細胞表面グリカンを修飾するための組成物および方法
グリカン（例えば生存細胞または細胞粒子上に発現するグリカン）を修飾する方法および組成物が本明細書中で提供される。その組成物および方法は、細胞の生存性および細胞の１つまたはそれ以上の表現型の特徴を保存しながら、細胞表面のグリカンの修飾を可能にする。例えば、その方法および組成物を採用して、細胞の１つまたはそれ以上の他の表現型の特徴（例えば多分化能）を保存しながら、細胞の特定の表現型の特徴（糖鎖付加のような）を修飾し得る。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本明細書中に記載される研究は、一部において、国立衛生研究所からの補助（補助金第ＲＯ１ ＨＬ０７３７１４号および補助金第ＲＯ１ ＨＬ０６０５２８号）をとおして資金を提供された。従って、米国政府は、本発明に一定の権利を有する。
本発明は、外来性の糖転移酵素を用いて、生存細胞の細胞表面グリカンを修飾する組成物および方法に関連する。特に、本発明の方法の組成物は、処理した細胞の生存性および１つまたはそれ以上のもとの表現型の特徴を保存する。
【背景技術】
【０００２】
血液由来細胞の、前もって決定された位置への移動を指示する能力（「ホーミング」）は、様々な生理学的および病理学的過程に大きな意味を有する。循環細胞の、特定の解剖学的位置へのリクルートは、血流中の細胞および標的組織の血管内皮の間の、別々の接着相互作用によって開始される。これらの接触を媒介する分子は、「ホーミング受容体」と呼ばれ、そして歴史的に定義されるように、これらの構造は血中の細胞の、それぞれの標的組織への指向性を導く。現在、３つの組織特異的ホーミング受容体：末梢リンパ節のＬ−セレクチン、腸管および消化管関連リンパ系組織のα４β７（ＬＰＡＭ−１）、および皮膚の皮膚リンパ球抗原（ＣＬＡ）のみが知られている（非特許文献１）。これらの組織の他に、循環細胞、特に造血幹細胞は、効率的に骨髄へ向かうことが、数十年の間知られていた（非特許文献２）。しかし、数十年にわたるこの過程に対する多数の調査は、複雑な、および時には対立する結果を生じ、骨髄指向性を独自に促進するホーミング受容体の直接的な証拠は提供しなかった。
【０００３】
生物物理学的観点から、ホーミング受容体は、分子ブレーキとして機能し、支配的な血流の速度より低い速度で、血流中の細胞の、血管内皮への最初の係留、次いで持続した回転接触を起こす（第１段階）（非特許文献１）。その後、典型的にはケモカインによって増強される、イベントのカスケードが後に続き、インテグリン接着の活性化（第２段階）、安定した接着（第３段階）、および内皮遊出（第４段階）を引き起こす（非特許文献３）。この「多段階パラダイム」は、組織特異的遊走は、当該循環細胞上のホーミング受容体およびケモカイン受容体発現の別々の組み合わせによって調節され、関連する血管接着リガンドおよび標的内皮に発現するケモカインによって、臓器特異的な方式で示される、適切な「交通信号」の認識を可能にすることを主張する。細胞の骨髄への交通を指示するホーミング受容体の関与後、いくつかの証拠が、特に１つのケモカイン、ＳＤＦ−１が、第２段階による細胞のこの部位へのリクルートに、重要な役割を果たしていることを示す（（非特許文献２）、４、５）。
【０００４】
第１段階の回転相互作用の最も効率的なエフェクターは、セレクチン（Ｅ−、Ｐ−およびＬ−セレクチン）およびそのリガンドである（非特許文献１）。その名前が示すように、セレクチンは、原型として四糖シアリルルイスＸ（ｓＬｅＸ；Ｎｅｕ５Ａｃα２−３Ｇａｌβ１−４［Ｆｕｃα１−３］ＧｌｃＮＡｃβ１−））として提示される、α（２，３）−結合シアル酸置換およびα（１，３）−結合フコース修飾を含むシアロフコシル化からなる、特定化された炭水化物決定基に結合するレクチンである（１、６）。Ｅ−およびＰ−セレクチンは、血管内皮に発現し（Ｐ−セレクチンは血小板にも発現）、およびＬ−セレクチンは循環白血球に発現する（非特許文献１）。Ｅ−およびＰ−セレクチンは、典型的には組織の損傷および炎症の部位のみに顕著に発現する、誘導性内皮膜分子である。しかし、骨髄の微小血管系は、これらのセレクチンを構成的に発現し（５、７）、そしてインビボ研究が、循環細胞の骨髄へのリクルートにおけるＥ−セレクチンの役割を示した（５、８）。重要なことに、ＳＤＦ−１は骨髄内で高濃度に発現し、そして血液由来細胞を骨髄へリクルートする、特定化した類洞内皮ベッドでＥ−セレクチンと独自に共存する（５）。
【０００５】
Ｅ−セレクチンの２つの主なリガンド、ＰＳＧＬ−１（９）および造血細胞Ｅ−／Ｌ−セレクチンリガンド（ＨＣＥＬＬ）（１０、１１）として知られる、特定化されたシアロフコシル化ＣＤ４４グリコフォームが、ヒト造血幹／前駆細胞（ＨＳＰＣ）において同定された。ＣＤ４４は、どちらかと言えば遍在性の細胞膜タンパク質であるが、ＨＣＥＬＬ表現型は、ヒトＨＳＰＣにおいてのみ見出される。ＨＣＥＬＬの限定された分布と対照的に、ＰＳＧＬ−１は、骨髄内の造血前駆細胞およびより成熟した骨髄およびリンパ球系細胞の中で広く発現している（９）。ＨＣＥＬＬは、操作上、せん断条件下でＥ−セレクチンおよびＬ−セレクチンに結合するＣＤ４４として定義され、そしてＣＤ４４グリコフォームはＥ−セレクチン−Ｉｇキメラ（Ｅ−Ｉｇ）、およびシアリルルイスＸ様エピトープを認識するｍＡｂ ＨＥＣＡ４５２と反応性のＣＤ４４グリコフォームとして、細胞溶解物のウェスタンブロット分析によって同定される。全ての糖タンパク質セレクチンリガンドと同様に、Ｅ−およびＬ−セレクチンに対するＨＣＥＬＬの結合は、α（２，３）−シアル酸およびα（１，３）−フコース修飾に決定的に依存する（１０−１３）。ヒトＨＳＰＣにおいて、ＨＣＥＬＬは、Ｎ−グリカンにおける適切なシアロフコシル化セレクチン結合決定基を提示する（１０、１２）。血行力学的せん断ストレス下でのＥ−およびＬ−セレクチン結合のインビトロアッセイは、ＨＣＥＬＬは、あらゆるヒト細胞において発現するこれらの分子の最も強力なリガンドであることを示す（１０、１３）。重要なことに、Ｅ−セレクチンは骨髄の微小血管内皮に構成的に発現するが、この分子は組織の損傷（例えば虚血−再灌流障害または外傷）または炎症の全ての部位において、内皮ベッドに顕著に発現する。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｒ．Ｓａｃｋｓｔｅｉｎ，Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｈｅｍａｔｏｌ １２，４４４（２００５）
【非特許文献２】Ｔ．Ｌａｐｉｄｏｔ，Ａ．Ｄａｒ，Ｏ．Ｋｏｌｌｅｔ，Ｂｌｏｏｄ １０６，１９０１（２００５）
【非特許文献３】Ｔ．Ａ．Ｓｐｒｉｎｇｅｒ，Ｃｅｌｌ ７６，３０１（１９９４）
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、生きているもの、例えば生存細胞の表面に発現するグリカンを修飾するための組成物および方法を特色とする。その組成物および方法は、細胞の生存性および細胞の１つまたはそれ以上の表現型の特徴を保存しながら、細胞表面のグリカンの修飾を可能にする。例えば、その方法および組成物を採用して、細胞の１つまたはそれ以上の他の表現型の特徴（例えば多分化能）を保存しながら、細胞の特定の表現型の特徴（糖鎖付加のような）を修飾し得る。
【０００８】
１つの局面において、本発明は、グリカン、例えば細胞または粒子または細胞断片（例えば哺乳類細胞または血小板またはリポソームのような細胞膜由来物質／断片）の表面に発現するグリカンを（エキソビボまたはインビトロで）修飾するための組成物を特色とする。その組成物は、精製した糖転移酵素（例えば組み換え糖転移酵素）および生理学的に許容可能な溶液を含み、ここでその生理学的に許容可能な溶液は、１つまたはそれ以上の二価金属補助因子を含まない（例えば、その溶液はマンガン、マグネシウム、カルシウム、亜鉛、コバルトまたはニッケルを含まない）。様々な実施態様において、その糖転移酵素は、フコシル基転移酵素（例えばアルファ１，３フコシル基転移酵素、例えばアルファ１，３フコシル基転移酵素ＩＩＩ、アルファ１，３フコシル基転移酵素ＩＶ、アルファ１，３フコシル基転移酵素ＶＩ、アルファ１，３フコシル基転移酵素ＶＩＩ、またはアルファ１，３フコシル基転移酵素ＩＸ）、ガラクトシル基転移酵素、またはシアル酸転移酵素である。
【０００９】
その組成物は、１つ以上の糖転移酵素を含み得る、および／またはドナー基質（例えば糖）のような、１つまたはそれ以上のさらなる薬剤を含み得る。ドナー基質は、フコース、ガラクトース、シアル酸、またはＮ−アセチルグルコサミンを含む。
【００１０】
その糖転移酵素は、酵素活性を有する。最適には、その糖転移酵素は、ｐＨ６．５、３７℃で１分あたり１．０μモルの糖を転移し得る。その組成物は、細胞または細胞粒子のインテグリン接着に影響を与えない。
【００１１】
その組成物は、二価の金属補助因子を欠く、あらゆる生理学的に許容可能な溶液を含み得る。様々な実施態様において、生理学的に許容可能な溶液は、緩衝化されている。その生理学的に許容可能な溶液は、例えばハンクス平衡塩溶液、ダルベッコ変法イーグル培地、ＨＥＰＥＳ緩衝液のようなグッド緩衝液（Ｎ．Ｅ．Ｇｏｏｄ、Ｇ．Ｄ．Ｗｉｎｇｅｔ、Ｗ．Ｗｉｎｔｅｒ、ＴＮ．Ｃｏｎｏｌｌｙ、Ｓ．ＩｚａｗａおよびＲ．Ｍ．Ｍ．Ｓｉｎｇｈ、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ５、４６７（１９６６）；Ｎ．Ｅ．Ｇｏｏｄ、Ｓ．Ｉｚａｗａ、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．２４、６２（１９７２）を参照のこと）、２−モルホリノエタンスルホン酸（ＭＥＳ）緩衝液、リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）である。
【００１２】
様々な実施態様において、生理学的に許容可能な溶液は、グリセロールを含まない。
【００１３】
その組成物を、幹細胞（例えば間葉系幹細胞、造血幹細胞）、前駆細胞（例えば神経幹／前駆細胞または肺幹／前駆細胞）、または造血系の細胞（例えば白血球、リンパ球）、または細胞粒子（例えば血小板）、またはリポソームのような、細胞の表面のグリカンを修飾するために使用し得る。
【００１４】
別の局面において、本発明は、細胞または粒子の表面のグリカンを修飾するためのキットを特色とする。そのキットは、精製糖転移酵素、および１つまたはそれ以上の二価金属補助因子を含まない、生理学的に許容可能な溶液中で、細胞を糖転移酵素と接触させるための指示を含む。
【００１５】
別の局面において、本発明は、細胞または粒子の表面上のグリカンを修飾する方法を特色とする。その方法は、二価の金属補助因子を含まない、生理学的に許容可能な溶液中で、糖転移酵素が酵素活性を有し、そして細胞または細胞粒子集団の生存性が、少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上である条件下で、細胞または細胞粒子を、糖転移酵素と接触させることを含む。生存性は、糖転移酵素との接触後２、４、６、８、１２、２４時間に測定する。
【００１６】
様々な実施態様において、細胞または粒子を、１つ以上の糖転移酵素およびその適当なドナー基質（例えば糖）と接触させる。例えば、細胞を、２つの糖転移酵素と同時に、または連続的に接触させ、それぞれ別の単糖を適当な結合で、（伸長している）コアグリカン構造に加える。その方法は、例えば細胞、例えば幹細胞または分化した細胞または血小板のような細胞粒子の表面上のグリカンを修飾するために有用である。細胞は、例えば間葉系細胞、造血幹細胞、神経幹細胞、筋幹細胞、または肺幹細胞のような、組織幹／前駆細胞、臍帯幹細胞、胚性幹細胞、または白血球を含む。その細胞または細胞粒子は、ＣＤ４４、例えばα（２，３）シアル酸付加ＣＤ４４を発現する。その細胞または細胞粒子は、ＣＤ３４またはＰＳＧＬ−１を発現しない。修飾後、その細胞または細胞粒子は、Ｅ−セレクチンおよび／またはＬ−セレクチンに結合する。修飾された細胞または細胞粒子は、Ｐ−セレクチンには結合しない。
【００１７】
様々な局面において、細胞のリガンドに対する親和性を増加するために、および／または患者に投与した場合に細胞のインビボにおける生着／ホーミング可能性を増加させるために、投与された細胞または血小板のクリアランスを予防する（循環半減期を延長する）ために、または血小板の凝集するまたは基質（例えば内皮、白血球、細胞外マトリックス等）に結合する能力を変化させるために、その方法は有用である。
【００１８】
本発明の方法によって産生された細胞または細胞粒子も、本発明に含まれる。
【００１９】
本発明はまた、患者、例えばヒトに、本発明の細胞を含む組成物を投与することによって、細胞の生着可能性を増加させる、免疫疾患、組織損傷または癌の症状を治療または軽減する方法を特色とする。
【００２０】
本発明の１つまたはそれ以上の実施態様の詳細を、付随する図および下記の説明で述べる。本発明の他の特徴、目的、および利点が、その説明および図から、および請求から明らかとなる。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】ヒト間葉系幹細胞（ＭＳＣ）はＣＤ４４を発現し、そしてＣＤ４４骨格にのみ存在するＮ−グリカン置換基に提示される、シアル酸依存性エピトープを認識するＳＡＣＫ−１ｍＡｂと反応する。（ａ）還元４−２０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで分離したＫＧ１ａ細胞（ＨＣＥＬＬを天然に発現するヒト細胞系統）からの未処理（−）またはＮ−グリコシダーゼ−Ｆ処理（＋）免疫沈降ＣＤ４４のウェスタンブロットのＳＡＣＫ−１染色。（ｂ）（左パネル）未処理（灰色のヒストグラム）またはシアリダーゼ処理（白色のヒストグラム）ＫＧ１ａ細胞におけるＳＡＣＫ−１発現のフローサイトメトリー分析。（右パネル）還元４−２０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで分離したＫＧａ１細胞由来の未処理（−）またはシアリダーゼ処理（＋）免疫沈降ＣＤ４４のウェスタンブロットのＳＡＣＫ−１染色。ＳＡＣＫ−１反応性は、フローサイトメトリーおよびウェスタンブロットの両方によって示されたように、シアリダーゼ処理後に顕著に減少する。（ｃ）Ｅ−セレクチンリガンド活性（Ｅ−セレクチン−Ｉｇキメラ（Ｅ−Ｉｇ）結合）、およびＭＳＣ上のＰＳＧＬ−１、ＣＤ４４、ＳＡＣＫ−１、ＨＥＣＡ４５２、ＫＭ９３（ｓＬｅｘ）、ＣＤ１１ａ／ＣＤ１８（ＬＦＡ−１）、ＣＤ４９ｄ／ＣＤ２９（ＶＬＡ−４）およびＣＸＣＲ４発現のフローサイトメトリー分析。点線はアイソタイプコントロールであり、実線は特異的抗体（またはＥ−Ｉｇキメラ）である；ＳＡＣＫ−１プロファイルの影のついたヒストグラムは、ＭＳＣのシアリダーゼ処理後の反応性を示す。示した結果は、複数の骨髄ドナーから得られたＭＳＣ由来の複数のヒストグラムの代表である。ヒトＭＳＣは、ＣＤ４４およびＳＡＣＫ−１決定基を提示するＣＤ４４グリコフォームを発現するが、Ｅ−セレクチンリガンドを発現しない（Ｅ−セレクチン−Ｉｇキメラで染色なし）ことに注意すること；それらはまたＣＸＣＲ４およびＰＳＧＬ−１を欠き、そしてＫＭ９３およびＨＥＣＡ４５２ｍＡｂによって認識されるｓＬｅｘ決定基も欠く。
【図２】ヒトＭＳＣのＦＴＶＩ処理は、ＣＤ４４のＮ−結合グリカンのシアロフコシル化を生じ、ＨＣＥＬＬ発現を与える。（ａ）未処理およびＦＴＶＩ処理ＭＳＣのＨＥＣＡ４５２、ＫＭ９３（ｓＬｅｘ）およびＥ−Ｉｇ反応性のフローサイトメトリー分析。点線は未処理ＭＳＣであり、実線はＦＴＶＩ処理ＭＳＣである。（ｂ）還元４−２０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離した、ＭＳＣ溶解物のＨＥＣＡ４５２（左パネル）およびＥ−Ｉｇ（右パネル）反応性のウェスタンブロット分析。各レーンの溶解物の量を、未処理およびＦＴＶＩ処理ＭＳＣの細胞数に関して標準化する。Ｃａ２＋の存在下（＋）または非存在下（−）で、Ｅ−Ｉｇによる染色を行った。ＦＴＶＩ処理は、〜１００ｋＤａの糖タンパク質に対するＨＥＣＡ４５２反応性シアロフコシル化およびＥ−Ｉｇ結合選択性を誘導することに注意すること。（ｃ）ＭＳＣをＦＴＶＩで処理した（＋）または処理しなかった（−）。その後、ＦＴＶＩ処理および未処理細胞の等価な細胞溶解物からＣＤ４４を免疫沈降し（抗ＣＤ４４ｍＡｂ Ｈｅｒｍｅｓ−１を用いて）、そして免疫沈降物をＮ−グリコシダーゼＦで消化（＋）または緩衝液で処理した（−）。次いで免疫沈降物を、還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（４−２０％勾配）によって分離し、そしてＨＥＣＡ４５２、Ｅ−Ｉｇ、または別の抗ヒトＣＤ４４ｍＡｂ（２Ｃ５）によってブロッティングした。示されるように、Ｎ−グリコシダーゼＦ処理は、ＦＴＶＩ処理ＭＳＣ由来のＣＤ４４のＨＥＣＡ４５２およびＥ−Ｉｇ染色を抑制する。示した結果は、数人の骨髄ドナーから得られたＭＳＣ由来の複数の実験の代表である。
【図３】ＦＴＶＩ処理ヒトＭＳＣは、規定されたせん断ストレス条件下で、内皮Ｅ−セレクチンと顕著に増強されたせん断抵抗性接着相互作用を示す。未処理、ＦＴＶＩ処理、またはシアリダーゼ消化ＦＴＶＩ処理ＭＳＣを、０．５ｄｙｎｅ／ｃｍ２で、ＩＬ−１βおよびＴＮＦ−α刺激ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）に灌流した。関連するＭＳＣの蓄積を、０．５、１、２、５、１０、２０、および３０ｄｙｎｅ／ｃｍ２のせん断ストレスで決定した。ある場合には、ＥＤＴＡをアッセイ緩衝液に加えた、または接着アッセイにおいて使用する前にＨＵＶＥＣをＥ−セレクチンに対する機能阻害ｍＡｂで前処理した。値は平均±ＳＥＭである（各グループｎ＝４）。
【図４】ＦＴＶＩ処理、ＨＣＥＬＬ発現ヒトＭＳＣは、インビボで骨髄に効率的にホーミングする。ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスの代表的な実験から集められた、頭蓋冠の傍矢状領域のモンタージュ画像。（ａ）このパネルのセットで示された全ての画像は、関連細胞の注入の１時間後に得られた：左パネル、未処理ＭＳＣ；中央パネル、シアリダーゼで消化したＦＴＶＩ処理細胞；右パネル、ＦＴＶＩ処理細胞。（ｂ）示した結果は、ＦＴＶＩ処理ＭＳＣの注入の１時間（左パネル）および２４時間（中央パネル）後における、１匹のマウスの代表的な画像由来である。右パネルは、ＦＴＶＩ処理ＭＳＣの注入の２４時間後の、類洞血管周囲領域の高画質カラー画像を示し、注入したＦＴＶＩ処理ＭＳＣの血管外（実質性）浸潤を明らかにする：赤い斑点はＤｉＤ標識ＭＳＣであり、蛍光量子ドット（８０５ｎｍ）の注入によって可視化された緑色は類洞血管を強調する。
【図５】フコシル基転移酵素−ＶＩで処理した神経幹細胞のＨＥＣＡ４５２反応性を示すウェスタンブロットの写真である。
【図６】フコシル基転移酵素−ＶＩ処理前および後の、神経幹細胞のＨＥＣＡ４５２発現のフローサイトメトリー分析である。
【図７】フコシル基転移酵素−ＶＩ処理前および後の、肺幹細胞のＨＥＣＡ４５２発現のフローサイトメトリー分析である。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
本発明は、部分的には、糖転移酵素は二価金属補助因子（例えばマンガン、マグネシウム、カルシウム、亜鉛、コバルトまたはニッケルのような二価陽イオン）およびグリセロールのような安定剤の非存在下で、酵素活性を保持するという驚くべき発見に基づく。以前は、二価金属補助因子は酵素活性に決定的であると考えられてきた。本発明による糖転移酵素組成物は、生存細胞のグリカンの修飾において特に有用である。生存細胞のグリカン構造を修飾する以前の試みは、金属補助因子およびグリセロールのような酵素安定剤の毒性効果のために、細胞死および細胞の表現型の変化を引き起こした。エキソビボにおける、糖転移酵素を用いた生存細胞表面グリカンのカスタムエンジニアリングのために、処理後に標的細胞が生きたままであり、そして表現型が保存されることが重要である。幹細胞を利用する適用において、酵素処理によって、特徴的な系列にそった分化が影響を受けるかどうかを分析することも重要である。
【００２３】
細胞生存性に対するその認識された効果の他に（２０）、Ｍｎ＋＋のような二価金属補助因子は、それ自身がシグナル伝達を引き起こし（２１）、そしてインテグリン接着（例えばＶＬＡ−４に関して）を、強制糖鎖付加（例えばフコシル化）で採用されるものよりもずっと下のレベルで活性化する（２２、２３）。できたインテグリンによる強固な接着は、内皮ベッドおよび関連リガンドを発現する組織実質内で広く現れるので、これらのＭｎ＋＋効果は、細胞輸送に対する糖鎖付加の効果に対する交絡因子である。
【００２４】
これらの問題に取り組むために、Ｐｉｃｈｉａ Ｐａｓｔｏｒｉｓ系における高力価のフコシル基転移酵素産生の新規方法を開発した。さらに、フコシル基転移酵素を、細胞毒性を最低限にするために特に選択された緩衝液（例えばＨＢＳＳ）中で、安定化させた。さらに、二価金属補助因子を入れずに（例えばＭｎ＋＋イオンを入れずに）、結合反応で生理学的緩衝液を利用するために、酵素条件を改良した。
【００２５】
これらの実験的修飾は、ＭＳＣ上のＣＤ４４の高い効率のフコシル化を引き起こし、酵素処理後の細胞生存性は１００％であった。重要なことに、強制フコシル化後の動態分析は、インビトロの細胞生存性は、全てのＭＳＣにおいて処理後無期限に保持されたが、ＨＣＥＬＬ発現は一過性であることを示した：ＨＣＥＬＬレベルは２４時間の間安定であり、そしてその後９６時間までにベースライン（ＨＣＥＬＬなし）まで着実に減少し、おそらく膜ＣＤ４４の細胞ターンオーバーを反映する。重要なことに、処理後２週間まで毎日アッセイして、ＦＴＶＩ処理後、様々な系統へのＭＳＣの分化には影響はなかった。従って、ＦＴＶＩ処理は、ＨＣＥＬＬ発現のみを例外として、ＭＳＣの表現型に明らかな影響を有さなかった（図２ｃ）。対照的に、市販で入手可能なＦＴＶＩ（例えばＭｎ＋＋およびグリセロールを含む組成物；Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）由来のＭＳＣのＦＴＶＩ処理は、ＨＣＥＬＬ発現は増強したが、細胞生存性はこれらのＦＴＶＩ処理後に損傷を受け、修飾後８時間以内に＞９５％の細胞が死んだ。この生存性の喪失は、市販の酵素処方中の安定剤（例えばグリセロール）に対する暴露、および酵素反応に使用された高レベルのＭｎ＋＋（１０ｍＭ）に対する暴露のためであった。よって、本発明の組成物は、エキソビボで生存細胞の表面上のグリカンを操作して、ヒトへのインビボ投与に適当な治療製品を産生することを可能にする。
【００２６】
強制フコシル化の後、そして表面ＣＸＣＲ４の発現の欠如にも関わらず、静脈内注入されたＭＳＣは、血管Ｅ−セレクチンを構成的に発現する組織である、骨髄に強くホーミングした。これらの発見は、ＨＣＥＬＬをヒト骨髄ホーミング受容体として確立し、ＣＸＣＲ４の関与は骨髄輸送に必須ではないという直接的な証拠を提供し、そして多段階パラダイムに対する新しい展望を示す。
【００２７】
強制ＨＣＥＬＬ発現は、骨髄指向性を与えること、およびシアリダーゼ処理によるその機能的不活性化は、この効果を特異的に逆転させるという発見は、このＣＤ４４グリコフォームを「骨髄ホーミング受容体」として規定する。それ自体、エキソビボでＨＣＥＬＬ発現を注文に応じて修飾する能力は、臨床的移植におけるＨＳＰＣの生着の改善に、または細胞に基づく治療（例えば骨疾患のための）におけるＭＳＣの使用のために有用であり得る。より一般的に、そのデータは、細胞のＨＣＥＬＬ発現を強制することは、全身性伝達を、その内皮ベッドがＥ−セレクチンを発現する組織にまで促進し得ることを示唆する。従って、ＣＤ４４のα（２，３）シアル化グリコフォームの、このどちらかといえばわずかなフコース修飾の高い特異性および効率は、養子細胞療法のためにＨＣＥＬＬ発現を選択的にアップレギュレートする戦略に、先導する原理および技術を提供する。これを達成し得る容易さは、このアプローチの患者への迅速な移行は、直接であるべきであることを示唆する。Ｅ−セレクチンは主に、霊長類の影響された組織の、炎症および虚血の部位に提示されるので（２９、３０）、ＨＣＥＬＬ発現の調節は、再生治療のために、損傷／障害組織における前駆／幹細胞の指向性の移動および浸潤を引き起こし得る。幹細胞に基づく治療における意味を超えて、これらの発見はまた、免疫学的エフェクターおよび調節細胞のような他の細胞における、アップレギュレートされたＥ−セレクチンリガンド活性を、免疫疾患、感染性疾患、および癌治療を含む様々な生理学的および病理学的過程において標的化細胞移動を達成するために、いかに利用し得るかを試験する。
【００２８】
組成物
本発明は、生存細胞または細胞粒子の細胞表面グリカンの、エキソビボ修飾のための組成物を提供する。その組成物は、精製糖転移酵素ポリペプチドおよび二価金属補助因子を含まない生理学的に許容可能な溶液を含む。その組成物は、例えばグリセロールのような安定化化合物を含まない。糖転移酵素は、例えばフコシル基転移酵素、ガラクトシル基転移酵素、シアル酸転移酵素、およびＮ−アセチルグルコサミン転移酵素を含む。フコシル基転移酵素は、アルファ１，３フコシル基転移酵素ＩＩＩ、アルファ１，３フコシル基転移酵素ＩＶ、アルファ１，３フコシル基転移酵素ＶＩ、アルファ１，３フコシル基転移酵素ＶＩＩ、またはアルファ１，３フコシル基転移酵素ＩＸのような、アルファ１，３フコシル基転移酵素である。
【００２９】
任意で、その組成物はさらに、特定の糖転移酵素に適当な糖ドナーを含む。例えば、その糖転移酵素がフコシル基転移酵素である場合、ドナーはＧＤＰ−フコースである。一方、その糖転移酵素がシアル酸転移酵素である場合、ドナーはＣＭＰ−シアル酸である。当業者は、適当な糖ドナーを認識する。
【００３０】
その糖転移酵素は、生物学的に活性である。生物学的に活性によって、その糖転移酵素が、糖分子をドナーからアクセプターへ転移し得ることを意味する。例えば、その糖転移酵素は、ｐＨ６．５、３７℃において、１分あたり０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、１．０、１．５、２．０、２．５、５、１０またはそれ以上のμモルの糖を転移し得る。
【００３１】
生理学的に許容可能な溶液は、細胞に損傷、例えば死を引き起こさないあらゆる溶液である。例えば、細胞または細胞粒子の生存性は、本発明の組成物による治療後に、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上である。適当な生理学的に許容可能な溶液は、例えばハンクス平衡塩溶液（ＨＢＳＳ）、ダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）、ＨＥＰＥＳ緩衝液のようなグッド緩衝液（Ｎ．Ｅ．Ｇｏｏｄ、Ｇ．Ｄ．Ｗｉｎｇｅｔ、Ｗ．Ｗｉｎｔｅｒ、ＴＮ．Ｃｏｎｏｌｌｙ、Ｓ．ＩｚａｗａおよびＲ．Ｍ．Ｍ．Ｓｉｎｇｈ、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ５、４６７（１９６６）；Ｎ．Ｅ．Ｇｏｏｄ、Ｓ．Ｉｚａｗａ、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．２４、６２（１９７２）を参照のこと）、２−モルホリノエタンスルホン酸（ＭＥＳ）緩衝液、またはリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）を含む。
【００３２】
治療方法
本発明の組成物は、その生存細胞に対する低い毒性および高い酵素活性のために、細胞または細胞粒子の表面上のグリカンの、エキソビボまたはインビトロ修飾に有用である。さらに、本発明の組成物および方法を用いて産生された修飾細胞および粒子は、骨疾患、免疫疾患、感染性疾患、および癌治療薬を含む、様々な生理学的および病理学的過程において、標的化細胞移動を達成するために、治療環境において有用である。Ｆｅｄｅｒａｌ Ｄｒｕｇ Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ（ＦＤＡ）は、ヒト投与のための全ての最終細胞産物に、厳格な必要条件を課す。具体的には、ＦＤＡは、７０％の最低細胞生存性を要求し、そしてあらゆる過程は一貫してこの最低必要条件を超えなければならない。二価金属補助因子およびグリセロールのような安定剤（有意な細胞死を引き起こす）を含む、糖転移酵素組成物を利用した細胞表面のグリカンのエキソビボまたはインビトロ修飾の以前に記載された方法と違って、本明細書中で記載された方法は、ＦＤＡの必要条件を満たす、またはそれを超える、細胞に基づく製品を産生する。
【００３３】
より具体的には、細胞表面のグリカン操作は、Ｅ−セレクチンを発現するあらゆる部位に対する細胞のホーミングを促進する。特に、ＣＤ４４は普遍的に発現する細胞膜タンパク質であり、そして「成人」および胚性の型両方の幹／前駆細胞集団に提示されるので、このタンパク質の、エキソビボグリカン操作によって糖鎖付加を修飾してＨＣＥＬＬ（ＣＤ４４グリコフォーム）表現型を産生する能力は、インビボで血管内に注入された（養子性に伝達された）細胞の、骨髄またはＥ−セレクチンを発現するあらゆる組織／臓器部位に対する移動を促進する。
【００３４】
細胞の集団を、１つまたはそれ以上の本発明による糖転移酵素組成物と接触させることによって、細胞または細胞粒子（例えば血小板またはリポソーム）の表面上でグリカンを修飾する。糖転移酵素が酵素活性を有する条件下で、細胞を糖転移酵素組成物と接触させる。本発明によるグリカン修飾は、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の生存性を有する細胞を生ずる。トリパンブルー色素排除試験のような、当該分野で公知の方法によって、生存性を決定する。生存性を、処理の１時間、２時間、４時間、１８時間、１２時間、２４時間またはそれ以上後に測定する。細胞の表現型（グリカン修飾以外）は、処理後に保存される。保存された表現型によって、その細胞がそのもとの機能および／または活性を維持することを意味する。例えば、もしその細胞が幹細胞なら、それはその多能性を保持する。
【００３５】
修飾後、その細胞または細胞粒子は、Ｅ−セレクチンおよび／またはＬ−セレクチンに結合する。様々な局面において、その修飾細胞は、Ｐ−セレクチンには結合しない。好ましくは、修飾後、細胞は造血細胞Ｅ−／Ｌ−セレクチンリガンド（ＨＣＥＬＬ）として知られる、シアロフコシル化ＣＤ４４グリコフォームを発現する。修飾後、その細胞または細胞粒子は、インビボで骨髄および／または虚血または炎症の部位にホーミングし得る。
【００３６】
その細胞または細胞粒子は、細胞表面グリカン修飾が望ましいあらゆる細胞である。その細胞は幹細胞（すなわち多分化能）または分化細胞である。幹細胞は、例えば造血幹細胞、間葉系幹細胞、組織幹／前駆細胞（例えば神経幹細胞、筋幹細胞、または肺幹細胞）、臍帯幹細胞、または胚性幹細胞を含む。分化細胞は、白血球、例えばリンパ球のような造血系細胞を含む。リンパ球は、Ｂ−リンパ球またはＴ−リンパ球、またはＴ−リンパ球のサブセット、例えば「調節性」リンパ球（ＣＤ４＋／ＣＤ２５＋／ＦＯＸＰ３＋）であり得る。
【００３７】
その細胞または細胞粒子は、ＣＤ４４を発現する。そのＣＤ４４はシアロフコシル化されていない。あるいは、そのＣＤ４４はアルファ（２，３）−シアル化され、そしてＨＣＥＬＬ表現型を与える、関連するフコシル化を欠く。ＨＣＥＬＬを与えるためのＣＤ４４の強制糖鎖付加は、臨床的造血幹細胞移植において、造血幹／前駆細胞（ＨＳＰＣ）の生着の改善において、または細胞に基づく治療（例えば骨疾患のための）におけるＭＳＣの使用のために有用である。より一般的には、そのデータは、細胞ＨＣＥＬＬ発現を強制することは、ＨＣＥＬＬを有する細胞の、その内皮ベッドがＥ−セレクチンを発現する組織への全身性伝達を促進し得ることを示唆する。
【００３８】
様々な局面において、細胞はＰＳＧＬ−１、ＣＤ３４、または両方を発現しない。
【００３９】
本発明の修飾細胞は、その増加したホーミング能力のために、例えば臨床的移植におけるＨＳＰＣの生着の改善において、細胞に基づく治療（例えば骨疾患のための）におけるＭＳＣの使用のために、または再生治療のために損傷／障害組織における前駆／幹細胞の移動および浸潤を指示するために有用である。
【００４０】
例えば、その組成物は、虚血性状態（例えば四肢の虚血、うっ血性心不全、心虚血、腎臓虚血およびＥＳＲＤ、脳卒中、および眼の虚血）、臓器または組織の再生（例えば肝臓、膵臓、肺、唾液腺、血管、骨、皮膚、軟骨、腱、靭帯、脳、毛髪、腎臓、筋肉、心筋、神経および四肢の再生）を必要とする状態、炎症性疾患（例えば心疾患、糖尿病、脊髄損傷、慢性関節リウマチ、変形性関節症、人工股関節置換術または修正のための炎症、クローン病、および移植片対宿主病）、自己免疫疾患（例えば１型糖尿病、乾癬、全身性ループス、および多発性硬化症）、変性性疾患、先天性疾患、貧血、好中球減少症、血小板増加症、骨髄増殖性疾患、または白血病のような血液学的新生物および癌のような血液学的疾患のような、様々な疾患および異常を治療するために有用である。
【００４１】
その必要がある患者に、本発明の方法によって産生された細胞組成物を投与することによって、疾患および異常を治療する、または症状を軽減する。その細胞組成物を、同種間で、または自己に投与する。
【実施例】
【００４２】
実施例１：一般的な方法
試薬：以下の抗体はＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ由来であった：機能阻害マウス抗ヒトＥ−セレクチン（６８−５４１１；ＩｇＧ１）、ラット抗ヒトＣＬＡ（ＨＥＣＡ−４５２；ＩｇＭ）、マウス抗ヒトＰＳＧＬ−１（ＫＰＬ−１；ＩｇＧ１）、精製およびＦＩＴＣ結合マウス抗ヒトＬ−セレクチン（ＤＲＥＧ−５６；ＩｇＧ１）、マウス抗ヒトＣＸＣＲ４（１２Ｇ５；ＩｇＧ２ａ）、ＦＩＴＣ結合マウス抗ヒトＣＤ１８（Ｌ１３０；ＩｇＧ１）、マウス抗ヒトＣＤ２９（ＭＡＲ４；ＩｇＧ１）、ＰＥ結合マウス抗ヒトＣＤ４９ｄ（９Ｆ１０；ＩｇＧ１）、マウスＩｇＧ１、κアイソタイプ、マウスＩｇＧ２ａアイソタイプ、マウスＩｇＭアイソタイプ、ラットＩｇＧアイソタイプおよびラットＩｇＭアイソタイプ。ラット抗ヒトＣＤ４４（Ｈｅｒｍｅｓ−１；ＩｇＧ２ａ）は、Ｄｒ．Ｂｒｅｎｄａ Ｓａｎｄｍａｉｅｒ（Ｆｒｅｄ Ｈｕｔｃｈｉｎｓｏｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ；Ｓｅａｔｔｌｅ、ＷＡ）から寄贈された。組み換えマウスＢ−セレクチン／ヒトＩｇキメラ（Ｅ−Ｉｇ）およびマウス抗ヒトＣＤ４４（２Ｃ５；ＩｇＧ２ａ）は、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ由来であった。マウス抗ヒトｓＬｅｘ（ＫＭ９３；ＩｇＭ）はＣａｌｂｉｏｃｈｅｍ由来であった。ＦＩＴＣ結合マウス抗ヒトＣＤ１１ａ（２５．３；ＩｇＧ１）、ＰＥ結合マウスＩｇＧ１、κアイソタイプおよびＦＩＴＣ結合マウスＩｇＭアイソタイプは、Ｃｏｕｌｔｅｒ−Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈ由来であった。ＦＩＴＣ結合ヤギ抗ラットＩｇＭ、ＦＩＴＣ結合ヤギ抗マウスＩｇＧ、ＦＩＴＣ結合ヤギ抗マウスＩｇＭ、ＰＥ結合ストレプトアビジン、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）結合抗ラットＩｇＭ、抗マウスＩｇ、および抗ヒトＩｇは、Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ由来であった。Ｖ．ＣｈｏｌｅｒａｅシアリダーゼはＲｏｃｈｅ由来であった。
【００４３】
ヒト細胞：骨髄（ＢＭ）細胞は、Ｂｒｉｇｈａｍ ＆ Ｗｏｍｅｎ’ｓ Ｈｏｓｐｉｔａｌ／Ｄａｎａ Ｆａｒｂｅｒ Ｃａｎｃｅｒ ＩｎｓｔｉｔｕｔｅおよびＭａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｈｏｓｐｉｔａｌにおいて、造血幹細胞移植のために骨髄を提供した健康な個人の採取フィルターから得た。ＢＭ単核細胞（ＢＭＭＮＣ）を、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ密度勾配遠心によって採取した。ヒト細胞を、Ｈｕｍａｎ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｅｔｈｉｃｓ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅｓ ｏｆ Ｐａｒｔｎｅｒｓ Ｃａｎｃｅｒ Ｃａｒｅ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎｓ［Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｈｏｓｐｉｔａｌ、Ｂｒｉｇｈａｍ ＆ Ｗｏｍｅｎ’ｓ Ｈｏｓｐｉｔａｌ ａｎｄ Ｄａｎａ Ｆａｒｂｅｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（Ｂｏｓｔｏｎ、ＭＡ）］によって許可されたプロトコールに使用した。ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）を、Ｂｒｉｇｈａｍ ＆ Ｗｏｍｅｎ’ｓ Ｈｏｓｐｉｔａｌ’ｓ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔの組織培養コア施設から得て、そして１５％のＦＢＳ、５ユニット／ｍｌのヘパリン、５０μｇ／ｍｌの内皮増殖因子および１％のペニシリン／ストレプトマイシンを添加したＭ１９９で維持した。Ｅ−セレクチンの発現を刺激するために、ＨＵＶＥＣのコンフルエントな単層を、接着研究において使用する前に、１ｎｇ／ｍｌのＩＬ−１β（Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｉｎｃ；Ｃｏｎｃｏｒｄ、ＭＡ）および１０ｎｇ／ｍｌのＴＮＦ−α（Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．）で、４−６時間前処理した。
【００４４】
ＭＳＣ培養：ＭＳＣを、９５％空気、５％ＣＯ２雰囲気下で（（１５）により）、または３％Ｏ２、５％ＣＯ２、９２％Ｎ２において（（１６）により、「ＭＩＡＭＩ」細胞）、加湿インキュベーター中で、３７℃で維持した。ＭＳＣのいずれかの型の培養のために、ＢＭＭＮＣを最初に２×１０５／ｃｍ２の濃度で、選択したロットから１０％の胎児ウシ血清（ＦＢＳ）を添加したＤＭＥＭ−低グルコース培地にまいた。数日後、非接着細胞を除去し、そして接着細胞を、０．０５％のトリプシン／０．５ｍＭのＥＤＴＡ／ＨＢＳＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．）で処理することによって回収し、そして５０細胞／ｃｍ２の密度で再びまいた。培地を４８から７２時間に、そしてその後３または４日ごとに交換した。密度が４０％コンフルエントに近づいた場合に細胞を再びまいた。全ての実験に関して、ＭＳＣを最初の３継代以内に使用し、そして０．０５％のトリプシン／０．５ｍＭのＥＤＴＡ／ＨＢＳＳで、３７℃で３分以下の間処理することによって回収した。
【００４５】
ＳＡＣＫ−１ ｍＡｂの産生：抗ＣＤ４４ｍＡｂを用いた細胞溶解物のイムノアフィニティークロマトグラフィーによって、ＨＣＥＬＬをＫＧ１ａ細胞から単離した。ＢＡＬＢ／ｃマウスに、接種材料を皮膚および腹腔内部位に５０：５０で分けて、完全フロイントアジュバント中の純粋ＨＣＥＬＬ（１：１エマルション）を注射した。不完全フロイントアジュバント中で１：１に希釈し、そして腹腔内に注射した純粋ＨＣＥＬＬで、２週間後に追加免疫を行った。１０−１４日後、５μｇのＨＣＥＬＬのＩＶ注射によってマウスを追加免疫し、次いでＩＶ追加免疫の３日後に脾臓を採取した。脾臓細胞をＮＳＯ骨髄腫細胞と融合した。最初にハイブリドーマ上清のスクリーニングを、造血細胞系統ＫＧ１ａ（ＣＤ４４＋／ＨＣＥＬＬ＋／ＨＥＣＡ４５２＋）、ＨＬ６０（ＣＤ４４＋／ＨＣＥＬＬ−／ＨＥＣＡ４５２＋）、ＲＰＭＩ８４０２（ＣＤ４４＋／ＨＣＥＬＬ−／ＨＥＣＡ４５２−）、ＪＵＲＫＡＴおよびＫ５６２（両方ともＣＤ４４−／ＨＣＥＬＬ−／ＨＥＣＡ４５２−）に対して、フローサイトメトリーによって行った。ＳＡＣＫ−１ｍＡｂを、ＣＤ４４−細胞系統ではなくＫＧ１ａに対する反応性によって、Ｎ−グリコシダーゼＦ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ；Ｎ−グリコシダーゼＦ消化は以前に記載されたように行った（１０、１２））による消化に感受性の、ＫＧ１ａ細胞に発現するＣＤ４４に対する単一特異性のウェスタンブロットの証拠と組み合わせて、「ＣＤ４４−特異的、炭水化物特異的」として同定した。
【００４６】
フローサイトメトリー：細胞のアリコート（２×１０５細胞）を、ＰＢＳ／２％ＦＢＳで洗浄し、そして一次ｍＡｂまたはアイソタイプコントロールｍＡｂ（未結合または蛍光色素結合のいずれか）とインキュベートした。細胞をＰＢＳ／２％ＦＢＳで洗浄し、そして間接的免疫蛍光のために、適当な二次蛍光色素結合抗アイソタイプ抗体とインキュベートした。細胞を洗浄した後、ＦＩＴＣまたはＰＥ蛍光強度を、Ｃｙｔｏｍｉｃｓ ＦＣ５００ＭＰＬフローサイトメーター（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｉｎｃ．、Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ、ＣＡ）を用いて決定した。
【００４７】
ヒトα（１，３）−フコシル基転移酵素ＶＩの組み換え発現および処方：オンラインメタノール検知（Ｒａｖｅｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ、Ｃａｎａｄａによる滅菌可能メタノールセンサー）およびＡｌｉｔｅａ−ポンプ（Ａｌｉｔｅａ Ａ．Ｂ．、Ｓｔｏｃｋｈｏｌｍ、Ｓｗｅｄｅｎ）によるメタノール添加の調節を用いて、ヒトα（１，３）−フコシル基転移酵素ＶＩ（ＦＴＶＩ）遺伝子およびＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ α因子のＮ末端シグナル配列を含むＰｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ ＫＭ７１（ａｒｇ４ｈｉｓ４ａｏｘ１：ＡＲＧ４）宿主系統を、高度に活性なα（１，３）−フコシル基転移酵素ＶＩの安定した発現および培地への分泌のために使用した。発酵の終了後、ブロスを１０℃に冷却し、そしてＰｉｃｈｉａ細胞を、０．２μｍの膜を有するＰｅｌｌｉｃｏｎ−微量ろ過システムによって分離し、そして続いて、最終的な処方を、１０ｋＤ−ＵＦ−膜（再生セルロース）を有するＰｅｌｌｉｃｏｎ−限外ろ過システムを用いて、ＨＢＳＳによる緩衝液交換によって達成した。
【００４８】
ヒトシアル酸転移酵素の組み換え発現および処方：オンラインメタノール検知（Ｒａｖｅｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ、Ｃａｎａｄａによる滅菌可能メタノールセンサー）およびＡｌｉｔｅａ−ポンプ（Ａｌｉｔｅａ Ａ．Ｂ．、Ｓｔｏｃｋｈｏｌｍ、Ｓｗｅｄｅｎ）によるメタノール添加の調節を用いて、ヒトシアル酸転移酵素遺伝子およびＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ α因子のＮ末端シグナル配列を含むＰｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ ＫＭ７１（ａｒｇ４ｈｉｓ４ａｏｘ１：ＡＲＧ４）宿主系統を、高度に活性なシアル酸転移酵素の安定した発現および培地への分泌のために使用した。発酵の終了後、ブロスを１０℃に冷却し、そしてＰｉｃｈｉａ細胞を、０．２μｍの膜を有するＰｅｌｌｉｃｏｎ−微量ろ過システムによって分離し、そして続いて、最終的な処方を、１０ｋＤ−ＵＦ−膜（再生セルロース）を有するＰｅｌｌｉｃｏｎ−限外ろ過システムを用いて、ＨＢＳＳによる緩衝液交換によって達成した。
【００４９】
ヒト糖転移酵素の組み換え発現および処方：オンラインメタノール検知（Ｒａｖｅｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ、Ｃａｎａｄａによる滅菌可能メタノールセンサー）およびＡｌｉｔｅａ−ポンプ（Ａｌｉｔｅａ Ａ．Ｂ．、Ｓｔｏｃｋｈｏｌｍ、Ｓｗｅｄｅｎ）によるメタノール添加の調節を用いて、ヒト糖転移酵素遺伝子およびＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ α因子のＮ末端シグナル配列を含むＰｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ ＫＭ７１（ａｒｇ４ｈｉｓ４ａｏｘ１：ＡＲＧ４）宿主系統を、高度に活性な糖転移酵素の安定した発現および培地への分泌のために使用した。発酵の終了後、ブロスを１０℃に冷却し、そしてＰｉｃｈｉａ細胞を、０．２μｍの膜を有するＰｅｌｌｉｃｏｎ−微量ろ過システムによって分離し、そして続いて、最終的な処方を、１０ｋＤ−ＵＦ−膜（再生セルロース）を有するＰｅｌｌｉｃｏｎ−限外ろ過システムを用いて、ＨＢＳＳによる緩衝液交換によって達成した。
【００５０】
ヒトＮ−アセチルグルコサミン転移酵素の組み換え発現および処方：オンラインメタノール検知（Ｒａｖｅｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ、Ｃａｎａｄａによる滅菌可能メタノールセンサー）およびＡｌｉｔｅａ−ポンプ（Ａｌｉｔｅａ Ａ．Ｂ．、Ｓｔｏｃｋｈｏｌｍ、Ｓｗｅｄｅｎ）によるメタノール添加の調節を用いて、ヒトＮ−アセチルグルコサミン転移酵素遺伝子およびＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ α因子のＮ末端シグナル配列を含むＰｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ ＫＭ７１（ａｒｇ４ｈｉｓ４ａｏｘ１：ＡＲＧ４）宿主系統を、高度に活性なＮ−アセチルグルコサミン転移酵素の安定した発現および培地への分泌のために使用した。発酵の終了後、ブロスを１０℃に冷却し、そしてＰｉｃｈｉａ細胞を、０．２μｍの膜を有するＰｅｌｌｉｃｏｎ−微量ろ過システムによって分離し、そして続いて、最終的な処方を、１０ｋＤ−ＵＦ−膜（再生セルロース）を有するＰｅｌｌｉｃｏｎ−限外ろ過システムを用いて、ＨＢＳＳによる緩衝液交換によって達成した。
【００５１】
ＦＴＶＩおよびシアリダーゼ処理：コンフルエントな単層または懸濁液中のＭＳＣを、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ、０．１％のヒト血清アルブミンおよび１ｍＭのグアノシン２リン酸（ＧＤＰ）−フコースを含むＨＢＳＳ中、６０ｍＵ／ｍＬのＦＴＶＩで、３７℃で４０分間処理した。インキュベーション後、ＭＳＣを、０．２％のＢＳＡおよび２０ｍＭのＨＥＰＥＳを含むＨＢＳＳで洗浄した。次いで未処理およびＦＴＶＩ処理ＭＳＣを実験に使用した。いくつかの実験において、ＭＳＣをまずＦＴＶＩで処理し、そして次いでシアリダーゼ処理（１００ｍＵ／ｍｌのＶ．Ｃｈｏｌｅｒａｅシアリダーゼ、１時間、３７℃）した（「ＦＴＶＩ−シアリダーゼＭＳＣ」）。シアリダーゼ処理の効率を、フローサイトメトリーによる、ＫＭ９３およびＨＥＣＡ４５２に対する反応性の喪失によって、各例において確認した。
【００５２】
シアル酸転移酵素処理：細胞を、６０ｍＵ／ｍＬのＮ−シアル酸転移酵素、１ｍＭのＣＭＰ−シアル酸で、または緩衝液単独（ＨＢＳＳ、０．１％ヒト血清アルブミン）で、３７℃で１時間処理する。インキュベーション後、細胞を、０．２％のＢＳＡおよび２０ｍＭのＨＥＰＥＳを含むＨＢＳＳで洗浄する。
【００５３】
ガラクトシル基転移酵素処理：細胞を、６０ｍＵ／ｍＬのガラクトシル基転移酵素、１ｍＭのＵＤＰ−ガラクトースで、または緩衝液単独（ＨＢＳＳ、０．１％ヒト血清アルブミン）で、３７℃で１時間処理する。インキュベーション後、細胞を、０．２％のＢＳＡおよび２０ｍＭのＨＥＰＥＳを含むＨＢＳＳで洗浄する。
【００５４】
Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素処理：細胞を、６０ｍＵ／ｍＬのＮ−アセチルグルコサミン転移酵素、１ｍＭのＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミンで、または緩衝液単独（ＨＢＳＳ、０．１％ヒト血清アルブミン）で、３７℃で１時間処理する。インキュベーション後、細胞を、０．２％のＢＳＡおよび２０ｍＭのＨＥＰＥＳを含むＨＢＳＳで洗浄する。
【００５５】
ウェスタンブロット分析：未処理およびＦＴＶＩ処理ＭＳＣを、緩衝液Ａ（１５０ｍＭのＮａＣｌ、５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．４．１ｍＭのＥＤＴＡ、２０μｇ／ｍｌのＰＭＳＦ、０．０２％のアジ化ナトリウム、およびプロテアーゼ阻害剤カクテル錠（Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ））中、２％のＮＰ−４０を用いて溶解した。定量したタンパク質溶解物または免疫沈降タンパク質のウェスタンブロットを、以前に記載されたように（１０）、還元条件下で行った。
【００５６】
免疫沈降研究：未処理またはＦＴＶＩ処理ＭＳＣの細胞溶解物を、免疫沈降抗体または適当なアイソタイプコントロールとインキュベートし、そして次いでプロテインＧ−アガロースとインキュベートした。免疫沈降物を、２％のＮＰ−４０、１％のＳＤＳを含む緩衝液Ａを用いて徹底的に洗浄した。いくつかの実験において、免疫沈降物を、以前に記載されたように（１０、１２）Ｎ−グリコシダーゼＦ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）で処理した。ウェスタンブロット分析のために、全ての免疫沈降物を、還元サンプル緩衝液で希釈し、沸騰させ、次いでＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけ、ＰＶＤＦ膜に転写し、そしてＨＥＣＡ−４５２、Ｅ−Ｉｇ、ＳＡＣＫ−１、または２Ｃ５で免疫染色した（１０）。
【００５７】
パラレルプレートフローチャンバー接着アッセイ：未処理およびＦＴＶＩ処理ＭＳＣのＥ−セレクチン結合能力を、パラレルプレートフローチャンバー（Ｇｌｙｃｏｔｅｃｈ；Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）を用いて評価した。ＭＳＣ（０．５×１０６細胞／ｍｌ、ＨＢＳＳ／１０ｍＭのＨＥＰＥＳ／２ｍＭのＣａＣｌ２溶液に懸濁）を、コンフルエントなＨＵＶＥＣ単層の上に伸ばした。最初、ＭＳＣをＨＵＶＥＣと０．５ｄｙｎｅ／ｃｍ２のせん断ストレスで接触させ、続いて０．５から３０ｄｙｎｅ／ｃｍ２のせん断ストレスを及ぼすように、流速を調整した。ＨＵＶＥＣ単層に接着性の未処理またはＦＴＶＩ処理ＭＳＣの数を、０．５、１、２、５、１０、２０および３０ｄｙｎｅ／ｃｍ２のせん断ストレスで、最終的に１５秒の間隔で定量した。各アッセイを少なくとも３回行い、そして値を平均した。セレクチン結合に必要なＣａ２＋をキレート化するために５ｍＭのＥＤＴＡをアッセイ緩衝液に加えることによって、または接着アッセイで使用する前に、ＨＵＶＥＣを機能阻害抗ヒトＥ−セレクチンｍＡｂ（６８−５４１１）で、３７℃で１５分処理することによって、コントロールアッセイを行った。
【００５８】
インビボホーミング：全ての研究を、動物のケアおよび使用に関するＮＩＨのガイドラインに従って、およびＩｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｈｏｓｐｉｔａｌ ａｎｄ ｔｈｅ Ｈａｒｖａｒｄ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｃｈｏｏｌの許可の下で行った。生体内顕微鏡検査のために、以前に記載されたように（５）、ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスを麻酔し、そして頭皮に小さい切開をして下にある背側頭蓋骨表面を露出した。ＭＳＣの４つのグループ（各グループｎ＝４）：（１）ＦＴＶＩ処理（上記のように）ＭＳＣ；（２）緩衝液処理ＭＳＣ；（３）シアリダーゼで消化した（１００ｍＵ／ｍｌ、Ｖ．Ｃｈｏｌｅｒａｅシアリダーゼ、３７℃、１時間）ＦＴＶＩ処理ＭＳＣ；および（４）未処理ＭＳＣのそれぞれを分析するために、同腹仔を用いて同じ日に実験を行った。細胞を、蛍光親油性トレーサー色素ＤｉＤ（１０μＭ、３７℃、３０分；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）で染色し、そしてＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスの尾静脈に注入した。傍矢状領域におけるＭＳＣの骨髄微小血管内皮細胞との相互作用を、以前に記載されたように（５）、ビデオレートイメージングと組み合わせた順次走査および光学切片を用いたインビボ共焦点顕微鏡によって、注射後の異なる時点においてモニターおよび画像化した。骨髄の脈管構造を描写するために、長時間循環蛍光量子ドット（Ｑｔｒａｃｋｅｒ８００、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を、画像化の直前に全身性に注射した。Ｑｔｒａｃｋｅｒ８００のストック溶液（２μＭ）を１：４に希釈し（５０μＬを１５０μＬのＰＢＳ１×と混合する）、そして麻酔マウス尾静脈に注射した。マウス頭蓋骨骨髄のインビボ共焦点顕微鏡検査を、以前に記載されたように（５）行った。ＤｉＤ標識細胞を、６３３ｎｍの固体レーザーで励起し、そして６９５ｎｍで中心に置いた４５ｎｍのバンドパスフィルターで画像化し、一方量子ドットを固体Ｎｄ：ＹＡＧレーザーで５３２ｎｍにおいて励起し、そして７７０ｎｍのロングパスフィルターで画像化した。
【００５９】
実施例２：ヒト間葉系幹細胞は、ＣＤ４４のＮ−結合シアル化グリコフォームを発現し、そしてセレクチンに結合しない
骨髄は、２つの幹細胞の集団、造血幹細胞および間葉系幹細胞（ＭＳＣ）を含む。ＭＳＣは、正常骨髄内に存在する細胞の小集団を表すが、それらを単離および培養中で増殖させ得る。ＭＳＣは特徴的にＣＤ４４および造血細胞において見出されるいくつかの他の接着分子を発現する（１４）。しかし、これらの原始的非造血細胞が、セレクチンリガンドを発現しているかどうかは不明である。このデータの不足、およびＨＣＥＬＬは最も初期の造血細胞（ＣＤ３４＋／ｌｉｎ−細胞）にのみ発現するという発見（１０、１１）が、ＭＳＣがセレクチンに結合し得る、ＣＤ４４上の同様の炭水化物修飾を示すかどうかを調査するよう私たちを刺激した。
【００６０】
ＭＳＣを、２つの確立された、公開されたプロトコール（１５、１６）に従って、ヒト骨髄から培養した。両方の方法を用いて得られたＭＳＣは、以前に記載されたように（１５、１６）、脂肪細胞、骨細胞、および線維芽細胞分化に向けて、多分化能の分化をし得た。プロトコールに関わらず、ＭＳＣは、測定された細胞表面マーカーのいずれにおいても、または酵素的処理に対する反応においても、有意な差は示さなかった。フローサイトメトリー（図１ｃ）によって、ＭＳＣはＰＳＧＬ−１、またはセレクチンリガンドとして作用し得るシアロフコシル化決定基を欠いていた：特に、フローサイトメトリーおよびウェスタンブロットの両方によって、細胞はｍＡｂＫＭ９３またはＨＥＣＡ４５２（これらはそれぞれシアリルルイスＸを同定する）、およびＥ−Ｉｇに対する反応性を欠いていた（図１ｃ、２ａ、および２ｂ）。さらに、両方の型のＭＳＣは、ＬＦＡ−１（ＣＤ１１ａ／ＣＤ１８）を欠いていたが、別のインテグリン、ＶＬＡ−４（ＣＤ４９ｄ／ＣＤ２９）を発現していた（図１ｃ）。ＶＬＡ−４は、血管内皮における回転相互作用および安定した接着を媒介し得るが（１７）、これらの接着機能はどちらも、通常ＳＤＦ−１／ＣＸＣＲ４経路によって媒介される「インサイドアウト」活性化を必要とする（１８）。重要なことに、プレートにおける、およびフローサイトメトリーによる接着ＭＳＣの免疫蛍光染色の分析は、ＣＸＣＲ４の発現を示さず（図１ｃ）、そして予想通り、ＭＳＣは静的または流れに基づくアッセイのいずれにおいても、ＳＤＦ−１に反応して移動しなかった（示していない）。
【００６１】
ＣＤ４４の発現は、多くのドナーから単離された全てのＭＳＣで高かった（図１ｃ）。顕著に、ＳＡＣＫ−１反応性も、全てのドナー由来の全てのＭＳＣで高く（図１ｃ）、これらの細胞は一様にＣＤ４４のＮ−結合、シアル酸付加グリコフォームを発現していることを示す。もともとセレクチンリガンドを欠くが、シアル酸付加ＣＤ４４アクセプターが存在するので、ＭＳＣは、ＨＣＥＬＬ発現が骨髄への細胞輸送にどのように影響するか調べるために理想的な細胞型であった。
【００６２】
実施例３：間葉系幹細胞のエキソビボフコシル化はＨＣＥＬＬの発現を引き起こす
ＨＣＥＬＬ発現を強制するために、ＭＳＣをエキソビボでα（１，３）−フコシル基転移酵素、フコシル基転移酵素ＶＩ（ＦＴＶＩ）で処理した。全てのドナーから培養した全てのＭＳＣにおいて、強制フコシル化は、ｍＡｂ ＨＥＣＡ４５２およびＫＭ９３による著明な染色を引き起こし、シアリルルイスＸエピトープの発現と一致していた（図２ａ）。細胞溶解物およびＦＴＶＩ処理ＭＳＣ由来の免疫沈降ＣＤ４４のウェスタンブロットは、ＨＥＣＡ４５２によって認識される必要なシアロフコシル化を有する唯一の糖タンパク質がＣＤ４４であることを明らかにした（図２ｂおよび２ｃ）。さらに、フローサイトメトリーによって、フコシル化ＭＳＣはＥ−Ｉｇに結合しており、そして細胞溶解物のウェスタンブロット分析は、Ｅ−Ｉｇ結合を支持する唯一の糖タンパク質がＣＤ４４であることを示した（図２）。関連するＨＣＥＬＬのシアロフコシル化は、Ｎ−グリコシダーゼＦによる消化後のＥ−Ｉｇ結合の抑止によって示されるように、Ｎ−グリカン上に示された（図２ｃ）。
【００６３】
生理学的な血流条件下で、ＦＴＶＩ処理ＭＳＣのＥ−セレクチンリガンド活性を分析するために、Ｅ−セレクチンを発現するようサイトカインで刺激したヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）を用いて、パラレルプレートフローチャンバー研究を行った。図３に示すように、ＦＴＶＩ処理ＭＳＣは、著明なＥ−セレクチンリガンド活性を示し、それはＥＤＴＡの存在下で、およびＭＳＣをシアリダーゼで処理することによって完全に抑止された。もともとＨＣＥＬＬを発現する細胞の以前の研究と一致して、通常の後毛細管細静脈せん断レベル（１−４ｄｙｎｅ／ｃｍ２）で、確固としたせん断抵抗相互作用が観察され、ＰＳＧＬ−１がＥ−セレクチン結合を支持し得る範囲をはるかに超えて、２０ｄｙｎｅ／ｃｍ２より上において持続した（１０）。これらのデータは、ＭＳＣ表面のフコシル化によって産生されたＨＣＥＬＬは、ＫＧ１ａ細胞およびヒト造血前駆細胞の表面にもともと示されるものと機能的に同様であることを示した（１０、１１）。
【００６４】
実施例４：ＨＣＥＬＬの発現は、インビボでＭＳＣの骨髄へのホーミングを増強した
ＨＣＥＬＬの発現がインビボでＭＳＣの骨髄へのホーミングを増強するかどうかを決定するために、我々はダイナミックリアルタイム共焦点顕微鏡を採用して、生存免疫欠損マウス（ＮＯＤ／ＳＣＩＤ）宿主の頭蓋冠の骨髄類洞血管を可視化した（５）。４つのグループの細胞を、それぞれの宿主の尾静脈に注射した：（１）ＦＴＶＩ処理ＭＳＣ、（２）シアリダーゼで消化したＦＴＶＩ処理ＭＳＣ（「ＦＴＶＩ−シアリダーゼＭＳＣ」）、（３）緩衝液処理ＭＳＣ、および（４）未処理ＭＳＣ。インビボ顕微鏡研究は、ＦＴＶＩ処理、ＨＣＥＬＬ発現ＭＳＣは、骨髄類洞血管を直接回転し、そして注入から数時間以内に、骨髄実質に迅速に浸潤したことを示した（図４）。対照的に、未処理ＭＳＣおよび緩衝液処理ＭＳＣは、類洞内皮と最低限の結合相互作用を示し、そして中程度の浸潤のみを示し、一方ＦＴＶＩ−シアリダーゼＭＳＣは、典型的にはさらに低いレベルの内皮相互作用および骨髄浸潤を示した（図４）。後者の発見は、ホーミングにおけるＨＣＥＬＬの決定的な役割を強調し、そしてまたＦＴＶＩ処理後の骨髄指向性は、フコシル化それ自体または他の接着分子の間接的な影響の結果ではなく、（２，３）シアル酸の発現およびα（１，３）フコース修飾を同時に必要とする、誘導されたセレクチンリガンド活性の結果のみであることを示す。ＭＳＣおよび血管の同時染色によって得られた画像は、ＨＣＥＬＬ＋ＭＳＣが骨髄実質に浸潤したことを明らかに示す（図４）。本明細書中の研究は、骨髄輸送を促進する類洞リガンドの発現を著しく増強する、レシピエント動物の照射または他の予備操作の使用によるような、損傷を誘発せずに行われたことを考えると、観察された骨髄浸潤は印象的である（２７）。まとめると、これらのデータは、ＨＣＥＬＬ発現はＭＳＣの骨髄へのホーミングを直接的に増強するという決定的な証拠を提供する。
【００６５】
基準の多段階パラダイムにおいて、内皮におけるホーミング受容体による回転相互作用は、安定した接着、続く遊出を引き起こす、インテグリン接着のＧ−タンパク質共役アップレギュレーションに決定的であると考えられる、ケモカインへの接触を促進する（３）。特に、本明細書中で使用したＭＳＣは、ＣＸＣＲ４を有さない、または骨髄ホーミングを調節する主なケモカインであるＳＤＦ−１への走化性がない（４、５）。従って、これらの細胞の骨髄へ浸潤する能力は、ＣＸＣＲ４の関与は、骨髄輸送に必須ではないことを示す。しかし、第１段階の相互作用は、細胞のあらゆる組織への輸送のために不可欠であり、そしてここで示したように、Ｅ−セレクチンリガンド活性の増強は、骨髄ホーミングを促進する。より広い観点から、我々の発見は、安定した接着および内皮を超える移動を伴うインテグリン接着を誘発するために、ホーミング受容体の関与は単独で（すなわちケモカインシグナル伝達の非存在下で）十分であり得ることを示す、増加する実験的証拠と一致する（１）。特に、リンパ球上のＣＤ４４それ自身のライゲーションが、ケモカインの関与なしで遊出を引き起こす、ＶＬＡ−４接着の直接的な、相乗的アップレギュレーションを引き起こすことが発見された（２８）。この軸が他の細胞型で作用するどうかを決定するためには将来の研究が必要であるが、ＭＳＣが特徴的にＶＬＡ−４を発現するという事実（図１ｃ）は、この可能性を高める。
【００６６】
実施例５：神経幹細胞のインビボフコシル化
神経幹細胞を、６０ｍＵ／ｍＬのＦＴ−ＶＩ、１ｍＭのＧＤＰ−フコースで、または緩衝液単独（ＨＢＳＳ、０．１％ヒト血清アルブミン）で、３７℃で１時間処理した。細胞を、２％のＮＰ−４０を含む緩衝液中で溶解した。タンパク質を、変性条件下で４−２０％Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ勾配ゲルで分離し、そしてＰＶＤＦ膜に転写した。膜をＨＥＣＡ４５２抗体でイムノブロッティングした。できたブロットは、強制フコシル化後、多くのタンパク質上のＨＥＣＡ４５２反応性エピトープの発現を示す。ＦＴ−ＶＩ処理神経幹細胞をまた、フローサイトメトリーを用いてＨＥＣＡ４５２反応性に関して分析した。ＦＴ−ＶＩ細胞を、１０μｇ／ｍＬのＨＥＣＡ４５２または１０μｇ／ｍＬのラットＩｇＭアイソタイプコントロールと、４℃で３０分間、そして続いて２０μｇ／ｍＬの抗ラットＩｇＭ−ＦＩＴＣと、４℃で３０分間インキュベートした。フローサイトメトリーの結果は、強制フコシル化後、細胞表面のＨＥＣＡ４５２エピトープ発現の増加を示す。
【００６７】
実施例６：肺幹細胞のインビボフコシル化
肺幹細胞を、６０ｍＵ／ｍＬのＦｔ−ＶＩ、１ｍＭのＧＤＰ−フコースで、または緩衝液単独（ＨＢＳＳ、０．１％ヒト血清アルブミン）で、３７℃で１時間処理した。細胞を、１０μｇ／ｍＬのＨＥＣＡ４５２または１０μｇ／ｍＬのラットＩｇＭアイソタイプコントロールと、４℃で３０分間、そして続いて２０μｇ／ｍＬの抗ラットＩｇＭ−ＦＩＴＣと、４℃で３０分間インキュベートした。フローサイトメトリーの結果は、強制フコシル化後、細胞表面のＨＥＣＡ４５２エピトープ発現の増加を示す。
【００６８】
参考文献
【００６９】
【化１】
【００７０】
【化２】
本発明の多くの実施態様が記載された。それにも関わらず、本発明の意図および範囲から離れることなく、様々な修飾をし得ることが理解される。よって、他の実施態様が以下の請求の範囲内である。
【技術分野】
【０００１】
本明細書中に記載される研究は、一部において、国立衛生研究所からの補助（補助金第ＲＯ１ ＨＬ０７３７１４号および補助金第ＲＯ１ ＨＬ０６０５２８号）をとおして資金を提供された。従って、米国政府は、本発明に一定の権利を有する。
本発明は、外来性の糖転移酵素を用いて、生存細胞の細胞表面グリカンを修飾する組成物および方法に関連する。特に、本発明の方法の組成物は、処理した細胞の生存性および１つまたはそれ以上のもとの表現型の特徴を保存する。
【背景技術】
【０００２】
血液由来細胞の、前もって決定された位置への移動を指示する能力（「ホーミング」）は、様々な生理学的および病理学的過程に大きな意味を有する。循環細胞の、特定の解剖学的位置へのリクルートは、血流中の細胞および標的組織の血管内皮の間の、別々の接着相互作用によって開始される。これらの接触を媒介する分子は、「ホーミング受容体」と呼ばれ、そして歴史的に定義されるように、これらの構造は血中の細胞の、それぞれの標的組織への指向性を導く。現在、３つの組織特異的ホーミング受容体：末梢リンパ節のＬ−セレクチン、腸管および消化管関連リンパ系組織のα４β７（ＬＰＡＭ−１）、および皮膚の皮膚リンパ球抗原（ＣＬＡ）のみが知られている（非特許文献１）。これらの組織の他に、循環細胞、特に造血幹細胞は、効率的に骨髄へ向かうことが、数十年の間知られていた（非特許文献２）。しかし、数十年にわたるこの過程に対する多数の調査は、複雑な、および時には対立する結果を生じ、骨髄指向性を独自に促進するホーミング受容体の直接的な証拠は提供しなかった。
【０００３】
生物物理学的観点から、ホーミング受容体は、分子ブレーキとして機能し、支配的な血流の速度より低い速度で、血流中の細胞の、血管内皮への最初の係留、次いで持続した回転接触を起こす（第１段階）（非特許文献１）。その後、典型的にはケモカインによって増強される、イベントのカスケードが後に続き、インテグリン接着の活性化（第２段階）、安定した接着（第３段階）、および内皮遊出（第４段階）を引き起こす（非特許文献３）。この「多段階パラダイム」は、組織特異的遊走は、当該循環細胞上のホーミング受容体およびケモカイン受容体発現の別々の組み合わせによって調節され、関連する血管接着リガンドおよび標的内皮に発現するケモカインによって、臓器特異的な方式で示される、適切な「交通信号」の認識を可能にすることを主張する。細胞の骨髄への交通を指示するホーミング受容体の関与後、いくつかの証拠が、特に１つのケモカイン、ＳＤＦ−１が、第２段階による細胞のこの部位へのリクルートに、重要な役割を果たしていることを示す（（非特許文献２）、４、５）。
【０００４】
第１段階の回転相互作用の最も効率的なエフェクターは、セレクチン（Ｅ−、Ｐ−およびＬ−セレクチン）およびそのリガンドである（非特許文献１）。その名前が示すように、セレクチンは、原型として四糖シアリルルイスＸ（ｓＬｅＸ；Ｎｅｕ５Ａｃα２−３Ｇａｌβ１−４［Ｆｕｃα１−３］ＧｌｃＮＡｃβ１−））として提示される、α（２，３）−結合シアル酸置換およびα（１，３）−結合フコース修飾を含むシアロフコシル化からなる、特定化された炭水化物決定基に結合するレクチンである（１、６）。Ｅ−およびＰ−セレクチンは、血管内皮に発現し（Ｐ−セレクチンは血小板にも発現）、およびＬ−セレクチンは循環白血球に発現する（非特許文献１）。Ｅ−およびＰ−セレクチンは、典型的には組織の損傷および炎症の部位のみに顕著に発現する、誘導性内皮膜分子である。しかし、骨髄の微小血管系は、これらのセレクチンを構成的に発現し（５、７）、そしてインビボ研究が、循環細胞の骨髄へのリクルートにおけるＥ−セレクチンの役割を示した（５、８）。重要なことに、ＳＤＦ−１は骨髄内で高濃度に発現し、そして血液由来細胞を骨髄へリクルートする、特定化した類洞内皮ベッドでＥ−セレクチンと独自に共存する（５）。
【０００５】
Ｅ−セレクチンの２つの主なリガンド、ＰＳＧＬ−１（９）および造血細胞Ｅ−／Ｌ−セレクチンリガンド（ＨＣＥＬＬ）（１０、１１）として知られる、特定化されたシアロフコシル化ＣＤ４４グリコフォームが、ヒト造血幹／前駆細胞（ＨＳＰＣ）において同定された。ＣＤ４４は、どちらかと言えば遍在性の細胞膜タンパク質であるが、ＨＣＥＬＬ表現型は、ヒトＨＳＰＣにおいてのみ見出される。ＨＣＥＬＬの限定された分布と対照的に、ＰＳＧＬ−１は、骨髄内の造血前駆細胞およびより成熟した骨髄およびリンパ球系細胞の中で広く発現している（９）。ＨＣＥＬＬは、操作上、せん断条件下でＥ−セレクチンおよびＬ−セレクチンに結合するＣＤ４４として定義され、そしてＣＤ４４グリコフォームはＥ−セレクチン−Ｉｇキメラ（Ｅ−Ｉｇ）、およびシアリルルイスＸ様エピトープを認識するｍＡｂ ＨＥＣＡ４５２と反応性のＣＤ４４グリコフォームとして、細胞溶解物のウェスタンブロット分析によって同定される。全ての糖タンパク質セレクチンリガンドと同様に、Ｅ−およびＬ−セレクチンに対するＨＣＥＬＬの結合は、α（２，３）−シアル酸およびα（１，３）−フコース修飾に決定的に依存する（１０−１３）。ヒトＨＳＰＣにおいて、ＨＣＥＬＬは、Ｎ−グリカンにおける適切なシアロフコシル化セレクチン結合決定基を提示する（１０、１２）。血行力学的せん断ストレス下でのＥ−およびＬ−セレクチン結合のインビトロアッセイは、ＨＣＥＬＬは、あらゆるヒト細胞において発現するこれらの分子の最も強力なリガンドであることを示す（１０、１３）。重要なことに、Ｅ−セレクチンは骨髄の微小血管内皮に構成的に発現するが、この分子は組織の損傷（例えば虚血−再灌流障害または外傷）または炎症の全ての部位において、内皮ベッドに顕著に発現する。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｒ．Ｓａｃｋｓｔｅｉｎ，Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｈｅｍａｔｏｌ １２，４４４（２００５）
【非特許文献２】Ｔ．Ｌａｐｉｄｏｔ，Ａ．Ｄａｒ，Ｏ．Ｋｏｌｌｅｔ，Ｂｌｏｏｄ １０６，１９０１（２００５）
【非特許文献３】Ｔ．Ａ．Ｓｐｒｉｎｇｅｒ，Ｃｅｌｌ ７６，３０１（１９９４）
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、生きているもの、例えば生存細胞の表面に発現するグリカンを修飾するための組成物および方法を特色とする。その組成物および方法は、細胞の生存性および細胞の１つまたはそれ以上の表現型の特徴を保存しながら、細胞表面のグリカンの修飾を可能にする。例えば、その方法および組成物を採用して、細胞の１つまたはそれ以上の他の表現型の特徴（例えば多分化能）を保存しながら、細胞の特定の表現型の特徴（糖鎖付加のような）を修飾し得る。
【０００８】
１つの局面において、本発明は、グリカン、例えば細胞または粒子または細胞断片（例えば哺乳類細胞または血小板またはリポソームのような細胞膜由来物質／断片）の表面に発現するグリカンを（エキソビボまたはインビトロで）修飾するための組成物を特色とする。その組成物は、精製した糖転移酵素（例えば組み換え糖転移酵素）および生理学的に許容可能な溶液を含み、ここでその生理学的に許容可能な溶液は、１つまたはそれ以上の二価金属補助因子を含まない（例えば、その溶液はマンガン、マグネシウム、カルシウム、亜鉛、コバルトまたはニッケルを含まない）。様々な実施態様において、その糖転移酵素は、フコシル基転移酵素（例えばアルファ１，３フコシル基転移酵素、例えばアルファ１，３フコシル基転移酵素ＩＩＩ、アルファ１，３フコシル基転移酵素ＩＶ、アルファ１，３フコシル基転移酵素ＶＩ、アルファ１，３フコシル基転移酵素ＶＩＩ、またはアルファ１，３フコシル基転移酵素ＩＸ）、ガラクトシル基転移酵素、またはシアル酸転移酵素である。
【０００９】
その組成物は、１つ以上の糖転移酵素を含み得る、および／またはドナー基質（例えば糖）のような、１つまたはそれ以上のさらなる薬剤を含み得る。ドナー基質は、フコース、ガラクトース、シアル酸、またはＮ−アセチルグルコサミンを含む。
【００１０】
その糖転移酵素は、酵素活性を有する。最適には、その糖転移酵素は、ｐＨ６．５、３７℃で１分あたり１．０μモルの糖を転移し得る。その組成物は、細胞または細胞粒子のインテグリン接着に影響を与えない。
【００１１】
その組成物は、二価の金属補助因子を欠く、あらゆる生理学的に許容可能な溶液を含み得る。様々な実施態様において、生理学的に許容可能な溶液は、緩衝化されている。その生理学的に許容可能な溶液は、例えばハンクス平衡塩溶液、ダルベッコ変法イーグル培地、ＨＥＰＥＳ緩衝液のようなグッド緩衝液（Ｎ．Ｅ．Ｇｏｏｄ、Ｇ．Ｄ．Ｗｉｎｇｅｔ、Ｗ．Ｗｉｎｔｅｒ、ＴＮ．Ｃｏｎｏｌｌｙ、Ｓ．ＩｚａｗａおよびＲ．Ｍ．Ｍ．Ｓｉｎｇｈ、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ５、４６７（１９６６）；Ｎ．Ｅ．Ｇｏｏｄ、Ｓ．Ｉｚａｗａ、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．２４、６２（１９７２）を参照のこと）、２−モルホリノエタンスルホン酸（ＭＥＳ）緩衝液、リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）である。
【００１２】
様々な実施態様において、生理学的に許容可能な溶液は、グリセロールを含まない。
【００１３】
その組成物を、幹細胞（例えば間葉系幹細胞、造血幹細胞）、前駆細胞（例えば神経幹／前駆細胞または肺幹／前駆細胞）、または造血系の細胞（例えば白血球、リンパ球）、または細胞粒子（例えば血小板）、またはリポソームのような、細胞の表面のグリカンを修飾するために使用し得る。
【００１４】
別の局面において、本発明は、細胞または粒子の表面のグリカンを修飾するためのキットを特色とする。そのキットは、精製糖転移酵素、および１つまたはそれ以上の二価金属補助因子を含まない、生理学的に許容可能な溶液中で、細胞を糖転移酵素と接触させるための指示を含む。
【００１５】
別の局面において、本発明は、細胞または粒子の表面上のグリカンを修飾する方法を特色とする。その方法は、二価の金属補助因子を含まない、生理学的に許容可能な溶液中で、糖転移酵素が酵素活性を有し、そして細胞または細胞粒子集団の生存性が、少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上である条件下で、細胞または細胞粒子を、糖転移酵素と接触させることを含む。生存性は、糖転移酵素との接触後２、４、６、８、１２、２４時間に測定する。
【００１６】
様々な実施態様において、細胞または粒子を、１つ以上の糖転移酵素およびその適当なドナー基質（例えば糖）と接触させる。例えば、細胞を、２つの糖転移酵素と同時に、または連続的に接触させ、それぞれ別の単糖を適当な結合で、（伸長している）コアグリカン構造に加える。その方法は、例えば細胞、例えば幹細胞または分化した細胞または血小板のような細胞粒子の表面上のグリカンを修飾するために有用である。細胞は、例えば間葉系細胞、造血幹細胞、神経幹細胞、筋幹細胞、または肺幹細胞のような、組織幹／前駆細胞、臍帯幹細胞、胚性幹細胞、または白血球を含む。その細胞または細胞粒子は、ＣＤ４４、例えばα（２，３）シアル酸付加ＣＤ４４を発現する。その細胞または細胞粒子は、ＣＤ３４またはＰＳＧＬ−１を発現しない。修飾後、その細胞または細胞粒子は、Ｅ−セレクチンおよび／またはＬ−セレクチンに結合する。修飾された細胞または細胞粒子は、Ｐ−セレクチンには結合しない。
【００１７】
様々な局面において、細胞のリガンドに対する親和性を増加するために、および／または患者に投与した場合に細胞のインビボにおける生着／ホーミング可能性を増加させるために、投与された細胞または血小板のクリアランスを予防する（循環半減期を延長する）ために、または血小板の凝集するまたは基質（例えば内皮、白血球、細胞外マトリックス等）に結合する能力を変化させるために、その方法は有用である。
【００１８】
本発明の方法によって産生された細胞または細胞粒子も、本発明に含まれる。
【００１９】
本発明はまた、患者、例えばヒトに、本発明の細胞を含む組成物を投与することによって、細胞の生着可能性を増加させる、免疫疾患、組織損傷または癌の症状を治療または軽減する方法を特色とする。
【００２０】
本発明の１つまたはそれ以上の実施態様の詳細を、付随する図および下記の説明で述べる。本発明の他の特徴、目的、および利点が、その説明および図から、および請求から明らかとなる。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】ヒト間葉系幹細胞（ＭＳＣ）はＣＤ４４を発現し、そしてＣＤ４４骨格にのみ存在するＮ−グリカン置換基に提示される、シアル酸依存性エピトープを認識するＳＡＣＫ−１ｍＡｂと反応する。（ａ）還元４−２０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで分離したＫＧ１ａ細胞（ＨＣＥＬＬを天然に発現するヒト細胞系統）からの未処理（−）またはＮ−グリコシダーゼ−Ｆ処理（＋）免疫沈降ＣＤ４４のウェスタンブロットのＳＡＣＫ−１染色。（ｂ）（左パネル）未処理（灰色のヒストグラム）またはシアリダーゼ処理（白色のヒストグラム）ＫＧ１ａ細胞におけるＳＡＣＫ−１発現のフローサイトメトリー分析。（右パネル）還元４−２０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで分離したＫＧａ１細胞由来の未処理（−）またはシアリダーゼ処理（＋）免疫沈降ＣＤ４４のウェスタンブロットのＳＡＣＫ−１染色。ＳＡＣＫ−１反応性は、フローサイトメトリーおよびウェスタンブロットの両方によって示されたように、シアリダーゼ処理後に顕著に減少する。（ｃ）Ｅ−セレクチンリガンド活性（Ｅ−セレクチン−Ｉｇキメラ（Ｅ−Ｉｇ）結合）、およびＭＳＣ上のＰＳＧＬ−１、ＣＤ４４、ＳＡＣＫ−１、ＨＥＣＡ４５２、ＫＭ９３（ｓＬｅｘ）、ＣＤ１１ａ／ＣＤ１８（ＬＦＡ−１）、ＣＤ４９ｄ／ＣＤ２９（ＶＬＡ−４）およびＣＸＣＲ４発現のフローサイトメトリー分析。点線はアイソタイプコントロールであり、実線は特異的抗体（またはＥ−Ｉｇキメラ）である；ＳＡＣＫ−１プロファイルの影のついたヒストグラムは、ＭＳＣのシアリダーゼ処理後の反応性を示す。示した結果は、複数の骨髄ドナーから得られたＭＳＣ由来の複数のヒストグラムの代表である。ヒトＭＳＣは、ＣＤ４４およびＳＡＣＫ−１決定基を提示するＣＤ４４グリコフォームを発現するが、Ｅ−セレクチンリガンドを発現しない（Ｅ−セレクチン−Ｉｇキメラで染色なし）ことに注意すること；それらはまたＣＸＣＲ４およびＰＳＧＬ−１を欠き、そしてＫＭ９３およびＨＥＣＡ４５２ｍＡｂによって認識されるｓＬｅｘ決定基も欠く。
【図２】ヒトＭＳＣのＦＴＶＩ処理は、ＣＤ４４のＮ−結合グリカンのシアロフコシル化を生じ、ＨＣＥＬＬ発現を与える。（ａ）未処理およびＦＴＶＩ処理ＭＳＣのＨＥＣＡ４５２、ＫＭ９３（ｓＬｅｘ）およびＥ−Ｉｇ反応性のフローサイトメトリー分析。点線は未処理ＭＳＣであり、実線はＦＴＶＩ処理ＭＳＣである。（ｂ）還元４−２０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離した、ＭＳＣ溶解物のＨＥＣＡ４５２（左パネル）およびＥ−Ｉｇ（右パネル）反応性のウェスタンブロット分析。各レーンの溶解物の量を、未処理およびＦＴＶＩ処理ＭＳＣの細胞数に関して標準化する。Ｃａ２＋の存在下（＋）または非存在下（−）で、Ｅ−Ｉｇによる染色を行った。ＦＴＶＩ処理は、〜１００ｋＤａの糖タンパク質に対するＨＥＣＡ４５２反応性シアロフコシル化およびＥ−Ｉｇ結合選択性を誘導することに注意すること。（ｃ）ＭＳＣをＦＴＶＩで処理した（＋）または処理しなかった（−）。その後、ＦＴＶＩ処理および未処理細胞の等価な細胞溶解物からＣＤ４４を免疫沈降し（抗ＣＤ４４ｍＡｂ Ｈｅｒｍｅｓ−１を用いて）、そして免疫沈降物をＮ−グリコシダーゼＦで消化（＋）または緩衝液で処理した（−）。次いで免疫沈降物を、還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（４−２０％勾配）によって分離し、そしてＨＥＣＡ４５２、Ｅ−Ｉｇ、または別の抗ヒトＣＤ４４ｍＡｂ（２Ｃ５）によってブロッティングした。示されるように、Ｎ−グリコシダーゼＦ処理は、ＦＴＶＩ処理ＭＳＣ由来のＣＤ４４のＨＥＣＡ４５２およびＥ−Ｉｇ染色を抑制する。示した結果は、数人の骨髄ドナーから得られたＭＳＣ由来の複数の実験の代表である。
【図３】ＦＴＶＩ処理ヒトＭＳＣは、規定されたせん断ストレス条件下で、内皮Ｅ−セレクチンと顕著に増強されたせん断抵抗性接着相互作用を示す。未処理、ＦＴＶＩ処理、またはシアリダーゼ消化ＦＴＶＩ処理ＭＳＣを、０．５ｄｙｎｅ／ｃｍ２で、ＩＬ−１βおよびＴＮＦ−α刺激ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）に灌流した。関連するＭＳＣの蓄積を、０．５、１、２、５、１０、２０、および３０ｄｙｎｅ／ｃｍ２のせん断ストレスで決定した。ある場合には、ＥＤＴＡをアッセイ緩衝液に加えた、または接着アッセイにおいて使用する前にＨＵＶＥＣをＥ−セレクチンに対する機能阻害ｍＡｂで前処理した。値は平均±ＳＥＭである（各グループｎ＝４）。
【図４】ＦＴＶＩ処理、ＨＣＥＬＬ発現ヒトＭＳＣは、インビボで骨髄に効率的にホーミングする。ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスの代表的な実験から集められた、頭蓋冠の傍矢状領域のモンタージュ画像。（ａ）このパネルのセットで示された全ての画像は、関連細胞の注入の１時間後に得られた：左パネル、未処理ＭＳＣ；中央パネル、シアリダーゼで消化したＦＴＶＩ処理細胞；右パネル、ＦＴＶＩ処理細胞。（ｂ）示した結果は、ＦＴＶＩ処理ＭＳＣの注入の１時間（左パネル）および２４時間（中央パネル）後における、１匹のマウスの代表的な画像由来である。右パネルは、ＦＴＶＩ処理ＭＳＣの注入の２４時間後の、類洞血管周囲領域の高画質カラー画像を示し、注入したＦＴＶＩ処理ＭＳＣの血管外（実質性）浸潤を明らかにする：赤い斑点はＤｉＤ標識ＭＳＣであり、蛍光量子ドット（８０５ｎｍ）の注入によって可視化された緑色は類洞血管を強調する。
【図５】フコシル基転移酵素−ＶＩで処理した神経幹細胞のＨＥＣＡ４５２反応性を示すウェスタンブロットの写真である。
【図６】フコシル基転移酵素−ＶＩ処理前および後の、神経幹細胞のＨＥＣＡ４５２発現のフローサイトメトリー分析である。
【図７】フコシル基転移酵素−ＶＩ処理前および後の、肺幹細胞のＨＥＣＡ４５２発現のフローサイトメトリー分析である。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
本発明は、部分的には、糖転移酵素は二価金属補助因子（例えばマンガン、マグネシウム、カルシウム、亜鉛、コバルトまたはニッケルのような二価陽イオン）およびグリセロールのような安定剤の非存在下で、酵素活性を保持するという驚くべき発見に基づく。以前は、二価金属補助因子は酵素活性に決定的であると考えられてきた。本発明による糖転移酵素組成物は、生存細胞のグリカンの修飾において特に有用である。生存細胞のグリカン構造を修飾する以前の試みは、金属補助因子およびグリセロールのような酵素安定剤の毒性効果のために、細胞死および細胞の表現型の変化を引き起こした。エキソビボにおける、糖転移酵素を用いた生存細胞表面グリカンのカスタムエンジニアリングのために、処理後に標的細胞が生きたままであり、そして表現型が保存されることが重要である。幹細胞を利用する適用において、酵素処理によって、特徴的な系列にそった分化が影響を受けるかどうかを分析することも重要である。
【００２３】
細胞生存性に対するその認識された効果の他に（２０）、Ｍｎ＋＋のような二価金属補助因子は、それ自身がシグナル伝達を引き起こし（２１）、そしてインテグリン接着（例えばＶＬＡ−４に関して）を、強制糖鎖付加（例えばフコシル化）で採用されるものよりもずっと下のレベルで活性化する（２２、２３）。できたインテグリンによる強固な接着は、内皮ベッドおよび関連リガンドを発現する組織実質内で広く現れるので、これらのＭｎ＋＋効果は、細胞輸送に対する糖鎖付加の効果に対する交絡因子である。
【００２４】
これらの問題に取り組むために、Ｐｉｃｈｉａ Ｐａｓｔｏｒｉｓ系における高力価のフコシル基転移酵素産生の新規方法を開発した。さらに、フコシル基転移酵素を、細胞毒性を最低限にするために特に選択された緩衝液（例えばＨＢＳＳ）中で、安定化させた。さらに、二価金属補助因子を入れずに（例えばＭｎ＋＋イオンを入れずに）、結合反応で生理学的緩衝液を利用するために、酵素条件を改良した。
【００２５】
これらの実験的修飾は、ＭＳＣ上のＣＤ４４の高い効率のフコシル化を引き起こし、酵素処理後の細胞生存性は１００％であった。重要なことに、強制フコシル化後の動態分析は、インビトロの細胞生存性は、全てのＭＳＣにおいて処理後無期限に保持されたが、ＨＣＥＬＬ発現は一過性であることを示した：ＨＣＥＬＬレベルは２４時間の間安定であり、そしてその後９６時間までにベースライン（ＨＣＥＬＬなし）まで着実に減少し、おそらく膜ＣＤ４４の細胞ターンオーバーを反映する。重要なことに、処理後２週間まで毎日アッセイして、ＦＴＶＩ処理後、様々な系統へのＭＳＣの分化には影響はなかった。従って、ＦＴＶＩ処理は、ＨＣＥＬＬ発現のみを例外として、ＭＳＣの表現型に明らかな影響を有さなかった（図２ｃ）。対照的に、市販で入手可能なＦＴＶＩ（例えばＭｎ＋＋およびグリセロールを含む組成物；Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）由来のＭＳＣのＦＴＶＩ処理は、ＨＣＥＬＬ発現は増強したが、細胞生存性はこれらのＦＴＶＩ処理後に損傷を受け、修飾後８時間以内に＞９５％の細胞が死んだ。この生存性の喪失は、市販の酵素処方中の安定剤（例えばグリセロール）に対する暴露、および酵素反応に使用された高レベルのＭｎ＋＋（１０ｍＭ）に対する暴露のためであった。よって、本発明の組成物は、エキソビボで生存細胞の表面上のグリカンを操作して、ヒトへのインビボ投与に適当な治療製品を産生することを可能にする。
【００２６】
強制フコシル化の後、そして表面ＣＸＣＲ４の発現の欠如にも関わらず、静脈内注入されたＭＳＣは、血管Ｅ−セレクチンを構成的に発現する組織である、骨髄に強くホーミングした。これらの発見は、ＨＣＥＬＬをヒト骨髄ホーミング受容体として確立し、ＣＸＣＲ４の関与は骨髄輸送に必須ではないという直接的な証拠を提供し、そして多段階パラダイムに対する新しい展望を示す。
【００２７】
強制ＨＣＥＬＬ発現は、骨髄指向性を与えること、およびシアリダーゼ処理によるその機能的不活性化は、この効果を特異的に逆転させるという発見は、このＣＤ４４グリコフォームを「骨髄ホーミング受容体」として規定する。それ自体、エキソビボでＨＣＥＬＬ発現を注文に応じて修飾する能力は、臨床的移植におけるＨＳＰＣの生着の改善に、または細胞に基づく治療（例えば骨疾患のための）におけるＭＳＣの使用のために有用であり得る。より一般的に、そのデータは、細胞のＨＣＥＬＬ発現を強制することは、全身性伝達を、その内皮ベッドがＥ−セレクチンを発現する組織にまで促進し得ることを示唆する。従って、ＣＤ４４のα（２，３）シアル化グリコフォームの、このどちらかといえばわずかなフコース修飾の高い特異性および効率は、養子細胞療法のためにＨＣＥＬＬ発現を選択的にアップレギュレートする戦略に、先導する原理および技術を提供する。これを達成し得る容易さは、このアプローチの患者への迅速な移行は、直接であるべきであることを示唆する。Ｅ−セレクチンは主に、霊長類の影響された組織の、炎症および虚血の部位に提示されるので（２９、３０）、ＨＣＥＬＬ発現の調節は、再生治療のために、損傷／障害組織における前駆／幹細胞の指向性の移動および浸潤を引き起こし得る。幹細胞に基づく治療における意味を超えて、これらの発見はまた、免疫学的エフェクターおよび調節細胞のような他の細胞における、アップレギュレートされたＥ−セレクチンリガンド活性を、免疫疾患、感染性疾患、および癌治療を含む様々な生理学的および病理学的過程において標的化細胞移動を達成するために、いかに利用し得るかを試験する。
【００２８】
組成物
本発明は、生存細胞または細胞粒子の細胞表面グリカンの、エキソビボ修飾のための組成物を提供する。その組成物は、精製糖転移酵素ポリペプチドおよび二価金属補助因子を含まない生理学的に許容可能な溶液を含む。その組成物は、例えばグリセロールのような安定化化合物を含まない。糖転移酵素は、例えばフコシル基転移酵素、ガラクトシル基転移酵素、シアル酸転移酵素、およびＮ−アセチルグルコサミン転移酵素を含む。フコシル基転移酵素は、アルファ１，３フコシル基転移酵素ＩＩＩ、アルファ１，３フコシル基転移酵素ＩＶ、アルファ１，３フコシル基転移酵素ＶＩ、アルファ１，３フコシル基転移酵素ＶＩＩ、またはアルファ１，３フコシル基転移酵素ＩＸのような、アルファ１，３フコシル基転移酵素である。
【００２９】
任意で、その組成物はさらに、特定の糖転移酵素に適当な糖ドナーを含む。例えば、その糖転移酵素がフコシル基転移酵素である場合、ドナーはＧＤＰ−フコースである。一方、その糖転移酵素がシアル酸転移酵素である場合、ドナーはＣＭＰ−シアル酸である。当業者は、適当な糖ドナーを認識する。
【００３０】
その糖転移酵素は、生物学的に活性である。生物学的に活性によって、その糖転移酵素が、糖分子をドナーからアクセプターへ転移し得ることを意味する。例えば、その糖転移酵素は、ｐＨ６．５、３７℃において、１分あたり０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、１．０、１．５、２．０、２．５、５、１０またはそれ以上のμモルの糖を転移し得る。
【００３１】
生理学的に許容可能な溶液は、細胞に損傷、例えば死を引き起こさないあらゆる溶液である。例えば、細胞または細胞粒子の生存性は、本発明の組成物による治療後に、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上である。適当な生理学的に許容可能な溶液は、例えばハンクス平衡塩溶液（ＨＢＳＳ）、ダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）、ＨＥＰＥＳ緩衝液のようなグッド緩衝液（Ｎ．Ｅ．Ｇｏｏｄ、Ｇ．Ｄ．Ｗｉｎｇｅｔ、Ｗ．Ｗｉｎｔｅｒ、ＴＮ．Ｃｏｎｏｌｌｙ、Ｓ．ＩｚａｗａおよびＲ．Ｍ．Ｍ．Ｓｉｎｇｈ、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ５、４６７（１９６６）；Ｎ．Ｅ．Ｇｏｏｄ、Ｓ．Ｉｚａｗａ、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．２４、６２（１９７２）を参照のこと）、２−モルホリノエタンスルホン酸（ＭＥＳ）緩衝液、またはリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）を含む。
【００３２】
治療方法
本発明の組成物は、その生存細胞に対する低い毒性および高い酵素活性のために、細胞または細胞粒子の表面上のグリカンの、エキソビボまたはインビトロ修飾に有用である。さらに、本発明の組成物および方法を用いて産生された修飾細胞および粒子は、骨疾患、免疫疾患、感染性疾患、および癌治療薬を含む、様々な生理学的および病理学的過程において、標的化細胞移動を達成するために、治療環境において有用である。Ｆｅｄｅｒａｌ Ｄｒｕｇ Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ（ＦＤＡ）は、ヒト投与のための全ての最終細胞産物に、厳格な必要条件を課す。具体的には、ＦＤＡは、７０％の最低細胞生存性を要求し、そしてあらゆる過程は一貫してこの最低必要条件を超えなければならない。二価金属補助因子およびグリセロールのような安定剤（有意な細胞死を引き起こす）を含む、糖転移酵素組成物を利用した細胞表面のグリカンのエキソビボまたはインビトロ修飾の以前に記載された方法と違って、本明細書中で記載された方法は、ＦＤＡの必要条件を満たす、またはそれを超える、細胞に基づく製品を産生する。
【００３３】
より具体的には、細胞表面のグリカン操作は、Ｅ−セレクチンを発現するあらゆる部位に対する細胞のホーミングを促進する。特に、ＣＤ４４は普遍的に発現する細胞膜タンパク質であり、そして「成人」および胚性の型両方の幹／前駆細胞集団に提示されるので、このタンパク質の、エキソビボグリカン操作によって糖鎖付加を修飾してＨＣＥＬＬ（ＣＤ４４グリコフォーム）表現型を産生する能力は、インビボで血管内に注入された（養子性に伝達された）細胞の、骨髄またはＥ−セレクチンを発現するあらゆる組織／臓器部位に対する移動を促進する。
【００３４】
細胞の集団を、１つまたはそれ以上の本発明による糖転移酵素組成物と接触させることによって、細胞または細胞粒子（例えば血小板またはリポソーム）の表面上でグリカンを修飾する。糖転移酵素が酵素活性を有する条件下で、細胞を糖転移酵素組成物と接触させる。本発明によるグリカン修飾は、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の生存性を有する細胞を生ずる。トリパンブルー色素排除試験のような、当該分野で公知の方法によって、生存性を決定する。生存性を、処理の１時間、２時間、４時間、１８時間、１２時間、２４時間またはそれ以上後に測定する。細胞の表現型（グリカン修飾以外）は、処理後に保存される。保存された表現型によって、その細胞がそのもとの機能および／または活性を維持することを意味する。例えば、もしその細胞が幹細胞なら、それはその多能性を保持する。
【００３５】
修飾後、その細胞または細胞粒子は、Ｅ−セレクチンおよび／またはＬ−セレクチンに結合する。様々な局面において、その修飾細胞は、Ｐ−セレクチンには結合しない。好ましくは、修飾後、細胞は造血細胞Ｅ−／Ｌ−セレクチンリガンド（ＨＣＥＬＬ）として知られる、シアロフコシル化ＣＤ４４グリコフォームを発現する。修飾後、その細胞または細胞粒子は、インビボで骨髄および／または虚血または炎症の部位にホーミングし得る。
【００３６】
その細胞または細胞粒子は、細胞表面グリカン修飾が望ましいあらゆる細胞である。その細胞は幹細胞（すなわち多分化能）または分化細胞である。幹細胞は、例えば造血幹細胞、間葉系幹細胞、組織幹／前駆細胞（例えば神経幹細胞、筋幹細胞、または肺幹細胞）、臍帯幹細胞、または胚性幹細胞を含む。分化細胞は、白血球、例えばリンパ球のような造血系細胞を含む。リンパ球は、Ｂ−リンパ球またはＴ−リンパ球、またはＴ−リンパ球のサブセット、例えば「調節性」リンパ球（ＣＤ４＋／ＣＤ２５＋／ＦＯＸＰ３＋）であり得る。
【００３７】
その細胞または細胞粒子は、ＣＤ４４を発現する。そのＣＤ４４はシアロフコシル化されていない。あるいは、そのＣＤ４４はアルファ（２，３）−シアル化され、そしてＨＣＥＬＬ表現型を与える、関連するフコシル化を欠く。ＨＣＥＬＬを与えるためのＣＤ４４の強制糖鎖付加は、臨床的造血幹細胞移植において、造血幹／前駆細胞（ＨＳＰＣ）の生着の改善において、または細胞に基づく治療（例えば骨疾患のための）におけるＭＳＣの使用のために有用である。より一般的には、そのデータは、細胞ＨＣＥＬＬ発現を強制することは、ＨＣＥＬＬを有する細胞の、その内皮ベッドがＥ−セレクチンを発現する組織への全身性伝達を促進し得ることを示唆する。
【００３８】
様々な局面において、細胞はＰＳＧＬ−１、ＣＤ３４、または両方を発現しない。
【００３９】
本発明の修飾細胞は、その増加したホーミング能力のために、例えば臨床的移植におけるＨＳＰＣの生着の改善において、細胞に基づく治療（例えば骨疾患のための）におけるＭＳＣの使用のために、または再生治療のために損傷／障害組織における前駆／幹細胞の移動および浸潤を指示するために有用である。
【００４０】
例えば、その組成物は、虚血性状態（例えば四肢の虚血、うっ血性心不全、心虚血、腎臓虚血およびＥＳＲＤ、脳卒中、および眼の虚血）、臓器または組織の再生（例えば肝臓、膵臓、肺、唾液腺、血管、骨、皮膚、軟骨、腱、靭帯、脳、毛髪、腎臓、筋肉、心筋、神経および四肢の再生）を必要とする状態、炎症性疾患（例えば心疾患、糖尿病、脊髄損傷、慢性関節リウマチ、変形性関節症、人工股関節置換術または修正のための炎症、クローン病、および移植片対宿主病）、自己免疫疾患（例えば１型糖尿病、乾癬、全身性ループス、および多発性硬化症）、変性性疾患、先天性疾患、貧血、好中球減少症、血小板増加症、骨髄増殖性疾患、または白血病のような血液学的新生物および癌のような血液学的疾患のような、様々な疾患および異常を治療するために有用である。
【００４１】
その必要がある患者に、本発明の方法によって産生された細胞組成物を投与することによって、疾患および異常を治療する、または症状を軽減する。その細胞組成物を、同種間で、または自己に投与する。
【実施例】
【００４２】
実施例１：一般的な方法
試薬：以下の抗体はＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ由来であった：機能阻害マウス抗ヒトＥ−セレクチン（６８−５４１１；ＩｇＧ１）、ラット抗ヒトＣＬＡ（ＨＥＣＡ−４５２；ＩｇＭ）、マウス抗ヒトＰＳＧＬ−１（ＫＰＬ−１；ＩｇＧ１）、精製およびＦＩＴＣ結合マウス抗ヒトＬ−セレクチン（ＤＲＥＧ−５６；ＩｇＧ１）、マウス抗ヒトＣＸＣＲ４（１２Ｇ５；ＩｇＧ２ａ）、ＦＩＴＣ結合マウス抗ヒトＣＤ１８（Ｌ１３０；ＩｇＧ１）、マウス抗ヒトＣＤ２９（ＭＡＲ４；ＩｇＧ１）、ＰＥ結合マウス抗ヒトＣＤ４９ｄ（９Ｆ１０；ＩｇＧ１）、マウスＩｇＧ１、κアイソタイプ、マウスＩｇＧ２ａアイソタイプ、マウスＩｇＭアイソタイプ、ラットＩｇＧアイソタイプおよびラットＩｇＭアイソタイプ。ラット抗ヒトＣＤ４４（Ｈｅｒｍｅｓ−１；ＩｇＧ２ａ）は、Ｄｒ．Ｂｒｅｎｄａ Ｓａｎｄｍａｉｅｒ（Ｆｒｅｄ Ｈｕｔｃｈｉｎｓｏｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ；Ｓｅａｔｔｌｅ、ＷＡ）から寄贈された。組み換えマウスＢ−セレクチン／ヒトＩｇキメラ（Ｅ−Ｉｇ）およびマウス抗ヒトＣＤ４４（２Ｃ５；ＩｇＧ２ａ）は、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ由来であった。マウス抗ヒトｓＬｅｘ（ＫＭ９３；ＩｇＭ）はＣａｌｂｉｏｃｈｅｍ由来であった。ＦＩＴＣ結合マウス抗ヒトＣＤ１１ａ（２５．３；ＩｇＧ１）、ＰＥ結合マウスＩｇＧ１、κアイソタイプおよびＦＩＴＣ結合マウスＩｇＭアイソタイプは、Ｃｏｕｌｔｅｒ−Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈ由来であった。ＦＩＴＣ結合ヤギ抗ラットＩｇＭ、ＦＩＴＣ結合ヤギ抗マウスＩｇＧ、ＦＩＴＣ結合ヤギ抗マウスＩｇＭ、ＰＥ結合ストレプトアビジン、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）結合抗ラットＩｇＭ、抗マウスＩｇ、および抗ヒトＩｇは、Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ由来であった。Ｖ．ＣｈｏｌｅｒａｅシアリダーゼはＲｏｃｈｅ由来であった。
【００４３】
ヒト細胞：骨髄（ＢＭ）細胞は、Ｂｒｉｇｈａｍ ＆ Ｗｏｍｅｎ’ｓ Ｈｏｓｐｉｔａｌ／Ｄａｎａ Ｆａｒｂｅｒ Ｃａｎｃｅｒ ＩｎｓｔｉｔｕｔｅおよびＭａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｈｏｓｐｉｔａｌにおいて、造血幹細胞移植のために骨髄を提供した健康な個人の採取フィルターから得た。ＢＭ単核細胞（ＢＭＭＮＣ）を、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ密度勾配遠心によって採取した。ヒト細胞を、Ｈｕｍａｎ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｅｔｈｉｃｓ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅｓ ｏｆ Ｐａｒｔｎｅｒｓ Ｃａｎｃｅｒ Ｃａｒｅ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎｓ［Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｈｏｓｐｉｔａｌ、Ｂｒｉｇｈａｍ ＆ Ｗｏｍｅｎ’ｓ Ｈｏｓｐｉｔａｌ ａｎｄ Ｄａｎａ Ｆａｒｂｅｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（Ｂｏｓｔｏｎ、ＭＡ）］によって許可されたプロトコールに使用した。ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）を、Ｂｒｉｇｈａｍ ＆ Ｗｏｍｅｎ’ｓ Ｈｏｓｐｉｔａｌ’ｓ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔの組織培養コア施設から得て、そして１５％のＦＢＳ、５ユニット／ｍｌのヘパリン、５０μｇ／ｍｌの内皮増殖因子および１％のペニシリン／ストレプトマイシンを添加したＭ１９９で維持した。Ｅ−セレクチンの発現を刺激するために、ＨＵＶＥＣのコンフルエントな単層を、接着研究において使用する前に、１ｎｇ／ｍｌのＩＬ−１β（Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｉｎｃ；Ｃｏｎｃｏｒｄ、ＭＡ）および１０ｎｇ／ｍｌのＴＮＦ−α（Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．）で、４−６時間前処理した。
【００４４】
ＭＳＣ培養：ＭＳＣを、９５％空気、５％ＣＯ２雰囲気下で（（１５）により）、または３％Ｏ２、５％ＣＯ２、９２％Ｎ２において（（１６）により、「ＭＩＡＭＩ」細胞）、加湿インキュベーター中で、３７℃で維持した。ＭＳＣのいずれかの型の培養のために、ＢＭＭＮＣを最初に２×１０５／ｃｍ２の濃度で、選択したロットから１０％の胎児ウシ血清（ＦＢＳ）を添加したＤＭＥＭ−低グルコース培地にまいた。数日後、非接着細胞を除去し、そして接着細胞を、０．０５％のトリプシン／０．５ｍＭのＥＤＴＡ／ＨＢＳＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．）で処理することによって回収し、そして５０細胞／ｃｍ２の密度で再びまいた。培地を４８から７２時間に、そしてその後３または４日ごとに交換した。密度が４０％コンフルエントに近づいた場合に細胞を再びまいた。全ての実験に関して、ＭＳＣを最初の３継代以内に使用し、そして０．０５％のトリプシン／０．５ｍＭのＥＤＴＡ／ＨＢＳＳで、３７℃で３分以下の間処理することによって回収した。
【００４５】
ＳＡＣＫ−１ ｍＡｂの産生：抗ＣＤ４４ｍＡｂを用いた細胞溶解物のイムノアフィニティークロマトグラフィーによって、ＨＣＥＬＬをＫＧ１ａ細胞から単離した。ＢＡＬＢ／ｃマウスに、接種材料を皮膚および腹腔内部位に５０：５０で分けて、完全フロイントアジュバント中の純粋ＨＣＥＬＬ（１：１エマルション）を注射した。不完全フロイントアジュバント中で１：１に希釈し、そして腹腔内に注射した純粋ＨＣＥＬＬで、２週間後に追加免疫を行った。１０−１４日後、５μｇのＨＣＥＬＬのＩＶ注射によってマウスを追加免疫し、次いでＩＶ追加免疫の３日後に脾臓を採取した。脾臓細胞をＮＳＯ骨髄腫細胞と融合した。最初にハイブリドーマ上清のスクリーニングを、造血細胞系統ＫＧ１ａ（ＣＤ４４＋／ＨＣＥＬＬ＋／ＨＥＣＡ４５２＋）、ＨＬ６０（ＣＤ４４＋／ＨＣＥＬＬ−／ＨＥＣＡ４５２＋）、ＲＰＭＩ８４０２（ＣＤ４４＋／ＨＣＥＬＬ−／ＨＥＣＡ４５２−）、ＪＵＲＫＡＴおよびＫ５６２（両方ともＣＤ４４−／ＨＣＥＬＬ−／ＨＥＣＡ４５２−）に対して、フローサイトメトリーによって行った。ＳＡＣＫ−１ｍＡｂを、ＣＤ４４−細胞系統ではなくＫＧ１ａに対する反応性によって、Ｎ−グリコシダーゼＦ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ；Ｎ−グリコシダーゼＦ消化は以前に記載されたように行った（１０、１２））による消化に感受性の、ＫＧ１ａ細胞に発現するＣＤ４４に対する単一特異性のウェスタンブロットの証拠と組み合わせて、「ＣＤ４４−特異的、炭水化物特異的」として同定した。
【００４６】
フローサイトメトリー：細胞のアリコート（２×１０５細胞）を、ＰＢＳ／２％ＦＢＳで洗浄し、そして一次ｍＡｂまたはアイソタイプコントロールｍＡｂ（未結合または蛍光色素結合のいずれか）とインキュベートした。細胞をＰＢＳ／２％ＦＢＳで洗浄し、そして間接的免疫蛍光のために、適当な二次蛍光色素結合抗アイソタイプ抗体とインキュベートした。細胞を洗浄した後、ＦＩＴＣまたはＰＥ蛍光強度を、Ｃｙｔｏｍｉｃｓ ＦＣ５００ＭＰＬフローサイトメーター（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｉｎｃ．、Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ、ＣＡ）を用いて決定した。
【００４７】
ヒトα（１，３）−フコシル基転移酵素ＶＩの組み換え発現および処方：オンラインメタノール検知（Ｒａｖｅｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ、Ｃａｎａｄａによる滅菌可能メタノールセンサー）およびＡｌｉｔｅａ−ポンプ（Ａｌｉｔｅａ Ａ．Ｂ．、Ｓｔｏｃｋｈｏｌｍ、Ｓｗｅｄｅｎ）によるメタノール添加の調節を用いて、ヒトα（１，３）−フコシル基転移酵素ＶＩ（ＦＴＶＩ）遺伝子およびＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ α因子のＮ末端シグナル配列を含むＰｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ ＫＭ７１（ａｒｇ４ｈｉｓ４ａｏｘ１：ＡＲＧ４）宿主系統を、高度に活性なα（１，３）−フコシル基転移酵素ＶＩの安定した発現および培地への分泌のために使用した。発酵の終了後、ブロスを１０℃に冷却し、そしてＰｉｃｈｉａ細胞を、０．２μｍの膜を有するＰｅｌｌｉｃｏｎ−微量ろ過システムによって分離し、そして続いて、最終的な処方を、１０ｋＤ−ＵＦ−膜（再生セルロース）を有するＰｅｌｌｉｃｏｎ−限外ろ過システムを用いて、ＨＢＳＳによる緩衝液交換によって達成した。
【００４８】
ヒトシアル酸転移酵素の組み換え発現および処方：オンラインメタノール検知（Ｒａｖｅｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ、Ｃａｎａｄａによる滅菌可能メタノールセンサー）およびＡｌｉｔｅａ−ポンプ（Ａｌｉｔｅａ Ａ．Ｂ．、Ｓｔｏｃｋｈｏｌｍ、Ｓｗｅｄｅｎ）によるメタノール添加の調節を用いて、ヒトシアル酸転移酵素遺伝子およびＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ α因子のＮ末端シグナル配列を含むＰｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ ＫＭ７１（ａｒｇ４ｈｉｓ４ａｏｘ１：ＡＲＧ４）宿主系統を、高度に活性なシアル酸転移酵素の安定した発現および培地への分泌のために使用した。発酵の終了後、ブロスを１０℃に冷却し、そしてＰｉｃｈｉａ細胞を、０．２μｍの膜を有するＰｅｌｌｉｃｏｎ−微量ろ過システムによって分離し、そして続いて、最終的な処方を、１０ｋＤ−ＵＦ−膜（再生セルロース）を有するＰｅｌｌｉｃｏｎ−限外ろ過システムを用いて、ＨＢＳＳによる緩衝液交換によって達成した。
【００４９】
ヒト糖転移酵素の組み換え発現および処方：オンラインメタノール検知（Ｒａｖｅｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ、Ｃａｎａｄａによる滅菌可能メタノールセンサー）およびＡｌｉｔｅａ−ポンプ（Ａｌｉｔｅａ Ａ．Ｂ．、Ｓｔｏｃｋｈｏｌｍ、Ｓｗｅｄｅｎ）によるメタノール添加の調節を用いて、ヒト糖転移酵素遺伝子およびＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ α因子のＮ末端シグナル配列を含むＰｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ ＫＭ７１（ａｒｇ４ｈｉｓ４ａｏｘ１：ＡＲＧ４）宿主系統を、高度に活性な糖転移酵素の安定した発現および培地への分泌のために使用した。発酵の終了後、ブロスを１０℃に冷却し、そしてＰｉｃｈｉａ細胞を、０．２μｍの膜を有するＰｅｌｌｉｃｏｎ−微量ろ過システムによって分離し、そして続いて、最終的な処方を、１０ｋＤ−ＵＦ−膜（再生セルロース）を有するＰｅｌｌｉｃｏｎ−限外ろ過システムを用いて、ＨＢＳＳによる緩衝液交換によって達成した。
【００５０】
ヒトＮ−アセチルグルコサミン転移酵素の組み換え発現および処方：オンラインメタノール検知（Ｒａｖｅｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ、Ｃａｎａｄａによる滅菌可能メタノールセンサー）およびＡｌｉｔｅａ−ポンプ（Ａｌｉｔｅａ Ａ．Ｂ．、Ｓｔｏｃｋｈｏｌｍ、Ｓｗｅｄｅｎ）によるメタノール添加の調節を用いて、ヒトＮ−アセチルグルコサミン転移酵素遺伝子およびＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ α因子のＮ末端シグナル配列を含むＰｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ ＫＭ７１（ａｒｇ４ｈｉｓ４ａｏｘ１：ＡＲＧ４）宿主系統を、高度に活性なＮ−アセチルグルコサミン転移酵素の安定した発現および培地への分泌のために使用した。発酵の終了後、ブロスを１０℃に冷却し、そしてＰｉｃｈｉａ細胞を、０．２μｍの膜を有するＰｅｌｌｉｃｏｎ−微量ろ過システムによって分離し、そして続いて、最終的な処方を、１０ｋＤ−ＵＦ−膜（再生セルロース）を有するＰｅｌｌｉｃｏｎ−限外ろ過システムを用いて、ＨＢＳＳによる緩衝液交換によって達成した。
【００５１】
ＦＴＶＩおよびシアリダーゼ処理：コンフルエントな単層または懸濁液中のＭＳＣを、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ、０．１％のヒト血清アルブミンおよび１ｍＭのグアノシン２リン酸（ＧＤＰ）−フコースを含むＨＢＳＳ中、６０ｍＵ／ｍＬのＦＴＶＩで、３７℃で４０分間処理した。インキュベーション後、ＭＳＣを、０．２％のＢＳＡおよび２０ｍＭのＨＥＰＥＳを含むＨＢＳＳで洗浄した。次いで未処理およびＦＴＶＩ処理ＭＳＣを実験に使用した。いくつかの実験において、ＭＳＣをまずＦＴＶＩで処理し、そして次いでシアリダーゼ処理（１００ｍＵ／ｍｌのＶ．Ｃｈｏｌｅｒａｅシアリダーゼ、１時間、３７℃）した（「ＦＴＶＩ−シアリダーゼＭＳＣ」）。シアリダーゼ処理の効率を、フローサイトメトリーによる、ＫＭ９３およびＨＥＣＡ４５２に対する反応性の喪失によって、各例において確認した。
【００５２】
シアル酸転移酵素処理：細胞を、６０ｍＵ／ｍＬのＮ−シアル酸転移酵素、１ｍＭのＣＭＰ−シアル酸で、または緩衝液単独（ＨＢＳＳ、０．１％ヒト血清アルブミン）で、３７℃で１時間処理する。インキュベーション後、細胞を、０．２％のＢＳＡおよび２０ｍＭのＨＥＰＥＳを含むＨＢＳＳで洗浄する。
【００５３】
ガラクトシル基転移酵素処理：細胞を、６０ｍＵ／ｍＬのガラクトシル基転移酵素、１ｍＭのＵＤＰ−ガラクトースで、または緩衝液単独（ＨＢＳＳ、０．１％ヒト血清アルブミン）で、３７℃で１時間処理する。インキュベーション後、細胞を、０．２％のＢＳＡおよび２０ｍＭのＨＥＰＥＳを含むＨＢＳＳで洗浄する。
【００５４】
Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素処理：細胞を、６０ｍＵ／ｍＬのＮ−アセチルグルコサミン転移酵素、１ｍＭのＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミンで、または緩衝液単独（ＨＢＳＳ、０．１％ヒト血清アルブミン）で、３７℃で１時間処理する。インキュベーション後、細胞を、０．２％のＢＳＡおよび２０ｍＭのＨＥＰＥＳを含むＨＢＳＳで洗浄する。
【００５５】
ウェスタンブロット分析：未処理およびＦＴＶＩ処理ＭＳＣを、緩衝液Ａ（１５０ｍＭのＮａＣｌ、５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．４．１ｍＭのＥＤＴＡ、２０μｇ／ｍｌのＰＭＳＦ、０．０２％のアジ化ナトリウム、およびプロテアーゼ阻害剤カクテル錠（Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ））中、２％のＮＰ−４０を用いて溶解した。定量したタンパク質溶解物または免疫沈降タンパク質のウェスタンブロットを、以前に記載されたように（１０）、還元条件下で行った。
【００５６】
免疫沈降研究：未処理またはＦＴＶＩ処理ＭＳＣの細胞溶解物を、免疫沈降抗体または適当なアイソタイプコントロールとインキュベートし、そして次いでプロテインＧ−アガロースとインキュベートした。免疫沈降物を、２％のＮＰ−４０、１％のＳＤＳを含む緩衝液Ａを用いて徹底的に洗浄した。いくつかの実験において、免疫沈降物を、以前に記載されたように（１０、１２）Ｎ−グリコシダーゼＦ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）で処理した。ウェスタンブロット分析のために、全ての免疫沈降物を、還元サンプル緩衝液で希釈し、沸騰させ、次いでＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけ、ＰＶＤＦ膜に転写し、そしてＨＥＣＡ−４５２、Ｅ−Ｉｇ、ＳＡＣＫ−１、または２Ｃ５で免疫染色した（１０）。
【００５７】
パラレルプレートフローチャンバー接着アッセイ：未処理およびＦＴＶＩ処理ＭＳＣのＥ−セレクチン結合能力を、パラレルプレートフローチャンバー（Ｇｌｙｃｏｔｅｃｈ；Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）を用いて評価した。ＭＳＣ（０．５×１０６細胞／ｍｌ、ＨＢＳＳ／１０ｍＭのＨＥＰＥＳ／２ｍＭのＣａＣｌ２溶液に懸濁）を、コンフルエントなＨＵＶＥＣ単層の上に伸ばした。最初、ＭＳＣをＨＵＶＥＣと０．５ｄｙｎｅ／ｃｍ２のせん断ストレスで接触させ、続いて０．５から３０ｄｙｎｅ／ｃｍ２のせん断ストレスを及ぼすように、流速を調整した。ＨＵＶＥＣ単層に接着性の未処理またはＦＴＶＩ処理ＭＳＣの数を、０．５、１、２、５、１０、２０および３０ｄｙｎｅ／ｃｍ２のせん断ストレスで、最終的に１５秒の間隔で定量した。各アッセイを少なくとも３回行い、そして値を平均した。セレクチン結合に必要なＣａ２＋をキレート化するために５ｍＭのＥＤＴＡをアッセイ緩衝液に加えることによって、または接着アッセイで使用する前に、ＨＵＶＥＣを機能阻害抗ヒトＥ−セレクチンｍＡｂ（６８−５４１１）で、３７℃で１５分処理することによって、コントロールアッセイを行った。
【００５８】
インビボホーミング：全ての研究を、動物のケアおよび使用に関するＮＩＨのガイドラインに従って、およびＩｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｈｏｓｐｉｔａｌ ａｎｄ ｔｈｅ Ｈａｒｖａｒｄ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｃｈｏｏｌの許可の下で行った。生体内顕微鏡検査のために、以前に記載されたように（５）、ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスを麻酔し、そして頭皮に小さい切開をして下にある背側頭蓋骨表面を露出した。ＭＳＣの４つのグループ（各グループｎ＝４）：（１）ＦＴＶＩ処理（上記のように）ＭＳＣ；（２）緩衝液処理ＭＳＣ；（３）シアリダーゼで消化した（１００ｍＵ／ｍｌ、Ｖ．Ｃｈｏｌｅｒａｅシアリダーゼ、３７℃、１時間）ＦＴＶＩ処理ＭＳＣ；および（４）未処理ＭＳＣのそれぞれを分析するために、同腹仔を用いて同じ日に実験を行った。細胞を、蛍光親油性トレーサー色素ＤｉＤ（１０μＭ、３７℃、３０分；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）で染色し、そしてＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスの尾静脈に注入した。傍矢状領域におけるＭＳＣの骨髄微小血管内皮細胞との相互作用を、以前に記載されたように（５）、ビデオレートイメージングと組み合わせた順次走査および光学切片を用いたインビボ共焦点顕微鏡によって、注射後の異なる時点においてモニターおよび画像化した。骨髄の脈管構造を描写するために、長時間循環蛍光量子ドット（Ｑｔｒａｃｋｅｒ８００、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を、画像化の直前に全身性に注射した。Ｑｔｒａｃｋｅｒ８００のストック溶液（２μＭ）を１：４に希釈し（５０μＬを１５０μＬのＰＢＳ１×と混合する）、そして麻酔マウス尾静脈に注射した。マウス頭蓋骨骨髄のインビボ共焦点顕微鏡検査を、以前に記載されたように（５）行った。ＤｉＤ標識細胞を、６３３ｎｍの固体レーザーで励起し、そして６９５ｎｍで中心に置いた４５ｎｍのバンドパスフィルターで画像化し、一方量子ドットを固体Ｎｄ：ＹＡＧレーザーで５３２ｎｍにおいて励起し、そして７７０ｎｍのロングパスフィルターで画像化した。
【００５９】
実施例２：ヒト間葉系幹細胞は、ＣＤ４４のＮ−結合シアル化グリコフォームを発現し、そしてセレクチンに結合しない
骨髄は、２つの幹細胞の集団、造血幹細胞および間葉系幹細胞（ＭＳＣ）を含む。ＭＳＣは、正常骨髄内に存在する細胞の小集団を表すが、それらを単離および培養中で増殖させ得る。ＭＳＣは特徴的にＣＤ４４および造血細胞において見出されるいくつかの他の接着分子を発現する（１４）。しかし、これらの原始的非造血細胞が、セレクチンリガンドを発現しているかどうかは不明である。このデータの不足、およびＨＣＥＬＬは最も初期の造血細胞（ＣＤ３４＋／ｌｉｎ−細胞）にのみ発現するという発見（１０、１１）が、ＭＳＣがセレクチンに結合し得る、ＣＤ４４上の同様の炭水化物修飾を示すかどうかを調査するよう私たちを刺激した。
【００６０】
ＭＳＣを、２つの確立された、公開されたプロトコール（１５、１６）に従って、ヒト骨髄から培養した。両方の方法を用いて得られたＭＳＣは、以前に記載されたように（１５、１６）、脂肪細胞、骨細胞、および線維芽細胞分化に向けて、多分化能の分化をし得た。プロトコールに関わらず、ＭＳＣは、測定された細胞表面マーカーのいずれにおいても、または酵素的処理に対する反応においても、有意な差は示さなかった。フローサイトメトリー（図１ｃ）によって、ＭＳＣはＰＳＧＬ−１、またはセレクチンリガンドとして作用し得るシアロフコシル化決定基を欠いていた：特に、フローサイトメトリーおよびウェスタンブロットの両方によって、細胞はｍＡｂＫＭ９３またはＨＥＣＡ４５２（これらはそれぞれシアリルルイスＸを同定する）、およびＥ−Ｉｇに対する反応性を欠いていた（図１ｃ、２ａ、および２ｂ）。さらに、両方の型のＭＳＣは、ＬＦＡ−１（ＣＤ１１ａ／ＣＤ１８）を欠いていたが、別のインテグリン、ＶＬＡ−４（ＣＤ４９ｄ／ＣＤ２９）を発現していた（図１ｃ）。ＶＬＡ−４は、血管内皮における回転相互作用および安定した接着を媒介し得るが（１７）、これらの接着機能はどちらも、通常ＳＤＦ−１／ＣＸＣＲ４経路によって媒介される「インサイドアウト」活性化を必要とする（１８）。重要なことに、プレートにおける、およびフローサイトメトリーによる接着ＭＳＣの免疫蛍光染色の分析は、ＣＸＣＲ４の発現を示さず（図１ｃ）、そして予想通り、ＭＳＣは静的または流れに基づくアッセイのいずれにおいても、ＳＤＦ−１に反応して移動しなかった（示していない）。
【００６１】
ＣＤ４４の発現は、多くのドナーから単離された全てのＭＳＣで高かった（図１ｃ）。顕著に、ＳＡＣＫ−１反応性も、全てのドナー由来の全てのＭＳＣで高く（図１ｃ）、これらの細胞は一様にＣＤ４４のＮ−結合、シアル酸付加グリコフォームを発現していることを示す。もともとセレクチンリガンドを欠くが、シアル酸付加ＣＤ４４アクセプターが存在するので、ＭＳＣは、ＨＣＥＬＬ発現が骨髄への細胞輸送にどのように影響するか調べるために理想的な細胞型であった。
【００６２】
実施例３：間葉系幹細胞のエキソビボフコシル化はＨＣＥＬＬの発現を引き起こす
ＨＣＥＬＬ発現を強制するために、ＭＳＣをエキソビボでα（１，３）−フコシル基転移酵素、フコシル基転移酵素ＶＩ（ＦＴＶＩ）で処理した。全てのドナーから培養した全てのＭＳＣにおいて、強制フコシル化は、ｍＡｂ ＨＥＣＡ４５２およびＫＭ９３による著明な染色を引き起こし、シアリルルイスＸエピトープの発現と一致していた（図２ａ）。細胞溶解物およびＦＴＶＩ処理ＭＳＣ由来の免疫沈降ＣＤ４４のウェスタンブロットは、ＨＥＣＡ４５２によって認識される必要なシアロフコシル化を有する唯一の糖タンパク質がＣＤ４４であることを明らかにした（図２ｂおよび２ｃ）。さらに、フローサイトメトリーによって、フコシル化ＭＳＣはＥ−Ｉｇに結合しており、そして細胞溶解物のウェスタンブロット分析は、Ｅ−Ｉｇ結合を支持する唯一の糖タンパク質がＣＤ４４であることを示した（図２）。関連するＨＣＥＬＬのシアロフコシル化は、Ｎ−グリコシダーゼＦによる消化後のＥ−Ｉｇ結合の抑止によって示されるように、Ｎ−グリカン上に示された（図２ｃ）。
【００６３】
生理学的な血流条件下で、ＦＴＶＩ処理ＭＳＣのＥ−セレクチンリガンド活性を分析するために、Ｅ−セレクチンを発現するようサイトカインで刺激したヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）を用いて、パラレルプレートフローチャンバー研究を行った。図３に示すように、ＦＴＶＩ処理ＭＳＣは、著明なＥ−セレクチンリガンド活性を示し、それはＥＤＴＡの存在下で、およびＭＳＣをシアリダーゼで処理することによって完全に抑止された。もともとＨＣＥＬＬを発現する細胞の以前の研究と一致して、通常の後毛細管細静脈せん断レベル（１−４ｄｙｎｅ／ｃｍ２）で、確固としたせん断抵抗相互作用が観察され、ＰＳＧＬ−１がＥ−セレクチン結合を支持し得る範囲をはるかに超えて、２０ｄｙｎｅ／ｃｍ２より上において持続した（１０）。これらのデータは、ＭＳＣ表面のフコシル化によって産生されたＨＣＥＬＬは、ＫＧ１ａ細胞およびヒト造血前駆細胞の表面にもともと示されるものと機能的に同様であることを示した（１０、１１）。
【００６４】
実施例４：ＨＣＥＬＬの発現は、インビボでＭＳＣの骨髄へのホーミングを増強した
ＨＣＥＬＬの発現がインビボでＭＳＣの骨髄へのホーミングを増強するかどうかを決定するために、我々はダイナミックリアルタイム共焦点顕微鏡を採用して、生存免疫欠損マウス（ＮＯＤ／ＳＣＩＤ）宿主の頭蓋冠の骨髄類洞血管を可視化した（５）。４つのグループの細胞を、それぞれの宿主の尾静脈に注射した：（１）ＦＴＶＩ処理ＭＳＣ、（２）シアリダーゼで消化したＦＴＶＩ処理ＭＳＣ（「ＦＴＶＩ−シアリダーゼＭＳＣ」）、（３）緩衝液処理ＭＳＣ、および（４）未処理ＭＳＣ。インビボ顕微鏡研究は、ＦＴＶＩ処理、ＨＣＥＬＬ発現ＭＳＣは、骨髄類洞血管を直接回転し、そして注入から数時間以内に、骨髄実質に迅速に浸潤したことを示した（図４）。対照的に、未処理ＭＳＣおよび緩衝液処理ＭＳＣは、類洞内皮と最低限の結合相互作用を示し、そして中程度の浸潤のみを示し、一方ＦＴＶＩ−シアリダーゼＭＳＣは、典型的にはさらに低いレベルの内皮相互作用および骨髄浸潤を示した（図４）。後者の発見は、ホーミングにおけるＨＣＥＬＬの決定的な役割を強調し、そしてまたＦＴＶＩ処理後の骨髄指向性は、フコシル化それ自体または他の接着分子の間接的な影響の結果ではなく、（２，３）シアル酸の発現およびα（１，３）フコース修飾を同時に必要とする、誘導されたセレクチンリガンド活性の結果のみであることを示す。ＭＳＣおよび血管の同時染色によって得られた画像は、ＨＣＥＬＬ＋ＭＳＣが骨髄実質に浸潤したことを明らかに示す（図４）。本明細書中の研究は、骨髄輸送を促進する類洞リガンドの発現を著しく増強する、レシピエント動物の照射または他の予備操作の使用によるような、損傷を誘発せずに行われたことを考えると、観察された骨髄浸潤は印象的である（２７）。まとめると、これらのデータは、ＨＣＥＬＬ発現はＭＳＣの骨髄へのホーミングを直接的に増強するという決定的な証拠を提供する。
【００６５】
基準の多段階パラダイムにおいて、内皮におけるホーミング受容体による回転相互作用は、安定した接着、続く遊出を引き起こす、インテグリン接着のＧ−タンパク質共役アップレギュレーションに決定的であると考えられる、ケモカインへの接触を促進する（３）。特に、本明細書中で使用したＭＳＣは、ＣＸＣＲ４を有さない、または骨髄ホーミングを調節する主なケモカインであるＳＤＦ−１への走化性がない（４、５）。従って、これらの細胞の骨髄へ浸潤する能力は、ＣＸＣＲ４の関与は、骨髄輸送に必須ではないことを示す。しかし、第１段階の相互作用は、細胞のあらゆる組織への輸送のために不可欠であり、そしてここで示したように、Ｅ−セレクチンリガンド活性の増強は、骨髄ホーミングを促進する。より広い観点から、我々の発見は、安定した接着および内皮を超える移動を伴うインテグリン接着を誘発するために、ホーミング受容体の関与は単独で（すなわちケモカインシグナル伝達の非存在下で）十分であり得ることを示す、増加する実験的証拠と一致する（１）。特に、リンパ球上のＣＤ４４それ自身のライゲーションが、ケモカインの関与なしで遊出を引き起こす、ＶＬＡ−４接着の直接的な、相乗的アップレギュレーションを引き起こすことが発見された（２８）。この軸が他の細胞型で作用するどうかを決定するためには将来の研究が必要であるが、ＭＳＣが特徴的にＶＬＡ−４を発現するという事実（図１ｃ）は、この可能性を高める。
【００６６】
実施例５：神経幹細胞のインビボフコシル化
神経幹細胞を、６０ｍＵ／ｍＬのＦＴ−ＶＩ、１ｍＭのＧＤＰ−フコースで、または緩衝液単独（ＨＢＳＳ、０．１％ヒト血清アルブミン）で、３７℃で１時間処理した。細胞を、２％のＮＰ−４０を含む緩衝液中で溶解した。タンパク質を、変性条件下で４−２０％Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ勾配ゲルで分離し、そしてＰＶＤＦ膜に転写した。膜をＨＥＣＡ４５２抗体でイムノブロッティングした。できたブロットは、強制フコシル化後、多くのタンパク質上のＨＥＣＡ４５２反応性エピトープの発現を示す。ＦＴ−ＶＩ処理神経幹細胞をまた、フローサイトメトリーを用いてＨＥＣＡ４５２反応性に関して分析した。ＦＴ−ＶＩ細胞を、１０μｇ／ｍＬのＨＥＣＡ４５２または１０μｇ／ｍＬのラットＩｇＭアイソタイプコントロールと、４℃で３０分間、そして続いて２０μｇ／ｍＬの抗ラットＩｇＭ−ＦＩＴＣと、４℃で３０分間インキュベートした。フローサイトメトリーの結果は、強制フコシル化後、細胞表面のＨＥＣＡ４５２エピトープ発現の増加を示す。
【００６７】
実施例６：肺幹細胞のインビボフコシル化
肺幹細胞を、６０ｍＵ／ｍＬのＦｔ−ＶＩ、１ｍＭのＧＤＰ−フコースで、または緩衝液単独（ＨＢＳＳ、０．１％ヒト血清アルブミン）で、３７℃で１時間処理した。細胞を、１０μｇ／ｍＬのＨＥＣＡ４５２または１０μｇ／ｍＬのラットＩｇＭアイソタイプコントロールと、４℃で３０分間、そして続いて２０μｇ／ｍＬの抗ラットＩｇＭ−ＦＩＴＣと、４℃で３０分間インキュベートした。フローサイトメトリーの結果は、強制フコシル化後、細胞表面のＨＥＣＡ４５２エピトープ発現の増加を示す。
【００６８】
参考文献
【００６９】
【化１】
【００７０】
【化２】
本発明の多くの実施態様が記載された。それにも関わらず、本発明の意図および範囲から離れることなく、様々な修飾をし得ることが理解される。よって、他の実施態様が以下の請求の範囲内である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
生存細胞または細胞粒子の表面上のグリカンのエキソビボ修飾のための組成物であって、該組成物が、以下：
精製糖転移酵素ポリペプチドと、
二価金属補助因子を含まない生理学的に受容可能な溶液を含む、組成物。
【請求項２】
請求項１に記載の組成物であって、前記糖転移酵素がフコシル基転移酵素、ガラクトシル基転移酵素、シアル酸転移酵素、またはＮ−アセチルグルコサミン転移酵素である組成物。
【請求項３】
請求項１に記載の組成物であって、適当な糖ドナーをさらに含む組成物。
【請求項４】
請求項１に記載の組成物であって、前記生理学的に受容可能な溶液が緩衝されている組成物。
【請求項５】
請求項１に記載の組成物であって、前記生理学的に受容可能な溶液がグリセロールを含まない組成物。
【請求項６】
請求項１に記載の組成物であって、前記糖転移酵素が、ｐＨ６．５、３７℃で１分あたり１．０μモルの糖を転移し得る組成物。
【請求項７】
請求項３に記載の組成物であって、前記糖がフコース、ガラクトース、シアル酸、またはＮ−アセチルグルコサミンである組成物。
【請求項８】
請求項１に記載の組成物であって、該組成物が前記細胞または粒子のインテグリン接着に影響しない、組成物。
【請求項９】
請求項１に記載の組成物であって、前記細胞粒子が血小板である組成物。
【請求項１０】
請求項１に記載の組成物であって、前記細胞が分化細胞または幹細胞である組成物。
【請求項１１】
請求項１０に記載の組成物であって、前記幹細胞が造血幹細胞、間葉系幹細胞、組織幹／前駆細胞、臍帯幹細胞、または胚性幹細胞である組成物。
【請求項１２】
請求項１１に記載の組成物であって、前記組織幹／前駆細胞が神経幹細胞、筋幹細胞、または肺幹細胞である組成物。
【請求項１３】
請求項１に記載の組成物であって、前記細胞がＣＤ４４を発現する組成物。
【請求項１４】
請求項１に記載の組成物であって、前記二価金属補助因子がマンガン、マグネシウム、カルシウム、亜鉛、コバルト、またはニッケルである組成物。
【請求項１５】
細胞または粒子の表面上のグリカンを修飾するためのキットであって、該キットが、以下：
二価金属補助因子を含まない生理学的に受容可能な溶液中の精製糖転移酵素、および
細胞または粒子を接触させるための指示を含む、キット。
【請求項１６】
生存細胞または細胞粒子の表面上のグリカンを修飾するためのエキソビボの方法であって、該方法が、以下：
糖転移酵素が酵素活性を有し、そして細胞または細胞粒子集団の生存性が、糖転移酵素との接触後８時間において少なくとも９０％である条件下で、細胞または細胞粒子の集団を、二価の金属補助因子を含まない生理学的に許容可能な溶液中で、糖転移酵素と接触させることを含む、方法。
【請求項１７】
請求項１６に記載の方法であって、前記細胞または細胞粒子の天然の機能上の表現型が、糖転移酵素および酵素学的条件との接触後保存されている方法。
【請求項１８】
請求項１６に記載の方法であって、前記細胞粒子が血小板である方法。
【請求項１９】
請求項１６に記載の方法であって、前記細胞が分化細胞または幹細胞である方法。
【請求項２０】
請求項１９に記載の方法であって、前記幹細胞が造血幹細胞、間葉系幹細胞、組織幹／前駆細胞、臍帯幹細胞、または胚性幹細胞である方法。
【請求項２１】
請求項２０に記載の方法であって、前記組織幹／前駆細胞が神経幹細胞、筋幹細胞、または肺幹細胞である方法。
【請求項２２】
請求項１６に記載の方法であって、前記細胞がＣＤ４４を発現する方法。
【請求項２３】
請求項１６に記載の方法であって、前記細胞がＣＤ３４−である方法。
【請求項２４】
請求項１６に記載の方法であって、前記細胞または細胞粒子が、関連する糖転移酵素と接触後、Ｅ−セレクチン、Ｌ−セレクチン、またはこの両方と結合する、方法。
【請求項２５】
請求項１６に記載の組成物であって、前記糖転移酵素が、フコシル基転移酵素、ガラクトシル基転移酵素、シアル酸転移酵素、またはＮ−アセチルグルコサミン転移酵素、またはそれらの組合せである組成物。
【請求項２６】
細胞上のグリカンを修飾する方法であって、以下：
α（２，３）シアル酸付加ＣＤ４４を発現し、そしてＥ−セレクチンを結合しない細胞の集団を提供し、そして該細胞の集団をインビトロで二価金属補助因子を含まない生理学的に受容可能な溶液中の精製アルファ１，３−フコシル基転移酵素、およびフコースドナーで処理して修飾細胞を形成させることを含み、ここで該修飾細胞がＥ−セレクチンを結合する、方法。
【請求項２７】
請求項２６に記載の方法であって、前記細胞がＣＤ３４−である方法。
【請求項２８】
請求項２６に記載の方法であって、前記細胞が分化細胞または幹細胞である方法。
【請求項２９】
請求項２６に記載の方法であって、前記幹細胞が造血幹細胞、間葉系幹細胞、組織幹／前駆細胞、臍帯幹細胞、または胚性幹細胞である方法。
【請求項３０】
請求項２９に記載の方法であって、前記組織幹／前駆細胞が神経幹細胞、筋幹細胞、または肺幹細胞である方法。
【請求項３１】
請求項２６に記載の方法であって、前記細胞がさらにＬ−セレクチンを結合する方法。
【請求項３２】
請求項２６に記載の方法であって、前記修飾細胞がＰ−セレクチンを結合しない方法。
【請求項３３】
請求項２８に記載の方法であって、前記分化細胞がリンパ球または白血球である方法。
【請求項３４】
請求項１９に記載の方法であって、修飾細胞の生存性が少なくとも９０％である方法。
【請求項３５】
細胞上のグリカンを修飾する方法であって、ＣＤ４４を発現し、そしてＥ−セレクチンを結合しない細胞の集団を提供し、そして該細胞の集団をインビトロで以下：
ａ） グリセロールおよび二価金属補助因子を含まない生理学的に受容可能な溶液中でシアル酸ドナーの存在下、精製シアル酸転移酵素；
ｂ） 二価金属補助因子を含まない生理学的に受容可能な溶液中で精製アルファ１，３−フコシル基転移酵素、およびフコースドナー
で処理して修飾細胞を形成させることを含み、ここで該修飾細胞がＥ−セレクチンを結合する、方法
【請求項３６】
請求項３５に記載の方法であって、前記細胞がＣＤ３４−である方法。
【請求項３７】
請求項３５に記載の方法であって、前記ＣＤ４４が修飾に先立ってシアル酸付加されていない方法。
【請求項３８】
請求項３５に記載の方法であって、前記細胞が分化細胞または幹／前駆細胞である方法。
【請求項３９】
請求項３８に記載の方法であって、前記幹細胞が造血幹細胞、間葉系幹細胞、組織幹／前駆細胞、臍帯幹細胞、または胚性幹細胞である方法。
【請求項４０】
請求項３９に記載の方法であって、前記組織幹／前駆細胞が神経幹細胞、筋幹細胞、または肺幹細胞である方法。
【請求項４１】
請求項３６に記載の方法であって、前記修飾細胞がさらにＬ−セレクチンを結合する方法。
【請求項４２】
請求項３６に記載の方法であって、前記修飾細胞がＰ−セレクチンを結合しない方法。
【請求項４３】
請求項３６に記載の方法であって、分化細胞が白血球である方法。
【請求項４４】
請求項３６に記載の方法であって、前記修飾細胞の生存性が少なくとも９０％である方法。
【請求項４５】
請求項１６、２６、または３５の方法により生成される細胞。
【請求項４６】
細胞の移植可能性を増大させる方法であって、請求項４５に記載の細胞を含む組成物を、必要とする被験体に投与することを含む方法。
【請求項４７】
免疫不全、組織損傷、または癌の症状を処置または軽減する方法であって、請求項４５に記載の細胞を含む組成物を、必要とする被験体に投与することを含む方法。
【請求項１】
生存細胞または細胞粒子の表面上のグリカンのエキソビボ修飾のための組成物であって、該組成物が、以下：
精製糖転移酵素ポリペプチドと、
二価金属補助因子を含まない生理学的に受容可能な溶液を含む、組成物。
【請求項２】
請求項１に記載の組成物であって、前記糖転移酵素がフコシル基転移酵素、ガラクトシル基転移酵素、シアル酸転移酵素、またはＮ−アセチルグルコサミン転移酵素である組成物。
【請求項３】
請求項１に記載の組成物であって、適当な糖ドナーをさらに含む組成物。
【請求項４】
請求項１に記載の組成物であって、前記生理学的に受容可能な溶液が緩衝されている組成物。
【請求項５】
請求項１に記載の組成物であって、前記生理学的に受容可能な溶液がグリセロールを含まない組成物。
【請求項６】
請求項１に記載の組成物であって、前記糖転移酵素が、ｐＨ６．５、３７℃で１分あたり１．０μモルの糖を転移し得る組成物。
【請求項７】
請求項３に記載の組成物であって、前記糖がフコース、ガラクトース、シアル酸、またはＮ−アセチルグルコサミンである組成物。
【請求項８】
請求項１に記載の組成物であって、該組成物が前記細胞または粒子のインテグリン接着に影響しない、組成物。
【請求項９】
請求項１に記載の組成物であって、前記細胞粒子が血小板である組成物。
【請求項１０】
請求項１に記載の組成物であって、前記細胞が分化細胞または幹細胞である組成物。
【請求項１１】
請求項１０に記載の組成物であって、前記幹細胞が造血幹細胞、間葉系幹細胞、組織幹／前駆細胞、臍帯幹細胞、または胚性幹細胞である組成物。
【請求項１２】
請求項１１に記載の組成物であって、前記組織幹／前駆細胞が神経幹細胞、筋幹細胞、または肺幹細胞である組成物。
【請求項１３】
請求項１に記載の組成物であって、前記細胞がＣＤ４４を発現する組成物。
【請求項１４】
請求項１に記載の組成物であって、前記二価金属補助因子がマンガン、マグネシウム、カルシウム、亜鉛、コバルト、またはニッケルである組成物。
【請求項１５】
細胞または粒子の表面上のグリカンを修飾するためのキットであって、該キットが、以下：
二価金属補助因子を含まない生理学的に受容可能な溶液中の精製糖転移酵素、および
細胞または粒子を接触させるための指示を含む、キット。
【請求項１６】
生存細胞または細胞粒子の表面上のグリカンを修飾するためのエキソビボの方法であって、該方法が、以下：
糖転移酵素が酵素活性を有し、そして細胞または細胞粒子集団の生存性が、糖転移酵素との接触後８時間において少なくとも９０％である条件下で、細胞または細胞粒子の集団を、二価の金属補助因子を含まない生理学的に許容可能な溶液中で、糖転移酵素と接触させることを含む、方法。
【請求項１７】
請求項１６に記載の方法であって、前記細胞または細胞粒子の天然の機能上の表現型が、糖転移酵素および酵素学的条件との接触後保存されている方法。
【請求項１８】
請求項１６に記載の方法であって、前記細胞粒子が血小板である方法。
【請求項１９】
請求項１６に記載の方法であって、前記細胞が分化細胞または幹細胞である方法。
【請求項２０】
請求項１９に記載の方法であって、前記幹細胞が造血幹細胞、間葉系幹細胞、組織幹／前駆細胞、臍帯幹細胞、または胚性幹細胞である方法。
【請求項２１】
請求項２０に記載の方法であって、前記組織幹／前駆細胞が神経幹細胞、筋幹細胞、または肺幹細胞である方法。
【請求項２２】
請求項１６に記載の方法であって、前記細胞がＣＤ４４を発現する方法。
【請求項２３】
請求項１６に記載の方法であって、前記細胞がＣＤ３４−である方法。
【請求項２４】
請求項１６に記載の方法であって、前記細胞または細胞粒子が、関連する糖転移酵素と接触後、Ｅ−セレクチン、Ｌ−セレクチン、またはこの両方と結合する、方法。
【請求項２５】
請求項１６に記載の組成物であって、前記糖転移酵素が、フコシル基転移酵素、ガラクトシル基転移酵素、シアル酸転移酵素、またはＮ−アセチルグルコサミン転移酵素、またはそれらの組合せである組成物。
【請求項２６】
細胞上のグリカンを修飾する方法であって、以下：
α（２，３）シアル酸付加ＣＤ４４を発現し、そしてＥ−セレクチンを結合しない細胞の集団を提供し、そして該細胞の集団をインビトロで二価金属補助因子を含まない生理学的に受容可能な溶液中の精製アルファ１，３−フコシル基転移酵素、およびフコースドナーで処理して修飾細胞を形成させることを含み、ここで該修飾細胞がＥ−セレクチンを結合する、方法。
【請求項２７】
請求項２６に記載の方法であって、前記細胞がＣＤ３４−である方法。
【請求項２８】
請求項２６に記載の方法であって、前記細胞が分化細胞または幹細胞である方法。
【請求項２９】
請求項２６に記載の方法であって、前記幹細胞が造血幹細胞、間葉系幹細胞、組織幹／前駆細胞、臍帯幹細胞、または胚性幹細胞である方法。
【請求項３０】
請求項２９に記載の方法であって、前記組織幹／前駆細胞が神経幹細胞、筋幹細胞、または肺幹細胞である方法。
【請求項３１】
請求項２６に記載の方法であって、前記細胞がさらにＬ−セレクチンを結合する方法。
【請求項３２】
請求項２６に記載の方法であって、前記修飾細胞がＰ−セレクチンを結合しない方法。
【請求項３３】
請求項２８に記載の方法であって、前記分化細胞がリンパ球または白血球である方法。
【請求項３４】
請求項１９に記載の方法であって、修飾細胞の生存性が少なくとも９０％である方法。
【請求項３５】
細胞上のグリカンを修飾する方法であって、ＣＤ４４を発現し、そしてＥ−セレクチンを結合しない細胞の集団を提供し、そして該細胞の集団をインビトロで以下：
ａ） グリセロールおよび二価金属補助因子を含まない生理学的に受容可能な溶液中でシアル酸ドナーの存在下、精製シアル酸転移酵素；
ｂ） 二価金属補助因子を含まない生理学的に受容可能な溶液中で精製アルファ１，３−フコシル基転移酵素、およびフコースドナー
で処理して修飾細胞を形成させることを含み、ここで該修飾細胞がＥ−セレクチンを結合する、方法
【請求項３６】
請求項３５に記載の方法であって、前記細胞がＣＤ３４−である方法。
【請求項３７】
請求項３５に記載の方法であって、前記ＣＤ４４が修飾に先立ってシアル酸付加されていない方法。
【請求項３８】
請求項３５に記載の方法であって、前記細胞が分化細胞または幹／前駆細胞である方法。
【請求項３９】
請求項３８に記載の方法であって、前記幹細胞が造血幹細胞、間葉系幹細胞、組織幹／前駆細胞、臍帯幹細胞、または胚性幹細胞である方法。
【請求項４０】
請求項３９に記載の方法であって、前記組織幹／前駆細胞が神経幹細胞、筋幹細胞、または肺幹細胞である方法。
【請求項４１】
請求項３６に記載の方法であって、前記修飾細胞がさらにＬ−セレクチンを結合する方法。
【請求項４２】
請求項３６に記載の方法であって、前記修飾細胞がＰ−セレクチンを結合しない方法。
【請求項４３】
請求項３６に記載の方法であって、分化細胞が白血球である方法。
【請求項４４】
請求項３６に記載の方法であって、前記修飾細胞の生存性が少なくとも９０％である方法。
【請求項４５】
請求項１６、２６、または３５の方法により生成される細胞。
【請求項４６】
細胞の移植可能性を増大させる方法であって、請求項４５に記載の細胞を含む組成物を、必要とする被験体に投与することを含む方法。
【請求項４７】
免疫不全、組織損傷、または癌の症状を処置または軽減する方法であって、請求項４５に記載の細胞を含む組成物を、必要とする被験体に投与することを含む方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【公表番号】特表２００９−５３９３５０（Ｐ２００９−５３９３５０Ａ）
【公表日】平成２１年１１月１９日（２００９．１１．１９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−５１３３３４（Ｐ２００９−５１３３３４）
【出願日】平成１９年６月４日（２００７．６．４）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００７／０１３１７８
【国際公開番号】ＷＯ２００７／１４３２０４
【国際公開日】平成１９年１２月１３日（２００７．１２．１３）
【出願人】（５０８３５４６９２）
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２１年１１月１９日（２００９．１１．１９）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年６月４日（２００７．６．４）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００７／０１３１７８
【国際公開番号】ＷＯ２００７／１４３２０４
【国際公開日】平成１９年１２月１３日（２００７．１２．１３）
【出願人】（５０８３５４６９２）
【Ｆターム（参考）】
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