細胞・組織の凍結障害防止液及び凍結保存法
【課題】例えば、糖尿病に対する根治療法である膵島細胞移植では凍結保存された膵島を解凍して使用することがある。膵島細胞などの凍結保存において、凍結解凍障害を軽減し解凍後も高い生存率と機能を維持できる細胞凍結保存法を提供する。
【解決手段】緑茶ポリフェノールの主成分であるエピガロカテキンガレートを凍結保存前の膵島細胞に付着させる。具体的には、エピガロカテキンガレート（EGCg）を、例えば３０〜１２０ｐｐｍ（μｇ／ｍｌ）添加した通常の細胞培養用培地（例えば１０％ウシ胎児血清含有CMRL培地）で凍結前に膵島細胞を培養する。
【解決手段】緑茶ポリフェノールの主成分であるエピガロカテキンガレートを凍結保存前の膵島細胞に付着させる。具体的には、エピガロカテキンガレート（EGCg）を、例えば３０〜１２０ｐｐｍ（μｇ／ｍｌ）添加した通常の細胞培養用培地（例えば１０％ウシ胎児血清含有CMRL培地）で凍結前に膵島細胞を培養する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、膵島細胞などの凍結解凍障害を軽減可能な凍結障害防止液及び凍結保存方法に関する。皮膚、角膜、心臓弁など他の生体組織移植分野及びES細胞などを用いる再生医療分野においてもこの技術の需要は高まると予測される。
【背景技術】
【０００２】
細胞や生体組織の凍結保存技術は、5〜15%DMSO（ジメチルスルホキシド）を含む培養液に細胞を懸濁しクライオチューブに詰めて冷却し、最終的に-196℃の極低温で凍結保存するのが一般的である。そして細胞や生体組織が必要な時は、これらの凍結細胞や生体組織を急速解凍して得る。
【特許文献１】特表２０００−５０７５４７
【特許文献２】特開２００３−２２５０８４
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
しかし、上記の従来の凍結保存法では、例えば、凍結解凍後の膵島細胞生存率はとても低くさらに機能も低下することが問題である。
【０００４】
その原因は凍結解凍時に細胞が障害を受けることによるもので、例え解凍直後は生存していたとしてもひどく障害された細胞は生存能力（ｖｉａｂｉｌｉｔｙ）が低く、移植あるいは培養の後、死んでいくことになる。細胞の凍結解凍障害にはMMP(matrix metalloproteinase：マトリックス分解酵素)、あるいはフリーラジカル等の関与が知られている。
【０００５】
この発明は上記の問題を解決するものであり、その目的とするところは、酵素活性を阻害したり、フリーラジカルを制御することで凍結解凍障害を軽減する方法を開発することである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
ポリフェノールには抗菌・抗ウイルス作用、抗癌作用、抗酸化作用などの生理活性作用があること知られているが、ラジカルスカベンジャー能も報告されている。またポリフェノールがこのMMP(matrix metalloproteinase)を阻害するという知見も散見される。
【０００７】
上記の目的を達成するため、この発明の凍結保存法には、典型的には緑茶ポリフェノール、特にはその主要成分であるエピガロカテキンガレート（EGCg）を用いる。例えば、具体的には、エピガロカテキンガレート（EGCg）を添加した通常の細胞培養用培地で凍結前に膵島細胞を培養する。すなわち、EGCgを膵島に付着させることで凍結保存および解凍時の細胞障害を軽減させる。
【発明の効果】
【０００８】
保存細胞や保存生体組織の生存率及び質を高く維持することができ、良質な移植用または実験用の細胞や生体組織を必要時に必要量提供することを可能にする。
【０００９】
例えば、膵島移植は細胞移植医療の代表的な例で、レシピエントにとって侵襲が少なく安全性が高い。この発明で凍結保存後解凍された膵島でも生存率及び質が高く維持できることによって、膵島バンキングシステムがより現実的なものとなり、良質な膵島を必要時に必要量提供することを可能にする。
【００１０】
糖尿病という疾患が国民病と呼ばれること、また膵島細胞はその機能を簡便に評価できることから動物の膵島細胞を用いた研究は頻繁に行なわれている。しかし膵島は培養が難しく凍結保存後では質が悪いので実験に用いる場合、その都度膵島分離を行い新鮮な状態で使用しなければならない。この発明によって凍結保存後でも充分に実験に用いられる量と質の膵島を得ることができれば、煩雑で手間がかかる膵島分離作業を省略できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
本発明の細胞保存法は、人または動物の組織から単離した膵島細胞の保存に、特に効果的である。しかし、血管、軟骨その他の骨、神経、心臓弁その他の弁、羊膜などの生体組織、特には移植用生体組織に使用可能である。
【００１２】
ポリフェノールは、植物ポリフェノールであり、特には緑茶に含まれる植物ポリフェノール成分である。緑茶ポリフェノールは、実質上カテキン類であり、少量の他の植物ポリフェノールを不純物として含んでも良い。緑茶ポリフェノールは、カテキン類の中でも、エピガロカテキンガレート（(-)-エピガロカテキン-3-O-ガレート；EGCg）を主要成分とするのが好ましい。ここで、EGCgの含量は、好ましくは９０重量％以上、より好ましくは９５重量％以上、さらに好ましくは９８重量％以上である。EGCgの細胞用培地における添加濃度は、例えば１０〜３００μg/ml（ppm）であり、好ましくは３０〜１２０μg/ml（ppm）である。添加濃度が、３００μg/ml（ppm）を越えると、凍結障害防止の効果が見られなくなってしまう。
【００１３】
付着とは、EGCgが細胞表面に、比較的強い分子間相互作用によって吸着されることをいう。したがって、膵島細胞をEGCg含有細胞培地にて培養するかまたは一定時間浸漬した後、EGCgを含まない培地に移して保存してもほぼ同様の効果が得られる。凍結保存前の、EGCg含有細胞培地中での培養は、例えば0.5〜3時間行う。
【００１４】
本発明の凍結障害防止液は、細胞・生体組織用の培養液と、凍結防御剤とからなる従来の凍結保存液に、緑茶ポリフェノールを添加したものである。緑茶ポリフェノールの添加濃度は、EGCgを例にとり上記に説明したとおりである。凍結防御剤としては、5〜15%のDMSOを添加するのが一般に好ましいが、グリセリン、エチレングリコール、ＰＶＰ（ポリビニルピロリドン）などを、適宜用いることができる。本発明の凍結保存液は、市販の凍結保存液、例えば日本全薬工業(株)製の「セルバンカー（cell banker）」にEGCgなどを添加して得ることもでき、また、市販の細胞・生体組織用の培養液に、EGCgなどと、上記の凍結保存液とを添加して得ることもできる。
【００１５】
以下、この発明の実施例及び比較例を示す。
【００１６】
＜試験方法＞
ブタの膵臓から膵島を分離し、分離された膵島細胞を以下の4群に分けた。EGCgとしては、純度約９８重量％のもの（Roche社）を用いた。
グループ1：EGCg無添加培地で培養（従来法）
グループ2：EGCg 30μg/ml添加培地で培養
グループ3：EGCg 60μg/ml添加培地で培養
グループ4：EGCg 120μg/ml添加培地で培養
各群とも培地は、10%ウシ胎児血清含有CMRL細胞培養用培地に、凍結防御剤としてDMSOを10%となるように添加したものを使用し、その後プログラムフリーザーを用いて凍結した。最終的に液体窒素中（-196℃）に保存し、4週間後に急速解凍した。そして、解凍直後、及び、解凍後に48時間培養した後の膵島細胞の生存率（生存率＝凍結解凍後の膵島数 / 凍結前の膵島数）を比較検討した。また、解凍直後のバイアビリティー及び膵島機能を比較検討した。
【００１７】
＜結果＞
解凍直後の膵島細胞の生存率は、従来法（グループ1）では約50%と低かったが、EGCg添加群（グループ2〜4）では60〜80%と著明な改善が認められた（図1）。また48時間培養後でも生存率は従来法（グループ1）では約25%と低いのに対し、EGCg添加群（グループ2〜4）では45〜70%と有意に高かった（図1）。バイアビリティーにおいても従来法（グループ1）では約70%だったのに対し、EGCg添加群（グループ2〜4）では80〜85%と高かった（図2）。解凍直後の膵島機能をグルコース負荷試験によるインスリン分泌反応（Static Incubation）で検討したところ、EGCg添加群では無添加群に比べ良好な傾向にあった（図3）。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】凍結解凍後（直後、48時間培養後）のブタ膵島生存率のグラフである。
【図２】解凍直後のブタ膵島のバイアビリティーを示すグラフである。
【図３】凍結解凍直後の膵島機能（Stimulation Index）を示すグラフである。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、膵島細胞などの凍結解凍障害を軽減可能な凍結障害防止液及び凍結保存方法に関する。皮膚、角膜、心臓弁など他の生体組織移植分野及びES細胞などを用いる再生医療分野においてもこの技術の需要は高まると予測される。
【背景技術】
【０００２】
細胞や生体組織の凍結保存技術は、5〜15%DMSO（ジメチルスルホキシド）を含む培養液に細胞を懸濁しクライオチューブに詰めて冷却し、最終的に-196℃の極低温で凍結保存するのが一般的である。そして細胞や生体組織が必要な時は、これらの凍結細胞や生体組織を急速解凍して得る。
【特許文献１】特表２０００−５０７５４７
【特許文献２】特開２００３−２２５０８４
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
しかし、上記の従来の凍結保存法では、例えば、凍結解凍後の膵島細胞生存率はとても低くさらに機能も低下することが問題である。
【０００４】
その原因は凍結解凍時に細胞が障害を受けることによるもので、例え解凍直後は生存していたとしてもひどく障害された細胞は生存能力（ｖｉａｂｉｌｉｔｙ）が低く、移植あるいは培養の後、死んでいくことになる。細胞の凍結解凍障害にはMMP(matrix metalloproteinase：マトリックス分解酵素)、あるいはフリーラジカル等の関与が知られている。
【０００５】
この発明は上記の問題を解決するものであり、その目的とするところは、酵素活性を阻害したり、フリーラジカルを制御することで凍結解凍障害を軽減する方法を開発することである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
ポリフェノールには抗菌・抗ウイルス作用、抗癌作用、抗酸化作用などの生理活性作用があること知られているが、ラジカルスカベンジャー能も報告されている。またポリフェノールがこのMMP(matrix metalloproteinase)を阻害するという知見も散見される。
【０００７】
上記の目的を達成するため、この発明の凍結保存法には、典型的には緑茶ポリフェノール、特にはその主要成分であるエピガロカテキンガレート（EGCg）を用いる。例えば、具体的には、エピガロカテキンガレート（EGCg）を添加した通常の細胞培養用培地で凍結前に膵島細胞を培養する。すなわち、EGCgを膵島に付着させることで凍結保存および解凍時の細胞障害を軽減させる。
【発明の効果】
【０００８】
保存細胞や保存生体組織の生存率及び質を高く維持することができ、良質な移植用または実験用の細胞や生体組織を必要時に必要量提供することを可能にする。
【０００９】
例えば、膵島移植は細胞移植医療の代表的な例で、レシピエントにとって侵襲が少なく安全性が高い。この発明で凍結保存後解凍された膵島でも生存率及び質が高く維持できることによって、膵島バンキングシステムがより現実的なものとなり、良質な膵島を必要時に必要量提供することを可能にする。
【００１０】
糖尿病という疾患が国民病と呼ばれること、また膵島細胞はその機能を簡便に評価できることから動物の膵島細胞を用いた研究は頻繁に行なわれている。しかし膵島は培養が難しく凍結保存後では質が悪いので実験に用いる場合、その都度膵島分離を行い新鮮な状態で使用しなければならない。この発明によって凍結保存後でも充分に実験に用いられる量と質の膵島を得ることができれば、煩雑で手間がかかる膵島分離作業を省略できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
本発明の細胞保存法は、人または動物の組織から単離した膵島細胞の保存に、特に効果的である。しかし、血管、軟骨その他の骨、神経、心臓弁その他の弁、羊膜などの生体組織、特には移植用生体組織に使用可能である。
【００１２】
ポリフェノールは、植物ポリフェノールであり、特には緑茶に含まれる植物ポリフェノール成分である。緑茶ポリフェノールは、実質上カテキン類であり、少量の他の植物ポリフェノールを不純物として含んでも良い。緑茶ポリフェノールは、カテキン類の中でも、エピガロカテキンガレート（(-)-エピガロカテキン-3-O-ガレート；EGCg）を主要成分とするのが好ましい。ここで、EGCgの含量は、好ましくは９０重量％以上、より好ましくは９５重量％以上、さらに好ましくは９８重量％以上である。EGCgの細胞用培地における添加濃度は、例えば１０〜３００μg/ml（ppm）であり、好ましくは３０〜１２０μg/ml（ppm）である。添加濃度が、３００μg/ml（ppm）を越えると、凍結障害防止の効果が見られなくなってしまう。
【００１３】
付着とは、EGCgが細胞表面に、比較的強い分子間相互作用によって吸着されることをいう。したがって、膵島細胞をEGCg含有細胞培地にて培養するかまたは一定時間浸漬した後、EGCgを含まない培地に移して保存してもほぼ同様の効果が得られる。凍結保存前の、EGCg含有細胞培地中での培養は、例えば0.5〜3時間行う。
【００１４】
本発明の凍結障害防止液は、細胞・生体組織用の培養液と、凍結防御剤とからなる従来の凍結保存液に、緑茶ポリフェノールを添加したものである。緑茶ポリフェノールの添加濃度は、EGCgを例にとり上記に説明したとおりである。凍結防御剤としては、5〜15%のDMSOを添加するのが一般に好ましいが、グリセリン、エチレングリコール、ＰＶＰ（ポリビニルピロリドン）などを、適宜用いることができる。本発明の凍結保存液は、市販の凍結保存液、例えば日本全薬工業(株)製の「セルバンカー（cell banker）」にEGCgなどを添加して得ることもでき、また、市販の細胞・生体組織用の培養液に、EGCgなどと、上記の凍結保存液とを添加して得ることもできる。
【００１５】
以下、この発明の実施例及び比較例を示す。
【００１６】
＜試験方法＞
ブタの膵臓から膵島を分離し、分離された膵島細胞を以下の4群に分けた。EGCgとしては、純度約９８重量％のもの（Roche社）を用いた。
グループ1：EGCg無添加培地で培養（従来法）
グループ2：EGCg 30μg/ml添加培地で培養
グループ3：EGCg 60μg/ml添加培地で培養
グループ4：EGCg 120μg/ml添加培地で培養
各群とも培地は、10%ウシ胎児血清含有CMRL細胞培養用培地に、凍結防御剤としてDMSOを10%となるように添加したものを使用し、その後プログラムフリーザーを用いて凍結した。最終的に液体窒素中（-196℃）に保存し、4週間後に急速解凍した。そして、解凍直後、及び、解凍後に48時間培養した後の膵島細胞の生存率（生存率＝凍結解凍後の膵島数 / 凍結前の膵島数）を比較検討した。また、解凍直後のバイアビリティー及び膵島機能を比較検討した。
【００１７】
＜結果＞
解凍直後の膵島細胞の生存率は、従来法（グループ1）では約50%と低かったが、EGCg添加群（グループ2〜4）では60〜80%と著明な改善が認められた（図1）。また48時間培養後でも生存率は従来法（グループ1）では約25%と低いのに対し、EGCg添加群（グループ2〜4）では45〜70%と有意に高かった（図1）。バイアビリティーにおいても従来法（グループ1）では約70%だったのに対し、EGCg添加群（グループ2〜4）では80〜85%と高かった（図2）。解凍直後の膵島機能をグルコース負荷試験によるインスリン分泌反応（Static Incubation）で検討したところ、EGCg添加群では無添加群に比べ良好な傾向にあった（図3）。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】凍結解凍後（直後、48時間培養後）のブタ膵島生存率のグラフである。
【図２】解凍直後のブタ膵島のバイアビリティーを示すグラフである。
【図３】凍結解凍直後の膵島機能（Stimulation Index）を示すグラフである。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
移植用の生体組織を凍結保存前または凍結保存時に浸漬することにより、該生体組織が凍結保存時または解凍時に障害されるのを防止するための凍結障害防止液であって、細胞・組織培養用培地に、３０〜１２０ｐｐｍのポリフェノールを添加したものであることを特徴とする移植用生体組織の凍結障害防止液。
【請求項２】
前記ポリフェノールが純度９０重量％以上のエピガロカテキンガレートである請求項１記載の凍結障害防止液。
【請求項３】
請求項１または２記載の凍結障害防止液中に、凍結保存前または凍結保存時に浸漬したことを特徴とする凍結保存中または解凍後の移植用の生体組織。
【請求項４】
膵島、血管、皮膚、軟骨その他の骨、神経、心臓弁その他の弁、または羊膜である請求項３記載の移植用の生体組織。
【請求項５】
凍結保存前または凍結保存時に、１０〜３００ｐｐｍのポリフェノールを含む細胞・組織培養用培地に移植用の細胞または生体組織を浸漬することを特徴とする細胞または生体組織の凍結保存方法。
【請求項６】
ポリフェノールが純度９０重量％以上のエピガロカテキンガレートである請求項５記載の凍結保存方法。
【請求項７】
細胞が、人または動物の膵臓から単離した細胞である請求項５記載の凍結保存方法。
【請求項８】
移植用の生体組織が、膵島、血管、皮膚、軟骨その他の骨、神経、心臓弁その他の弁、または羊膜である請求項５記載の凍結保存方法。
【請求項１】
移植用の生体組織を凍結保存前または凍結保存時に浸漬することにより、該生体組織が凍結保存時または解凍時に障害されるのを防止するための凍結障害防止液であって、細胞・組織培養用培地に、３０〜１２０ｐｐｍのポリフェノールを添加したものであることを特徴とする移植用生体組織の凍結障害防止液。
【請求項２】
前記ポリフェノールが純度９０重量％以上のエピガロカテキンガレートである請求項１記載の凍結障害防止液。
【請求項３】
請求項１または２記載の凍結障害防止液中に、凍結保存前または凍結保存時に浸漬したことを特徴とする凍結保存中または解凍後の移植用の生体組織。
【請求項４】
膵島、血管、皮膚、軟骨その他の骨、神経、心臓弁その他の弁、または羊膜である請求項３記載の移植用の生体組織。
【請求項５】
凍結保存前または凍結保存時に、１０〜３００ｐｐｍのポリフェノールを含む細胞・組織培養用培地に移植用の細胞または生体組織を浸漬することを特徴とする細胞または生体組織の凍結保存方法。
【請求項６】
ポリフェノールが純度９０重量％以上のエピガロカテキンガレートである請求項５記載の凍結保存方法。
【請求項７】
細胞が、人または動物の膵臓から単離した細胞である請求項５記載の凍結保存方法。
【請求項８】
移植用の生体組織が、膵島、血管、皮膚、軟骨その他の骨、神経、心臓弁その他の弁、または羊膜である請求項５記載の凍結保存方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図２】
【図３】
【公開番号】特開２００６−３０６８２１（Ｐ２００６−３０６８２１Ａ）
【公開日】平成１８年１１月９日（２００６．１１．９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００５−１３４６７０（Ｐ２００５−１３４６７０）
【出願日】平成１７年５月２日（２００５．５．２）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り ２００５年４月１５日 国際膵臓・膵島学会の第１０回ジュネーブ大会のホームページ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｐｉｔａ２００５．ｏｒｇ／）において（ｗｗｗ．ｉｐｉｔａ２００５．ｏｒｇ／ａｂｓｔｒａｃｔｓ＿ｏｎ−ｌｉｎｅ．ｈｔｍ）にて発表
【出願人】（５０３３６０１１５）独立行政法人科学技術振興機構 (1,734)
【出願人】（５０４１３２２７２）国立大学法人京都大学 (1,269)
【出願人】（５０３２４７２２９）
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１８年１１月９日（２００６．１１．９）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年５月２日（２００５．５．２）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り ２００５年４月１５日 国際膵臓・膵島学会の第１０回ジュネーブ大会のホームページ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｐｉｔａ２００５．ｏｒｇ／）において（ｗｗｗ．ｉｐｉｔａ２００５．ｏｒｇ／ａｂｓｔｒａｃｔｓ＿ｏｎ−ｌｉｎｅ．ｈｔｍ）にて発表
【出願人】（５０３３６０１１５）独立行政法人科学技術振興機構 (1,734)
【出願人】（５０４１３２２７２）国立大学法人京都大学 (1,269)
【出願人】（５０３２４７２２９）
【Ｆターム（参考）】
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