細胞転写用基板
【課題】本発明は、培養された細胞パターンの大きさが非常に小さい場合や、培養された細胞がまばらな状態や小さなコロニーを形成した状態で存在する場合、また血管やリンパ管等の脈管網や神経網等のように、培養された細胞がパターン状とされている場合であっても、生体組織等の上にパターンを維持したまま細胞を移植することが可能な細胞転写基板、およびその細胞転写基板に用いられる細胞転写用基板を提供することを主目的としている。
【解決手段】上記目的を達成するために、本発明は、高分子基材と、前記高分子基材上に形成された中間層と、前記中間層上に形成された細胞転写層とを有することを特徴とする細胞転写用基板を提供する。
【解決手段】上記目的を達成するために、本発明は、高分子基材と、前記高分子基材上に形成された中間層と、前記中間層上に形成された細胞転写層とを有することを特徴とする細胞転写用基板を提供する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞の加工や移植等に用いられ、細胞を活性なまま転写可能な細胞転写基板、およびその細胞転写基板を形成可能な細胞転写用基板に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
近年、細胞を培養して組織化させたものをそのまま移植するという技術が注目されている。これは、合成高分子を用いた人工皮膚や人工血管等では移植後に拒絶反応が生じる可能性があり、使用が難しいという問題があるが、本人の細胞を培養して組織化させた培養細胞組織等を用いる場合には、拒絶反応の心配がなく、移植用に好ましく用いることができることによるものである。
【０００３】
しかしながら、細胞培養基板上で培養された上記培養細胞組織等は、例えば生体組織へ移植することや、加工のために別の培養基板上に移し変えたりすることが難しい、という問題があった。これは、例えば細胞培養基板上でパターン状に培養された培養細胞組織を回収する際、培養細胞組織のみを細胞培養基板から剥離させることが難しいからである。
【０００４】
そこで、例えばたんぱく質分解酵素や化学薬品等を用いて細胞培養基板上から剥離させて、培養細胞組織を回収する方法が提案されている。しかしながらこの方法においては、上記薬品や酵素等により細胞が変性もしくは損傷し、細胞本来の機能が損なわれる可能性があった。また、処理工程が煩雑であり、またコンタミネーションの可能性がある等の問題もあった。
【０００５】
また特許文献１には、基材上に、感温性高分子によるパターンを形成した細胞培養支持体を作製し、その細胞培養支持体上で細胞を培養した後、細胞組織を剥離する方法も提案されている。この方法によれば、感温性高分子上で培養された細胞を、例えば高分子膜等に密着させた状態で、感温性高分子の温度を変化させることにより、シート状の細胞（細胞シート）を感温性高分子から剥離させ、培養液の表面張力の作用で上記細胞シートを高分子膜に密着させることができる。その後、高分子膜側に保持された細胞シートを、培養基板や生体組織等と密着させることによって、上記細胞シートを別の培養基板上に移し変えたり、生体組織上に移植することができるのである。しかしながらこの方法においては、細胞シートの大きさが非常に小さい場合や、細胞がまばらな状態や小さなコロニーを形成した状態で培養された場合には、高分子膜との間の表面張力の作用が十分でなく、細胞が高分子膜上を流れ滑る等して、高分子膜側に密着させることができない、という問題があった。また血管やリンパ管等の脈管網や神経網等、パターン状に培養された細胞を高分子膜に密着させた場合には、パターン状の細胞が高分子膜状を流れ滑る等してこれらのパターンが維持できない、という問題があった。
【特許文献１】特開２００３−３８１７０号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
そこで、培養された細胞パターンの大きさが非常に小さい場合や、培養された細胞がまばらな状態や小さなコロニーを形成した状態で存在する場合、また血管やリンパ管等の脈管網や神経網等のように、培養された細胞がパターン状とされている場合であっても、生体組織等の上にパターンを維持したまま細胞を移植することが可能な細胞転写基板、およびその細胞転写基板に用いられる細胞転写用基板の提供が望まれている。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、高分子基材と、上記高分子基材上に形成された中間層と、上記中間層上に形成された細胞転写層とを有することを特徴とする細胞転写用基板を提供する。
【０００８】
一般的に、高分子基材は、水性コーティング材料や高極性コーティング材料との濡れ性が悪く、本発明に用いられる細胞転写層を形成するために用いられる細胞転写層形成用材料との濡れ性も悪い。したがって、上記高分子基材上に、細胞転写性を有する細胞転写層を均一に形成することが難しい。しかしながら本発明によれば、上記高分子基材と細胞転写層との間に、中間層が形成されていることから、細胞転写層が形成される表面の濡れ性を調整することが可能となり、細胞転写層が均一に形成されたものとすることができるのである。また上記細胞転写層が均一に形成されていることから、細胞転写層上で安定して細胞を培養したり、目的とするパターン状に培養したりすることができ、培養された細胞を活性なまま、別の細胞培養基板上に移し変えたり、生体組織上に直接移植したりすること等が可能となるのである。
【０００９】
上記発明においては、上記細胞転写層が感温性高分子を含有する層としてもよい。この場合、上記細胞転写層が温度によって、細胞との接着性が変化するものとすることができ、効率よく細胞転写層上で培養した細胞組織を、転写することが可能となるからである。
【００１０】
また上記発明においては、上記細胞転写層がポリアルキレングリコールおよびその誘導体を含有する層としてもよい。この場合、上記細胞転写層が、非常に弱い細胞接着性を持つことにより、効率よく細胞転写層上で培養した細胞組織を、被転写物に転写することが可能となるからである。
【００１１】
本発明は、上述したいずれかの細胞転写用基板の細胞転写層上に細胞が接着していることを特徴とする細胞転写基板を提供する。
【００１２】
本発明によれば、上記細胞転写層が均一に形成されていることから、この細胞転写層上に、細胞を安定して培養し、均一に接着させることができる。したがって、細胞転写層上で培養された細胞を、活性なまま被転写体に直接移植等することが可能な細胞転写基板とすることができる。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によれば、上記中間層が形成されていることから、上記細胞転写層が均一に形成されたものとすることができる。したがって、本発明の細胞転写用基板を用いることにより、細胞を安定して培養したり、目的とするパターン状に形成することができ、培養された細胞を活性なまま、別の細胞培養基板上に移し変えたり、生体組織上に直接移植したりすること等が可能となるという効果を奏するものである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
本発明は、細胞の加工や移植等に用いられ、細胞を活性なまま転写可能な細胞転写基板、およびその細胞転写基板を形成可能な細胞転写用基板に関するものである。以下、それぞれについて説明する。
【００１５】
Ａ．細胞転写用基板
まず、本発明の細胞転写用基板について説明する。本発明の細胞転写用基板は、高分子基材と、上記高分子基材上に形成された中間層と、上記中間層上に形成された細胞転写層とを有することを特徴とするものである。
【００１６】
本発明の細胞転写用基板は、例えば図１に示すように、高分子基材１と、その高分子基材１上に形成された中間層２と、中間層２上に形成された細胞転写層３とを有するものである。本発明の細胞転写用基板は、例えば図２に示すように、上記細胞転写層３上に細胞４を接着させて細胞転写基板とし（図２（ａ））、この細胞転写基板で培養された細胞４を、例えば生体組織や細胞培養基板等の被転写体５に密着させて（図２（ｂ））、細胞４のみ被転写体５側に転写する（図２（ｃ））ために用いられるものである。
【００１７】
本発明においては、細胞転写性を有する細胞転写層が形成されていることから、細胞転写層上で培養された細胞を、直接細胞培養基板や生体組織等の被転写体に転写することができ、上記細胞転写層上で培養された細胞パターンの大きさが非常に小さい場合や、培養された細胞がまばらな状態や小さなコロニーを形成した状態で存在する場合、また血管やリンパ管等の脈管網や神経網等のように、培養された細胞がパターン状とされている場合であっても、生体組織等の上にパターンを維持したまま細胞を移植することが可能となる。
【００１８】
ここで一般的に、高分子基材は、水性コーティング材料や高極性コーティング材料と濡れ性が悪く、本発明において細胞転写層の形成に用いられる細胞転写層形成用材料とも濡れ性が悪く、細胞転写層を均一に形成することが難しい。しかしながら、本発明においては、上記中間層を有することから、上記細胞転写層が形成される表面の濡れ性を調整することが可能となり、均一に細胞転写層が形成されたものとすることができるのである。したがって、本発明の細胞転写用基板を用いることにより、細胞転写層上で安定して細胞を培養することや、目的とするパターン状に細胞を培養することが可能となり、細胞を活性なまま被転写体に直接転写することが可能となるのである。
【００１９】
また、本発明においては、上記細胞転写用基板に高分子基材が用いられていることから、細胞転写用基板の柔軟性を高いものとすることができ、曲面を有する生体組織等にも、細胞組織を転写することが可能であり、種々の用途に用いることができる、という利点も有している。
以下本発明の細胞転写用基板について、各構成ごとに詳しく説明する。
【００２０】
１．中間層
まず、本発明の細胞転写用基板に用いられる中間層について説明する。本発明に用いられる中間層としては、高分子基材上に形成されるものであり、後述する細胞転写層を、その上に均一に形成可能なものであれば、特に限定されるものではない。
【００２１】
本発明に用いられる中間層は、液体との接触角が所定の範囲内とされていることが好ましく、具体的には、表面張力７２．７５ｍＮ／ｍ（文献値）の液体（水）との接触角が１°〜５０°の範囲内、中でも５°〜４５°の範囲内とされていることが好ましい。これにより中間層と、細胞転写層を形成するための細胞転写層形成用材料との濡れ性を良好なものとすることができ、中間層上に細胞転写層を均一に形成することが可能となるからである。なお、上記水との接触角は、市販の接触角測定器、例えば協和界面科学（株）製ＣＡ−Ｚ型を用いて、マイクロシリンジから水滴を滴下してから１分間以内に測定した値を元にして求められる。
【００２２】
このような中間層としては、例えば極性高分子を含有する層や無機酸化物を含有する層、またはこれらの複合物からなる層等とすることができる。上記極性高分子としては、例えばポリビニルアルコールや、ポリメタクリル酸−２−ヒドロキシエチル、ポリビニルピロリドン、ポリアクリル酸、ポリスチレンスルホン酸、ポリリジン、ポリエチレンイミン、ポリアリルアミン等を挙げることができる。また、上記無機酸化物としては、例えばケイ素系酸化物、チタン系酸化物、アルミ系酸化物、リン酸化物等を挙げることができる。特に、ケイ素系酸化物による中間層の原料としては、ヘキサメチルジシロキサン、テトラメチルジシロキサンなどの有機ケイ素化合物が好ましい。また、上記無機酸化物はメチル基やフルオロアルキル基等を有する材料とともに用いられてもよい。
【００２３】
このような中間層の形成方法としては、均一に上記中間層を形成可能な方法であれば特に限定されるものではなく、上記中間層の種類に応じて適宜選択される。具体的には、ロールコート法、ダイコート法、ビードコート法等の湿式コーティング法や、吸着法、交互吸着法、スパッタ法、物理的蒸着法（ＰＶＤ法）や、化学的蒸着法（ＣＶＤ法）、プラズマを用いた方法等の乾式コーティング法等が挙げられる。
【００２４】
なお、上記中間層の表面は平坦なものであってもよいが、中間層の表面の濡れ性を調整するために、表面に微細な凹凸を有していてもよい。この場合の中間層の表面粗さとしては、５ｎｍ〜３００ｎｍの範囲内、中でも１５ｎｍ〜２５０ｎｍの範囲内であることが好ましい。これにより、中間層の表面の液体との接触角を上述した範囲とすることができるからである。上記中間層の表面に上記凹凸を形成する方法としては、例えば上記極性高分子を含有する中間層を酸素プラズマ等を用いてドライエッチングする方法や、吸着法により中間層を形成する方法等が挙げられる。ここで上記表面粗さは、市販の原子間力顕微鏡、例えばセイコーインスツルメンツ社製；SPI3800Nを用いて、タッピングモードで測定される値、または市販の走査型電子顕微鏡で断面の高低差を測定した値を元にして求められる。
【００２５】
また上記中間層は、後述する高分子基材上に全面に形成されているものであってもよく、またパターン状に形成されているものであってもよい。中間層がパターン状に形成されている場合には、中間層が形成された領域上にのみ、後述する細胞転写層を形成することができ、パターン状に細胞を培養して転写することが可能となるという利点を有する。なお、上記中間層をパターニングする方法としては、一般的なパターニング方法と同様とすることができる。
【００２６】
また上記中間層の膜厚は、１ｎｍ〜５００ｎｍ程度とされることが好ましく、中でも２ｎｍ〜３００ｎｍ程度、特に５ｎｍ〜２００ｎｍ程度とされることが好ましい。上記膜厚より薄い場合には、均一に中間層を形成することが困難となり、後述する細胞転写層を均一に形成することが困難となるからである。また、上記範囲より厚い場合には、クラック等が入りやすくなり、細胞転写用基板の柔軟性が悪くなる場合があるからである。
【００２７】
２．細胞転写層
次に、本発明に用いられる細胞転写層について説明する。上記細胞転写層は、上記中間層上に形成されるものであり、その表面に細胞を接着させて培養することが可能であって、培養された細胞を、その機能を損なうことなく、例えば他の細胞培養基板や生体組織等に転写することが可能なものであれば特に限定されるものではない。なお、本発明において、細胞転写性とは、基板上で接着培養した細胞を、基板に接着したままの状態で被転写体に生きたまま接触させ、所定時間後、その細胞を被転写体に転写することができる性質をいう。本発明において、基板上で接着培養した細胞を被転写体に接触させてから遅くとも４８時間以内に、基板に接着していた細胞の８０％以上の細胞が被転写体に転写されたとき、基板は細胞転写性を有するものとする。上記細胞転写性の評価は、基板上に接着した細胞を被転写体に所定時間接触させてから基板を剥がし、基板と被転写体とが細胞を介して接触していた所定の領域の基板および被転写体の表面に存在する細胞の数を、市販の顕微鏡で観察することにより評価することができる。被転写体が生体組織等の場合は、被転写体の顕微鏡観察が困難である場合があるが、この場合は、転写操作前の基板の所定の領域の細胞数をあらかじめ数えておき、細胞転写後、基板の上記領域に残存する細胞の数を数えることにより評価することができる。
【００２８】
なお本発明に用いられる細胞転写層は、細胞転写層上で培養された細胞のうちの８０％以上を転写するのに必要な時間が、２４時間以内であるものが好ましく、６時間以内であるものがより好ましい。
【００２９】
ここで、上記細胞転写層に用いられる材料としては、上記細胞転写性を有するものであれば特に限定されるものではない。このような材料としては、例えばフッ素および酸素を含有する材料等が挙げられ、具体的にはナフィオン（商品名）等のイオン性フッ素高分子や、フッ素系シランカップリング剤、フルオロアルキル鎖と水酸基を含むゲル、エチレングリコール系シランカップリング剤等が挙げられる。
【００３０】
また本発明においては、上記細胞転写層として親水性の高分子材料も用いることができる。具体的にはポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）等の感温性高分子や、ポリエチレングリコール、ポリエチレングリコール−ポリプロピレングリコールブロック共重合体等のポリアルキレングリコールおよびその誘導体、リン脂質極性基を有するＭＰＣポリマー（商品名）等の両性イオン高分子等が挙げられる。
【００３１】
また、上記細胞転写層は光触媒を含有していてもよい。具体的には上記細胞転写層を、上記細胞転写性を有する材料と光触媒微粒子との混合物からなる層とすることや、上記細胞転写層を、少なくとも光触媒を含有する光触媒含有層と上記細胞転写性を有する材料からなる層との２層からなる層等とすることができる。この際、用いられる光触媒としては、例えば特開２００１−２４９２１９号公報に記載されているものと同様とすることができる。
【００３２】
本発明においては、特に上記の中でも感温性高分子を含有する層であることが好ましい。これにより、細胞転写層上で細胞を培養した後、温度を変化させることにより細胞と細胞転写層との接着性を変化させることができ、効率よく細胞を被転写物に直接転写させることが可能となるからである。
【００３３】
また本発明においては、ポリアルキレングリコールおよびその誘導体を用いてもよく、特にポリエチレングリコールを用いることが好ましい。これらの材料は、高い細胞接着阻害性を有するが、上記光触媒等を用いた改質により、非常に弱い細胞接着性を有する細胞転写層を形成することが可能であり、その結果、効率よく細胞を被転写物に直接転写することが可能となるからである。
【００３４】
上記細胞転写層の形成方法としては、上記細胞転写層の種類や、細胞転写用基板の形状等に合わせて適宜選択されるものであるが、通常ロールコート法、ダイコート法、ビードコート法等の湿式コーティング法や、吸着法、交互吸着法等を用いることができる。
【００３５】
また、上記細胞転写層は、全面が細胞との接着性を有する細胞接着領域であってもよいが、例えば図３に示すように、細胞転写層３が、細胞との接着性を有する細胞接着領域６と、細胞と接着性を有しない細胞接着阻害領域７とからなるものであってもよい。細胞転写層が、上記細胞接着領域と細胞接着阻害領域とを有する場合、細胞接着領域上にのみ細胞を接着させて培養することが可能となり、パターン状に細胞を転写することが可能となる。
【００３６】
ここで、上記細胞を培養し、かつ転写するために用いられる細胞接着領域は、転写する細胞の種類等により適宜選択されるものであるが、通常、細胞転写層表面の水との接触角が１０°〜６０°程度の領域、中でも１５°〜５５°の範囲内の領域とされていることが好ましい。このような水との接触角を有するものとすることにより、細胞を細胞転写層上に接着させて培養し、活性なまま被転写体に転写することができるからである。また上記範囲より水との接触角が大きい場合には、細胞を細胞転写層上に接着させることは可能であるが、転写することが困難となり、上記範囲より水との接触角が小さい場合には、細胞を細胞転写層上に接着させることが困難となるからである。なお、細胞を転写するパターンの幅が１ｍｍ以下のラインやドットである場合等には特に、上記細胞接着領域表面の水との接触角が、１０°〜４５°の範囲内、中でも１５°〜３５°の範囲内とされていることが好ましい。このような範囲内とすることにより、高精細なパターン状に細胞を転写することが可能となるからである。
【００３７】
また、細胞転写層が上記細胞接着阻害領域を有する場合には、この細胞接着阻害領域は、上記細胞接着領域の液体との接触角より、５０°〜１６０°程度、中でも６０°〜１５０°程度液体との接触角が大きい領域、もしくは細胞接着領域の液体との接触角より１０°〜４０°程度、中でも１５°〜３５°程度液体との接触角が小さい領域とすることが好ましい。このような領域では、細胞との接着性が悪いものとすることができるからである。
【００３８】
上記細胞接着領域と細胞接着阻害領域とを形成する方法としては、例えば細胞と接着阻害性を有する層を形成した後、細胞接着領域とする部分のみ液体との接触角を変化させる方法や、細胞接着性を有する層を形成した後、細胞接着阻害領域とする部分のみの液体との接触角を変化させる方法等が挙げられる。例えば上述したような材料を用いて細胞転写層を形成した後、細胞接着領域とする部分のみ、もしくは細胞接着阻害領域とする部分のみ、液体との接触を低下させる方法や、上述したような材料を用いて細胞転写層を形成した後、細胞接着領域とする部分のみ、もしくは細胞接着阻害領域とする部分のみ液体との接触角を高くする方法等が挙げられる。
【００３９】
上述したような細胞転写層の液体との接触角を大きいものとする方法としては、例えば細胞転写層表面に微細な凹凸を形成する方法等が挙げられ、例えば、資料ジャパニーズ・ジャーナル・オブ・アプライド・フィジックス、パート２、３２巻、Ｌ６１４〜Ｌ６１５、１９９３年 Ｏｇａｗａら、に開示されている方法や、資料ラングミュア、１９巻、１０６２４〜１０６２７、２００３年 Ｔｅｓｈｉｍａら、に開示されている方法を用いることができる。
【００４０】
また、上記細胞転写層の液体との接触角を小さくする方法としては、例えばエネルギー照射に伴う光触媒の作用を利用し、撥液性を有する基を分解または変性させる方法や、熱照射、紫外光照射、電子線照射等により撥液性を有する基を分解または変性させる方法等が挙げられる。上述したように、細胞転写層中に光触媒が含有されている場合には、この細胞転写層中の光触媒の作用を利用して、細胞転写層との液体との接触角を低下させることができる。また、細胞転写層中に光触媒が含有されていない場合には、例えば特開２００１−２４９２１９号公報に記載されている光触媒を用いたパターニング方法や、特開２００３−２２２６２６号公報に記載されている光触媒を用いたパターニング方法等を用いて、細胞転写層の液体との接触角を低下させることができる。また、熱照射や紫外光照射、電子線照射等によるパターニングは、これらのエネルギーを用いてパターニングする一般的な方法と同様とすることができるので、ここでの詳しい説明は省略する。
【００４１】
また、上記細胞転写層は、上記中間層上の全面に形成されていてもよいが、パターン状に形成されていてもよい。このようなパターニング方法としては、一般的なパターニング方法と同様とすることができる。
【００４２】
ここで、上述したような細胞転写層の膜厚としては、上記細胞転写層の種類等により適宜選択されるものであるが、通常１ｎｍ〜１０００ｎｍ程度、好ましくは、１．５ｎｍ〜７５０ｎｍ程度、中でも２０ｎｍ〜５００ｎｍ程度とされることが好ましい。上記範囲内とすることにより、細胞を安定して培養し、転写することが可能となるからである。
【００４３】
３．高分子基材
次に、本発明に用いられる高分子基材について説明する。本発明に用いられる高分子基材は、上記中間層が均一に形成可能なものであり、公知の方法で滅菌できることが可能なものであれば高分子基材の種類等は特に限定されるものではない。公知の滅菌方法としては、例えばγ線を照射して滅菌する方法、紫外光を照射して滅菌する方法、電子線を照射して滅菌する方法、オートクレーブにより滅菌する方法等が挙げられる。
【００４４】
このような高分子基材としては、可撓性や透明性等、細胞転写用基板が必要とされる機能に基づき適宜選択され、例えば、ポリプロピレン、ポリメチルペンテン、ポリプロピレン共重合体、テフロン（登録商標）やエチレン−テトラフロオロエチレン共重合体等のフッ素樹脂、ポリカーボネート、アセタール樹脂、ポリサルフォン、ポリ塩化ビニル、シリコーン樹脂、ポリスチレン、スチレン−アクリロニトリル共重合体、ポリメタクリル酸メチルなどのアクリル樹脂、ポリウレタン、ポリエステル、ポリイミド、ポリグリコール酸、ポリ乳酸、コラーゲン、エラスチン等の生体吸収性高分子等を用いることができる。また、不織布や織布等も用いることができる。
【００４５】
また上記高分子基材は多孔質であっても良く、この高分子基材は、細胞転写層上に培養された細胞を転写する前に、フィーダー細胞を用いて共培養する必要がある場合等に特に有用である。またこの場合、細胞転写操作時に、培養液や酸素が全ての細胞に均一に行き渡るという効果もある。この場合、孔の平均の大きさは細胞の種類に依存するが、通常０．１μｍ〜５μｍであることが好ましく、０．２μｍ〜１．５μｍであることがさらに好ましい。孔の大きさが０．１μｍ未満だと栄養や液性因子などの培養細胞への供給効率が悪くなるからである。また孔の大きさが５μｍを超えると孔の中や高分子基材の裏面まで培養細胞が接着する割合が増し、培養細胞を効率良く転写できなくなるからである。
【００４６】
また、例えば図４に示すように、上記高分子基材１は、細胞転写層３が形成されるパターン状に凹部や凸部が形成されたものであってもよい。この場合、上記凸部上にのみ、もしくは凹部上にのみ細胞転写層を形成して高精細なパターン状に細胞を培養し、転写することが可能となる。このような凹部や凸部の幅としては、通常１０μｍ〜５００μｍ程度、中でも２０μｍ〜２００μｍ程度とすることができる。また、上記凹部や凸部の高さとしては、０．１μｍ〜１００μｍ程度、中でも０．２μｍ〜２０μｍ程度とすることができる。
【００４７】
ここで、上述した高分子基材の厚みは、１μｍ〜２５０μｍ、中でも５μｍ〜２００μｍとされることが好ましい。上記範囲より薄い場合には、柔軟性が非常に高いため、取り扱いが非常に難しくなったり、強度が不足し、簡単に裂けたり破れたりする場合があるからである。また上記範囲より厚みが厚い場合には、柔軟性が不足することから、細胞転写用基板上に培養された細胞を転写する際、被転写物との密着性が悪くなる場合があるからである。
【００４８】
４．細胞転写用基板
本発明の細胞転写用基板は、上記高分子基材、中間層、および細胞転写層を有するものであれば、特に限定されるものではなく、必要に応じて適宜他の層を有していてもよく、例えば上記細胞転写層上に細胞転写補助層等が形成されているもの等とすることができる。以下、本発明に用いられる細胞転写補助層について説明する。
【００４９】
（細胞転写補助層）
上記細胞転写補助層としては、細胞転写層上に形成されるものであり、この細胞転写補助層上に細胞が接着されることとなる。このような細胞転写補助層は、細胞転写補助層上で細胞を培養した後、細胞を転写する際、細胞と一緒に被転写体側に少なくとも一部が一緒に転写される。本発明においては、このような細胞転写補助層が形成されていることにより、より効率よく細胞を被転写体上に転写させることが可能となるのである。このような細胞転写補助層としては、被転写体側に影響を及ぼさないものが選択され、例えばコラーゲン等のポリペプチドや、ヒアルロン酸等の多糖類、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、アルギン酸、ポリビニルアルコール、ポリリジン等が挙げられる。また上記細胞転写補助層中には、カルシウムイオンやマグネシウムイオン等の金属イオンが含まれていてもよい。
【００５０】
Ｂ．細胞転写基板
次に本発明の細胞転写基板について説明する。本発明の細胞転写基板は、上述した細胞転写用基板の細胞転写層上に細胞を接着させたものである。本発明の細胞転写基板は、例えば図２（ａ）に示すように、高分子基材１と、その高分子基材１上に形成された中間層２と、その中間層２上に形成された細胞転写層３と、細胞転写層３上に接着した細胞４とを有するものである。
【００５１】
上述した細胞転写用基板には、上記中間層が形成されていることから、上記細胞転写層が均一に形成されている。したがって本発明によれば、この細胞転写層上に、細胞を安定して培養し、均一に接着させることができ、細胞転写層上で培養された細胞を、活性なまま被転写体に直接移植等することが可能な細胞転写基板とすることができる。また本発明によれば、培養された細胞パターンの大きさが非常に小さい場合や、培養された細胞がまばらな状態や小さなコロニーを形成した状態で存在する場合、また血管やリンパ管等の脈管網や神経網等のように、培養された細胞がパターン状とされている場合であっても、生体組織等の上にパターンを維持したまま細胞を移植することが可能となるのである。
以下、本発明に用いられる細胞について説明する。
【００５２】
１．細胞
本発明において、上記細胞転写層上に接着される細胞としては、血球系細胞やリンパ系細胞などの浮遊細胞でもよく、また接着性細胞でもよい。本発明においては、特に接着性を有する細胞であることが好ましい。このような接着性を有する細胞としては、例えば、肝臓の実質細胞である肝細胞、血管内皮細胞、繊維芽細胞、表皮角化細胞などの表皮細胞、気管上皮細胞、消化管上皮細胞、子宮頸部上皮細胞、水晶体上皮細胞などの上皮細胞、乳腺細胞、平滑筋細胞や心筋細胞などの筋細胞、腎細胞、膵ランゲルハンス島細胞、末梢神経細胞や視神経細胞などの神経細胞、軟骨細胞、骨細胞などが挙げられる。またこれらの細胞は、組織や器官から直接採取した初代細胞でもよく、あるいは、それらを何代か継代させたものでもよい。また株化された細胞でもよい。さらにこれら細胞は、未分化細胞であるＥＳ細胞、多分化能を有する多能性幹細胞、単分化能を有する単能性幹細胞、分化が終了した細胞の何れであっても良い。また、細胞は単一種を培養してもよいし二種以上の細胞を共培養したものであってもよい。
【００５３】
２．細胞転写基板
本発明の細胞転写基板は、上記高分子基材、中間層、細胞転写層、および細胞を有するものであれば、特に限定されるものではない。本発明の細胞転写基板は、上記細胞転写層上で培養された細胞を、加工のために別の培養基板上に移し変えたり、上記細胞を生体組織上に移植する際に用いられることとなる。
【００５４】
なお、本発明は上記実施形態に限定されるものではない。上記実施形態は、例示であり、本発明の特許請求の範囲に記載された技術的思想と実質的に同一な構成を有し、同様な作用効果を奏するものは、いかなるものであっても本発明の技術的範囲に包含される。
【実施例】
【００５５】
以下に実施例を示し、本発明をさらに具体的に説明する。
【００５６】
［実施例１］
（中間層の形成）
厚さ２５μｍのポリエステルフィルムを用意し、ＣＶＤチャンバー内の真空度を４．０×１０−３Ｐａに減圧し、電極に９０ｋＨｚの周波数を有する電力（投入電力３００Ｗ）を印加した。その後、ヘキサメチルジシロキサン、酸素ガス、ヘリウムガスをそれぞれ所定量投入し、真空度が３０ＭＰａとなるように制御した。これにより、プラズマ気相成長法（ＣＶＤ法）による酸化珪素系薄膜（中間層）が、厚さ約１００ｎｍで形成された。
【００５７】
（細胞転写層の形成）
オルガノシランＴＳＬ８１１４（ＧＥ東芝シリコーン）０．４ｇとフルオロアルキルシランＴＳＬ８２３３（ＧＥ東芝シリコーン）０．４ｇとをイソプロピルアルコール５ｇで希釈し、１５分以上攪拌した。上記溶液に１，３−ブタンジオールを添加し、１５分以上攪拌した。このようにして調製した溶液を上記中間層上にスピンコーティングし、乾燥させて細胞転写層とした。細胞転写層表面の水との接触角の平均値は１０３．１°だった。
【００５８】
（露光処理用フォトマスクの作製）
テトラメトキシシランおよびＨＣｌを１２時間以上混合し、これをイソプロピルアルコールで希釈した。このようにして調製した溶液を、幅６０μｍの開口部と幅３００μｍの遮光部とが交互に配置されたラインパターンを有するフォトマスクのクロムパターン面上にスピンコーティングし、その後１５０℃で乾燥させた。
次に、酸化チタンゾル液に硝酸銅を加えた溶液を作製し、上記マスクにスピンコーティングし、１５０℃で乾燥させることにより、透明な光触媒含有層を有する露光処理用フォトマスクを形成した。
【００５９】
（細胞転写層の露光処理）
上記露光処理用フォトマスクの光触媒含有層面と上記細胞転写層とを対向させ、フォトマスク側から水銀ランプにより１４Ｊ／ｃｍ２の照射量で紫外線照射を行った。これにより、幅６０μｍのライン状の細胞接着領域及び幅３００μｍの細胞接着阻害領域が交互に形成された細胞転写用基板を得た。上記細胞接着領域表面の水との接触角の平均値は２１．７°であった。
【００６０】
（細胞培養）
上述した細胞転写用基板を常法によりオートクレーブ滅菌した。細胞はウシ由来の頚動脈内皮細胞を用いた。細胞転写用基板をウェルプレート上に並べ、５％血清を含むＭＥＭ培地を加え、１×１０６ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌになるように細胞を播種した。これを３７℃で１６時間培養することにより、高い配向性で細胞が幅６０μｍの細胞接着領域上に接着した細胞転写基板とした。
【００６１】
（細胞転写とさらなる培養）
細胞転写のために、ＥＨＳマウス腫瘍細胞から抽出した可溶化基底膜を調製したもの（以下、細胞被転写用機能材料ともいう。）を使用した。上記細胞転写基板の細胞面を、細胞被転写用機能材料に接触させ、その後０．３％血清を含むＭＥＭ培地を加えた。これを３７℃で５．５時間培養した後に、細胞転写基板を剥がし、さらに１２時間細胞被転写用機能材料中で培養した。顕微鏡で観察し、細胞が管腔化していることを確認した。また、転写の前後において所定の領域の基板上の細胞数を計測することにより、細胞が９５％転写したことを確認した。
【００６２】
［実施例２］
（中間層の形成）
実施例１と同様に、厚さ１５０μｍのポリエステルフィルム上に、膜厚６５ｎｍのメチル基を含む酸価珪素系薄膜（中間層）を形成した。
【００６３】
（細胞転写層の形成）
上記中間層表面を紫外線洗浄した後、その表面にシランカップリング剤ＸＣ９８−Ｂ２４７２（ＧＥ東芝シリコーン）をイソプロピルアルコールで１０倍希釈したコーティング剤をスピンコーティングにより塗布した。続いて、１５０℃で１０分間乾燥させることにより、細胞転写層が形成された細胞転写用基板を得た。上記細胞転写層の水との接触角の平均値は１０１．８°だった。
【００６４】
（露光処理用フォトマスクの作製）
ヒトの眼底血管写真をベースにした血管パターンを開口部とするフォトマスクを作製した。このフォトマスクに実施例１と同様の方法で光触媒含有層を形成した。
【００６５】
（細胞転写層の露光処理）
上記露光処理用フォトマスクの光触媒含有層面と細胞転写層とを対向させ、露光処理用フォトマスク側から水銀ランプにより１３Ｊ／ｃｍ２の照射量で紫外線照射を行った。これにより眼底血管パターン状の細胞接着領域、及びそれ以外の細胞接着阻害領域を有する細胞転写用基板を得た。上記細胞接着領域の水との接触角の平均値は２５．２°だった。
【００６６】
（細胞培養）
上記細胞転写用基板を常法によりオートクレーブ滅菌した。細胞はヒト臍帯静脈内皮細胞を用いた。上記細胞転写用基板をウェルプレート上に並べ、２０％ウシ胎児血清と成長因子ＥＣＧＳとヘパリンを加えたＲＰＭＩ培地を加え、１×１０６ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌになるように細胞を播種した。これを３７℃で１６時間培養することにより、高い配向性で細胞が６０μｍの細胞接着領域上に接着した細胞転写基板とした。
【００６７】
（細胞転写とさらなる培養）
実施例１と同様に、細胞を細胞被転写用機能材料上に転写し、細胞が管腔したことを確認した。また、細胞転写用基板の所定の領域に存在していた細胞数と細胞被転写用機能材料上の所定の領域の細胞数を計測したところ、細胞転写率は、１００％であった。
【００６８】
［実施例３］
（中間層の形成）
直径約２０ｍｍの未処理ポリスチレン（ＰＳ）シートを用意し、実施例１と同様の方法で中間層を形成した。これを酸素プラズマ処理し、フィルム表面にシラノール基を生成した。
【００６９】
（細胞転写層の形成）
上記処理済ＰＳシートを、すばやくγ−メタクリロキシプロピルトリメトキシシラン（ＧＥ東芝シリコーン）のトルエン溶液（濃度３％）に２時間浸漬した。その後トルエンで洗浄し窒素ガスで乾燥した。続いてＰＳシートを３５ｍｍディッシュの中に配置し、Ｎ−イソプロピルアクリルアミドをイソプロピルアルコールで５５％に希釈した溶液を上記ＰＳシート上に展開した。このＰＳシートに対して電子線を照射し、さらに水洗することにより、中間層上にポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）層からなる細胞転写層が形成された。
【００７０】
（細胞転写層の露光処理）
実施例１とネガポジ反転したパターンを有する通常のフォトマスクを用い、上記細胞転写層に真空紫外線を３０分間照射し、照射部のポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）を酸化分解により除去し、細胞転写用基板とした。
【００７１】
（細胞培養）
細胞転写用基板を常法によりエチレンオキサイドガス滅菌した。その後、実施例１と同様の条件で細胞転写用基板上に細胞を培養し、ウシ血管内皮パターンが形成された細胞転写基板とした。
【００７２】
（細胞転写とさらなる培養）
マウス骨芽細胞様細胞(MC3T3E1)を１０ｃｍディッシュに播種し、コンフルエントになったのを確認した後さらに２日以上インキュベートし、細胞外基質産生を促した。上記ウシ血管内皮パターンが形成された細胞転写基板を上記骨芽細胞シート上に、細胞が相対するように静かに配置し、その後、培地を静かにディッシュ内に注いだ。この状態を２５℃で４０分間維持した。その後、血管内皮パターンが骨芽細胞シートと細胞転写用基板にサンドイッチされた状態のまま、ディッシュを３７℃のＣＯ２インキュベータ内に戻し共培養を２４時間実施した後に、基板のみを剥がしてさらに２４時間培養した。顕微鏡で観察を行うと、骨芽細胞様細胞層上に内皮細胞がパターン状に配置され且つ管腔状になっていることが確認できた。また、細胞転写の前後において細胞転写用基板の所定の領域に存在する細胞数を数えることにより、細胞が８５％転写したことを確認した。
【００７３】
［実施例４］
（中間層の形成）
平均１μｍの孔が開いている多孔質ポリエステルシートを酸素プラズマ装置に入れ５×１０−５Ｐａに減圧した。酸素圧を５Ｐａに調整し１０分間酸素プラズマ処理した。この処理済多孔質ポリエステルシートに、実施例１と同様に厚さ１０ｎｍのメチル基を含む酸価珪素系薄膜（中間層）を形成した。
【００７４】
（細胞転写層の形成）
上記中間層を酸素プラズマ処理し、その後速やかに、ヘプタデカフルオロ−１，１，２，２−テトラヒドロデシル−１−トリメトキシシラン（信越化学）０．２ｃｃを含むテフロン（登録商標）容器（容積６５ｃｍ３）に入れ、容器を密閉し１００℃のオーブン内で５時間保持して細胞転写層を形成した。
【００７５】
（細胞転写層の露光処理）
実施例１と同じ露光処理用フォトマスクを用い、露光処理用フォトマスク側から水銀ランプを用いて１４Ｊ／ｃｍ２の照射量で紫外線照射を行った。これにより、幅６０μｍのライン状の細胞接着領域、及び幅３００μｍの細胞接着阻害領域が交互に形成された細胞転写用基板を得た。
【００７６】
（細胞培養、および細胞転写とさらなる培養）
実施例１と同様に、上記細胞転写用基板上に細胞を接着させて培養し、細胞被転写用機能材料上に転写した。これにより、細胞が管腔したことを確認した。また、基板の所定の領域の細胞数を計測することで、細胞転写率が９０％であることを確認した。
【００７７】
［実施例５］
（中間層の形成）
厚さ１５μｍのポリ乳酸フィルムを用い、実施例１と同様の方法により中間層を形成した。
【００７８】
（細胞転写層の形成）
上記中間層表面をＵＶ洗浄した。次いで、シランカップリング剤ＸＣ９８−Ｂ２４７２（ＧＥ東芝シリコーン）をイソプロピルアルコールで１０倍希釈し、ここに１，３−ブタンジオールを濃度１０％となるように添加し、攪拌した。このコーティング液をスピンコート法により塗布し、５５℃で２４時間乾燥させた。その後、よく水洗し乾燥させて細胞転写層とした。この細胞転写層の水との接触角の平均値は１０４．７°であった。
【００７９】
（細胞転写層の露光処理）
実施例１と同じ露光処理用フォトマスクを用い、露光処理用フォトマスク側から水銀ランプを用いて１４Ｊ／ｃｍ２の照射量で紫外線照射を行った。これにより、幅６０μｍのライン状の細胞接着領域及び幅３００μｍの細胞接着阻害領域が交互に形成された細胞転写用基板を得た。
【００８０】
（細胞培養）
上記細胞転写用基板を７０％エタノールで滅菌した後、実施例１と同様に細胞を培養し、細胞接着領域上に予めＰＫＨ２６（アルドリッチ）で蛍光染色した血管内皮細胞を接着させ、細胞転写基板とした。
【００８１】
（細胞転写とさらなる培養）
滅菌処理下で、ヌードマウス（日齢５、オス）より、背部の皮膚、腹膜及び肝臓をそれぞれ摘出し、３５ｍｍ培養ディッシュに入れ、皮膚は皮下組織、肝臓は漿膜を剥離した。これらの摘出組織に、血管内皮細胞が接着している上記細胞転写基板を乗せた。その培養ディッシュに３ｍｌの培養液（５％ウシ胎児血清含有ＭＥＭ培地）をいれ、４８時間培養した。その後、ピンセットで細胞転写基板を除去したところ、内皮細胞は摘出組織上に保持された。組織切片を顕微鏡観察したところ、摘出組織上に血管内皮パターンが形成されていることが確認された。また、転写前の細胞転写基板の所定の領域に存在する細胞数と、転写後の所定の領域に残存する細胞数を計測することで、９５％の細胞が転写したことを確認した。
【００８２】
［実施例６］
（微細凹凸中間層の形成）
直径２３ｍｍのポリエステルシートをＵＶ洗浄した。次に、ポリジアリルジメチルアンモニウムクロライド（アルドリッチ）の０．２％溶液（０．２Ｍ塩化ナトリウム含有）に浸漬し水洗することによって、ポリエステルシート上にカチオン性ポリマーの吸着層を形成した。次いでスフェリカスラリーＳ１２０（触媒化成工業）に上記ＰＥＴシートを浸漬し、水洗することによって、シリカ粒子吸着層からなる中間層を形成した。
【００８３】
（細胞転写層の形成）
シランカップリング剤ＸＣ９８−Ｂ２４７２（ＧＥ東芝シリコーン）をイソプロピルアルコールで１０倍希釈したコーティング液を上記中間層上にスピンコート法により塗布し、１５０℃で１５時間乾燥させて細胞転写層とした。この細胞転写層の水との接触角の平均値は１３７．２°であった。
【００８４】
（細胞転写層の露光処理）
実施例１と同じ露光処理用フォトマスクを用い、露光処理用フォトマスク側から水銀ランプを用いて１２Ｊ／ｃｍ２の照射量で紫外線照射を行った。これにより、幅６０μｍのライン状の細胞接着領域及び幅３００μｍの細胞接着阻害領域が交互に形成された細胞転写用基板を得た。細胞接着領域の水との接触角の平均値は２０．０°であった。
【００８５】
（細胞培養、および細胞転写とさらなる培養）
実施例１と同様に、上記細胞転写用基板上に細胞を接着させて細胞転写基板とし、この細胞転写基板上の細胞を細胞被転写用機能材料上に転写した。これにより、細胞が細胞被転写用機能材料内で管腔したことを確認した。また、細胞転写の前後において所定の領域の細胞数を計測し、細胞転写率が９２％であることを確認した。
【００８６】
［実施例７］
（中間層の形成および細胞転写層の形成）
実施例１と同様に中間層を形成した後、実施例６と同様に、細胞転写層を形成した。この細胞転写層の水との接触角の平均値は１０２．２°であった。
【００８７】
（露光処理用フォトマスクの作製）
実施例１と同様の手順により、遮光部中に直径１８ｍｍの円状の開口部が２０ｍｍ間隔で多数配置されたドットパターンを有する透明な光触媒含有層を有する露光処理用フォトマスクを形成した。
【００８８】
（細胞転写層の露光処理）
上記露光処理用フォトマスクの光触媒含有層面と、上記細胞転写層とを対向させ、露光処理用フォトマスク側から水銀ランプを用いて４Ｊ／ｃｍ２の照射量で紫外線照射を行い、直径１８ｍｍの円状の細胞接着領域と、その周囲に細胞接着領域が形成された細胞転写用基板を得た。この細胞接着領域の水との接触角の平均値は４９．６°であった。
次いで、細胞転写用基板を７．５ｃｍ角に切り取った。この際、切り取られた細胞転写用基板には、細胞接着領域が４箇所含まれるものとした。
【００８９】
（細胞培養）
細胞転写用基板を定法によりオートクレーブ滅菌した。細胞は、ウシ由来の頚動脈内皮細胞を用いた。上記細胞転写用基板を角型のディッシュに配置し、５％血清を含むＭＥＭ培地を加え、１×１０６ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌとなるように細胞を播種した。これを３７℃で１６時間培養することにより、円形の細胞接着領域にのみ内皮細胞をコンフルエントに接着させて細胞転写基板とした。
【００９０】
（細胞転写とさらなる培養）
細胞転写のために、ＥＨＳマウス腫瘍細胞から抽出した可溶化基底膜を調製したもの（以下、細胞被転写用機能材料ともいう。）を使用した。上記細胞転写基板の細胞面を、細胞被転写用機能材料に接触させ、その後０．３％血清を含むＭＥＭ培地を加えた。これを３７℃で５．５時間培養した後に、細胞転写基板を剥がし、さらに２４時間細胞被転写用機能材料中で培養した。培養中、血管内皮細胞は、一部再配列し、管腔を形成した。また、細胞転写前後において、所定の領域の細胞数を計測することにより、細胞が８０％転写したことを確認した。
【００９１】
［実施例８］
（細胞転写層の形成）
（第一段階目の反応）
実施例１で作製した、厚さ２５μｍのポリエステルに酸化珪素系薄膜（中間層）が厚さ１００ｎｍで形成された中間層付き基材の中間層表面をＵＶ洗浄した。トルエン３９．０ｇ、シランカップリング剤ＴＳＬ８３５０（ＧＥ東芝シリコーン製）１３．５ｇを混合し、攪拌しながらトリエチルアミンを４５０μｌ添加した。そのまま室温で数分間攪拌した後、全量をガラス皿へ移した。ここに上記ＵＶ洗浄済み中間層付き基材を浸漬し、室温で１６時間放置した。その後、中間層付き基材をエタノールと水で洗浄し、乾燥させた。これにより、中間層表面にエポキシ基を含む薄膜が形成された。
【００９２】
（第二段階目の反応）
５０ｇのテトラエチレングリコールを攪拌しながら２５０μｌの濃硫酸を一滴ずつ添加した。そのまま数分間攪拌してから、全量をガラス皿に移した。ここに上記中間層付き基材を浸漬し、８０℃で３０分間反応させた。反応後、上記中間層付き基材をよく水洗し、乾燥させた。これにより、中間層表面に、細胞転写層としての均一な親水性薄膜が形成された。
【００９３】
（細胞転写層の露光処理）
実施例１と同様にして、１０Ｊ／ｃｍ２の照射量で紫外線照射を行った。これにより、幅６０μｍのライン状の細胞接着領域及び幅３００μｍの細胞接着阻害領域が交互に形成された細胞転写用基板を得た。上記細胞接着領域表面の水との接触角の平均値は１５．８°であった。
【００９４】
（細胞培養）
上記細胞転写用基板を常法によりオートクレーブ滅菌した。細胞はヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ、クラボウ）を用いた。上記細胞転写用基板をウェルプレートに並べ、正常ヒト血管内皮細胞用低血清培地であるＨｕＭｅｄｉａ−ＥＧ２（クラボウ）を加え、１×１０６ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌになるように細胞を播種した。これを３７℃、５％ＣＯ２濃度のインキュベータ内で４６時間培養することにより、細胞接着領域にのみＨＵＶＥＣをコンフルエントな状態で接着させて細胞転写基板とした。
【００９５】
（細胞転写とさらなる培養）
上記細胞転写基板と成長因子低減マトリゲル（ベクトン・ディッキンソン）とを、細胞面がマトリゲルと対面するように接触させ、数分保持した。その後、ＨｕＭｅｄｉａ−ＥＧ２を培養容器に入れ、３７℃、５％ＣＯ２濃度のインキュベータ内で２時間培養した。位相差顕微鏡で観察したところ、ＨＵＶＥＣが形態変化しチューブ状になっていることを確認した。その後、細胞転写用基板のみを剥がしたところ、細胞転写用基板は簡単に剥がすことができ、ＨＵＶＥＣは、マトリゲル上に保持された。位相差顕微鏡で観察したところ、ＨＵＶＥＣのチューブ状の形態にほとんど乱れがなかったことを確認した。また転写の前後において所定の領域の基板上の細胞数を計測することにより、細胞がほぼ１００％マトリゲルに転写されていることを確認した。
【００９６】
［実施例９］
（細胞転写層の形成）
（第一段階目の反応）
実施例２で作製した、厚さ１５０μｍのポリエステルに酸化珪素系薄膜（中間層）が厚さ６５ｎｍで形成された中間層付き基材の中間層表面をＵＶ洗浄した。トルエン３９．０ｇ、シランカップリング剤ＴＳＬ８３５０（ＧＥ東芝シリコーン製）１３．５ｇを混合し、攪拌しながらトリエチルアミンを４５０μｌ添加した。そのまま室温で数分間攪拌した後、全量をガラス皿へ移した。ここにＵＶ洗浄済み上記中間層付き基材を浸漬し、室温で１６時間放置した。その後、上記中間層付き基材をエタノールと水で洗浄し、乾燥させた。これにより、中間層表面にエポキシ基を含む薄膜が形成された。
【００９７】
（第二段階目の反応）
５０ｇの平均分子量４００のポリエチレングリコール（ＰＥＧ４００）を攪拌しながら２５μｌの濃硫酸を一滴ずつ添加した。そのまま数分間攪拌してから、全量をガラス皿に移した。ここに上記中間層付き基材を浸漬し、８０℃で２０分間反応させた。反応後、上記中間層付き基材をよく水洗し、乾燥させた。これにより、中間層表面に、細胞転写層としての均一な親水性薄膜が形成された。
【００９８】
（細胞転写層の露光処理）
実施例１と同様にして、１０Ｊ／ｃｍ２の照射量で紫外線照射を行った。これにより、幅６０μｍのライン状の細胞接着領域及び幅３００μｍの細胞接着阻害領域が交互に形成された細胞転写用基板を得た。上記細胞接着領域表面の水との接触角の平均値は１７．２°であった。
【００９９】
（細胞培養）
上述した細胞転写用基板を常法によりオートクレーブ滅菌した。実施例８と同様にして、ウェルプレートにＨｕＭｅｄｉａ−ＥＧ２（クラボウ）を加え、１×１０６ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌになるようヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ、クラボウ）を播種した。これを３７℃、５％ＣＯ２濃度のインキュベータ内で４６時間培養することにより、細胞接着領域にのみＨＵＶＥＣをコンフルエントな状態で接着させて細胞転写基板とした。
【０１００】
（細胞転写とさらなる培養）
上記細胞転写基板と、成長因子低減マトリゲル（ベクトン・ディッキンソン）とを、細胞面がマトリゲルと対面するように接触させ、その後、ＨｕＭｅｄｉａ−ＥＧ２を培養容器に入れ、３７℃、５％ＣＯ２濃度のインキュベータ内で２時間培養した。位相差顕微鏡で観察したところ、ＨＵＶＥＣが形態変化しチューブ状になっていることを確認した。その後、細胞転写用基板のみを剥がしたところ、細胞転写用基板は簡単に剥がすことができ、ＨＵＶＥＣは、マトリゲル上に保持された。位相差顕微鏡で観察したところ、ＨＵＶＥＣのチューブ状の形態にほとんど乱れがなかったことを確認した。また転写の前後において所定の領域の基板上の細胞数を計測することにより、細胞がほぼ１００％マトリゲルに転写されていることを確認した。
【０１０１】
［実施例１０］
（線維芽細胞の培養）
マウス胚の線維芽細胞ＢＡＬＢ／３Ｔ３クローンＡ３１を、１０％ウシ胎児血清を含むＤＭＥＭ培地を加えた６ｃｍディッシュで培養した。１００％コンフルエントになったのを確認した後さらに２４時間培養を続けた。
【０１０２】
（ウシ血管内皮細胞の蛍光染色）
ウシ血管内皮細胞（ｂＥＣ）を蛍光色素ＰＫＨ２６（アルドリッチ製）を使って蛍光染色した。染色方法はメーカーのプロトコルシートに則って行った。
【０１０３】
（蛍光染色したｂＥＣのパターン培養）
実施例８で作製した細胞転写用基板に、５％ウシ胎児血清を含むＭＥＭ培地を加え、蛍光染色したｂＥＣを播種し、これをインキュベータ（３７℃、５％ＣＯ２）内で４８時間パターン培養して細胞転写基板とした。位相差顕微鏡観察により細胞パターンが良好であることを確認した。また、蛍光顕微鏡観察により、ｂＥＣが良く染まっていることを確認した。
【０１０４】
（細胞転写とさらなる培養）
上記線維芽細胞を培養しているディッシュから培地を吸引除去し、上記蛍光染色ｂＥＣをパターン培養した上記細胞転写基板を、線維芽細胞シートとパターン培養されたｂＥＣが相対するように配置し、ディッシュの蓋をし、インキュベータ内で１０分間保持した。その後、ディッシュ内に、０．３％ウシ血清含有ＭＥＭ培地を基板を動かさないよう注意して加え、さらにインキュベータ内で６時間培養した。蛍光顕微鏡観察により、ｂＥＣパターンの幅が５０％程度細くなっていることを確認した。また、細胞転写用基板を注意深く剥離したところ、細胞培養用基板にはｂＥＣは残っておらず、ｂＥＣパターンは線維芽細胞シート上に転写されたことを顕微鏡観察により確認した。
【図面の簡単な説明】
【０１０５】
【図１】本発明の細胞転写用基板の一例を示す概略断面図である。
【図２】本発明の細胞転写用基板を説明するための説明図である。
【図３】本発明の細胞転写用基板の他の例を示す概略断面図である。
【図４】本発明の細胞転写用基板の他の例を示す概略断面図である。
【符号の説明】
【０１０６】
１ … 高分子基材
２ … 中間層
３ … 細胞転写層
４ … 細胞
５ … 被転写体
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞の加工や移植等に用いられ、細胞を活性なまま転写可能な細胞転写基板、およびその細胞転写基板を形成可能な細胞転写用基板に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
近年、細胞を培養して組織化させたものをそのまま移植するという技術が注目されている。これは、合成高分子を用いた人工皮膚や人工血管等では移植後に拒絶反応が生じる可能性があり、使用が難しいという問題があるが、本人の細胞を培養して組織化させた培養細胞組織等を用いる場合には、拒絶反応の心配がなく、移植用に好ましく用いることができることによるものである。
【０００３】
しかしながら、細胞培養基板上で培養された上記培養細胞組織等は、例えば生体組織へ移植することや、加工のために別の培養基板上に移し変えたりすることが難しい、という問題があった。これは、例えば細胞培養基板上でパターン状に培養された培養細胞組織を回収する際、培養細胞組織のみを細胞培養基板から剥離させることが難しいからである。
【０００４】
そこで、例えばたんぱく質分解酵素や化学薬品等を用いて細胞培養基板上から剥離させて、培養細胞組織を回収する方法が提案されている。しかしながらこの方法においては、上記薬品や酵素等により細胞が変性もしくは損傷し、細胞本来の機能が損なわれる可能性があった。また、処理工程が煩雑であり、またコンタミネーションの可能性がある等の問題もあった。
【０００５】
また特許文献１には、基材上に、感温性高分子によるパターンを形成した細胞培養支持体を作製し、その細胞培養支持体上で細胞を培養した後、細胞組織を剥離する方法も提案されている。この方法によれば、感温性高分子上で培養された細胞を、例えば高分子膜等に密着させた状態で、感温性高分子の温度を変化させることにより、シート状の細胞（細胞シート）を感温性高分子から剥離させ、培養液の表面張力の作用で上記細胞シートを高分子膜に密着させることができる。その後、高分子膜側に保持された細胞シートを、培養基板や生体組織等と密着させることによって、上記細胞シートを別の培養基板上に移し変えたり、生体組織上に移植することができるのである。しかしながらこの方法においては、細胞シートの大きさが非常に小さい場合や、細胞がまばらな状態や小さなコロニーを形成した状態で培養された場合には、高分子膜との間の表面張力の作用が十分でなく、細胞が高分子膜上を流れ滑る等して、高分子膜側に密着させることができない、という問題があった。また血管やリンパ管等の脈管網や神経網等、パターン状に培養された細胞を高分子膜に密着させた場合には、パターン状の細胞が高分子膜状を流れ滑る等してこれらのパターンが維持できない、という問題があった。
【特許文献１】特開２００３−３８１７０号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
そこで、培養された細胞パターンの大きさが非常に小さい場合や、培養された細胞がまばらな状態や小さなコロニーを形成した状態で存在する場合、また血管やリンパ管等の脈管網や神経網等のように、培養された細胞がパターン状とされている場合であっても、生体組織等の上にパターンを維持したまま細胞を移植することが可能な細胞転写基板、およびその細胞転写基板に用いられる細胞転写用基板の提供が望まれている。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、高分子基材と、上記高分子基材上に形成された中間層と、上記中間層上に形成された細胞転写層とを有することを特徴とする細胞転写用基板を提供する。
【０００８】
一般的に、高分子基材は、水性コーティング材料や高極性コーティング材料との濡れ性が悪く、本発明に用いられる細胞転写層を形成するために用いられる細胞転写層形成用材料との濡れ性も悪い。したがって、上記高分子基材上に、細胞転写性を有する細胞転写層を均一に形成することが難しい。しかしながら本発明によれば、上記高分子基材と細胞転写層との間に、中間層が形成されていることから、細胞転写層が形成される表面の濡れ性を調整することが可能となり、細胞転写層が均一に形成されたものとすることができるのである。また上記細胞転写層が均一に形成されていることから、細胞転写層上で安定して細胞を培養したり、目的とするパターン状に培養したりすることができ、培養された細胞を活性なまま、別の細胞培養基板上に移し変えたり、生体組織上に直接移植したりすること等が可能となるのである。
【０００９】
上記発明においては、上記細胞転写層が感温性高分子を含有する層としてもよい。この場合、上記細胞転写層が温度によって、細胞との接着性が変化するものとすることができ、効率よく細胞転写層上で培養した細胞組織を、転写することが可能となるからである。
【００１０】
また上記発明においては、上記細胞転写層がポリアルキレングリコールおよびその誘導体を含有する層としてもよい。この場合、上記細胞転写層が、非常に弱い細胞接着性を持つことにより、効率よく細胞転写層上で培養した細胞組織を、被転写物に転写することが可能となるからである。
【００１１】
本発明は、上述したいずれかの細胞転写用基板の細胞転写層上に細胞が接着していることを特徴とする細胞転写基板を提供する。
【００１２】
本発明によれば、上記細胞転写層が均一に形成されていることから、この細胞転写層上に、細胞を安定して培養し、均一に接着させることができる。したがって、細胞転写層上で培養された細胞を、活性なまま被転写体に直接移植等することが可能な細胞転写基板とすることができる。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によれば、上記中間層が形成されていることから、上記細胞転写層が均一に形成されたものとすることができる。したがって、本発明の細胞転写用基板を用いることにより、細胞を安定して培養したり、目的とするパターン状に形成することができ、培養された細胞を活性なまま、別の細胞培養基板上に移し変えたり、生体組織上に直接移植したりすること等が可能となるという効果を奏するものである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
本発明は、細胞の加工や移植等に用いられ、細胞を活性なまま転写可能な細胞転写基板、およびその細胞転写基板を形成可能な細胞転写用基板に関するものである。以下、それぞれについて説明する。
【００１５】
Ａ．細胞転写用基板
まず、本発明の細胞転写用基板について説明する。本発明の細胞転写用基板は、高分子基材と、上記高分子基材上に形成された中間層と、上記中間層上に形成された細胞転写層とを有することを特徴とするものである。
【００１６】
本発明の細胞転写用基板は、例えば図１に示すように、高分子基材１と、その高分子基材１上に形成された中間層２と、中間層２上に形成された細胞転写層３とを有するものである。本発明の細胞転写用基板は、例えば図２に示すように、上記細胞転写層３上に細胞４を接着させて細胞転写基板とし（図２（ａ））、この細胞転写基板で培養された細胞４を、例えば生体組織や細胞培養基板等の被転写体５に密着させて（図２（ｂ））、細胞４のみ被転写体５側に転写する（図２（ｃ））ために用いられるものである。
【００１７】
本発明においては、細胞転写性を有する細胞転写層が形成されていることから、細胞転写層上で培養された細胞を、直接細胞培養基板や生体組織等の被転写体に転写することができ、上記細胞転写層上で培養された細胞パターンの大きさが非常に小さい場合や、培養された細胞がまばらな状態や小さなコロニーを形成した状態で存在する場合、また血管やリンパ管等の脈管網や神経網等のように、培養された細胞がパターン状とされている場合であっても、生体組織等の上にパターンを維持したまま細胞を移植することが可能となる。
【００１８】
ここで一般的に、高分子基材は、水性コーティング材料や高極性コーティング材料と濡れ性が悪く、本発明において細胞転写層の形成に用いられる細胞転写層形成用材料とも濡れ性が悪く、細胞転写層を均一に形成することが難しい。しかしながら、本発明においては、上記中間層を有することから、上記細胞転写層が形成される表面の濡れ性を調整することが可能となり、均一に細胞転写層が形成されたものとすることができるのである。したがって、本発明の細胞転写用基板を用いることにより、細胞転写層上で安定して細胞を培養することや、目的とするパターン状に細胞を培養することが可能となり、細胞を活性なまま被転写体に直接転写することが可能となるのである。
【００１９】
また、本発明においては、上記細胞転写用基板に高分子基材が用いられていることから、細胞転写用基板の柔軟性を高いものとすることができ、曲面を有する生体組織等にも、細胞組織を転写することが可能であり、種々の用途に用いることができる、という利点も有している。
以下本発明の細胞転写用基板について、各構成ごとに詳しく説明する。
【００２０】
１．中間層
まず、本発明の細胞転写用基板に用いられる中間層について説明する。本発明に用いられる中間層としては、高分子基材上に形成されるものであり、後述する細胞転写層を、その上に均一に形成可能なものであれば、特に限定されるものではない。
【００２１】
本発明に用いられる中間層は、液体との接触角が所定の範囲内とされていることが好ましく、具体的には、表面張力７２．７５ｍＮ／ｍ（文献値）の液体（水）との接触角が１°〜５０°の範囲内、中でも５°〜４５°の範囲内とされていることが好ましい。これにより中間層と、細胞転写層を形成するための細胞転写層形成用材料との濡れ性を良好なものとすることができ、中間層上に細胞転写層を均一に形成することが可能となるからである。なお、上記水との接触角は、市販の接触角測定器、例えば協和界面科学（株）製ＣＡ−Ｚ型を用いて、マイクロシリンジから水滴を滴下してから１分間以内に測定した値を元にして求められる。
【００２２】
このような中間層としては、例えば極性高分子を含有する層や無機酸化物を含有する層、またはこれらの複合物からなる層等とすることができる。上記極性高分子としては、例えばポリビニルアルコールや、ポリメタクリル酸−２−ヒドロキシエチル、ポリビニルピロリドン、ポリアクリル酸、ポリスチレンスルホン酸、ポリリジン、ポリエチレンイミン、ポリアリルアミン等を挙げることができる。また、上記無機酸化物としては、例えばケイ素系酸化物、チタン系酸化物、アルミ系酸化物、リン酸化物等を挙げることができる。特に、ケイ素系酸化物による中間層の原料としては、ヘキサメチルジシロキサン、テトラメチルジシロキサンなどの有機ケイ素化合物が好ましい。また、上記無機酸化物はメチル基やフルオロアルキル基等を有する材料とともに用いられてもよい。
【００２３】
このような中間層の形成方法としては、均一に上記中間層を形成可能な方法であれば特に限定されるものではなく、上記中間層の種類に応じて適宜選択される。具体的には、ロールコート法、ダイコート法、ビードコート法等の湿式コーティング法や、吸着法、交互吸着法、スパッタ法、物理的蒸着法（ＰＶＤ法）や、化学的蒸着法（ＣＶＤ法）、プラズマを用いた方法等の乾式コーティング法等が挙げられる。
【００２４】
なお、上記中間層の表面は平坦なものであってもよいが、中間層の表面の濡れ性を調整するために、表面に微細な凹凸を有していてもよい。この場合の中間層の表面粗さとしては、５ｎｍ〜３００ｎｍの範囲内、中でも１５ｎｍ〜２５０ｎｍの範囲内であることが好ましい。これにより、中間層の表面の液体との接触角を上述した範囲とすることができるからである。上記中間層の表面に上記凹凸を形成する方法としては、例えば上記極性高分子を含有する中間層を酸素プラズマ等を用いてドライエッチングする方法や、吸着法により中間層を形成する方法等が挙げられる。ここで上記表面粗さは、市販の原子間力顕微鏡、例えばセイコーインスツルメンツ社製；SPI3800Nを用いて、タッピングモードで測定される値、または市販の走査型電子顕微鏡で断面の高低差を測定した値を元にして求められる。
【００２５】
また上記中間層は、後述する高分子基材上に全面に形成されているものであってもよく、またパターン状に形成されているものであってもよい。中間層がパターン状に形成されている場合には、中間層が形成された領域上にのみ、後述する細胞転写層を形成することができ、パターン状に細胞を培養して転写することが可能となるという利点を有する。なお、上記中間層をパターニングする方法としては、一般的なパターニング方法と同様とすることができる。
【００２６】
また上記中間層の膜厚は、１ｎｍ〜５００ｎｍ程度とされることが好ましく、中でも２ｎｍ〜３００ｎｍ程度、特に５ｎｍ〜２００ｎｍ程度とされることが好ましい。上記膜厚より薄い場合には、均一に中間層を形成することが困難となり、後述する細胞転写層を均一に形成することが困難となるからである。また、上記範囲より厚い場合には、クラック等が入りやすくなり、細胞転写用基板の柔軟性が悪くなる場合があるからである。
【００２７】
２．細胞転写層
次に、本発明に用いられる細胞転写層について説明する。上記細胞転写層は、上記中間層上に形成されるものであり、その表面に細胞を接着させて培養することが可能であって、培養された細胞を、その機能を損なうことなく、例えば他の細胞培養基板や生体組織等に転写することが可能なものであれば特に限定されるものではない。なお、本発明において、細胞転写性とは、基板上で接着培養した細胞を、基板に接着したままの状態で被転写体に生きたまま接触させ、所定時間後、その細胞を被転写体に転写することができる性質をいう。本発明において、基板上で接着培養した細胞を被転写体に接触させてから遅くとも４８時間以内に、基板に接着していた細胞の８０％以上の細胞が被転写体に転写されたとき、基板は細胞転写性を有するものとする。上記細胞転写性の評価は、基板上に接着した細胞を被転写体に所定時間接触させてから基板を剥がし、基板と被転写体とが細胞を介して接触していた所定の領域の基板および被転写体の表面に存在する細胞の数を、市販の顕微鏡で観察することにより評価することができる。被転写体が生体組織等の場合は、被転写体の顕微鏡観察が困難である場合があるが、この場合は、転写操作前の基板の所定の領域の細胞数をあらかじめ数えておき、細胞転写後、基板の上記領域に残存する細胞の数を数えることにより評価することができる。
【００２８】
なお本発明に用いられる細胞転写層は、細胞転写層上で培養された細胞のうちの８０％以上を転写するのに必要な時間が、２４時間以内であるものが好ましく、６時間以内であるものがより好ましい。
【００２９】
ここで、上記細胞転写層に用いられる材料としては、上記細胞転写性を有するものであれば特に限定されるものではない。このような材料としては、例えばフッ素および酸素を含有する材料等が挙げられ、具体的にはナフィオン（商品名）等のイオン性フッ素高分子や、フッ素系シランカップリング剤、フルオロアルキル鎖と水酸基を含むゲル、エチレングリコール系シランカップリング剤等が挙げられる。
【００３０】
また本発明においては、上記細胞転写層として親水性の高分子材料も用いることができる。具体的にはポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）等の感温性高分子や、ポリエチレングリコール、ポリエチレングリコール−ポリプロピレングリコールブロック共重合体等のポリアルキレングリコールおよびその誘導体、リン脂質極性基を有するＭＰＣポリマー（商品名）等の両性イオン高分子等が挙げられる。
【００３１】
また、上記細胞転写層は光触媒を含有していてもよい。具体的には上記細胞転写層を、上記細胞転写性を有する材料と光触媒微粒子との混合物からなる層とすることや、上記細胞転写層を、少なくとも光触媒を含有する光触媒含有層と上記細胞転写性を有する材料からなる層との２層からなる層等とすることができる。この際、用いられる光触媒としては、例えば特開２００１−２４９２１９号公報に記載されているものと同様とすることができる。
【００３２】
本発明においては、特に上記の中でも感温性高分子を含有する層であることが好ましい。これにより、細胞転写層上で細胞を培養した後、温度を変化させることにより細胞と細胞転写層との接着性を変化させることができ、効率よく細胞を被転写物に直接転写させることが可能となるからである。
【００３３】
また本発明においては、ポリアルキレングリコールおよびその誘導体を用いてもよく、特にポリエチレングリコールを用いることが好ましい。これらの材料は、高い細胞接着阻害性を有するが、上記光触媒等を用いた改質により、非常に弱い細胞接着性を有する細胞転写層を形成することが可能であり、その結果、効率よく細胞を被転写物に直接転写することが可能となるからである。
【００３４】
上記細胞転写層の形成方法としては、上記細胞転写層の種類や、細胞転写用基板の形状等に合わせて適宜選択されるものであるが、通常ロールコート法、ダイコート法、ビードコート法等の湿式コーティング法や、吸着法、交互吸着法等を用いることができる。
【００３５】
また、上記細胞転写層は、全面が細胞との接着性を有する細胞接着領域であってもよいが、例えば図３に示すように、細胞転写層３が、細胞との接着性を有する細胞接着領域６と、細胞と接着性を有しない細胞接着阻害領域７とからなるものであってもよい。細胞転写層が、上記細胞接着領域と細胞接着阻害領域とを有する場合、細胞接着領域上にのみ細胞を接着させて培養することが可能となり、パターン状に細胞を転写することが可能となる。
【００３６】
ここで、上記細胞を培養し、かつ転写するために用いられる細胞接着領域は、転写する細胞の種類等により適宜選択されるものであるが、通常、細胞転写層表面の水との接触角が１０°〜６０°程度の領域、中でも１５°〜５５°の範囲内の領域とされていることが好ましい。このような水との接触角を有するものとすることにより、細胞を細胞転写層上に接着させて培養し、活性なまま被転写体に転写することができるからである。また上記範囲より水との接触角が大きい場合には、細胞を細胞転写層上に接着させることは可能であるが、転写することが困難となり、上記範囲より水との接触角が小さい場合には、細胞を細胞転写層上に接着させることが困難となるからである。なお、細胞を転写するパターンの幅が１ｍｍ以下のラインやドットである場合等には特に、上記細胞接着領域表面の水との接触角が、１０°〜４５°の範囲内、中でも１５°〜３５°の範囲内とされていることが好ましい。このような範囲内とすることにより、高精細なパターン状に細胞を転写することが可能となるからである。
【００３７】
また、細胞転写層が上記細胞接着阻害領域を有する場合には、この細胞接着阻害領域は、上記細胞接着領域の液体との接触角より、５０°〜１６０°程度、中でも６０°〜１５０°程度液体との接触角が大きい領域、もしくは細胞接着領域の液体との接触角より１０°〜４０°程度、中でも１５°〜３５°程度液体との接触角が小さい領域とすることが好ましい。このような領域では、細胞との接着性が悪いものとすることができるからである。
【００３８】
上記細胞接着領域と細胞接着阻害領域とを形成する方法としては、例えば細胞と接着阻害性を有する層を形成した後、細胞接着領域とする部分のみ液体との接触角を変化させる方法や、細胞接着性を有する層を形成した後、細胞接着阻害領域とする部分のみの液体との接触角を変化させる方法等が挙げられる。例えば上述したような材料を用いて細胞転写層を形成した後、細胞接着領域とする部分のみ、もしくは細胞接着阻害領域とする部分のみ、液体との接触を低下させる方法や、上述したような材料を用いて細胞転写層を形成した後、細胞接着領域とする部分のみ、もしくは細胞接着阻害領域とする部分のみ液体との接触角を高くする方法等が挙げられる。
【００３９】
上述したような細胞転写層の液体との接触角を大きいものとする方法としては、例えば細胞転写層表面に微細な凹凸を形成する方法等が挙げられ、例えば、資料ジャパニーズ・ジャーナル・オブ・アプライド・フィジックス、パート２、３２巻、Ｌ６１４〜Ｌ６１５、１９９３年 Ｏｇａｗａら、に開示されている方法や、資料ラングミュア、１９巻、１０６２４〜１０６２７、２００３年 Ｔｅｓｈｉｍａら、に開示されている方法を用いることができる。
【００４０】
また、上記細胞転写層の液体との接触角を小さくする方法としては、例えばエネルギー照射に伴う光触媒の作用を利用し、撥液性を有する基を分解または変性させる方法や、熱照射、紫外光照射、電子線照射等により撥液性を有する基を分解または変性させる方法等が挙げられる。上述したように、細胞転写層中に光触媒が含有されている場合には、この細胞転写層中の光触媒の作用を利用して、細胞転写層との液体との接触角を低下させることができる。また、細胞転写層中に光触媒が含有されていない場合には、例えば特開２００１−２４９２１９号公報に記載されている光触媒を用いたパターニング方法や、特開２００３−２２２６２６号公報に記載されている光触媒を用いたパターニング方法等を用いて、細胞転写層の液体との接触角を低下させることができる。また、熱照射や紫外光照射、電子線照射等によるパターニングは、これらのエネルギーを用いてパターニングする一般的な方法と同様とすることができるので、ここでの詳しい説明は省略する。
【００４１】
また、上記細胞転写層は、上記中間層上の全面に形成されていてもよいが、パターン状に形成されていてもよい。このようなパターニング方法としては、一般的なパターニング方法と同様とすることができる。
【００４２】
ここで、上述したような細胞転写層の膜厚としては、上記細胞転写層の種類等により適宜選択されるものであるが、通常１ｎｍ〜１０００ｎｍ程度、好ましくは、１．５ｎｍ〜７５０ｎｍ程度、中でも２０ｎｍ〜５００ｎｍ程度とされることが好ましい。上記範囲内とすることにより、細胞を安定して培養し、転写することが可能となるからである。
【００４３】
３．高分子基材
次に、本発明に用いられる高分子基材について説明する。本発明に用いられる高分子基材は、上記中間層が均一に形成可能なものであり、公知の方法で滅菌できることが可能なものであれば高分子基材の種類等は特に限定されるものではない。公知の滅菌方法としては、例えばγ線を照射して滅菌する方法、紫外光を照射して滅菌する方法、電子線を照射して滅菌する方法、オートクレーブにより滅菌する方法等が挙げられる。
【００４４】
このような高分子基材としては、可撓性や透明性等、細胞転写用基板が必要とされる機能に基づき適宜選択され、例えば、ポリプロピレン、ポリメチルペンテン、ポリプロピレン共重合体、テフロン（登録商標）やエチレン−テトラフロオロエチレン共重合体等のフッ素樹脂、ポリカーボネート、アセタール樹脂、ポリサルフォン、ポリ塩化ビニル、シリコーン樹脂、ポリスチレン、スチレン−アクリロニトリル共重合体、ポリメタクリル酸メチルなどのアクリル樹脂、ポリウレタン、ポリエステル、ポリイミド、ポリグリコール酸、ポリ乳酸、コラーゲン、エラスチン等の生体吸収性高分子等を用いることができる。また、不織布や織布等も用いることができる。
【００４５】
また上記高分子基材は多孔質であっても良く、この高分子基材は、細胞転写層上に培養された細胞を転写する前に、フィーダー細胞を用いて共培養する必要がある場合等に特に有用である。またこの場合、細胞転写操作時に、培養液や酸素が全ての細胞に均一に行き渡るという効果もある。この場合、孔の平均の大きさは細胞の種類に依存するが、通常０．１μｍ〜５μｍであることが好ましく、０．２μｍ〜１．５μｍであることがさらに好ましい。孔の大きさが０．１μｍ未満だと栄養や液性因子などの培養細胞への供給効率が悪くなるからである。また孔の大きさが５μｍを超えると孔の中や高分子基材の裏面まで培養細胞が接着する割合が増し、培養細胞を効率良く転写できなくなるからである。
【００４６】
また、例えば図４に示すように、上記高分子基材１は、細胞転写層３が形成されるパターン状に凹部や凸部が形成されたものであってもよい。この場合、上記凸部上にのみ、もしくは凹部上にのみ細胞転写層を形成して高精細なパターン状に細胞を培養し、転写することが可能となる。このような凹部や凸部の幅としては、通常１０μｍ〜５００μｍ程度、中でも２０μｍ〜２００μｍ程度とすることができる。また、上記凹部や凸部の高さとしては、０．１μｍ〜１００μｍ程度、中でも０．２μｍ〜２０μｍ程度とすることができる。
【００４７】
ここで、上述した高分子基材の厚みは、１μｍ〜２５０μｍ、中でも５μｍ〜２００μｍとされることが好ましい。上記範囲より薄い場合には、柔軟性が非常に高いため、取り扱いが非常に難しくなったり、強度が不足し、簡単に裂けたり破れたりする場合があるからである。また上記範囲より厚みが厚い場合には、柔軟性が不足することから、細胞転写用基板上に培養された細胞を転写する際、被転写物との密着性が悪くなる場合があるからである。
【００４８】
４．細胞転写用基板
本発明の細胞転写用基板は、上記高分子基材、中間層、および細胞転写層を有するものであれば、特に限定されるものではなく、必要に応じて適宜他の層を有していてもよく、例えば上記細胞転写層上に細胞転写補助層等が形成されているもの等とすることができる。以下、本発明に用いられる細胞転写補助層について説明する。
【００４９】
（細胞転写補助層）
上記細胞転写補助層としては、細胞転写層上に形成されるものであり、この細胞転写補助層上に細胞が接着されることとなる。このような細胞転写補助層は、細胞転写補助層上で細胞を培養した後、細胞を転写する際、細胞と一緒に被転写体側に少なくとも一部が一緒に転写される。本発明においては、このような細胞転写補助層が形成されていることにより、より効率よく細胞を被転写体上に転写させることが可能となるのである。このような細胞転写補助層としては、被転写体側に影響を及ぼさないものが選択され、例えばコラーゲン等のポリペプチドや、ヒアルロン酸等の多糖類、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、アルギン酸、ポリビニルアルコール、ポリリジン等が挙げられる。また上記細胞転写補助層中には、カルシウムイオンやマグネシウムイオン等の金属イオンが含まれていてもよい。
【００５０】
Ｂ．細胞転写基板
次に本発明の細胞転写基板について説明する。本発明の細胞転写基板は、上述した細胞転写用基板の細胞転写層上に細胞を接着させたものである。本発明の細胞転写基板は、例えば図２（ａ）に示すように、高分子基材１と、その高分子基材１上に形成された中間層２と、その中間層２上に形成された細胞転写層３と、細胞転写層３上に接着した細胞４とを有するものである。
【００５１】
上述した細胞転写用基板には、上記中間層が形成されていることから、上記細胞転写層が均一に形成されている。したがって本発明によれば、この細胞転写層上に、細胞を安定して培養し、均一に接着させることができ、細胞転写層上で培養された細胞を、活性なまま被転写体に直接移植等することが可能な細胞転写基板とすることができる。また本発明によれば、培養された細胞パターンの大きさが非常に小さい場合や、培養された細胞がまばらな状態や小さなコロニーを形成した状態で存在する場合、また血管やリンパ管等の脈管網や神経網等のように、培養された細胞がパターン状とされている場合であっても、生体組織等の上にパターンを維持したまま細胞を移植することが可能となるのである。
以下、本発明に用いられる細胞について説明する。
【００５２】
１．細胞
本発明において、上記細胞転写層上に接着される細胞としては、血球系細胞やリンパ系細胞などの浮遊細胞でもよく、また接着性細胞でもよい。本発明においては、特に接着性を有する細胞であることが好ましい。このような接着性を有する細胞としては、例えば、肝臓の実質細胞である肝細胞、血管内皮細胞、繊維芽細胞、表皮角化細胞などの表皮細胞、気管上皮細胞、消化管上皮細胞、子宮頸部上皮細胞、水晶体上皮細胞などの上皮細胞、乳腺細胞、平滑筋細胞や心筋細胞などの筋細胞、腎細胞、膵ランゲルハンス島細胞、末梢神経細胞や視神経細胞などの神経細胞、軟骨細胞、骨細胞などが挙げられる。またこれらの細胞は、組織や器官から直接採取した初代細胞でもよく、あるいは、それらを何代か継代させたものでもよい。また株化された細胞でもよい。さらにこれら細胞は、未分化細胞であるＥＳ細胞、多分化能を有する多能性幹細胞、単分化能を有する単能性幹細胞、分化が終了した細胞の何れであっても良い。また、細胞は単一種を培養してもよいし二種以上の細胞を共培養したものであってもよい。
【００５３】
２．細胞転写基板
本発明の細胞転写基板は、上記高分子基材、中間層、細胞転写層、および細胞を有するものであれば、特に限定されるものではない。本発明の細胞転写基板は、上記細胞転写層上で培養された細胞を、加工のために別の培養基板上に移し変えたり、上記細胞を生体組織上に移植する際に用いられることとなる。
【００５４】
なお、本発明は上記実施形態に限定されるものではない。上記実施形態は、例示であり、本発明の特許請求の範囲に記載された技術的思想と実質的に同一な構成を有し、同様な作用効果を奏するものは、いかなるものであっても本発明の技術的範囲に包含される。
【実施例】
【００５５】
以下に実施例を示し、本発明をさらに具体的に説明する。
【００５６】
［実施例１］
（中間層の形成）
厚さ２５μｍのポリエステルフィルムを用意し、ＣＶＤチャンバー内の真空度を４．０×１０−３Ｐａに減圧し、電極に９０ｋＨｚの周波数を有する電力（投入電力３００Ｗ）を印加した。その後、ヘキサメチルジシロキサン、酸素ガス、ヘリウムガスをそれぞれ所定量投入し、真空度が３０ＭＰａとなるように制御した。これにより、プラズマ気相成長法（ＣＶＤ法）による酸化珪素系薄膜（中間層）が、厚さ約１００ｎｍで形成された。
【００５７】
（細胞転写層の形成）
オルガノシランＴＳＬ８１１４（ＧＥ東芝シリコーン）０．４ｇとフルオロアルキルシランＴＳＬ８２３３（ＧＥ東芝シリコーン）０．４ｇとをイソプロピルアルコール５ｇで希釈し、１５分以上攪拌した。上記溶液に１，３−ブタンジオールを添加し、１５分以上攪拌した。このようにして調製した溶液を上記中間層上にスピンコーティングし、乾燥させて細胞転写層とした。細胞転写層表面の水との接触角の平均値は１０３．１°だった。
【００５８】
（露光処理用フォトマスクの作製）
テトラメトキシシランおよびＨＣｌを１２時間以上混合し、これをイソプロピルアルコールで希釈した。このようにして調製した溶液を、幅６０μｍの開口部と幅３００μｍの遮光部とが交互に配置されたラインパターンを有するフォトマスクのクロムパターン面上にスピンコーティングし、その後１５０℃で乾燥させた。
次に、酸化チタンゾル液に硝酸銅を加えた溶液を作製し、上記マスクにスピンコーティングし、１５０℃で乾燥させることにより、透明な光触媒含有層を有する露光処理用フォトマスクを形成した。
【００５９】
（細胞転写層の露光処理）
上記露光処理用フォトマスクの光触媒含有層面と上記細胞転写層とを対向させ、フォトマスク側から水銀ランプにより１４Ｊ／ｃｍ２の照射量で紫外線照射を行った。これにより、幅６０μｍのライン状の細胞接着領域及び幅３００μｍの細胞接着阻害領域が交互に形成された細胞転写用基板を得た。上記細胞接着領域表面の水との接触角の平均値は２１．７°であった。
【００６０】
（細胞培養）
上述した細胞転写用基板を常法によりオートクレーブ滅菌した。細胞はウシ由来の頚動脈内皮細胞を用いた。細胞転写用基板をウェルプレート上に並べ、５％血清を含むＭＥＭ培地を加え、１×１０６ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌになるように細胞を播種した。これを３７℃で１６時間培養することにより、高い配向性で細胞が幅６０μｍの細胞接着領域上に接着した細胞転写基板とした。
【００６１】
（細胞転写とさらなる培養）
細胞転写のために、ＥＨＳマウス腫瘍細胞から抽出した可溶化基底膜を調製したもの（以下、細胞被転写用機能材料ともいう。）を使用した。上記細胞転写基板の細胞面を、細胞被転写用機能材料に接触させ、その後０．３％血清を含むＭＥＭ培地を加えた。これを３７℃で５．５時間培養した後に、細胞転写基板を剥がし、さらに１２時間細胞被転写用機能材料中で培養した。顕微鏡で観察し、細胞が管腔化していることを確認した。また、転写の前後において所定の領域の基板上の細胞数を計測することにより、細胞が９５％転写したことを確認した。
【００６２】
［実施例２］
（中間層の形成）
実施例１と同様に、厚さ１５０μｍのポリエステルフィルム上に、膜厚６５ｎｍのメチル基を含む酸価珪素系薄膜（中間層）を形成した。
【００６３】
（細胞転写層の形成）
上記中間層表面を紫外線洗浄した後、その表面にシランカップリング剤ＸＣ９８−Ｂ２４７２（ＧＥ東芝シリコーン）をイソプロピルアルコールで１０倍希釈したコーティング剤をスピンコーティングにより塗布した。続いて、１５０℃で１０分間乾燥させることにより、細胞転写層が形成された細胞転写用基板を得た。上記細胞転写層の水との接触角の平均値は１０１．８°だった。
【００６４】
（露光処理用フォトマスクの作製）
ヒトの眼底血管写真をベースにした血管パターンを開口部とするフォトマスクを作製した。このフォトマスクに実施例１と同様の方法で光触媒含有層を形成した。
【００６５】
（細胞転写層の露光処理）
上記露光処理用フォトマスクの光触媒含有層面と細胞転写層とを対向させ、露光処理用フォトマスク側から水銀ランプにより１３Ｊ／ｃｍ２の照射量で紫外線照射を行った。これにより眼底血管パターン状の細胞接着領域、及びそれ以外の細胞接着阻害領域を有する細胞転写用基板を得た。上記細胞接着領域の水との接触角の平均値は２５．２°だった。
【００６６】
（細胞培養）
上記細胞転写用基板を常法によりオートクレーブ滅菌した。細胞はヒト臍帯静脈内皮細胞を用いた。上記細胞転写用基板をウェルプレート上に並べ、２０％ウシ胎児血清と成長因子ＥＣＧＳとヘパリンを加えたＲＰＭＩ培地を加え、１×１０６ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌになるように細胞を播種した。これを３７℃で１６時間培養することにより、高い配向性で細胞が６０μｍの細胞接着領域上に接着した細胞転写基板とした。
【００６７】
（細胞転写とさらなる培養）
実施例１と同様に、細胞を細胞被転写用機能材料上に転写し、細胞が管腔したことを確認した。また、細胞転写用基板の所定の領域に存在していた細胞数と細胞被転写用機能材料上の所定の領域の細胞数を計測したところ、細胞転写率は、１００％であった。
【００６８】
［実施例３］
（中間層の形成）
直径約２０ｍｍの未処理ポリスチレン（ＰＳ）シートを用意し、実施例１と同様の方法で中間層を形成した。これを酸素プラズマ処理し、フィルム表面にシラノール基を生成した。
【００６９】
（細胞転写層の形成）
上記処理済ＰＳシートを、すばやくγ−メタクリロキシプロピルトリメトキシシラン（ＧＥ東芝シリコーン）のトルエン溶液（濃度３％）に２時間浸漬した。その後トルエンで洗浄し窒素ガスで乾燥した。続いてＰＳシートを３５ｍｍディッシュの中に配置し、Ｎ−イソプロピルアクリルアミドをイソプロピルアルコールで５５％に希釈した溶液を上記ＰＳシート上に展開した。このＰＳシートに対して電子線を照射し、さらに水洗することにより、中間層上にポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）層からなる細胞転写層が形成された。
【００７０】
（細胞転写層の露光処理）
実施例１とネガポジ反転したパターンを有する通常のフォトマスクを用い、上記細胞転写層に真空紫外線を３０分間照射し、照射部のポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）を酸化分解により除去し、細胞転写用基板とした。
【００７１】
（細胞培養）
細胞転写用基板を常法によりエチレンオキサイドガス滅菌した。その後、実施例１と同様の条件で細胞転写用基板上に細胞を培養し、ウシ血管内皮パターンが形成された細胞転写基板とした。
【００７２】
（細胞転写とさらなる培養）
マウス骨芽細胞様細胞(MC3T3E1)を１０ｃｍディッシュに播種し、コンフルエントになったのを確認した後さらに２日以上インキュベートし、細胞外基質産生を促した。上記ウシ血管内皮パターンが形成された細胞転写基板を上記骨芽細胞シート上に、細胞が相対するように静かに配置し、その後、培地を静かにディッシュ内に注いだ。この状態を２５℃で４０分間維持した。その後、血管内皮パターンが骨芽細胞シートと細胞転写用基板にサンドイッチされた状態のまま、ディッシュを３７℃のＣＯ２インキュベータ内に戻し共培養を２４時間実施した後に、基板のみを剥がしてさらに２４時間培養した。顕微鏡で観察を行うと、骨芽細胞様細胞層上に内皮細胞がパターン状に配置され且つ管腔状になっていることが確認できた。また、細胞転写の前後において細胞転写用基板の所定の領域に存在する細胞数を数えることにより、細胞が８５％転写したことを確認した。
【００７３】
［実施例４］
（中間層の形成）
平均１μｍの孔が開いている多孔質ポリエステルシートを酸素プラズマ装置に入れ５×１０−５Ｐａに減圧した。酸素圧を５Ｐａに調整し１０分間酸素プラズマ処理した。この処理済多孔質ポリエステルシートに、実施例１と同様に厚さ１０ｎｍのメチル基を含む酸価珪素系薄膜（中間層）を形成した。
【００７４】
（細胞転写層の形成）
上記中間層を酸素プラズマ処理し、その後速やかに、ヘプタデカフルオロ−１，１，２，２−テトラヒドロデシル−１−トリメトキシシラン（信越化学）０．２ｃｃを含むテフロン（登録商標）容器（容積６５ｃｍ３）に入れ、容器を密閉し１００℃のオーブン内で５時間保持して細胞転写層を形成した。
【００７５】
（細胞転写層の露光処理）
実施例１と同じ露光処理用フォトマスクを用い、露光処理用フォトマスク側から水銀ランプを用いて１４Ｊ／ｃｍ２の照射量で紫外線照射を行った。これにより、幅６０μｍのライン状の細胞接着領域、及び幅３００μｍの細胞接着阻害領域が交互に形成された細胞転写用基板を得た。
【００７６】
（細胞培養、および細胞転写とさらなる培養）
実施例１と同様に、上記細胞転写用基板上に細胞を接着させて培養し、細胞被転写用機能材料上に転写した。これにより、細胞が管腔したことを確認した。また、基板の所定の領域の細胞数を計測することで、細胞転写率が９０％であることを確認した。
【００７７】
［実施例５］
（中間層の形成）
厚さ１５μｍのポリ乳酸フィルムを用い、実施例１と同様の方法により中間層を形成した。
【００７８】
（細胞転写層の形成）
上記中間層表面をＵＶ洗浄した。次いで、シランカップリング剤ＸＣ９８−Ｂ２４７２（ＧＥ東芝シリコーン）をイソプロピルアルコールで１０倍希釈し、ここに１，３−ブタンジオールを濃度１０％となるように添加し、攪拌した。このコーティング液をスピンコート法により塗布し、５５℃で２４時間乾燥させた。その後、よく水洗し乾燥させて細胞転写層とした。この細胞転写層の水との接触角の平均値は１０４．７°であった。
【００７９】
（細胞転写層の露光処理）
実施例１と同じ露光処理用フォトマスクを用い、露光処理用フォトマスク側から水銀ランプを用いて１４Ｊ／ｃｍ２の照射量で紫外線照射を行った。これにより、幅６０μｍのライン状の細胞接着領域及び幅３００μｍの細胞接着阻害領域が交互に形成された細胞転写用基板を得た。
【００８０】
（細胞培養）
上記細胞転写用基板を７０％エタノールで滅菌した後、実施例１と同様に細胞を培養し、細胞接着領域上に予めＰＫＨ２６（アルドリッチ）で蛍光染色した血管内皮細胞を接着させ、細胞転写基板とした。
【００８１】
（細胞転写とさらなる培養）
滅菌処理下で、ヌードマウス（日齢５、オス）より、背部の皮膚、腹膜及び肝臓をそれぞれ摘出し、３５ｍｍ培養ディッシュに入れ、皮膚は皮下組織、肝臓は漿膜を剥離した。これらの摘出組織に、血管内皮細胞が接着している上記細胞転写基板を乗せた。その培養ディッシュに３ｍｌの培養液（５％ウシ胎児血清含有ＭＥＭ培地）をいれ、４８時間培養した。その後、ピンセットで細胞転写基板を除去したところ、内皮細胞は摘出組織上に保持された。組織切片を顕微鏡観察したところ、摘出組織上に血管内皮パターンが形成されていることが確認された。また、転写前の細胞転写基板の所定の領域に存在する細胞数と、転写後の所定の領域に残存する細胞数を計測することで、９５％の細胞が転写したことを確認した。
【００８２】
［実施例６］
（微細凹凸中間層の形成）
直径２３ｍｍのポリエステルシートをＵＶ洗浄した。次に、ポリジアリルジメチルアンモニウムクロライド（アルドリッチ）の０．２％溶液（０．２Ｍ塩化ナトリウム含有）に浸漬し水洗することによって、ポリエステルシート上にカチオン性ポリマーの吸着層を形成した。次いでスフェリカスラリーＳ１２０（触媒化成工業）に上記ＰＥＴシートを浸漬し、水洗することによって、シリカ粒子吸着層からなる中間層を形成した。
【００８３】
（細胞転写層の形成）
シランカップリング剤ＸＣ９８−Ｂ２４７２（ＧＥ東芝シリコーン）をイソプロピルアルコールで１０倍希釈したコーティング液を上記中間層上にスピンコート法により塗布し、１５０℃で１５時間乾燥させて細胞転写層とした。この細胞転写層の水との接触角の平均値は１３７．２°であった。
【００８４】
（細胞転写層の露光処理）
実施例１と同じ露光処理用フォトマスクを用い、露光処理用フォトマスク側から水銀ランプを用いて１２Ｊ／ｃｍ２の照射量で紫外線照射を行った。これにより、幅６０μｍのライン状の細胞接着領域及び幅３００μｍの細胞接着阻害領域が交互に形成された細胞転写用基板を得た。細胞接着領域の水との接触角の平均値は２０．０°であった。
【００８５】
（細胞培養、および細胞転写とさらなる培養）
実施例１と同様に、上記細胞転写用基板上に細胞を接着させて細胞転写基板とし、この細胞転写基板上の細胞を細胞被転写用機能材料上に転写した。これにより、細胞が細胞被転写用機能材料内で管腔したことを確認した。また、細胞転写の前後において所定の領域の細胞数を計測し、細胞転写率が９２％であることを確認した。
【００８６】
［実施例７］
（中間層の形成および細胞転写層の形成）
実施例１と同様に中間層を形成した後、実施例６と同様に、細胞転写層を形成した。この細胞転写層の水との接触角の平均値は１０２．２°であった。
【００８７】
（露光処理用フォトマスクの作製）
実施例１と同様の手順により、遮光部中に直径１８ｍｍの円状の開口部が２０ｍｍ間隔で多数配置されたドットパターンを有する透明な光触媒含有層を有する露光処理用フォトマスクを形成した。
【００８８】
（細胞転写層の露光処理）
上記露光処理用フォトマスクの光触媒含有層面と、上記細胞転写層とを対向させ、露光処理用フォトマスク側から水銀ランプを用いて４Ｊ／ｃｍ２の照射量で紫外線照射を行い、直径１８ｍｍの円状の細胞接着領域と、その周囲に細胞接着領域が形成された細胞転写用基板を得た。この細胞接着領域の水との接触角の平均値は４９．６°であった。
次いで、細胞転写用基板を７．５ｃｍ角に切り取った。この際、切り取られた細胞転写用基板には、細胞接着領域が４箇所含まれるものとした。
【００８９】
（細胞培養）
細胞転写用基板を定法によりオートクレーブ滅菌した。細胞は、ウシ由来の頚動脈内皮細胞を用いた。上記細胞転写用基板を角型のディッシュに配置し、５％血清を含むＭＥＭ培地を加え、１×１０６ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌとなるように細胞を播種した。これを３７℃で１６時間培養することにより、円形の細胞接着領域にのみ内皮細胞をコンフルエントに接着させて細胞転写基板とした。
【００９０】
（細胞転写とさらなる培養）
細胞転写のために、ＥＨＳマウス腫瘍細胞から抽出した可溶化基底膜を調製したもの（以下、細胞被転写用機能材料ともいう。）を使用した。上記細胞転写基板の細胞面を、細胞被転写用機能材料に接触させ、その後０．３％血清を含むＭＥＭ培地を加えた。これを３７℃で５．５時間培養した後に、細胞転写基板を剥がし、さらに２４時間細胞被転写用機能材料中で培養した。培養中、血管内皮細胞は、一部再配列し、管腔を形成した。また、細胞転写前後において、所定の領域の細胞数を計測することにより、細胞が８０％転写したことを確認した。
【００９１】
［実施例８］
（細胞転写層の形成）
（第一段階目の反応）
実施例１で作製した、厚さ２５μｍのポリエステルに酸化珪素系薄膜（中間層）が厚さ１００ｎｍで形成された中間層付き基材の中間層表面をＵＶ洗浄した。トルエン３９．０ｇ、シランカップリング剤ＴＳＬ８３５０（ＧＥ東芝シリコーン製）１３．５ｇを混合し、攪拌しながらトリエチルアミンを４５０μｌ添加した。そのまま室温で数分間攪拌した後、全量をガラス皿へ移した。ここに上記ＵＶ洗浄済み中間層付き基材を浸漬し、室温で１６時間放置した。その後、中間層付き基材をエタノールと水で洗浄し、乾燥させた。これにより、中間層表面にエポキシ基を含む薄膜が形成された。
【００９２】
（第二段階目の反応）
５０ｇのテトラエチレングリコールを攪拌しながら２５０μｌの濃硫酸を一滴ずつ添加した。そのまま数分間攪拌してから、全量をガラス皿に移した。ここに上記中間層付き基材を浸漬し、８０℃で３０分間反応させた。反応後、上記中間層付き基材をよく水洗し、乾燥させた。これにより、中間層表面に、細胞転写層としての均一な親水性薄膜が形成された。
【００９３】
（細胞転写層の露光処理）
実施例１と同様にして、１０Ｊ／ｃｍ２の照射量で紫外線照射を行った。これにより、幅６０μｍのライン状の細胞接着領域及び幅３００μｍの細胞接着阻害領域が交互に形成された細胞転写用基板を得た。上記細胞接着領域表面の水との接触角の平均値は１５．８°であった。
【００９４】
（細胞培養）
上記細胞転写用基板を常法によりオートクレーブ滅菌した。細胞はヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ、クラボウ）を用いた。上記細胞転写用基板をウェルプレートに並べ、正常ヒト血管内皮細胞用低血清培地であるＨｕＭｅｄｉａ−ＥＧ２（クラボウ）を加え、１×１０６ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌになるように細胞を播種した。これを３７℃、５％ＣＯ２濃度のインキュベータ内で４６時間培養することにより、細胞接着領域にのみＨＵＶＥＣをコンフルエントな状態で接着させて細胞転写基板とした。
【００９５】
（細胞転写とさらなる培養）
上記細胞転写基板と成長因子低減マトリゲル（ベクトン・ディッキンソン）とを、細胞面がマトリゲルと対面するように接触させ、数分保持した。その後、ＨｕＭｅｄｉａ−ＥＧ２を培養容器に入れ、３７℃、５％ＣＯ２濃度のインキュベータ内で２時間培養した。位相差顕微鏡で観察したところ、ＨＵＶＥＣが形態変化しチューブ状になっていることを確認した。その後、細胞転写用基板のみを剥がしたところ、細胞転写用基板は簡単に剥がすことができ、ＨＵＶＥＣは、マトリゲル上に保持された。位相差顕微鏡で観察したところ、ＨＵＶＥＣのチューブ状の形態にほとんど乱れがなかったことを確認した。また転写の前後において所定の領域の基板上の細胞数を計測することにより、細胞がほぼ１００％マトリゲルに転写されていることを確認した。
【００９６】
［実施例９］
（細胞転写層の形成）
（第一段階目の反応）
実施例２で作製した、厚さ１５０μｍのポリエステルに酸化珪素系薄膜（中間層）が厚さ６５ｎｍで形成された中間層付き基材の中間層表面をＵＶ洗浄した。トルエン３９．０ｇ、シランカップリング剤ＴＳＬ８３５０（ＧＥ東芝シリコーン製）１３．５ｇを混合し、攪拌しながらトリエチルアミンを４５０μｌ添加した。そのまま室温で数分間攪拌した後、全量をガラス皿へ移した。ここにＵＶ洗浄済み上記中間層付き基材を浸漬し、室温で１６時間放置した。その後、上記中間層付き基材をエタノールと水で洗浄し、乾燥させた。これにより、中間層表面にエポキシ基を含む薄膜が形成された。
【００９７】
（第二段階目の反応）
５０ｇの平均分子量４００のポリエチレングリコール（ＰＥＧ４００）を攪拌しながら２５μｌの濃硫酸を一滴ずつ添加した。そのまま数分間攪拌してから、全量をガラス皿に移した。ここに上記中間層付き基材を浸漬し、８０℃で２０分間反応させた。反応後、上記中間層付き基材をよく水洗し、乾燥させた。これにより、中間層表面に、細胞転写層としての均一な親水性薄膜が形成された。
【００９８】
（細胞転写層の露光処理）
実施例１と同様にして、１０Ｊ／ｃｍ２の照射量で紫外線照射を行った。これにより、幅６０μｍのライン状の細胞接着領域及び幅３００μｍの細胞接着阻害領域が交互に形成された細胞転写用基板を得た。上記細胞接着領域表面の水との接触角の平均値は１７．２°であった。
【００９９】
（細胞培養）
上述した細胞転写用基板を常法によりオートクレーブ滅菌した。実施例８と同様にして、ウェルプレートにＨｕＭｅｄｉａ−ＥＧ２（クラボウ）を加え、１×１０６ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌになるようヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ、クラボウ）を播種した。これを３７℃、５％ＣＯ２濃度のインキュベータ内で４６時間培養することにより、細胞接着領域にのみＨＵＶＥＣをコンフルエントな状態で接着させて細胞転写基板とした。
【０１００】
（細胞転写とさらなる培養）
上記細胞転写基板と、成長因子低減マトリゲル（ベクトン・ディッキンソン）とを、細胞面がマトリゲルと対面するように接触させ、その後、ＨｕＭｅｄｉａ−ＥＧ２を培養容器に入れ、３７℃、５％ＣＯ２濃度のインキュベータ内で２時間培養した。位相差顕微鏡で観察したところ、ＨＵＶＥＣが形態変化しチューブ状になっていることを確認した。その後、細胞転写用基板のみを剥がしたところ、細胞転写用基板は簡単に剥がすことができ、ＨＵＶＥＣは、マトリゲル上に保持された。位相差顕微鏡で観察したところ、ＨＵＶＥＣのチューブ状の形態にほとんど乱れがなかったことを確認した。また転写の前後において所定の領域の基板上の細胞数を計測することにより、細胞がほぼ１００％マトリゲルに転写されていることを確認した。
【０１０１】
［実施例１０］
（線維芽細胞の培養）
マウス胚の線維芽細胞ＢＡＬＢ／３Ｔ３クローンＡ３１を、１０％ウシ胎児血清を含むＤＭＥＭ培地を加えた６ｃｍディッシュで培養した。１００％コンフルエントになったのを確認した後さらに２４時間培養を続けた。
【０１０２】
（ウシ血管内皮細胞の蛍光染色）
ウシ血管内皮細胞（ｂＥＣ）を蛍光色素ＰＫＨ２６（アルドリッチ製）を使って蛍光染色した。染色方法はメーカーのプロトコルシートに則って行った。
【０１０３】
（蛍光染色したｂＥＣのパターン培養）
実施例８で作製した細胞転写用基板に、５％ウシ胎児血清を含むＭＥＭ培地を加え、蛍光染色したｂＥＣを播種し、これをインキュベータ（３７℃、５％ＣＯ２）内で４８時間パターン培養して細胞転写基板とした。位相差顕微鏡観察により細胞パターンが良好であることを確認した。また、蛍光顕微鏡観察により、ｂＥＣが良く染まっていることを確認した。
【０１０４】
（細胞転写とさらなる培養）
上記線維芽細胞を培養しているディッシュから培地を吸引除去し、上記蛍光染色ｂＥＣをパターン培養した上記細胞転写基板を、線維芽細胞シートとパターン培養されたｂＥＣが相対するように配置し、ディッシュの蓋をし、インキュベータ内で１０分間保持した。その後、ディッシュ内に、０．３％ウシ血清含有ＭＥＭ培地を基板を動かさないよう注意して加え、さらにインキュベータ内で６時間培養した。蛍光顕微鏡観察により、ｂＥＣパターンの幅が５０％程度細くなっていることを確認した。また、細胞転写用基板を注意深く剥離したところ、細胞培養用基板にはｂＥＣは残っておらず、ｂＥＣパターンは線維芽細胞シート上に転写されたことを顕微鏡観察により確認した。
【図面の簡単な説明】
【０１０５】
【図１】本発明の細胞転写用基板の一例を示す概略断面図である。
【図２】本発明の細胞転写用基板を説明するための説明図である。
【図３】本発明の細胞転写用基板の他の例を示す概略断面図である。
【図４】本発明の細胞転写用基板の他の例を示す概略断面図である。
【符号の説明】
【０１０６】
１ … 高分子基材
２ … 中間層
３ … 細胞転写層
４ … 細胞
５ … 被転写体
【特許請求の範囲】
【請求項１】
高分子基材と、前記高分子基材上に形成された中間層と、前記中間層上に形成された細胞転写層とを有することを特徴とする細胞転写用基板。
【請求項２】
前記細胞転写層が感温性高分子を含有する層であることを特徴とする請求項１に記載の細胞転写用基板。
【請求項３】
前記細胞転写層がポリアルキレングリコールおよびその誘導体を含有する層であることを特徴とする請求項１に記載の細胞転写用基板。
【請求項４】
請求項１から請求項３までのいずれかの請求項に記載の細胞転写用基板の前記細胞転写層上に細胞が接着していることを特徴とする細胞転写基板。
【請求項１】
高分子基材と、前記高分子基材上に形成された中間層と、前記中間層上に形成された細胞転写層とを有することを特徴とする細胞転写用基板。
【請求項２】
前記細胞転写層が感温性高分子を含有する層であることを特徴とする請求項１に記載の細胞転写用基板。
【請求項３】
前記細胞転写層がポリアルキレングリコールおよびその誘導体を含有する層であることを特徴とする請求項１に記載の細胞転写用基板。
【請求項４】
請求項１から請求項３までのいずれかの請求項に記載の細胞転写用基板の前記細胞転写層上に細胞が接着していることを特徴とする細胞転写基板。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図２】
【図３】
【図４】
【公開番号】特開２００７−１４７５３（Ｐ２００７−１４７５３Ａ）
【公開日】平成１９年１月２５日（２００７．１．２５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−１５２２７１（Ｐ２００６−１５２２７１）
【出願日】平成１８年５月３１日（２００６．５．３１）
【出願人】（０００００２８９７）大日本印刷株式会社 (14,506)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１９年１月２５日（２００７．１．２５）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年５月３１日（２００６．５．３１）
【出願人】（０００００２８９７）大日本印刷株式会社 (14,506)
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]