細菌バイオフィルムの酵素破壊
バイオフィルム形成細菌を致死または損傷させる少なくとも１種の抗菌酵素を、バイオフィルムに接触させると少なくとも部分的にバイオフィルムを破壊するのに有効な量投与することにより、損傷組織または留置人工装置もしくはカテーテル上に細菌バイオフィルムが成長している患者を、バイオフィルムを少なくとも部分的に破壊するように治療する方法。さらに、患者を予防的に治療する方法、および、生体外（ｅｘ ｖｉｖｏ）で表面を消毒または滅菌してバイオフィルムを除去またはバイオフィルム成長を予防する方法、ならびに、バイオフィルム成長が生じやすいインプラント用品に予防的抗菌酵素コーティングを施したものも開示される。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗菌酵素による細菌バイオフィルムの破壊に関する。より具体的には、本発明は、リソスタフィンによるブドウ球菌バイオフィルムの破壊に関する。
【背景技術】
【０００２】
（関連出願の相互参照）
本願は、米国特許法第１１９条（ｅ）のもとに、２００２年３月２６日出願の米国仮出願第６０／３６８，１１２号の優先権を主張するものであり、この仮出願の開示内容は参照により本明細書に援用される。
【０００３】
Ａ．バイオフィルム
埋め込み医療装置または損傷組織に付着する細菌は、多糖体とタンパク質とからなる水和構造体内に自身を埋め込んで、バイオフィルムとしても知られているスライム層を形成し得る。バイオフィルム関連微生物の高い抗菌剤耐性、および留置医療装置または損傷組織を有する患者におけるこれらの微生物と感染との関連性が原因で、バイオフィルムは公衆衛生上重大な問題をもたらす。バイオフィルム中で増殖する細菌の抗生物質耐性は、感染、例えば埋め込み医療装置に関連した感染の持続および慢性化の一因となる。バイオフィルムの耐性機構は、現在良く知られている個々の細菌細胞に生得的な耐性を付与するプラスミド、トランスポゾンおよび突然変異とは異なる。バイオフィルムの場合、耐性は多細胞的な戦略によるようである。
【０００４】
バイオフィルムは表面に付着するか、または接触面もしくは損傷組織に結合した複合微生物群集である。現代の微生物学研究が純粋培養、浮遊性の（自由遊泳性の）細菌に集中しているにもかかわらず、自然、臨床および工業条件下に見出されるほとんどの細菌がバイオフィルムとして表面との結合を強力に維持することは今や広く認められている。さらに、これらの微生物群集は、多くの場合、互いに相互作用し、かつ環境と相互作用する複数の種からなる。バイオフィルム構造、特に小集落（細胞集塊）の相互の空間的配置を決定することは、これらの複合群集の機能に関して重大な影響がある。
【０００５】
バイオフィルム構造体は、その構成要素である微生物細胞が恒常状態に到達するようであり、すべての利用可能な栄養素を利用するように最適に組織化されている動的環境である。したがって、この構造体は、内部に数々の微小環境が存在しうる高度の微小不均一性を示す。バイオフィルム形成は、細菌細胞が表面に付着し、次いで、細菌が増殖を繰り返して多層細胞集塊に集積するという２段階のプロセスであると考えられている。菌体外多糖は構造体の骨格となるが、バイオフィルム内ではさまざまな酵素活性を検出することができ、そのなかには、構造の完全性および安定性に大きな影響を与えるものがある。
【０００６】
より具体的には、第１形成期においては、宿主血漿のフィブリノーゲンやフィブロネクチンが医療用インプラントまたは損傷組織の表面を覆い、構成的に発現されている微生物の表面成分によって識別され、これらの成分が生体材料または損傷組織の表面への細菌の初期付着を媒介すると仮定される。第２段階では、細菌細胞内の特定の遺伝子座、いわゆる細胞内接着（ｉｃａ（ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ａｄｈｅｓｉｏｎ））遺伝子座が、細菌細胞の相互接着を活性化し、二次バイオフィルム層を形成させる。ｉｃａ遺伝子座は莢膜多糖オペロン（ｃａｐｓｕｌａｒ ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ ｏｐｅｒｏｎ）の発現に関与し、莢膜多糖オペロンは、‐１．６結合グルコサミノグリカンである糖類ポリ‐Ｎ‐スクシニルグルコサミン（ＰＮＳＧ）を介して多糖細胞間接着（ＰＩＡ）を活性化する。この多糖層ができると、電子顕微鏡を使って見たときに、バイオフィルムはス
ライム様外観を呈する。
【０００７】
黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）は極めて伝染力の強いヒト病原菌である。黄色ブドウ球菌もコアグラーゼ陰性ブドウ球菌も、埋め込み医療装置や損傷組織上のバイオフィルム形成に関与する主要な院内病原菌として浮上している。これらの微生物はヒトの皮膚や粘膜の常在細菌叢の仲間であり、侵襲手術または長期入院の間および後に合併症を流行させる。細菌は健康な人も病人も持っているので、ブドウ球菌は開いた傷口や生体材料インプラントを介して患者に侵入する日和見病原菌とみなされている。
【０００８】
黄色ブドウ球菌に関連するバイオフィルム感染は、特に、病院や、老人ホーム、診療所などの環境における罹患や死亡の重大な要因である。リスクの高い患者には、幼児、高齢者、免疫不全患者、免疫抑制患者や、頻繁に入院を必要とする慢性症状を有する患者が含まれる。血管内および他の埋め込み人工装置を有する患者は、免疫力が低下していること、ならびに組織損傷の原因となりかつ／またはバイオフィルム形成表面となる異物が挿入されていることから、黄色ブドウ球菌感染にかかるリスクがさらに高くなる。そのような感染は、命にかかわるとはいわないまでも、慢性化する可能性がある。
【０００９】
カテーテル関連の感染は、常に、カテーテル挿入を必要する患者の罹患率および死亡率の重大な原因となっている。米国で報告された発症率は４％であるが、これは、１年あたりの患者２００，０００人に相当する。さらに、カテーテル関連の感染は寄与死亡率が１４〜２４％であり、入院の長期化により医療費を増大させる。結果として、これらのカテーテル関連の感染の発生を予防することにより、または発生率を低下させるだけでも、保健医療上の大きな利点を得ることができるであろう。
【００１０】
カテーテル感染は、通常、ブドウ球菌、コアグラーゼ陰性ブドウ球菌（ＣｏＮＳ）または黄色ブドウ球菌のいずれかによって引き起こされる。ＣｏＮＳによって引き起こされる感染は軽い傾向があり、カテーテルを抜去するか、カテーテルを所定の位置に配置した状態で抗生物質治療によって治療できるものもある。黄色ブドウ球菌感染は通常これより重く、カテーテルまたは他の人工装置の抜去に加えて、長期抗生物質治療を必要とする。
【００１１】
黄色ブドウ球菌は、並外れた毒素産生菌であり、かつ極めて悪性のヒト病原菌である。黄色ブドウ球菌は、局所的皮膚感染から生死にかかわる菌血症や重要臓器への感染に及ぶ多様なヒト疾患の要因である。黄色ブドウ球菌感染は、早急に制御しないと、たちまち原発感染部位から他の臓器に広がり得る。感染巣がはっきりしない場合もあるが、特に感染しやすい臓器には、心臓弁、腎臓、肺、骨、髄膜および火傷患者の皮膚が含まれる。
【００１２】
抗生物質感受性のブドウ球菌感染に対して有効な抗菌剤は開発されたが、抗生物質耐性の黄色ブドウ球菌、特に埋め込み人工装置や損傷組織上のバイオフィルムに関連する黄色ブドウ球菌を確実かつ完全に死滅させて、持続的および慢性的なブドウ球菌感染源を除去する薬剤が依然として必要とされている。残念ながら、バイオフィルム中の黄色ブドウ球菌は（浮遊性の状態では抗生物質感受性のものでも）抗生物質に対する感受性が低く、従って感染を除去することがより難しい傾向がある。
【００１３】
バイオフィルムの抗生物質耐性の要因としては、一部の抗菌剤がバイオフィルムのすべての層に浸透できないこと、ある種のバイオフィルム細胞は増殖速度が遅く、そのために活発な細菌増殖を必要とする抗菌剤に対する感受性が低いこと、およびバイオフィルム中に埋め込まれた細菌細胞による遺伝子の発現パターンが浮遊性（自由遊泳）状態で発現される遺伝子とは異なることを挙げることができる。バイオフィルム関連の細菌におけるこれらの違いによって、浮遊性細菌の殺菌には有効に作用する抗菌剤が、バイオフィルム関
連細菌の殺菌には無効になる。多くの場合、バイオフィルムが形成されているカテーテルまたは人工装置を処理する唯一の方法は汚染された装置を抜去することであるが、それには、追加手術を必要として患者にさらなるリスクを与える恐れがある。
【００１４】
カテーテルまたは他の人工装置を抗菌剤でコーティングする方法は、これらの異物関連感染の制御および予防に有望な方法である。これまでに、６つのタイプの抗菌カテーテル、すなわち、セファゾリン、テイコプラニン、バンコマイシン、銀、クロロヘキシジン‐銀スルファジアジンおよびミノサイクリン‐リファンピンでコーティングされたカテーテルが臨床試験でテストされてきた。しかし、カテーテル関連の血流感染（ＣＲＢＩ）の発生率を低下させると証明されたのはミノサイクリン‐リファンピンコーティングカテーテルだけで、その長期効果は未だ研究されていない。ＣＲＢＩを減少させてカテーテルの耐久力を向上させる特性を有する新規抗菌剤、および、カテーテル上であれ、人工装置上であれ、または損傷組織上であれ、外科的除去の必要なくその場所でバイオフィルム関連ブドウ球菌感染を除去する能力を有する薬剤を見出す必要があることは明らかである。
【００１５】
Ｂ．リソスタフィン
当初バイオフィルムに対して有効ではないと考えられていたそのような抗菌剤の１つがリソスタフィンである。リソスタフィンは〔かつて、Ｓ．スタフィロリティカス（Ｓ．ｓｔａｐｈｙｌｏｌｙｔｉｃｕｓ）として知られていた〕スタフィロコッカス・シムランス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｓｉｍｕｌａｎｓ）において最初に同定された強力な抗菌酵素である。細菌のグリシルグリシンエンドペプチダーゼであるリソスタフィンは、ブドウ球菌細胞壁の架橋結合しているポリグリシンの特定の架橋部分（ブリッジ）を開裂する能力を有し、したがって、活発に増殖中のブドウ球菌に対しても休止状態のブドウ球菌に対しても高い致死性を示す。リソスタフィンは単一のポリペプチド鎖として発現され、約２７ｋＤａの分子量を有する。
【００１６】
リソスタフィンは、黄色ブドウ球菌の細胞壁ブリッジがグリシンを多く含んでいるために、黄色ブドウ球菌の溶解に特に有効である。また、リソスタフィンは、病院環境で見出される最も一般的なコアグラーゼ陰性菌感染の表皮ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）を溶解する能力があることも実証されている。しかし、バイオフィルム構造の複雑性と、リソスタフィンのブドウ球菌溶解機構とのために、リソスタフィンは定着したバイオフィルム中のブドウ球菌に対しては有効ではないだろうと予想された。
【００１７】
クリモ（Ｃｌｉｍｏ）らの特許文献１は、リソスタフィンによるブドウ球菌病の治療法を開示している。治療には、体重１ｋｇあたり、少なくとも５０ミリグラム、好ましくは１００ミリグラムという比較的高用量のリソスタフィンが用いられる。リソスタフィンは、単回投与治療または複数回投与治療に用いることも、単独で、または別の抗生剤と組み合わせて使用することも可能である。上記特許文献は、さらに、リソスタフィン遺伝子のクローニングおよび配列決定により、野生型リソスタフィンの特性と類似または異なる特性を有し得る変異型の単離が可能であることも開示している。
【００１８】
オキャラハン（Ｏ’Ｃａｌｌａｇｈａｎ）らの特許文献２は、ブドウ球菌角膜感染の局所治療に有効な抗生物質としてリソスタフィンを使用する方法を開示している。ブラックバーン（Ｂｌａｃｋｂｕｒｎ）らの特許文献３は、リソスタフィンを用いて、乳房内注入による乳牛の乳腺炎の治療を含めたブドウ球菌感染の除去・治療法を開示している。
【００１９】
ゴールドシュタイン（Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎ）らの特許文献４は、０．５〜４５ｍｇ／ｋｇ／日のオーダーの低用量のリソスタフィンならびにその変異体などの類似体および関連酵素が、カテーテルまたは人工装置「に関連する」ものを含めたほとんどのブドウ球菌感
染の根絶に「十分」であることを開示している。よって、この公報にも他の刊行物にも、リソスタフィンが、埋め込み人工装置、カテーテルまたは損傷組織の表面に定着したブドウ球菌または他の細菌起源のバイオフィルムの破壊に有効であると期待するように当業者を導く開示は存在しない。
【特許文献１】米国特許第６，０２８，０５１号
【特許文献２】米国特許第６，３１５，９９６号
【特許文献３】米国特許第５，７６０，０２６号
【特許文献４】米国公開特許公報第２００２／０００６４０６号
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００２０】
ＣＲＢＩを減少させてカテーテルの耐久力を向上させる特性を有する新規抗菌剤、および、カテーテル上であれ、人工装置上であれ、または損傷組織上であれ、外科的除去の必要なくその場所でバイオフィルム関連ブドウ球菌感染を除去する能力を有する薬剤を見出す必要があることは明らかである。
【課題を解決するための手段】
【００２１】
リソスタフィンなどの抗菌酵素が、バイオフィルム中のすべての細菌を死滅させるだけでなく、バイオフィルム構造体を完全に破壊し、バイオフィルムをその形成表面から根絶することが思いがけず発見された。これによって、バイオフィルム関連感染、特に、損傷組織上または留置人工装置およびカテーテルの表面に生じる感染を、外科切除手段に頼ることなく治療することができる。
【００２２】
したがって、本発明の１つの態様により、表面上にバイオフィルムが成長している損傷組織または留置人工装置もしくはカテーテルを有する患者を、バイオフィルムを少なくとも部分的に破壊するように治療する方法が提供され、この方法は、患者に、バイオフィルム形成細菌を致死または損傷させる少なくとも１種の抗菌酵素を、バイオフィルムと接触させると該バイオフィルムを少なくとも部分的に破壊するのに有効な量投与することを含む。ブドウ球菌および他の細菌によるバイオフィルムの場合、バイオフィルム成長の予防にも、すでに定着しているバイオフィルムの根絶にも、リソスタフィンおよびリソスタフィン類似体が特に有効であることが証明された。
【００２３】
本発明は、さらに、組織損傷または人工装置もしくはカテーテルを有するバイオフィルム感受性患者におけるバイオフィルムの成長を予防するために、抗菌酵素を予防的に投与することも含む。したがって、本発明の別の態様により、バイオフィルム形成細菌を致死または損傷させる抗菌酵素を予防上有効量投与して、バイオフィルム感受性患者におけるバイオフィルム成長を予防する方法が提供される。例えば、リソスタフィンおよびリソスタフィン類似体を予防的に投与して、バイオフィルム感受性患者におけるブドウ球菌バイオフィルムの成長を予防し得る。
【００２４】
本発明は、さらに、必ずしも患者との接触を対象としない生体外の表面を消毒または滅菌する方法を含む。すなわち、本発明のこの方法は、バイオフィルムがすでに成長しているか、成長する可能性があるが望ましくない、体内に埋め込み可能な任意のもの、例えば、ポリマーやチタンなどの金属を含めた、実質的にあらゆる表面の消毒または滅菌に適している。実際に使用する場合、本発明のこの方法は、主に、苛酷な使用化学物質の微量残留物が有害であると考えられる状況など、バイオフィルムの除去または予防に用いられる比較的厳しい滅菌または消毒条件が適していない状況に用いられるであろう。それゆえ、本発明のこの方法は、患者体内の医療用インプラントを対象とする表面のバイオフィルム成長の予防またはバイオフィルム形成が始まる前の雑菌混入の排除に特に有用である。
【００２５】
したがって、本発明の別の態様により、細菌バイオフィルムが成長している表面を生体外で消毒または滅菌して、該表面からバイオフィルムを少なくとも部分的に除去する方法が提供され、この方法においては、表面を、バイオフィルムと接触してバイオフィルムを少なくとも部分的に破壊するのに有効な量の、バイオフィルム形成細菌を致死または損傷させる少なくとも１種の抗菌酵素と接触させる。本発明のこの態様は、表面を消毒または滅菌してバイオフィルム成長を予防または排除するのに特に有効である。
【００２６】
本発明は、さらに、バイオフィルム感受性表面上のバイオフィルム成長を予防する生体外における方法を含む。したがって、本発明の別の態様により、バイオフィルム形成細菌を致死または損傷させる少なくとも１種類の予防上有効量の抗菌酵素と表面を接触させることにより、生体外で表面を消毒、保護または滅菌してバイオフィルム形成細菌の該表面上での増殖を予防する方法が提供される。本発明のこの態様は、カテーテルや人工装置など患者への医療用埋め込みを目的とした、バイオフィルムが成長しやすい表面を殺菌、保護または滅菌するのに特に有効である。
【００２７】
リソスタフィンなどの抗菌酵素は、表面、特にポリマー表面に付着する傾向を有する程度にｉｎ ｓｉｔｕでイオン帯電される。それゆえ、抗菌酵素で処理した表面は、生体内で消毒または滅菌状態を維持して該表面上のバイオフィルム形成を予防するのに役立つ酵素コーティングを保持する。したがって、本発明は、埋め込みを必要とする患者に埋め込み可能で細菌バイオフィルム成長が生じやすい少なくとも１つの表面を有する、バイオフィルム形成の予防に有効な量のバイオフィルム形成細菌を致死させる少なくとも１種の抗菌酵素でコーティングされた人工装置およびカテーテルを含む。
【００２８】
コーティング剤は酵素のイオン電荷によって物理的に保持され得る。ポリマー表面の場合、ポリマー表面に酵素を共有結合させてコーティング剤を保持してもよいし、酵素をポリマー表面から実質的に放出させることなく表面に提示させる技術を用いて、酵素を表面ポリマーとブレンドしてもよい。したがって、本発明はさらに、ポリマーと、バイオフィルム形成細菌を致死させる少なくとも１種の有効量の抗菌酵素とをブレンドすることによりポリマー組成物を調製する方法であって、該組成物から形成される表面上における細菌バイオフィルムの成長に抵抗性のポリマー組成物を調製する方法を含む。また、本発明は、人工装置またはカテーテル製造用ポリマー組成物であって、ポリマーと、該組成物から形成される表面上におけるバイオフィルム形成の予防に有効な量のバイオフィルム形成細菌を致死させる少なくとも１種の抗菌酵素とがブレンドされている組成物を含む。
【００２９】
人工装置の例としては、シャント、ステント、組織構築用足場、栄養補給管、パンクタルプラグ、人工関節、ペースメーカー、人工弁などを含むがそれらには限定されない、体内挿入用の実質的にすべての装置が含まれる。この定義は、細菌バイオフィルム成長が生じる恐れのある実質的にすべての表面を含むものとする。
【００３０】
本発明の上記および他の目的、特徴ならびに利点は、添付図面と併せて以下に記載する発明を実施するための最良の形態からより容易に明らかにされる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３１】
本発明は、抗菌酵素を用いて細菌バイオフィルム感染の治療および予防を行う。本発明において、用語「バイオフィルム感染」とは、感染が生じやすい損傷組織上または留置カテーテルもしくは人工装置の表面上のバイオフィルム形成と定義される。この定義は、患者体内でバイオフィルム形成後に続発する持続性感染および慢性感染とは区別され、それらの感染は含まない。これらの二次感染は、従来の治療や、バイオフィルムの完全除去には有効ではないかもしれない本発明の抗菌酵素投与量に一時的に応答し得る。
【００３２】
「抗菌酵素」とは、当業者がこの用語に与える意味に従って定義され、ある細菌種またはその特定の菌株を死滅または損傷させる任意のタンパク質分解酵素、孔形成（ｐｏｒｅ−ｆｏｒｍｉｎｇ）酵素、分解酵素または阻害酵素を指す。その効果は、細菌の細胞壁の損傷、細胞壁に結合しているか細菌内部の細胞膜の破壊、細菌内タンパク質合成の阻害、糖主鎖の破壊により、または当業者が抗菌酵素であるとみなすペプチドもしくはタンパク質によって起こる任意の他のメカニズムによって達成され得る。抗菌酵素は、天然の野生型酵素でも、従来技術で修飾した酵素でも、他の分子に結合させた酵素でも、組換え発現酵素でも、合成的に構築された酵素でもよい。
【００３３】
これは材料の種類を無制限とするということではない。本明細書から本出願人が抗菌酵素の殺菌能および該殺菌能に基づく細菌バイオフィルム破壊能を発見したことを知れば、当業者は、過度な実験を行うことなく、本発明での使用に適した酵素を容易に特定することができる。抗菌酵素の１例はリソスタフィンである。リソスタフィンはブドウ球菌およびブドウ球菌から形成されたバイオフィルムの処理に有効であるので、重要である。
【００３４】
「リソスタフィン」および「リソスタフィン類似体」とは、生体内および生体外（ｉｎ
ｖｉｔｒｏ）で、ブドウ球菌の細胞壁ペプチドグリカンの架橋結合ポリグリシンブリッジを開裂するタンパク質分解能を保持する、リソスタフィン（野生型）、任意のリソスタフィン突然変異体もしくは変異体、任意の組換え体、または関連酵素（類似体）もしくは任意の合成体あるいはリソスタフィン断片（合成かどうかにかかわらない）を包含するものと定義される。これらの酵素は、（生産菌株内に存在する酵素、またはプロセシングの任意のステージで導入される酵素もしくは試薬のいずれかによる）タンパク質の翻訳後プロセシング、または構造遺伝子の突然変異によって産生され得る。突然変異には、部位欠失、挿入、ドメイン除去および置換突然変異が含まれる。
【００３５】
本発明のリソスタフィンは、合成的に構築しても、哺乳動物細胞、昆虫、細菌、酵母、は虫類または菌類中で発現させても、細胞培養物またはマウスなどの高等な組換え生物種から組換え発現させてもよいし、あるいはその他の方法でもよい。これには、合成ペプチドおよび合成ポリペプチドを含めた活性を維持した人工合成、あるいはブドウ球菌または他のバイオフィルム形成菌種のいずれかに有効な１種以上の他の抗菌酵素の活性部位を含有する、キメラタンパク質を含めた大型タンパク質もしくはペプチドの一部としてブドウ球菌に対するその活性を担うリソスタフィン酵素部分の組換え発現が含まれるであろう。
【００３６】
均質なリソスタフィンの組換え発現、および発現タンパク質から調製した均質で完全な活性を有するリソスタフィン含有組成物が、２００２年１２月２１日に、ジェフリー リチャード スティンソン（Ｊｅｆｆｅｒｙ Ｒｉｃｈａｒｄ Ｓｔｉｎｓｏｎ）、リュボフ グリンバーグ（Ｌｉｏｕｂｏｖ Ｇｒｉｎｂｅｒｇ）、ジョン コーカイ‐クン（Ｊｏｎ Ｋｏｋａｉ‐Ｋｕｎ）、アンドリュー リース（Ａｎｄｒｅｗ Ｌｅｅｓ）およびジェイムス ヤコブ モンド（Ｊａｍｅｓ Ｊａｃｏｂ Ｍｏｎｄ）により出願された「ブドウ球菌溶解活性が増強されたリソスタフィン分子（Lysostaphin Molecule with Enhanced Staphylolytic Activity ）」と題する米国特許出願に開示されており、同出願は引用によりその全文が本明細書に援用される。同出願は、２００１年１２月２１日出願の米国仮特許出願第６０／３４１，８０４号の優先権を主張している。
【００３７】
有効な抗菌酵素医薬製剤としては、水溶液または活性物質の非経口送達に適した液体で再構成するための乾燥製剤（例えば、凍結乾燥した結晶または非結晶質（アモルファス）であり、浸透圧平衡を得るための追加の溶質を含んでも含まなくてもよい）がある。製剤は、ボーラスの静注、筋注もしくは末梢注入に適した少量の液体としてもよく、同液体中で再構成しても、または大量の静脈内点滴溶液に添加して再構成してもよく、あるいは、低速静注により投与される大量の液体としても、同液体中で再構成してもよい。
【００３８】
送達は、活性物質の最低阻害濃度（ＭＩＣ）または最低殺菌濃度（ＭＢＣ）を上回る血中レベルおよび組織レベルを達成することにより、細菌力価を低下させて、形成されているバイオフィルムを破壊するか、または潜在的バイオフィルム形成を阻害するように、静脈内（ｉｖ）、筋肉内、皮下、腹腔内経路を介するか、鞘内もしくは吸入によるか、あるいは感染部位（または、予防のためには、バイオフィルム形成が生じやすい組織損傷部位か、留置カテーテルもしくは人工装置部位）への直接注入によるのが好ましい。
【００３９】
本発明の抗菌酵素が、細菌種、または状況によりその１種以上の菌株に特異的である場合、医薬製剤は、バイオフィルム感染に対して広範なスペクトルを得るために複数の酵素を含有してもよい。しかし、本発明の抗菌酵素は、単独投与の状況下で同酵素の効力が証明されているようなバイオフィルム感染を治療するためには、単独で投与し得る。
【００４０】
本発明の抗菌酵素の適当な投与量および投与計画は、患者の生物種、バイオフィルム感染の重篤度、感染微生物の感受性に応じて異なり、組み合わせ療法の場合には、組み合わせて用いられる特定の抗菌剤に依存し得る。患者候補の生物種はヒトには限定されず、抗菌酵素による治療の利益を享受すると考えられるバイオフィルム感染に罹患しているか罹患の恐れがある実質的にすべての冷血または温血脊椎動物種を含む。投与量は、約０．１〜約１００ｍｇ／ｋｇ／日の範囲、典型的には、約５〜約５０ｍｇ／ｋｇ／日の範囲であってよく、単回用量または分割用量として投与される。これらの用量は、持続注入または１日当たり複数の投与量に分割することを含めた多くの手段により投与し得る。バイオフィルム形成の予防には、比較的低い用量が有効であろう。
【００４１】
さらに、本発明の抗菌酵素は、バイオフィルムをより効果的に破壊し、かつその再発を防止するように、他の抗菌剤と同時または交互に併用（ｃｏａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）することができる。例えば、リソスタフィンおよびその類似体を、細胞壁合成を妨害または阻害する抗生物質、例えば、ペニシリン、ナフシリン、オキサシリン、および他のβ‐ラクタム抗生物質、セファロチンなどのセファロスポリン、バンコマイシンなどのグリコペプチドや他のポリペプチドと併せて投与することができる。または、リソスタフィンおよびその類似体を、タンパク質合成を阻害する抗生物質、例えば、ストレプトマイシンなどのアミノグリコシド、テトラサイクリンおよびストレプトグラミンと併せて投与し得る。さらに、リソスタフィンおよびその類似体を、モノクローナル抗体；またはリゾチーム、ムタノリシンおよびセロジル（ｃｅｌｌｏｚｙｌ）ムラミダーゼなどの他の抗菌酵素；デフェンシンなどのペプチド；およびナイシンなどのランチビオティクス；または任意の他のランチオン（ｌａｎｔｈｉｏｎｅ）含有分子、例えばズブチリンと併せて投与してもよい。リソスタフィンおよびその類似体と共投与しようとする抗ブドウ球菌剤を、一定の組み合わせとして一緒に製剤化してもよいし、または、利用可能かつ実用的などのような製剤中にも、感染部位で適切なレベルの上記薬剤を提供することが知られているどのような経路を介しても即時的に使用し得る。
【００４２】
また、バイオフィルム形成が生じやすい少なくとも１つの表面を有する埋め込み型の金属またはプラスチック製カテーテルまたは人工装置を、バイオフィルム形成しやすい表面上にバイオフィルム形成を阻害する本発明の抗菌酵素コーティングを形成するのに十分な時間酵素溶液に浸漬することにより、該カテーテルまたは人工装置の表面に同酵素をコーティングすることもできる。最低濃度の酵素でも、ある程度の保護を与えるであろう。典型的には、約１０μｇ／ｍｌ〜約１００ｍｇ／ｍｌの濃度を用い得る。装置表面の場合、酵素を表面に共有結合させてコーティングを形成させることもできる。ポリマー製装置の場合、酵素を表面から実質的に放出させることなく表面に酵素の金属イオン封鎖または局在化をもたらす技術により酵素と表面ポリマーとをブレンドし得る。また、リソスタフィンおよび他の阻害因子を、カテーテルおよび留置装置の埋め込み前または後に、留置装置
またはカテーテルの表面をバイオフィルム形成から保護するリソスタフィンおよび他の阻害因子のコーティングが得られるような速度で、カテーテルおよび留置装置を介して直接導入してもよい。この導入速度には、カテーテルにリソスタフィンおよび他の阻害因子を充填すること、およびリソスタフィンおよび他の阻害因子がカテーテル表面をコーティングする時間を見越してカテーテルを密閉すること、または密閉ループ内または埋め込みカテーテルを介して、リソスタフィンおよび他の因子がカテーテルをコーティングできるような速度でリソスタフィンおよび他の因子をポンプ注入することを含み得る。これらの技術は留置装置の製造業者には周知であり、これ以上の説明は無用である。
【００４３】
当業者に本発明の実施法を教示する以下の実施例により本発明をさらに説明する。以下の実施例は、単に本発明を例証するに過ぎず、本発明の特定の実施形態の種々の有利な特性を開示するものである。以下の実施例は、特許請求の範囲に記載の発明を限定するものと解釈すべきではない。
【実施例１】
【００４４】
（ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける１００μｇ／ｍｌのリソスタフィンによる黄色ブドウ球菌バイオフィルムの破壊）
ブドウ球菌株を、〜０．５ｍｌのトリプシン大豆ブロス（Ｔｒｙｐｔｉｃ Ｓｏｙ Ｂｒｏｔｈ（ＴＳＢ）、ディフコ・バクト社（Ｄｉｆｃｏ Ｂａｃｔｏ）製）のアリコート中−７０℃で保存した。各実験の前に、フリーザーからアリコートを１つ取り出し、ヒツジ血液寒天〔リメル社（Ｒｅｍｅｌ）〕上に播種し、３７℃で一晩インキュベートした。
【００４５】
【表１】
（バイオフィルムアッセイ）
０．２５％グルコース（シグマアルドリッチ社）を追加した５ｍｌのＴＳＢに、分離した５つのブドウ球菌コロニーを接種した。培養物を振盪下に３７℃で一晩インキュベートした。
【００４６】
Ｓｐｅｃｔｒｏｎｉｃ（登録商標）２０Ｄ＋を用いて、一晩培養物を〜３ｍｌ ＰＢＳ（バイオウィッタカー社（Ｂｉｏ Ｗｈｉｔｔａｋｅｒ））中でＡｂｓ５７８が０．１になるように調整した。２００μｌのＴＳＢ＋０．２５％グルコースを含有する１枚の９６ウエルプレート、またはそれぞれ１ｍｌのＴＳＢ＋０．２５％グルコールを含有し、２４ウエル組織培養プレート（ナルジェヌンクインターナショナル社（Ｎａｌｇｅ Ｎｕｎｃ
Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ））にはめ込んだ２４個の滅菌済０．０２ｍｍ Ａｎｏｐｏｒｅ（登録商標）メンブレンポリスチレンプレートインサート（ナルジェヌンクインターナショナル社）に、１：２００希釈した調整済み一晩培養物を接種した。プレートを３７℃で一晩インキュベートしてバイオフィルムを形成させた。
【００４７】
（処理）
約２４時間成長させた後、半分のウエルまたはインサートに、１００μｇ／ｍｌのリソスタフィン（ＡＭＢＩ社、現在はニュートリション２１社（Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ２１）、またはバイオシネクサスインコーポレイテッド社（Ｂｉｏｓｙｎｅｘｕｓ Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ））を注入した。次いで、プレートを３７℃で一晩インキュベートした。
【００４８】
（バイオフィルムの検出）
４８時間インキュベートした後、ウエルまたはインサートをＰＢＳで２回軽く洗浄した。洗浄済み９６ウエルプレートまたは２４インサートを室温下に完全に風乾した。９６ウエルプレートはバイオフィルム検出のためにサフラニン（リメル社）で染色し、インサートは、走査電子顕微鏡検査（ＳＥＭ）に備えて、３×グルタルアルデヒド緩衝液（０．７Ｍ ＮａＣｌ、０．０１４Ｍ ＫＣｌ、０．００７Ｍ ＫＨ２ＰＯ４、０．０３９Ｍ Ｎａ２ＨＰＯ４、１Ｍ ＯＨＣ（ＣＨ２）３ＣＨＯ）で固定した。
【００４９】
図１は、リソスタフィンで処理しなかったインサート上のバイオフィルムの成長を示す２レベルの倍率（２，０００×および６６０×）のＳＥＭ写真である。
図２は、リソスタフィンで処理したインサートを示す倍率６，６００×および６６０×のＳＥＭ写真である。２４時間の成長後のバイオフィルム形成を破壊するリソスタフィンの能力が直ちに明白である。
【実施例２】
【００５０】
（ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける５０μｇ／ｍｌのリソスタフィンによる黄色ブドウ球菌バイオフィルムの破壊）
メチシリン耐性黄色ブドウ球菌株ＭＢＴ５０４０を、実施例１と同様にＴＳＢ＋グルコース中で一晩増殖させた。２４時間後、これも実施例１と同じように、２００μｌのＴＳＢ＋グルコースを含有する９６ウエル組織培養プレートに１：２００希釈した一晩培養物を接種した。９６ウエルプレートを振盪下に３７℃で一晩インキュベートし、静置型の３７℃インキュベータに移してさらに２４時間インキュベートした。２回目のインキュベーションの後、ウエルをＰＢＳで２回洗浄して浮遊細胞を除去し、室温下に３時間、リソスタフィンを含まないＰＢＳ（−）または５０μｇ／ｍｌのリソスタフィンを含むＰＢＳ（＋）と共にインキュベートした。この３時間のインキュベーション後、ウエルをＰＢＳで２回洗浄し、次いで、ブアン液（シグマアルドリッチ社）中で５分間固定した。ウエルをサフラニンで１分間染色し、再度ＰＢＳで洗浄した。結果を図３に示すが、この図は、リソスタフィン処理の結果生じたバイオフィルムの破壊を示している。処理しなかったウエルはバイオフィルムを含んでいたが、処理したウエルでは、バイオフィルムが完全に破壊された。
【実施例３】
【００５１】
（バイオフィルム形成抵抗性リソスタフィンコーティングカテーテルの作製）
６つのウエルを、ＰＢＳで希釈して１０ｍｇ／ｍｌ、１ｍｇ／ｍｌまたは１００μｇ／ｍｌとしたリソスタフィン３００μｌと共にインキュベートした。試料はすべて２連とした。該プレートを４℃で一晩インキュベートした。翌朝、ウエルを１ｍｌのＰＢＳで１０回洗浄したが、ウエルを空にするために真空吸引を使用した。黄色ブドウ球菌株ＳＡ５をＰＢＳで透過率４０％に希釈した。この溶液の１：１０，０００希釈液を作成し、各ウエルに３００μｌ加えた。プレートを、７５ｒｐｍの振盪式インキュベータに３７℃で２時
間入れておいた。２時間後、各ウエルから４０μｌを採取し、血液寒天プレート上に播種し、インキュベータに３７℃で一晩入れておいた。翌朝、プレート上のコロニーを計数した。
【００５２】
２つのアンジオカット（Ａｎｇｉｏｃａｔｈ（商標））カテーテル（ベクトンディッキンソン社（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ））をリソスタフィンの１００μｇ／ｍｌ溶液２００μｌと共にインキュベートし、他の２つをＰＢＳ中でインキュベートした。該カテーテルを４℃で一晩インキュベートした。翌朝、流速１．５ｍｌ／分のポンプを用い、カテーテルを５０ｍｌのＰＢＳで洗浄した。カテーテルが洗浄されたら、黄色ブドウ球菌ＳＡ５をＰＢＳで透過率４０％に希釈した。この溶液の１：１０，０００希釈液を作成し、各カテーテルに１００μｌを加えた。カテーテルを３７℃で２時間インキュベートした。インキュベートした後、カテーテル流出液を血液寒天プレート上に播種し、インキュベータに３７℃で一晩入れておいた。翌朝、プレート上のコロニーを計数した。
【００５３】
【表２】
（結果）
リソスタフィンは２つの異なる表面上で細菌（黄色ブドウ球菌ＳＡ５）を効果的に死滅させることができた。ポリスチレン表面を、１０ｍｇ／ｍｌ、１ｍｇ／ｍｌおよび１００μｇ／ｍｌの３種の異なる濃度のリソスタフィンと共にインキュベートした。３種の濃度のリソスタフィン全てについて、加えた黄色ブドウ球菌を３７℃で２時間の間に死滅させるのに十分な酵素がポリマー表面に結合して残ったが、コーティングされていない対照ウエルは有意に高い細菌数を示した。
【００５４】
アンジオカットカテーテルの内部を１００μｇ／ｍｌのリソスタフィン溶液と共にインキュベートした。リソスタフィンでコーティングされたカテーテルは黄色ブドウ球菌を３７℃で２時間の間に死滅させることができたが、コーティングされていない対照カテーテルはカテーテル内の細菌を死滅させる効果が全くなかった。
【００５５】
（比較実施例）
黄色ブドウ球菌株をトリプシン大豆ブロス（ＴＳＢ）＋グルコース中で一晩増殖させた。２４時間後、２００μｌのＴＳＢ＋グルコースを含有する９６ウエル組織培養プレートに１：２００希釈した一晩培養物を接種した。９６ウエルプレートを振盪下に３７℃で一晩インキュベートし、次いで、静置型３７℃インキュベータに移してさらに２４時間インキュベートした。２回目のインキュベーション後、ウエルをＰＢＳで２回洗浄して浮遊性細胞を除去し、次いで、室温下に３時間、リソスタフィンを含まないＰＢＳ（−）または５０μｇ／ｍｌのリソスタフィンを含むＰＢＳ（＋）と共にインキュベートした。この３時間インキュベーションの後、ウエルをＰＢＳで２回洗浄し、次いで、ブアン液中で５分間固定した。固定ウエルをサフラニンで染色し、次いで再度ＰＢＳで洗浄した。リソスタフィンが黄色ブドウ球菌のリソスタフィン耐性株のバイオフィルムを破壊できないことが図４に示されているが、これは、リソスタフィンが同酵素に感受性の細菌に対して特異的であることを示している。この知見はさらに、リソスタフィンがバイオフィルム中の細菌細胞そのものに作用し、これらのバイオフィルム関連細胞を破壊すればバイオフィルムを完全に破壊するのに十分であることをも示唆している。
【実施例４】
【００５６】
（リソスタフィンは他の抗生物質より迅速かつより効果的に黄色ブドウ球菌のバイオフィルムを破壊する）
黄色ブドウ球菌バイオフィルムの抗生物質感受性の研究には、オキサシリンおよびバンコマイシンが用いられることが多かった。これらの抗生物質を、リソスタフィンが黄色ブドウ球菌株ＡＴＣＣ３５５５６のバイオフィルムの破壊に従来の抗生物質より有効であるかどうかを判定するために、リソスタフィンと比較した。ポリスチレン製９６ウエル組織培養プレート中の２４時間バイオフィルムを、系列希釈したリソスタフィン、オキサシリンおよびバンコマイシンで処理した（図７）。
【００５７】
バイオフィルムに及ぼすリソスタフィン、オキサシリンおよびバンコマイシンの速度論的効果を調べるために、９６ウエル組織培養プレートに定着したバイオフィルムの吸光度を経時的に（０〜３時間および２４時間）測定した。黄色ブドウ球菌ＳＡ１１３のバイオフィルムを有する組織培養ウエルを、系列希釈したリソスタフィン（０．８ｇ／ｍｌ〜２００ｇ／ｍｌ）、オキサシリン（１．６ｇ／ｍｌ〜４００ｇ／ｍｌ）、またはバンコマイシン（３．２ｇ／ｍｌ〜８００ｇ／ｍｌ）と共に２４時間インキュベートし、６５０ｎＭでの吸光度を、最初の３時間は２０分毎に、次いで２４時間目に再びモニターした。ＰＢＳ中６．２５μｇ／ｍｌの用量のリソスタフィンで処理すると、リソスタフィン処理バイオフィルムの吸光度は、０時間での約０．３５から処理後３時間の０．１２５に低下し、２４時間までにベースライン近く（０．０４）まで低下した（図７）。バイオフィルムをＰＢＳ中４００μｇ／ｍｌもの多量のオキサシリンまたは８００μｇ／ｍｌもの多量のバンコマイシンで処理したにも拘わらず、オキサシリンまたはバンコマイシンで２４時間処理したバイオフィルムの吸光度にはほとんど変化がなく、０．３２５辺りのままであった（図７）。オキサシリンまたはバンコマシンのような抗菌剤は活発に代謝を行っている細菌に有効なので、類似の実験を行い、ただしバイオフィルムを細菌用培地（ＴＳＢ）中の３種の抗菌剤と共にインキュベートした。ＰＢＳ中ではなくＴＳＢ中でアッセイを行ったときにも極めて類似した結果が認められた。リソスタフィンは２４時間までにバイオフィルムの吸光度をバックグラウンド近くまで低下させたが、オキサシリンおよびバンコマイシンは２４時間のインキュベーション後にもほとんど効果がなかった（データは示さず）。
【００５８】
上記３種の薬剤の、ポリスチレンウエル中の黄色ブドウ球菌バイオフィルムの破壊能力を、処理ウエルと対照（緩衝液処理）ウエルとの染色強度を比較することにより視覚化することができる。２４時間処理した上述の速度論的実験由来のバイオフィルムはウエルの底で黒っぽく染まるが（図８）、バイオフィルムの無いウエルはサフラニンで染まらない
。ＰＢＳ中０．８μｇ／ｍｌ（図８Ａ）およびＴＳＢ＋０．２５％グルコース中１２．５ｇ／ｍｌ（図８Ｂ）程度の少量のリソスタフィンは、トランスウエルからバイオフィルムを除去しているように見えたが、ＰＢＳまたはＴＳＢ中４００μｇ／ｍｌのオキサシリンまたは８００μｇ／ｍｌのバンコマイシンは２４時間処理した後でも定着バイオフィルムに明らかな影響を与えなかった（図８Ａおよび８Ｂ）。
【実施例５】
【００５９】
（リソスタフィンは表皮ブドウ球菌バイオフィルムを破壊する）
リソスタフィンは黄色ブドウ球菌バイオフィルムに対して活性を示したが、リソスタフィンに対して感受性が低いことが知られている表皮ブドウ球菌のバイオフィルムもリソスタフィンのバイオフィルム破壊作用に対して感受性であるかどうかを調べることは重要であった。それぞれ異なるグリコカリックス（スライム）産生能力を有する３種の表皮ブドウ球菌株、表皮ブドウ球菌株Ｈａｙ（低スライム産生株）、表皮ブドウ球菌株ＳＥ１１７５（中程度スライム産生株）および表皮ブドウ球菌ＡＴＣＣ３５９８４（高スライム産生株）、を調べた。予想通り、これら３種の表皮ブドウ球菌株はすべてガラスチャンバスライド上にバイオフィルムを産生し（図９）、ＡＴＣＣ３５９８４が最も厚く、最も黒っぽく染まるバイオフィルムを産生した。これらの表皮ブドウ球菌バイオフィルムを２００ｇ／ｍｌのリソスタフィンと共に３時間インキュベートすると、３種の表皮ブドウ球菌株すべてのバイオフィルムが破壊された（図９）。この実験には対照として黄色ブドウ球菌株ＳＡ１１３も含めた。破壊されたバイオフィルムの顕微鏡検査により、この人工表面に結合したまま残る無傷の細菌は存在しないことが判明した（データは示さず）。リソスタフィン処理ウエル中に見える染色された物質は、サフラニンでピンク色に染まった細胞外グリコカリックスであり、無傷のグラム陽性表皮ブドウ球菌細胞は含んでおらず、細胞破片だけがあった。
【実施例６】
【００６０】
（マウスにおいて成立した感染の治療）
頚静脈カテーテル挿入したマウス（チャールスリバーラボラトリーズ社（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｓ））を用いた。尾静脈を介してマウスに黄色ブドウ球菌（カテーテルを挿入していないマウスに感染を成立させるのに通常必要な用量５×１０６ＣＦＵ以上よりはるかに低い１０３〜１０４ＣＦＵ）を負荷投与した。感染が成立した負荷投与後４日目に治療を開始した。留置カテーテルを介して２００μ容量のＰＢＳ中のリソスタフィンを投与した（メチシリン耐性黄色ブドウ球菌の場合には、治療にナフシリンを加えた）。その日の最終治療後、リソスタフィン（さらに、使用する場合にはナフシリン）を治療に用いたのと同じ濃度で加えた５０μｌのロック溶液（５０％滅菌グルコース溶液）をカテーテルに入れた。対照マウスには、ＰＢＳおよびロック溶液だけで同じ治療をした。
【００６１】
最終治療の翌日、肝臓、心臓および心臓内のカテーテルの一部を採取した。カテーテル部分は超音波処理して細菌を分離した。回収された細菌（黄色ブドウ球菌）の数（ＣＦＵ）が表３〜表１１に示されている。
【００６２】
【表３】
【００６３】
【表４】
【００６４】
【表５】
【００６５】
【表６】
【００６６】
【表７】
【００６７】
【表８】
【００６８】
【表９】
【００６９】
【表１０】
【００７０】
【表１１】
マウスにおいて成立したカテーテル感染を除去するためには、メチシリン感受性黄色ブドウ球菌に対しては２０ｍｇ／ｋｇのリソスタフィン、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌に対しては１５ｍｇ／ｋｇリソスタフィン＋５０ｍｇ／ｋｇナフシリンを１日３回４日間投与する必要があった（注：リソスタフィンおよびナフシリンは黄色ブドウ球菌に対して相乗的殺菌効果を有することが知られている）。リソスタフィンの用量を少なくするか、または異なる投与計画（例えば、４０ｍｇ／ｋｇを１回に続いて以後５ｍｇ／ｋｇ、または初日に１５ｍｇ／ｋｇを３回に続いて以後５ｍｇ／ｋｇ）を実施した場合には、黄色ブドウ球菌感染の完全な除去は生じなかった。メチシリン耐性黄色ブドウ球菌をリソスタフィンだけで治療すると、２，３のケースでリソスタフィン耐性が発生したが、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌をリソスタフィンとナフシリンで組み合わせ治療すると、リソスタフィン耐性は全く検出されなかった。リソスタフィン耐性とβ‐ラクタム耐性は相互に排他的であることが知られている。ＳＥＭにより、黄色ブドウ球菌が埋め込みカテーテル上でバイオフィルムとして増殖し（図５）、リソスタフィンがこれらのカテーテルから黄色ブドウ球菌バイオフィルムを除去することが示された（図６）。
【実施例７】
【００７１】
（カテーテル挿入マウスのリソスタフィンによる前処理）
実施例４のように黄色ブドウ球菌を負荷投与する前に、カテーテルを介して頚静脈カテーテル挿入マウスをリソスタフィンで１または２回前処理した。マウスには、リソスタフィン（４０ｍｇ／ｋｇ）を負荷投与２４時間前に１回、またはリソスタフィン（４０ｍｇ／ｋｇ）を負荷投与２４時間前と２時間前の２回投与した。リソスタフィン溶液は負荷投与中カテーテルに入れたままにした。対照マウスには、標準的なリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を投与した。負荷投与後４日目にマウスを屠殺した。
【００７２】
３匹の対照マウスのうち２匹は、カテーテル、肝臓および心臓に感染していた。処理した８匹のマウスにはいずれも黄色ブドウ球菌はなかった。
上記実施例において、リソスタフィン溶液を細菌の負荷投与時にカテーテルに入れたままにしたので、溶液中のこのリソスタフィンがカテーテルを黄色ブドウ球菌感染から保護したと主張することができよう。もっと厳しい実験を実施するために、カテーテル挿入マ
ウスに、カテーテルを介して２００μｌのＰＢＳ中４０ｍｇ／ｋｇのリソスタフィンを１回注入した。１群には、その後さらに、前注入投与と同じ濃度のリソスタフィンを含む５０μｌのロック溶液を投与した。２２時間後、これらのマウスすべてのカテーテルをＰＢＳで徹底的にすすいだ。すすぎの２時間後に、動物に１０４個の黄色ブドウ球菌を負荷投与した。黄色ブドウ球菌負荷投与の４日後に動物を屠殺し、カテーテルと臓器を細菌に関して調査分析した。表１２に示すように、過剰なリソスタフィンがすすぎ流されても、カテーテルを黄色ブドウ球菌感染から保護するのに十分なリソスタフィンが頚静脈カーテルに結合して残っていた。
【００７３】
【表１２】
ｉｎ ｖｉｖｏの実施例における上記結果は、カテーテル感染マウスモデルにおいてリソスタフィンが感染カテーテルから黄色ブドウ球菌バイオフィルムを除去できることを示している。これらの実施例において、マウス内のカテーテルを清浄化するには、最低用量で４０ｍｇ／ｋｇを１日３回４日間投与する必要があった。上記実施例はさらに、マウス内のカテーテルに単回で４０ｍｇ／ｋｇのリソスタフィンを予め注入すれば、カテーテルから過剰なリソスタフィンを洗い流しても、カテーテルが黄色ブドウ球菌バイオフィルム形成から保護されるであろうことを実証している。マウスのバイオフィルム感染を除去または防ぐのに必要なリソスタフィン用量はヒトおよび他の動物の治療に必要な用量とは異なり得るので、これらの実施例は本特許の特許請求の範囲を制限することを意図するものではない。
【００７４】
上記結果は、リソスタフィンがカテーテルに結合してその殺ブドウ球菌活性を維持することを示す実施例３の結果と相関しており、カテーテルの前処理がリソスタフィンをカテーテル感染の療法として用いるよりも実用的であり得ることを示唆している。
【実施例８】
【００７５】
（リソスタフィンコーティング静脈内カテーテルの生体外（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）における効力）
（材料および方法）
（材料） ポリスチレン製２４ウエル組織培養プレートは、米国マサチューセッツ州アクトン（Ａｃｔｏｎ）所在のコスター社（Ｃｏｓｔａｒ）から購入した。アンジオカットカテーテルおよびトリプシン大豆ブロスは、米国メリーランド州スパークス（Ｓｐａｒｋｓ）所在のベクトンディッキンソン社（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）から購入した。リン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．２）は、米国メリーランド州ロックビル（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ）所在のギブコライフテクノロジーズ社（Ｇｉｂｃｏ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）から購入した。血液寒天プレートは、米国カンザス州レネクサ（Ｌｅｎｅｘａ）所在のリメル社から購入した。リソスタフィン（Ａｍｂｉｃｉｎ（登録商標）Ｌ
）は、ＡＭＢＩインコーポレイテッド社（ＡＭＢＩ，Ｉｎｃ．）から入手した。種々のアッセイにおいて、菌株：黄色ブドウ球菌莢膜型５型（ＳＡ５）および８型（臨床分離株）；メチシリン耐性黄色ブドウ球菌ＭＢＴ５０４０（ＷＲＡＭＣ由来の臨床分離株）、表皮ブドウ球菌ＳＥ３８０（臨床分離株）、１１７５（臨床分離株）、ＡＴＣＣ３５９８４（ＡＴＣＣから購入）を用いた。
【００７６】
（ポリスチレンウエルのコーティング） ＰＢＳに希釈した１０ｍｇ／ｍｌ、１ｍｇ／ｍｌまたは０．１ｍｇ／ｍｌのリソスタフィン３００μｌでウエルをコーティングした。プレートを４℃で一晩インキュベートした。ウエルを１ｍｌのＰＢＳで１０回洗浄し、洗浄液を真空吸引して除去した。各ウエルに、黄色ブドウ球菌の５×１０４ＣＦＵ／ｍｌ溶液３００μｌを加えた。プレートを３７℃下に２時間、７５ｒｐｍで振盪した。次いで、各ウエルから４０μｌを採取し、血液寒天プレート上に画線塗布（ストリーク）し、３７℃下に一晩インキュベートした。
【００７７】
（カテーテルのコーティング） アンジオカットカテーテルから針を除去し、処分した。１ｍｌシリンジを用いて、カテーテルをリソスタフィンの０．１ｍｇ／ｍｌ溶液２００μｌでコーティングした。カテーテルは、特に断りのない限り、室温下に１時間インキュベートした。次いで、蠕動ポンプを用いて１．５ｍｌ／分の流速で５０ｍｌのリン酸緩衝生理食塩水によりカテーテルを洗浄した。次いで、カテーテルに、細菌の〜５×１０４ＣＦＵ／ｍｌ溶液（ＴＳＢで希釈したもの）１２０μｌを接種し、３７℃で２時間インキュベートした。次いで、カテーテルから流出させた液を血液寒天プレート上に画線塗布し、３７℃下に一晩インキュベートした。
【００７８】
（リソスタフィンの浸出） リソスタフィンがカテーテルから管腔溶液中にゆっくり放出されるかどうかをテストするために、リソスタフィンコーティングカテーテルを１００μｌのＰＢＳと共に３７℃で２時間インキュベートした。次いで、ＰＢＳをエッペンドルフチューブ内に移し、この流出液に１０５ＣＦＵのＳＡ５を加え、３７℃で１時間インキュベートした。試料から４０μｌを採取し、血液寒天プレート上に画線塗布し、３７℃で一晩インキュベートした。もう１つの方法として、リソスタフィンコーティングカテーテルをＰＢＳと共に３７℃で一晩インキュベートした。翌朝、ＰＢＳを洗浄除去し、カテーテルに〜５×１０４ＣＦＵ／ｍｌのＳＡ５を３７℃で２時間接種した。次いで、流出液を血液寒天プレート上に画線塗布し、３７℃で一晩インキュベートした。ポリスチレン表面からの浸出を検出するために、ウエルを１０、１および０．１ｍｇ／ｍｌのリソスタフィンで６０分かけてコーティングした。次いで、ウエルを洗浄し、各ウエルに３００μｌのＰＢＳを加えて２時間おいてから取り除いた。このＰＢＳ洗浄液に５×１０４ＣＦＵ／ｍｌ溶液３００μｌを加え、３７℃で一晩インキュベートした。次いで、４０μｌを採取し、血液寒天プレート上に画線塗布し、３７℃で一晩インキュベートした。
【００７９】
（リソスタフィンの長期浸出） １０個のリソスタフィンコーティングカテーテル（１０ｍｇ／ｍｌのコーティング濃度）をＰＢＳと共に３７℃で２時間インキュベートした。次いで、カテーテルを洗浄し、１０個のリソスタフィンコーティングカテーテルのうち２個をＳＡ５の５×１０４ＣＦＵ／ｍｌ溶液２００μｌと共に３７℃で２時間インキュベートした。流出液を血液寒天プレート上に画線塗布し、３７℃で一晩インキュベートした。残りのカテーテルを新鮮なＰＢＳと共にインキュベートし、一晩３７℃下に放置した。翌日、全８個のカテーテルを洗い流し、そのうち２個のカテーテルを上記のように細菌と共にインキュベートした。他の６個のカテーテルは再び新鮮なＰＢＳと共にインキュベートし、一晩３７℃下に放置した。この手順を４日間毎日繰り返した。
【００８０】
（細菌のカテーテルへの付着） リソスタフィンコーティングカテーテルを、振盪下に２時間、０．１ｍｇ／ｍｌのリソスタフィン溶液２ｍｌ中に入れておき、カテーテルの外
側をコーティングした。次いで、カテーテルを洗浄し、５×１０４ＣＦＵ／ｍｌのＳＡ５溶液に入れ、３７℃で３時間インキュベートした。この細菌溶液４０μｌを血液寒天プレート上に画線塗布し、３７℃で一晩インキュベートした。カテーテルを２ｍｌのＴＳＢ中３７℃で一晩インキュベートし、増殖について調べた。処理していないカテーテルを５０ｍｌのＰＢＳで洗浄し、次いで、５×１０６ＣＦＵ／ｍｌの細菌溶液１２０μｌを接種し、２または２４時間インキュベートした。次いで、カテーテル流出液を血液寒天プレート上に画線塗布し、一晩３７℃下に放置した。カテーテルを５０ｍｌのＰＢＳで洗浄し、最後の１ｍｌの洗浄液を回収し、１００μｌを血液寒天プレート上に画線塗布して３７℃で一晩インキュベートした。次いで、カテーテルを１ｍｌのＴＳＢ中３７℃で一晩インキュベートし、増殖について調べた。
【００８１】
（血清タンパク質の存在下におけるリソスタフィン活性） カテーテルを室温下に６０分かけて０．１ｍｇ／ｍｌでコーティングした。次いで、カテーテルを洗浄し、ヒト血清またはＴＢＳと共に３７℃で２４時間インキュベートした。カテーテルを洗浄し、次いで、５×１０４ＣＦＵ／ｍｌの細菌を３７℃で２時間接種した。カテーテルからの流出液を血液寒天プレート上に画線塗布し、３７℃で一晩インキュベートした。
【００８２】
固定化されたリソスタフィンにより、ポリスチレンおよびカテーテルの表面から細菌を効果的に除去することができた。対照ウエルからは平均して６１０ＣＦＵが回収されたのに対し、リソスタフィンでコーティングしたウエルにはわずか３ＣＦＵしか残っておらず、細菌数が９９．５％減少した。３種の濃度はいずれも細菌に対して極めて活性が高かったので、この範囲における殺菌は濃度依存的ではなかった。リソスタフィンコーティングカテーテルでは細菌が完全に除去されたのに対し、対照カテーテルでは４９３ＣＦＵが回収された。これらの結果は、リソスタフィンがプラスチック表面に結合している間、黄色ブドウ球菌に対する活性を維持することを示唆している。
【００８３】
殺菌活性がリソスタフィンコーティング時間の関数であるかどうかを突きとめるために、カテーテルを、５、１０または１５分間かけて、０．１ｍｇ／ｍｌのリソスタフィンでコーティングし、それらの黄色ブドウ球菌殺菌効力を調べた。図１０に示すように、カテーテルは、リソスタフィンでわずか５分間コーティングしただけでも高レベルの殺菌活性を有していたが、コーティング時間が長くなるにつれ、効力が増大する傾向があった。細菌数は、５分間のコーティング後には９８．７％、１０分後には９９．４％減少し、わずか１５分間のコーティング後では完全に除去された。
【００８４】
（コーティング表面からのリソスタフィンの浸出）
リソスタフィンコーティングカテーテルのＰＢＳ洗浄液は、ごくわずかな細菌数減少しか示さなかった（表１４）。リソスタフィンコーティングカテーテルは、ＰＢＳで一晩洗浄した後でも細菌を完全に除去したことを示したのに対し、非処理カテーテルでは１５００ＣＦＵが回収された。このデータは、リソスタフィンがカテーテルから浸出しているとしても、このような細菌負荷に対しては有効でない量の浸出であることを示唆している。
【００８５】
ポリスチレンからのリソスタフィン浸出の結果として、細菌除去に及ぼすコーティング濃度依存的効果が存在する。１０ｍｇ／ｍｌについての洗浄液は、ＳＡ５の力価を、対照に比べて１．４ｌｏｇ減少させ、１ｍｇ／ｍｌの洗浄液は１．３ｌｏｇ減少させた。しかし、０．１ｍｇ／ｍｌコーティングでは、浸出による細菌数の減少はわずか０．３３ｌｏｇであった。一方、０．１ｍｇ／ｍｌでコーティングしたウエルに同じ細菌力価を直接加えると、細菌数が２．４ｌｏｇ減少した（表１３）。
【００８６】
【表１３】
【００８７】
【表１４】
コーティングカテーテルの殺菌活性に及ぼすリソスタフィンの連続浸出の効果を図１１に示す。カテーテルを、２４時間毎にＰＢＳを新しくしながら、最大９６時間までＰＢＳとともにインキュベートした。次いで、カテーテルが黄色ブドウ球菌殺菌活性を維持しているかどうかを調べるために、カテーテルを細菌で負荷曝露した。図１１に示すように、ＰＢＳと共に２時間インキュベートした後では、リソスタフィンコーティングカテーテルから回収された細菌は非コーティングカテーテルに比べて２．８ｌｏｇ減少していた。細菌数は、２４時間後には１．８ｌｏｇ、４８時間後には１．５ｌｏｇ、７２時間後には０．７ｌｏｇ、９６時間後には０．３ｌｏｇ減少した。
【００８８】
（リソスタフィンコーティングカテーテルに対する種々の菌株の感受性）
表１５は、生体外（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）カテーテルモデルでテストした、ＭＲＳＡ株および原型のバイオフィルム産生表皮ブドウ球菌株を含めた数種の黄色ブドウ球菌株および表皮ブドウ球菌株の感受性を示している。
【００８９】
【表１５】
以前の研究では、リソスタフィンは黄色ブドウ球菌に比べて表皮ブドウ球菌に対して活性が低いことが示されたが、リソスタフィンコーティングカテーテルは、黄色ブドウ球菌株に対するより幾分効果が低いとは言え、表皮ブドウ球菌の３種の菌株を効果的に死滅させることができた。表皮ブドウ球菌３８０型は表皮ブドウ球菌のうちで最も感受性が高く、２．２ｌｏｇ減少した。バイオフィルム産生表皮ブドウ球菌ＡＴＣＣ３５９８４は、対照試料に対して１．８ｌｏｇの減少、表皮ブドウ球菌１１７５は１．１ｌｏｇの減少を示した。リソスタフィンコーティングカテーテルは、黄色ブドウ球菌ＭＢＴ５０４０（ＭＲＳＡ）および黄色ブドウ球菌莢膜型８型（ＳＡ８）のいずれにも非常に有効であった。平均すると、ＭＲＳＡと共にインキュベートしたカテーテルからは１ＣＦＵが回収され、一方、ＳＡ８と共にインキュベートしたカテーテルでは完全に清浄化（細菌除去）されたのに比べ、非コーティングカテーテルからは１２５０ＣＦＵの細菌が回収された。
【００９０】
（細菌のカテーテルへの付着）
非コーティングカテーテル流出液中の細菌数は多すぎて数えられなかったが、洗浄液の最後の１ｍｌを回収して、血液寒天プレート上に画線塗布した。洗浄液中の細菌数はインキュベーション時間に比例し、２４時間ではより多数の細菌が付着していた。平均して、２４時間洗浄液からは１０００ＣＦＵが回収されたのに対し、２時間洗浄液からは約３０ＣＦＵが回収された。洗浄液中の細菌数は、カテーテル内の細菌付着レベルを示す可能性が高い。次に、非コーティングカテーテルを培養し、細菌増殖について調べた。培地中で一晩インキュベートすると、カテーテルにはかなりのコロニーが形成され、培地中で細菌が増殖することが示された。このデータは、細菌がカテーテル表面に付着し、感染を引き起こし得ることを示唆している。大量の接種細菌中で３時間インキュベートしたリソスタフィンカテーテルは溶液を清浄化（細菌を除去）した。一晩インキュベートした後、培地には細菌がなかったが、これは、リソスタフィンコーティングカテーテルが３時間で細菌
溶液を清浄化することができ、カテーテルは無菌状態に保たれることを示唆している。
【００９１】
（血清タンパク質存在下のリソスタフィン活性）
図１２に示すように、０．１ｍｇ／ｍｌのリソスタフィンでコーティングしたカテーテルをヒト血清と共にインキュベートすると、細菌数が９９％減少することが示され、一方、１０および１ｍｇ／ｍｌのリソスタフィンでコーティングしたカテーテルをヒト血清と共にインキュベートすると、細菌が完全に除去された。これらの結果は、血清タンパク質の存在がカテーテル上のリソスタフィンの活性に有意な影響を与えないことを示唆している。
【００９２】
上記実施例は人工的な表面へのリソスタフィンコーティングの効力を実証している。リソスタフィンでコーティングされた表面は、カテーテル関連感染およびインプラント関連感染のいずれの予防においても重要な新規療法となり得る。
【００９３】
上述の特徴の種々の変形形態および組み合わせが、特許請求の範囲に記載されている本発明から逸脱することなく利用可能であることは容易に理解されよう。それらの変形形態は本発明の思想および範囲から逸脱したものとは見なされず、そのような変更形態はすべて以下の特許請求の範囲内に包含されるものとする。
【図面の簡単な説明】
【００９４】
【図１】リソスタフィンで処理していない組織培養インサート上の黄色ブドウ球菌バイオフィルムの成長を示す、２通りの倍率（左側が２０００×、右側が６６０×）のＳＥＭ写真。
【図２】リソスタフィンで処理したインサートを示す、倍率が左側６，６００×、右側６６０×のＳＥＭ写真。黄色ブドウ球菌バイオフィルムはすべて根絶されている。
【図３】黄色ブドウ球菌株ＭＢＴ５０４０バイオフィルムがそれぞれ５０μｇ／ｍｌのリソスタフィンで処理された（＋）８ウエルと、処理されていない（−）８ウエルとからなる１６ウエルの組織培養プレートの走査を示す図。
【図４】２種のリソスタフィン耐性黄色ブドウ球菌（ＬｙｓｏＲ）変異株を含めた種々の黄色ブドウ球菌株のバイオフィルムを５０μｇ／ｍｌのリソスタフィンで処理した（＋）ウエルと、比較のために処理していない（−）ウエルとからなる３０ウエルの組織培養プレートの走査を示す図。
【図５Ａ】リソスタフィンで治療する前の、黄色ブドウ球菌感染マウスの頚静脈カテーテル上に生体内（ｉｎ ｖｉｖｏ）で成長したバイオフィルムを示す倍率４０００×のＳＥＭ写真。
【図５Ｂ】リソスタフィンで治療する前の、黄色ブドウ球菌感染マウスの頚静脈カテーテル上に生体内（ｉｎ ｖｉｖｏ）で成長したバイオフィルムを示す倍率４０００×のＳＥＭ写真。
【図６Ａ】リソスタフィンによる治療後に、黄色ブドウ球菌に感染した頚静脈カテーテル挿入マウス（図５と類似）のカテーテルからバイオフィルムが除去されたことを示す倍率４０００×のＳＥＭ写真。
【図６Ｂ】リソスタフィンによる治療後に、黄色ブドウ球菌に感染した頚静脈カテーテル挿入マウス（図５と類似）のカテーテルからバイオフィルムが除去されたことを示す倍率４０００×のＳＥＭ写真。
【図７】リソスタフィン（６．２５ｃｇ／ｍｌ）が時間とともに黄色ブドウ球菌バイオフィルムの吸光度を即時かつ連続的に低下させるのに対し、バンコマイシン（８００ｃｇ／ｍｌ）およびオキサシリン（４００□ｃｇ／ｍｌ）はバイオフィルムに何の影響も与えないことを示すグラフ。
【図８】オキサシリン（１．６ｃｇ／ｍｌ〜４００ｃｇ／ｍｌ）またはバンコマイシン（３．２ｃｇ／ｍｌ〜８００ｃｇ／ｍｌ）がＰＢＳ（Ａ）または細菌培地（Ｂ）中での２４時間インキュベーション後に黄色ブドウ球菌バイオフィルムに何の影響も与えないのに対し、リソスタフィンがＰＢＳ中では０．８ｃｇ／ｍｌ（Ａ）で、ＴＳＢ＋０．２５％グルコース中では１２．５ｃｇ／ｍｌ（Ｂ）でバイオフィルムを除去したことを示す走査の図。
【図９】リソスタフィンが、表皮ブドウ球菌バイオフィルム（対照としての黄色ブドウ球菌（Ａ）、表皮ブドウ球菌株Ｈａｙ（Ｂ）、表皮ブドウ球菌株ＡＴＣＣ３５９８４（Ｃ）または表皮ブドウ球菌株ＳＥ１１７５（Ｄ））を破壊することを示す走査の図。２つの拡大部分は、表皮ブドウ球菌株ＡＴＣＣ３５９８４の多層バイオフィルム（上）と、リソスタフィン処理後の、無傷のブドウ球菌を含まない同菌株の残留グリコカリックス（下）を示している。
【図１０】リソスタフィンコーティング時間の関数としてのカテーテルの抗菌効力を示す図。
【図１１】黄色ブドウ球菌に対するリソスタフィンコーティングカテーテルの長期抗菌効力を示す図。
【図１２】血清タンパク質の存在下におけるリソスタフィンコーティングカテーテルの抗菌効力を示す図。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗菌酵素による細菌バイオフィルムの破壊に関する。より具体的には、本発明は、リソスタフィンによるブドウ球菌バイオフィルムの破壊に関する。
【背景技術】
【０００２】
（関連出願の相互参照）
本願は、米国特許法第１１９条（ｅ）のもとに、２００２年３月２６日出願の米国仮出願第６０／３６８，１１２号の優先権を主張するものであり、この仮出願の開示内容は参照により本明細書に援用される。
【０００３】
Ａ．バイオフィルム
埋め込み医療装置または損傷組織に付着する細菌は、多糖体とタンパク質とからなる水和構造体内に自身を埋め込んで、バイオフィルムとしても知られているスライム層を形成し得る。バイオフィルム関連微生物の高い抗菌剤耐性、および留置医療装置または損傷組織を有する患者におけるこれらの微生物と感染との関連性が原因で、バイオフィルムは公衆衛生上重大な問題をもたらす。バイオフィルム中で増殖する細菌の抗生物質耐性は、感染、例えば埋め込み医療装置に関連した感染の持続および慢性化の一因となる。バイオフィルムの耐性機構は、現在良く知られている個々の細菌細胞に生得的な耐性を付与するプラスミド、トランスポゾンおよび突然変異とは異なる。バイオフィルムの場合、耐性は多細胞的な戦略によるようである。
【０００４】
バイオフィルムは表面に付着するか、または接触面もしくは損傷組織に結合した複合微生物群集である。現代の微生物学研究が純粋培養、浮遊性の（自由遊泳性の）細菌に集中しているにもかかわらず、自然、臨床および工業条件下に見出されるほとんどの細菌がバイオフィルムとして表面との結合を強力に維持することは今や広く認められている。さらに、これらの微生物群集は、多くの場合、互いに相互作用し、かつ環境と相互作用する複数の種からなる。バイオフィルム構造、特に小集落（細胞集塊）の相互の空間的配置を決定することは、これらの複合群集の機能に関して重大な影響がある。
【０００５】
バイオフィルム構造体は、その構成要素である微生物細胞が恒常状態に到達するようであり、すべての利用可能な栄養素を利用するように最適に組織化されている動的環境である。したがって、この構造体は、内部に数々の微小環境が存在しうる高度の微小不均一性を示す。バイオフィルム形成は、細菌細胞が表面に付着し、次いで、細菌が増殖を繰り返して多層細胞集塊に集積するという２段階のプロセスであると考えられている。菌体外多糖は構造体の骨格となるが、バイオフィルム内ではさまざまな酵素活性を検出することができ、そのなかには、構造の完全性および安定性に大きな影響を与えるものがある。
【０００６】
より具体的には、第１形成期においては、宿主血漿のフィブリノーゲンやフィブロネクチンが医療用インプラントまたは損傷組織の表面を覆い、構成的に発現されている微生物の表面成分によって識別され、これらの成分が生体材料または損傷組織の表面への細菌の初期付着を媒介すると仮定される。第２段階では、細菌細胞内の特定の遺伝子座、いわゆる細胞内接着（ｉｃａ（ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ａｄｈｅｓｉｏｎ））遺伝子座が、細菌細胞の相互接着を活性化し、二次バイオフィルム層を形成させる。ｉｃａ遺伝子座は莢膜多糖オペロン（ｃａｐｓｕｌａｒ ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ ｏｐｅｒｏｎ）の発現に関与し、莢膜多糖オペロンは、‐１．６結合グルコサミノグリカンである糖類ポリ‐Ｎ‐スクシニルグルコサミン（ＰＮＳＧ）を介して多糖細胞間接着（ＰＩＡ）を活性化する。この多糖層ができると、電子顕微鏡を使って見たときに、バイオフィルムはス
ライム様外観を呈する。
【０００７】
黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）は極めて伝染力の強いヒト病原菌である。黄色ブドウ球菌もコアグラーゼ陰性ブドウ球菌も、埋め込み医療装置や損傷組織上のバイオフィルム形成に関与する主要な院内病原菌として浮上している。これらの微生物はヒトの皮膚や粘膜の常在細菌叢の仲間であり、侵襲手術または長期入院の間および後に合併症を流行させる。細菌は健康な人も病人も持っているので、ブドウ球菌は開いた傷口や生体材料インプラントを介して患者に侵入する日和見病原菌とみなされている。
【０００８】
黄色ブドウ球菌に関連するバイオフィルム感染は、特に、病院や、老人ホーム、診療所などの環境における罹患や死亡の重大な要因である。リスクの高い患者には、幼児、高齢者、免疫不全患者、免疫抑制患者や、頻繁に入院を必要とする慢性症状を有する患者が含まれる。血管内および他の埋め込み人工装置を有する患者は、免疫力が低下していること、ならびに組織損傷の原因となりかつ／またはバイオフィルム形成表面となる異物が挿入されていることから、黄色ブドウ球菌感染にかかるリスクがさらに高くなる。そのような感染は、命にかかわるとはいわないまでも、慢性化する可能性がある。
【０００９】
カテーテル関連の感染は、常に、カテーテル挿入を必要する患者の罹患率および死亡率の重大な原因となっている。米国で報告された発症率は４％であるが、これは、１年あたりの患者２００，０００人に相当する。さらに、カテーテル関連の感染は寄与死亡率が１４〜２４％であり、入院の長期化により医療費を増大させる。結果として、これらのカテーテル関連の感染の発生を予防することにより、または発生率を低下させるだけでも、保健医療上の大きな利点を得ることができるであろう。
【００１０】
カテーテル感染は、通常、ブドウ球菌、コアグラーゼ陰性ブドウ球菌（ＣｏＮＳ）または黄色ブドウ球菌のいずれかによって引き起こされる。ＣｏＮＳによって引き起こされる感染は軽い傾向があり、カテーテルを抜去するか、カテーテルを所定の位置に配置した状態で抗生物質治療によって治療できるものもある。黄色ブドウ球菌感染は通常これより重く、カテーテルまたは他の人工装置の抜去に加えて、長期抗生物質治療を必要とする。
【００１１】
黄色ブドウ球菌は、並外れた毒素産生菌であり、かつ極めて悪性のヒト病原菌である。黄色ブドウ球菌は、局所的皮膚感染から生死にかかわる菌血症や重要臓器への感染に及ぶ多様なヒト疾患の要因である。黄色ブドウ球菌感染は、早急に制御しないと、たちまち原発感染部位から他の臓器に広がり得る。感染巣がはっきりしない場合もあるが、特に感染しやすい臓器には、心臓弁、腎臓、肺、骨、髄膜および火傷患者の皮膚が含まれる。
【００１２】
抗生物質感受性のブドウ球菌感染に対して有効な抗菌剤は開発されたが、抗生物質耐性の黄色ブドウ球菌、特に埋め込み人工装置や損傷組織上のバイオフィルムに関連する黄色ブドウ球菌を確実かつ完全に死滅させて、持続的および慢性的なブドウ球菌感染源を除去する薬剤が依然として必要とされている。残念ながら、バイオフィルム中の黄色ブドウ球菌は（浮遊性の状態では抗生物質感受性のものでも）抗生物質に対する感受性が低く、従って感染を除去することがより難しい傾向がある。
【００１３】
バイオフィルムの抗生物質耐性の要因としては、一部の抗菌剤がバイオフィルムのすべての層に浸透できないこと、ある種のバイオフィルム細胞は増殖速度が遅く、そのために活発な細菌増殖を必要とする抗菌剤に対する感受性が低いこと、およびバイオフィルム中に埋め込まれた細菌細胞による遺伝子の発現パターンが浮遊性（自由遊泳）状態で発現される遺伝子とは異なることを挙げることができる。バイオフィルム関連の細菌におけるこれらの違いによって、浮遊性細菌の殺菌には有効に作用する抗菌剤が、バイオフィルム関
連細菌の殺菌には無効になる。多くの場合、バイオフィルムが形成されているカテーテルまたは人工装置を処理する唯一の方法は汚染された装置を抜去することであるが、それには、追加手術を必要として患者にさらなるリスクを与える恐れがある。
【００１４】
カテーテルまたは他の人工装置を抗菌剤でコーティングする方法は、これらの異物関連感染の制御および予防に有望な方法である。これまでに、６つのタイプの抗菌カテーテル、すなわち、セファゾリン、テイコプラニン、バンコマイシン、銀、クロロヘキシジン‐銀スルファジアジンおよびミノサイクリン‐リファンピンでコーティングされたカテーテルが臨床試験でテストされてきた。しかし、カテーテル関連の血流感染（ＣＲＢＩ）の発生率を低下させると証明されたのはミノサイクリン‐リファンピンコーティングカテーテルだけで、その長期効果は未だ研究されていない。ＣＲＢＩを減少させてカテーテルの耐久力を向上させる特性を有する新規抗菌剤、および、カテーテル上であれ、人工装置上であれ、または損傷組織上であれ、外科的除去の必要なくその場所でバイオフィルム関連ブドウ球菌感染を除去する能力を有する薬剤を見出す必要があることは明らかである。
【００１５】
Ｂ．リソスタフィン
当初バイオフィルムに対して有効ではないと考えられていたそのような抗菌剤の１つがリソスタフィンである。リソスタフィンは〔かつて、Ｓ．スタフィロリティカス（Ｓ．ｓｔａｐｈｙｌｏｌｙｔｉｃｕｓ）として知られていた〕スタフィロコッカス・シムランス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｓｉｍｕｌａｎｓ）において最初に同定された強力な抗菌酵素である。細菌のグリシルグリシンエンドペプチダーゼであるリソスタフィンは、ブドウ球菌細胞壁の架橋結合しているポリグリシンの特定の架橋部分（ブリッジ）を開裂する能力を有し、したがって、活発に増殖中のブドウ球菌に対しても休止状態のブドウ球菌に対しても高い致死性を示す。リソスタフィンは単一のポリペプチド鎖として発現され、約２７ｋＤａの分子量を有する。
【００１６】
リソスタフィンは、黄色ブドウ球菌の細胞壁ブリッジがグリシンを多く含んでいるために、黄色ブドウ球菌の溶解に特に有効である。また、リソスタフィンは、病院環境で見出される最も一般的なコアグラーゼ陰性菌感染の表皮ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）を溶解する能力があることも実証されている。しかし、バイオフィルム構造の複雑性と、リソスタフィンのブドウ球菌溶解機構とのために、リソスタフィンは定着したバイオフィルム中のブドウ球菌に対しては有効ではないだろうと予想された。
【００１７】
クリモ（Ｃｌｉｍｏ）らの特許文献１は、リソスタフィンによるブドウ球菌病の治療法を開示している。治療には、体重１ｋｇあたり、少なくとも５０ミリグラム、好ましくは１００ミリグラムという比較的高用量のリソスタフィンが用いられる。リソスタフィンは、単回投与治療または複数回投与治療に用いることも、単独で、または別の抗生剤と組み合わせて使用することも可能である。上記特許文献は、さらに、リソスタフィン遺伝子のクローニングおよび配列決定により、野生型リソスタフィンの特性と類似または異なる特性を有し得る変異型の単離が可能であることも開示している。
【００１８】
オキャラハン（Ｏ’Ｃａｌｌａｇｈａｎ）らの特許文献２は、ブドウ球菌角膜感染の局所治療に有効な抗生物質としてリソスタフィンを使用する方法を開示している。ブラックバーン（Ｂｌａｃｋｂｕｒｎ）らの特許文献３は、リソスタフィンを用いて、乳房内注入による乳牛の乳腺炎の治療を含めたブドウ球菌感染の除去・治療法を開示している。
【００１９】
ゴールドシュタイン（Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎ）らの特許文献４は、０．５〜４５ｍｇ／ｋｇ／日のオーダーの低用量のリソスタフィンならびにその変異体などの類似体および関連酵素が、カテーテルまたは人工装置「に関連する」ものを含めたほとんどのブドウ球菌感
染の根絶に「十分」であることを開示している。よって、この公報にも他の刊行物にも、リソスタフィンが、埋め込み人工装置、カテーテルまたは損傷組織の表面に定着したブドウ球菌または他の細菌起源のバイオフィルムの破壊に有効であると期待するように当業者を導く開示は存在しない。
【特許文献１】米国特許第６，０２８，０５１号
【特許文献２】米国特許第６，３１５，９９６号
【特許文献３】米国特許第５，７６０，０２６号
【特許文献４】米国公開特許公報第２００２／０００６４０６号
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００２０】
ＣＲＢＩを減少させてカテーテルの耐久力を向上させる特性を有する新規抗菌剤、および、カテーテル上であれ、人工装置上であれ、または損傷組織上であれ、外科的除去の必要なくその場所でバイオフィルム関連ブドウ球菌感染を除去する能力を有する薬剤を見出す必要があることは明らかである。
【課題を解決するための手段】
【００２１】
リソスタフィンなどの抗菌酵素が、バイオフィルム中のすべての細菌を死滅させるだけでなく、バイオフィルム構造体を完全に破壊し、バイオフィルムをその形成表面から根絶することが思いがけず発見された。これによって、バイオフィルム関連感染、特に、損傷組織上または留置人工装置およびカテーテルの表面に生じる感染を、外科切除手段に頼ることなく治療することができる。
【００２２】
したがって、本発明の１つの態様により、表面上にバイオフィルムが成長している損傷組織または留置人工装置もしくはカテーテルを有する患者を、バイオフィルムを少なくとも部分的に破壊するように治療する方法が提供され、この方法は、患者に、バイオフィルム形成細菌を致死または損傷させる少なくとも１種の抗菌酵素を、バイオフィルムと接触させると該バイオフィルムを少なくとも部分的に破壊するのに有効な量投与することを含む。ブドウ球菌および他の細菌によるバイオフィルムの場合、バイオフィルム成長の予防にも、すでに定着しているバイオフィルムの根絶にも、リソスタフィンおよびリソスタフィン類似体が特に有効であることが証明された。
【００２３】
本発明は、さらに、組織損傷または人工装置もしくはカテーテルを有するバイオフィルム感受性患者におけるバイオフィルムの成長を予防するために、抗菌酵素を予防的に投与することも含む。したがって、本発明の別の態様により、バイオフィルム形成細菌を致死または損傷させる抗菌酵素を予防上有効量投与して、バイオフィルム感受性患者におけるバイオフィルム成長を予防する方法が提供される。例えば、リソスタフィンおよびリソスタフィン類似体を予防的に投与して、バイオフィルム感受性患者におけるブドウ球菌バイオフィルムの成長を予防し得る。
【００２４】
本発明は、さらに、必ずしも患者との接触を対象としない生体外の表面を消毒または滅菌する方法を含む。すなわち、本発明のこの方法は、バイオフィルムがすでに成長しているか、成長する可能性があるが望ましくない、体内に埋め込み可能な任意のもの、例えば、ポリマーやチタンなどの金属を含めた、実質的にあらゆる表面の消毒または滅菌に適している。実際に使用する場合、本発明のこの方法は、主に、苛酷な使用化学物質の微量残留物が有害であると考えられる状況など、バイオフィルムの除去または予防に用いられる比較的厳しい滅菌または消毒条件が適していない状況に用いられるであろう。それゆえ、本発明のこの方法は、患者体内の医療用インプラントを対象とする表面のバイオフィルム成長の予防またはバイオフィルム形成が始まる前の雑菌混入の排除に特に有用である。
【００２５】
したがって、本発明の別の態様により、細菌バイオフィルムが成長している表面を生体外で消毒または滅菌して、該表面からバイオフィルムを少なくとも部分的に除去する方法が提供され、この方法においては、表面を、バイオフィルムと接触してバイオフィルムを少なくとも部分的に破壊するのに有効な量の、バイオフィルム形成細菌を致死または損傷させる少なくとも１種の抗菌酵素と接触させる。本発明のこの態様は、表面を消毒または滅菌してバイオフィルム成長を予防または排除するのに特に有効である。
【００２６】
本発明は、さらに、バイオフィルム感受性表面上のバイオフィルム成長を予防する生体外における方法を含む。したがって、本発明の別の態様により、バイオフィルム形成細菌を致死または損傷させる少なくとも１種類の予防上有効量の抗菌酵素と表面を接触させることにより、生体外で表面を消毒、保護または滅菌してバイオフィルム形成細菌の該表面上での増殖を予防する方法が提供される。本発明のこの態様は、カテーテルや人工装置など患者への医療用埋め込みを目的とした、バイオフィルムが成長しやすい表面を殺菌、保護または滅菌するのに特に有効である。
【００２７】
リソスタフィンなどの抗菌酵素は、表面、特にポリマー表面に付着する傾向を有する程度にｉｎ ｓｉｔｕでイオン帯電される。それゆえ、抗菌酵素で処理した表面は、生体内で消毒または滅菌状態を維持して該表面上のバイオフィルム形成を予防するのに役立つ酵素コーティングを保持する。したがって、本発明は、埋め込みを必要とする患者に埋め込み可能で細菌バイオフィルム成長が生じやすい少なくとも１つの表面を有する、バイオフィルム形成の予防に有効な量のバイオフィルム形成細菌を致死させる少なくとも１種の抗菌酵素でコーティングされた人工装置およびカテーテルを含む。
【００２８】
コーティング剤は酵素のイオン電荷によって物理的に保持され得る。ポリマー表面の場合、ポリマー表面に酵素を共有結合させてコーティング剤を保持してもよいし、酵素をポリマー表面から実質的に放出させることなく表面に提示させる技術を用いて、酵素を表面ポリマーとブレンドしてもよい。したがって、本発明はさらに、ポリマーと、バイオフィルム形成細菌を致死させる少なくとも１種の有効量の抗菌酵素とをブレンドすることによりポリマー組成物を調製する方法であって、該組成物から形成される表面上における細菌バイオフィルムの成長に抵抗性のポリマー組成物を調製する方法を含む。また、本発明は、人工装置またはカテーテル製造用ポリマー組成物であって、ポリマーと、該組成物から形成される表面上におけるバイオフィルム形成の予防に有効な量のバイオフィルム形成細菌を致死させる少なくとも１種の抗菌酵素とがブレンドされている組成物を含む。
【００２９】
人工装置の例としては、シャント、ステント、組織構築用足場、栄養補給管、パンクタルプラグ、人工関節、ペースメーカー、人工弁などを含むがそれらには限定されない、体内挿入用の実質的にすべての装置が含まれる。この定義は、細菌バイオフィルム成長が生じる恐れのある実質的にすべての表面を含むものとする。
【００３０】
本発明の上記および他の目的、特徴ならびに利点は、添付図面と併せて以下に記載する発明を実施するための最良の形態からより容易に明らかにされる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３１】
本発明は、抗菌酵素を用いて細菌バイオフィルム感染の治療および予防を行う。本発明において、用語「バイオフィルム感染」とは、感染が生じやすい損傷組織上または留置カテーテルもしくは人工装置の表面上のバイオフィルム形成と定義される。この定義は、患者体内でバイオフィルム形成後に続発する持続性感染および慢性感染とは区別され、それらの感染は含まない。これらの二次感染は、従来の治療や、バイオフィルムの完全除去には有効ではないかもしれない本発明の抗菌酵素投与量に一時的に応答し得る。
【００３２】
「抗菌酵素」とは、当業者がこの用語に与える意味に従って定義され、ある細菌種またはその特定の菌株を死滅または損傷させる任意のタンパク質分解酵素、孔形成（ｐｏｒｅ−ｆｏｒｍｉｎｇ）酵素、分解酵素または阻害酵素を指す。その効果は、細菌の細胞壁の損傷、細胞壁に結合しているか細菌内部の細胞膜の破壊、細菌内タンパク質合成の阻害、糖主鎖の破壊により、または当業者が抗菌酵素であるとみなすペプチドもしくはタンパク質によって起こる任意の他のメカニズムによって達成され得る。抗菌酵素は、天然の野生型酵素でも、従来技術で修飾した酵素でも、他の分子に結合させた酵素でも、組換え発現酵素でも、合成的に構築された酵素でもよい。
【００３３】
これは材料の種類を無制限とするということではない。本明細書から本出願人が抗菌酵素の殺菌能および該殺菌能に基づく細菌バイオフィルム破壊能を発見したことを知れば、当業者は、過度な実験を行うことなく、本発明での使用に適した酵素を容易に特定することができる。抗菌酵素の１例はリソスタフィンである。リソスタフィンはブドウ球菌およびブドウ球菌から形成されたバイオフィルムの処理に有効であるので、重要である。
【００３４】
「リソスタフィン」および「リソスタフィン類似体」とは、生体内および生体外（ｉｎ
ｖｉｔｒｏ）で、ブドウ球菌の細胞壁ペプチドグリカンの架橋結合ポリグリシンブリッジを開裂するタンパク質分解能を保持する、リソスタフィン（野生型）、任意のリソスタフィン突然変異体もしくは変異体、任意の組換え体、または関連酵素（類似体）もしくは任意の合成体あるいはリソスタフィン断片（合成かどうかにかかわらない）を包含するものと定義される。これらの酵素は、（生産菌株内に存在する酵素、またはプロセシングの任意のステージで導入される酵素もしくは試薬のいずれかによる）タンパク質の翻訳後プロセシング、または構造遺伝子の突然変異によって産生され得る。突然変異には、部位欠失、挿入、ドメイン除去および置換突然変異が含まれる。
【００３５】
本発明のリソスタフィンは、合成的に構築しても、哺乳動物細胞、昆虫、細菌、酵母、は虫類または菌類中で発現させても、細胞培養物またはマウスなどの高等な組換え生物種から組換え発現させてもよいし、あるいはその他の方法でもよい。これには、合成ペプチドおよび合成ポリペプチドを含めた活性を維持した人工合成、あるいはブドウ球菌または他のバイオフィルム形成菌種のいずれかに有効な１種以上の他の抗菌酵素の活性部位を含有する、キメラタンパク質を含めた大型タンパク質もしくはペプチドの一部としてブドウ球菌に対するその活性を担うリソスタフィン酵素部分の組換え発現が含まれるであろう。
【００３６】
均質なリソスタフィンの組換え発現、および発現タンパク質から調製した均質で完全な活性を有するリソスタフィン含有組成物が、２００２年１２月２１日に、ジェフリー リチャード スティンソン（Ｊｅｆｆｅｒｙ Ｒｉｃｈａｒｄ Ｓｔｉｎｓｏｎ）、リュボフ グリンバーグ（Ｌｉｏｕｂｏｖ Ｇｒｉｎｂｅｒｇ）、ジョン コーカイ‐クン（Ｊｏｎ Ｋｏｋａｉ‐Ｋｕｎ）、アンドリュー リース（Ａｎｄｒｅｗ Ｌｅｅｓ）およびジェイムス ヤコブ モンド（Ｊａｍｅｓ Ｊａｃｏｂ Ｍｏｎｄ）により出願された「ブドウ球菌溶解活性が増強されたリソスタフィン分子（Lysostaphin Molecule with Enhanced Staphylolytic Activity ）」と題する米国特許出願に開示されており、同出願は引用によりその全文が本明細書に援用される。同出願は、２００１年１２月２１日出願の米国仮特許出願第６０／３４１，８０４号の優先権を主張している。
【００３７】
有効な抗菌酵素医薬製剤としては、水溶液または活性物質の非経口送達に適した液体で再構成するための乾燥製剤（例えば、凍結乾燥した結晶または非結晶質（アモルファス）であり、浸透圧平衡を得るための追加の溶質を含んでも含まなくてもよい）がある。製剤は、ボーラスの静注、筋注もしくは末梢注入に適した少量の液体としてもよく、同液体中で再構成しても、または大量の静脈内点滴溶液に添加して再構成してもよく、あるいは、低速静注により投与される大量の液体としても、同液体中で再構成してもよい。
【００３８】
送達は、活性物質の最低阻害濃度（ＭＩＣ）または最低殺菌濃度（ＭＢＣ）を上回る血中レベルおよび組織レベルを達成することにより、細菌力価を低下させて、形成されているバイオフィルムを破壊するか、または潜在的バイオフィルム形成を阻害するように、静脈内（ｉｖ）、筋肉内、皮下、腹腔内経路を介するか、鞘内もしくは吸入によるか、あるいは感染部位（または、予防のためには、バイオフィルム形成が生じやすい組織損傷部位か、留置カテーテルもしくは人工装置部位）への直接注入によるのが好ましい。
【００３９】
本発明の抗菌酵素が、細菌種、または状況によりその１種以上の菌株に特異的である場合、医薬製剤は、バイオフィルム感染に対して広範なスペクトルを得るために複数の酵素を含有してもよい。しかし、本発明の抗菌酵素は、単独投与の状況下で同酵素の効力が証明されているようなバイオフィルム感染を治療するためには、単独で投与し得る。
【００４０】
本発明の抗菌酵素の適当な投与量および投与計画は、患者の生物種、バイオフィルム感染の重篤度、感染微生物の感受性に応じて異なり、組み合わせ療法の場合には、組み合わせて用いられる特定の抗菌剤に依存し得る。患者候補の生物種はヒトには限定されず、抗菌酵素による治療の利益を享受すると考えられるバイオフィルム感染に罹患しているか罹患の恐れがある実質的にすべての冷血または温血脊椎動物種を含む。投与量は、約０．１〜約１００ｍｇ／ｋｇ／日の範囲、典型的には、約５〜約５０ｍｇ／ｋｇ／日の範囲であってよく、単回用量または分割用量として投与される。これらの用量は、持続注入または１日当たり複数の投与量に分割することを含めた多くの手段により投与し得る。バイオフィルム形成の予防には、比較的低い用量が有効であろう。
【００４１】
さらに、本発明の抗菌酵素は、バイオフィルムをより効果的に破壊し、かつその再発を防止するように、他の抗菌剤と同時または交互に併用（ｃｏａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）することができる。例えば、リソスタフィンおよびその類似体を、細胞壁合成を妨害または阻害する抗生物質、例えば、ペニシリン、ナフシリン、オキサシリン、および他のβ‐ラクタム抗生物質、セファロチンなどのセファロスポリン、バンコマイシンなどのグリコペプチドや他のポリペプチドと併せて投与することができる。または、リソスタフィンおよびその類似体を、タンパク質合成を阻害する抗生物質、例えば、ストレプトマイシンなどのアミノグリコシド、テトラサイクリンおよびストレプトグラミンと併せて投与し得る。さらに、リソスタフィンおよびその類似体を、モノクローナル抗体；またはリゾチーム、ムタノリシンおよびセロジル（ｃｅｌｌｏｚｙｌ）ムラミダーゼなどの他の抗菌酵素；デフェンシンなどのペプチド；およびナイシンなどのランチビオティクス；または任意の他のランチオン（ｌａｎｔｈｉｏｎｅ）含有分子、例えばズブチリンと併せて投与してもよい。リソスタフィンおよびその類似体と共投与しようとする抗ブドウ球菌剤を、一定の組み合わせとして一緒に製剤化してもよいし、または、利用可能かつ実用的などのような製剤中にも、感染部位で適切なレベルの上記薬剤を提供することが知られているどのような経路を介しても即時的に使用し得る。
【００４２】
また、バイオフィルム形成が生じやすい少なくとも１つの表面を有する埋め込み型の金属またはプラスチック製カテーテルまたは人工装置を、バイオフィルム形成しやすい表面上にバイオフィルム形成を阻害する本発明の抗菌酵素コーティングを形成するのに十分な時間酵素溶液に浸漬することにより、該カテーテルまたは人工装置の表面に同酵素をコーティングすることもできる。最低濃度の酵素でも、ある程度の保護を与えるであろう。典型的には、約１０μｇ／ｍｌ〜約１００ｍｇ／ｍｌの濃度を用い得る。装置表面の場合、酵素を表面に共有結合させてコーティングを形成させることもできる。ポリマー製装置の場合、酵素を表面から実質的に放出させることなく表面に酵素の金属イオン封鎖または局在化をもたらす技術により酵素と表面ポリマーとをブレンドし得る。また、リソスタフィンおよび他の阻害因子を、カテーテルおよび留置装置の埋め込み前または後に、留置装置
またはカテーテルの表面をバイオフィルム形成から保護するリソスタフィンおよび他の阻害因子のコーティングが得られるような速度で、カテーテルおよび留置装置を介して直接導入してもよい。この導入速度には、カテーテルにリソスタフィンおよび他の阻害因子を充填すること、およびリソスタフィンおよび他の阻害因子がカテーテル表面をコーティングする時間を見越してカテーテルを密閉すること、または密閉ループ内または埋め込みカテーテルを介して、リソスタフィンおよび他の因子がカテーテルをコーティングできるような速度でリソスタフィンおよび他の因子をポンプ注入することを含み得る。これらの技術は留置装置の製造業者には周知であり、これ以上の説明は無用である。
【００４３】
当業者に本発明の実施法を教示する以下の実施例により本発明をさらに説明する。以下の実施例は、単に本発明を例証するに過ぎず、本発明の特定の実施形態の種々の有利な特性を開示するものである。以下の実施例は、特許請求の範囲に記載の発明を限定するものと解釈すべきではない。
【実施例１】
【００４４】
（ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける１００μｇ／ｍｌのリソスタフィンによる黄色ブドウ球菌バイオフィルムの破壊）
ブドウ球菌株を、〜０．５ｍｌのトリプシン大豆ブロス（Ｔｒｙｐｔｉｃ Ｓｏｙ Ｂｒｏｔｈ（ＴＳＢ）、ディフコ・バクト社（Ｄｉｆｃｏ Ｂａｃｔｏ）製）のアリコート中−７０℃で保存した。各実験の前に、フリーザーからアリコートを１つ取り出し、ヒツジ血液寒天〔リメル社（Ｒｅｍｅｌ）〕上に播種し、３７℃で一晩インキュベートした。
【００４５】
【表１】
（バイオフィルムアッセイ）
０．２５％グルコース（シグマアルドリッチ社）を追加した５ｍｌのＴＳＢに、分離した５つのブドウ球菌コロニーを接種した。培養物を振盪下に３７℃で一晩インキュベートした。
【００４６】
Ｓｐｅｃｔｒｏｎｉｃ（登録商標）２０Ｄ＋を用いて、一晩培養物を〜３ｍｌ ＰＢＳ（バイオウィッタカー社（Ｂｉｏ Ｗｈｉｔｔａｋｅｒ））中でＡｂｓ５７８が０．１になるように調整した。２００μｌのＴＳＢ＋０．２５％グルコースを含有する１枚の９６ウエルプレート、またはそれぞれ１ｍｌのＴＳＢ＋０．２５％グルコールを含有し、２４ウエル組織培養プレート（ナルジェヌンクインターナショナル社（Ｎａｌｇｅ Ｎｕｎｃ
Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ））にはめ込んだ２４個の滅菌済０．０２ｍｍ Ａｎｏｐｏｒｅ（登録商標）メンブレンポリスチレンプレートインサート（ナルジェヌンクインターナショナル社）に、１：２００希釈した調整済み一晩培養物を接種した。プレートを３７℃で一晩インキュベートしてバイオフィルムを形成させた。
【００４７】
（処理）
約２４時間成長させた後、半分のウエルまたはインサートに、１００μｇ／ｍｌのリソスタフィン（ＡＭＢＩ社、現在はニュートリション２１社（Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ２１）、またはバイオシネクサスインコーポレイテッド社（Ｂｉｏｓｙｎｅｘｕｓ Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ））を注入した。次いで、プレートを３７℃で一晩インキュベートした。
【００４８】
（バイオフィルムの検出）
４８時間インキュベートした後、ウエルまたはインサートをＰＢＳで２回軽く洗浄した。洗浄済み９６ウエルプレートまたは２４インサートを室温下に完全に風乾した。９６ウエルプレートはバイオフィルム検出のためにサフラニン（リメル社）で染色し、インサートは、走査電子顕微鏡検査（ＳＥＭ）に備えて、３×グルタルアルデヒド緩衝液（０．７Ｍ ＮａＣｌ、０．０１４Ｍ ＫＣｌ、０．００７Ｍ ＫＨ２ＰＯ４、０．０３９Ｍ Ｎａ２ＨＰＯ４、１Ｍ ＯＨＣ（ＣＨ２）３ＣＨＯ）で固定した。
【００４９】
図１は、リソスタフィンで処理しなかったインサート上のバイオフィルムの成長を示す２レベルの倍率（２，０００×および６６０×）のＳＥＭ写真である。
図２は、リソスタフィンで処理したインサートを示す倍率６，６００×および６６０×のＳＥＭ写真である。２４時間の成長後のバイオフィルム形成を破壊するリソスタフィンの能力が直ちに明白である。
【実施例２】
【００５０】
（ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける５０μｇ／ｍｌのリソスタフィンによる黄色ブドウ球菌バイオフィルムの破壊）
メチシリン耐性黄色ブドウ球菌株ＭＢＴ５０４０を、実施例１と同様にＴＳＢ＋グルコース中で一晩増殖させた。２４時間後、これも実施例１と同じように、２００μｌのＴＳＢ＋グルコースを含有する９６ウエル組織培養プレートに１：２００希釈した一晩培養物を接種した。９６ウエルプレートを振盪下に３７℃で一晩インキュベートし、静置型の３７℃インキュベータに移してさらに２４時間インキュベートした。２回目のインキュベーションの後、ウエルをＰＢＳで２回洗浄して浮遊細胞を除去し、室温下に３時間、リソスタフィンを含まないＰＢＳ（−）または５０μｇ／ｍｌのリソスタフィンを含むＰＢＳ（＋）と共にインキュベートした。この３時間のインキュベーション後、ウエルをＰＢＳで２回洗浄し、次いで、ブアン液（シグマアルドリッチ社）中で５分間固定した。ウエルをサフラニンで１分間染色し、再度ＰＢＳで洗浄した。結果を図３に示すが、この図は、リソスタフィン処理の結果生じたバイオフィルムの破壊を示している。処理しなかったウエルはバイオフィルムを含んでいたが、処理したウエルでは、バイオフィルムが完全に破壊された。
【実施例３】
【００５１】
（バイオフィルム形成抵抗性リソスタフィンコーティングカテーテルの作製）
６つのウエルを、ＰＢＳで希釈して１０ｍｇ／ｍｌ、１ｍｇ／ｍｌまたは１００μｇ／ｍｌとしたリソスタフィン３００μｌと共にインキュベートした。試料はすべて２連とした。該プレートを４℃で一晩インキュベートした。翌朝、ウエルを１ｍｌのＰＢＳで１０回洗浄したが、ウエルを空にするために真空吸引を使用した。黄色ブドウ球菌株ＳＡ５をＰＢＳで透過率４０％に希釈した。この溶液の１：１０，０００希釈液を作成し、各ウエルに３００μｌ加えた。プレートを、７５ｒｐｍの振盪式インキュベータに３７℃で２時
間入れておいた。２時間後、各ウエルから４０μｌを採取し、血液寒天プレート上に播種し、インキュベータに３７℃で一晩入れておいた。翌朝、プレート上のコロニーを計数した。
【００５２】
２つのアンジオカット（Ａｎｇｉｏｃａｔｈ（商標））カテーテル（ベクトンディッキンソン社（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ））をリソスタフィンの１００μｇ／ｍｌ溶液２００μｌと共にインキュベートし、他の２つをＰＢＳ中でインキュベートした。該カテーテルを４℃で一晩インキュベートした。翌朝、流速１．５ｍｌ／分のポンプを用い、カテーテルを５０ｍｌのＰＢＳで洗浄した。カテーテルが洗浄されたら、黄色ブドウ球菌ＳＡ５をＰＢＳで透過率４０％に希釈した。この溶液の１：１０，０００希釈液を作成し、各カテーテルに１００μｌを加えた。カテーテルを３７℃で２時間インキュベートした。インキュベートした後、カテーテル流出液を血液寒天プレート上に播種し、インキュベータに３７℃で一晩入れておいた。翌朝、プレート上のコロニーを計数した。
【００５３】
【表２】
（結果）
リソスタフィンは２つの異なる表面上で細菌（黄色ブドウ球菌ＳＡ５）を効果的に死滅させることができた。ポリスチレン表面を、１０ｍｇ／ｍｌ、１ｍｇ／ｍｌおよび１００μｇ／ｍｌの３種の異なる濃度のリソスタフィンと共にインキュベートした。３種の濃度のリソスタフィン全てについて、加えた黄色ブドウ球菌を３７℃で２時間の間に死滅させるのに十分な酵素がポリマー表面に結合して残ったが、コーティングされていない対照ウエルは有意に高い細菌数を示した。
【００５４】
アンジオカットカテーテルの内部を１００μｇ／ｍｌのリソスタフィン溶液と共にインキュベートした。リソスタフィンでコーティングされたカテーテルは黄色ブドウ球菌を３７℃で２時間の間に死滅させることができたが、コーティングされていない対照カテーテルはカテーテル内の細菌を死滅させる効果が全くなかった。
【００５５】
（比較実施例）
黄色ブドウ球菌株をトリプシン大豆ブロス（ＴＳＢ）＋グルコース中で一晩増殖させた。２４時間後、２００μｌのＴＳＢ＋グルコースを含有する９６ウエル組織培養プレートに１：２００希釈した一晩培養物を接種した。９６ウエルプレートを振盪下に３７℃で一晩インキュベートし、次いで、静置型３７℃インキュベータに移してさらに２４時間インキュベートした。２回目のインキュベーション後、ウエルをＰＢＳで２回洗浄して浮遊性細胞を除去し、次いで、室温下に３時間、リソスタフィンを含まないＰＢＳ（−）または５０μｇ／ｍｌのリソスタフィンを含むＰＢＳ（＋）と共にインキュベートした。この３時間インキュベーションの後、ウエルをＰＢＳで２回洗浄し、次いで、ブアン液中で５分間固定した。固定ウエルをサフラニンで染色し、次いで再度ＰＢＳで洗浄した。リソスタフィンが黄色ブドウ球菌のリソスタフィン耐性株のバイオフィルムを破壊できないことが図４に示されているが、これは、リソスタフィンが同酵素に感受性の細菌に対して特異的であることを示している。この知見はさらに、リソスタフィンがバイオフィルム中の細菌細胞そのものに作用し、これらのバイオフィルム関連細胞を破壊すればバイオフィルムを完全に破壊するのに十分であることをも示唆している。
【実施例４】
【００５６】
（リソスタフィンは他の抗生物質より迅速かつより効果的に黄色ブドウ球菌のバイオフィルムを破壊する）
黄色ブドウ球菌バイオフィルムの抗生物質感受性の研究には、オキサシリンおよびバンコマイシンが用いられることが多かった。これらの抗生物質を、リソスタフィンが黄色ブドウ球菌株ＡＴＣＣ３５５５６のバイオフィルムの破壊に従来の抗生物質より有効であるかどうかを判定するために、リソスタフィンと比較した。ポリスチレン製９６ウエル組織培養プレート中の２４時間バイオフィルムを、系列希釈したリソスタフィン、オキサシリンおよびバンコマイシンで処理した（図７）。
【００５７】
バイオフィルムに及ぼすリソスタフィン、オキサシリンおよびバンコマイシンの速度論的効果を調べるために、９６ウエル組織培養プレートに定着したバイオフィルムの吸光度を経時的に（０〜３時間および２４時間）測定した。黄色ブドウ球菌ＳＡ１１３のバイオフィルムを有する組織培養ウエルを、系列希釈したリソスタフィン（０．８ｇ／ｍｌ〜２００ｇ／ｍｌ）、オキサシリン（１．６ｇ／ｍｌ〜４００ｇ／ｍｌ）、またはバンコマイシン（３．２ｇ／ｍｌ〜８００ｇ／ｍｌ）と共に２４時間インキュベートし、６５０ｎＭでの吸光度を、最初の３時間は２０分毎に、次いで２４時間目に再びモニターした。ＰＢＳ中６．２５μｇ／ｍｌの用量のリソスタフィンで処理すると、リソスタフィン処理バイオフィルムの吸光度は、０時間での約０．３５から処理後３時間の０．１２５に低下し、２４時間までにベースライン近く（０．０４）まで低下した（図７）。バイオフィルムをＰＢＳ中４００μｇ／ｍｌもの多量のオキサシリンまたは８００μｇ／ｍｌもの多量のバンコマイシンで処理したにも拘わらず、オキサシリンまたはバンコマイシンで２４時間処理したバイオフィルムの吸光度にはほとんど変化がなく、０．３２５辺りのままであった（図７）。オキサシリンまたはバンコマシンのような抗菌剤は活発に代謝を行っている細菌に有効なので、類似の実験を行い、ただしバイオフィルムを細菌用培地（ＴＳＢ）中の３種の抗菌剤と共にインキュベートした。ＰＢＳ中ではなくＴＳＢ中でアッセイを行ったときにも極めて類似した結果が認められた。リソスタフィンは２４時間までにバイオフィルムの吸光度をバックグラウンド近くまで低下させたが、オキサシリンおよびバンコマイシンは２４時間のインキュベーション後にもほとんど効果がなかった（データは示さず）。
【００５８】
上記３種の薬剤の、ポリスチレンウエル中の黄色ブドウ球菌バイオフィルムの破壊能力を、処理ウエルと対照（緩衝液処理）ウエルとの染色強度を比較することにより視覚化することができる。２４時間処理した上述の速度論的実験由来のバイオフィルムはウエルの底で黒っぽく染まるが（図８）、バイオフィルムの無いウエルはサフラニンで染まらない
。ＰＢＳ中０．８μｇ／ｍｌ（図８Ａ）およびＴＳＢ＋０．２５％グルコース中１２．５ｇ／ｍｌ（図８Ｂ）程度の少量のリソスタフィンは、トランスウエルからバイオフィルムを除去しているように見えたが、ＰＢＳまたはＴＳＢ中４００μｇ／ｍｌのオキサシリンまたは８００μｇ／ｍｌのバンコマイシンは２４時間処理した後でも定着バイオフィルムに明らかな影響を与えなかった（図８Ａおよび８Ｂ）。
【実施例５】
【００５９】
（リソスタフィンは表皮ブドウ球菌バイオフィルムを破壊する）
リソスタフィンは黄色ブドウ球菌バイオフィルムに対して活性を示したが、リソスタフィンに対して感受性が低いことが知られている表皮ブドウ球菌のバイオフィルムもリソスタフィンのバイオフィルム破壊作用に対して感受性であるかどうかを調べることは重要であった。それぞれ異なるグリコカリックス（スライム）産生能力を有する３種の表皮ブドウ球菌株、表皮ブドウ球菌株Ｈａｙ（低スライム産生株）、表皮ブドウ球菌株ＳＥ１１７５（中程度スライム産生株）および表皮ブドウ球菌ＡＴＣＣ３５９８４（高スライム産生株）、を調べた。予想通り、これら３種の表皮ブドウ球菌株はすべてガラスチャンバスライド上にバイオフィルムを産生し（図９）、ＡＴＣＣ３５９８４が最も厚く、最も黒っぽく染まるバイオフィルムを産生した。これらの表皮ブドウ球菌バイオフィルムを２００ｇ／ｍｌのリソスタフィンと共に３時間インキュベートすると、３種の表皮ブドウ球菌株すべてのバイオフィルムが破壊された（図９）。この実験には対照として黄色ブドウ球菌株ＳＡ１１３も含めた。破壊されたバイオフィルムの顕微鏡検査により、この人工表面に結合したまま残る無傷の細菌は存在しないことが判明した（データは示さず）。リソスタフィン処理ウエル中に見える染色された物質は、サフラニンでピンク色に染まった細胞外グリコカリックスであり、無傷のグラム陽性表皮ブドウ球菌細胞は含んでおらず、細胞破片だけがあった。
【実施例６】
【００６０】
（マウスにおいて成立した感染の治療）
頚静脈カテーテル挿入したマウス（チャールスリバーラボラトリーズ社（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｓ））を用いた。尾静脈を介してマウスに黄色ブドウ球菌（カテーテルを挿入していないマウスに感染を成立させるのに通常必要な用量５×１０６ＣＦＵ以上よりはるかに低い１０３〜１０４ＣＦＵ）を負荷投与した。感染が成立した負荷投与後４日目に治療を開始した。留置カテーテルを介して２００μ容量のＰＢＳ中のリソスタフィンを投与した（メチシリン耐性黄色ブドウ球菌の場合には、治療にナフシリンを加えた）。その日の最終治療後、リソスタフィン（さらに、使用する場合にはナフシリン）を治療に用いたのと同じ濃度で加えた５０μｌのロック溶液（５０％滅菌グルコース溶液）をカテーテルに入れた。対照マウスには、ＰＢＳおよびロック溶液だけで同じ治療をした。
【００６１】
最終治療の翌日、肝臓、心臓および心臓内のカテーテルの一部を採取した。カテーテル部分は超音波処理して細菌を分離した。回収された細菌（黄色ブドウ球菌）の数（ＣＦＵ）が表３〜表１１に示されている。
【００６２】
【表３】
【００６３】
【表４】
【００６４】
【表５】
【００６５】
【表６】
【００６６】
【表７】
【００６７】
【表８】
【００６８】
【表９】
【００６９】
【表１０】
【００７０】
【表１１】
マウスにおいて成立したカテーテル感染を除去するためには、メチシリン感受性黄色ブドウ球菌に対しては２０ｍｇ／ｋｇのリソスタフィン、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌に対しては１５ｍｇ／ｋｇリソスタフィン＋５０ｍｇ／ｋｇナフシリンを１日３回４日間投与する必要があった（注：リソスタフィンおよびナフシリンは黄色ブドウ球菌に対して相乗的殺菌効果を有することが知られている）。リソスタフィンの用量を少なくするか、または異なる投与計画（例えば、４０ｍｇ／ｋｇを１回に続いて以後５ｍｇ／ｋｇ、または初日に１５ｍｇ／ｋｇを３回に続いて以後５ｍｇ／ｋｇ）を実施した場合には、黄色ブドウ球菌感染の完全な除去は生じなかった。メチシリン耐性黄色ブドウ球菌をリソスタフィンだけで治療すると、２，３のケースでリソスタフィン耐性が発生したが、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌をリソスタフィンとナフシリンで組み合わせ治療すると、リソスタフィン耐性は全く検出されなかった。リソスタフィン耐性とβ‐ラクタム耐性は相互に排他的であることが知られている。ＳＥＭにより、黄色ブドウ球菌が埋め込みカテーテル上でバイオフィルムとして増殖し（図５）、リソスタフィンがこれらのカテーテルから黄色ブドウ球菌バイオフィルムを除去することが示された（図６）。
【実施例７】
【００７１】
（カテーテル挿入マウスのリソスタフィンによる前処理）
実施例４のように黄色ブドウ球菌を負荷投与する前に、カテーテルを介して頚静脈カテーテル挿入マウスをリソスタフィンで１または２回前処理した。マウスには、リソスタフィン（４０ｍｇ／ｋｇ）を負荷投与２４時間前に１回、またはリソスタフィン（４０ｍｇ／ｋｇ）を負荷投与２４時間前と２時間前の２回投与した。リソスタフィン溶液は負荷投与中カテーテルに入れたままにした。対照マウスには、標準的なリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を投与した。負荷投与後４日目にマウスを屠殺した。
【００７２】
３匹の対照マウスのうち２匹は、カテーテル、肝臓および心臓に感染していた。処理した８匹のマウスにはいずれも黄色ブドウ球菌はなかった。
上記実施例において、リソスタフィン溶液を細菌の負荷投与時にカテーテルに入れたままにしたので、溶液中のこのリソスタフィンがカテーテルを黄色ブドウ球菌感染から保護したと主張することができよう。もっと厳しい実験を実施するために、カテーテル挿入マ
ウスに、カテーテルを介して２００μｌのＰＢＳ中４０ｍｇ／ｋｇのリソスタフィンを１回注入した。１群には、その後さらに、前注入投与と同じ濃度のリソスタフィンを含む５０μｌのロック溶液を投与した。２２時間後、これらのマウスすべてのカテーテルをＰＢＳで徹底的にすすいだ。すすぎの２時間後に、動物に１０４個の黄色ブドウ球菌を負荷投与した。黄色ブドウ球菌負荷投与の４日後に動物を屠殺し、カテーテルと臓器を細菌に関して調査分析した。表１２に示すように、過剰なリソスタフィンがすすぎ流されても、カテーテルを黄色ブドウ球菌感染から保護するのに十分なリソスタフィンが頚静脈カーテルに結合して残っていた。
【００７３】
【表１２】
ｉｎ ｖｉｖｏの実施例における上記結果は、カテーテル感染マウスモデルにおいてリソスタフィンが感染カテーテルから黄色ブドウ球菌バイオフィルムを除去できることを示している。これらの実施例において、マウス内のカテーテルを清浄化するには、最低用量で４０ｍｇ／ｋｇを１日３回４日間投与する必要があった。上記実施例はさらに、マウス内のカテーテルに単回で４０ｍｇ／ｋｇのリソスタフィンを予め注入すれば、カテーテルから過剰なリソスタフィンを洗い流しても、カテーテルが黄色ブドウ球菌バイオフィルム形成から保護されるであろうことを実証している。マウスのバイオフィルム感染を除去または防ぐのに必要なリソスタフィン用量はヒトおよび他の動物の治療に必要な用量とは異なり得るので、これらの実施例は本特許の特許請求の範囲を制限することを意図するものではない。
【００７４】
上記結果は、リソスタフィンがカテーテルに結合してその殺ブドウ球菌活性を維持することを示す実施例３の結果と相関しており、カテーテルの前処理がリソスタフィンをカテーテル感染の療法として用いるよりも実用的であり得ることを示唆している。
【実施例８】
【００７５】
（リソスタフィンコーティング静脈内カテーテルの生体外（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）における効力）
（材料および方法）
（材料） ポリスチレン製２４ウエル組織培養プレートは、米国マサチューセッツ州アクトン（Ａｃｔｏｎ）所在のコスター社（Ｃｏｓｔａｒ）から購入した。アンジオカットカテーテルおよびトリプシン大豆ブロスは、米国メリーランド州スパークス（Ｓｐａｒｋｓ）所在のベクトンディッキンソン社（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）から購入した。リン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．２）は、米国メリーランド州ロックビル（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ）所在のギブコライフテクノロジーズ社（Ｇｉｂｃｏ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）から購入した。血液寒天プレートは、米国カンザス州レネクサ（Ｌｅｎｅｘａ）所在のリメル社から購入した。リソスタフィン（Ａｍｂｉｃｉｎ（登録商標）Ｌ
）は、ＡＭＢＩインコーポレイテッド社（ＡＭＢＩ，Ｉｎｃ．）から入手した。種々のアッセイにおいて、菌株：黄色ブドウ球菌莢膜型５型（ＳＡ５）および８型（臨床分離株）；メチシリン耐性黄色ブドウ球菌ＭＢＴ５０４０（ＷＲＡＭＣ由来の臨床分離株）、表皮ブドウ球菌ＳＥ３８０（臨床分離株）、１１７５（臨床分離株）、ＡＴＣＣ３５９８４（ＡＴＣＣから購入）を用いた。
【００７６】
（ポリスチレンウエルのコーティング） ＰＢＳに希釈した１０ｍｇ／ｍｌ、１ｍｇ／ｍｌまたは０．１ｍｇ／ｍｌのリソスタフィン３００μｌでウエルをコーティングした。プレートを４℃で一晩インキュベートした。ウエルを１ｍｌのＰＢＳで１０回洗浄し、洗浄液を真空吸引して除去した。各ウエルに、黄色ブドウ球菌の５×１０４ＣＦＵ／ｍｌ溶液３００μｌを加えた。プレートを３７℃下に２時間、７５ｒｐｍで振盪した。次いで、各ウエルから４０μｌを採取し、血液寒天プレート上に画線塗布（ストリーク）し、３７℃下に一晩インキュベートした。
【００７７】
（カテーテルのコーティング） アンジオカットカテーテルから針を除去し、処分した。１ｍｌシリンジを用いて、カテーテルをリソスタフィンの０．１ｍｇ／ｍｌ溶液２００μｌでコーティングした。カテーテルは、特に断りのない限り、室温下に１時間インキュベートした。次いで、蠕動ポンプを用いて１．５ｍｌ／分の流速で５０ｍｌのリン酸緩衝生理食塩水によりカテーテルを洗浄した。次いで、カテーテルに、細菌の〜５×１０４ＣＦＵ／ｍｌ溶液（ＴＳＢで希釈したもの）１２０μｌを接種し、３７℃で２時間インキュベートした。次いで、カテーテルから流出させた液を血液寒天プレート上に画線塗布し、３７℃下に一晩インキュベートした。
【００７８】
（リソスタフィンの浸出） リソスタフィンがカテーテルから管腔溶液中にゆっくり放出されるかどうかをテストするために、リソスタフィンコーティングカテーテルを１００μｌのＰＢＳと共に３７℃で２時間インキュベートした。次いで、ＰＢＳをエッペンドルフチューブ内に移し、この流出液に１０５ＣＦＵのＳＡ５を加え、３７℃で１時間インキュベートした。試料から４０μｌを採取し、血液寒天プレート上に画線塗布し、３７℃で一晩インキュベートした。もう１つの方法として、リソスタフィンコーティングカテーテルをＰＢＳと共に３７℃で一晩インキュベートした。翌朝、ＰＢＳを洗浄除去し、カテーテルに〜５×１０４ＣＦＵ／ｍｌのＳＡ５を３７℃で２時間接種した。次いで、流出液を血液寒天プレート上に画線塗布し、３７℃で一晩インキュベートした。ポリスチレン表面からの浸出を検出するために、ウエルを１０、１および０．１ｍｇ／ｍｌのリソスタフィンで６０分かけてコーティングした。次いで、ウエルを洗浄し、各ウエルに３００μｌのＰＢＳを加えて２時間おいてから取り除いた。このＰＢＳ洗浄液に５×１０４ＣＦＵ／ｍｌ溶液３００μｌを加え、３７℃で一晩インキュベートした。次いで、４０μｌを採取し、血液寒天プレート上に画線塗布し、３７℃で一晩インキュベートした。
【００７９】
（リソスタフィンの長期浸出） １０個のリソスタフィンコーティングカテーテル（１０ｍｇ／ｍｌのコーティング濃度）をＰＢＳと共に３７℃で２時間インキュベートした。次いで、カテーテルを洗浄し、１０個のリソスタフィンコーティングカテーテルのうち２個をＳＡ５の５×１０４ＣＦＵ／ｍｌ溶液２００μｌと共に３７℃で２時間インキュベートした。流出液を血液寒天プレート上に画線塗布し、３７℃で一晩インキュベートした。残りのカテーテルを新鮮なＰＢＳと共にインキュベートし、一晩３７℃下に放置した。翌日、全８個のカテーテルを洗い流し、そのうち２個のカテーテルを上記のように細菌と共にインキュベートした。他の６個のカテーテルは再び新鮮なＰＢＳと共にインキュベートし、一晩３７℃下に放置した。この手順を４日間毎日繰り返した。
【００８０】
（細菌のカテーテルへの付着） リソスタフィンコーティングカテーテルを、振盪下に２時間、０．１ｍｇ／ｍｌのリソスタフィン溶液２ｍｌ中に入れておき、カテーテルの外
側をコーティングした。次いで、カテーテルを洗浄し、５×１０４ＣＦＵ／ｍｌのＳＡ５溶液に入れ、３７℃で３時間インキュベートした。この細菌溶液４０μｌを血液寒天プレート上に画線塗布し、３７℃で一晩インキュベートした。カテーテルを２ｍｌのＴＳＢ中３７℃で一晩インキュベートし、増殖について調べた。処理していないカテーテルを５０ｍｌのＰＢＳで洗浄し、次いで、５×１０６ＣＦＵ／ｍｌの細菌溶液１２０μｌを接種し、２または２４時間インキュベートした。次いで、カテーテル流出液を血液寒天プレート上に画線塗布し、一晩３７℃下に放置した。カテーテルを５０ｍｌのＰＢＳで洗浄し、最後の１ｍｌの洗浄液を回収し、１００μｌを血液寒天プレート上に画線塗布して３７℃で一晩インキュベートした。次いで、カテーテルを１ｍｌのＴＳＢ中３７℃で一晩インキュベートし、増殖について調べた。
【００８１】
（血清タンパク質の存在下におけるリソスタフィン活性） カテーテルを室温下に６０分かけて０．１ｍｇ／ｍｌでコーティングした。次いで、カテーテルを洗浄し、ヒト血清またはＴＢＳと共に３７℃で２４時間インキュベートした。カテーテルを洗浄し、次いで、５×１０４ＣＦＵ／ｍｌの細菌を３７℃で２時間接種した。カテーテルからの流出液を血液寒天プレート上に画線塗布し、３７℃で一晩インキュベートした。
【００８２】
固定化されたリソスタフィンにより、ポリスチレンおよびカテーテルの表面から細菌を効果的に除去することができた。対照ウエルからは平均して６１０ＣＦＵが回収されたのに対し、リソスタフィンでコーティングしたウエルにはわずか３ＣＦＵしか残っておらず、細菌数が９９．５％減少した。３種の濃度はいずれも細菌に対して極めて活性が高かったので、この範囲における殺菌は濃度依存的ではなかった。リソスタフィンコーティングカテーテルでは細菌が完全に除去されたのに対し、対照カテーテルでは４９３ＣＦＵが回収された。これらの結果は、リソスタフィンがプラスチック表面に結合している間、黄色ブドウ球菌に対する活性を維持することを示唆している。
【００８３】
殺菌活性がリソスタフィンコーティング時間の関数であるかどうかを突きとめるために、カテーテルを、５、１０または１５分間かけて、０．１ｍｇ／ｍｌのリソスタフィンでコーティングし、それらの黄色ブドウ球菌殺菌効力を調べた。図１０に示すように、カテーテルは、リソスタフィンでわずか５分間コーティングしただけでも高レベルの殺菌活性を有していたが、コーティング時間が長くなるにつれ、効力が増大する傾向があった。細菌数は、５分間のコーティング後には９８．７％、１０分後には９９．４％減少し、わずか１５分間のコーティング後では完全に除去された。
【００８４】
（コーティング表面からのリソスタフィンの浸出）
リソスタフィンコーティングカテーテルのＰＢＳ洗浄液は、ごくわずかな細菌数減少しか示さなかった（表１４）。リソスタフィンコーティングカテーテルは、ＰＢＳで一晩洗浄した後でも細菌を完全に除去したことを示したのに対し、非処理カテーテルでは１５００ＣＦＵが回収された。このデータは、リソスタフィンがカテーテルから浸出しているとしても、このような細菌負荷に対しては有効でない量の浸出であることを示唆している。
【００８５】
ポリスチレンからのリソスタフィン浸出の結果として、細菌除去に及ぼすコーティング濃度依存的効果が存在する。１０ｍｇ／ｍｌについての洗浄液は、ＳＡ５の力価を、対照に比べて１．４ｌｏｇ減少させ、１ｍｇ／ｍｌの洗浄液は１．３ｌｏｇ減少させた。しかし、０．１ｍｇ／ｍｌコーティングでは、浸出による細菌数の減少はわずか０．３３ｌｏｇであった。一方、０．１ｍｇ／ｍｌでコーティングしたウエルに同じ細菌力価を直接加えると、細菌数が２．４ｌｏｇ減少した（表１３）。
【００８６】
【表１３】
【００８７】
【表１４】
コーティングカテーテルの殺菌活性に及ぼすリソスタフィンの連続浸出の効果を図１１に示す。カテーテルを、２４時間毎にＰＢＳを新しくしながら、最大９６時間までＰＢＳとともにインキュベートした。次いで、カテーテルが黄色ブドウ球菌殺菌活性を維持しているかどうかを調べるために、カテーテルを細菌で負荷曝露した。図１１に示すように、ＰＢＳと共に２時間インキュベートした後では、リソスタフィンコーティングカテーテルから回収された細菌は非コーティングカテーテルに比べて２．８ｌｏｇ減少していた。細菌数は、２４時間後には１．８ｌｏｇ、４８時間後には１．５ｌｏｇ、７２時間後には０．７ｌｏｇ、９６時間後には０．３ｌｏｇ減少した。
【００８８】
（リソスタフィンコーティングカテーテルに対する種々の菌株の感受性）
表１５は、生体外（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）カテーテルモデルでテストした、ＭＲＳＡ株および原型のバイオフィルム産生表皮ブドウ球菌株を含めた数種の黄色ブドウ球菌株および表皮ブドウ球菌株の感受性を示している。
【００８９】
【表１５】
以前の研究では、リソスタフィンは黄色ブドウ球菌に比べて表皮ブドウ球菌に対して活性が低いことが示されたが、リソスタフィンコーティングカテーテルは、黄色ブドウ球菌株に対するより幾分効果が低いとは言え、表皮ブドウ球菌の３種の菌株を効果的に死滅させることができた。表皮ブドウ球菌３８０型は表皮ブドウ球菌のうちで最も感受性が高く、２．２ｌｏｇ減少した。バイオフィルム産生表皮ブドウ球菌ＡＴＣＣ３５９８４は、対照試料に対して１．８ｌｏｇの減少、表皮ブドウ球菌１１７５は１．１ｌｏｇの減少を示した。リソスタフィンコーティングカテーテルは、黄色ブドウ球菌ＭＢＴ５０４０（ＭＲＳＡ）および黄色ブドウ球菌莢膜型８型（ＳＡ８）のいずれにも非常に有効であった。平均すると、ＭＲＳＡと共にインキュベートしたカテーテルからは１ＣＦＵが回収され、一方、ＳＡ８と共にインキュベートしたカテーテルでは完全に清浄化（細菌除去）されたのに比べ、非コーティングカテーテルからは１２５０ＣＦＵの細菌が回収された。
【００９０】
（細菌のカテーテルへの付着）
非コーティングカテーテル流出液中の細菌数は多すぎて数えられなかったが、洗浄液の最後の１ｍｌを回収して、血液寒天プレート上に画線塗布した。洗浄液中の細菌数はインキュベーション時間に比例し、２４時間ではより多数の細菌が付着していた。平均して、２４時間洗浄液からは１０００ＣＦＵが回収されたのに対し、２時間洗浄液からは約３０ＣＦＵが回収された。洗浄液中の細菌数は、カテーテル内の細菌付着レベルを示す可能性が高い。次に、非コーティングカテーテルを培養し、細菌増殖について調べた。培地中で一晩インキュベートすると、カテーテルにはかなりのコロニーが形成され、培地中で細菌が増殖することが示された。このデータは、細菌がカテーテル表面に付着し、感染を引き起こし得ることを示唆している。大量の接種細菌中で３時間インキュベートしたリソスタフィンカテーテルは溶液を清浄化（細菌を除去）した。一晩インキュベートした後、培地には細菌がなかったが、これは、リソスタフィンコーティングカテーテルが３時間で細菌
溶液を清浄化することができ、カテーテルは無菌状態に保たれることを示唆している。
【００９１】
（血清タンパク質存在下のリソスタフィン活性）
図１２に示すように、０．１ｍｇ／ｍｌのリソスタフィンでコーティングしたカテーテルをヒト血清と共にインキュベートすると、細菌数が９９％減少することが示され、一方、１０および１ｍｇ／ｍｌのリソスタフィンでコーティングしたカテーテルをヒト血清と共にインキュベートすると、細菌が完全に除去された。これらの結果は、血清タンパク質の存在がカテーテル上のリソスタフィンの活性に有意な影響を与えないことを示唆している。
【００９２】
上記実施例は人工的な表面へのリソスタフィンコーティングの効力を実証している。リソスタフィンでコーティングされた表面は、カテーテル関連感染およびインプラント関連感染のいずれの予防においても重要な新規療法となり得る。
【００９３】
上述の特徴の種々の変形形態および組み合わせが、特許請求の範囲に記載されている本発明から逸脱することなく利用可能であることは容易に理解されよう。それらの変形形態は本発明の思想および範囲から逸脱したものとは見なされず、そのような変更形態はすべて以下の特許請求の範囲内に包含されるものとする。
【図面の簡単な説明】
【００９４】
【図１】リソスタフィンで処理していない組織培養インサート上の黄色ブドウ球菌バイオフィルムの成長を示す、２通りの倍率（左側が２０００×、右側が６６０×）のＳＥＭ写真。
【図２】リソスタフィンで処理したインサートを示す、倍率が左側６，６００×、右側６６０×のＳＥＭ写真。黄色ブドウ球菌バイオフィルムはすべて根絶されている。
【図３】黄色ブドウ球菌株ＭＢＴ５０４０バイオフィルムがそれぞれ５０μｇ／ｍｌのリソスタフィンで処理された（＋）８ウエルと、処理されていない（−）８ウエルとからなる１６ウエルの組織培養プレートの走査を示す図。
【図４】２種のリソスタフィン耐性黄色ブドウ球菌（ＬｙｓｏＲ）変異株を含めた種々の黄色ブドウ球菌株のバイオフィルムを５０μｇ／ｍｌのリソスタフィンで処理した（＋）ウエルと、比較のために処理していない（−）ウエルとからなる３０ウエルの組織培養プレートの走査を示す図。
【図５Ａ】リソスタフィンで治療する前の、黄色ブドウ球菌感染マウスの頚静脈カテーテル上に生体内（ｉｎ ｖｉｖｏ）で成長したバイオフィルムを示す倍率４０００×のＳＥＭ写真。
【図５Ｂ】リソスタフィンで治療する前の、黄色ブドウ球菌感染マウスの頚静脈カテーテル上に生体内（ｉｎ ｖｉｖｏ）で成長したバイオフィルムを示す倍率４０００×のＳＥＭ写真。
【図６Ａ】リソスタフィンによる治療後に、黄色ブドウ球菌に感染した頚静脈カテーテル挿入マウス（図５と類似）のカテーテルからバイオフィルムが除去されたことを示す倍率４０００×のＳＥＭ写真。
【図６Ｂ】リソスタフィンによる治療後に、黄色ブドウ球菌に感染した頚静脈カテーテル挿入マウス（図５と類似）のカテーテルからバイオフィルムが除去されたことを示す倍率４０００×のＳＥＭ写真。
【図７】リソスタフィン（６．２５ｃｇ／ｍｌ）が時間とともに黄色ブドウ球菌バイオフィルムの吸光度を即時かつ連続的に低下させるのに対し、バンコマイシン（８００ｃｇ／ｍｌ）およびオキサシリン（４００□ｃｇ／ｍｌ）はバイオフィルムに何の影響も与えないことを示すグラフ。
【図８】オキサシリン（１．６ｃｇ／ｍｌ〜４００ｃｇ／ｍｌ）またはバンコマイシン（３．２ｃｇ／ｍｌ〜８００ｃｇ／ｍｌ）がＰＢＳ（Ａ）または細菌培地（Ｂ）中での２４時間インキュベーション後に黄色ブドウ球菌バイオフィルムに何の影響も与えないのに対し、リソスタフィンがＰＢＳ中では０．８ｃｇ／ｍｌ（Ａ）で、ＴＳＢ＋０．２５％グルコース中では１２．５ｃｇ／ｍｌ（Ｂ）でバイオフィルムを除去したことを示す走査の図。
【図９】リソスタフィンが、表皮ブドウ球菌バイオフィルム（対照としての黄色ブドウ球菌（Ａ）、表皮ブドウ球菌株Ｈａｙ（Ｂ）、表皮ブドウ球菌株ＡＴＣＣ３５９８４（Ｃ）または表皮ブドウ球菌株ＳＥ１１７５（Ｄ））を破壊することを示す走査の図。２つの拡大部分は、表皮ブドウ球菌株ＡＴＣＣ３５９８４の多層バイオフィルム（上）と、リソスタフィン処理後の、無傷のブドウ球菌を含まない同菌株の残留グリコカリックス（下）を示している。
【図１０】リソスタフィンコーティング時間の関数としてのカテーテルの抗菌効力を示す図。
【図１１】黄色ブドウ球菌に対するリソスタフィンコーティングカテーテルの長期抗菌効力を示す図。
【図１２】血清タンパク質の存在下におけるリソスタフィンコーティングカテーテルの抗菌効力を示す図。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
表面上に細菌バイオフィルムが成長している損傷組織または留置人工装置もしくはカテーテルを体内に有する患者を、前記バイオフィルムを少なくとも部分的に破壊するように治療する方法であって、前記患者に、バイオフィルム形成細菌を致死または損傷させる少なくとも１種の抗菌酵素を、バイオフィルムと接触させると該バイオフィルムを少なくとも部分的に破壊するのに有効な量投与することを含む方法。
【請求項２】
前記抗菌酵素量が、前記バイオフィルムが成長している表面から前記バイオフィルムを完全に根絶するのに有効である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
抗菌酵素を少なくとも１種の他の抗菌剤と併用する、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記バイオフィルムがブドウ球菌性である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記バイオフィルムが黄色ブドウ球菌を含んでなる、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記バイオフィルムが表皮ブドウ球菌を含んでなる、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
前記バイオフィルムが黄色ブドウ球菌と表皮ブドウ球菌とを含んでなる、請求項４に記載の方法。
【請求項８】
リソスタフィンまたはリソスタフィン類似体を投与することを含んでなる、請求項４に記載の方法。
【請求項９】
リソスタフィンまたはリソスタフィン類似体もしくはリソスタフィンと同じ酵素活性を有するキメラ分子を投与することを含んでなる、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
組換え発現され完全な活性を有する同種リソスタフィンを投与する、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
前記リソスタフィンが人工合成されている、請求項８に記載の方法。
【請求項１２】
前記抗菌酵素が人工合成されている、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記リソスタフィンが天然由来である、請求項８に記載の方法。
【請求項１４】
前記リソスタフィンをブドウ球菌に有効な他の抗生物質と併用する、請求項８に記載の方法。
【請求項１５】
前記他の抗生物質が細胞壁合成を妨害または阻害する、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記抗生物質が、β‐ラクタム、セファロスポリン、グリコペプチド、アミノグリコシド、スルホノミド（ｓｕｌｆｏｎｏｍｉｄｅ）、マクロライド、葉酸、ポリペプチドおよびそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記他の抗生物質がタンパク質合成を妨害する、請求項１４に記載の方法。
【請求項１８】
前記他の抗生物質が、グリコシド、テトラサイクリンおよびストレプトグラミンを含んでなる、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
バイオフィルム形成細菌を致死または損傷させる少なくとも１種の抗菌酵素を予防上有効な量投与して、患者内のバイオフィルム成長が生じやすいインプラント表面または損傷組織上におけるバイオフィルム成長を予防する方法。
【請求項２０】
前記患者が、バイオフィルム成長が生じやすい表面を備えた留置カテーテルまたは人工装置を有する、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記バイオフィルムがブドウ球菌のバイオフィルムである、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
前記バイオフィルムが黄色ブドウ球菌を含んでなる、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記バイオフィルムが表皮ブドウ球菌である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
前記バイオフィルムが、黄色ブドウ球菌と表皮ブドウ球菌とを含んでなる、請求項２１に記載の方法。
【請求項２５】
前記投与が、少なくとも１種のリソスタフィンまたはリソスタフィン類似体もしくはリソスタフィンと同じ酵素活性を有するキメラ分子を投与することを含んでなる、請求項２１に記載の方法。
【請求項２６】
前記投与が、少なくとも１種のリソスタフィンまたはリソスタフィン類似体もしくはリソスタフィンと同じ酵素活性を有するキメラ分子を投与するステップを含んでなる、請求項１９に記載の方法。
【請求項２７】
組換え発現され完全な活性を有する同種リソスタフィンを投与する、請求項２５に記載の方法。
【請求項２８】
前記リソスタフィンが人工合成されている、請求項２５に記載の方法。
【請求項２９】
前記抗菌酵素が人工合成されている、請求項１９に記載の方法。
【請求項３０】
前記リソスタフィンが天然由来である、請求項２５に記載の方法。
【請求項３１】
前記リソスタフィンをブドウ球菌に有効な他の抗生物質と併用する、請求項１９に記載の方法。
【請求項３２】
前記他の抗生物質が細胞壁合成を妨害または阻害する、請求項１９に記載の方法。
【請求項３３】
前記抗生物質が、β‐ラクタム、セファロスポリン、アミノグリコシド、スルホノミド、マクロライド、葉酸、グリコペプチド、ポリペプチドおよびそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１９に記載の方法。
【請求項３４】
前記他の抗生物質がタンパク質合成を妨害する、請求項１９に記載の方法。
【請求項３５】
前記他の抗生物質が、グリコシド、テトラサイクリンおよびストレプトグラミンを含んでなる、請求項１９に記載の方法。
【請求項３６】
前記リソスタフィンを、埋め込む前の前記カテーテル内または前記人工装置上に導入する、請求項２０に記載の方法。
【請求項３７】
溶液のポンプ注入により前記リソスタフィンを前記カテーテルに導入する、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記リソスタフィンを挿入後の前記カテーテルに導入する、請求項２０に記載の方法。
【請求項３９】
ボーラス注入により前記リソスタフィンを前記カテーテルに導入する、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
低速注入により前記リソスタフィンを前記カテーテルに導入する、請求項３８に記載の方法。
【請求項４１】
表面を生体外（ｅｘ ｖｉｖｏ）で消毒または殺菌して、バイオフィルム形成細菌の該表面上での増殖を予防する方法であって、前記表面と、前記バイオフィルム形成細菌を致死または損傷させる少なくとも１種の予防上有効な量の抗菌酵素とを接触させることを含んでなる方法。
【請求項４２】
前記バイオフィルム形成細菌がブドウ球菌を含む、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記バイオフィルム形成細菌が黄色ブドウ球菌を含む、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記バイオフィルム形成細菌が表皮ブドウ球菌を含む、請求項４２に記載の方法。
【請求項４５】
前記バイオフィルム形成細菌が、黄色ブドウ球菌と表皮ブドウ球菌とを含む、請求項４２に記載の方法。
【請求項４６】
前記接触が、前記表面と、少なくとも１種のリソスタフィンまたはリソスタフィン類似体もしくはリソスタフィンと同じ酵素活性を有するキメラ分子とを接触させることを含んでなる、請求項４２に記載の方法。
【請求項４７】
前記接触が、前記表面と、少なくとも１種のリソスタフィンまたはリソスタフィン類似体もしくはリソスタフィンと同じ酵素活性を有するキメラ分子とを接触させることを含んでなる、請求項４１に記載の方法。
【請求項４８】
前記表面と、組換え発現され完全な活性を有する同種リソスタフィンとを接触させる、請求項４１に記載の方法。
【請求項４９】
前記リソスタフィンが人工合成されている、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
前記抗菌酵素が人工合成されている、請求項４１に記載の方法。
【請求項５１】
前記リソスタフィンを、ブドウ球菌に有効な他の抗生物質と併用する、請求項４８に記載の方法。
【請求項５２】
前記他の抗生物質が細胞壁合成を妨害または阻害する、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
前記抗生物質が、β‐ラクタム、セファロスポリン、グリコペプチド、ポリペプチドおよびそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
前記他の抗生物質がタンパク質合成を妨害する、請求項５１に記載の方法。
【請求項５５】
前記他の抗生物質がグリコシド、テトラサイクリンおよびストレプトグラミンを含んでなる、請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
人工装置またはカテーテルであって、それを必要とする患者に埋め込み可能であり、細菌バイオフィルムが成長しやすい少なくとも１つの表面を有し、バイオフィルム形成の予防に有効な量のバイオフィルム形成細菌を致死させる少なくとも１種の抗菌酵素でコーティングされている人工装置またはカテーテル。
【請求項５７】
前記酵素コーティングが前記表面に共有結合している、請求項５６に記載の装置またはカテーテル。
【請求項５８】
前記少なくとも１つの表面は、前記酵素をポリマー表面から実質的に放出させることなく前記ポリマー表面に呈するように、前記ポリマーと前記酵素とのブレンドを含んでなる、請求項５６に記載の装置またはカテーテル。
【請求項５９】
前記装置が、シャント、ステント、組織構築用足場、栄養補給菅、パンクタルプラグ、人工関節、ペースメーカー、人工弁からなる群から選択される、請求項５６に記載の装置またはカテーテル。
【請求項６０】
前記装置またはカテーテルが埋め込み式金属装置である、請求項５９に記載の装置またはカテーテル。
【請求項６１】
前記金属がチタンである、請求項６０に記載の装置またはカテーテル。
【請求項６２】
ポリマーと、バイオフィルム形成細菌を致死させる少なくとも１種の有効量の抗菌酵素とをブレンドすることを含んでなる、ポリマー組成物を製造する方法であって、該組成物から形成される表面上におけるバイオフィルム形成細菌の増殖に抵抗性のポリマー組成物を製造する方法。
【請求項６３】
前記バイオフィルム形成細菌がブドウ球菌である、請求項６２に記載の方法。
【請求項６４】
前記バイオフィルム形成細菌が黄色ブドウ球菌を含む、請求項６３に記載の方法。
【請求項６５】
前記バイオフィルム形成細菌が表皮ブドウ球菌を含む、請求項６３に記載の方法。
【請求項６６】
前記バイオフィルム形成細菌が黄色ブドウ球菌と表皮ブドウ球菌とを含む、請求項６３に記載の方法。
【請求項６７】
前記酵素が、リソスタフィン、リソスタフィン類似体またはリソスタフィンと同じ酵素活性を有するキメラ分子を含んでなる、請求項６２に記載の方法。
【請求項６８】
前記リソスタフィンまたはリソスタフィン類似体が、組換え発現され完全な活性を有する同種リソスタフィンである、請求項６７に記載の方法。
【請求項６９】
前記リソスタフィンが天然由来である、請求項６７に記載の方法。
【請求項７０】
前記リソスタフィンが合成由来である、請求項６７に記載の方法。
【請求項７１】
前記リソスタフィンを、ブドウ球菌に有効な他の抗生物質と併用する、請求項６７に記
載の方法。
【請求項７２】
前記酵素がリソスタフィンまたはリソスタフィン類似体を含んでなる、請求項６２に記載の方法。
【請求項７３】
前記リソスタフィンが天然由来である、請求項７２に記載の方法。
【請求項７４】
前記リソスタフィンが合成由来である、請求項７２に記載の方法。
【請求項７５】
前記リソスタフィンを、ブドウ球菌に有効な他の抗生物質と併用する、請求項６２に記載の方法。
【請求項７６】
前記他の抗生物質が細胞壁合成を妨害または阻害する、請求項６２に記載の方法。
【請求項７７】
前記抗生物質が、β‐ラクタム、セファロスポリン、グリコペプチド、ポリペプチドおよびそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項７６に記載の方法。
【請求項７８】
前記他の抗生物質がタンパク質合成を妨害する、請求項６２に記載の方法。
【請求項７９】
前記他の抗生物質が、グリコシド、テトラサイクリンおよびストレプトグラミンを含んでなる、請求項６２に記載の方法。
【請求項８０】
人工装置またはカテーテル製造用ポリマー組成物であって、ポリマー組成物に用いるのに適したポリマーと、前記ポリマー組成物から形成される表面上におけるバイオフィルム形成の予防に有効な量のバイオフィルム形成細菌を致死させる少なくとも１種の抗菌酵素とをブレンドしたポリマー組成物。
【請求項８１】
前記バイオフィルム形成細菌がブドウ球菌である、請求項８０に記載のポリマー組成物。
【請求項８２】
前記バイオフィルム形成細菌が黄色ブドウ球菌を含む、請求項８１に記載のポリマー組成物。
【請求項８３】
前記バイオフィルム形成細菌が表皮ブドウ球菌を含む、請求項８１に記載のポリマー組成物。
【請求項８４】
前記バイオフィルム形成細菌が黄色ブドウ球菌と表皮ブドウ球菌とを含む、請求項８１に記載のポリマー組成物。
【請求項８５】
前記酵素が、リソスタフィン、リソスタフィン類似体またはリソスタフィンと同じ酵素活性を有するキメラ分子を含んでなる、請求項８１に記載のポリマー組成物。
【請求項８６】
前記リソスタフィンまたはリソスタフィン類似体が組換え発現され完全な活性を有する同種リソスタフィンである、請求項８５に記載のポリマー組成物。
【請求項８７】
前記リソスタフィンが天然由来である、請求項８５に記載のポリマー組成物。
【請求項８８】
前記リソスタフィンが合成由来である、請求項８５に記載のポリマー組成物。
【請求項８９】
前記リソスタフィンがブドウ球菌に有効な他の抗生物質とブレンドされている、請求項
８５に記載のポリマー組成物。
【請求項９０】
前記酵素がリソスタフィンまたはリソスタフィン類似体を含んでなる、請求項８０に記載のポリマー組成物。
【請求項９１】
前記リソスタフィンが天然由来である、請求項９０に記載の方法。
【請求項９２】
前記リソスタフィンが合成由来である、請求項９０に記載の方法。
【請求項１】
表面上に細菌バイオフィルムが成長している損傷組織または留置人工装置もしくはカテーテルを体内に有する患者を、前記バイオフィルムを少なくとも部分的に破壊するように治療する方法であって、前記患者に、バイオフィルム形成細菌を致死または損傷させる少なくとも１種の抗菌酵素を、バイオフィルムと接触させると該バイオフィルムを少なくとも部分的に破壊するのに有効な量投与することを含む方法。
【請求項２】
前記抗菌酵素量が、前記バイオフィルムが成長している表面から前記バイオフィルムを完全に根絶するのに有効である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
抗菌酵素を少なくとも１種の他の抗菌剤と併用する、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記バイオフィルムがブドウ球菌性である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記バイオフィルムが黄色ブドウ球菌を含んでなる、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記バイオフィルムが表皮ブドウ球菌を含んでなる、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
前記バイオフィルムが黄色ブドウ球菌と表皮ブドウ球菌とを含んでなる、請求項４に記載の方法。
【請求項８】
リソスタフィンまたはリソスタフィン類似体を投与することを含んでなる、請求項４に記載の方法。
【請求項９】
リソスタフィンまたはリソスタフィン類似体もしくはリソスタフィンと同じ酵素活性を有するキメラ分子を投与することを含んでなる、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
組換え発現され完全な活性を有する同種リソスタフィンを投与する、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
前記リソスタフィンが人工合成されている、請求項８に記載の方法。
【請求項１２】
前記抗菌酵素が人工合成されている、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記リソスタフィンが天然由来である、請求項８に記載の方法。
【請求項１４】
前記リソスタフィンをブドウ球菌に有効な他の抗生物質と併用する、請求項８に記載の方法。
【請求項１５】
前記他の抗生物質が細胞壁合成を妨害または阻害する、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記抗生物質が、β‐ラクタム、セファロスポリン、グリコペプチド、アミノグリコシド、スルホノミド（ｓｕｌｆｏｎｏｍｉｄｅ）、マクロライド、葉酸、ポリペプチドおよびそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記他の抗生物質がタンパク質合成を妨害する、請求項１４に記載の方法。
【請求項１８】
前記他の抗生物質が、グリコシド、テトラサイクリンおよびストレプトグラミンを含んでなる、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
バイオフィルム形成細菌を致死または損傷させる少なくとも１種の抗菌酵素を予防上有効な量投与して、患者内のバイオフィルム成長が生じやすいインプラント表面または損傷組織上におけるバイオフィルム成長を予防する方法。
【請求項２０】
前記患者が、バイオフィルム成長が生じやすい表面を備えた留置カテーテルまたは人工装置を有する、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記バイオフィルムがブドウ球菌のバイオフィルムである、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
前記バイオフィルムが黄色ブドウ球菌を含んでなる、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記バイオフィルムが表皮ブドウ球菌である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
前記バイオフィルムが、黄色ブドウ球菌と表皮ブドウ球菌とを含んでなる、請求項２１に記載の方法。
【請求項２５】
前記投与が、少なくとも１種のリソスタフィンまたはリソスタフィン類似体もしくはリソスタフィンと同じ酵素活性を有するキメラ分子を投与することを含んでなる、請求項２１に記載の方法。
【請求項２６】
前記投与が、少なくとも１種のリソスタフィンまたはリソスタフィン類似体もしくはリソスタフィンと同じ酵素活性を有するキメラ分子を投与するステップを含んでなる、請求項１９に記載の方法。
【請求項２７】
組換え発現され完全な活性を有する同種リソスタフィンを投与する、請求項２５に記載の方法。
【請求項２８】
前記リソスタフィンが人工合成されている、請求項２５に記載の方法。
【請求項２９】
前記抗菌酵素が人工合成されている、請求項１９に記載の方法。
【請求項３０】
前記リソスタフィンが天然由来である、請求項２５に記載の方法。
【請求項３１】
前記リソスタフィンをブドウ球菌に有効な他の抗生物質と併用する、請求項１９に記載の方法。
【請求項３２】
前記他の抗生物質が細胞壁合成を妨害または阻害する、請求項１９に記載の方法。
【請求項３３】
前記抗生物質が、β‐ラクタム、セファロスポリン、アミノグリコシド、スルホノミド、マクロライド、葉酸、グリコペプチド、ポリペプチドおよびそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１９に記載の方法。
【請求項３４】
前記他の抗生物質がタンパク質合成を妨害する、請求項１９に記載の方法。
【請求項３５】
前記他の抗生物質が、グリコシド、テトラサイクリンおよびストレプトグラミンを含んでなる、請求項１９に記載の方法。
【請求項３６】
前記リソスタフィンを、埋め込む前の前記カテーテル内または前記人工装置上に導入する、請求項２０に記載の方法。
【請求項３７】
溶液のポンプ注入により前記リソスタフィンを前記カテーテルに導入する、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記リソスタフィンを挿入後の前記カテーテルに導入する、請求項２０に記載の方法。
【請求項３９】
ボーラス注入により前記リソスタフィンを前記カテーテルに導入する、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
低速注入により前記リソスタフィンを前記カテーテルに導入する、請求項３８に記載の方法。
【請求項４１】
表面を生体外（ｅｘ ｖｉｖｏ）で消毒または殺菌して、バイオフィルム形成細菌の該表面上での増殖を予防する方法であって、前記表面と、前記バイオフィルム形成細菌を致死または損傷させる少なくとも１種の予防上有効な量の抗菌酵素とを接触させることを含んでなる方法。
【請求項４２】
前記バイオフィルム形成細菌がブドウ球菌を含む、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記バイオフィルム形成細菌が黄色ブドウ球菌を含む、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記バイオフィルム形成細菌が表皮ブドウ球菌を含む、請求項４２に記載の方法。
【請求項４５】
前記バイオフィルム形成細菌が、黄色ブドウ球菌と表皮ブドウ球菌とを含む、請求項４２に記載の方法。
【請求項４６】
前記接触が、前記表面と、少なくとも１種のリソスタフィンまたはリソスタフィン類似体もしくはリソスタフィンと同じ酵素活性を有するキメラ分子とを接触させることを含んでなる、請求項４２に記載の方法。
【請求項４７】
前記接触が、前記表面と、少なくとも１種のリソスタフィンまたはリソスタフィン類似体もしくはリソスタフィンと同じ酵素活性を有するキメラ分子とを接触させることを含んでなる、請求項４１に記載の方法。
【請求項４８】
前記表面と、組換え発現され完全な活性を有する同種リソスタフィンとを接触させる、請求項４１に記載の方法。
【請求項４９】
前記リソスタフィンが人工合成されている、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
前記抗菌酵素が人工合成されている、請求項４１に記載の方法。
【請求項５１】
前記リソスタフィンを、ブドウ球菌に有効な他の抗生物質と併用する、請求項４８に記載の方法。
【請求項５２】
前記他の抗生物質が細胞壁合成を妨害または阻害する、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
前記抗生物質が、β‐ラクタム、セファロスポリン、グリコペプチド、ポリペプチドおよびそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
前記他の抗生物質がタンパク質合成を妨害する、請求項５１に記載の方法。
【請求項５５】
前記他の抗生物質がグリコシド、テトラサイクリンおよびストレプトグラミンを含んでなる、請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
人工装置またはカテーテルであって、それを必要とする患者に埋め込み可能であり、細菌バイオフィルムが成長しやすい少なくとも１つの表面を有し、バイオフィルム形成の予防に有効な量のバイオフィルム形成細菌を致死させる少なくとも１種の抗菌酵素でコーティングされている人工装置またはカテーテル。
【請求項５７】
前記酵素コーティングが前記表面に共有結合している、請求項５６に記載の装置またはカテーテル。
【請求項５８】
前記少なくとも１つの表面は、前記酵素をポリマー表面から実質的に放出させることなく前記ポリマー表面に呈するように、前記ポリマーと前記酵素とのブレンドを含んでなる、請求項５６に記載の装置またはカテーテル。
【請求項５９】
前記装置が、シャント、ステント、組織構築用足場、栄養補給菅、パンクタルプラグ、人工関節、ペースメーカー、人工弁からなる群から選択される、請求項５６に記載の装置またはカテーテル。
【請求項６０】
前記装置またはカテーテルが埋め込み式金属装置である、請求項５９に記載の装置またはカテーテル。
【請求項６１】
前記金属がチタンである、請求項６０に記載の装置またはカテーテル。
【請求項６２】
ポリマーと、バイオフィルム形成細菌を致死させる少なくとも１種の有効量の抗菌酵素とをブレンドすることを含んでなる、ポリマー組成物を製造する方法であって、該組成物から形成される表面上におけるバイオフィルム形成細菌の増殖に抵抗性のポリマー組成物を製造する方法。
【請求項６３】
前記バイオフィルム形成細菌がブドウ球菌である、請求項６２に記載の方法。
【請求項６４】
前記バイオフィルム形成細菌が黄色ブドウ球菌を含む、請求項６３に記載の方法。
【請求項６５】
前記バイオフィルム形成細菌が表皮ブドウ球菌を含む、請求項６３に記載の方法。
【請求項６６】
前記バイオフィルム形成細菌が黄色ブドウ球菌と表皮ブドウ球菌とを含む、請求項６３に記載の方法。
【請求項６７】
前記酵素が、リソスタフィン、リソスタフィン類似体またはリソスタフィンと同じ酵素活性を有するキメラ分子を含んでなる、請求項６２に記載の方法。
【請求項６８】
前記リソスタフィンまたはリソスタフィン類似体が、組換え発現され完全な活性を有する同種リソスタフィンである、請求項６７に記載の方法。
【請求項６９】
前記リソスタフィンが天然由来である、請求項６７に記載の方法。
【請求項７０】
前記リソスタフィンが合成由来である、請求項６７に記載の方法。
【請求項７１】
前記リソスタフィンを、ブドウ球菌に有効な他の抗生物質と併用する、請求項６７に記
載の方法。
【請求項７２】
前記酵素がリソスタフィンまたはリソスタフィン類似体を含んでなる、請求項６２に記載の方法。
【請求項７３】
前記リソスタフィンが天然由来である、請求項７２に記載の方法。
【請求項７４】
前記リソスタフィンが合成由来である、請求項７２に記載の方法。
【請求項７５】
前記リソスタフィンを、ブドウ球菌に有効な他の抗生物質と併用する、請求項６２に記載の方法。
【請求項７６】
前記他の抗生物質が細胞壁合成を妨害または阻害する、請求項６２に記載の方法。
【請求項７７】
前記抗生物質が、β‐ラクタム、セファロスポリン、グリコペプチド、ポリペプチドおよびそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項７６に記載の方法。
【請求項７８】
前記他の抗生物質がタンパク質合成を妨害する、請求項６２に記載の方法。
【請求項７９】
前記他の抗生物質が、グリコシド、テトラサイクリンおよびストレプトグラミンを含んでなる、請求項６２に記載の方法。
【請求項８０】
人工装置またはカテーテル製造用ポリマー組成物であって、ポリマー組成物に用いるのに適したポリマーと、前記ポリマー組成物から形成される表面上におけるバイオフィルム形成の予防に有効な量のバイオフィルム形成細菌を致死させる少なくとも１種の抗菌酵素とをブレンドしたポリマー組成物。
【請求項８１】
前記バイオフィルム形成細菌がブドウ球菌である、請求項８０に記載のポリマー組成物。
【請求項８２】
前記バイオフィルム形成細菌が黄色ブドウ球菌を含む、請求項８１に記載のポリマー組成物。
【請求項８３】
前記バイオフィルム形成細菌が表皮ブドウ球菌を含む、請求項８１に記載のポリマー組成物。
【請求項８４】
前記バイオフィルム形成細菌が黄色ブドウ球菌と表皮ブドウ球菌とを含む、請求項８１に記載のポリマー組成物。
【請求項８５】
前記酵素が、リソスタフィン、リソスタフィン類似体またはリソスタフィンと同じ酵素活性を有するキメラ分子を含んでなる、請求項８１に記載のポリマー組成物。
【請求項８６】
前記リソスタフィンまたはリソスタフィン類似体が組換え発現され完全な活性を有する同種リソスタフィンである、請求項８５に記載のポリマー組成物。
【請求項８７】
前記リソスタフィンが天然由来である、請求項８５に記載のポリマー組成物。
【請求項８８】
前記リソスタフィンが合成由来である、請求項８５に記載のポリマー組成物。
【請求項８９】
前記リソスタフィンがブドウ球菌に有効な他の抗生物質とブレンドされている、請求項
８５に記載のポリマー組成物。
【請求項９０】
前記酵素がリソスタフィンまたはリソスタフィン類似体を含んでなる、請求項８０に記載のポリマー組成物。
【請求項９１】
前記リソスタフィンが天然由来である、請求項９０に記載の方法。
【請求項９２】
前記リソスタフィンが合成由来である、請求項９０に記載の方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５Ａ】
【図５Ｂ】
【図６Ａ】
【図６Ｂ】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５Ａ】
【図５Ｂ】
【図６Ａ】
【図６Ｂ】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【公表番号】特表２００６−５０７８５０（Ｐ２００６−５０７８５０Ａ）
【公表日】平成１８年３月９日（２００６．３．９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００３−５７９６９４（Ｐ２００３−５７９６９４）
【出願日】平成１５年３月２６日（２００３．３．２６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００３／００９３５４
【国際公開番号】ＷＯ２００３／０８２１４８
【国際公開日】平成１５年１０月９日（２００３．１０．９）
【出願人】（５０２４４８７７５）バイオシネクサス インコーポレイテッド (2)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１８年３月９日（２００６．３．９）
【国際特許分類】
【出願日】平成１５年３月２６日（２００３．３．２６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００３／００９３５４
【国際公開番号】ＷＯ２００３／０８２１４８
【国際公開日】平成１５年１０月９日（２００３．１０．９）
【出願人】（５０２４４８７７５）バイオシネクサス インコーポレイテッド (2)
【Ｆターム（参考）】
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