組成物、保護／再生促進組成物、ｃＡＭＰ産生促進組成物、及び組成物
【課題】副作用が少なく、それぞれの組成物を単独で用いるよりもインスリン分泌を促進する糖尿病治療／肥満治療用の組成物を提供する。
【解決手段】ＧＬＰ−１関連組成物とグレリン阻害組成物とを含有する組成物により、糖尿病及び／又は肥満を治療する。この糖尿病としては、主に２型糖尿病に用いることができる。また、ＧＬＰ−１関連組成物とグレリン阻害組成物は、それぞれ単独で使用する用量よりも低い投与用量で使用可能である。
【解決手段】ＧＬＰ−１関連組成物とグレリン阻害組成物とを含有する組成物により、糖尿病及び／又は肥満を治療する。この糖尿病としては、主に２型糖尿病に用いることができる。また、ＧＬＰ−１関連組成物とグレリン阻害組成物は、それぞれ単独で使用する用量よりも低い投与用量で使用可能である。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、血糖値を正常に維持するための治療用組成物に係るものであり、特に糖尿病の治療又は予防用の組成物、膵臓ランゲルハンス島β細胞の保護／再生促進組成物、膵臓ランゲルハンス島β細胞のｃＡＭＰ産生促進組成物、及び糖尿病及び／又は肥満を治療する組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
糖尿病には、小児期や若年期から発症する１型糖尿病と、主に成人になってから発症する２型糖尿病が知られている。
このうち、１型糖尿病は、先天的な自己免疫疾患であり、膵臓のランゲルハンス島（膵島）のβ細胞が破壊されて、血糖値を下げるペプチドホルモンであるインスリンの分泌が欠乏し、血糖値を下げることができなくなる代謝異常の疾病である。
２型糖尿病は、膵島β細胞は残存していることもあり得るが、インスリン分泌異常、インスリン抵抗性といった要因で、血糖値のコントロールがうまくいかず、長期的には動脈硬化、神経障害、網膜剥離、腎臓障害等の合併症を引き起こす疾病である。２型糖尿病は、遺伝的、潜在的な要因に加えて、偏食（過食）、ストレス、運動不足等の生活習慣（ライフスタイル）の影響により発病すると考えられている。そのうち、肥満が発症因子として重要である。
我が国の糖尿病の９５％以上は２型糖尿病であり、国民的な疾病となっている。
【０００３】
この２型糖尿病の治療薬として、従来より、インスリンの分泌を促進するスルフォニル尿素剤（ＳＵ剤）、インスリン製剤等が用いられてきた。
このうち、ＳＵ剤は、膵島β細胞を刺激して、インスリンを分泌させる働きにより、血糖値を下げる作用がある。また、インスリン製剤も、注射することで血中のインスリン濃度を上げて血糖値を下げることができる。
しかしながら、ＳＵ剤は、膵島β細胞を刺激して疲弊させる副作用が存在するという問題があった。
また、ＳＵ剤、インスリン製剤とも、血漿インスリン濃度が必要以上に上昇し、低血糖を引き起こすという副作用があった。
低血糖の状態は患者の死を招くこともあり、より副作用の少ない治療薬が求められていた。
【０００４】
そこで、非特許文献１を参照すると、次世代の２型糖尿病の治療薬として、ＧＬＰ−１のアナログが注目されている。ＧＬＰ−１はグルカゴン様ペプチド（ｇｌｕｃａｇｏｎ−ｌｉｋｅ ｐｅｐｔｉｄｅ）のことで、ヒトの消化管の粘膜から分泌されるペプチドホルモンである。
【０００５】
まず、図１７を参照して、このＧＬＰ−１の作用について説明する。通常、膵島β細胞は、血糖値が上がる、すなわち血中のグルコースの濃度が上がると、インスリンの分泌が促進されて血糖値を下げる。
より詳しく説明すると、まず、食事摂取により小腸から吸収されたグルコースが、膵臓の膵島β細胞を刺激してインスリン分泌を起こす。それと同時に、小腸からＧＬＰ−１が分泌され、膵島のβ細胞を刺激して、インスリン分泌を増強する。
ＧＬＰ−１の分泌は食事により刺激され、さらにその作用は食後の血糖値が上昇した状態で強く、食前の血糖値の低い状態では弱い。すなわち、ＧＬＰ−１は、食後のグルコース誘発インスリン分泌を促進する因子である。
【０００６】
ところが、２型糖尿病患者においては、このグルコース誘発インスリン分泌が低下していることが多い。
すなわち、２型糖尿病の患者では、膵島β細胞のグルコース受容が障害されており、その結果、十分な量のインスリン分泌が起こらない。
そこで、膵島β細胞のインスリン分泌を促進するＧＬＰ−１を治療薬として用いることが考えられている。
しかしながら、生体内のＧＬＰ−１は、食物の消化に伴い消化管から分泌されるものの、通常、体内のＧＬＰ−１は、産生からわずか１〜２分で分解酵素により分解されてしまう。
【０００７】
このため、ＧＬＰ−１を治療薬として使用するために、化学的に修飾して、長時間作用させるＧＬＰ−１アナログが開発されている。
また、ＧＬＰ−１の体内濃度を保つため、体内のＧＬＰ−１を分解する分解酵素であるジペプチジルペプチターゼ（ＤＰＰ）４の働きを抑えるＤＰＰ４阻害剤についても、開発が進んでいる。
【０００８】
一方、特許文献１を参照すると、従来、胃から分泌されて摂食を亢進する内分泌物質として知られてきたペプチドホルモンのグレリン（Ｇｈｒｅｌｉｎ）が、膵島β細胞にも存在し、インスリンの分泌を抑制していることが分かってきた。
【０００９】
ここで、図１８を参照して、より詳しくグレリンの作用について説明する。
図１８は、２型糖尿病のモデルのラットに高脂肪食を与えたときの、予防・治療の概念を示す図である。
まず、グレリン阻害組成物を与えていない場合には、高脂肪食が与えられたラットではインスリンに対する抵抗性を生じ、それを乗り越えるまでにはインスリン分泌が増加しないために、血糖値が上昇し、耐糖能障害が生じ、２型糖尿病を発症する。
それに対して、グレリン阻害組成物を与えた場合には、高脂肪食が与えられたラットではインスリンに対する抵抗性は上がるものの、グレリンが阻害されることによってインスリンの分泌量が上昇する。これにより、結果的に、血糖値も上昇しないため、正常状態を維持できる。
このように、グレリンに特異的な抗体のようなグレリン阻害組成物によって、インスリン分泌のブレーキが解除され、インスリン分泌が促進されると考えられる。
【００１０】
上述のように、グレリンはインスリン分泌を抑制するホルモンであるため、内在性グレリン阻害組成物を投与すると、投与対象においてインスリン分泌が増加し血糖値を低下させることができる。
つまり、図１８の概念図によれば、グレリン阻害組成物を与えてグレリンの働きを抑制すると、インスリンの分泌が促進されて、血糖値が下がると理論的に考えられる。このため、２型糖尿病治療用組成物として有効である。
よって、グレリン阻害組成物により、ＧＬＰ−１アナログやＤＰＰ４阻害剤と同様のインスリン分泌促進効果を得ることが期待される。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】特開２００８−１２７３７７号公報
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】Ｋｎｕｄｓｅｎ ｅｔ ａｌ．、Ｊ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ ２０００、４３、１６６４−９
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
しかしながら、ＧＬＰ−１アナログやＤＰＰ４阻害剤のようなＧＬＰ−１関連組成物は、従来の２型糖尿病治療組成物（ＳＵ剤）に比べ、低血糖発作の副作用が少ないが皆無ではなく、かなりの頻度で嘔吐などの副作用を起こしていた。
また、ＧＬＰ−１関連組成物は、比較的インスリン分泌促進及び血糖降下作用が弱いため、治療用組成物としての適用が、比較的軽度の２型糖尿病に限られていた。
一方、グレリン阻害組成物は、インスリン分泌を促進することで２型糖尿病を抑える効果が考えられるものの、その作用機構はインスリン分泌の抑制を阻害するものなので、治療用組成物として使用しても効果が比較的弱いと推察されていた。
【００１４】
このため、副作用を抑えて治療効果が高い、２型糖尿病の治療に用いることができる治療用の組成物が求められていた。
【００１５】
本発明は、このような状況に鑑みてなされたものであり、上述の課題を解消することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本発明の組成物は、ＧＬＰ関連組成物とグレリン阻害組成物とを含有する、糖尿病及び／又は肥満を治療する組成物であることを特徴とする。
本発明の組成物は、前記糖尿病は２型糖尿病であり、前記ＧＬＰ−１関連組成物及び／又はグレリン阻害組成物は、成人における投与用量より低い濃度であることを特徴とする。
本発明の組成物は、前記グレリン阻害組成物及び前記ＧＬＰ−１関連組成物の併用により膵臓ランゲルハンス島β細胞のｃＡＭＰ産生量を増やすことを特徴とする。
本発明の組成物は、前記ＧＬＰ関連組成物がＧＬＰ−１である場合は、１日投与用量が０．１ｎｍｏｌ／ｋｇ体重〜０．３ｎｍｏｌ／ｋｇ体重であることを特徴とする。
本発明の組成物は、前記ＧＬＰ関連組成物がＧＬＰ−１アナログのＥｘｅｎａｔｉｄｅである場合は、成人における１日投与用量が１μｇ〜６μｇであることを特徴とする。
本発明の組成物は、前記ＧＬＰ関連組成物がＧＬＰ−１アナログのＬｉｒａｇｌｕｔｉｄｅである場合は、成人における１日投与用量が０．１ｍｇ〜０．３ｍｇであることを特徴とする。
本発明の組成物は、前記グレリン阻害組成物が［Ｄ−Ｌｙｓ3］−ＧＨＲＰ−６である場合に、１日投与用量は０．１μｍｏｌ／ｋｇ体重〜０．３μｍｏｌ／ｋｇ体重であることを特徴とする。
本発明の膵臓ランゲルハンス島β細胞の保護／再生促進組成物は、前記組成物を含むことを特徴とする。
本発明の膵臓ランゲルハンス島β細胞のｃＡＭＰ産生促進組成物は、前記組成物を含むことを特徴とする。
本発明の組成物は、ＧＬＰ関連組成物、及びグレリン阻害組成物又はＫｖ２．１チャネル阻害組成物のいずれかを含有することを特徴とする。
本発明の組成物は、前記Ｋｖ２．１チャネル阻害組成物は、Ｓｔｒｏｍａｔｏｘｉｎ又はｇｕａｎｇｘｉｔｏｘｉｎ−１Ｅであることを特徴とする。
【発明の効果】
【００１７】
本発明によれば、ＧＬＰ−１関連組成物と内因性グレリン阻害組成物を併用することで、それぞれ単独で使用する場合に比べて、副作用を低減し、血糖降下作用を増強し、それぞれの組成物の濃度を低く処方できる治療用組成物を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】本発明の実施の形態の実施例１に係る正常ラット膵島におけるＧＬＰ−１関連組成物及びグレリン阻害組成物の併用によるインスリン分泌の実験結果を示すグラフである。
【図２】本発明の実施の形態の実施例２に係る２型糖尿病モデルＧＫラットの膵島におけるＧＬＰ−１関連組成物及びグレリン阻害組成物の併用によるインスリン分泌の実験結果を示すグラフである。
【図３】本発明の実施の形態の実施例３に係るＧＫラットに対する糖負荷試験の実験結果を示すグラフである。
【図４】本発明の実施の形態の実施例４に係る正常ラット膵島におけるＧＬＰ−１関連組成物によるｃＡＭＰ産生に対するグレリンの抑制効果を示すグラフである。
【図５】本発明の実施の形態の実施例５に係るＧＫラット膵島におけるＧＬＰ−１関連組成物及びグレリン阻害組成物の併用によるｃＡＭＰ産生の実験結果を示すグラフである。
【図６】本発明の実施の形態の実施例６に係る正常ラットおよび２型糖尿病ＧＫラット血中グレリン濃度と血糖値の測定の実験結果を示すグラフである。
【図７】本発明の実施の形態の実施例７に係る正常ラットおよび２型糖尿病ＧＫラットの膵島ｍＲＮＡ発現量の測定結果を示すグラフである。
【図８】本発明の実施の形態の実施例８に係る正常ラットにＧＬＰ−１を投与した際の膵島β細胞内Ｃａ2+濃度（［Ｃａ2+］i）の蛍光顕微鏡画像解析法による測定結果を示すグラフである。
【図９】本発明の実施の形態の実施例８に係る正常ラットにＧＬＰ−１とグレリンとを投与した際の膵島β細胞内Ｃａ2+濃度（［Ｃａ2+］i）の蛍光顕微鏡画像解析法による測定結果を示すグラフである。
【図１０】本発明の実施の形態の実施例８に係るグレリン作用の濃度−反応曲線を比較した結果を示すグラフである。
【図１１】本発明の実施の形態の実施例９に係る膵島におけるＫｖ２．１チャネルのｍＲＮＡ発現量をリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ法によって測定した結果を示すグラフである。
【図１２】本発明の実施の形態の実施例に係るグレリンとＫｖ２．１チャネルとの関係を示す概念図である。
【図１３】本発明の実施の形態の実施例１０に係る２型糖尿病ＧＫラットへのグレリン阻害組成物の浸透圧ポンプによる持続投与の際の血糖値測定結果を示すグラフである。
【図１４】本発明の実施の形態の実施例１０に係る２型糖尿病ＧＫラットへのグレリン阻害組成物の浸透圧ポンプの埋め込み後の血糖値の平均を示すグラフである。
【図１５】本発明の実施の形態の実施例１１に係る２型糖尿病ＧＫラットに対する糖負荷試験の実験結果を示すグラフである。
【図１６】本発明の実施の形態の実施例１１に係る２型糖尿病ＧＫラットに対する糖負荷試験の血糖値とインスリン値を示すグラフである。
【図１７】従来のＧＬＰ−１及び関連組成物の膵島β細胞でのインスリン分泌促進を示す概念図である。
【図１８】従来のグレリン阻害組成物による２型糖尿病の予防または治療の概念図である。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
＜実施の形態＞
上述したように、ＧＬＰ−１は、食事摂取により小腸から分泌されインスリン分泌を起こすペプチドホルモンである。ＧＬＰ−１の長時間持続型アナログおよびＧＬＰ−１分解酵素（ＤＤＰ）阻害剤は、２型糖尿病治療薬として米国ですでに臨床使用されている。
一方、グレリンは、インスリン分泌を抑制するホルモンである。動物実験において、内在性グレリンを阻害すると、インスリン分泌が増加し血糖値が低下するため、２型糖尿病治療に有効であることが分かった。
本発明の発明者は、従来のＳＵ剤やインスリン製剤に代わるいくつかの治療用組成物について検討を重ねてきた。この際に、ＧＬＰ−１関連組成物や、内因性グレリン阻害組成物についても、それぞれ、臨床応用について検討を行い、有効性の基礎的データを得た。
【００２０】
ここで、ＧＬＰ−１関連組成物は、膵島β細胞に働きかけてインスリン分泌を促進するという働きをするが、グレリン阻害組成物は、インスリン分泌の「抑制を阻害」するという働きがある。これらの二つの方法は、従来、単独で使用しても、ＳＵ剤に比して効果が低いという問題があった。また、効果を高めるためにＧＬＰ−１関連組成物を多量に処方して使用すると、吐き気や重篤な低血糖等の副作用があるということが分かった。
このため、通常、働きが弱い薬剤を同時に投与することは当業者にとって想定外であり、ＧＬＰ−１関連組成物とグレリン阻害組成物を同時に投与することは全く考えられていなかった。
【００２１】
ところが、本発明の発明者は、ＧＬＰ−１関連組成物とグレリン阻害組成物を併用して投与することで、当業者が想定していなかった顕著な効果が得られることを発見し、本発明の実施の形態に係る糖尿病治療用組成物を発明するに至った。
【００２２】
本発明の実施の形態に係る糖尿病治療用組成物は、ＧＬＰ−１関連組成物とグレリン阻害組成物をそれぞれ単独で使用するよりも、大幅に血糖値を低下させる効果が得られる。このため、吐き気や重篤な低血糖のような副作用をもたらさない濃度にて、糖尿病治療用組成物として使用することができる。
また、ＧＬＰ−１関連組成物とグレリン阻害組成物を併用することで、効果的な摂食抑制作用が得られ、抗肥満効果も期待できる。
【００２３】
より具体的に説明すると、本発明の実施の形態に係る治療用組成物は、既に報告されているＧＬＰ−１関連組成物を用いているものの、このＧＬＰ−１関連組成物を低濃度で処方することによって副作用を低減させる効果を有する組成物を提供する。
すなわち、ＧＬＰ−１関連組成物と内在性グレリン阻害組成物とを組み合わせて併用した組成物は、２型糖尿病の患者にとって、副作用を軽減させて低血糖を起こさない安全な組成物としての治療用組成物として使用できる。
【００２４】
グレリン阻害によるインスリン分泌促進と組み合わせることにより、ＧＬＰ−１、ＧＬＰ−１アナログ、ＤＰＰ４阻害剤のインスリン分泌促進・血糖降下作用を高める。
グレリン阻害によるインスリン分泌促進と組み合わせることにより、ＧＬＰ−１アナログのより低い臨床使用濃度で同様のインスリン分泌促進・血糖降下作用が得られ、嘔吐、低血糖発作などの副作用が回避できる。
【００２５】
また、本発明の実施の形態において用いられるＧＬＰ−１関連組成物としては、例えば、上述したＧＬＰ−１の他、ＧＬＰ−１アナログ、ＧＬＰ−１分解酵素（ＤＰＰ４）阻害剤等を用いることができる。
このＧＬＰ−１の長時間持続型アナログとしては、例えば、Ｅｘｅｎａｔｉｄｅ（合成ｅｘｅｎｄｉｎ−４、イーライリリー社製）、Ｌｉｒａｇｌｕｔｉｄｅ（ＧＬＰ−１脂肪酸修飾、ノボノルディスクファーマ社製）等が挙げられる。
【００２６】
また、本発明の実施の形態において用いられるＧＬＰ−１関連組成物としては、上述したように、ＧＬＰ−１分解酵素（ＤＰＰ４）阻害剤についても用いることができる。このＤＰＰ４阻害剤としては、Ｓｉｔａｇｌｉｐｔｉｎ（製品名：Ｊａｎｕｖｉａ、万有製薬社製）、Ｖｉｌｄａｇｌｉｐｔｉｎ（製品名：Ｇａｌｖｕｓ、ノバルティスファーマ社製）等を用いることができる。
【００２７】
また、本発明の実施の形態において用いられるＧＬＰ−１関連組成物は、上述したように、ＧＬＰ−１関連組成物を単独で用いて、インスリン分泌を促す等の作用を奏するための、成人における投与用量は、ＧＬＰ−１アナログの場合、Ｅｘｅｎａｔｉｄｅでは１回５μｇか１０μｇを１日２回、Ｌｉｒａｇｌｕｔｉｄｅでは１日１回０．９ｍｇ投与であり、副作用として嘔吐・悪心・胃部不快感を起す頻度が約５〜９％と報告されている。また、重篤な低血糖とそれに伴う神経症状等の副作用も報告されている。
このため、本発明の実施の形態において用いられるＧＬＰ−１関連組成物は、例えば、ＧＬＰ−１アナログの場合は成人における投与量の１／６〜１／３で、糖尿病治療効果はあるが吐き気や重篤な低血糖等の副作用を起こさないか頻度の極めて少ない投与量を用いることができる。
【００２８】
また、本発明の実施の形態において用いられる内在性グレリン阻害組成物は、グレリン阻害剤、グレリン受容体阻害剤等を用いることができる。
例えば、グレリン阻害剤としては、内在性グレリンに結合してグレリンの作用を阻害する中和抗体等が挙げられる。
また、グレリン受容体阻害剤としては、例えば、［Ｄ−Ｌｙｓ3］−ＧＨＲＰ−６等があるものの、より特異性の高いグレリン受容体阻害分子を用いることができる。
このグレリン受容体阻害剤としては、例えば ［Ｄ−Ｌｙｓ3］−ＧＨＲＰ−６の場合、マウスにおける１日投与用量として濃度０．１μｍｏｌ／ｋｇ〜０．３μｍｏｌ／ｋｇ体重といった、副作用を起こさない用量を用いることができる。マウスとヒトで、グレリン投与の血糖値に対する効果はほぼ同様であり、またグレリン血漿濃度の差は数倍以内であるので、マウスで明らかとなった上記濃度のグレリン受容体阻害剤［Ｄ−Ｌｙｓ3］−ＧＨＲＰ−６の効果はヒトに適用することができると考えられる。また、グレリン受容体阻害剤の種類によっては、ＧＬＰ−１関連組成物と併せて処方することで、濃度０．１μｍｏｌ／ｋｇよりもさらに少ない投与量を用いることも可能である。
【００２９】
本発明の実施の形態に係る治療用組成物は、任意の製剤上許容しうる担体（例えば生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液、例えばＤ−ソルビトール、Ｄ−マンノース、Ｄ−マンニトール、塩化ナトリウム等が挙げられ、適当な溶解補助剤、例えばアルコール、具体的にはエタノール、ポリアルコール、例えばプロピレングリコール、ポリエチレングリコール、非イオン性界面活性剤、例えばポリソルベート８０（ＴＭ）、ＨＣＯ−５０等を挙げることができるが、それらに限定されない）と共に投与することができる。また、適切な賦形剤等を含んでもよい。
【００３０】
また、本発明の実施の形態に係る治療用組成物は、製剤上許容しうる担体を調製するために、適切な薬学的に許容可能なキャリアを含み得る。
このキャリアとしては、シリコーン、コラーゲン、ゼラチン等の生体親和性材料を含んでもよい。あるいはまた、種々の乳濁液であってもよい。
さらには、例えば、希釈剤、香料、防腐剤、賦形剤、崩壊剤、滑沢剤、結合剤、乳化剤、可塑剤などから選択される１または２以上の製剤用添加物を含有させてもよい。
【００３１】
本発明の実施の形態に係る治療用組成物は、経口投与のための投与に適した投与形態において、当該分野で周知の製剤上許容しうる担体を用いて処方され得る。
本発明の実施の形態に係る医薬組成物の投与経路は、特に限定されないが、非経口的に投与することが好ましい。
非経口投与としては、例えば、静脈内、動脈内、皮下、真皮内、筋肉内または腹腔内の投与が挙げられる。
【００３２】
本発明の実施の形態の治療用組成物は、生物体、生物体の体内の一部分、または生物体より摘出または排出されたその一部分について、治療用の対象とすることができる。この生物体は特に限定されるものではないが、動物（例えば、ヒト、家畜動物種、野生動物）を含む。
【００３３】
また、本発明の実施の形態に係る治療用組成物の治療対象としては、主に２型糖尿病に用いることができる。これは、上述したように、２型糖尿病においては、膵島β細胞が残存していることが多いため、膵島β細胞のインスリン分泌能力を向上させることで、糖尿病を治療可能であるためである。
しかしながら、本発明の実施の形態係る治療用組成物は、インスリン分泌の負担による膵島β細胞のアポトーシスや機能不全を抑制する。これは、予備的な実験により、ＧＬＰ−１関連組成物には膵島β細胞保護・再生促進作用があり、これらの作用はグレリン阻害組成物の低濃度の併用により増強されるためと考えられる。
このため、１型糖尿病についても、ＧＬＰ−１関連組成物による膵島β細胞保護・再生促進作用をグレリン阻害組成物の併用により増強することにより、病気の進行を抑制しさらには改善することが想定できる。さらに、１型糖尿病の膵島移植、膵島β細胞の幹細胞治療等においても、インスリン分泌を促進しながら膵島β細胞の負担を抑えて、短期的、長期的に治療効果を高め、効果的に用いることが考えられる。
さらに、本発明の実施の形態係る治療用組成物は、予備的な実験により、副作用がほとんどない濃度で用いた場合でも、効果的な食欲抑制作用を得ることができる。
このため、特に２型糖尿病に至る肥満（メタボリック・シンドローム）の予防、治療等に用いることもできる。
【００３４】
また、本発明の実施の形態に係る治療用組成物を上述の治療に用いるために、投与間隔および投与量は、疾患の状況、さらに対象の状態などの種々の条件に応じて適宜選択および変更することが可能である。
ここで、２型糖尿病を予防または治療する場合には、血糖値を改善する投与用量を用いることができる。これらの用量は、予備的な実験においては、通常の成人における投与用量の１／６〜１／３程度でよく、ＧＬＰ−１関連組成物で報告されている吐き気や重篤な低血糖等の副作用を抑えて効果的に使用可能である。
【００３５】
本発明の実施の形態に係る治療用組成物の１回の投与量および投与回数は、投与の目的により、さらに患者の年齢および体重、症状および疾患の重篤度などの種々の条件に応じて適宜選択および変更することが可能である。
投与回数および期間は、１日１回約２〜４週間程度投与し、糖尿病の状態をモニターし、その状態により再度あるいは繰り返し投与を行う。
【００３６】
本発明の実施の形態に係る組成物は、他の組成物等と併用することも可能である。また、他の組成物と同時に本発明の組成物を投与してもよく、また間隔を空けて投与してもよいが、その投与順序は特に問わない。
【００３７】
また、本発明の実施の形態において、疾患が改善または軽減される期間は特に限定されないが、一時的な改善または軽減であってもよいし、一定期間の改善または軽減であってもよい。
【００３８】
また、本発明の実施の形態に係る組成物として、Ｋｖ２．１チャネルの阻害剤を更に用いて、グレリン阻害組成物の効果を高めることができる。このＫｖ２．１チャネルの阻害剤としては、例えば、クモ毒でありＡ型カリウムチャネルをブロックするＳｔｒｏｍａｔｏｘｉｎを用いることができる。また、ＧＬＰ−１関連組成物とＫｖ２．１チャネル阻害剤の組み合わせを用いることもできる。
これにより、治療用組成物の濃度を低くしても、同様の効果を得ることができる。
【００３９】
〔本発明の実施の形態に係る治療用組成物の実施例〕
以下で、本発明の実施の形態に係る治療用組成物について、具体的な実験を基にして、実施例としてさらに具体的に説明する。しかしながら、この実施例は一例にすぎず、これに限定されるものではない。
以下の実施例１〜５においては、本発明の実施の形態に係るＧＬＰ−１関連組成物としては、ＧＬＰ−１を用いた。また、内在性グレリン阻害組成物としては、グレリン受容体阻害剤［Ｄ−Ｌｙｓ3］−ＧＨＲＰ−６を用いた。
【実施例１】
【００４０】
（正常ラット膵島におけるインスリン分泌）
正常ラット膵島におけるインスリン分泌に対する内在性グレリン阻害組成物及び／又はＧＬＰ−１関連組成物の影響を調査した。８−１２週齢の正常なウィスターラットから膵島をコラゲナーゼ消化法により分離し、分離した膵島を集め、２．８ｍＭ又は８．３ｍＭのグルコースの存在下で、ＫＲＢＨ（１２９ｍＭのＮａＣｌ，５．０ｍＭのＮａＨＣＯ3，４．７ｍＭのＫＣｌ，１．２ｍＭのＫＨ2ＰＯ4，２．０ｍＭのＣａＣｌ2，１．２ｍＭのＭｇＳＯ4，１０ｍＭのＨＥＰＥＳ，ｐＨ＝７．４，０．１％のＢＳＡ）中で３７℃、１時間培養した。さらに、８．３ｍＭのグルコースの存在下では、１０ｎＭのＧＬＰ−１及び１μＭの［Ｄ−Ｌｙｓ3］−ＧＨＲＰ−６を各々単独、若しくは併用して使用した。それぞれの群におけるインスリン濃度は、ＥＬＩＳＡキット（和光純薬工業（株））を用いて測定した。
【００４１】
図１を参照して、正常ラット膵島のインスリン分泌測定例を示す。縦軸は、インスリン分泌量（Ｉｎｓｕｌｉｎ ｒｅｌｅａｓｅ （ｎｇ／ｉｓｌｅｔ／ｈｒ））を示す。横軸は、左側から、グルコース２．８ｍＭのみ投与した群、グルコース８．３ｍＭのみ投与した群、グルコース８．３ｍＭの存在下において内在性グレリン阻害組成物のみ作用した群、グルコース８．３ｍＭの存在下においてＧＬＰ−１関連組成物のみ作用した群、グルコース８．３ｍＭの存在下において内在性グレリン阻害組成物及びＧＬＰ−１関連組成物を併用して作用した群を示す。棒グラフの真上の数字は、実験に用いたラットの各群におけるサンプル数を示す。なお、１サンプルには、単離した膵島７−１０個を含む。
【００４２】
図１より、正常ラット膵島では、グルコースを投与するとインスリン分泌量が上昇した。そして、グルコース８．３ｍＭのみ投与した群と比較して、内在性グレリン阻害組成物又はＧＬＰ−１関連組成物を各々単独で処方させた場合において、インスリン分泌は増強していた（ｔ−検定にて、各々グルコース８．３ｍＭのみ投与した群に対してｐ＜０．０５。以下、ｔ−検定を用いて説明する）。
さらに、内在性グレリン阻害組成物又はＧＬＰ−１関連組成物を各々単独で処方させた群よりも、内在性グレリン阻害組成物及びＧＬＰ−１関連組成物を併用して作用させた群の方がインスリン分泌が増強していた（グルコース８．３ｍＭの存在下においてＧＬＰ−１関連組成物のみ作用した群に対してｐ＜０．０５）。
すなわち、内在性グレリン阻害組成物及びＧＬＰ−１関連組成物を併用して作用させた場合には、有意にインスリン分泌量が上昇することから、今まで単独で用いていた処方量よりも、より少ない量で薬効を得ることができると解される。
このように、正常な対象において、本発明の実施の形態に係る治療用組成物は、２型糖尿病に対する予防または治療効果が認められる。
【実施例２】
【００４３】
（２型糖尿病ＧＫラット膵島におけるインスリン分泌）
２型糖尿病Ｇｏｔｏｈ−Ｋａｋｉｚａｋｉ（ＧＫ）ラット膵島におけるインスリン分泌に対する内在性グレリン阻害組成物及び／又はＧＬＰ−１関連組成物の影響を調査した。実施例１に記載の正常ラット膵島におけるインスリン分泌と同様の条件を用いて実験を行った。２型糖尿病ＧＫラットとは、インスリン非依存型糖尿病である２型糖尿病を発症するモデルラットとして確立された系統のラットである。
【００４４】
図２を参照して、２型糖尿病ＧＫラット膵島のインスリン分泌測定例を示す。縦軸は、インスリン分泌量（Ｉｎｓｕｌｉｎ ｒｅｌｅａｓｅ （ｎｇ／ｉｓｌｅｔ／ｈｒ））を示す。横軸は、左側から、グルコース２．８ｍＭのみ投与した群、グルコース８．３ｍＭのみ投与した群、グルコース８．３ｍＭの存在下において内在性グレリン阻害組成物のみ作用した群、グルコース８．３ｍＭの存在下においてＧＬＰ−１関連組成物のみ作用した群、グルコース８．３ｍＭの存在下において内在性グレリン阻害組成物及びＧＬＰ−１関連組成物を併用して作用した群を示す。棒グラフの真上の数字は、実験に用いたラットの各群におけるサンプル数を示す。
【００４５】
図２より、正常ラット膵島と同様に、２型糖尿病ＧＫラット膵島でも、グルコースを投与するとインスリン分泌量が上昇した。そして、グルコース８．３ｍＭのみ投与した群と比較して、内在性グレリン阻害組成物又はＧＬＰ−１関連組成物各々単独で処方させた場合において、インスリン分泌は増強していた（各々グルコース８．３ｍＭのみ投与した群に対してｐ＜０．０１及びｐ＜０．００１）。さらに、内在性グレリン阻害組成物又はＧＬＰ−１関連組成物を各々単独で処方させた群よりも、内在性グレリン阻害組成物及びＧＬＰ−１関連組成物を併用して作用させた群の方がインスリン分泌が増強していた（グルコース８．３ｍＭの存在下において内在性グレリン阻害組成物のみ作用した群に対してｐ＜０．０１）。
このように内在性グレリン阻害組成物及びＧＬＰ−１関連組成物を併用して作用させた場合には、有意にインスリン分泌量が上昇することから、今まで単独で用いていた処方量よりもより少ない量で薬効を得ることができると共に、２型糖尿病を治療するための組成物として用いることも可能であることを示すことができた。
【実施例３】
【００４６】
（２型糖尿病ＧＫラットへの糖負荷試験）
２型糖尿病ＧＫラットの腹腔内への糖負荷試験（ＩＰＧＴＴ）を行い、対象に急性の糖負荷をかけた際の内在性グレリン阻害組成物及び／又はＧＬＰ−１関連組成物の影響を調査するために、血糖値及びインスリン分泌の測定を行った。
全ての実験群の２型糖尿病ＧＫラットには、一晩絶食させた後、１ｇグルコース／ｋｇ体重を腹腔内に投与し、その他の物質を投与しないＣｏｎｔｒｏｌ群、０．３μｍｏｌ／ｋｇ体重の［Ｄ−Ｌｙｓ3］−ＧＨＲＰ−６を投与した群、０．３ｎｍｏｌ／ｋｇ体重のＧＬＰ−１を投与した群、０．３μｍｏｌ／ｋｇ体重の［Ｄ−Ｌｙｓ3］−ＧＨＲＰ−６及び０．３ｎｍｏｌ／ｋｇ体重のＧＬＰ−１を併用して投与した群の調査を行った。尾静脈より採血を行いグルコース濃度及びインスリン濃度をそれぞれ測定した。インスリン濃度の測定は、ＥＬＩＳＡキット（和光純薬工業（株）社製）を用い、グルコース濃度の測定は、グルコカードＤＩＡメーター（ＧｌｕｃｏＣａｒｄ ＤＩＡ ｍｅｔｅｒ、Ａｒｋｒａｙ社製）を用いた。
【００４７】
図３Ａを参照して、２型糖尿病ＧＫラットの血糖値の測定例を示す。縦軸は、血糖値（Ｂｌｏｏｄ ｇｌｕｃｏｓｅ（ｍｇ／ｄｌ））を示す。横軸は、経過時間（Ｔｉｍｅ（ｍｉｎ））を示す。図３Ａより、全ての実験群において糖負荷後３０〜６０分で各群の血糖値はピークに達した。そして、１２０分経過した時には、コントロールや内在性グレリン阻害組成物又はＧＬＰ−１関連組成物を各々単独で処方させた群よりも、内在性グレリン阻害組成物及びＧＬＰ−１関連組成物を併用して作用させた群は有意に血糖値が減少していた（Ｃｏｎｔｒｏｌ群に対してｐ＜０．０５）。これにより、内在性グレリン阻害組成物及びＧＬＰ−１関連組成物を併用して作用させた場合には、より早く血糖値を正常値に戻すことができるため、２型糖尿病を治療するための組成物として効果が高いことが示された。
また、図３Ｂを参照して、２型糖尿病ＧＫラットのインスリン分泌の測定例を示す。縦軸は、インスリン分泌量（Ｉｎｓｕｌｉｎ ｒｅｌｅａｓｅ （ｎｇ／ｍｌ））を示す。横軸は、経過時間（Ｔｉｍｅ（ｍｉｎ））を示す。図３Ｂより、糖負荷後１５〜３０分で全ての群のインスリン分泌量は増加した。その中で、コントロールや内在性グレリン阻害組成物又はＧＬＰ−１関連組成物を各々単独で処方させた群よりも、内在性グレリン阻害組成物及びＧＬＰ−１関連組成物を併用して作用させた群において有意にインスリン分泌量が増加していた（Ｃｏｎｔｒｏｌ群に対してｐ＜０．０５）。これは、内在性グレリン阻害組成物及びＧＬＰ−１関連組成物を併用して作用させた場合には、図３Ｂで示したようにインスリン分泌量が有意に増加することに対応して、図３Ａで示したように血糖値が有意に減少したと解される。
このように、内在性グレリン阻害組成物及びＧＬＰ−１関連組成物を併用して作用させた場合には、有意にインスリン分泌量が増加して、血糖値が元に戻る時間が短くなった。したがって、本発明の実施の形態に係る治療用組成物は、今まで単独で内在性グレリン阻害組成物又はＧＬＰ−１関連組成物を処方していた場合よりも、２型糖尿病を治療するための組成物としての高い薬効を得ることができることが示された。
【実施例４】
【００４８】
（正常ラット膵島におけるｃＡＭＰ産生）
正常ラット膵島におけるｃＡＭＰ（Ｃｙｃｌｉｃ ａｄｅｎｏｓｉｎｅ ｍｏｎｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ）産生に対するＧＬＰ−１関連組成物及び／又はグレリン（Ｇｈｒｅｌｉｎ）の影響を調査した。膵島の培養は、実施例１に記載の正常ラット膵島におけるインスリン分泌と同様に、８−１２週齢の正常なウィスターラットから膵島をコラゲナーゼ消化法により分離し、分離した膵島を集め、ホスホジエステラーゼ阻害剤のＩＢＭＸ（０．５ｍＭ）存在下で２．８ｍＭ又は８．３ｍＭのグルコースを含むＫＲＢＨ中で３７℃、１時間インキュベートした。さらに、８．３ｍＭのグルコースの存在下では、１０ｎＭのＧＬＰ−１のみ、並びに１０ｎＭのＧＬＰ−１及び１０ｎＭのグレリン（Ｇｈｒｅｌｉｎ）とを併用して作用した。各群におけるｃＡＭＰ産生量は、ｃＡＭＰ測定ＥＩＡキット（アマシャム社製）を用いて測定した。
【００４９】
図４を参照して、正常ラット膵島のｃＡＭＰ量の測定例を示す。縦軸は、ｃＡＭＰ量（ｃＡＭＰ ｆｍｏｌ／ｉｓｌｅｔ／ｈｒ）を示す。横軸は、左側から、グルコース２．８ｍＭのみ投与した群、グルコース８．３ｍＭのみ投与した群、グルコース８．３ｍＭの存在下においてＧＬＰ−１関連組成物のみ作用した群、グルコース８．３ｍＭの存在下においてＧＬＰ−１関連組成物及びグレリンを併用して作用した群を示す。実験に用いたラットの個体数は、各群において９サンプルである（ｎ＝９）。
【００５０】
図４より、ＧＬＰ関連組成物を作用した群は、有意にｃＡＭＰ産生が上昇していた（グルコース８．３ｍＭのみ投与した群に対してｐ＜０．０１）。また、ＧＬＰ−１関連組成物を単独で作用した群よりも、ＧＬＰ−１関連組成物及びグレリンを併用して作用した群の方がｃＡＭＰ産生が抑制されていた（グルコース８．３ｍＭの存在下においてＧＬＰ−１関連組成物のみ作用した群に対してｐ＜０．０１）。
細胞内ｃＡＭＰ産生が増加するとインスリン分泌が促進されることが既に知られているが、そのｃＡＭＰ産生を制御する上流因子として、ＧＬＰ−１及びグレリンが関与していることが分かった。すなわち、ＧＬＰ−１関連組成物はｃＡＭＰ産生量を上昇させ、グレリンはｃＡＭＰ産生量を抑制する（グレリン阻害組成物はｃＡＭＰ産生量を上昇させる）という細胞内ｃＡＭＰ量の相反調整メカニズムも明らかとなった。
従って、ＧＬＰ−１関連組成物及びグレリン阻害組成物の併用作用によるインスリン分泌増強は、細胞内ｃＡＭＰ産生量の増強により説明される。このように、本発明の発明者は、ＧＬＰ−１関連組成物及びグレリン阻害組成物の併用作用によるインスリン分泌増強と２型糖尿病の治療有効性に関して、細胞内シグナル伝達レベルでの根拠を証明した。
【実施例５】
【００５１】
（２型糖尿病ＧＫラット膵島におけるｃＡＭＰ産生）
２型糖尿病ＧＫラット膵島におけるｃＡＭＰ産生に対する内在性グレリン阻害組成物及び／又はＧＬＰ−１関連組成物の影響を調査した。実施例２に記載の２型糖尿病ＧＫラット膵島におけるインスリン分泌を測定した場合と同様の条件の群を用いて実験を行った。各群におけるｃＡＭＰ産生量は、実施例４と同様にｃＡＭＰ測定ＥＩＡキット（アマシャム社製）を用いて測定した。
【００５２】
図５を参照して、２型糖尿病ＧＫラット膵島のｃＡＭＰ量の測定例を示す。縦軸は、ｃＡＭＰ量（ｃＡＭＰ ｆｍｏｌ／ｉｓｌｅｔ／ｈｒ）を示す。横軸は、左側から、グルコース２．８ｍＭのみ投与した群、グルコース８．３ｍＭのみ投与した群、グルコース８．３ｍＭの存在下において内在性グレリン阻害組成物のみ作用した群、グルコース８．３ｍＭの存在下においてＧＬＰ−１関連組成物のみ作用した群、グルコース８．３ｍＭの存在下において内在性グレリン阻害組成物及びＧＬＰ−１関連組成物を併用して作用した群を示す。実験に用いたラットの個体数は、各群において１０サンプルである（ｎ＝１０）。
【００５３】
図５より、グルコースのみを投与した群、内在性グレリン阻害組成物又はＧＬＰ−１関連組成物を各々単独で処方させた群よりも、内在性グレリン阻害組成物及びＧＬＰ−１関連組成物を併用して作用させた群の方がｃＡＭＰ産生が増強していた（グルコース８．３ｍＭの存在下において内在性グレリン阻害組成物のみ作用した群に対してｐ＜０．０５）。
このように内在性グレリン阻害組成物及びＧＬＰ−１関連組成物を併用して作用させた場合には、各々単独に比べて膵島β細胞のｃＡＭＰ産生が上昇した。したがって、実施例４と同様に、内在性グレリン阻害組成物及びＧＬＰ−１関連組成物の併用作用によりβ細胞シグナル伝達が増強され、２型糖尿病の治療用組成物としての併用治療の有用性の根拠を細胞内メカニズムで示した。
【００５４】
このように、実施例５の糖負荷試験においては、単独投与で効果のない濃度のグレリン捨抗薬とＧＬＰ−１を共投与することにより血中インスリン値の有意な上昇と血糖値の有意な低下を観察している。
これにより、最大効果濃度未満の濃度において、内在性グレリン阻害組成物又はＧＬＰ−１関連組成物が相乗的な作用を示し、顕著な効果があることを示している。
【００５５】
つまり、ＧＬＰ−１関連組成物により、ｃＡＭＰを増加させてインスリンの分泌を増やすことができるものの、従来は内在性のグレリンによりこのｃＡＭＰの増幅効果は抑制されていた。これに対し、ＧＬＰ−１関連組成物及びグレリン阻害剤を併用することで、ＧＬＰ−１によるｃＡＭＰ産出量を顕著に増やすことができる。さらに、グレリン阻害剤により、後述の実施例９に係る内因性グレリンのＫｖ２．１チャネルの活性化作用によるインスリン分泌の抑制に対応することができる。
すなわち、ＧＬＰ−１関連組成物及びグレリン阻害組成物を併用することで、ｃＡＭＰの産生量の増加を介して、膵島β細胞におけるインスリン分泌を促進することができる。
【００５６】
このように、グレリンがｃＡＭＰの産生を抑制していることはこれまで知られておらず、当業者がＧＬＰ−１関連組成物及びグレリン阻害組成物の併用を積極的に選択することは想定できなかった。
たとえば、ＧＬＰ−１関連組成物とガストリン化合物（例えば、特表２００７−５１９６４２号公報参照）の組み合わせについて、発明者らがｃＡＭＰ産生量を測定する予備的な実験をしたところ、ＧＬＰ−１を単独で使用した場合と同様のｃＡＭＰ産生量の上昇しか見られなかった。これは、いくつかの糖尿病治療用の化合物の組み合わせについても同様であった。
これに対して、ＧＬＰ−１関連組成物及びグレリン阻害組成物を併用することで、糖尿病の治療用の化合物を単に組み合わせるよりも、ｃＡＭＰの産生量を増加させられる。
【００５７】
以上のように、本発明によれば、ＧＬＰ−１関連組成物とグレリン阻害組成物との併用により、膵島β細胞への刺激により膵島β細胞を疲弊させることなく２型糖尿病治療用の組成物としてインスリン分泌促進・血糖降下作用を高めることができ、対象の血糖値を正常の状態に保つことが可能となる。さらに、ＧＬＰ−１関連組成物のより低い臨床使用濃度でのインスリン分泌促進・血糖降下作用が得られるため、嘔吐、低血糖発作などの副作用が回避できる。
【００５８】
また、ＧＬＰ−１関連組成物及び内在性グレリン阻害組成物を併用して作用させることによって、糖尿病肥満者への有効な治療法となる可能性がある。すなわち、脳視床下部室傍核（ＰＶＮ）へのＧＬＰ−１投与は、摂食を抑制することが知られている。さらに、摂食亢進因子のグレリンの阻害は摂食を抑制することも知られている。したがって、本発明の実施の形態で示したＧＬＰ−１関連組成物及び内在性グレリン阻害組成物を併用して作用させることによって、抗過食、抗肥満といった効果も抗糖尿病作用とともに期待される。この際に、本発明の組成物は、ＧＬＰ−１関連組成物とグレリン阻害組成物をそれぞれ単独で作用させるよりも低濃度で効果が得られる。このため、薬剤としての副作用を問題としないレベルで使用可能である。予防的に用いるためには、例えば食品に添加する等の投与方法の検討も有用である。
【００５９】
このように、ＧＬＰ−１関連組成物とグレリン阻害組成物との併用により２型糖尿病治療の有効性の基礎的データが示され、その臨床応用の基盤が確立された。さらに、ＧＬＰ−１とグレリン阻害は摂食抑制作用を持つことから、これら２つの方法の併用による抗肥満効果も期待される。
【実施例６】
【００６０】
（正常ラットおよび２型糖尿病ＧＫラット血中グレリン濃度と血糖値の測定）
正常なウィスターラット及び２型糖尿病ＧＫラットの血糖値と血中グレリン濃度の測定を行った。自由摂餌させた条件（Ｆｅｄ）で尾静脈より採血した後、４８時間絶食後（Ｆａｓｔ）と、その後、再度餌を与えた２時間後（Ｒｅｆｅｄ）に尾静脈より採血し血中グレリン濃度及び血糖値（血中グルコース濃度）の測定を行った。
グレリン濃度の測定は、ＥＬＩＳＡキット（三菱化学ヤトロン（株）社製）を用いた。グルコース濃度の測定は、グルコカードＤＩＡメーター（ＧｌｕｃｏＣａｒｄ ＤＩＡ ｍｅｔｅｒ、Ａｒｋｒａｙ社製）を用いた。
【００６１】
図６のグラフを参照して、正常のウィスターラット（正常ラット）および２型糖尿病ＧＫラットについて、図６（ａ）は血中のグレリン濃度、図６（ｂ）は血糖値の測定の結果について説明する。
図６（ａ）（ｂ）とも、正常ラット、２型糖尿病ＧＫラットについて、個体数１０（ｎ＝１０）の実験結果を平均してプロットした。各プロットにおいて、白丸は正常ラット（Ｗｉｓｔａｒ）、黒丸は２型糖尿病ＧＫラット（ＧＫ）の結果をそれぞれ示すプロットである。
【００６２】
図６（ａ）においては、縦軸は、グレリン濃度（Ｐｌａｓｍａ ｇｈｒｅｌｉｎ ｌｅｖｅｌｓ （ｆｍｏｌ／ｍｌ））をＥＬＩＳＡキットの反応レベルにより、１〜１００で示す。また、横軸は、自由摂餌させた条件（Ｆｅｄ）、４８時間後絶食後（Ｆａｓｔ）、再度餌を与えた２時間後（Ｒｅｆｅｄ）のそれぞれの測定条件を示す。
図６（ａ）によると、正常ラットの血中グレリン濃度は空腹時（Ｆａｓｔ）に高く、食後（Ｒｅｆｅｄ）低下する。一方、ＧＫラットの血中グレリンのレベルは、食後（Ｒｅｆｅｄ）で低下せず高値のままであった。それぞれ血中グレリンのレベルは正常ラットに比べて、自由摂餌させた条件（Ｆｅｄ）ではｐ＜０．０１であり、食後（Ｒｅｆｅｄ）ではｐ＜０．０５であった。
【００６３】
また、図６（ｂ）は、縦軸は、血糖値（Ｂｌｏｏｄ ｇｌｕｃｏｓｅ （ｍｇ／ｄｌ））の測定結果を示す。横軸は、自由摂餌させた条件（Ｆｅｄ）、４８時間後断食後（Ｆａｓｔ）、再度餌を与えた２時間後（Ｒｅｆｅｄ）のそれぞれの測定条件を示す。
図６（ｂ）によると、２型糖尿病ＧＫラットは、食後（Ｆｅｄ）で高血糖を示した。空腹時の血糖は変化なかった。高血糖のレベルとしては、正常ラット群と比べて、２型糖尿病ＧＫラットは、自由摂餌させた条件（Ｆｅｄ）、食後（Ｒｅｆｅｄ）において、ｐ＜０．０１であった。
【００６４】
このように、２型糖尿病のモデルとなるＧＫラットにおいては、グレリンの血中レベルは顕著に高くなっている。このため、本実施形態に係る内在性グレリン阻害組成物を投与することで、上述の実施例４、５に示したように、インスリン分泌に重要なｃＡＭＰを抑制している内在性グレリンに対抗することができる。
このように、本発明の実施の形態に係るＧＬＰ−１関連組成物とグレリン阻害組成物との併用することで、内在性のグレリンに対抗する顕著な効果が得られる。
【実施例７】
【００６５】
（正常ラットおよび２型糖尿病ＧＫラットの膵島ｍＲＮＡ発現量の測定）
５週齢の正常のウィスターラット（正常ラット）および２型糖尿病ＧＫラットから膵島をコラゲナーゼ消化法により分離し、膵島におけるメッセンジャーＲＮＡ発現量をＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ（タカラバイオ社製）を用いたリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ法により測定した。ここでは、グレリン（遺伝子ＩＤ、ＮＭ＿０２１６６９．２、プライマー配列は配列番号１（Ｐｒｉｍｅｒ １）と配列番号２（Ｐｒｉｍｅｒ ２）とを使用）、Ｋｉｒ６．２（遺伝子ＩＤ、ＮＭ＿０３１３５８．３、プライマー配列は配列番号３（Ｐｒｉｍｅｒ ３）と配列番号４（Ｐｒｉｍｅｒ ４）とを使用）、インスリンの遺伝子であるＩｎｓｕｌｉｎ−１（遺伝子ＩＤ、ＮＭ＿０１９１２９．２、プライマー配列は配列番号５（Ｐｒｉｍｅｒ ５）と配列番号６（Ｐｒｉｍｅｒ ６）とを使用）のメッセンジャーＲＮＡ量を測定した。なお、Ｋｉｒ６．２は、グルコース刺激による膵島β細胞からのインスリン分泌に関連することが知られている、ＡＴＰ感受性カリウム（ＫＡＴＰ）チャネルのサブユニットである。
【００６６】
図７は、正常ラット（Ｗｉｓｔａｒ）および２型糖尿病ＧＫラット（ＧＫ）の膵島ｍＲＮＡ発現量の測定の結果を示すグラフである。縦軸は正常ウィスターラットのｍＲＮＡ発現量を１とした時の相対的発現量を示す。横軸は、それぞれ、グレリン、Ｋｉｒ６．２、インスリン（Ｉｎｓｕｌｉｎ−１）の発現量を示す。なお、実験に用いた正常ラットおよび２型糖尿病ＧＫラットの個体数は、それぞれ７（ｎ＝７）である。
このように、２型糖尿病ＧＫラットでは、膵島グレリンのｍＲＮＡ発現が亢進していた（ｐ＜０．０５）。すなわち、２型糖尿病ＧＫラットにおいては、血中のグレリンのみならず、膵島においても、グレリンの濃度が高くなっていると考えられる。
これは、膵島による自らのグレリン分泌の増加により、ｃＡＭＰ産出を抑制させ、インスリン分泌を抑えていることが２型糖尿病ＧＫラットの病原性に関わっていることを示唆している。
このため、本実施形態に係る内在性グレリン阻害組成物は、膵島のｃＡＭＰ産出の抑制をなくし、ＧＬＰ−１関連組成物によるｃＡＭＰ産出を増加させることで、ｃＡＭＰによる膵島β細胞のインスリン分泌及び再生促進作用を高めることができることが分かる。
【実施例８】
【００６７】
（ラットの膵島β細胞内Ｃａ2+濃度（［Ｃａ2+］i）の測定）
次に、膵島β細胞のインスリン分泌の中心的制御因子である膵島β細胞内Ｃａ2+濃度（［Ｃａ2+］i）を測定した。ここでは、正常ウィスターラット（正常ラット）および２型糖尿病ＧＫラットからコラゲナーゼ消化法により分離した膵島をさらに単一細胞にし、単離した膵島β細胞［Ｃａ2+］iをＣａ2+感受性蛍光色素のｆｕｒａ−２（同仁社製）を用いた蛍光顕微鏡画像解析法により測定した。
灌流液中のグルコース濃度を２．８ｍＭ（２．８Ｇ）から８．３ｍＭ（８．３Ｇ）にし、その後８．３Ｇ下でＧＬＰ−１（１０ｎＭ）及び／又はグレリン（１０ｎＭ）を投与した。
膵島β細胞の同定指標としては、グルコース濃度８．３Ｇでの刺激およびインスリン分泌刺激薬のトルブタミド（Ｔｏｌｂ；３００μＭ）投与の両方により細胞内Ｃａ2+濃度が上昇したものをβ細胞と判断した。
【００６８】
図８〜図１０を参照して、ラットの膵島β細胞内Ｃａ2+濃度（［Ｃａ2+］i）の測定の結果について説明する。
図８は、正常ラットの膵島β細胞において８．３ｍＭグルコース存在下でＧＬＰ−１を投与した例である。縦軸は、細胞内Ｃａ2+濃度を反映するｆｕｒａ−２蛍光比（Ｆ３４０／Ｆ３８０）を示し、値が大きいほどＣａ2+濃度が高いことを示す。横軸は分単位の経過時間（Ｔｉｍｅ（ｍｉｎ））である。なお、図８中の「Ｔｏｌｂ」は、コントロールのＴｏｌｂを投与した際の波形を示す。
結果として、ＧＬＰ−１は、膵島β細胞［Ｃａ2+］iを増加させた。
【００６９】
図９は、正常ラット膵島β細胞において、８．３ｍＭグルコース存在下でＧＬＰ−１とグレリンとを投与した例である。縦軸、横軸とも図８と同様である。
結果として、グレリンはＧＬＰ−１により誘発される膵島β細胞［Ｃａ2+］i増加を抑制することが分かる。つまり、グレリンにより上述のようにｃＡＭＰ産生が抑制されているため、ＧＬＰ−１によるｃＡＭＰ依存性の［Ｃａ2+］i増加が抑えられていると考えられる。
【００７０】
図１０は、正常ウィスターラット（正常ラット）及び２型糖尿病ＧＫラットで、グレリン作用の濃度−反応曲線を比較した結果を示すグラフである。白丸は正常ラットを示し、黒丸は２型糖尿病ＧＫラットを示す。
縦軸はグレリン濃度０（−）を１００％とした際の、ＧＬＰ−１投与時の膵島β細胞［Ｃａ2+］iの増加率（％ ＧＬＰ−１−ｉｎｄｕｃｅｄ ［Ｃａ2+］i ｉｎｃｒｅａｓｅｓ）を示している。横軸は、グレリンの濃度（Ｇｈｒｅｌｉｎ（Ｍ））を示し、それぞれ０Ｍ（−）、１０-10Ｍ、１０-9Ｍ、１０-8Ｍ、１０-7Ｍを示す。
図１０の結果として、ＧＫラット膵島β細胞ではグレリンの反応性が亢進しており、グレリンの濃度−反応曲線が左方シフトしていることが分かる。これは、２型糖尿病ＧＫラットで、膵島β細胞のグレリン濃度に対する感受性が亢進していることを示している。
このため、２型糖尿病ＧＫラットは、内在性のグレリンを抑制することで、よりＧＬＰ−１によるインスリン分泌を促進できると考えられる。
【００７１】
以上のように、実施例８において、ＧＬＰ−１関連組成物は、膵島β細胞の細胞内のカルシウムイオン濃度［Ｃａ2+］iの増加によりインスリン分泌を促しているものの、これをグレリンが抑制することが分かる。
すなわち、ＧＬＰ−１関連組成物とグレリン阻害組成物を併用することで、ＧＬＰ−１による［Ｃａ2+］iの増加の抑制を除去し、よりインスリン分泌を促すことができる。すなわち、膵島β細胞のインスリン分泌促進・血糖降下の作用を得るために、ＧＬＰ−１関連組成物とグレリン阻害組成物を、従来より低い濃度にて用いることができるという効果が得られる。
これは、上述のｃＡＭＰ増強の作用と合わせて、ヒトの２型糖尿病の患者にも同様の効果があると考えられる。
【実施例９】
【００７２】
（正常ラットおよび２型糖尿病ＧＫラットの膵島ｍＲＮＡ発現量の測定）
５週齢の正常ウィスターラット（正常ラット）および２型糖尿病ＧＫラットから膵島をコラゲナーゼ消化法により分離し、膵島におけるメッセンジャーＲＮＡ発現量をＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ（タカラバイオ社製）を用いたリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ法により測定した。いくつかの膵島β細胞で発現している遺伝子について発現を調べた内の、カリウムチャネルの一つであるＫｖ２．１チャネル（遺伝子ＩＤ、ＮＭ＿０１３１８６．１、ｇｉ：５７７８５。プライマー配列は下記配列表の配列番号７（Ｐｒｉｍｅｒ ７）と配列番号８（Ｐｒｉｍｅｒ ８）とを使用）、コントロールのグレリン受容体（ＧＨＳ−Ｒ）（遺伝子ＩＤ、ＮＭ＿０３２０７５．３。プライマー配列は下記配列表の配列番号９（Ｐｒｉｍｅｒ ９）と配列番号１０（Ｐｒｉｍｅｒ １０）とを使用）の結果について示す。
図１１を参照して説明すると、縦軸は、正常ラット（Ｗｉｓｔａｒ）を１とした際の、膵島のメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の２型糖尿病ＧＫラットでの相対的発現量（Ｒｅｌａｔｉｖｅ ｍＲＮＡ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｉｓｌｅｔ）を示す。横軸は、それぞれＫｖ２．１チャネルと、ＧＨＳ−Ｒの結果について示す。２型糖尿病ＧＫラット膵島では、膵島β細胞グレリンシグナルを仲介するＫｖ２．１チャネルのｍＲＮＡ発現が亢進していた（ｐ＜０．０１）。すなわち、Ｋｖ２．１チャネルが膵島β細胞のインスリン分泌連関の生理的な抑制因子として機能していることが示唆される。
【００７３】
図１２の概念図を参照して、上述の結果について説明する。
正常ラットにおいては、膵島β細胞内へのグルコース濃度増加による刺激で、ＡＴＰ感受性カリウム（ＫＡＴＰ）チャネルが閉鎖され、膵島β細胞の細胞内のマイナス電位が低下する脱分極が起こる。この脱分極により、電位依存性カルシウム（Ｃａ）チャネルが開口し、細胞内にカルシウムイオン（Ｃａ2+）が流入することで、インスリンが分泌されると考えられている。ここで、ｃＡＭＰ産生量が増加すると、電位依存性カルシウム（Ｃａ）チャネルをさらに活性化し、またインスリンの放出過程を増強することがわかっている。図１２では、このようなグルコース刺激によるインスリンの分泌を増強する経路を実線の矢印で示している。
これに対して、Ｋｖ２．１チャネルの活性化は、細胞膜を再分極させて静止電位に戻すことで活動電位を抑制し、電位依存性カルシウムチャネルを介したカルシウムイオン流入およびインスリン分泌を抑制すると考えられる。グルコース代謝により、この系が抑制されると考えられる。
ここで、グレリンは、グレリン受容体（ＧＨＳ−Ｒ）とＧＴＰ結合タンパク質Ｇｉ２α２サブユニットを介したシグナルにより、Ｋｖ２．１チャネルを活性化する。これにより、細胞膜が再分極され、カルシウムイオン流入が抑制され、よってインスリン分泌を抑制すると考えられる。図１２では、このようなグレリンによるインスリン分泌に抑制する経路を点線の矢印で示している。
すなわち、Ｋｖ２．１チャネルの活動を阻害する組成物、例えば、クモ毒のＳｔｒｏｍａｔｏｘｉｎやｇｕａｎｇｘｉｔｏｘｉｎ−１Ｅといった化合物は、本発明の実施の形態に係るグレリン阻害組成物と同様に用いることができる。
つまり、本発明の実施の形態に係るＧＬＰ−１関連組成物とグレリン阻害組成物と同様に、ＧＬＰ−１関連組成物とＫｖ２．１チャネル阻害組成物を用いることができ、同様の効果を得ることができる。
なお、ヒトの２型糖尿病患者においても、Ｋｖ２．１チャネルの発現量が亢進していることが予備的な実験により分かっており、同様の効果が期待できる。
【実施例１０】
【００７４】
（２型糖尿病ＧＫラットへのグレリン阻害組成物の浸透圧ポンプによる持続投与）
本発明の実施の形態に係るグレリン阻害組成物であるグレリン受容体拮抗薬を２型糖尿病ＧＫラットへ浸透圧ポンプにより持続投与した際の血糖値の変化について測定した。具体的には、グレリン受容体阻害剤［Ｄ−Ｌｙｓ3］−ＧＨＲＰ−６を充填した浸透圧ミニポンプ（ａｌｚｅｔ社製）を６週齢の２型糖尿病ＧＫラットの背部皮下に埋め込み、その後、２８日間にわたり随時血糖値をグルコカードＤＩＡメーター（ＧｌｕｃｏＣａｒｄ ＤＩＡ ｍｅｔｅｒ、Ａｒｋｒａｙ社製）を用いて測定した。
図１３と図１４とを参照して、このグレリン受容体拮抗薬の浸透圧ポンプによる持続投与の結果について説明する。
図１３は、浸透圧ミニポンプの測定結果を示すグラフである。縦軸は血糖値（Ｂｌｏｏｄ ｇｌｕｃｏｓｅ ｍｇ／ｄｌ）を示し、横軸は埋め込み後の日数（Ｄａｙ ａｆｔｅｒ ｉｍｐｌａｎｔａｔｉｏｎ）を示す。また、グラフ中で、白丸は透圧ミニポンプが埋め込まれていないコントロール（Ｃｏｎｔｒｏｌ）、黒丸は浸透圧ミニポンプが埋め込まれている（［Ｄ−Ｌｙｓ3］−ＧＨＲＰ−６）、２型糖尿病ＧＫラットを示す。
この結果のように、２型糖尿病ＧＫラットへのグレリン受容体拮抗薬の浸透圧ポンプによる持続投与（３μｍｏｌ／ｋｇ／ｄａｙ）により高血糖が是正された。
【００７５】
図１４は、埋め込み後の血糖値の平均を示すグラフである。縦軸は平均の血糖値（Ａｖａｒａｇｅｄ Ｂｌｏｏｄ ｇｌｕｃｏｓｅ ｍｇ／ｄｌ）を示す。横軸は、浸透圧ミニポンプが埋め込まれていないコントロール（Ｃｏｎｔｒｏｌ）と浸透圧ミニポンプを埋め込んだ場合の結果（［Ｄ−Ｌｙｓ3］−ＧＨＲＰ−６）について示す。このように、グレリン受容体拮抗薬の浸透圧ポンプを体内に埋め込むことで、高血糖を是正することができる。すなわち、投与２８日間の平均随時血糖は、グレリン受容体拮抗薬の投与により有意に低下した。
これらの結果から、グレリン阻害組成物を、浸透圧ポンプにより持続投与することは２型糖尿病の治療に有効であることが分かる。これにより、血糖値を正常レベルに近づけた上で、さらに血糖値が高い場合に、通常の投与量よりも低いレベルのＧＬＰ−１関連組成物を併用することで、低血糖等の副作用を抑えて血糖値を下げることができると期待できる。
【実施例１１】
【００７６】
（２型糖尿病ＧＫラットへの糖負荷試験）
実施例３と同様に、２型糖尿病ＧＫラットへの糖負荷試験と、インスリン分泌との関係の測定を行った。具体的には、２型糖尿病ＧＫラットの腹腔内への糖負荷試験（ＩＰＧＴＴ）を行い、対象に急性の糖負荷をかけた際の内在性グレリン阻害組成物及び／又はＧＬＰ−１関連組成物の影響を調査するために、血糖値及びインスリン分泌の測定を行った。実験方法は、実施例３と同様であり、全ての実験群の２型糖尿病ＧＫラットには、一晩絶食させた後、１ｇグルコース／ｋｇ体重を腹腔内に投与し、その他の物質を投与しないコントロール（Ｃｏｎｔｒｏｌ）群、０．３μｍｏｌ／ｋｇ体重のグレリン阻害組成物である［Ｄ−Ｌｙｓ3］−ＧＨＲＰ−６を投与した群、０．３ｎｍｏｌ／ｋｇ体重のＧＬＰ−１を投与した群、０．３μｍｏｌ／ｋｇ体重の［Ｄ−Ｌｙｓ3］−ＧＨＲＰ−６及び０．３ｎｍｏｌ／ｋｇ体重のＧＬＰ−１を併用して投与した群の調査を行った。尾静脈より採血を行いグルコース濃度及びインスリン濃度をそれぞれ測定した。インスリン濃度の測定は、ＥＬＩＳＡキット（和光純薬工業（株）社製）を用い、グルコース濃度の測定は、グルコカードＤＩＡメーター（ＧｌｕｃｏＣａｒｄ ＤＩＡ ｍｅｔｅｒ、Ａｒｋｒａｙ社製）を用いた。
【００７７】
図１５（ａ）を参照して、２型糖尿病ＧＫラットの血糖値の測定例を示す。縦軸は、血糖値（ｍｇ／ｄｌ）について説明する。図３Ａと同様に、全ての実験群において糖負荷後３０〜６０分で各群の血糖値はピークに達した。そして、１２０分経過した時には、コントロールや内在性グレリン阻害組成物又はＧＬＰ−１関連組成物を各々単独で処方させた群よりも、内在性グレリン阻害組成物及びＧＬＰ−１関連組成物を併用して作用させた群は有意に血糖値が減少していた（Ｃｏｎｔｒｏｌ群に対してｐ＜０．０５）。すなわち、実施例３と同様に、ＧＬＰ−１関連組成物とグレリン阻害組成物を併用することで、それぞれを単独で使用した際には効果がない投与量で血糖値を下げることができる。
また、図１５（ｂ）を参照して、２型糖尿病ＧＫラットのインスリン分泌の測定例について説明する。縦軸は、インスリン分泌量（ｎｇ／ｍｌ）を示す。横軸は、経過時間（ｍｉｎ）を示す。図３Ｂと同様に、糖負荷後１５〜３０分で全ての群のインスリン分泌量は増加した。その中で、コントロールや内在性グレリン阻害組成物又はＧＬＰ−１関連組成物を各々単独で処方させた群よりも、内在性グレリン阻害組成物及びＧＬＰ−１関連組成物を併用して作用させた群において有意にインスリン分泌量が増加していた（Ｃｏｎｔｒｏｌ群に対してｐ＜０．０５）。実施例３と同様に、ＧＬＰ−１関連組成物とグレリン阻害組成物を併用することで、それぞれを単独で使用した際には効果がない投与量でインスリン分泌を増やし、これにより血糖値を下げることができると考えられる。
【００７８】
図１６（ａ）を参照して、図１５（ａ）に示した血糖値の血糖値０〜１２０分の曲線下面積について説明する。図１６（ａ）は、図１５（ａ）の実験群のグルコース投与０〜１２０分の曲線下面積（ＡＵＣ）を算出したグラフである。ＡＵＣ（Ａｒｅａ Ｕｎｄｅｒ Ｃｕｒｖｅ、血中濃度曲線下面積）は、薬物血中濃度−時間曲線下面積を示す数値である。すなわち、対象成分の血中濃度（Ｙ軸）と経過時間（Ｘ軸）のグラフの面積であり、図１６（ａ）の場合は血糖の量を示す。図１５（ａ）のグラフによると、グレリン阻害組成物０．３μｍｏｌ／ｋｇ、ＧＬＰ−１を０．３ｎｍｏｌ／ｋｇそれぞれ単独で与えても血糖値は下がらなかった。これに対して、グレリン阻害組成物とＧＬＰ−１とを併用した群ではｐ＜０．０５で有意に血糖値が低下した。このように、グレリン受容体阻害剤及びＧＬＰ−１を併用すると、それぞれの単独使用では作用を示さない用量を与えても、有意な血糖値低下作用を示すことが確認された。
図１６（ｂ）を参照して、図１５（ｂ）に示したインスリン値０〜３０分の曲線下面積について説明する。図１６（ｂ）は、図１５（ｂ）の実験群のグルコース投与０〜３０分の血漿インスリンの曲線下面積を産出したグラフである。図１５（ｂ）のグラフによると、グレリン阻害組成物０．３μｍｏｌ／ｋｇ、ＧＬＰ−１を０．３ｎｍｏｌ／ｋｇをそれぞれ与えても、血漿インスリン濃度はそれほど増加しなかった。これに対して、併用した群ではｐ＜０．０５で有意に血漿インスリン濃度が増加した。このように、グレリン受容体阻害剤及びＧＬＰ−１の各々単独作用を示さない用量を併用することで、有意な血漿インスリン分泌促進作用が確認された。
【００７９】
以上の実施の形態及び実施例で説明された構成、配置関係等については本発明が理解・実施できる程度に概略的にしたものにすぎない。
従って本発明は、説明された実施の形態及び実施例に限定されるものではなく、特許請求の範囲に示される技術的思想の範囲を逸脱しない限り様々な形態に変更することができる。
【００８０】
上述のように、従来、ＧＬＰ−１アナログおよびＤＰＰ４阻害剤は、従来の２型糖尿病治療薬（ＳＵ剤）に比べ、低血糖発作の副作用が少ない点で優れているが皆無ではなく、インスリン分泌促進・血糖降下作用は比較的弱いことが、これらの適用対象を狭めているという問題があった。
ＧＬＰ−１アナログはかなりの頻度で嘔吐などの副作用を起こす。このため、使用濃度を低下できれば副作用を解消することができると期待される。
また、上述の実施例で示したように、ＧＬＰ−１関連組成物とグレリン阻害組成物を併用することで、それぞれの組成物を単独で用いるよりもインスリン分泌を促進し、血糖降下を高めることができる。
また、ＧＬＰ−１関連組成物とグレリン阻害組成物を併用することで、ＧＬＰ−１アナログを低い臨床使用濃度でインスリン分泌促進・血糖降下作用が得られ、嘔吐、低血糖発作などの副作用を回避できる。
また、ＧＬＰ−１関連組成物とグレリン阻害組成物を併用することで、低濃度でインスリン分泌を向上させることができるため、膵島β細胞の保護を行う保護用の組成物として使用することも可能である。
また、ＧＬＰ−１関連組成物と内在性グレリン阻害組成物の併用により、各々単独で用いることに比べ、膵島β細胞のｃＡＭＰ産生が顕著に増強される。すなわち、ＧＬＰ−１関連組成物とグレリン阻害組成物の協同作用は、細胞内メカニズムとしても根拠がある。
また、ｃＡＭＰには膵島β細胞再生促進作用があるので、ＧＬＰ−１関連組成物と内在性グレリン阻害組成物を併用することにより、膵島β細胞の再生作用が増強され、β細胞数を低下させず二次無効をもたらさない、長期に渡り有効な２型糖尿病治療用の組成物として使用できる。
【００８１】
より具体的に説明すると、ＧＬＰ−１関連組成物の臨床応用は進んできているものの、副作用もまた問題になってきている。たとえば、ＧＬＰ−１分解酵素（ＤＰＰ４）阻害剤であるＳｉｔａｇｌｉｐｔｉｎ（シタグリプチンリン酸塩水和物錠、製品名：グラクティブ（登録商標）錠、及び、製品名：ジャヌビア（登録商標）錠、万有製薬社製）の市販直後調査の中間報告（２０１０年３月３日現在、小野薬品工業株式会社提供）によると、副作用が３４７例４６２件、重篤な副作用は３７例５２件あると報告されている。この副作用として、低血糖による意識障害、心不全、下痢等による死亡例も報告されている。
このように、ＧＬＰ−１関連組成物を用いた際に、副作用の出ない濃度で用いつつ、膵島β細胞のインスリン分泌を増進させることが求められている。
これに対して、本発明の実施の形態に係るＧＬＰ−１関連組成物と内在性グレリン阻害組成物の併用、又はＧＬＰ−１関連組成物とＫｖ２．１チャネル阻害組成物の併用により、投与量をより少なくして膵島β細胞のインスリン分泌を増進させることができる。
【００８２】
また、グレリン阻害剤においても、主として肥満症の治療が検討されてきており、その結果として肥満関連疾患である２型糖尿病の治療が期待されている。
しかしながら、上述のように、ＧＬＰ−１関連組成物とグレリン阻害剤を併用して使用すると、単に両方の薬剤の効果を合わせた以上の効果があることは当業者には予想できなかった。
すなわち、ＧＬＰ−１関連組成物とグレリン阻害剤、又はＧＬＰ−１関連組成物とＫｖ２．１チャネル阻害組成物の併用は、膵島β細胞を共通のターゲットとした糖尿病治療に有用である。
このＧＬＰ−１関連組成物とグレリン阻害剤、又はＧＬＰ−１関連組成物とＫｖ２．１チャネル阻害組成物の併用は、グレリン受容体活性による細胞内ｃＡＭＰ産生の抑制を取り払うもので、グレリンの濃度が高く膵島β細胞内ｃＡＭＰが低くグルコース刺激に応答しない状態になった２型糖尿病患者に効果が期待できる。
【００８３】
なお、上記実施の形態の構成及び動作は例であって、本発明の趣旨を逸脱しない範囲で適宜変更して実行することができることは言うまでもない。
【産業上の利用可能性】
【００８４】
本発明によれば、ＧＬＰ−１関連組成物とグレリン阻害組成物を併用することで、吐き気や低血糖等の副作用が少なく、それぞれの組成物を単独で用いるよりもインスリン分泌を促進する糖尿病治療／肥満治療用の組成物を提供することができる。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、血糖値を正常に維持するための治療用組成物に係るものであり、特に糖尿病の治療又は予防用の組成物、膵臓ランゲルハンス島β細胞の保護／再生促進組成物、膵臓ランゲルハンス島β細胞のｃＡＭＰ産生促進組成物、及び糖尿病及び／又は肥満を治療する組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
糖尿病には、小児期や若年期から発症する１型糖尿病と、主に成人になってから発症する２型糖尿病が知られている。
このうち、１型糖尿病は、先天的な自己免疫疾患であり、膵臓のランゲルハンス島（膵島）のβ細胞が破壊されて、血糖値を下げるペプチドホルモンであるインスリンの分泌が欠乏し、血糖値を下げることができなくなる代謝異常の疾病である。
２型糖尿病は、膵島β細胞は残存していることもあり得るが、インスリン分泌異常、インスリン抵抗性といった要因で、血糖値のコントロールがうまくいかず、長期的には動脈硬化、神経障害、網膜剥離、腎臓障害等の合併症を引き起こす疾病である。２型糖尿病は、遺伝的、潜在的な要因に加えて、偏食（過食）、ストレス、運動不足等の生活習慣（ライフスタイル）の影響により発病すると考えられている。そのうち、肥満が発症因子として重要である。
我が国の糖尿病の９５％以上は２型糖尿病であり、国民的な疾病となっている。
【０００３】
この２型糖尿病の治療薬として、従来より、インスリンの分泌を促進するスルフォニル尿素剤（ＳＵ剤）、インスリン製剤等が用いられてきた。
このうち、ＳＵ剤は、膵島β細胞を刺激して、インスリンを分泌させる働きにより、血糖値を下げる作用がある。また、インスリン製剤も、注射することで血中のインスリン濃度を上げて血糖値を下げることができる。
しかしながら、ＳＵ剤は、膵島β細胞を刺激して疲弊させる副作用が存在するという問題があった。
また、ＳＵ剤、インスリン製剤とも、血漿インスリン濃度が必要以上に上昇し、低血糖を引き起こすという副作用があった。
低血糖の状態は患者の死を招くこともあり、より副作用の少ない治療薬が求められていた。
【０００４】
そこで、非特許文献１を参照すると、次世代の２型糖尿病の治療薬として、ＧＬＰ−１のアナログが注目されている。ＧＬＰ−１はグルカゴン様ペプチド（ｇｌｕｃａｇｏｎ−ｌｉｋｅ ｐｅｐｔｉｄｅ）のことで、ヒトの消化管の粘膜から分泌されるペプチドホルモンである。
【０００５】
まず、図１７を参照して、このＧＬＰ−１の作用について説明する。通常、膵島β細胞は、血糖値が上がる、すなわち血中のグルコースの濃度が上がると、インスリンの分泌が促進されて血糖値を下げる。
より詳しく説明すると、まず、食事摂取により小腸から吸収されたグルコースが、膵臓の膵島β細胞を刺激してインスリン分泌を起こす。それと同時に、小腸からＧＬＰ−１が分泌され、膵島のβ細胞を刺激して、インスリン分泌を増強する。
ＧＬＰ−１の分泌は食事により刺激され、さらにその作用は食後の血糖値が上昇した状態で強く、食前の血糖値の低い状態では弱い。すなわち、ＧＬＰ−１は、食後のグルコース誘発インスリン分泌を促進する因子である。
【０００６】
ところが、２型糖尿病患者においては、このグルコース誘発インスリン分泌が低下していることが多い。
すなわち、２型糖尿病の患者では、膵島β細胞のグルコース受容が障害されており、その結果、十分な量のインスリン分泌が起こらない。
そこで、膵島β細胞のインスリン分泌を促進するＧＬＰ−１を治療薬として用いることが考えられている。
しかしながら、生体内のＧＬＰ−１は、食物の消化に伴い消化管から分泌されるものの、通常、体内のＧＬＰ−１は、産生からわずか１〜２分で分解酵素により分解されてしまう。
【０００７】
このため、ＧＬＰ−１を治療薬として使用するために、化学的に修飾して、長時間作用させるＧＬＰ−１アナログが開発されている。
また、ＧＬＰ−１の体内濃度を保つため、体内のＧＬＰ−１を分解する分解酵素であるジペプチジルペプチターゼ（ＤＰＰ）４の働きを抑えるＤＰＰ４阻害剤についても、開発が進んでいる。
【０００８】
一方、特許文献１を参照すると、従来、胃から分泌されて摂食を亢進する内分泌物質として知られてきたペプチドホルモンのグレリン（Ｇｈｒｅｌｉｎ）が、膵島β細胞にも存在し、インスリンの分泌を抑制していることが分かってきた。
【０００９】
ここで、図１８を参照して、より詳しくグレリンの作用について説明する。
図１８は、２型糖尿病のモデルのラットに高脂肪食を与えたときの、予防・治療の概念を示す図である。
まず、グレリン阻害組成物を与えていない場合には、高脂肪食が与えられたラットではインスリンに対する抵抗性を生じ、それを乗り越えるまでにはインスリン分泌が増加しないために、血糖値が上昇し、耐糖能障害が生じ、２型糖尿病を発症する。
それに対して、グレリン阻害組成物を与えた場合には、高脂肪食が与えられたラットではインスリンに対する抵抗性は上がるものの、グレリンが阻害されることによってインスリンの分泌量が上昇する。これにより、結果的に、血糖値も上昇しないため、正常状態を維持できる。
このように、グレリンに特異的な抗体のようなグレリン阻害組成物によって、インスリン分泌のブレーキが解除され、インスリン分泌が促進されると考えられる。
【００１０】
上述のように、グレリンはインスリン分泌を抑制するホルモンであるため、内在性グレリン阻害組成物を投与すると、投与対象においてインスリン分泌が増加し血糖値を低下させることができる。
つまり、図１８の概念図によれば、グレリン阻害組成物を与えてグレリンの働きを抑制すると、インスリンの分泌が促進されて、血糖値が下がると理論的に考えられる。このため、２型糖尿病治療用組成物として有効である。
よって、グレリン阻害組成物により、ＧＬＰ−１アナログやＤＰＰ４阻害剤と同様のインスリン分泌促進効果を得ることが期待される。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】特開２００８−１２７３７７号公報
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】Ｋｎｕｄｓｅｎ ｅｔ ａｌ．、Ｊ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ ２０００、４３、１６６４−９
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
しかしながら、ＧＬＰ−１アナログやＤＰＰ４阻害剤のようなＧＬＰ−１関連組成物は、従来の２型糖尿病治療組成物（ＳＵ剤）に比べ、低血糖発作の副作用が少ないが皆無ではなく、かなりの頻度で嘔吐などの副作用を起こしていた。
また、ＧＬＰ−１関連組成物は、比較的インスリン分泌促進及び血糖降下作用が弱いため、治療用組成物としての適用が、比較的軽度の２型糖尿病に限られていた。
一方、グレリン阻害組成物は、インスリン分泌を促進することで２型糖尿病を抑える効果が考えられるものの、その作用機構はインスリン分泌の抑制を阻害するものなので、治療用組成物として使用しても効果が比較的弱いと推察されていた。
【００１４】
このため、副作用を抑えて治療効果が高い、２型糖尿病の治療に用いることができる治療用の組成物が求められていた。
【００１５】
本発明は、このような状況に鑑みてなされたものであり、上述の課題を解消することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本発明の組成物は、ＧＬＰ関連組成物とグレリン阻害組成物とを含有する、糖尿病及び／又は肥満を治療する組成物であることを特徴とする。
本発明の組成物は、前記糖尿病は２型糖尿病であり、前記ＧＬＰ−１関連組成物及び／又はグレリン阻害組成物は、成人における投与用量より低い濃度であることを特徴とする。
本発明の組成物は、前記グレリン阻害組成物及び前記ＧＬＰ−１関連組成物の併用により膵臓ランゲルハンス島β細胞のｃＡＭＰ産生量を増やすことを特徴とする。
本発明の組成物は、前記ＧＬＰ関連組成物がＧＬＰ−１である場合は、１日投与用量が０．１ｎｍｏｌ／ｋｇ体重〜０．３ｎｍｏｌ／ｋｇ体重であることを特徴とする。
本発明の組成物は、前記ＧＬＰ関連組成物がＧＬＰ−１アナログのＥｘｅｎａｔｉｄｅである場合は、成人における１日投与用量が１μｇ〜６μｇであることを特徴とする。
本発明の組成物は、前記ＧＬＰ関連組成物がＧＬＰ−１アナログのＬｉｒａｇｌｕｔｉｄｅである場合は、成人における１日投与用量が０．１ｍｇ〜０．３ｍｇであることを特徴とする。
本発明の組成物は、前記グレリン阻害組成物が［Ｄ−Ｌｙｓ3］−ＧＨＲＰ−６である場合に、１日投与用量は０．１μｍｏｌ／ｋｇ体重〜０．３μｍｏｌ／ｋｇ体重であることを特徴とする。
本発明の膵臓ランゲルハンス島β細胞の保護／再生促進組成物は、前記組成物を含むことを特徴とする。
本発明の膵臓ランゲルハンス島β細胞のｃＡＭＰ産生促進組成物は、前記組成物を含むことを特徴とする。
本発明の組成物は、ＧＬＰ関連組成物、及びグレリン阻害組成物又はＫｖ２．１チャネル阻害組成物のいずれかを含有することを特徴とする。
本発明の組成物は、前記Ｋｖ２．１チャネル阻害組成物は、Ｓｔｒｏｍａｔｏｘｉｎ又はｇｕａｎｇｘｉｔｏｘｉｎ−１Ｅであることを特徴とする。
【発明の効果】
【００１７】
本発明によれば、ＧＬＰ−１関連組成物と内因性グレリン阻害組成物を併用することで、それぞれ単独で使用する場合に比べて、副作用を低減し、血糖降下作用を増強し、それぞれの組成物の濃度を低く処方できる治療用組成物を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】本発明の実施の形態の実施例１に係る正常ラット膵島におけるＧＬＰ−１関連組成物及びグレリン阻害組成物の併用によるインスリン分泌の実験結果を示すグラフである。
【図２】本発明の実施の形態の実施例２に係る２型糖尿病モデルＧＫラットの膵島におけるＧＬＰ−１関連組成物及びグレリン阻害組成物の併用によるインスリン分泌の実験結果を示すグラフである。
【図３】本発明の実施の形態の実施例３に係るＧＫラットに対する糖負荷試験の実験結果を示すグラフである。
【図４】本発明の実施の形態の実施例４に係る正常ラット膵島におけるＧＬＰ−１関連組成物によるｃＡＭＰ産生に対するグレリンの抑制効果を示すグラフである。
【図５】本発明の実施の形態の実施例５に係るＧＫラット膵島におけるＧＬＰ−１関連組成物及びグレリン阻害組成物の併用によるｃＡＭＰ産生の実験結果を示すグラフである。
【図６】本発明の実施の形態の実施例６に係る正常ラットおよび２型糖尿病ＧＫラット血中グレリン濃度と血糖値の測定の実験結果を示すグラフである。
【図７】本発明の実施の形態の実施例７に係る正常ラットおよび２型糖尿病ＧＫラットの膵島ｍＲＮＡ発現量の測定結果を示すグラフである。
【図８】本発明の実施の形態の実施例８に係る正常ラットにＧＬＰ−１を投与した際の膵島β細胞内Ｃａ2+濃度（［Ｃａ2+］i）の蛍光顕微鏡画像解析法による測定結果を示すグラフである。
【図９】本発明の実施の形態の実施例８に係る正常ラットにＧＬＰ−１とグレリンとを投与した際の膵島β細胞内Ｃａ2+濃度（［Ｃａ2+］i）の蛍光顕微鏡画像解析法による測定結果を示すグラフである。
【図１０】本発明の実施の形態の実施例８に係るグレリン作用の濃度−反応曲線を比較した結果を示すグラフである。
【図１１】本発明の実施の形態の実施例９に係る膵島におけるＫｖ２．１チャネルのｍＲＮＡ発現量をリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ法によって測定した結果を示すグラフである。
【図１２】本発明の実施の形態の実施例に係るグレリンとＫｖ２．１チャネルとの関係を示す概念図である。
【図１３】本発明の実施の形態の実施例１０に係る２型糖尿病ＧＫラットへのグレリン阻害組成物の浸透圧ポンプによる持続投与の際の血糖値測定結果を示すグラフである。
【図１４】本発明の実施の形態の実施例１０に係る２型糖尿病ＧＫラットへのグレリン阻害組成物の浸透圧ポンプの埋め込み後の血糖値の平均を示すグラフである。
【図１５】本発明の実施の形態の実施例１１に係る２型糖尿病ＧＫラットに対する糖負荷試験の実験結果を示すグラフである。
【図１６】本発明の実施の形態の実施例１１に係る２型糖尿病ＧＫラットに対する糖負荷試験の血糖値とインスリン値を示すグラフである。
【図１７】従来のＧＬＰ−１及び関連組成物の膵島β細胞でのインスリン分泌促進を示す概念図である。
【図１８】従来のグレリン阻害組成物による２型糖尿病の予防または治療の概念図である。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
＜実施の形態＞
上述したように、ＧＬＰ−１は、食事摂取により小腸から分泌されインスリン分泌を起こすペプチドホルモンである。ＧＬＰ−１の長時間持続型アナログおよびＧＬＰ−１分解酵素（ＤＤＰ）阻害剤は、２型糖尿病治療薬として米国ですでに臨床使用されている。
一方、グレリンは、インスリン分泌を抑制するホルモンである。動物実験において、内在性グレリンを阻害すると、インスリン分泌が増加し血糖値が低下するため、２型糖尿病治療に有効であることが分かった。
本発明の発明者は、従来のＳＵ剤やインスリン製剤に代わるいくつかの治療用組成物について検討を重ねてきた。この際に、ＧＬＰ−１関連組成物や、内因性グレリン阻害組成物についても、それぞれ、臨床応用について検討を行い、有効性の基礎的データを得た。
【００２０】
ここで、ＧＬＰ−１関連組成物は、膵島β細胞に働きかけてインスリン分泌を促進するという働きをするが、グレリン阻害組成物は、インスリン分泌の「抑制を阻害」するという働きがある。これらの二つの方法は、従来、単独で使用しても、ＳＵ剤に比して効果が低いという問題があった。また、効果を高めるためにＧＬＰ−１関連組成物を多量に処方して使用すると、吐き気や重篤な低血糖等の副作用があるということが分かった。
このため、通常、働きが弱い薬剤を同時に投与することは当業者にとって想定外であり、ＧＬＰ−１関連組成物とグレリン阻害組成物を同時に投与することは全く考えられていなかった。
【００２１】
ところが、本発明の発明者は、ＧＬＰ−１関連組成物とグレリン阻害組成物を併用して投与することで、当業者が想定していなかった顕著な効果が得られることを発見し、本発明の実施の形態に係る糖尿病治療用組成物を発明するに至った。
【００２２】
本発明の実施の形態に係る糖尿病治療用組成物は、ＧＬＰ−１関連組成物とグレリン阻害組成物をそれぞれ単独で使用するよりも、大幅に血糖値を低下させる効果が得られる。このため、吐き気や重篤な低血糖のような副作用をもたらさない濃度にて、糖尿病治療用組成物として使用することができる。
また、ＧＬＰ−１関連組成物とグレリン阻害組成物を併用することで、効果的な摂食抑制作用が得られ、抗肥満効果も期待できる。
【００２３】
より具体的に説明すると、本発明の実施の形態に係る治療用組成物は、既に報告されているＧＬＰ−１関連組成物を用いているものの、このＧＬＰ−１関連組成物を低濃度で処方することによって副作用を低減させる効果を有する組成物を提供する。
すなわち、ＧＬＰ−１関連組成物と内在性グレリン阻害組成物とを組み合わせて併用した組成物は、２型糖尿病の患者にとって、副作用を軽減させて低血糖を起こさない安全な組成物としての治療用組成物として使用できる。
【００２４】
グレリン阻害によるインスリン分泌促進と組み合わせることにより、ＧＬＰ−１、ＧＬＰ−１アナログ、ＤＰＰ４阻害剤のインスリン分泌促進・血糖降下作用を高める。
グレリン阻害によるインスリン分泌促進と組み合わせることにより、ＧＬＰ−１アナログのより低い臨床使用濃度で同様のインスリン分泌促進・血糖降下作用が得られ、嘔吐、低血糖発作などの副作用が回避できる。
【００２５】
また、本発明の実施の形態において用いられるＧＬＰ−１関連組成物としては、例えば、上述したＧＬＰ−１の他、ＧＬＰ−１アナログ、ＧＬＰ−１分解酵素（ＤＰＰ４）阻害剤等を用いることができる。
このＧＬＰ−１の長時間持続型アナログとしては、例えば、Ｅｘｅｎａｔｉｄｅ（合成ｅｘｅｎｄｉｎ−４、イーライリリー社製）、Ｌｉｒａｇｌｕｔｉｄｅ（ＧＬＰ−１脂肪酸修飾、ノボノルディスクファーマ社製）等が挙げられる。
【００２６】
また、本発明の実施の形態において用いられるＧＬＰ−１関連組成物としては、上述したように、ＧＬＰ−１分解酵素（ＤＰＰ４）阻害剤についても用いることができる。このＤＰＰ４阻害剤としては、Ｓｉｔａｇｌｉｐｔｉｎ（製品名：Ｊａｎｕｖｉａ、万有製薬社製）、Ｖｉｌｄａｇｌｉｐｔｉｎ（製品名：Ｇａｌｖｕｓ、ノバルティスファーマ社製）等を用いることができる。
【００２７】
また、本発明の実施の形態において用いられるＧＬＰ−１関連組成物は、上述したように、ＧＬＰ−１関連組成物を単独で用いて、インスリン分泌を促す等の作用を奏するための、成人における投与用量は、ＧＬＰ−１アナログの場合、Ｅｘｅｎａｔｉｄｅでは１回５μｇか１０μｇを１日２回、Ｌｉｒａｇｌｕｔｉｄｅでは１日１回０．９ｍｇ投与であり、副作用として嘔吐・悪心・胃部不快感を起す頻度が約５〜９％と報告されている。また、重篤な低血糖とそれに伴う神経症状等の副作用も報告されている。
このため、本発明の実施の形態において用いられるＧＬＰ−１関連組成物は、例えば、ＧＬＰ−１アナログの場合は成人における投与量の１／６〜１／３で、糖尿病治療効果はあるが吐き気や重篤な低血糖等の副作用を起こさないか頻度の極めて少ない投与量を用いることができる。
【００２８】
また、本発明の実施の形態において用いられる内在性グレリン阻害組成物は、グレリン阻害剤、グレリン受容体阻害剤等を用いることができる。
例えば、グレリン阻害剤としては、内在性グレリンに結合してグレリンの作用を阻害する中和抗体等が挙げられる。
また、グレリン受容体阻害剤としては、例えば、［Ｄ−Ｌｙｓ3］−ＧＨＲＰ−６等があるものの、より特異性の高いグレリン受容体阻害分子を用いることができる。
このグレリン受容体阻害剤としては、例えば ［Ｄ−Ｌｙｓ3］−ＧＨＲＰ−６の場合、マウスにおける１日投与用量として濃度０．１μｍｏｌ／ｋｇ〜０．３μｍｏｌ／ｋｇ体重といった、副作用を起こさない用量を用いることができる。マウスとヒトで、グレリン投与の血糖値に対する効果はほぼ同様であり、またグレリン血漿濃度の差は数倍以内であるので、マウスで明らかとなった上記濃度のグレリン受容体阻害剤［Ｄ−Ｌｙｓ3］−ＧＨＲＰ−６の効果はヒトに適用することができると考えられる。また、グレリン受容体阻害剤の種類によっては、ＧＬＰ−１関連組成物と併せて処方することで、濃度０．１μｍｏｌ／ｋｇよりもさらに少ない投与量を用いることも可能である。
【００２９】
本発明の実施の形態に係る治療用組成物は、任意の製剤上許容しうる担体（例えば生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液、例えばＤ−ソルビトール、Ｄ−マンノース、Ｄ−マンニトール、塩化ナトリウム等が挙げられ、適当な溶解補助剤、例えばアルコール、具体的にはエタノール、ポリアルコール、例えばプロピレングリコール、ポリエチレングリコール、非イオン性界面活性剤、例えばポリソルベート８０（ＴＭ）、ＨＣＯ−５０等を挙げることができるが、それらに限定されない）と共に投与することができる。また、適切な賦形剤等を含んでもよい。
【００３０】
また、本発明の実施の形態に係る治療用組成物は、製剤上許容しうる担体を調製するために、適切な薬学的に許容可能なキャリアを含み得る。
このキャリアとしては、シリコーン、コラーゲン、ゼラチン等の生体親和性材料を含んでもよい。あるいはまた、種々の乳濁液であってもよい。
さらには、例えば、希釈剤、香料、防腐剤、賦形剤、崩壊剤、滑沢剤、結合剤、乳化剤、可塑剤などから選択される１または２以上の製剤用添加物を含有させてもよい。
【００３１】
本発明の実施の形態に係る治療用組成物は、経口投与のための投与に適した投与形態において、当該分野で周知の製剤上許容しうる担体を用いて処方され得る。
本発明の実施の形態に係る医薬組成物の投与経路は、特に限定されないが、非経口的に投与することが好ましい。
非経口投与としては、例えば、静脈内、動脈内、皮下、真皮内、筋肉内または腹腔内の投与が挙げられる。
【００３２】
本発明の実施の形態の治療用組成物は、生物体、生物体の体内の一部分、または生物体より摘出または排出されたその一部分について、治療用の対象とすることができる。この生物体は特に限定されるものではないが、動物（例えば、ヒト、家畜動物種、野生動物）を含む。
【００３３】
また、本発明の実施の形態に係る治療用組成物の治療対象としては、主に２型糖尿病に用いることができる。これは、上述したように、２型糖尿病においては、膵島β細胞が残存していることが多いため、膵島β細胞のインスリン分泌能力を向上させることで、糖尿病を治療可能であるためである。
しかしながら、本発明の実施の形態係る治療用組成物は、インスリン分泌の負担による膵島β細胞のアポトーシスや機能不全を抑制する。これは、予備的な実験により、ＧＬＰ−１関連組成物には膵島β細胞保護・再生促進作用があり、これらの作用はグレリン阻害組成物の低濃度の併用により増強されるためと考えられる。
このため、１型糖尿病についても、ＧＬＰ−１関連組成物による膵島β細胞保護・再生促進作用をグレリン阻害組成物の併用により増強することにより、病気の進行を抑制しさらには改善することが想定できる。さらに、１型糖尿病の膵島移植、膵島β細胞の幹細胞治療等においても、インスリン分泌を促進しながら膵島β細胞の負担を抑えて、短期的、長期的に治療効果を高め、効果的に用いることが考えられる。
さらに、本発明の実施の形態係る治療用組成物は、予備的な実験により、副作用がほとんどない濃度で用いた場合でも、効果的な食欲抑制作用を得ることができる。
このため、特に２型糖尿病に至る肥満（メタボリック・シンドローム）の予防、治療等に用いることもできる。
【００３４】
また、本発明の実施の形態に係る治療用組成物を上述の治療に用いるために、投与間隔および投与量は、疾患の状況、さらに対象の状態などの種々の条件に応じて適宜選択および変更することが可能である。
ここで、２型糖尿病を予防または治療する場合には、血糖値を改善する投与用量を用いることができる。これらの用量は、予備的な実験においては、通常の成人における投与用量の１／６〜１／３程度でよく、ＧＬＰ−１関連組成物で報告されている吐き気や重篤な低血糖等の副作用を抑えて効果的に使用可能である。
【００３５】
本発明の実施の形態に係る治療用組成物の１回の投与量および投与回数は、投与の目的により、さらに患者の年齢および体重、症状および疾患の重篤度などの種々の条件に応じて適宜選択および変更することが可能である。
投与回数および期間は、１日１回約２〜４週間程度投与し、糖尿病の状態をモニターし、その状態により再度あるいは繰り返し投与を行う。
【００３６】
本発明の実施の形態に係る組成物は、他の組成物等と併用することも可能である。また、他の組成物と同時に本発明の組成物を投与してもよく、また間隔を空けて投与してもよいが、その投与順序は特に問わない。
【００３７】
また、本発明の実施の形態において、疾患が改善または軽減される期間は特に限定されないが、一時的な改善または軽減であってもよいし、一定期間の改善または軽減であってもよい。
【００３８】
また、本発明の実施の形態に係る組成物として、Ｋｖ２．１チャネルの阻害剤を更に用いて、グレリン阻害組成物の効果を高めることができる。このＫｖ２．１チャネルの阻害剤としては、例えば、クモ毒でありＡ型カリウムチャネルをブロックするＳｔｒｏｍａｔｏｘｉｎを用いることができる。また、ＧＬＰ−１関連組成物とＫｖ２．１チャネル阻害剤の組み合わせを用いることもできる。
これにより、治療用組成物の濃度を低くしても、同様の効果を得ることができる。
【００３９】
〔本発明の実施の形態に係る治療用組成物の実施例〕
以下で、本発明の実施の形態に係る治療用組成物について、具体的な実験を基にして、実施例としてさらに具体的に説明する。しかしながら、この実施例は一例にすぎず、これに限定されるものではない。
以下の実施例１〜５においては、本発明の実施の形態に係るＧＬＰ−１関連組成物としては、ＧＬＰ−１を用いた。また、内在性グレリン阻害組成物としては、グレリン受容体阻害剤［Ｄ−Ｌｙｓ3］−ＧＨＲＰ−６を用いた。
【実施例１】
【００４０】
（正常ラット膵島におけるインスリン分泌）
正常ラット膵島におけるインスリン分泌に対する内在性グレリン阻害組成物及び／又はＧＬＰ−１関連組成物の影響を調査した。８−１２週齢の正常なウィスターラットから膵島をコラゲナーゼ消化法により分離し、分離した膵島を集め、２．８ｍＭ又は８．３ｍＭのグルコースの存在下で、ＫＲＢＨ（１２９ｍＭのＮａＣｌ，５．０ｍＭのＮａＨＣＯ3，４．７ｍＭのＫＣｌ，１．２ｍＭのＫＨ2ＰＯ4，２．０ｍＭのＣａＣｌ2，１．２ｍＭのＭｇＳＯ4，１０ｍＭのＨＥＰＥＳ，ｐＨ＝７．４，０．１％のＢＳＡ）中で３７℃、１時間培養した。さらに、８．３ｍＭのグルコースの存在下では、１０ｎＭのＧＬＰ−１及び１μＭの［Ｄ−Ｌｙｓ3］−ＧＨＲＰ−６を各々単独、若しくは併用して使用した。それぞれの群におけるインスリン濃度は、ＥＬＩＳＡキット（和光純薬工業（株））を用いて測定した。
【００４１】
図１を参照して、正常ラット膵島のインスリン分泌測定例を示す。縦軸は、インスリン分泌量（Ｉｎｓｕｌｉｎ ｒｅｌｅａｓｅ （ｎｇ／ｉｓｌｅｔ／ｈｒ））を示す。横軸は、左側から、グルコース２．８ｍＭのみ投与した群、グルコース８．３ｍＭのみ投与した群、グルコース８．３ｍＭの存在下において内在性グレリン阻害組成物のみ作用した群、グルコース８．３ｍＭの存在下においてＧＬＰ−１関連組成物のみ作用した群、グルコース８．３ｍＭの存在下において内在性グレリン阻害組成物及びＧＬＰ−１関連組成物を併用して作用した群を示す。棒グラフの真上の数字は、実験に用いたラットの各群におけるサンプル数を示す。なお、１サンプルには、単離した膵島７−１０個を含む。
【００４２】
図１より、正常ラット膵島では、グルコースを投与するとインスリン分泌量が上昇した。そして、グルコース８．３ｍＭのみ投与した群と比較して、内在性グレリン阻害組成物又はＧＬＰ−１関連組成物を各々単独で処方させた場合において、インスリン分泌は増強していた（ｔ−検定にて、各々グルコース８．３ｍＭのみ投与した群に対してｐ＜０．０５。以下、ｔ−検定を用いて説明する）。
さらに、内在性グレリン阻害組成物又はＧＬＰ−１関連組成物を各々単独で処方させた群よりも、内在性グレリン阻害組成物及びＧＬＰ−１関連組成物を併用して作用させた群の方がインスリン分泌が増強していた（グルコース８．３ｍＭの存在下においてＧＬＰ−１関連組成物のみ作用した群に対してｐ＜０．０５）。
すなわち、内在性グレリン阻害組成物及びＧＬＰ−１関連組成物を併用して作用させた場合には、有意にインスリン分泌量が上昇することから、今まで単独で用いていた処方量よりも、より少ない量で薬効を得ることができると解される。
このように、正常な対象において、本発明の実施の形態に係る治療用組成物は、２型糖尿病に対する予防または治療効果が認められる。
【実施例２】
【００４３】
（２型糖尿病ＧＫラット膵島におけるインスリン分泌）
２型糖尿病Ｇｏｔｏｈ−Ｋａｋｉｚａｋｉ（ＧＫ）ラット膵島におけるインスリン分泌に対する内在性グレリン阻害組成物及び／又はＧＬＰ−１関連組成物の影響を調査した。実施例１に記載の正常ラット膵島におけるインスリン分泌と同様の条件を用いて実験を行った。２型糖尿病ＧＫラットとは、インスリン非依存型糖尿病である２型糖尿病を発症するモデルラットとして確立された系統のラットである。
【００４４】
図２を参照して、２型糖尿病ＧＫラット膵島のインスリン分泌測定例を示す。縦軸は、インスリン分泌量（Ｉｎｓｕｌｉｎ ｒｅｌｅａｓｅ （ｎｇ／ｉｓｌｅｔ／ｈｒ））を示す。横軸は、左側から、グルコース２．８ｍＭのみ投与した群、グルコース８．３ｍＭのみ投与した群、グルコース８．３ｍＭの存在下において内在性グレリン阻害組成物のみ作用した群、グルコース８．３ｍＭの存在下においてＧＬＰ−１関連組成物のみ作用した群、グルコース８．３ｍＭの存在下において内在性グレリン阻害組成物及びＧＬＰ−１関連組成物を併用して作用した群を示す。棒グラフの真上の数字は、実験に用いたラットの各群におけるサンプル数を示す。
【００４５】
図２より、正常ラット膵島と同様に、２型糖尿病ＧＫラット膵島でも、グルコースを投与するとインスリン分泌量が上昇した。そして、グルコース８．３ｍＭのみ投与した群と比較して、内在性グレリン阻害組成物又はＧＬＰ−１関連組成物各々単独で処方させた場合において、インスリン分泌は増強していた（各々グルコース８．３ｍＭのみ投与した群に対してｐ＜０．０１及びｐ＜０．００１）。さらに、内在性グレリン阻害組成物又はＧＬＰ−１関連組成物を各々単独で処方させた群よりも、内在性グレリン阻害組成物及びＧＬＰ−１関連組成物を併用して作用させた群の方がインスリン分泌が増強していた（グルコース８．３ｍＭの存在下において内在性グレリン阻害組成物のみ作用した群に対してｐ＜０．０１）。
このように内在性グレリン阻害組成物及びＧＬＰ−１関連組成物を併用して作用させた場合には、有意にインスリン分泌量が上昇することから、今まで単独で用いていた処方量よりもより少ない量で薬効を得ることができると共に、２型糖尿病を治療するための組成物として用いることも可能であることを示すことができた。
【実施例３】
【００４６】
（２型糖尿病ＧＫラットへの糖負荷試験）
２型糖尿病ＧＫラットの腹腔内への糖負荷試験（ＩＰＧＴＴ）を行い、対象に急性の糖負荷をかけた際の内在性グレリン阻害組成物及び／又はＧＬＰ−１関連組成物の影響を調査するために、血糖値及びインスリン分泌の測定を行った。
全ての実験群の２型糖尿病ＧＫラットには、一晩絶食させた後、１ｇグルコース／ｋｇ体重を腹腔内に投与し、その他の物質を投与しないＣｏｎｔｒｏｌ群、０．３μｍｏｌ／ｋｇ体重の［Ｄ−Ｌｙｓ3］−ＧＨＲＰ−６を投与した群、０．３ｎｍｏｌ／ｋｇ体重のＧＬＰ−１を投与した群、０．３μｍｏｌ／ｋｇ体重の［Ｄ−Ｌｙｓ3］−ＧＨＲＰ−６及び０．３ｎｍｏｌ／ｋｇ体重のＧＬＰ−１を併用して投与した群の調査を行った。尾静脈より採血を行いグルコース濃度及びインスリン濃度をそれぞれ測定した。インスリン濃度の測定は、ＥＬＩＳＡキット（和光純薬工業（株）社製）を用い、グルコース濃度の測定は、グルコカードＤＩＡメーター（ＧｌｕｃｏＣａｒｄ ＤＩＡ ｍｅｔｅｒ、Ａｒｋｒａｙ社製）を用いた。
【００４７】
図３Ａを参照して、２型糖尿病ＧＫラットの血糖値の測定例を示す。縦軸は、血糖値（Ｂｌｏｏｄ ｇｌｕｃｏｓｅ（ｍｇ／ｄｌ））を示す。横軸は、経過時間（Ｔｉｍｅ（ｍｉｎ））を示す。図３Ａより、全ての実験群において糖負荷後３０〜６０分で各群の血糖値はピークに達した。そして、１２０分経過した時には、コントロールや内在性グレリン阻害組成物又はＧＬＰ−１関連組成物を各々単独で処方させた群よりも、内在性グレリン阻害組成物及びＧＬＰ−１関連組成物を併用して作用させた群は有意に血糖値が減少していた（Ｃｏｎｔｒｏｌ群に対してｐ＜０．０５）。これにより、内在性グレリン阻害組成物及びＧＬＰ−１関連組成物を併用して作用させた場合には、より早く血糖値を正常値に戻すことができるため、２型糖尿病を治療するための組成物として効果が高いことが示された。
また、図３Ｂを参照して、２型糖尿病ＧＫラットのインスリン分泌の測定例を示す。縦軸は、インスリン分泌量（Ｉｎｓｕｌｉｎ ｒｅｌｅａｓｅ （ｎｇ／ｍｌ））を示す。横軸は、経過時間（Ｔｉｍｅ（ｍｉｎ））を示す。図３Ｂより、糖負荷後１５〜３０分で全ての群のインスリン分泌量は増加した。その中で、コントロールや内在性グレリン阻害組成物又はＧＬＰ−１関連組成物を各々単独で処方させた群よりも、内在性グレリン阻害組成物及びＧＬＰ−１関連組成物を併用して作用させた群において有意にインスリン分泌量が増加していた（Ｃｏｎｔｒｏｌ群に対してｐ＜０．０５）。これは、内在性グレリン阻害組成物及びＧＬＰ−１関連組成物を併用して作用させた場合には、図３Ｂで示したようにインスリン分泌量が有意に増加することに対応して、図３Ａで示したように血糖値が有意に減少したと解される。
このように、内在性グレリン阻害組成物及びＧＬＰ−１関連組成物を併用して作用させた場合には、有意にインスリン分泌量が増加して、血糖値が元に戻る時間が短くなった。したがって、本発明の実施の形態に係る治療用組成物は、今まで単独で内在性グレリン阻害組成物又はＧＬＰ−１関連組成物を処方していた場合よりも、２型糖尿病を治療するための組成物としての高い薬効を得ることができることが示された。
【実施例４】
【００４８】
（正常ラット膵島におけるｃＡＭＰ産生）
正常ラット膵島におけるｃＡＭＰ（Ｃｙｃｌｉｃ ａｄｅｎｏｓｉｎｅ ｍｏｎｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ）産生に対するＧＬＰ−１関連組成物及び／又はグレリン（Ｇｈｒｅｌｉｎ）の影響を調査した。膵島の培養は、実施例１に記載の正常ラット膵島におけるインスリン分泌と同様に、８−１２週齢の正常なウィスターラットから膵島をコラゲナーゼ消化法により分離し、分離した膵島を集め、ホスホジエステラーゼ阻害剤のＩＢＭＸ（０．５ｍＭ）存在下で２．８ｍＭ又は８．３ｍＭのグルコースを含むＫＲＢＨ中で３７℃、１時間インキュベートした。さらに、８．３ｍＭのグルコースの存在下では、１０ｎＭのＧＬＰ−１のみ、並びに１０ｎＭのＧＬＰ−１及び１０ｎＭのグレリン（Ｇｈｒｅｌｉｎ）とを併用して作用した。各群におけるｃＡＭＰ産生量は、ｃＡＭＰ測定ＥＩＡキット（アマシャム社製）を用いて測定した。
【００４９】
図４を参照して、正常ラット膵島のｃＡＭＰ量の測定例を示す。縦軸は、ｃＡＭＰ量（ｃＡＭＰ ｆｍｏｌ／ｉｓｌｅｔ／ｈｒ）を示す。横軸は、左側から、グルコース２．８ｍＭのみ投与した群、グルコース８．３ｍＭのみ投与した群、グルコース８．３ｍＭの存在下においてＧＬＰ−１関連組成物のみ作用した群、グルコース８．３ｍＭの存在下においてＧＬＰ−１関連組成物及びグレリンを併用して作用した群を示す。実験に用いたラットの個体数は、各群において９サンプルである（ｎ＝９）。
【００５０】
図４より、ＧＬＰ関連組成物を作用した群は、有意にｃＡＭＰ産生が上昇していた（グルコース８．３ｍＭのみ投与した群に対してｐ＜０．０１）。また、ＧＬＰ−１関連組成物を単独で作用した群よりも、ＧＬＰ−１関連組成物及びグレリンを併用して作用した群の方がｃＡＭＰ産生が抑制されていた（グルコース８．３ｍＭの存在下においてＧＬＰ−１関連組成物のみ作用した群に対してｐ＜０．０１）。
細胞内ｃＡＭＰ産生が増加するとインスリン分泌が促進されることが既に知られているが、そのｃＡＭＰ産生を制御する上流因子として、ＧＬＰ−１及びグレリンが関与していることが分かった。すなわち、ＧＬＰ−１関連組成物はｃＡＭＰ産生量を上昇させ、グレリンはｃＡＭＰ産生量を抑制する（グレリン阻害組成物はｃＡＭＰ産生量を上昇させる）という細胞内ｃＡＭＰ量の相反調整メカニズムも明らかとなった。
従って、ＧＬＰ−１関連組成物及びグレリン阻害組成物の併用作用によるインスリン分泌増強は、細胞内ｃＡＭＰ産生量の増強により説明される。このように、本発明の発明者は、ＧＬＰ−１関連組成物及びグレリン阻害組成物の併用作用によるインスリン分泌増強と２型糖尿病の治療有効性に関して、細胞内シグナル伝達レベルでの根拠を証明した。
【実施例５】
【００５１】
（２型糖尿病ＧＫラット膵島におけるｃＡＭＰ産生）
２型糖尿病ＧＫラット膵島におけるｃＡＭＰ産生に対する内在性グレリン阻害組成物及び／又はＧＬＰ−１関連組成物の影響を調査した。実施例２に記載の２型糖尿病ＧＫラット膵島におけるインスリン分泌を測定した場合と同様の条件の群を用いて実験を行った。各群におけるｃＡＭＰ産生量は、実施例４と同様にｃＡＭＰ測定ＥＩＡキット（アマシャム社製）を用いて測定した。
【００５２】
図５を参照して、２型糖尿病ＧＫラット膵島のｃＡＭＰ量の測定例を示す。縦軸は、ｃＡＭＰ量（ｃＡＭＰ ｆｍｏｌ／ｉｓｌｅｔ／ｈｒ）を示す。横軸は、左側から、グルコース２．８ｍＭのみ投与した群、グルコース８．３ｍＭのみ投与した群、グルコース８．３ｍＭの存在下において内在性グレリン阻害組成物のみ作用した群、グルコース８．３ｍＭの存在下においてＧＬＰ−１関連組成物のみ作用した群、グルコース８．３ｍＭの存在下において内在性グレリン阻害組成物及びＧＬＰ−１関連組成物を併用して作用した群を示す。実験に用いたラットの個体数は、各群において１０サンプルである（ｎ＝１０）。
【００５３】
図５より、グルコースのみを投与した群、内在性グレリン阻害組成物又はＧＬＰ−１関連組成物を各々単独で処方させた群よりも、内在性グレリン阻害組成物及びＧＬＰ−１関連組成物を併用して作用させた群の方がｃＡＭＰ産生が増強していた（グルコース８．３ｍＭの存在下において内在性グレリン阻害組成物のみ作用した群に対してｐ＜０．０５）。
このように内在性グレリン阻害組成物及びＧＬＰ−１関連組成物を併用して作用させた場合には、各々単独に比べて膵島β細胞のｃＡＭＰ産生が上昇した。したがって、実施例４と同様に、内在性グレリン阻害組成物及びＧＬＰ−１関連組成物の併用作用によりβ細胞シグナル伝達が増強され、２型糖尿病の治療用組成物としての併用治療の有用性の根拠を細胞内メカニズムで示した。
【００５４】
このように、実施例５の糖負荷試験においては、単独投与で効果のない濃度のグレリン捨抗薬とＧＬＰ−１を共投与することにより血中インスリン値の有意な上昇と血糖値の有意な低下を観察している。
これにより、最大効果濃度未満の濃度において、内在性グレリン阻害組成物又はＧＬＰ−１関連組成物が相乗的な作用を示し、顕著な効果があることを示している。
【００５５】
つまり、ＧＬＰ−１関連組成物により、ｃＡＭＰを増加させてインスリンの分泌を増やすことができるものの、従来は内在性のグレリンによりこのｃＡＭＰの増幅効果は抑制されていた。これに対し、ＧＬＰ−１関連組成物及びグレリン阻害剤を併用することで、ＧＬＰ−１によるｃＡＭＰ産出量を顕著に増やすことができる。さらに、グレリン阻害剤により、後述の実施例９に係る内因性グレリンのＫｖ２．１チャネルの活性化作用によるインスリン分泌の抑制に対応することができる。
すなわち、ＧＬＰ−１関連組成物及びグレリン阻害組成物を併用することで、ｃＡＭＰの産生量の増加を介して、膵島β細胞におけるインスリン分泌を促進することができる。
【００５６】
このように、グレリンがｃＡＭＰの産生を抑制していることはこれまで知られておらず、当業者がＧＬＰ−１関連組成物及びグレリン阻害組成物の併用を積極的に選択することは想定できなかった。
たとえば、ＧＬＰ−１関連組成物とガストリン化合物（例えば、特表２００７−５１９６４２号公報参照）の組み合わせについて、発明者らがｃＡＭＰ産生量を測定する予備的な実験をしたところ、ＧＬＰ−１を単独で使用した場合と同様のｃＡＭＰ産生量の上昇しか見られなかった。これは、いくつかの糖尿病治療用の化合物の組み合わせについても同様であった。
これに対して、ＧＬＰ−１関連組成物及びグレリン阻害組成物を併用することで、糖尿病の治療用の化合物を単に組み合わせるよりも、ｃＡＭＰの産生量を増加させられる。
【００５７】
以上のように、本発明によれば、ＧＬＰ−１関連組成物とグレリン阻害組成物との併用により、膵島β細胞への刺激により膵島β細胞を疲弊させることなく２型糖尿病治療用の組成物としてインスリン分泌促進・血糖降下作用を高めることができ、対象の血糖値を正常の状態に保つことが可能となる。さらに、ＧＬＰ−１関連組成物のより低い臨床使用濃度でのインスリン分泌促進・血糖降下作用が得られるため、嘔吐、低血糖発作などの副作用が回避できる。
【００５８】
また、ＧＬＰ−１関連組成物及び内在性グレリン阻害組成物を併用して作用させることによって、糖尿病肥満者への有効な治療法となる可能性がある。すなわち、脳視床下部室傍核（ＰＶＮ）へのＧＬＰ−１投与は、摂食を抑制することが知られている。さらに、摂食亢進因子のグレリンの阻害は摂食を抑制することも知られている。したがって、本発明の実施の形態で示したＧＬＰ−１関連組成物及び内在性グレリン阻害組成物を併用して作用させることによって、抗過食、抗肥満といった効果も抗糖尿病作用とともに期待される。この際に、本発明の組成物は、ＧＬＰ−１関連組成物とグレリン阻害組成物をそれぞれ単独で作用させるよりも低濃度で効果が得られる。このため、薬剤としての副作用を問題としないレベルで使用可能である。予防的に用いるためには、例えば食品に添加する等の投与方法の検討も有用である。
【００５９】
このように、ＧＬＰ−１関連組成物とグレリン阻害組成物との併用により２型糖尿病治療の有効性の基礎的データが示され、その臨床応用の基盤が確立された。さらに、ＧＬＰ−１とグレリン阻害は摂食抑制作用を持つことから、これら２つの方法の併用による抗肥満効果も期待される。
【実施例６】
【００６０】
（正常ラットおよび２型糖尿病ＧＫラット血中グレリン濃度と血糖値の測定）
正常なウィスターラット及び２型糖尿病ＧＫラットの血糖値と血中グレリン濃度の測定を行った。自由摂餌させた条件（Ｆｅｄ）で尾静脈より採血した後、４８時間絶食後（Ｆａｓｔ）と、その後、再度餌を与えた２時間後（Ｒｅｆｅｄ）に尾静脈より採血し血中グレリン濃度及び血糖値（血中グルコース濃度）の測定を行った。
グレリン濃度の測定は、ＥＬＩＳＡキット（三菱化学ヤトロン（株）社製）を用いた。グルコース濃度の測定は、グルコカードＤＩＡメーター（ＧｌｕｃｏＣａｒｄ ＤＩＡ ｍｅｔｅｒ、Ａｒｋｒａｙ社製）を用いた。
【００６１】
図６のグラフを参照して、正常のウィスターラット（正常ラット）および２型糖尿病ＧＫラットについて、図６（ａ）は血中のグレリン濃度、図６（ｂ）は血糖値の測定の結果について説明する。
図６（ａ）（ｂ）とも、正常ラット、２型糖尿病ＧＫラットについて、個体数１０（ｎ＝１０）の実験結果を平均してプロットした。各プロットにおいて、白丸は正常ラット（Ｗｉｓｔａｒ）、黒丸は２型糖尿病ＧＫラット（ＧＫ）の結果をそれぞれ示すプロットである。
【００６２】
図６（ａ）においては、縦軸は、グレリン濃度（Ｐｌａｓｍａ ｇｈｒｅｌｉｎ ｌｅｖｅｌｓ （ｆｍｏｌ／ｍｌ））をＥＬＩＳＡキットの反応レベルにより、１〜１００で示す。また、横軸は、自由摂餌させた条件（Ｆｅｄ）、４８時間後絶食後（Ｆａｓｔ）、再度餌を与えた２時間後（Ｒｅｆｅｄ）のそれぞれの測定条件を示す。
図６（ａ）によると、正常ラットの血中グレリン濃度は空腹時（Ｆａｓｔ）に高く、食後（Ｒｅｆｅｄ）低下する。一方、ＧＫラットの血中グレリンのレベルは、食後（Ｒｅｆｅｄ）で低下せず高値のままであった。それぞれ血中グレリンのレベルは正常ラットに比べて、自由摂餌させた条件（Ｆｅｄ）ではｐ＜０．０１であり、食後（Ｒｅｆｅｄ）ではｐ＜０．０５であった。
【００６３】
また、図６（ｂ）は、縦軸は、血糖値（Ｂｌｏｏｄ ｇｌｕｃｏｓｅ （ｍｇ／ｄｌ））の測定結果を示す。横軸は、自由摂餌させた条件（Ｆｅｄ）、４８時間後断食後（Ｆａｓｔ）、再度餌を与えた２時間後（Ｒｅｆｅｄ）のそれぞれの測定条件を示す。
図６（ｂ）によると、２型糖尿病ＧＫラットは、食後（Ｆｅｄ）で高血糖を示した。空腹時の血糖は変化なかった。高血糖のレベルとしては、正常ラット群と比べて、２型糖尿病ＧＫラットは、自由摂餌させた条件（Ｆｅｄ）、食後（Ｒｅｆｅｄ）において、ｐ＜０．０１であった。
【００６４】
このように、２型糖尿病のモデルとなるＧＫラットにおいては、グレリンの血中レベルは顕著に高くなっている。このため、本実施形態に係る内在性グレリン阻害組成物を投与することで、上述の実施例４、５に示したように、インスリン分泌に重要なｃＡＭＰを抑制している内在性グレリンに対抗することができる。
このように、本発明の実施の形態に係るＧＬＰ−１関連組成物とグレリン阻害組成物との併用することで、内在性のグレリンに対抗する顕著な効果が得られる。
【実施例７】
【００６５】
（正常ラットおよび２型糖尿病ＧＫラットの膵島ｍＲＮＡ発現量の測定）
５週齢の正常のウィスターラット（正常ラット）および２型糖尿病ＧＫラットから膵島をコラゲナーゼ消化法により分離し、膵島におけるメッセンジャーＲＮＡ発現量をＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ（タカラバイオ社製）を用いたリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ法により測定した。ここでは、グレリン（遺伝子ＩＤ、ＮＭ＿０２１６６９．２、プライマー配列は配列番号１（Ｐｒｉｍｅｒ １）と配列番号２（Ｐｒｉｍｅｒ ２）とを使用）、Ｋｉｒ６．２（遺伝子ＩＤ、ＮＭ＿０３１３５８．３、プライマー配列は配列番号３（Ｐｒｉｍｅｒ ３）と配列番号４（Ｐｒｉｍｅｒ ４）とを使用）、インスリンの遺伝子であるＩｎｓｕｌｉｎ−１（遺伝子ＩＤ、ＮＭ＿０１９１２９．２、プライマー配列は配列番号５（Ｐｒｉｍｅｒ ５）と配列番号６（Ｐｒｉｍｅｒ ６）とを使用）のメッセンジャーＲＮＡ量を測定した。なお、Ｋｉｒ６．２は、グルコース刺激による膵島β細胞からのインスリン分泌に関連することが知られている、ＡＴＰ感受性カリウム（ＫＡＴＰ）チャネルのサブユニットである。
【００６６】
図７は、正常ラット（Ｗｉｓｔａｒ）および２型糖尿病ＧＫラット（ＧＫ）の膵島ｍＲＮＡ発現量の測定の結果を示すグラフである。縦軸は正常ウィスターラットのｍＲＮＡ発現量を１とした時の相対的発現量を示す。横軸は、それぞれ、グレリン、Ｋｉｒ６．２、インスリン（Ｉｎｓｕｌｉｎ−１）の発現量を示す。なお、実験に用いた正常ラットおよび２型糖尿病ＧＫラットの個体数は、それぞれ７（ｎ＝７）である。
このように、２型糖尿病ＧＫラットでは、膵島グレリンのｍＲＮＡ発現が亢進していた（ｐ＜０．０５）。すなわち、２型糖尿病ＧＫラットにおいては、血中のグレリンのみならず、膵島においても、グレリンの濃度が高くなっていると考えられる。
これは、膵島による自らのグレリン分泌の増加により、ｃＡＭＰ産出を抑制させ、インスリン分泌を抑えていることが２型糖尿病ＧＫラットの病原性に関わっていることを示唆している。
このため、本実施形態に係る内在性グレリン阻害組成物は、膵島のｃＡＭＰ産出の抑制をなくし、ＧＬＰ−１関連組成物によるｃＡＭＰ産出を増加させることで、ｃＡＭＰによる膵島β細胞のインスリン分泌及び再生促進作用を高めることができることが分かる。
【実施例８】
【００６７】
（ラットの膵島β細胞内Ｃａ2+濃度（［Ｃａ2+］i）の測定）
次に、膵島β細胞のインスリン分泌の中心的制御因子である膵島β細胞内Ｃａ2+濃度（［Ｃａ2+］i）を測定した。ここでは、正常ウィスターラット（正常ラット）および２型糖尿病ＧＫラットからコラゲナーゼ消化法により分離した膵島をさらに単一細胞にし、単離した膵島β細胞［Ｃａ2+］iをＣａ2+感受性蛍光色素のｆｕｒａ−２（同仁社製）を用いた蛍光顕微鏡画像解析法により測定した。
灌流液中のグルコース濃度を２．８ｍＭ（２．８Ｇ）から８．３ｍＭ（８．３Ｇ）にし、その後８．３Ｇ下でＧＬＰ−１（１０ｎＭ）及び／又はグレリン（１０ｎＭ）を投与した。
膵島β細胞の同定指標としては、グルコース濃度８．３Ｇでの刺激およびインスリン分泌刺激薬のトルブタミド（Ｔｏｌｂ；３００μＭ）投与の両方により細胞内Ｃａ2+濃度が上昇したものをβ細胞と判断した。
【００６８】
図８〜図１０を参照して、ラットの膵島β細胞内Ｃａ2+濃度（［Ｃａ2+］i）の測定の結果について説明する。
図８は、正常ラットの膵島β細胞において８．３ｍＭグルコース存在下でＧＬＰ−１を投与した例である。縦軸は、細胞内Ｃａ2+濃度を反映するｆｕｒａ−２蛍光比（Ｆ３４０／Ｆ３８０）を示し、値が大きいほどＣａ2+濃度が高いことを示す。横軸は分単位の経過時間（Ｔｉｍｅ（ｍｉｎ））である。なお、図８中の「Ｔｏｌｂ」は、コントロールのＴｏｌｂを投与した際の波形を示す。
結果として、ＧＬＰ−１は、膵島β細胞［Ｃａ2+］iを増加させた。
【００６９】
図９は、正常ラット膵島β細胞において、８．３ｍＭグルコース存在下でＧＬＰ−１とグレリンとを投与した例である。縦軸、横軸とも図８と同様である。
結果として、グレリンはＧＬＰ−１により誘発される膵島β細胞［Ｃａ2+］i増加を抑制することが分かる。つまり、グレリンにより上述のようにｃＡＭＰ産生が抑制されているため、ＧＬＰ−１によるｃＡＭＰ依存性の［Ｃａ2+］i増加が抑えられていると考えられる。
【００７０】
図１０は、正常ウィスターラット（正常ラット）及び２型糖尿病ＧＫラットで、グレリン作用の濃度−反応曲線を比較した結果を示すグラフである。白丸は正常ラットを示し、黒丸は２型糖尿病ＧＫラットを示す。
縦軸はグレリン濃度０（−）を１００％とした際の、ＧＬＰ−１投与時の膵島β細胞［Ｃａ2+］iの増加率（％ ＧＬＰ−１−ｉｎｄｕｃｅｄ ［Ｃａ2+］i ｉｎｃｒｅａｓｅｓ）を示している。横軸は、グレリンの濃度（Ｇｈｒｅｌｉｎ（Ｍ））を示し、それぞれ０Ｍ（−）、１０-10Ｍ、１０-9Ｍ、１０-8Ｍ、１０-7Ｍを示す。
図１０の結果として、ＧＫラット膵島β細胞ではグレリンの反応性が亢進しており、グレリンの濃度−反応曲線が左方シフトしていることが分かる。これは、２型糖尿病ＧＫラットで、膵島β細胞のグレリン濃度に対する感受性が亢進していることを示している。
このため、２型糖尿病ＧＫラットは、内在性のグレリンを抑制することで、よりＧＬＰ−１によるインスリン分泌を促進できると考えられる。
【００７１】
以上のように、実施例８において、ＧＬＰ−１関連組成物は、膵島β細胞の細胞内のカルシウムイオン濃度［Ｃａ2+］iの増加によりインスリン分泌を促しているものの、これをグレリンが抑制することが分かる。
すなわち、ＧＬＰ−１関連組成物とグレリン阻害組成物を併用することで、ＧＬＰ−１による［Ｃａ2+］iの増加の抑制を除去し、よりインスリン分泌を促すことができる。すなわち、膵島β細胞のインスリン分泌促進・血糖降下の作用を得るために、ＧＬＰ−１関連組成物とグレリン阻害組成物を、従来より低い濃度にて用いることができるという効果が得られる。
これは、上述のｃＡＭＰ増強の作用と合わせて、ヒトの２型糖尿病の患者にも同様の効果があると考えられる。
【実施例９】
【００７２】
（正常ラットおよび２型糖尿病ＧＫラットの膵島ｍＲＮＡ発現量の測定）
５週齢の正常ウィスターラット（正常ラット）および２型糖尿病ＧＫラットから膵島をコラゲナーゼ消化法により分離し、膵島におけるメッセンジャーＲＮＡ発現量をＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ（タカラバイオ社製）を用いたリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ法により測定した。いくつかの膵島β細胞で発現している遺伝子について発現を調べた内の、カリウムチャネルの一つであるＫｖ２．１チャネル（遺伝子ＩＤ、ＮＭ＿０１３１８６．１、ｇｉ：５７７８５。プライマー配列は下記配列表の配列番号７（Ｐｒｉｍｅｒ ７）と配列番号８（Ｐｒｉｍｅｒ ８）とを使用）、コントロールのグレリン受容体（ＧＨＳ−Ｒ）（遺伝子ＩＤ、ＮＭ＿０３２０７５．３。プライマー配列は下記配列表の配列番号９（Ｐｒｉｍｅｒ ９）と配列番号１０（Ｐｒｉｍｅｒ １０）とを使用）の結果について示す。
図１１を参照して説明すると、縦軸は、正常ラット（Ｗｉｓｔａｒ）を１とした際の、膵島のメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の２型糖尿病ＧＫラットでの相対的発現量（Ｒｅｌａｔｉｖｅ ｍＲＮＡ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｉｓｌｅｔ）を示す。横軸は、それぞれＫｖ２．１チャネルと、ＧＨＳ−Ｒの結果について示す。２型糖尿病ＧＫラット膵島では、膵島β細胞グレリンシグナルを仲介するＫｖ２．１チャネルのｍＲＮＡ発現が亢進していた（ｐ＜０．０１）。すなわち、Ｋｖ２．１チャネルが膵島β細胞のインスリン分泌連関の生理的な抑制因子として機能していることが示唆される。
【００７３】
図１２の概念図を参照して、上述の結果について説明する。
正常ラットにおいては、膵島β細胞内へのグルコース濃度増加による刺激で、ＡＴＰ感受性カリウム（ＫＡＴＰ）チャネルが閉鎖され、膵島β細胞の細胞内のマイナス電位が低下する脱分極が起こる。この脱分極により、電位依存性カルシウム（Ｃａ）チャネルが開口し、細胞内にカルシウムイオン（Ｃａ2+）が流入することで、インスリンが分泌されると考えられている。ここで、ｃＡＭＰ産生量が増加すると、電位依存性カルシウム（Ｃａ）チャネルをさらに活性化し、またインスリンの放出過程を増強することがわかっている。図１２では、このようなグルコース刺激によるインスリンの分泌を増強する経路を実線の矢印で示している。
これに対して、Ｋｖ２．１チャネルの活性化は、細胞膜を再分極させて静止電位に戻すことで活動電位を抑制し、電位依存性カルシウムチャネルを介したカルシウムイオン流入およびインスリン分泌を抑制すると考えられる。グルコース代謝により、この系が抑制されると考えられる。
ここで、グレリンは、グレリン受容体（ＧＨＳ−Ｒ）とＧＴＰ結合タンパク質Ｇｉ２α２サブユニットを介したシグナルにより、Ｋｖ２．１チャネルを活性化する。これにより、細胞膜が再分極され、カルシウムイオン流入が抑制され、よってインスリン分泌を抑制すると考えられる。図１２では、このようなグレリンによるインスリン分泌に抑制する経路を点線の矢印で示している。
すなわち、Ｋｖ２．１チャネルの活動を阻害する組成物、例えば、クモ毒のＳｔｒｏｍａｔｏｘｉｎやｇｕａｎｇｘｉｔｏｘｉｎ−１Ｅといった化合物は、本発明の実施の形態に係るグレリン阻害組成物と同様に用いることができる。
つまり、本発明の実施の形態に係るＧＬＰ−１関連組成物とグレリン阻害組成物と同様に、ＧＬＰ−１関連組成物とＫｖ２．１チャネル阻害組成物を用いることができ、同様の効果を得ることができる。
なお、ヒトの２型糖尿病患者においても、Ｋｖ２．１チャネルの発現量が亢進していることが予備的な実験により分かっており、同様の効果が期待できる。
【実施例１０】
【００７４】
（２型糖尿病ＧＫラットへのグレリン阻害組成物の浸透圧ポンプによる持続投与）
本発明の実施の形態に係るグレリン阻害組成物であるグレリン受容体拮抗薬を２型糖尿病ＧＫラットへ浸透圧ポンプにより持続投与した際の血糖値の変化について測定した。具体的には、グレリン受容体阻害剤［Ｄ−Ｌｙｓ3］−ＧＨＲＰ−６を充填した浸透圧ミニポンプ（ａｌｚｅｔ社製）を６週齢の２型糖尿病ＧＫラットの背部皮下に埋め込み、その後、２８日間にわたり随時血糖値をグルコカードＤＩＡメーター（ＧｌｕｃｏＣａｒｄ ＤＩＡ ｍｅｔｅｒ、Ａｒｋｒａｙ社製）を用いて測定した。
図１３と図１４とを参照して、このグレリン受容体拮抗薬の浸透圧ポンプによる持続投与の結果について説明する。
図１３は、浸透圧ミニポンプの測定結果を示すグラフである。縦軸は血糖値（Ｂｌｏｏｄ ｇｌｕｃｏｓｅ ｍｇ／ｄｌ）を示し、横軸は埋め込み後の日数（Ｄａｙ ａｆｔｅｒ ｉｍｐｌａｎｔａｔｉｏｎ）を示す。また、グラフ中で、白丸は透圧ミニポンプが埋め込まれていないコントロール（Ｃｏｎｔｒｏｌ）、黒丸は浸透圧ミニポンプが埋め込まれている（［Ｄ−Ｌｙｓ3］−ＧＨＲＰ−６）、２型糖尿病ＧＫラットを示す。
この結果のように、２型糖尿病ＧＫラットへのグレリン受容体拮抗薬の浸透圧ポンプによる持続投与（３μｍｏｌ／ｋｇ／ｄａｙ）により高血糖が是正された。
【００７５】
図１４は、埋め込み後の血糖値の平均を示すグラフである。縦軸は平均の血糖値（Ａｖａｒａｇｅｄ Ｂｌｏｏｄ ｇｌｕｃｏｓｅ ｍｇ／ｄｌ）を示す。横軸は、浸透圧ミニポンプが埋め込まれていないコントロール（Ｃｏｎｔｒｏｌ）と浸透圧ミニポンプを埋め込んだ場合の結果（［Ｄ−Ｌｙｓ3］−ＧＨＲＰ−６）について示す。このように、グレリン受容体拮抗薬の浸透圧ポンプを体内に埋め込むことで、高血糖を是正することができる。すなわち、投与２８日間の平均随時血糖は、グレリン受容体拮抗薬の投与により有意に低下した。
これらの結果から、グレリン阻害組成物を、浸透圧ポンプにより持続投与することは２型糖尿病の治療に有効であることが分かる。これにより、血糖値を正常レベルに近づけた上で、さらに血糖値が高い場合に、通常の投与量よりも低いレベルのＧＬＰ−１関連組成物を併用することで、低血糖等の副作用を抑えて血糖値を下げることができると期待できる。
【実施例１１】
【００７６】
（２型糖尿病ＧＫラットへの糖負荷試験）
実施例３と同様に、２型糖尿病ＧＫラットへの糖負荷試験と、インスリン分泌との関係の測定を行った。具体的には、２型糖尿病ＧＫラットの腹腔内への糖負荷試験（ＩＰＧＴＴ）を行い、対象に急性の糖負荷をかけた際の内在性グレリン阻害組成物及び／又はＧＬＰ−１関連組成物の影響を調査するために、血糖値及びインスリン分泌の測定を行った。実験方法は、実施例３と同様であり、全ての実験群の２型糖尿病ＧＫラットには、一晩絶食させた後、１ｇグルコース／ｋｇ体重を腹腔内に投与し、その他の物質を投与しないコントロール（Ｃｏｎｔｒｏｌ）群、０．３μｍｏｌ／ｋｇ体重のグレリン阻害組成物である［Ｄ−Ｌｙｓ3］−ＧＨＲＰ−６を投与した群、０．３ｎｍｏｌ／ｋｇ体重のＧＬＰ−１を投与した群、０．３μｍｏｌ／ｋｇ体重の［Ｄ−Ｌｙｓ3］−ＧＨＲＰ−６及び０．３ｎｍｏｌ／ｋｇ体重のＧＬＰ−１を併用して投与した群の調査を行った。尾静脈より採血を行いグルコース濃度及びインスリン濃度をそれぞれ測定した。インスリン濃度の測定は、ＥＬＩＳＡキット（和光純薬工業（株）社製）を用い、グルコース濃度の測定は、グルコカードＤＩＡメーター（ＧｌｕｃｏＣａｒｄ ＤＩＡ ｍｅｔｅｒ、Ａｒｋｒａｙ社製）を用いた。
【００７７】
図１５（ａ）を参照して、２型糖尿病ＧＫラットの血糖値の測定例を示す。縦軸は、血糖値（ｍｇ／ｄｌ）について説明する。図３Ａと同様に、全ての実験群において糖負荷後３０〜６０分で各群の血糖値はピークに達した。そして、１２０分経過した時には、コントロールや内在性グレリン阻害組成物又はＧＬＰ−１関連組成物を各々単独で処方させた群よりも、内在性グレリン阻害組成物及びＧＬＰ−１関連組成物を併用して作用させた群は有意に血糖値が減少していた（Ｃｏｎｔｒｏｌ群に対してｐ＜０．０５）。すなわち、実施例３と同様に、ＧＬＰ−１関連組成物とグレリン阻害組成物を併用することで、それぞれを単独で使用した際には効果がない投与量で血糖値を下げることができる。
また、図１５（ｂ）を参照して、２型糖尿病ＧＫラットのインスリン分泌の測定例について説明する。縦軸は、インスリン分泌量（ｎｇ／ｍｌ）を示す。横軸は、経過時間（ｍｉｎ）を示す。図３Ｂと同様に、糖負荷後１５〜３０分で全ての群のインスリン分泌量は増加した。その中で、コントロールや内在性グレリン阻害組成物又はＧＬＰ−１関連組成物を各々単独で処方させた群よりも、内在性グレリン阻害組成物及びＧＬＰ−１関連組成物を併用して作用させた群において有意にインスリン分泌量が増加していた（Ｃｏｎｔｒｏｌ群に対してｐ＜０．０５）。実施例３と同様に、ＧＬＰ−１関連組成物とグレリン阻害組成物を併用することで、それぞれを単独で使用した際には効果がない投与量でインスリン分泌を増やし、これにより血糖値を下げることができると考えられる。
【００７８】
図１６（ａ）を参照して、図１５（ａ）に示した血糖値の血糖値０〜１２０分の曲線下面積について説明する。図１６（ａ）は、図１５（ａ）の実験群のグルコース投与０〜１２０分の曲線下面積（ＡＵＣ）を算出したグラフである。ＡＵＣ（Ａｒｅａ Ｕｎｄｅｒ Ｃｕｒｖｅ、血中濃度曲線下面積）は、薬物血中濃度−時間曲線下面積を示す数値である。すなわち、対象成分の血中濃度（Ｙ軸）と経過時間（Ｘ軸）のグラフの面積であり、図１６（ａ）の場合は血糖の量を示す。図１５（ａ）のグラフによると、グレリン阻害組成物０．３μｍｏｌ／ｋｇ、ＧＬＰ−１を０．３ｎｍｏｌ／ｋｇそれぞれ単独で与えても血糖値は下がらなかった。これに対して、グレリン阻害組成物とＧＬＰ−１とを併用した群ではｐ＜０．０５で有意に血糖値が低下した。このように、グレリン受容体阻害剤及びＧＬＰ−１を併用すると、それぞれの単独使用では作用を示さない用量を与えても、有意な血糖値低下作用を示すことが確認された。
図１６（ｂ）を参照して、図１５（ｂ）に示したインスリン値０〜３０分の曲線下面積について説明する。図１６（ｂ）は、図１５（ｂ）の実験群のグルコース投与０〜３０分の血漿インスリンの曲線下面積を産出したグラフである。図１５（ｂ）のグラフによると、グレリン阻害組成物０．３μｍｏｌ／ｋｇ、ＧＬＰ−１を０．３ｎｍｏｌ／ｋｇをそれぞれ与えても、血漿インスリン濃度はそれほど増加しなかった。これに対して、併用した群ではｐ＜０．０５で有意に血漿インスリン濃度が増加した。このように、グレリン受容体阻害剤及びＧＬＰ−１の各々単独作用を示さない用量を併用することで、有意な血漿インスリン分泌促進作用が確認された。
【００７９】
以上の実施の形態及び実施例で説明された構成、配置関係等については本発明が理解・実施できる程度に概略的にしたものにすぎない。
従って本発明は、説明された実施の形態及び実施例に限定されるものではなく、特許請求の範囲に示される技術的思想の範囲を逸脱しない限り様々な形態に変更することができる。
【００８０】
上述のように、従来、ＧＬＰ−１アナログおよびＤＰＰ４阻害剤は、従来の２型糖尿病治療薬（ＳＵ剤）に比べ、低血糖発作の副作用が少ない点で優れているが皆無ではなく、インスリン分泌促進・血糖降下作用は比較的弱いことが、これらの適用対象を狭めているという問題があった。
ＧＬＰ−１アナログはかなりの頻度で嘔吐などの副作用を起こす。このため、使用濃度を低下できれば副作用を解消することができると期待される。
また、上述の実施例で示したように、ＧＬＰ−１関連組成物とグレリン阻害組成物を併用することで、それぞれの組成物を単独で用いるよりもインスリン分泌を促進し、血糖降下を高めることができる。
また、ＧＬＰ−１関連組成物とグレリン阻害組成物を併用することで、ＧＬＰ−１アナログを低い臨床使用濃度でインスリン分泌促進・血糖降下作用が得られ、嘔吐、低血糖発作などの副作用を回避できる。
また、ＧＬＰ−１関連組成物とグレリン阻害組成物を併用することで、低濃度でインスリン分泌を向上させることができるため、膵島β細胞の保護を行う保護用の組成物として使用することも可能である。
また、ＧＬＰ−１関連組成物と内在性グレリン阻害組成物の併用により、各々単独で用いることに比べ、膵島β細胞のｃＡＭＰ産生が顕著に増強される。すなわち、ＧＬＰ−１関連組成物とグレリン阻害組成物の協同作用は、細胞内メカニズムとしても根拠がある。
また、ｃＡＭＰには膵島β細胞再生促進作用があるので、ＧＬＰ−１関連組成物と内在性グレリン阻害組成物を併用することにより、膵島β細胞の再生作用が増強され、β細胞数を低下させず二次無効をもたらさない、長期に渡り有効な２型糖尿病治療用の組成物として使用できる。
【００８１】
より具体的に説明すると、ＧＬＰ−１関連組成物の臨床応用は進んできているものの、副作用もまた問題になってきている。たとえば、ＧＬＰ−１分解酵素（ＤＰＰ４）阻害剤であるＳｉｔａｇｌｉｐｔｉｎ（シタグリプチンリン酸塩水和物錠、製品名：グラクティブ（登録商標）錠、及び、製品名：ジャヌビア（登録商標）錠、万有製薬社製）の市販直後調査の中間報告（２０１０年３月３日現在、小野薬品工業株式会社提供）によると、副作用が３４７例４６２件、重篤な副作用は３７例５２件あると報告されている。この副作用として、低血糖による意識障害、心不全、下痢等による死亡例も報告されている。
このように、ＧＬＰ−１関連組成物を用いた際に、副作用の出ない濃度で用いつつ、膵島β細胞のインスリン分泌を増進させることが求められている。
これに対して、本発明の実施の形態に係るＧＬＰ−１関連組成物と内在性グレリン阻害組成物の併用、又はＧＬＰ−１関連組成物とＫｖ２．１チャネル阻害組成物の併用により、投与量をより少なくして膵島β細胞のインスリン分泌を増進させることができる。
【００８２】
また、グレリン阻害剤においても、主として肥満症の治療が検討されてきており、その結果として肥満関連疾患である２型糖尿病の治療が期待されている。
しかしながら、上述のように、ＧＬＰ−１関連組成物とグレリン阻害剤を併用して使用すると、単に両方の薬剤の効果を合わせた以上の効果があることは当業者には予想できなかった。
すなわち、ＧＬＰ−１関連組成物とグレリン阻害剤、又はＧＬＰ−１関連組成物とＫｖ２．１チャネル阻害組成物の併用は、膵島β細胞を共通のターゲットとした糖尿病治療に有用である。
このＧＬＰ−１関連組成物とグレリン阻害剤、又はＧＬＰ−１関連組成物とＫｖ２．１チャネル阻害組成物の併用は、グレリン受容体活性による細胞内ｃＡＭＰ産生の抑制を取り払うもので、グレリンの濃度が高く膵島β細胞内ｃＡＭＰが低くグルコース刺激に応答しない状態になった２型糖尿病患者に効果が期待できる。
【００８３】
なお、上記実施の形態の構成及び動作は例であって、本発明の趣旨を逸脱しない範囲で適宜変更して実行することができることは言うまでもない。
【産業上の利用可能性】
【００８４】
本発明によれば、ＧＬＰ−１関連組成物とグレリン阻害組成物を併用することで、吐き気や低血糖等の副作用が少なく、それぞれの組成物を単独で用いるよりもインスリン分泌を促進する糖尿病治療／肥満治療用の組成物を提供することができる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＧＬＰ関連組成物とグレリン阻害組成物とを含有する
ことを特徴とする糖尿病及び／又は肥満を治療する組成物。
【請求項２】
前記糖尿病は２型糖尿病であり、前記ＧＬＰ−１関連組成物及び／又は前記グレリン阻害組成物は、成人における投与用量より低い濃度である
ことを特徴とする請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記グレリン阻害組成物及び前記ＧＬＰ−１関連組成物の併用により膵臓ランゲルハンス島β細胞のｃＡＭＰ産生量を増やす
ことを特徴とする請求項１又は２に記載の組成物。
【請求項４】
前記ＧＬＰ関連組成物がＧＬＰ−１である場合は、１日投与用量が０．１ｎｍｏｌ／ｋｇ体重〜０．３ｎｍｏｌ／ｋｇ体重であることを特徴とする請求項１乃至３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項５】
前記ＧＬＰ関連組成物がＧＬＰ−１アナログのＥｘｅｎａｔｉｄｅである場合は、成人における１日投与用量が１μｇ〜６μｇであることを特徴とする１乃至３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項６】
前記ＧＬＰ関連組成物がＧＬＰ−１アナログのＬｉｒａｇｌｕｔｉｄｅである場合は、成人における１日投与用量が０．１ｍｇ〜０．３ｍｇであることを特徴とする１乃至３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項７】
前記グレリン阻害組成物が［Ｄ−Ｌｙｓ3］−ＧＨＲＰ−６である場合に、１日投与用量は０．１μｍｏｌ／ｋｇ体重〜０．３μｍｏｌ／ｋｇ体重であることを特徴とする１乃至３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項８】
請求項１乃至７のいずれか１項に記載の組成物を含む、膵臓ランゲルハンス島β細胞の保護／再生促進組成物。
【請求項９】
請求項１乃至７のいずれか１項に記載の組成物を含む、膵臓ランゲルハンス島β細胞のｃＡＭＰ産生促進組成物。
【請求項１０】
ＧＬＰ関連組成物、及びグレリン阻害組成物又はＫｖ２．１チャネル阻害組成物のいずれかを含有する
ことを特徴とする糖尿病及び／又は肥満を治療する組成物。
【請求項１１】
前記Ｋｖ２．１チャネル阻害組成物は、Ｓｔｒｏｍａｔｏｘｉｎ又はｇｕａｎｇｘｉｔｏｘｉｎ−１Ｅである
ことを特徴とする請求項１０に記載の糖尿病及び／又は肥満を治療する組成物。
【請求項１】
ＧＬＰ関連組成物とグレリン阻害組成物とを含有する
ことを特徴とする糖尿病及び／又は肥満を治療する組成物。
【請求項２】
前記糖尿病は２型糖尿病であり、前記ＧＬＰ−１関連組成物及び／又は前記グレリン阻害組成物は、成人における投与用量より低い濃度である
ことを特徴とする請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記グレリン阻害組成物及び前記ＧＬＰ−１関連組成物の併用により膵臓ランゲルハンス島β細胞のｃＡＭＰ産生量を増やす
ことを特徴とする請求項１又は２に記載の組成物。
【請求項４】
前記ＧＬＰ関連組成物がＧＬＰ−１である場合は、１日投与用量が０．１ｎｍｏｌ／ｋｇ体重〜０．３ｎｍｏｌ／ｋｇ体重であることを特徴とする請求項１乃至３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項５】
前記ＧＬＰ関連組成物がＧＬＰ−１アナログのＥｘｅｎａｔｉｄｅである場合は、成人における１日投与用量が１μｇ〜６μｇであることを特徴とする１乃至３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項６】
前記ＧＬＰ関連組成物がＧＬＰ−１アナログのＬｉｒａｇｌｕｔｉｄｅである場合は、成人における１日投与用量が０．１ｍｇ〜０．３ｍｇであることを特徴とする１乃至３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項７】
前記グレリン阻害組成物が［Ｄ−Ｌｙｓ3］−ＧＨＲＰ−６である場合に、１日投与用量は０．１μｍｏｌ／ｋｇ体重〜０．３μｍｏｌ／ｋｇ体重であることを特徴とする１乃至３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項８】
請求項１乃至７のいずれか１項に記載の組成物を含む、膵臓ランゲルハンス島β細胞の保護／再生促進組成物。
【請求項９】
請求項１乃至７のいずれか１項に記載の組成物を含む、膵臓ランゲルハンス島β細胞のｃＡＭＰ産生促進組成物。
【請求項１０】
ＧＬＰ関連組成物、及びグレリン阻害組成物又はＫｖ２．１チャネル阻害組成物のいずれかを含有する
ことを特徴とする糖尿病及び／又は肥満を治療する組成物。
【請求項１１】
前記Ｋｖ２．１チャネル阻害組成物は、Ｓｔｒｏｍａｔｏｘｉｎ又はｇｕａｎｇｘｉｔｏｘｉｎ−１Ｅである
ことを特徴とする請求項１０に記載の糖尿病及び／又は肥満を治療する組成物。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【公開番号】特開２０１１−６４０３（Ｐ２０１１−６４０３Ａ）
【公開日】平成２３年１月１３日（２０１１．１．１３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−１２０７３１（Ｐ２０１０−１２０７３１）
【出願日】平成２２年５月２６日（２０１０．５．２６）
【出願人】（５０５２４６７８９）学校法人自治医科大学 (49)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２３年１月１３日（２０１１．１．１３）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年５月２６日（２０１０．５．２６）
【出願人】（５０５２４６７８９）学校法人自治医科大学 (49)
【Ｆターム（参考）】
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