細胞培養
【課題】細胞を培養、増殖、分化、代謝活性、および表現型表現のような細胞プロセスの調節するための改良された技術を提供する。
【解決手段】（ａ）培養培地においてマイクロキャリアーまたはビーズに接着され、培地透過性バリアーに閉じ込められているか、または捕捉された幹細胞を増殖させるステップと、（ｂ）ステップ（ａ）の細胞を、マイクロキャリアーを１つの培養培地から別の培養培地に移動させるステップと、（ｃ）任意選択により、必要であればステップ（ｂ）を反復するステップと、（ｄ）分化した細胞を得るステップとを含む、インビトロにおいて幹細胞から分化した細胞を得る方法。
【解決手段】（ａ）培養培地においてマイクロキャリアーまたはビーズに接着され、培地透過性バリアーに閉じ込められているか、または捕捉された幹細胞を増殖させるステップと、（ｂ）ステップ（ａ）の細胞を、マイクロキャリアーを１つの培養培地から別の培養培地に移動させるステップと、（ｃ）任意選択により、必要であればステップ（ｂ）を反復するステップと、（ｄ）分化した細胞を得るステップとを含む、インビトロにおいて幹細胞から分化した細胞を得る方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞培養、特に、初代培養細胞、細胞系、多能性細胞、全能性細胞、および幹細胞の培養、および細胞培養条件の調整を通じてのそれらの種々の細胞プロセスの調節に関する。本発明は細胞経路を調整するための複数の条件下における複数培養ステップの使用に関し、増殖、分化および代謝活性のような細胞プロセスに対する種々の複数培養ステップ処方の効果を決定する方法を提供する。
【背景技術】
【０００２】
近年、細胞培養はライフサイエンスにおいて核心的な技術となった。細胞培養は、「ＢａｓｉｃＣｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ」ＯｘｆｏｒｄＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ（２００２）Ｅｄ．Ｊ．Ｍ．Ｄａｖｉｓ；および「ＡｎｉｍａｌＣｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ' Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ（２０００）Ｅｄ．Ｊｏｈｎ Ｒ．Ｗ．Ｍａｓｔｅｒｓに記載されている。両文献は、本明細書に参照することにより組み込む。細胞培養は細胞の生存性、表現型、遺伝子型、増殖および分化のような細胞プロセス、生物学的分子、中間体および産物の形成を研究するための基礎を提供する。また、単離された状態におけるか、または全トランスジェニック動物におけるかを問わず、これらのプロセスの、遺伝子レベルから、個々のタンパク質分子のレベルへの調節を調べる手段も提供する。現在の生物学の状態に対するその多大な貢献にもかかわらず、多くの点で、細胞培養は、遺伝子治療および組織エンジニアリングの可能性を究極的には提供する著しく活発な科学であるにもかかわらず、開発原理に止まっている。
【０００３】
細胞培養の重要な目標は、広く種々の細胞をインビトロで増殖することができることである。培養で増殖させることができる異なる細胞型のリストは広く存在し（ＡｍｅｒｉｃａｎＴｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ａｔｃｃ．ｏｒｇ；ＥｕｒｏｐｅａｎＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆＣｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ，ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｃａｃｃ．ｏｒｇ．ｕｋ；ＤｅｕｔｓｃｈｅＳａｍｍｌｕｎｇ ｖｏｎＭｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ ｕｎｄ Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ ＧｍｂＨ，ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｄｓｍｚ．ｄｅ）、ほとんどの細胞型の代表的なものを含み、より多くの培養条件が発見するに従って益々増加しつつある。この分野における定常的な進歩にもかかわらず、新しい細胞型のための適当な培養条件を決定する方法は全く経験的なものに止まっており；増殖条件はほとんど常に試行錯誤による。出発点の選択は、しばしば、以前に同様な細胞について他者によって何が用いられたか、または、異なる細胞について現在実験室で何が用いられつつあるかに基づいている。これらは単に完全に不適切であることが何度もあるであろうし、試行錯誤のプロセスが新しく始まるに違いない。新しい培養条件が成功した場合でさえ、以前のプロトコルの適合は歴史的なバイアスを実験に導入してしまうであろうということを明記しておくのは重要である。例えば、初期の組織培養実験の多くは線維芽細胞を盛んに使用し、今日まで、ほとんどの標準的な細胞培養条件は、中胚葉（線維芽細胞、内皮細胞、筋芽細胞）に由来する細胞の増殖に好都合である。これらの条件に基づく上皮および他の細胞型に対する選択的培養培地の開発は挑戦であった。これらの細胞型のいくつかについては、今日、血清（中胚葉細胞のための多くの培養培地の通常の成分である）は、現実には増殖を阻害する。本明細書中に記載した本発明の１つの態様は、特定の細胞型の生存性、増殖または成長、およびその表現型の保持を可能とする適当な培養条件を開発する方法である。
【０００４】
細胞増殖に好都合である条件とは別に、現代の組織培養における特に重要なステップは、細胞の分化を特定の表現型に向けて制御または指令することができることである。細胞系の増殖は細胞数が増加することを必要とするので、最大細胞増殖に好都合なように、非常に多数の培養条件が開発されてきた。これらの条件は、細胞分化を導かず、細胞増殖はしばしば限定されるか、または増殖しなくなりさえするのは驚くべきことではない。細胞増殖に好都合な条件は、一般に、低い細胞密度、低いＣａ２＋濃度、および表皮細胞成長因子（ＥＧＦ）、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）および血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）のような成長因子の存在である。他方、サイトスタシス（細胞増殖抑制）および分化は、高い細胞密度、高いＣａ２＋濃度、およびホルモン（例えば、ヒドロコルチゾン）、パラクリン因子（例えば、ＩＬ−６、ＫＧＦ、ＮＧＦ）、レチノイド、およびジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）のような平面極性化合物のような分化インデューサーの存在の条件において促進される。よって、異なる条件が特定の細胞系の増殖および分化に必要とされ、勿論、これらの各々の条件は異なる系の細胞の間で異なるであろう。本明細書中に記載の本発明の第二の態様は、細胞の選択的分化を可能とする適当な培養条件を発見する方法である。
【０００５】
細胞培養において依然として直面するいくつかの共通の問題は、初代培養細胞系の限定された寿命、継代に伴う細胞系の特徴の変化、および興味深い細胞特徴の喪失に伴うそれらの形質転換である。これらの効果は、実験またはアッセイ、例えば、後に記載する細胞ベースのアッセイで用いられる培養細胞の利用性をひどく限定する。初代培養細胞、すなわち、新たに組織から単離された細胞は、断然、ほとんどの正確な細胞培養モデルを提供する。というのは、初代培養細胞は、その起源の組織に広く似た挙動をするからである。顕著なことには、初代培養細胞を培養する信頼できる方法は、依然として開発されておらず、その結果、これらの細胞はインビトロにおいて限定された寿命を呈する。これは、例えば、初代培養を増殖させようと試みる場合、あるいは長期実験を行おうと試みる場合に、ひどい技術的な制限となる。初代培養の使用に関連するさらなる問題は、それが一定の新鮮な単離を必要とするので、特に、ヒトからの初代培養材料を源とするのは困難であり、また、合致して挙動する系を得るのは困難であることである。本発明の第三の態様は、従って、寿命の延長した生きた培養物を得るための初代培養細胞の培養方法である。
【０００６】
初代培養がインビトロにて延長された期間維持されれば、それは、初代培養は、細胞の大部分が死滅する危機を受けるが、生存する細胞はより長く生き、無限に培養できる。これらの継続的細胞系のほとんどは、細胞のほとんどが、無傷動物組織で見出されているような普遍的に貧弱な提示である。この１つの理由は、細胞が不滅状態となるのを可能とするプロセスもまた細胞の特徴に影響を与えるという事実である。例えば、ほとんどの確立された細胞培養物は、組織特異的遺伝子の発現を停止させ、その代わり、細胞培養において継続的増殖に必要なハウスキーピング遺伝子を発現するに過ぎず−その結果、元来源とした組織よりも、ほとんどのそのような細胞系同士で相互に似ている。例えば、ほとんどの肝細胞系は、通常、それを薬物毒性のテストのための興味深いツールとなる薬物代謝酵素の発現を停止してしまっている。本明細書中に記載の本発明のさらなる態様は、それが組織のより正確なモデルを提供するように細胞を培養する方法である。これは、今度は、細胞ベースの実験およびアッセイの信頼性および予期能力を改良するであろう。
【０００７】
細胞を培養するための改良された技術、および増殖、分化、代謝活性、および表現型表現のような細胞プロセスの調節のためのそのような技術を発見し、それを実施する方法に対する要望が存在する。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｂａｓｉｃ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ」Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ（２００２）Ｅｄ．Ｊ．Ｍ．Ｄａｖｉｓ
【非特許文献２】Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ' Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ（２０００）Ｅｄ．Ｊｏｈｎ Ｒ．Ｗ．Ｍａｓｔｅｒｓ
【発明の概要】
【０００９】
本発明は、細胞培養が、所望の効果を達成するための規定された順序で実行される一連の培養ステップを含む動的なプロセスとして良好にアプローチされるという概念に基づく新規な細胞培養技術を提供する。本発明は、選択された薬剤に対する系列的暴露を開発して、細胞プロセスを調整し、従って、従来の技術によって従来は達成できなかったこれらを超える制御のレベルを達成することができることを認識する。
【００１０】
本発明は、複数のステップおよび薬剤に関連する細胞培養技術が、もし、試行錯誤を伴う従来の実験によって決定するのが不可能であれば、現実面では困難である問題に立ち向かう。慣用的な細胞培養の面倒な性質のため、複雑な多工程手法による組織培養条件の経験的な決定は、膨大な仕事の負荷を伴うため、現実には可能ではない。
【００１１】
第一の態様において、本発明は、
（ａ）各々が１以上の細胞を含む細胞ユニットの群の第一の組を提供し、前記群を所望の培養条件に暴露するステップと、
（ｂ）前記群の１以上をサブ分割して、細胞ユニットの群のさらなる組を作るステップと、
（ｃ）前記さらなる群をさらなる所望の培養条件に暴露するステップと、
（ｄ）任意選択により、必要に応じて、ステップ（ｂ）〜（ｃ）を繰り返し反復するステップと、
（ｅ）細胞が暴露された培養条件の所与の細胞ユニットに対する効果を評価するステップと
を含む、細胞に対する複数の培養条件の効果を決定する方法を提供する。
【００１２】
有利には、本発明による細胞の群はプールであり、引き続いて分割される。従って、好ましい実施形態において、本発明は、
（ａ）各々が１以上の細胞を含む細胞ユニットの群の第一の組を提供し、前記群を所望の培養条件に暴露するステップと、
（ｂ）前記群の２以上をプールして、少なくとも１つのプールを形成するステップと、
（ｃ）前記プールをサブ分割して、細胞ユニットの群のさらなる組を作るステップと、
（ｄ）前記さらなる群を所望の培養条件に暴露するステップと、
（ｅ）任意選択により、必要に応じ、ステップ（ｂ）〜（ｄ）を繰り返し反復するステップと、
（ｆ）細胞が暴露された培養条件の所与の細胞ユニットに対する効果を評価するステップと
を含む、細胞に対する複数の培養条件の効果を決定する方法を提供する。
【００１３】
本発明は、表現型、遺伝子型、分子生産、生存率、および細胞の増殖および分化を含む全ての細胞プロセスに取組む。好ましくは、本発明を用いて、細胞分化をもたらす条件を同定する。例えば、細胞を適当な培養条件に付すことによって、細胞を誘導して所望の分化経路に沿って分化させることができる。また、培養条件の変化のタイミングを開発して、細胞の開発プログラムを良好に規定する。
【００１４】
培養条件は、増殖培地、増殖培地に存在する化学的、分子的、および高分子的薬剤、温度処方、基質、雰囲気条件、物理的細胞取扱を含む。
【００１５】
コンビナトリアル細胞培養、またはスプリットプール培養として知られた本発明の前記方法は、細胞が、系統的にまたは高度に生産的に、一連の培養条件に供され、および培養培地中の一連の薬剤に暴露されるのを可能とする。
【００１６】
分割およびプーリングの反復周期をかなり効率的に用いることができるが、コンビナトリアル・ケミストリープロトコルと同様に、必要なプロセッシングパワーを仮定すれば、（再度プーリングすることなく）少なくとも２つの順次のスプリッティング工程を含むプロトコルを使用することができる。そのようなプロトコルの不利は、種々に扱われてきた非常に多数の別々の試料を迅速に生じさせることができることである。しかしながら、利点は、各々の試料が面倒なデコンヴォルージョン（ｄｅｃｏｎｖｏｌｕｔｉｏｎ）を必要としないことである。というのは、そこでの細胞ユニットは条件の１つの組に暴露されたに過ぎないからである。従って、安定な試料取扱施設を仮定すれば、スプリッティングアプローチは迅速な結果を生じさせることができる。
【００１７】
本発明は細胞ユニットを使用する。そのような細胞ユニットは単一の細胞とすることができるが、有利には、２以上の細胞のコロニーであり、これは、それらがスプリットプール培養手法の間においてさえ破壊に対して抵抗性であるように配置される。例えば、細胞は後にさらに詳細に記載するようにビーズのような固体基材上で培養することができる。
【００１８】
有利には、細胞ユニットは標識される。標識は、細胞が暴露された培養条件の以下のもの、または異なる培養条件に暴露されるような細胞ユニットの以下のものを可能とする。従って、いずれかの所与の細胞ユニットは、それがどのようにして開始細胞プールまたは培養に由来したかを判断するために、読まれるその標識を有することができる。標識は核酸標識、放射線周波数暗号化タグ、蛍光または光学的タグ、および表面またはマトリックス表面の細胞ユニットの空間的暗号化を含む、種々の分子または物理的形態のいずれかを取ることができる。
【００１９】
本発明の方法は、数千または数百万の細胞培養条件および試薬が、多重ハイスループットアッセイでテストされて、いずれかの細胞プロセスに関する所望の結果を達成するのに必要な条件を決定することを可能とする。
【００２０】
従って、本発明は、
（ａ）各々が１以上の細胞を含む細胞ユニットの群の第一の組を提供し、前記群を所望の培養条件に暴露するステップと、
（ｂ）前記群の１以上をサブ分割して、細胞ユニットの群のさらなる組を作るステップと、
（ｃ）前記さらなる群をさらなる所望の培養条件に暴露するステップと、
（ｄ）任意選択により、必要に応じ、ステップ（ｂ）〜（ｃ）を繰り返し反復するステップと
を含む、種々の細胞培養条件に細胞を暴露する方法を提供する。
【００２１】
好ましい実施形態においては、前記したように、プーリング手法を使用する。そのような実施形態においては、本発明は、
（ａ）各々が１以上の細胞を含む細胞ユニットの群の第一の組を提供し、前記群を所望の培養条件に暴露するステップと、
（ｂ）前記群の２以上をプールして、少なくとも１つの第二のプールを形成するステップと、
（ｃ）第二のプールをサブ分割して、細胞ユニットの群のさらなる組を作るステップと、
（ｄ）前記さらなる群を所望の培養条件に暴露するステップと、
（ｅ）任意選択により、必要に応じ、ステップ（ｂ）〜（ｄ）を繰り返し反復するステップと、
（ｆ）それが暴露された培養条件の所与の細胞ユニットに対する効果を評価するステップと
を含む、細胞に対する複数の培養条件の効果を決定する方法を提供する。
【００２２】
さらなる態様において、本発明は、
（ａ）本発明の前記態様に従い、細胞ユニットに対する１以上の培養条件の効果を測定するステップと、
（ｂ）前記培養条件に暴露する場合の前記細胞ユニットにおける遺伝子発現を分析するステップと、
（ｃ）所望の培養条件下で差異的に発現される遺伝子を同定するステップと
を含む、細胞プロセスに影響する遺伝子を同定する方法を提供する。
【００２３】
有利には、用いる培養条件は細胞プロセスの変化を引き起こすものであり、これらの培養条件は遺伝子発現が分析される細胞の生産について選択される。遺伝子発現は、便宜には、ＰＣＲベースの技術、遺伝子発現の系列的分析（ＳＡＧＥ）、またはＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘのような供給業者から広く入手可能なアレイ技術を含む、いずれかの比較発現モニタリング技術を用いて分析することができる。
【００２４】
もう１つの態様において、本発明は、前記遺伝子を同定し、次いで、核酸合成または生物学的複製によって前記遺伝子の少なくともコード領域を製造することを含む、細胞プロセスに影響する遺伝子産物をコードする核酸の製造方法を提供する。
【００２５】
さらなる態様において、
（ａ）本発明に従った細胞プロセスに関連して差異的に発現される１以上の遺伝子を同定するステップと、
（ｂ）前記１以上の遺伝子の細胞における発現を調整するステップと
を含む、細胞において細胞プロセスを誘導する方法が提供される。
【００２６】
細胞における遺伝子の発現は、例えば、それが一過性または永久に過剰発現されるようにトランスフェクトし、またはそうでなければ遺伝子を細胞に導入することによって調整することができる。あるいは、内因性遺伝子の発現は、標的化エンハンサーの挿入、または遺伝子の発現の増加（例えば、余剰のインデューサー）または減少（例えば、アンチセンス、ＲＮＡｉ、転写因子）を引き起こす外因性薬剤の投与によるなどして変化させることができる。さらに、遺伝子産物はそれ自体細胞に投与され、あるいは細胞に導入されて、その活性の増加を達成することができる。さらに、遺伝子産物の活性を増加または減少させる薬剤（例えば、競合的および非競合的阻害薬剤、薬物、医薬）を細胞に投与することができる。
【００２７】
なおさらなる態様において、本発明は、
（ａ）前記した細胞プロセスに関連して差異的に発現される１以上の遺伝子を同定するステップと、
（ｂ）細胞における前記１以上の遺伝子の発現の調整を検出し、それにより、前記細胞における細胞プロセスの状態を判断するステップと
を含む、細胞において細胞プロセスの状態を同定する方法を提供する。
【００２８】
有利には、この分析で使用する遺伝子は、例えば、イムノアッセイによって検出できる細胞マーカーをコードする。あるいは、遺伝子産物は、蛍光測定、色測定、放射線測定または他の方法で活性についてアッセイすることができる酵素であり得る。
【００２９】
本発明は、さらに、
（ａ）本発明の前記態様に従って、細胞ユニットに対する１以上の培養条件の効果を測定するステップと、
（ｂ）細胞プロセスの変化を行う培養条件に細胞を暴露するステップと、
（ｃ）所望の細胞を単離するステップと
を含む、細胞プロセスを調節する方法を提供する。
【００３０】
従って、本発明は、本発明の前記態様に従って、二能性、多能性、または全能性先祖から分化した細胞を生産する方法を提供する。分化した細胞、特に部分的に分化した多能性細胞、または発生的に決定されたが未分化の先祖細胞は、薬物発見、細胞治療、および規定された系列の細胞が必要とする他の手法で有用である。
【００３１】
また、
（ａ）本発明の前記態様に従って、細胞ユニットに対する１以上の薬剤の効果を測定するステップと、
（ｂ）細胞ユニットにおいて所望の細胞プロセスを誘導する薬剤を同定するステップと
を含む、細胞プロセスを誘導することができる薬剤を同定する方法が提供される。
【００３２】
本発明に従って同定された薬剤は従来の化学的、生化学的または他の技術によって合成することができ、例えば本明細書中に記載の細胞において特定の細胞プロセスを調節する方法で用いられる。
【００３３】
本発明は、さらに、広く、マイクロキャリアーまたはビーズのような固体キャリアーに接着された細胞を培養する方法を提供する。そのようなキャリアーは、セルロース、デキストラン、アガロースまたはアクリルアミドのような高分子、あるいはガラスのような無機材料より構成することができる。キャリアーの表面は、さらに、所望の電荷または他の所望の特徴を持つ分子体の吸着または共有架橋結合のような物理的または化学的処理によって修飾することができる。あるいは、キャリアーは、細胞より小さいサイズの材料の灌流を可能とするマトリックス内にカプセル化された細胞または複数細胞よりなることができる。マイクロキャリアー培養は、培養のスケールアップを含むかなりの利点を有し、所望の細胞プロセスを引き起こすのに必要な選択された培養条件に細胞ユニットを便宜に暴露させるのを可能とする。従って、最も広い実施形態において、本発明は、マイクロキャリアーまたはビーズに接着した細胞を増殖させることを特徴とするインビトロで細胞を培養する方法を提供する。
【００３４】
有利には、細胞は培養条件の少なくとも１つの変化に供される。好ましくは、それらは２、３、４、５、６、７、８、９または１０以上の異なる培養条件に供される。好ましくは、培養条件の前記変化は培地の変化を含む。
【００３５】
本発明は、さらに、細胞を培養する方法を提供し、本発明のこれまでの実施形態について記載されたように、細胞のプールが作られ、サブ分割される。従って、１つの態様において、
（ａ）異なる条件下で増殖された細胞の１以上の培養を合わせるステップと、
（ｂ）前記細胞を通常の条件下で培養するステップと
を含む、インビトロにて細胞を培養する方法が提供される。
【００３６】
さらなる実施形態において、
（ａ）細胞培養をインキュベートするステップと、
（ｂ）前記培養を細胞の２以上の群に分割し、培養条件の２以上の異なる組下で細胞の前記群を培養するステップと
を含む、インビトロで細胞を培養する方法が提供される。
【００３７】
好ましくは、細胞を３、４、５、６、７、８、９、１０以上の異なる培養条件に暴露する。用いる培養条件は、有利には、培地の変化を含む。本発明は、さらに、広く、ビーズのようなマイクロキャリアーに接着された、インビトロにて幹細胞、および幹細胞に由来する分化された細胞を培養する方法を提供する。マイクロキャリアー培養は、培養のスケールアップを含むかなりの利点を有し、所望の増殖および／または分化条件を得るのに必要な選択された培養条件に幹細胞のユニットを暴露するのを可能とする。従って、１つの実施形態において、本発明は、マイクロキャリアーまたはビーズに接着された前記細胞を増殖することを含むインビトロにて幹細胞、および幹細胞に由来する分化された細胞を培養する方法を提供する。
【００３８】
有利には、前記培養は培養条件の少なくとも１つの変化に供される。好ましくは、それらは２、３、４、５、６、７、８、９または１０以上の異なる培養条件に供される。好ましくは、培養条件の前記変化は培地の変化を含む。
【００３９】
本発明は、さらに、幹細胞を培養する方法を提供し、本発明のこれまでの実施形態について記載されたように、幹細胞のプールが作られ、サブ分割される。従って、１つの態様において、
（ａ）異なる条件下で増殖された細胞の１以上の培養を合わせるステップと、
（ｂ）通常の条件下で細胞を培養するステップと
を含む、インビトロにて、幹細胞、および幹細胞に由来する分化された細胞を培養する方法が提供される。
【００４０】
さらなる実施形態において、
（ａ）幹細胞培養をインキュベートするステップと、
（ｂ）前記培養を幹細胞の２以上の群に分割し、２以上の異なる組の培養条件下で前記幹細胞の群を培養するステップと
を含む、インビトロにて、幹細胞、および幹細胞に由来する分化された細胞を培養する方法が提供される。
【００４１】
好ましくは、細胞は３、４、５、６、７、８、９、１０以上の異なる培養条件に暴露される。用いる培養条件は、有利には、培地の変化を含む。
【００４２】
有利には、細胞または幹細胞は細胞ユニットで培養され、各細胞ユニットは１以上のそのような細胞を含む。例えば、細胞ユニットは単細胞であり得る。
【００４３】
しかしながら、各細胞ユニットは、マイクロキャリアーまたはビーズのような固体基材に接着された、または結合した１以上の細胞または幹細胞を含むことができる。さらなる固体基材はウェルまたは培地浸透性バリアーを含む。
【００４４】
本発明による細胞または幹細胞を培養する方法は、適当なバイオリアクターにおいてスケールアップすることができる。例えば、本発明の方法は５０ｇ乾燥重量を超えるマイクロキャリアーを用いて実施することができる。
【図面の簡単な説明】
【００４５】
【図１】３ラウンドにわたって行われた分割プール細胞培養の例を示す。細胞ユニットの群は、所与の条件下で増殖させることによって得られる。細胞ユニットは球として描かれ、細胞ユニットの群はフラスコ中に示される。細胞ユニットは３つのアリコットに分割され、これは、Ａ、Ｂ、Ｃで示される異なる増殖条件下で２日間培養する。細胞ユニットは引き続いてプールされ１回以上３つのアリコットに分割され、これは条件Ｄ、ＥまたはＦ下で増殖される。２ラウンドのこのプロトコルの後、種々の細胞群は細胞培養条件の全ての可能な組合せに暴露することが理解される。
【図２】分割プール細胞培養のさらなる例を示す。この場合、実験は３つの群Ａ、ＢおよびＣで始まる。試料は第１の工程でプールされ、引き続いて、群Ｄ、ＥおよびＦに分割される。
【図３】分割プール方法の変形を示し、ここに、群Ａ、ＢおよびＣからの試料は先立ってのプーリングなしで群Ｄ、ＥおよびＦに直接分割される。個々の細胞群の分割はランダムであってよく、あるいは所定のものであってよい。
【図４】分割プールのさらなる変形を示し、そこでは細胞群Ａ、ＢおよびＣは細胞群Ｄ、ＥおよびＦに先立ってのプーリングなしで分割され、他方、第２の工程においては、細胞群Ｄ、ＥおよびＦはプールされ、引き続いて細胞群Ｇ、ＨおよびＩに分割される。
【図５】第１の工程を含む分割―分割プロトコルを示し、ここに、細胞群Ａは分割されて、細胞群Ｂ、ＣおよびＤを形成し、および第２の工程を示し、そこでは細胞群Ｂ、ＣおよびＤは分割され、細胞群Ｅ〜Ｍを形成する。
【図６】分割−分割工程を含む分割プールプロトコルを示す。２ラウンドの分割およびプーリングの後、細胞群Ａ、ＢおよびＣは先立ってのプーリングなしで分割され、その結果細胞群Ａ、ＢまたはＣに種々に由来する３つの細胞群系統が得られる。分割−分割工程を含むことを用いて、細胞効果を生じさせるにおいて細胞培養条件の役割を推定することができるのを注意されたい。例えば、もし細胞効果が系統Ａのみから誘導された細胞ユニットで観察され、系統Ａ、ＢおよびＣの多様性に引き続いての種々の細胞グループ分けでアッセイされた細胞培養条件が同一であると仮定すれば、分岐点における細胞群Ａの培養の条件は細胞効果に対して必須であるに違いない。また図１〜６で示した方法は多数の組合せで用いることができるのにも注意されたい。
【図７】プロトンマイクロキャリア―（Ｃｙｔｏｐｏｒｅ２，ＡｍｅｒｓｈａｍＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）に付着したキメラＴａｕ−緑色蛍光タンパク質を発現する多能性胚様幹細胞を示す。
【図８】パネルＡ〜Ｈは、グリア細胞マーカーＧＦＡＰの発現用の抗体染色によって測定される分化を受けるＴａｕ−緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）融合タンパク質を発現するＥＳ細胞および多孔性マイクロキャリアーＣｕｌｔｉｓｐｈｅｒＧを含む細胞ユニットを示す。パネルＡ〜Ｄは位相顕微鏡（Ａ）下で、および細胞核がＤＡＰＩ（Ｂ）を用いて青色に染色され、（赤色マーカー）ＧＦＡＰ（Ｃ）および（緑色）ＧＦＰ（Ｄ）が明らかである蛍光下で、４０×対物レンズを用いて観察された細胞ユニットを示す。パネルＣおよびＤは、ニューロン突起を包むグリア細胞を思わせる細胞の直線アレイ（白色矢印）であるように見えるものを示す。パネルＥ〜Ｈは、一次抗ＧＦＡＰ抗体が省略された対照細胞ユニットを示す。パネル１は、非多孔性マイクロキャリアー（Ｃｙｔｏｄｅｘ３、ＡｍｅｒｓｈａｍＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）上で増殖する分化した胚様幹細胞を示す蛍光顕微鏡によって得られた複合イメージを示す。前記細胞はＴａｕ−ＧＦＰを発現し、ニューロン特異的タンパク質β−チューブリンＩＩＩに対して生起された蛍光抗体で免疫科学的に赤色に染色される。黄色着色は、同時の赤色および緑色染色を示す。
【図９】非多孔性マイクロキャリアー（Ｃｙｔｏｄｅｘ３、Ａｍｅｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）に付着したＨｅｐＧ２細胞を含む細胞ユニットの位相（パネルＡ、Ｃ、Ｅ）および蛍光（パネルＢ、Ｄ、Ｆ）顕微鏡写真を示す。パネルＡ／Ｂ：エトキシレソルフィンの赤色蛍光生成物の変換を示す陽性対照細胞ユニット；パネルＣ／Ｄ：同様であるが、エトキシレソルフィンは添加せずに培養した陰性対照細胞ユニット；パネルＥ／Ｆ：Ｐ４５０インデューサーβ−ナフトフラボンで処理された、いくつかの細胞ユニットは高いレベルのＰ４５０を有し、蛍光生成物へエトキシレソルフィンを迅速に変換することができ（パネルＦ）、他方、分割プール培養に供された他の細胞ユニットは、高レベルのＰ４５０を発現しない多数の細胞が存在する（例えば、パネルＥの底部右側で明らかな細胞ユニット）ことを示す、分割プール実験に続いての細胞ユニット。
【図１０】ＲＦＩＤを用いる細胞ユニットの標識を示す。パネルＡ：ガラスカプセル化高周波数トランスポンダＩＤ１００−Ａ（Ｔｒｏｖａｎ）；パネルＢ；ガラスカプセル化高周波数トランスポンダのまっすぐなエッジで増殖するＴａｕ−ＧＦＰ融合タンパク質を発現するマウス胚様幹細胞（光学顕微鏡、頂部；蛍光顕微鏡、底部；合わせたイメージ、中央）；（Ｃ）はガラスカプセル化高周波数トランスポンダの丸い端部で増殖するＧＦＰを発現する胚様幹細胞を示す（光学顕微鏡、頂部；蛍光顕微鏡、底部；合わせたイメージ、中心）。
【図１１】マウスＥＳ細胞の分割プール培養に続いての分化遺伝子発現を示す。ＥＳ細胞は１μＭＬｉＣｌ（レーン２、５、８、１１）または１μＭレチノイン酸（３、６、９、１２）を加えた、または加えない（レーン１、４、７、１０）、ＥＳ培地（Ａ）、ＣＤＭ（Ｂ）、またはＤＭＥＭ（Ｃ）中のＣｙｔｏｐｏｒｅ２マイクロキャリアーで増殖された。ｃＤＮＡは細胞から調製し、等量を、対照遺伝子グリセルアルデヒド３リン酸デヒドロゲナーゼ（Ｇ３ＰＤＨ）のためのオリゴヌクレオチドプライマー、および未分化ＥＳ細胞のマーカー（Ｏｃｔ４）、ニューロン前駆体（ネスチン）、および内胚葉細胞（ＨＮＦ３β）を用いるＰＣＲに供した。写真は、塗りつぶしていないブラケットによって示されるＰＣＲ産物の臭化エチジウム−染色アガロースゲルのものである。「ＰＤ」はプライマー−ダイマー産物を示す。
【図１２】マイクロキャリアーの標識を示す。パネルＡ〜Ｄ：ストレプトアビジン−ＦＩＴＣで染色し、位相（Ａ、Ｃ）および蛍光（Ｂ、Ｄ）顕微鏡下で観察されたビオチン化抗コラーゲン抗体と共に（Ｃ、Ｄ）または（Ａ、１３）なしでインキュベートされたＣｙｔｏｄｅｘ３マイクロキャリアー。パネルＥ〜Ｈ：ストレプトアビジン−被覆１μＭ直径赤色蛍光ビーズで染色され、位相（Ｅ、Ｇ）および蛍光（Ｆ、Ｈ）顕微鏡下で観察された架橋ビオチン部位を持つ（Ｇ、Ｈ）または持たない（Ｅ、Ｆ）ＣｕｌｔｉｓｐｈｅｒＧマイクロキャリアー。
【図１３】細胞ユニットの標識を示す。ｔａｕ−ＧＦＰ融合タンパク質を発現するＥＳ細胞でシードされたＣｙｔｏｄｅｘ３ビーズを赤色蛍光ラテックスビーズで標識し、３０分後（Ａ〜Ｃ）、または２４時間後（Ｄ〜Ｆ）で調べた。マイクロキャリアーは位相顕微鏡（Ａ、Ｄ）を用い、およびフィルターで観察して、緑色（Ｂ、Ｅ）または赤色（Ｃ、Ｆ）蛍光を検出した。
【図１４】２つの異なる蛍光標識でのマイクロキャリアーの２つの集団の標識を示す。Ｃｙｔｏｄｅｘ３マイクロキャリアーは赤色または緑色ストレプトアビジンラテックスビーズで別々にインキュベートし、次いで、１：１比率で混合した。それらは位相顕微鏡（Ａ）を用いておよびフィルターで観察して緑色（Ｃ）または赤色（Ｄ）蛍光を検出した。ＢはＣ＋Ｄの合わせた写真である。双方の標識は容易に検出され、有意な標識の移動は検出されなかった。
【図１５】２つの異なる蛍光標識でのマイクロキャリアーの二重標識を示す。Ｃｙｔｏｄｅｘ３マイクロキャリアーを赤色および緑色ストレプトアビジンラテックスビーズの１：１混合物と共にインキュベートした。それらは位相顕微鏡（Ａ）下でおよびフィルターで観察して、緑色（Ｃ）または赤色（Ｄ）蛍光を検出した。ＢはＣ＋Ｄの合わせた顕微鏡写真である。各マイクロキャリアーは二重に標識される。
【図１６】位相（パネルＡ）または蛍光（パネルＢ）顕微鏡を用いる、細胞プロセスを呈する細胞ユニットの検出を示す。Ｔａｕ−ＧＦＰ融合タンパク質を発現する細胞ユニットは蛍光顕微鏡（Ｂ）を用いてバックグラウンドから容易に区別することができ、混合物から手動で単離することができる。
【図１７】ＣＯＰＡＳ Ｓｅｌｅｃｔ（ＵｎｉｏｎＢｉｏｍｅｔｒｉｃａ Ｉｎｃ．，Ｓｏｍｅｒｖｉｌｌｅ，ＭＡ）機器を用いるマイクロキャリアーおよび細胞ユニットの自動分析からのデータを示す。パネルＡおよびＢ：ＰＢＳで懸濁したＣｙｔｏｄｅｘ３マイクロキャリアーをソーターを通し、サイズ（時間飛行；ＴＯＦ）対光学散乱（消光；Ｅｘｔ）［Ａ］について、および緑色蛍光（ＦＬＵ１）対赤色蛍光（ＦＬＵ２）［Ｂ］についてモニターした。パネルＣおよびＤ：Ｅｘｔ対ＴＯＦのプロット［Ｃ］、および蛍光［Ｄ］を示す赤色蛍光ラテックスビーズで標識されたＣｙｔｏｄｅｘ３マイクロキャリアーの分析；パネルＢおよびＤの比較は、マイクロキャリアーの標識はそれらの赤色蛍光シグナルの増加をもたらすことを示す。パネルＥおよびＦ：Ｃｙｔｏｘ３、およびＴａｕ−ＧＦＰトランスジーンを発現するＥＳ細胞を含む細胞ユニットの群の分析。Ｅｘｔ対ＴＯＦを示すプロットにおける増大した散乱［Ｅ］および広い範囲の緑色蛍光（ＦＬＵ１）［Ｆ］は、細胞数に基づいて分類できる細胞ユニットを明らかにする。
【図１８】細胞ユニットを標識するのに用いられるタグの同定を示す。パネルＡ〜Ｄ：ビオチンで修飾された（Ａ、Ｂ）またはそれらの天然未処理状態の（Ｃ、Ｄ）Ｃｕｌｔｉｓｐｈｅｒマイクロキャリアーのストレプトアビジン−ＦＩＴＣ標識。パネルＥ〜Ｇ：各々、ＧＦＰ−標識細胞および赤色蛍光タグを可視化するための位相顕微鏡（Ｅ）下、および緑色（Ｆ）および赤色（Ｇ）エピ蛍光オプティックス下で観察された、Ｔａｕ−ＧＦＰ融合タンパク質を発現するＥＳ細胞およびストレプトアビジン被覆赤色−蛍光、１μｍラテックスビーズ（Ｓｉｇｍａ）で標識されたビオチン化ＣｕｌｔｉｓｐｈｅｒＧマイクロキャリアーを含む細胞セル。パネルＨ〜Ｋ：特徴的な前方および側方散乱パラメーター（Ｈ；ボックス領域）およびＦＬ３蛍光チャネルにおける特徴的な蛍光強度（Ｉ）を示す１μｍ赤色−蛍光ラテックスビーズ（Ｓｉｇｍａ）の対照試料を用いるＦＡＣＳのギャリブレーション。１μｍ赤色−蛍光ラテックスビーズ（Ｓｉｇｍａ）で標識された単一のタンパク質分解により消化された細胞ユニットのＦＡＣＳ分析は、タグについての以前に決定されたサイズパラメーターについてゲーティングし（Ｊ；ボックス領域）、続いて、タグに特徴的なＦＬ３チャネル強度の検出によって行うことができる（Ｋ）。
【図１９】マイクロキャリアーを標識するのに用いられる多数のタグの同定を示す。パネルＡ：対照タグで設定された前方／側方散乱パラメーターを用い、４．４μｍ（ゲートＲ１）、５．５μｍ（ゲートＲ２）、および１μｍ（ゲートＲ３）ビーズについてのサイズゲートを提示した。パネルＢ〜Ｄ：標識されたマイクロキャリアーのタンパク質分解消化のＦＡＣＳ分析は、ＢａｎｇｓＬａｂｓからの緑色蛍光４．４μｍビーズ組ｎｏ．５（パネルＢ）；ＢａｎｇｓＬａｂｓからの緑色蛍光５．５μｍビーズ組ｎｏ．１（パネルＣ）、およびＳｉｇｍａからの１μｍ赤色蛍光ビーズ（パネルＤ）に対応するタグの存在を明らかにする。
【発明を実施するための形態】
【００４６】
＜定義＞
＜培養条件＞
本明細書中で用いるように、用語「培養条件」とは、細胞の増殖または分化を促進するために細胞が置かれ、または暴露される環境をいう。従って、前記用語は、細胞の増殖および／または分化に影響し得る培地、温度、雰囲気条件、基材、攪拌条件などをいう。さらに詳しくは、前記用語は、培養培地に取り込むことができ、細胞の増殖および／または分化に影響し得る特定の薬剤をいう。
【００４７】
＜細胞＞
本明細書中でいう細胞は、全てが半透性細胞膜または細胞壁によって囲まれた、１以上の核、細胞質および種々のオルガネラよりなる、独立して機能することができる生物、または単細胞生物の最も小さな構造ユニットと定義される。前記細胞は原核生物、真核生物または古細菌であり得る。例えば、細胞は真核生物細胞であり得る。哺乳動物細胞、特にヒト細胞が好ましい。細胞は天然のものであるか、あるいは遺伝子操作または培養における継代によるなどして修飾して所望の特性を達成することができる。幹細胞は後により詳細に定義され、その１を超える分化した細胞型を生じることができる全能性、多能性または複能性細胞である。幹細胞はインビトロで分化した細胞を生じ、これはそれ自体が複能性であるか、または終末的に分化させることができる。インビトロで分化した細胞は、細胞分化を促進する１以上の薬剤に幹細胞を暴露することによって人工的に作られた細胞である。
【００４８】
＜細胞プロセス＞
細胞プロセスは、細胞に起こるか、あるいは細胞に観察されるか、あるいは細胞に帰すことができる、いずれかの細胞内または細胞外の特徴的な機能、プロセス、事象、原因または効果である。細胞プロセスの例は、限定されるものではないが、生存率、老化、死滅、多能性、形態学、シグナリング、結合、認識、分子生産または破壊（分解）、突然変異、タンパク質フォールディング、転写、翻訳、触媒、シナプス伝達、小胞輸送、オルガネラ機能、細胞周期、代謝、増殖、細胞分裂、分化、表現型、遺伝子型、遺伝子発現、またはこれらのプロセスの制御を含む。
【００４９】
＜細胞ユニット＞
細胞の群であり、１つの群であってもよい。細胞ユニットのプールは、細胞ユニットが細胞のコロニーとして挙動し、細胞ユニットにおける各細胞が同一の培養条件に暴露されるように、細胞ユニットそれ自体を実質的に解離させることなく分類し、サブ分割し、取り扱うことができる。例えば、細胞ユニットは、細胞の群に接着するビーズを含むことができる。
【００５０】
＜全能性＞
全能性細胞は、生物において見出された体細胞または生殖細胞のいずれかのタイプに分化する能力を持つ細胞である。従って、いずれの所望の細胞も、何らかの手段で、全能性細胞に由来することができる。
【００５１】
＜多能性＞
多能性細胞は、１を超えるが、全てではない細胞型に分化することができる細胞である。
【００５２】
＜標識＞
本明細書中で用いる標識またはタグは、細胞ユニットを同定し、および／または細胞ユニットが暴露された培養条件、または培養条件の配列を決定するための手段である。従って、標識は標識の群であってもよく、各々は特異的な培養ステップに添加され；または細胞ユニットが暴露された培養ステップに従って修飾された、あるいは初期に、あるいは前記ステップの間に追跡された実験の間に添加された標識であり；または用いられる培養工程が推定できるようにする単純に位置的な参照である。また、標識またはタグは、いずれか１つの時点で細胞ユニットの位置または同一性を報告し、または記録し、あるいは細胞ユニットに独特なアイデンティファイアーに割り当てるデバイスであってもよい。標識またはタグの例は独特な配列、構造または質量の分子；あるいはビーズのような蛍光分子または物体；あるいは放射線周波数および他のトランスポンダ；またはユニークなマーキングまたは形状を持つ物体である。
【００５３】
＜培養条件への暴露＞
細胞が培地と接触するように置かれるか、または細胞の増殖、分化または代謝状態のような１以上の細胞プロセスに影響する条件下で増殖された場合、細胞は培養条件に暴露される。従って、もし培養条件が細胞を培地中で培養することを含めば、細胞はそれが効果を有するのに十分な長さの時間培地に入れられる。同様に、もし条件が温度条件であれば、細胞は所望の温度で培養される。
【００５４】
＜プーリング＞
細胞ユニットの１以上の群のプーリングは、１を超えるバックグラウンドの細胞ユニットを含み、すなわち、培養条件の１を超える異なる組に暴露された単一の群またはプールを作り出すための群の混合物を含む。プールはさらにランダムにまたはランダムではなく群にサブ分割され；そのような群は本発明の目的ではそれ自体は「プール」ではないが、それ自体は、例えば、培養条件の異なる組への暴露の後に組合せによってプールされる。
【００５５】
＜増殖＞
細胞成長および細胞増殖は、ここでは、異なる細胞型または細胞系譜への分化なしで細胞の数の大きさを示すのに相互交換的に用いられる。換言すれば、前記用語は生きた細胞数の増加を示す。好ましくは、増殖は表現型または遺伝子型の認識可能な変化は伴われない。
【００５６】
＜分化＞
細胞分化は、異なる細胞型の、細胞型からの発生である。例えば、二能性、多能性、または全能性細胞は中性細胞に分化することができる。分化には増殖が伴うことができ、あるいはそれとは独立していてもよい。用語「分化」は、一般には、発生的にはあまり定義されていない細胞型からの成熟細胞型、例えば、ニューロン、またはリンパ球の表現型の獲得をいうが、トランス分化を排除せず、それにより、１つの成熟細胞型はもう１つの成熟細胞型に変換することができ、例えば、ニューロンはリンパ球に変換することができる。
【００５７】
＜分化の状態＞
細胞の分化の状態は、細胞が特定の経路または系譜に沿って分化されたレベルである。
【００５８】
＜細胞プロセスの状態＞
細胞プロセスの状態は、細胞プロセスが起こりつつあるか、またはそうでないかをいい、複雑な細胞プロセスでは、その細胞プロセスにおける特定のステップまたは段階を示すことができる。例えば、細胞における細胞分化経路は不活性であるか、あるいは誘導されており、酵素または中間体の特徴的な組の存在によって特徴付けられるシグナリング事象のような区別されるステップまたは成分の数を含むことができる。
【００５９】
＜遺伝子＞
遺伝子は、それがポリペプチドまたはＲＮＡ遺伝子産物であるかを問わず遺伝子産物をコードする核酸である。本明細書中で用いるように、遺伝子は遺伝子産物をコードするコード配列を少なくとも含み；それは、所望により、コード配列の転写および／または翻訳に必要な１以上の調節領域を含むことができる。
【００６０】
＜遺伝子産物＞
遺伝子産物は、典型的には、慣用的方法で遺伝子によってコードされるタンパク質である。しかしながら、前記用語は遺伝子によってコードされるリボ核酸のような非ポリペプチド遺伝子産物も含む。
【００６１】
＜核酸合成＞
核酸は、いずれかの入手可能な技術に従って合成することができる。好ましくは、核酸合成は自動化される。さらに、核酸は、当分野で公知の手法に従って、細菌または真核生物細胞におけるクローニングおよび複製によるような、生物学的複製によって生産することができる。
【００６２】
＜差異的な発現＞
細胞培養条件に応答した異なるレベルで発現される遺伝子は、当分野で知られた方法によって、遺伝子アレイ上のような遺伝子発現分析によって同定することができる。差異的に（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ）発現された遺伝子は、総じて遺伝子発現レベルに対して、別の条件下よりもテスト条件下で細胞におけるｍＲＮＡまたは遺伝子産物のより大きなまたはより小さな量を呈する。
【００６３】
＜トランスフェクション＞
遺伝子は、いずれかの適当な手段によって細胞にトランスフェクトすることができる。前記用語は、ここでは、例えば、リン酸カルシウムを用いる従来のトランスフェクションを意味するように用いられるが、形質転換、ウイルス導入、電気穿孔などを含む、核酸を細胞に導入するための他の技術も含む。
【００６４】
＜調整＞
前記用語調整は、調整されるべきパラメーターの増加および／または減少を意味するように用いられる。従って、遺伝子発現の調整は、遺伝子発現の増加および遺伝子発現の減少を共に含む。
【００６５】
＜細胞ベースのアッセイ＞
細胞ベースのアッセイは現代の生物医薬科学の重要な一部であり、細胞が用いられる工程を含むいずれかのアッセイを含む。細胞ベースのアッセイを、薬物発見および開発プロセスのほとんど全ての段階にわたって用いることができ、どのようにして化合物が単離された潜在的薬物標的と相互作用するかについてではなく、どのようにして化合物が生物学的系で相互作用するかについての情報を提供するのに貴重である。
【００６６】
例えば、細胞ベースのアッセイを用いて、潜在的薬物標的を同定し、確認することができる。病気プロセスに関与する遺伝子または細胞経路を同定するのに、標的遺伝子の機能を判断するのに、あるいはある種の遺伝子またはそれらの産物の活性化に際して誘導することができる表現型の変化を決定するのに用いることができる細胞ベースのアッセイが開発されている。
【００６７】
細胞ベースのアッセイは、リード化合物の発見、選択および最適化のための薬物発見で用いることができる。伝統的なハイスループットスクリーニングアッセイでしばしば用いられる生化学アッセイとは異なり、細胞ベースのアッセイは、吸収、浸透性、選択性、特異性および代謝のような薬物特性に関連する情報を提供することができる。その結果、細胞ベースのスクリーニングの後に選択されるリード化合物は良好に特徴付けられており、価値あるリードをより提供するようであって、薬物発見プロセスの引き続いてのフェーズでより排除されないようである。
【００６８】
細胞ベースのアッセイの主な適用は毒性スクリーニングである。薬物の発見および開発の非常に重要な部分は、副作用を引き起こす化合物を排除するための薬物候補のスクリーニングである。しかしながら、現在の方法は大いに不適切であり、特に、毒性スクリーニングのための動物モデルの使用は費用がかかり、時間を消費するものである。加えて、動物モデルは信頼できない。なぜならば、これらのモデルにおける結果は、どのようにして化合物がヒトで実行されるかを常には正確に予測しないからである。従って、ヒト細胞ベースのスクリーニングが好ましい。
【００６９】
＜幹細胞＞
幹細胞はＳｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ：ＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃＰｒｏｇｒｅｓｓ ａｎｄＦｕｔｕｒｅ ＲｅｓｅａｒｃｈＤｉｒｅｃｔｉｏｎｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ．Ｊｕｎｅ ２００１．ｈｔｔｐ／／ｗｗｗ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｎｅｗｓ／ｓｔｅｍｃｅｌｌ／ｓｃｉｒｅｐｏｒｔ．ｈｔｍに詳細に記載されている。参照することにより前記報告の内容を本明細書に組み込む。
【００７０】
幹細胞は、分化して少なくとも１つの、時々は多くの特殊化した細胞型を形成することができる細胞である。幹細胞から形成することができる異なる細胞のレパートリーはあますところがないと考えられている；すなわち、生物を作り上げる異なる細胞型の全てを含む。幹細胞は生物の寿命を通じて、それが比較的豊富である初期の胚から、それが比較的稀である生体まで存在する。生体動物の多くの組織に存在する幹細胞は正常な組織の修復およびホメオスタシスで重要である。
【００７１】
これらの細胞の存在は、それが、ヒトに移植されて、病気組織において死滅したまたは非機能細胞を置き換えることができる特殊化機能細胞を作り出す手段を提供する。これが治療を提供することができる病気のリストはパーキンソン病、糖尿病、脊髄負傷、発作、慢性心臓病、末期腎臓病、心疾患および癌を含む。細胞置換療法が幹細胞において少なくとも２つの主な大進歩において可能となるためには、研究が必要である。第一に、細胞の治療的に関連する用量を製造することができるように開発される必要がある十分な数まで幹細胞を増殖させるための条件。理想的には、大規模な培養が可能であり、複数患者を治療するための材料を提供する。第二に、動物に移植された未分化幹細胞はしばしば腫瘍を生起するので、幹細胞のより特殊化された細胞への分化は細胞置換療法の必要条件であり、従って、異なる病気に必要な幹細胞の特に特殊化された細胞型への分化のための条件を発見する必要がある。
【００７２】
これらの障害を克服するための鍵は、幹細胞およびそれらの誘導体のための細胞培養の適当な方法を工夫することにあるのは明らかである。しかしながら、前記で説明した理由のため、すなわち、細胞培養技術の進歩に関与する試行錯誤の労力のかかるプロセスのため、前記仕事は特に困難である。よって、本明細書中に記載の本発明の適用の１つは、幹細胞の増殖および分化のための技術の解明である。
【００７３】
＜幹細胞のタイプ＞
何が幹細胞を構成するかについては依然としてかなりの論争があるが、この議論の目的では、鍵となる特徴は異なる細胞型に分化する能力である。幹細胞の例を以下に掲げる。
【００７４】
異なる幹細胞は種々の細胞型を形成する異なる能力を有する。天然では精子のみを生じるため、精原細胞幹細胞は単能性である一方で、造血幹細胞は多能性であって、胚性幹細胞は全ての細胞型を生起させることができると考えられるからであり、全能性または多能性であるといわれる。
【００７５】
今日、３つのタイプの哺乳動物多能性幹細胞が単離されている。これらの細胞は胚の３つの生殖細胞層（内胚葉、中胚葉および外胚葉）に通常は由来する細胞型を生起することができる。幹細胞の３つのタイプは精巣腫瘍に由来する胚性癌腫（ＥＣ）細胞；着床前胚（通常は、胚盤胞）に由来する胚性幹（ＥＳ）細胞；および着床後胚に由来する胚性生殖（ＥＧ）細胞（通常は、生殖腺の一部となる運命にある胎児の細胞）である。これらの細胞は、正確にはそれらが多能性であるので、分化を指令する努力において特別の注意を受ける。
【００７６】
成体生物は幹細胞も存在する。成体幹細胞は分化した（特殊化された）組織で生じ、自身を新しくし、分化してより特殊化された細胞を生じることができる未分化細胞である。最近、成体幹細胞は可塑性となることができることが示されており、すなわち、それらは分化して、それが存在する組織の特徴的を持たず、また、その組織が由来する生殖細胞層ではない細胞型を生じさせることができる。例えば、（中胚葉に由来する）血液幹細胞は（通常は、外胚葉に由来する）ニューロンに分化することができることが示されている。Ｔｏｍａｅｔ ａｌ．，（２００１，ＮａｔｕｒｅＣｅｌｌ Ｂｉｏｌ．３，ｐ７７８−７８４）は、最近、皮膚の真皮に由来する幹細胞の新しいタイプの同定および単離を記載した。これらの幹細胞は皮膚由来前駆体（ＳＫＰ）細胞と呼ばれた。前記ＳＫＰ細胞は、ポリリシン上で培養し、培養基中の血清の濃度を変化させることによって分化するように誘導することができた。血清の非存在においては、それらはニューロンおよびグリア細胞に分化し；３％血清の添加では、それらは平滑筋細胞に分化し；血清を１０％まで増加させると、ＳＫＰ細胞が脂肪細胞に分化するのを引き起こす。成体幹細胞は、これまでに、組織において、神経系、骨髄および血液、肝臓、骨格筋、皮膚および消化系と同程度に多様であると報告されている。
【００７７】
成体幹細胞に加えて、多数のタイプの先祖または前駆体細胞がある。これらの細胞は、その分化能力が部分的に制限されており、身体の組織の恐らくは全てで生じる細胞であり、それは分化できるが、そのレパートリーが広くない点で、および自己更新できない定義によって幹細胞とは異なる。
【００７８】
最近の証拠は、分化した細胞型が表現型を変化できることを示唆さえしている。トランス分化といわれる現象は、介在細胞分裂の有っても無くても、１つの分化した細胞型からもう１つの分化された細胞型への変換である。以前、一般には、最終分化状態は固定されていると認められていたが、今日では、分化は時々逆行し、または改変できることが明らかである。細胞系をトランス分化まで誘導することができるインビトロプロトコルが今日では利用できる（Ｓｈｅｎ，Ｓｌａｃｋ＆ Ｔｏｓｈ，２０００，ＮａｔｕｒｅＣｅｌｌ Ｂｉｏｌ，ｖｏｌ２，ｐ．８７９−８８７；Ｈｏｒｂ ｅｔ ａｌ．，２００３，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｂｉｏｌ．Ｖｏｌ １３，ｐ１０５−１１５）。最後に、脱分化して、さらに細胞型に分化する能力を持つ幹様細胞を生じさせることができる特殊化された細胞タイプの報告があった。
【００７９】
＜幹細胞の増殖および分化＞
幹細胞の重要な特性は培養において対称的に分裂するその能力であり、由来する幹細胞の正確なコピーである２つの娘細胞を生じる。これは、幹細胞がその未分化状態で培養において拡大培養できることを可能とし、生物学的研究または細胞療法のための十分な材料を生じる。幹細胞がこれをなすことができる手段は、理解されることには、精力的な研究の主題であるが、幹細胞更新を促進する因子は少数しか知られていない。典型的には、多能性幹細胞系が線維芽細胞の細胞分裂的には不活性なフィーダー層、またはそのような細胞によるコンディション培地で維持される。フィーダー細胞は培養基からいくつかの未知の因子を除去し／中和し、および／またはそれは、分化を抑制し、幹細胞の自己複製を促進する因子を提供すると考えられている。１つのそのような因子は白血病阻害因子（ＬＩＦ）、すなわち、フィーダー細胞の非存在下でマウスＥ３細胞自己複製を促進できる、ＩＬ−６に関連するサイトカインファミリーのメンバーである。フィーダー細胞（および／またはＬＩＦ）の非存在下で増殖された幹細胞は、しばしば、自然発生的に、および偶然に分化し、分化した細胞型の混合物を生じる。
【００８０】
幹細胞自己複製に影響する因子は刺激的または阻害的であってもよく、細胞外または細胞内で機能してもよい。分泌された因子ＬＩＦの場合には、その細胞外受容体はｇｐ１３０であり、このタンパク質の活性化はマウスＥＳ細胞分化を阻害するのに十分であることが知られている。細胞内では、非常に重要なｇｐ１３０の下流エフェクターはシグナルトランジューサーおよび転写−３のアクチベーター（ＳＴＡＴ−３）である。幹細胞多能性を維持するのに特に重要なもう１つの分子は転写因子Ｏｃｔ−４であり、これは、ダウンレギュレートされた場合に、人工的に、ＥＳ細胞またはマウスにおける多能性状態の喪失に導く。マイトジェン−活性化タンパク質キナーゼのような天然にＥＳ細胞自己更新を阻害する他のシグナリング分子もまた解明されている。幹細胞研究の主な目標は、天然および合成因子、薬物、ポリペプチド、遺伝子、オリゴヌクレオチド、組織培養培地および条件、特別な条件培地、フィーダー細胞、および前記拡大を促進し、種々のタイプの幹細胞の分化能力を保有する効果を有する他の刺激の発見である。これは、生体幹細胞を含み、これは、現在、細胞培養では認識可能には拡大されていない。
【００８１】
幹細胞研究の第二の大きな挑戦は、機能的であり、種々の病気状態で細胞喪失を置き換えることができ、ポジティブな臨床結果をもたらす特定の細胞型への幹細胞の分化を指令することである。分化を開始するための幹細胞をコアクスすること（ｃｏａｘｉｎｇ）は、現実には、かなり直接的なプロセスである。例えば、フィーダー培養から取り出され、接着性基材上で密集するまで増殖されたＥＳ細胞は自然発生的に分化を開始する。同様に、フィーダー培養から取り出され、非接着性基材上で増殖されたＥＳ細胞は胚様体、すなわち、全ての３つの生殖細胞層からの未分化および部分的に分化した細胞の塊を形成する。これらの細胞は引き続いて解離し、単層で平板培養し、指令された分化を促進する因子に暴露される。これらの因子に暴露された培養物は、多くの異なる細胞型の混合物を含む細胞を分化する胚様体または未処理培養と比較して、より少ないタイプの分化細胞によってより占められるようである。それにもかかわらず、もしいずれかの条件が工夫されたとしても、実質的に純粋な分化細胞の培養を生じるのはほとんどない。加えて、幹細胞分化のために工夫されたプロトコルのいずれかは、細胞置換療法に適当な細胞を生じるかは明らかでなく、細胞は必要な正確な表現型に最終的には分化されず、分化された細胞はもはやインビボでは生存しないであろう。
【００８２】
幹細胞の指令された分化を誘導するのに用いられてきた因子は、レチノイン酸、上皮成長因子（ＥＧＦ）、骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ）、塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）、アクチビン−Ａ、トランスフォーミング成長因子β−１（ＴＦＧβ−１）、肝細胞成長因子、神経成長因子、ソニックヘッジホッグ（ＳＨＨ）、インターロイキン−３（ＩＬ−３）、インターロイキン６（ＩＬ−６）、顆粒細胞マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、エリスロポエチン、ビタミンＤ３、デキサメタゾン、β−メルカプトエタノール、ブチル化ヒドロキシアニソール、５−アザシチジン、ＤＭＳＯ、インスリン、甲状腺ホルモン（Ｔ３）、ＬＩＦ、胎児ウシ血清、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、スティール因子、酸素濃度の変化、アスコルビン酸、β−グリセロホスフェート、ニコチンアミド、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、ｃＡＭＰ、種々の細胞接着分子および基質およびその他を含む。これらの規定された因子に加えて、コンディション培地、ヒトおよび動物組織ホモジェネートのような規定されていない抽出物、または植物抽出物を用いて、幹細胞分化を用いることができる。これらの規定されていない抽出物の進歩的な画分により、活性な画分、または高い能力を持つ純粋な成分でさえ生じさせることができる。これらの因子は、単独、または組み合わせて、または実験結果に対して非常に重要な規定された順番で、特別な実験で用いる増殖培地に添加することができる。
【００８３】
インビトロにて幹細胞の分化のために工夫された多くの系は複雑な多段階手法であり、ここに、種々の工程の正確な性質、ならびに種々の工程の年代学が重要である。例えば、Ｌｅｅｅｔ ａｌ．（２０００，ＮａｔｕｒｅＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．１８，ｐ．６７５−６７９）は、マウスＥＳ細胞からドーパミン作動性ニューロンを誘導するのに五段階プロトコルを用いた。１）未分化ＥＳ細胞はＬＩＦの存在下でＥＳ細胞培地上でゼラチン被覆組織培養表面で拡大培養され；２）胚様体をＥＳ細胞培地中で４日間懸濁培養で生じさせ；３）ネスチン陽性細胞は、組織培養表面で平板した後ＩＴＳＦｎ培地で８日間胚様体から選択された；４）ネスチン陽性細胞は、ｂＦＧＦ／ラミニンを含有するＮ２培地で６日間拡大培養され；５）最後に、拡大培養されたニューロン前駆体細胞は、ラミニンを含有するＮ２培地からｇＦＧＦを除去することによって分化するように誘導された。
【００８４】
系列的細胞培養の第二の例において、Ｂｏｎｎｅｒ−Ｗｅｉｒ ｅｔ ａｌ．［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（２０００）９７：７９９９−８００４］は、１）血清の存在下で固体表面での２〜４日間の選択的接着によって島細胞上の管細胞を選択し；２）引き続いて、血清を除去し、ケラチノサイト増殖因子を加えて、５〜１０日間線維芽細胞上で管上皮細胞につき選択し；および３）細胞外マトリックス調製物「Ｍａｔｒｉｇｅｌ」で３〜６週間細胞を重ねることによって、ヒト膵臓管細胞からインスリン生産細胞を誘導した。
【００８５】
系列的細胞培養のさらなる例において、Ｌｕｍｅｌｓｋｙ ｅｔ ａｌ．［Ｓｃｉｅｎｃｅ（２００１）２９２：１３８９−１３９４］は、１）ＬＩＦの存在下でＥＳ細胞を２〜３日間拡大培養し；２）ＬＩＦの非存在下で４日間にわたって胚様体を生じさせ；３）ＩＴＳＦｎ培地を用いてネスチン陽性細胞を６〜７日間選択し；４）Ｂ２７培地補足物およびｂＦＧＦを含有するＮ２培地において６日間膵臓内分泌前駆体を拡大培養し；および５）ｂＦＧＦを除去し、ニコチンアミドを添加することによって、インスリン分泌細胞への分化を誘導することによって、マウス胚幹（ＥＳ）細胞の指令された分化によってインスリン分泌細胞を誘導した。
【００８６】
しかしながら、重要なのは、細胞分化の測定において様々な異なる因子の添加の工程またはシリーズの配列および間においてのみではない。胚様発生は、位置情報を付与するシグナリング因子のグラジエントの作用によって調節されるので、単一シグナリング因子の濃度、および２以上の因子の相対的濃度は、インビトロおよびインビボで細胞集団の運命を特定するのに重要であると予測される。因子の濃度は、発生の間に変化し、幹細胞は同一分子の異なる濃度に対して異なって応答する。例えば、後期段階の胚のＣＮＳから単離された幹細胞は、異なる濃度のＥＧＦに異なって応答する。低濃度のＥＧＦは増殖せよとのシグナルを結果的に生じ、他方、ＥＧＦのより高い濃度は増殖および星状細胞の分化をもたらす。
【００８７】
インビトロで幹細胞の自己複製および分化に影響することが見出されている因子の多くは天然に生じる分子である。これは、分化は、シグナル変換経路に沿って作用する分子および受容体をシグナリングすることによって誘導され、制御されるので予測されるべきものである。しかしながら、同一の証拠によって、多くの合成化合物は幹細胞分化に対して影響を有するようである。シグナリングおよびシグナル変換経路（いわゆる、薬物可能標的）内の細胞標的と相互作用する高い確率を有するそのような合成化合物は、例えば、医薬会社によって薬物スクリーニングのためにルーチン的に合成される。一旦知られると、これらの化合物を用いて、エキソビボにて幹細胞の分化を指令することができるか、あるいはインビボで投与することができ、それらの場合には、それらは患者の標的器官に存在する幹細胞に作用するであろう。
【００８８】
＜組織培養における共通の変数＞
特別な細胞型の成功した培養のための、あるいは細胞プロセスを達成するまたは調整するための条件の開発において、しばしば、種々の因子を考慮するのが重要である。
【００８９】
１つの重要な因子は、懸濁液中で、あるいは基材に付着した単層として細胞を増殖させるか否かの判断である。ほとんどの細胞は、基材に接着するのを好むが、形質転換された細胞、造血細胞を含むいくらか、および腹水からの細胞は懸濁液で増殖することができる。
【００９０】
培養物が接着細胞のものであると仮定すれば、重要な因子は接着基材の選択である。ほとんどの研究所は、組織培養のための基材として使い捨て可能なプラスチックを用いる。用いられてきたプラスチックはポリスチレン（最も普通のタイプ）、ポリエチレン、ポリカルボネート、Ｐｅｒｓｐｅｘ、ＰＶＣ、テフロン（登録商標）、セロファンおよび酢酸セルロースを含む。いずれのプラスチックも用いることができるが、これらの多くはそれを細胞接着のために湿潤性とし、適したものとするのに処理される必要があろう。さらに、いずれの適当に調製された固体基材も、細胞用の支持体を提供するのに用いることができ、今日まで用いられてきた基材はガラス（例えば、ミョウバン−ボロシリケートおよびソーダライムガラス）、ゴム、合成繊維、重合されたデキストラン、メタル（例えば、ステンレス鋼およびチタン）その他を含む。
【００９１】
気管支上皮、血管内皮、骨格筋およびニューロンのようないくつかの細胞型は、生物学的産物を被覆した増殖基材、通常は、フィブロネクチン、コラーゲン、ラミニン、ポリリシンなどのような細胞外マトリックス材料を必要とする。増殖基材および適用の方法（湿潤または乾燥コーティング、またはゲル化）、細胞の増殖および分化の特徴のような細胞プロセスに対して影響を有することができ、これらは、前記したように経験的に決定されなければならない。
【００９２】
恐らくは、細胞培養における変数の最も明らかに重要なものは、培養基および血清のような補足物の選択である。これらは細胞増殖に対する水性区画を提供し、そのいくつかは前記でリストされており、その他はあまり定義されていない栄養物および種々の因子と競合する。これらの因子のいくつかは、接着に対して必須であり、その他は情報（例えば、ホルモン、マイトジェン、サイトカイン）を運ぶために必須であり、その他は解毒薬剤として必須である。通常に使用される培地はＲＰＭＩ１６４０、ＭＥＭ／ハンクスの塩、ＭＥＭ／イーグルの塩、Ｆ１２、ＤＭＥＭ／Ｆ１２、Ｌ１５、ＭＣＤＢ１５３などを含む。種々の培地はその構成要素が広く異なることができ、共通の差のいくつかは炭酸水粗ナトリウムの濃度、ＣａおよびＭｇのような二価イオンの濃度、緩衝液の組成、抗生物質、微量元素、ヌクレオシド、ポリペプチド、合成化合物、薬物などを含む。異なる培地は選択的であることが周知であり、これは、それらがいくつかの細胞型のみの増殖を促進することを意味する。血清、下垂体脳および他の抽出物のような培地補足物は、しばしば、培養中の細胞の増殖に対して必須であり、加えて、培養中の細胞の表現型を決定するのを担い、すなわち、それらは細胞生存を決定し、分化を指令することができる。分化のような細胞プロセスにおける補足物の役割は複雑であり、その濃度、それらが培養に添加される時点、用いられる細胞型および培地に依存する。これらの補足物の規定されていない性質、および細胞表現型に影響するそれらの能力は、無血清培地の開発を動機付けた。全ての培地のように、それらの開発は、前記したように、試行錯誤によってかなり起こった。
【００９３】
また、組織培養のガス相も重要であって、用いるべきその組成および用量は必要な培地のタイプ、必要な緩衝の量、培養容器が開いているかまたはシールされているか、および特定の細胞プロセスが調整される必要があるか否かに依存し得る。共通の変数は二酸化炭素および炭素の濃度を含む。
【００９４】
組織培養に対して重要な他の条件は培養容器、ヘッドスペースの量、播種密度、温度、培地変化の頻度、酵素での処理、揺動または攪拌の速度および様式を含む。
【００９５】
従って、細胞培養条件の変化は、所望の細胞プロセスを達成する方法である。本発明の１つの態様は、系列的な細胞培養条件の変動は細胞効果を達成するかなり効果的な方法であり得ることを認識している。種々の適用において、例えば、細胞分化の実験においては、それは、しばしば、異なる組織培養条件の特定のシリーズが細胞プロセスを行うのに必要である場合である。異なる条件は特定の時点における培地または培地の変化に／から付加または除去を含むことができる。その例を以下に掲げるそのような条件の組は、前記した試行錯誤によって共通して開発される。
【００９６】
＜細胞ユニットの形成＞
本発明の重要な態様は、細胞（細胞コロニー）の群が種々の条件下で細胞培養を増殖させることができ、コロニーは、乱された場合、および他のコロニーと混合された場合、種々の条件下でその一体性を大いに維持することができることである。そのような群またはコロニーは、本明細書では細胞ユニットという。細胞ユニットの形成は、例示として、キャリアーのような固体基材上での接着性培養としての細胞を増殖させることによって達成することができる。もしキャリアー上でのシーディング後に細胞増殖が起これば、娘細胞は同一キャリアー上に付着し、同一コロニーの一部を形成する。一般には、生きた接着性細胞はその増殖基材から容易には解離せず、従って、細胞コロニーの一体性は、キャリアーのいずれかの機械的な操作、培養基の揺動、またはもう１つの組織培養系への導入にもかかわらず終始一貫して存在する。同様に、もしいずれかの時点において、複数キャリアーが同一容器に入れられると（例えば、ビーズがプールされると）、１つのビーズからもう１つのビーズへの細胞の実質的移動はない。
【００９７】
ユニットまたはコロニーにおいて細胞を増殖する１つの利点は、もしユニットが異なる組織培養培地の組で系列的に置かれると、コロニーを含む全ての細胞は、同一の順番で、かつ同一の時間同一シリーズの培養条件に暴露されたであろう。組織培養容器に対してそれ自体が必ずしも接着性ではないユニットにおける細胞の増殖は、個々のコロニーが自由に除去でき、異なる培養容器に移すことができる利点を有する。この方法の利点の１つは、組織培養を小型化できることであり：最小の組織培養フラスコさえと比較して、マイクロキャリアービーズ（後記参照）をコロニー化するのに必要である。キャリアーで形成された細胞ユニットを増殖させるさらなる利点は、細胞培養をスケールアップすることができることである。キャリアー上での幹細胞の増殖は、幹細胞療法のための十分な材料を提供するために生産をスケールアップする方法を提供する。同等に、キャリアー上での幹細胞の分化は、分化が進行するにつれて生産をスケールアップする方法を提供し、結局は、細胞置換療法に対して十分な材料を提供する。そのような細胞培養のスケールアップは、少なくとも５０ｇ（乾燥重量）のマイクロキャリアー、好ましくは、１００ｇ、５００ｇ、１ｋｇ、１０ｋｇ以上を必要とする。
【００９８】
固体基材上の細胞ユニットを形成するもう１つの重要な利点は、基材および、したがって、会合の理由による付着細胞が種々の手段によって標識することができることである。
【００９９】
３ｍｍおよび５ｍｍのガラス球は細胞接着基材として、特に、細胞培養のスケールアップで用いられるガラスビーズバイオリアクター（例えば、ＭｅｒｅｄｏｓＧｍｂｈによって製造されたような）で広く用いられてきた。これらのビーズは、典型的には、パッチ培養よりはむしろ充填床で用いられて、接着性細胞に対する機械的損傷を回避する。
【０１００】
対照的に、細胞をより小さなキャリアー上で増殖させた場合、それらは懸濁培養として処理することができる。小さなキャリアー上で細胞を増殖させる通常の方法はマイクロキャリアー細胞培養という（その全体を本明細書に参照して組み込む「Ｍｉｃｒｏｃａｒｒｉｅｒｃｅｌｌ ｃｕｌｔｕｒｅ，Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ」，ＡＡ編参照，ＡｍｅｒｓｈａｍＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓから入手可能（１８−１１４０−６２））。マイクロキャリアー培養は４０００リットルまでのファーメンターでの抗体およびインターフェロン生産で商業的に使用されている。形状およびサイズがある範囲で、異なる材料で作成された種々のマイクロキャリアーが入手できる。とりわけ、ポリスチレン（Ｂｉｏｓｉｌｏｎ，Ｎｕｎｃ）、ガラス（Ｂｉｏｇｌａｓｓ，ＳｏｌｏｈｉｌｌＥｎｇ）、コラーゲン（Ｂｉｏｓｐｈｅｒｅｓ，Ｓｏｌｏｈｉｌｌ Ｅｎｇ）、ＤＥＡＥセファデックス（Ｃｙｔｏｄｅｘ−１，Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、デキストラン（Ｄｏｒｍａｃｅｌｌ，Ｐｆｅｉｆｅｒ＆ Ｌａｎｇｅｎ）、セルロース（ＤＥ−５３，Ｗｈａｔｍａｎ）、ゼラチン（Ｇｅｌｉｂｅａｄ，ＨａｚｅｌｔｏｎＬａｂ）、およびＤＥＡＥデキストラン（Ｍｉｃｒｏｄｅｘ，ＤｅｘｔｒａｎＰｒｏｄ．）で作成されたマイクロキャリアービーズが商業的に入手可能である。これらのキャリアーはビーズの比重、細胞増殖で利用できる直径および表面積の点でよく特徴付けられている。加えて、多数の多孔性（マイクロ）キャリアーは細胞増殖のためにかなり増大した表面積を持つものとして入手できる。これらの多孔性キャリアーのさらなる特徴は、それが、足場依存性細胞の増殖に、ならびに開いた相互結合ポアのネットワークにおいて捕獲によって担持された懸濁細胞に適していることである。多孔性キャリアーはゼラチン（ＣｕｌｔｉｓｐｈｅｒＧ，ＨｙＣｌｏｎｅ）、セルロース（Ｃｙｔｏｃｅｌｌ，Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、ポリエチレン（Ｃｙｔｏｌｉｎｅ１および２，Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、シリコーンゴム（Ｉｍｍｏｂａｓｉｌ，ＡｓｈｂｙＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、コラーゲン（Ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅ，ＣｅｌｌｅｘＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、およびガラス（Ｓｉｒａｎ，Ｓｃｈｏｔｔ Ｇｌａｓｓｗａｒｅ）のような材料で入手可能である。これらのキャリアーは攪拌された、液化されたまたは固定された床培養系に種々に適している。
【０１０１】
キャリアーの物理的特性は周知であるので、実験で用いたキャリアーの数を計算するのは容易である。記載されたキャリアーのいくつかおよび多くのその他のものは、正確に重量を測定することができ、引き続いて、液体培地中で膨潤させることによって調製することができる乾燥した製品として利用できる。加えて、マイクロキャリアー培養を接種するのに用いられる細胞の数は算定し、変化させることができる。例えば、ビーズ当たり６細胞で接種されたＣｙｔｏｄｅｘ３（２ｇ／リットル）の培養が、その上に４８００万細胞／リットルが５×１０４細胞／ｃｍ２の密度にて増殖される８００万マイクロキャリアーを含有する培養を与える。
【０１０２】
マイクロキャリアーで増殖させた細胞の収穫、またはマイクロキャリアーからの標識の遊離（後記参照）は細胞の酵素脱着によって、および／または適用可能であればキャリアーの消化によって達成することができる。ゼラチンキャリアーはトリプシンおよび／またはＥＤＴＡ、コラゲナーゼを用いるコラーゲンキャリアーおよびデキストラナーゼを用いるデキストランキャリアーによって可溶化させることができる。
【０１０３】
固体または多孔性マイクロキャリアーに加えて、細胞は埋め込みによってグループ化することができ、すなわち、培地浸透性バリアー内に閉じ込めることができる。浸透性透析膜が細胞の群を保持するが、培養基およびその構成要素が内部および外部区画で自由に交換できるようにする場合、膜培養系が開発されている。中空繊維カートリッジにおける細胞培養も開発されており、多数の繊維およびターン−キー系が（例えば、Ａｍｉｃｏｎ，ＣｅｌｌｅｘＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓから）商業的に入手可能である。細胞が吸着、共有結合、架橋またはポリマーマットリックスへの捕獲によって満たされる場合、半固体マトリックスにおける細胞カプセル化も開発されている。用いられてきた材料はゼラチン、ポリリシン、アルギネートおよびアガロースを含む。典型的なプロトコルはその通常の増殖培地において細胞の懸濁液と４０℃の５％アガロースを混合し、等用量のパラフィン油を用いて混合物を乳化し、氷浴中で冷却することであり、８０〜２００μｍ直径の球を生じさせる。これらの球は油から分離することができ、組織培養容器中の培地に移すことができる。
【０１０４】
細胞捕獲は、マイクロキャリアーまたは多孔性基材の使用と同様に、細胞の群の固定化のための簡単な方法である。単純な技術は、（Ｓｉｇｍａから全て入手可能な）ＤＥＡＥ、ＴＬＣ、ＱＡＥ、ＴＥＡＥのようなセルロース繊維に細胞をからませることである。他のより巧妙な工夫は、Ｏｐｔｉｃｅｌ培養系（ＣｅｌｌｅｘＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）におけるような懸濁液細胞に適したセラミックカートリッジである。
【０１０５】
当業者であれば、細胞ユニットを作る前記方法に加えて、神経球または胚様体のような細胞の３Ｄ培養の形成、または組織および、事実、ＤｒｏｓｏｐｈｉｌａまたはＣ．ｅｌｅｇａｎｓのような完全な生物の使用を含む、細胞のグループ分けを作り出す他の方法を考えるであろう。
【０１０６】
それらが構成される細胞ユニット、または基材は、限定されるものではないが、タンパク質、核酸または薬物のような他の化学物質を含む特定の因子と会合させることができる。基材のプレコンディショニングは、例えば、単純に、基材を注目する因子と共にインキュベートすることによって、あるいは前記因子を基材に共有結合または非共有結合させることによって、多くの方法で達成することができる。可溶性因子は含浸によって乾燥した材料に一体化させることができる。この技術は可溶性因子を担う液体の急速な進入、同時に膨潤し、直ちに使用できるようになる乾燥した多孔性材料に頼る。固体因子は、例えば、トロンビン溶液とフィブリノーゲン中の因子とを混合することによって取り込むことができ、その時点で、前記因子を含有するフィブリンクロットが形成される。前記因子を他の細胞と一緒に含浸し、捕獲し、またはカプセル化することに加え、細胞群と因子とを会合させる多くの他の方法が考えることができる。
【０１０７】
細胞群と多数の異なる因子とを会合させるための方法は、引き続いて、特定の細胞群と会合される因子のプレ−フォームカクテルである。第二の方法は多数の因子における細胞群を系列的に条件付けすることである。その例として細胞群増殖基材の乾燥した処方を用い、この方法は、第一の因子を含有する溶液中で基材をまず部分的に膨潤させ、引き続いて、さらに第二の因子を含有する溶液中のそれを膨潤させ、その結果、双方の因子が会合するようになる基材が得られることを含む。細胞群と異なる因子の異なる組合せとを会合させる系列的なプロトコルを工夫することによって、因子の組のいずれかの組合せの細胞群に対する効果をサンプリングすることが可能である。
【０１０８】
細胞ユニットを因子と共に条件付けするのに用いられる方法とは無関係に、前記因子は、その細胞ユニットを含む細胞によって取り込まれる。増殖培地に漏れる因子は、その濃度が物理生理学的に関連する限界未満となり、それらが、暴露されたいずれかのさらなる細胞群に対して影響を有しない程度まで希釈される。例えば、細胞ユニットの部分を形成する基材からの因子の拡散は、材料の性質および寸法、平均ポア直径、および因子の分子量および濃度のようなパラメーターによって支配される。必要であれば、前記プロセスをキャリブレートするために、ＨＰＬＣ分析または標識された因子培地への放出のような物理的アッセイによって、あるいは神経栄養因子についての後根神経節外植バイオアッセイのような生物学的アッセイによって、因子放出を測定することができる。
【０１０９】
＜細胞のコンビナトリアル系列培養＞
＜スプリットプール細胞培養＞
細胞ユニット（特に、顕微鏡的細胞ユニット）の形成は、多数の組織培養条件をサンプリングするのにさらに有用である。というのは、各細胞ユニットは、種々の細胞培養条件に暴露することができる容易に取り扱われるユニットを構成するからである。単純のために、この議論においては、我々は、マイクロキャリアー培養において細胞を増殖することによって細胞のグループ分けが作成されると仮定しており、用語細胞ユニット、細胞群、コロニーおよびビーズは相互交換的に用いられる。しかしながら、記載した方法はいずれの細胞ユニットにも、例えば、前記したものに同等に適用することができる。非常に多数の細胞培養条件をサンプリングするための特に効果的な方法は、コンビナトリアル細胞培養またはスプリットプール細胞培養といい（図１および２）、１つの実施形態においては、細胞培養条件の複数の組合せをサンプリングするための細胞ユニットの群の系列的サブ分割および組合せを含む。本発明の一つの態様において、前記方法は、細胞ユニットの初期スターター培養（または異なるスターター培養）を（各々が異なる培養条件下で別々に増殖された複数ビーズ（群／コロニー／キャリアー）を含有する）アリコットのＸ１数で割ることによって行われる。所与の時間の間の細胞培養に続き、細胞ユニットは、異なるアリコットからのビーズを組合せ、混合することによってプールすることができる。このプールはアリコットのＸ２数に再度分割することができ、その各々はある時間異なる条件下で培養され、引き続いてプールもされる。細胞ユニットを分割し、培養し、およびプールする（またはプーリング、分割および培養；どこで前記周期に入るかに依存）この反復手法は、細胞培養条件の多くの異なる組合せの系列的サンプリングを可能とする。実験に複雑性、換言すれば、テストした細胞培養条件の異なる組合せの数は各ラウンドでサンプリングした異なる条件の数の積（Ｘ１×Ｘ２×．．．Ｘｎ）に等しい。引き続いての分割に先立って全ての細胞ユニットをプールする工程は任意とすることができ−限定された数の細胞ユニットがプールされる工程は、図３および４に示したように同一の効果を有することができることに留意のこと。本発明は、従って、細胞ユニットの群がひとまとめで取り扱われる場合に、細胞培養条件の多数の組合せを系列的にサンプリングする多数の関連方法を具体化する。
【０１１０】
多様な細胞培養条件がこの手段によってサンプリングできる正確な方法とは無関係に、前記手法は効果的である。なぜならば、多数の細胞ユニットが同一の条件下で培養される場合、単一の容器を共有することができ、それはいずれの時点においても少数の培養容器のみを用いて行うことができるからである（用いる培養容器の数は分割された試料の数と等しい）。多くの点で、この手法の原理は、化学的な形成ブロック基の間の結合の全ての可能な組み合わせをサンプリングする（コンビナトリアル・ケミストリーとして知られた）大きな化学ライブラリーの分割合成の原理と似ている（例えば、ＣｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌＣｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ（２０００），Ｈｉｃｈａｍ Ｆｅｎｎｉｒｉ（編集者）参照）。分割プール細胞培養は、いずれかの数のラウンドにわたって繰り返すことができ、いずれかの数の条件は各ラウンドでサンプリングすることができる。細胞ユニット（またはこの例においてはコロニー化されたビーズ）の数が全てのラウンドにわたってサンプリングされた異なる状態の数よりも大きい、または等しく、かつ細胞ユニットの分割が全くランダムに起こると仮定する限り、実験によってサンプリングされた培養条件の種々の組合せの各々に従って培養された少なくとも１つの細胞ユニットがあると予測される。この手法を用いて、いずれかの細胞型についての増殖または分化条件、いずれかの細胞型による生体分子生産（例えば、エリスロポエチンまたはインターフェロンの生産）の効率をサンプリングすることができる。前記手法は反復的であるゆえに、複数の組織培養プロトコル−例えば幹細胞分化と組み合わせた前記のもののテストに理想的に適合する。この技術を用いてサンプリングすることができる変数は細胞型、細胞グループ分け（例えば、マイクロキャリアー培養、細胞カプセル化、全生物）、増殖基材（例えば、マイクロキャリアー上のフィブロネクチン）、細胞培養ラウンドの持続、温度、（構成要素の異なる濃度を含む）異なる培養基、成長因子、条件培地、種々の細胞型（例えば、フィーダー細胞）との共培養、動物または植物抽出物、薬物、他の合成化学物質、ウイルス（トランスジェニックウイルスを含む）での感染、導入遺伝子の添加、アンチセンスまたは抗遺伝子分子（例えば、ＲＮＡｉ、三重らせん）の付加、（生物の場合における）感覚入力、電気、光またはレドックス刺激体などを含む。
【０１１１】
＜分割−分割細胞培養＞
細胞ユニット上でスプリットプールプロセスを行う目的は、条件の予め規定された組合せにこれらを系統的に暴露することである。当業者であれば、この結果を達成する多くの異なる手段を考え付くであろう。分割プールプロセスおよびその変形に加えて、分割−分割（ｓｐｌｉｔ−ｓｐｌｉｔ）プロセスを軽く議論するのは価値あることである。分割−分割プロセスは、細胞ユニットのプーリングに介入することなく、細胞ユニットの群を少なくとも２回サブ分割することを含む（図５）。もし分割−分割プロセスが大きな数のラウンドにわたって用いられれば、生じた別々の試料の数は指数関数的に増大する。この場合、あるレベルの自動化、例えば、ロボットプラットフォームおよび巧妙な試料トラッキングシステムの使用を用いるのが重要である。分割−分割工程の利点は、（細胞ユニットが組み合わせられていないので）、それらの細胞培養履歴に基づいて種々の細胞ユニットの系統を分離することが可能である。その結果、分割−分割工程を用いて、特定の細胞培養条件がいずれかの所与の細胞プロセスを担うかを推定することができ、従って、（図６で説明された、および「Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｏｆ ｃｕｌｔｕｒｅｈｉｓｔｏｒｙ ｏｆａ ｃｅｌｌｕｎｉｔ」下で詳細に説明された）細胞ユニットの培養履歴を推定することができる。
【０１１２】
＜所定のプロトコル＞
細胞ユニットの分割および／またはプーリングは全くランダムに達成することができるか、あるいは所定のプロトコルに従うことができる。細胞にユニットがランダムに分割および／またはプールされる場合、与えられた細胞ユニットのいずれかの群への分離は断じて所定のものであったり、妥当性を損なうものではない。少なくとも１つの細胞ユニットが細胞培養条件の可能な組合せの１つに暴露される高い確率がもたらされるためには、テストされるべき細胞培養条件の組合せの合計数よりも大きな数の細胞ユニットを使用するのが有利である。従って、ある種の条件下では、所定のプロトコルに従って細胞ユニットを分割しおよび／またはプールするのが有利であり、総じての効果は、偶発的な複製または省略が妨げられるということである。細胞ユニットの所定の取扱は、所望により、予め計画し、スプレッドシートまたはコンピュータプログラム、および自動化プロトコル、例えば、ロボットを用いて実行される分割および／またはプーリング操作にログすることができる。細胞ユニットの標識（後記参照）は多数の手段、例えば、ＲＦＩＤによる標識、光学タグ付けまたは空間的暗号化のいずれかによることができる。試料の同時性を決定し、従って、所定のプロトコルに従って試料を分割することができるロボットデバイスが記載されている（「ＣｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌＣｈｅｍｉｓｔｒｙ Ａｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｒｏｒｃｈ」）、ＯｘｆｏｒｄＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ（２０００）ＥｄＨ．Ｆｅｎｎｉｒｉ参照）。あるいは、標準研究所液体取扱および／または組織培養ロボット（例えば、ＢｅｃｋｍａｎＣｏｕｌｔｅｒ Ｉｎｃ．Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ，ＣＡ；ＴｈｅＡｕｔｏｍａｔｉｏｎ Ｐａｒｔｎｅｒｓｈｉｐ，Ｒｏｙｓｔｏｎ，ＵＫによって製造されたような）は、多数の試料の同一性を空間的に暗号化し、予めプログラムされたプロトコルに従ってこれらを付加し、除去し、または移動させることができる。
【０１１３】
＜細胞ユニットの分析および／または分離＞
細胞培養の各ラウンドに続き、または規定された数のラウンドの後、細胞ユニットを調べて、組織培養条件によって影響され得るいずれかの所定の細胞プロセスを観察することができる。以下の例は説明的であって、本発明の範囲を限定する意図のものではない。
【０１１４】
細胞培養の各ラウンドに続き、規定された数のラウンドの後、細胞ユニットをアッセイして、増大した細胞増殖を提示するメンバーがあるか否かを決定することができる。これは、種々の技術によって、例えば、顕微鏡下で細胞ユニットの視覚での精査によって、あるいは細胞に特徴的なマーカー産物を定量することによって達成することができる。これは、特定のＤＮＡ配列のような内因性マーカー、あるいはリガンドまたは抗体によって検出することができる細胞タンパク質であり得る。あるいは、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）のような外因性マーカーをアッセイすべき細胞ユニットに導入して、（生きた）細胞の特定の読みを提供することができる。生きた細胞は種々の活性な染色を用いて可視化することができるか、あるいは逆に、死滅した細胞は種々の方法を用いて、例えばヨウ化プロピジウムを用いて標識することができる。さらに、標識された細胞ユニットは、アフィニティー精製（「パンニング」）を含む手動および自動双方の種々の技術によって、あるいは蛍光活性化細胞ソーティング（ＦＡＣＳ）または広く同様な技術によって標識されていないものから分離することができる（図１７）。適用に応じて、標準的な実験室器具を用いることができるか、あるいは特殊化機器を用いるのが有利であろう。例えば、ある種の分析およびソ−ティング機器（例えば、ＵｎｉｏｎＢｉｏｍｅｔｒｉｃａ Ｉｎｃ．，ＳｏｍｅｒｖｉｌｌｅＭＡ，ＵＳＡ）は１ミリメートルまでのフロー細胞直径を有し、これは、５００ミクロンまでの直径を持つビーズのフローソーティングを可能とする。これらの機器はビーズサイズおよび光学密度ならびにＧＦＰ、ＹＦＰまたはＤＳ−赤色のようなダグからの２つの蛍光発光波長の読みを提供する。１時間当たり１８０，０００ビーズのソーティングスピードおよび複数ウェルプレートへの、またはバルク受容体への分配は可能である。
【０１１５】
細胞培養の各ラウンドに続き、または規定された数のラウンドの後、細胞ユニットをアッセイして、特定の遺伝子型または表現型を提示するメンバーがあるか否かを決定することができる。遺伝子型の決定はポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、蛍光インサイチューハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）、ＤＮＡ配列決定などのような周知の技術を用いて行うことができる。表現型決定は、種々の技術によって、例えば、顕微鏡下での細胞ユニットの視覚精査によって、あるいは細胞に特徴的なマーカー産物を検出することによって行うことができる。これは特定のＤＮＡまたはＲＮＡ配列、またはリガンド、酵素基質の変換によって検出することができる細胞タンパク質、特定の表現型マーカーを認識する抗体のような内因性マーカーであり得る（例えば、ＳｔｅｍＣｅｌｌｓ：Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｒｏｇｒｅｓｓ ａｎｄ Ｆｕｔｕｒｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｄｉｒｅｃｔｉｏｎｓ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ．Ｊｕｎｅ ２００１のＡｐｐｅｎｄｉｘＥ参照；本明細書に参照して付録を組み込む）。遺伝子マーカーは外因性とすることができ、すなわち、例えば、トランスフェクションまたはウイルス導入によって細胞集団に導入されたものであり得る。外因性マーカーの例は蛍光タンパク質（例えば、ＧＦＰ）、または特定の細胞系統で正常に発現されない、またはエピトープ−修飾された、または異なる種からの細胞表面抗原である。関連する転写制御エレメントを持つトランスジーンまたは外因性マーカー遺伝子は、内因性遺伝子に代表的なパターンを反映するように発現することができる。これは、遺伝子を最小細胞型特異的プロモーターと会合させることによって、あるいはトランスジーンを特定の遺伝子座に組み込むことによって達成することができる（例えば、欧州特許番号ＥＰ０６９５３５１参照）。標識された細胞ユニットは、アフィニティー精製（「パニング」）を含む手動および自動双方の種々の技術によって、あるいは蛍光活性化細胞ソーティング（ＦＡＣＳ）によって未標識のものから分離することができる。Ｎｉｓｈｉｋａｗａｅｔ ａｌ．（１９９８，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｖｏｌ １２５，ｐ１７４７−１７５７）は、全能性マウスＥＳ細胞の分化を追跡するために抗体によって認識される細胞表面マーカーを用いた。ＦＡＣＳを用い、それをその分化における種々の段階で造血系統の細胞を同定し、精製することができた。
【０１１６】
特定の遺伝子型または表現型の細胞ユニットを豊富化するための代替または補充的な技術は、所望の群を遺伝子的に選択することである。これは、例えば選択マーカーを細胞ユニットに導入することによって達成することができ、選択条件下での生存率についてアッセイするためには、例えば、分化したＥＳ細胞からインスリン分泌細胞を選択するそのようなシステムを用いたＳｏｒｉａｅｔ ａｌ．（２０００，Ｄｉａｂｅｔｅｓｖｏｌ ４９，ｐ１−６）参照。Ｌｉｅｔ ａｌ．（１９９８，ＣｕｒｒＢｉｏｌ ｖｏｌ８，ｐ ９７１−９７４）は、（β−ガラクトシダーゼ活性およびＧ４１８抵抗性を提供する）二官能性選択マーカー／レポーターβｇｅｏを、マウスＥＳ細胞において相同組換えによってＳｏｘ２遺伝子座に組み込むことによって神経先祖を同定した。神経先祖の特徴の１つはＳｏｘ２の発現および、従って、組み込まれたマーカー遺伝子であるので、これらの細胞は、レチノイン酸を用いる分化の誘導後におけるＧ４１８の添加によって非ニューロン系統から選択することができた。細胞の生存率は、顕微鏡下での精査によって、あるいはβ−ｇａｌ活性をモニタリングすることによって測定することができた。適当なリガンドまたは抗体の入手可能性によって制限され得る表現型ベースの選択アプローチとは異なり、遺伝子選択はいずれかの差異的に（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ）発現された遺伝子に適応することができる。
【０１１７】
＜細胞ユニットの同一性または細胞培養履歴の決定＞
非常に多数の細胞ユニットを取り扱う場合、その同一性および／または細胞培養履歴（例えば、いずれかの１つの群またはユニットが暴露されたであろう一連の培養条件の年代学および正確な性質）は混乱しかねない。例えば、細胞培養の分裂プールプロトコルは各ラウンドにおける細胞ユニットの混合を含み、それを個々のユニットに従うのを困難とする。複数培養条件に供された細胞ユニットの混合物における細胞ユニットの細胞培養履歴の決定は、時々、細胞培養履歴の「脱回旋」と言う。これを成す１つの方法は細胞ユニットを標識することであり、従って、細胞ユニットを標識するのは有利である。標識は実験の開始時、実験の各ラウンドの間に行うことができ、ユニークな標識（実験の間に修飾することができるか、またはできない）、またはユニークな集合を含む一連の標識を含むことができる。同様に標識の読みは、各ラウンドの間にまたは単純に実験の最後に行うことができる。好ましくは、ＲＦＩＤ標識のようなユニークな標識は各ラウンドの間に読まれ、他方、各ラウンドにおいて系列的に付加された標識は実験の最後に読まれる。
【０１１８】
細胞ユニットの標識は種々の手段、例えば、細胞それ自体の標識、あるいは細胞が付着した、そうでなければ会合したいずれかの物質によって達成することができる。合成コンビナトリアルライブラリーをコードするのに用いられた化学的および非化学的方法のいずれも、この目的のために適合させることができ、これらのいくつかは、その全てを本明細書に参照して組み込むＭｅｔｈｏｄｓｉｎ ＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙＶｏｌ ２６７（１９９６），「ＣｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌＣｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｊｏｈｎ Ｎ．Ａｂｅｌｓｏｎ（Ｅｄｉｔｏｒ）；Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，ＯｘｆｏｒｄＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ（２０００），ＨｉｃｈａｍＦｅｎｎｉｒｉ（Ｅｄｉｔｏｒ）；Ｋ．Ｂｒａｅｃｋｍａｎｓ ｅｔ ａｌ．，「Ｓｃａｎｉｎｇ ｔｈｅ ｃｏｄｅ」Ｍｏｄｅｒｎ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（Ｆｅｂ．２００３）；Ｋ．Ｂｒａｅｃｋｍａｎｓｅｔ ａｌ．，「Ｅｎｃｏｄｉｎｇｍｉｃｒｏｃａｒｒｉｅｒｓ；Ｐｒｅｓｅｎｔ ａｎｄ Ｆｕｔｕｒｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ」；Ｎａｔｕｒｅ ＲｅｖｉｅｗｓＤｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ，ｖｏｌ．１，ｐ．４４７−４５６（２００２）に記載されている。標識方法のいくつかの例は以下の通りである。
【０１１９】
細胞ユニットを標識する１つの方法は、順次に修飾されるようになるタグと細胞ユニットとを会合させることを含む。というのは、それを異なる培養条件に置くからである。これは、その立体化学、配列または質量が改変されるようなタグへのさらなるユニットの付加または減算；あるいはリードライトＲＦトランスポンダにおけるような電子メモリの改変を含むことができる（以下参照）。
【０１２０】
細胞ユニットを標識するもう１つの方法は、タグの引き続いての検出および同定が、それに細胞ユニットが暴露された細胞培養条件の年代学および同一性の明確な記録を提供するように、それらが異なる条件下で培養された場合には常にユニークなタグを細胞ユニットと順次に会合させることを含む。タグは細胞によって摂取できるか、あるいは吸着、または適当なリガンドまたは抗体によって細胞表面に付着させることができるか、あるいは吸着によるキャリアー、コロイド力または共有結合または非共有結合、例えば、ビオチン−ストレプトアビジン結合のような種々の結合によるキャリアーのような細胞会合マトリックスにコンジュゲートさせることができる。例えば、細胞に導入することができるか、あるいは細胞に会合したマトリックスに付着させることができる１つの単純なタグは、規定された長さおよび／または配列のオリゴヌクレオチドである。オリゴヌクレオチドはいずれかのクラスの核酸（例えば、ＲＮＡ、ＤＮＡ、ＰＮＡ、線状、環状またはウイルス）を含むことができ、増幅用の特異的な配列（例えばＰＣＲについてのプライマー配列）または検出用の標識（例えば、フルオロフォアまたはクエンチャー、同位体タグ）を含むことができる。これらの検出は、例えば、オリゴ配列決定することによって、あるいはそれらを（例えば、アレイまたはチップ上の）相補的な配列にハイブリダイズさせることによって、直接的であり得るか、あるいはオリゴヌクレオチドコード遺伝子産物のモニタリング、またはヌクレオチドと細胞活性との干渉（例えば、特定遺伝子のアンチセンス阻害）によって間接的であり得る。核酸を増幅する有利な方法は、核酸タグがＲＣＡ鋳型、伸長プライマー、または小円鋳型の環状化を助けるストルット（ｓｔｒｕｔ）を含むことができる場合には、ローリングサークル増幅（ＲＣＡ；２００２，Ｖ．Ｄｅｍｉｄｏｖ，ＥｘｐｅｒｔＲｅｖ．Ｍｏｌ．Ｄｉａｇｎ．２（６），ｐ．８９−９５）による。
【０１２１】
ペプチドタグ、着色または蛍光化合物、第二級アミン、ハロカーボン、安定な同位体の混合物などを含む、いずれの分子または高分子タグも、それが検出できる限り用いることができる。タグは細胞ユニットに直接的に、あるいは中間物質、例えば、細胞ユニットの構成要素に対して生起された抗体を介して、あるいはビオチン−ストレプトアビジンのような相互作用対を介して細胞ユニットに付着させることができる。加えて、タグは細胞培養の構成要素によって、例えば、化学的または他の修飾によって、またはカプセル化によって分解に対して保護することができる。タグのカプセル化は多くの異なる媒体中で、例えば、ＢａｎｇｓＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ．（Ｆｉｓｈｅｒｓ ＩＮ，ＵＳＡ）のような供給業者から入手できるビーズの多くのタイプで行うことができ、カプセル化を用いて、タグ増幅および／または検出用の構成要素を供することに加えて、タグの量を標準化することができる（例えば、ＤＮＡタグでの使用のためにＰＣＲプライマーを提供することによって）。細胞ユニットを標識する好ましい方法は、ＬｕｍｉｎｅｘＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ａｕｓｔｉｎ，ＴＸ，ＵＳＡ）によって製造されるもののような蛍光ビーズを使用する。前記Ｌｕｍｉｎｅｘシステムは（例えば、アビジンまたは抗体で）外部的に誘導体化することができるか、またはしなくてもよいポリスチレンビーズを含み、異なる比率の２つのスペクトル的に区別されるフルオロフォア、および各バンドのスペクトルシグニチャーを特徴付けることができるリーダーで内部的に染色される。さらなる好ましい方法は、ＢａｎｇｓＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ．（Ｆｉｓｈｅｒｓ ＩＮ，ＵＳＡ）によって製造されたもののようなビーズを使用する。前記Ｂａｎｇｓシステムは、異なるサイズ（例えば、４．４μｍおよび５．５μｍ直径のビーズの組）に基づいて区別することができるビーズ組を含む。各組内のビーズは、さらに、単一蛍光色素での異なる負荷による異なる蛍光強度に基づいて相互に区別することができる。内部的に負荷することができるか、あるいは多数の手段によって外部的にキャリアーに付着されることができる異なる吸収または発光特徴を持つ多くの異なる色素を用いることができる。さらに、便宜に読むことができる非常に多数の異なる蛍光標識を得るのに「量子ドット」を用いることができる。
【０１２２】
細胞ユニットの形成との関連で記載されたもののような細胞増殖基材は、タグ付けを容易とし、細胞増殖と干渉しない物質で誘導体化するか、またはコートすることができる。キャリアーを誘導体化する好ましい方法は、タグがそれにストレプトアビジンまたはアビジンを介して結合することができるビオチンと共有結合または非共有結合するように修飾する。一般に、それ自体は細胞効果を誘導せず（すなわち、不活性タグ）かつ細胞ユニットまたは培養基に存在する分子から識別することができ、かつその標的に結合することができ、引き続いて、そのような分子のバックグラウントで検出することができるタグを用いるのが重要である。検出を容易とするためには、細胞ユニットからタグを選択的に溶出させるか、選択条件を用いて細胞ユニットから細胞を追い出すのが有利であろう。より複雑な分子タグ付け戦略も考えることもでき、これは、分子タグの組およびその混合物に割り当てられた二元暗号の組によって情報が記録される「二元暗号化」の戦略を含む。
【０１２３】
タグの検出は、当業者が精通した教示の方法によって達成することができる。前記方法は質量分析、核磁気共鳴、配列決定、ハイブリダイゼーション、抗原検出、電気泳動、分光分析、顕微鏡観察、イメージ分析、蛍光検出などを含む。
【０１２４】
特に興味深いものの中には、標識が一回のみ行われるか、あるいは標識および／または検出が非物理的であり、従って、非侵入的である標識または暗号化戦略がある。高周波数同定（ＲＦＩＤ）は、これらの特性を呈する系の例である。ＲＦＩＤはトランスポンダ（ＲＦタグ）、アンテナおよびリーダーを使用する。ＲＦタグは、適当なエレクトロニクスによって、接触または照準線なしで「読む」ことができるユニークな同定暗号に対するアクセスを、その最も単純な形態において提供する、通常はガラスまたはプラスチックに入れられた小さな電子回路である。タグは、再度、接触または照準線なしで、ユーザーによって生じた情報を貯蔵することができる。「リーダー」は、１以上のタグへのおよび１以上のタグからの情報を移動させる電子ユニットである（用語リーダーは、読み出し専門および読出／書込ユニット双方を意味すると相互交換的に使用されることに注意すべきである）。リーダーのサイズおよび特徴はかなり変化することができ、それは単離において作動することができ、あるいは遠隔コンピューターシステムに接続することができる。アンテナはリーダーからタグへの情報を伝達し、ＲＦタグによって送られた情報を受け取るように用いられる。アンテナのサイズおよびフォーマットは特定の適用を反映し、小さな回路ホイルから大きな平面構造までの範囲とすることができる。ＲＦＩＤシステムは単離において作動することができるか、あるいは同定のより包括的解釈および操作のための遠隔コンピューター、およびタグに由来する関連データに接合することができる。コンビナトリアル・ケミストリーで用いられる１つのＦＲＩＤ戦略はＮｉｃｏｌａｏｕｅｔ ａｌ．（１９９５，ＡｎｇｅｗＣｈｅｍ ＩｎｔｌＥｄ Ｅｎｇｌ，ｖｏｌ．３４，ｐ．２２８９）に記載されており、これは、（ｉ）合成基材および半導体タグを含有する多孔性エンクロージャー；（ｉｉ）固相合成樹脂；（ｉｉｉ）高周波数シグナルを受信し、貯蔵し、および発信できるガラスに入れた単一または複数アドレス可能な高周波数タグ半導体ユニットを含む。同様なデバイスを、固相合成樹脂を組織培養マイクロキャリアーまたは適当な細胞ユニットで置き換えることによって増殖および追跡細胞ユニットに適合させることができよう。このより多くの変形が考えられ、限定されるものではないが、細胞がその上で直接的に増殖される（被覆または未被覆）ＲＦタグまたは細胞ユニットまたは生物に移植されたＲＦタグを含む。
【０１２５】
従って、タグは、最初の例においては、その化学的または分子的構造によって必ずしも識別される必要はない。非化学的タグ付け戦略の多くの変形を工夫して、混合物中における所与の細胞ユニットの同一性を決定することができ、あるいは混合物を含む異なる細胞ユニットの同一性を推定することができる。例えば、異なる形状の物体、グラフ的にエンコードされた物体、または異なる色が試料の同一性を示す場合（例えば、１９９８，Ｇｕｉｌｅｓｅｔ ａｌ．，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．ＩｎｔｌＥｄ Ｅｎｇｌ，ｖｏｌ．３７，ｐ９２６；ＬｕｍｉｎｅｘＣｏｒｐ，Ａｕｓｔｉｎ ＴＸ，ＵＳＡ；ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ；Ｍｅｍｏｂｅａｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｇｈｅｎｔ，Ｂｅｌｇｉｕｍ）、あるいはパターンまたはバーコードが、セラミックバーのような基材にエッチングされ、パターン認識技術を用いて認識される場合（例えば、１９９７，Ｘｉａｏｅｔ ａｌ．，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．ＩｎｔｌＥｄ Ｅｎｇｌ，ｖｏｌ．３６，ｐ７８０；ＳｍａｒｔＢｅａｄＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｂａｂｒａｈａｍ，ＵＫ）、タグ付けの光学的または可視的方法が記載されている。
【０１２６】
細胞ユニットを追跡するまたは標識するさらなる方法は、空間的にすなわち、空間におけるその位置によって、それらの同一性をエンコードすることである。この方法において、異なる細胞ユニットが規定された相対的位置に分離され、これらの位置はユニットの同一性を示すか、またはエンコードする。例えば、細胞ユニットはアレイが培養することができ、それにより、各ユニットの同一性および／または培養履歴が知られており、アレイにおける特定の位置に結合させる。それらの最も単純な形態において、そのようなアレイは、スライドグラスまたは他の表面上の組織培養フラスコ、複数ウェルプレートのウェル、または位置のコレクションを含むことができる。位置暗号化戦略の例はＧｅｙｓｅｎｅｔ ａｌ．で見出すことができる。（１９８４，ＰｒｏｃＮａｔｌ ＡｃａｄＳｃｉ ＵＳＡｖｏｌ．８１，ｐ．３９９８−４００２），Ｆｏｄｏｒ ｅｔ ａｌ．（１９９１，Ｓｃｉｅｎｃｅ ｖｏｌ．２５１，ｐ．７６７−７７３），Ｚｉａｕｄｄｉｎ ａｎｄＳａｂａｔｉｎｉ（２００１，Ｎａｔｕｒｅ，Ｖｏｌ．４１１，ｐ．１０７−１１０），ａｎｄ Ｗｕｅｔ ａｌ．（２００２，Ｔｒｅｂｎｄｓ，ＣｅｌｌＢｉｏｌ．Ｖｏｌ．１２（１０），ｐ．４８５−８）。
【０１２７】
本発明は、その各々が、本発明の多数の順列を形成するように組み合わせることができる多くの形態を有することができる、多くの様相を有する。細胞ユニットの全てを標識して、細胞培養プロトコルの組合せから得られた結果についての情報を推定できる必要がないのは明らかであろう。従って、細胞ユニットの標識なしで、本発明に従って細胞培養条件の大きな組合せをアッセイし、これらの１以上が特定の細胞効果をもたらすことができるか否かを判断するのは依然として可能であろう。しかしながら、細胞ユニットは好ましくは標識される。細胞ユニットの標識は、全ての細胞ユニットは反対に、標識された細胞ユニットによってサンプリングされた特定の条件の結果に関して実験からの有用な情報の引き出しを可能とする。あるいは、ある培養プロトコルに全てが暴露された細胞ユニットの１または数個の群、例えば、特定の分割またはプール工程の間に同一媒体に分離されている細胞ユニットの群を標識するのが時々有利である。また、ある細胞ユニットの標識が、他の（おそらくは、未標識の）細胞ユニットの同一性を推定するのを可能とするのも明らかであろう。
【０１２８】
同様に、種々の条件が省略された細胞培養実験の実行は、特定の実験結果に対するそれらの条件の利用性に関して情報を与えることができるのは明らかであろう。従って、実験を数回繰り返すことによって本発明に従った方法でサンプリングされた条件の各々を評価するのは可能であり、各回は条件の異なる組を省略する。
【０１２９】
また、分裂細胞培養工程を用いて、実験結果に対する条件の特定の組の結果を判断することもできる。事実、分割工程は、分岐の時点におけるユニークな細胞培養条件に各々が暴露された細胞ユニットの特定の系統の形成をもたらす。異なる系統を調べることによって、特定の実験結果に関して、分岐点において調べた組織培養条件の利用性を判断することができる（図６）。
【０１３０】
以下の実施例において本発明をさらに記載する。
【実施例１】
【０１３１】
＜分裂プール細胞培養を用いるＥＳ細胞ユニットの分化＞
分裂プール培養実験を行って、未分化マウスＥＳ細胞のスターター培養を用い、ドーパミン作動性表現型のニューロンを生起させることができる組織培養条件をアッセイした。
【０１３２】
未分化ＥＳ細胞を、１５％ＦＣＳ、１００ｍＭ ＭＥＭ非必須アミノ酸０．５５ｍＭ ２−メルカプトエタノール、Ｌ−グルタミンおよび抗体（全てＧＩＢＣＯ／ＢＲＬからのものである）を補足したノックアウトダルベッコの最小必須培地（ＤＭＥＭ；ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬよりなるＥＳ細胞培地中、１，４００Ｕｍｌ-1の白血病阻害因子（ＬＩＦ；Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）の存在下でゼラチン被覆組織培養プレート上で増殖させた。胚様体（ＥＢ）形成を誘導するために、０．０５％トリプシンおよびＰＢＳ中の０．０４％ＥＤＴＡによって、細胞を単細胞懸濁液に解離させ、前記した培地中で２〜２．５×１０４細胞ｃｍ−２の密度で非接着性細菌培養皿で平板培養した。ＥＢは４日間で形成し、次いで、ＥＳ細胞培地中の接着性組織培養表面に平板培養した。２４時間の培養後、無血清インスリン／トランスフェリン／セレン／フィブロネクチン（ＩＴＳＦｎ）培地によってＥＳ細胞培地を置き換え、１０日間インキュベートすることよってネスチン陽性細胞の選択を達成した。
【０１３３】
これらのネスチン陽性細胞は、分割プール培養実験のための出発物質として用いた。具体的には、細胞を０．０５％トリプシン／０．０４％ＥＤＴＡによって解離し、ほぼ１．５〜２×１０５細胞ｃｍ−２において＞１０，０００ガラスバイオスフェア（Ｗｈａｔｍａｎ，ＵＫ）に蒔いた。その後、用いた組織培養皿は非接着性材料から作成した。ポリオルニチン（１５ｍｇｍｌ-1）およびラミニン（１μｇ ｍｌ-1、共にＢｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ Ｌａｂｗａｒｅ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）を用いて滅菌ガラスビーズを予めコートした。ビーズをランダムに４つの組に分割し、その各々を、その組成を以下の表１に掲げる４つの組織培養基（Ａ１、Ａ２、Ａ３またはＡ４で表す）のうちの一つにおいてインキュベートした。これらはＪｏｈｅｅｔ ａｌ．（１９９６，ＧｅｎｅｓＤｅｖ，ｖｏｌ．１０，ｐ ３１２９−３１４０）に従って修飾されたＮ２培地に基づき、以下、これを単にＮ２培地という。
【０１３４】
【表１】
【０１３５】
ビーズの４つの組を各組織培養基に２日間暴露し、次いで、全ての４つの培養からのビーズをプールし、Ｎ２培地中で軽く洗浄し、再度、４つの組の分割し、その各々を培地Ａ１〜Ａ４の一つにおいてインキュベートした。２日後、この手法を再度反復して、培地Ａ１〜Ａ４の種々の組合せにおいて、６日間、細胞培養をサンプリングした。この後、全ての４つの培養からのビーズをプールし、Ｎ２培地で軽く洗浄し、４つの新しい組にランダムに分割し、その各々を、その組成を以下の表２に掲げた４つの新しい培地（Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３またはＢ４と命名）のうちの一つにおいてインキュベートした。
【０１３６】
【表２】
【０１３７】
培養の各ラウンドは５日間であり、次いで、全ての４つの培養からのビーズをプールし、Ｎ２培地で軽く洗浄し、４つの組に分割し、その各々を再度培地Ｂ１〜Ｂ４のうちの１つにおいてインキュベートした。この手法は、ビーズが合計１５日間Ｂ培地中に存在するように、合計３回行った。
【０１３８】
異なる培養基の組成物に含まれていたのは、少量ずつガラスマイクロキャリアー（または細胞）に接着させ、引き続いて増幅し、分析して、分割プール培養療法においていずれかの時点でマイクロキャリアービーズの所在を推定するユニークなオリゴヌクレオチド標識であった。各標識のＤＮＡ配列は、異なる培地（すなわち、培地Ａ１対培地Ａ２）および分割プール培地の２つの異なるラウンドでの同一培地（すなわち、０日対４日に用いた培地Ａ１）への暴露の間を識別するように異なった。合計２１日間にわたる種々の培地における分割プール培養療法の要約は以下の表３に掲げる。表における各エントリーは、組織培養フラスコに含まれた標識の同一性を示す（括弧に入れる）。標識の全ＤＮＡ配列は表４に示す。
【０１３９】
【表３】
【０１４０】
【表４】
【０１４１】
異なるＡ培地中で３回、続いて、異なるＢ培地中で３回幹細胞を分割プール培養することによって、４０９６の異なる組織培養プロトコルをサンプリングすることが可能であった−これは、異なるビーズが暴露された前記緩衝液の異なる組合せの合計数である。
【０１４２】
分割プール培養の最終ラウンドに続き、ビーズをプールし、Ｎ２培地中で軽く洗浄し、標準プロトコルを用いてＦＡＣＳによって分析した。簡単に述べれば、細胞をＰＢＳ中の４％パラホルムアルデヒド／０．１５％ピクリン酸中で固定した。ドーパミン作動性ニューロンを検出するために、共に製造業者の指示に従って、抗チロシンヒドロキシラーゼモノクローナル抗体（Ｓｉｇｍａ）、続いて、蛍光標識二次抗体（ＪａｃｋｓｏｎＩｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｗｅｓｔ Ｇｒｏｖｅ，ＰＡ）を用いて細胞を染色した。
【０１４３】
最高蛍光強度を持つ５つのビーズをＰＣＲプレートの別々のウェルに分類し、Ｔａｑポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，ＬａＪｏｌｌａ，ＣＡ）および以下の表５に示したプライマーを用い、オリゴヌクレオチド標識をＰＣＲの３０サイクルによって増幅した。
【０１４４】
【表５】
【０１４５】
フェノール／クロロホルム抽出、続いてのエタノール沈殿によって、ＰＣＲ産物を精製し、制限酵素ＥｃｏＲＩ（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｅｙ，ＭＡ）を用いて消化し、同様に調製されたｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ ＫＳ＋ベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，ＬａＪｏｌｌａ，ＣＡ）クローン化した。組換えベクターをコンピテントＥ．ｃｏｌｉＤＨ５αに電気穿孔し、アンピシリン抗生物質を含有する培地で平板培養した。各分析したビーズおよび調整したプラスミドＤＮＡにつき２００のコロニーを拾い、ポリリンカーの領域において配列決定した。
【０１４６】
配列決定分析は、ドーパミン作動性表現型を持つ細胞を運ぶビーズの大部分がオリゴ（Ｌ４、Ｌ８、Ｌ１２、Ｌ１６、Ｌ２０およびＬ２４）によって標識されたことを明らかとした。これらの標識をそれらの各細胞培養条件に相関させると、これらのビーズは合計６日間にわたって（０日、２日および４日）培地Ａ１に、続いて、さらに１５日の間に（６日、１１日および１６日）培地Ｂ４にこれらのビーズが分配されることを示唆した。この培養プロトコルは、前記したように、マウスＥＳ細胞を保有することによって、ドーパミン作動性ニューロンの生産に適したものであったと推定された。
【０１４７】
一旦これらの条件が確立されれば、前記プロトコルに従う（すなわち、拡大培養、ＥＢ形成、ネスチン選択など）が、分割プール培養のプロセスを受けることなく、未分化ＥＳ細胞を再度培養した。細胞をビーズの代わりに接着性組織培養プレート上で増殖させ、オリゴヌクレオチド標識は異なる培養基に添加せず、成功した培養条件のみをアッセイした。このように多数のドーパミン作動性細胞が生産でき、遺伝子発現のパターンにつきテストした。全ＲＮＡは培養プロトコルの４つの段階から得られた細胞から取り出した。（１）多能性ＥＳ細胞集団；（２）胚様体；（３）ネスチンについての選択を受けている解離し平板培養した細胞；および（４）緩衝液Ａ４中で培養したネスチン陽性細胞。逆転写酵素およびランダムヘキサマーでのプライミングを用いてｃＤＮＡを調製し、アクチン転写体の量を種々の試料の間で正規化した。表６に示したプライマーを用いて神経ｃＤＮＡを調製した。
【０１４８】
【表６】
【０１４９】
また、表６は、種々の遺伝子の転写体がＲＴ−ＰＣＲによって検出された段階の示す（括弧は痕跡量の検出を示す）。これらの結果からＥｎ１、Ｐａ２、Ｐａｘ５、Ｗｎｔ１およびＮｕｒｒ１は、ドーパミン作動性運命に予定された細胞のための適当なマーカーであると推定された。逆に、多能性幹細胞のそのような遺伝子、例えば、Ｎｕｒｒ１でのトランスフェクションの結果、インビトロでドーパミン作動性表現型を関係付けることができた（Ｗａｇｎｅｒｅｔ ａｌ．，１９９９，ＮａｔｕｒｅＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．１７，ｐ ６５３−６５９）。
【実施例２】
【０１５０】
＜ＨｅｐＧ２細胞ユニットの分割プール細胞培養＞
分割プール培養実験を行って、特定の細胞プロセス、すなわち、チトクロームＰ４５０（ＣｙＰ４５０）代謝酵素の発現および／または活性に影響し得る組織培養条件をアッセイした。１Ａ１および１Ａ２のようなこのクラスの酵素のメンバーは基質、すなわち、酵素的に加水分解されて生成物である、ＣｙＰ４５０酵素活性を測定するのに用いることができる区別される蛍光特徴を有するレソルフィンを生じるエトキシレソルフィンの使用でアッセイすることができる。ＣｙＰ４５０酵素の発現はβ−ナフトフラボンのようなインデューサー分子、およびα−ナフトフラボン、キノジンまたはアミノトリアゾールのような阻害薬剤によって調節することができる。また、いくつかの分子について、ＣｙＰ４５０遺伝子の発現を誘導することができるが、遺伝子の酵素産物の活性を阻害することが可能である。従って、発現および活性の複雑なパターンが、調節化合物への細胞の一連の暴露パターンに従って生起することができる。
【０１５１】
ヒト肝細胞癌細胞株ＨｅｂＧ２を、Ｌ−グルタミン、ペニシリン＋ストレプトマイシンおよび１０％加熱不活化胎児ウシ血清を補足したＤＭＥ培地中のＣｙｔｏｄｅｘ３（ＡｍｅｒｓｈａｍＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で増殖させた。シーディングから一日のうち、細胞ユニットを５つの群に分割し、５μＭのα−ナフトフラボン、β−ナフトフラボン、キニジン、アミノトリアゾールまたはジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ；テスト化合物のための溶媒キャリアー）の１つを含有する培養基にて、マルチウェル培養プレートの別々のウェルで培養した。２４時間の培養（３７℃、５％ＣＯ２）、個々のウェル中の細胞ユニットをＰＰＳで２回洗浄し、培養基中で一緒にプールし、５つの群に分割し、これを第一ラウンドで用いた５つの異なる培地で培養した。培養のさらに２４時間後、細胞ユニットを前記のように分割プール培養の第三のラウンドまで処理した。培養のさらに２４時間後、ビーズの試料を最終の５つの細胞群、および、分割プール実験の持続のためにＤＭＳＯを含む標準培地で培養された対照群から取った。
【０１５２】
ＣｙＰ４５０アッセイでは、増殖培地中のビーズのアリコットを取り出し、酵素基質エトキシレソルフィンを１０μＭの最終濃度まで添加した。ビーズの試料をカバースリップを持つ顕微鏡スライドに置き、直ちに、テキサスレッド／ローダミン蛍光用の標準フィルター組を用いてエピ蛍光顕微鏡で観察した（図９参照）。対照細胞は、基質添加から約１５〜２０分後にレソルフィン蛍光を呈し、エトキシレソルフィンの非存在下では蛍光は検出されなかった。細胞ユニットを対照実験においてβ−ナフトフラボンで処理すると、酵素活性は５〜１０分以内に明らかである（データは示さず）。分割プール培養手法を受けた群から取った細胞ユニットは種々の程度の酵素活性を示し（１０分以内）、これは、それらが、エトキシレソルフィンを代謝することができるＣｙＰ４５０酵素の活性を誘導または阻害する種々の条件に遭遇したことを示す。
【実施例３】
【０１５３】
＜多能性幹細胞を含む細胞ユニットの増殖＞
Ｔａｕ−ＧＦＰ融合タンパク質を発現する多能性マウスＥＳ細胞を、１５％ＦＣＳ、０．５５ｍＭ２−メルカプトエタノール、Ｌ−グルタミン、抗生物質（全てＧＩＢＣＯ／ＢＲＬからのもの）、および１，４００Ｕｍｌ−１の白血病阻害因子（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）を補足したイスコベの培地よりなるＥＳ細胞培地中のマイトマイシンＣ−処理ＳＮＬ細胞（ＳＴＯ細胞誘導体）でのフィーダー層で維持し、１日おきに１：５分割した。細胞ユニットの形成で用いたＥＳ細胞およびフィーダー細胞をゼラチン被覆フラスコに移し、ＥＳ培地中で１日間培養して培養におけるフィーダー細胞の数を低下させた。ＥＳ細胞をゼラチンプレートからトリプシン処理し、ＦＣＳ含有培地で洗浄し、次いで、ＰＢＳ中で水和させたＣｙｔｏｐｏｒｅ２またはＣｙｔｏｄｅｘ３マイクロキャリアー（ＡｍｅｒｓｈａｍＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）いずれかと共にインキュベートし、オートクレーブ処理または７０％エタノール処理によって滅菌し、次いで、ＥＳ培地で洗浄した。ＥＳ細胞を非接着性ブラスチック皿中で約１０細胞／マイクロキャリアーの密度で蒔いた。ＥＳ細胞培養を、１日置きに培地の半分を新鮮なＥＳ培地で交換しつつ、標準条件（５％ＣＯ２、３７℃）下で維持した（図７参照）。多能性細胞の増殖をこれらの条件下で５日間観察し、その後、細胞をＥＳ細胞培地から移して分化を開始させた。
【実施例４】
【０１５４】
＜分割培養による幹細胞ユニットの分化＞
多能性マウスＥＳ細胞ユニットをＥＳ細胞培地中で５日間培養し（実施例３参照）。ＥＳ培地を捨て、細胞ユニットをＰＢＳで２回洗浄して痕跡量のＥＳ培地を除去した。ビーズ集団を３つの群に分割し、ＰＢＳを捨て、（ｉ）ＥＳ細胞培地；（ｉｉ）１０％胎児ウシ血清を含むダルベッコの修飾イーグル培地（ＤＭＥＭ）；または（ｉｉｉ）化学的に定義された培地（ＣＤＭ；ＷｉｌｅｓＭＶ，Ｊｏｈａｎｓｓｏｎ ＢＭ，１９９９，Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ．，ｖｏｌ２４７，ｐ．２４１−８）の一つで置き換えた。標準条件下での１時間の培養の後、３つの群の各々を３つのさらなる群に分割し、その各々を（ｉ）細胞群を培養した培地；（ｉｉ）細胞群を１μｍＬｉＣｌを含む培養した培地；または（ｉｉｉ）細胞群を、１μＭレチノイン酸（ＲＡ）を含む培養した培地の１つにおいてインキュベートした。一日おきに培地の半分を各新鮮な培地で置き換えた。
【実施例５】
【０１５５】
＜表現型マーカーを用いる細胞ユニットにおける細胞分化を含む細胞プロセスの検出＞
Ｃｕｌｔｉｓｐｈｅｒ Ｇ（ＰｅｒｃｅｌｌＢｉｏｌｙｔｉｃａ）マイクロキャリアーに、Ｔａｕ−ＧＦＰ融合タンパク質を発現するマウスＥＳ細胞を蒔き、無血清培地（ペニシリン／ストレプトマイシンおよび１４００Ｕ／ｍｌＬｉＦを補足したＧｌｕｔａｍａｘ（Ｇｉｂｃｏ）を含むイスコブの修飾ＤＭＥＭである１５％ＧｉｂｃｏＫＯ血清代替物）中で４週間増殖させた。培地中の色インジケーターによって示したように、ｐＨが酸性になると培地を変化させた。ビーズのアリコットを取り出し、ＰＢＳで洗浄した後、４℃ＰＢＳ中の４％パラホルムアルデヒドで２０分間固定した。ビーズをＰＢＳで数回洗浄し、ＰＢＳ／２．５％ＦＣＳ、０．１％トリトンＸ−１００に再懸濁させ、２つの試料に分割した。１つの試料をネズミ−抗グリア繊維酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）モノクローナル抗体で１：２００とし、他は対照として残した。４℃における一晩のインキュベーションの後、試料をＰＢＳで３回洗浄し、次いで、双方を室温にてＣｙ３−標識ロバ抗マウス抗体（ＪａｃｋｓｏｎＩｍｍｕｎｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）と共に２時間インキュベートした。試料をＰＢＳで３回洗浄し、次いで、ＤＡＰＩ（Ｖｅｃｔｏｒ）を含有する設置培地で顕微鏡スライドにスポットした。マイクロキャリアー上の細胞の大部分はＧＦＡＰについての特異的染色を呈した（図８Ａ〜Ｈ参照）。
【０１５６】
別々の実験において、Ｔａｕ−ＧＦＰ融合タンパク質を発現するマウスＥＳ細胞およびＣｙｔｏｄｅｘ３マイクロキャリアーを含む細胞ユニット（実施例３を参照）をＥＳ培地からＣＤＭに写し、標準条件下で４日間培養し、その後、細胞ユニットをＰＢＳで１回洗浄し、重力によって沈降させた。ＰＢＳを除去し、細胞ユニットを４℃にて２％パラホルムアルデヒド中で１５分間固定し、その後、溶液を除去し、細胞ユニットをＰＢＳで３回洗浄した。細胞ユニットを２．５％胎児ウシ血清および０．１％トリトンＸ１００（Ｓｉｇｍａ）を含有するＰＢＳに再懸濁させ、３つの別々のミクロチューブに分割した。チューブリンβＩＩＩ（Ｓｉｇｍａ）に特異的なマウス免疫グロブリンを１：２００の希釈にて１つの試料に添加し、抗体染色を室温にて２時間進行させ、場合によっては再懸濁させた。次いで、全ての３つの試料を大過剰のＴＢＳで３回洗浄した。次いで、抗チューブリン抗体と共にインキュベートした試料および一つの他の試料を、ＰＢＳ／ＦＣＳ／トリトン×１００中のＣｙ３−コンジュゲーテッド−ロバ抗マウス免疫グロブリン（ＪａｃｋｓｏｎＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）の１：２００に希釈と共に室温にて２時間インキュベートした。次いで、全ての３つの試料を大過剰のＰＢＳで３回洗浄し、次いで、細胞ユニットをＤＡＰＩ（Ｓｉｇｍａ）を含有する設置培地に再懸濁させ、カバーグラスを持つ顕微鏡スライド上にスポットし、エピ蛍光または共焦点顕微鏡によって観察した。（図８、パネル１参照）。
【実施例６】
【０１５７】
＜細胞プロセスによる分化遺伝子発現の検出＞
分割−分割培養によって分割するように誘導されたマウスＥＳ細胞の細胞ユニット（実施例４参照）をＰＢＳで洗浄し、製造業者の指示（Ｑｉａｇｅｎ）に従ってＲｎｅａｓｙ試薬を用いて細胞ユニットからＲＮＡを調製した。次いで、製造業者の指示（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に従って、逆転写酵素を用いて、オリゴ−ｄＴプライミングにて第一ストランドｃＤＮＡを調製した。試料の濃度を正規化するために、各ｃＤＮＡ試料について１０倍希釈系列を作成し、「ハウスキーピング」遺伝子用のオリゴヌクレオチドプライマー、グリセルアルデヒド３リン酸デヒドロゲナーゼを用いる２５、３０および３５ラウンドのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）に供した。１．５％アガロースゲルで分離した得られた産物の臭化エチジウム染色を用いて、各試料中のｃＤＮＡの相対量を見積もった。次いで、各試料からの当量のｃＤＮＡを、（未分化ＥＳ細胞で起こることが予測される）Ｏｃｔ４；（分化したニューロン子孫で起こることが予測される）ネスチン；または（分化した内胚葉子孫で起こることが予測される）ＨＮＦ３βのためのＤＮＡプライマーでのＰＣＲ反応で用いた。プライマーの配列は以下の通りであった。
【０１５８】
【表７】
【０１５９】
これらの識別マーカーの相対量は、細胞ユニットが暴露された培養条件に応じて異なった。例えば、ＥＳ培地中のＲＡは内胚葉マーカーＨＮＦ３βの発現を誘導し、他方、ＲＡを含むＤＭＥＭおよび、程度は低いが、ＬｉＣｌはニューロン前駆体のマーカーであるネスチンの発現に導いた。ＬｉＣｌは還元を阻害したが、Ｏｃｔ４の減少はＤＭＥＭで特に顕著であった（図１１参照）。
【実施例７】
【０１６０】
＜ＲＦＩＤを用いる細胞ユニットの標識＞
ガラスに入れたＩＤ１００−Ａトランスポンダ（Ｔｒｏｖａｎ）を１Ｎ塩酸で２時間処理し、脱イオン水で十分に洗浄し、次いで、ガラス容器中でアミノプロピルポリエトキシシラン（Ｓｉｇｍａ）と共に２時間インキュベートした。シラン試薬をデカントし、タグを順次水、７０％エタノール、滅菌脱イオン水、次いで、リン酸緩衝化生理食塩水で洗浄した。タグを、個々に、非接着性細菌プラスチックマルチウェルプレートのウェルに入れた（Ｓｔｅｒｉｌｉｎ）。ゼラチン被覆プレート上でＬＩＦ（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）を含むＥＳ細胞培地で維持されたＴａｕ−ＧＦＰ融合トランスジーンを発現するＥＳ細胞の多能性系をトリプシン処理によって単細胞懸濁液に解離した。細胞をＥＳ細胞培地で一回洗浄し、１０６細胞／ｍｌにてＥＳ培地に再懸濁し、２５０μＬの懸濁液を各タグにスポットした。標準培養条件（３７℃、５％ＣＯ２）下での１時間のインキュベーションの後に１．５ｍｌのさらなるＥＳ培地を添加し、プレートをインキュベーターに戻した。
【０１６１】
また、トランスポンダをヒト肝細胞癌細胞株ＨｅｐＧ２、およびマウスＳＴＯ細胞誘導体ＳＮＬでシードした。予備処理およびシーデングプロセスをＥＳ細胞について記載されたように実行したが、１０％ＦＣＳを含むＤＭＥＭで細胞を維持した。
【０１６２】
接着性培養を解剖顕微鏡で観察し、エピ蛍光を用いて蛍光タグ化細胞を可視化した（図１０参照）。接着した種々の細胞型は正常な展伸形態を示し、トランスポンダで増殖させた。標識した細胞ユニットを、細胞ユニットまたは標識の明らかな劣化なしで、数週間維持できた。細胞ユニットのユニークな同一性は、細胞ユニットの細胞培養条件または維持を満たすことなく、Ｔｒｏｖａｎポケットリーダーで登録することができた。
【実施例８】
【０１６３】
＜蛍光、分子または光学タグによる細胞ユニットの標識＞
Ｃｙｔｏｄｅｘ３マイクロキャリアー（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）は変性コラーゲン（ゼラチン）の表面層と共にデキストランから構成される。Ｃｙｔｏｄｅｘ３ビーズ（ＰＢＳ中での水和の後５０μｌ沈降用量）を、合計用量２００μｌ中の２．５％胎児ウシ血清を含むＰＢＳ中の１：５０の希釈にて、ビオチンにコンジュゲートした抗コラーゲン抗体（Ａｂｃａｍ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＵＫ）と共に室温にて９０分間インキュベートした。次いで、ビーズを、再懸濁、次いで、重力沈降によって、大過剰のＰＢＳ中で３回洗浄した。対照試料を同一法であるが、抗コラーゲン抗体を添加することなく処理した。対照および処理した試料を各々二つに分割し、各々の１つの試料を２５０μｌ用量のＰＢＳ／ＦＣＳ中の２．５μｇ／ｍｌの濃度にて、ストレプトアビジン−ＦＩＴＣコンジュゲートと共に室温にて３０分間インキュベートした。２つの試料を同一条件下ではあるがストレプトアビジン−ＦＩＴＣなしでインキュベートした。ビオチン化抗コラーゲン抗体、続いて、ストレプトアビジン−ＦＩＴＣコンジュゲートで予備処理したビーズは、より高いレベルの蛍光を示した（図１２参照）。ビオチン化抗体でのマイクロキャリアービーズのコーティングは、今度は、容易に脱着可能なストレプトアビジンコンジュゲートに結合することができるビオチン部位を提供する手段である。ストレプトアビジンは非常に多数の分子および高分子体にコンジュゲートすることができるので、従って、それが大きな範囲のタグに高い親和性で結合できるようにマイクロキャリアービーズを誘導体化することができる。
【０１６４】
別の実験において、Ｃｕｌｔｉｓｐｈｅｒ Ｇ（Ｐｅｒｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｙｔｉｃａ）マイクロキャリアーを、便宜なダグを提供するラテックスビーズで標識した。マイクロキャリアーをＰＢＳ中で水和し、７０％エタノールで滅菌し、ＰＢＳで洗浄し、次いで、ビオチン部に共有結合させた。４００μｌのジメチルホルムアミドに溶解させた１０ｍｇビオチンアミドヘキサノイル−６−アミノヘキサン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（Ｓｉｇｍａ）を用いてビオチン化を行い、これをＰＢＳ中のマイクロキャリアーの１ｍｌ沈降用量に添加した。反応を室温にて一晩進行させ、マイクロキャリアーを大過剰のＰＢＳで３回洗浄した。処理したビーズのアリコットおよび未修飾対照試料を１×１０ｅ５１μＭ直径のストレプトアビジン被覆赤色−蛍光ビーズ（Ｓｉｇｍａ）と共に、または２．５％胎児ウシ血清を含むＰＢＳ中の２．５μｇ／ｍｌストレプトアビジン−ＦＩＴＣ（Ｓｉｇｍａ）と共にインキュベートした。ビーズタグ（図１２Ｅ〜Ｈ）またはＦＩＴＣ（図１８Ａ〜Ｄ）での標識のレベルを、蛍光顕微鏡を用いて比較した。
【０１６５】
さらなる実験において、Ｃｙｔｏｄｅｘ３マイクロキャリアーを赤色または緑色で蛍光１μＭ直径のストレプトアビジン−被覆ビーズ（Ｓｉａｍｇ）で標識した。Ｃｙｔｏｄｅｘ３マイクロキャリアー（ＡｍｅｒｓｈａｍＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を、２．５％ＦＣＳを含むＰＢＳ中で、室温にて、赤色、緑色の懸濁液、または赤色および緑色ラテックスビーズの混合物と共に３０分間インキュベートした。再懸濁、次いで、重力による沈降によって、試料を大過剰のＰＢＳ中で３回洗浄した。次いで、赤色タグによって標識されたビーズのアリコットを緑色タグによって標識されビーズを含有する試料からの同一容量のアリコットと混合して、クロス−標識が起こるか否かを判断した。次いで、ＦＩＴＣおよびテキサスレッド／ローダミン検出用の標準フィルター組を用い、エピ蛍光顕微鏡下で試料を観察した（図１４および１５）参照。ラテックスビーズタグを用いてマイクロキャリアーを強固に標識することができ、その結果、異なって標識された集団が得られた。２つの集団の混合の結果、マイクロキャリアーの間の標識の有意な移動は得られず、これは、集団が識別されるままであることを意味する。２つのタグの組合せと共にインキュベートしたマイクロキャリアーは、双方によって安定に標識され、これは、単一マイクロキャリアーが複数のタグで標識できることを示す。この実験で用いたもののようなタグは非常に多数のレポーター（たとえば、異なるフルオロフォア、染料、酵素）にコンジュゲートすることができるので、マイクロキャリアーを大きな範囲の識別タグで標識するのにこれらを用いるのが可能である。加えて、抗体をラテックスビーズタグにカップリングさせ、それらをマイクロキャリアーまたは細胞ユニットに向けることが可能である。
【実施例９】
【０１６６】
＜蛍光、分子または光学タグによる細胞ユニットの標識＞
Ｃｙｔｏｄｅｘ３マイクロキャリアー（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を、Ｔａｕ−ＧＦＰトランスジーンを発現するＥＳ細胞でシードした。１日後、マイクロキャリアーをＰＢＳで洗浄し、次いで、ストレプトアビジン（Ｓｉｇｍａ）に共有結合した赤色１μｍ直径ラテックスビーズの懸濁液と共に室温にて３０分間インキュベートし；標準条件下で直ちに、または培養から２４時間後に分析した。分析は再懸濁による大過剰のＰＢＳ中での３回の洗浄、次いで、重力による沈降を含み、試料は、ＦＩＴＣおよびテキサスレッド／ローダミンの検出用の標準フィルファー組を用いてエピ蛍光下で観察した。ＥＳ細胞（緑色）を含み、ラテックスビーズタグ（赤色）とのコロイド相互作用によって標識された細胞ユニットは各場合に明らかであった（図１３参照）。
【０１６７】
ラテックスおよび他のポリマーと共に構成されるビーズは非常に多数の分子および超分子レポーターにコンジュゲートさせることができるので、従って、大きな範囲の識別標識で細胞ユニットを標識することが可能である。
【実施例１０】
【０１６８】
＜細胞プロセスをベースとした細胞ユニットの手動分析および単離＞
Ｔａｕ−ＧＦＰ融合タンパク質を発現するマウスＥＳ細胞およびＣｙｔｏｄｅｘ３マイクロキャリアーを含む細胞ユニットを裸のｃｙｔｏｅｘ３マイクロキャリアーと１：１００の比率で混合した。相および蛍光設定を用い、混合物を顕微鏡下で観察した。ＧＦＰを発現する細胞ユニットが、大過剰の非蛍光キャリアーにおいてさえ、蛍光顕微鏡を用いる場合に容易に明らかであった（図１６参照）。個々の細胞ユニットは、小容量の細胞ユニットを含有する培養を吸引するための所定の位置に設けられたピペットを用いて、手動で分類することができた。
【実施例１１】
【０１６９】
＜標識されたマイクロキャリアーおよび細胞ユニットの自動分析およびソーティング＞
自動または高スループット様式にて、種々のタグで標識される細胞ユニットを分析し、分類し、または特定の細胞プロセスを表示することができるのが望ましい。多細胞生物おおびビーズを０．５ｍｍまでの直径にて分類することができるＣＯＰＡＳＳｅｌｅｃｔ機器（Ｕｎｉｏｎ Ｂｉｏｍｅｔｒｉｃａ Ｉｎｃ．，Ｓｏｍｅｒｖｉｌｌｅ，ＭＡ）を用いて、細胞ユニット、マイクロキャリアーおよび標識されたマイクロキャリアーを分析した。Ｃｙｔｏｄｅｘ３（ＡｍｅｒｓｈａｍＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）をそのサイズおよび光学特徴に従った機器（Ｔｉｍｅｏｆ Ｆｌｉｇｈｔ，ＴＯＦ；Ｅｘｔｉｎｃｔｉｏｎ，Ｅｘｔ）によって分析し、サイズのわずかな変化を呈したが、利用した設定下で有意な自動蛍光は呈しなかった（図１７Ａ／Ｂ参照）。赤色ストレプトアビジン−コンジュゲーテッドラテックスビーズ（Ｓｉｇｍａ）でのＣｙｔｏｄｅｘ３マイクロキャリアーの標識（実施例９参照）は、赤色蛍光において検出可能なシフトに導いた（図１７Ｃ／Ｄ）。
【０１７０】
Ｔａｕ−ＧＦＰトランスジーンを発現するＥＳ細胞でシードしたＣｙｔｏｄｅｘ３マイクロキャリアーを含む細胞ユニットを、細胞数をベースとして細胞ユニットを分類する実験で用いた。種々の細胞密度を支持する細胞ユニットを含む細胞ユニットの群を固定することなく器具を通過させ、広い範囲の緑色蛍光強度を示した（図１７Ｅ／Ｆ）。前記器具を用いて、低蛍光の細胞ユニットから高度に蛍光な細胞ユニットを分類した。エピ蛍光顕微鏡を用いて引き続いて分析した試料は、細胞ユニットが高蛍光に基づいて分類された細胞ユニットが非常に多数の生きた細胞を運び、他方、低蛍光の細胞ユニットがまばらに集まっていることを明らかにした。従って、細胞ユニットの自動分析、同定および単離は、細胞数、表現型、および同定タグでの標識を含む多数のパラメーターに従って行うことができた。
【実施例１２】
【０１７１】
＜単細胞ユニットからのタグの同定＞
Ｃｕｌｔｉｓｐｈｅｒ Ｇ（ＰｅｒｃｅｌｌＢｉｏｌｙｔｉｃａ）マイクロキャリアーをビオチン部位に架橋させ（実施例８参照）、ビオチン化は、蛍光顕微鏡を用いてストレプトアビジン−ＦＩＴＣでの染色レベルを比較することによって確認した（図１８Ａ〜Ｄ）。
【０１７２】
細胞ユニットは、ＥＳ細胞増殖培地中の２５０μｌ沈降容量ビオチン化ＣｕｌｔｉｓｐｈｅｒＧマイクロキャリアーと共に１０６ＴＧＦＰ ＥＳ細胞の単細胞懸濁液を２４時間インキュベートすることによって形成された。５０μｌの細胞ユニットの試料を、室温にてほぼ５×１０５タグと共に１５分間インキュベートすることによって、ストレプトアビジン−被覆１μＭ赤色−蛍光ラテックスビーズ（Ｓｉｇｍａ）でタグを付した。数ラウンドの再懸濁および大容量のＰＢＳの定着によって細胞ユニットを過剰のラテックスビーズなしで洗浄した。エピ蛍光顕微鏡を用いて、ラテックスビーズタグによって細胞ユニットが標識されたことを確認した（図１８Ｅ〜Ｇ）。
【０１７３】
解剖顕微鏡下に設けたペトリ皿に細胞ユニットを入れ、ピペットを用いて個々のユニットを単離し、５ｍｌのＦＡＣＳチューブ（ＢｅｃｔｏｎＤｉｃｋｉｎｓｏｎ Ｆａｌｃｏｎ）に入れた。２００μｌのアリコットのＢｌｃｉｌｌｕｓｐｏｌｙｍｙｘａ中性プロテアーゼの１×溶液（Ｄｉｓｐａｓｅ ＩＩ，Ｒｏｃｈｅ）を各チューブに加え、マイクロキャリアーマトリックスを室温にて一晩消化した。消化物を、１μｍのサイズの範囲であって、遠赤色（ＦＬ３）発光スペクトルにおける事象を検出するようにキャリブレートされたサイトフルオリメーター（ＢｅｃｔｏｎＤｉｃｋｉｎｓｏｎ ＦＡＣＳｃａｌｉｂｕｒ）を通した（図１８Ｈ、Ｉ）。単細胞ユニットから単離されたタグの同一性は、適当なサイズおよび蛍光基準に適合させた事象を検出することによって確認することができた（図１８Ｊ、Ｋ）。
【実施例１３】
【０１７４】
＜細胞ユニットを標識するのに用いたタグの多重度の同定＞
正確なサイズおよび蛍光特徴の広く種々のラテックスビーズの入手可能性は、マイクロキャリアーの多重標識を可能とする。ビオチン化ＣｕｌｔｉｓｐｈｅｒＧマイクロキャリアー（実施例１２参照）は、サイズ、蛍光発光スペクトルおよび蛍光強度が異なる３つの異なるタイプのストレプトアビジン−被覆ビーズタグを含有する培地中での系列的なインキュベーションによって標識した。タグとして用いたビーズタイプは、１）Ｓｉｇｍａによって製造された１μｍの緑色ラテックスビーズ；２）ＢａｎｇｓＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓによって製造された１連の５．５μｍ赤色−蛍光ラテックスビーズ（ＱｕａｎｔｕｍＰｌｅｘ）におけるビーズ組ｎｏ．１；および３）ＢａｎｇｓＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓによって製造された一連の４．４μｍ赤色−蛍光ラテックスビーズにおけるビーズ組５ビーズであった。
【０１７５】
次いで、タグ化マイクロキャリアーをタンパク質分解によって消化し、遊離されたタグを前記したようにＦＡＣＳ分析に供した（実施例１２参照）。サイトフルオリメーター（ＢｅｃｔｏｎＤｉｃｋｉｎｓｏｎ ＦＡＣＳｃａｌｉｂｕｒ）をタグの試料でキャリブレートして、サイズゲートを設定し（図１９Ａ）、３つの異なるタグの蛍光シグニチャーを適当な（緑色または赤色）蛍光チャネルにおける事象を分析することによって検出した（図１９Ｂ〜Ｄ）。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞培養、特に、初代培養細胞、細胞系、多能性細胞、全能性細胞、および幹細胞の培養、および細胞培養条件の調整を通じてのそれらの種々の細胞プロセスの調節に関する。本発明は細胞経路を調整するための複数の条件下における複数培養ステップの使用に関し、増殖、分化および代謝活性のような細胞プロセスに対する種々の複数培養ステップ処方の効果を決定する方法を提供する。
【背景技術】
【０００２】
近年、細胞培養はライフサイエンスにおいて核心的な技術となった。細胞培養は、「ＢａｓｉｃＣｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ」ＯｘｆｏｒｄＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ（２００２）Ｅｄ．Ｊ．Ｍ．Ｄａｖｉｓ；および「ＡｎｉｍａｌＣｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ' Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ（２０００）Ｅｄ．Ｊｏｈｎ Ｒ．Ｗ．Ｍａｓｔｅｒｓに記載されている。両文献は、本明細書に参照することにより組み込む。細胞培養は細胞の生存性、表現型、遺伝子型、増殖および分化のような細胞プロセス、生物学的分子、中間体および産物の形成を研究するための基礎を提供する。また、単離された状態におけるか、または全トランスジェニック動物におけるかを問わず、これらのプロセスの、遺伝子レベルから、個々のタンパク質分子のレベルへの調節を調べる手段も提供する。現在の生物学の状態に対するその多大な貢献にもかかわらず、多くの点で、細胞培養は、遺伝子治療および組織エンジニアリングの可能性を究極的には提供する著しく活発な科学であるにもかかわらず、開発原理に止まっている。
【０００３】
細胞培養の重要な目標は、広く種々の細胞をインビトロで増殖することができることである。培養で増殖させることができる異なる細胞型のリストは広く存在し（ＡｍｅｒｉｃａｎＴｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ａｔｃｃ．ｏｒｇ；ＥｕｒｏｐｅａｎＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆＣｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ，ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｃａｃｃ．ｏｒｇ．ｕｋ；ＤｅｕｔｓｃｈｅＳａｍｍｌｕｎｇ ｖｏｎＭｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ ｕｎｄ Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ ＧｍｂＨ，ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｄｓｍｚ．ｄｅ）、ほとんどの細胞型の代表的なものを含み、より多くの培養条件が発見するに従って益々増加しつつある。この分野における定常的な進歩にもかかわらず、新しい細胞型のための適当な培養条件を決定する方法は全く経験的なものに止まっており；増殖条件はほとんど常に試行錯誤による。出発点の選択は、しばしば、以前に同様な細胞について他者によって何が用いられたか、または、異なる細胞について現在実験室で何が用いられつつあるかに基づいている。これらは単に完全に不適切であることが何度もあるであろうし、試行錯誤のプロセスが新しく始まるに違いない。新しい培養条件が成功した場合でさえ、以前のプロトコルの適合は歴史的なバイアスを実験に導入してしまうであろうということを明記しておくのは重要である。例えば、初期の組織培養実験の多くは線維芽細胞を盛んに使用し、今日まで、ほとんどの標準的な細胞培養条件は、中胚葉（線維芽細胞、内皮細胞、筋芽細胞）に由来する細胞の増殖に好都合である。これらの条件に基づく上皮および他の細胞型に対する選択的培養培地の開発は挑戦であった。これらの細胞型のいくつかについては、今日、血清（中胚葉細胞のための多くの培養培地の通常の成分である）は、現実には増殖を阻害する。本明細書中に記載した本発明の１つの態様は、特定の細胞型の生存性、増殖または成長、およびその表現型の保持を可能とする適当な培養条件を開発する方法である。
【０００４】
細胞増殖に好都合である条件とは別に、現代の組織培養における特に重要なステップは、細胞の分化を特定の表現型に向けて制御または指令することができることである。細胞系の増殖は細胞数が増加することを必要とするので、最大細胞増殖に好都合なように、非常に多数の培養条件が開発されてきた。これらの条件は、細胞分化を導かず、細胞増殖はしばしば限定されるか、または増殖しなくなりさえするのは驚くべきことではない。細胞増殖に好都合な条件は、一般に、低い細胞密度、低いＣａ２＋濃度、および表皮細胞成長因子（ＥＧＦ）、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）および血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）のような成長因子の存在である。他方、サイトスタシス（細胞増殖抑制）および分化は、高い細胞密度、高いＣａ２＋濃度、およびホルモン（例えば、ヒドロコルチゾン）、パラクリン因子（例えば、ＩＬ−６、ＫＧＦ、ＮＧＦ）、レチノイド、およびジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）のような平面極性化合物のような分化インデューサーの存在の条件において促進される。よって、異なる条件が特定の細胞系の増殖および分化に必要とされ、勿論、これらの各々の条件は異なる系の細胞の間で異なるであろう。本明細書中に記載の本発明の第二の態様は、細胞の選択的分化を可能とする適当な培養条件を発見する方法である。
【０００５】
細胞培養において依然として直面するいくつかの共通の問題は、初代培養細胞系の限定された寿命、継代に伴う細胞系の特徴の変化、および興味深い細胞特徴の喪失に伴うそれらの形質転換である。これらの効果は、実験またはアッセイ、例えば、後に記載する細胞ベースのアッセイで用いられる培養細胞の利用性をひどく限定する。初代培養細胞、すなわち、新たに組織から単離された細胞は、断然、ほとんどの正確な細胞培養モデルを提供する。というのは、初代培養細胞は、その起源の組織に広く似た挙動をするからである。顕著なことには、初代培養細胞を培養する信頼できる方法は、依然として開発されておらず、その結果、これらの細胞はインビトロにおいて限定された寿命を呈する。これは、例えば、初代培養を増殖させようと試みる場合、あるいは長期実験を行おうと試みる場合に、ひどい技術的な制限となる。初代培養の使用に関連するさらなる問題は、それが一定の新鮮な単離を必要とするので、特に、ヒトからの初代培養材料を源とするのは困難であり、また、合致して挙動する系を得るのは困難であることである。本発明の第三の態様は、従って、寿命の延長した生きた培養物を得るための初代培養細胞の培養方法である。
【０００６】
初代培養がインビトロにて延長された期間維持されれば、それは、初代培養は、細胞の大部分が死滅する危機を受けるが、生存する細胞はより長く生き、無限に培養できる。これらの継続的細胞系のほとんどは、細胞のほとんどが、無傷動物組織で見出されているような普遍的に貧弱な提示である。この１つの理由は、細胞が不滅状態となるのを可能とするプロセスもまた細胞の特徴に影響を与えるという事実である。例えば、ほとんどの確立された細胞培養物は、組織特異的遺伝子の発現を停止させ、その代わり、細胞培養において継続的増殖に必要なハウスキーピング遺伝子を発現するに過ぎず−その結果、元来源とした組織よりも、ほとんどのそのような細胞系同士で相互に似ている。例えば、ほとんどの肝細胞系は、通常、それを薬物毒性のテストのための興味深いツールとなる薬物代謝酵素の発現を停止してしまっている。本明細書中に記載の本発明のさらなる態様は、それが組織のより正確なモデルを提供するように細胞を培養する方法である。これは、今度は、細胞ベースの実験およびアッセイの信頼性および予期能力を改良するであろう。
【０００７】
細胞を培養するための改良された技術、および増殖、分化、代謝活性、および表現型表現のような細胞プロセスの調節のためのそのような技術を発見し、それを実施する方法に対する要望が存在する。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｂａｓｉｃ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ」Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ（２００２）Ｅｄ．Ｊ．Ｍ．Ｄａｖｉｓ
【非特許文献２】Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ' Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ（２０００）Ｅｄ．Ｊｏｈｎ Ｒ．Ｗ．Ｍａｓｔｅｒｓ
【発明の概要】
【０００９】
本発明は、細胞培養が、所望の効果を達成するための規定された順序で実行される一連の培養ステップを含む動的なプロセスとして良好にアプローチされるという概念に基づく新規な細胞培養技術を提供する。本発明は、選択された薬剤に対する系列的暴露を開発して、細胞プロセスを調整し、従って、従来の技術によって従来は達成できなかったこれらを超える制御のレベルを達成することができることを認識する。
【００１０】
本発明は、複数のステップおよび薬剤に関連する細胞培養技術が、もし、試行錯誤を伴う従来の実験によって決定するのが不可能であれば、現実面では困難である問題に立ち向かう。慣用的な細胞培養の面倒な性質のため、複雑な多工程手法による組織培養条件の経験的な決定は、膨大な仕事の負荷を伴うため、現実には可能ではない。
【００１１】
第一の態様において、本発明は、
（ａ）各々が１以上の細胞を含む細胞ユニットの群の第一の組を提供し、前記群を所望の培養条件に暴露するステップと、
（ｂ）前記群の１以上をサブ分割して、細胞ユニットの群のさらなる組を作るステップと、
（ｃ）前記さらなる群をさらなる所望の培養条件に暴露するステップと、
（ｄ）任意選択により、必要に応じて、ステップ（ｂ）〜（ｃ）を繰り返し反復するステップと、
（ｅ）細胞が暴露された培養条件の所与の細胞ユニットに対する効果を評価するステップと
を含む、細胞に対する複数の培養条件の効果を決定する方法を提供する。
【００１２】
有利には、本発明による細胞の群はプールであり、引き続いて分割される。従って、好ましい実施形態において、本発明は、
（ａ）各々が１以上の細胞を含む細胞ユニットの群の第一の組を提供し、前記群を所望の培養条件に暴露するステップと、
（ｂ）前記群の２以上をプールして、少なくとも１つのプールを形成するステップと、
（ｃ）前記プールをサブ分割して、細胞ユニットの群のさらなる組を作るステップと、
（ｄ）前記さらなる群を所望の培養条件に暴露するステップと、
（ｅ）任意選択により、必要に応じ、ステップ（ｂ）〜（ｄ）を繰り返し反復するステップと、
（ｆ）細胞が暴露された培養条件の所与の細胞ユニットに対する効果を評価するステップと
を含む、細胞に対する複数の培養条件の効果を決定する方法を提供する。
【００１３】
本発明は、表現型、遺伝子型、分子生産、生存率、および細胞の増殖および分化を含む全ての細胞プロセスに取組む。好ましくは、本発明を用いて、細胞分化をもたらす条件を同定する。例えば、細胞を適当な培養条件に付すことによって、細胞を誘導して所望の分化経路に沿って分化させることができる。また、培養条件の変化のタイミングを開発して、細胞の開発プログラムを良好に規定する。
【００１４】
培養条件は、増殖培地、増殖培地に存在する化学的、分子的、および高分子的薬剤、温度処方、基質、雰囲気条件、物理的細胞取扱を含む。
【００１５】
コンビナトリアル細胞培養、またはスプリットプール培養として知られた本発明の前記方法は、細胞が、系統的にまたは高度に生産的に、一連の培養条件に供され、および培養培地中の一連の薬剤に暴露されるのを可能とする。
【００１６】
分割およびプーリングの反復周期をかなり効率的に用いることができるが、コンビナトリアル・ケミストリープロトコルと同様に、必要なプロセッシングパワーを仮定すれば、（再度プーリングすることなく）少なくとも２つの順次のスプリッティング工程を含むプロトコルを使用することができる。そのようなプロトコルの不利は、種々に扱われてきた非常に多数の別々の試料を迅速に生じさせることができることである。しかしながら、利点は、各々の試料が面倒なデコンヴォルージョン（ｄｅｃｏｎｖｏｌｕｔｉｏｎ）を必要としないことである。というのは、そこでの細胞ユニットは条件の１つの組に暴露されたに過ぎないからである。従って、安定な試料取扱施設を仮定すれば、スプリッティングアプローチは迅速な結果を生じさせることができる。
【００１７】
本発明は細胞ユニットを使用する。そのような細胞ユニットは単一の細胞とすることができるが、有利には、２以上の細胞のコロニーであり、これは、それらがスプリットプール培養手法の間においてさえ破壊に対して抵抗性であるように配置される。例えば、細胞は後にさらに詳細に記載するようにビーズのような固体基材上で培養することができる。
【００１８】
有利には、細胞ユニットは標識される。標識は、細胞が暴露された培養条件の以下のもの、または異なる培養条件に暴露されるような細胞ユニットの以下のものを可能とする。従って、いずれかの所与の細胞ユニットは、それがどのようにして開始細胞プールまたは培養に由来したかを判断するために、読まれるその標識を有することができる。標識は核酸標識、放射線周波数暗号化タグ、蛍光または光学的タグ、および表面またはマトリックス表面の細胞ユニットの空間的暗号化を含む、種々の分子または物理的形態のいずれかを取ることができる。
【００１９】
本発明の方法は、数千または数百万の細胞培養条件および試薬が、多重ハイスループットアッセイでテストされて、いずれかの細胞プロセスに関する所望の結果を達成するのに必要な条件を決定することを可能とする。
【００２０】
従って、本発明は、
（ａ）各々が１以上の細胞を含む細胞ユニットの群の第一の組を提供し、前記群を所望の培養条件に暴露するステップと、
（ｂ）前記群の１以上をサブ分割して、細胞ユニットの群のさらなる組を作るステップと、
（ｃ）前記さらなる群をさらなる所望の培養条件に暴露するステップと、
（ｄ）任意選択により、必要に応じ、ステップ（ｂ）〜（ｃ）を繰り返し反復するステップと
を含む、種々の細胞培養条件に細胞を暴露する方法を提供する。
【００２１】
好ましい実施形態においては、前記したように、プーリング手法を使用する。そのような実施形態においては、本発明は、
（ａ）各々が１以上の細胞を含む細胞ユニットの群の第一の組を提供し、前記群を所望の培養条件に暴露するステップと、
（ｂ）前記群の２以上をプールして、少なくとも１つの第二のプールを形成するステップと、
（ｃ）第二のプールをサブ分割して、細胞ユニットの群のさらなる組を作るステップと、
（ｄ）前記さらなる群を所望の培養条件に暴露するステップと、
（ｅ）任意選択により、必要に応じ、ステップ（ｂ）〜（ｄ）を繰り返し反復するステップと、
（ｆ）それが暴露された培養条件の所与の細胞ユニットに対する効果を評価するステップと
を含む、細胞に対する複数の培養条件の効果を決定する方法を提供する。
【００２２】
さらなる態様において、本発明は、
（ａ）本発明の前記態様に従い、細胞ユニットに対する１以上の培養条件の効果を測定するステップと、
（ｂ）前記培養条件に暴露する場合の前記細胞ユニットにおける遺伝子発現を分析するステップと、
（ｃ）所望の培養条件下で差異的に発現される遺伝子を同定するステップと
を含む、細胞プロセスに影響する遺伝子を同定する方法を提供する。
【００２３】
有利には、用いる培養条件は細胞プロセスの変化を引き起こすものであり、これらの培養条件は遺伝子発現が分析される細胞の生産について選択される。遺伝子発現は、便宜には、ＰＣＲベースの技術、遺伝子発現の系列的分析（ＳＡＧＥ）、またはＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘのような供給業者から広く入手可能なアレイ技術を含む、いずれかの比較発現モニタリング技術を用いて分析することができる。
【００２４】
もう１つの態様において、本発明は、前記遺伝子を同定し、次いで、核酸合成または生物学的複製によって前記遺伝子の少なくともコード領域を製造することを含む、細胞プロセスに影響する遺伝子産物をコードする核酸の製造方法を提供する。
【００２５】
さらなる態様において、
（ａ）本発明に従った細胞プロセスに関連して差異的に発現される１以上の遺伝子を同定するステップと、
（ｂ）前記１以上の遺伝子の細胞における発現を調整するステップと
を含む、細胞において細胞プロセスを誘導する方法が提供される。
【００２６】
細胞における遺伝子の発現は、例えば、それが一過性または永久に過剰発現されるようにトランスフェクトし、またはそうでなければ遺伝子を細胞に導入することによって調整することができる。あるいは、内因性遺伝子の発現は、標的化エンハンサーの挿入、または遺伝子の発現の増加（例えば、余剰のインデューサー）または減少（例えば、アンチセンス、ＲＮＡｉ、転写因子）を引き起こす外因性薬剤の投与によるなどして変化させることができる。さらに、遺伝子産物はそれ自体細胞に投与され、あるいは細胞に導入されて、その活性の増加を達成することができる。さらに、遺伝子産物の活性を増加または減少させる薬剤（例えば、競合的および非競合的阻害薬剤、薬物、医薬）を細胞に投与することができる。
【００２７】
なおさらなる態様において、本発明は、
（ａ）前記した細胞プロセスに関連して差異的に発現される１以上の遺伝子を同定するステップと、
（ｂ）細胞における前記１以上の遺伝子の発現の調整を検出し、それにより、前記細胞における細胞プロセスの状態を判断するステップと
を含む、細胞において細胞プロセスの状態を同定する方法を提供する。
【００２８】
有利には、この分析で使用する遺伝子は、例えば、イムノアッセイによって検出できる細胞マーカーをコードする。あるいは、遺伝子産物は、蛍光測定、色測定、放射線測定または他の方法で活性についてアッセイすることができる酵素であり得る。
【００２９】
本発明は、さらに、
（ａ）本発明の前記態様に従って、細胞ユニットに対する１以上の培養条件の効果を測定するステップと、
（ｂ）細胞プロセスの変化を行う培養条件に細胞を暴露するステップと、
（ｃ）所望の細胞を単離するステップと
を含む、細胞プロセスを調節する方法を提供する。
【００３０】
従って、本発明は、本発明の前記態様に従って、二能性、多能性、または全能性先祖から分化した細胞を生産する方法を提供する。分化した細胞、特に部分的に分化した多能性細胞、または発生的に決定されたが未分化の先祖細胞は、薬物発見、細胞治療、および規定された系列の細胞が必要とする他の手法で有用である。
【００３１】
また、
（ａ）本発明の前記態様に従って、細胞ユニットに対する１以上の薬剤の効果を測定するステップと、
（ｂ）細胞ユニットにおいて所望の細胞プロセスを誘導する薬剤を同定するステップと
を含む、細胞プロセスを誘導することができる薬剤を同定する方法が提供される。
【００３２】
本発明に従って同定された薬剤は従来の化学的、生化学的または他の技術によって合成することができ、例えば本明細書中に記載の細胞において特定の細胞プロセスを調節する方法で用いられる。
【００３３】
本発明は、さらに、広く、マイクロキャリアーまたはビーズのような固体キャリアーに接着された細胞を培養する方法を提供する。そのようなキャリアーは、セルロース、デキストラン、アガロースまたはアクリルアミドのような高分子、あるいはガラスのような無機材料より構成することができる。キャリアーの表面は、さらに、所望の電荷または他の所望の特徴を持つ分子体の吸着または共有架橋結合のような物理的または化学的処理によって修飾することができる。あるいは、キャリアーは、細胞より小さいサイズの材料の灌流を可能とするマトリックス内にカプセル化された細胞または複数細胞よりなることができる。マイクロキャリアー培養は、培養のスケールアップを含むかなりの利点を有し、所望の細胞プロセスを引き起こすのに必要な選択された培養条件に細胞ユニットを便宜に暴露させるのを可能とする。従って、最も広い実施形態において、本発明は、マイクロキャリアーまたはビーズに接着した細胞を増殖させることを特徴とするインビトロで細胞を培養する方法を提供する。
【００３４】
有利には、細胞は培養条件の少なくとも１つの変化に供される。好ましくは、それらは２、３、４、５、６、７、８、９または１０以上の異なる培養条件に供される。好ましくは、培養条件の前記変化は培地の変化を含む。
【００３５】
本発明は、さらに、細胞を培養する方法を提供し、本発明のこれまでの実施形態について記載されたように、細胞のプールが作られ、サブ分割される。従って、１つの態様において、
（ａ）異なる条件下で増殖された細胞の１以上の培養を合わせるステップと、
（ｂ）前記細胞を通常の条件下で培養するステップと
を含む、インビトロにて細胞を培養する方法が提供される。
【００３６】
さらなる実施形態において、
（ａ）細胞培養をインキュベートするステップと、
（ｂ）前記培養を細胞の２以上の群に分割し、培養条件の２以上の異なる組下で細胞の前記群を培養するステップと
を含む、インビトロで細胞を培養する方法が提供される。
【００３７】
好ましくは、細胞を３、４、５、６、７、８、９、１０以上の異なる培養条件に暴露する。用いる培養条件は、有利には、培地の変化を含む。本発明は、さらに、広く、ビーズのようなマイクロキャリアーに接着された、インビトロにて幹細胞、および幹細胞に由来する分化された細胞を培養する方法を提供する。マイクロキャリアー培養は、培養のスケールアップを含むかなりの利点を有し、所望の増殖および／または分化条件を得るのに必要な選択された培養条件に幹細胞のユニットを暴露するのを可能とする。従って、１つの実施形態において、本発明は、マイクロキャリアーまたはビーズに接着された前記細胞を増殖することを含むインビトロにて幹細胞、および幹細胞に由来する分化された細胞を培養する方法を提供する。
【００３８】
有利には、前記培養は培養条件の少なくとも１つの変化に供される。好ましくは、それらは２、３、４、５、６、７、８、９または１０以上の異なる培養条件に供される。好ましくは、培養条件の前記変化は培地の変化を含む。
【００３９】
本発明は、さらに、幹細胞を培養する方法を提供し、本発明のこれまでの実施形態について記載されたように、幹細胞のプールが作られ、サブ分割される。従って、１つの態様において、
（ａ）異なる条件下で増殖された細胞の１以上の培養を合わせるステップと、
（ｂ）通常の条件下で細胞を培養するステップと
を含む、インビトロにて、幹細胞、および幹細胞に由来する分化された細胞を培養する方法が提供される。
【００４０】
さらなる実施形態において、
（ａ）幹細胞培養をインキュベートするステップと、
（ｂ）前記培養を幹細胞の２以上の群に分割し、２以上の異なる組の培養条件下で前記幹細胞の群を培養するステップと
を含む、インビトロにて、幹細胞、および幹細胞に由来する分化された細胞を培養する方法が提供される。
【００４１】
好ましくは、細胞は３、４、５、６、７、８、９、１０以上の異なる培養条件に暴露される。用いる培養条件は、有利には、培地の変化を含む。
【００４２】
有利には、細胞または幹細胞は細胞ユニットで培養され、各細胞ユニットは１以上のそのような細胞を含む。例えば、細胞ユニットは単細胞であり得る。
【００４３】
しかしながら、各細胞ユニットは、マイクロキャリアーまたはビーズのような固体基材に接着された、または結合した１以上の細胞または幹細胞を含むことができる。さらなる固体基材はウェルまたは培地浸透性バリアーを含む。
【００４４】
本発明による細胞または幹細胞を培養する方法は、適当なバイオリアクターにおいてスケールアップすることができる。例えば、本発明の方法は５０ｇ乾燥重量を超えるマイクロキャリアーを用いて実施することができる。
【図面の簡単な説明】
【００４５】
【図１】３ラウンドにわたって行われた分割プール細胞培養の例を示す。細胞ユニットの群は、所与の条件下で増殖させることによって得られる。細胞ユニットは球として描かれ、細胞ユニットの群はフラスコ中に示される。細胞ユニットは３つのアリコットに分割され、これは、Ａ、Ｂ、Ｃで示される異なる増殖条件下で２日間培養する。細胞ユニットは引き続いてプールされ１回以上３つのアリコットに分割され、これは条件Ｄ、ＥまたはＦ下で増殖される。２ラウンドのこのプロトコルの後、種々の細胞群は細胞培養条件の全ての可能な組合せに暴露することが理解される。
【図２】分割プール細胞培養のさらなる例を示す。この場合、実験は３つの群Ａ、ＢおよびＣで始まる。試料は第１の工程でプールされ、引き続いて、群Ｄ、ＥおよびＦに分割される。
【図３】分割プール方法の変形を示し、ここに、群Ａ、ＢおよびＣからの試料は先立ってのプーリングなしで群Ｄ、ＥおよびＦに直接分割される。個々の細胞群の分割はランダムであってよく、あるいは所定のものであってよい。
【図４】分割プールのさらなる変形を示し、そこでは細胞群Ａ、ＢおよびＣは細胞群Ｄ、ＥおよびＦに先立ってのプーリングなしで分割され、他方、第２の工程においては、細胞群Ｄ、ＥおよびＦはプールされ、引き続いて細胞群Ｇ、ＨおよびＩに分割される。
【図５】第１の工程を含む分割―分割プロトコルを示し、ここに、細胞群Ａは分割されて、細胞群Ｂ、ＣおよびＤを形成し、および第２の工程を示し、そこでは細胞群Ｂ、ＣおよびＤは分割され、細胞群Ｅ〜Ｍを形成する。
【図６】分割−分割工程を含む分割プールプロトコルを示す。２ラウンドの分割およびプーリングの後、細胞群Ａ、ＢおよびＣは先立ってのプーリングなしで分割され、その結果細胞群Ａ、ＢまたはＣに種々に由来する３つの細胞群系統が得られる。分割−分割工程を含むことを用いて、細胞効果を生じさせるにおいて細胞培養条件の役割を推定することができるのを注意されたい。例えば、もし細胞効果が系統Ａのみから誘導された細胞ユニットで観察され、系統Ａ、ＢおよびＣの多様性に引き続いての種々の細胞グループ分けでアッセイされた細胞培養条件が同一であると仮定すれば、分岐点における細胞群Ａの培養の条件は細胞効果に対して必須であるに違いない。また図１〜６で示した方法は多数の組合せで用いることができるのにも注意されたい。
【図７】プロトンマイクロキャリア―（Ｃｙｔｏｐｏｒｅ２，ＡｍｅｒｓｈａｍＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）に付着したキメラＴａｕ−緑色蛍光タンパク質を発現する多能性胚様幹細胞を示す。
【図８】パネルＡ〜Ｈは、グリア細胞マーカーＧＦＡＰの発現用の抗体染色によって測定される分化を受けるＴａｕ−緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）融合タンパク質を発現するＥＳ細胞および多孔性マイクロキャリアーＣｕｌｔｉｓｐｈｅｒＧを含む細胞ユニットを示す。パネルＡ〜Ｄは位相顕微鏡（Ａ）下で、および細胞核がＤＡＰＩ（Ｂ）を用いて青色に染色され、（赤色マーカー）ＧＦＡＰ（Ｃ）および（緑色）ＧＦＰ（Ｄ）が明らかである蛍光下で、４０×対物レンズを用いて観察された細胞ユニットを示す。パネルＣおよびＤは、ニューロン突起を包むグリア細胞を思わせる細胞の直線アレイ（白色矢印）であるように見えるものを示す。パネルＥ〜Ｈは、一次抗ＧＦＡＰ抗体が省略された対照細胞ユニットを示す。パネル１は、非多孔性マイクロキャリアー（Ｃｙｔｏｄｅｘ３、ＡｍｅｒｓｈａｍＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）上で増殖する分化した胚様幹細胞を示す蛍光顕微鏡によって得られた複合イメージを示す。前記細胞はＴａｕ−ＧＦＰを発現し、ニューロン特異的タンパク質β−チューブリンＩＩＩに対して生起された蛍光抗体で免疫科学的に赤色に染色される。黄色着色は、同時の赤色および緑色染色を示す。
【図９】非多孔性マイクロキャリアー（Ｃｙｔｏｄｅｘ３、Ａｍｅｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）に付着したＨｅｐＧ２細胞を含む細胞ユニットの位相（パネルＡ、Ｃ、Ｅ）および蛍光（パネルＢ、Ｄ、Ｆ）顕微鏡写真を示す。パネルＡ／Ｂ：エトキシレソルフィンの赤色蛍光生成物の変換を示す陽性対照細胞ユニット；パネルＣ／Ｄ：同様であるが、エトキシレソルフィンは添加せずに培養した陰性対照細胞ユニット；パネルＥ／Ｆ：Ｐ４５０インデューサーβ−ナフトフラボンで処理された、いくつかの細胞ユニットは高いレベルのＰ４５０を有し、蛍光生成物へエトキシレソルフィンを迅速に変換することができ（パネルＦ）、他方、分割プール培養に供された他の細胞ユニットは、高レベルのＰ４５０を発現しない多数の細胞が存在する（例えば、パネルＥの底部右側で明らかな細胞ユニット）ことを示す、分割プール実験に続いての細胞ユニット。
【図１０】ＲＦＩＤを用いる細胞ユニットの標識を示す。パネルＡ：ガラスカプセル化高周波数トランスポンダＩＤ１００−Ａ（Ｔｒｏｖａｎ）；パネルＢ；ガラスカプセル化高周波数トランスポンダのまっすぐなエッジで増殖するＴａｕ−ＧＦＰ融合タンパク質を発現するマウス胚様幹細胞（光学顕微鏡、頂部；蛍光顕微鏡、底部；合わせたイメージ、中央）；（Ｃ）はガラスカプセル化高周波数トランスポンダの丸い端部で増殖するＧＦＰを発現する胚様幹細胞を示す（光学顕微鏡、頂部；蛍光顕微鏡、底部；合わせたイメージ、中心）。
【図１１】マウスＥＳ細胞の分割プール培養に続いての分化遺伝子発現を示す。ＥＳ細胞は１μＭＬｉＣｌ（レーン２、５、８、１１）または１μＭレチノイン酸（３、６、９、１２）を加えた、または加えない（レーン１、４、７、１０）、ＥＳ培地（Ａ）、ＣＤＭ（Ｂ）、またはＤＭＥＭ（Ｃ）中のＣｙｔｏｐｏｒｅ２マイクロキャリアーで増殖された。ｃＤＮＡは細胞から調製し、等量を、対照遺伝子グリセルアルデヒド３リン酸デヒドロゲナーゼ（Ｇ３ＰＤＨ）のためのオリゴヌクレオチドプライマー、および未分化ＥＳ細胞のマーカー（Ｏｃｔ４）、ニューロン前駆体（ネスチン）、および内胚葉細胞（ＨＮＦ３β）を用いるＰＣＲに供した。写真は、塗りつぶしていないブラケットによって示されるＰＣＲ産物の臭化エチジウム−染色アガロースゲルのものである。「ＰＤ」はプライマー−ダイマー産物を示す。
【図１２】マイクロキャリアーの標識を示す。パネルＡ〜Ｄ：ストレプトアビジン−ＦＩＴＣで染色し、位相（Ａ、Ｃ）および蛍光（Ｂ、Ｄ）顕微鏡下で観察されたビオチン化抗コラーゲン抗体と共に（Ｃ、Ｄ）または（Ａ、１３）なしでインキュベートされたＣｙｔｏｄｅｘ３マイクロキャリアー。パネルＥ〜Ｈ：ストレプトアビジン−被覆１μＭ直径赤色蛍光ビーズで染色され、位相（Ｅ、Ｇ）および蛍光（Ｆ、Ｈ）顕微鏡下で観察された架橋ビオチン部位を持つ（Ｇ、Ｈ）または持たない（Ｅ、Ｆ）ＣｕｌｔｉｓｐｈｅｒＧマイクロキャリアー。
【図１３】細胞ユニットの標識を示す。ｔａｕ−ＧＦＰ融合タンパク質を発現するＥＳ細胞でシードされたＣｙｔｏｄｅｘ３ビーズを赤色蛍光ラテックスビーズで標識し、３０分後（Ａ〜Ｃ）、または２４時間後（Ｄ〜Ｆ）で調べた。マイクロキャリアーは位相顕微鏡（Ａ、Ｄ）を用い、およびフィルターで観察して、緑色（Ｂ、Ｅ）または赤色（Ｃ、Ｆ）蛍光を検出した。
【図１４】２つの異なる蛍光標識でのマイクロキャリアーの２つの集団の標識を示す。Ｃｙｔｏｄｅｘ３マイクロキャリアーは赤色または緑色ストレプトアビジンラテックスビーズで別々にインキュベートし、次いで、１：１比率で混合した。それらは位相顕微鏡（Ａ）を用いておよびフィルターで観察して緑色（Ｃ）または赤色（Ｄ）蛍光を検出した。ＢはＣ＋Ｄの合わせた写真である。双方の標識は容易に検出され、有意な標識の移動は検出されなかった。
【図１５】２つの異なる蛍光標識でのマイクロキャリアーの二重標識を示す。Ｃｙｔｏｄｅｘ３マイクロキャリアーを赤色および緑色ストレプトアビジンラテックスビーズの１：１混合物と共にインキュベートした。それらは位相顕微鏡（Ａ）下でおよびフィルターで観察して、緑色（Ｃ）または赤色（Ｄ）蛍光を検出した。ＢはＣ＋Ｄの合わせた顕微鏡写真である。各マイクロキャリアーは二重に標識される。
【図１６】位相（パネルＡ）または蛍光（パネルＢ）顕微鏡を用いる、細胞プロセスを呈する細胞ユニットの検出を示す。Ｔａｕ−ＧＦＰ融合タンパク質を発現する細胞ユニットは蛍光顕微鏡（Ｂ）を用いてバックグラウンドから容易に区別することができ、混合物から手動で単離することができる。
【図１７】ＣＯＰＡＳ Ｓｅｌｅｃｔ（ＵｎｉｏｎＢｉｏｍｅｔｒｉｃａ Ｉｎｃ．，Ｓｏｍｅｒｖｉｌｌｅ，ＭＡ）機器を用いるマイクロキャリアーおよび細胞ユニットの自動分析からのデータを示す。パネルＡおよびＢ：ＰＢＳで懸濁したＣｙｔｏｄｅｘ３マイクロキャリアーをソーターを通し、サイズ（時間飛行；ＴＯＦ）対光学散乱（消光；Ｅｘｔ）［Ａ］について、および緑色蛍光（ＦＬＵ１）対赤色蛍光（ＦＬＵ２）［Ｂ］についてモニターした。パネルＣおよびＤ：Ｅｘｔ対ＴＯＦのプロット［Ｃ］、および蛍光［Ｄ］を示す赤色蛍光ラテックスビーズで標識されたＣｙｔｏｄｅｘ３マイクロキャリアーの分析；パネルＢおよびＤの比較は、マイクロキャリアーの標識はそれらの赤色蛍光シグナルの増加をもたらすことを示す。パネルＥおよびＦ：Ｃｙｔｏｘ３、およびＴａｕ−ＧＦＰトランスジーンを発現するＥＳ細胞を含む細胞ユニットの群の分析。Ｅｘｔ対ＴＯＦを示すプロットにおける増大した散乱［Ｅ］および広い範囲の緑色蛍光（ＦＬＵ１）［Ｆ］は、細胞数に基づいて分類できる細胞ユニットを明らかにする。
【図１８】細胞ユニットを標識するのに用いられるタグの同定を示す。パネルＡ〜Ｄ：ビオチンで修飾された（Ａ、Ｂ）またはそれらの天然未処理状態の（Ｃ、Ｄ）Ｃｕｌｔｉｓｐｈｅｒマイクロキャリアーのストレプトアビジン−ＦＩＴＣ標識。パネルＥ〜Ｇ：各々、ＧＦＰ−標識細胞および赤色蛍光タグを可視化するための位相顕微鏡（Ｅ）下、および緑色（Ｆ）および赤色（Ｇ）エピ蛍光オプティックス下で観察された、Ｔａｕ−ＧＦＰ融合タンパク質を発現するＥＳ細胞およびストレプトアビジン被覆赤色−蛍光、１μｍラテックスビーズ（Ｓｉｇｍａ）で標識されたビオチン化ＣｕｌｔｉｓｐｈｅｒＧマイクロキャリアーを含む細胞セル。パネルＨ〜Ｋ：特徴的な前方および側方散乱パラメーター（Ｈ；ボックス領域）およびＦＬ３蛍光チャネルにおける特徴的な蛍光強度（Ｉ）を示す１μｍ赤色−蛍光ラテックスビーズ（Ｓｉｇｍａ）の対照試料を用いるＦＡＣＳのギャリブレーション。１μｍ赤色−蛍光ラテックスビーズ（Ｓｉｇｍａ）で標識された単一のタンパク質分解により消化された細胞ユニットのＦＡＣＳ分析は、タグについての以前に決定されたサイズパラメーターについてゲーティングし（Ｊ；ボックス領域）、続いて、タグに特徴的なＦＬ３チャネル強度の検出によって行うことができる（Ｋ）。
【図１９】マイクロキャリアーを標識するのに用いられる多数のタグの同定を示す。パネルＡ：対照タグで設定された前方／側方散乱パラメーターを用い、４．４μｍ（ゲートＲ１）、５．５μｍ（ゲートＲ２）、および１μｍ（ゲートＲ３）ビーズについてのサイズゲートを提示した。パネルＢ〜Ｄ：標識されたマイクロキャリアーのタンパク質分解消化のＦＡＣＳ分析は、ＢａｎｇｓＬａｂｓからの緑色蛍光４．４μｍビーズ組ｎｏ．５（パネルＢ）；ＢａｎｇｓＬａｂｓからの緑色蛍光５．５μｍビーズ組ｎｏ．１（パネルＣ）、およびＳｉｇｍａからの１μｍ赤色蛍光ビーズ（パネルＤ）に対応するタグの存在を明らかにする。
【発明を実施するための形態】
【００４６】
＜定義＞
＜培養条件＞
本明細書中で用いるように、用語「培養条件」とは、細胞の増殖または分化を促進するために細胞が置かれ、または暴露される環境をいう。従って、前記用語は、細胞の増殖および／または分化に影響し得る培地、温度、雰囲気条件、基材、攪拌条件などをいう。さらに詳しくは、前記用語は、培養培地に取り込むことができ、細胞の増殖および／または分化に影響し得る特定の薬剤をいう。
【００４７】
＜細胞＞
本明細書中でいう細胞は、全てが半透性細胞膜または細胞壁によって囲まれた、１以上の核、細胞質および種々のオルガネラよりなる、独立して機能することができる生物、または単細胞生物の最も小さな構造ユニットと定義される。前記細胞は原核生物、真核生物または古細菌であり得る。例えば、細胞は真核生物細胞であり得る。哺乳動物細胞、特にヒト細胞が好ましい。細胞は天然のものであるか、あるいは遺伝子操作または培養における継代によるなどして修飾して所望の特性を達成することができる。幹細胞は後により詳細に定義され、その１を超える分化した細胞型を生じることができる全能性、多能性または複能性細胞である。幹細胞はインビトロで分化した細胞を生じ、これはそれ自体が複能性であるか、または終末的に分化させることができる。インビトロで分化した細胞は、細胞分化を促進する１以上の薬剤に幹細胞を暴露することによって人工的に作られた細胞である。
【００４８】
＜細胞プロセス＞
細胞プロセスは、細胞に起こるか、あるいは細胞に観察されるか、あるいは細胞に帰すことができる、いずれかの細胞内または細胞外の特徴的な機能、プロセス、事象、原因または効果である。細胞プロセスの例は、限定されるものではないが、生存率、老化、死滅、多能性、形態学、シグナリング、結合、認識、分子生産または破壊（分解）、突然変異、タンパク質フォールディング、転写、翻訳、触媒、シナプス伝達、小胞輸送、オルガネラ機能、細胞周期、代謝、増殖、細胞分裂、分化、表現型、遺伝子型、遺伝子発現、またはこれらのプロセスの制御を含む。
【００４９】
＜細胞ユニット＞
細胞の群であり、１つの群であってもよい。細胞ユニットのプールは、細胞ユニットが細胞のコロニーとして挙動し、細胞ユニットにおける各細胞が同一の培養条件に暴露されるように、細胞ユニットそれ自体を実質的に解離させることなく分類し、サブ分割し、取り扱うことができる。例えば、細胞ユニットは、細胞の群に接着するビーズを含むことができる。
【００５０】
＜全能性＞
全能性細胞は、生物において見出された体細胞または生殖細胞のいずれかのタイプに分化する能力を持つ細胞である。従って、いずれの所望の細胞も、何らかの手段で、全能性細胞に由来することができる。
【００５１】
＜多能性＞
多能性細胞は、１を超えるが、全てではない細胞型に分化することができる細胞である。
【００５２】
＜標識＞
本明細書中で用いる標識またはタグは、細胞ユニットを同定し、および／または細胞ユニットが暴露された培養条件、または培養条件の配列を決定するための手段である。従って、標識は標識の群であってもよく、各々は特異的な培養ステップに添加され；または細胞ユニットが暴露された培養ステップに従って修飾された、あるいは初期に、あるいは前記ステップの間に追跡された実験の間に添加された標識であり；または用いられる培養工程が推定できるようにする単純に位置的な参照である。また、標識またはタグは、いずれか１つの時点で細胞ユニットの位置または同一性を報告し、または記録し、あるいは細胞ユニットに独特なアイデンティファイアーに割り当てるデバイスであってもよい。標識またはタグの例は独特な配列、構造または質量の分子；あるいはビーズのような蛍光分子または物体；あるいは放射線周波数および他のトランスポンダ；またはユニークなマーキングまたは形状を持つ物体である。
【００５３】
＜培養条件への暴露＞
細胞が培地と接触するように置かれるか、または細胞の増殖、分化または代謝状態のような１以上の細胞プロセスに影響する条件下で増殖された場合、細胞は培養条件に暴露される。従って、もし培養条件が細胞を培地中で培養することを含めば、細胞はそれが効果を有するのに十分な長さの時間培地に入れられる。同様に、もし条件が温度条件であれば、細胞は所望の温度で培養される。
【００５４】
＜プーリング＞
細胞ユニットの１以上の群のプーリングは、１を超えるバックグラウンドの細胞ユニットを含み、すなわち、培養条件の１を超える異なる組に暴露された単一の群またはプールを作り出すための群の混合物を含む。プールはさらにランダムにまたはランダムではなく群にサブ分割され；そのような群は本発明の目的ではそれ自体は「プール」ではないが、それ自体は、例えば、培養条件の異なる組への暴露の後に組合せによってプールされる。
【００５５】
＜増殖＞
細胞成長および細胞増殖は、ここでは、異なる細胞型または細胞系譜への分化なしで細胞の数の大きさを示すのに相互交換的に用いられる。換言すれば、前記用語は生きた細胞数の増加を示す。好ましくは、増殖は表現型または遺伝子型の認識可能な変化は伴われない。
【００５６】
＜分化＞
細胞分化は、異なる細胞型の、細胞型からの発生である。例えば、二能性、多能性、または全能性細胞は中性細胞に分化することができる。分化には増殖が伴うことができ、あるいはそれとは独立していてもよい。用語「分化」は、一般には、発生的にはあまり定義されていない細胞型からの成熟細胞型、例えば、ニューロン、またはリンパ球の表現型の獲得をいうが、トランス分化を排除せず、それにより、１つの成熟細胞型はもう１つの成熟細胞型に変換することができ、例えば、ニューロンはリンパ球に変換することができる。
【００５７】
＜分化の状態＞
細胞の分化の状態は、細胞が特定の経路または系譜に沿って分化されたレベルである。
【００５８】
＜細胞プロセスの状態＞
細胞プロセスの状態は、細胞プロセスが起こりつつあるか、またはそうでないかをいい、複雑な細胞プロセスでは、その細胞プロセスにおける特定のステップまたは段階を示すことができる。例えば、細胞における細胞分化経路は不活性であるか、あるいは誘導されており、酵素または中間体の特徴的な組の存在によって特徴付けられるシグナリング事象のような区別されるステップまたは成分の数を含むことができる。
【００５９】
＜遺伝子＞
遺伝子は、それがポリペプチドまたはＲＮＡ遺伝子産物であるかを問わず遺伝子産物をコードする核酸である。本明細書中で用いるように、遺伝子は遺伝子産物をコードするコード配列を少なくとも含み；それは、所望により、コード配列の転写および／または翻訳に必要な１以上の調節領域を含むことができる。
【００６０】
＜遺伝子産物＞
遺伝子産物は、典型的には、慣用的方法で遺伝子によってコードされるタンパク質である。しかしながら、前記用語は遺伝子によってコードされるリボ核酸のような非ポリペプチド遺伝子産物も含む。
【００６１】
＜核酸合成＞
核酸は、いずれかの入手可能な技術に従って合成することができる。好ましくは、核酸合成は自動化される。さらに、核酸は、当分野で公知の手法に従って、細菌または真核生物細胞におけるクローニングおよび複製によるような、生物学的複製によって生産することができる。
【００６２】
＜差異的な発現＞
細胞培養条件に応答した異なるレベルで発現される遺伝子は、当分野で知られた方法によって、遺伝子アレイ上のような遺伝子発現分析によって同定することができる。差異的に（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ）発現された遺伝子は、総じて遺伝子発現レベルに対して、別の条件下よりもテスト条件下で細胞におけるｍＲＮＡまたは遺伝子産物のより大きなまたはより小さな量を呈する。
【００６３】
＜トランスフェクション＞
遺伝子は、いずれかの適当な手段によって細胞にトランスフェクトすることができる。前記用語は、ここでは、例えば、リン酸カルシウムを用いる従来のトランスフェクションを意味するように用いられるが、形質転換、ウイルス導入、電気穿孔などを含む、核酸を細胞に導入するための他の技術も含む。
【００６４】
＜調整＞
前記用語調整は、調整されるべきパラメーターの増加および／または減少を意味するように用いられる。従って、遺伝子発現の調整は、遺伝子発現の増加および遺伝子発現の減少を共に含む。
【００６５】
＜細胞ベースのアッセイ＞
細胞ベースのアッセイは現代の生物医薬科学の重要な一部であり、細胞が用いられる工程を含むいずれかのアッセイを含む。細胞ベースのアッセイを、薬物発見および開発プロセスのほとんど全ての段階にわたって用いることができ、どのようにして化合物が単離された潜在的薬物標的と相互作用するかについてではなく、どのようにして化合物が生物学的系で相互作用するかについての情報を提供するのに貴重である。
【００６６】
例えば、細胞ベースのアッセイを用いて、潜在的薬物標的を同定し、確認することができる。病気プロセスに関与する遺伝子または細胞経路を同定するのに、標的遺伝子の機能を判断するのに、あるいはある種の遺伝子またはそれらの産物の活性化に際して誘導することができる表現型の変化を決定するのに用いることができる細胞ベースのアッセイが開発されている。
【００６７】
細胞ベースのアッセイは、リード化合物の発見、選択および最適化のための薬物発見で用いることができる。伝統的なハイスループットスクリーニングアッセイでしばしば用いられる生化学アッセイとは異なり、細胞ベースのアッセイは、吸収、浸透性、選択性、特異性および代謝のような薬物特性に関連する情報を提供することができる。その結果、細胞ベースのスクリーニングの後に選択されるリード化合物は良好に特徴付けられており、価値あるリードをより提供するようであって、薬物発見プロセスの引き続いてのフェーズでより排除されないようである。
【００６８】
細胞ベースのアッセイの主な適用は毒性スクリーニングである。薬物の発見および開発の非常に重要な部分は、副作用を引き起こす化合物を排除するための薬物候補のスクリーニングである。しかしながら、現在の方法は大いに不適切であり、特に、毒性スクリーニングのための動物モデルの使用は費用がかかり、時間を消費するものである。加えて、動物モデルは信頼できない。なぜならば、これらのモデルにおける結果は、どのようにして化合物がヒトで実行されるかを常には正確に予測しないからである。従って、ヒト細胞ベースのスクリーニングが好ましい。
【００６９】
＜幹細胞＞
幹細胞はＳｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ：ＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃＰｒｏｇｒｅｓｓ ａｎｄＦｕｔｕｒｅ ＲｅｓｅａｒｃｈＤｉｒｅｃｔｉｏｎｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ．Ｊｕｎｅ ２００１．ｈｔｔｐ／／ｗｗｗ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｎｅｗｓ／ｓｔｅｍｃｅｌｌ／ｓｃｉｒｅｐｏｒｔ．ｈｔｍに詳細に記載されている。参照することにより前記報告の内容を本明細書に組み込む。
【００７０】
幹細胞は、分化して少なくとも１つの、時々は多くの特殊化した細胞型を形成することができる細胞である。幹細胞から形成することができる異なる細胞のレパートリーはあますところがないと考えられている；すなわち、生物を作り上げる異なる細胞型の全てを含む。幹細胞は生物の寿命を通じて、それが比較的豊富である初期の胚から、それが比較的稀である生体まで存在する。生体動物の多くの組織に存在する幹細胞は正常な組織の修復およびホメオスタシスで重要である。
【００７１】
これらの細胞の存在は、それが、ヒトに移植されて、病気組織において死滅したまたは非機能細胞を置き換えることができる特殊化機能細胞を作り出す手段を提供する。これが治療を提供することができる病気のリストはパーキンソン病、糖尿病、脊髄負傷、発作、慢性心臓病、末期腎臓病、心疾患および癌を含む。細胞置換療法が幹細胞において少なくとも２つの主な大進歩において可能となるためには、研究が必要である。第一に、細胞の治療的に関連する用量を製造することができるように開発される必要がある十分な数まで幹細胞を増殖させるための条件。理想的には、大規模な培養が可能であり、複数患者を治療するための材料を提供する。第二に、動物に移植された未分化幹細胞はしばしば腫瘍を生起するので、幹細胞のより特殊化された細胞への分化は細胞置換療法の必要条件であり、従って、異なる病気に必要な幹細胞の特に特殊化された細胞型への分化のための条件を発見する必要がある。
【００７２】
これらの障害を克服するための鍵は、幹細胞およびそれらの誘導体のための細胞培養の適当な方法を工夫することにあるのは明らかである。しかしながら、前記で説明した理由のため、すなわち、細胞培養技術の進歩に関与する試行錯誤の労力のかかるプロセスのため、前記仕事は特に困難である。よって、本明細書中に記載の本発明の適用の１つは、幹細胞の増殖および分化のための技術の解明である。
【００７３】
＜幹細胞のタイプ＞
何が幹細胞を構成するかについては依然としてかなりの論争があるが、この議論の目的では、鍵となる特徴は異なる細胞型に分化する能力である。幹細胞の例を以下に掲げる。
【００７４】
異なる幹細胞は種々の細胞型を形成する異なる能力を有する。天然では精子のみを生じるため、精原細胞幹細胞は単能性である一方で、造血幹細胞は多能性であって、胚性幹細胞は全ての細胞型を生起させることができると考えられるからであり、全能性または多能性であるといわれる。
【００７５】
今日、３つのタイプの哺乳動物多能性幹細胞が単離されている。これらの細胞は胚の３つの生殖細胞層（内胚葉、中胚葉および外胚葉）に通常は由来する細胞型を生起することができる。幹細胞の３つのタイプは精巣腫瘍に由来する胚性癌腫（ＥＣ）細胞；着床前胚（通常は、胚盤胞）に由来する胚性幹（ＥＳ）細胞；および着床後胚に由来する胚性生殖（ＥＧ）細胞（通常は、生殖腺の一部となる運命にある胎児の細胞）である。これらの細胞は、正確にはそれらが多能性であるので、分化を指令する努力において特別の注意を受ける。
【００７６】
成体生物は幹細胞も存在する。成体幹細胞は分化した（特殊化された）組織で生じ、自身を新しくし、分化してより特殊化された細胞を生じることができる未分化細胞である。最近、成体幹細胞は可塑性となることができることが示されており、すなわち、それらは分化して、それが存在する組織の特徴的を持たず、また、その組織が由来する生殖細胞層ではない細胞型を生じさせることができる。例えば、（中胚葉に由来する）血液幹細胞は（通常は、外胚葉に由来する）ニューロンに分化することができることが示されている。Ｔｏｍａｅｔ ａｌ．，（２００１，ＮａｔｕｒｅＣｅｌｌ Ｂｉｏｌ．３，ｐ７７８−７８４）は、最近、皮膚の真皮に由来する幹細胞の新しいタイプの同定および単離を記載した。これらの幹細胞は皮膚由来前駆体（ＳＫＰ）細胞と呼ばれた。前記ＳＫＰ細胞は、ポリリシン上で培養し、培養基中の血清の濃度を変化させることによって分化するように誘導することができた。血清の非存在においては、それらはニューロンおよびグリア細胞に分化し；３％血清の添加では、それらは平滑筋細胞に分化し；血清を１０％まで増加させると、ＳＫＰ細胞が脂肪細胞に分化するのを引き起こす。成体幹細胞は、これまでに、組織において、神経系、骨髄および血液、肝臓、骨格筋、皮膚および消化系と同程度に多様であると報告されている。
【００７７】
成体幹細胞に加えて、多数のタイプの先祖または前駆体細胞がある。これらの細胞は、その分化能力が部分的に制限されており、身体の組織の恐らくは全てで生じる細胞であり、それは分化できるが、そのレパートリーが広くない点で、および自己更新できない定義によって幹細胞とは異なる。
【００７８】
最近の証拠は、分化した細胞型が表現型を変化できることを示唆さえしている。トランス分化といわれる現象は、介在細胞分裂の有っても無くても、１つの分化した細胞型からもう１つの分化された細胞型への変換である。以前、一般には、最終分化状態は固定されていると認められていたが、今日では、分化は時々逆行し、または改変できることが明らかである。細胞系をトランス分化まで誘導することができるインビトロプロトコルが今日では利用できる（Ｓｈｅｎ，Ｓｌａｃｋ＆ Ｔｏｓｈ，２０００，ＮａｔｕｒｅＣｅｌｌ Ｂｉｏｌ，ｖｏｌ２，ｐ．８７９−８８７；Ｈｏｒｂ ｅｔ ａｌ．，２００３，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｂｉｏｌ．Ｖｏｌ １３，ｐ１０５−１１５）。最後に、脱分化して、さらに細胞型に分化する能力を持つ幹様細胞を生じさせることができる特殊化された細胞タイプの報告があった。
【００７９】
＜幹細胞の増殖および分化＞
幹細胞の重要な特性は培養において対称的に分裂するその能力であり、由来する幹細胞の正確なコピーである２つの娘細胞を生じる。これは、幹細胞がその未分化状態で培養において拡大培養できることを可能とし、生物学的研究または細胞療法のための十分な材料を生じる。幹細胞がこれをなすことができる手段は、理解されることには、精力的な研究の主題であるが、幹細胞更新を促進する因子は少数しか知られていない。典型的には、多能性幹細胞系が線維芽細胞の細胞分裂的には不活性なフィーダー層、またはそのような細胞によるコンディション培地で維持される。フィーダー細胞は培養基からいくつかの未知の因子を除去し／中和し、および／またはそれは、分化を抑制し、幹細胞の自己複製を促進する因子を提供すると考えられている。１つのそのような因子は白血病阻害因子（ＬＩＦ）、すなわち、フィーダー細胞の非存在下でマウスＥ３細胞自己複製を促進できる、ＩＬ−６に関連するサイトカインファミリーのメンバーである。フィーダー細胞（および／またはＬＩＦ）の非存在下で増殖された幹細胞は、しばしば、自然発生的に、および偶然に分化し、分化した細胞型の混合物を生じる。
【００８０】
幹細胞自己複製に影響する因子は刺激的または阻害的であってもよく、細胞外または細胞内で機能してもよい。分泌された因子ＬＩＦの場合には、その細胞外受容体はｇｐ１３０であり、このタンパク質の活性化はマウスＥＳ細胞分化を阻害するのに十分であることが知られている。細胞内では、非常に重要なｇｐ１３０の下流エフェクターはシグナルトランジューサーおよび転写−３のアクチベーター（ＳＴＡＴ−３）である。幹細胞多能性を維持するのに特に重要なもう１つの分子は転写因子Ｏｃｔ−４であり、これは、ダウンレギュレートされた場合に、人工的に、ＥＳ細胞またはマウスにおける多能性状態の喪失に導く。マイトジェン−活性化タンパク質キナーゼのような天然にＥＳ細胞自己更新を阻害する他のシグナリング分子もまた解明されている。幹細胞研究の主な目標は、天然および合成因子、薬物、ポリペプチド、遺伝子、オリゴヌクレオチド、組織培養培地および条件、特別な条件培地、フィーダー細胞、および前記拡大を促進し、種々のタイプの幹細胞の分化能力を保有する効果を有する他の刺激の発見である。これは、生体幹細胞を含み、これは、現在、細胞培養では認識可能には拡大されていない。
【００８１】
幹細胞研究の第二の大きな挑戦は、機能的であり、種々の病気状態で細胞喪失を置き換えることができ、ポジティブな臨床結果をもたらす特定の細胞型への幹細胞の分化を指令することである。分化を開始するための幹細胞をコアクスすること（ｃｏａｘｉｎｇ）は、現実には、かなり直接的なプロセスである。例えば、フィーダー培養から取り出され、接着性基材上で密集するまで増殖されたＥＳ細胞は自然発生的に分化を開始する。同様に、フィーダー培養から取り出され、非接着性基材上で増殖されたＥＳ細胞は胚様体、すなわち、全ての３つの生殖細胞層からの未分化および部分的に分化した細胞の塊を形成する。これらの細胞は引き続いて解離し、単層で平板培養し、指令された分化を促進する因子に暴露される。これらの因子に暴露された培養物は、多くの異なる細胞型の混合物を含む細胞を分化する胚様体または未処理培養と比較して、より少ないタイプの分化細胞によってより占められるようである。それにもかかわらず、もしいずれかの条件が工夫されたとしても、実質的に純粋な分化細胞の培養を生じるのはほとんどない。加えて、幹細胞分化のために工夫されたプロトコルのいずれかは、細胞置換療法に適当な細胞を生じるかは明らかでなく、細胞は必要な正確な表現型に最終的には分化されず、分化された細胞はもはやインビボでは生存しないであろう。
【００８２】
幹細胞の指令された分化を誘導するのに用いられてきた因子は、レチノイン酸、上皮成長因子（ＥＧＦ）、骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ）、塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）、アクチビン−Ａ、トランスフォーミング成長因子β−１（ＴＦＧβ−１）、肝細胞成長因子、神経成長因子、ソニックヘッジホッグ（ＳＨＨ）、インターロイキン−３（ＩＬ−３）、インターロイキン６（ＩＬ−６）、顆粒細胞マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、エリスロポエチン、ビタミンＤ３、デキサメタゾン、β−メルカプトエタノール、ブチル化ヒドロキシアニソール、５−アザシチジン、ＤＭＳＯ、インスリン、甲状腺ホルモン（Ｔ３）、ＬＩＦ、胎児ウシ血清、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、スティール因子、酸素濃度の変化、アスコルビン酸、β−グリセロホスフェート、ニコチンアミド、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、ｃＡＭＰ、種々の細胞接着分子および基質およびその他を含む。これらの規定された因子に加えて、コンディション培地、ヒトおよび動物組織ホモジェネートのような規定されていない抽出物、または植物抽出物を用いて、幹細胞分化を用いることができる。これらの規定されていない抽出物の進歩的な画分により、活性な画分、または高い能力を持つ純粋な成分でさえ生じさせることができる。これらの因子は、単独、または組み合わせて、または実験結果に対して非常に重要な規定された順番で、特別な実験で用いる増殖培地に添加することができる。
【００８３】
インビトロにて幹細胞の分化のために工夫された多くの系は複雑な多段階手法であり、ここに、種々の工程の正確な性質、ならびに種々の工程の年代学が重要である。例えば、Ｌｅｅｅｔ ａｌ．（２０００，ＮａｔｕｒｅＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．１８，ｐ．６７５−６７９）は、マウスＥＳ細胞からドーパミン作動性ニューロンを誘導するのに五段階プロトコルを用いた。１）未分化ＥＳ細胞はＬＩＦの存在下でＥＳ細胞培地上でゼラチン被覆組織培養表面で拡大培養され；２）胚様体をＥＳ細胞培地中で４日間懸濁培養で生じさせ；３）ネスチン陽性細胞は、組織培養表面で平板した後ＩＴＳＦｎ培地で８日間胚様体から選択された；４）ネスチン陽性細胞は、ｂＦＧＦ／ラミニンを含有するＮ２培地で６日間拡大培養され；５）最後に、拡大培養されたニューロン前駆体細胞は、ラミニンを含有するＮ２培地からｇＦＧＦを除去することによって分化するように誘導された。
【００８４】
系列的細胞培養の第二の例において、Ｂｏｎｎｅｒ−Ｗｅｉｒ ｅｔ ａｌ．［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（２０００）９７：７９９９−８００４］は、１）血清の存在下で固体表面での２〜４日間の選択的接着によって島細胞上の管細胞を選択し；２）引き続いて、血清を除去し、ケラチノサイト増殖因子を加えて、５〜１０日間線維芽細胞上で管上皮細胞につき選択し；および３）細胞外マトリックス調製物「Ｍａｔｒｉｇｅｌ」で３〜６週間細胞を重ねることによって、ヒト膵臓管細胞からインスリン生産細胞を誘導した。
【００８５】
系列的細胞培養のさらなる例において、Ｌｕｍｅｌｓｋｙ ｅｔ ａｌ．［Ｓｃｉｅｎｃｅ（２００１）２９２：１３８９−１３９４］は、１）ＬＩＦの存在下でＥＳ細胞を２〜３日間拡大培養し；２）ＬＩＦの非存在下で４日間にわたって胚様体を生じさせ；３）ＩＴＳＦｎ培地を用いてネスチン陽性細胞を６〜７日間選択し；４）Ｂ２７培地補足物およびｂＦＧＦを含有するＮ２培地において６日間膵臓内分泌前駆体を拡大培養し；および５）ｂＦＧＦを除去し、ニコチンアミドを添加することによって、インスリン分泌細胞への分化を誘導することによって、マウス胚幹（ＥＳ）細胞の指令された分化によってインスリン分泌細胞を誘導した。
【００８６】
しかしながら、重要なのは、細胞分化の測定において様々な異なる因子の添加の工程またはシリーズの配列および間においてのみではない。胚様発生は、位置情報を付与するシグナリング因子のグラジエントの作用によって調節されるので、単一シグナリング因子の濃度、および２以上の因子の相対的濃度は、インビトロおよびインビボで細胞集団の運命を特定するのに重要であると予測される。因子の濃度は、発生の間に変化し、幹細胞は同一分子の異なる濃度に対して異なって応答する。例えば、後期段階の胚のＣＮＳから単離された幹細胞は、異なる濃度のＥＧＦに異なって応答する。低濃度のＥＧＦは増殖せよとのシグナルを結果的に生じ、他方、ＥＧＦのより高い濃度は増殖および星状細胞の分化をもたらす。
【００８７】
インビトロで幹細胞の自己複製および分化に影響することが見出されている因子の多くは天然に生じる分子である。これは、分化は、シグナル変換経路に沿って作用する分子および受容体をシグナリングすることによって誘導され、制御されるので予測されるべきものである。しかしながら、同一の証拠によって、多くの合成化合物は幹細胞分化に対して影響を有するようである。シグナリングおよびシグナル変換経路（いわゆる、薬物可能標的）内の細胞標的と相互作用する高い確率を有するそのような合成化合物は、例えば、医薬会社によって薬物スクリーニングのためにルーチン的に合成される。一旦知られると、これらの化合物を用いて、エキソビボにて幹細胞の分化を指令することができるか、あるいはインビボで投与することができ、それらの場合には、それらは患者の標的器官に存在する幹細胞に作用するであろう。
【００８８】
＜組織培養における共通の変数＞
特別な細胞型の成功した培養のための、あるいは細胞プロセスを達成するまたは調整するための条件の開発において、しばしば、種々の因子を考慮するのが重要である。
【００８９】
１つの重要な因子は、懸濁液中で、あるいは基材に付着した単層として細胞を増殖させるか否かの判断である。ほとんどの細胞は、基材に接着するのを好むが、形質転換された細胞、造血細胞を含むいくらか、および腹水からの細胞は懸濁液で増殖することができる。
【００９０】
培養物が接着細胞のものであると仮定すれば、重要な因子は接着基材の選択である。ほとんどの研究所は、組織培養のための基材として使い捨て可能なプラスチックを用いる。用いられてきたプラスチックはポリスチレン（最も普通のタイプ）、ポリエチレン、ポリカルボネート、Ｐｅｒｓｐｅｘ、ＰＶＣ、テフロン（登録商標）、セロファンおよび酢酸セルロースを含む。いずれのプラスチックも用いることができるが、これらの多くはそれを細胞接着のために湿潤性とし、適したものとするのに処理される必要があろう。さらに、いずれの適当に調製された固体基材も、細胞用の支持体を提供するのに用いることができ、今日まで用いられてきた基材はガラス（例えば、ミョウバン−ボロシリケートおよびソーダライムガラス）、ゴム、合成繊維、重合されたデキストラン、メタル（例えば、ステンレス鋼およびチタン）その他を含む。
【００９１】
気管支上皮、血管内皮、骨格筋およびニューロンのようないくつかの細胞型は、生物学的産物を被覆した増殖基材、通常は、フィブロネクチン、コラーゲン、ラミニン、ポリリシンなどのような細胞外マトリックス材料を必要とする。増殖基材および適用の方法（湿潤または乾燥コーティング、またはゲル化）、細胞の増殖および分化の特徴のような細胞プロセスに対して影響を有することができ、これらは、前記したように経験的に決定されなければならない。
【００９２】
恐らくは、細胞培養における変数の最も明らかに重要なものは、培養基および血清のような補足物の選択である。これらは細胞増殖に対する水性区画を提供し、そのいくつかは前記でリストされており、その他はあまり定義されていない栄養物および種々の因子と競合する。これらの因子のいくつかは、接着に対して必須であり、その他は情報（例えば、ホルモン、マイトジェン、サイトカイン）を運ぶために必須であり、その他は解毒薬剤として必須である。通常に使用される培地はＲＰＭＩ１６４０、ＭＥＭ／ハンクスの塩、ＭＥＭ／イーグルの塩、Ｆ１２、ＤＭＥＭ／Ｆ１２、Ｌ１５、ＭＣＤＢ１５３などを含む。種々の培地はその構成要素が広く異なることができ、共通の差のいくつかは炭酸水粗ナトリウムの濃度、ＣａおよびＭｇのような二価イオンの濃度、緩衝液の組成、抗生物質、微量元素、ヌクレオシド、ポリペプチド、合成化合物、薬物などを含む。異なる培地は選択的であることが周知であり、これは、それらがいくつかの細胞型のみの増殖を促進することを意味する。血清、下垂体脳および他の抽出物のような培地補足物は、しばしば、培養中の細胞の増殖に対して必須であり、加えて、培養中の細胞の表現型を決定するのを担い、すなわち、それらは細胞生存を決定し、分化を指令することができる。分化のような細胞プロセスにおける補足物の役割は複雑であり、その濃度、それらが培養に添加される時点、用いられる細胞型および培地に依存する。これらの補足物の規定されていない性質、および細胞表現型に影響するそれらの能力は、無血清培地の開発を動機付けた。全ての培地のように、それらの開発は、前記したように、試行錯誤によってかなり起こった。
【００９３】
また、組織培養のガス相も重要であって、用いるべきその組成および用量は必要な培地のタイプ、必要な緩衝の量、培養容器が開いているかまたはシールされているか、および特定の細胞プロセスが調整される必要があるか否かに依存し得る。共通の変数は二酸化炭素および炭素の濃度を含む。
【００９４】
組織培養に対して重要な他の条件は培養容器、ヘッドスペースの量、播種密度、温度、培地変化の頻度、酵素での処理、揺動または攪拌の速度および様式を含む。
【００９５】
従って、細胞培養条件の変化は、所望の細胞プロセスを達成する方法である。本発明の１つの態様は、系列的な細胞培養条件の変動は細胞効果を達成するかなり効果的な方法であり得ることを認識している。種々の適用において、例えば、細胞分化の実験においては、それは、しばしば、異なる組織培養条件の特定のシリーズが細胞プロセスを行うのに必要である場合である。異なる条件は特定の時点における培地または培地の変化に／から付加または除去を含むことができる。その例を以下に掲げるそのような条件の組は、前記した試行錯誤によって共通して開発される。
【００９６】
＜細胞ユニットの形成＞
本発明の重要な態様は、細胞（細胞コロニー）の群が種々の条件下で細胞培養を増殖させることができ、コロニーは、乱された場合、および他のコロニーと混合された場合、種々の条件下でその一体性を大いに維持することができることである。そのような群またはコロニーは、本明細書では細胞ユニットという。細胞ユニットの形成は、例示として、キャリアーのような固体基材上での接着性培養としての細胞を増殖させることによって達成することができる。もしキャリアー上でのシーディング後に細胞増殖が起これば、娘細胞は同一キャリアー上に付着し、同一コロニーの一部を形成する。一般には、生きた接着性細胞はその増殖基材から容易には解離せず、従って、細胞コロニーの一体性は、キャリアーのいずれかの機械的な操作、培養基の揺動、またはもう１つの組織培養系への導入にもかかわらず終始一貫して存在する。同様に、もしいずれかの時点において、複数キャリアーが同一容器に入れられると（例えば、ビーズがプールされると）、１つのビーズからもう１つのビーズへの細胞の実質的移動はない。
【００９７】
ユニットまたはコロニーにおいて細胞を増殖する１つの利点は、もしユニットが異なる組織培養培地の組で系列的に置かれると、コロニーを含む全ての細胞は、同一の順番で、かつ同一の時間同一シリーズの培養条件に暴露されたであろう。組織培養容器に対してそれ自体が必ずしも接着性ではないユニットにおける細胞の増殖は、個々のコロニーが自由に除去でき、異なる培養容器に移すことができる利点を有する。この方法の利点の１つは、組織培養を小型化できることであり：最小の組織培養フラスコさえと比較して、マイクロキャリアービーズ（後記参照）をコロニー化するのに必要である。キャリアーで形成された細胞ユニットを増殖させるさらなる利点は、細胞培養をスケールアップすることができることである。キャリアー上での幹細胞の増殖は、幹細胞療法のための十分な材料を提供するために生産をスケールアップする方法を提供する。同等に、キャリアー上での幹細胞の分化は、分化が進行するにつれて生産をスケールアップする方法を提供し、結局は、細胞置換療法に対して十分な材料を提供する。そのような細胞培養のスケールアップは、少なくとも５０ｇ（乾燥重量）のマイクロキャリアー、好ましくは、１００ｇ、５００ｇ、１ｋｇ、１０ｋｇ以上を必要とする。
【００９８】
固体基材上の細胞ユニットを形成するもう１つの重要な利点は、基材および、したがって、会合の理由による付着細胞が種々の手段によって標識することができることである。
【００９９】
３ｍｍおよび５ｍｍのガラス球は細胞接着基材として、特に、細胞培養のスケールアップで用いられるガラスビーズバイオリアクター（例えば、ＭｅｒｅｄｏｓＧｍｂｈによって製造されたような）で広く用いられてきた。これらのビーズは、典型的には、パッチ培養よりはむしろ充填床で用いられて、接着性細胞に対する機械的損傷を回避する。
【０１００】
対照的に、細胞をより小さなキャリアー上で増殖させた場合、それらは懸濁培養として処理することができる。小さなキャリアー上で細胞を増殖させる通常の方法はマイクロキャリアー細胞培養という（その全体を本明細書に参照して組み込む「Ｍｉｃｒｏｃａｒｒｉｅｒｃｅｌｌ ｃｕｌｔｕｒｅ，Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ」，ＡＡ編参照，ＡｍｅｒｓｈａｍＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓから入手可能（１８−１１４０−６２））。マイクロキャリアー培養は４０００リットルまでのファーメンターでの抗体およびインターフェロン生産で商業的に使用されている。形状およびサイズがある範囲で、異なる材料で作成された種々のマイクロキャリアーが入手できる。とりわけ、ポリスチレン（Ｂｉｏｓｉｌｏｎ，Ｎｕｎｃ）、ガラス（Ｂｉｏｇｌａｓｓ，ＳｏｌｏｈｉｌｌＥｎｇ）、コラーゲン（Ｂｉｏｓｐｈｅｒｅｓ，Ｓｏｌｏｈｉｌｌ Ｅｎｇ）、ＤＥＡＥセファデックス（Ｃｙｔｏｄｅｘ−１，Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、デキストラン（Ｄｏｒｍａｃｅｌｌ，Ｐｆｅｉｆｅｒ＆ Ｌａｎｇｅｎ）、セルロース（ＤＥ−５３，Ｗｈａｔｍａｎ）、ゼラチン（Ｇｅｌｉｂｅａｄ，ＨａｚｅｌｔｏｎＬａｂ）、およびＤＥＡＥデキストラン（Ｍｉｃｒｏｄｅｘ，ＤｅｘｔｒａｎＰｒｏｄ．）で作成されたマイクロキャリアービーズが商業的に入手可能である。これらのキャリアーはビーズの比重、細胞増殖で利用できる直径および表面積の点でよく特徴付けられている。加えて、多数の多孔性（マイクロ）キャリアーは細胞増殖のためにかなり増大した表面積を持つものとして入手できる。これらの多孔性キャリアーのさらなる特徴は、それが、足場依存性細胞の増殖に、ならびに開いた相互結合ポアのネットワークにおいて捕獲によって担持された懸濁細胞に適していることである。多孔性キャリアーはゼラチン（ＣｕｌｔｉｓｐｈｅｒＧ，ＨｙＣｌｏｎｅ）、セルロース（Ｃｙｔｏｃｅｌｌ，Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、ポリエチレン（Ｃｙｔｏｌｉｎｅ１および２，Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、シリコーンゴム（Ｉｍｍｏｂａｓｉｌ，ＡｓｈｂｙＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、コラーゲン（Ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅ，ＣｅｌｌｅｘＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、およびガラス（Ｓｉｒａｎ，Ｓｃｈｏｔｔ Ｇｌａｓｓｗａｒｅ）のような材料で入手可能である。これらのキャリアーは攪拌された、液化されたまたは固定された床培養系に種々に適している。
【０１０１】
キャリアーの物理的特性は周知であるので、実験で用いたキャリアーの数を計算するのは容易である。記載されたキャリアーのいくつかおよび多くのその他のものは、正確に重量を測定することができ、引き続いて、液体培地中で膨潤させることによって調製することができる乾燥した製品として利用できる。加えて、マイクロキャリアー培養を接種するのに用いられる細胞の数は算定し、変化させることができる。例えば、ビーズ当たり６細胞で接種されたＣｙｔｏｄｅｘ３（２ｇ／リットル）の培養が、その上に４８００万細胞／リットルが５×１０４細胞／ｃｍ２の密度にて増殖される８００万マイクロキャリアーを含有する培養を与える。
【０１０２】
マイクロキャリアーで増殖させた細胞の収穫、またはマイクロキャリアーからの標識の遊離（後記参照）は細胞の酵素脱着によって、および／または適用可能であればキャリアーの消化によって達成することができる。ゼラチンキャリアーはトリプシンおよび／またはＥＤＴＡ、コラゲナーゼを用いるコラーゲンキャリアーおよびデキストラナーゼを用いるデキストランキャリアーによって可溶化させることができる。
【０１０３】
固体または多孔性マイクロキャリアーに加えて、細胞は埋め込みによってグループ化することができ、すなわち、培地浸透性バリアー内に閉じ込めることができる。浸透性透析膜が細胞の群を保持するが、培養基およびその構成要素が内部および外部区画で自由に交換できるようにする場合、膜培養系が開発されている。中空繊維カートリッジにおける細胞培養も開発されており、多数の繊維およびターン−キー系が（例えば、Ａｍｉｃｏｎ，ＣｅｌｌｅｘＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓから）商業的に入手可能である。細胞が吸着、共有結合、架橋またはポリマーマットリックスへの捕獲によって満たされる場合、半固体マトリックスにおける細胞カプセル化も開発されている。用いられてきた材料はゼラチン、ポリリシン、アルギネートおよびアガロースを含む。典型的なプロトコルはその通常の増殖培地において細胞の懸濁液と４０℃の５％アガロースを混合し、等用量のパラフィン油を用いて混合物を乳化し、氷浴中で冷却することであり、８０〜２００μｍ直径の球を生じさせる。これらの球は油から分離することができ、組織培養容器中の培地に移すことができる。
【０１０４】
細胞捕獲は、マイクロキャリアーまたは多孔性基材の使用と同様に、細胞の群の固定化のための簡単な方法である。単純な技術は、（Ｓｉｇｍａから全て入手可能な）ＤＥＡＥ、ＴＬＣ、ＱＡＥ、ＴＥＡＥのようなセルロース繊維に細胞をからませることである。他のより巧妙な工夫は、Ｏｐｔｉｃｅｌ培養系（ＣｅｌｌｅｘＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）におけるような懸濁液細胞に適したセラミックカートリッジである。
【０１０５】
当業者であれば、細胞ユニットを作る前記方法に加えて、神経球または胚様体のような細胞の３Ｄ培養の形成、または組織および、事実、ＤｒｏｓｏｐｈｉｌａまたはＣ．ｅｌｅｇａｎｓのような完全な生物の使用を含む、細胞のグループ分けを作り出す他の方法を考えるであろう。
【０１０６】
それらが構成される細胞ユニット、または基材は、限定されるものではないが、タンパク質、核酸または薬物のような他の化学物質を含む特定の因子と会合させることができる。基材のプレコンディショニングは、例えば、単純に、基材を注目する因子と共にインキュベートすることによって、あるいは前記因子を基材に共有結合または非共有結合させることによって、多くの方法で達成することができる。可溶性因子は含浸によって乾燥した材料に一体化させることができる。この技術は可溶性因子を担う液体の急速な進入、同時に膨潤し、直ちに使用できるようになる乾燥した多孔性材料に頼る。固体因子は、例えば、トロンビン溶液とフィブリノーゲン中の因子とを混合することによって取り込むことができ、その時点で、前記因子を含有するフィブリンクロットが形成される。前記因子を他の細胞と一緒に含浸し、捕獲し、またはカプセル化することに加え、細胞群と因子とを会合させる多くの他の方法が考えることができる。
【０１０７】
細胞群と多数の異なる因子とを会合させるための方法は、引き続いて、特定の細胞群と会合される因子のプレ−フォームカクテルである。第二の方法は多数の因子における細胞群を系列的に条件付けすることである。その例として細胞群増殖基材の乾燥した処方を用い、この方法は、第一の因子を含有する溶液中で基材をまず部分的に膨潤させ、引き続いて、さらに第二の因子を含有する溶液中のそれを膨潤させ、その結果、双方の因子が会合するようになる基材が得られることを含む。細胞群と異なる因子の異なる組合せとを会合させる系列的なプロトコルを工夫することによって、因子の組のいずれかの組合せの細胞群に対する効果をサンプリングすることが可能である。
【０１０８】
細胞ユニットを因子と共に条件付けするのに用いられる方法とは無関係に、前記因子は、その細胞ユニットを含む細胞によって取り込まれる。増殖培地に漏れる因子は、その濃度が物理生理学的に関連する限界未満となり、それらが、暴露されたいずれかのさらなる細胞群に対して影響を有しない程度まで希釈される。例えば、細胞ユニットの部分を形成する基材からの因子の拡散は、材料の性質および寸法、平均ポア直径、および因子の分子量および濃度のようなパラメーターによって支配される。必要であれば、前記プロセスをキャリブレートするために、ＨＰＬＣ分析または標識された因子培地への放出のような物理的アッセイによって、あるいは神経栄養因子についての後根神経節外植バイオアッセイのような生物学的アッセイによって、因子放出を測定することができる。
【０１０９】
＜細胞のコンビナトリアル系列培養＞
＜スプリットプール細胞培養＞
細胞ユニット（特に、顕微鏡的細胞ユニット）の形成は、多数の組織培養条件をサンプリングするのにさらに有用である。というのは、各細胞ユニットは、種々の細胞培養条件に暴露することができる容易に取り扱われるユニットを構成するからである。単純のために、この議論においては、我々は、マイクロキャリアー培養において細胞を増殖することによって細胞のグループ分けが作成されると仮定しており、用語細胞ユニット、細胞群、コロニーおよびビーズは相互交換的に用いられる。しかしながら、記載した方法はいずれの細胞ユニットにも、例えば、前記したものに同等に適用することができる。非常に多数の細胞培養条件をサンプリングするための特に効果的な方法は、コンビナトリアル細胞培養またはスプリットプール細胞培養といい（図１および２）、１つの実施形態においては、細胞培養条件の複数の組合せをサンプリングするための細胞ユニットの群の系列的サブ分割および組合せを含む。本発明の一つの態様において、前記方法は、細胞ユニットの初期スターター培養（または異なるスターター培養）を（各々が異なる培養条件下で別々に増殖された複数ビーズ（群／コロニー／キャリアー）を含有する）アリコットのＸ１数で割ることによって行われる。所与の時間の間の細胞培養に続き、細胞ユニットは、異なるアリコットからのビーズを組合せ、混合することによってプールすることができる。このプールはアリコットのＸ２数に再度分割することができ、その各々はある時間異なる条件下で培養され、引き続いてプールもされる。細胞ユニットを分割し、培養し、およびプールする（またはプーリング、分割および培養；どこで前記周期に入るかに依存）この反復手法は、細胞培養条件の多くの異なる組合せの系列的サンプリングを可能とする。実験に複雑性、換言すれば、テストした細胞培養条件の異なる組合せの数は各ラウンドでサンプリングした異なる条件の数の積（Ｘ１×Ｘ２×．．．Ｘｎ）に等しい。引き続いての分割に先立って全ての細胞ユニットをプールする工程は任意とすることができ−限定された数の細胞ユニットがプールされる工程は、図３および４に示したように同一の効果を有することができることに留意のこと。本発明は、従って、細胞ユニットの群がひとまとめで取り扱われる場合に、細胞培養条件の多数の組合せを系列的にサンプリングする多数の関連方法を具体化する。
【０１１０】
多様な細胞培養条件がこの手段によってサンプリングできる正確な方法とは無関係に、前記手法は効果的である。なぜならば、多数の細胞ユニットが同一の条件下で培養される場合、単一の容器を共有することができ、それはいずれの時点においても少数の培養容器のみを用いて行うことができるからである（用いる培養容器の数は分割された試料の数と等しい）。多くの点で、この手法の原理は、化学的な形成ブロック基の間の結合の全ての可能な組み合わせをサンプリングする（コンビナトリアル・ケミストリーとして知られた）大きな化学ライブラリーの分割合成の原理と似ている（例えば、ＣｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌＣｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ（２０００），Ｈｉｃｈａｍ Ｆｅｎｎｉｒｉ（編集者）参照）。分割プール細胞培養は、いずれかの数のラウンドにわたって繰り返すことができ、いずれかの数の条件は各ラウンドでサンプリングすることができる。細胞ユニット（またはこの例においてはコロニー化されたビーズ）の数が全てのラウンドにわたってサンプリングされた異なる状態の数よりも大きい、または等しく、かつ細胞ユニットの分割が全くランダムに起こると仮定する限り、実験によってサンプリングされた培養条件の種々の組合せの各々に従って培養された少なくとも１つの細胞ユニットがあると予測される。この手法を用いて、いずれかの細胞型についての増殖または分化条件、いずれかの細胞型による生体分子生産（例えば、エリスロポエチンまたはインターフェロンの生産）の効率をサンプリングすることができる。前記手法は反復的であるゆえに、複数の組織培養プロトコル−例えば幹細胞分化と組み合わせた前記のもののテストに理想的に適合する。この技術を用いてサンプリングすることができる変数は細胞型、細胞グループ分け（例えば、マイクロキャリアー培養、細胞カプセル化、全生物）、増殖基材（例えば、マイクロキャリアー上のフィブロネクチン）、細胞培養ラウンドの持続、温度、（構成要素の異なる濃度を含む）異なる培養基、成長因子、条件培地、種々の細胞型（例えば、フィーダー細胞）との共培養、動物または植物抽出物、薬物、他の合成化学物質、ウイルス（トランスジェニックウイルスを含む）での感染、導入遺伝子の添加、アンチセンスまたは抗遺伝子分子（例えば、ＲＮＡｉ、三重らせん）の付加、（生物の場合における）感覚入力、電気、光またはレドックス刺激体などを含む。
【０１１１】
＜分割−分割細胞培養＞
細胞ユニット上でスプリットプールプロセスを行う目的は、条件の予め規定された組合せにこれらを系統的に暴露することである。当業者であれば、この結果を達成する多くの異なる手段を考え付くであろう。分割プールプロセスおよびその変形に加えて、分割−分割（ｓｐｌｉｔ−ｓｐｌｉｔ）プロセスを軽く議論するのは価値あることである。分割−分割プロセスは、細胞ユニットのプーリングに介入することなく、細胞ユニットの群を少なくとも２回サブ分割することを含む（図５）。もし分割−分割プロセスが大きな数のラウンドにわたって用いられれば、生じた別々の試料の数は指数関数的に増大する。この場合、あるレベルの自動化、例えば、ロボットプラットフォームおよび巧妙な試料トラッキングシステムの使用を用いるのが重要である。分割−分割工程の利点は、（細胞ユニットが組み合わせられていないので）、それらの細胞培養履歴に基づいて種々の細胞ユニットの系統を分離することが可能である。その結果、分割−分割工程を用いて、特定の細胞培養条件がいずれかの所与の細胞プロセスを担うかを推定することができ、従って、（図６で説明された、および「Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｏｆ ｃｕｌｔｕｒｅｈｉｓｔｏｒｙ ｏｆａ ｃｅｌｌｕｎｉｔ」下で詳細に説明された）細胞ユニットの培養履歴を推定することができる。
【０１１２】
＜所定のプロトコル＞
細胞ユニットの分割および／またはプーリングは全くランダムに達成することができるか、あるいは所定のプロトコルに従うことができる。細胞にユニットがランダムに分割および／またはプールされる場合、与えられた細胞ユニットのいずれかの群への分離は断じて所定のものであったり、妥当性を損なうものではない。少なくとも１つの細胞ユニットが細胞培養条件の可能な組合せの１つに暴露される高い確率がもたらされるためには、テストされるべき細胞培養条件の組合せの合計数よりも大きな数の細胞ユニットを使用するのが有利である。従って、ある種の条件下では、所定のプロトコルに従って細胞ユニットを分割しおよび／またはプールするのが有利であり、総じての効果は、偶発的な複製または省略が妨げられるということである。細胞ユニットの所定の取扱は、所望により、予め計画し、スプレッドシートまたはコンピュータプログラム、および自動化プロトコル、例えば、ロボットを用いて実行される分割および／またはプーリング操作にログすることができる。細胞ユニットの標識（後記参照）は多数の手段、例えば、ＲＦＩＤによる標識、光学タグ付けまたは空間的暗号化のいずれかによることができる。試料の同時性を決定し、従って、所定のプロトコルに従って試料を分割することができるロボットデバイスが記載されている（「ＣｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌＣｈｅｍｉｓｔｒｙ Ａｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｒｏｒｃｈ」）、ＯｘｆｏｒｄＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ（２０００）ＥｄＨ．Ｆｅｎｎｉｒｉ参照）。あるいは、標準研究所液体取扱および／または組織培養ロボット（例えば、ＢｅｃｋｍａｎＣｏｕｌｔｅｒ Ｉｎｃ．Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ，ＣＡ；ＴｈｅＡｕｔｏｍａｔｉｏｎ Ｐａｒｔｎｅｒｓｈｉｐ，Ｒｏｙｓｔｏｎ，ＵＫによって製造されたような）は、多数の試料の同一性を空間的に暗号化し、予めプログラムされたプロトコルに従ってこれらを付加し、除去し、または移動させることができる。
【０１１３】
＜細胞ユニットの分析および／または分離＞
細胞培養の各ラウンドに続き、または規定された数のラウンドの後、細胞ユニットを調べて、組織培養条件によって影響され得るいずれかの所定の細胞プロセスを観察することができる。以下の例は説明的であって、本発明の範囲を限定する意図のものではない。
【０１１４】
細胞培養の各ラウンドに続き、規定された数のラウンドの後、細胞ユニットをアッセイして、増大した細胞増殖を提示するメンバーがあるか否かを決定することができる。これは、種々の技術によって、例えば、顕微鏡下で細胞ユニットの視覚での精査によって、あるいは細胞に特徴的なマーカー産物を定量することによって達成することができる。これは、特定のＤＮＡ配列のような内因性マーカー、あるいはリガンドまたは抗体によって検出することができる細胞タンパク質であり得る。あるいは、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）のような外因性マーカーをアッセイすべき細胞ユニットに導入して、（生きた）細胞の特定の読みを提供することができる。生きた細胞は種々の活性な染色を用いて可視化することができるか、あるいは逆に、死滅した細胞は種々の方法を用いて、例えばヨウ化プロピジウムを用いて標識することができる。さらに、標識された細胞ユニットは、アフィニティー精製（「パンニング」）を含む手動および自動双方の種々の技術によって、あるいは蛍光活性化細胞ソーティング（ＦＡＣＳ）または広く同様な技術によって標識されていないものから分離することができる（図１７）。適用に応じて、標準的な実験室器具を用いることができるか、あるいは特殊化機器を用いるのが有利であろう。例えば、ある種の分析およびソ−ティング機器（例えば、ＵｎｉｏｎＢｉｏｍｅｔｒｉｃａ Ｉｎｃ．，ＳｏｍｅｒｖｉｌｌｅＭＡ，ＵＳＡ）は１ミリメートルまでのフロー細胞直径を有し、これは、５００ミクロンまでの直径を持つビーズのフローソーティングを可能とする。これらの機器はビーズサイズおよび光学密度ならびにＧＦＰ、ＹＦＰまたはＤＳ−赤色のようなダグからの２つの蛍光発光波長の読みを提供する。１時間当たり１８０，０００ビーズのソーティングスピードおよび複数ウェルプレートへの、またはバルク受容体への分配は可能である。
【０１１５】
細胞培養の各ラウンドに続き、または規定された数のラウンドの後、細胞ユニットをアッセイして、特定の遺伝子型または表現型を提示するメンバーがあるか否かを決定することができる。遺伝子型の決定はポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、蛍光インサイチューハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）、ＤＮＡ配列決定などのような周知の技術を用いて行うことができる。表現型決定は、種々の技術によって、例えば、顕微鏡下での細胞ユニットの視覚精査によって、あるいは細胞に特徴的なマーカー産物を検出することによって行うことができる。これは特定のＤＮＡまたはＲＮＡ配列、またはリガンド、酵素基質の変換によって検出することができる細胞タンパク質、特定の表現型マーカーを認識する抗体のような内因性マーカーであり得る（例えば、ＳｔｅｍＣｅｌｌｓ：Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｒｏｇｒｅｓｓ ａｎｄ Ｆｕｔｕｒｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｄｉｒｅｃｔｉｏｎｓ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ．Ｊｕｎｅ ２００１のＡｐｐｅｎｄｉｘＥ参照；本明細書に参照して付録を組み込む）。遺伝子マーカーは外因性とすることができ、すなわち、例えば、トランスフェクションまたはウイルス導入によって細胞集団に導入されたものであり得る。外因性マーカーの例は蛍光タンパク質（例えば、ＧＦＰ）、または特定の細胞系統で正常に発現されない、またはエピトープ−修飾された、または異なる種からの細胞表面抗原である。関連する転写制御エレメントを持つトランスジーンまたは外因性マーカー遺伝子は、内因性遺伝子に代表的なパターンを反映するように発現することができる。これは、遺伝子を最小細胞型特異的プロモーターと会合させることによって、あるいはトランスジーンを特定の遺伝子座に組み込むことによって達成することができる（例えば、欧州特許番号ＥＰ０６９５３５１参照）。標識された細胞ユニットは、アフィニティー精製（「パニング」）を含む手動および自動双方の種々の技術によって、あるいは蛍光活性化細胞ソーティング（ＦＡＣＳ）によって未標識のものから分離することができる。Ｎｉｓｈｉｋａｗａｅｔ ａｌ．（１９９８，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｖｏｌ １２５，ｐ１７４７−１７５７）は、全能性マウスＥＳ細胞の分化を追跡するために抗体によって認識される細胞表面マーカーを用いた。ＦＡＣＳを用い、それをその分化における種々の段階で造血系統の細胞を同定し、精製することができた。
【０１１６】
特定の遺伝子型または表現型の細胞ユニットを豊富化するための代替または補充的な技術は、所望の群を遺伝子的に選択することである。これは、例えば選択マーカーを細胞ユニットに導入することによって達成することができ、選択条件下での生存率についてアッセイするためには、例えば、分化したＥＳ細胞からインスリン分泌細胞を選択するそのようなシステムを用いたＳｏｒｉａｅｔ ａｌ．（２０００，Ｄｉａｂｅｔｅｓｖｏｌ ４９，ｐ１−６）参照。Ｌｉｅｔ ａｌ．（１９９８，ＣｕｒｒＢｉｏｌ ｖｏｌ８，ｐ ９７１−９７４）は、（β−ガラクトシダーゼ活性およびＧ４１８抵抗性を提供する）二官能性選択マーカー／レポーターβｇｅｏを、マウスＥＳ細胞において相同組換えによってＳｏｘ２遺伝子座に組み込むことによって神経先祖を同定した。神経先祖の特徴の１つはＳｏｘ２の発現および、従って、組み込まれたマーカー遺伝子であるので、これらの細胞は、レチノイン酸を用いる分化の誘導後におけるＧ４１８の添加によって非ニューロン系統から選択することができた。細胞の生存率は、顕微鏡下での精査によって、あるいはβ−ｇａｌ活性をモニタリングすることによって測定することができた。適当なリガンドまたは抗体の入手可能性によって制限され得る表現型ベースの選択アプローチとは異なり、遺伝子選択はいずれかの差異的に（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ）発現された遺伝子に適応することができる。
【０１１７】
＜細胞ユニットの同一性または細胞培養履歴の決定＞
非常に多数の細胞ユニットを取り扱う場合、その同一性および／または細胞培養履歴（例えば、いずれかの１つの群またはユニットが暴露されたであろう一連の培養条件の年代学および正確な性質）は混乱しかねない。例えば、細胞培養の分裂プールプロトコルは各ラウンドにおける細胞ユニットの混合を含み、それを個々のユニットに従うのを困難とする。複数培養条件に供された細胞ユニットの混合物における細胞ユニットの細胞培養履歴の決定は、時々、細胞培養履歴の「脱回旋」と言う。これを成す１つの方法は細胞ユニットを標識することであり、従って、細胞ユニットを標識するのは有利である。標識は実験の開始時、実験の各ラウンドの間に行うことができ、ユニークな標識（実験の間に修飾することができるか、またはできない）、またはユニークな集合を含む一連の標識を含むことができる。同様に標識の読みは、各ラウンドの間にまたは単純に実験の最後に行うことができる。好ましくは、ＲＦＩＤ標識のようなユニークな標識は各ラウンドの間に読まれ、他方、各ラウンドにおいて系列的に付加された標識は実験の最後に読まれる。
【０１１８】
細胞ユニットの標識は種々の手段、例えば、細胞それ自体の標識、あるいは細胞が付着した、そうでなければ会合したいずれかの物質によって達成することができる。合成コンビナトリアルライブラリーをコードするのに用いられた化学的および非化学的方法のいずれも、この目的のために適合させることができ、これらのいくつかは、その全てを本明細書に参照して組み込むＭｅｔｈｏｄｓｉｎ ＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙＶｏｌ ２６７（１９９６），「ＣｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌＣｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｊｏｈｎ Ｎ．Ａｂｅｌｓｏｎ（Ｅｄｉｔｏｒ）；Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，ＯｘｆｏｒｄＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ（２０００），ＨｉｃｈａｍＦｅｎｎｉｒｉ（Ｅｄｉｔｏｒ）；Ｋ．Ｂｒａｅｃｋｍａｎｓ ｅｔ ａｌ．，「Ｓｃａｎｉｎｇ ｔｈｅ ｃｏｄｅ」Ｍｏｄｅｒｎ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（Ｆｅｂ．２００３）；Ｋ．Ｂｒａｅｃｋｍａｎｓｅｔ ａｌ．，「Ｅｎｃｏｄｉｎｇｍｉｃｒｏｃａｒｒｉｅｒｓ；Ｐｒｅｓｅｎｔ ａｎｄ Ｆｕｔｕｒｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ」；Ｎａｔｕｒｅ ＲｅｖｉｅｗｓＤｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ，ｖｏｌ．１，ｐ．４４７−４５６（２００２）に記載されている。標識方法のいくつかの例は以下の通りである。
【０１１９】
細胞ユニットを標識する１つの方法は、順次に修飾されるようになるタグと細胞ユニットとを会合させることを含む。というのは、それを異なる培養条件に置くからである。これは、その立体化学、配列または質量が改変されるようなタグへのさらなるユニットの付加または減算；あるいはリードライトＲＦトランスポンダにおけるような電子メモリの改変を含むことができる（以下参照）。
【０１２０】
細胞ユニットを標識するもう１つの方法は、タグの引き続いての検出および同定が、それに細胞ユニットが暴露された細胞培養条件の年代学および同一性の明確な記録を提供するように、それらが異なる条件下で培養された場合には常にユニークなタグを細胞ユニットと順次に会合させることを含む。タグは細胞によって摂取できるか、あるいは吸着、または適当なリガンドまたは抗体によって細胞表面に付着させることができるか、あるいは吸着によるキャリアー、コロイド力または共有結合または非共有結合、例えば、ビオチン−ストレプトアビジン結合のような種々の結合によるキャリアーのような細胞会合マトリックスにコンジュゲートさせることができる。例えば、細胞に導入することができるか、あるいは細胞に会合したマトリックスに付着させることができる１つの単純なタグは、規定された長さおよび／または配列のオリゴヌクレオチドである。オリゴヌクレオチドはいずれかのクラスの核酸（例えば、ＲＮＡ、ＤＮＡ、ＰＮＡ、線状、環状またはウイルス）を含むことができ、増幅用の特異的な配列（例えばＰＣＲについてのプライマー配列）または検出用の標識（例えば、フルオロフォアまたはクエンチャー、同位体タグ）を含むことができる。これらの検出は、例えば、オリゴ配列決定することによって、あるいはそれらを（例えば、アレイまたはチップ上の）相補的な配列にハイブリダイズさせることによって、直接的であり得るか、あるいはオリゴヌクレオチドコード遺伝子産物のモニタリング、またはヌクレオチドと細胞活性との干渉（例えば、特定遺伝子のアンチセンス阻害）によって間接的であり得る。核酸を増幅する有利な方法は、核酸タグがＲＣＡ鋳型、伸長プライマー、または小円鋳型の環状化を助けるストルット（ｓｔｒｕｔ）を含むことができる場合には、ローリングサークル増幅（ＲＣＡ；２００２，Ｖ．Ｄｅｍｉｄｏｖ，ＥｘｐｅｒｔＲｅｖ．Ｍｏｌ．Ｄｉａｇｎ．２（６），ｐ．８９−９５）による。
【０１２１】
ペプチドタグ、着色または蛍光化合物、第二級アミン、ハロカーボン、安定な同位体の混合物などを含む、いずれの分子または高分子タグも、それが検出できる限り用いることができる。タグは細胞ユニットに直接的に、あるいは中間物質、例えば、細胞ユニットの構成要素に対して生起された抗体を介して、あるいはビオチン−ストレプトアビジンのような相互作用対を介して細胞ユニットに付着させることができる。加えて、タグは細胞培養の構成要素によって、例えば、化学的または他の修飾によって、またはカプセル化によって分解に対して保護することができる。タグのカプセル化は多くの異なる媒体中で、例えば、ＢａｎｇｓＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ．（Ｆｉｓｈｅｒｓ ＩＮ，ＵＳＡ）のような供給業者から入手できるビーズの多くのタイプで行うことができ、カプセル化を用いて、タグ増幅および／または検出用の構成要素を供することに加えて、タグの量を標準化することができる（例えば、ＤＮＡタグでの使用のためにＰＣＲプライマーを提供することによって）。細胞ユニットを標識する好ましい方法は、ＬｕｍｉｎｅｘＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ａｕｓｔｉｎ，ＴＸ，ＵＳＡ）によって製造されるもののような蛍光ビーズを使用する。前記Ｌｕｍｉｎｅｘシステムは（例えば、アビジンまたは抗体で）外部的に誘導体化することができるか、またはしなくてもよいポリスチレンビーズを含み、異なる比率の２つのスペクトル的に区別されるフルオロフォア、および各バンドのスペクトルシグニチャーを特徴付けることができるリーダーで内部的に染色される。さらなる好ましい方法は、ＢａｎｇｓＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ．（Ｆｉｓｈｅｒｓ ＩＮ，ＵＳＡ）によって製造されたもののようなビーズを使用する。前記Ｂａｎｇｓシステムは、異なるサイズ（例えば、４．４μｍおよび５．５μｍ直径のビーズの組）に基づいて区別することができるビーズ組を含む。各組内のビーズは、さらに、単一蛍光色素での異なる負荷による異なる蛍光強度に基づいて相互に区別することができる。内部的に負荷することができるか、あるいは多数の手段によって外部的にキャリアーに付着されることができる異なる吸収または発光特徴を持つ多くの異なる色素を用いることができる。さらに、便宜に読むことができる非常に多数の異なる蛍光標識を得るのに「量子ドット」を用いることができる。
【０１２２】
細胞ユニットの形成との関連で記載されたもののような細胞増殖基材は、タグ付けを容易とし、細胞増殖と干渉しない物質で誘導体化するか、またはコートすることができる。キャリアーを誘導体化する好ましい方法は、タグがそれにストレプトアビジンまたはアビジンを介して結合することができるビオチンと共有結合または非共有結合するように修飾する。一般に、それ自体は細胞効果を誘導せず（すなわち、不活性タグ）かつ細胞ユニットまたは培養基に存在する分子から識別することができ、かつその標的に結合することができ、引き続いて、そのような分子のバックグラウントで検出することができるタグを用いるのが重要である。検出を容易とするためには、細胞ユニットからタグを選択的に溶出させるか、選択条件を用いて細胞ユニットから細胞を追い出すのが有利であろう。より複雑な分子タグ付け戦略も考えることもでき、これは、分子タグの組およびその混合物に割り当てられた二元暗号の組によって情報が記録される「二元暗号化」の戦略を含む。
【０１２３】
タグの検出は、当業者が精通した教示の方法によって達成することができる。前記方法は質量分析、核磁気共鳴、配列決定、ハイブリダイゼーション、抗原検出、電気泳動、分光分析、顕微鏡観察、イメージ分析、蛍光検出などを含む。
【０１２４】
特に興味深いものの中には、標識が一回のみ行われるか、あるいは標識および／または検出が非物理的であり、従って、非侵入的である標識または暗号化戦略がある。高周波数同定（ＲＦＩＤ）は、これらの特性を呈する系の例である。ＲＦＩＤはトランスポンダ（ＲＦタグ）、アンテナおよびリーダーを使用する。ＲＦタグは、適当なエレクトロニクスによって、接触または照準線なしで「読む」ことができるユニークな同定暗号に対するアクセスを、その最も単純な形態において提供する、通常はガラスまたはプラスチックに入れられた小さな電子回路である。タグは、再度、接触または照準線なしで、ユーザーによって生じた情報を貯蔵することができる。「リーダー」は、１以上のタグへのおよび１以上のタグからの情報を移動させる電子ユニットである（用語リーダーは、読み出し専門および読出／書込ユニット双方を意味すると相互交換的に使用されることに注意すべきである）。リーダーのサイズおよび特徴はかなり変化することができ、それは単離において作動することができ、あるいは遠隔コンピューターシステムに接続することができる。アンテナはリーダーからタグへの情報を伝達し、ＲＦタグによって送られた情報を受け取るように用いられる。アンテナのサイズおよびフォーマットは特定の適用を反映し、小さな回路ホイルから大きな平面構造までの範囲とすることができる。ＲＦＩＤシステムは単離において作動することができるか、あるいは同定のより包括的解釈および操作のための遠隔コンピューター、およびタグに由来する関連データに接合することができる。コンビナトリアル・ケミストリーで用いられる１つのＦＲＩＤ戦略はＮｉｃｏｌａｏｕｅｔ ａｌ．（１９９５，ＡｎｇｅｗＣｈｅｍ ＩｎｔｌＥｄ Ｅｎｇｌ，ｖｏｌ．３４，ｐ．２２８９）に記載されており、これは、（ｉ）合成基材および半導体タグを含有する多孔性エンクロージャー；（ｉｉ）固相合成樹脂；（ｉｉｉ）高周波数シグナルを受信し、貯蔵し、および発信できるガラスに入れた単一または複数アドレス可能な高周波数タグ半導体ユニットを含む。同様なデバイスを、固相合成樹脂を組織培養マイクロキャリアーまたは適当な細胞ユニットで置き換えることによって増殖および追跡細胞ユニットに適合させることができよう。このより多くの変形が考えられ、限定されるものではないが、細胞がその上で直接的に増殖される（被覆または未被覆）ＲＦタグまたは細胞ユニットまたは生物に移植されたＲＦタグを含む。
【０１２５】
従って、タグは、最初の例においては、その化学的または分子的構造によって必ずしも識別される必要はない。非化学的タグ付け戦略の多くの変形を工夫して、混合物中における所与の細胞ユニットの同一性を決定することができ、あるいは混合物を含む異なる細胞ユニットの同一性を推定することができる。例えば、異なる形状の物体、グラフ的にエンコードされた物体、または異なる色が試料の同一性を示す場合（例えば、１９９８，Ｇｕｉｌｅｓｅｔ ａｌ．，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．ＩｎｔｌＥｄ Ｅｎｇｌ，ｖｏｌ．３７，ｐ９２６；ＬｕｍｉｎｅｘＣｏｒｐ，Ａｕｓｔｉｎ ＴＸ，ＵＳＡ；ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ；Ｍｅｍｏｂｅａｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｇｈｅｎｔ，Ｂｅｌｇｉｕｍ）、あるいはパターンまたはバーコードが、セラミックバーのような基材にエッチングされ、パターン認識技術を用いて認識される場合（例えば、１９９７，Ｘｉａｏｅｔ ａｌ．，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．ＩｎｔｌＥｄ Ｅｎｇｌ，ｖｏｌ．３６，ｐ７８０；ＳｍａｒｔＢｅａｄＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｂａｂｒａｈａｍ，ＵＫ）、タグ付けの光学的または可視的方法が記載されている。
【０１２６】
細胞ユニットを追跡するまたは標識するさらなる方法は、空間的にすなわち、空間におけるその位置によって、それらの同一性をエンコードすることである。この方法において、異なる細胞ユニットが規定された相対的位置に分離され、これらの位置はユニットの同一性を示すか、またはエンコードする。例えば、細胞ユニットはアレイが培養することができ、それにより、各ユニットの同一性および／または培養履歴が知られており、アレイにおける特定の位置に結合させる。それらの最も単純な形態において、そのようなアレイは、スライドグラスまたは他の表面上の組織培養フラスコ、複数ウェルプレートのウェル、または位置のコレクションを含むことができる。位置暗号化戦略の例はＧｅｙｓｅｎｅｔ ａｌ．で見出すことができる。（１９８４，ＰｒｏｃＮａｔｌ ＡｃａｄＳｃｉ ＵＳＡｖｏｌ．８１，ｐ．３９９８−４００２），Ｆｏｄｏｒ ｅｔ ａｌ．（１９９１，Ｓｃｉｅｎｃｅ ｖｏｌ．２５１，ｐ．７６７−７７３），Ｚｉａｕｄｄｉｎ ａｎｄＳａｂａｔｉｎｉ（２００１，Ｎａｔｕｒｅ，Ｖｏｌ．４１１，ｐ．１０７−１１０），ａｎｄ Ｗｕｅｔ ａｌ．（２００２，Ｔｒｅｂｎｄｓ，ＣｅｌｌＢｉｏｌ．Ｖｏｌ．１２（１０），ｐ．４８５−８）。
【０１２７】
本発明は、その各々が、本発明の多数の順列を形成するように組み合わせることができる多くの形態を有することができる、多くの様相を有する。細胞ユニットの全てを標識して、細胞培養プロトコルの組合せから得られた結果についての情報を推定できる必要がないのは明らかであろう。従って、細胞ユニットの標識なしで、本発明に従って細胞培養条件の大きな組合せをアッセイし、これらの１以上が特定の細胞効果をもたらすことができるか否かを判断するのは依然として可能であろう。しかしながら、細胞ユニットは好ましくは標識される。細胞ユニットの標識は、全ての細胞ユニットは反対に、標識された細胞ユニットによってサンプリングされた特定の条件の結果に関して実験からの有用な情報の引き出しを可能とする。あるいは、ある培養プロトコルに全てが暴露された細胞ユニットの１または数個の群、例えば、特定の分割またはプール工程の間に同一媒体に分離されている細胞ユニットの群を標識するのが時々有利である。また、ある細胞ユニットの標識が、他の（おそらくは、未標識の）細胞ユニットの同一性を推定するのを可能とするのも明らかであろう。
【０１２８】
同様に、種々の条件が省略された細胞培養実験の実行は、特定の実験結果に対するそれらの条件の利用性に関して情報を与えることができるのは明らかであろう。従って、実験を数回繰り返すことによって本発明に従った方法でサンプリングされた条件の各々を評価するのは可能であり、各回は条件の異なる組を省略する。
【０１２９】
また、分裂細胞培養工程を用いて、実験結果に対する条件の特定の組の結果を判断することもできる。事実、分割工程は、分岐の時点におけるユニークな細胞培養条件に各々が暴露された細胞ユニットの特定の系統の形成をもたらす。異なる系統を調べることによって、特定の実験結果に関して、分岐点において調べた組織培養条件の利用性を判断することができる（図６）。
【０１３０】
以下の実施例において本発明をさらに記載する。
【実施例１】
【０１３１】
＜分裂プール細胞培養を用いるＥＳ細胞ユニットの分化＞
分裂プール培養実験を行って、未分化マウスＥＳ細胞のスターター培養を用い、ドーパミン作動性表現型のニューロンを生起させることができる組織培養条件をアッセイした。
【０１３２】
未分化ＥＳ細胞を、１５％ＦＣＳ、１００ｍＭ ＭＥＭ非必須アミノ酸０．５５ｍＭ ２−メルカプトエタノール、Ｌ−グルタミンおよび抗体（全てＧＩＢＣＯ／ＢＲＬからのものである）を補足したノックアウトダルベッコの最小必須培地（ＤＭＥＭ；ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬよりなるＥＳ細胞培地中、１，４００Ｕｍｌ-1の白血病阻害因子（ＬＩＦ；Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）の存在下でゼラチン被覆組織培養プレート上で増殖させた。胚様体（ＥＢ）形成を誘導するために、０．０５％トリプシンおよびＰＢＳ中の０．０４％ＥＤＴＡによって、細胞を単細胞懸濁液に解離させ、前記した培地中で２〜２．５×１０４細胞ｃｍ−２の密度で非接着性細菌培養皿で平板培養した。ＥＢは４日間で形成し、次いで、ＥＳ細胞培地中の接着性組織培養表面に平板培養した。２４時間の培養後、無血清インスリン／トランスフェリン／セレン／フィブロネクチン（ＩＴＳＦｎ）培地によってＥＳ細胞培地を置き換え、１０日間インキュベートすることよってネスチン陽性細胞の選択を達成した。
【０１３３】
これらのネスチン陽性細胞は、分割プール培養実験のための出発物質として用いた。具体的には、細胞を０．０５％トリプシン／０．０４％ＥＤＴＡによって解離し、ほぼ１．５〜２×１０５細胞ｃｍ−２において＞１０，０００ガラスバイオスフェア（Ｗｈａｔｍａｎ，ＵＫ）に蒔いた。その後、用いた組織培養皿は非接着性材料から作成した。ポリオルニチン（１５ｍｇｍｌ-1）およびラミニン（１μｇ ｍｌ-1、共にＢｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ Ｌａｂｗａｒｅ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）を用いて滅菌ガラスビーズを予めコートした。ビーズをランダムに４つの組に分割し、その各々を、その組成を以下の表１に掲げる４つの組織培養基（Ａ１、Ａ２、Ａ３またはＡ４で表す）のうちの一つにおいてインキュベートした。これらはＪｏｈｅｅｔ ａｌ．（１９９６，ＧｅｎｅｓＤｅｖ，ｖｏｌ．１０，ｐ ３１２９−３１４０）に従って修飾されたＮ２培地に基づき、以下、これを単にＮ２培地という。
【０１３４】
【表１】
【０１３５】
ビーズの４つの組を各組織培養基に２日間暴露し、次いで、全ての４つの培養からのビーズをプールし、Ｎ２培地中で軽く洗浄し、再度、４つの組の分割し、その各々を培地Ａ１〜Ａ４の一つにおいてインキュベートした。２日後、この手法を再度反復して、培地Ａ１〜Ａ４の種々の組合せにおいて、６日間、細胞培養をサンプリングした。この後、全ての４つの培養からのビーズをプールし、Ｎ２培地で軽く洗浄し、４つの新しい組にランダムに分割し、その各々を、その組成を以下の表２に掲げた４つの新しい培地（Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３またはＢ４と命名）のうちの一つにおいてインキュベートした。
【０１３６】
【表２】
【０１３７】
培養の各ラウンドは５日間であり、次いで、全ての４つの培養からのビーズをプールし、Ｎ２培地で軽く洗浄し、４つの組に分割し、その各々を再度培地Ｂ１〜Ｂ４のうちの１つにおいてインキュベートした。この手法は、ビーズが合計１５日間Ｂ培地中に存在するように、合計３回行った。
【０１３８】
異なる培養基の組成物に含まれていたのは、少量ずつガラスマイクロキャリアー（または細胞）に接着させ、引き続いて増幅し、分析して、分割プール培養療法においていずれかの時点でマイクロキャリアービーズの所在を推定するユニークなオリゴヌクレオチド標識であった。各標識のＤＮＡ配列は、異なる培地（すなわち、培地Ａ１対培地Ａ２）および分割プール培地の２つの異なるラウンドでの同一培地（すなわち、０日対４日に用いた培地Ａ１）への暴露の間を識別するように異なった。合計２１日間にわたる種々の培地における分割プール培養療法の要約は以下の表３に掲げる。表における各エントリーは、組織培養フラスコに含まれた標識の同一性を示す（括弧に入れる）。標識の全ＤＮＡ配列は表４に示す。
【０１３９】
【表３】
【０１４０】
【表４】
【０１４１】
異なるＡ培地中で３回、続いて、異なるＢ培地中で３回幹細胞を分割プール培養することによって、４０９６の異なる組織培養プロトコルをサンプリングすることが可能であった−これは、異なるビーズが暴露された前記緩衝液の異なる組合せの合計数である。
【０１４２】
分割プール培養の最終ラウンドに続き、ビーズをプールし、Ｎ２培地中で軽く洗浄し、標準プロトコルを用いてＦＡＣＳによって分析した。簡単に述べれば、細胞をＰＢＳ中の４％パラホルムアルデヒド／０．１５％ピクリン酸中で固定した。ドーパミン作動性ニューロンを検出するために、共に製造業者の指示に従って、抗チロシンヒドロキシラーゼモノクローナル抗体（Ｓｉｇｍａ）、続いて、蛍光標識二次抗体（ＪａｃｋｓｏｎＩｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｗｅｓｔ Ｇｒｏｖｅ，ＰＡ）を用いて細胞を染色した。
【０１４３】
最高蛍光強度を持つ５つのビーズをＰＣＲプレートの別々のウェルに分類し、Ｔａｑポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，ＬａＪｏｌｌａ，ＣＡ）および以下の表５に示したプライマーを用い、オリゴヌクレオチド標識をＰＣＲの３０サイクルによって増幅した。
【０１４４】
【表５】
【０１４５】
フェノール／クロロホルム抽出、続いてのエタノール沈殿によって、ＰＣＲ産物を精製し、制限酵素ＥｃｏＲＩ（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｅｙ，ＭＡ）を用いて消化し、同様に調製されたｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ ＫＳ＋ベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，ＬａＪｏｌｌａ，ＣＡ）クローン化した。組換えベクターをコンピテントＥ．ｃｏｌｉＤＨ５αに電気穿孔し、アンピシリン抗生物質を含有する培地で平板培養した。各分析したビーズおよび調整したプラスミドＤＮＡにつき２００のコロニーを拾い、ポリリンカーの領域において配列決定した。
【０１４６】
配列決定分析は、ドーパミン作動性表現型を持つ細胞を運ぶビーズの大部分がオリゴ（Ｌ４、Ｌ８、Ｌ１２、Ｌ１６、Ｌ２０およびＬ２４）によって標識されたことを明らかとした。これらの標識をそれらの各細胞培養条件に相関させると、これらのビーズは合計６日間にわたって（０日、２日および４日）培地Ａ１に、続いて、さらに１５日の間に（６日、１１日および１６日）培地Ｂ４にこれらのビーズが分配されることを示唆した。この培養プロトコルは、前記したように、マウスＥＳ細胞を保有することによって、ドーパミン作動性ニューロンの生産に適したものであったと推定された。
【０１４７】
一旦これらの条件が確立されれば、前記プロトコルに従う（すなわち、拡大培養、ＥＢ形成、ネスチン選択など）が、分割プール培養のプロセスを受けることなく、未分化ＥＳ細胞を再度培養した。細胞をビーズの代わりに接着性組織培養プレート上で増殖させ、オリゴヌクレオチド標識は異なる培養基に添加せず、成功した培養条件のみをアッセイした。このように多数のドーパミン作動性細胞が生産でき、遺伝子発現のパターンにつきテストした。全ＲＮＡは培養プロトコルの４つの段階から得られた細胞から取り出した。（１）多能性ＥＳ細胞集団；（２）胚様体；（３）ネスチンについての選択を受けている解離し平板培養した細胞；および（４）緩衝液Ａ４中で培養したネスチン陽性細胞。逆転写酵素およびランダムヘキサマーでのプライミングを用いてｃＤＮＡを調製し、アクチン転写体の量を種々の試料の間で正規化した。表６に示したプライマーを用いて神経ｃＤＮＡを調製した。
【０１４８】
【表６】
【０１４９】
また、表６は、種々の遺伝子の転写体がＲＴ−ＰＣＲによって検出された段階の示す（括弧は痕跡量の検出を示す）。これらの結果からＥｎ１、Ｐａ２、Ｐａｘ５、Ｗｎｔ１およびＮｕｒｒ１は、ドーパミン作動性運命に予定された細胞のための適当なマーカーであると推定された。逆に、多能性幹細胞のそのような遺伝子、例えば、Ｎｕｒｒ１でのトランスフェクションの結果、インビトロでドーパミン作動性表現型を関係付けることができた（Ｗａｇｎｅｒｅｔ ａｌ．，１９９９，ＮａｔｕｒｅＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．１７，ｐ ６５３−６５９）。
【実施例２】
【０１５０】
＜ＨｅｐＧ２細胞ユニットの分割プール細胞培養＞
分割プール培養実験を行って、特定の細胞プロセス、すなわち、チトクロームＰ４５０（ＣｙＰ４５０）代謝酵素の発現および／または活性に影響し得る組織培養条件をアッセイした。１Ａ１および１Ａ２のようなこのクラスの酵素のメンバーは基質、すなわち、酵素的に加水分解されて生成物である、ＣｙＰ４５０酵素活性を測定するのに用いることができる区別される蛍光特徴を有するレソルフィンを生じるエトキシレソルフィンの使用でアッセイすることができる。ＣｙＰ４５０酵素の発現はβ−ナフトフラボンのようなインデューサー分子、およびα−ナフトフラボン、キノジンまたはアミノトリアゾールのような阻害薬剤によって調節することができる。また、いくつかの分子について、ＣｙＰ４５０遺伝子の発現を誘導することができるが、遺伝子の酵素産物の活性を阻害することが可能である。従って、発現および活性の複雑なパターンが、調節化合物への細胞の一連の暴露パターンに従って生起することができる。
【０１５１】
ヒト肝細胞癌細胞株ＨｅｂＧ２を、Ｌ−グルタミン、ペニシリン＋ストレプトマイシンおよび１０％加熱不活化胎児ウシ血清を補足したＤＭＥ培地中のＣｙｔｏｄｅｘ３（ＡｍｅｒｓｈａｍＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で増殖させた。シーディングから一日のうち、細胞ユニットを５つの群に分割し、５μＭのα−ナフトフラボン、β−ナフトフラボン、キニジン、アミノトリアゾールまたはジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ；テスト化合物のための溶媒キャリアー）の１つを含有する培養基にて、マルチウェル培養プレートの別々のウェルで培養した。２４時間の培養（３７℃、５％ＣＯ２）、個々のウェル中の細胞ユニットをＰＰＳで２回洗浄し、培養基中で一緒にプールし、５つの群に分割し、これを第一ラウンドで用いた５つの異なる培地で培養した。培養のさらに２４時間後、細胞ユニットを前記のように分割プール培養の第三のラウンドまで処理した。培養のさらに２４時間後、ビーズの試料を最終の５つの細胞群、および、分割プール実験の持続のためにＤＭＳＯを含む標準培地で培養された対照群から取った。
【０１５２】
ＣｙＰ４５０アッセイでは、増殖培地中のビーズのアリコットを取り出し、酵素基質エトキシレソルフィンを１０μＭの最終濃度まで添加した。ビーズの試料をカバースリップを持つ顕微鏡スライドに置き、直ちに、テキサスレッド／ローダミン蛍光用の標準フィルター組を用いてエピ蛍光顕微鏡で観察した（図９参照）。対照細胞は、基質添加から約１５〜２０分後にレソルフィン蛍光を呈し、エトキシレソルフィンの非存在下では蛍光は検出されなかった。細胞ユニットを対照実験においてβ−ナフトフラボンで処理すると、酵素活性は５〜１０分以内に明らかである（データは示さず）。分割プール培養手法を受けた群から取った細胞ユニットは種々の程度の酵素活性を示し（１０分以内）、これは、それらが、エトキシレソルフィンを代謝することができるＣｙＰ４５０酵素の活性を誘導または阻害する種々の条件に遭遇したことを示す。
【実施例３】
【０１５３】
＜多能性幹細胞を含む細胞ユニットの増殖＞
Ｔａｕ−ＧＦＰ融合タンパク質を発現する多能性マウスＥＳ細胞を、１５％ＦＣＳ、０．５５ｍＭ２−メルカプトエタノール、Ｌ−グルタミン、抗生物質（全てＧＩＢＣＯ／ＢＲＬからのもの）、および１，４００Ｕｍｌ−１の白血病阻害因子（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）を補足したイスコベの培地よりなるＥＳ細胞培地中のマイトマイシンＣ−処理ＳＮＬ細胞（ＳＴＯ細胞誘導体）でのフィーダー層で維持し、１日おきに１：５分割した。細胞ユニットの形成で用いたＥＳ細胞およびフィーダー細胞をゼラチン被覆フラスコに移し、ＥＳ培地中で１日間培養して培養におけるフィーダー細胞の数を低下させた。ＥＳ細胞をゼラチンプレートからトリプシン処理し、ＦＣＳ含有培地で洗浄し、次いで、ＰＢＳ中で水和させたＣｙｔｏｐｏｒｅ２またはＣｙｔｏｄｅｘ３マイクロキャリアー（ＡｍｅｒｓｈａｍＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）いずれかと共にインキュベートし、オートクレーブ処理または７０％エタノール処理によって滅菌し、次いで、ＥＳ培地で洗浄した。ＥＳ細胞を非接着性ブラスチック皿中で約１０細胞／マイクロキャリアーの密度で蒔いた。ＥＳ細胞培養を、１日置きに培地の半分を新鮮なＥＳ培地で交換しつつ、標準条件（５％ＣＯ２、３７℃）下で維持した（図７参照）。多能性細胞の増殖をこれらの条件下で５日間観察し、その後、細胞をＥＳ細胞培地から移して分化を開始させた。
【実施例４】
【０１５４】
＜分割培養による幹細胞ユニットの分化＞
多能性マウスＥＳ細胞ユニットをＥＳ細胞培地中で５日間培養し（実施例３参照）。ＥＳ培地を捨て、細胞ユニットをＰＢＳで２回洗浄して痕跡量のＥＳ培地を除去した。ビーズ集団を３つの群に分割し、ＰＢＳを捨て、（ｉ）ＥＳ細胞培地；（ｉｉ）１０％胎児ウシ血清を含むダルベッコの修飾イーグル培地（ＤＭＥＭ）；または（ｉｉｉ）化学的に定義された培地（ＣＤＭ；ＷｉｌｅｓＭＶ，Ｊｏｈａｎｓｓｏｎ ＢＭ，１９９９，Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ．，ｖｏｌ２４７，ｐ．２４１−８）の一つで置き換えた。標準条件下での１時間の培養の後、３つの群の各々を３つのさらなる群に分割し、その各々を（ｉ）細胞群を培養した培地；（ｉｉ）細胞群を１μｍＬｉＣｌを含む培養した培地；または（ｉｉｉ）細胞群を、１μＭレチノイン酸（ＲＡ）を含む培養した培地の１つにおいてインキュベートした。一日おきに培地の半分を各新鮮な培地で置き換えた。
【実施例５】
【０１５５】
＜表現型マーカーを用いる細胞ユニットにおける細胞分化を含む細胞プロセスの検出＞
Ｃｕｌｔｉｓｐｈｅｒ Ｇ（ＰｅｒｃｅｌｌＢｉｏｌｙｔｉｃａ）マイクロキャリアーに、Ｔａｕ−ＧＦＰ融合タンパク質を発現するマウスＥＳ細胞を蒔き、無血清培地（ペニシリン／ストレプトマイシンおよび１４００Ｕ／ｍｌＬｉＦを補足したＧｌｕｔａｍａｘ（Ｇｉｂｃｏ）を含むイスコブの修飾ＤＭＥＭである１５％ＧｉｂｃｏＫＯ血清代替物）中で４週間増殖させた。培地中の色インジケーターによって示したように、ｐＨが酸性になると培地を変化させた。ビーズのアリコットを取り出し、ＰＢＳで洗浄した後、４℃ＰＢＳ中の４％パラホルムアルデヒドで２０分間固定した。ビーズをＰＢＳで数回洗浄し、ＰＢＳ／２．５％ＦＣＳ、０．１％トリトンＸ−１００に再懸濁させ、２つの試料に分割した。１つの試料をネズミ−抗グリア繊維酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）モノクローナル抗体で１：２００とし、他は対照として残した。４℃における一晩のインキュベーションの後、試料をＰＢＳで３回洗浄し、次いで、双方を室温にてＣｙ３−標識ロバ抗マウス抗体（ＪａｃｋｓｏｎＩｍｍｕｎｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）と共に２時間インキュベートした。試料をＰＢＳで３回洗浄し、次いで、ＤＡＰＩ（Ｖｅｃｔｏｒ）を含有する設置培地で顕微鏡スライドにスポットした。マイクロキャリアー上の細胞の大部分はＧＦＡＰについての特異的染色を呈した（図８Ａ〜Ｈ参照）。
【０１５６】
別々の実験において、Ｔａｕ−ＧＦＰ融合タンパク質を発現するマウスＥＳ細胞およびＣｙｔｏｄｅｘ３マイクロキャリアーを含む細胞ユニット（実施例３を参照）をＥＳ培地からＣＤＭに写し、標準条件下で４日間培養し、その後、細胞ユニットをＰＢＳで１回洗浄し、重力によって沈降させた。ＰＢＳを除去し、細胞ユニットを４℃にて２％パラホルムアルデヒド中で１５分間固定し、その後、溶液を除去し、細胞ユニットをＰＢＳで３回洗浄した。細胞ユニットを２．５％胎児ウシ血清および０．１％トリトンＸ１００（Ｓｉｇｍａ）を含有するＰＢＳに再懸濁させ、３つの別々のミクロチューブに分割した。チューブリンβＩＩＩ（Ｓｉｇｍａ）に特異的なマウス免疫グロブリンを１：２００の希釈にて１つの試料に添加し、抗体染色を室温にて２時間進行させ、場合によっては再懸濁させた。次いで、全ての３つの試料を大過剰のＴＢＳで３回洗浄した。次いで、抗チューブリン抗体と共にインキュベートした試料および一つの他の試料を、ＰＢＳ／ＦＣＳ／トリトン×１００中のＣｙ３−コンジュゲーテッド−ロバ抗マウス免疫グロブリン（ＪａｃｋｓｏｎＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）の１：２００に希釈と共に室温にて２時間インキュベートした。次いで、全ての３つの試料を大過剰のＰＢＳで３回洗浄し、次いで、細胞ユニットをＤＡＰＩ（Ｓｉｇｍａ）を含有する設置培地に再懸濁させ、カバーグラスを持つ顕微鏡スライド上にスポットし、エピ蛍光または共焦点顕微鏡によって観察した。（図８、パネル１参照）。
【実施例６】
【０１５７】
＜細胞プロセスによる分化遺伝子発現の検出＞
分割−分割培養によって分割するように誘導されたマウスＥＳ細胞の細胞ユニット（実施例４参照）をＰＢＳで洗浄し、製造業者の指示（Ｑｉａｇｅｎ）に従ってＲｎｅａｓｙ試薬を用いて細胞ユニットからＲＮＡを調製した。次いで、製造業者の指示（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に従って、逆転写酵素を用いて、オリゴ−ｄＴプライミングにて第一ストランドｃＤＮＡを調製した。試料の濃度を正規化するために、各ｃＤＮＡ試料について１０倍希釈系列を作成し、「ハウスキーピング」遺伝子用のオリゴヌクレオチドプライマー、グリセルアルデヒド３リン酸デヒドロゲナーゼを用いる２５、３０および３５ラウンドのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）に供した。１．５％アガロースゲルで分離した得られた産物の臭化エチジウム染色を用いて、各試料中のｃＤＮＡの相対量を見積もった。次いで、各試料からの当量のｃＤＮＡを、（未分化ＥＳ細胞で起こることが予測される）Ｏｃｔ４；（分化したニューロン子孫で起こることが予測される）ネスチン；または（分化した内胚葉子孫で起こることが予測される）ＨＮＦ３βのためのＤＮＡプライマーでのＰＣＲ反応で用いた。プライマーの配列は以下の通りであった。
【０１５８】
【表７】
【０１５９】
これらの識別マーカーの相対量は、細胞ユニットが暴露された培養条件に応じて異なった。例えば、ＥＳ培地中のＲＡは内胚葉マーカーＨＮＦ３βの発現を誘導し、他方、ＲＡを含むＤＭＥＭおよび、程度は低いが、ＬｉＣｌはニューロン前駆体のマーカーであるネスチンの発現に導いた。ＬｉＣｌは還元を阻害したが、Ｏｃｔ４の減少はＤＭＥＭで特に顕著であった（図１１参照）。
【実施例７】
【０１６０】
＜ＲＦＩＤを用いる細胞ユニットの標識＞
ガラスに入れたＩＤ１００−Ａトランスポンダ（Ｔｒｏｖａｎ）を１Ｎ塩酸で２時間処理し、脱イオン水で十分に洗浄し、次いで、ガラス容器中でアミノプロピルポリエトキシシラン（Ｓｉｇｍａ）と共に２時間インキュベートした。シラン試薬をデカントし、タグを順次水、７０％エタノール、滅菌脱イオン水、次いで、リン酸緩衝化生理食塩水で洗浄した。タグを、個々に、非接着性細菌プラスチックマルチウェルプレートのウェルに入れた（Ｓｔｅｒｉｌｉｎ）。ゼラチン被覆プレート上でＬＩＦ（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）を含むＥＳ細胞培地で維持されたＴａｕ−ＧＦＰ融合トランスジーンを発現するＥＳ細胞の多能性系をトリプシン処理によって単細胞懸濁液に解離した。細胞をＥＳ細胞培地で一回洗浄し、１０６細胞／ｍｌにてＥＳ培地に再懸濁し、２５０μＬの懸濁液を各タグにスポットした。標準培養条件（３７℃、５％ＣＯ２）下での１時間のインキュベーションの後に１．５ｍｌのさらなるＥＳ培地を添加し、プレートをインキュベーターに戻した。
【０１６１】
また、トランスポンダをヒト肝細胞癌細胞株ＨｅｐＧ２、およびマウスＳＴＯ細胞誘導体ＳＮＬでシードした。予備処理およびシーデングプロセスをＥＳ細胞について記載されたように実行したが、１０％ＦＣＳを含むＤＭＥＭで細胞を維持した。
【０１６２】
接着性培養を解剖顕微鏡で観察し、エピ蛍光を用いて蛍光タグ化細胞を可視化した（図１０参照）。接着した種々の細胞型は正常な展伸形態を示し、トランスポンダで増殖させた。標識した細胞ユニットを、細胞ユニットまたは標識の明らかな劣化なしで、数週間維持できた。細胞ユニットのユニークな同一性は、細胞ユニットの細胞培養条件または維持を満たすことなく、Ｔｒｏｖａｎポケットリーダーで登録することができた。
【実施例８】
【０１６３】
＜蛍光、分子または光学タグによる細胞ユニットの標識＞
Ｃｙｔｏｄｅｘ３マイクロキャリアー（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）は変性コラーゲン（ゼラチン）の表面層と共にデキストランから構成される。Ｃｙｔｏｄｅｘ３ビーズ（ＰＢＳ中での水和の後５０μｌ沈降用量）を、合計用量２００μｌ中の２．５％胎児ウシ血清を含むＰＢＳ中の１：５０の希釈にて、ビオチンにコンジュゲートした抗コラーゲン抗体（Ａｂｃａｍ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＵＫ）と共に室温にて９０分間インキュベートした。次いで、ビーズを、再懸濁、次いで、重力沈降によって、大過剰のＰＢＳ中で３回洗浄した。対照試料を同一法であるが、抗コラーゲン抗体を添加することなく処理した。対照および処理した試料を各々二つに分割し、各々の１つの試料を２５０μｌ用量のＰＢＳ／ＦＣＳ中の２．５μｇ／ｍｌの濃度にて、ストレプトアビジン−ＦＩＴＣコンジュゲートと共に室温にて３０分間インキュベートした。２つの試料を同一条件下ではあるがストレプトアビジン−ＦＩＴＣなしでインキュベートした。ビオチン化抗コラーゲン抗体、続いて、ストレプトアビジン−ＦＩＴＣコンジュゲートで予備処理したビーズは、より高いレベルの蛍光を示した（図１２参照）。ビオチン化抗体でのマイクロキャリアービーズのコーティングは、今度は、容易に脱着可能なストレプトアビジンコンジュゲートに結合することができるビオチン部位を提供する手段である。ストレプトアビジンは非常に多数の分子および高分子体にコンジュゲートすることができるので、従って、それが大きな範囲のタグに高い親和性で結合できるようにマイクロキャリアービーズを誘導体化することができる。
【０１６４】
別の実験において、Ｃｕｌｔｉｓｐｈｅｒ Ｇ（Ｐｅｒｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｙｔｉｃａ）マイクロキャリアーを、便宜なダグを提供するラテックスビーズで標識した。マイクロキャリアーをＰＢＳ中で水和し、７０％エタノールで滅菌し、ＰＢＳで洗浄し、次いで、ビオチン部に共有結合させた。４００μｌのジメチルホルムアミドに溶解させた１０ｍｇビオチンアミドヘキサノイル−６−アミノヘキサン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（Ｓｉｇｍａ）を用いてビオチン化を行い、これをＰＢＳ中のマイクロキャリアーの１ｍｌ沈降用量に添加した。反応を室温にて一晩進行させ、マイクロキャリアーを大過剰のＰＢＳで３回洗浄した。処理したビーズのアリコットおよび未修飾対照試料を１×１０ｅ５１μＭ直径のストレプトアビジン被覆赤色−蛍光ビーズ（Ｓｉｇｍａ）と共に、または２．５％胎児ウシ血清を含むＰＢＳ中の２．５μｇ／ｍｌストレプトアビジン−ＦＩＴＣ（Ｓｉｇｍａ）と共にインキュベートした。ビーズタグ（図１２Ｅ〜Ｈ）またはＦＩＴＣ（図１８Ａ〜Ｄ）での標識のレベルを、蛍光顕微鏡を用いて比較した。
【０１６５】
さらなる実験において、Ｃｙｔｏｄｅｘ３マイクロキャリアーを赤色または緑色で蛍光１μＭ直径のストレプトアビジン−被覆ビーズ（Ｓｉａｍｇ）で標識した。Ｃｙｔｏｄｅｘ３マイクロキャリアー（ＡｍｅｒｓｈａｍＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を、２．５％ＦＣＳを含むＰＢＳ中で、室温にて、赤色、緑色の懸濁液、または赤色および緑色ラテックスビーズの混合物と共に３０分間インキュベートした。再懸濁、次いで、重力による沈降によって、試料を大過剰のＰＢＳ中で３回洗浄した。次いで、赤色タグによって標識されたビーズのアリコットを緑色タグによって標識されビーズを含有する試料からの同一容量のアリコットと混合して、クロス−標識が起こるか否かを判断した。次いで、ＦＩＴＣおよびテキサスレッド／ローダミン検出用の標準フィルター組を用い、エピ蛍光顕微鏡下で試料を観察した（図１４および１５）参照。ラテックスビーズタグを用いてマイクロキャリアーを強固に標識することができ、その結果、異なって標識された集団が得られた。２つの集団の混合の結果、マイクロキャリアーの間の標識の有意な移動は得られず、これは、集団が識別されるままであることを意味する。２つのタグの組合せと共にインキュベートしたマイクロキャリアーは、双方によって安定に標識され、これは、単一マイクロキャリアーが複数のタグで標識できることを示す。この実験で用いたもののようなタグは非常に多数のレポーター（たとえば、異なるフルオロフォア、染料、酵素）にコンジュゲートすることができるので、マイクロキャリアーを大きな範囲の識別タグで標識するのにこれらを用いるのが可能である。加えて、抗体をラテックスビーズタグにカップリングさせ、それらをマイクロキャリアーまたは細胞ユニットに向けることが可能である。
【実施例９】
【０１６６】
＜蛍光、分子または光学タグによる細胞ユニットの標識＞
Ｃｙｔｏｄｅｘ３マイクロキャリアー（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を、Ｔａｕ−ＧＦＰトランスジーンを発現するＥＳ細胞でシードした。１日後、マイクロキャリアーをＰＢＳで洗浄し、次いで、ストレプトアビジン（Ｓｉｇｍａ）に共有結合した赤色１μｍ直径ラテックスビーズの懸濁液と共に室温にて３０分間インキュベートし；標準条件下で直ちに、または培養から２４時間後に分析した。分析は再懸濁による大過剰のＰＢＳ中での３回の洗浄、次いで、重力による沈降を含み、試料は、ＦＩＴＣおよびテキサスレッド／ローダミンの検出用の標準フィルファー組を用いてエピ蛍光下で観察した。ＥＳ細胞（緑色）を含み、ラテックスビーズタグ（赤色）とのコロイド相互作用によって標識された細胞ユニットは各場合に明らかであった（図１３参照）。
【０１６７】
ラテックスおよび他のポリマーと共に構成されるビーズは非常に多数の分子および超分子レポーターにコンジュゲートさせることができるので、従って、大きな範囲の識別標識で細胞ユニットを標識することが可能である。
【実施例１０】
【０１６８】
＜細胞プロセスをベースとした細胞ユニットの手動分析および単離＞
Ｔａｕ−ＧＦＰ融合タンパク質を発現するマウスＥＳ細胞およびＣｙｔｏｄｅｘ３マイクロキャリアーを含む細胞ユニットを裸のｃｙｔｏｅｘ３マイクロキャリアーと１：１００の比率で混合した。相および蛍光設定を用い、混合物を顕微鏡下で観察した。ＧＦＰを発現する細胞ユニットが、大過剰の非蛍光キャリアーにおいてさえ、蛍光顕微鏡を用いる場合に容易に明らかであった（図１６参照）。個々の細胞ユニットは、小容量の細胞ユニットを含有する培養を吸引するための所定の位置に設けられたピペットを用いて、手動で分類することができた。
【実施例１１】
【０１６９】
＜標識されたマイクロキャリアーおよび細胞ユニットの自動分析およびソーティング＞
自動または高スループット様式にて、種々のタグで標識される細胞ユニットを分析し、分類し、または特定の細胞プロセスを表示することができるのが望ましい。多細胞生物おおびビーズを０．５ｍｍまでの直径にて分類することができるＣＯＰＡＳＳｅｌｅｃｔ機器（Ｕｎｉｏｎ Ｂｉｏｍｅｔｒｉｃａ Ｉｎｃ．，Ｓｏｍｅｒｖｉｌｌｅ，ＭＡ）を用いて、細胞ユニット、マイクロキャリアーおよび標識されたマイクロキャリアーを分析した。Ｃｙｔｏｄｅｘ３（ＡｍｅｒｓｈａｍＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）をそのサイズおよび光学特徴に従った機器（Ｔｉｍｅｏｆ Ｆｌｉｇｈｔ，ＴＯＦ；Ｅｘｔｉｎｃｔｉｏｎ，Ｅｘｔ）によって分析し、サイズのわずかな変化を呈したが、利用した設定下で有意な自動蛍光は呈しなかった（図１７Ａ／Ｂ参照）。赤色ストレプトアビジン−コンジュゲーテッドラテックスビーズ（Ｓｉｇｍａ）でのＣｙｔｏｄｅｘ３マイクロキャリアーの標識（実施例９参照）は、赤色蛍光において検出可能なシフトに導いた（図１７Ｃ／Ｄ）。
【０１７０】
Ｔａｕ−ＧＦＰトランスジーンを発現するＥＳ細胞でシードしたＣｙｔｏｄｅｘ３マイクロキャリアーを含む細胞ユニットを、細胞数をベースとして細胞ユニットを分類する実験で用いた。種々の細胞密度を支持する細胞ユニットを含む細胞ユニットの群を固定することなく器具を通過させ、広い範囲の緑色蛍光強度を示した（図１７Ｅ／Ｆ）。前記器具を用いて、低蛍光の細胞ユニットから高度に蛍光な細胞ユニットを分類した。エピ蛍光顕微鏡を用いて引き続いて分析した試料は、細胞ユニットが高蛍光に基づいて分類された細胞ユニットが非常に多数の生きた細胞を運び、他方、低蛍光の細胞ユニットがまばらに集まっていることを明らかにした。従って、細胞ユニットの自動分析、同定および単離は、細胞数、表現型、および同定タグでの標識を含む多数のパラメーターに従って行うことができた。
【実施例１２】
【０１７１】
＜単細胞ユニットからのタグの同定＞
Ｃｕｌｔｉｓｐｈｅｒ Ｇ（ＰｅｒｃｅｌｌＢｉｏｌｙｔｉｃａ）マイクロキャリアーをビオチン部位に架橋させ（実施例８参照）、ビオチン化は、蛍光顕微鏡を用いてストレプトアビジン−ＦＩＴＣでの染色レベルを比較することによって確認した（図１８Ａ〜Ｄ）。
【０１７２】
細胞ユニットは、ＥＳ細胞増殖培地中の２５０μｌ沈降容量ビオチン化ＣｕｌｔｉｓｐｈｅｒＧマイクロキャリアーと共に１０６ＴＧＦＰ ＥＳ細胞の単細胞懸濁液を２４時間インキュベートすることによって形成された。５０μｌの細胞ユニットの試料を、室温にてほぼ５×１０５タグと共に１５分間インキュベートすることによって、ストレプトアビジン−被覆１μＭ赤色−蛍光ラテックスビーズ（Ｓｉｇｍａ）でタグを付した。数ラウンドの再懸濁および大容量のＰＢＳの定着によって細胞ユニットを過剰のラテックスビーズなしで洗浄した。エピ蛍光顕微鏡を用いて、ラテックスビーズタグによって細胞ユニットが標識されたことを確認した（図１８Ｅ〜Ｇ）。
【０１７３】
解剖顕微鏡下に設けたペトリ皿に細胞ユニットを入れ、ピペットを用いて個々のユニットを単離し、５ｍｌのＦＡＣＳチューブ（ＢｅｃｔｏｎＤｉｃｋｉｎｓｏｎ Ｆａｌｃｏｎ）に入れた。２００μｌのアリコットのＢｌｃｉｌｌｕｓｐｏｌｙｍｙｘａ中性プロテアーゼの１×溶液（Ｄｉｓｐａｓｅ ＩＩ，Ｒｏｃｈｅ）を各チューブに加え、マイクロキャリアーマトリックスを室温にて一晩消化した。消化物を、１μｍのサイズの範囲であって、遠赤色（ＦＬ３）発光スペクトルにおける事象を検出するようにキャリブレートされたサイトフルオリメーター（ＢｅｃｔｏｎＤｉｃｋｉｎｓｏｎ ＦＡＣＳｃａｌｉｂｕｒ）を通した（図１８Ｈ、Ｉ）。単細胞ユニットから単離されたタグの同一性は、適当なサイズおよび蛍光基準に適合させた事象を検出することによって確認することができた（図１８Ｊ、Ｋ）。
【実施例１３】
【０１７４】
＜細胞ユニットを標識するのに用いたタグの多重度の同定＞
正確なサイズおよび蛍光特徴の広く種々のラテックスビーズの入手可能性は、マイクロキャリアーの多重標識を可能とする。ビオチン化ＣｕｌｔｉｓｐｈｅｒＧマイクロキャリアー（実施例１２参照）は、サイズ、蛍光発光スペクトルおよび蛍光強度が異なる３つの異なるタイプのストレプトアビジン−被覆ビーズタグを含有する培地中での系列的なインキュベーションによって標識した。タグとして用いたビーズタイプは、１）Ｓｉｇｍａによって製造された１μｍの緑色ラテックスビーズ；２）ＢａｎｇｓＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓによって製造された１連の５．５μｍ赤色−蛍光ラテックスビーズ（ＱｕａｎｔｕｍＰｌｅｘ）におけるビーズ組ｎｏ．１；および３）ＢａｎｇｓＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓによって製造された一連の４．４μｍ赤色−蛍光ラテックスビーズにおけるビーズ組５ビーズであった。
【０１７５】
次いで、タグ化マイクロキャリアーをタンパク質分解によって消化し、遊離されたタグを前記したようにＦＡＣＳ分析に供した（実施例１２参照）。サイトフルオリメーター（ＢｅｃｔｏｎＤｉｃｋｉｎｓｏｎ ＦＡＣＳｃａｌｉｂｕｒ）をタグの試料でキャリブレートして、サイズゲートを設定し（図１９Ａ）、３つの異なるタグの蛍光シグニチャーを適当な（緑色または赤色）蛍光チャネルにおける事象を分析することによって検出した（図１９Ｂ〜Ｄ）。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）培養培地においてマイクロキャリアーまたはビーズに接着され、培地透過性バリアーに閉じ込められているか、または捕捉された幹細胞を増殖させるステップと、
（ｂ）ステップ（ａ）の細胞を、ある培養培地から別の培養培地に移動させるステップと、
（ｃ）任意選択により、必要であればステップ（ｂ）を反復するステップと、
（ｄ）分化した細胞を得るステップと
を含む、インビトロにおいて幹細胞から分化した細胞を得る方法。
【請求項２】
分化した細胞が、マイクロキャリアー又はビーズからの酵素的脱着によって単離される請求項１に記載の方法。
【請求項３】
分化した細胞が、マイクロキャリアーの消化によって単離される請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
（ａ）培地透過性バリアー内で、マイクロキャリアーまたはビーズに幹細胞を播種するか、または幹細胞を捕捉するステップと、
（ｂ）培地透過性バリアー内に閉じ込められ、マイクロキャリアーまたはビーズに接着された、または捕捉された前記細胞を増殖させるステップと
を含む、インビトロにて幹細胞を増殖させる方法。
【請求項５】
（ａ）細胞がマイクロキャリアーまたはビーズに接着され、培地透過性バリアーに閉じ込められているか、または捕捉された細胞ユニットを形成するステップと、
（ｂ）一連の細胞培養条件に細胞ユニットを段階的に曝露するステップと、
（ｃ）細胞プロセスを誘導するステップと
を含む、インビトロで細胞において細胞プロセスを誘導する方法。
【請求項６】
マイクロキャリアーまたはビーズに接着され、培地透過性バリアーに閉じ込められているか、または捕捉された幹細胞及び幹細胞に由来する分化した細胞を増殖させることを含む、幹細胞及び幹細胞に由来する分化した細胞を培養する方法。
【請求項７】
前記細胞が、選択された培養条件に曝露される請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記細胞が、少なくとも１つの培養条件の変化を受ける請求項７に記載の方法。
【請求項９】
培養条件の前記変化が、培地の変化を含む請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
細胞のプールが作られ、反復してサブ分割される請求項６〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
（ａ）異なる条件で増殖された一以上の細胞培養物を組み合わせるステップと、
（ｂ）共通の条件で細胞を培養するステップと
を含む請求項６〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
（ａ）細胞培養物をインキュベートするステップと、
（ｂ）前記細胞培養物を２以上の細胞の群に分割するステップと、
（ｃ）前記細胞の群を２以上の異なるセットの培養条件で培養するステップと
を含む、請求項６〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
マイクロキャリアーが、プラスチック；ポリマー；セルロース、デキストラン、アガロースまたはアクリルアミドのような高分子；またはガラスのような無機材料を含む請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
細胞が、ＤＥＡＥ、ＴＬＣ、ＱＡＥ、ＴＥＡＥのようなセルロース繊維中、またはセラミックカートリッジ中に捕捉される請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
細胞が、多能性細胞である請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１】
（ａ）培養培地においてマイクロキャリアーまたはビーズに接着され、培地透過性バリアーに閉じ込められているか、または捕捉された幹細胞を増殖させるステップと、
（ｂ）ステップ（ａ）の細胞を、ある培養培地から別の培養培地に移動させるステップと、
（ｃ）任意選択により、必要であればステップ（ｂ）を反復するステップと、
（ｄ）分化した細胞を得るステップと
を含む、インビトロにおいて幹細胞から分化した細胞を得る方法。
【請求項２】
分化した細胞が、マイクロキャリアー又はビーズからの酵素的脱着によって単離される請求項１に記載の方法。
【請求項３】
分化した細胞が、マイクロキャリアーの消化によって単離される請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
（ａ）培地透過性バリアー内で、マイクロキャリアーまたはビーズに幹細胞を播種するか、または幹細胞を捕捉するステップと、
（ｂ）培地透過性バリアー内に閉じ込められ、マイクロキャリアーまたはビーズに接着された、または捕捉された前記細胞を増殖させるステップと
を含む、インビトロにて幹細胞を増殖させる方法。
【請求項５】
（ａ）細胞がマイクロキャリアーまたはビーズに接着され、培地透過性バリアーに閉じ込められているか、または捕捉された細胞ユニットを形成するステップと、
（ｂ）一連の細胞培養条件に細胞ユニットを段階的に曝露するステップと、
（ｃ）細胞プロセスを誘導するステップと
を含む、インビトロで細胞において細胞プロセスを誘導する方法。
【請求項６】
マイクロキャリアーまたはビーズに接着され、培地透過性バリアーに閉じ込められているか、または捕捉された幹細胞及び幹細胞に由来する分化した細胞を増殖させることを含む、幹細胞及び幹細胞に由来する分化した細胞を培養する方法。
【請求項７】
前記細胞が、選択された培養条件に曝露される請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記細胞が、少なくとも１つの培養条件の変化を受ける請求項７に記載の方法。
【請求項９】
培養条件の前記変化が、培地の変化を含む請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
細胞のプールが作られ、反復してサブ分割される請求項６〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
（ａ）異なる条件で増殖された一以上の細胞培養物を組み合わせるステップと、
（ｂ）共通の条件で細胞を培養するステップと
を含む請求項６〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
（ａ）細胞培養物をインキュベートするステップと、
（ｂ）前記細胞培養物を２以上の細胞の群に分割するステップと、
（ｃ）前記細胞の群を２以上の異なるセットの培養条件で培養するステップと
を含む、請求項６〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
マイクロキャリアーが、プラスチック；ポリマー；セルロース、デキストラン、アガロースまたはアクリルアミドのような高分子；またはガラスのような無機材料を含む請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
細胞が、ＤＥＡＥ、ＴＬＣ、ＱＡＥ、ＴＥＡＥのようなセルロース繊維中、またはセラミックカートリッジ中に捕捉される請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
細胞が、多能性細胞である請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【公開番号】特開２０１１−２５０７９１（Ｐ２０１１−２５０７９１Ａ）
【公開日】平成２３年１２月１５日（２０１１．１２．１５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−１５５４３３（Ｐ２０１１−１５５４３３）
【出願日】平成２３年７月１４日（２０１１．７．１４）
【分割の表示】特願２００４−５４０９８０（Ｐ２００４−５４０９８０）の分割
【原出願日】平成１５年１０月３日（２００３．１０．３）
【出願人】（５０５１２３８０４）
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２３年１２月１５日（２０１１．１２．１５）
【国際特許分類】
【出願日】平成２３年７月１４日（２０１１．７．１４）
【分割の表示】特願２００４−５４０９８０（Ｐ２００４−５４０９８０）の分割
【原出願日】平成１５年１０月３日（２００３．１０．３）
【出願人】（５０５１２３８０４）
【Ｆターム（参考）】
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