細胞老化関連因子
【課題】本発明の課題は、老化を診断する方法を提供することである。
【解決手段】当該課題は、Ｂａｎｄ１、Ｂａｎｄ２、Ｂａｎｄ３、Ｂａｎｄ４、Ｂａｎｄ５、Ｂａｎｄ６、Ｂａｎｄ１０、Ｂａｎｄ１１、Ｓｐｏｔ１、Ｓｐｏｔ４、Ｓｐｏｔ７、Ｓｐｏｔ８、Ｓｐｏｔ１０、Ｓｐｏｔ１３、Ｓｐｏｔ２３及びＳｐｏｔ２７からなる群から選択される少なくとも１の遺伝子を検出し、その発現量の変化を検出することにより解決される。
【解決手段】当該課題は、Ｂａｎｄ１、Ｂａｎｄ２、Ｂａｎｄ３、Ｂａｎｄ４、Ｂａｎｄ５、Ｂａｎｄ６、Ｂａｎｄ１０、Ｂａｎｄ１１、Ｓｐｏｔ１、Ｓｐｏｔ４、Ｓｐｏｔ７、Ｓｐｏｔ８、Ｓｐｏｔ１０、Ｓｐｏｔ１３、Ｓｐｏｔ２３及びＳｐｏｔ２７からなる群から選択される少なくとも１の遺伝子を検出し、その発現量の変化を検出することにより解決される。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞老化関連因子を含む、老化を診断する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒト正常線維芽細胞は、細胞の分裂に従い、その表現型を大きく変え、やがては老化を迎えることが知られており、これを細胞老化という。
加齢に伴いおきるエラー・損傷の蓄積などの変化は、生理的な機能低下だけでなく、ガン、糖尿病、高血圧等の生活習慣病を含む様々な疾病の原因となる病的な変化をも引き起こす。そこで、このような変化を引き起こす老化の機構を明らかにするために、細胞老化に着目した研究が行われてきた。
【０００３】
現在までに判明している細胞老化の指標としては、老化関連β−ガラクトシダーゼ（Ｓｅｎｅｓｃｅｎｃｅ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ β−ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ：ＳＡ−β−ｇａｌ）活性が上昇すること；過酸化脂質であるリポフスチンが脳や内臓の細胞に蓄積すること；ヒト線維芽細胞ではＳｅｎｅｓｃｅｎｃｅ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｈｅｔｅｒｏｃｈｒｏｍａｔｉｎ ｆｏｃｉ （ＳＡＨＦ）というゲノムワイドなヘテロクロマチン形成が核内に蓄積すること等が知られており、また多くの増殖抑制遺伝子が老化関連遺伝子として単離されている。
【０００４】
老化に関連する遺伝子はこれまでにも解析が行われてきてはいるが、老化の結果として発現増強あるいは活性化されているに過ぎないものであることが多く、老化の原因を規定する遺伝子の同定までに至った研究は非常に少ない。また、ある特定の遺伝子ノックダウンの結果として、細胞老化が遅延又は阻害された例は非常に少ない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 92(20): 9363-9367 (1995)
【非特許文献２】J. Biol. Chem., 279： 17826-17833 (2004)
【非特許文献３】Cell, 113(6): 703-716 (2003)
【非特許文献４】Aging Cell, 2(3): 145-150 (2003)
【非特許文献５】Cell, 133(6): 1019-1031 (2008)
【非特許文献６】Cell, 133(6): 1006-1018 (2008),
【非特許文献７】Cell, 132(3): 363-374 (2008)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
細胞老化を制御しうる分子基盤は明らかにされておらず、細胞老化プログラム及びその制御因子が加齢性疾患発症へどのように関与しているのかについても明らかにされていなかった。そこで、本発明は、この細胞老化という局面において、発現増強する老化誘導遺伝子および発現低下する老化抑制遺伝子を同定することにより、細胞老化関連因子を含む、老化を診断する方法又は老化を軽減又は予防するための医薬組成物を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者は、上記課題を解決するために鋭意研究を行った。そして、加齢に伴う生理的な機能低下と病的老化のモデルとなる分子・シグナルを明らかにするために、ヒト正常線維芽細胞（ＴＩＧ−１）をモデル細胞として用いて、細胞の老化とともに発現を変化させる細胞老化関連因子をプロテオミクス的アプローチにより同定するとともに、それらの強制発現実験を通じた機能解析を行い、細胞老化を誘導しうる遺伝子を同定すること、及び、各種生活習慣病患者由来ｃＤＮＡを用いた細胞老化関連因子の発現解析から、細胞老化関連因子の生活習慣病発症に対する寄与を明らかにすることにより、本発明を完成するに至った。
【０００８】
すなわち、本発明は以下のとおりである。
（１）Ｂａｎｄ１、Ｂａｎｄ２、Ｂａｎｄ３、Ｂａｎｄ４、Ｂａｎｄ５、Ｂａｎｄ６、Ｂａｎｄ１０、Ｂａｎｄ１１、Ｓｐｏｔ１、Ｓｐｏｔ４、Ｓｐｏｔ７、Ｓｐｏｔ８、Ｓｐｏｔ１０、Ｓｐｏｔ１３、Ｓｐｏｔ２３及びＳｐｏｔ２７からなる群から選択される少なくとも１の遺伝子を検出することを特徴とする、老化を診断する方法。
【０００９】
（２）Ｂａｎｄ１、Ｂａｎｄ２、Ｂａｎｄ３、Ｂａｎｄ４、Ｂａｎｄ５、Ｂａｎｄ６、Ｂａｎｄ１０、Ｂａｎｄ１１、Ｓｐｏｔ１、Ｓｐｏｔ４、Ｓｐｏｔ７、Ｓｐｏｔ８、Ｓｐｏｔ１０、Ｓｐｏｔ１３、Ｓｐｏｔ２３及びＳｐｏｔ２７からなる群から選択される少なくとも１の遺伝子を含む、生活習慣病、神経変性疾患、自己免疫疾患又は炎症性疾患のマーカー。
ここで、生活習慣病は、肥満症、糖尿病、高血圧及び動脈硬化からなる群から選択される少なくとも１でもよい。さらに、神経変性疾患はアルツハイマー病又は認知症でもよい。そして、自己免疫疾患は、リューマチ、１型糖尿病及び多発性硬化症からなる群から選択される少なくとも１であってもよい。また、炎症性疾患は、潰瘍性大腸炎及びクローン病からなる群から選択される少なくとも１であってもよい。
【００１０】
（３）老化を軽減又は予防する物質のスクリーニング方法であって、Ｂａｎｄ１、Ｂａｎｄ２、Ｂａｎｄ３、Ｂａｎｄ４、Ｂａｎｄ５、Ｂａｎｄ６、Ｂａｎｄ１０、Ｂａｎｄ１１、Ｓｐｏｔ１、Ｓｐｏｔ４、Ｓｐｏｔ７、Ｓｐｏｔ８、Ｓｐｏｔ１０、Ｓｐｏｔ１３、Ｓｐｏｔ２３及びＳｐｏｔ２７からなる群から選択される少なくとも１の細胞老化関連因子の遺伝子を用いて、少なくとも次の工程、
（ｉ）被験物質の存在下または非存在下に、前記細胞老化関連因子を接触させる工程；
（ｉｉ）前記細胞老化関連因子の遺伝子の発現量又はタンパク質質量を測定する工程；
（ｉｉｉ）被験物質の作用を、上記（ｉ）および（ｉｉ）に基づく結果と、同時に行った対照の結果とを比較して検出する工程；および
（ｉｖ）前記発現量が変化した被験物質を選択する工程；
を含む、前記方法。
ここで、細胞老化関連因子がＢａｎｄ１、Ｂａｎｄ２、Ｂａｎｄ３、Ｂａｎｄ４、Ｂａｎｄ５、Ｂａｎｄ６、Ｂａｎｄ１０、Ｂａｎｄ１１、Ｓｐｏｔ１、Ｓｐｏｔ４、Ｓｐｏｔ７、Ｓｐｏｔ８、Ｓｐｏｔ１０、Ｓｐｏｔ１３、Ｓｐｏｔ２３及びＳｐｏｔ２７から選択される少なくとも１の物質であり、当該物質の発現量が対照由来の発現量よりも減少している場合に、用いた被験物質が老化の軽減又は予防に効果があると判断してもよい。さらに、細胞老化関連因子がＢａｎｄ２、Ｂａｎｄ４、Ｂａｎｄ５、Ｂａｎｄ６、Ｂａｎｄ１０、Ｓｐｏｔ８、Ｓｐｏｔ１０、Ｓｐｏｔ１３及びＳｐｏｔ２７から選択される少なくとも１の物質であり、当該物質の発現量が対照由来の発現量よりも増加している場合に、用いた被験物質が老化の軽減又は予防に効果があると判断してもよい。
【００１１】
（４）Ｂａｎｄ２、Ｂａｎｄ４、Ｂａｎｄ５、Ｂａｎｄ６、Ｂａｎｄ１０、Ｓｐｏｔ８、Ｓｐｏｔ１０、Ｓｐｏｔ１３及びＳｐｏｔ２７からなる群から選択される少なくとも１の細胞老化関連因子の発現を促進させる物質、又は、Ｂａｎｄ１、Ｂａｎｄ２、Ｂａｎｄ３、Ｂａｎｄ４、Ｂａｎｄ５、Ｂａｎｄ６、Ｂａｎｄ１０、Ｂａｎｄ１１、Ｓｐｏｔ１、Ｓｐｏｔ４、Ｓｐｏｔ７、Ｓｐｏｔ８、Ｓｐｏｔ１０、Ｓｐｏｔ１３、Ｓｐｏｔ２３及びＳｐｏｔ２７からなる群から選択される少なくとも１の細胞老化関連因子の発現を抑制する物質を含む、老化を軽減するための医薬組成物。
【００１２】
ここで、細胞老化関連因子のうち、好ましくは、分裂老化に伴い発現が増加する老化関連遺伝子は、Ｂａｎｄ１、Ｂａｎｄ５、Ｂａｎｄ１１、Ｓｐｏｔ１、Ｓｐｏｔ４、Ｓｐｏｔ７、Ｓｐｏｔ８、Ｓｐｏｔ１０及びＳｐｏｔ２３であってもよく、分裂老化に伴い発現が低下する老化関連遺伝子は、Ｂａｎｄ２、Ｂａｎｄ４、Ｂａｎｄ６、Ｂａｎｄ１０及びＳｐｏｔ１３であってもよい。
【００１３】
また、細胞老化関連因子のうち、好ましくは、早期老化に協調して発現増強する遺伝子は、Ｂａｎｄ１、Ｂａｎｄ２、Ｂａｎｄ３、Ｂａｎｄ４、Ｂａｎｄ５、Ｂａｎｄ６、Ｂａｎｄ１１、Ｓｐｏｔ１、Ｓｐｏｔ４、Ｓｐｏｔ７、Ｓｐｏｔ８、Ｓｐｏｔ１０、Ｓｐｏｔ１３、Ｓｐｏｔ２３及びＳｐｏｔ２７であってもよく、発現低下する遺伝子はＳｐｏｔ１０、Ｓｐｏｔ１３及びＳｐｏｔ２７でもよい。
さらに、細胞老化関連因子のうち、好ましくは、糖尿病患者由来の筋肉で発現が増加する老化関連遺伝子は、Ｂａｎｄ１、Ｂａｎｄ３、Ｂａｎｄ４、Ｂａｎｄ５、Ｂａｎｄ６、Ｂａｎｄ１１、Ｓｐｏｔ１、Ｓｐｏｔ４、Ｓｐｏｔ７、Ｓｐｏｔ８、Ｓｐｏｔ１３、Ｓｐｏｔ２３及びＳｐｏｔ２７であってもよく、糖尿病患者由来の膵臓で発現が増加する老化関連遺伝子は、Ｂａｎｄ１、Ｂａｎｄ２、Ｂａｎｄ３、Ｂａｎｄ４、Ｂａｎｄ６、Ｂａｎｄ１０、Ｂａｎｄ１１、Ｓｐｏｔ１、Ｓｐｏｔ４、Ｓｐｏｔ７、Ｓｐｏｔ１０、Ｓｐｏｔ１３、Ｓｐｏｔ２３及びＳｐｏｔ２７であってもよく、糖尿病患者由来の膵臓で発現が低下する老化関連遺伝子はＢａｎｄ５及びＳｐｏｔ８であってもよい。
【００１４】
そして、細胞老化関連因子のうち、好ましくは、アルツハイマー病患者での発現が増加する老化関連遺伝子は、Ｂａｎｄ１及びＢａｎｄ１１であってもよい。
【発明の効果】
【００１５】
本発明の老化を診断する方法に関連する老化特異的遺伝子又は抗老化遺伝子は、臓器レベルでの老化症状を客観的に測定して、診断するための指標として用いることができる。
また、本発明の老化特異的遺伝子等は、老化関連疾患の治療や創薬に有用な情報として利用することもできる。
【００１６】
さらに、本発明の老化特異的遺伝子は、老化の進行を人為的に操作する技術にも応用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】図１は、分裂老化を誘導したＴＩＧ−１細胞から調製した、膜タンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す写真である。
【図２】図２は、分裂老化を誘導したＴＩＧ−１細胞から調製した、膜タンパク質の二次元電気泳動の結果を示す写真である。
【図３】図３は、分裂老化及び早期老化を誘導したＴＩＧ−１細胞から調製した、膜タンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す写真である。
【図４】図４は、分裂老化及び早期老化を誘導したＴＩＧ−１細胞から調製した、膜タンパク質の二次元電気泳動の結果を示す写真である。
【図５】図５は、ヒト線維芽細胞の分裂老化にともなう老化マーカー遺伝子の発現変化を示すグラフである。
【図６】図６は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより同定した遺伝子の分裂変化における発現変化を定量リアルタイムＰＣＲにより定量したグラフである。
【図７】図７は、二次元電気泳動により同定した遺伝子の分裂変化における発現変化を定量リアルタイムＰＣＲにより定量したである。
【図８】図８は、ＴＩＧ−１細胞へ老化関連遺伝子強制発現ベクターを導入し、ＳＡ−β−ｇａｌ染色してから１０時間経過後の写真である。
【図９】図９は、糖尿病患者と健常者由来筋肉組織における老化関連因子群の発現量を定量ＰＣＲで解析した結果を示すグラフである。
【図１０】図１０は、糖尿病患者及び健常者由来膵臓組織における老化関連因子群の発現量を定量ＰＣＲで解析した結果を示すグラフである。
【図１１】図１１は、アルツハイマー病患者及び健常者由来大脳皮質組織における老化関連因子群の発現量を定量ＰＣＲにより解析した結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
本発明は、細胞老化関連因子を含む、老化を診断する方法に関する。以下、本発明を詳細に説明する。
＜本発明の細胞老化関連因子＞
本発明の細胞老化関連因子は、その発現量の変化を解析することにより、老化の進行を診断する方法に供することができる。
【００１９】
本発明の細胞老化関連因子とは、細胞の老化形質に依存して発現量が変化する遺伝子をいう。好ましくは、Ｂａｎｄ１（Ｈｏｍｏ Ｓａｐｉｅｎｓ ｄｅａｔｈ ｉｎｄｕｃｅｒ−ｏｂｌｉｔｅｒａｔｏｒ１；アクセッション番号ＡＫ００２１２７．１；配列番号１）、Ｂａｎｄ２（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ ｚｉｎｃ ｆｉｎｇｅｒ ｐｒｏｔｅｉｎ４５；ＺＮＦ４５；アクセッション番号ＢＣ０３７５７５．１；配列番号３）、Ｂａｎｄ３（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ Ｒａｎ ＧＴＰａｓｅ ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ１；ＲＡＮＧＡＰ１；アクセッション番号ＢＣ０１４０４４．２；配列番号５）、Ｂａｎｄ４（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ ＦＫ５０６ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ５；ＦＫＢＰ５；アクセッション番号Ｕ７１３２１．１；配列番号７）、Ｂａｎｄ５（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ ＷＮＴ１ ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｐａｔｈｗａｙ ｐｒｏｔｅｉｎ３；ＷＩＳＰ３；アクセッション番号ＡＦ１００７８１．１；配列番号９）、Ｂａｎｄ６（Ｈｏｍｏ ｓａｐｅｉｎｓ ｍｉｔｏｇｅｎ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ ｋｉｎａｓｅ６；ＭＡＰ２Ｋ６；アクセッション番号ＢＣ０１２００９．１；配列番号１１）、Ｂａｎｄ１０（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ Ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ ｐｒｏｔｅｉｎ１９９；ＴＭＥＭ１９９；アクセッション番号ＢＣ０３３１１３．１；配列番号１３）、Ｂａｎｄ１１（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ ｓｐｅｒｍｉｄｉｎｅ／ｓｐｅｒｍｉｎｅ Ｎ１−ａｃｅｔｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ ｆａｍｉｌｙ ｍｅｍｂｅｒ２；ＳＡＴ２；アクセッション番号ＢＣ０１１７５１．２；配列番号１５）、Ｓｐｏｔ１（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ ｚｉｎｃ ｆｉｎｇｅｒ ｐｒｏｔｅｉｎ７３；ＺＮＦ７３；アクセッション番号Ｙ１０９２９．１；配列番号１７）、Ｓｐｏｔ４（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ ＳＷＩ／ＳＮＦ ｒｅｌａｔｅｄ、ｍａｔｒｉｘ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ、ａｃｔｉｎ ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｒｅｇｕｌａｔｏｒ ｏｆ ｃｈｒｏｍａｔｉｎ、ｓｕｂｆａｍｉｌｙｄ、ｍｅｍｂｅｒ１；ＳＭＡＲＣＤ１；アクセッション番号ＢＣ００９３６８．２；配列番号１９）、Ｓｐｏｔ７（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ ｓｅｒｉｎｅ／ｔｈｒｅｏｎｉｎｅ ｋｉｎａｓｅ４；ＳＴＫ４；アクセッション番号Ｕ６０２０７．１；配列番号２１）、Ｓｐｏｔ８（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ ＡＴＰ ｓｙｎｔｈａｓｅ，Ｈ＋ ｔｒａｎｓｐｏｒｔｉｎｇ，ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ Ｆ１ ｃｏｍｐｌｅｘ，ｂｅｔａ ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ；ＡＴＰ５Ｂ；アクセッション番号ＢＣ０１６５１２．１；配列番号２３）、Ｓｐｏｔ１０（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ Ｖｉｍｅｎｔｉｎ；アクセッション番号ＢＣ０００１６３．２；配列番号２５）、Ｓｐｏｔ１３（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ，ｃＧＭＰ−ｄｅｐｅｎｄｅｎ，ｔｙｐｅ１；ＰＲＫＧ１；アクセッション番号ＢＣ１２７０９０．１；配列番号２７）、Ｓｐｏｔ２３（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ ＡＴＰａｓｅ，Ｈ＋ ｔｒａｎｓｐｏｒｔｉｎｇ，ｌｙｓｏｓｏｍａｌ Ｖ０ ｓｕｂｕｎｉｔａ２；ＡＴＰ６Ｖ０Ａ２；アクセッション番号ＡＦ１１２９７２．１；配列番号２９）、Ｓｐｏｔ２７（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ ｃａｌｍｉｎ；ＣＬＭＮ；アクセッション番号ＡＢ０４７９７９．１；配列番号３１）があげられるが、これらに限定されない。
【００２０】
このうち、Ｂａｎｄ１、Ｂａｎｄ５、Ｂａｎｄ１１、Ｓｐｏｔ１、Ｓｐｏｔ４、Ｓｐｏｔ７、Ｓｐｏｔ８、Ｓｐｏｔ１０及びＳｐｏｔ２３等の遺伝子は分裂老化に伴い発現が増加する遺伝子であり、Ｂａｎｄ２、Ｂａｎｄ４、Ｂａｎｄ６、Ｂａｎｄ１０及びＳｐｏｔ１３等の遺伝子は分裂老化に伴い発現が低下する遺伝子である。
【００２１】
このうち、Ｂａｎｄ１、Ｂａｎｄ２、Ｂａｎｄ３、Ｂａｎｄ４、Ｂａｎｄ５、Ｂａｎｄ６、Ｂａｎｄ１１、Ｓｐｏｔ１、Ｓｐｏｔ４、Ｓｐｏｔ７、Ｓｐｏｔ８、Ｓｐｏｔ１０、Ｓｐｏｔ１３、Ｓｐｏｔ２３及びＳｐｏｔ２７等の遺伝子は早期老化に伴い発現が増加する遺伝子であり、Ｓｐｏｔ１０、Ｓｐｏｔ１３及びＳｐｏｔ２７等の遺伝子は早期老化に伴い発現が低下する遺伝子である。
【００２２】
また、Ｂａｎｄ１、Ｂａｎｄ３、Ｂａｎｄ４、Ｂａｎｄ５、Ｂａｎｄ６、Ｂａｎｄ１１、Ｓｐｏｔ１、Ｓｐｏｔ４、Ｓｐｏｔ７、Ｓｐｏｔ８、Ｓｐｏｔ１３、Ｓｐｏｔ２３及びＳｐｏｔ２７等の遺伝子は糖尿病の進行に伴い筋肉で発現が増加する遺伝子であり、Ｂａｎｄ１、Ｂａｎｄ２、Ｂａｎｄ３、Ｂａｎｄ４、Ｂａｎｄ６、Ｂａｎｄ１０、Ｂａｎｄ１１、Ｓｐｏｔ１、Ｓｐｏｔ４、Ｓｐｏｔ７、Ｓｐｏｔ１０、Ｓｐｏｔ１３、Ｓｐｏｔ２３及びＳｐｏｔ２７等の遺伝子は糖尿病の進行に伴い、膵臓で発現が増加する遺伝子であり、Ｂａｎｄ５及びＳｐｏｔ８等の遺伝子は糖尿病の進行に伴い膵臓で発現が低下する遺伝子である。
【００２３】
さらに、Ｂａｎｄ１及びＢａｎｄ１１等の遺伝子はアルツハイマー病の進行に伴い発現が増加する遺伝子である。
総じて、老化や老化関連の疾病の進行に伴い発現が増加する遺伝子を老化特異的遺伝子という場合もあり、また、老化や老化関連の疾病の進行に伴い発現が低下する遺伝子を、抗老化遺伝子という場合もある。
【００２４】
本発明の細胞老化関連因子の遺伝子群は、細胞の老化形質に依存して発現量が変化する遺伝子であり、細胞老化診断、細胞老化に依存した細胞機能変化修復のためのターゲット分子として好ましい。
【００２５】
＜本発明の老化を診断する方法＞
本発明の上記細胞老化関連因子の遺伝子を用いて、老化を診断することができる。
本発明の老化とは、生物学的に時間の経過とともに生物の個体に起こる変化や、細胞が分裂を停止し、増殖できなくなった状態が不可逆的に引き起こされる細胞老化をいい、加齢性疾患や各種炎症性疾患が発症する状態をも含まれる。細胞老化は、特に、ヒト正常線維芽細胞において、細胞の分裂に従い、当該細胞の表現型が大きく変化することにより、老化を迎えることをいう場合もある。
【００２６】
細胞老化には、「分裂老化」と「早期老化」が含まれる。正常なヒト体細胞では、染色体末端のテロメアを延長する酵素テロメラーゼが発現していないため、末端複製問題から細胞分裂の度にテロメアが短縮する。テロメア長がある限界値まで達したとき、細胞周期チェックポイントの発動とともに、細胞が増殖を不可逆的に停止する過程を分裂老化という。これに対して、細胞分裂回数に依存することなく、ガン遺伝子やＤＮＡ損傷などの様々な外因性のストレスによっても、細胞は不可逆的に増殖を停止し、細胞老化様の表現型を示す。この細胞老化は、テロメアが一定の閾値まで短縮するのを待たず、短期間のうちに細胞老化様形態を示し、早期老化と呼ばれている。この早期老化は最近、炎症性サイトカインによっても誘導されることが知られており、各種炎症性疾患発症に対する早期老化の寄与も推定されている。ここでいう炎症性疾患とは、糖尿病・肥満症を含むメタボリックシンドローム、動脈硬化症、アルツハイマー病、認知症を含む神経変性疾患、リューマチ及び多発性硬化症を含む自己免疫疾患を含むものであるがこれらに限定されない。
【００２７】
「加齢性疾患」とは、加齢に伴い発症頻度が高まる疾患をいい、糖尿病、高血圧、高脂血症、肥満等の生活習慣病やアルツハイマー病や認知症等の神経変性疾患や、動脈硬化、骨粗鬆症、脳梗塞、脳出血、心筋梗塞、狭心症、大腸癌等の様々な癌等があげられるが、これらに限定されない。
【００２８】
本発明の老化を診断する方法は、好ましくは、本発明の細胞老化関連因子を用いて、少なくとも次の工程、
（ｉ）生体試料中の本発明の細胞老化関連因子の遺伝子の発現量又はタンパク質量を測定する工程；
（ｉｉ）上記（ｉ）に基づく結果と、同時に行った対照の結果又は経時的変化による結果とを比較して検出する工程；及び、
（ｉｉｉ）前記発現量の変化により、老化の進行を評価する工程；
を含む方法である。
【００２９】
本発明の上記方法のうち、「生体試料」とは、血液、尿、組織等があげられるが、これらに限定されない。
本発明の上記方法のうち、「発現量の測定」には、公知の発現量を測定する方法を用いることができるが、例えば、本実施例に記載の定量ＰＣＲ法、ＥＬＩＳＡ法、ウェスタンブロット法、免疫染色法などがあげられる。
【００３０】
本発明の上記方法のうち、工程（ｉｉ）については、対照との比較を行ってもよく、また、経時変化による試験結果を比較することによってもよい。この場合、生体試料が存在しない条件下で工程（ｉ）と同じ操作を行ったものが対照として好適である。あるいは、対照としては、生体試料をより低い濃度で含む場合であってもよい。または、健常者由来の生体試料を対照としてもよい。また、対照との比較にかえて、発現量の経時的な変化を比較してもよい。その場合は、試験開始時期と比較した、試験開始一定期間後の発現量の変化を指標にしてもよく、また、２以上の所定の時点での発現量をそれぞれ比較することにより、その発現量の変化を指標としてもよい。
【００３１】
本発明の上記方法のうち、工程（ｉｉｉ）については、老化特異的遺伝子を用いる場合は、当該遺伝子の発現量又は当該タンパク質の発現量が増加すれば老化の状態が進行していると評価することができる。抗老化遺伝子を用いる場合は、当該遺伝子の発現量又は当該タンパク質の発現量が増加すれば、老化の進行が抑制されている又は老化が開始されていないと評価できる。
【００３２】
「老化の状態」とは、生物学的に時間の経過とともに生物の個体に起こる変化の状態や、細胞が分裂を停止し、増殖できなくなった状態が不可逆的に引き起こされた結果の状態、細胞がストレスや炎症性サイトカインに曝されることで増殖できなくなった状態が不可逆的に引き起こされた結果の状態のほか、加齢性疾患が発症又は進行する状態をいう。
【００３３】
＜本発明のマーカー＞
本発明の上記細胞老化関連因子は、老化の診断、例えば、上記＜本発明の老化を診断する方法＞に記載した方法において、マーカーとして用いることができる。すなわち、本発明の細胞老化関連因子は、老化マーカー、又は糖尿病又はアルツハイマー病等の加齢性疾患及び炎症性疾患のマーカーに適用することもできる。
【００３４】
本発明の上記細胞老化関連因子をマーカーとして用いる場合の指標は、上記＜本発明の老化を診断する方法＞に記載したとおりである。
＜老化を軽減又は予防する物質のスクリーニング方法＞
本発明の上記細胞老化関連因子を用いて、老化を軽減又は予防する物質のスクリーニングを行うことができる。
【００３５】
老化を軽減又は予防する物質について、本発明によるスクリーニング方法は、以下の手順に基づく。すなわち、本発明の細胞老化関連因子を用いて、少なくとも次の工程、
（ｉ）被験物質の存在下又は非存在下に、本発明の細胞老化関連因子を接触させる工程；
（ｉｉ）上記細胞老化関連因子の遺伝子又はタンパク質の発現量を測定する工程；
（ｉｉｉ）被験物質の作用を、上記（ｉ）および（ｉｉ）に基づく結果と、同時に行った対照の結果とを比較して検出する工程；および
（ｉｖ）前記発現量が変化した被験物質を選択する工程；
を含む方法により、老化を軽減又は予防する物質のスクリーニングを行うことができる。
【００３６】
この場合、工程（ｉ）の工程としては、被験物質の存在下または非存在下に、本発明の細胞老化関連因子を接触させる工程であれば何でもよく、例えば、特定の細胞を培養する工程や被験物質をある特定の細胞に接触させる工程でもよい。また、対照としては、被験物質が存在しない条件下で工程（ｉ）および（ｉｉ）と同じ操作を行ったものが好適である。あるいは、被験物質をより低い濃度で含む場合であってもよい。また、対照との比較にかえて、発現量の経時的な変化を比較してもよい。その場合は、試験開始時期と比較した、被験物質投与一定期間後の発現量の変化を指標にしてもよく、また、２以上の所定の時点での発現量をそれぞれ比較することにより、その発現量の変化を指標としてもよい。
【００３７】
このような物質のスクリーニングにおいて、被験物質の存在により老化特異的遺伝子又はタンパク質の発現量が減少するか、又は、抗老化遺伝子又はタンパク質の発現量が増加することが確認できれば、当該物質は老化を軽減又は予防を促進する物質と判定される。
【００３８】
＜本発明の老化を軽減又は予防するための医薬組成物＞
本発明は、老化を軽減又は予防するための医薬組成物も提供する。
本発明に関する細胞老化関連因子のうち、老化特異的遺伝子又はタンパク質の発現を阻害することにより、老化を軽減又は予防できる。したがって、本発明の老化を軽減又は予防するための医薬組成物には、老化特異的遺伝子又はタンパク質の発現を阻害する物質が含まれてもよい。当該物質は、上記＜老化を軽減又は予防する物質のスクリーニング方法＞に記載した方法により探索することができる。
【００３９】
その他、当該遺伝子の発現阻害の方法としては、特に限定されるものではないが、例えばＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を利用することができる。当該遺伝子に対するｓｉＲＮＡ（ｓｍａｌｌ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡ）を設計及び合成し、これを細胞内に導入させることによって、ＲＮＡｉを引き起こすことができる。
【００４０】
また、本発明に関する細胞老化関連因子のうち、抗老化遺伝子の発現を促進することによっても、老化を軽減又は予防できる。したがって、本発明の老化を軽減又は予防するための医薬組成物には、抗老化遺伝子の発現を促進する物質が含まれてもよい。当該物質は、上記＜老化を軽減又は予防する物質のスクリーニング方法＞に記載した方法により探索することができる。
【００４１】
本発明の医薬組成物を細胞内に導入させるには、公知の方法を用いることができるが、例えば、本発明の医薬組成物をリポソームなどのリン脂質小胞体に導入し、その小胞体を投与することも可能であるし、市販の遺伝子導入キット（例えばＡｄｅｎｏ−Ｘ発現システム：クローンテック社）を用いることもできる。また場合によっては、本発明の医薬組成物を細胞に接触させるだけでもよい。本発明の医薬組成物の投与形態は、経口、非経口投与のいずれでも可能であり、その投与量は、年齢、性別、症状、投与経路、投与回数、剤型により適宜変更することができる。
【実施例】
【００４２】
本実施例は、プロテオミクス的手法により、分裂老化、早期老化、加齢性疾患及び炎症性疾患の発症に関与する細胞老化関連因子を同定し、その発現解析を行うことを目的とする。
【００４３】
１．老化の誘導
分裂老化（Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｖｅ ｓｅｎｅｓｃｅｎｃｅ）は、ヒト正常線維芽細胞ＴＩＧ−１を用いて、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含むＭＥＭ培地にて、３７℃、５％ＣＯ２存在下で長期間継代培養することで誘導した。
【００４４】
早期老化（Ｐｒｅｍａｔｕｒｅ ｓｅｎｅｓｃｅｎｃｅ）は、アデノウイルス発現系を用いて、ＴＩＧ−１細胞に細胞老化誘導因子であるＴＡＫ１とＴＡＢ１、ＰＫＣ−δ、Ｒａｓを強制発現させることにより、誘導した。まず、アデノウイルスのインフェクションを行う１２時間前に、１０％ＦＢＳを含むＭＥＭ培地で培養したＴＩＧ−１細胞を、１．２×１０３細胞／ｍＬの細胞密度で播種した。１２時間後、無血清培地で２回洗浄した。陰性コントロールとしてＡｄｅｎｏ−ｎｕｌｌを、サンプルとしてＲａｓを発現するＡｄｅｎｏ- Ｒａｓ，ＭＫＫ６の優性活性化変異体ＭＫＫ６ｇｌｕを発現するＡｄｅｎｏ- ＭＫＫ６ｇｌｕ，ＴＡＫ１を発現するＡｄ−ＴＡＫ１，ＴＡＢ１を発現するＡｄ−ＴＡＢ１及びＰＫＣ−δを発現するＡｄ−ＰＫＣ−δの各ウイルス原液をＭＯＩ（Ｍｕｌｔｉｐｌｉｃｉｔｙ ｏｆ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ：多重感染度）が１００となるように無血清ＭＥＭ培地で希釈したものを細胞に添加した。細胞全体にウイルス液を行き渡らせ、３７℃、５％ＣＯ２存在下で２４時間培養した。培地交換後、さらに同条件にて３〜４日間培養を行い、早期老化を誘導した。
【００４５】
２．老化細胞において発現が増強又は減少しているタンパク質の同定
次に、上記のように老化を誘導したＴＩＧ−１細胞から、細胞表層タンパクビオチン化キット（ＰＩＥＲＣＥ）を用いて、膜タンパク質を調製した。具体的には、細胞をビオチン化し、ＮｅｕｔｒＡｖｉｄｉｎ（商標）Ｒｅｓｉｎを用いてビオチン化タンパク質を単離し、ＳＤＳバッファ及び５０ｍＭ ＤＤＴで溶出したものをサンプルとした。
【００４６】
あるいは、細胞膜タンパク質はＣＡＬＢＩＯＣＨＥＭ膜タンパク質抽出キットを用いて調製した。具体的には、細胞にＥｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ Ｉ及びＥｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ ＩＩを加え、遠心後沈殿物を除いた上清をサンプルとした。
【００４７】
上記で得られた膜タンパク質を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及び二次元電気泳動に供し、目的タンパク質を切り出した。その後、ゲル内にてプロテアーゼ消化を行い、ＭＡＬＤＩ ＴＯＦ−ＭＳ解析により当該タンパク質の同定を行った。
【００４８】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥは、以下の方法で行った。すなわち、一般的なＳＤＳ−ＰＡＧＥ法に基づき、５％の濃縮ゲル、８％の分離ゲルである組成のゲルを作製し、２５ｍＭ Ｔｒｉｓ、１９２ｍＭグリシン、０．１％ＳＤＳ溶液を泳動バッファとして用いて、４００μｇ相当のタンパク質を、４０Ｖ、２００ｍＡにて電気泳動を行った。
【００４９】
二次元電気泳動は、以下の方法で行った。すなわち、まず一次元目は等電点電気泳動を行い、等電点によりタンパク質の分離を行った。二次元目はＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、分子量でタンパク質の分離を行った。泳動後のゲルについて銀染色を行い、目的タンパク質のスポットを切り出した。その後、ゲル内にてプロテアーゼ消化を行い、ＭＡＬＤＩ ＴＯＦ−ＭＳ解析により当該タンパク質の同定を行った。
【００５０】
分裂老化に関する結果を図１及び２に示す。図１はＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示し、図２は二次元電気泳動の結果を示す。ここで、Ｙｏｕｎｇとは、集団倍加数ＰＤＬ（Ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ ｄｏｕｂｌｉｎｇ ｌｅｖｅｌ）４０（４０回分裂したＴＩＧ−１細胞）を示し、Ｏｌｄとは、ＰＤＬ６４（６４回分裂したＴＩＧ−１細胞）を示す。このようにＹｏｕｎｇとＯｌｄでは、発現に差があり、これにより、合計１６種類のタンパク質を同定することができた。
【００５１】
また、調製した膜タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥと二次元電気泳動により分離して、早期老化及び分裂老化を誘導した細胞における発現タンパク質の変化を比較した結果を図３及び４に示す。
【００５２】
その後、目的タンパク質を切り出してゲル内にてプロテアーゼ消化を行い、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ分析に供し、ペプチド断片の質量を測定し、データベース検索でそれぞれのタンパク質を同定した。
【００５３】
上記の結果、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび二次元電気泳動により同定されたタンパク質を表１に示す。
【００５４】
【表１】
【００５５】
３．細胞老化関連遺伝子の遺伝子発現解析
次に上記で同定した老化関連タンパク質に対する老化関連遺伝子が、ＴＩＧ−１細胞の細胞老化にともない、どのような発現変化を示すかを検討した。当該遺伝子には細胞老化や個体老化との関連がこれまで指摘されていないものも多く見受けられた。
【００５６】
具体的には、まず、上記で同定された１６種類の細胞老化関連タンパク質について、該当遺伝子に関する情報を収集し、それぞれに対するプライマーを合成後、定量ＰＣＲ法により細胞老化に依存した遺伝子発現解析を行った。用いた老化関連遺伝子は、Ｂａｎｄ１（配列番号１）、Ｂａｎｄ２（配列番号３）、Ｂａｎｄ３（配列番号５）、Ｂａｎｄ４（配列番号７）、Ｂａｎｄ５（配列番号９）、Ｂａｎｄ６（配列番号１１）、Ｂａｎｄ１０（配列番号１３）、Ｂａｎｄ１１（配列番号１５）、Ｓｐｏｔ１（配列番号１７）、Ｓｐｏｔ４（配列番号１９）、Ｓｐｏｔ７（配列番号２１）、Ｓｐｏｔ８（配列番号２３）、Ｓｐｏｔ１０（配列番号２５）、Ｓｐｏｔ１３（配列番号２７）、Ｓｐｏｔ２３（配列番号２９）、Ｓｐｏｔ２７（配列番号３１）である。老化マーカーとしてＣＤＫインヒビターである、ｐ２１（アクセッション番号ＮＭ＿０００３８９．３；配列番号３３）、ｐ１６（アクセッション番号ＮＭ＿００００７７．３；配列番号３４）も用いた。
【００５７】
分裂老化は上記のとおり、ＴＩＧ−１の継代培養により誘導し、継代ごとにＦａｓｔＰｕｒｅＲＮＡキット（Ｔａｋａｒａ）を用いて全ＲＮＡを抽出した。具体的には、１／１００容の２−メルカプトエタノールを含むＬｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒを添加し、１．５ｍＬチューブに回収した。２０Ｇの注射針でＤＮＡを剪断後、Ｓｏｌｕｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒを添加した。この混合液をフィルターカートリッジに供し、Ｅｌｕｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒで全ＲＮＡ溶液を溶出した。
【００５８】
この継代ごとのＲＮＡの品質を、老化マーカーであるＣＤＫインヒビターｐ２１とｐ１６の発現変化を指標にして、定量ＰＣＲ法により評価した。定量ＰＣＲ法には、ＳＹＢＲ Ｐｒｅｍｉｘ ＥＸ Ｔａｑキット（Ｔａｋａｒａ）を用いた。測定には、ＴｈｅｒｍａｌＣｙｃｌｅｒＤｉｃｅＲｅａｌＴｉｍｅＳｙｓｔｅｍ（Ｔａｋａｒａ）を用いた。ＰＣＲ反応条件としては、９５℃ １０秒を１ｃｙｃｌｅ、９５℃ ５秒、５５℃ ２０秒、７２℃ ２０秒を５０ｃｙｃｌｅ行った。スタンダードには、ヒトβ−アクチンを用いた。また、相対遺伝子発現量は、標的遺伝子の発現量をβ−アクチンの発現量で除し求めた。以下にβ−アクチン、ｐ１６、ｐ２１のプライマー配列を示す。
−Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ β−アクチン
Ｆｏｒｗａｒｄ：５’−ＴＧＧＣＡＣＣＣＡＧＣＡＣＡＡＴＧＡＡ−３’（配列番号３５）
Ｒｅｖｅｒｓｅ：５’−ＣＴＡＡＧＴＣＡＴＡＧＴＣＣＧＣＣＴＡＧＡＡＧＣＡ−３’（配列番号３６）
−Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ ｐ１６
Ｆｏｒｗａｒｄ：５’−ＧＧＣＡＣＣＡＧＡＧＧＣＡＧＴＡＡＣＣＡ−３’（配列番号３７）
Ｒｅｖｅｒｓｅ：５’−ＧＧＡＣＣＴＴＧＧＧＴＧＡＣＴＧＡＴＧＡＴＣ−３’（配列番号３８）
−Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ ｐ２１
Ｆｏｒｗａｒｄ：５’−ＴＧＡＡＡＴＣＧＴＣＣＡＧＣＧＡＣＣＴＴＣ−３’（配列番号３９）
Ｒｅｖｅｒｓｅ：５’−ＧＴＣＣＡＴＡＧＣＣＴＣＴＡＣＴＧＣＣＡＣＣ−３’（配列番号４０）
その結果、両老化マーカーとも、ＴＩＧ−１の分裂老化とともに発現増強していることが明らかとなった（図５）。そのため、以下の実験は、当該ＲＮＡを用いて行った。
【００５９】
次に、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで同定した８種の老化関連タンパク質（Ｂａｎｄ１、Ｂａｎｄ２、Ｂａｎｄ３、Ｂａｎｄ４、Ｂａｎｄ５、Ｂａｎｄ６、Ｂａｎｄ１０及びＢａｎｄ１１）に相当する老化関連遺伝子について、各々プライマーを合成し、定量ＰＣＲによりＴＩＧ−１の分裂老化に伴う遺伝子発現解析を行った。定量ＰＣＲ条件は上記の通り行った。以下にプライマー配列を示す。
Ｂａｎｄ１：
Ｆｏｒｗａｒｄ：５’−ＧＣＣＴＧＴＣＴＣＣＣＴＧＧＡＧＧＡＴＴ（配列番号４１）
Ｒｅｖｅｒｓｅ：５’−ＴＴＴＣＡＧＡＡＧＡＧＧＣＴＧＧＴＣＧＴ（配列番号４２）
Ｂａｎｄ２：
Ｆｏｒｗａｒｄ：５’−ＧＡＣＧＴＧＧＣＴＧＴＧＧＴＣＴＴＣＴＣ（配列番号４３）
Ｒｅｖｅｒｓｅ：５’−ＣＴＣＴＧＧＧＴＴＧＣＣＡＴＣＴＴＣＡＴ（配列番号４４）
Ｂａｎｄ３：
Ｆｏｒｗａｒｄ：５’−ＣＴＣＡＧＴＧＡＴＧＡＣＧＡＧＧＡＣＧＡ（配列番号４５）
Ｒｅｖｅｒｓｅ：５’−ＣＣＣＡＧＴＧＴＴＡＧＧＧＴＣＣＡＧＡＡ（配列番号４６）
Ｂａｎｄ４：
Ｆｏｒｗａｒｄ：５’−ＴＣＣＣＴＣＧＡＡＴＧＣＡＡＣＴＣＴＣＴ（配列番号４７）
Ｒｅｖｅｒｓｅ：５’−ＡＡＡＣＡＴＣＣＴＴＣＣＡＣＣＡＣＡＧＣ（配列番号４８）
Ｂａｎｄ５：
Ｆｏｒｗａｒｄ：５’−ＣＡＧＡＴＧＣＡＣＣＴＣＡＧＣＧＴＡＡＡ（配列番号４９）
Ｒｅｖｅｒｓｅ：５’−ＡＴＣＣＡＣＡＧＣＣＡＴＴＣＴＴＣＡＣＣ（配列番号５０）
Ｂａｎｄ６：
Ｆｏｒｗａｒｄ：５’−ＡＣＧＧＣＴＡＣＴＧＡＴＧＧＡＴＴＴＧＧ（配列番号５１）
Ｒｅｖｅｒｓｅ：５’−ＴＧＡＣＣＧＡＧＡＧＣＡＴＴＧＡＴＧＡＧ（配列番号５２）
Ｂａｎｄ１０：
Ｆｏｒｗａｒｄ：５’−ＣＴＣＣＡＣＧＧＡＡＣＣＣＡＧＡＡＣＴＡ（配列番号５３）
Ｒｅｖｅｒｓｅ：５’−ＧＡＴＧＧＴＧＡＴＧＡＣＣＡＧＡＧＣＣＴ（配列番号５４）
Ｂａｎｄ１１：
Ｆｏｒｗａｒｄ：５’−ＡＧＴＡＣＡＴＧＧＡＡＧＧＧＡＣＧＣＡＣ（配列番号５５）
Ｒｅｖｅｒｓｅ：５’−ＣＴＴＴＣＣＴＧＣＣＡＡＣＴＴＴＣＴＣＧ（配列番号５６）
その結果、ＴＩＧ−１の分裂老化とともに発現増強する老化関連遺伝子３種（Ｂａｎｄ１、Ｂａｎｄ５及びＢａｎｄ１１）および発現低下する老化関連遺伝子４種（Ｂａｎｄ２、Ｂａｎｄ４、Ｂａｎｄ６及びＢａｎｄ１０）が同定された（図６）。当該結果は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥでみられた発現変化とほぼ一致した。
【００６０】
さらに、二次元電気泳動で同定した老化関連タンパク質（Ｓｐｏｔ１、Ｓｐｏｔ４、Ｓｐｏｔ７、Ｓｐｏｔ８、Ｓｐｏｔ１０、Ｓｐｏｔ１３、Ｓｐｏｔ２３、Ｓｐｏｔ２７）について、同様に定量ＰＣＲにより分裂老化に伴う遺伝子発現解析を行った。定量ＰＣＲ条件は上記の通り行った。以下にプライマー配列を示す。
Ｓｐｏｔ１：
Ｆｏｒｗａｒｄ：５’−ＧＧＧＡＡＡＡＣＧＴＴＴＣＡＣＣＡＡＡＡＧ（配列番号５７）
Ｒｅｖｅｒｓｅ：５’−ＣＡＴＧＣＡＴＡＴＧＧＴＴＴＴＴＣＣＣＣＣＧ（配列番号５８）
Ｓｐｏｔ４：
Ｆｏｒｗａｒｄ：５’−ＡＣＧＴＣＣＣＡＴＣＡＡＧＣＡＡＡＡＡＣ（配列番号５９）
Ｒｅｖｅｒｓｅ：５’−ＴＴＧＧＡＣＡＡＧＧＣＴＧＡＡＴＣＣＴＣ（配列番号６０）
Ｓｐｏｔ７：
Ｆｏｒｗａｒｄ：５’−ＴＣＣＴＧＴＧＧＡＡＴＣＡＧＡＣＣＴＣＣ（配列番号６１）
Ｒｅｖｅｒｓｅ：５’−ＴＣＡＧＡＴＡＣＡＧＡＡＣＣＡＧＣＣＣＣ（配列番号６２）
Ｓｐｏｔ８：
Ｆｏｒｗａｒｄ：５’−ＴＣＡＣＣＣＡＧＧＣＴＧＧＴＴＣＡＧＡ（配列番号６３）
Ｒｅｖｅｒｓｅ：５’−ＡＧＴＧＧＣＣＡＧＧＧＴＡＧＧＣＴＧＡＴ（配列番号６４）
Ｓｐｏｔ１０：
Ｆｏｒｗａｒｄ：５’−ＧＡＧＡＡＣＴＴＴＧＣＣＧＴＴＧＡＡＧＣ（配列番号６５）
Ｒｅｖｅｒｓｅ：５’−ＧＡＡＡＴＣＣＴＧＣＴＣＴＣＣＴＣＧＣ（配列番号６６）
Ｓｐｏｔ１３：
Ｆｏｒｗａｒｄ：５’−ＣＧＡＧＧＴＴＡＴＧＣＣＡＡＡＣＴＧＧＴ（配列番号６７）
Ｒｅｖｅｒｓｅ：５’−ＧＧＡＴＧＡＴＣＴＣＴＧＧＧＧＣＴＡＣＡ（配列番号６８）
Ｓｐｏｔ２３：
Ｆｏｒｗａｒｄ：５’−ＧＧＧＡＴＴＴＧＴＧＴＣＴＧＧＣＣＴＡＡ（配列番号６９）
Ｒｅｖｅｒｓｅ：５’−ＣＡＧＧＧＴＣＴＴＣＡＡＧＧＧＡＴＴＣＡ（配列番号７０）
Ｓｐｏｔ２７
Ｆｏｒｗａｒｄ：５’−ＴＧＴＴＣＡＧＴＴＧＡＧＧＡＡＣＧＣＡＧ（配列番号７１）
Ｒｅｖｅｒｓｅ：５’−ＣＡＡＧＣＴＧＴＧＴＣＡＧＧＧＡＧＴＣＡ（配列番号７２）
その結果、ＴＩＧ−１の分裂老化とともに発現増強する老化関連遺伝子６種（Ｓｐｏｔ１、Ｓｐｏｔ４、Ｓｐｏｔ７、Ｓｐｏｔ８、Ｓｐｏｔ１０及びＳｐｏｔ２３）および発現低下する老化関連遺伝子１種（Ｓｐｏｔ１３）が同定された（図７）。この結果も、二次元電気泳動でみられた発現変化とほぼ一致した。
【００６１】
以上の結果より、分裂老化に伴い発現が増加する老化関連遺伝子が９種類（Ｂａｎｄ１、Ｂａｎｄ５、Ｂａｎｄ１１、Ｓｐｏｔ１、Ｓｐｏｔ４、Ｓｐｏｔ７、Ｓｐｏｔ８、Ｓｐｏｔ１０及びＳｐｏｔ２３）、分裂老化に伴い発現が低下する老化関連遺伝子が５種類（Ｂａｎｄ２、Ｂａｎｄ４、Ｂａｎｄ６、Ｂａｎｄ１０及びＳｐｏｔ１３）同定された。
【００６２】
同様に、早期老化における遺伝子発現解析を行った。上記の老化関連遺伝子の転写量を、上記プライマーを用い、上記方法にてリアルタイムＰＣＲで測定した。
早期老化ＴＩＧ−１細胞における、老化関連遺伝子の発現量をリアルタイムＰＣＲで測定した結果から、多くの老化関連遺伝子の発現が早期老化の誘導とともに増強されていることが明らかとなった。具体的には、４通り全ての早期老化誘導時に発現が増加する老化関連遺伝子が７種類（Ｂａｎｄ１、Ｂａｎｄ２、Ｂａｎｄ３、Ｂａｎｄ５、Ｂａｎｄ１１、Ｓｐｏｔ１及びＳｐｏｔ７）、４通りのうち３通りの早期老化誘導時に発現が増加する老化関連遺伝子が５種類（Ｂａｎｄ６、Ｓｐｏｔ４、Ｓｐｏｔ１３、Ｓｐｏｔ２３及びＳｐｏｔ２７）同定された。
【００６３】
以上の結果から、本研究により同定された老化関連遺伝子群は細胞の老化形質に依存して発現量が変化する遺伝子であり、細胞老化診断、細胞老化に依存した細胞機能変化修復のためのターゲット分子であることが示された。
【００６４】
４．発現が増加する遺伝子と老化誘導との関連性の検討
上記分裂老化に伴い発現が増加する老化関連遺伝子が老化を誘導するか否かを解析した。
【００６５】
老化を誘導するか否かの評価については、老化の指標として広く用いられているＳＡ−β−ｇａｌアッセイにより検討した。具体的には、まずそれぞれの細胞老化関連遺伝子全長を増幅するためのプライマーを合成し、ＴＩＧ−１細胞より調製したＲＮＡを用いて合成したｃＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行い、細胞老化関連遺伝子をｐＧＥＭＴ−ｅａｓｙベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）にクローニングした。塩基配列を確認後、各細胞老化関連遺伝子を切り出し、動物細胞発現ベクターであるｐＥＧＦＰ−Ｃ３（クローンテック）に挿入した。得られた発現ベクターを遺伝子導入試薬（ＨｉｌｙＭａｘ；同仁化学）を用いＴＩＧ−１細胞へ導入した。
【００６６】
その後、当該細胞に対し、ＳＡ−β−ｇａｌ染色を行い、１０時間放置した。
その結果、細胞老化関連遺伝子を強制発現した細胞では、ｍｏｃｋと比較して、より強く染まっていることが確認された（図８）。当該結果から、分裂老化に伴い発現が増加する老化関連遺伝子は、ＴＩＧ−１細胞において老化を誘導することが示された。このことから、当該遺伝子が老化プログラムにおいて重要な役割を担っていることが示された。
【００６７】
５．細胞老化関連遺伝子の加齢性疾患に対する寄与
次に、細胞老化関連遺伝子が加齢性疾患にどのように寄与しているかを、糖尿病患者及び健常人の筋肉・膵臓組織由来ｃＤＮＡを用いた、細胞老化関連遺伝子の発現解析により解析した。加齢性疾患としては糖尿病及びアルツハイマー病を選択した。
【００６８】
糖尿病は、筋肉・膵臓の組織に対して、エラー・損傷の蓄積、ウイルス感染、ストレス等により細胞老化が誘導され、それに伴い、インスリン抵抗性、インスリン分泌低下を引き起こすことにより、発症すると考えることができるため、老化関連遺伝子が糖尿病の発症メカニズムとどのように関連しているかを検討した。
【００６９】
具体的には、Ｔｏｙｏｂｏより購入した糖尿病患者及びコントロールとして健常者由来の筋肉組織ｃＤＮＡを鋳型として用いて、上記老化関連遺伝子特異的プライマーを用いて、上記方法により定量ＰＣＲを行い、老化関連遺伝子の発現を解析した。ＰＣＲ反応条件としては、９５℃１０秒を１ｃｙｃｌｅ、９５℃５秒、５５℃２０秒、７２℃２０秒を５０ｃｙｃｌｅ行った。スタンダードとしては、β−アクチンを用いた。相対遺伝子発現量は、測定した値をβ−アクチンの値で除し求めた。
【００７０】
その結果、糖尿病患者由来の筋肉では、ｐ２１、ｐ１６の発現が増強していることが明らかとなり、細胞老化が誘導されていることが示された（図９）。さらに、上記実施例で同定された多くの老化関連遺伝子群が、糖尿病患者由来の筋肉でも、発現が増強されていることも示された。具体的には、糖尿病患者由来の筋肉で発現が増加する老化関連遺伝子が１３種類（Ｂａｎｄ１、Ｂａｎｄ３、Ｂａｎｄ４、Ｂａｎｄ５、Ｂａｎｄ６、Ｂａｎｄ１１、Ｓｐｏｔ１、Ｓｐｏｔ４、Ｓｐｏｔ７、Ｓｐｏｔ８、Ｓｐｏｔ１３、Ｓｐｏｔ２３及びＳｐｏｔ２７）同定された。なお、図９では、左側が健常者、右側が糖尿病患者を示し、縦軸は相対発現量を示す。
【００７１】
また、Ｔｏｙｏｂｏより購入した、糖尿病患者及びコントロールとして健常者由来の膵臓組織ｃＤＮＡを鋳型として用いて、上記老化関連遺伝子特異的プライマーを用いて、上記方法により定量ＰＣＲを行い、老化関連遺伝子の発現を解析した。
【００７２】
その結果、筋肉組織と同様、糖尿病患者由来の膵臓においても、ｐ２１及びｐ１６の発現が増強していることが明らかとなり、ここでも細胞老化が誘導されていることが示された（図１０）。さらに、ここでも上記実施例で同定された多くの老化関連遺伝子群が、糖尿病患者由来膵臓において、発現増強していることが示された。具体的には、糖尿病患者由来の膵臓で発現が増加する老化関連遺伝子が１４種類（Ｂａｎｄ１、Ｂａｎｄ２、Ｂａｎｄ３、Ｂａｎｄ４、Ｂａｎｄ６、Ｂａｎｄ１０、Ｂａｎｄ１１、Ｓｐｏｔ１、Ｓｐｏｔ４、Ｓｐｏｔ７、Ｓｐｏｔ１０、Ｓｐｏｔ１３、Ｓｐｏｔ２３及びＳｐｏｔ２７）、糖尿病患者由来の膵臓で発現が低下する老化関連遺伝子が２種類（Ｂａｎｄ５及びＳｐｏｔ８）同定された。
なお、図１０では、左側が健常者、右側が糖尿病患者を示し、縦軸は相対発現量を示す。
【００７３】
このように、今回同定した、ＴＩＧ−１の分裂老化に伴い発現増強する老化関連遺伝子のうち、そのほとんどのものが、糖尿病患者由来筋肉・膵臓組織で発現増強していることが明らかになった。その結果を表２に示す。
【００７４】
【表２】
【００７５】
このように、定量ＰＣＲ法に基づき遺伝子発現解析を行った結果、ＴＩＧ−１の分裂老化に協調して発現増強する遺伝子が９種類（Ｂａｎｄ１、Ｂａｎｄ５、Ｂａｎｄ１１、Ｓｐｏｔ１、Ｓｐｏｔ４、Ｓｐｏｔ７、Ｓｐｏｔ８、Ｓｐｏｔ１０及びＳｐｏｔ２３）及び発現低下する遺伝子が５種類（Ｂａｎｄ２、Ｂａｎｄ４、Ｂａｎｄ６、Ｂａｎｄ１０及びＳｐｏｔ１３）確認された。
【００７６】
さらに、４種類の細胞老化誘導因子（Ｒａｓ，優勢活性化型変異体ＭＫＫ６（ＭＫＫ６ｇｌｕ）、ＴＡＫ１およびＴＡＢ１、ＰＫＣ−δ）を導入し早期老化を誘導した場合には、７種類の遺伝子の発現が全てに共通して、５種類の遺伝子の発現が４通りのうち３通りの早期老化誘導時に増強されていた。具体的には、ＴＩＧ−１の早期老化に協調して発現増強する遺伝子が１５種類（Ｂａｎｄ１、Ｂａｎｄ２、Ｂａｎｄ３、Ｂａｎｄ４、Ｂａｎｄ５、Ｂａｎｄ６、Ｂａｎｄ１１、Ｓｐｏｔ１、Ｓｐｏｔ４、Ｓｐｏｔ７、Ｓｐｏｔ８、Ｓｐｏｔ１０、Ｓｐｏｔ１３、Ｓｐｏｔ２３及びＳｐｏｔ２７）及び発現低下する遺伝子が３種類（Ｓｐｏｔ１０、Ｓｐｏｔ１３及びＳｐｏｔ２７）確認された。
【００７７】
これら細胞老化に伴って多少なりとも発現変化を示す細胞老化関連因子１６種類のうち、糖尿病患者筋肉では１３種類の遺伝子が、糖尿病患者膵臓でも１４種類の遺伝子が発現増強されていた。具体的には、糖尿病患者由来の筋肉で発現が増加する老化関連遺伝子が１３種類（Ｂａｎｄ１、Ｂａｎｄ３、Ｂａｎｄ４、Ｂａｎｄ５、Ｂａｎｄ６、Ｂａｎｄ１１、Ｓｐｏｔ１、Ｓｐｏｔ４、Ｓｐｏｔ７、Ｓｐｏｔ８、Ｓｐｏｔ１３、Ｓｐｏｔ２３及びＳｐｏｔ２７）同定された。さらに、また、糖尿病患者由来の膵臓で発現が増加する老化関連遺伝子が１４種類（Ｂａｎｄ１、Ｂａｎｄ２、Ｂａｎｄ３、Ｂａｎｄ４、Ｂａｎｄ６、Ｂａｎｄ１０、Ｂａｎｄ１１、Ｓｐｏｔ１、Ｓｐｏｔ４、Ｓｐｏｔ７、Ｓｐｏｔ１０、Ｓｐｏｔ１３、Ｓｐｏｔ２３及びＳｐｏｔ２７）、糖尿病患者由来の膵臓で発現が低下する老化関連遺伝子が２種類（Ｂａｎｄ５及びＳｐｏｔ８）同定された。
【００７８】
また、ＣＤＫインヒビターｐ１６及びｐ２１を含む細胞老化関連遺伝子群の発現が、上記疾患患者由来組織において増強していたことから、これら加齢性疾患の発症が細胞老化により引き起こされていることが示された。
【００７９】
次に、分裂老化と早期老化ＴＩＧ−１細胞において発現量が有意に変化した遺伝子について、その神経変性疾患に対する寄与を明らかにするため、Ｔｏｙｏｂｏより購入した、アルツハイマー病患者由来大脳皮質及びコントロールとして健常者由来の大脳皮質ｃＤＮＡを鋳型として用いて、前述と同様の方法により老化関連遺伝子の発現解析を行った。
【００８０】
その結果、老化マーカーであるｐ２１の発現がアルツハイマー病患者大脳皮質において、正常大脳皮質に比べて増強されていることが明らかになるとともに、今回同定された２種の細胞老化関連因子（Ｂａｎｄ１及びＢａｎｄ１１）の発現がアルツハイマー病患者大脳皮質において、正常大脳皮質に比べて増強されていることが明らかとなった（図１１）。この結果から、アルツハイマー病が細胞老化により引き起こされていると考えられるとともに、アルツハイマー病の発症においてもこれら細胞老化関連遺伝子が関与しているものと考えることができた。
【産業上の利用可能性】
【００８１】
本発明の細胞老化関連因子を含む、老化を軽減するための医薬組成物により、肥満症・糖尿病・高血圧・動脈硬化を含む生活習慣病や神経変性疾患の診断、治療又は予防ができる。また、本発明に関連する細胞老化関連因子は上記疾患のマーカーとして有用である。さらに本発明に関連する細胞老化関連因子は未病診断マーカーとしても有用である。
【００８２】
したがって、本発明に関連する細胞老化関連因子は、新たなドラッグターゲットになりうる点で産業上の利用可能性がある。
【配列表フリーテキスト】
【００８３】
配列番号３５：プライマー
配列番号３６：プライマー
配列番号３７：プライマー
配列番号３８：プライマー
配列番号３９：プライマー
配列番号４０：プライマー
配列番号４１：プライマー
配列番号４２：プライマー
配列番号４３：プライマー
配列番号４４：プライマー
配列番号４５：プライマー
配列番号４６：プライマー
配列番号４７：プライマー
配列番号４８：プライマー
配列番号４９：プライマー
配列番号５０：プライマー
配列番号５１：プライマー
配列番号５２：プライマー
配列番号５３：プライマー
配列番号５４：プライマー
配列番号５５：プライマー
配列番号５６：プライマー
配列番号５７：プライマー
配列番号５８：プライマー
配列番号５９：プライマー
配列番号６０：プライマー
配列番号６１：プライマー
配列番号６２：プライマー
配列番号６３：プライマー
配列番号６４：プライマー
配列番号６５：プライマー
配列番号６６：プライマー
配列番号６７：プライマー
配列番号６８：プライマー
配列番号６９：プライマー
配列番号７０：プライマー
配列番号７１：プライマー
配列番号７２：プライマー
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞老化関連因子を含む、老化を診断する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒト正常線維芽細胞は、細胞の分裂に従い、その表現型を大きく変え、やがては老化を迎えることが知られており、これを細胞老化という。
加齢に伴いおきるエラー・損傷の蓄積などの変化は、生理的な機能低下だけでなく、ガン、糖尿病、高血圧等の生活習慣病を含む様々な疾病の原因となる病的な変化をも引き起こす。そこで、このような変化を引き起こす老化の機構を明らかにするために、細胞老化に着目した研究が行われてきた。
【０００３】
現在までに判明している細胞老化の指標としては、老化関連β−ガラクトシダーゼ（Ｓｅｎｅｓｃｅｎｃｅ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ β−ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ：ＳＡ−β−ｇａｌ）活性が上昇すること；過酸化脂質であるリポフスチンが脳や内臓の細胞に蓄積すること；ヒト線維芽細胞ではＳｅｎｅｓｃｅｎｃｅ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｈｅｔｅｒｏｃｈｒｏｍａｔｉｎ ｆｏｃｉ （ＳＡＨＦ）というゲノムワイドなヘテロクロマチン形成が核内に蓄積すること等が知られており、また多くの増殖抑制遺伝子が老化関連遺伝子として単離されている。
【０００４】
老化に関連する遺伝子はこれまでにも解析が行われてきてはいるが、老化の結果として発現増強あるいは活性化されているに過ぎないものであることが多く、老化の原因を規定する遺伝子の同定までに至った研究は非常に少ない。また、ある特定の遺伝子ノックダウンの結果として、細胞老化が遅延又は阻害された例は非常に少ない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 92(20): 9363-9367 (1995)
【非特許文献２】J. Biol. Chem., 279： 17826-17833 (2004)
【非特許文献３】Cell, 113(6): 703-716 (2003)
【非特許文献４】Aging Cell, 2(3): 145-150 (2003)
【非特許文献５】Cell, 133(6): 1019-1031 (2008)
【非特許文献６】Cell, 133(6): 1006-1018 (2008),
【非特許文献７】Cell, 132(3): 363-374 (2008)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
細胞老化を制御しうる分子基盤は明らかにされておらず、細胞老化プログラム及びその制御因子が加齢性疾患発症へどのように関与しているのかについても明らかにされていなかった。そこで、本発明は、この細胞老化という局面において、発現増強する老化誘導遺伝子および発現低下する老化抑制遺伝子を同定することにより、細胞老化関連因子を含む、老化を診断する方法又は老化を軽減又は予防するための医薬組成物を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者は、上記課題を解決するために鋭意研究を行った。そして、加齢に伴う生理的な機能低下と病的老化のモデルとなる分子・シグナルを明らかにするために、ヒト正常線維芽細胞（ＴＩＧ−１）をモデル細胞として用いて、細胞の老化とともに発現を変化させる細胞老化関連因子をプロテオミクス的アプローチにより同定するとともに、それらの強制発現実験を通じた機能解析を行い、細胞老化を誘導しうる遺伝子を同定すること、及び、各種生活習慣病患者由来ｃＤＮＡを用いた細胞老化関連因子の発現解析から、細胞老化関連因子の生活習慣病発症に対する寄与を明らかにすることにより、本発明を完成するに至った。
【０００８】
すなわち、本発明は以下のとおりである。
（１）Ｂａｎｄ１、Ｂａｎｄ２、Ｂａｎｄ３、Ｂａｎｄ４、Ｂａｎｄ５、Ｂａｎｄ６、Ｂａｎｄ１０、Ｂａｎｄ１１、Ｓｐｏｔ１、Ｓｐｏｔ４、Ｓｐｏｔ７、Ｓｐｏｔ８、Ｓｐｏｔ１０、Ｓｐｏｔ１３、Ｓｐｏｔ２３及びＳｐｏｔ２７からなる群から選択される少なくとも１の遺伝子を検出することを特徴とする、老化を診断する方法。
【０００９】
（２）Ｂａｎｄ１、Ｂａｎｄ２、Ｂａｎｄ３、Ｂａｎｄ４、Ｂａｎｄ５、Ｂａｎｄ６、Ｂａｎｄ１０、Ｂａｎｄ１１、Ｓｐｏｔ１、Ｓｐｏｔ４、Ｓｐｏｔ７、Ｓｐｏｔ８、Ｓｐｏｔ１０、Ｓｐｏｔ１３、Ｓｐｏｔ２３及びＳｐｏｔ２７からなる群から選択される少なくとも１の遺伝子を含む、生活習慣病、神経変性疾患、自己免疫疾患又は炎症性疾患のマーカー。
ここで、生活習慣病は、肥満症、糖尿病、高血圧及び動脈硬化からなる群から選択される少なくとも１でもよい。さらに、神経変性疾患はアルツハイマー病又は認知症でもよい。そして、自己免疫疾患は、リューマチ、１型糖尿病及び多発性硬化症からなる群から選択される少なくとも１であってもよい。また、炎症性疾患は、潰瘍性大腸炎及びクローン病からなる群から選択される少なくとも１であってもよい。
【００１０】
（３）老化を軽減又は予防する物質のスクリーニング方法であって、Ｂａｎｄ１、Ｂａｎｄ２、Ｂａｎｄ３、Ｂａｎｄ４、Ｂａｎｄ５、Ｂａｎｄ６、Ｂａｎｄ１０、Ｂａｎｄ１１、Ｓｐｏｔ１、Ｓｐｏｔ４、Ｓｐｏｔ７、Ｓｐｏｔ８、Ｓｐｏｔ１０、Ｓｐｏｔ１３、Ｓｐｏｔ２３及びＳｐｏｔ２７からなる群から選択される少なくとも１の細胞老化関連因子の遺伝子を用いて、少なくとも次の工程、
（ｉ）被験物質の存在下または非存在下に、前記細胞老化関連因子を接触させる工程；
（ｉｉ）前記細胞老化関連因子の遺伝子の発現量又はタンパク質質量を測定する工程；
（ｉｉｉ）被験物質の作用を、上記（ｉ）および（ｉｉ）に基づく結果と、同時に行った対照の結果とを比較して検出する工程；および
（ｉｖ）前記発現量が変化した被験物質を選択する工程；
を含む、前記方法。
ここで、細胞老化関連因子がＢａｎｄ１、Ｂａｎｄ２、Ｂａｎｄ３、Ｂａｎｄ４、Ｂａｎｄ５、Ｂａｎｄ６、Ｂａｎｄ１０、Ｂａｎｄ１１、Ｓｐｏｔ１、Ｓｐｏｔ４、Ｓｐｏｔ７、Ｓｐｏｔ８、Ｓｐｏｔ１０、Ｓｐｏｔ１３、Ｓｐｏｔ２３及びＳｐｏｔ２７から選択される少なくとも１の物質であり、当該物質の発現量が対照由来の発現量よりも減少している場合に、用いた被験物質が老化の軽減又は予防に効果があると判断してもよい。さらに、細胞老化関連因子がＢａｎｄ２、Ｂａｎｄ４、Ｂａｎｄ５、Ｂａｎｄ６、Ｂａｎｄ１０、Ｓｐｏｔ８、Ｓｐｏｔ１０、Ｓｐｏｔ１３及びＳｐｏｔ２７から選択される少なくとも１の物質であり、当該物質の発現量が対照由来の発現量よりも増加している場合に、用いた被験物質が老化の軽減又は予防に効果があると判断してもよい。
【００１１】
（４）Ｂａｎｄ２、Ｂａｎｄ４、Ｂａｎｄ５、Ｂａｎｄ６、Ｂａｎｄ１０、Ｓｐｏｔ８、Ｓｐｏｔ１０、Ｓｐｏｔ１３及びＳｐｏｔ２７からなる群から選択される少なくとも１の細胞老化関連因子の発現を促進させる物質、又は、Ｂａｎｄ１、Ｂａｎｄ２、Ｂａｎｄ３、Ｂａｎｄ４、Ｂａｎｄ５、Ｂａｎｄ６、Ｂａｎｄ１０、Ｂａｎｄ１１、Ｓｐｏｔ１、Ｓｐｏｔ４、Ｓｐｏｔ７、Ｓｐｏｔ８、Ｓｐｏｔ１０、Ｓｐｏｔ１３、Ｓｐｏｔ２３及びＳｐｏｔ２７からなる群から選択される少なくとも１の細胞老化関連因子の発現を抑制する物質を含む、老化を軽減するための医薬組成物。
【００１２】
ここで、細胞老化関連因子のうち、好ましくは、分裂老化に伴い発現が増加する老化関連遺伝子は、Ｂａｎｄ１、Ｂａｎｄ５、Ｂａｎｄ１１、Ｓｐｏｔ１、Ｓｐｏｔ４、Ｓｐｏｔ７、Ｓｐｏｔ８、Ｓｐｏｔ１０及びＳｐｏｔ２３であってもよく、分裂老化に伴い発現が低下する老化関連遺伝子は、Ｂａｎｄ２、Ｂａｎｄ４、Ｂａｎｄ６、Ｂａｎｄ１０及びＳｐｏｔ１３であってもよい。
【００１３】
また、細胞老化関連因子のうち、好ましくは、早期老化に協調して発現増強する遺伝子は、Ｂａｎｄ１、Ｂａｎｄ２、Ｂａｎｄ３、Ｂａｎｄ４、Ｂａｎｄ５、Ｂａｎｄ６、Ｂａｎｄ１１、Ｓｐｏｔ１、Ｓｐｏｔ４、Ｓｐｏｔ７、Ｓｐｏｔ８、Ｓｐｏｔ１０、Ｓｐｏｔ１３、Ｓｐｏｔ２３及びＳｐｏｔ２７であってもよく、発現低下する遺伝子はＳｐｏｔ１０、Ｓｐｏｔ１３及びＳｐｏｔ２７でもよい。
さらに、細胞老化関連因子のうち、好ましくは、糖尿病患者由来の筋肉で発現が増加する老化関連遺伝子は、Ｂａｎｄ１、Ｂａｎｄ３、Ｂａｎｄ４、Ｂａｎｄ５、Ｂａｎｄ６、Ｂａｎｄ１１、Ｓｐｏｔ１、Ｓｐｏｔ４、Ｓｐｏｔ７、Ｓｐｏｔ８、Ｓｐｏｔ１３、Ｓｐｏｔ２３及びＳｐｏｔ２７であってもよく、糖尿病患者由来の膵臓で発現が増加する老化関連遺伝子は、Ｂａｎｄ１、Ｂａｎｄ２、Ｂａｎｄ３、Ｂａｎｄ４、Ｂａｎｄ６、Ｂａｎｄ１０、Ｂａｎｄ１１、Ｓｐｏｔ１、Ｓｐｏｔ４、Ｓｐｏｔ７、Ｓｐｏｔ１０、Ｓｐｏｔ１３、Ｓｐｏｔ２３及びＳｐｏｔ２７であってもよく、糖尿病患者由来の膵臓で発現が低下する老化関連遺伝子はＢａｎｄ５及びＳｐｏｔ８であってもよい。
【００１４】
そして、細胞老化関連因子のうち、好ましくは、アルツハイマー病患者での発現が増加する老化関連遺伝子は、Ｂａｎｄ１及びＢａｎｄ１１であってもよい。
【発明の効果】
【００１５】
本発明の老化を診断する方法に関連する老化特異的遺伝子又は抗老化遺伝子は、臓器レベルでの老化症状を客観的に測定して、診断するための指標として用いることができる。
また、本発明の老化特異的遺伝子等は、老化関連疾患の治療や創薬に有用な情報として利用することもできる。
【００１６】
さらに、本発明の老化特異的遺伝子は、老化の進行を人為的に操作する技術にも応用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】図１は、分裂老化を誘導したＴＩＧ−１細胞から調製した、膜タンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す写真である。
【図２】図２は、分裂老化を誘導したＴＩＧ−１細胞から調製した、膜タンパク質の二次元電気泳動の結果を示す写真である。
【図３】図３は、分裂老化及び早期老化を誘導したＴＩＧ−１細胞から調製した、膜タンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す写真である。
【図４】図４は、分裂老化及び早期老化を誘導したＴＩＧ−１細胞から調製した、膜タンパク質の二次元電気泳動の結果を示す写真である。
【図５】図５は、ヒト線維芽細胞の分裂老化にともなう老化マーカー遺伝子の発現変化を示すグラフである。
【図６】図６は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより同定した遺伝子の分裂変化における発現変化を定量リアルタイムＰＣＲにより定量したグラフである。
【図７】図７は、二次元電気泳動により同定した遺伝子の分裂変化における発現変化を定量リアルタイムＰＣＲにより定量したである。
【図８】図８は、ＴＩＧ−１細胞へ老化関連遺伝子強制発現ベクターを導入し、ＳＡ−β−ｇａｌ染色してから１０時間経過後の写真である。
【図９】図９は、糖尿病患者と健常者由来筋肉組織における老化関連因子群の発現量を定量ＰＣＲで解析した結果を示すグラフである。
【図１０】図１０は、糖尿病患者及び健常者由来膵臓組織における老化関連因子群の発現量を定量ＰＣＲで解析した結果を示すグラフである。
【図１１】図１１は、アルツハイマー病患者及び健常者由来大脳皮質組織における老化関連因子群の発現量を定量ＰＣＲにより解析した結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
本発明は、細胞老化関連因子を含む、老化を診断する方法に関する。以下、本発明を詳細に説明する。
＜本発明の細胞老化関連因子＞
本発明の細胞老化関連因子は、その発現量の変化を解析することにより、老化の進行を診断する方法に供することができる。
【００１９】
本発明の細胞老化関連因子とは、細胞の老化形質に依存して発現量が変化する遺伝子をいう。好ましくは、Ｂａｎｄ１（Ｈｏｍｏ Ｓａｐｉｅｎｓ ｄｅａｔｈ ｉｎｄｕｃｅｒ−ｏｂｌｉｔｅｒａｔｏｒ１；アクセッション番号ＡＫ００２１２７．１；配列番号１）、Ｂａｎｄ２（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ ｚｉｎｃ ｆｉｎｇｅｒ ｐｒｏｔｅｉｎ４５；ＺＮＦ４５；アクセッション番号ＢＣ０３７５７５．１；配列番号３）、Ｂａｎｄ３（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ Ｒａｎ ＧＴＰａｓｅ ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ１；ＲＡＮＧＡＰ１；アクセッション番号ＢＣ０１４０４４．２；配列番号５）、Ｂａｎｄ４（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ ＦＫ５０６ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ５；ＦＫＢＰ５；アクセッション番号Ｕ７１３２１．１；配列番号７）、Ｂａｎｄ５（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ ＷＮＴ１ ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｐａｔｈｗａｙ ｐｒｏｔｅｉｎ３；ＷＩＳＰ３；アクセッション番号ＡＦ１００７８１．１；配列番号９）、Ｂａｎｄ６（Ｈｏｍｏ ｓａｐｅｉｎｓ ｍｉｔｏｇｅｎ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ ｋｉｎａｓｅ６；ＭＡＰ２Ｋ６；アクセッション番号ＢＣ０１２００９．１；配列番号１１）、Ｂａｎｄ１０（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ Ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ ｐｒｏｔｅｉｎ１９９；ＴＭＥＭ１９９；アクセッション番号ＢＣ０３３１１３．１；配列番号１３）、Ｂａｎｄ１１（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ ｓｐｅｒｍｉｄｉｎｅ／ｓｐｅｒｍｉｎｅ Ｎ１−ａｃｅｔｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ ｆａｍｉｌｙ ｍｅｍｂｅｒ２；ＳＡＴ２；アクセッション番号ＢＣ０１１７５１．２；配列番号１５）、Ｓｐｏｔ１（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ ｚｉｎｃ ｆｉｎｇｅｒ ｐｒｏｔｅｉｎ７３；ＺＮＦ７３；アクセッション番号Ｙ１０９２９．１；配列番号１７）、Ｓｐｏｔ４（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ ＳＷＩ／ＳＮＦ ｒｅｌａｔｅｄ、ｍａｔｒｉｘ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ、ａｃｔｉｎ ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｒｅｇｕｌａｔｏｒ ｏｆ ｃｈｒｏｍａｔｉｎ、ｓｕｂｆａｍｉｌｙｄ、ｍｅｍｂｅｒ１；ＳＭＡＲＣＤ１；アクセッション番号ＢＣ００９３６８．２；配列番号１９）、Ｓｐｏｔ７（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ ｓｅｒｉｎｅ／ｔｈｒｅｏｎｉｎｅ ｋｉｎａｓｅ４；ＳＴＫ４；アクセッション番号Ｕ６０２０７．１；配列番号２１）、Ｓｐｏｔ８（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ ＡＴＰ ｓｙｎｔｈａｓｅ，Ｈ＋ ｔｒａｎｓｐｏｒｔｉｎｇ，ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ Ｆ１ ｃｏｍｐｌｅｘ，ｂｅｔａ ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ；ＡＴＰ５Ｂ；アクセッション番号ＢＣ０１６５１２．１；配列番号２３）、Ｓｐｏｔ１０（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ Ｖｉｍｅｎｔｉｎ；アクセッション番号ＢＣ０００１６３．２；配列番号２５）、Ｓｐｏｔ１３（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ，ｃＧＭＰ−ｄｅｐｅｎｄｅｎ，ｔｙｐｅ１；ＰＲＫＧ１；アクセッション番号ＢＣ１２７０９０．１；配列番号２７）、Ｓｐｏｔ２３（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ ＡＴＰａｓｅ，Ｈ＋ ｔｒａｎｓｐｏｒｔｉｎｇ，ｌｙｓｏｓｏｍａｌ Ｖ０ ｓｕｂｕｎｉｔａ２；ＡＴＰ６Ｖ０Ａ２；アクセッション番号ＡＦ１１２９７２．１；配列番号２９）、Ｓｐｏｔ２７（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ ｃａｌｍｉｎ；ＣＬＭＮ；アクセッション番号ＡＢ０４７９７９．１；配列番号３１）があげられるが、これらに限定されない。
【００２０】
このうち、Ｂａｎｄ１、Ｂａｎｄ５、Ｂａｎｄ１１、Ｓｐｏｔ１、Ｓｐｏｔ４、Ｓｐｏｔ７、Ｓｐｏｔ８、Ｓｐｏｔ１０及びＳｐｏｔ２３等の遺伝子は分裂老化に伴い発現が増加する遺伝子であり、Ｂａｎｄ２、Ｂａｎｄ４、Ｂａｎｄ６、Ｂａｎｄ１０及びＳｐｏｔ１３等の遺伝子は分裂老化に伴い発現が低下する遺伝子である。
【００２１】
このうち、Ｂａｎｄ１、Ｂａｎｄ２、Ｂａｎｄ３、Ｂａｎｄ４、Ｂａｎｄ５、Ｂａｎｄ６、Ｂａｎｄ１１、Ｓｐｏｔ１、Ｓｐｏｔ４、Ｓｐｏｔ７、Ｓｐｏｔ８、Ｓｐｏｔ１０、Ｓｐｏｔ１３、Ｓｐｏｔ２３及びＳｐｏｔ２７等の遺伝子は早期老化に伴い発現が増加する遺伝子であり、Ｓｐｏｔ１０、Ｓｐｏｔ１３及びＳｐｏｔ２７等の遺伝子は早期老化に伴い発現が低下する遺伝子である。
【００２２】
また、Ｂａｎｄ１、Ｂａｎｄ３、Ｂａｎｄ４、Ｂａｎｄ５、Ｂａｎｄ６、Ｂａｎｄ１１、Ｓｐｏｔ１、Ｓｐｏｔ４、Ｓｐｏｔ７、Ｓｐｏｔ８、Ｓｐｏｔ１３、Ｓｐｏｔ２３及びＳｐｏｔ２７等の遺伝子は糖尿病の進行に伴い筋肉で発現が増加する遺伝子であり、Ｂａｎｄ１、Ｂａｎｄ２、Ｂａｎｄ３、Ｂａｎｄ４、Ｂａｎｄ６、Ｂａｎｄ１０、Ｂａｎｄ１１、Ｓｐｏｔ１、Ｓｐｏｔ４、Ｓｐｏｔ７、Ｓｐｏｔ１０、Ｓｐｏｔ１３、Ｓｐｏｔ２３及びＳｐｏｔ２７等の遺伝子は糖尿病の進行に伴い、膵臓で発現が増加する遺伝子であり、Ｂａｎｄ５及びＳｐｏｔ８等の遺伝子は糖尿病の進行に伴い膵臓で発現が低下する遺伝子である。
【００２３】
さらに、Ｂａｎｄ１及びＢａｎｄ１１等の遺伝子はアルツハイマー病の進行に伴い発現が増加する遺伝子である。
総じて、老化や老化関連の疾病の進行に伴い発現が増加する遺伝子を老化特異的遺伝子という場合もあり、また、老化や老化関連の疾病の進行に伴い発現が低下する遺伝子を、抗老化遺伝子という場合もある。
【００２４】
本発明の細胞老化関連因子の遺伝子群は、細胞の老化形質に依存して発現量が変化する遺伝子であり、細胞老化診断、細胞老化に依存した細胞機能変化修復のためのターゲット分子として好ましい。
【００２５】
＜本発明の老化を診断する方法＞
本発明の上記細胞老化関連因子の遺伝子を用いて、老化を診断することができる。
本発明の老化とは、生物学的に時間の経過とともに生物の個体に起こる変化や、細胞が分裂を停止し、増殖できなくなった状態が不可逆的に引き起こされる細胞老化をいい、加齢性疾患や各種炎症性疾患が発症する状態をも含まれる。細胞老化は、特に、ヒト正常線維芽細胞において、細胞の分裂に従い、当該細胞の表現型が大きく変化することにより、老化を迎えることをいう場合もある。
【００２６】
細胞老化には、「分裂老化」と「早期老化」が含まれる。正常なヒト体細胞では、染色体末端のテロメアを延長する酵素テロメラーゼが発現していないため、末端複製問題から細胞分裂の度にテロメアが短縮する。テロメア長がある限界値まで達したとき、細胞周期チェックポイントの発動とともに、細胞が増殖を不可逆的に停止する過程を分裂老化という。これに対して、細胞分裂回数に依存することなく、ガン遺伝子やＤＮＡ損傷などの様々な外因性のストレスによっても、細胞は不可逆的に増殖を停止し、細胞老化様の表現型を示す。この細胞老化は、テロメアが一定の閾値まで短縮するのを待たず、短期間のうちに細胞老化様形態を示し、早期老化と呼ばれている。この早期老化は最近、炎症性サイトカインによっても誘導されることが知られており、各種炎症性疾患発症に対する早期老化の寄与も推定されている。ここでいう炎症性疾患とは、糖尿病・肥満症を含むメタボリックシンドローム、動脈硬化症、アルツハイマー病、認知症を含む神経変性疾患、リューマチ及び多発性硬化症を含む自己免疫疾患を含むものであるがこれらに限定されない。
【００２７】
「加齢性疾患」とは、加齢に伴い発症頻度が高まる疾患をいい、糖尿病、高血圧、高脂血症、肥満等の生活習慣病やアルツハイマー病や認知症等の神経変性疾患や、動脈硬化、骨粗鬆症、脳梗塞、脳出血、心筋梗塞、狭心症、大腸癌等の様々な癌等があげられるが、これらに限定されない。
【００２８】
本発明の老化を診断する方法は、好ましくは、本発明の細胞老化関連因子を用いて、少なくとも次の工程、
（ｉ）生体試料中の本発明の細胞老化関連因子の遺伝子の発現量又はタンパク質量を測定する工程；
（ｉｉ）上記（ｉ）に基づく結果と、同時に行った対照の結果又は経時的変化による結果とを比較して検出する工程；及び、
（ｉｉｉ）前記発現量の変化により、老化の進行を評価する工程；
を含む方法である。
【００２９】
本発明の上記方法のうち、「生体試料」とは、血液、尿、組織等があげられるが、これらに限定されない。
本発明の上記方法のうち、「発現量の測定」には、公知の発現量を測定する方法を用いることができるが、例えば、本実施例に記載の定量ＰＣＲ法、ＥＬＩＳＡ法、ウェスタンブロット法、免疫染色法などがあげられる。
【００３０】
本発明の上記方法のうち、工程（ｉｉ）については、対照との比較を行ってもよく、また、経時変化による試験結果を比較することによってもよい。この場合、生体試料が存在しない条件下で工程（ｉ）と同じ操作を行ったものが対照として好適である。あるいは、対照としては、生体試料をより低い濃度で含む場合であってもよい。または、健常者由来の生体試料を対照としてもよい。また、対照との比較にかえて、発現量の経時的な変化を比較してもよい。その場合は、試験開始時期と比較した、試験開始一定期間後の発現量の変化を指標にしてもよく、また、２以上の所定の時点での発現量をそれぞれ比較することにより、その発現量の変化を指標としてもよい。
【００３１】
本発明の上記方法のうち、工程（ｉｉｉ）については、老化特異的遺伝子を用いる場合は、当該遺伝子の発現量又は当該タンパク質の発現量が増加すれば老化の状態が進行していると評価することができる。抗老化遺伝子を用いる場合は、当該遺伝子の発現量又は当該タンパク質の発現量が増加すれば、老化の進行が抑制されている又は老化が開始されていないと評価できる。
【００３２】
「老化の状態」とは、生物学的に時間の経過とともに生物の個体に起こる変化の状態や、細胞が分裂を停止し、増殖できなくなった状態が不可逆的に引き起こされた結果の状態、細胞がストレスや炎症性サイトカインに曝されることで増殖できなくなった状態が不可逆的に引き起こされた結果の状態のほか、加齢性疾患が発症又は進行する状態をいう。
【００３３】
＜本発明のマーカー＞
本発明の上記細胞老化関連因子は、老化の診断、例えば、上記＜本発明の老化を診断する方法＞に記載した方法において、マーカーとして用いることができる。すなわち、本発明の細胞老化関連因子は、老化マーカー、又は糖尿病又はアルツハイマー病等の加齢性疾患及び炎症性疾患のマーカーに適用することもできる。
【００３４】
本発明の上記細胞老化関連因子をマーカーとして用いる場合の指標は、上記＜本発明の老化を診断する方法＞に記載したとおりである。
＜老化を軽減又は予防する物質のスクリーニング方法＞
本発明の上記細胞老化関連因子を用いて、老化を軽減又は予防する物質のスクリーニングを行うことができる。
【００３５】
老化を軽減又は予防する物質について、本発明によるスクリーニング方法は、以下の手順に基づく。すなわち、本発明の細胞老化関連因子を用いて、少なくとも次の工程、
（ｉ）被験物質の存在下又は非存在下に、本発明の細胞老化関連因子を接触させる工程；
（ｉｉ）上記細胞老化関連因子の遺伝子又はタンパク質の発現量を測定する工程；
（ｉｉｉ）被験物質の作用を、上記（ｉ）および（ｉｉ）に基づく結果と、同時に行った対照の結果とを比較して検出する工程；および
（ｉｖ）前記発現量が変化した被験物質を選択する工程；
を含む方法により、老化を軽減又は予防する物質のスクリーニングを行うことができる。
【００３６】
この場合、工程（ｉ）の工程としては、被験物質の存在下または非存在下に、本発明の細胞老化関連因子を接触させる工程であれば何でもよく、例えば、特定の細胞を培養する工程や被験物質をある特定の細胞に接触させる工程でもよい。また、対照としては、被験物質が存在しない条件下で工程（ｉ）および（ｉｉ）と同じ操作を行ったものが好適である。あるいは、被験物質をより低い濃度で含む場合であってもよい。また、対照との比較にかえて、発現量の経時的な変化を比較してもよい。その場合は、試験開始時期と比較した、被験物質投与一定期間後の発現量の変化を指標にしてもよく、また、２以上の所定の時点での発現量をそれぞれ比較することにより、その発現量の変化を指標としてもよい。
【００３７】
このような物質のスクリーニングにおいて、被験物質の存在により老化特異的遺伝子又はタンパク質の発現量が減少するか、又は、抗老化遺伝子又はタンパク質の発現量が増加することが確認できれば、当該物質は老化を軽減又は予防を促進する物質と判定される。
【００３８】
＜本発明の老化を軽減又は予防するための医薬組成物＞
本発明は、老化を軽減又は予防するための医薬組成物も提供する。
本発明に関する細胞老化関連因子のうち、老化特異的遺伝子又はタンパク質の発現を阻害することにより、老化を軽減又は予防できる。したがって、本発明の老化を軽減又は予防するための医薬組成物には、老化特異的遺伝子又はタンパク質の発現を阻害する物質が含まれてもよい。当該物質は、上記＜老化を軽減又は予防する物質のスクリーニング方法＞に記載した方法により探索することができる。
【００３９】
その他、当該遺伝子の発現阻害の方法としては、特に限定されるものではないが、例えばＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を利用することができる。当該遺伝子に対するｓｉＲＮＡ（ｓｍａｌｌ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡ）を設計及び合成し、これを細胞内に導入させることによって、ＲＮＡｉを引き起こすことができる。
【００４０】
また、本発明に関する細胞老化関連因子のうち、抗老化遺伝子の発現を促進することによっても、老化を軽減又は予防できる。したがって、本発明の老化を軽減又は予防するための医薬組成物には、抗老化遺伝子の発現を促進する物質が含まれてもよい。当該物質は、上記＜老化を軽減又は予防する物質のスクリーニング方法＞に記載した方法により探索することができる。
【００４１】
本発明の医薬組成物を細胞内に導入させるには、公知の方法を用いることができるが、例えば、本発明の医薬組成物をリポソームなどのリン脂質小胞体に導入し、その小胞体を投与することも可能であるし、市販の遺伝子導入キット（例えばＡｄｅｎｏ−Ｘ発現システム：クローンテック社）を用いることもできる。また場合によっては、本発明の医薬組成物を細胞に接触させるだけでもよい。本発明の医薬組成物の投与形態は、経口、非経口投与のいずれでも可能であり、その投与量は、年齢、性別、症状、投与経路、投与回数、剤型により適宜変更することができる。
【実施例】
【００４２】
本実施例は、プロテオミクス的手法により、分裂老化、早期老化、加齢性疾患及び炎症性疾患の発症に関与する細胞老化関連因子を同定し、その発現解析を行うことを目的とする。
【００４３】
１．老化の誘導
分裂老化（Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｖｅ ｓｅｎｅｓｃｅｎｃｅ）は、ヒト正常線維芽細胞ＴＩＧ−１を用いて、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含むＭＥＭ培地にて、３７℃、５％ＣＯ２存在下で長期間継代培養することで誘導した。
【００４４】
早期老化（Ｐｒｅｍａｔｕｒｅ ｓｅｎｅｓｃｅｎｃｅ）は、アデノウイルス発現系を用いて、ＴＩＧ−１細胞に細胞老化誘導因子であるＴＡＫ１とＴＡＢ１、ＰＫＣ−δ、Ｒａｓを強制発現させることにより、誘導した。まず、アデノウイルスのインフェクションを行う１２時間前に、１０％ＦＢＳを含むＭＥＭ培地で培養したＴＩＧ−１細胞を、１．２×１０３細胞／ｍＬの細胞密度で播種した。１２時間後、無血清培地で２回洗浄した。陰性コントロールとしてＡｄｅｎｏ−ｎｕｌｌを、サンプルとしてＲａｓを発現するＡｄｅｎｏ- Ｒａｓ，ＭＫＫ６の優性活性化変異体ＭＫＫ６ｇｌｕを発現するＡｄｅｎｏ- ＭＫＫ６ｇｌｕ，ＴＡＫ１を発現するＡｄ−ＴＡＫ１，ＴＡＢ１を発現するＡｄ−ＴＡＢ１及びＰＫＣ−δを発現するＡｄ−ＰＫＣ−δの各ウイルス原液をＭＯＩ（Ｍｕｌｔｉｐｌｉｃｉｔｙ ｏｆ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ：多重感染度）が１００となるように無血清ＭＥＭ培地で希釈したものを細胞に添加した。細胞全体にウイルス液を行き渡らせ、３７℃、５％ＣＯ２存在下で２４時間培養した。培地交換後、さらに同条件にて３〜４日間培養を行い、早期老化を誘導した。
【００４５】
２．老化細胞において発現が増強又は減少しているタンパク質の同定
次に、上記のように老化を誘導したＴＩＧ−１細胞から、細胞表層タンパクビオチン化キット（ＰＩＥＲＣＥ）を用いて、膜タンパク質を調製した。具体的には、細胞をビオチン化し、ＮｅｕｔｒＡｖｉｄｉｎ（商標）Ｒｅｓｉｎを用いてビオチン化タンパク質を単離し、ＳＤＳバッファ及び５０ｍＭ ＤＤＴで溶出したものをサンプルとした。
【００４６】
あるいは、細胞膜タンパク質はＣＡＬＢＩＯＣＨＥＭ膜タンパク質抽出キットを用いて調製した。具体的には、細胞にＥｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ Ｉ及びＥｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ ＩＩを加え、遠心後沈殿物を除いた上清をサンプルとした。
【００４７】
上記で得られた膜タンパク質を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及び二次元電気泳動に供し、目的タンパク質を切り出した。その後、ゲル内にてプロテアーゼ消化を行い、ＭＡＬＤＩ ＴＯＦ−ＭＳ解析により当該タンパク質の同定を行った。
【００４８】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥは、以下の方法で行った。すなわち、一般的なＳＤＳ−ＰＡＧＥ法に基づき、５％の濃縮ゲル、８％の分離ゲルである組成のゲルを作製し、２５ｍＭ Ｔｒｉｓ、１９２ｍＭグリシン、０．１％ＳＤＳ溶液を泳動バッファとして用いて、４００μｇ相当のタンパク質を、４０Ｖ、２００ｍＡにて電気泳動を行った。
【００４９】
二次元電気泳動は、以下の方法で行った。すなわち、まず一次元目は等電点電気泳動を行い、等電点によりタンパク質の分離を行った。二次元目はＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、分子量でタンパク質の分離を行った。泳動後のゲルについて銀染色を行い、目的タンパク質のスポットを切り出した。その後、ゲル内にてプロテアーゼ消化を行い、ＭＡＬＤＩ ＴＯＦ−ＭＳ解析により当該タンパク質の同定を行った。
【００５０】
分裂老化に関する結果を図１及び２に示す。図１はＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示し、図２は二次元電気泳動の結果を示す。ここで、Ｙｏｕｎｇとは、集団倍加数ＰＤＬ（Ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ ｄｏｕｂｌｉｎｇ ｌｅｖｅｌ）４０（４０回分裂したＴＩＧ−１細胞）を示し、Ｏｌｄとは、ＰＤＬ６４（６４回分裂したＴＩＧ−１細胞）を示す。このようにＹｏｕｎｇとＯｌｄでは、発現に差があり、これにより、合計１６種類のタンパク質を同定することができた。
【００５１】
また、調製した膜タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥと二次元電気泳動により分離して、早期老化及び分裂老化を誘導した細胞における発現タンパク質の変化を比較した結果を図３及び４に示す。
【００５２】
その後、目的タンパク質を切り出してゲル内にてプロテアーゼ消化を行い、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ分析に供し、ペプチド断片の質量を測定し、データベース検索でそれぞれのタンパク質を同定した。
【００５３】
上記の結果、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび二次元電気泳動により同定されたタンパク質を表１に示す。
【００５４】
【表１】
【００５５】
３．細胞老化関連遺伝子の遺伝子発現解析
次に上記で同定した老化関連タンパク質に対する老化関連遺伝子が、ＴＩＧ−１細胞の細胞老化にともない、どのような発現変化を示すかを検討した。当該遺伝子には細胞老化や個体老化との関連がこれまで指摘されていないものも多く見受けられた。
【００５６】
具体的には、まず、上記で同定された１６種類の細胞老化関連タンパク質について、該当遺伝子に関する情報を収集し、それぞれに対するプライマーを合成後、定量ＰＣＲ法により細胞老化に依存した遺伝子発現解析を行った。用いた老化関連遺伝子は、Ｂａｎｄ１（配列番号１）、Ｂａｎｄ２（配列番号３）、Ｂａｎｄ３（配列番号５）、Ｂａｎｄ４（配列番号７）、Ｂａｎｄ５（配列番号９）、Ｂａｎｄ６（配列番号１１）、Ｂａｎｄ１０（配列番号１３）、Ｂａｎｄ１１（配列番号１５）、Ｓｐｏｔ１（配列番号１７）、Ｓｐｏｔ４（配列番号１９）、Ｓｐｏｔ７（配列番号２１）、Ｓｐｏｔ８（配列番号２３）、Ｓｐｏｔ１０（配列番号２５）、Ｓｐｏｔ１３（配列番号２７）、Ｓｐｏｔ２３（配列番号２９）、Ｓｐｏｔ２７（配列番号３１）である。老化マーカーとしてＣＤＫインヒビターである、ｐ２１（アクセッション番号ＮＭ＿０００３８９．３；配列番号３３）、ｐ１６（アクセッション番号ＮＭ＿００００７７．３；配列番号３４）も用いた。
【００５７】
分裂老化は上記のとおり、ＴＩＧ−１の継代培養により誘導し、継代ごとにＦａｓｔＰｕｒｅＲＮＡキット（Ｔａｋａｒａ）を用いて全ＲＮＡを抽出した。具体的には、１／１００容の２−メルカプトエタノールを含むＬｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒを添加し、１．５ｍＬチューブに回収した。２０Ｇの注射針でＤＮＡを剪断後、Ｓｏｌｕｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒを添加した。この混合液をフィルターカートリッジに供し、Ｅｌｕｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒで全ＲＮＡ溶液を溶出した。
【００５８】
この継代ごとのＲＮＡの品質を、老化マーカーであるＣＤＫインヒビターｐ２１とｐ１６の発現変化を指標にして、定量ＰＣＲ法により評価した。定量ＰＣＲ法には、ＳＹＢＲ Ｐｒｅｍｉｘ ＥＸ Ｔａｑキット（Ｔａｋａｒａ）を用いた。測定には、ＴｈｅｒｍａｌＣｙｃｌｅｒＤｉｃｅＲｅａｌＴｉｍｅＳｙｓｔｅｍ（Ｔａｋａｒａ）を用いた。ＰＣＲ反応条件としては、９５℃ １０秒を１ｃｙｃｌｅ、９５℃ ５秒、５５℃ ２０秒、７２℃ ２０秒を５０ｃｙｃｌｅ行った。スタンダードには、ヒトβ−アクチンを用いた。また、相対遺伝子発現量は、標的遺伝子の発現量をβ−アクチンの発現量で除し求めた。以下にβ−アクチン、ｐ１６、ｐ２１のプライマー配列を示す。
−Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ β−アクチン
Ｆｏｒｗａｒｄ：５’−ＴＧＧＣＡＣＣＣＡＧＣＡＣＡＡＴＧＡＡ−３’（配列番号３５）
Ｒｅｖｅｒｓｅ：５’−ＣＴＡＡＧＴＣＡＴＡＧＴＣＣＧＣＣＴＡＧＡＡＧＣＡ−３’（配列番号３６）
−Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ ｐ１６
Ｆｏｒｗａｒｄ：５’−ＧＧＣＡＣＣＡＧＡＧＧＣＡＧＴＡＡＣＣＡ−３’（配列番号３７）
Ｒｅｖｅｒｓｅ：５’−ＧＧＡＣＣＴＴＧＧＧＴＧＡＣＴＧＡＴＧＡＴＣ−３’（配列番号３８）
−Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ ｐ２１
Ｆｏｒｗａｒｄ：５’−ＴＧＡＡＡＴＣＧＴＣＣＡＧＣＧＡＣＣＴＴＣ−３’（配列番号３９）
Ｒｅｖｅｒｓｅ：５’−ＧＴＣＣＡＴＡＧＣＣＴＣＴＡＣＴＧＣＣＡＣＣ−３’（配列番号４０）
その結果、両老化マーカーとも、ＴＩＧ−１の分裂老化とともに発現増強していることが明らかとなった（図５）。そのため、以下の実験は、当該ＲＮＡを用いて行った。
【００５９】
次に、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで同定した８種の老化関連タンパク質（Ｂａｎｄ１、Ｂａｎｄ２、Ｂａｎｄ３、Ｂａｎｄ４、Ｂａｎｄ５、Ｂａｎｄ６、Ｂａｎｄ１０及びＢａｎｄ１１）に相当する老化関連遺伝子について、各々プライマーを合成し、定量ＰＣＲによりＴＩＧ−１の分裂老化に伴う遺伝子発現解析を行った。定量ＰＣＲ条件は上記の通り行った。以下にプライマー配列を示す。
Ｂａｎｄ１：
Ｆｏｒｗａｒｄ：５’−ＧＣＣＴＧＴＣＴＣＣＣＴＧＧＡＧＧＡＴＴ（配列番号４１）
Ｒｅｖｅｒｓｅ：５’−ＴＴＴＣＡＧＡＡＧＡＧＧＣＴＧＧＴＣＧＴ（配列番号４２）
Ｂａｎｄ２：
Ｆｏｒｗａｒｄ：５’−ＧＡＣＧＴＧＧＣＴＧＴＧＧＴＣＴＴＣＴＣ（配列番号４３）
Ｒｅｖｅｒｓｅ：５’−ＣＴＣＴＧＧＧＴＴＧＣＣＡＴＣＴＴＣＡＴ（配列番号４４）
Ｂａｎｄ３：
Ｆｏｒｗａｒｄ：５’−ＣＴＣＡＧＴＧＡＴＧＡＣＧＡＧＧＡＣＧＡ（配列番号４５）
Ｒｅｖｅｒｓｅ：５’−ＣＣＣＡＧＴＧＴＴＡＧＧＧＴＣＣＡＧＡＡ（配列番号４６）
Ｂａｎｄ４：
Ｆｏｒｗａｒｄ：５’−ＴＣＣＣＴＣＧＡＡＴＧＣＡＡＣＴＣＴＣＴ（配列番号４７）
Ｒｅｖｅｒｓｅ：５’−ＡＡＡＣＡＴＣＣＴＴＣＣＡＣＣＡＣＡＧＣ（配列番号４８）
Ｂａｎｄ５：
Ｆｏｒｗａｒｄ：５’−ＣＡＧＡＴＧＣＡＣＣＴＣＡＧＣＧＴＡＡＡ（配列番号４９）
Ｒｅｖｅｒｓｅ：５’−ＡＴＣＣＡＣＡＧＣＣＡＴＴＣＴＴＣＡＣＣ（配列番号５０）
Ｂａｎｄ６：
Ｆｏｒｗａｒｄ：５’−ＡＣＧＧＣＴＡＣＴＧＡＴＧＧＡＴＴＴＧＧ（配列番号５１）
Ｒｅｖｅｒｓｅ：５’−ＴＧＡＣＣＧＡＧＡＧＣＡＴＴＧＡＴＧＡＧ（配列番号５２）
Ｂａｎｄ１０：
Ｆｏｒｗａｒｄ：５’−ＣＴＣＣＡＣＧＧＡＡＣＣＣＡＧＡＡＣＴＡ（配列番号５３）
Ｒｅｖｅｒｓｅ：５’−ＧＡＴＧＧＴＧＡＴＧＡＣＣＡＧＡＧＣＣＴ（配列番号５４）
Ｂａｎｄ１１：
Ｆｏｒｗａｒｄ：５’−ＡＧＴＡＣＡＴＧＧＡＡＧＧＧＡＣＧＣＡＣ（配列番号５５）
Ｒｅｖｅｒｓｅ：５’−ＣＴＴＴＣＣＴＧＣＣＡＡＣＴＴＴＣＴＣＧ（配列番号５６）
その結果、ＴＩＧ−１の分裂老化とともに発現増強する老化関連遺伝子３種（Ｂａｎｄ１、Ｂａｎｄ５及びＢａｎｄ１１）および発現低下する老化関連遺伝子４種（Ｂａｎｄ２、Ｂａｎｄ４、Ｂａｎｄ６及びＢａｎｄ１０）が同定された（図６）。当該結果は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥでみられた発現変化とほぼ一致した。
【００６０】
さらに、二次元電気泳動で同定した老化関連タンパク質（Ｓｐｏｔ１、Ｓｐｏｔ４、Ｓｐｏｔ７、Ｓｐｏｔ８、Ｓｐｏｔ１０、Ｓｐｏｔ１３、Ｓｐｏｔ２３、Ｓｐｏｔ２７）について、同様に定量ＰＣＲにより分裂老化に伴う遺伝子発現解析を行った。定量ＰＣＲ条件は上記の通り行った。以下にプライマー配列を示す。
Ｓｐｏｔ１：
Ｆｏｒｗａｒｄ：５’−ＧＧＧＡＡＡＡＣＧＴＴＴＣＡＣＣＡＡＡＡＧ（配列番号５７）
Ｒｅｖｅｒｓｅ：５’−ＣＡＴＧＣＡＴＡＴＧＧＴＴＴＴＴＣＣＣＣＣＧ（配列番号５８）
Ｓｐｏｔ４：
Ｆｏｒｗａｒｄ：５’−ＡＣＧＴＣＣＣＡＴＣＡＡＧＣＡＡＡＡＡＣ（配列番号５９）
Ｒｅｖｅｒｓｅ：５’−ＴＴＧＧＡＣＡＡＧＧＣＴＧＡＡＴＣＣＴＣ（配列番号６０）
Ｓｐｏｔ７：
Ｆｏｒｗａｒｄ：５’−ＴＣＣＴＧＴＧＧＡＡＴＣＡＧＡＣＣＴＣＣ（配列番号６１）
Ｒｅｖｅｒｓｅ：５’−ＴＣＡＧＡＴＡＣＡＧＡＡＣＣＡＧＣＣＣＣ（配列番号６２）
Ｓｐｏｔ８：
Ｆｏｒｗａｒｄ：５’−ＴＣＡＣＣＣＡＧＧＣＴＧＧＴＴＣＡＧＡ（配列番号６３）
Ｒｅｖｅｒｓｅ：５’−ＡＧＴＧＧＣＣＡＧＧＧＴＡＧＧＣＴＧＡＴ（配列番号６４）
Ｓｐｏｔ１０：
Ｆｏｒｗａｒｄ：５’−ＧＡＧＡＡＣＴＴＴＧＣＣＧＴＴＧＡＡＧＣ（配列番号６５）
Ｒｅｖｅｒｓｅ：５’−ＧＡＡＡＴＣＣＴＧＣＴＣＴＣＣＴＣＧＣ（配列番号６６）
Ｓｐｏｔ１３：
Ｆｏｒｗａｒｄ：５’−ＣＧＡＧＧＴＴＡＴＧＣＣＡＡＡＣＴＧＧＴ（配列番号６７）
Ｒｅｖｅｒｓｅ：５’−ＧＧＡＴＧＡＴＣＴＣＴＧＧＧＧＣＴＡＣＡ（配列番号６８）
Ｓｐｏｔ２３：
Ｆｏｒｗａｒｄ：５’−ＧＧＧＡＴＴＴＧＴＧＴＣＴＧＧＣＣＴＡＡ（配列番号６９）
Ｒｅｖｅｒｓｅ：５’−ＣＡＧＧＧＴＣＴＴＣＡＡＧＧＧＡＴＴＣＡ（配列番号７０）
Ｓｐｏｔ２７
Ｆｏｒｗａｒｄ：５’−ＴＧＴＴＣＡＧＴＴＧＡＧＧＡＡＣＧＣＡＧ（配列番号７１）
Ｒｅｖｅｒｓｅ：５’−ＣＡＡＧＣＴＧＴＧＴＣＡＧＧＧＡＧＴＣＡ（配列番号７２）
その結果、ＴＩＧ−１の分裂老化とともに発現増強する老化関連遺伝子６種（Ｓｐｏｔ１、Ｓｐｏｔ４、Ｓｐｏｔ７、Ｓｐｏｔ８、Ｓｐｏｔ１０及びＳｐｏｔ２３）および発現低下する老化関連遺伝子１種（Ｓｐｏｔ１３）が同定された（図７）。この結果も、二次元電気泳動でみられた発現変化とほぼ一致した。
【００６１】
以上の結果より、分裂老化に伴い発現が増加する老化関連遺伝子が９種類（Ｂａｎｄ１、Ｂａｎｄ５、Ｂａｎｄ１１、Ｓｐｏｔ１、Ｓｐｏｔ４、Ｓｐｏｔ７、Ｓｐｏｔ８、Ｓｐｏｔ１０及びＳｐｏｔ２３）、分裂老化に伴い発現が低下する老化関連遺伝子が５種類（Ｂａｎｄ２、Ｂａｎｄ４、Ｂａｎｄ６、Ｂａｎｄ１０及びＳｐｏｔ１３）同定された。
【００６２】
同様に、早期老化における遺伝子発現解析を行った。上記の老化関連遺伝子の転写量を、上記プライマーを用い、上記方法にてリアルタイムＰＣＲで測定した。
早期老化ＴＩＧ−１細胞における、老化関連遺伝子の発現量をリアルタイムＰＣＲで測定した結果から、多くの老化関連遺伝子の発現が早期老化の誘導とともに増強されていることが明らかとなった。具体的には、４通り全ての早期老化誘導時に発現が増加する老化関連遺伝子が７種類（Ｂａｎｄ１、Ｂａｎｄ２、Ｂａｎｄ３、Ｂａｎｄ５、Ｂａｎｄ１１、Ｓｐｏｔ１及びＳｐｏｔ７）、４通りのうち３通りの早期老化誘導時に発現が増加する老化関連遺伝子が５種類（Ｂａｎｄ６、Ｓｐｏｔ４、Ｓｐｏｔ１３、Ｓｐｏｔ２３及びＳｐｏｔ２７）同定された。
【００６３】
以上の結果から、本研究により同定された老化関連遺伝子群は細胞の老化形質に依存して発現量が変化する遺伝子であり、細胞老化診断、細胞老化に依存した細胞機能変化修復のためのターゲット分子であることが示された。
【００６４】
４．発現が増加する遺伝子と老化誘導との関連性の検討
上記分裂老化に伴い発現が増加する老化関連遺伝子が老化を誘導するか否かを解析した。
【００６５】
老化を誘導するか否かの評価については、老化の指標として広く用いられているＳＡ−β−ｇａｌアッセイにより検討した。具体的には、まずそれぞれの細胞老化関連遺伝子全長を増幅するためのプライマーを合成し、ＴＩＧ−１細胞より調製したＲＮＡを用いて合成したｃＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行い、細胞老化関連遺伝子をｐＧＥＭＴ−ｅａｓｙベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）にクローニングした。塩基配列を確認後、各細胞老化関連遺伝子を切り出し、動物細胞発現ベクターであるｐＥＧＦＰ−Ｃ３（クローンテック）に挿入した。得られた発現ベクターを遺伝子導入試薬（ＨｉｌｙＭａｘ；同仁化学）を用いＴＩＧ−１細胞へ導入した。
【００６６】
その後、当該細胞に対し、ＳＡ−β−ｇａｌ染色を行い、１０時間放置した。
その結果、細胞老化関連遺伝子を強制発現した細胞では、ｍｏｃｋと比較して、より強く染まっていることが確認された（図８）。当該結果から、分裂老化に伴い発現が増加する老化関連遺伝子は、ＴＩＧ−１細胞において老化を誘導することが示された。このことから、当該遺伝子が老化プログラムにおいて重要な役割を担っていることが示された。
【００６７】
５．細胞老化関連遺伝子の加齢性疾患に対する寄与
次に、細胞老化関連遺伝子が加齢性疾患にどのように寄与しているかを、糖尿病患者及び健常人の筋肉・膵臓組織由来ｃＤＮＡを用いた、細胞老化関連遺伝子の発現解析により解析した。加齢性疾患としては糖尿病及びアルツハイマー病を選択した。
【００６８】
糖尿病は、筋肉・膵臓の組織に対して、エラー・損傷の蓄積、ウイルス感染、ストレス等により細胞老化が誘導され、それに伴い、インスリン抵抗性、インスリン分泌低下を引き起こすことにより、発症すると考えることができるため、老化関連遺伝子が糖尿病の発症メカニズムとどのように関連しているかを検討した。
【００６９】
具体的には、Ｔｏｙｏｂｏより購入した糖尿病患者及びコントロールとして健常者由来の筋肉組織ｃＤＮＡを鋳型として用いて、上記老化関連遺伝子特異的プライマーを用いて、上記方法により定量ＰＣＲを行い、老化関連遺伝子の発現を解析した。ＰＣＲ反応条件としては、９５℃１０秒を１ｃｙｃｌｅ、９５℃５秒、５５℃２０秒、７２℃２０秒を５０ｃｙｃｌｅ行った。スタンダードとしては、β−アクチンを用いた。相対遺伝子発現量は、測定した値をβ−アクチンの値で除し求めた。
【００７０】
その結果、糖尿病患者由来の筋肉では、ｐ２１、ｐ１６の発現が増強していることが明らかとなり、細胞老化が誘導されていることが示された（図９）。さらに、上記実施例で同定された多くの老化関連遺伝子群が、糖尿病患者由来の筋肉でも、発現が増強されていることも示された。具体的には、糖尿病患者由来の筋肉で発現が増加する老化関連遺伝子が１３種類（Ｂａｎｄ１、Ｂａｎｄ３、Ｂａｎｄ４、Ｂａｎｄ５、Ｂａｎｄ６、Ｂａｎｄ１１、Ｓｐｏｔ１、Ｓｐｏｔ４、Ｓｐｏｔ７、Ｓｐｏｔ８、Ｓｐｏｔ１３、Ｓｐｏｔ２３及びＳｐｏｔ２７）同定された。なお、図９では、左側が健常者、右側が糖尿病患者を示し、縦軸は相対発現量を示す。
【００７１】
また、Ｔｏｙｏｂｏより購入した、糖尿病患者及びコントロールとして健常者由来の膵臓組織ｃＤＮＡを鋳型として用いて、上記老化関連遺伝子特異的プライマーを用いて、上記方法により定量ＰＣＲを行い、老化関連遺伝子の発現を解析した。
【００７２】
その結果、筋肉組織と同様、糖尿病患者由来の膵臓においても、ｐ２１及びｐ１６の発現が増強していることが明らかとなり、ここでも細胞老化が誘導されていることが示された（図１０）。さらに、ここでも上記実施例で同定された多くの老化関連遺伝子群が、糖尿病患者由来膵臓において、発現増強していることが示された。具体的には、糖尿病患者由来の膵臓で発現が増加する老化関連遺伝子が１４種類（Ｂａｎｄ１、Ｂａｎｄ２、Ｂａｎｄ３、Ｂａｎｄ４、Ｂａｎｄ６、Ｂａｎｄ１０、Ｂａｎｄ１１、Ｓｐｏｔ１、Ｓｐｏｔ４、Ｓｐｏｔ７、Ｓｐｏｔ１０、Ｓｐｏｔ１３、Ｓｐｏｔ２３及びＳｐｏｔ２７）、糖尿病患者由来の膵臓で発現が低下する老化関連遺伝子が２種類（Ｂａｎｄ５及びＳｐｏｔ８）同定された。
なお、図１０では、左側が健常者、右側が糖尿病患者を示し、縦軸は相対発現量を示す。
【００７３】
このように、今回同定した、ＴＩＧ−１の分裂老化に伴い発現増強する老化関連遺伝子のうち、そのほとんどのものが、糖尿病患者由来筋肉・膵臓組織で発現増強していることが明らかになった。その結果を表２に示す。
【００７４】
【表２】
【００７５】
このように、定量ＰＣＲ法に基づき遺伝子発現解析を行った結果、ＴＩＧ−１の分裂老化に協調して発現増強する遺伝子が９種類（Ｂａｎｄ１、Ｂａｎｄ５、Ｂａｎｄ１１、Ｓｐｏｔ１、Ｓｐｏｔ４、Ｓｐｏｔ７、Ｓｐｏｔ８、Ｓｐｏｔ１０及びＳｐｏｔ２３）及び発現低下する遺伝子が５種類（Ｂａｎｄ２、Ｂａｎｄ４、Ｂａｎｄ６、Ｂａｎｄ１０及びＳｐｏｔ１３）確認された。
【００７６】
さらに、４種類の細胞老化誘導因子（Ｒａｓ，優勢活性化型変異体ＭＫＫ６（ＭＫＫ６ｇｌｕ）、ＴＡＫ１およびＴＡＢ１、ＰＫＣ−δ）を導入し早期老化を誘導した場合には、７種類の遺伝子の発現が全てに共通して、５種類の遺伝子の発現が４通りのうち３通りの早期老化誘導時に増強されていた。具体的には、ＴＩＧ−１の早期老化に協調して発現増強する遺伝子が１５種類（Ｂａｎｄ１、Ｂａｎｄ２、Ｂａｎｄ３、Ｂａｎｄ４、Ｂａｎｄ５、Ｂａｎｄ６、Ｂａｎｄ１１、Ｓｐｏｔ１、Ｓｐｏｔ４、Ｓｐｏｔ７、Ｓｐｏｔ８、Ｓｐｏｔ１０、Ｓｐｏｔ１３、Ｓｐｏｔ２３及びＳｐｏｔ２７）及び発現低下する遺伝子が３種類（Ｓｐｏｔ１０、Ｓｐｏｔ１３及びＳｐｏｔ２７）確認された。
【００７７】
これら細胞老化に伴って多少なりとも発現変化を示す細胞老化関連因子１６種類のうち、糖尿病患者筋肉では１３種類の遺伝子が、糖尿病患者膵臓でも１４種類の遺伝子が発現増強されていた。具体的には、糖尿病患者由来の筋肉で発現が増加する老化関連遺伝子が１３種類（Ｂａｎｄ１、Ｂａｎｄ３、Ｂａｎｄ４、Ｂａｎｄ５、Ｂａｎｄ６、Ｂａｎｄ１１、Ｓｐｏｔ１、Ｓｐｏｔ４、Ｓｐｏｔ７、Ｓｐｏｔ８、Ｓｐｏｔ１３、Ｓｐｏｔ２３及びＳｐｏｔ２７）同定された。さらに、また、糖尿病患者由来の膵臓で発現が増加する老化関連遺伝子が１４種類（Ｂａｎｄ１、Ｂａｎｄ２、Ｂａｎｄ３、Ｂａｎｄ４、Ｂａｎｄ６、Ｂａｎｄ１０、Ｂａｎｄ１１、Ｓｐｏｔ１、Ｓｐｏｔ４、Ｓｐｏｔ７、Ｓｐｏｔ１０、Ｓｐｏｔ１３、Ｓｐｏｔ２３及びＳｐｏｔ２７）、糖尿病患者由来の膵臓で発現が低下する老化関連遺伝子が２種類（Ｂａｎｄ５及びＳｐｏｔ８）同定された。
【００７８】
また、ＣＤＫインヒビターｐ１６及びｐ２１を含む細胞老化関連遺伝子群の発現が、上記疾患患者由来組織において増強していたことから、これら加齢性疾患の発症が細胞老化により引き起こされていることが示された。
【００７９】
次に、分裂老化と早期老化ＴＩＧ−１細胞において発現量が有意に変化した遺伝子について、その神経変性疾患に対する寄与を明らかにするため、Ｔｏｙｏｂｏより購入した、アルツハイマー病患者由来大脳皮質及びコントロールとして健常者由来の大脳皮質ｃＤＮＡを鋳型として用いて、前述と同様の方法により老化関連遺伝子の発現解析を行った。
【００８０】
その結果、老化マーカーであるｐ２１の発現がアルツハイマー病患者大脳皮質において、正常大脳皮質に比べて増強されていることが明らかになるとともに、今回同定された２種の細胞老化関連因子（Ｂａｎｄ１及びＢａｎｄ１１）の発現がアルツハイマー病患者大脳皮質において、正常大脳皮質に比べて増強されていることが明らかとなった（図１１）。この結果から、アルツハイマー病が細胞老化により引き起こされていると考えられるとともに、アルツハイマー病の発症においてもこれら細胞老化関連遺伝子が関与しているものと考えることができた。
【産業上の利用可能性】
【００８１】
本発明の細胞老化関連因子を含む、老化を軽減するための医薬組成物により、肥満症・糖尿病・高血圧・動脈硬化を含む生活習慣病や神経変性疾患の診断、治療又は予防ができる。また、本発明に関連する細胞老化関連因子は上記疾患のマーカーとして有用である。さらに本発明に関連する細胞老化関連因子は未病診断マーカーとしても有用である。
【００８２】
したがって、本発明に関連する細胞老化関連因子は、新たなドラッグターゲットになりうる点で産業上の利用可能性がある。
【配列表フリーテキスト】
【００８３】
配列番号３５：プライマー
配列番号３６：プライマー
配列番号３７：プライマー
配列番号３８：プライマー
配列番号３９：プライマー
配列番号４０：プライマー
配列番号４１：プライマー
配列番号４２：プライマー
配列番号４３：プライマー
配列番号４４：プライマー
配列番号４５：プライマー
配列番号４６：プライマー
配列番号４７：プライマー
配列番号４８：プライマー
配列番号４９：プライマー
配列番号５０：プライマー
配列番号５１：プライマー
配列番号５２：プライマー
配列番号５３：プライマー
配列番号５４：プライマー
配列番号５５：プライマー
配列番号５６：プライマー
配列番号５７：プライマー
配列番号５８：プライマー
配列番号５９：プライマー
配列番号６０：プライマー
配列番号６１：プライマー
配列番号６２：プライマー
配列番号６３：プライマー
配列番号６４：プライマー
配列番号６５：プライマー
配列番号６６：プライマー
配列番号６７：プライマー
配列番号６８：プライマー
配列番号６９：プライマー
配列番号７０：プライマー
配列番号７１：プライマー
配列番号７２：プライマー
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｂａｎｄ１、Ｂａｎｄ２、Ｂａｎｄ３、Ｂａｎｄ４、Ｂａｎｄ５、Ｂａｎｄ６、Ｂａｎｄ１０、Ｂａｎｄ１１、Ｓｐｏｔ１、Ｓｐｏｔ４、Ｓｐｏｔ７、Ｓｐｏｔ８、Ｓｐｏｔ１０、Ｓｐｏｔ１３、Ｓｐｏｔ２３及びＳｐｏｔ２７からなる群から選択される少なくとも１の遺伝子を検出することを特徴とする、老化を診断する方法。
【請求項２】
Ｂａｎｄ１、Ｂａｎｄ２、Ｂａｎｄ３、Ｂａｎｄ４、Ｂａｎｄ５、Ｂａｎｄ６、Ｂａｎｄ１０、Ｂａｎｄ１１、Ｓｐｏｔ１、Ｓｐｏｔ４、Ｓｐｏｔ７、Ｓｐｏｔ８、Ｓｐｏｔ１０、Ｓｐｏｔ１３、Ｓｐｏｔ２３及びＳｐｏｔ２７からなる群から選択される少なくとも１の遺伝子を含む、生活習慣病、神経変性疾患、自己免疫疾患又は炎症性疾患のマーカー。
【請求項３】
生活習慣病が、肥満症、糖尿病、高血圧及び動脈硬化からなる群から選択される少なくとも１である、請求項２記載のマーカー。
【請求項４】
神経変性疾患がアルツハイマー病又は認知症である、請求項２記載のマーカー。
【請求項５】
自己免疫疾患が、リューマチ、１型糖尿病及び多発性硬化症からなる群から選択される少なくとも１である、請求項２記載のマーカー。
【請求項６】
炎症性疾患が、潰瘍性大腸炎及びクローン病からなる群から選択される少なくとも１である、請求項２記載のマーカー。
【請求項７】
老化を軽減又は予防する物質のスクリーニング方法であって、Ｂａｎｄ１、Ｂａｎｄ２、Ｂａｎｄ３、Ｂａｎｄ４、Ｂａｎｄ５、Ｂａｎｄ６、Ｂａｎｄ１０、Ｂａｎｄ１１、Ｓｐｏｔ１、Ｓｐｏｔ４、Ｓｐｏｔ７、Ｓｐｏｔ８、Ｓｐｏｔ１０、Ｓｐｏｔ１３、Ｓｐｏｔ２３及びＳｐｏｔ２７からなる群から選択される少なくとも１の細胞老化関連因子の遺伝子を用いて、少なくとも次の工程、
（ｉ）被験物質の存在下または非存在下に、前記細胞老化関連因子を接触させる工程；
（ｉｉ）前記細胞老化関連因子の遺伝子の発現量又はタンパク質質量を測定する工程；
（ｉｉｉ）被験物質の作用を、上記（ｉ）および（ｉｉ）に基づく結果と、同時に行った対照の結果とを比較して検出する工程；および
（ｉｖ）前記発現量が変化した被験物質を選択する工程；
を含む、前記方法。
【請求項８】
細胞老化関連因子がＢａｎｄ１、Ｂａｎｄ２、Ｂａｎｄ３、Ｂａｎｄ４、Ｂａｎｄ５、Ｂａｎｄ６、Ｂａｎｄ１０、Ｂａｎｄ１１、Ｓｐｏｔ１、Ｓｐｏｔ４、Ｓｐｏｔ７、Ｓｐｏｔ８、Ｓｐｏｔ１０、Ｓｐｏｔ１３、Ｓｐｏｔ２３及びＳｐｏｔ２７から選択される少なくとも１の物質であり、当該物質の発現量が対照由来の発現量よりも減少している場合に、用いた被験物質が老化の軽減又は予防に効果があると判断する、請求項７記載の方法。
【請求項９】
細胞老化関連因子がＢａｎｄ２、Ｂａｎｄ４、Ｂａｎｄ５、Ｂａｎｄ６、Ｂａｎｄ１０、Ｓｐｏｔ８、Ｓｐｏｔ１０、Ｓｐｏｔ１３及びＳｐｏｔ２７から選択される少なくとも１の物質であり、当該物質の発現量が対照由来の発現量よりも増加している場合に、用いた被験物質が老化の軽減又は予防に効果があると判断する、請求項７記載の方法。
【請求項１０】
Ｂａｎｄ２、Ｂａｎｄ４、Ｂａｎｄ５、Ｂａｎｄ６、Ｂａｎｄ１０、Ｓｐｏｔ８、Ｓｐｏｔ１０、Ｓｐｏｔ１３及びＳｐｏｔ２７からなる群から選択される少なくとも１の細胞老化関連因子の発現を促進させる物質、又は、Ｂａｎｄ１、Ｂａｎｄ２、Ｂａｎｄ３、Ｂａｎｄ４、Ｂａｎｄ５、Ｂａｎｄ６、Ｂａｎｄ１０、Ｂａｎｄ１１、Ｓｐｏｔ１、Ｓｐｏｔ４、Ｓｐｏｔ７、Ｓｐｏｔ８、Ｓｐｏｔ１０、Ｓｐｏｔ１３、Ｓｐｏｔ２３及びＳｐｏｔ２７からなる群から選択される少なくとも１の細胞老化関連因子の発現を抑制する物質を含む、老化を軽減するための医薬組成物。
【請求項１】
Ｂａｎｄ１、Ｂａｎｄ２、Ｂａｎｄ３、Ｂａｎｄ４、Ｂａｎｄ５、Ｂａｎｄ６、Ｂａｎｄ１０、Ｂａｎｄ１１、Ｓｐｏｔ１、Ｓｐｏｔ４、Ｓｐｏｔ７、Ｓｐｏｔ８、Ｓｐｏｔ１０、Ｓｐｏｔ１３、Ｓｐｏｔ２３及びＳｐｏｔ２７からなる群から選択される少なくとも１の遺伝子を検出することを特徴とする、老化を診断する方法。
【請求項２】
Ｂａｎｄ１、Ｂａｎｄ２、Ｂａｎｄ３、Ｂａｎｄ４、Ｂａｎｄ５、Ｂａｎｄ６、Ｂａｎｄ１０、Ｂａｎｄ１１、Ｓｐｏｔ１、Ｓｐｏｔ４、Ｓｐｏｔ７、Ｓｐｏｔ８、Ｓｐｏｔ１０、Ｓｐｏｔ１３、Ｓｐｏｔ２３及びＳｐｏｔ２７からなる群から選択される少なくとも１の遺伝子を含む、生活習慣病、神経変性疾患、自己免疫疾患又は炎症性疾患のマーカー。
【請求項３】
生活習慣病が、肥満症、糖尿病、高血圧及び動脈硬化からなる群から選択される少なくとも１である、請求項２記載のマーカー。
【請求項４】
神経変性疾患がアルツハイマー病又は認知症である、請求項２記載のマーカー。
【請求項５】
自己免疫疾患が、リューマチ、１型糖尿病及び多発性硬化症からなる群から選択される少なくとも１である、請求項２記載のマーカー。
【請求項６】
炎症性疾患が、潰瘍性大腸炎及びクローン病からなる群から選択される少なくとも１である、請求項２記載のマーカー。
【請求項７】
老化を軽減又は予防する物質のスクリーニング方法であって、Ｂａｎｄ１、Ｂａｎｄ２、Ｂａｎｄ３、Ｂａｎｄ４、Ｂａｎｄ５、Ｂａｎｄ６、Ｂａｎｄ１０、Ｂａｎｄ１１、Ｓｐｏｔ１、Ｓｐｏｔ４、Ｓｐｏｔ７、Ｓｐｏｔ８、Ｓｐｏｔ１０、Ｓｐｏｔ１３、Ｓｐｏｔ２３及びＳｐｏｔ２７からなる群から選択される少なくとも１の細胞老化関連因子の遺伝子を用いて、少なくとも次の工程、
（ｉ）被験物質の存在下または非存在下に、前記細胞老化関連因子を接触させる工程；
（ｉｉ）前記細胞老化関連因子の遺伝子の発現量又はタンパク質質量を測定する工程；
（ｉｉｉ）被験物質の作用を、上記（ｉ）および（ｉｉ）に基づく結果と、同時に行った対照の結果とを比較して検出する工程；および
（ｉｖ）前記発現量が変化した被験物質を選択する工程；
を含む、前記方法。
【請求項８】
細胞老化関連因子がＢａｎｄ１、Ｂａｎｄ２、Ｂａｎｄ３、Ｂａｎｄ４、Ｂａｎｄ５、Ｂａｎｄ６、Ｂａｎｄ１０、Ｂａｎｄ１１、Ｓｐｏｔ１、Ｓｐｏｔ４、Ｓｐｏｔ７、Ｓｐｏｔ８、Ｓｐｏｔ１０、Ｓｐｏｔ１３、Ｓｐｏｔ２３及びＳｐｏｔ２７から選択される少なくとも１の物質であり、当該物質の発現量が対照由来の発現量よりも減少している場合に、用いた被験物質が老化の軽減又は予防に効果があると判断する、請求項７記載の方法。
【請求項９】
細胞老化関連因子がＢａｎｄ２、Ｂａｎｄ４、Ｂａｎｄ５、Ｂａｎｄ６、Ｂａｎｄ１０、Ｓｐｏｔ８、Ｓｐｏｔ１０、Ｓｐｏｔ１３及びＳｐｏｔ２７から選択される少なくとも１の物質であり、当該物質の発現量が対照由来の発現量よりも増加している場合に、用いた被験物質が老化の軽減又は予防に効果があると判断する、請求項７記載の方法。
【請求項１０】
Ｂａｎｄ２、Ｂａｎｄ４、Ｂａｎｄ５、Ｂａｎｄ６、Ｂａｎｄ１０、Ｓｐｏｔ８、Ｓｐｏｔ１０、Ｓｐｏｔ１３及びＳｐｏｔ２７からなる群から選択される少なくとも１の細胞老化関連因子の発現を促進させる物質、又は、Ｂａｎｄ１、Ｂａｎｄ２、Ｂａｎｄ３、Ｂａｎｄ４、Ｂａｎｄ５、Ｂａｎｄ６、Ｂａｎｄ１０、Ｂａｎｄ１１、Ｓｐｏｔ１、Ｓｐｏｔ４、Ｓｐｏｔ７、Ｓｐｏｔ８、Ｓｐｏｔ１０、Ｓｐｏｔ１３、Ｓｐｏｔ２３及びＳｐｏｔ２７からなる群から選択される少なくとも１の細胞老化関連因子の発現を抑制する物質を含む、老化を軽減するための医薬組成物。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【公開番号】特開２０１１−４５３３４（Ｐ２０１１−４５３３４Ａ）
【公開日】平成２３年３月１０日（２０１１．３．１０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−１９８４６７（Ｐ２００９−１９８４６７）
【出願日】平成２１年８月２８日（２００９．８．２８）
【出願人】（５０４１４５３４２）国立大学法人九州大学 (960)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２３年３月１０日（２０１１．３．１０）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年８月２８日（２００９．８．２８）
【出願人】（５０４１４５３４２）国立大学法人九州大学 (960)
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]