糖鎖配列の同定方法
【課題】任意に設定した糖鎖長及び硫酸基位置のコンドロイチン（ＣＨ）及びコンドロイチン硫酸（ＣＳ）を質量分析に付した場合に得られる、ＭＳ2スペクトルにおけるフラグメントイオンのｍ／ｚ値を予測する方法を提供する。さらに、ＣＨ又はＣＳの糖鎖長及び硫酸基位置を、質量分析によって簡易に同定する方法を提供する。
【解決手段】ＣＨオリゴ糖、ＣＳＡオリゴ糖及びＣＳＣオリゴ糖について、各々のＭＳ2スペクトルにおいて出現するフラグメントイオンのｍ／ｚ値の規則性を見出し数式化する。さらに、前記数式に当てはめて予測した、糖鎖長及び硫酸基位置を設定したＣＨ又はＣＳのフラグメントイオンのｍ／ｚ値と、糖鎖長及び硫酸基位置が不明なＣＨ又はＣＳのＭＳ2スペクトルのｍ／ｚ値の実測値が実質的に一致したときに、前記任意に設定した糖鎖長及び硫酸基位置が、前記不明であったＣＨ又はＣＳの糖鎖長及び硫酸基位置であると同定する。
【解決手段】ＣＨオリゴ糖、ＣＳＡオリゴ糖及びＣＳＣオリゴ糖について、各々のＭＳ2スペクトルにおいて出現するフラグメントイオンのｍ／ｚ値の規則性を見出し数式化する。さらに、前記数式に当てはめて予測した、糖鎖長及び硫酸基位置を設定したＣＨ又はＣＳのフラグメントイオンのｍ／ｚ値と、糖鎖長及び硫酸基位置が不明なＣＨ又はＣＳのＭＳ2スペクトルのｍ／ｚ値の実測値が実質的に一致したときに、前記任意に設定した糖鎖長及び硫酸基位置が、前記不明であったＣＨ又はＣＳの糖鎖長及び硫酸基位置であると同定する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、任意に設定した糖鎖長及び硫酸基位置のコンドロイチン（ＣＨ）又はコンドロイチン硫酸（ＣＳ）を質量分析に付した場合に得られるＭＳ2スペクトルにおけるフラグメントイオンのｍ／ｚ値を予測する方法に関する。さらに本発明は、糖鎖長及び硫酸基位置が不明なＣＨ又はＣＳを質量分析に付して得られたＭＳ2スペクトルにおけるフラグメントイオンのｍ／ｚ値と、前記予測方法を利用して得られたｍ／ｚ値とを比較検討して、前記不明な糖鎖長及び硫酸基位置を同定する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
以下に本明細書等において使用する略語について説明する。
ＣＨ：コンドロイチン
ＣＳ：コンドロイチン硫酸
ＧＡＧ：グリコサミノグリカン
ＧＡＧ創薬：ＧＡＧを基点とした糖鎖創薬
ＭＳ：質量分析
ＭＳn：多段階質量分析
ＭＳ2：２段階質量分析
Ｈｅｐ：ヘパリン
ＨＳ：ヘパラン硫酸
ＧａｌＮＡｃ：Ｎ−アセチルガラクトサミン
ＧｌｃＡ：グルクロン酸
ＣＳＡ：コンドロイチン硫酸Ａ（ＧａｌＮＡｃのＣ−４位の水酸基が硫酸化されたもの（ＧａｌＮＡｃ４Ｓ））
ＣＳＣ：コンドロイチン硫酸Ｃ（ＧａｌＮＡｃのＣ−６位の水酸基が硫酸化されたもの（ＧａｌＮＡｃ６Ｓ））
ＥＳＩ−ＩＴ：エレクトロスプレーイオン化−イオントラップ型
ＣＩＤ：衝突誘起解離
【０００３】
糖鎖構造解析において、ここ数年間に多段階質量分析装置が高頻に使用されるようになってきた。糖鎖のなかで特に複雑な構造を呈するＧＡＧの研究シーンにおいても、１９９０年代後半から精力的にＭＳが使われるようになっている（非特許文献１）。
【０００４】
ＧＡＧの構造解析の難しさは、構造異性体（硫酸基位置異性体やウロン酸のエピマー）の存在により分子構造が無限に存在し得ることに起因する。ＧＡＧ創薬を実現するためには、無限に存在し得る異性体群を含んだ配列の中から生体機能を司るに必須な構造を解明するとともに、その分子構造情報をもとにして、当該機能を人為的に制御し得る配列を新たに設計していくことが必要になる。そして、そのＧＡＧ創薬の作業においては、一般的な低分子化合物やタンパク質を創薬候補化合物とする場合と比較して、遥かに高いウェートで構造解析技術が寄与することとなる（非特許文献２）。
【０００５】
ＭＳnによるＧＡＧの構造解析において特に着目されることの多い硫酸基位置異性体の識別は、これまでに短鎖オリゴ糖（ＧＡＧを脱離酵素によって分解して得られる不飽和型２糖）を対象に多く実施されてきた。例えばＣＳの２糖の解析例としては非特許文献３及び非特許文献４などが挙げられ、Ｈｅｐ／ＨＳの２糖の解析例としては非特許文献５などが挙げられる。また、ウロン酸エピマーの識別例としては非特許文献６が挙げられる。
【０００６】
一方、ＧＡＧの構造解析を目的にＭＳnを最大限に活用する試みはあるが、いまだ普
遍性の高い手法は開発されていないと言ってよい。これまでに、Ｈｅｐ／ＨＳオリゴ糖の分子構造をＭＳnによって解析するアルゴリズムが発表されているが（非特許文献７）、本法を用いてもウロン酸エピマーに関する構造情報は得ることができない。また、非特許文献８においてはケラタン硫酸の配列解析法が紹介されているが、ウロン酸を有するＧＡＧには適用できない方法論である。
【０００７】
ＧＡＧのなかでも特に、そのユニークな構造と生理活性から長年脚光を浴びているものとして、ＣＳが挙げられる。ＣＳもまた異性体構造が多く、配列も不均一性が高い（非特許文献９、非特許文献１０及び非特許文献１１）。
【０００８】
ＭＳnによるＣＳの配列解析の試みもまたいくつか報告されているが、いずれも決定力を欠く点を指摘し得る。
【０００９】
例えば、非特許文献１２及び非特許文献１３では、ＣＳＡとＣＳＣの構造異性体をＭＳ2スペクトルのイオン強度によって識別し、長鎖オリゴ糖においてもその法則が適用されることを示しているが、文献上の記述において、標準データの取得に用いられたオリゴ糖試料そのものが配列異性体の混合物と考えられ、またイオン強度の誤差範囲が明示されていないことから、配列決定精度に難点が生じ得る。また、非特許文献１４では、高い感度で高硫酸化長鎖オリゴ糖のＭＳ2スペクトルが得られているが、硫酸基の結合位置までは同定されていない。
【００１０】
さらに、非特許文献４ではＣＳ分解酵素を併用した配列解析法を提示しているものの、交互型配列、ランダム型配列もしくはブロック型配列の鎖長を推測するに止まる。
【００１１】
このような状況から、分析感度が高く、かつスループットの高いＭＳ2を用い、より高い精度でＣＳの配列を決定する方法論が待ち望まれている。
【非特許文献１】Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｇｌｙｃｏｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｇｌｙｃｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １８，２９３−３１２，２００６
【非特許文献２】Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｉｇｅｓｔ ３３，９６４−９６５，２００７
【非特許文献３】Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ １１，９１６−９２０，２０００
【非特許文献４】Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ７３，３５１３−３５２０，２００１
【非特許文献５】Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ １５，１２７４−１２８６，２００４
【非特許文献６】Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ １８，２３４−２４４，２００７
【非特許文献７】Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ７７，５９０２−５９１１，２００４
【非特許文献８】Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ７８，８９１−９００，２００６
【非特許文献９】Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ５３，３３−４８，２００６
【非特許文献１０】Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ５３，２８２−２９５，２００６
【非特許文献１１】Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ５３，５２３−５３９，２００６
【非特許文献１２】Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ７３，６０３０−６０３９，２００１
【非特許文献１３】Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ １４，１２７０−１２８１，２００３
【非特許文献１４】Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ ２５，２０１０−２０１６，２００４
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明の目的は、糖鎖長及び硫酸基位置を設定したＣＨ又はＣＳを質量分析に付した場合に得られる、ＭＳ2スペクトルにおけるフラグメントイオンのｍ／ｚ値を予測する方法を提供することである。さらに本発明の目的は、分子構造が不明なＣＨ又はＣＳの糖鎖長及び硫酸基位置を、質量分析によって簡易に同定する方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明者らは、高純度のＣＨオリゴ糖、ＣＳＡオリゴ糖及びＣＳＣオリゴ糖について、各々のＭＳ2スペクトルを分析した結果、各構造ごとに規則的なフラグメントイオンが生成していることを見出した。そして、前記フラグメントイオンのＭＳ2スペクトルにおけるｍ／ｚ値が、ＣＨ、ＣＳＡ及びＣＳＣオリゴ糖の糖鎖長及び硫酸基位置に基づいて所定の数式によって予測できることを見出した。さらに、任意に設定した糖鎖長及び硫酸基位置のＣＨ及びＣＳのＭＳ2スペクトルにおけるｍ／ｚ値の予測値と、糖鎖長及び硫酸基位置が不明なＣＨ及びＣＳのｍ／ｚ値の実測値とを比較検討することで、当該不明なＣＨ及びＣＳの糖鎖長及び硫酸基位置を同定することが可能となることを見出し本発明を完成するに至った。
【００１４】
すなわち本発明は、
（１）少なくとも以下の工程を含む、コンドロイチン又はコンドロイチン硫酸をＭＳ2に付した際に生じるフラグメントイオンのＭＳ2スペクトルにおけるｍ／ｚ値を予測する方法：
（I）ＭＳ2スペクトルにおけるｍ／ｚ値の予測対象となる２糖単位からなるコンドロイチン又はコンドロイチン硫酸の糖鎖長及び硫酸基位置を設定する工程；
（II）前記（I）のコンドロイチン又はコンドロイチン硫酸をＭＳ2に付した際に切断されるグリコシド結合が属する２糖単位を選択する工程；
（III）前記（I）のコンドロイチン又はコンドロイチン硫酸について、下記の（i）〜（iv）の各数値を求める工程；及び
（i）Ｎ：２糖単位の数、
（ii）ｕ：還元末端から順に２糖単位を１単位として番号を付した場合における、前記（II）で選択した２糖単位の番号、
（iii）ｓ：前記（II）において選択した２糖単位に属するグリコシド結合が切断されて生じるフラグメントイオンの硫酸基の数、
（iv）ａ：前記（II）において選択した２糖単位に属するグリコシド結合が切断されて生じるフラグメントイオンの価数、
（IV）前記（III）の工程により求めた各数値を、以下の（Ａ）〜（Ｃ）のいずれかに従って下記（イ）〜（ニ）の式に当てはめて、前記（II）で選択した２糖単位に属するグリコシド結合の切断によって生じ得るＢ、Ｃ、Ｙ及びＺ−タイプから選ばれるフラグメントイオンのＭＳ2スペクトルにおけるｍ／ｚ値を求める工程；
（Ａ）前記（II）で選択したグリコシド結合が属する２糖単位を構成するＮ−アセチルガラクトサミンが硫酸基を有さない場合には下記の（ロ）及び（ニ）の式、
（Ｂ）前記Ｎ−アセチルガラクトサミンのＣ−４位に硫酸基を有している場合には下記の（イ）及び（ハ）の式、又は
（Ｃ）前記Ｎ−アセチルガラクトサミンのＣ−６位のみに硫酸基を有している場合には下記の（イ）〜（ニ）の全ての式、
（イ）Ｂ2(N-u)+1イオン（ｍ／ｚ）＝｛［３７９（Ｎ−ｕ）＋１７６］＋８０ｓ−ａ｝／ａ、
（ロ）Ｃ2(N-u)+1イオン（ｍ／ｚ）＝｛［３７９（Ｎ−ｕ）＋１７６］＋１８＋８０ｓ−ａ｝／ａ、
（ハ）Ｙ2u-1イオン（ｍ／ｚ）＝｛［３７９（ｕ−１）＋２０３］＋１８＋８０ｓ−ａ｝／ａ、
（ニ）Ｚ2u-1イオン（ｍ／ｚ）＝｛［３７９（ｕ−１）＋２０３］＋８０ｓ−ａ｝／ａ、
（２）少なくとも以下の工程を含む、分子構造が不明なコンドロイチン又はコンドロイチン硫酸の糖鎖長及び硫酸基位置の同定方法；
（V）分子構造が不明なコンドロイチン又はコンドロイチン硫酸をＭＳ2に付して、得られたＭＳ2スペクトルにおいて観察される全てのフラグメントイオンのｍ／ｚ値を取得する工程、
（VI）（１）に記載の方法で、糖鎖長及び硫酸基位置を設定したコンドロイチン又はコンドロイチン硫酸をＭＳ2に付した際に２糖単位中のグリコシド結合が切断されて生じ得る全てのフラグメントイオンについて、ＭＳ2スペクトルにおけるｍ／ｚ値の予測値を取得する工程、
（VII）前記（V）の工程により取得した全てのｍ／ｚ値と、前記（VI）の工程により取得した全てのｍ／ｚ値の予測値とを比較し、両者が実質的に一致したときに、前記分子構造が不明なコンドロイチン又はコンドロイチン硫酸の糖鎖長及び硫酸基位置が、前記（VI）の工程で設定した糖鎖長及び硫酸基位置であると同定する工程、
（３）前記（V）の工程により取得した全てのｍ／ｚ値と、前記（VI）の工程により取得した全てのｍ／ｚ値の予測値とが実質的に一致するまで前記（VI）及び（VII）の工程を繰り返す工程をさらに含む、（２）に記載の同定方法、
（４）少なくとも以下の工程を含む、分子構造が不明なコンドロイチン又はコンドロイチン硫酸の糖鎖長及び硫酸基位置の同定方法；
（VIII）（１）に記載の方法で、異なる糖鎖長及び硫酸基位置に設定した、２糖単位からなる複数のコンドロイチン又はコンドロイチン硫酸の各々について、ＭＳ2に付した際に２糖単位中のグリコシド結合が切断されて生じ得る全てのフラグメントイオンについてＭＳ2スペクトルにおけるｍ／ｚ値の予測値を取得し、前記糖鎖長及び硫酸基位置と、前記ｍ／ｚ値の予測値との対応についてデータベースを作成する工程、
（IX）分子構造が不明なコンドロイチン又はコンドロイチン硫酸をＭＳ2に付して、得られたＭＳ2スペクトルにおいて観察される全てのフラグメントイオンのｍ／ｚ値を取得する工程、
（X）前記（IX）の工程により取得した全てのｍ／ｚ値を、前記（VIII）の工程で作成したデータベース上のｍ／ｚ値と照合し、前記（IX）の工程により取得した全てのｍ／ｚ値と実質的に一致するｍ／ｚ値の予測値を有するコンドロイチン又はコンドロイチン硫酸の糖鎖長及び硫酸基位置を見出す工程、
（５）前記コンドロイチン又はコンドロイチン硫酸は、それぞれコンドロイチンオリゴ糖又はコンドロイチン硫酸オリゴ糖である（１）〜（４）のいずれかに記載の方法、
を提供するものである。
【発明の効果】
【００１５】
本発明は一般的な質量分析データを用いるだけで、簡易にＣＨ及びＣＳの糖鎖長及び硫酸基位置が同定できるという優れた効果を有する。具体的には、糖鎖長及び硫酸基位置を設定したＣＨ及びＣＳをＭＳ2に付した場合に得られるｍ／ｚ値の予測値をデータベース化して、このｍ／ｚ値の予測値と、分子構造が不明なＣＨ又はＣＳを含む実試料におけるｍ／ｚ値の実測値との照合により、ＣＨ及びＣＳの糖鎖長及び硫酸基位置を簡易かつ迅速に同定することが可能となる。また、ＣＨ及びＣＳのＭＳ2によるイオン断片化の規則性を市販ソフトウェアに入力することにより、構造解析アプリケーションを提供すること
も可能になる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
以下に、本発明の実施の形態を詳細に説明する。
【００１７】
本発明の方法による解析対象となる糖鎖はＣＨ及びＣＳである。ＣＨ及びＣＳは、ヒアルロン酸などと共に、ＧＡＧと称される糖鎖のカテゴリーに含まれ、ヒトを含む動物細胞の表面や、軟骨成分などとして存在するものであり、生体における様々な機能を司っている分子として着目されている。
【００１８】
ＣＨ及びＣＳの構造は、２種類の単糖（ＧａｌＮＡｃ及びＧｌｃＡ）がグリコシド結合により交互に繰り返す直鎖状の基本骨格を有しており、ＧａｌＮＡｃとＧｌｃＡからなる２糖単位の繰り返し構造とみなすことができる。硫酸基を全く持たないものがＣＨであり、硫酸基を持つものがＣＳである。ＣＳの２糖単位は、その硫酸基位置の違いにより種々の異性体が存在するが、その代表的なものとしてＣＳＡとＣＳＣが挙げられ、２糖単位が単一の硫酸基位置異性体（硫酸基を含まないものを含む）で構成されているものや、異なる種類の硫酸基位置異性体（硫酸基を含まないものを含む）で構成されているものが存在する。
【００１９】
本明細書等において、均一な配列のＣＳＡとは、それを構成する２糖単位がＣＳＡのみからなるＣＳをいう。
【００２０】
本明細書等において、均一な配列のＣＳＡオリゴ糖とは、それを構成する２糖単位がＣＳＡのみからなるオリゴ糖をいい、単にＣＳＡオリゴ糖ともいう。
【００２１】
本明細書等において、均一な配列のＣＳＣとは、それを構成する２糖単位がＣＳＣのみからなるＣＳをいう。
【００２２】
本明細書等において、均一な配列のＣＳＣオリゴ糖とは、それを構成する２糖単位がＣＳＣのみからなるオリゴ糖をいい、単にＣＳＣオリゴ糖ともいう。
【００２３】
本明細書等において、ＣＨオリゴ糖とはそれを構成する２糖単位がＣＨのみからなるオリゴ糖をいう。
【００２４】
本発明の方法により、ＭＳ2スペクトルにおけるｍ／ｚ値を予測することが可能なＣＨ又はＣＳは、これらを構成する単糖の数が偶数のものであり、かつ、還元末端にＧａｌＮＡｃ残基を有しているものである。糖鎖長については特に制限はなく、通常には該ＣＨ又はＣＳを構成する２糖単位の数が１〜１０の整数であり、２糖単位の数が１〜９、１〜４、１〜３の整数のものなども例示することができる。本発明においてこのようなＣＨ又はＣＳを、２糖単位からなるＣＨ又はＣＳという。
【００２５】
本発明によって糖鎖長及び硫酸基位置を同定することが可能なＣＨ又はＣＳは、これらを構成する単糖の数が偶数のものであり、かつ、還元末端にＧａｌＮＡｃ残基を有しているものである。糖鎖長については特に制限はなく、通常には該ＣＨ又はＣＳを構成する２糖単位の数が１〜１０の整数であり、２糖単位の数が１〜９、１〜４、１〜３の整数のものなども例示することができる。
【００２６】
本明細書等におけるオリゴ糖には、それを構成する単糖の数が２〜２０の整数である全てのものが含まれるが、本発明において同定できるオリゴ糖は、これらを構成する単糖の数が偶数であり、かつ還元末端にＧａｌＮＡｃ残基を有しているものである。
【００２７】
本発明の方法により、糖鎖長及び硫酸基位置が不明なＣＨ又はＣＳにおいて、２糖単位のＣＨ、ＣＳＡ又はＣＳＣがどのように連なった構造をしているのかを判別することができる。また、該ＣＳ配列中に含まれるＧａｌＮＡｃのＣ−４位とＣ−６位の両方が硫酸化されている２糖単位（しばしばＣＳＥと称される）をも同定しうる。
【００２８】
本発明における質量分析は、一般的な質量分析データを出力できる既存の質量分析装置により行うことができる。本発明に使用可能な質量分析装置としては、例えばＥｓｑｕｉｒｅ，ＨＣＴ（ブルカー・ダルトニクス社製）、ＬＣＱ，ＬＴＱ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）などが挙げられる。本明細書等において質量分析データとは、ＭＳスペクトル及びＭＳ2スペクトルの両データを含み、本発明において質量分析（ＭＳ）に付すとは、質量分析データを得るために被検試料を質量分析にかけることをいう。本発明においてＭＳ2に付すとは、ＭＳ2スペクトルのデータを得るために、被検試料をＭＳ2（２段階質量分析）にかけることをいう。
【００２９】
本発明においてＭＳスペクトルとは、分析対象の糖鎖をイオン化して得られる、当該糖鎖の分子量を反映するスペクトルをいう。本発明においてＭＳ2スペクトルとは、ＭＳスペクトルで測定された任意のイオン（イオン化した分析対象の糖鎖分子）に対して装置内でエネルギーを加え、過剰エネルギーによって当該イオンが壊れて生じた様々な断片（以後フラグメントイオン又はプロダクトイオンともいう）の質量を反映するスペクトルをいう。
【００３０】
本発明においてｍ／ｚ値とは、質量電荷比とも呼ばれ，イオンの質量（ｍ）をイオンの電荷数（ｚ）で割った値のことをいう。質量分析装置は，電場や磁場中で質量電荷比の値に応じたイオンの運動の差を読み取るものであり、ｍ／ｚ値にイオンの価数をかければイオンの質量が計算できる。
【００３１】
本発明において、ＣＨ又はＣＳの「糖鎖長及び硫酸基位置」とは、ＣＨ又はＣＳを構成する２糖単位の数及びＣＨ又はＣＳにおいて硫酸基が存在する位置をいう。ＣＨ及びＣＳの基本骨格は、ＧａｌＮＡｃとＧｌｃＡからなる２糖単位の繰り返し構造であり、本発明では特に、このうちＧａｌＮＡｃのＣ−４位及び／又はＣ−６位に硫酸基を有する構造を扱う。したがって、本発明において「２糖単位からなるＣＨ又はＣＳの糖鎖長及び硫酸基位置を設定する」とは、ＣＨの場合には２糖単位の数を設定することをいい、ＣＳの場合には任意の位置のＧａｌＮＡｃにおける硫酸基位置を設定し（硫酸基を含まないように設定することを含む）、かつ２糖単位の数を設定することをいう。また、本発明において「糖鎖長及び硫酸基位置を同定する」とは、ＣＨ又はＣＳの２糖単位の数及びＧａｌＮＡｃの硫酸基位置の違い（硫酸基を含まないものを含む）による異性体構造を明らかにすることをいう。
【００３２】
本発明において「フラグメントイオンの価数」とは、フラグメントイオンにおける脱プロトン化の数をいう。質量分析において、ＣＨでは通常には分子中のカルボキシル基の全部又は一部が脱プロトン化されてイオン化し、ＣＳでは通常には分子中のカルボキシル基及び硫酸基の全部又は一部が脱プロトン化されてイオン化する。従って、フラグメントイオンの価数はフラグメントイオンに存在し得るカルボキシル基と硫酸基の数の和を超えることはない。
【００３３】
本発明の糖鎖長及び硫酸基位置の同定方法において、ｍ／ｚ値が実質的に一致するとは、分子構造が不明なＣＨ又はＣＳのＭＳ2スペクトルにおいて観察される全てのフラグメントイオンのｍ／ｚ値の実測値の中に、糖鎖長及び硫酸基位置を設定したＣＨ又はＣＳをＭＳ2に付した際に、２糖単位中のグリコシド結合が切断されて生じ得る全てのフラグ
メントイオンについてのｍ／ｚ値の予測値が含まれることの他、前記実測値の中に前記予測値の一部のみが含まれる場合をも意味する。ここで、ＣＨ又はＣＳをＭＳ2に付した際には、２糖単位中のグリコシド結合以外の部分が切断されて生じたフラグメントイオンも含まれるので、前記実測値の数が前記予測値の数より少なくなることはない。
【００３４】
前記実測値の中に前記予測値の一部のみが含まれる場合において、ｍ／ｚ値が実質的に一致すると判断されるケースについて以下に説明する。
【００３５】
２糖単位中のグリコシド結合が切断されて生じた断片が全てイオン化されれば、Ｂ−タイプ及びＹ−タイプイオンの両方、又はＣ−タイプ及びＺ−タイプイオンの両方が生じる（図２）。しかしながら、現実にはＢ−タイプ及びＹ−タイプイオンの一方、又はＣ−タイプ及びＺ−タイプイオンの一方が電荷を失う場合があり、電荷を失ったフラグメントはスペクトル上に観察されない。従って、前記予測値のうち、前記実測値に含まれなかったｍ／ｚ値が存在したとしても、当該ｍ／ｚ値を与えるフラグメントイオンが生じるためのグリコシド結合の切断により生じる他方のフラグメントイオン（当該ｍ／ｚ値を与えるフラグメントイオンがＢ（Ｙ）−タイプの場合には他方のフラグメントイオンはＹ（Ｂ）−タイプイオンであり、当該ｍ／ｚ値を与えるフラグメントイオンがＣ（Ｚ）−タイプの場合には他方のフラグメントイオンはＺ（Ｃ）−タイプイオンである）の予測値が前記実測値に含まれていれば、ｍ／ｚ値が実質的に一致していると判断することができる。
【００３６】
前記予測値と前記実測値が実質的に一致したときに、前記実測値を与えたＣＨ又はＣＳの糖鎖長及び硫酸基位置（不明であった糖鎖長及び硫酸基位置）が、前記予測値を与えたＣＨ又はＣＳの糖鎖長及び硫酸基位置と同一であると同定する。
【００３７】
異なる糖鎖長及び硫酸基位置に設定した、２糖単位からなる複数のＣＨ又はＣＳの各々ついて、２糖単位中のグリコシド結合が切断された場合に生じうる全てのフラグメントイオンのｍ／ｚ値の予測値を算出し、予めデータベースを作成しておけば、分子構造が不明なＣＨ又はＣＳのＭＳ2スペクトルにおけるｍ／ｚ値の実測値を、前記データベースと照合することにより、当該分子構造が不明なＣＨ又はＣＳの糖鎖長及び硫酸基位置を同定することができる。この場合、前記ｍ／ｚ値の実測値と実質的に一致するｍ／ｚ値の予測値を与えたＣＨ又はＣＳの糖鎖長及び硫酸基位置が、前記分子構造が不明なＣＨ又はＣＳの糖鎖長及び硫酸基位置であると同定することができる。
【００３８】
以下、本発明において上記のとおり観察されたＣＨ及びＣＳオリゴ糖鎖のグリコシド結合の切断（開裂）の規則性について説明する。
【００３９】
ここで、ＣＨ又はＣＳのモデルとして還元末端（図１の右端側）にＧａｌＮＡｃ残基、非還元末端（左端側）にＧｌｃＡ残基を有するものを想定する。
【００４０】
この糖鎖は、グルクロニド結合を間に挟む２糖単位の繰り返しであり、還元末端からＵ＝１、２、３、・・・Ｎ番目の単位と数える。すなわち、図１に示す偶数の長さの糖鎖は「２Ｎ糖」である。
また、任意の２糖単位をＵ＝ｕと表現する。
【００４１】
既報のフラグメントイオンの命名法（Ｇｌｙｃｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ５，３９７−４０９，１９８８）に基づくと、本発明において着目する各グリコシド切断イオンは、図２のとおり命名される。すなわち、２糖単位中のグルクロニド結合の切断が当該結合の酸素原子よりもＧｌｃＡ側で生じた場合には、その切断により生じる非還元末端側及び還元末端側のフラグメントイオンをそれぞれＢ−タイプイオン及びＹ−タイプイオンと呼び、２糖単位中のグルクロニド結合の切断が当該結合の酸素原子よりもＧａ
ｌＮＡｃ側で生じた場合には、その切断により生じる非還元末端側及び還元末端側のフラグメントイオンをそれぞれＣ−タイプイオン及びＺ−タイプイオンと呼ぶ。
【００４２】
ここでＵ＝ｕの場合の各Ｂ、Ｃ、Ｙ及びＺ−タイプイオン（それぞれＢ2(N-u)+1、Ｃ2(N-u)+1、Ｙ2u-1及びＺ2u-1イオンと表記）のＭＳ2スペクトルにおけるシグナルｍ／ｚ値（横軸値）は、次の数式で与えられる。
【００４３】
１）Ｂ2(N-u)+1イオン（ｍ／ｚ）＝｛［３７９（Ｎ−ｕ）＋１７６］＋８０ｓ−ａ｝／ａ２）Ｃ2(N-u)+1イオン（ｍ／ｚ）＝｛［３７９（Ｎ−ｕ）＋１７６］＋１８＋８０ｓ−ａ｝／ａ
３）Ｙ2u-1イオン（ｍ／ｚ）＝｛［３７９（ｕ−１）＋２０３］＋１８＋８０ｓ−ａ｝／ａ
４）Ｚ2u-1イオン（ｍ／ｚ）＝｛［３７９（ｕ−１）＋２０３］＋８０ｓ−ａ｝／ａ
Ｎ: 被検糖鎖の２糖単位数
Ｕ: 着目する切断グリコシド結合の属する、還元末端からの２糖単位の番号
３７９: 硫酸基を持たない２糖単位の質量
１７６: 硫酸基を持たないＧｌｃＡ残基の質量
２０３: 硫酸基を持たないＧａｌＮＡｃ残基の質量
８０: 硫酸基１個あたりの質量
１８: グリコシド結合の酸素の質量
ｓ: グリコシド結合が切断されて生じたイオンに含まれる硫酸基数（多くの場合、ＭＳ2スペクトルより判読可能）
ａ: グリコシド結合が切断されて生じたイオンの価数（多くの場合、ＭＳ2スペクトルにおける同位体組成より判読可能）
【００４４】
また、本発明において見出されたＣＨ及びＣＳのフラグメンテーションの規則性は図３のとおりである。
すなわち、グリコシド結合が切断される２糖単位中に存在するＧａｌＮＡｃ残基に硫酸基が存在しない場合には、Ｃ2(N-u)+1イオン及びＺ2u-1イオンの両方又は一方を生じる切断を生じ、グリコシド結合が切断される２糖単位中に存在するＧａｌＮＡｃ残基のＣ−４位に硫酸基が存在する場合には、Ｂ2(N-u)+1イオン及びＹ2u-1イオンの両方又は一方を生じる切断を生じ、グリコシド結合が切断される２糖単位中に存在するＧａｌＮＡｃ残基のＣ−６位に硫酸基が存在する場合には、Ｂ2(N-u)+1イオン及びＹ2u-1イオンの両方又は一方を生じる切断と、Ｃ2(N-u)+1イオン及びＺ2u-1イオンの両方又は一方を生じる切断を生じる。
【００４５】
また、フラグメンテーションのメカニズム上、グリコシド結合が切断される２糖単位中に存在するＧａｌＮＡｃ残基のＣ−４位およびＣ−６位の双方に硫酸基が存在する場合には、Ｂ2(N-u)+1イオン及びＹ2u-1イオンの両方又は一方が生じる切断が生じることになる。
【００４６】
ここで、「両方又は一方」と表現したのは、ＭＳ2におけるグリコシド結合切断後、電荷を有していないフラグメントについては装置原理上観測されないためである。本発明の場合、硫酸基もしくはカルボキシル基がイオン化時に脱プロトン化し、負電荷を獲得して検出されるが、すべてのそのような官能基が脱プロトン化するわけではないため、脱プロトン化した基が存在しない断片は検出されない。すなわち、Ｂ−タイプイオンとＹ−タイプイオンのいずれか、また、Ｃ−タイプイオンとＺ−タイプイオンのいずれかが観測されれば、当該結合は切断されたと見なすことができる。
【００４７】
本発明のＭＳ2スペクトルにおけるフラグメントイオンのｍ／ｚ値を予測する方法は、ＭＳ2において生じ得る全てのフラグメントイオンのｍ／ｚ値を予測する方法と、着目する一部のフラグメントイオンのｍ／ｚ値のみを予測する方法とを含む。
【００４８】
ＭＳ2において生じうる全てのフラグメントイオンのｍ／ｚ値を予測する場合には、Ｕ＝１〜Ｎの全てについて、２糖単位中のＧａｌＮＡｃの硫酸基の存在及び硫酸基位置に従って選ばれる、Ｂ、Ｃ、Ｙ及びＺ−タイプイオン（すなわち、切断されるグリコシド結合が属する２糖単位のＧａｌＮＡｃに硫酸基が存在しないときはＣ及びＺ−タイプイオン、Ｃ−４位に硫酸基が存在するときはＢ及びＹ−タイプイオン、Ｃ−６位にのみ硫酸基が存在するときはＢ，Ｃ，ＹおよびＺ−タイプイオン）のｍ／ｚ値を算出する。
【００４９】
一方、特定のグリコシド結合の切断によって生じるフラグメントイオンのｍ／ｚ値だけを予測することもできる。例えば、知りたいフラグメントイオンのｍ／ｚ値がＵ＝ｕにおけるグリコシド結合の切断により生じるＢ−タイプイオンのみである場合には、
Ｂ2(N-u)+1イオン（ｍ／ｚ）＝｛［３７９（Ｎ−ｕ）＋１７６］＋８０ｓ−ａ｝／ａ
の値のみ算出することができる。
【００５０】
続いて、モデルケースを用いて本願発明の方法を用いたＣＳの糖鎖長及び硫酸基位置の同定方法を、例を挙げて以下に示す。
【００５１】
あるＣＳオリゴ糖鎖のＭＳスペクトルを取得したところ、図４のように４６７のｍ／ｚ値に強いシグナルが現れた。スペクトルを横方向に拡大してみたところ(図略)、同位体のシグナルが４６７．５及び４６８．０のｍ／ｚ値に出現したため、これが２価のイオンであり、分子の質量は４６７×２＋２（Ｈ）＝９３６と算出された。
【００５２】
この分子量は、通常糖鎖の質量分析研究者が用いる糖鎖組成プログラム、Ｗｅｂリソース、あるいは経験則によれば、２０３（ＧａｌＮＡｃ）×２＋１７６（ＧｌｃＡ）×２＋１８（飽和オリゴ糖）＋８０（硫酸基）×２＝９３６となり、硫酸基が２箇所に結合したＣＳ４糖であると考えられる。この４６７のｍ／ｚ値を与えたイオンについてのＭＳ2スペクトルを取得したところ、図５のようになった。
【００５３】
４糖であれば、本発明によると着目すべきグリコシド結合は図６のように２箇所である。
【００５４】
ここで、ＭＳ2スペクトル上に既に２８２及び３００の両ｍ／ｚ値を与えるイオンが観測されている。これは１つの硫酸基を持ったＧａｌＮＡｃ、すなわちＹ1イオンとＺ1以外にはなく、これら双方の出現により、フラグメンテーション規則上、還元末端ＧａｌＮＡｃはＣ−６位が硫酸化されていることになる。
【００５５】
ちなみに、同じ切断位置から生じるＢ３及びＣ３イオンは、数式にあてはめると、
Ｂ2(2-1)+1(=3)イオン（ｍ／ｚ）＝｛［３７９（２−１）＋１７６］＋８０×１−１｝／１
＝６３４、及び
Ｃ2(2-1)+1(=3)イオン（ｍ／ｚ）＝｛［３７９（２−１）＋１７６］＋１８＋８０×１−１｝／１
＝６５２
となり、どちらのイオンもＭＳ2スペクトル上に観測されていることから、重ねて還元末端ＧａｌＮＡｃのＣ−６位が硫酸化されていることを確認し得る。
【００５６】
続いて、残る一つの硫酸基の位置について検討する。計算式においてＹ3及びＺ3イオ
ンのｍ／ｚ値を予測すると以下のようになる。
Ｙ2×2-1(=3)イオン（ｍ／ｚ）＝｛［３７９（２−１）＋２０３］＋１８＋８０×１−１｝／１
＝６７９、及び
Ｚ2×2-1(=3)イオン（ｍ／ｚ）＝｛［３７９（２−１）＋２０３］＋８０×１−１｝／１＝６６１。
【００５７】
しかしながら、これらのｍ／ｚ値のイオンはＭＳ2スペクトル上に確認できていない。念のために２価イオンを想定（ａ＝２）した計算値についても調べたが、いずれのイオンも同様に確認できなかった。一方、弱小シグナルではあるが、
Ｂ1（ｍ／ｚ）＝１７５
Ｃ1（ｍ／ｚ）＝１９３
のそれぞれに相当するイオンについてはＭＳ2スペクトル上に確認することができたため、当該グリコシド結合に関与するＧａｌＮＡｃのＣ−６位が硫酸化されていることが強く示唆される。
【００５８】
以上の検討の結果、図４および図５のＭＳスペクトル及びＭＳ2スペクトルを与えた糖鎖試料は、
ＧｌｃＡ−ＧａｌＮＡｃ６Ｓ−ＧｌｃＡ−ＧａｌＮＡｃ６Ｓ
の配列であると確定することができる。
【００５９】
上記モデルケースではＧａｌＮＡｃの硫酸基がすべて６位に位置しているケースについて説明した。当該ケースはＢ、Ｃ、Ｙ及びＺ−タイプの各フラグメントイオンが全て生じ得るために、他の硫酸基位置を有するものよりも解析が複雑であるといえる。従って、硫酸基が４位に位置しているケースや、４位と６位の双方に位置しているケース、あるいはＧａｌＮＡｃの全部又は一部に硫酸基が存在しないケースについても同様に糖鎖長及び硫酸基位置を同定できることは当業者に明らかである。また、糖鎖長が１０糖程度までのＣＨ又はＣＳであれば、ＭＳスペクトルデータから、前記糖鎖組成プログラム、Ｗｅｂリソース、あるいは経験則により硫酸基数や糖鎖長を予測することが可能であることも当業者に明らかである。
【実施例】
【００６０】
以下、実施例を挙げて本発明についてさらに詳細に説明を加える。ただし、本発明の範囲は実施例に限定されるものではない。
【００６１】
〔実施例１〕
ＭＳ2におけるＣＨの断片化規則の解析
硫酸基を持たないＣＨオリゴ糖を、そのＭＳnによる断片化（フラグメンテーション）の規則性を調べるために分析した。
【００６２】
（１）ＣＨオリゴ糖の調製
全てのＣＨオリゴ糖は愛知医科大学分子医科学研究所から入手した。簡単な手順は以下のとおりである。ＣＨの飽和４糖及び６糖（ＣＨ４及びＣＨ６）はＪ．Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ． ２７７，２１５６７−２１５７５（２００２）及びＡｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ３６５，６２−７３（２００７）に記載の方法をわずかに改良して調製した。すなわち、ＣＨ（生化学工業株式会社製）を精巣ヒアルロニダーゼ（タイプ−５、シグマ社製）により消化し、生じたオリゴ糖を陰イオン交換カラムクロマトグラフィーで分離した後、サイズ排除クロマトグラフィーにより脱塩した。非還元末端にＧａｌＮＡｃを有するＣＨ３及びＣＨ５は、ＣＨ４及びＣＨ６をβグルクロニダーゼ（牛肝臓由来、タイプＢ−１、シグマ社製）で処理することによって得た。ＣＨ６より長いオリゴ糖は、ＣＨ６を最初の
グリコシル化アクセプターとして使用し、ＣＨポリメラーゼにより酵素的に合成した。
【００６３】
（２）ＥＳＩ−ＭＳn分析条件
負イオンモードＥＳＩ−ＩＴ ＭＳは、Ｅｓｑｕｉｒｅ ３０００ Ｐｌｕｓ（Ｂｒｕｋｅｒ Ｄａｌｔｏｎｉｋ ＧｍｂＨ社製） を使用した。オリゴ糖を２．５ｍＭの酢酸アンモニウムを含む５０％メタノール（ｐＨ６．０）に溶解し、シリンジポンプを用いて３６０μＬ／時間の流速で装置に直接注入した。−３．８ｋＶのキャピラリー電圧、−５００Ｖのエンド−プレートオフセット、４．０Ｌ／分の乾燥窒素ガス流量、３００℃の乾燥温度にそれぞれセットして操作した。ＣＩＤ法によるＭＳnデータは、フラグメンテーションエネルギーを１．０Ｖに調整して取得した。スキャン分子量範囲は、ｍ／ｚ ５０〜１０００又は１５００に設定し、スキャン解像度は５５００Ｄａ／ｓに設定した。
【００６４】
（３）結果と考察（シグナルの帰属は、Ｇｌｙｃｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｊｏｕｒｎａｌ
５，３９７−４０９，１９８８に従って実施した）
３糖（ＣＨ３）〜８糖（ＣＨ８）のＣＨオリゴ糖について負イオンＥＳＩ質量スペクトルを得た（表１）。ＣＨ４〜ＣＨ８では２重の脱プロトン化分子である［Ｍ−２Ｈ］2-が顕著に出現した一方で、ＣＨ３では［Ｍ−Ｈ］-が顕著に出現した。その後、それらの断片化特性を調べるためにＣＩＤ ＭＳn実験を行った。
【表１】
【００６５】
図７に、ＭＳnプロダクトイオンの質量スペクトルの例を示す（（Ａ）：ＣＨ５、（
Ｂ）：ＣＨ６）。ほぼ全ての観察されたプロダクトイオン（フラグメントイオン）はグリコシド切断に由来するものであり、共通の断片化規則を見出した。すなわち、飽和ＣＨオリゴ糖は全てのＣＩＤプロセス1回ごとに単糖の残基を消失し、Ｃ−タイプイオンを生じた。
主にＣ−タイプイオンを産生するこれらの断片化について、３つのメカニズムが提唱できる（図８）。ＧａｌＮＡｃ残基の脱離は、チャージ・インデュースト・フラグメンテーションによって起こり得る（図８（Ａ）、（Ｃ））。一方、ＧｌｃＡ残基の脱離についても同様に、オキシラン環を形成するメカニズムが考えられる（図８（Ｂ））。
【００６６】
〔実施例２〕
ＭＳ2におけるＣＳの断片化規則の解析
配列が均一な２糖、４糖及び６糖のＣＳＡ及びＣＳＣオリゴ糖をＭＳnによって分析した。硫酸化された部位に特有のフラグメンテーションの特徴がＭＳ2スペクトルに観察された。断片化結果に基づいて、予想される開裂メカニズムについても考察する。
（１）ＣＳオリゴ糖の調製
全てのＣＳオリゴ糖は生化学工業株式会社において調製した（図９）。２糖、４糖及び６糖の均一な配列のＣＳＡオリゴ糖（ＣＳＡ２、ＣＳＡ４及びＣＳＡ６）はチョウザメの脊索から単離されたＣＳＡ（生化学工業株式会社製）から調製した。このＣＳＡはＣ−４が硫酸化されたＧａｌＮＡｃを有する２糖単位がクジラ軟骨から単離されたそれよりもかなり豊富である。このＣＳＡを精巣ヒアルロニダーゼ（タイプＶ, 購入先：シグマ社）で消化し、これにより生成したオリゴ糖を、硫酸化部位の異なる異性的オリゴ糖を分離できるＮＨ2修飾シリカカラム（ＹＭＣ−Ｐａｃｋ ＮＨ２， ＹＭＣ社製）に接続された陰イオン交換ＨＰＬＣによって繰り返し分離し、その後サイズ排除クロマトグラフィーにより脱塩した。こうして得られたオリゴ糖の構造を1Ｈ−ＮＭＲ測定及び酵素消化分析の両方によって分析し、Ｃ−４部位が硫酸化されたＧａｌＮＡｃのみを有することを確認した。
【００６７】
ＧａｌＮＡｃのＣ−６部位のみが全て硫酸化された均一な配列のＣＳＣの２糖、４糖及び６糖のオリゴ糖（ＣＳＣ２、ＣＳＣ４及びＣＳＣ６）は、市販されている硫酸化されていないコンドロイチン（ＣＨ、生化学工業社製）の化学的硫酸化物より調製した。低温下（０℃）におけるＮ，Ｎ−ジメチルフォルムアミド中でのピリジン−三酸化硫黄複合体によるＣＨの硫酸化により、一級水酸基（ＧａｌＮＡｃのＣ−６位）が主に硫酸化された硫酸化ＣＨを得た。その後、精巣ヒアルロニダーゼで消化して生成したオリゴ糖は、所望のオリゴ糖を得るためにサイズ排除クロマトグラフィーによって繰り返し分離された。こうして得られたオリゴ糖の構造を酵素消化により分析し、ＣＳに含有されるＧａｌＮＡｃは全てＣ−６位のみが硫酸化されていることを確認した。
【００６８】
（２）ＥＳＩ−ＭＳn分析条件
負イオンモードＥＳＩ−ＩＴ ＭＳは、Ｅｓｑｕｉｒｅ ３０００ Ｐｌｕｓ（Ｂｒｕｋｅｒ Ｄａｌｔｏｎｉｋ ＧｍｂＨ社製）を使用した。オリゴ糖サンプルは２．５ｍＭ酢酸アンモニウムを含むメタノール（スペクトロフォトメトリックグレード、販売元：アルドリッチケミカル）に溶解し、２０μＬ／ｈの流速でナノスプレー装置（ＰｉｃｏＴｉｐTM Ｅｍｉｔｔｅｒ、Ｎｅｗ Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ社製）を用いて装置に注入した。−２．５ｋＶのキャピラリー電圧、−５００Ｖのエンドプレートオフセット、５．０Ｌ／分の乾燥窒素ガス流量、３００℃の乾燥温度にセットし操作した。ＣＩＤ−ＭＳ2データはフラグメンテーションエネルギーを１．０Ｖに調整して取得した。スキャン質量範囲はｍ／ｚ ５０〜１５００であり、スキャン解像度は５５００ｍ／ｚ／ｓとした。
【００６９】
（３）結果と考察
１）均一な配列のＣＳＡオリゴ糖
チョウザメの脊索由来のＣＳＡはＧｌｃＡ−ＧａｌＮＡｃ４Ｓ配列を高含有（＞９０％）するものであるため、その単純反復配列（均一な配列）のオリゴ糖の調製に適している。このＣＳＡから得られたオリゴ糖、すなわちＣＳＡ２、ＣＳＡ４及びＣＳＡ６をＭＳnにかけた。
【００７０】
ＣＳＡオリゴ糖の各ＭＳスペクトルは、本研究において採用した条件下で、［Ｍ−ｎＨ］n-（「ｎ」は分子中の硫酸基の数に等しい）に対応する単純な単一シグナルを示した（データ省略）。すなわち、ＣＳＡ２、ＣＳＡ４及びＣＳＡ６は、ＭＳにおいてそれぞれ［Ｍ−Ｈ］-（ｍ／ｚ ４７６）、［Ｍ−２Ｈ］2-（ｍ／ｚ ４６７）及び［Ｍ−３Ｈ］3-（ｍ／ｚ ４６４）のイオンを与えた。続いてそれぞれのイオンを前駆イオンとしてＭＳnにかけた。図１０は、ＭＳ2におけるオリゴ糖の生成物イオンマススペクトルを示す。それらは高度に規則的なグリコシド切断様式を示し、脱硫酸を伴わずにＢ−タイプ及びＹ−タイプのプロダクトイオンを生成した。それらは全て、それぞれの負荷電がそれぞれの硫酸基に位置しているとの想定のもとに帰属することができた（表２）。硫酸化されていないＣＨオリゴ糖の断片化では、ほとんどの断片がＣ−タイプイオンであり、負荷電はカルボキシル基に位置していると考えられる。従って、ＧａｌＮＡｃのＣ−４水酸基の硫酸化は、オリゴ糖の断片化パターンに重要な影響を与えることが立証された。
【表２】
【００７１】
２）均一な配列のＣＳＣオリゴ糖
同様に、均一な配列のＣＳＣオリゴ糖を分析した。それらのＭＳ2スペクトルを図１１に示すが、均一な配列のＣＳＡオリゴ糖の場合とは対照的に、非常に複雑な特徴を示した。ＣＳＡオリゴ糖で観察されたプロダクトイオンの全てはＣＳＣオリゴ糖断片においてもまた観察され、特にＢ−タイプ及びＹ−タイプイオンが共通している点は注目に値する（図１０）。加えて、同一のグリコシド結合において、Ｃ−タイプ及びＺ−タイプイオンがＢ−タイプ及びＹ−タイプイオンと匹敵する程度にほぼ等量生じた。興味深いことに、いくつかのプロダクトイオンは硫酸基を失って水酸基を生じている点（例えば、［Ｍ−ＳＯ3−ｎＨ］n-、Ｂ3−ＳＯ3、Ｃ3−ＳＯ3等）もまた注目された。脱硫酸種及びＣ−タイプ及びＺ−タイプイオンは、均一な配列のＣＳＡオリゴ糖の断片としては、全く検出されないか、検出されても極微量であった。すなわち、ＣＳＣオリゴ糖の前駆イオンは多様な断片化を起こすことが分かった。
【００７２】
３）断片化メカニズム
本研究で得られたデータは、ＣＳ骨格の断片化（フラグメンテーション）パターンがＧａｌＮＡｃ残基における硫酸化位置を明確に反映することを示してきた。これらの断片化メカニズムは下記のように考察できる。
【００７３】
I）ＧｌｃＡの還元末端側においてＢ−タイプ及びＹ−タイプイオンを生成するグリコシド切断
この切断はＣＳＡとＣＳＣオリゴ糖の両方の断片化において起こったが、ＣＨオリゴ糖では起こらなかった。すなわちこれは、ＣＳの硫酸化配列のための特有の開裂プロセスとして考えられ、ＧｌｃＡのＣ−２水酸基が関与するメカニズムによって理解される（図１２(Ｂ)及び（Ｃ）、非特許文献５）。このプロセスは電荷位置に影響されない断片化（チャージリモートフラグメンテーション）であり、従って、ＧａｌＮＡｃ残基における硫酸基の位置とは無関係に生じる。
【００７４】
II）ＧｌｃＡの還元末端側においてＣ−タイプ及びＺ−タイプイオンを生成するグリコシド切断
このタイプのグルクロニド切断はＣＳＣオリゴ糖において観察されたが、ＣＳＡでは観察されなかった。一方で、非硫酸化ＣＨオリゴ糖でも生じる切断パターンである（図１２（Ａ））。チャージインデューストフラグメンテーションによるＣＨオリゴ糖の断片化において、カルボキシル基に存在する負電荷は、Ｃ−タイプ及びＺ−タイプイオンを与える開裂プロセスの引き金となる（図８）。しかしながら、本来硫酸化された糖の一般的なケースではそれらは荷電に影響されない断片化（チャージリモートフラグメンテーション）をする（非特許文献５及びＲａｐｉｄ Ｃｏｍｍｕｎ． Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍ． １９ １７８８−１７９６（２００５））。ここで、ＣＳＣオリゴ糖の断片化については、プロトン移動を仮定することにより、その断片化メカニズムを理解することが可能である（図１２（Ｃ））。
【００７５】
以上のように、ＣＨとＣＳオリゴ糖のＥＳＩ−ＭＳ2での断片化は、個々の構造に特異的な開裂メカニズムをベースに理解することができた。これらの組織化された知見は、ＣＳＡ及びＣＳＣの両者のオリゴ糖の区別だけでなく、多種のＣＳ関連オリゴ糖の配列決定にも拡張することができると考えられる。
【００７６】
より普遍的なＣＳ配列決定プロトコール
次に、上記ＭＳ2スペクトルの規則性に基づき、任意の配列のＣＳについて、その配列の予測が可能であることについて述べる。
【００７７】
上記実施例では、ＣＨ、ＣＳＡ及びＣＳＣの均一な配列の標準オリゴ糖を分析した。得られたデータによって、ＧａｌＮＡｃの硫酸化位置に特異的な断片化規則を見出すこと
ができた（図１２に断片化メカニズムを示す）。これらの結果を総合すれば、不均一な硫酸化配列を有するＣＳオリゴ糖の断片化挙動についても、図１３のように推測可能であることが理解できる。
【産業上の利用可能性】
【００７８】
本発明は、多段階質量分析装置を用いたＣＨ及びＣＳの糖鎖長及び硫酸基位置の同定手段を提供するものであり、これによりＣＨ及びＣＳの糖鎖長及び硫酸基位置と生体における機能の関係を明らかにすることができるため、ＣＨもしくはＣＳの化学構造の異常に起因する各種疾患の診断、治療に貢献することができる。
【図面の簡単な説明】
【００７９】
【図１】還元末端にＧａｌＮＡｃ残基、非還元末端にＧｌｃＡ残基を有するＣＨ又はＣＳの分子構造モデルを示した図である。
【図２】グリコシド結合の切断により生じるフラグメントイオンの命名法を示した図である。
【図３】ＧａｌＮＡｃ残基の硫酸基位置と、該ＧａｌＮＡｃ残基が属する２糖単位中のグリコシド結合の切断により生じるフラグメントイオンのタイプとの関係を示す図である。
【図４】モデルケースのＭＳスペクトルを示す図である。
【図５】モデルケースのＭＳ2スペクトルを示す図である。
【図６】モデルケースにおける、着目すべきグリコシド結合と、そこから生じ得るフラグメントイオンのタイプを示した図である。
【図７】ＣＨオリゴ糖の典型的なＥＳＩ−ＭＳnフラグメントを示す図である（（Ａ）：ＣＨ５、（Ｂ）ＣＨ６）。
【図８】飽和ＣＨオリゴ糖のＭＳn断片化の提唱されるメカニズムを示す図である（（Ａ）：Ｃ−タイプイオンを生じるグルクロニド結合の還元末端側の切断メカニズム、（Ｂ）：Ｃ又はＺ−タイプイオンを生じるＮ−アセチルガラクトサミニドの切断メカニズム）、（Ｃ）：Ｃ−タイプイオンを生じるグルクロニド結合の切断メカニズム）。
【図９】本実施例で分析したＣＳオリゴ糖の構造（（Ａ）：均一な配列のＣＳＡオリゴ糖、（Ｂ）：均一な配列のＣＳＣオリゴ糖）を示す図である。
【図１０】分析された均一な配列のＣＳＡオリゴ糖のＥＳＩ−ＭＳ2スペクトルを示す図である（（Ａ）：ＣＳＡ２、（Ｂ）ＣＳＡ４、（Ｃ）ＣＳＡ６）。各オリゴ糖の断片化パターンについてもそれぞれ図示した（（Ｄ）：ＣＳＡ２、（Ｅ）：ＣＳＡ４、（Ｆ）：ＣＳＡ６）。
【図１１】分析された均一な配列のＣＳＣオリゴ糖のＥＳＩ−ＭＳ2スペクトルを示す図である（（Ａ）：ＣＳＣ２、（Ｂ）ＣＳＣ４、（Ｃ）：ＣＳＣ６）。各オリゴ糖の断片化パターンについてもそれぞれ図示した（（Ｄ）：ＣＳＣ２、（Ｅ）：ＣＳＣ４、（Ｆ）：ＣＳＣ６）。
【図１２】ＣＨオリゴ糖（図中（Ａ））、ＣＳＡオリゴ糖（図中（Ｂ））及びＣＳＣオリゴ糖（図中（Ｃ））のグリコシド結合の推定切断メカニズムを示した図である。
【図１３】均一な配列と不均一な配列のＣＳにおける切断パターンを示した図である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、任意に設定した糖鎖長及び硫酸基位置のコンドロイチン（ＣＨ）又はコンドロイチン硫酸（ＣＳ）を質量分析に付した場合に得られるＭＳ2スペクトルにおけるフラグメントイオンのｍ／ｚ値を予測する方法に関する。さらに本発明は、糖鎖長及び硫酸基位置が不明なＣＨ又はＣＳを質量分析に付して得られたＭＳ2スペクトルにおけるフラグメントイオンのｍ／ｚ値と、前記予測方法を利用して得られたｍ／ｚ値とを比較検討して、前記不明な糖鎖長及び硫酸基位置を同定する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
以下に本明細書等において使用する略語について説明する。
ＣＨ：コンドロイチン
ＣＳ：コンドロイチン硫酸
ＧＡＧ：グリコサミノグリカン
ＧＡＧ創薬：ＧＡＧを基点とした糖鎖創薬
ＭＳ：質量分析
ＭＳn：多段階質量分析
ＭＳ2：２段階質量分析
Ｈｅｐ：ヘパリン
ＨＳ：ヘパラン硫酸
ＧａｌＮＡｃ：Ｎ−アセチルガラクトサミン
ＧｌｃＡ：グルクロン酸
ＣＳＡ：コンドロイチン硫酸Ａ（ＧａｌＮＡｃのＣ−４位の水酸基が硫酸化されたもの（ＧａｌＮＡｃ４Ｓ））
ＣＳＣ：コンドロイチン硫酸Ｃ（ＧａｌＮＡｃのＣ−６位の水酸基が硫酸化されたもの（ＧａｌＮＡｃ６Ｓ））
ＥＳＩ−ＩＴ：エレクトロスプレーイオン化−イオントラップ型
ＣＩＤ：衝突誘起解離
【０００３】
糖鎖構造解析において、ここ数年間に多段階質量分析装置が高頻に使用されるようになってきた。糖鎖のなかで特に複雑な構造を呈するＧＡＧの研究シーンにおいても、１９９０年代後半から精力的にＭＳが使われるようになっている（非特許文献１）。
【０００４】
ＧＡＧの構造解析の難しさは、構造異性体（硫酸基位置異性体やウロン酸のエピマー）の存在により分子構造が無限に存在し得ることに起因する。ＧＡＧ創薬を実現するためには、無限に存在し得る異性体群を含んだ配列の中から生体機能を司るに必須な構造を解明するとともに、その分子構造情報をもとにして、当該機能を人為的に制御し得る配列を新たに設計していくことが必要になる。そして、そのＧＡＧ創薬の作業においては、一般的な低分子化合物やタンパク質を創薬候補化合物とする場合と比較して、遥かに高いウェートで構造解析技術が寄与することとなる（非特許文献２）。
【０００５】
ＭＳnによるＧＡＧの構造解析において特に着目されることの多い硫酸基位置異性体の識別は、これまでに短鎖オリゴ糖（ＧＡＧを脱離酵素によって分解して得られる不飽和型２糖）を対象に多く実施されてきた。例えばＣＳの２糖の解析例としては非特許文献３及び非特許文献４などが挙げられ、Ｈｅｐ／ＨＳの２糖の解析例としては非特許文献５などが挙げられる。また、ウロン酸エピマーの識別例としては非特許文献６が挙げられる。
【０００６】
一方、ＧＡＧの構造解析を目的にＭＳnを最大限に活用する試みはあるが、いまだ普
遍性の高い手法は開発されていないと言ってよい。これまでに、Ｈｅｐ／ＨＳオリゴ糖の分子構造をＭＳnによって解析するアルゴリズムが発表されているが（非特許文献７）、本法を用いてもウロン酸エピマーに関する構造情報は得ることができない。また、非特許文献８においてはケラタン硫酸の配列解析法が紹介されているが、ウロン酸を有するＧＡＧには適用できない方法論である。
【０００７】
ＧＡＧのなかでも特に、そのユニークな構造と生理活性から長年脚光を浴びているものとして、ＣＳが挙げられる。ＣＳもまた異性体構造が多く、配列も不均一性が高い（非特許文献９、非特許文献１０及び非特許文献１１）。
【０００８】
ＭＳnによるＣＳの配列解析の試みもまたいくつか報告されているが、いずれも決定力を欠く点を指摘し得る。
【０００９】
例えば、非特許文献１２及び非特許文献１３では、ＣＳＡとＣＳＣの構造異性体をＭＳ2スペクトルのイオン強度によって識別し、長鎖オリゴ糖においてもその法則が適用されることを示しているが、文献上の記述において、標準データの取得に用いられたオリゴ糖試料そのものが配列異性体の混合物と考えられ、またイオン強度の誤差範囲が明示されていないことから、配列決定精度に難点が生じ得る。また、非特許文献１４では、高い感度で高硫酸化長鎖オリゴ糖のＭＳ2スペクトルが得られているが、硫酸基の結合位置までは同定されていない。
【００１０】
さらに、非特許文献４ではＣＳ分解酵素を併用した配列解析法を提示しているものの、交互型配列、ランダム型配列もしくはブロック型配列の鎖長を推測するに止まる。
【００１１】
このような状況から、分析感度が高く、かつスループットの高いＭＳ2を用い、より高い精度でＣＳの配列を決定する方法論が待ち望まれている。
【非特許文献１】Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｇｌｙｃｏｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｇｌｙｃｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １８，２９３−３１２，２００６
【非特許文献２】Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｉｇｅｓｔ ３３，９６４−９６５，２００７
【非特許文献３】Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ １１，９１６−９２０，２０００
【非特許文献４】Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ７３，３５１３−３５２０，２００１
【非特許文献５】Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ １５，１２７４−１２８６，２００４
【非特許文献６】Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ １８，２３４−２４４，２００７
【非特許文献７】Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ７７，５９０２−５９１１，２００４
【非特許文献８】Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ７８，８９１−９００，２００６
【非特許文献９】Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ５３，３３−４８，２００６
【非特許文献１０】Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ５３，２８２−２９５，２００６
【非特許文献１１】Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ５３，５２３−５３９，２００６
【非特許文献１２】Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ７３，６０３０−６０３９，２００１
【非特許文献１３】Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ １４，１２７０−１２８１，２００３
【非特許文献１４】Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ ２５，２０１０−２０１６，２００４
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明の目的は、糖鎖長及び硫酸基位置を設定したＣＨ又はＣＳを質量分析に付した場合に得られる、ＭＳ2スペクトルにおけるフラグメントイオンのｍ／ｚ値を予測する方法を提供することである。さらに本発明の目的は、分子構造が不明なＣＨ又はＣＳの糖鎖長及び硫酸基位置を、質量分析によって簡易に同定する方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明者らは、高純度のＣＨオリゴ糖、ＣＳＡオリゴ糖及びＣＳＣオリゴ糖について、各々のＭＳ2スペクトルを分析した結果、各構造ごとに規則的なフラグメントイオンが生成していることを見出した。そして、前記フラグメントイオンのＭＳ2スペクトルにおけるｍ／ｚ値が、ＣＨ、ＣＳＡ及びＣＳＣオリゴ糖の糖鎖長及び硫酸基位置に基づいて所定の数式によって予測できることを見出した。さらに、任意に設定した糖鎖長及び硫酸基位置のＣＨ及びＣＳのＭＳ2スペクトルにおけるｍ／ｚ値の予測値と、糖鎖長及び硫酸基位置が不明なＣＨ及びＣＳのｍ／ｚ値の実測値とを比較検討することで、当該不明なＣＨ及びＣＳの糖鎖長及び硫酸基位置を同定することが可能となることを見出し本発明を完成するに至った。
【００１４】
すなわち本発明は、
（１）少なくとも以下の工程を含む、コンドロイチン又はコンドロイチン硫酸をＭＳ2に付した際に生じるフラグメントイオンのＭＳ2スペクトルにおけるｍ／ｚ値を予測する方法：
（I）ＭＳ2スペクトルにおけるｍ／ｚ値の予測対象となる２糖単位からなるコンドロイチン又はコンドロイチン硫酸の糖鎖長及び硫酸基位置を設定する工程；
（II）前記（I）のコンドロイチン又はコンドロイチン硫酸をＭＳ2に付した際に切断されるグリコシド結合が属する２糖単位を選択する工程；
（III）前記（I）のコンドロイチン又はコンドロイチン硫酸について、下記の（i）〜（iv）の各数値を求める工程；及び
（i）Ｎ：２糖単位の数、
（ii）ｕ：還元末端から順に２糖単位を１単位として番号を付した場合における、前記（II）で選択した２糖単位の番号、
（iii）ｓ：前記（II）において選択した２糖単位に属するグリコシド結合が切断されて生じるフラグメントイオンの硫酸基の数、
（iv）ａ：前記（II）において選択した２糖単位に属するグリコシド結合が切断されて生じるフラグメントイオンの価数、
（IV）前記（III）の工程により求めた各数値を、以下の（Ａ）〜（Ｃ）のいずれかに従って下記（イ）〜（ニ）の式に当てはめて、前記（II）で選択した２糖単位に属するグリコシド結合の切断によって生じ得るＢ、Ｃ、Ｙ及びＺ−タイプから選ばれるフラグメントイオンのＭＳ2スペクトルにおけるｍ／ｚ値を求める工程；
（Ａ）前記（II）で選択したグリコシド結合が属する２糖単位を構成するＮ−アセチルガラクトサミンが硫酸基を有さない場合には下記の（ロ）及び（ニ）の式、
（Ｂ）前記Ｎ−アセチルガラクトサミンのＣ−４位に硫酸基を有している場合には下記の（イ）及び（ハ）の式、又は
（Ｃ）前記Ｎ−アセチルガラクトサミンのＣ−６位のみに硫酸基を有している場合には下記の（イ）〜（ニ）の全ての式、
（イ）Ｂ2(N-u)+1イオン（ｍ／ｚ）＝｛［３７９（Ｎ−ｕ）＋１７６］＋８０ｓ−ａ｝／ａ、
（ロ）Ｃ2(N-u)+1イオン（ｍ／ｚ）＝｛［３７９（Ｎ−ｕ）＋１７６］＋１８＋８０ｓ−ａ｝／ａ、
（ハ）Ｙ2u-1イオン（ｍ／ｚ）＝｛［３７９（ｕ−１）＋２０３］＋１８＋８０ｓ−ａ｝／ａ、
（ニ）Ｚ2u-1イオン（ｍ／ｚ）＝｛［３７９（ｕ−１）＋２０３］＋８０ｓ−ａ｝／ａ、
（２）少なくとも以下の工程を含む、分子構造が不明なコンドロイチン又はコンドロイチン硫酸の糖鎖長及び硫酸基位置の同定方法；
（V）分子構造が不明なコンドロイチン又はコンドロイチン硫酸をＭＳ2に付して、得られたＭＳ2スペクトルにおいて観察される全てのフラグメントイオンのｍ／ｚ値を取得する工程、
（VI）（１）に記載の方法で、糖鎖長及び硫酸基位置を設定したコンドロイチン又はコンドロイチン硫酸をＭＳ2に付した際に２糖単位中のグリコシド結合が切断されて生じ得る全てのフラグメントイオンについて、ＭＳ2スペクトルにおけるｍ／ｚ値の予測値を取得する工程、
（VII）前記（V）の工程により取得した全てのｍ／ｚ値と、前記（VI）の工程により取得した全てのｍ／ｚ値の予測値とを比較し、両者が実質的に一致したときに、前記分子構造が不明なコンドロイチン又はコンドロイチン硫酸の糖鎖長及び硫酸基位置が、前記（VI）の工程で設定した糖鎖長及び硫酸基位置であると同定する工程、
（３）前記（V）の工程により取得した全てのｍ／ｚ値と、前記（VI）の工程により取得した全てのｍ／ｚ値の予測値とが実質的に一致するまで前記（VI）及び（VII）の工程を繰り返す工程をさらに含む、（２）に記載の同定方法、
（４）少なくとも以下の工程を含む、分子構造が不明なコンドロイチン又はコンドロイチン硫酸の糖鎖長及び硫酸基位置の同定方法；
（VIII）（１）に記載の方法で、異なる糖鎖長及び硫酸基位置に設定した、２糖単位からなる複数のコンドロイチン又はコンドロイチン硫酸の各々について、ＭＳ2に付した際に２糖単位中のグリコシド結合が切断されて生じ得る全てのフラグメントイオンについてＭＳ2スペクトルにおけるｍ／ｚ値の予測値を取得し、前記糖鎖長及び硫酸基位置と、前記ｍ／ｚ値の予測値との対応についてデータベースを作成する工程、
（IX）分子構造が不明なコンドロイチン又はコンドロイチン硫酸をＭＳ2に付して、得られたＭＳ2スペクトルにおいて観察される全てのフラグメントイオンのｍ／ｚ値を取得する工程、
（X）前記（IX）の工程により取得した全てのｍ／ｚ値を、前記（VIII）の工程で作成したデータベース上のｍ／ｚ値と照合し、前記（IX）の工程により取得した全てのｍ／ｚ値と実質的に一致するｍ／ｚ値の予測値を有するコンドロイチン又はコンドロイチン硫酸の糖鎖長及び硫酸基位置を見出す工程、
（５）前記コンドロイチン又はコンドロイチン硫酸は、それぞれコンドロイチンオリゴ糖又はコンドロイチン硫酸オリゴ糖である（１）〜（４）のいずれかに記載の方法、
を提供するものである。
【発明の効果】
【００１５】
本発明は一般的な質量分析データを用いるだけで、簡易にＣＨ及びＣＳの糖鎖長及び硫酸基位置が同定できるという優れた効果を有する。具体的には、糖鎖長及び硫酸基位置を設定したＣＨ及びＣＳをＭＳ2に付した場合に得られるｍ／ｚ値の予測値をデータベース化して、このｍ／ｚ値の予測値と、分子構造が不明なＣＨ又はＣＳを含む実試料におけるｍ／ｚ値の実測値との照合により、ＣＨ及びＣＳの糖鎖長及び硫酸基位置を簡易かつ迅速に同定することが可能となる。また、ＣＨ及びＣＳのＭＳ2によるイオン断片化の規則性を市販ソフトウェアに入力することにより、構造解析アプリケーションを提供すること
も可能になる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
以下に、本発明の実施の形態を詳細に説明する。
【００１７】
本発明の方法による解析対象となる糖鎖はＣＨ及びＣＳである。ＣＨ及びＣＳは、ヒアルロン酸などと共に、ＧＡＧと称される糖鎖のカテゴリーに含まれ、ヒトを含む動物細胞の表面や、軟骨成分などとして存在するものであり、生体における様々な機能を司っている分子として着目されている。
【００１８】
ＣＨ及びＣＳの構造は、２種類の単糖（ＧａｌＮＡｃ及びＧｌｃＡ）がグリコシド結合により交互に繰り返す直鎖状の基本骨格を有しており、ＧａｌＮＡｃとＧｌｃＡからなる２糖単位の繰り返し構造とみなすことができる。硫酸基を全く持たないものがＣＨであり、硫酸基を持つものがＣＳである。ＣＳの２糖単位は、その硫酸基位置の違いにより種々の異性体が存在するが、その代表的なものとしてＣＳＡとＣＳＣが挙げられ、２糖単位が単一の硫酸基位置異性体（硫酸基を含まないものを含む）で構成されているものや、異なる種類の硫酸基位置異性体（硫酸基を含まないものを含む）で構成されているものが存在する。
【００１９】
本明細書等において、均一な配列のＣＳＡとは、それを構成する２糖単位がＣＳＡのみからなるＣＳをいう。
【００２０】
本明細書等において、均一な配列のＣＳＡオリゴ糖とは、それを構成する２糖単位がＣＳＡのみからなるオリゴ糖をいい、単にＣＳＡオリゴ糖ともいう。
【００２１】
本明細書等において、均一な配列のＣＳＣとは、それを構成する２糖単位がＣＳＣのみからなるＣＳをいう。
【００２２】
本明細書等において、均一な配列のＣＳＣオリゴ糖とは、それを構成する２糖単位がＣＳＣのみからなるオリゴ糖をいい、単にＣＳＣオリゴ糖ともいう。
【００２３】
本明細書等において、ＣＨオリゴ糖とはそれを構成する２糖単位がＣＨのみからなるオリゴ糖をいう。
【００２４】
本発明の方法により、ＭＳ2スペクトルにおけるｍ／ｚ値を予測することが可能なＣＨ又はＣＳは、これらを構成する単糖の数が偶数のものであり、かつ、還元末端にＧａｌＮＡｃ残基を有しているものである。糖鎖長については特に制限はなく、通常には該ＣＨ又はＣＳを構成する２糖単位の数が１〜１０の整数であり、２糖単位の数が１〜９、１〜４、１〜３の整数のものなども例示することができる。本発明においてこのようなＣＨ又はＣＳを、２糖単位からなるＣＨ又はＣＳという。
【００２５】
本発明によって糖鎖長及び硫酸基位置を同定することが可能なＣＨ又はＣＳは、これらを構成する単糖の数が偶数のものであり、かつ、還元末端にＧａｌＮＡｃ残基を有しているものである。糖鎖長については特に制限はなく、通常には該ＣＨ又はＣＳを構成する２糖単位の数が１〜１０の整数であり、２糖単位の数が１〜９、１〜４、１〜３の整数のものなども例示することができる。
【００２６】
本明細書等におけるオリゴ糖には、それを構成する単糖の数が２〜２０の整数である全てのものが含まれるが、本発明において同定できるオリゴ糖は、これらを構成する単糖の数が偶数であり、かつ還元末端にＧａｌＮＡｃ残基を有しているものである。
【００２７】
本発明の方法により、糖鎖長及び硫酸基位置が不明なＣＨ又はＣＳにおいて、２糖単位のＣＨ、ＣＳＡ又はＣＳＣがどのように連なった構造をしているのかを判別することができる。また、該ＣＳ配列中に含まれるＧａｌＮＡｃのＣ−４位とＣ−６位の両方が硫酸化されている２糖単位（しばしばＣＳＥと称される）をも同定しうる。
【００２８】
本発明における質量分析は、一般的な質量分析データを出力できる既存の質量分析装置により行うことができる。本発明に使用可能な質量分析装置としては、例えばＥｓｑｕｉｒｅ，ＨＣＴ（ブルカー・ダルトニクス社製）、ＬＣＱ，ＬＴＱ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）などが挙げられる。本明細書等において質量分析データとは、ＭＳスペクトル及びＭＳ2スペクトルの両データを含み、本発明において質量分析（ＭＳ）に付すとは、質量分析データを得るために被検試料を質量分析にかけることをいう。本発明においてＭＳ2に付すとは、ＭＳ2スペクトルのデータを得るために、被検試料をＭＳ2（２段階質量分析）にかけることをいう。
【００２９】
本発明においてＭＳスペクトルとは、分析対象の糖鎖をイオン化して得られる、当該糖鎖の分子量を反映するスペクトルをいう。本発明においてＭＳ2スペクトルとは、ＭＳスペクトルで測定された任意のイオン（イオン化した分析対象の糖鎖分子）に対して装置内でエネルギーを加え、過剰エネルギーによって当該イオンが壊れて生じた様々な断片（以後フラグメントイオン又はプロダクトイオンともいう）の質量を反映するスペクトルをいう。
【００３０】
本発明においてｍ／ｚ値とは、質量電荷比とも呼ばれ，イオンの質量（ｍ）をイオンの電荷数（ｚ）で割った値のことをいう。質量分析装置は，電場や磁場中で質量電荷比の値に応じたイオンの運動の差を読み取るものであり、ｍ／ｚ値にイオンの価数をかければイオンの質量が計算できる。
【００３１】
本発明において、ＣＨ又はＣＳの「糖鎖長及び硫酸基位置」とは、ＣＨ又はＣＳを構成する２糖単位の数及びＣＨ又はＣＳにおいて硫酸基が存在する位置をいう。ＣＨ及びＣＳの基本骨格は、ＧａｌＮＡｃとＧｌｃＡからなる２糖単位の繰り返し構造であり、本発明では特に、このうちＧａｌＮＡｃのＣ−４位及び／又はＣ−６位に硫酸基を有する構造を扱う。したがって、本発明において「２糖単位からなるＣＨ又はＣＳの糖鎖長及び硫酸基位置を設定する」とは、ＣＨの場合には２糖単位の数を設定することをいい、ＣＳの場合には任意の位置のＧａｌＮＡｃにおける硫酸基位置を設定し（硫酸基を含まないように設定することを含む）、かつ２糖単位の数を設定することをいう。また、本発明において「糖鎖長及び硫酸基位置を同定する」とは、ＣＨ又はＣＳの２糖単位の数及びＧａｌＮＡｃの硫酸基位置の違い（硫酸基を含まないものを含む）による異性体構造を明らかにすることをいう。
【００３２】
本発明において「フラグメントイオンの価数」とは、フラグメントイオンにおける脱プロトン化の数をいう。質量分析において、ＣＨでは通常には分子中のカルボキシル基の全部又は一部が脱プロトン化されてイオン化し、ＣＳでは通常には分子中のカルボキシル基及び硫酸基の全部又は一部が脱プロトン化されてイオン化する。従って、フラグメントイオンの価数はフラグメントイオンに存在し得るカルボキシル基と硫酸基の数の和を超えることはない。
【００３３】
本発明の糖鎖長及び硫酸基位置の同定方法において、ｍ／ｚ値が実質的に一致するとは、分子構造が不明なＣＨ又はＣＳのＭＳ2スペクトルにおいて観察される全てのフラグメントイオンのｍ／ｚ値の実測値の中に、糖鎖長及び硫酸基位置を設定したＣＨ又はＣＳをＭＳ2に付した際に、２糖単位中のグリコシド結合が切断されて生じ得る全てのフラグ
メントイオンについてのｍ／ｚ値の予測値が含まれることの他、前記実測値の中に前記予測値の一部のみが含まれる場合をも意味する。ここで、ＣＨ又はＣＳをＭＳ2に付した際には、２糖単位中のグリコシド結合以外の部分が切断されて生じたフラグメントイオンも含まれるので、前記実測値の数が前記予測値の数より少なくなることはない。
【００３４】
前記実測値の中に前記予測値の一部のみが含まれる場合において、ｍ／ｚ値が実質的に一致すると判断されるケースについて以下に説明する。
【００３５】
２糖単位中のグリコシド結合が切断されて生じた断片が全てイオン化されれば、Ｂ−タイプ及びＹ−タイプイオンの両方、又はＣ−タイプ及びＺ−タイプイオンの両方が生じる（図２）。しかしながら、現実にはＢ−タイプ及びＹ−タイプイオンの一方、又はＣ−タイプ及びＺ−タイプイオンの一方が電荷を失う場合があり、電荷を失ったフラグメントはスペクトル上に観察されない。従って、前記予測値のうち、前記実測値に含まれなかったｍ／ｚ値が存在したとしても、当該ｍ／ｚ値を与えるフラグメントイオンが生じるためのグリコシド結合の切断により生じる他方のフラグメントイオン（当該ｍ／ｚ値を与えるフラグメントイオンがＢ（Ｙ）−タイプの場合には他方のフラグメントイオンはＹ（Ｂ）−タイプイオンであり、当該ｍ／ｚ値を与えるフラグメントイオンがＣ（Ｚ）−タイプの場合には他方のフラグメントイオンはＺ（Ｃ）−タイプイオンである）の予測値が前記実測値に含まれていれば、ｍ／ｚ値が実質的に一致していると判断することができる。
【００３６】
前記予測値と前記実測値が実質的に一致したときに、前記実測値を与えたＣＨ又はＣＳの糖鎖長及び硫酸基位置（不明であった糖鎖長及び硫酸基位置）が、前記予測値を与えたＣＨ又はＣＳの糖鎖長及び硫酸基位置と同一であると同定する。
【００３７】
異なる糖鎖長及び硫酸基位置に設定した、２糖単位からなる複数のＣＨ又はＣＳの各々ついて、２糖単位中のグリコシド結合が切断された場合に生じうる全てのフラグメントイオンのｍ／ｚ値の予測値を算出し、予めデータベースを作成しておけば、分子構造が不明なＣＨ又はＣＳのＭＳ2スペクトルにおけるｍ／ｚ値の実測値を、前記データベースと照合することにより、当該分子構造が不明なＣＨ又はＣＳの糖鎖長及び硫酸基位置を同定することができる。この場合、前記ｍ／ｚ値の実測値と実質的に一致するｍ／ｚ値の予測値を与えたＣＨ又はＣＳの糖鎖長及び硫酸基位置が、前記分子構造が不明なＣＨ又はＣＳの糖鎖長及び硫酸基位置であると同定することができる。
【００３８】
以下、本発明において上記のとおり観察されたＣＨ及びＣＳオリゴ糖鎖のグリコシド結合の切断（開裂）の規則性について説明する。
【００３９】
ここで、ＣＨ又はＣＳのモデルとして還元末端（図１の右端側）にＧａｌＮＡｃ残基、非還元末端（左端側）にＧｌｃＡ残基を有するものを想定する。
【００４０】
この糖鎖は、グルクロニド結合を間に挟む２糖単位の繰り返しであり、還元末端からＵ＝１、２、３、・・・Ｎ番目の単位と数える。すなわち、図１に示す偶数の長さの糖鎖は「２Ｎ糖」である。
また、任意の２糖単位をＵ＝ｕと表現する。
【００４１】
既報のフラグメントイオンの命名法（Ｇｌｙｃｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ５，３９７−４０９，１９８８）に基づくと、本発明において着目する各グリコシド切断イオンは、図２のとおり命名される。すなわち、２糖単位中のグルクロニド結合の切断が当該結合の酸素原子よりもＧｌｃＡ側で生じた場合には、その切断により生じる非還元末端側及び還元末端側のフラグメントイオンをそれぞれＢ−タイプイオン及びＹ−タイプイオンと呼び、２糖単位中のグルクロニド結合の切断が当該結合の酸素原子よりもＧａ
ｌＮＡｃ側で生じた場合には、その切断により生じる非還元末端側及び還元末端側のフラグメントイオンをそれぞれＣ−タイプイオン及びＺ−タイプイオンと呼ぶ。
【００４２】
ここでＵ＝ｕの場合の各Ｂ、Ｃ、Ｙ及びＺ−タイプイオン（それぞれＢ2(N-u)+1、Ｃ2(N-u)+1、Ｙ2u-1及びＺ2u-1イオンと表記）のＭＳ2スペクトルにおけるシグナルｍ／ｚ値（横軸値）は、次の数式で与えられる。
【００４３】
１）Ｂ2(N-u)+1イオン（ｍ／ｚ）＝｛［３７９（Ｎ−ｕ）＋１７６］＋８０ｓ−ａ｝／ａ２）Ｃ2(N-u)+1イオン（ｍ／ｚ）＝｛［３７９（Ｎ−ｕ）＋１７６］＋１８＋８０ｓ−ａ｝／ａ
３）Ｙ2u-1イオン（ｍ／ｚ）＝｛［３７９（ｕ−１）＋２０３］＋１８＋８０ｓ−ａ｝／ａ
４）Ｚ2u-1イオン（ｍ／ｚ）＝｛［３７９（ｕ−１）＋２０３］＋８０ｓ−ａ｝／ａ
Ｎ: 被検糖鎖の２糖単位数
Ｕ: 着目する切断グリコシド結合の属する、還元末端からの２糖単位の番号
３７９: 硫酸基を持たない２糖単位の質量
１７６: 硫酸基を持たないＧｌｃＡ残基の質量
２０３: 硫酸基を持たないＧａｌＮＡｃ残基の質量
８０: 硫酸基１個あたりの質量
１８: グリコシド結合の酸素の質量
ｓ: グリコシド結合が切断されて生じたイオンに含まれる硫酸基数（多くの場合、ＭＳ2スペクトルより判読可能）
ａ: グリコシド結合が切断されて生じたイオンの価数（多くの場合、ＭＳ2スペクトルにおける同位体組成より判読可能）
【００４４】
また、本発明において見出されたＣＨ及びＣＳのフラグメンテーションの規則性は図３のとおりである。
すなわち、グリコシド結合が切断される２糖単位中に存在するＧａｌＮＡｃ残基に硫酸基が存在しない場合には、Ｃ2(N-u)+1イオン及びＺ2u-1イオンの両方又は一方を生じる切断を生じ、グリコシド結合が切断される２糖単位中に存在するＧａｌＮＡｃ残基のＣ−４位に硫酸基が存在する場合には、Ｂ2(N-u)+1イオン及びＹ2u-1イオンの両方又は一方を生じる切断を生じ、グリコシド結合が切断される２糖単位中に存在するＧａｌＮＡｃ残基のＣ−６位に硫酸基が存在する場合には、Ｂ2(N-u)+1イオン及びＹ2u-1イオンの両方又は一方を生じる切断と、Ｃ2(N-u)+1イオン及びＺ2u-1イオンの両方又は一方を生じる切断を生じる。
【００４５】
また、フラグメンテーションのメカニズム上、グリコシド結合が切断される２糖単位中に存在するＧａｌＮＡｃ残基のＣ−４位およびＣ−６位の双方に硫酸基が存在する場合には、Ｂ2(N-u)+1イオン及びＹ2u-1イオンの両方又は一方が生じる切断が生じることになる。
【００４６】
ここで、「両方又は一方」と表現したのは、ＭＳ2におけるグリコシド結合切断後、電荷を有していないフラグメントについては装置原理上観測されないためである。本発明の場合、硫酸基もしくはカルボキシル基がイオン化時に脱プロトン化し、負電荷を獲得して検出されるが、すべてのそのような官能基が脱プロトン化するわけではないため、脱プロトン化した基が存在しない断片は検出されない。すなわち、Ｂ−タイプイオンとＹ−タイプイオンのいずれか、また、Ｃ−タイプイオンとＺ−タイプイオンのいずれかが観測されれば、当該結合は切断されたと見なすことができる。
【００４７】
本発明のＭＳ2スペクトルにおけるフラグメントイオンのｍ／ｚ値を予測する方法は、ＭＳ2において生じ得る全てのフラグメントイオンのｍ／ｚ値を予測する方法と、着目する一部のフラグメントイオンのｍ／ｚ値のみを予測する方法とを含む。
【００４８】
ＭＳ2において生じうる全てのフラグメントイオンのｍ／ｚ値を予測する場合には、Ｕ＝１〜Ｎの全てについて、２糖単位中のＧａｌＮＡｃの硫酸基の存在及び硫酸基位置に従って選ばれる、Ｂ、Ｃ、Ｙ及びＺ−タイプイオン（すなわち、切断されるグリコシド結合が属する２糖単位のＧａｌＮＡｃに硫酸基が存在しないときはＣ及びＺ−タイプイオン、Ｃ−４位に硫酸基が存在するときはＢ及びＹ−タイプイオン、Ｃ−６位にのみ硫酸基が存在するときはＢ，Ｃ，ＹおよびＺ−タイプイオン）のｍ／ｚ値を算出する。
【００４９】
一方、特定のグリコシド結合の切断によって生じるフラグメントイオンのｍ／ｚ値だけを予測することもできる。例えば、知りたいフラグメントイオンのｍ／ｚ値がＵ＝ｕにおけるグリコシド結合の切断により生じるＢ−タイプイオンのみである場合には、
Ｂ2(N-u)+1イオン（ｍ／ｚ）＝｛［３７９（Ｎ−ｕ）＋１７６］＋８０ｓ−ａ｝／ａ
の値のみ算出することができる。
【００５０】
続いて、モデルケースを用いて本願発明の方法を用いたＣＳの糖鎖長及び硫酸基位置の同定方法を、例を挙げて以下に示す。
【００５１】
あるＣＳオリゴ糖鎖のＭＳスペクトルを取得したところ、図４のように４６７のｍ／ｚ値に強いシグナルが現れた。スペクトルを横方向に拡大してみたところ(図略)、同位体のシグナルが４６７．５及び４６８．０のｍ／ｚ値に出現したため、これが２価のイオンであり、分子の質量は４６７×２＋２（Ｈ）＝９３６と算出された。
【００５２】
この分子量は、通常糖鎖の質量分析研究者が用いる糖鎖組成プログラム、Ｗｅｂリソース、あるいは経験則によれば、２０３（ＧａｌＮＡｃ）×２＋１７６（ＧｌｃＡ）×２＋１８（飽和オリゴ糖）＋８０（硫酸基）×２＝９３６となり、硫酸基が２箇所に結合したＣＳ４糖であると考えられる。この４６７のｍ／ｚ値を与えたイオンについてのＭＳ2スペクトルを取得したところ、図５のようになった。
【００５３】
４糖であれば、本発明によると着目すべきグリコシド結合は図６のように２箇所である。
【００５４】
ここで、ＭＳ2スペクトル上に既に２８２及び３００の両ｍ／ｚ値を与えるイオンが観測されている。これは１つの硫酸基を持ったＧａｌＮＡｃ、すなわちＹ1イオンとＺ1以外にはなく、これら双方の出現により、フラグメンテーション規則上、還元末端ＧａｌＮＡｃはＣ−６位が硫酸化されていることになる。
【００５５】
ちなみに、同じ切断位置から生じるＢ３及びＣ３イオンは、数式にあてはめると、
Ｂ2(2-1)+1(=3)イオン（ｍ／ｚ）＝｛［３７９（２−１）＋１７６］＋８０×１−１｝／１
＝６３４、及び
Ｃ2(2-1)+1(=3)イオン（ｍ／ｚ）＝｛［３７９（２−１）＋１７６］＋１８＋８０×１−１｝／１
＝６５２
となり、どちらのイオンもＭＳ2スペクトル上に観測されていることから、重ねて還元末端ＧａｌＮＡｃのＣ−６位が硫酸化されていることを確認し得る。
【００５６】
続いて、残る一つの硫酸基の位置について検討する。計算式においてＹ3及びＺ3イオ
ンのｍ／ｚ値を予測すると以下のようになる。
Ｙ2×2-1(=3)イオン（ｍ／ｚ）＝｛［３７９（２−１）＋２０３］＋１８＋８０×１−１｝／１
＝６７９、及び
Ｚ2×2-1(=3)イオン（ｍ／ｚ）＝｛［３７９（２−１）＋２０３］＋８０×１−１｝／１＝６６１。
【００５７】
しかしながら、これらのｍ／ｚ値のイオンはＭＳ2スペクトル上に確認できていない。念のために２価イオンを想定（ａ＝２）した計算値についても調べたが、いずれのイオンも同様に確認できなかった。一方、弱小シグナルではあるが、
Ｂ1（ｍ／ｚ）＝１７５
Ｃ1（ｍ／ｚ）＝１９３
のそれぞれに相当するイオンについてはＭＳ2スペクトル上に確認することができたため、当該グリコシド結合に関与するＧａｌＮＡｃのＣ−６位が硫酸化されていることが強く示唆される。
【００５８】
以上の検討の結果、図４および図５のＭＳスペクトル及びＭＳ2スペクトルを与えた糖鎖試料は、
ＧｌｃＡ−ＧａｌＮＡｃ６Ｓ−ＧｌｃＡ−ＧａｌＮＡｃ６Ｓ
の配列であると確定することができる。
【００５９】
上記モデルケースではＧａｌＮＡｃの硫酸基がすべて６位に位置しているケースについて説明した。当該ケースはＢ、Ｃ、Ｙ及びＺ−タイプの各フラグメントイオンが全て生じ得るために、他の硫酸基位置を有するものよりも解析が複雑であるといえる。従って、硫酸基が４位に位置しているケースや、４位と６位の双方に位置しているケース、あるいはＧａｌＮＡｃの全部又は一部に硫酸基が存在しないケースについても同様に糖鎖長及び硫酸基位置を同定できることは当業者に明らかである。また、糖鎖長が１０糖程度までのＣＨ又はＣＳであれば、ＭＳスペクトルデータから、前記糖鎖組成プログラム、Ｗｅｂリソース、あるいは経験則により硫酸基数や糖鎖長を予測することが可能であることも当業者に明らかである。
【実施例】
【００６０】
以下、実施例を挙げて本発明についてさらに詳細に説明を加える。ただし、本発明の範囲は実施例に限定されるものではない。
【００６１】
〔実施例１〕
ＭＳ2におけるＣＨの断片化規則の解析
硫酸基を持たないＣＨオリゴ糖を、そのＭＳnによる断片化（フラグメンテーション）の規則性を調べるために分析した。
【００６２】
（１）ＣＨオリゴ糖の調製
全てのＣＨオリゴ糖は愛知医科大学分子医科学研究所から入手した。簡単な手順は以下のとおりである。ＣＨの飽和４糖及び６糖（ＣＨ４及びＣＨ６）はＪ．Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ． ２７７，２１５６７−２１５７５（２００２）及びＡｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ３６５，６２−７３（２００７）に記載の方法をわずかに改良して調製した。すなわち、ＣＨ（生化学工業株式会社製）を精巣ヒアルロニダーゼ（タイプ−５、シグマ社製）により消化し、生じたオリゴ糖を陰イオン交換カラムクロマトグラフィーで分離した後、サイズ排除クロマトグラフィーにより脱塩した。非還元末端にＧａｌＮＡｃを有するＣＨ３及びＣＨ５は、ＣＨ４及びＣＨ６をβグルクロニダーゼ（牛肝臓由来、タイプＢ−１、シグマ社製）で処理することによって得た。ＣＨ６より長いオリゴ糖は、ＣＨ６を最初の
グリコシル化アクセプターとして使用し、ＣＨポリメラーゼにより酵素的に合成した。
【００６３】
（２）ＥＳＩ−ＭＳn分析条件
負イオンモードＥＳＩ−ＩＴ ＭＳは、Ｅｓｑｕｉｒｅ ３０００ Ｐｌｕｓ（Ｂｒｕｋｅｒ Ｄａｌｔｏｎｉｋ ＧｍｂＨ社製） を使用した。オリゴ糖を２．５ｍＭの酢酸アンモニウムを含む５０％メタノール（ｐＨ６．０）に溶解し、シリンジポンプを用いて３６０μＬ／時間の流速で装置に直接注入した。−３．８ｋＶのキャピラリー電圧、−５００Ｖのエンド−プレートオフセット、４．０Ｌ／分の乾燥窒素ガス流量、３００℃の乾燥温度にそれぞれセットして操作した。ＣＩＤ法によるＭＳnデータは、フラグメンテーションエネルギーを１．０Ｖに調整して取得した。スキャン分子量範囲は、ｍ／ｚ ５０〜１０００又は１５００に設定し、スキャン解像度は５５００Ｄａ／ｓに設定した。
【００６４】
（３）結果と考察（シグナルの帰属は、Ｇｌｙｃｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｊｏｕｒｎａｌ
５，３９７−４０９，１９８８に従って実施した）
３糖（ＣＨ３）〜８糖（ＣＨ８）のＣＨオリゴ糖について負イオンＥＳＩ質量スペクトルを得た（表１）。ＣＨ４〜ＣＨ８では２重の脱プロトン化分子である［Ｍ−２Ｈ］2-が顕著に出現した一方で、ＣＨ３では［Ｍ−Ｈ］-が顕著に出現した。その後、それらの断片化特性を調べるためにＣＩＤ ＭＳn実験を行った。
【表１】
【００６５】
図７に、ＭＳnプロダクトイオンの質量スペクトルの例を示す（（Ａ）：ＣＨ５、（
Ｂ）：ＣＨ６）。ほぼ全ての観察されたプロダクトイオン（フラグメントイオン）はグリコシド切断に由来するものであり、共通の断片化規則を見出した。すなわち、飽和ＣＨオリゴ糖は全てのＣＩＤプロセス1回ごとに単糖の残基を消失し、Ｃ−タイプイオンを生じた。
主にＣ−タイプイオンを産生するこれらの断片化について、３つのメカニズムが提唱できる（図８）。ＧａｌＮＡｃ残基の脱離は、チャージ・インデュースト・フラグメンテーションによって起こり得る（図８（Ａ）、（Ｃ））。一方、ＧｌｃＡ残基の脱離についても同様に、オキシラン環を形成するメカニズムが考えられる（図８（Ｂ））。
【００６６】
〔実施例２〕
ＭＳ2におけるＣＳの断片化規則の解析
配列が均一な２糖、４糖及び６糖のＣＳＡ及びＣＳＣオリゴ糖をＭＳnによって分析した。硫酸化された部位に特有のフラグメンテーションの特徴がＭＳ2スペクトルに観察された。断片化結果に基づいて、予想される開裂メカニズムについても考察する。
（１）ＣＳオリゴ糖の調製
全てのＣＳオリゴ糖は生化学工業株式会社において調製した（図９）。２糖、４糖及び６糖の均一な配列のＣＳＡオリゴ糖（ＣＳＡ２、ＣＳＡ４及びＣＳＡ６）はチョウザメの脊索から単離されたＣＳＡ（生化学工業株式会社製）から調製した。このＣＳＡはＣ−４が硫酸化されたＧａｌＮＡｃを有する２糖単位がクジラ軟骨から単離されたそれよりもかなり豊富である。このＣＳＡを精巣ヒアルロニダーゼ（タイプＶ, 購入先：シグマ社）で消化し、これにより生成したオリゴ糖を、硫酸化部位の異なる異性的オリゴ糖を分離できるＮＨ2修飾シリカカラム（ＹＭＣ−Ｐａｃｋ ＮＨ２， ＹＭＣ社製）に接続された陰イオン交換ＨＰＬＣによって繰り返し分離し、その後サイズ排除クロマトグラフィーにより脱塩した。こうして得られたオリゴ糖の構造を1Ｈ−ＮＭＲ測定及び酵素消化分析の両方によって分析し、Ｃ−４部位が硫酸化されたＧａｌＮＡｃのみを有することを確認した。
【００６７】
ＧａｌＮＡｃのＣ−６部位のみが全て硫酸化された均一な配列のＣＳＣの２糖、４糖及び６糖のオリゴ糖（ＣＳＣ２、ＣＳＣ４及びＣＳＣ６）は、市販されている硫酸化されていないコンドロイチン（ＣＨ、生化学工業社製）の化学的硫酸化物より調製した。低温下（０℃）におけるＮ，Ｎ−ジメチルフォルムアミド中でのピリジン−三酸化硫黄複合体によるＣＨの硫酸化により、一級水酸基（ＧａｌＮＡｃのＣ−６位）が主に硫酸化された硫酸化ＣＨを得た。その後、精巣ヒアルロニダーゼで消化して生成したオリゴ糖は、所望のオリゴ糖を得るためにサイズ排除クロマトグラフィーによって繰り返し分離された。こうして得られたオリゴ糖の構造を酵素消化により分析し、ＣＳに含有されるＧａｌＮＡｃは全てＣ−６位のみが硫酸化されていることを確認した。
【００６８】
（２）ＥＳＩ−ＭＳn分析条件
負イオンモードＥＳＩ−ＩＴ ＭＳは、Ｅｓｑｕｉｒｅ ３０００ Ｐｌｕｓ（Ｂｒｕｋｅｒ Ｄａｌｔｏｎｉｋ ＧｍｂＨ社製）を使用した。オリゴ糖サンプルは２．５ｍＭ酢酸アンモニウムを含むメタノール（スペクトロフォトメトリックグレード、販売元：アルドリッチケミカル）に溶解し、２０μＬ／ｈの流速でナノスプレー装置（ＰｉｃｏＴｉｐTM Ｅｍｉｔｔｅｒ、Ｎｅｗ Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ社製）を用いて装置に注入した。−２．５ｋＶのキャピラリー電圧、−５００Ｖのエンドプレートオフセット、５．０Ｌ／分の乾燥窒素ガス流量、３００℃の乾燥温度にセットし操作した。ＣＩＤ−ＭＳ2データはフラグメンテーションエネルギーを１．０Ｖに調整して取得した。スキャン質量範囲はｍ／ｚ ５０〜１５００であり、スキャン解像度は５５００ｍ／ｚ／ｓとした。
【００６９】
（３）結果と考察
１）均一な配列のＣＳＡオリゴ糖
チョウザメの脊索由来のＣＳＡはＧｌｃＡ−ＧａｌＮＡｃ４Ｓ配列を高含有（＞９０％）するものであるため、その単純反復配列（均一な配列）のオリゴ糖の調製に適している。このＣＳＡから得られたオリゴ糖、すなわちＣＳＡ２、ＣＳＡ４及びＣＳＡ６をＭＳnにかけた。
【００７０】
ＣＳＡオリゴ糖の各ＭＳスペクトルは、本研究において採用した条件下で、［Ｍ−ｎＨ］n-（「ｎ」は分子中の硫酸基の数に等しい）に対応する単純な単一シグナルを示した（データ省略）。すなわち、ＣＳＡ２、ＣＳＡ４及びＣＳＡ６は、ＭＳにおいてそれぞれ［Ｍ−Ｈ］-（ｍ／ｚ ４７６）、［Ｍ−２Ｈ］2-（ｍ／ｚ ４６７）及び［Ｍ−３Ｈ］3-（ｍ／ｚ ４６４）のイオンを与えた。続いてそれぞれのイオンを前駆イオンとしてＭＳnにかけた。図１０は、ＭＳ2におけるオリゴ糖の生成物イオンマススペクトルを示す。それらは高度に規則的なグリコシド切断様式を示し、脱硫酸を伴わずにＢ−タイプ及びＹ−タイプのプロダクトイオンを生成した。それらは全て、それぞれの負荷電がそれぞれの硫酸基に位置しているとの想定のもとに帰属することができた（表２）。硫酸化されていないＣＨオリゴ糖の断片化では、ほとんどの断片がＣ−タイプイオンであり、負荷電はカルボキシル基に位置していると考えられる。従って、ＧａｌＮＡｃのＣ−４水酸基の硫酸化は、オリゴ糖の断片化パターンに重要な影響を与えることが立証された。
【表２】
【００７１】
２）均一な配列のＣＳＣオリゴ糖
同様に、均一な配列のＣＳＣオリゴ糖を分析した。それらのＭＳ2スペクトルを図１１に示すが、均一な配列のＣＳＡオリゴ糖の場合とは対照的に、非常に複雑な特徴を示した。ＣＳＡオリゴ糖で観察されたプロダクトイオンの全てはＣＳＣオリゴ糖断片においてもまた観察され、特にＢ−タイプ及びＹ−タイプイオンが共通している点は注目に値する（図１０）。加えて、同一のグリコシド結合において、Ｃ−タイプ及びＺ−タイプイオンがＢ−タイプ及びＹ−タイプイオンと匹敵する程度にほぼ等量生じた。興味深いことに、いくつかのプロダクトイオンは硫酸基を失って水酸基を生じている点（例えば、［Ｍ−ＳＯ3−ｎＨ］n-、Ｂ3−ＳＯ3、Ｃ3−ＳＯ3等）もまた注目された。脱硫酸種及びＣ−タイプ及びＺ−タイプイオンは、均一な配列のＣＳＡオリゴ糖の断片としては、全く検出されないか、検出されても極微量であった。すなわち、ＣＳＣオリゴ糖の前駆イオンは多様な断片化を起こすことが分かった。
【００７２】
３）断片化メカニズム
本研究で得られたデータは、ＣＳ骨格の断片化（フラグメンテーション）パターンがＧａｌＮＡｃ残基における硫酸化位置を明確に反映することを示してきた。これらの断片化メカニズムは下記のように考察できる。
【００７３】
I）ＧｌｃＡの還元末端側においてＢ−タイプ及びＹ−タイプイオンを生成するグリコシド切断
この切断はＣＳＡとＣＳＣオリゴ糖の両方の断片化において起こったが、ＣＨオリゴ糖では起こらなかった。すなわちこれは、ＣＳの硫酸化配列のための特有の開裂プロセスとして考えられ、ＧｌｃＡのＣ−２水酸基が関与するメカニズムによって理解される（図１２(Ｂ)及び（Ｃ）、非特許文献５）。このプロセスは電荷位置に影響されない断片化（チャージリモートフラグメンテーション）であり、従って、ＧａｌＮＡｃ残基における硫酸基の位置とは無関係に生じる。
【００７４】
II）ＧｌｃＡの還元末端側においてＣ−タイプ及びＺ−タイプイオンを生成するグリコシド切断
このタイプのグルクロニド切断はＣＳＣオリゴ糖において観察されたが、ＣＳＡでは観察されなかった。一方で、非硫酸化ＣＨオリゴ糖でも生じる切断パターンである（図１２（Ａ））。チャージインデューストフラグメンテーションによるＣＨオリゴ糖の断片化において、カルボキシル基に存在する負電荷は、Ｃ−タイプ及びＺ−タイプイオンを与える開裂プロセスの引き金となる（図８）。しかしながら、本来硫酸化された糖の一般的なケースではそれらは荷電に影響されない断片化（チャージリモートフラグメンテーション）をする（非特許文献５及びＲａｐｉｄ Ｃｏｍｍｕｎ． Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍ． １９ １７８８−１７９６（２００５））。ここで、ＣＳＣオリゴ糖の断片化については、プロトン移動を仮定することにより、その断片化メカニズムを理解することが可能である（図１２（Ｃ））。
【００７５】
以上のように、ＣＨとＣＳオリゴ糖のＥＳＩ−ＭＳ2での断片化は、個々の構造に特異的な開裂メカニズムをベースに理解することができた。これらの組織化された知見は、ＣＳＡ及びＣＳＣの両者のオリゴ糖の区別だけでなく、多種のＣＳ関連オリゴ糖の配列決定にも拡張することができると考えられる。
【００７６】
より普遍的なＣＳ配列決定プロトコール
次に、上記ＭＳ2スペクトルの規則性に基づき、任意の配列のＣＳについて、その配列の予測が可能であることについて述べる。
【００７７】
上記実施例では、ＣＨ、ＣＳＡ及びＣＳＣの均一な配列の標準オリゴ糖を分析した。得られたデータによって、ＧａｌＮＡｃの硫酸化位置に特異的な断片化規則を見出すこと
ができた（図１２に断片化メカニズムを示す）。これらの結果を総合すれば、不均一な硫酸化配列を有するＣＳオリゴ糖の断片化挙動についても、図１３のように推測可能であることが理解できる。
【産業上の利用可能性】
【００７８】
本発明は、多段階質量分析装置を用いたＣＨ及びＣＳの糖鎖長及び硫酸基位置の同定手段を提供するものであり、これによりＣＨ及びＣＳの糖鎖長及び硫酸基位置と生体における機能の関係を明らかにすることができるため、ＣＨもしくはＣＳの化学構造の異常に起因する各種疾患の診断、治療に貢献することができる。
【図面の簡単な説明】
【００７９】
【図１】還元末端にＧａｌＮＡｃ残基、非還元末端にＧｌｃＡ残基を有するＣＨ又はＣＳの分子構造モデルを示した図である。
【図２】グリコシド結合の切断により生じるフラグメントイオンの命名法を示した図である。
【図３】ＧａｌＮＡｃ残基の硫酸基位置と、該ＧａｌＮＡｃ残基が属する２糖単位中のグリコシド結合の切断により生じるフラグメントイオンのタイプとの関係を示す図である。
【図４】モデルケースのＭＳスペクトルを示す図である。
【図５】モデルケースのＭＳ2スペクトルを示す図である。
【図６】モデルケースにおける、着目すべきグリコシド結合と、そこから生じ得るフラグメントイオンのタイプを示した図である。
【図７】ＣＨオリゴ糖の典型的なＥＳＩ−ＭＳnフラグメントを示す図である（（Ａ）：ＣＨ５、（Ｂ）ＣＨ６）。
【図８】飽和ＣＨオリゴ糖のＭＳn断片化の提唱されるメカニズムを示す図である（（Ａ）：Ｃ−タイプイオンを生じるグルクロニド結合の還元末端側の切断メカニズム、（Ｂ）：Ｃ又はＺ−タイプイオンを生じるＮ−アセチルガラクトサミニドの切断メカニズム）、（Ｃ）：Ｃ−タイプイオンを生じるグルクロニド結合の切断メカニズム）。
【図９】本実施例で分析したＣＳオリゴ糖の構造（（Ａ）：均一な配列のＣＳＡオリゴ糖、（Ｂ）：均一な配列のＣＳＣオリゴ糖）を示す図である。
【図１０】分析された均一な配列のＣＳＡオリゴ糖のＥＳＩ−ＭＳ2スペクトルを示す図である（（Ａ）：ＣＳＡ２、（Ｂ）ＣＳＡ４、（Ｃ）ＣＳＡ６）。各オリゴ糖の断片化パターンについてもそれぞれ図示した（（Ｄ）：ＣＳＡ２、（Ｅ）：ＣＳＡ４、（Ｆ）：ＣＳＡ６）。
【図１１】分析された均一な配列のＣＳＣオリゴ糖のＥＳＩ−ＭＳ2スペクトルを示す図である（（Ａ）：ＣＳＣ２、（Ｂ）ＣＳＣ４、（Ｃ）：ＣＳＣ６）。各オリゴ糖の断片化パターンについてもそれぞれ図示した（（Ｄ）：ＣＳＣ２、（Ｅ）：ＣＳＣ４、（Ｆ）：ＣＳＣ６）。
【図１２】ＣＨオリゴ糖（図中（Ａ））、ＣＳＡオリゴ糖（図中（Ｂ））及びＣＳＣオリゴ糖（図中（Ｃ））のグリコシド結合の推定切断メカニズムを示した図である。
【図１３】均一な配列と不均一な配列のＣＳにおける切断パターンを示した図である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも以下の工程を含む、コンドロイチン又はコンドロイチン硫酸をＭＳ2に付した際に生じるフラグメントイオンのＭＳ2スペクトルにおけるｍ／ｚ値を予測する方法：
（I）ＭＳ2スペクトルにおけるｍ／ｚ値の予測対象となる２糖単位からなるコンドロイチン又はコンドロイチン硫酸の糖鎖長及び硫酸基位置を設定する工程；
（II）前記（I）のコンドロイチン又はコンドロイチン硫酸をＭＳ2に付した際に切断されるグリコシド結合が属する２糖単位を選択する工程；
（III）前記（I）のコンドロイチン又はコンドロイチン硫酸について、下記の（i）〜（iv）の各数値を求める工程；及び
（i）Ｎ：２糖単位の数、
（ii）ｕ：還元末端から順に２糖単位を１単位として番号を付した場合における、前記（II）で選択した２糖単位の番号、
（iii）ｓ：前記（II）において選択した２糖単位に属するグリコシド結合が切断されて生じるフラグメントイオンの硫酸基の数、
（iv）ａ：前記（II）において選択した２糖単位に属するグリコシド結合が切断されて生じるフラグメントイオンの価数、
（IV）前記（III）の工程により求めた各数値を、以下の（Ａ）〜（Ｃ）のいずれかに従って下記（イ）〜（ニ）の式に当てはめて、前記（II）で選択した２糖単位に属するグリコシド結合の切断によって生じ得るＢ、Ｃ、Ｙ及びＺ−タイプから選ばれるフラグメントイオンのＭＳ2スペクトルにおけるｍ／ｚ値を求める工程；
（Ａ）前記（II）で選択したグリコシド結合が属する２糖単位を構成するＮ−アセチルガラクトサミンが硫酸基を有さない場合には下記の（ロ）及び（ニ）の式、
（Ｂ）前記Ｎ−アセチルガラクトサミンのＣ−４位に硫酸基を有している場合には下記の（イ）及び（ハ）の式、又は
（Ｃ）前記Ｎ−アセチルガラクトサミンのＣ−６位のみに硫酸基を有している場合には下記の（イ）〜（ニ）の全ての式、
（イ）Ｂ2(N-u)+1イオン（ｍ／ｚ）＝｛［３７９（Ｎ−ｕ）＋１７６］＋８０ｓ−ａ｝／ａ、
（ロ）Ｃ2(N-u)+1イオン（ｍ／ｚ）＝｛［３７９（Ｎ−ｕ）＋１７６］＋１８＋８０ｓ−ａ｝／ａ、
（ハ）Ｙ2u-1イオン（ｍ／ｚ）＝｛［３７９（ｕ−１）＋２０３］＋１８＋８０ｓ−ａ｝／ａ、
（ニ）Ｚ2u-1イオン（ｍ／ｚ）＝｛［３７９（ｕ−１）＋２０３］＋８０ｓ−ａ｝／ａ。
【請求項２】
少なくとも以下の工程を含む、分子構造が不明なコンドロイチン又はコンドロイチン硫酸の糖鎖長及び硫酸基位置の同定方法；
（V）分子構造が不明なコンドロイチン又はコンドロイチン硫酸をＭＳ2に付して、得られたＭＳ2スペクトルにおいて観察される全てのフラグメントイオンのｍ／ｚ値を取得する工程、
（VI）請求項１に記載の方法で、糖鎖長及び硫酸基位置を設定したコンドロイチン又はコンドロイチン硫酸をＭＳ2に付した際に２糖単位中のグリコシド結合が切断されて生じ得る全てのフラグメントイオンについて、ＭＳ2スペクトルにおけるｍ／ｚ値の予測値を取得する工程、及び
（VII）前記（V）の工程により取得した全てのｍ／ｚ値と、前記（VI）の工程により取得した全てのｍ／ｚ値の予測値とを比較し、両者が実質的に一致したときに、前記分子構造が不明なコンドロイチン又はコンドロイチン硫酸の糖鎖長及び硫酸基位置が、前記（VI）の工程で設定した糖鎖長及び硫酸基位置であると同定する工程。
【請求項３】
前記（V）の工程により取得した全てのｍ／ｚ値と、前記（VI）の工程により取得した全てのｍ／ｚ値の予測値とが実質的に一致するまで前記（VI）及び（VII）の工程を繰り返す工程をさらに含む、請求項２に記載の同定方法。
【請求項４】
少なくとも以下の工程を含む、分子構造が不明なコンドロイチン又はコンドロイチン硫酸の糖鎖長及び硫酸基位置の同定方法；
（VIII）請求項１に記載の方法で、異なる糖鎖長及び硫酸基位置に設定した、２糖単位からなる複数のコンドロイチン又はコンドロイチン硫酸の各々について、ＭＳ2に付した際に２糖単位中のグリコシド結合が切断されて生じ得る全てのフラグメントイオンについてＭＳ2スペクトルにおけるｍ／ｚ値の予測値を取得し、前記糖鎖長及び硫酸基位置と、前記ｍ／ｚ値の予測値との対応についてデータベースを作成する工程、
（IX）分子構造が不明なコンドロイチン又はコンドロイチン硫酸をＭＳ2に付して、得られたＭＳ2スペクトルにおいて観察される全てのフラグメントイオンのｍ／ｚ値を取得する工程、及び
（X）前記（IX）の工程により取得した全てのｍ／ｚ値を、前記（VIII）の工程で作成したデータベース上のｍ／ｚ値と照合し、前記（IX）の工程により取得した全てのｍ／ｚ値と実質的に一致するｍ／ｚ値の予測値を有するコンドロイチン又はコンドロイチン硫酸の糖鎖長及び硫酸基位置を見出す工程。
【請求項５】
前記コンドロイチン又はコンドロイチン硫酸は、それぞれコンドロイチンオリゴ糖又はコンドロイチン硫酸オリゴ糖である請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項１】
少なくとも以下の工程を含む、コンドロイチン又はコンドロイチン硫酸をＭＳ2に付した際に生じるフラグメントイオンのＭＳ2スペクトルにおけるｍ／ｚ値を予測する方法：
（I）ＭＳ2スペクトルにおけるｍ／ｚ値の予測対象となる２糖単位からなるコンドロイチン又はコンドロイチン硫酸の糖鎖長及び硫酸基位置を設定する工程；
（II）前記（I）のコンドロイチン又はコンドロイチン硫酸をＭＳ2に付した際に切断されるグリコシド結合が属する２糖単位を選択する工程；
（III）前記（I）のコンドロイチン又はコンドロイチン硫酸について、下記の（i）〜（iv）の各数値を求める工程；及び
（i）Ｎ：２糖単位の数、
（ii）ｕ：還元末端から順に２糖単位を１単位として番号を付した場合における、前記（II）で選択した２糖単位の番号、
（iii）ｓ：前記（II）において選択した２糖単位に属するグリコシド結合が切断されて生じるフラグメントイオンの硫酸基の数、
（iv）ａ：前記（II）において選択した２糖単位に属するグリコシド結合が切断されて生じるフラグメントイオンの価数、
（IV）前記（III）の工程により求めた各数値を、以下の（Ａ）〜（Ｃ）のいずれかに従って下記（イ）〜（ニ）の式に当てはめて、前記（II）で選択した２糖単位に属するグリコシド結合の切断によって生じ得るＢ、Ｃ、Ｙ及びＺ−タイプから選ばれるフラグメントイオンのＭＳ2スペクトルにおけるｍ／ｚ値を求める工程；
（Ａ）前記（II）で選択したグリコシド結合が属する２糖単位を構成するＮ−アセチルガラクトサミンが硫酸基を有さない場合には下記の（ロ）及び（ニ）の式、
（Ｂ）前記Ｎ−アセチルガラクトサミンのＣ−４位に硫酸基を有している場合には下記の（イ）及び（ハ）の式、又は
（Ｃ）前記Ｎ−アセチルガラクトサミンのＣ−６位のみに硫酸基を有している場合には下記の（イ）〜（ニ）の全ての式、
（イ）Ｂ2(N-u)+1イオン（ｍ／ｚ）＝｛［３７９（Ｎ−ｕ）＋１７６］＋８０ｓ−ａ｝／ａ、
（ロ）Ｃ2(N-u)+1イオン（ｍ／ｚ）＝｛［３７９（Ｎ−ｕ）＋１７６］＋１８＋８０ｓ−ａ｝／ａ、
（ハ）Ｙ2u-1イオン（ｍ／ｚ）＝｛［３７９（ｕ−１）＋２０３］＋１８＋８０ｓ−ａ｝／ａ、
（ニ）Ｚ2u-1イオン（ｍ／ｚ）＝｛［３７９（ｕ−１）＋２０３］＋８０ｓ−ａ｝／ａ。
【請求項２】
少なくとも以下の工程を含む、分子構造が不明なコンドロイチン又はコンドロイチン硫酸の糖鎖長及び硫酸基位置の同定方法；
（V）分子構造が不明なコンドロイチン又はコンドロイチン硫酸をＭＳ2に付して、得られたＭＳ2スペクトルにおいて観察される全てのフラグメントイオンのｍ／ｚ値を取得する工程、
（VI）請求項１に記載の方法で、糖鎖長及び硫酸基位置を設定したコンドロイチン又はコンドロイチン硫酸をＭＳ2に付した際に２糖単位中のグリコシド結合が切断されて生じ得る全てのフラグメントイオンについて、ＭＳ2スペクトルにおけるｍ／ｚ値の予測値を取得する工程、及び
（VII）前記（V）の工程により取得した全てのｍ／ｚ値と、前記（VI）の工程により取得した全てのｍ／ｚ値の予測値とを比較し、両者が実質的に一致したときに、前記分子構造が不明なコンドロイチン又はコンドロイチン硫酸の糖鎖長及び硫酸基位置が、前記（VI）の工程で設定した糖鎖長及び硫酸基位置であると同定する工程。
【請求項３】
前記（V）の工程により取得した全てのｍ／ｚ値と、前記（VI）の工程により取得した全てのｍ／ｚ値の予測値とが実質的に一致するまで前記（VI）及び（VII）の工程を繰り返す工程をさらに含む、請求項２に記載の同定方法。
【請求項４】
少なくとも以下の工程を含む、分子構造が不明なコンドロイチン又はコンドロイチン硫酸の糖鎖長及び硫酸基位置の同定方法；
（VIII）請求項１に記載の方法で、異なる糖鎖長及び硫酸基位置に設定した、２糖単位からなる複数のコンドロイチン又はコンドロイチン硫酸の各々について、ＭＳ2に付した際に２糖単位中のグリコシド結合が切断されて生じ得る全てのフラグメントイオンについてＭＳ2スペクトルにおけるｍ／ｚ値の予測値を取得し、前記糖鎖長及び硫酸基位置と、前記ｍ／ｚ値の予測値との対応についてデータベースを作成する工程、
（IX）分子構造が不明なコンドロイチン又はコンドロイチン硫酸をＭＳ2に付して、得られたＭＳ2スペクトルにおいて観察される全てのフラグメントイオンのｍ／ｚ値を取得する工程、及び
（X）前記（IX）の工程により取得した全てのｍ／ｚ値を、前記（VIII）の工程で作成したデータベース上のｍ／ｚ値と照合し、前記（IX）の工程により取得した全てのｍ／ｚ値と実質的に一致するｍ／ｚ値の予測値を有するコンドロイチン又はコンドロイチン硫酸の糖鎖長及び硫酸基位置を見出す工程。
【請求項５】
前記コンドロイチン又はコンドロイチン硫酸は、それぞれコンドロイチンオリゴ糖又はコンドロイチン硫酸オリゴ糖である請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【公開番号】特開２００９−２６４９６６（Ｐ２００９−２６４９６６Ａ）
【公開日】平成２１年１１月１２日（２００９．１１．１２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−１１５７６４（Ｐ２００８−１１５７６４）
【出願日】平成２０年４月２５日（２００８．４．２５）
【出願人】（０００１９５５２４）生化学工業株式会社 (143)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２１年１１月１２日（２００９．１１．１２）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年４月２５日（２００８．４．２５）
【出願人】（０００１９５５２４）生化学工業株式会社 (143)
【Ｆターム（参考）】
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