２記載の糖鎖アレイ用基材
【請求項１３】
前記基材の材質がプラスチックである請求項１１または１２記載の糖鎖アレイ用基材
【請求項１４】
前記プラスチックが飽和環状ポリオレフィンまたはポリスチレンを含むものである請求項１１〜１３いずれか記載の糖鎖アレイ用基材
【請求項１５】
前記糖類が糖、糖脂質、グリコサミノグリカン、プロテオグリカン、グリコシルホスファチジルイノシトール、ペプチドグリカン、リポ多糖、又はそれらの誘導体、およびこれらを有する生体由来物質から選ばれる少なくとも一つを固定化されていることを特徴とする請求項１〜１４いずれか記載の糖類捕捉用高分子化合物および糖鎖アレイ。
【請求項１６】
請求項１５に記載の前記グリコサミノグリカンまたはプロテオグリカンが、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、ケラタン硫酸、ヘパリン、ヘパラン硫酸、ヒアルロン酸、又はそれらの誘導体、およびこれらを有する生体由来物質から選ばれる少なくとも一つを固定化されている糖類捕捉用高分子化合物および糖鎖アレイ。
【請求項１７】
請求項１５に記載の前記前記糖類が、下表のリスト中の糖鎖、又はそれらの誘導体、及びこれらを有する生体由来物質から選ばれる少なくとも一つを固定化させてなる糖類捕捉用高分子化合物および糖鎖アレイ。
表１
【公開番号】特開２０１１−１９１２８６（Ｐ２０１１−１９１２８６Ａ）
【公開日】平成２３年９月２９日（２０１１．９．２９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−１７０２２８（Ｐ２０１０−１７０２２８）
【出願日】平成２２年７月２９日（２０１０．７．２９）
【出願人】（０００００２１４１）住友ベークライト株式会社 (2,927)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２３年９月２９日（２０１１．９．２９）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年７月２９日（２０１０．７．２９）
【出願人】（０００００２１４１）住友ベークライト株式会社 (2,927)
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]