細胞画像解析システム
【課題】生細胞の顕微鏡画像を取得中に、細胞を特定し、特定した細胞の種類を認識可能な細胞画像解析システムを提供する。
【解決手段】細胞周期の特定の期に特異的に蛍光を発する蛍光タンパクが導入された生細胞の画像を時系列に取得する装置１と、画像を用いて生細胞の解析を行うコンピュータを備えた画像解析装置２を有する。画像解析装置２は、コンピュータを、画像における蛍光輝度が所定の閾値を上回る或いは隣接輝度との輝度差が所定の閾値を上回る画素群を細胞領域として特定する手段２ａ、蛍光に対応する細胞周期の期が格納されたテーブルと照合して、当該生細胞の細胞周期の期を検出する手段２ｂ、当該生細胞の細胞周期の期が別の期に変化するまでの時間を計測する手段２ｃ、細胞周期の期の時間を用いて、少なくとも細胞の種類を同定する手段２ｈとして機能させる画像解析ソフトウェアを備える。
【解決手段】細胞周期の特定の期に特異的に蛍光を発する蛍光タンパクが導入された生細胞の画像を時系列に取得する装置１と、画像を用いて生細胞の解析を行うコンピュータを備えた画像解析装置２を有する。画像解析装置２は、コンピュータを、画像における蛍光輝度が所定の閾値を上回る或いは隣接輝度との輝度差が所定の閾値を上回る画素群を細胞領域として特定する手段２ａ、蛍光に対応する細胞周期の期が格納されたテーブルと照合して、当該生細胞の細胞周期の期を検出する手段２ｂ、当該生細胞の細胞周期の期が別の期に変化するまでの時間を計測する手段２ｃ、細胞周期の期の時間を用いて、少なくとも細胞の種類を同定する手段２ｈとして機能させる画像解析ソフトウェアを備える。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生細胞の画像を取得し、取得した画像を用いて細胞を解析する細胞画像解析システムに関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、ＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞、癌肝細胞などの研究が盛んである。これらは、万能細胞と呼ばれる細胞であり、多様な細胞に分化することが可能である。
しかるに、これらの万能細胞が分化し、他の細胞に変化したことを顕微鏡観察しながら肉眼で確認することは、非常に困難である。分化する細胞が多種多様であり、細胞画像を肉眼で観察しただけでは、細胞画像中における細胞の種類を判別することが難しい。
このため、従来、万能細胞が分化して他の細胞に変化したことを確認するためには、分化した細胞を一旦取り出して増殖させ、増殖させた細胞に対して分子統計学的な解析を行うことによって、その分化した細胞の種類を特定するという手法を用いる必要があり、顕微鏡観察しながら分化した細胞の種類を特定することが困難であった。
【０００３】
この問題を解決する方法として、本件出願人は、培養した細胞における細胞周期を特定し、特定した細胞周期における各期やＭ期内の詳細期に要した時間に応じて、分化する細胞の種類を検出することを着想した。
【０００４】
従来、細胞周期を特定する方法としては、例えば、非特許文献１〜３、特許文献１に記載の方法がある。
【０００５】
非特許文献１に記載の方法は、ＤＮＡインターカレータであるＤＡＰＩやＰＩを用いて、細胞周期を解析する方法であり、次のような手順で行われる。
ＤＮＡインターカレータは、ＤＮＡの二本鎖間に挿入される蛍光試薬である。培養した細胞にＤＮＡインターカレータであるＤＡＰＩやＰＩで核を染色する。染色した細胞を、例えば、プレパラートに固定あるいはマルチウェルやシャーレ等の容器に収容して標本を作成し、顕微鏡を備えた撮像装置を介して画像を取得する。
取得した画像から核を認識して、各々の細胞を特定し、特定した細胞毎に、核内の蛍光量を測定する。蛍光量の測定は、核の画像ピクセル毎の輝度値の合計値と核内の画像ピクセルの最高輝度値との２つのパラメータから輝度の散布図を作図する。これにより、散布図上に各々の細胞が点として表される。散布図上に表された細胞集団における個々の細胞の相対的な輝度値からＧ１期、Ｓ期、Ｇ２期、Ｍ期、Ｍ期以後に層別することができる。また、プレパラート標本毎にＧ１期、Ｓ期、Ｇ２期、Ｍ期、Ｍ期以後のそれぞれに該当する細胞の割合を算出する、即ち、細胞周期における各期に該当する細胞の割合を算出することも可能である。
【０００６】
この点に関し、詳述する。
ＤＮＡインターカレータを用いると、ＤＮＡ量＝細胞画像輝度、の関係が成り立つ。このため、以下の分析方法を用いることによって細胞周期の特定が可能となる。
即ち、細胞周期の各期においては、ＤＮＡ量と核の凝集度が異なる。このＤＮＡ量と核の凝集度を、核の画像ピクセル毎の輝度値の合計値と核内の画像ピクセルの最高輝度値で測定する。
Ｇ１期においては、染色体が２本ある。このときのＤＮＡ量を２Ｎとする。Ｓ期においては、ＤＮＡの合成期にあり、２Ｎから４Ｎに増える過程にある。Ｇ２期においては、分裂前の準備期間にあり、ＤＮＡ量がＧ１期の２倍に増えた状態（４Ｎ）となる。また、Ｍ期においては、核が凝集するので明るくなる。
そこで、Ｇ１期，Ｓ期，Ｇ２期は、ＤＮＡ量（＝ＤＡＰＩの輝度の総和）によって特定する。ＤＮＡに直接結びつくタイプの蛍光試薬を用いると、蛍光量（核領域の輝度の総和）＝ＤＮＡ量となる。
Ｍ期は核の明るさで判断する。分裂期にある細胞は、輝度が明るく核が凝集している。このため、核領域中の最大輝度で判断する。
【０００７】
しかし、非特許文献１に記載の方法は、蛍光試薬として用いるＤＡＰＩに細胞毒性があり、染色する際に細胞が死ぬ、或いは細胞の特性が変わってしまう等の影響が出ないように殺す等により固定標本を対象とせざるを得ず、細胞を生かしたままで解析することが困難であり、細胞周期の各期に該当する細胞の統計的な割合を算出することは可能であるが、特定の細胞の細胞分裂する時間の割合や細胞分裂期における細胞分裂する状況を把握することが出来ない。また、非特許文献１に記載の方法は、散布図を作図するために数百以上の細胞集団に対して輝度値をプロットする必要があるため、仮に、細胞を生かしたまま解析するようにしたとしても、時間が掛かり過ぎるため、生細胞を用いた細胞周期の期の解析には実用的でない。
【０００８】
一方、蛍光顕微鏡（コンベンショナル顕微鏡、レーザ顕微鏡など）では、生きた細胞のタイムラプス観察が可能であり、サブマイクロ秒単位で細胞画像を取得し、Ｍ期における細胞分裂する状況を画像化することが可能である。このような細胞分裂する状況を画像化することにより、細胞の形態情報が認識できる。また、細胞が分裂した後、次に分裂するまでの画像を取得すれば、１サイクルの細胞分裂に要する時間（世代時間）も細胞の形態情報から認識可能である。
【０００９】
しかし、細胞画像から細胞周期における各期を認識することは、細胞の形態情報のみからでは困難である。
例えば、特許文献１には、細胞の形状等からＭ期における細胞分裂の詳細期を特定することが可能であることが示されている。しかし、特許文献１に記載の方法は、Ｍ期における細胞分裂の詳細期のみを計測する方法であって、細胞を培養中に細胞周期における各期の時間を計測することができない。また、特許文献１の方法には、Ｍ期における細胞分裂の詳細期の時間や詳細期毎の時間を計測することについての着想がない。
【００１０】
また、近年、非特許文献２，３に記載の方法のような、細胞周期を可視化する方法が提案されている。
非特許文献２に記載の方法は、細胞周期における特定の時期にのみ存在する２種類のタンパク質に、それぞれ融合しうる２種類の蛍光タンパク質からなるＦＵＣＣＩと呼ばれる蛍光プローブを細胞の核に導入して、細胞周期を可視化する方法である。ＦＵＣＣＩを導入された細胞は、Ｇ１期では赤色に光り、Ｓ期、Ｇ２期、Ｍ期では緑色に光る。非特許文献２に記載の方法を用いれば、Ｇ１期とそれ以外の期の時間を計測することが可能である。また、ＦＵＣＣＩには、ＤＡＰＩなどの蛍光試薬とは異なり、細胞毒性がないので、細胞周期の１サイクルの時間（世代時間）のみならず、細胞を生きたままの状態にして長時間計測することができる。
【００１１】
しかし、非特許文献２に記載の方法では、Ｓ期、Ｇ２期、Ｍ期の区別をすることができない。また、非特許文献２に記載の方法では、Ｍ期における細胞分裂の詳細期の時間や詳細期毎の時間を計測することができない。また、蛍光タンパクは、上述した非特許文献１に記載のような蛍光試薬に比べて、生細胞から発する蛍光シグナルが弱く、細胞ごとにシグナルのバラツキが生じやすい。このため、非特許文献２に記載の方法では、細胞周期を高精度に解析し難い。
【００１２】
非特許文献３の方法では、細胞周期に応じて細胞内における蛍光を発する部位が細胞核から細胞質へ移行する細胞周期マーカー（ＣＣＰＭ）を用いて、細胞周期を解析する。
しかし、非特許文献３に記載の方法では、細胞周期マーカーに毒性があるため、細胞を生きたままの状態では解析できず、細胞周期における各期を特定することができない。また、非特許文献３に記載の方法も、Ｍ期における細胞分裂の詳細期の時間や詳細期毎の時間を計測することができない。
【００１３】
さらに、これら特許文献１、非特許文献１〜３のいずれも、細胞周期の各期、或いはＭ期における詳細期を認識するものであって、種類の異なる細胞毎に、細胞周期の各期、Ｍ期における詳細期の時間を計測するものではないため、これらの方法では、細胞画像中における細胞の種類を判別することができない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１４】
【特許文献１】特開２００８−１６４５５１号公報
【非特許文献】
【００１５】
【非特許文献１】製品カタログ“レーザスキャニングサイトメータ ＬＳＣ２”， オリンパス光学工業株式会社
【非特許文献２】"Visualizing Spatiotemporal Dynamics of Multi cellular Cell-Cycle Progression", Cell 132, p487-498, February 8,2008, Elsevier inc.
【非特許文献３】“Ｇ１／Ｓ Ｃｅｌｌ Ｃｙｃｌｅ Ｐｈａｓｅ Ｍａｋｅｒ Ａｓｓａｙ”，ＧＥヘルスケア，［online］，http://www.gelifesciences.co.jp/technologies/cell-cycle/g1s.asp
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
上述したように、近年、生細胞の観察において、医療応用を目的としたｉＰＳ細胞やがん幹細胞による研究が盛んに行われている。また、ｉＰＳ細胞の研究では、ｉＰＳ細胞が樹立した後のがん化の問題が指摘されている。
このため、例えば、ｉＰＳ細胞が樹立した細胞とその他の細胞との識別、ｉＰＳ細胞が樹立した細胞と樹立後に分化した細胞との識別、ｉＰＳ細胞が樹立した後に分化した細胞ごとの識別等や、細胞周期における細胞の状態の変化の正確な把握をすべく、細胞分裂に関する時間情報の定量化や細胞追跡のニーズが高まっている。
【００１７】
また、ｉＰＳ細胞の分化解析を含めて、一般的に生きたままの細胞を観察したいというニーズは多い。
固定状態（死んだ状態）の細胞からは、固定状態の前後の時点における細胞の状態を正確に把握することができず、前後の時点における細胞の状態は、一般に統計的に推測することができるに過ぎないのに対し、細胞が生きたままの状態で観察すれば、現時点の前後の時点における細胞の状態を正確に把握することができる。
ｉＰＳ細胞などを含む幹細胞は、分裂と分化（「幹＝元の状態」から、特定の種類の細胞に変化する状態）を繰り返していくが、特に、分化がどのように進行するのかを観察するためには、生きた細胞を観察途中で殺す（＝固定する）ことができない。
また、生きたままの細胞を観察することによって、細胞集団の中で特異な細胞を抽出することができる。例えば、がん細胞などでは、極く少数の細胞だけが分裂時に異常を起こす場合がある。また、ｉＰＳ細胞も作成方法によっては、がん化しやすくなることが知られている。このような細胞集団内における特異な細胞の抽出と解析を行うためには、個々の細胞に対して時間の経過にともなう状態の変化を辿るためにも、生きたままの細胞を解析することが必要である。
【００１８】
しかし、特許文献１や非特許文献１〜３記載の技術では、上述のように、細胞周期の各期、或いはＭ期における詳細期を認識するものであって、種類の異なる細胞毎に、細胞周期の各期、Ｍ期における詳細期の時間を計測するものではないため、これらの方法では、異なる種類の細胞を特定することが難しい。このため、特定した種類の細胞ごとに、がん化等により細胞分裂を続けそうな細胞を事前に認識すること等や、細胞周期における細胞の状態の変化を正確に捉えることが難しい。
【００１９】
また、そもそも非特許文献１、３に記載の方法のようなＤＡＰＩやＣＣＰＭ等の蛍光試薬は毒性があり、生細胞の観察に適さない。非特許文献２に記載の蛍光タンパクを用いれば生細胞を観察することができるが、蛍光タンパクから発せられる蛍光は通常の蛍光試薬から発せられる蛍光に比べて輝度が弱く、蛍光タンパク遺伝子導入時における細胞の環境（温度やＰｈ）や、周囲の細胞の多さなど、の条件によって、蛍光タンパクの蛍光量（輝度）にバラツキが大きいうえ。Ｇ１期，Ｓ期，Ｇ２期を判別できず、しかもＭ期における詳細期を分類することができない。このため、従来の方法では、生細胞を観察しながら細胞周期の期及びＭ期における詳細期を特定することが難しい。
【００２０】
本発明は、このような従来の問題点に鑑みてなされたものであり、生細胞の顕微鏡画像を取得中に、細胞周期の各期、Ｍ期の詳細期を特定し、特定した期に応じて細胞の種類を認識でき、例えば、ｉＰＳ細胞が樹立した細胞とその他の細胞との識別、ｉＰＳ細胞が樹立した細胞と樹立後に分化した細胞との識別、ｉＰＳ細胞が樹立した後に分化した細胞ごとの識別等や、細胞周期における細胞の状態の変化を正確に捉えることのできる細胞画像解析システムを提供することを目的としている。
【課題を解決するための手段】
【００２１】
上記目的を達成するため、本発明による細胞画像解析システムは、細胞周期の特定の期に特異的に蛍光を発する蛍光タンパクが導入された生細胞の画像を時系列に取得する、顕微鏡を備えた画像取得装置と、前記画像取得装置が時系列に取得した画像を用いて生細胞に対する所定の解析を行う、コンピュータを備えた細胞画像解析装置と、を有する細胞画像解析システムであって、前記細胞画像解析装置は、前記コンピュータを、前記画像取得装置が取得した画像において、蛍光輝度が所定の輝度の閾値を上回る画素群、あるいは隣接輝度との輝度差が所定の輝度差の閾値を上回る画素群を細胞領域として特定する細胞領域特定手段、前記蛍光タンパクから発せられる蛍光に対応する細胞周期の期が格納されたデータテーブルと照合して、当該生細胞の細胞周期の期を検出する細胞周期の期検出手段、前記細胞周期の期検出手段が検出した当該生細胞の細胞周期の期が別の期に変化するまでの細胞周期の期の時間を計測する細胞周期の期の時間計測手段、前記細胞周期の期の時間を用いて、少なくとも細胞の種類を同定する同定手段、として機能させる画像解析ソフトウェアを備えたことを特徴としている。
【００２２】
また、本発明の細胞画像解析システムにおいては、前記データテーブルは、予め前記蛍光タンパクを導入するとともに前記蛍光タンパクとは別の所定の蛍光試薬で染色した、前記生細胞と同種の細胞において、前記所定の蛍光試薬から発せられる蛍光を用いて細胞周期の期を分類するとともに、前記所定の蛍光試薬から発せられる蛍光と、前記蛍光タンパクから発せられる蛍光との対応付けを行うことによって得られたものであるのが好ましい。
【００２３】
また、本発明の細胞画像解析システムにおいては、前記蛍光タンパクが色の異なる２つの蛍光タンパクであり、前記細胞周期の期検出手段が、前記細胞領域特定手段が細胞領域として特定した画素群における前記蛍光タンパクから発せられる異なる色同士の蛍光輝度の総量の比及び異なる色ごとの蛍光輝度の総量の増加量を、予め前記蛍光タンパクを導入するとともに前記蛍光タンパクとは別の所定の蛍光試薬で染色した、前記生細胞と同種の細胞の画像を前記画像取得装置を介して取得し、前記細胞領域特定手段を介して細胞領域として特定したデータテーブル作成用画素群における前記所定の蛍光試薬から発せられる蛍光輝度の総量及び蛍光輝度の最大値を用いて細胞周期の期を分類するとともに、前記データテーブル作成用画素群における前記所定の蛍光試薬から発せられる蛍光輝度の総量及び蛍光輝度の最大値と前記データテーブル作成用画素群における前記蛍光タンパクから発せられる異なる色同士の蛍光輝度の総量の比及び異なる色ごとの蛍光輝度の総量の増加量との対応付けを行うことによって得られた、前記蛍光タンパクから発せられる異なる色同士の蛍光輝度の総量の比及び異なる色ごとの蛍光輝度の総量の増加量に対応する細胞周期の期が格納されたデータテーブルと照合して、当該生細胞の細胞周期の期を検出するのが好ましい。
【００２４】
また、本発明の細胞画像解析システムにおいては、前記細胞周期の期の時間が、当該生細胞の細胞周期の期が次世代における当該細胞周期の期に変化するまでの世代時間であるのが好ましい。
【００２５】
また、本発明の細胞画像解析システムにおいては、前記細胞周期の期の時間が、当該生細胞の細胞周期の期が次の期に変化するまでの期の時間であるのが好ましい。
【００２６】
また、本発明の細胞画像解析システムにおいては、前記細胞周期の期検出手段が検出した当該生細胞の細胞周期の期がＭ期である場合に、当該生細胞の形態的特徴要素を、Ｍ期における生細胞の形態的特徴要素に対応するＭ期内の詳細期が格納されたデータテーブルと照合することにより、当該生細胞のＭ期内の詳細期を検出するＭ期内の詳細期検出手段をさらに備えるのが好ましい。
【００２７】
また、本発明の細胞画像解析システムにおいては、前記Ｍ期内の詳細期検出手段が検出した当該生細胞のＭ期内の詳細期が次の詳細期または次の細胞周期の期に変化するまでの詳細期の時間を計測するＭ期内の詳細期の時間計測手段をさらに備えるのが好ましい。
【００２８】
また、本発明の細胞画像解析システムにおいては、前記細胞周期の期の時間計測手段が計測した当該生細胞の第一の期から次の期に変化するまでの第一の期の時間と、前記細胞周期の期の時間計測手段が計測した当該生細胞の第二の期から次の期に変化するまでの第二の期の時間とを比較する細胞周期の期の時間比較手段をさらに備えるのが好ましい。
【００２９】
また、本発明の細胞画像解析システムにおいては、前記Ｍ期内の詳細期の時間計測手段が計測した当該生細胞のＭ期内の第一の詳細期が次の詳細期または次の細胞周期の期に変化するまでの第一の詳細期の時間と、前記Ｍ期内の詳細期の時間計測手段が計測した当該生細胞のＭ期内の第二の詳細期が次の詳細期または次の細胞周期の期に変化するまでの第二の詳細期の時間とを比較するＭ期内の詳細期の時間比較手段をさらに備えるのが好ましい。
【００３０】
また、本発明の細胞画像解析システムにおいては、前記同定手段が、前記細胞周期の期の時間計測手段が計測した当該生細胞の細胞周期の期の時間、前記Ｍ期内の詳細期の時間計測手段が計測した当該生細胞のＭ期内の詳細期の時間、前記細胞周期の期の時間比較手段が比較した当該生細胞の細胞周期の期の時間の比較値、前記Ｍ期内の詳細期の時間比較手段が比較した当該生細胞のＭ期内の詳細期の時間の比較値の少なくともいずれかを用いて、少なくとも細胞の種類を同定するのが好ましい。
【００３１】
また、本発明の細胞画像解析システムにおいては、前記同定手段は、さらに、前記細胞周期の期の時間計測手段が計測した当該生細胞の細胞周期の期の時間、前記Ｍ期内の詳細期の時間計測手段が計測した当該生細胞のＭ期内の詳細期の時間、前記細胞周期の期の時間比較手段が比較した当該生細胞の細胞周期の期の時間の比較値、前記Ｍ期内の詳細期の時間比較手段が比較した当該生細胞のＭ期内の詳細期の時間の比較値の少なくともいずれかを用いて、細胞分裂、細胞の成長度、細胞集団の層別、細胞の性質の少なくともいずれかを同定するのが好ましい。
【００３２】
また、本発明の細胞画像解析システムにおいては、前記細胞周期の期の時間計測手段は、一つの生細胞における複数世代の世代時間を計測し、前記画像解析ソフトウェアは、前記コンピュータを、さらに、前記細胞周期の期の時間計測手段が計測した当該一つの生細胞の異なる世代同士の世代時間を比較する世代時間比較手段として機能させ、前記同定手段は、さらに、前記世代時間比較手段が比較した当該一つの生細胞の異なる世代同士の世代時間の比較値を、生細胞の異なる世代同士の世代時間の比較値に対応する生細胞の変化情報が格納されたデータテーブルと照合することにより、当該一つの生細胞の変化を検出するのが好ましい。
【００３３】
また、本発明の細胞画像解析システムにおいては、前記細胞周期の期の時間計測手段は、二つ以上の生細胞のそれぞれにおける複数世代の世代時間を計測し、前記画像解析ソフトウェアは、前記コンピュータを、さらに、前記細胞周期の期の時間計測手段が計測した当該二つ以上の生細胞のそれぞれにおける異なる世代同士の世代時間を比較する世代時間比較手段として機能させ、前記同定手段は、さらに、前記世代時間比較手段が比較した当該二つ以上の生細胞のそれぞれにおける異なる世代同士の世代時間の比較値を、生細胞の異なる世代同士の世代時間の比較値に対応する生細胞の層別化情報が格納されたデータテーブルと照合することにより、当該二つ以上の生細胞を層別化するのが好ましい。
【００３４】
また、本発明の細胞画像解析システムにおいては、前記細胞周期の期の時間計測手段は、二つ以上の生細胞のそれぞれにおける複数世代の世代時間を計測し、前記画像解析ソフトウェアは、前記コンピュータを、さらに、前記細胞周期の期の時間計測手段が計測した当該二つ以上の生細胞のそれぞれにおける異なる世代同士の世代時間を比較する世代時間比較手段として機能させ、前記同定手段は、さらに、前記世代時間比較手段が比較した当該二つ以上の生細胞のそれぞれにおける異なる世代同士の世代時間の比較値を、生細胞の異なる世代同士の世代時間の比較値に対応する生細胞の変化情報及び層別化情報が格納されたデータテーブルと照合することにより、当該二つ以上の生細胞のそれぞれにおける変化を検出するとともに当該二つ以上の生細胞を層別化するのが好ましい。
【００３５】
また、本発明の細胞画像解析システムにおいては、前記画像取得装置は、投与する化学薬品、光刺激、遺伝子操作、温度・湿度・圧力・ＰＨ等の環境、培地の養分等の少なくともいずれかを異ならせた２つの計測条件下における生細胞の画像を時系列に取得し、前記世代時間比較手段は、前記２つの計測条件下のそれぞれにおいて、前記細胞周期の期の時間計測手段が計測した当該生細胞の世代時間を比較するのが好ましい。
【００３６】
また、本発明の細胞画像解析システムにおいては、前記生細胞が、ＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞、がん幹細胞の少なくともいずれかであるのが好ましい。
【００３７】
また、本発明の細胞画像解析システムにおいては、前記生細胞が、ＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞、がん幹細胞から分化した細胞の少なくともいずれかであるのが好ましい。
【００３８】
また、本発明の細胞画像解析システムにおいては、前記蛍光タンパクが、ＦＵＣＣＩであるのが好ましい。
【発明の効果】
【００３９】
本発明によれば、生細胞の顕微鏡画像を取得中に、細胞周期の各期、Ｍ期の詳細期を特定し、特定した細胞を特定し、特定した期に応じて細胞の種類を認識でき、例えば、ｉＰＳ細胞が樹立した細胞とその他の細胞との識別、ｉＰＳ細胞が樹立した細胞と樹立後に分化した細胞との識別、ｉＰＳ細胞が樹立した後に分化した細胞ごとの識別等や、細胞周期における細胞の状態の変化を正確に捉えることのできる細胞画像解析システムが得られる。
【図面の簡単な説明】
【００４０】
【図１】本発明の一実施形態にかかる細胞画像解析システムの全体構成を示すブロック図である。
【図２】細胞から発される蛍光輝度と細胞周期との相関関係を示す図で、(a)は撮像した細胞画像において細胞領域として特定された画素群における、細胞を染色した蛍光試薬から発せられる蛍光輝度の総量及び蛍光輝度の最大値と細胞の細胞周期の期との相関関係を示す説明図、(b)は撮像した細胞画像において細胞領域として特定された画素群における、細胞に導入した蛍光タンパクから発せられる異なる色ごとの蛍光輝度の総量の時間経過特性を示す説明図、(c)は(a)と(b)との対応付けにより分類した、撮像した細胞画像において細胞領域として特定された画素群における、細胞に導入した蛍光タンパクから発せられる異なる色ごとの蛍光輝度の総量と細胞の細胞周期の期との相関関係を示す図である。
【図３】Ｍ期内の詳細期ごとの細胞の状態を模式的に示す説明図で、(a)は前期における細胞の状態を示す図、(b)は前中期における細胞の状態を示す図、(c)は中期における細胞の状態を示す図、(d)は後期における細胞の状態を示す図、(e)は終期における細胞の状態を示す図、(f)は細胞質分裂の状態を示す図である。
【図４】本実施形態の細胞画像解析システムを用いた前段階の処理としての生細胞への蛍光タンパクの導入から生細胞画像の解析までの全体の処理手順の概略を示す説明図である。
【図５】本実施形態の細胞画像解析システムにおける細胞画像解析装置の処理手順を示すフローチャートである。
【図６】実施例１の細胞画像解析システムの全体構成を示すブロック図である。
【図７】種類の異なる細胞ごとの世代時間を模式的に示すグラフである。
【図８】実施例２の細胞画像解析システムの全体構成を示すブロック図である。
【図９】種類の異なる細胞ごとの世代数と世代数に応じた世代時間の合計値との相関関係を模式的に示すグラフである。
【図１０】実施例３の細胞画像解析システムの全体構成を示すブロック図である。
【図１１】特定の細胞の世代数と世代数に応じた世代時間の合計値との相関関係における理想値と測定値を模式的に示すグラフである。
【図１２】実施例４の細胞画像解析システムの全体構成を示すブロック図である。
【図１３】種類の異なる細胞ごとのＭ期内の詳細期の時間を模式的に示すグラフである。
【図１４】実施例５の細胞画像解析システムの全体構成を示すブロック図である。
【図１５】種類の異なる細胞ごとの一世代における細胞周期の各期の時間を模式的に示すグラフである。
【図１６】実施例６の細胞画像解析システムの全体構成を示すブロック図である。
【図１７】実施例７の細胞画像解析システムの全体構成を示すブロック図である。
【図１８】実施例１８の細胞画像解析システムの全体構成を示すブロック図である。
【発明を実施するための形態】
【００４１】
以下、図面に基づき、本発明の実施の形態を説明する。
図１は本発明の一実施形態にかかる細胞画像解析システムの全体構成を示すブロック図である。
本実施形態の細胞画像解析システムは、画像取得装置１と、細胞画像解析装置２と、培養装置（図示省略）と、電動ステージ（図示省略）を有する。
画像取得装置１は、蛍光顕微鏡、共焦点レーザ蛍光顕微鏡など、細胞の蛍光画像を観察する顕微鏡を用いて構成されており、顕微鏡観察光学系１ａと、撮像手段１ｂを有する。
顕微鏡観察光学系１ａは、光源、照明レンズ、複数種類の励起フィルタをターレット等に備えた励起光切換手段、対物レンズ、吸収フィルタ、結像レンズ等、を備えた一般的な蛍光顕微鏡、共焦点レーザ蛍光顕微鏡における照明光学系及び観察光学系（図示省略）で構成されており、試料の像を撮像素子１ｂ２の撮像面に結像する。
撮像手段１ｂは、撮像時間制御手段１ｂ１と撮像素子１ｂ２を有する。撮像素子１ｂ２は、顕微鏡観察光学系１ａを介して結像された細胞像を撮像する。撮像時間制御手段１ｂ１は、撮像素子１ｂ２が所定の時間的間隔でもって断続的に撮像動作を行うように制御する。
このような構成により、画像取得装置１は、細胞周期の特定の期に特異的に蛍光を発する色の異なる２つの蛍光タンパク、又は、細胞周期の期に応じて異なる色を発する１つの蛍光タンパクが導入された生細胞の画像を所定の時間的な間隔でもって時系列に取得する。
【００４２】
なお、生細胞の画像の時系列取得するための撮像時間制御手段１ｂ１による時間的な間隔は、細胞周期における各期、Ｍ期内の詳細期の時間を算出するための単位であるサンプリング時間となる。このため、時間的な間隔は短い方が望ましい。本実施形態の細胞画像解析システムにおける画像取得装置１では、ｍｓ〜数百ｍｓの短時間から１時間程度の長時間に至るまでの所定の時間的な間隔でもって画像取得するよう撮像時間制御手段１ｂ１が撮像する時間的な間隔を制御している。これに対し、細胞周期の１サイクルは、１日程度であるため、本実施形態の細胞画像解析システムにおける画像取得装置１が画像取得する時間的な間隔であれば、細胞周期の期の時間やＭ期内の詳細期の時間を算出する精度を充分に保つことが可能である。
【００４３】
培養装置（図示省略）は、ディッシュやマイクロプレートなどの容器中に収容された細胞サンプルを、温度・湿度を一定に保った状態で培養する。
電動ステージ（図示省略）は、ＸＹステージ等で構成されており、生細胞を収容したディシュやマイクロプレートを画像取得装置１における撮像位置に搬送する。
【００４４】
本実施形態の細胞画像解析システムにおける画像取得装置１は、顕微鏡観察において一視野内であれば、複数の生細胞の画像を同時に取得することができるようになっている。
なお、顕微鏡観察における一視野に入らない生細胞に対しては、ＸＹステージ等を用いて撮像位置に生細胞が位置するようにすることで、広範囲に生細胞の画像を取得することも可能になっている。あるいは、ＸＹステージを用いる代わりに、撮像素子１ｂ２をラインセンサ方式のＴＤＩ（Time Delay Integration：移動積分スキャン）カメラで構成することによって、広範囲に生細胞の画像を取得することができるようにしてもよい。
【００４５】
細胞画像解析装置２は、コンピュータ（例えば、パーソナルコンピュータ）と、画像解析ソフトウェアを備えて構成されている。
画像解析ソフトウェアは、コンピュータを、細胞領域特定手段２ａ、細胞周期の期検出手段２ｂ、細胞周期の期の時間計測手段２ｃ、Ｍ期内の詳細期検出手段２ｄ、Ｍ期内の詳細期の時間計測手段２ｅ、細胞周期の期の時間比較手段２ｆ、Ｍ期内の詳細期の時間比較手段２ｇ、同定手段２ｈとして機能させるように構成されている。
【００４６】
細胞領域特定手段２ａは、画像取得装置１が取得した画像において、蛍光輝度が所定の輝度の閾値を上回る画素群、あるいは隣接輝度との輝度差が所定の輝度値の閾値を上回る画素群を細胞領域として特定する。
【００４７】
細胞周期の期検出手段２ｂは、細胞領域特定手段２ａが細胞領域として特定した画素群における蛍光タンパクから発せられる異なる色同士の蛍光輝度の総量（即ち、画素群を構成する各画素の蛍光輝度を合計した値）の比及び異なる色ごとの蛍光輝度の総量の増加量を、データテーブル２ｔ−１と照合して、当該生細胞の細胞周期の期を検出する。
データテーブル２ｔ−１は、予め蛍光タンパクを導入するとともに蛍光タンパクとは別の所定の蛍光試薬で染色した、生細胞と同種の細胞の画像を画像取得装置１を介して取得し、細胞領域特定手段２ａを介して細胞領域として特定したデータテーブル作成用画素群における所定の蛍光試薬から発せられる蛍光輝度の総量（即ち、データテーブル作成用画素群を構成する各画素の蛍光輝度を合計した値）及び蛍光輝度の最大値（即ち、データテーブル作成用画素群を構成する画素のうち、最も蛍光輝度が高い画素の蛍光輝度）を用いて、細胞周期の期を分類するとともに、データテーブル作成用画素群における所定の蛍光試薬から発せられる蛍光輝度の総量及び蛍光輝度の最大値とデータテーブル作成用画素群における蛍光タンパクから発せられる異なる色同士の蛍光輝度の総量の比及び異なる色ごとの蛍光輝度の総量の増加量との対応付けを行うことによって得られた、蛍光タンパクから発せられる異なる色同士の蛍光輝度の総量の比及び異なる色ごとの蛍光輝度の総量の増加量に対応する細胞周期の期が格納されている。
【００４８】
図２は細胞から発される蛍光輝度と細胞周期との相関関係を示す図で、(a)は撮像した細胞画像において細胞領域として特定された画素群における、細胞を染色した蛍光試薬から発せられる蛍光輝度の総量及び蛍光輝度の最大値と細胞の細胞周期の期との相関関係を示す説明図、(b)は撮像した細胞画像において細胞領域として特定された画素群における、細胞に導入した蛍光タンパクから発せられる異なる色ごとの蛍光輝度の総量の時間経過特性を示す説明図、(c)は(a)と(b)との対応付けにより分類した、撮像した細胞画像において細胞領域として特定された画素群における、細胞に導入した蛍光タンパクから発せられる異なる色ごとの蛍光輝度の総量と細胞の細胞周期の期との相関関係を示す図である。
【００４９】
図２(a)において、蛍光輝度の総量は、細胞内のＤＮＡ量を反映している。また、細胞内の蛍光輝度の最大値は、クロマチン凝集度を反映している。
細胞周期は、細胞分裂を起こす期であるＭ期と、Ｍ間とＭ期との間の期であるＩ期に分けられる。さらに、Ｉ期は、ＤＮＡ合成の準備期であるＧ１期と、ＤＮＡが合成されて、染色体の複製が行われる期であるＳ期、Ｓ期とＭ期との間の細胞分裂の準備期であるＧ２期に分けられる。また、細胞周期から外れた期としてＧ０期がある。
【００５０】
Ｍ期においては、細胞の分裂に際し、細胞内のＤＮＡが合成されることによって複製された染色体が凝縮する。このため、Ｍ期においては、図２(a)に示すように、蛍光輝度の総量が大きく、且つ、蛍光輝度の最大値が大きくなっている。
細胞分裂後（ｐｏｓｔ Ｍ期）は、分裂した個々の細胞内のＤＮＡが少なくなる。そして、Ｇ１期では、ＤＮＡの合成のために必要な酵素が活性化される。このため、Ｇ１期においては、図２(a)に示すように、蛍光輝度の総量が小さくなっている。
なお、細胞は、通常、Ｇ１期おける酵素の活性化によりＳ期に移行するが、細胞分裂を続けない細胞は、Ｇ０期に移行する。
Ｓ期においては、細胞内でＤＮＡが合成されて染色体が複製される。このため、図２(a)に示すように、蛍光輝度の総量が増加している。
Ｇ２期においては、細胞分裂の準備の最終段階として、細胞内でタンパク質の合成が増加する。但し、この段階では、染色体は凝集していない。このため、図２(a)に示すように、蛍光輝度の総量が大きく、且つ、蛍光輝度の最大値が小さくなっている。
【００５１】
このように、生細胞の画素群における蛍光輝度の総量及び蛍光輝度の最大値と生細胞の細胞周期の期には、相関関係がある。
このような相関関係は、ＤＡＰＩなどの蛍光試薬を用いて染色した、大量の細胞集団における夫々の細胞領域として特定した画素群における蛍光輝度の総量及び細胞領域として特定した画素群内における最大蛍光輝度をプロットした散布図を作成し、散布図における相対的な値を用いて判別できる。しかし、ＤＡＰＩなどの蛍光試薬を用いる方法では、細胞を長時間生きたままの状態にしておくことが出来ない。
【００５２】
また、ＦＵＣＣＩなどの細胞周期の特定の期に特異的に蛍光を発する色の異なる２つの蛍光タンパク、又は、細胞周期の期に応じて異なる色を発する１つの蛍光タンパクを用いた蛍光プローブを細胞に導入すると、細胞周期の期に応じて特定のタンパクが発現する際に蛍光タンパクが同時に発現して異なる蛍光を発する、あるいは細胞周期の期に応じて１つの蛍光タンパクが異なる色を発する。このため、細胞における、蛍光タンパクから発せられる異なる色ごとの蛍光輝度の総量の時間的な変化（例えば、図２(b)に示すようなＦＵＣＣＩにおける赤色と緑色の夫々の光の輝度値の変化）、例えば、赤色と緑色の夫々の光に対して基準輝度を閾値として設定し、その基準輝度との相対的な大小関係によって、細胞周期の期を判別することができると考えられる。しかし、ＦＵＣＣＩを用いた場合、赤色、緑色の輝度値は、細胞ごとの性質や観察している細胞の周囲のノイズなどの要因によってバラツキが大きく、また、赤色に比べて緑色が強くなった状態での細胞周期の各期（Ｓ期，Ｇ２期，Ｍ期）を判別することが難しい。また、上記基準輝度の精度を上げるためには、多数の細胞の輝度値の平均を基準輝度とせざるを得ないが、それでは基準輝度から大きく外れた輝度値の光を発する細胞に対して正確な期を特定することが難しくなる。
【００５３】
そこで、本発明では、予め、上述したＤＡＰＩなどの蛍光試薬を用いた方法とＦＵＣＣＩを用いた方法とを組み合せることによって、蛍光タンパクから発せられる異なる色同士の蛍光輝度の総量の比及び異なる色ごとの蛍光輝度の増加量に対応する細胞周期の期が格納されたデータテーブル２ｔ−１を備えている。そして、細胞周期の期検出手段２ｂは、細胞領域特定手段２ａが細胞領域として特定した画素群における蛍光タンパクから発せられる異なる色同士の蛍光輝度の総量の比及び異なる色ごとの蛍光輝度の総量の増加量を、このデータテーブル２ｔ−１と照合することによって、当該生細胞の細胞周期の期を検出する。
【００５４】
ここで、データテーブル２ｔ−１の具体的な作成例について説明する。
例えば、所定の蛍光試薬であるＤＮＡインターカレータとして、ヘキスト、ＤＲＡＱ５を用いて細胞核を染色する。なお、後述するように、この細胞には、細胞周期の特定の期に特異的に蛍光を発する色の異なる２つの蛍光タンパク、又は、細胞周期の期に応じて異なる色を発する１つの蛍光タンパクとしてＦＵＣＣＩも導入されている。
【００５５】
まず、蛍光試薬を用いて細胞周期の期の検出を行う。
画像取得装置１を介して細胞画像を取得する。次いで、取得した細胞画像から細胞画像解析装置２の細胞領域特定手段２ａを介して細胞における細胞核の領域を特定する。
次いで、細胞領域特定手段２ａが細胞における細胞核の領域として特定したデータテーブル作成用画素群における蛍光輝度の総量及び蛍光輝度の最大値をパラメータとした散布図を作成する（図２(a)）。これにより、散布図上に細胞集団をなす各々の細胞が点として表される。次いで、散布図における細胞集団をなす各々の細胞の相対的な輝度値からＧ１期，Ｓ期，Ｇ２期，Ｍ期，ｐｏｓｔ Ｍ期（分裂後）を層別する。
【００５６】
一般に、Ｇ２期及びＭ期はＧ１期及びｐｏｓｔ Ｍ期（分裂後）と比較して輝度の合計値が約２倍となる。そこで、散布図において、輝度の合計値が２倍離れて分布している範囲を割り出す。これらの範囲のうち、輝度の合計値が小さい方の範囲をＧ１期及びｐｏｓｔ Ｍ期（分裂後）の範囲、大きい方の範囲をＧ２期及びＭ期の範囲とする。次いで、Ｇ１期及びｐｏｓｔ Ｍ期（分裂後）、Ｇ２期及びＭ期に該当するそれぞれの範囲における輝度の合計値の平均値（μ）と標準偏差（シグマ：σ）を計算する。そして、Ｇ１期及びｐｏｓｔ Ｍ期（分裂後）に該当する範囲の輝度の合計値の平均値μから+３σを上回り、且つ、Ｇ２期及びＭ期に該当する範囲の輝度の合計値の平均値μから−３σを下回る範囲をＳ期の範囲とする。
次に、Ｇ１期及びｐｏｓｔ Ｍ期（分裂後）の範囲における輝度の最大値の平均値（μ）と標準偏差（シグマ：σ）を計算する。そして、輝度の最大値の平均値μから±３σの範囲をＧ１期の範囲、それ以外をｐｏｓｔ Ｍ期（分裂後）の範囲とする。
同様に、Ｇ２期及びＭ期の範囲における輝度の最大値の平均値（μ）と標準偏差（シグマ：σ）を計算する。そして、輝度の最大値の平均値μから±３σの範囲をＧ２期の範囲、それ以外をＭ期の範囲とする。
このようにして定めた、輝度の最大値、輝度の合計値に対応するＧ１期，Ｇ２期，Ｓ期，Ｍ期，ｐｏｓｔ Ｍ期（分裂後）をコンピュータの記憶領域に格納する。
【００５７】
次に、蛍光試薬を用いて得た細胞周期の期を、蛍光タンパクから発せられる異なる色ごとの蛍光輝度の総量と対応付けする。
上記細胞の核には、例えば、細胞周期におけるそれぞれ異なる特定の時期にのみ存在するＧｅｍｉｎｉｎとＣｄｔ１という２種類のタンパク質にそれぞれ融合しうる２種類の蛍光タンパク質からなるＦＵＣＣＩと呼ばれる蛍光プローブが導入されている。
細胞領域特定手段２ａが細胞における細胞核の領域として特定したデータテーブル作成用画素群における蛍光のうち、Ｇｅｍｉｎｉｎに融合した蛍光タンパク質であるｍＡＧ１から発する緑色の光、Ｃｄｔ１に融合したたんぱく質であるｍｋＯ２から発する赤色の光について、１サイクルの細胞周期分の時間において所定のピッチで取得された夫々の画像から検出する。なお、ここでは、緑色の光、赤色の光の特性の変化が１回りする時間を１サイクルとする。これにより、図２(b)に示すような緑色の光、赤色の光のそれぞれにおける時間に対する輝度値の総量の特性を示すグラフが得られる。
このとき、細胞領域特定手段２ａが細胞における細胞核の領域として特定した画素群において、上述の蛍光試薬を用いた方法により、図２(a)に示すように、蛍光輝度の総量及び蛍光輝度の最大値が得られるとともに、その細胞周期の期が層別されている。
【００５８】
そこで、次に、図２(a)に示す散布図における細胞群における蛍光輝度の総量及び蛍光輝度の最大値と図２(b)に示す緑色の光、赤色の光のそれぞれの時間に対する輝度値の特性との対応付けを行い、対応付けしたデータをコンピュータの記憶領域に格納する。これにより、図２(b)で得た緑色の光、赤色の光のそれぞれの時間に対する輝度値の特性と、細胞周期のＧ１期，Ｓ期，Ｇ２期，Ｍ期とが、図２(c)に示すように対応付けられる。
次いで、図２(c)において、細胞周期のＧ１期，Ｓ期，Ｇ２期，Ｍ期に分けられたそれぞれの期間における緑色の光、赤色の光の輝度値の総量の比や、緑色の光と赤色の光の輝度値の総量の増加量を算出し、算出値をコンピュータの記憶領域に格納する。
これにより、データテーブル用画素群における蛍光タンパクから発せられる異なる色同士の蛍光輝度の総量の比及び異なる色ごとの蛍光輝度の増加量に対応する細胞周期の期がコンピュータの記憶領域に格納された、データテーブル２ｔ−１が作成される。
【００５９】
上記の作成例のデータテーブル２ｔ−１を用いた場合、細胞周期の期検出手段２ｂは、細胞領域特定手段２ａが細胞領域として特定した画素群における蛍光の輝度値の総量のうち、Ｃｄｔに融合した蛍光タンパク質であるｍＫＯ２から発する赤色の光がＧｅｍｉｎｉｎに融合した蛍光タンパク質であるｍＡＧ１から発する緑色の光よりも大きいときは、データテーブル２ｔ−１と照合してＧ１期と検出する。また、ｍＡＧ１から発する緑色の光が、ｍＫＯ２から発する赤色の光よりも大きいときは、ｍＡＧ１から発する緑色の蛍光輝度の総量とｍKＯ２から発する赤色の光の蛍光輝度の総量の比及び夫々の蛍光輝度ごとの増加量に対応する細胞周期の期が格納されたデータテーブル２ｔ−１と照合して、当該生細胞の細胞周期の期（Ｓ期，Ｇ２期，Ｍ期のいずれか）を検出する。
【００６０】
このように作成されたデータテーブル２ｔ−１を用いると、実際に観察する細胞に対しては、毒性の強い蛍光試薬で染色しなくて済むので、細胞を長時間生きたままの状態に保つことができる。また、データデーブル２ｔ−１の作成時には、蛍光試薬から発せられる蛍光輝度の総量及び蛍光輝度の最大値に、蛍光タンパクから発せられる異なる色同士の蛍光輝度の総量の比及び異なる色ごとの蛍光輝度の総量の増加量を対応付けたので、蛍光タンパクを用いた場合における細胞ごとの蛍光の輝度値のバラツキを補正でき、また、Ｓ期，Ｇ２期，Ｍ期を精度良く判別できるようになる。その結果、蛍光タンパクを用いて生細胞を観察しながら、精度良く細胞周期の期を検出することができるようになる。
【００６１】
細胞周期の期の時間計測手段２ｃは、細胞周期の期検出手段２ｂが検出した当該生細胞の細胞周期の期が次世代における当該細胞周期の期に変化するまでの世代時間を計測する。
上述したように、本実施形態の細胞画像解析システムにおいては、画像取得装置１が、撮像時間制御手段１ｂ１等を介して生細胞の画像を一定の時間的間隔で時系列に取得する。このため、撮像時間制御手段１ｂ１が制御する一定の時間的間隔に、細胞画像解析装置２において解析した画像の数を掛け合わせることで、所望の時間を算出することができる。
詳しくは、細胞周期の期の時間計測手段２ｃは、細胞周期の期検出手段２ｂが検出した当該生細胞の細胞周期の期が次世代における当該細胞周期の期に変化するまでの解析対象となった画像の数をカウントし、その画像数を撮像時間制御手段１ｂ１において定められた所定の時間的間隔に掛け合わせる。これにより、世代期間が算出される。
【００６２】
また、本実施形態では、細胞周期の期の時間計測手段２ｃは、細胞周期の期検出手段２ｂが検出した当該生細胞の細胞周期の期が次の期に変化するまでの期の時間を計測する機能も備えている。
即ち、細胞周期の期の時間計測手段２ｃは、細胞周期の期検出手段２ｂが検出した当該生細胞の細胞周期の期が次の期に変化するまでの解析対象となった画像の数をカウントし、その画像数を撮像時間制御手段１ｂ１において定められた所定の時間的間隔に掛け合わせる。これにより、細胞周期の期の時間が算出される。
即ち、ここでの「細胞周期の期の時間」とは、当該生細胞の細胞周期の期が次世代における当該細胞周期の期に変化するまでの世代時間、当該生細胞の細胞周期の期が次の期に変化するまでの期の時間のいずれも相当しうる。
【００６３】
Ｍ期内の詳細期検出手段２ｄは、細胞周期の期検出手段２ｂが検出した当該生細胞の細胞周期の期がＭ期である場合に、当該生細胞の形態的特徴要素を、Ｍ期における生細胞の形態的特徴要素に対応するＭ期内の詳細期が格納されたデータテーブル２ｔ−２と照合することにより、当該生細胞のＭ期内の詳細期を検出する。
【００６４】
図３はＭ期内の詳細期ごとの細胞の状態を模式的に示す説明図で、(a)は前期における細胞の状態を示す図、(b)は前中期における細胞の状態を示す図、(c)は中期における細胞の状態を示す図、(d)は後期における細胞の状態を示す図、(e)は終期における細胞の状態を示す図、(f)は細胞質分裂の状態を示す図である。
Ｍ期においては、有糸分裂と細胞質分裂が行われる。Ｍ期は、有糸分裂の段階に応じて、前期・前中期・中期・後期・終期に分けられる。
前期では、図３(a)に示すように、染色体３ａが凝縮し、セントロゾーム（中心体）３ｂが２つ構成され、微小管３ｃが伸びる。前中期では、図３(b)に示すように、核膜３ｄが消失し、染色体３ａが赤道面へ移動し始める。中期では、図３(c)に示すように、染色体３ａが赤道面上に並ぶ。後期では、図３(d)に示すように、染色体３ａが分離し始め、極方向に移動を開始する。終期では、図３(e)に示すように、染色体３ａが両極へ移動を完了し凝集がなくなるとともに、新しい核膜３ｄが形成される。その後、細胞質分裂は、終期の間に始まる。そして、図３(f)に示すように、細胞質分裂により、細胞が２つに分裂する。
【００６５】
このように、Ｍ期の詳細な各期においては、それぞれ、細胞に形態的特徴が現れる。
そこで、本実施形態の細胞画像解析システムでは、細胞画像解析装置２に備わるコンピュータの記憶領域に、Ｍ期における生細胞の形態的特徴要素に対応するＭ期内の詳細期を格納したデータテーブル２ｔ−２を備えている。そして、Ｍ期内の詳細期検出手段２ｄが、細胞周期の期検出手段２ｂが検出した当該生細胞の細胞周期の期がＭ期である場合に、当該生細胞の形態的特徴要素を、Ｍ期における生細胞の形態的特徴要素に対応するＭ期内の詳細期が格納されたデータテーブル２ｔ−２と照合することによって、当該生細胞のＭ期内の詳細期を検出するようにしている。
【００６６】
Ｍ期内の詳細期の時間計測手段２ｅは、Ｍ期内の詳細期検出手段２ｄが検出した当該生細胞のＭ期内の詳細期が次の詳細期または次の細胞周期の期に変化するまでの詳細期の時間を計測する。
即ち、Ｍ期内の詳細期の時間計測手段２ｅは、Ｍ期内の詳細期検出手段２ｄが検出した当該生細胞のＭ期内の詳細期が次の詳細期に変化するまで、またはＭ期の終期が次の細胞周期の期であるＧ１期に変化するまでの解析対象となった細胞画像の数をカウントし、その画像数を撮像時間制御手段１ｂ１において定められた所定の時間的間隔に掛け合わせる。これにより、Ｍ期内の詳細期の時間が算出される。
【００６７】
細胞周期の期の時間比較手段２ｆは、細胞周期の期の時間計測手段２ｃが計測した当該生細胞の第一の期から次の期に変化するまでの第一の期の時間と、細胞周期の期の時間計測手段２ｃが計測した当該生細胞の第二の期から次の期に変化するまでの第二の期の時間とを比較する。そして、例えば、双方の期の時間の差分等、客観的な比較値を示す数値データを作成する。
なお、ここでの「第一の期の時間」及び「第二の期の時間」としては、例えば、互いに同一世代内における異なる二つの細胞周期の期同士の時間や、互いに異なる二つの世代における一つの細胞周期の期同士の時間が相当しうる。
【００６８】
Ｍ期内の詳細期の時間比較手段２ｇは、Ｍ期内の詳細期の時間計測手段２ｅが計測した当該生細胞のＭ期内の第一の詳細期が次の詳細期に変化するまで、またはＭ期の終期が次の細胞周期の期であるＧ１期に変化するまでの第一の詳細期の時間と、Ｍ期内の詳細期の時間計測手段２ｅが計測した当該生細胞のＭ期内の第二の詳細期が次の詳細期に変化するまで、またはＭ期の終期が次の細胞周期の期であるＧ１期に変化するまでの第二の詳細期の時間とを比較する。そして、例えば、双方のＭ期内の詳細期の時間の差分等、客観的な比較値を示す数値データを作成する。
なお、ここでの「第一の詳細期の時間」と「第二の詳細期の時間」としては、例えば、互いに同一世代のＭ期内における異なる二つの詳細期の時間や、互いに異なる二つの世代における一つのＭ期内の詳細期の時間が相当しうる。
【００６９】
同定手段２ｈは、細胞周期の期の時間計測手段２ｃが計測した当該生細胞の細胞周期の期の時間、Ｍ期内の詳細期の時間計測手段２ｅが計測した当該生細胞のＭ期内の詳細期の時間、細胞周期の期の時間比較手段２ｆが比較した当該生細胞の細胞周期の期の時間の比較値、Ｍ期内の詳細期の時間比較手段２ｇが比較した当該生細胞のＭ期内の異なる詳細期同士の詳細期の時間の比較値の少なくともいずれかを用いて、少なくとも細胞の種類を同定する。
同定手段２ｈは、さらに、細胞周期の期の時間計測手段２ｃが計測した当該生細胞の細胞周期の期の時間、Ｍ期内の詳細期の時間計測手段２ｅが計測した当該生細胞のＭ期内の詳細期の時間、細胞周期の期の時間比較手段２ｆが比較した当該生細胞の細胞周期の期の時間の比較値、Ｍ期内の詳細期の時間比較手段２ｇが比較した当該生細胞のＭ期内の異なる詳細期同士の詳細期の時間の比較値の少なくともいずれかを用いて、細胞分裂、細胞の成長度、細胞集団の層別、細胞集団の成長度、細胞の性質の少なくともいずれかを同定する。
【００７０】
次に、このように構成された本実施形態の細胞画像解析システムを用いた生細胞の標識・染色から生細胞の画像の解析までの全体の処理手順について説明する。
図４は本実施形態の細胞画像解析システムを用いた前段階の処理としての生細胞への蛍光タンパクの導入から生細胞の画像の解析までの全体の処理手順の概略を示す説明図である。
全体の処理は、図４に示すように、前段階の処理としての生細胞への蛍光タンパクの導入（ステップＳ１）、画像取得装置１による生細胞の画像の取得（ステップＳ２）、細胞画像解析装置２による生細胞の画像の解析（ステップＳ３）の順で行う。生細胞への蛍光タンパクの導入（ステップＳ１）後、タイムラプス観察を行い、生細胞の画像の取得（ステップ２）と生細胞の画像の解析（ステップ３）を繰り返し行う。
【００７１】
蛍光タンパクの導入処理段階（ステップＳ１）
蛍光タンパクの導入処理段階では、細胞周期の特定の期に特異的に蛍光を発する色の異なる２つの蛍光タンパク、又は、細胞周期の期に応じて異なる色を発する１つの蛍光タンパクとして、ＦＵＣＣＩ（Fluorescent Ubiqutination-based Cell Cycle Indicator: フーチ)を細胞内に導入する。そして、蛍光タンパクが導入された複数の細胞が、例えば、マルチウェルプレートに播種された状態にして、顕微鏡によりタイムラプス観察を行えるようにする。
【００７２】
細胞画像取得段階（ステップＳ２）
撮像処理段階では、顕微鏡を用いて構成された細胞画像取得装置１の顕微鏡観察光学系１ａが、試料中の生細胞の像を結像し、撮像素子１ｂ２が顕微鏡観察光学系１ａを介して結像された細胞像を所定の時間的間隔でもって撮像する。これにより、蛍光タンパクを導入された生細胞の画像が時系列に取得される。
【００７３】
生細胞の画像の解析処理段階（ステップＳ３）
図５は本実施形態の細胞画像解析システムにおける細胞画像解析装置の処理手順を示すフローチャートである。
生細胞の画像の解析処理段階では、まず、細胞画像解析装置２の細胞領域特定手段２ａが、画像取得装置１が取得した画像において、蛍光輝度が所定の輝度の閾値を上回る画素群、あるいは隣接輝度との輝度差が所定の輝度差の閾値を上回る画素群を細胞領域として特定する（ステップＳ３１）。
【００７４】
次いで、細胞周期の期検出手段２ｂが、細胞領域特定手段２ａが細胞領域として特定した画素群における蛍光タンパクから発せられる異なる色同士の蛍光輝度の総量の比及び異なる色ごとの蛍光輝度の総量の増加量を、上述した、蛍光タンパクから発せられる異なる色同士の蛍光輝度の総量の比及び異なる色ごとの蛍光輝度の総量の増加量に対応する細胞周期の期が格納されたデータテーブル２ｔ−１と照合して、当該生細胞の細胞周期の期を検出する（ステップＳ３２）。
【００７５】
ここで、細胞周期の期が次の期に移行したときには、細胞周期の期の時間計測手段２ｃが、細胞周期の期検出手段２ｂが検出した当該生細胞の細胞周期の期が次の期に変化するまでの解析対象となった画像の数をカウントし、その画像数を撮像時間制御手段１ｂ１において定められた所定の時間的間隔に掛け合わせて、細胞周期の期の時間を算出する（ステップＳ３３，Ｓ３４）。
【００７６】
また、細胞周期の期が当世代の次世代の当該期に移行したときには、細胞周期の期の時間計測手段２ｃが、細胞周期の期検出手段２ｂが検出した当該生細胞の細胞周期の期が次世代における当該細胞周期の期に変化するまでの解析対象となった画像の数をカウントし、その画像数を撮像時間制御手段１ｂ１において定められた所定の時間的間隔に掛け合わせて、世代期間を算出する（ステップＳ３５，Ｓ３６）。
【００７７】
また、細胞周期の期検出手段２ｂが検出した当該生細胞の細胞周期の期がＭ期である場合には、Ｍ期内の詳細期検出手段２ｄが、当該生細胞の形態的特徴要素を、Ｍ期における生細胞の形態的特徴要素に対応するＭ期内の詳細期が格納されたデータテーブル２ｔ−２と照合することにより、当該生細胞のＭ期内の詳細期を検出する（ステップＳ３７，Ｓ３８）。
【００７８】
また、Ｍ期内の詳細期が次の期に移行したときには、Ｍ期内の詳細期の時間計測手段２ｅが、Ｍ期内の詳細期検出手段２ｄが検出した当該生細胞のＭ期内の詳細期が次の詳細期または次の細胞周期の期に変化するまでの解析対象となった画像の数をカウントし、その画像数を撮像時間制御手段１ｂ１において定められた所定の時間的間隔に掛け合わせて、Ｍ期内の詳細期の時間を算出する（ステップＳ３９，Ｓ４０）。
【００７９】
次いで、細胞周期の期の時間比較手段２ｇが、細胞周期の期の時間計測手段２ｃが計測した当該生細胞の第一の期から次の期に変化するまでの第一の期の時間と、細胞周期の期の時間計測手段２ｃが計測した当該生細胞の第二の期から次の期に変化するまでの第二の期の時間とを比較し、例えば、双方の期の時間の差分等、客観的な比較値を示す数値データを作成する。（ステップＳ４１）。
【００８０】
また、Ｍ期内の詳細期の時間比較手段２ｇが、Ｍ期内の詳細期の時間計測手段２ｅが計測した当該生細胞のＭ期内の第一の詳細期が次の詳細期または次の細胞周期の期に変化するまでの第一の詳細期の時間と、Ｍ期内の詳細期の時間計測手段２ｅが計測した当該生細胞のＭ期内の第二の詳細期が次の詳細期または次の細胞周期の期に変化するまでの第二の詳細期の時間とを比較し例えば、双方のＭ期内の詳細期の時間の差分等、客観的な比較値を示す数値データを作成する（ステップＳ４２）。
【００８１】
このように、本実施形態の細胞画像解析システムでは、画像取得装置１を介して取得した画像を用いて細胞分裂に関連する諸情報を取得する。そこで、その意義について説明する。
【００８２】
細胞は、細胞周期の進行を監視し、細胞の状態に異常等がある場合に、細胞周期の進行を減速ないし停止する制御機構（細胞周期チェックポイント）を備えている。
細胞周期チェックポイントは、次のポイントを監視し、異常が検知されたときに、チェックポイント制御因子と呼ばれるタンパク質リン酸化酵素（サイクリン依存性キナーゼ：Ｃｄｋ）とサイクリンという２種類のタンパク質からなる複合体の活性を制御することによって細胞周期の進行を減速ないし停止する。
・ＤＮＡ複製チェック
ＤＮＡの複製が完了してＭ期へ進む準備が整っているかを監視する。
・紡錘体集合チェック
紡錘体の形成が正常でＭ期後期に移行できるかを監視する。
・染色体分離チェック
Ｍ期終期に正常な染色体分離分配がなされたかを監視する。
・ＤＮＡ損傷チェック
Ｇ１期、Ｇ１期とＳ期との間、Ｓ期、Ｇ２期とＭ期との間で機能し、ＤＮＡ損傷の修復が完了したかを監視する。
【００８３】
細胞周期チェックポイントは、細胞周期の進行段階に応じて、例えば、Ｇ１期からＳ期へ移行する際のチェックポイント、Ｓ期チェックポイント、Ｇ２期からＭ期へ移行する際のチェックポイント、Ｍ期チェックポイント等に分類される。
Ｇ１期からＳ期へ移行する際のチェックポイントでは、Ｇ１期におけるＤＮＡ損傷の修復が完了したか否か、ＤＮＡ複製に必要な栄養や、増殖因子が存在するか否か等を監視する。
Ｓ期チェックポイントでは、ＤＮＡの複製に不具合がないか否かを監視する。
Ｇ２期からＭ期へ移行する際のチェックポイントでは、ＤＮＡ複製が完了したか否か、ＤＮＡ損傷の修復が完了したか否か、ＤＮＡ分配が可能であるか否か等を監視する。
Ｍ期チェックポイントでは、Ｍ期中期において、紡錘体の形成が完了したか否かを監視する。
【００８４】
そして、Ｇ１期の通過はサイクリンＤ−Ｃｄｋ４複合体、Ｓ期の開始はサイクリンＥ−Ｃｄｋ２複合体、Ｓ期の通過はサイクリンＡ―Ｃｄｋ２複合体、Ｇ２期の通過はサイクリンＡ−Ｃｄｋ１（Ｃｄｃ２）複合体、M期の開始はサイクリンＢ−Ｃｄｋ１（Ｃｄｃ２）複合体によってそれぞれ制御される。
【００８５】
このように細胞は、細胞周期チェックポイントにより、ＤＮＡの損傷等、正常な細胞分裂を進行するための条件を満たしていないときに、細胞周期を停止し、その間にＤＮＡ傷害等を修復し不正な遺伝情報蓄積によるがん化等、細胞の変異を防止する。
【００８６】
ところで、細胞周期チェックポイントによる細胞周期の進行の制御の破綻は、がんの発生と進行（細胞の無制御な異常増殖）の要因となると考えられている。
例えば、がん抑制遺伝子産物p53、Rb、BRCA1は，細胞周期チェックポイント制御に関与し、多くのがん抑制遺伝子産物はヒトのがんにおいて頻繁に不活性化され、多くのがんの原因となることが多い。細胞周期チェックポイントの異常は、遺伝的不安定性をもたらし、遺伝的不安定性は多くのがん細胞における主要な特徴となっている。
このようなことから、細胞周期における各期の時間やＭ期における各詳細期の時間の変化は、細胞の何らかの状態の変化を示し、さらには、細胞のがん化の予兆を示すシグナルとなり得るものと考えられる。
【００８７】
そこで、本実施形態の細胞画像解析システムでは、生細胞の細胞周期の期やＭ期における詳細期における時間の長さや、それらの時間の長さの比によって細胞を分類・層別化するようにしている。具体的には、同定手段２ｈが、細胞周期の期の時間計測手段２ｃが計測した当該生細胞の細胞周期の期の時間、Ｍ期内の詳細期の時間計測手段２ｅが計測した当該生細胞のＭ期内の詳細期の時間、細胞周期の期の時間比較手段２ｆが比較した当該生細胞の細胞周期の期の時間の比較値、Ｍ期内の詳細期の時間比較手段２ｇが比較した当該生細胞のＭ期内の詳細期の時間の比較値の少なくともいずれかを用いて、少なくとも細胞の種類を同定するようにしている。また、同定手段２ｈが、さらに、細胞周期の期の時間計測手段２ｃが計測した当該生細胞の細胞周期の期の時間、Ｍ期内の詳細期の時間計測手段２ｅが計測した当該生細胞のＭ期内の詳細期の時間、細胞周期の期の時間比較手段２ｆが比較した当該生細胞の細胞周期の期の時間の比較値、Ｍ期内の詳細期の時間比較手段２ｇが比較した当該生細胞のＭ期内の詳細期の時間の比較値の少なくともいずれかを用いて、細胞分裂、細胞の成長度、細胞集団の層別、細胞の性質の少なくともいずれかを同定するようにしている。
【００８８】
このため、本実施形態の細胞画像解析システムによれば、細胞分裂に関する時間的な情報に基づいて、細胞の種類を識別でき、さらに、例えば、細胞の特性の変化や、細胞の種類、細胞の分化の安定度、ｉＰＳ細胞の樹立した細胞とその他の細胞との識別、ｉＰＳ細胞の樹立後の分化した細胞との識別、分化した細胞ごとの識別等、ｉＰＳ細胞やＥＳ細胞、がん細胞の研究において有用と考えられる新たな解析データが得られる。
【００８９】
なお、本実施形態の細胞画像解析システムでは、細胞画像解析装置２は、表示手段（図示省略）と接続可能あるいは表示手段を備えている。従って、同定手段２ｈが同定したデータは、表示手段を介して表示され得る。
【００９０】
以下、本実施形態の細胞画像解析システムを用いた実施例について説明する。
実施例１
図６は実施例１の細胞画像解析システムの全体構成を示すブロック図、図７は種類の異なる細胞ごとの世代時間を模式的に示すグラフである。
例えば、樹立したｉＰＳ細胞、ｉＰＳ細胞から分化した細胞、がん細胞、卵細胞等は、それぞれの種類ごとに世代時間が異なる。
そこで、実施例１の細胞画像解析システムでは、細胞画像解析装置２は、種類の異なる細胞ごとの世代時間を格納したデータテーブル２ｔ−３を備えている。また、同定手段２ｈは、細胞周期の期の時間計測手段２ｃが計測した夫々の生細胞の世代時間を、種類の異なる細胞ごとの世代時間が格納されたデータテーブル２ｔ−３と照合して、細胞の種類を特定するように構成されている。
実施例１の細胞画像解析システムによれば、細胞の種類が、世代時間から特定できるようになる。
その他の構成及び作用効果は、図１に示した細胞画像解析システムと略同じである。
【００９１】
実施例２
図８は実施例２の細胞画像解析システムの全体構成を示すブロック図、図９は種類の異なる細胞ごとの世代数と世代数に応じた世代時間の合計値との相関関係を模式的に示すグラフである。
例えば、樹立したｉＰＳ細胞、ｉＰＳ細胞から分化した細胞、がん細胞、卵細胞等は、それぞれの種類ごとに、世代数と世代数に応じた世代時間の合計値との相関関係が異なり、その相関関係の違いは世代数を重ねるごとに明確になる。
そこで、実施例２の細胞画像解析システムでは、細胞画像解析装置２は、種類の異なる細胞ごとの世代数及び世代数に応じた世代時間の積算値を格納したデータテーブル２ｔ−４を備えている。また、細胞画像解析装置２に備わる画像解析ソフトウェアは、コンピュータを、さらに、細胞周期の期検出手段２ｂが検出した当該生細胞の細胞周期の期が次世代における当該細胞周期の期に到達したとき、即ち、細胞領域特定手段２ａが特定した夫々の生細胞の世代が変わるごとに世代数をカウントする世代数計測手段２ｉとしても機能させるように構成されている。また、細胞周期の期の時間計測手段２ｃ’は、当該世代の世代期間を算出するとともに、世代ごとの世代期間を積算するように構成されている。また、同定手段２ｈは、細胞周期の期の時間計測手段２ｃ’が計測した夫々の生細胞の世代時間の積算値及び世代数計測手段２ｉが計測した夫々の生細胞の世代数を、種類の異なる細胞ごとの世代数及び世代数に応じた世代時間の積算値が格納されたデータテーブル２ｔ−４と照合して、細胞の種類を特定するように構成されている。
実施例２の細胞画像解析システムによれば、細胞の種類を、一世代の世代時間からでは特定することが難しい場合であっても、特定することができるようになる。
その他の構成及び作用効果は、図１に示した細胞画像解析システムと略同じである。
【００９２】
実施例３
図１０は実施例３の細胞画像解析システムの全体構成を示すブロック図、図１１は特定の細胞の世代数と世代数に応じた世代時間の合計値との相関関係における理想値と測定値を模式的に示すグラフである。
一般に細胞は、分裂を繰り返していくにつれて固有の形態および機能を持った細胞へと変化して行く。分化とは、この形態的機能的な細胞の変化をいう。また、一般に細胞は、未分化細胞ほど細胞周期が短く盛んに細胞分裂を繰り返す傾向がある。また、正常組織の細胞は、分化の方向は一方向である。これに対し、がん細胞は、分化の方向が逆行する幼若化・脱分化という性質を有している。また、がん細胞は、分化度の低いものほど増殖が早くて悪性度が高く、分化度の高いものほど比較的悪性度が低い傾向にある。このため、細胞の分化度や分化の安定度は、細胞のがん化やがん細胞の状態を検知する指標となると考えられる。
【００９３】
そこで、実施例３の細胞画像解析システムでは、細胞画像解析装置２は、種類の異なる細胞ごとの世代数及び世代数に応じた世代時間の積算値の相関の理想値及び理想値からの乖離度に応じた細胞分化の安定度を格納したデータテーブル２ｔ−５を備えている。また、同定手段２ｈは、さらに、細胞周期の期の時間計測手段２ｃ’が計測した夫々の生細胞の世代時間の積算値及び世代数計測手段２ｉが計測した夫々の生細胞の世代数を用いて、夫々の生細胞における世代数及び世代数に応じた世代時間の積算値の相関を算出し、算出した相関値を、種類の異なる細胞ごとの世代数及び世代数に応じた世代時間の積算値の相関の理想値及び理想値からの乖離度に応じた細胞分化の安定度が格納されたデータテーブル２ｔ−５と照合して、夫々の細胞について細胞分化の安定度を検出するように構成されている。
実施例３の細胞画像解析システムによれば、複数世代の細胞の世代時間から、細胞分化の安定度を検出することができ、細胞のがん化や、がん化した細胞の悪性度などの診断に寄与しうる。
その他の構成及び作用効果は、図１及び図８に示した細胞画像解析システムと略同じである。
【００９４】
実施例４
図１２は実施例４の細胞画像解析システムの全体構成を示すブロック図、図１３は種類の異なる細胞ごとのＭ期内の詳細期の時間を模式的に示すグラフである。
例えば、樹立したｉＰＳ細胞、ｉＰＳ細胞から分化した細胞、がん細胞、卵細胞等は、それぞれの種類ごとにＭ期内の詳細期の時間及びＭ期全体の時間が異なる。
そこで、実施例４の細胞画像解析システムでは、細胞画像解析装置２は、種類の異なる細胞ごとのＭ期内の時間を詳細期の時間に分けて格納したデータテーブル２ｔ−６を備えている。また、同定手段２ｈは、Ｍ期内の詳細期の時間計測手段２ｅが計測した夫々の生細胞のＭ期内の詳細期の時間及びＭ期全体の時間を、種類の異なる細胞ごとのＭ期内の時間を詳細期の時間に分けて格納したデータテーブル２ｔ−６と照合して、細胞の種類を特定するように構成されている。
実施例４の細胞画像解析システムによれば、細胞の種類が、Ｍ期内の詳細期の時間及びＭ期全体の時間から特定できるようになる。
その他の構成及び作用効果は、図１に示した細胞画像解析システムと略同じである。
【００９５】
実施例５
図１４は実施例５の細胞画像解析システムの全体構成を示すブロック図、図１５は種類の異なる細胞ごとの一世代における細胞周期の各期の時間を模式的に示すグラフである。
例えば、樹立したｉＰＳ細胞、ｉＰＳ細胞から分化した細胞、がん細胞、卵細胞等は、それぞれの種類ごとに一世代における細胞周期の各期の時間及び世代時間が異なる。
そこで、実施例５の細胞画像解析システムでは、細胞画像解析装置２は、種類の異なる細胞ごとの一世代における細胞周期の時間を各期の時間に分けて格納したデータテーブル２ｔ−７を備えている。また、同定手段２ｈは、細胞周期の期の時間計測手段２ｃが計測した一世代における夫々の生細胞の細胞周期の各期の時間及び世代時間を、種類の異なる細胞ごとの一世代における細胞周期の時間を各期の時間に分けて格納したデータテーブル２ｔ−７と照合して、細胞の種類を特定するように構成されている。
実施例５の細胞画像解析システムによれば、細胞の種類が、一世代における細胞周期の各期の時間及び世代時間から特定できるようになる。
その他の構成及び作用効果は、図１に示した細胞画像解析システムと略同じである。
【００９６】
実施例６
図１６は実施例６の細胞画像解析システムの全体構成を示すブロック図である。
がん化等、細胞の変化に伴い世代時間も変化するものと考えられる。
そこで、実施例６の細胞画像解析システムでは、細胞画像解析装置２は、種類の異なる細胞ごとの異なる世代同士の世代時間の比較値（例えば、双方の世代時間の差分値）に対応する生細胞の変化情報を格納したデータテーブル２ｔ−８を備えている。また、細胞周期の期の時間計測手段２ｃは、一つの生細胞における複数世代の世代時間を計測するように構成されている。また、細胞画像解析装置２に備わる画像解析ソフトウェアは、コンピュータを、さらに、細胞周期の期の時間計測手段２ｃが計測した当該一つの生細胞の異なる世代同士の世代時間を比較する世代時間比較手段２ｊとしても機能させるように構成されている。また、同定手段２ｈは、さらに、世代時間比較手段２ｊが比較した当該一つの生細胞の異なる世代同士の世代時間の比較値を、生細胞の異なる世代同士の世代時間の比較値に対応する生細胞の変化情報が格納されたデータテーブル２ｔ−８と照合することにより、当該一つの生細胞の変化を検出するように構成されている。
実施例６の細胞画像解析装置によれば、一つの生細胞の異なる世代同士の世代時間の比較値から、細胞の変化を検出することができるようになる。
その他の構成及び作用効果は、図１に示した細胞画像解析システムと略同じである。
【００９７】
実施例７
図１７は実施例７の細胞画像解析システムの全体構成を示すブロック図である。
がん細胞等に対しては、層別化を行うことがその後の治療効果を上げるために重要であると考えられる。
そこで、実施例７の細胞画像解析システムでは、細胞周期の期の時間計測手段２ｃ”は、二つ以上の生細胞のそれぞれにおける複数世代の世代時間を計測するように構成されている。また、細胞画像解析装置２に備わる画像解析ソフトウェアは、コンピュータを、さらに、細胞周期の期の時間計測手段２ｃ”が計測した当該二つ以上の生細胞のそれぞれにおける異なる世代同士の世代時間を比較する世代時間比較手段２ｊ’として機能させるように構成されている。また、同定手段２ｈは、さらに、世代時間比較手段２ｊ’が比較した当該二つ以上の生細胞のそれぞれにおける異なる世代同士の世代時間の比較値を、生細胞の異なる世代同士の世代時間の比較値に対応する生細胞の層別化情報が格納されたデータテーブル２−９と照合することにより、当該二つ以上の生細胞を層別化するように構成されている。
その他の構成は、図１６に示した細胞画像解析システムと略同じである。
実施例７の細胞画像解析装置によれば、二つ以上の生細胞のそれぞれにおける異なる世代同士の世代時間の比較値から、当該二つ以上の生細胞を層別化することができるようになる。
その他の構成及び作用効果は、図１に示した細胞画像解析システムと略同じである。
【００９８】
実施例８
図１８は実施例１８の細胞画像解析システムの全体構成を示すブロック図である。
実施例８の細胞画像解析システムでは、細胞画像解析装置２は、種類の異なる細胞ごとの異なる世代同士の世代時間の比較値（例えば、双方の世代時間の差分値）に対応する生細胞の変化情報及び層別化情報を格納したデータテーブル２ｔ−１０を備えている。また、細胞周期の期の時間計測手段２ｃ”は、二つ以上の生細胞のそれぞれにおける複数世代の世代時間を計測するように構成されている。また、細胞画像解析装置２に備わる画像解析ソフトウェアは、コンピュータを、細胞周期の期の時間計測手段２ｃ”が計測した当該二つ以上の生細胞のそれぞれにおける異なる世代同士の世代時間を比較する世代時間比較手段２ｊ’として機能させるように構成されている。また、同定手段２ｈは、さらに、世代時間比較手段２ｊ’が比較した当該二つ以上の生細胞のそれぞれにおける異なる世代同士の世代時間の比較値を、生細胞の異なる世代同士の世代時間の比較値に対応する生細胞の変化情報及び層別化情報が格納されたデータテーブル２ｔ−１０と照合することにより、当該二つ以上の生細胞のそれぞれにおける変化を検出するとともに当該二つ以上の生細胞を層別化するように構成されている。
実施例８の細胞画像解析装置によれば、二つ以上の生細胞のそれぞれにおける異なる世代同士の世代時間の比較値から、当該二つ以上の生細胞のそれぞれにおける変化を検出すると同時に当該二つ以上の生細胞を層別化することができるようになる。
その他の構成及び作用効果は、図１に示した細胞画像解析システムと略同じである。
【００９９】
実施例９
実施例９の細胞画像解析システムでは、画像取得装置１は、投与する化学薬品、光刺激、遺伝子操作、温度・湿度・圧力・ＰＨ等の環境、培地の養分等の少なくともいずれかを異ならせた２つの計測条件下における生細胞の画像を時系列に取得するように構成されている。
また、世代時間比較手段２ｊ（２ｊ’）は、２つの計測条件下のそれぞれにおいて、細胞周期の期の時間計測手段２ｃ（２ｃ’，２ｃ”）が計測した当該生細胞の世代時間を比較する。
その他の構成は、実施例１〜８のいずれかの細胞画像解析システムと略同じである。
【０１００】
なお、上記各実施例の細胞画像解析システムにおいては、解析対象の生細胞は、ＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞、がん幹細胞の少なくともいずれかであるのが好ましい。または、生細胞が、ＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞、がん幹細胞から分化した細胞の少なくともいずれかであってもよい。
さらに、上記各実施例の細胞画像解析システムにおいては、蛍光色素が、ＦＵＣＣＩであるのが好ましい。
【０１０１】
上記各実施例の細胞画像解析システムによれば、がん化等による細胞分裂を続けそうな細胞を事前に認識し、細胞周期における細胞の変化を正確に捉えることができる。
なお、本発明の細胞画像解析システムは、上記実施例に記載の構成に限定されるものではなく、例えば、上記各実施例において特有の構成を任意に組み合せた構成としてもよい。
【０１０２】
また、本発明の細胞画像解析システムにおいては、細胞画像解析装置２を介して解析された解析結果に応じて、特定の細胞に対して詳細な画像の取得を行うように、画像取得装置１の画像取得動作を制御するようにしてもよい。
例えば、細胞画像解析装置２を介して特異な細胞が検出された場合、画像取得装置１における顕微鏡観察光学系１ａの倍率を高倍率にする、あるいは、撮像時間制御手段１の撮像時間間隔を短くする等の制御をして、この特異な細胞の分裂時の詳細な画像を取得するようにしてもよい。
【０１０３】
また、細胞画像取得のための時間は短いほうが、正確な細胞周期の期の時間を計測するためには好ましい。一方、画像取得装置１として用いる顕微鏡装置がレーザ顕微鏡の場合、撮像時におけるレーザによる細胞へのダメージを考慮すると、撮像のインターバルは長いほうが好ましい。そこで、細胞画像解析装置２を介して得られたデータから、細胞周期において注目を所望する期（細胞周期における所定の期やＭ期における所定の詳細期）の開始時刻と終了時刻を予測し、その所望する期を挟む前後の時間帯のみ撮像のインターバルを短くするとよい。
例えば、生細胞をＧ１期とＧ１期以外の期の長さの比で層別する場合、画像取得装置１は、当初は例えば１時間間隔のインターバルで生細胞を撮像し、細胞画像解析装置２が画像を解析する。ここで、細胞画像解析装置２がＧ１期からＳ期へ移行しそうな生細胞を検出した場合、画像取得装置１は、インターバルを例えば１０分間隔に短縮して生細胞を撮像する。そして、細胞画像解析装置２がＳ期に移行した期の時間を測定し、その後、画像取得装置１は元のインターバル（例えば１時間間隔）で撮像する。
同様に、例えば、Ｍ期からＰｏｓｔＭ期に移行するまでの時間で層別する場合、細胞画像解析装置２がＭ期からＰｏｓｔＭ期へ移行しそうな生細胞を検出した場合、画像取得装置１は、インターバルを例えば５分間隔に短縮して生細胞を撮像する。そして、細胞画像解析装置２がＰｏｓｔＭ期に移行した（細胞が完全に分裂した）時間を測定し、その後、画像取得装置１は元のインターバル（例えば１時間間隔）で撮像する。
このようにすれば、細胞へ与えるダメージを極力抑えながら、細胞周期における所望の期の時間を正確に計測することができる。
【産業上の利用可能性】
【０１０４】
本発明の細胞画像解析システムは、医療応用を目的としたｉＰＳ細胞、ＥＳ細胞、がん細胞を用いた診断や細胞遺伝子学研究を行う分野に有用である。
【符号の説明】
【０１０５】
１ 細胞画像取得装置
１ａ 顕微鏡観察光学系
１ｂ 撮像手段
１ｂ１ 撮像時間制御手段
１ｂ２ 撮像素子
２ 細胞画像解析装置
２ａ 細胞領域特定手段
２ｂ 細胞周期の期検出手段
２ｃ，２ｃ’，２ｃ” 細胞周期の期の時間計測手段
２ｄ Ｍ期内の詳細期検出手段
２ｅ Ｍ期内の詳細期の時間計測手段
２ｆ 細胞周期の期の時間比較手段
２ｇ Ｍ期内の詳細期の時間比較手段
２ｈ 同定手段
２ｉ 世代数計測手段
２ｊ，２ｊ’ 世代時間比較手段
２ｔ−１，２ｔ−２，２ｔ−３，２ｔ−４，２ｔ−５，２ｔ−６，２ｔ−７，２ｔ−８，２ｔ−９ データテーブル
３ａ 染色体
３ｂ セントロゾーム（中心体）
３ｃ 微小管
３ｄ 核膜
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生細胞の画像を取得し、取得した画像を用いて細胞を解析する細胞画像解析システムに関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、ＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞、癌肝細胞などの研究が盛んである。これらは、万能細胞と呼ばれる細胞であり、多様な細胞に分化することが可能である。
しかるに、これらの万能細胞が分化し、他の細胞に変化したことを顕微鏡観察しながら肉眼で確認することは、非常に困難である。分化する細胞が多種多様であり、細胞画像を肉眼で観察しただけでは、細胞画像中における細胞の種類を判別することが難しい。
このため、従来、万能細胞が分化して他の細胞に変化したことを確認するためには、分化した細胞を一旦取り出して増殖させ、増殖させた細胞に対して分子統計学的な解析を行うことによって、その分化した細胞の種類を特定するという手法を用いる必要があり、顕微鏡観察しながら分化した細胞の種類を特定することが困難であった。
【０００３】
この問題を解決する方法として、本件出願人は、培養した細胞における細胞周期を特定し、特定した細胞周期における各期やＭ期内の詳細期に要した時間に応じて、分化する細胞の種類を検出することを着想した。
【０００４】
従来、細胞周期を特定する方法としては、例えば、非特許文献１〜３、特許文献１に記載の方法がある。
【０００５】
非特許文献１に記載の方法は、ＤＮＡインターカレータであるＤＡＰＩやＰＩを用いて、細胞周期を解析する方法であり、次のような手順で行われる。
ＤＮＡインターカレータは、ＤＮＡの二本鎖間に挿入される蛍光試薬である。培養した細胞にＤＮＡインターカレータであるＤＡＰＩやＰＩで核を染色する。染色した細胞を、例えば、プレパラートに固定あるいはマルチウェルやシャーレ等の容器に収容して標本を作成し、顕微鏡を備えた撮像装置を介して画像を取得する。
取得した画像から核を認識して、各々の細胞を特定し、特定した細胞毎に、核内の蛍光量を測定する。蛍光量の測定は、核の画像ピクセル毎の輝度値の合計値と核内の画像ピクセルの最高輝度値との２つのパラメータから輝度の散布図を作図する。これにより、散布図上に各々の細胞が点として表される。散布図上に表された細胞集団における個々の細胞の相対的な輝度値からＧ１期、Ｓ期、Ｇ２期、Ｍ期、Ｍ期以後に層別することができる。また、プレパラート標本毎にＧ１期、Ｓ期、Ｇ２期、Ｍ期、Ｍ期以後のそれぞれに該当する細胞の割合を算出する、即ち、細胞周期における各期に該当する細胞の割合を算出することも可能である。
【０００６】
この点に関し、詳述する。
ＤＮＡインターカレータを用いると、ＤＮＡ量＝細胞画像輝度、の関係が成り立つ。このため、以下の分析方法を用いることによって細胞周期の特定が可能となる。
即ち、細胞周期の各期においては、ＤＮＡ量と核の凝集度が異なる。このＤＮＡ量と核の凝集度を、核の画像ピクセル毎の輝度値の合計値と核内の画像ピクセルの最高輝度値で測定する。
Ｇ１期においては、染色体が２本ある。このときのＤＮＡ量を２Ｎとする。Ｓ期においては、ＤＮＡの合成期にあり、２Ｎから４Ｎに増える過程にある。Ｇ２期においては、分裂前の準備期間にあり、ＤＮＡ量がＧ１期の２倍に増えた状態（４Ｎ）となる。また、Ｍ期においては、核が凝集するので明るくなる。
そこで、Ｇ１期，Ｓ期，Ｇ２期は、ＤＮＡ量（＝ＤＡＰＩの輝度の総和）によって特定する。ＤＮＡに直接結びつくタイプの蛍光試薬を用いると、蛍光量（核領域の輝度の総和）＝ＤＮＡ量となる。
Ｍ期は核の明るさで判断する。分裂期にある細胞は、輝度が明るく核が凝集している。このため、核領域中の最大輝度で判断する。
【０００７】
しかし、非特許文献１に記載の方法は、蛍光試薬として用いるＤＡＰＩに細胞毒性があり、染色する際に細胞が死ぬ、或いは細胞の特性が変わってしまう等の影響が出ないように殺す等により固定標本を対象とせざるを得ず、細胞を生かしたままで解析することが困難であり、細胞周期の各期に該当する細胞の統計的な割合を算出することは可能であるが、特定の細胞の細胞分裂する時間の割合や細胞分裂期における細胞分裂する状況を把握することが出来ない。また、非特許文献１に記載の方法は、散布図を作図するために数百以上の細胞集団に対して輝度値をプロットする必要があるため、仮に、細胞を生かしたまま解析するようにしたとしても、時間が掛かり過ぎるため、生細胞を用いた細胞周期の期の解析には実用的でない。
【０００８】
一方、蛍光顕微鏡（コンベンショナル顕微鏡、レーザ顕微鏡など）では、生きた細胞のタイムラプス観察が可能であり、サブマイクロ秒単位で細胞画像を取得し、Ｍ期における細胞分裂する状況を画像化することが可能である。このような細胞分裂する状況を画像化することにより、細胞の形態情報が認識できる。また、細胞が分裂した後、次に分裂するまでの画像を取得すれば、１サイクルの細胞分裂に要する時間（世代時間）も細胞の形態情報から認識可能である。
【０００９】
しかし、細胞画像から細胞周期における各期を認識することは、細胞の形態情報のみからでは困難である。
例えば、特許文献１には、細胞の形状等からＭ期における細胞分裂の詳細期を特定することが可能であることが示されている。しかし、特許文献１に記載の方法は、Ｍ期における細胞分裂の詳細期のみを計測する方法であって、細胞を培養中に細胞周期における各期の時間を計測することができない。また、特許文献１の方法には、Ｍ期における細胞分裂の詳細期の時間や詳細期毎の時間を計測することについての着想がない。
【００１０】
また、近年、非特許文献２，３に記載の方法のような、細胞周期を可視化する方法が提案されている。
非特許文献２に記載の方法は、細胞周期における特定の時期にのみ存在する２種類のタンパク質に、それぞれ融合しうる２種類の蛍光タンパク質からなるＦＵＣＣＩと呼ばれる蛍光プローブを細胞の核に導入して、細胞周期を可視化する方法である。ＦＵＣＣＩを導入された細胞は、Ｇ１期では赤色に光り、Ｓ期、Ｇ２期、Ｍ期では緑色に光る。非特許文献２に記載の方法を用いれば、Ｇ１期とそれ以外の期の時間を計測することが可能である。また、ＦＵＣＣＩには、ＤＡＰＩなどの蛍光試薬とは異なり、細胞毒性がないので、細胞周期の１サイクルの時間（世代時間）のみならず、細胞を生きたままの状態にして長時間計測することができる。
【００１１】
しかし、非特許文献２に記載の方法では、Ｓ期、Ｇ２期、Ｍ期の区別をすることができない。また、非特許文献２に記載の方法では、Ｍ期における細胞分裂の詳細期の時間や詳細期毎の時間を計測することができない。また、蛍光タンパクは、上述した非特許文献１に記載のような蛍光試薬に比べて、生細胞から発する蛍光シグナルが弱く、細胞ごとにシグナルのバラツキが生じやすい。このため、非特許文献２に記載の方法では、細胞周期を高精度に解析し難い。
【００１２】
非特許文献３の方法では、細胞周期に応じて細胞内における蛍光を発する部位が細胞核から細胞質へ移行する細胞周期マーカー（ＣＣＰＭ）を用いて、細胞周期を解析する。
しかし、非特許文献３に記載の方法では、細胞周期マーカーに毒性があるため、細胞を生きたままの状態では解析できず、細胞周期における各期を特定することができない。また、非特許文献３に記載の方法も、Ｍ期における細胞分裂の詳細期の時間や詳細期毎の時間を計測することができない。
【００１３】
さらに、これら特許文献１、非特許文献１〜３のいずれも、細胞周期の各期、或いはＭ期における詳細期を認識するものであって、種類の異なる細胞毎に、細胞周期の各期、Ｍ期における詳細期の時間を計測するものではないため、これらの方法では、細胞画像中における細胞の種類を判別することができない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１４】
【特許文献１】特開２００８−１６４５５１号公報
【非特許文献】
【００１５】
【非特許文献１】製品カタログ“レーザスキャニングサイトメータ ＬＳＣ２”， オリンパス光学工業株式会社
【非特許文献２】"Visualizing Spatiotemporal Dynamics of Multi cellular Cell-Cycle Progression", Cell 132, p487-498, February 8,2008, Elsevier inc.
【非特許文献３】“Ｇ１／Ｓ Ｃｅｌｌ Ｃｙｃｌｅ Ｐｈａｓｅ Ｍａｋｅｒ Ａｓｓａｙ”，ＧＥヘルスケア，［online］，http://www.gelifesciences.co.jp/technologies/cell-cycle/g1s.asp
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
上述したように、近年、生細胞の観察において、医療応用を目的としたｉＰＳ細胞やがん幹細胞による研究が盛んに行われている。また、ｉＰＳ細胞の研究では、ｉＰＳ細胞が樹立した後のがん化の問題が指摘されている。
このため、例えば、ｉＰＳ細胞が樹立した細胞とその他の細胞との識別、ｉＰＳ細胞が樹立した細胞と樹立後に分化した細胞との識別、ｉＰＳ細胞が樹立した後に分化した細胞ごとの識別等や、細胞周期における細胞の状態の変化の正確な把握をすべく、細胞分裂に関する時間情報の定量化や細胞追跡のニーズが高まっている。
【００１７】
また、ｉＰＳ細胞の分化解析を含めて、一般的に生きたままの細胞を観察したいというニーズは多い。
固定状態（死んだ状態）の細胞からは、固定状態の前後の時点における細胞の状態を正確に把握することができず、前後の時点における細胞の状態は、一般に統計的に推測することができるに過ぎないのに対し、細胞が生きたままの状態で観察すれば、現時点の前後の時点における細胞の状態を正確に把握することができる。
ｉＰＳ細胞などを含む幹細胞は、分裂と分化（「幹＝元の状態」から、特定の種類の細胞に変化する状態）を繰り返していくが、特に、分化がどのように進行するのかを観察するためには、生きた細胞を観察途中で殺す（＝固定する）ことができない。
また、生きたままの細胞を観察することによって、細胞集団の中で特異な細胞を抽出することができる。例えば、がん細胞などでは、極く少数の細胞だけが分裂時に異常を起こす場合がある。また、ｉＰＳ細胞も作成方法によっては、がん化しやすくなることが知られている。このような細胞集団内における特異な細胞の抽出と解析を行うためには、個々の細胞に対して時間の経過にともなう状態の変化を辿るためにも、生きたままの細胞を解析することが必要である。
【００１８】
しかし、特許文献１や非特許文献１〜３記載の技術では、上述のように、細胞周期の各期、或いはＭ期における詳細期を認識するものであって、種類の異なる細胞毎に、細胞周期の各期、Ｍ期における詳細期の時間を計測するものではないため、これらの方法では、異なる種類の細胞を特定することが難しい。このため、特定した種類の細胞ごとに、がん化等により細胞分裂を続けそうな細胞を事前に認識すること等や、細胞周期における細胞の状態の変化を正確に捉えることが難しい。
【００１９】
また、そもそも非特許文献１、３に記載の方法のようなＤＡＰＩやＣＣＰＭ等の蛍光試薬は毒性があり、生細胞の観察に適さない。非特許文献２に記載の蛍光タンパクを用いれば生細胞を観察することができるが、蛍光タンパクから発せられる蛍光は通常の蛍光試薬から発せられる蛍光に比べて輝度が弱く、蛍光タンパク遺伝子導入時における細胞の環境（温度やＰｈ）や、周囲の細胞の多さなど、の条件によって、蛍光タンパクの蛍光量（輝度）にバラツキが大きいうえ。Ｇ１期，Ｓ期，Ｇ２期を判別できず、しかもＭ期における詳細期を分類することができない。このため、従来の方法では、生細胞を観察しながら細胞周期の期及びＭ期における詳細期を特定することが難しい。
【００２０】
本発明は、このような従来の問題点に鑑みてなされたものであり、生細胞の顕微鏡画像を取得中に、細胞周期の各期、Ｍ期の詳細期を特定し、特定した期に応じて細胞の種類を認識でき、例えば、ｉＰＳ細胞が樹立した細胞とその他の細胞との識別、ｉＰＳ細胞が樹立した細胞と樹立後に分化した細胞との識別、ｉＰＳ細胞が樹立した後に分化した細胞ごとの識別等や、細胞周期における細胞の状態の変化を正確に捉えることのできる細胞画像解析システムを提供することを目的としている。
【課題を解決するための手段】
【００２１】
上記目的を達成するため、本発明による細胞画像解析システムは、細胞周期の特定の期に特異的に蛍光を発する蛍光タンパクが導入された生細胞の画像を時系列に取得する、顕微鏡を備えた画像取得装置と、前記画像取得装置が時系列に取得した画像を用いて生細胞に対する所定の解析を行う、コンピュータを備えた細胞画像解析装置と、を有する細胞画像解析システムであって、前記細胞画像解析装置は、前記コンピュータを、前記画像取得装置が取得した画像において、蛍光輝度が所定の輝度の閾値を上回る画素群、あるいは隣接輝度との輝度差が所定の輝度差の閾値を上回る画素群を細胞領域として特定する細胞領域特定手段、前記蛍光タンパクから発せられる蛍光に対応する細胞周期の期が格納されたデータテーブルと照合して、当該生細胞の細胞周期の期を検出する細胞周期の期検出手段、前記細胞周期の期検出手段が検出した当該生細胞の細胞周期の期が別の期に変化するまでの細胞周期の期の時間を計測する細胞周期の期の時間計測手段、前記細胞周期の期の時間を用いて、少なくとも細胞の種類を同定する同定手段、として機能させる画像解析ソフトウェアを備えたことを特徴としている。
【００２２】
また、本発明の細胞画像解析システムにおいては、前記データテーブルは、予め前記蛍光タンパクを導入するとともに前記蛍光タンパクとは別の所定の蛍光試薬で染色した、前記生細胞と同種の細胞において、前記所定の蛍光試薬から発せられる蛍光を用いて細胞周期の期を分類するとともに、前記所定の蛍光試薬から発せられる蛍光と、前記蛍光タンパクから発せられる蛍光との対応付けを行うことによって得られたものであるのが好ましい。
【００２３】
また、本発明の細胞画像解析システムにおいては、前記蛍光タンパクが色の異なる２つの蛍光タンパクであり、前記細胞周期の期検出手段が、前記細胞領域特定手段が細胞領域として特定した画素群における前記蛍光タンパクから発せられる異なる色同士の蛍光輝度の総量の比及び異なる色ごとの蛍光輝度の総量の増加量を、予め前記蛍光タンパクを導入するとともに前記蛍光タンパクとは別の所定の蛍光試薬で染色した、前記生細胞と同種の細胞の画像を前記画像取得装置を介して取得し、前記細胞領域特定手段を介して細胞領域として特定したデータテーブル作成用画素群における前記所定の蛍光試薬から発せられる蛍光輝度の総量及び蛍光輝度の最大値を用いて細胞周期の期を分類するとともに、前記データテーブル作成用画素群における前記所定の蛍光試薬から発せられる蛍光輝度の総量及び蛍光輝度の最大値と前記データテーブル作成用画素群における前記蛍光タンパクから発せられる異なる色同士の蛍光輝度の総量の比及び異なる色ごとの蛍光輝度の総量の増加量との対応付けを行うことによって得られた、前記蛍光タンパクから発せられる異なる色同士の蛍光輝度の総量の比及び異なる色ごとの蛍光輝度の総量の増加量に対応する細胞周期の期が格納されたデータテーブルと照合して、当該生細胞の細胞周期の期を検出するのが好ましい。
【００２４】
また、本発明の細胞画像解析システムにおいては、前記細胞周期の期の時間が、当該生細胞の細胞周期の期が次世代における当該細胞周期の期に変化するまでの世代時間であるのが好ましい。
【００２５】
また、本発明の細胞画像解析システムにおいては、前記細胞周期の期の時間が、当該生細胞の細胞周期の期が次の期に変化するまでの期の時間であるのが好ましい。
【００２６】
また、本発明の細胞画像解析システムにおいては、前記細胞周期の期検出手段が検出した当該生細胞の細胞周期の期がＭ期である場合に、当該生細胞の形態的特徴要素を、Ｍ期における生細胞の形態的特徴要素に対応するＭ期内の詳細期が格納されたデータテーブルと照合することにより、当該生細胞のＭ期内の詳細期を検出するＭ期内の詳細期検出手段をさらに備えるのが好ましい。
【００２７】
また、本発明の細胞画像解析システムにおいては、前記Ｍ期内の詳細期検出手段が検出した当該生細胞のＭ期内の詳細期が次の詳細期または次の細胞周期の期に変化するまでの詳細期の時間を計測するＭ期内の詳細期の時間計測手段をさらに備えるのが好ましい。
【００２８】
また、本発明の細胞画像解析システムにおいては、前記細胞周期の期の時間計測手段が計測した当該生細胞の第一の期から次の期に変化するまでの第一の期の時間と、前記細胞周期の期の時間計測手段が計測した当該生細胞の第二の期から次の期に変化するまでの第二の期の時間とを比較する細胞周期の期の時間比較手段をさらに備えるのが好ましい。
【００２９】
また、本発明の細胞画像解析システムにおいては、前記Ｍ期内の詳細期の時間計測手段が計測した当該生細胞のＭ期内の第一の詳細期が次の詳細期または次の細胞周期の期に変化するまでの第一の詳細期の時間と、前記Ｍ期内の詳細期の時間計測手段が計測した当該生細胞のＭ期内の第二の詳細期が次の詳細期または次の細胞周期の期に変化するまでの第二の詳細期の時間とを比較するＭ期内の詳細期の時間比較手段をさらに備えるのが好ましい。
【００３０】
また、本発明の細胞画像解析システムにおいては、前記同定手段が、前記細胞周期の期の時間計測手段が計測した当該生細胞の細胞周期の期の時間、前記Ｍ期内の詳細期の時間計測手段が計測した当該生細胞のＭ期内の詳細期の時間、前記細胞周期の期の時間比較手段が比較した当該生細胞の細胞周期の期の時間の比較値、前記Ｍ期内の詳細期の時間比較手段が比較した当該生細胞のＭ期内の詳細期の時間の比較値の少なくともいずれかを用いて、少なくとも細胞の種類を同定するのが好ましい。
【００３１】
また、本発明の細胞画像解析システムにおいては、前記同定手段は、さらに、前記細胞周期の期の時間計測手段が計測した当該生細胞の細胞周期の期の時間、前記Ｍ期内の詳細期の時間計測手段が計測した当該生細胞のＭ期内の詳細期の時間、前記細胞周期の期の時間比較手段が比較した当該生細胞の細胞周期の期の時間の比較値、前記Ｍ期内の詳細期の時間比較手段が比較した当該生細胞のＭ期内の詳細期の時間の比較値の少なくともいずれかを用いて、細胞分裂、細胞の成長度、細胞集団の層別、細胞の性質の少なくともいずれかを同定するのが好ましい。
【００３２】
また、本発明の細胞画像解析システムにおいては、前記細胞周期の期の時間計測手段は、一つの生細胞における複数世代の世代時間を計測し、前記画像解析ソフトウェアは、前記コンピュータを、さらに、前記細胞周期の期の時間計測手段が計測した当該一つの生細胞の異なる世代同士の世代時間を比較する世代時間比較手段として機能させ、前記同定手段は、さらに、前記世代時間比較手段が比較した当該一つの生細胞の異なる世代同士の世代時間の比較値を、生細胞の異なる世代同士の世代時間の比較値に対応する生細胞の変化情報が格納されたデータテーブルと照合することにより、当該一つの生細胞の変化を検出するのが好ましい。
【００３３】
また、本発明の細胞画像解析システムにおいては、前記細胞周期の期の時間計測手段は、二つ以上の生細胞のそれぞれにおける複数世代の世代時間を計測し、前記画像解析ソフトウェアは、前記コンピュータを、さらに、前記細胞周期の期の時間計測手段が計測した当該二つ以上の生細胞のそれぞれにおける異なる世代同士の世代時間を比較する世代時間比較手段として機能させ、前記同定手段は、さらに、前記世代時間比較手段が比較した当該二つ以上の生細胞のそれぞれにおける異なる世代同士の世代時間の比較値を、生細胞の異なる世代同士の世代時間の比較値に対応する生細胞の層別化情報が格納されたデータテーブルと照合することにより、当該二つ以上の生細胞を層別化するのが好ましい。
【００３４】
また、本発明の細胞画像解析システムにおいては、前記細胞周期の期の時間計測手段は、二つ以上の生細胞のそれぞれにおける複数世代の世代時間を計測し、前記画像解析ソフトウェアは、前記コンピュータを、さらに、前記細胞周期の期の時間計測手段が計測した当該二つ以上の生細胞のそれぞれにおける異なる世代同士の世代時間を比較する世代時間比較手段として機能させ、前記同定手段は、さらに、前記世代時間比較手段が比較した当該二つ以上の生細胞のそれぞれにおける異なる世代同士の世代時間の比較値を、生細胞の異なる世代同士の世代時間の比較値に対応する生細胞の変化情報及び層別化情報が格納されたデータテーブルと照合することにより、当該二つ以上の生細胞のそれぞれにおける変化を検出するとともに当該二つ以上の生細胞を層別化するのが好ましい。
【００３５】
また、本発明の細胞画像解析システムにおいては、前記画像取得装置は、投与する化学薬品、光刺激、遺伝子操作、温度・湿度・圧力・ＰＨ等の環境、培地の養分等の少なくともいずれかを異ならせた２つの計測条件下における生細胞の画像を時系列に取得し、前記世代時間比較手段は、前記２つの計測条件下のそれぞれにおいて、前記細胞周期の期の時間計測手段が計測した当該生細胞の世代時間を比較するのが好ましい。
【００３６】
また、本発明の細胞画像解析システムにおいては、前記生細胞が、ＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞、がん幹細胞の少なくともいずれかであるのが好ましい。
【００３７】
また、本発明の細胞画像解析システムにおいては、前記生細胞が、ＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞、がん幹細胞から分化した細胞の少なくともいずれかであるのが好ましい。
【００３８】
また、本発明の細胞画像解析システムにおいては、前記蛍光タンパクが、ＦＵＣＣＩであるのが好ましい。
【発明の効果】
【００３９】
本発明によれば、生細胞の顕微鏡画像を取得中に、細胞周期の各期、Ｍ期の詳細期を特定し、特定した細胞を特定し、特定した期に応じて細胞の種類を認識でき、例えば、ｉＰＳ細胞が樹立した細胞とその他の細胞との識別、ｉＰＳ細胞が樹立した細胞と樹立後に分化した細胞との識別、ｉＰＳ細胞が樹立した後に分化した細胞ごとの識別等や、細胞周期における細胞の状態の変化を正確に捉えることのできる細胞画像解析システムが得られる。
【図面の簡単な説明】
【００４０】
【図１】本発明の一実施形態にかかる細胞画像解析システムの全体構成を示すブロック図である。
【図２】細胞から発される蛍光輝度と細胞周期との相関関係を示す図で、(a)は撮像した細胞画像において細胞領域として特定された画素群における、細胞を染色した蛍光試薬から発せられる蛍光輝度の総量及び蛍光輝度の最大値と細胞の細胞周期の期との相関関係を示す説明図、(b)は撮像した細胞画像において細胞領域として特定された画素群における、細胞に導入した蛍光タンパクから発せられる異なる色ごとの蛍光輝度の総量の時間経過特性を示す説明図、(c)は(a)と(b)との対応付けにより分類した、撮像した細胞画像において細胞領域として特定された画素群における、細胞に導入した蛍光タンパクから発せられる異なる色ごとの蛍光輝度の総量と細胞の細胞周期の期との相関関係を示す図である。
【図３】Ｍ期内の詳細期ごとの細胞の状態を模式的に示す説明図で、(a)は前期における細胞の状態を示す図、(b)は前中期における細胞の状態を示す図、(c)は中期における細胞の状態を示す図、(d)は後期における細胞の状態を示す図、(e)は終期における細胞の状態を示す図、(f)は細胞質分裂の状態を示す図である。
【図４】本実施形態の細胞画像解析システムを用いた前段階の処理としての生細胞への蛍光タンパクの導入から生細胞画像の解析までの全体の処理手順の概略を示す説明図である。
【図５】本実施形態の細胞画像解析システムにおける細胞画像解析装置の処理手順を示すフローチャートである。
【図６】実施例１の細胞画像解析システムの全体構成を示すブロック図である。
【図７】種類の異なる細胞ごとの世代時間を模式的に示すグラフである。
【図８】実施例２の細胞画像解析システムの全体構成を示すブロック図である。
【図９】種類の異なる細胞ごとの世代数と世代数に応じた世代時間の合計値との相関関係を模式的に示すグラフである。
【図１０】実施例３の細胞画像解析システムの全体構成を示すブロック図である。
【図１１】特定の細胞の世代数と世代数に応じた世代時間の合計値との相関関係における理想値と測定値を模式的に示すグラフである。
【図１２】実施例４の細胞画像解析システムの全体構成を示すブロック図である。
【図１３】種類の異なる細胞ごとのＭ期内の詳細期の時間を模式的に示すグラフである。
【図１４】実施例５の細胞画像解析システムの全体構成を示すブロック図である。
【図１５】種類の異なる細胞ごとの一世代における細胞周期の各期の時間を模式的に示すグラフである。
【図１６】実施例６の細胞画像解析システムの全体構成を示すブロック図である。
【図１７】実施例７の細胞画像解析システムの全体構成を示すブロック図である。
【図１８】実施例１８の細胞画像解析システムの全体構成を示すブロック図である。
【発明を実施するための形態】
【００４１】
以下、図面に基づき、本発明の実施の形態を説明する。
図１は本発明の一実施形態にかかる細胞画像解析システムの全体構成を示すブロック図である。
本実施形態の細胞画像解析システムは、画像取得装置１と、細胞画像解析装置２と、培養装置（図示省略）と、電動ステージ（図示省略）を有する。
画像取得装置１は、蛍光顕微鏡、共焦点レーザ蛍光顕微鏡など、細胞の蛍光画像を観察する顕微鏡を用いて構成されており、顕微鏡観察光学系１ａと、撮像手段１ｂを有する。
顕微鏡観察光学系１ａは、光源、照明レンズ、複数種類の励起フィルタをターレット等に備えた励起光切換手段、対物レンズ、吸収フィルタ、結像レンズ等、を備えた一般的な蛍光顕微鏡、共焦点レーザ蛍光顕微鏡における照明光学系及び観察光学系（図示省略）で構成されており、試料の像を撮像素子１ｂ２の撮像面に結像する。
撮像手段１ｂは、撮像時間制御手段１ｂ１と撮像素子１ｂ２を有する。撮像素子１ｂ２は、顕微鏡観察光学系１ａを介して結像された細胞像を撮像する。撮像時間制御手段１ｂ１は、撮像素子１ｂ２が所定の時間的間隔でもって断続的に撮像動作を行うように制御する。
このような構成により、画像取得装置１は、細胞周期の特定の期に特異的に蛍光を発する色の異なる２つの蛍光タンパク、又は、細胞周期の期に応じて異なる色を発する１つの蛍光タンパクが導入された生細胞の画像を所定の時間的な間隔でもって時系列に取得する。
【００４２】
なお、生細胞の画像の時系列取得するための撮像時間制御手段１ｂ１による時間的な間隔は、細胞周期における各期、Ｍ期内の詳細期の時間を算出するための単位であるサンプリング時間となる。このため、時間的な間隔は短い方が望ましい。本実施形態の細胞画像解析システムにおける画像取得装置１では、ｍｓ〜数百ｍｓの短時間から１時間程度の長時間に至るまでの所定の時間的な間隔でもって画像取得するよう撮像時間制御手段１ｂ１が撮像する時間的な間隔を制御している。これに対し、細胞周期の１サイクルは、１日程度であるため、本実施形態の細胞画像解析システムにおける画像取得装置１が画像取得する時間的な間隔であれば、細胞周期の期の時間やＭ期内の詳細期の時間を算出する精度を充分に保つことが可能である。
【００４３】
培養装置（図示省略）は、ディッシュやマイクロプレートなどの容器中に収容された細胞サンプルを、温度・湿度を一定に保った状態で培養する。
電動ステージ（図示省略）は、ＸＹステージ等で構成されており、生細胞を収容したディシュやマイクロプレートを画像取得装置１における撮像位置に搬送する。
【００４４】
本実施形態の細胞画像解析システムにおける画像取得装置１は、顕微鏡観察において一視野内であれば、複数の生細胞の画像を同時に取得することができるようになっている。
なお、顕微鏡観察における一視野に入らない生細胞に対しては、ＸＹステージ等を用いて撮像位置に生細胞が位置するようにすることで、広範囲に生細胞の画像を取得することも可能になっている。あるいは、ＸＹステージを用いる代わりに、撮像素子１ｂ２をラインセンサ方式のＴＤＩ（Time Delay Integration：移動積分スキャン）カメラで構成することによって、広範囲に生細胞の画像を取得することができるようにしてもよい。
【００４５】
細胞画像解析装置２は、コンピュータ（例えば、パーソナルコンピュータ）と、画像解析ソフトウェアを備えて構成されている。
画像解析ソフトウェアは、コンピュータを、細胞領域特定手段２ａ、細胞周期の期検出手段２ｂ、細胞周期の期の時間計測手段２ｃ、Ｍ期内の詳細期検出手段２ｄ、Ｍ期内の詳細期の時間計測手段２ｅ、細胞周期の期の時間比較手段２ｆ、Ｍ期内の詳細期の時間比較手段２ｇ、同定手段２ｈとして機能させるように構成されている。
【００４６】
細胞領域特定手段２ａは、画像取得装置１が取得した画像において、蛍光輝度が所定の輝度の閾値を上回る画素群、あるいは隣接輝度との輝度差が所定の輝度値の閾値を上回る画素群を細胞領域として特定する。
【００４７】
細胞周期の期検出手段２ｂは、細胞領域特定手段２ａが細胞領域として特定した画素群における蛍光タンパクから発せられる異なる色同士の蛍光輝度の総量（即ち、画素群を構成する各画素の蛍光輝度を合計した値）の比及び異なる色ごとの蛍光輝度の総量の増加量を、データテーブル２ｔ−１と照合して、当該生細胞の細胞周期の期を検出する。
データテーブル２ｔ−１は、予め蛍光タンパクを導入するとともに蛍光タンパクとは別の所定の蛍光試薬で染色した、生細胞と同種の細胞の画像を画像取得装置１を介して取得し、細胞領域特定手段２ａを介して細胞領域として特定したデータテーブル作成用画素群における所定の蛍光試薬から発せられる蛍光輝度の総量（即ち、データテーブル作成用画素群を構成する各画素の蛍光輝度を合計した値）及び蛍光輝度の最大値（即ち、データテーブル作成用画素群を構成する画素のうち、最も蛍光輝度が高い画素の蛍光輝度）を用いて、細胞周期の期を分類するとともに、データテーブル作成用画素群における所定の蛍光試薬から発せられる蛍光輝度の総量及び蛍光輝度の最大値とデータテーブル作成用画素群における蛍光タンパクから発せられる異なる色同士の蛍光輝度の総量の比及び異なる色ごとの蛍光輝度の総量の増加量との対応付けを行うことによって得られた、蛍光タンパクから発せられる異なる色同士の蛍光輝度の総量の比及び異なる色ごとの蛍光輝度の総量の増加量に対応する細胞周期の期が格納されている。
【００４８】
図２は細胞から発される蛍光輝度と細胞周期との相関関係を示す図で、(a)は撮像した細胞画像において細胞領域として特定された画素群における、細胞を染色した蛍光試薬から発せられる蛍光輝度の総量及び蛍光輝度の最大値と細胞の細胞周期の期との相関関係を示す説明図、(b)は撮像した細胞画像において細胞領域として特定された画素群における、細胞に導入した蛍光タンパクから発せられる異なる色ごとの蛍光輝度の総量の時間経過特性を示す説明図、(c)は(a)と(b)との対応付けにより分類した、撮像した細胞画像において細胞領域として特定された画素群における、細胞に導入した蛍光タンパクから発せられる異なる色ごとの蛍光輝度の総量と細胞の細胞周期の期との相関関係を示す図である。
【００４９】
図２(a)において、蛍光輝度の総量は、細胞内のＤＮＡ量を反映している。また、細胞内の蛍光輝度の最大値は、クロマチン凝集度を反映している。
細胞周期は、細胞分裂を起こす期であるＭ期と、Ｍ間とＭ期との間の期であるＩ期に分けられる。さらに、Ｉ期は、ＤＮＡ合成の準備期であるＧ１期と、ＤＮＡが合成されて、染色体の複製が行われる期であるＳ期、Ｓ期とＭ期との間の細胞分裂の準備期であるＧ２期に分けられる。また、細胞周期から外れた期としてＧ０期がある。
【００５０】
Ｍ期においては、細胞の分裂に際し、細胞内のＤＮＡが合成されることによって複製された染色体が凝縮する。このため、Ｍ期においては、図２(a)に示すように、蛍光輝度の総量が大きく、且つ、蛍光輝度の最大値が大きくなっている。
細胞分裂後（ｐｏｓｔ Ｍ期）は、分裂した個々の細胞内のＤＮＡが少なくなる。そして、Ｇ１期では、ＤＮＡの合成のために必要な酵素が活性化される。このため、Ｇ１期においては、図２(a)に示すように、蛍光輝度の総量が小さくなっている。
なお、細胞は、通常、Ｇ１期おける酵素の活性化によりＳ期に移行するが、細胞分裂を続けない細胞は、Ｇ０期に移行する。
Ｓ期においては、細胞内でＤＮＡが合成されて染色体が複製される。このため、図２(a)に示すように、蛍光輝度の総量が増加している。
Ｇ２期においては、細胞分裂の準備の最終段階として、細胞内でタンパク質の合成が増加する。但し、この段階では、染色体は凝集していない。このため、図２(a)に示すように、蛍光輝度の総量が大きく、且つ、蛍光輝度の最大値が小さくなっている。
【００５１】
このように、生細胞の画素群における蛍光輝度の総量及び蛍光輝度の最大値と生細胞の細胞周期の期には、相関関係がある。
このような相関関係は、ＤＡＰＩなどの蛍光試薬を用いて染色した、大量の細胞集団における夫々の細胞領域として特定した画素群における蛍光輝度の総量及び細胞領域として特定した画素群内における最大蛍光輝度をプロットした散布図を作成し、散布図における相対的な値を用いて判別できる。しかし、ＤＡＰＩなどの蛍光試薬を用いる方法では、細胞を長時間生きたままの状態にしておくことが出来ない。
【００５２】
また、ＦＵＣＣＩなどの細胞周期の特定の期に特異的に蛍光を発する色の異なる２つの蛍光タンパク、又は、細胞周期の期に応じて異なる色を発する１つの蛍光タンパクを用いた蛍光プローブを細胞に導入すると、細胞周期の期に応じて特定のタンパクが発現する際に蛍光タンパクが同時に発現して異なる蛍光を発する、あるいは細胞周期の期に応じて１つの蛍光タンパクが異なる色を発する。このため、細胞における、蛍光タンパクから発せられる異なる色ごとの蛍光輝度の総量の時間的な変化（例えば、図２(b)に示すようなＦＵＣＣＩにおける赤色と緑色の夫々の光の輝度値の変化）、例えば、赤色と緑色の夫々の光に対して基準輝度を閾値として設定し、その基準輝度との相対的な大小関係によって、細胞周期の期を判別することができると考えられる。しかし、ＦＵＣＣＩを用いた場合、赤色、緑色の輝度値は、細胞ごとの性質や観察している細胞の周囲のノイズなどの要因によってバラツキが大きく、また、赤色に比べて緑色が強くなった状態での細胞周期の各期（Ｓ期，Ｇ２期，Ｍ期）を判別することが難しい。また、上記基準輝度の精度を上げるためには、多数の細胞の輝度値の平均を基準輝度とせざるを得ないが、それでは基準輝度から大きく外れた輝度値の光を発する細胞に対して正確な期を特定することが難しくなる。
【００５３】
そこで、本発明では、予め、上述したＤＡＰＩなどの蛍光試薬を用いた方法とＦＵＣＣＩを用いた方法とを組み合せることによって、蛍光タンパクから発せられる異なる色同士の蛍光輝度の総量の比及び異なる色ごとの蛍光輝度の増加量に対応する細胞周期の期が格納されたデータテーブル２ｔ−１を備えている。そして、細胞周期の期検出手段２ｂは、細胞領域特定手段２ａが細胞領域として特定した画素群における蛍光タンパクから発せられる異なる色同士の蛍光輝度の総量の比及び異なる色ごとの蛍光輝度の総量の増加量を、このデータテーブル２ｔ−１と照合することによって、当該生細胞の細胞周期の期を検出する。
【００５４】
ここで、データテーブル２ｔ−１の具体的な作成例について説明する。
例えば、所定の蛍光試薬であるＤＮＡインターカレータとして、ヘキスト、ＤＲＡＱ５を用いて細胞核を染色する。なお、後述するように、この細胞には、細胞周期の特定の期に特異的に蛍光を発する色の異なる２つの蛍光タンパク、又は、細胞周期の期に応じて異なる色を発する１つの蛍光タンパクとしてＦＵＣＣＩも導入されている。
【００５５】
まず、蛍光試薬を用いて細胞周期の期の検出を行う。
画像取得装置１を介して細胞画像を取得する。次いで、取得した細胞画像から細胞画像解析装置２の細胞領域特定手段２ａを介して細胞における細胞核の領域を特定する。
次いで、細胞領域特定手段２ａが細胞における細胞核の領域として特定したデータテーブル作成用画素群における蛍光輝度の総量及び蛍光輝度の最大値をパラメータとした散布図を作成する（図２(a)）。これにより、散布図上に細胞集団をなす各々の細胞が点として表される。次いで、散布図における細胞集団をなす各々の細胞の相対的な輝度値からＧ１期，Ｓ期，Ｇ２期，Ｍ期，ｐｏｓｔ Ｍ期（分裂後）を層別する。
【００５６】
一般に、Ｇ２期及びＭ期はＧ１期及びｐｏｓｔ Ｍ期（分裂後）と比較して輝度の合計値が約２倍となる。そこで、散布図において、輝度の合計値が２倍離れて分布している範囲を割り出す。これらの範囲のうち、輝度の合計値が小さい方の範囲をＧ１期及びｐｏｓｔ Ｍ期（分裂後）の範囲、大きい方の範囲をＧ２期及びＭ期の範囲とする。次いで、Ｇ１期及びｐｏｓｔ Ｍ期（分裂後）、Ｇ２期及びＭ期に該当するそれぞれの範囲における輝度の合計値の平均値（μ）と標準偏差（シグマ：σ）を計算する。そして、Ｇ１期及びｐｏｓｔ Ｍ期（分裂後）に該当する範囲の輝度の合計値の平均値μから+３σを上回り、且つ、Ｇ２期及びＭ期に該当する範囲の輝度の合計値の平均値μから−３σを下回る範囲をＳ期の範囲とする。
次に、Ｇ１期及びｐｏｓｔ Ｍ期（分裂後）の範囲における輝度の最大値の平均値（μ）と標準偏差（シグマ：σ）を計算する。そして、輝度の最大値の平均値μから±３σの範囲をＧ１期の範囲、それ以外をｐｏｓｔ Ｍ期（分裂後）の範囲とする。
同様に、Ｇ２期及びＭ期の範囲における輝度の最大値の平均値（μ）と標準偏差（シグマ：σ）を計算する。そして、輝度の最大値の平均値μから±３σの範囲をＧ２期の範囲、それ以外をＭ期の範囲とする。
このようにして定めた、輝度の最大値、輝度の合計値に対応するＧ１期，Ｇ２期，Ｓ期，Ｍ期，ｐｏｓｔ Ｍ期（分裂後）をコンピュータの記憶領域に格納する。
【００５７】
次に、蛍光試薬を用いて得た細胞周期の期を、蛍光タンパクから発せられる異なる色ごとの蛍光輝度の総量と対応付けする。
上記細胞の核には、例えば、細胞周期におけるそれぞれ異なる特定の時期にのみ存在するＧｅｍｉｎｉｎとＣｄｔ１という２種類のタンパク質にそれぞれ融合しうる２種類の蛍光タンパク質からなるＦＵＣＣＩと呼ばれる蛍光プローブが導入されている。
細胞領域特定手段２ａが細胞における細胞核の領域として特定したデータテーブル作成用画素群における蛍光のうち、Ｇｅｍｉｎｉｎに融合した蛍光タンパク質であるｍＡＧ１から発する緑色の光、Ｃｄｔ１に融合したたんぱく質であるｍｋＯ２から発する赤色の光について、１サイクルの細胞周期分の時間において所定のピッチで取得された夫々の画像から検出する。なお、ここでは、緑色の光、赤色の光の特性の変化が１回りする時間を１サイクルとする。これにより、図２(b)に示すような緑色の光、赤色の光のそれぞれにおける時間に対する輝度値の総量の特性を示すグラフが得られる。
このとき、細胞領域特定手段２ａが細胞における細胞核の領域として特定した画素群において、上述の蛍光試薬を用いた方法により、図２(a)に示すように、蛍光輝度の総量及び蛍光輝度の最大値が得られるとともに、その細胞周期の期が層別されている。
【００５８】
そこで、次に、図２(a)に示す散布図における細胞群における蛍光輝度の総量及び蛍光輝度の最大値と図２(b)に示す緑色の光、赤色の光のそれぞれの時間に対する輝度値の特性との対応付けを行い、対応付けしたデータをコンピュータの記憶領域に格納する。これにより、図２(b)で得た緑色の光、赤色の光のそれぞれの時間に対する輝度値の特性と、細胞周期のＧ１期，Ｓ期，Ｇ２期，Ｍ期とが、図２(c)に示すように対応付けられる。
次いで、図２(c)において、細胞周期のＧ１期，Ｓ期，Ｇ２期，Ｍ期に分けられたそれぞれの期間における緑色の光、赤色の光の輝度値の総量の比や、緑色の光と赤色の光の輝度値の総量の増加量を算出し、算出値をコンピュータの記憶領域に格納する。
これにより、データテーブル用画素群における蛍光タンパクから発せられる異なる色同士の蛍光輝度の総量の比及び異なる色ごとの蛍光輝度の増加量に対応する細胞周期の期がコンピュータの記憶領域に格納された、データテーブル２ｔ−１が作成される。
【００５９】
上記の作成例のデータテーブル２ｔ−１を用いた場合、細胞周期の期検出手段２ｂは、細胞領域特定手段２ａが細胞領域として特定した画素群における蛍光の輝度値の総量のうち、Ｃｄｔに融合した蛍光タンパク質であるｍＫＯ２から発する赤色の光がＧｅｍｉｎｉｎに融合した蛍光タンパク質であるｍＡＧ１から発する緑色の光よりも大きいときは、データテーブル２ｔ−１と照合してＧ１期と検出する。また、ｍＡＧ１から発する緑色の光が、ｍＫＯ２から発する赤色の光よりも大きいときは、ｍＡＧ１から発する緑色の蛍光輝度の総量とｍKＯ２から発する赤色の光の蛍光輝度の総量の比及び夫々の蛍光輝度ごとの増加量に対応する細胞周期の期が格納されたデータテーブル２ｔ−１と照合して、当該生細胞の細胞周期の期（Ｓ期，Ｇ２期，Ｍ期のいずれか）を検出する。
【００６０】
このように作成されたデータテーブル２ｔ−１を用いると、実際に観察する細胞に対しては、毒性の強い蛍光試薬で染色しなくて済むので、細胞を長時間生きたままの状態に保つことができる。また、データデーブル２ｔ−１の作成時には、蛍光試薬から発せられる蛍光輝度の総量及び蛍光輝度の最大値に、蛍光タンパクから発せられる異なる色同士の蛍光輝度の総量の比及び異なる色ごとの蛍光輝度の総量の増加量を対応付けたので、蛍光タンパクを用いた場合における細胞ごとの蛍光の輝度値のバラツキを補正でき、また、Ｓ期，Ｇ２期，Ｍ期を精度良く判別できるようになる。その結果、蛍光タンパクを用いて生細胞を観察しながら、精度良く細胞周期の期を検出することができるようになる。
【００６１】
細胞周期の期の時間計測手段２ｃは、細胞周期の期検出手段２ｂが検出した当該生細胞の細胞周期の期が次世代における当該細胞周期の期に変化するまでの世代時間を計測する。
上述したように、本実施形態の細胞画像解析システムにおいては、画像取得装置１が、撮像時間制御手段１ｂ１等を介して生細胞の画像を一定の時間的間隔で時系列に取得する。このため、撮像時間制御手段１ｂ１が制御する一定の時間的間隔に、細胞画像解析装置２において解析した画像の数を掛け合わせることで、所望の時間を算出することができる。
詳しくは、細胞周期の期の時間計測手段２ｃは、細胞周期の期検出手段２ｂが検出した当該生細胞の細胞周期の期が次世代における当該細胞周期の期に変化するまでの解析対象となった画像の数をカウントし、その画像数を撮像時間制御手段１ｂ１において定められた所定の時間的間隔に掛け合わせる。これにより、世代期間が算出される。
【００６２】
また、本実施形態では、細胞周期の期の時間計測手段２ｃは、細胞周期の期検出手段２ｂが検出した当該生細胞の細胞周期の期が次の期に変化するまでの期の時間を計測する機能も備えている。
即ち、細胞周期の期の時間計測手段２ｃは、細胞周期の期検出手段２ｂが検出した当該生細胞の細胞周期の期が次の期に変化するまでの解析対象となった画像の数をカウントし、その画像数を撮像時間制御手段１ｂ１において定められた所定の時間的間隔に掛け合わせる。これにより、細胞周期の期の時間が算出される。
即ち、ここでの「細胞周期の期の時間」とは、当該生細胞の細胞周期の期が次世代における当該細胞周期の期に変化するまでの世代時間、当該生細胞の細胞周期の期が次の期に変化するまでの期の時間のいずれも相当しうる。
【００６３】
Ｍ期内の詳細期検出手段２ｄは、細胞周期の期検出手段２ｂが検出した当該生細胞の細胞周期の期がＭ期である場合に、当該生細胞の形態的特徴要素を、Ｍ期における生細胞の形態的特徴要素に対応するＭ期内の詳細期が格納されたデータテーブル２ｔ−２と照合することにより、当該生細胞のＭ期内の詳細期を検出する。
【００６４】
図３はＭ期内の詳細期ごとの細胞の状態を模式的に示す説明図で、(a)は前期における細胞の状態を示す図、(b)は前中期における細胞の状態を示す図、(c)は中期における細胞の状態を示す図、(d)は後期における細胞の状態を示す図、(e)は終期における細胞の状態を示す図、(f)は細胞質分裂の状態を示す図である。
Ｍ期においては、有糸分裂と細胞質分裂が行われる。Ｍ期は、有糸分裂の段階に応じて、前期・前中期・中期・後期・終期に分けられる。
前期では、図３(a)に示すように、染色体３ａが凝縮し、セントロゾーム（中心体）３ｂが２つ構成され、微小管３ｃが伸びる。前中期では、図３(b)に示すように、核膜３ｄが消失し、染色体３ａが赤道面へ移動し始める。中期では、図３(c)に示すように、染色体３ａが赤道面上に並ぶ。後期では、図３(d)に示すように、染色体３ａが分離し始め、極方向に移動を開始する。終期では、図３(e)に示すように、染色体３ａが両極へ移動を完了し凝集がなくなるとともに、新しい核膜３ｄが形成される。その後、細胞質分裂は、終期の間に始まる。そして、図３(f)に示すように、細胞質分裂により、細胞が２つに分裂する。
【００６５】
このように、Ｍ期の詳細な各期においては、それぞれ、細胞に形態的特徴が現れる。
そこで、本実施形態の細胞画像解析システムでは、細胞画像解析装置２に備わるコンピュータの記憶領域に、Ｍ期における生細胞の形態的特徴要素に対応するＭ期内の詳細期を格納したデータテーブル２ｔ−２を備えている。そして、Ｍ期内の詳細期検出手段２ｄが、細胞周期の期検出手段２ｂが検出した当該生細胞の細胞周期の期がＭ期である場合に、当該生細胞の形態的特徴要素を、Ｍ期における生細胞の形態的特徴要素に対応するＭ期内の詳細期が格納されたデータテーブル２ｔ−２と照合することによって、当該生細胞のＭ期内の詳細期を検出するようにしている。
【００６６】
Ｍ期内の詳細期の時間計測手段２ｅは、Ｍ期内の詳細期検出手段２ｄが検出した当該生細胞のＭ期内の詳細期が次の詳細期または次の細胞周期の期に変化するまでの詳細期の時間を計測する。
即ち、Ｍ期内の詳細期の時間計測手段２ｅは、Ｍ期内の詳細期検出手段２ｄが検出した当該生細胞のＭ期内の詳細期が次の詳細期に変化するまで、またはＭ期の終期が次の細胞周期の期であるＧ１期に変化するまでの解析対象となった細胞画像の数をカウントし、その画像数を撮像時間制御手段１ｂ１において定められた所定の時間的間隔に掛け合わせる。これにより、Ｍ期内の詳細期の時間が算出される。
【００６７】
細胞周期の期の時間比較手段２ｆは、細胞周期の期の時間計測手段２ｃが計測した当該生細胞の第一の期から次の期に変化するまでの第一の期の時間と、細胞周期の期の時間計測手段２ｃが計測した当該生細胞の第二の期から次の期に変化するまでの第二の期の時間とを比較する。そして、例えば、双方の期の時間の差分等、客観的な比較値を示す数値データを作成する。
なお、ここでの「第一の期の時間」及び「第二の期の時間」としては、例えば、互いに同一世代内における異なる二つの細胞周期の期同士の時間や、互いに異なる二つの世代における一つの細胞周期の期同士の時間が相当しうる。
【００６８】
Ｍ期内の詳細期の時間比較手段２ｇは、Ｍ期内の詳細期の時間計測手段２ｅが計測した当該生細胞のＭ期内の第一の詳細期が次の詳細期に変化するまで、またはＭ期の終期が次の細胞周期の期であるＧ１期に変化するまでの第一の詳細期の時間と、Ｍ期内の詳細期の時間計測手段２ｅが計測した当該生細胞のＭ期内の第二の詳細期が次の詳細期に変化するまで、またはＭ期の終期が次の細胞周期の期であるＧ１期に変化するまでの第二の詳細期の時間とを比較する。そして、例えば、双方のＭ期内の詳細期の時間の差分等、客観的な比較値を示す数値データを作成する。
なお、ここでの「第一の詳細期の時間」と「第二の詳細期の時間」としては、例えば、互いに同一世代のＭ期内における異なる二つの詳細期の時間や、互いに異なる二つの世代における一つのＭ期内の詳細期の時間が相当しうる。
【００６９】
同定手段２ｈは、細胞周期の期の時間計測手段２ｃが計測した当該生細胞の細胞周期の期の時間、Ｍ期内の詳細期の時間計測手段２ｅが計測した当該生細胞のＭ期内の詳細期の時間、細胞周期の期の時間比較手段２ｆが比較した当該生細胞の細胞周期の期の時間の比較値、Ｍ期内の詳細期の時間比較手段２ｇが比較した当該生細胞のＭ期内の異なる詳細期同士の詳細期の時間の比較値の少なくともいずれかを用いて、少なくとも細胞の種類を同定する。
同定手段２ｈは、さらに、細胞周期の期の時間計測手段２ｃが計測した当該生細胞の細胞周期の期の時間、Ｍ期内の詳細期の時間計測手段２ｅが計測した当該生細胞のＭ期内の詳細期の時間、細胞周期の期の時間比較手段２ｆが比較した当該生細胞の細胞周期の期の時間の比較値、Ｍ期内の詳細期の時間比較手段２ｇが比較した当該生細胞のＭ期内の異なる詳細期同士の詳細期の時間の比較値の少なくともいずれかを用いて、細胞分裂、細胞の成長度、細胞集団の層別、細胞集団の成長度、細胞の性質の少なくともいずれかを同定する。
【００７０】
次に、このように構成された本実施形態の細胞画像解析システムを用いた生細胞の標識・染色から生細胞の画像の解析までの全体の処理手順について説明する。
図４は本実施形態の細胞画像解析システムを用いた前段階の処理としての生細胞への蛍光タンパクの導入から生細胞の画像の解析までの全体の処理手順の概略を示す説明図である。
全体の処理は、図４に示すように、前段階の処理としての生細胞への蛍光タンパクの導入（ステップＳ１）、画像取得装置１による生細胞の画像の取得（ステップＳ２）、細胞画像解析装置２による生細胞の画像の解析（ステップＳ３）の順で行う。生細胞への蛍光タンパクの導入（ステップＳ１）後、タイムラプス観察を行い、生細胞の画像の取得（ステップ２）と生細胞の画像の解析（ステップ３）を繰り返し行う。
【００７１】
蛍光タンパクの導入処理段階（ステップＳ１）
蛍光タンパクの導入処理段階では、細胞周期の特定の期に特異的に蛍光を発する色の異なる２つの蛍光タンパク、又は、細胞周期の期に応じて異なる色を発する１つの蛍光タンパクとして、ＦＵＣＣＩ（Fluorescent Ubiqutination-based Cell Cycle Indicator: フーチ)を細胞内に導入する。そして、蛍光タンパクが導入された複数の細胞が、例えば、マルチウェルプレートに播種された状態にして、顕微鏡によりタイムラプス観察を行えるようにする。
【００７２】
細胞画像取得段階（ステップＳ２）
撮像処理段階では、顕微鏡を用いて構成された細胞画像取得装置１の顕微鏡観察光学系１ａが、試料中の生細胞の像を結像し、撮像素子１ｂ２が顕微鏡観察光学系１ａを介して結像された細胞像を所定の時間的間隔でもって撮像する。これにより、蛍光タンパクを導入された生細胞の画像が時系列に取得される。
【００７３】
生細胞の画像の解析処理段階（ステップＳ３）
図５は本実施形態の細胞画像解析システムにおける細胞画像解析装置の処理手順を示すフローチャートである。
生細胞の画像の解析処理段階では、まず、細胞画像解析装置２の細胞領域特定手段２ａが、画像取得装置１が取得した画像において、蛍光輝度が所定の輝度の閾値を上回る画素群、あるいは隣接輝度との輝度差が所定の輝度差の閾値を上回る画素群を細胞領域として特定する（ステップＳ３１）。
【００７４】
次いで、細胞周期の期検出手段２ｂが、細胞領域特定手段２ａが細胞領域として特定した画素群における蛍光タンパクから発せられる異なる色同士の蛍光輝度の総量の比及び異なる色ごとの蛍光輝度の総量の増加量を、上述した、蛍光タンパクから発せられる異なる色同士の蛍光輝度の総量の比及び異なる色ごとの蛍光輝度の総量の増加量に対応する細胞周期の期が格納されたデータテーブル２ｔ−１と照合して、当該生細胞の細胞周期の期を検出する（ステップＳ３２）。
【００７５】
ここで、細胞周期の期が次の期に移行したときには、細胞周期の期の時間計測手段２ｃが、細胞周期の期検出手段２ｂが検出した当該生細胞の細胞周期の期が次の期に変化するまでの解析対象となった画像の数をカウントし、その画像数を撮像時間制御手段１ｂ１において定められた所定の時間的間隔に掛け合わせて、細胞周期の期の時間を算出する（ステップＳ３３，Ｓ３４）。
【００７６】
また、細胞周期の期が当世代の次世代の当該期に移行したときには、細胞周期の期の時間計測手段２ｃが、細胞周期の期検出手段２ｂが検出した当該生細胞の細胞周期の期が次世代における当該細胞周期の期に変化するまでの解析対象となった画像の数をカウントし、その画像数を撮像時間制御手段１ｂ１において定められた所定の時間的間隔に掛け合わせて、世代期間を算出する（ステップＳ３５，Ｓ３６）。
【００７７】
また、細胞周期の期検出手段２ｂが検出した当該生細胞の細胞周期の期がＭ期である場合には、Ｍ期内の詳細期検出手段２ｄが、当該生細胞の形態的特徴要素を、Ｍ期における生細胞の形態的特徴要素に対応するＭ期内の詳細期が格納されたデータテーブル２ｔ−２と照合することにより、当該生細胞のＭ期内の詳細期を検出する（ステップＳ３７，Ｓ３８）。
【００７８】
また、Ｍ期内の詳細期が次の期に移行したときには、Ｍ期内の詳細期の時間計測手段２ｅが、Ｍ期内の詳細期検出手段２ｄが検出した当該生細胞のＭ期内の詳細期が次の詳細期または次の細胞周期の期に変化するまでの解析対象となった画像の数をカウントし、その画像数を撮像時間制御手段１ｂ１において定められた所定の時間的間隔に掛け合わせて、Ｍ期内の詳細期の時間を算出する（ステップＳ３９，Ｓ４０）。
【００７９】
次いで、細胞周期の期の時間比較手段２ｇが、細胞周期の期の時間計測手段２ｃが計測した当該生細胞の第一の期から次の期に変化するまでの第一の期の時間と、細胞周期の期の時間計測手段２ｃが計測した当該生細胞の第二の期から次の期に変化するまでの第二の期の時間とを比較し、例えば、双方の期の時間の差分等、客観的な比較値を示す数値データを作成する。（ステップＳ４１）。
【００８０】
また、Ｍ期内の詳細期の時間比較手段２ｇが、Ｍ期内の詳細期の時間計測手段２ｅが計測した当該生細胞のＭ期内の第一の詳細期が次の詳細期または次の細胞周期の期に変化するまでの第一の詳細期の時間と、Ｍ期内の詳細期の時間計測手段２ｅが計測した当該生細胞のＭ期内の第二の詳細期が次の詳細期または次の細胞周期の期に変化するまでの第二の詳細期の時間とを比較し例えば、双方のＭ期内の詳細期の時間の差分等、客観的な比較値を示す数値データを作成する（ステップＳ４２）。
【００８１】
このように、本実施形態の細胞画像解析システムでは、画像取得装置１を介して取得した画像を用いて細胞分裂に関連する諸情報を取得する。そこで、その意義について説明する。
【００８２】
細胞は、細胞周期の進行を監視し、細胞の状態に異常等がある場合に、細胞周期の進行を減速ないし停止する制御機構（細胞周期チェックポイント）を備えている。
細胞周期チェックポイントは、次のポイントを監視し、異常が検知されたときに、チェックポイント制御因子と呼ばれるタンパク質リン酸化酵素（サイクリン依存性キナーゼ：Ｃｄｋ）とサイクリンという２種類のタンパク質からなる複合体の活性を制御することによって細胞周期の進行を減速ないし停止する。
・ＤＮＡ複製チェック
ＤＮＡの複製が完了してＭ期へ進む準備が整っているかを監視する。
・紡錘体集合チェック
紡錘体の形成が正常でＭ期後期に移行できるかを監視する。
・染色体分離チェック
Ｍ期終期に正常な染色体分離分配がなされたかを監視する。
・ＤＮＡ損傷チェック
Ｇ１期、Ｇ１期とＳ期との間、Ｓ期、Ｇ２期とＭ期との間で機能し、ＤＮＡ損傷の修復が完了したかを監視する。
【００８３】
細胞周期チェックポイントは、細胞周期の進行段階に応じて、例えば、Ｇ１期からＳ期へ移行する際のチェックポイント、Ｓ期チェックポイント、Ｇ２期からＭ期へ移行する際のチェックポイント、Ｍ期チェックポイント等に分類される。
Ｇ１期からＳ期へ移行する際のチェックポイントでは、Ｇ１期におけるＤＮＡ損傷の修復が完了したか否か、ＤＮＡ複製に必要な栄養や、増殖因子が存在するか否か等を監視する。
Ｓ期チェックポイントでは、ＤＮＡの複製に不具合がないか否かを監視する。
Ｇ２期からＭ期へ移行する際のチェックポイントでは、ＤＮＡ複製が完了したか否か、ＤＮＡ損傷の修復が完了したか否か、ＤＮＡ分配が可能であるか否か等を監視する。
Ｍ期チェックポイントでは、Ｍ期中期において、紡錘体の形成が完了したか否かを監視する。
【００８４】
そして、Ｇ１期の通過はサイクリンＤ−Ｃｄｋ４複合体、Ｓ期の開始はサイクリンＥ−Ｃｄｋ２複合体、Ｓ期の通過はサイクリンＡ―Ｃｄｋ２複合体、Ｇ２期の通過はサイクリンＡ−Ｃｄｋ１（Ｃｄｃ２）複合体、M期の開始はサイクリンＢ−Ｃｄｋ１（Ｃｄｃ２）複合体によってそれぞれ制御される。
【００８５】
このように細胞は、細胞周期チェックポイントにより、ＤＮＡの損傷等、正常な細胞分裂を進行するための条件を満たしていないときに、細胞周期を停止し、その間にＤＮＡ傷害等を修復し不正な遺伝情報蓄積によるがん化等、細胞の変異を防止する。
【００８６】
ところで、細胞周期チェックポイントによる細胞周期の進行の制御の破綻は、がんの発生と進行（細胞の無制御な異常増殖）の要因となると考えられている。
例えば、がん抑制遺伝子産物p53、Rb、BRCA1は，細胞周期チェックポイント制御に関与し、多くのがん抑制遺伝子産物はヒトのがんにおいて頻繁に不活性化され、多くのがんの原因となることが多い。細胞周期チェックポイントの異常は、遺伝的不安定性をもたらし、遺伝的不安定性は多くのがん細胞における主要な特徴となっている。
このようなことから、細胞周期における各期の時間やＭ期における各詳細期の時間の変化は、細胞の何らかの状態の変化を示し、さらには、細胞のがん化の予兆を示すシグナルとなり得るものと考えられる。
【００８７】
そこで、本実施形態の細胞画像解析システムでは、生細胞の細胞周期の期やＭ期における詳細期における時間の長さや、それらの時間の長さの比によって細胞を分類・層別化するようにしている。具体的には、同定手段２ｈが、細胞周期の期の時間計測手段２ｃが計測した当該生細胞の細胞周期の期の時間、Ｍ期内の詳細期の時間計測手段２ｅが計測した当該生細胞のＭ期内の詳細期の時間、細胞周期の期の時間比較手段２ｆが比較した当該生細胞の細胞周期の期の時間の比較値、Ｍ期内の詳細期の時間比較手段２ｇが比較した当該生細胞のＭ期内の詳細期の時間の比較値の少なくともいずれかを用いて、少なくとも細胞の種類を同定するようにしている。また、同定手段２ｈが、さらに、細胞周期の期の時間計測手段２ｃが計測した当該生細胞の細胞周期の期の時間、Ｍ期内の詳細期の時間計測手段２ｅが計測した当該生細胞のＭ期内の詳細期の時間、細胞周期の期の時間比較手段２ｆが比較した当該生細胞の細胞周期の期の時間の比較値、Ｍ期内の詳細期の時間比較手段２ｇが比較した当該生細胞のＭ期内の詳細期の時間の比較値の少なくともいずれかを用いて、細胞分裂、細胞の成長度、細胞集団の層別、細胞の性質の少なくともいずれかを同定するようにしている。
【００８８】
このため、本実施形態の細胞画像解析システムによれば、細胞分裂に関する時間的な情報に基づいて、細胞の種類を識別でき、さらに、例えば、細胞の特性の変化や、細胞の種類、細胞の分化の安定度、ｉＰＳ細胞の樹立した細胞とその他の細胞との識別、ｉＰＳ細胞の樹立後の分化した細胞との識別、分化した細胞ごとの識別等、ｉＰＳ細胞やＥＳ細胞、がん細胞の研究において有用と考えられる新たな解析データが得られる。
【００８９】
なお、本実施形態の細胞画像解析システムでは、細胞画像解析装置２は、表示手段（図示省略）と接続可能あるいは表示手段を備えている。従って、同定手段２ｈが同定したデータは、表示手段を介して表示され得る。
【００９０】
以下、本実施形態の細胞画像解析システムを用いた実施例について説明する。
実施例１
図６は実施例１の細胞画像解析システムの全体構成を示すブロック図、図７は種類の異なる細胞ごとの世代時間を模式的に示すグラフである。
例えば、樹立したｉＰＳ細胞、ｉＰＳ細胞から分化した細胞、がん細胞、卵細胞等は、それぞれの種類ごとに世代時間が異なる。
そこで、実施例１の細胞画像解析システムでは、細胞画像解析装置２は、種類の異なる細胞ごとの世代時間を格納したデータテーブル２ｔ−３を備えている。また、同定手段２ｈは、細胞周期の期の時間計測手段２ｃが計測した夫々の生細胞の世代時間を、種類の異なる細胞ごとの世代時間が格納されたデータテーブル２ｔ−３と照合して、細胞の種類を特定するように構成されている。
実施例１の細胞画像解析システムによれば、細胞の種類が、世代時間から特定できるようになる。
その他の構成及び作用効果は、図１に示した細胞画像解析システムと略同じである。
【００９１】
実施例２
図８は実施例２の細胞画像解析システムの全体構成を示すブロック図、図９は種類の異なる細胞ごとの世代数と世代数に応じた世代時間の合計値との相関関係を模式的に示すグラフである。
例えば、樹立したｉＰＳ細胞、ｉＰＳ細胞から分化した細胞、がん細胞、卵細胞等は、それぞれの種類ごとに、世代数と世代数に応じた世代時間の合計値との相関関係が異なり、その相関関係の違いは世代数を重ねるごとに明確になる。
そこで、実施例２の細胞画像解析システムでは、細胞画像解析装置２は、種類の異なる細胞ごとの世代数及び世代数に応じた世代時間の積算値を格納したデータテーブル２ｔ−４を備えている。また、細胞画像解析装置２に備わる画像解析ソフトウェアは、コンピュータを、さらに、細胞周期の期検出手段２ｂが検出した当該生細胞の細胞周期の期が次世代における当該細胞周期の期に到達したとき、即ち、細胞領域特定手段２ａが特定した夫々の生細胞の世代が変わるごとに世代数をカウントする世代数計測手段２ｉとしても機能させるように構成されている。また、細胞周期の期の時間計測手段２ｃ’は、当該世代の世代期間を算出するとともに、世代ごとの世代期間を積算するように構成されている。また、同定手段２ｈは、細胞周期の期の時間計測手段２ｃ’が計測した夫々の生細胞の世代時間の積算値及び世代数計測手段２ｉが計測した夫々の生細胞の世代数を、種類の異なる細胞ごとの世代数及び世代数に応じた世代時間の積算値が格納されたデータテーブル２ｔ−４と照合して、細胞の種類を特定するように構成されている。
実施例２の細胞画像解析システムによれば、細胞の種類を、一世代の世代時間からでは特定することが難しい場合であっても、特定することができるようになる。
その他の構成及び作用効果は、図１に示した細胞画像解析システムと略同じである。
【００９２】
実施例３
図１０は実施例３の細胞画像解析システムの全体構成を示すブロック図、図１１は特定の細胞の世代数と世代数に応じた世代時間の合計値との相関関係における理想値と測定値を模式的に示すグラフである。
一般に細胞は、分裂を繰り返していくにつれて固有の形態および機能を持った細胞へと変化して行く。分化とは、この形態的機能的な細胞の変化をいう。また、一般に細胞は、未分化細胞ほど細胞周期が短く盛んに細胞分裂を繰り返す傾向がある。また、正常組織の細胞は、分化の方向は一方向である。これに対し、がん細胞は、分化の方向が逆行する幼若化・脱分化という性質を有している。また、がん細胞は、分化度の低いものほど増殖が早くて悪性度が高く、分化度の高いものほど比較的悪性度が低い傾向にある。このため、細胞の分化度や分化の安定度は、細胞のがん化やがん細胞の状態を検知する指標となると考えられる。
【００９３】
そこで、実施例３の細胞画像解析システムでは、細胞画像解析装置２は、種類の異なる細胞ごとの世代数及び世代数に応じた世代時間の積算値の相関の理想値及び理想値からの乖離度に応じた細胞分化の安定度を格納したデータテーブル２ｔ−５を備えている。また、同定手段２ｈは、さらに、細胞周期の期の時間計測手段２ｃ’が計測した夫々の生細胞の世代時間の積算値及び世代数計測手段２ｉが計測した夫々の生細胞の世代数を用いて、夫々の生細胞における世代数及び世代数に応じた世代時間の積算値の相関を算出し、算出した相関値を、種類の異なる細胞ごとの世代数及び世代数に応じた世代時間の積算値の相関の理想値及び理想値からの乖離度に応じた細胞分化の安定度が格納されたデータテーブル２ｔ−５と照合して、夫々の細胞について細胞分化の安定度を検出するように構成されている。
実施例３の細胞画像解析システムによれば、複数世代の細胞の世代時間から、細胞分化の安定度を検出することができ、細胞のがん化や、がん化した細胞の悪性度などの診断に寄与しうる。
その他の構成及び作用効果は、図１及び図８に示した細胞画像解析システムと略同じである。
【００９４】
実施例４
図１２は実施例４の細胞画像解析システムの全体構成を示すブロック図、図１３は種類の異なる細胞ごとのＭ期内の詳細期の時間を模式的に示すグラフである。
例えば、樹立したｉＰＳ細胞、ｉＰＳ細胞から分化した細胞、がん細胞、卵細胞等は、それぞれの種類ごとにＭ期内の詳細期の時間及びＭ期全体の時間が異なる。
そこで、実施例４の細胞画像解析システムでは、細胞画像解析装置２は、種類の異なる細胞ごとのＭ期内の時間を詳細期の時間に分けて格納したデータテーブル２ｔ−６を備えている。また、同定手段２ｈは、Ｍ期内の詳細期の時間計測手段２ｅが計測した夫々の生細胞のＭ期内の詳細期の時間及びＭ期全体の時間を、種類の異なる細胞ごとのＭ期内の時間を詳細期の時間に分けて格納したデータテーブル２ｔ−６と照合して、細胞の種類を特定するように構成されている。
実施例４の細胞画像解析システムによれば、細胞の種類が、Ｍ期内の詳細期の時間及びＭ期全体の時間から特定できるようになる。
その他の構成及び作用効果は、図１に示した細胞画像解析システムと略同じである。
【００９５】
実施例５
図１４は実施例５の細胞画像解析システムの全体構成を示すブロック図、図１５は種類の異なる細胞ごとの一世代における細胞周期の各期の時間を模式的に示すグラフである。
例えば、樹立したｉＰＳ細胞、ｉＰＳ細胞から分化した細胞、がん細胞、卵細胞等は、それぞれの種類ごとに一世代における細胞周期の各期の時間及び世代時間が異なる。
そこで、実施例５の細胞画像解析システムでは、細胞画像解析装置２は、種類の異なる細胞ごとの一世代における細胞周期の時間を各期の時間に分けて格納したデータテーブル２ｔ−７を備えている。また、同定手段２ｈは、細胞周期の期の時間計測手段２ｃが計測した一世代における夫々の生細胞の細胞周期の各期の時間及び世代時間を、種類の異なる細胞ごとの一世代における細胞周期の時間を各期の時間に分けて格納したデータテーブル２ｔ−７と照合して、細胞の種類を特定するように構成されている。
実施例５の細胞画像解析システムによれば、細胞の種類が、一世代における細胞周期の各期の時間及び世代時間から特定できるようになる。
その他の構成及び作用効果は、図１に示した細胞画像解析システムと略同じである。
【００９６】
実施例６
図１６は実施例６の細胞画像解析システムの全体構成を示すブロック図である。
がん化等、細胞の変化に伴い世代時間も変化するものと考えられる。
そこで、実施例６の細胞画像解析システムでは、細胞画像解析装置２は、種類の異なる細胞ごとの異なる世代同士の世代時間の比較値（例えば、双方の世代時間の差分値）に対応する生細胞の変化情報を格納したデータテーブル２ｔ−８を備えている。また、細胞周期の期の時間計測手段２ｃは、一つの生細胞における複数世代の世代時間を計測するように構成されている。また、細胞画像解析装置２に備わる画像解析ソフトウェアは、コンピュータを、さらに、細胞周期の期の時間計測手段２ｃが計測した当該一つの生細胞の異なる世代同士の世代時間を比較する世代時間比較手段２ｊとしても機能させるように構成されている。また、同定手段２ｈは、さらに、世代時間比較手段２ｊが比較した当該一つの生細胞の異なる世代同士の世代時間の比較値を、生細胞の異なる世代同士の世代時間の比較値に対応する生細胞の変化情報が格納されたデータテーブル２ｔ−８と照合することにより、当該一つの生細胞の変化を検出するように構成されている。
実施例６の細胞画像解析装置によれば、一つの生細胞の異なる世代同士の世代時間の比較値から、細胞の変化を検出することができるようになる。
その他の構成及び作用効果は、図１に示した細胞画像解析システムと略同じである。
【００９７】
実施例７
図１７は実施例７の細胞画像解析システムの全体構成を示すブロック図である。
がん細胞等に対しては、層別化を行うことがその後の治療効果を上げるために重要であると考えられる。
そこで、実施例７の細胞画像解析システムでは、細胞周期の期の時間計測手段２ｃ”は、二つ以上の生細胞のそれぞれにおける複数世代の世代時間を計測するように構成されている。また、細胞画像解析装置２に備わる画像解析ソフトウェアは、コンピュータを、さらに、細胞周期の期の時間計測手段２ｃ”が計測した当該二つ以上の生細胞のそれぞれにおける異なる世代同士の世代時間を比較する世代時間比較手段２ｊ’として機能させるように構成されている。また、同定手段２ｈは、さらに、世代時間比較手段２ｊ’が比較した当該二つ以上の生細胞のそれぞれにおける異なる世代同士の世代時間の比較値を、生細胞の異なる世代同士の世代時間の比較値に対応する生細胞の層別化情報が格納されたデータテーブル２−９と照合することにより、当該二つ以上の生細胞を層別化するように構成されている。
その他の構成は、図１６に示した細胞画像解析システムと略同じである。
実施例７の細胞画像解析装置によれば、二つ以上の生細胞のそれぞれにおける異なる世代同士の世代時間の比較値から、当該二つ以上の生細胞を層別化することができるようになる。
その他の構成及び作用効果は、図１に示した細胞画像解析システムと略同じである。
【００９８】
実施例８
図１８は実施例１８の細胞画像解析システムの全体構成を示すブロック図である。
実施例８の細胞画像解析システムでは、細胞画像解析装置２は、種類の異なる細胞ごとの異なる世代同士の世代時間の比較値（例えば、双方の世代時間の差分値）に対応する生細胞の変化情報及び層別化情報を格納したデータテーブル２ｔ−１０を備えている。また、細胞周期の期の時間計測手段２ｃ”は、二つ以上の生細胞のそれぞれにおける複数世代の世代時間を計測するように構成されている。また、細胞画像解析装置２に備わる画像解析ソフトウェアは、コンピュータを、細胞周期の期の時間計測手段２ｃ”が計測した当該二つ以上の生細胞のそれぞれにおける異なる世代同士の世代時間を比較する世代時間比較手段２ｊ’として機能させるように構成されている。また、同定手段２ｈは、さらに、世代時間比較手段２ｊ’が比較した当該二つ以上の生細胞のそれぞれにおける異なる世代同士の世代時間の比較値を、生細胞の異なる世代同士の世代時間の比較値に対応する生細胞の変化情報及び層別化情報が格納されたデータテーブル２ｔ−１０と照合することにより、当該二つ以上の生細胞のそれぞれにおける変化を検出するとともに当該二つ以上の生細胞を層別化するように構成されている。
実施例８の細胞画像解析装置によれば、二つ以上の生細胞のそれぞれにおける異なる世代同士の世代時間の比較値から、当該二つ以上の生細胞のそれぞれにおける変化を検出すると同時に当該二つ以上の生細胞を層別化することができるようになる。
その他の構成及び作用効果は、図１に示した細胞画像解析システムと略同じである。
【００９９】
実施例９
実施例９の細胞画像解析システムでは、画像取得装置１は、投与する化学薬品、光刺激、遺伝子操作、温度・湿度・圧力・ＰＨ等の環境、培地の養分等の少なくともいずれかを異ならせた２つの計測条件下における生細胞の画像を時系列に取得するように構成されている。
また、世代時間比較手段２ｊ（２ｊ’）は、２つの計測条件下のそれぞれにおいて、細胞周期の期の時間計測手段２ｃ（２ｃ’，２ｃ”）が計測した当該生細胞の世代時間を比較する。
その他の構成は、実施例１〜８のいずれかの細胞画像解析システムと略同じである。
【０１００】
なお、上記各実施例の細胞画像解析システムにおいては、解析対象の生細胞は、ＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞、がん幹細胞の少なくともいずれかであるのが好ましい。または、生細胞が、ＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞、がん幹細胞から分化した細胞の少なくともいずれかであってもよい。
さらに、上記各実施例の細胞画像解析システムにおいては、蛍光色素が、ＦＵＣＣＩであるのが好ましい。
【０１０１】
上記各実施例の細胞画像解析システムによれば、がん化等による細胞分裂を続けそうな細胞を事前に認識し、細胞周期における細胞の変化を正確に捉えることができる。
なお、本発明の細胞画像解析システムは、上記実施例に記載の構成に限定されるものではなく、例えば、上記各実施例において特有の構成を任意に組み合せた構成としてもよい。
【０１０２】
また、本発明の細胞画像解析システムにおいては、細胞画像解析装置２を介して解析された解析結果に応じて、特定の細胞に対して詳細な画像の取得を行うように、画像取得装置１の画像取得動作を制御するようにしてもよい。
例えば、細胞画像解析装置２を介して特異な細胞が検出された場合、画像取得装置１における顕微鏡観察光学系１ａの倍率を高倍率にする、あるいは、撮像時間制御手段１の撮像時間間隔を短くする等の制御をして、この特異な細胞の分裂時の詳細な画像を取得するようにしてもよい。
【０１０３】
また、細胞画像取得のための時間は短いほうが、正確な細胞周期の期の時間を計測するためには好ましい。一方、画像取得装置１として用いる顕微鏡装置がレーザ顕微鏡の場合、撮像時におけるレーザによる細胞へのダメージを考慮すると、撮像のインターバルは長いほうが好ましい。そこで、細胞画像解析装置２を介して得られたデータから、細胞周期において注目を所望する期（細胞周期における所定の期やＭ期における所定の詳細期）の開始時刻と終了時刻を予測し、その所望する期を挟む前後の時間帯のみ撮像のインターバルを短くするとよい。
例えば、生細胞をＧ１期とＧ１期以外の期の長さの比で層別する場合、画像取得装置１は、当初は例えば１時間間隔のインターバルで生細胞を撮像し、細胞画像解析装置２が画像を解析する。ここで、細胞画像解析装置２がＧ１期からＳ期へ移行しそうな生細胞を検出した場合、画像取得装置１は、インターバルを例えば１０分間隔に短縮して生細胞を撮像する。そして、細胞画像解析装置２がＳ期に移行した期の時間を測定し、その後、画像取得装置１は元のインターバル（例えば１時間間隔）で撮像する。
同様に、例えば、Ｍ期からＰｏｓｔＭ期に移行するまでの時間で層別する場合、細胞画像解析装置２がＭ期からＰｏｓｔＭ期へ移行しそうな生細胞を検出した場合、画像取得装置１は、インターバルを例えば５分間隔に短縮して生細胞を撮像する。そして、細胞画像解析装置２がＰｏｓｔＭ期に移行した（細胞が完全に分裂した）時間を測定し、その後、画像取得装置１は元のインターバル（例えば１時間間隔）で撮像する。
このようにすれば、細胞へ与えるダメージを極力抑えながら、細胞周期における所望の期の時間を正確に計測することができる。
【産業上の利用可能性】
【０１０４】
本発明の細胞画像解析システムは、医療応用を目的としたｉＰＳ細胞、ＥＳ細胞、がん細胞を用いた診断や細胞遺伝子学研究を行う分野に有用である。
【符号の説明】
【０１０５】
１ 細胞画像取得装置
１ａ 顕微鏡観察光学系
１ｂ 撮像手段
１ｂ１ 撮像時間制御手段
１ｂ２ 撮像素子
２ 細胞画像解析装置
２ａ 細胞領域特定手段
２ｂ 細胞周期の期検出手段
２ｃ，２ｃ’，２ｃ” 細胞周期の期の時間計測手段
２ｄ Ｍ期内の詳細期検出手段
２ｅ Ｍ期内の詳細期の時間計測手段
２ｆ 細胞周期の期の時間比較手段
２ｇ Ｍ期内の詳細期の時間比較手段
２ｈ 同定手段
２ｉ 世代数計測手段
２ｊ，２ｊ’ 世代時間比較手段
２ｔ−１，２ｔ−２，２ｔ−３，２ｔ−４，２ｔ−５，２ｔ−６，２ｔ−７，２ｔ−８，２ｔ−９ データテーブル
３ａ 染色体
３ｂ セントロゾーム（中心体）
３ｃ 微小管
３ｄ 核膜
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞周期の特定の期に特異的に蛍光を発する蛍光タンパクが導入された生細胞の画像を時系列に取得する、顕微鏡を備えた画像取得装置と、前記画像取得装置が時系列に取得した画像を用いて生細胞に対する所定の解析を行う、コンピュータを備えた細胞画像解析装置と、を有する細胞画像解析システムであって、
前記細胞画像解析装置は、前記コンピュータを、
前記画像取得装置が取得した画像において、蛍光輝度が所定の輝度の閾値を上回る画素群、あるいは隣接輝度との輝度差が所定の輝度差の閾値を上回る画素群を細胞領域として特定する細胞領域特定手段、
前記蛍光タンパクから発せられる蛍光に対応する細胞周期の期が格納されたデータテーブルと照合して、当該生細胞の細胞周期の期を検出する細胞周期の期検出手段、
前記細胞周期の期検出手段が検出した当該生細胞の細胞周期の期が別の期に変化するまでの細胞周期の期の時間を計測する細胞周期の期の時間計測手段、
前記細胞周期の期の時間を用いて、少なくとも細胞の種類を同定する同定手段、
として機能させる画像解析ソフトウェアを備えたことを特徴とする細胞画像解析システム。
【請求項２】
前記データテーブルは、
予め前記蛍光タンパクを導入するとともに前記蛍光タンパクとは別の所定の蛍光試薬で染色した、前記生細胞と同種の細胞において、前記所定の蛍光試薬から発せられる蛍光を用いて細胞周期の期を分類するとともに、前記所定の蛍光試薬から発せられる蛍光と、前記蛍光タンパクから発せられる蛍光との対応付けを行うことによって得られたものであることを特徴とする請求項１に記載の細胞画像解析システム。
【請求項３】
前記蛍光タンパクが色の異なる２つの蛍光タンパク、又は、細胞周期の期に応じて異なる色を発する１つの蛍光タンパクであり、
前記細胞周期の期検出手段が、
前記細胞領域特定手段が細胞領域として特定した画素群における前記蛍光タンパクから発せられる異なる色同士の蛍光輝度の総量の比及び異なる色ごとの蛍光輝度の総量の増加量を、予め前記蛍光タンパクを導入するとともに前記蛍光タンパクとは別の所定の蛍光試薬で染色した、前記生細胞と同種の細胞の画像を前記画像取得装置を介して取得し、前記細胞領域特定手段を介して細胞領域として特定したデータテーブル作成用画素群における前記所定の蛍光試薬から発せられる蛍光輝度の総量及び蛍光輝度の最大値を用いて細胞周期の期を分類するとともに、前記データテーブル作成用画素群における前記所定の蛍光試薬から発せられる蛍光輝度の総量及び蛍光輝度の最大値と前記データテーブル作成用画素群における前記蛍光タンパクから発せられる異なる色同士の蛍光輝度の総量の比及び異なる色ごとの蛍光輝度の総量の増加量との対応付けを行うことによって得られた、前記蛍光タンパクから発せられる異なる色同士の蛍光輝度の総量の比及び異なる色ごとの蛍光輝度の総量の増加量に対応する細胞周期の期が格納されたデータテーブルと照合して、当該生細胞の細胞周期の期を検出することを特徴とする請求項１又は２に記載の細胞画像解析装置。
【請求項４】
前記細胞周期の期の時間が、当該生細胞の細胞周期の期が次世代における当該細胞周期の期に変化するまでの世代時間であることを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の細胞画像解析システム。
【請求項５】
前記細胞周期の期の時間が、当該生細胞の細胞周期の期が次の期に変化するまでの期の時間であることを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の細胞画像解析システム。
【請求項６】
前記細胞周期の期検出手段が検出した当該生細胞の細胞周期の期がＭ期である場合に、当該生細胞の形態的特徴要素を、Ｍ期における生細胞の形態的特徴要素に対応するＭ期内の詳細期が格納されたデータテーブルと照合することにより、当該生細胞のＭ期内の詳細期を検出するＭ期内の詳細期検出手段をさらに備えることを特徴とする請求項１〜５のいずれかに記載の細胞画像解析システム。
【請求項７】
前記Ｍ期内の詳細期検出手段が検出した当該生細胞のＭ期内の詳細期が次の詳細期または次の細胞周期の期に変化するまでの詳細期の時間を計測するＭ期内の詳細期の時間計測手段をさらに備える請求項６に記載の細胞画像解析システム。
【請求項８】
前記細胞周期の期の時間計測手段が計測した当該生細胞の第一の期から次の期に変化するまでの第一の期の時間と、前記細胞周期の期の時間計測手段が計測した当該生細胞の第二の期から次の期に変化するまでの第二の期の時間とを比較する細胞周期の期の時間比較手段をさらに備える請求項１〜７のいずれかに記載の細胞画像解析システム。
【請求項９】
前記Ｍ期内の詳細期の時間計測手段が計測した当該生細胞のＭ期内の第一の詳細期が次の詳細期または次の細胞周期の期に変化するまでの第一の詳細期の時間と、前記Ｍ期内の詳細期の時間計測手段が計測した当該生細胞のＭ期内の第二の詳細期が次の詳細期または次の細胞周期の期に変化するまでの第二の詳細期の時間とを比較するＭ期内の詳細期の時間比較手段をさらに備えることを特徴とする請求項７又は請求項７に従属する請求項８に記載の細胞画像解析システム。
【請求項１０】
前記同定手段が、
前記細胞周期の期の時間計測手段が計測した当該生細胞の細胞周期の期の時間、前記Ｍ期内の詳細期の時間計測手段が計測した当該生細胞のＭ期内の詳細期の時間、前記細胞周期の期の時間比較手段が比較した当該生細胞の細胞周期の期の時間の比較値、前記Ｍ期内の詳細期の時間比較手段が比較した当該生細胞のＭ期内の詳細期の時間の比較値の少なくともいずれかを用いて、少なくとも細胞の種類を同定することを特徴とする請求項７に従属する請求項８に従属する請求項９に記載の細胞画像解析システム。
【請求項１１】
前記同定手段は、さらに、前記細胞周期の期の時間計測手段が計測した当該生細胞の細胞周期の期の時間、前記Ｍ期内の詳細期の時間計測手段が計測した当該生細胞のＭ期内の詳細期の時間、前記細胞周期の期の時間比較手段が比較した当該生細胞の細胞周期の期の時間の比較値、前記Ｍ期内の詳細期の時間比較手段が比較した当該生細胞のＭ期内の詳細期の時間の比較値の少なくともいずれかを用いて、細胞分裂、細胞の成長度、細胞集団の層別、細胞の性質の少なくともいずれかを同定することを特徴とする請求項１０に記載の細胞画像解析システム。
【請求項１２】
前記細胞周期の期の時間計測手段は、一つの生細胞における複数世代の世代時間を計測し、
前記画像解析ソフトウェアは、前記コンピュータを、さらに、前記細胞周期の期の時間計測手段が計測した当該一つの生細胞の異なる世代同士の世代時間を比較する世代時間比較手段として機能させ、
前記同定手段は、さらに、前記世代時間比較手段が比較した当該一つの生細胞の異なる世代同士の世代時間の比較値を、生細胞の異なる世代同士の世代時間の比較値に対応する生細胞の変化情報が格納されたデータテーブルと照合することにより、当該一つの生細胞の変化を検出することを特徴とする請求項１〜１１のいずれかに記載の細胞画像解析システム。
【請求項１３】
前記細胞周期の期の時間計測手段は、二つ以上の生細胞のそれぞれにおける複数世代の世代時間を計測し、
前記画像解析ソフトウェアは、前記コンピュータを、さらに、前記細胞周期の期の時間計測手段が計測した当該二つ以上の生細胞のそれぞれにおける異なる世代同士の世代時間を比較する世代時間比較手段として機能させ、
前記同定手段は、さらに、前記世代時間比較手段が比較した当該二つ以上の生細胞のそれぞれにおける異なる世代同士の世代時間の比較値を、生細胞の異なる世代同士の世代時間の比較値に対応する生細胞の層別化情報が格納されたデータテーブルと照合することにより、当該二つ以上の生細胞を層別化することを特徴とする請求項１〜１１のいずれかに記載の細胞画像解析システム。
【請求項１４】
前記細胞周期の期の時間計測手段は、二つ以上の生細胞のそれぞれにおける複数世代の世代時間を計測し、
前記画像解析ソフトウェアは、前記コンピュータを、さらに、前記細胞周期の期の時間計測手段が計測した当該二つ以上の生細胞のそれぞれにおける異なる世代同士の世代時間を比較する世代時間比較手段として機能させ、
前記同定手段は、さらに、前記世代時間比較手段が比較した当該二つ以上の生細胞のそれぞれにおける異なる世代同士の世代時間の比較値を、生細胞の異なる世代同士の世代時間の比較値に対応する生細胞の変化情報及び層別化情報が格納されたデータテーブルと照合することにより、当該二つ以上の生細胞のそれぞれにおける変化を検出するとともに当該二つ以上の生細胞を層別化することを特徴とする請求項１〜１１のいずれかに記載の細胞画像解析システム。
【請求項１５】
前記画像取得装置は、投与する化学薬品、光刺激、遺伝子操作、温度・湿度・圧力・ＰＨ等の環境、培地の養分等の少なくともいずれかを異ならせた２つの計測条件下における生細胞の画像を時系列に取得し、
前記世代時間比較手段は、前記２つの計測条件下のそれぞれにおいて、前記細胞周期の期の時間計測手段が計測した当該生細胞の世代時間を比較することを特徴とする請求項１２〜１４のいずれかに記載の細胞画像解析システム。
【請求項１６】
前記生細胞が、ＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞、がん幹細胞の少なくともいずれかであることを特徴とする請求項１〜１５のいずれかに記載の細胞画像解析システム。
【請求項１７】
前記生細胞が、ＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞、がん幹細胞から分化した細胞の少なくともいずれかであることを特徴とする請求項１〜１５のいずれかに記載の細胞画像解析システム。
【請求項１８】
前記蛍光タンパクが、ＦＵＣＣＩであることを特徴とする請求項1〜１７のいずれかに記載の細胞画像解析システム。
【請求項１】
細胞周期の特定の期に特異的に蛍光を発する蛍光タンパクが導入された生細胞の画像を時系列に取得する、顕微鏡を備えた画像取得装置と、前記画像取得装置が時系列に取得した画像を用いて生細胞に対する所定の解析を行う、コンピュータを備えた細胞画像解析装置と、を有する細胞画像解析システムであって、
前記細胞画像解析装置は、前記コンピュータを、
前記画像取得装置が取得した画像において、蛍光輝度が所定の輝度の閾値を上回る画素群、あるいは隣接輝度との輝度差が所定の輝度差の閾値を上回る画素群を細胞領域として特定する細胞領域特定手段、
前記蛍光タンパクから発せられる蛍光に対応する細胞周期の期が格納されたデータテーブルと照合して、当該生細胞の細胞周期の期を検出する細胞周期の期検出手段、
前記細胞周期の期検出手段が検出した当該生細胞の細胞周期の期が別の期に変化するまでの細胞周期の期の時間を計測する細胞周期の期の時間計測手段、
前記細胞周期の期の時間を用いて、少なくとも細胞の種類を同定する同定手段、
として機能させる画像解析ソフトウェアを備えたことを特徴とする細胞画像解析システム。
【請求項２】
前記データテーブルは、
予め前記蛍光タンパクを導入するとともに前記蛍光タンパクとは別の所定の蛍光試薬で染色した、前記生細胞と同種の細胞において、前記所定の蛍光試薬から発せられる蛍光を用いて細胞周期の期を分類するとともに、前記所定の蛍光試薬から発せられる蛍光と、前記蛍光タンパクから発せられる蛍光との対応付けを行うことによって得られたものであることを特徴とする請求項１に記載の細胞画像解析システム。
【請求項３】
前記蛍光タンパクが色の異なる２つの蛍光タンパク、又は、細胞周期の期に応じて異なる色を発する１つの蛍光タンパクであり、
前記細胞周期の期検出手段が、
前記細胞領域特定手段が細胞領域として特定した画素群における前記蛍光タンパクから発せられる異なる色同士の蛍光輝度の総量の比及び異なる色ごとの蛍光輝度の総量の増加量を、予め前記蛍光タンパクを導入するとともに前記蛍光タンパクとは別の所定の蛍光試薬で染色した、前記生細胞と同種の細胞の画像を前記画像取得装置を介して取得し、前記細胞領域特定手段を介して細胞領域として特定したデータテーブル作成用画素群における前記所定の蛍光試薬から発せられる蛍光輝度の総量及び蛍光輝度の最大値を用いて細胞周期の期を分類するとともに、前記データテーブル作成用画素群における前記所定の蛍光試薬から発せられる蛍光輝度の総量及び蛍光輝度の最大値と前記データテーブル作成用画素群における前記蛍光タンパクから発せられる異なる色同士の蛍光輝度の総量の比及び異なる色ごとの蛍光輝度の総量の増加量との対応付けを行うことによって得られた、前記蛍光タンパクから発せられる異なる色同士の蛍光輝度の総量の比及び異なる色ごとの蛍光輝度の総量の増加量に対応する細胞周期の期が格納されたデータテーブルと照合して、当該生細胞の細胞周期の期を検出することを特徴とする請求項１又は２に記載の細胞画像解析装置。
【請求項４】
前記細胞周期の期の時間が、当該生細胞の細胞周期の期が次世代における当該細胞周期の期に変化するまでの世代時間であることを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の細胞画像解析システム。
【請求項５】
前記細胞周期の期の時間が、当該生細胞の細胞周期の期が次の期に変化するまでの期の時間であることを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の細胞画像解析システム。
【請求項６】
前記細胞周期の期検出手段が検出した当該生細胞の細胞周期の期がＭ期である場合に、当該生細胞の形態的特徴要素を、Ｍ期における生細胞の形態的特徴要素に対応するＭ期内の詳細期が格納されたデータテーブルと照合することにより、当該生細胞のＭ期内の詳細期を検出するＭ期内の詳細期検出手段をさらに備えることを特徴とする請求項１〜５のいずれかに記載の細胞画像解析システム。
【請求項７】
前記Ｍ期内の詳細期検出手段が検出した当該生細胞のＭ期内の詳細期が次の詳細期または次の細胞周期の期に変化するまでの詳細期の時間を計測するＭ期内の詳細期の時間計測手段をさらに備える請求項６に記載の細胞画像解析システム。
【請求項８】
前記細胞周期の期の時間計測手段が計測した当該生細胞の第一の期から次の期に変化するまでの第一の期の時間と、前記細胞周期の期の時間計測手段が計測した当該生細胞の第二の期から次の期に変化するまでの第二の期の時間とを比較する細胞周期の期の時間比較手段をさらに備える請求項１〜７のいずれかに記載の細胞画像解析システム。
【請求項９】
前記Ｍ期内の詳細期の時間計測手段が計測した当該生細胞のＭ期内の第一の詳細期が次の詳細期または次の細胞周期の期に変化するまでの第一の詳細期の時間と、前記Ｍ期内の詳細期の時間計測手段が計測した当該生細胞のＭ期内の第二の詳細期が次の詳細期または次の細胞周期の期に変化するまでの第二の詳細期の時間とを比較するＭ期内の詳細期の時間比較手段をさらに備えることを特徴とする請求項７又は請求項７に従属する請求項８に記載の細胞画像解析システム。
【請求項１０】
前記同定手段が、
前記細胞周期の期の時間計測手段が計測した当該生細胞の細胞周期の期の時間、前記Ｍ期内の詳細期の時間計測手段が計測した当該生細胞のＭ期内の詳細期の時間、前記細胞周期の期の時間比較手段が比較した当該生細胞の細胞周期の期の時間の比較値、前記Ｍ期内の詳細期の時間比較手段が比較した当該生細胞のＭ期内の詳細期の時間の比較値の少なくともいずれかを用いて、少なくとも細胞の種類を同定することを特徴とする請求項７に従属する請求項８に従属する請求項９に記載の細胞画像解析システム。
【請求項１１】
前記同定手段は、さらに、前記細胞周期の期の時間計測手段が計測した当該生細胞の細胞周期の期の時間、前記Ｍ期内の詳細期の時間計測手段が計測した当該生細胞のＭ期内の詳細期の時間、前記細胞周期の期の時間比較手段が比較した当該生細胞の細胞周期の期の時間の比較値、前記Ｍ期内の詳細期の時間比較手段が比較した当該生細胞のＭ期内の詳細期の時間の比較値の少なくともいずれかを用いて、細胞分裂、細胞の成長度、細胞集団の層別、細胞の性質の少なくともいずれかを同定することを特徴とする請求項１０に記載の細胞画像解析システム。
【請求項１２】
前記細胞周期の期の時間計測手段は、一つの生細胞における複数世代の世代時間を計測し、
前記画像解析ソフトウェアは、前記コンピュータを、さらに、前記細胞周期の期の時間計測手段が計測した当該一つの生細胞の異なる世代同士の世代時間を比較する世代時間比較手段として機能させ、
前記同定手段は、さらに、前記世代時間比較手段が比較した当該一つの生細胞の異なる世代同士の世代時間の比較値を、生細胞の異なる世代同士の世代時間の比較値に対応する生細胞の変化情報が格納されたデータテーブルと照合することにより、当該一つの生細胞の変化を検出することを特徴とする請求項１〜１１のいずれかに記載の細胞画像解析システム。
【請求項１３】
前記細胞周期の期の時間計測手段は、二つ以上の生細胞のそれぞれにおける複数世代の世代時間を計測し、
前記画像解析ソフトウェアは、前記コンピュータを、さらに、前記細胞周期の期の時間計測手段が計測した当該二つ以上の生細胞のそれぞれにおける異なる世代同士の世代時間を比較する世代時間比較手段として機能させ、
前記同定手段は、さらに、前記世代時間比較手段が比較した当該二つ以上の生細胞のそれぞれにおける異なる世代同士の世代時間の比較値を、生細胞の異なる世代同士の世代時間の比較値に対応する生細胞の層別化情報が格納されたデータテーブルと照合することにより、当該二つ以上の生細胞を層別化することを特徴とする請求項１〜１１のいずれかに記載の細胞画像解析システム。
【請求項１４】
前記細胞周期の期の時間計測手段は、二つ以上の生細胞のそれぞれにおける複数世代の世代時間を計測し、
前記画像解析ソフトウェアは、前記コンピュータを、さらに、前記細胞周期の期の時間計測手段が計測した当該二つ以上の生細胞のそれぞれにおける異なる世代同士の世代時間を比較する世代時間比較手段として機能させ、
前記同定手段は、さらに、前記世代時間比較手段が比較した当該二つ以上の生細胞のそれぞれにおける異なる世代同士の世代時間の比較値を、生細胞の異なる世代同士の世代時間の比較値に対応する生細胞の変化情報及び層別化情報が格納されたデータテーブルと照合することにより、当該二つ以上の生細胞のそれぞれにおける変化を検出するとともに当該二つ以上の生細胞を層別化することを特徴とする請求項１〜１１のいずれかに記載の細胞画像解析システム。
【請求項１５】
前記画像取得装置は、投与する化学薬品、光刺激、遺伝子操作、温度・湿度・圧力・ＰＨ等の環境、培地の養分等の少なくともいずれかを異ならせた２つの計測条件下における生細胞の画像を時系列に取得し、
前記世代時間比較手段は、前記２つの計測条件下のそれぞれにおいて、前記細胞周期の期の時間計測手段が計測した当該生細胞の世代時間を比較することを特徴とする請求項１２〜１４のいずれかに記載の細胞画像解析システム。
【請求項１６】
前記生細胞が、ＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞、がん幹細胞の少なくともいずれかであることを特徴とする請求項１〜１５のいずれかに記載の細胞画像解析システム。
【請求項１７】
前記生細胞が、ＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞、がん幹細胞から分化した細胞の少なくともいずれかであることを特徴とする請求項１〜１５のいずれかに記載の細胞画像解析システム。
【請求項１８】
前記蛍光タンパクが、ＦＵＣＣＩであることを特徴とする請求項1〜１７のいずれかに記載の細胞画像解析システム。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【公開番号】特開２０１２−１６３５３８（Ｐ２０１２−１６３５３８Ａ）
【公開日】平成２４年８月３０日（２０１２．８．３０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−２６２８３（Ｐ２０１１−２６２８３）
【出願日】平成２３年２月９日（２０１１．２．９）
【出願人】（００００００３７６）オリンパス株式会社 (11,466)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年８月３０日（２０１２．８．３０）
【国際特許分類】
【出願日】平成２３年２月９日（２０１１．２．９）
【出願人】（００００００３７６）オリンパス株式会社 (11,466)
【Ｆターム（参考）】
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