組換えタンパク質および酵素技術のためのツールとしてのＳｌｐＡ
【課題】ＳｌｐＡシャペロンおよび標的ポリペプチドを含む融合タンパク質をコードする組換えＤＮＡ分子、および該融合タンパク質をコードする対応する発現ベクター、ならびに該発現ベクターで形質転換された宿主細胞の提供。
【解決手段】ＳｌｐＡシャペロンおよび標的ポリペプチドを含む組換え的に製造された融合タンパク質。イムノアッセイでの結合パートナーとしての、または干渉を低減するための手段としての該組換え的に製造された融合タンパク質の使用。
【解決手段】ＳｌｐＡシャペロンおよび標的ポリペプチドを含む組換え的に製造された融合タンパク質。イムノアッセイでの結合パートナーとしての、または干渉を低減するための手段としての該組換え的に製造された融合タンパク質の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＳｌｐＡシャペロンおよび標的ポリペプチドを含む融合タンパク質、これら融合タンパク質を組換え的に発現、精製および再フォールディングする方法、タンパク質および酵素バイオテクノロジーにおけるその使用、および特に診断におけるその応用に関する。さらに本発明は、バイオテクノロジー用途のための標的ポリペプチドまたは酵素の可溶性、活性、安定性および／またはフォールディングの可逆性を増大させることを意図した、ＳｌｐＡおよび標的ポリペプチドを含んでなるあらゆる複合体に関する。
【背景技術】
【０００２】
タンパク質フォールディングはネイティブな状態と未フォールディングの状態の間の微小なギブス自由エネルギーの差により駆動される自発的な現象である。構造がほとんど確定していないポリペプチド鎖は、フォールディングの過程において、タンパク質のネイティブなコンホメーションまたは三次構造と呼ばれる構造を選択していく。不完全にフォールディングされた分子の凝集は生成的なフォールディングと競合し、これは大きな問題となり、ｉｎ ｖｉｖｏおよびｉｎ ｖｉｔｒｏの両方でフォールディング収率に影響を及ぼす。生きた細胞では、フォールディングはヘルパータンパク質が支援する。フォールディングヘルパーは、他のタンパク質のフォールディングを支援し、その構造的完全性を維持するポリペプチドである。該ヘルパーはその標的ポリペプチド鎖と可逆的に相互作用することにより該標的の正しいフォールディングを促進する能力を有し、そのことにより凝集のような有害な副反応を防止する。これはｉｎ ｖｉｖｏでもｉｎ ｖｉｔｒｏでも起こり、バイオテクノロジーの諸課題において、こうしたフォールディングヘルパーの用途の数はかつてないほど増加している。一般にフォールディングヘルパーはフォールディング触媒とシャペロンに細分化される。
【０００３】
シャペロンは、変性した、部分的に変性した、または単純にそのままのポリペプチドの疎水性表面に可逆的に結合し、そのことによりタンパク質を復元する、またはタンパク質を溶解状態に保つことを支援する。シャペロンは、疎水性表面に可逆的に結合しそれをマスキングすることにより、凝集傾向のあるフォールディング中間体および凝集傾向のあるフォールディングされたタンパク質の濃度を下げる。つまり、シャペロンは、単純な結合機能を発揮している。対照的にフォールディング触媒（例えばジスルフィドオキシドレダクターゼおよびペプチジル−プロリルシス／トランスイソメラーゼ）はタンパク質フォールディングの律速工程を促進し、したがってフォールディング中間体の寿命を短縮する。フォールディング触媒は、その触媒機能により凝集傾向のあるフォールディング中間体の濃度を低下させる。フォールディング触媒の重要な一群のことをペプチジルプロリルシス／トランスイソメラーゼ（ＰＰＩアーゼ）と言う。
【０００４】
配列類似性、タンパク質位相幾何および免疫抑制分子の結合に基づき、プロリルイソメラーゼは、３つの異なるファミリー、すなわちシクロフィリン、パラブリンおよびＦＫ５０６結合タンパク質（すなわち頭字語ＦＫＢＰ）に分類される。ＦＫＢＰは、ＦＫ５０６、ラパマイシンおよび関連するマクロライド誘導体に結合してこれらにより阻害されるが、これらは免疫抑制剤としても使用されている。
【０００５】
大腸菌（E. coli）のペプチジルプロリルシス／トランスイソメラーゼのＦＫＢＰファミリーに属する推定上のフォールディングヘルパーはＳｌｐＡであり、ＳｌｐＡとは「ＳｌｙＤ様プロテインＡ」の頭字語である（Hottenrottら 1997, JBC 272/25, 15697-15701）。今日までの、ＳｌｐＡおよび大腸菌（E. coli）内でのその生理学的な役割に関する情報は不十分である。ＳｌｐＡの微弱なプロリルイソメラーゼ活性が報告されているが、このタンパク質はこれまでどちらかといえば不可解とされてきた。これまでに、ＳｌｐＡの物理化学的性質または考えられるシャペロン特性に関する情報は不足しており、大腸菌（E. coli）細胞質ゾルでのＳｌｐＡの機能は検討されたことすらない。
【０００６】
多くの診断用途では組換え的に製造されたタンパク質が結合パートナーとして、例えばある特定の免疫グロブリンアナライトの検出のために設計されたイムノアッセイにおける抗原として使用される。こうした抗原は、調べているサンプルまたはアッセイ混合物中に存在する特定の基を認識し、それに結合することが意図された標的部分または抗原性ポリペプチドを構成する部分を有する融合タンパク質として製造することができる。該組換え的に製造される融合タンパク質の他方の部分は、特異性を付与する抗原性部分に融合され、該タンパク質のクローニング、発現、過剰産生、フォールディング／再フォールディングおよび精製を容易にし、該タンパク質の溶解性、安定性またはフォールディングの可逆性を増大させるためのポリペプチド部分である。組換え的に製造された融合タンパク質の合成は従来技術に詳述されている。また、シャペロンを、標的ポリペプチドの発現、フォールディング、精製、可溶化および全体としての安定性の増大のための補助分子としての役割を果たす融合タンパク質の一部として使用するのが有利であることもよく知られている。
【０００７】
米国特許第6,207,420号はタンパク質の発現のための融合タンパク質システムであって、標的ポリペプチド部分と融合ペプチド部分のアミノ酸配列が異なる生物に由来するシステムを開示する。最近、ＦｋｐＡおよびＳｌｙＤが組換えタンパク質の製造において融合モジュールとして好適であることが示された。両種のシャペロンは、原核生物宿主内でのその対象タンパク質の発現速度を増大させ、正しい再フォールディングを助け、レトロウイルス膜貫通タンパク質のような極めて凝集傾向の強いタンパク質でさえも、全体としてのその可溶性を増大させる（Scholzら 2005, JMB 345, 1229-1241およびWO 03/000877）。
【０００８】
ＦｋｐＡおよびＳｌｙＤは、一方では取扱困難なまたは凝集傾向のあるタンパク質を助けて、診断試薬中で、より一般的にはバイオテクノロジー用途において、該タンパク質のネイティブな構造を維持するのに特に有用であるが、なおも熱安定性の問題は残されている。タンパク質のネイティブなコンホメーションは、ファン・デル・ワールス接触、水素結合、塩橋および疎水性相互作用の慎重にバランスされたネットワークにより安定化されている。こうした接触は対応するタンパク質の微小環境に最適化されており、ｐＨ、イオン強度または温度の変化は実際にフォールディングした分子および未フォールディング分子の間の平衡を乱しシフトさせる。温度の上昇はタンパク質を変性させるのに特に適しており、これは多くの場合、完全または部分的に未フォールディングの分子の凝集をもたらす。熱により誘発されるタンパク質凝集は機能の喪失を伴い、これはあらゆるタンパク質製剤について大きな問題となる。高温、より一般的には、熱ストレスが、タンパク質試薬または製剤の不適切な輸送または貯蔵中に生じ得ることは容易に想像できる。
【０００９】
ＳｌｙＤのようなシャペロン融合モジュールについては、約４２℃という温度で熱誘導性の逆フォールディング（アンフォールディング）の開始が見られる。これは、例えばタンパク質製剤の輸送、積込み、または貯蔵に使用されるコンテナの冷却機構に不具合が生じたときに、容易に超過される温度である。標的タンパク質Ｘが非常に疎水性であり、その融合パートナーのシャペロン活性に完全に依存する場合、完全な状態の融合ポリペプチドは、ＳｌｙＤモジュールが逆フォールディングされると直ちに凝集し、それと当時にその可溶化機能も失われる。言い換えると、Ｘが非常に疎水性であり凝集傾向の強い対象タンパク質の場合、ＳｌｙＤの安定性がＳｌｙＤ−Ｘ融合ポリペプチド全体の安定性を制限する。
【００１０】
ＦｋｐＡを含む融合タンパク質は若干高い安定性を示し、これは二量体型ＦｋｐＡキャリアーモジュールの固有の熱安定性が高いことに起因している可能性がある。大腸菌（E. coli）ＳｌｙＤの融解温度は約４２℃と決定されているが、これに対してＦｋｐＡは最大で約５０℃まで比較的安定である。しかしながら、以下に記載する理由により、高い固有の安定性を有する別の機能性シャペロン変異体を提供する緊急の必要性がなおもある。
【００１１】
二重抗原サンドイッチ（ＤＡＧＳ）フォーマットの異種イムノアッセイでは、例えばある抗原の２種の変異体をアッセイのそれぞれの側に使用する。一方の変異体は固相に対して親和性の高い標識を有し、他方の変異体はシグナル出力を生成するためのシグナリング部分を有する。この抗原変異体をそれぞれヘルパー配列、すなわちキャリアーまたは融合モジュールに融合させることができる。少なくとも１つのシャペロン（または機能性のポリペプチド結合ドメイン、すなわちシャペロンドメイン）が標的ポリペプチドに連結または融合され、フォールディングを促進し、安定性と溶解性を増大させ、標的ポリペプチドを適当なコンホメーションに保ち、このことにより決定すべき抗体アナライトは標的ポリペプチドを特異的に認識しそれに結合することができる。好ましくは、アッセイに固有の対称性を崩すために、免疫学的ブリッジアッセイのいずれの側にもそれぞれ異なるシャペロンを融合パートナーとして使用する。キャリアーまたは融合モジュールは異なるが、いずれの側（すなわち捕捉側および検出側）の標的ポリペプチドも同一または類似であるアッセイフォーマットのことも非対称ＤＡＧＳフォーマットと呼ぶことができる。ＤＡＧＳアッセイのそれぞれの側に異なる融合モジュールを使用することで、キャリアモジュールに起因する免疫学的交差反応およびそれに付随する誤った高いシグナルのリスクを大幅に低減することができる。
【００１２】
明らかに、アッセイ全体の安定性は、最も低い固有安定性を有する免疫学的成分によって制限される。非対称ＤＡＧＳにおいてＦｋｐＡおよびＳｌｙＤを融合パートナーとして使用すると、全体の安定性を制限する融合パートナーはＳｌｙＤである。したがって、完全に機能的にＳｌｙＤに取って代わることができ、かつ本質的に熱ストレスに対して内在的により安定な他のシャペロンを見出す必要がある。好熱性または超好熱性生物由来のＳｌｙＤホモログが多数記載されているが、単純にこうしたタンパク質を融合パートナーとして使用するには障害がある。こうしたタンパク質は６０℃よりも大幅に高い温度に最適化され進化したため、熱力学的安定性が極めて高い。その結果、安定および超安定なタンパク質は室温では比較的硬直的になる傾向があり、すなわち標的分子に動的に結合するための必須条件である柔軟性は失われる。タンパク質の安定性はその柔軟性と機能の両方と引き替えにしか高めることができないことは一般に受け入れられており、このことは多くの場合、高度に安定なタンパク質を室温で用いることを妨げる。したがって本発明の目的は、中等温度生物から熱安定なフォールディングヘルパーを同定することである。本発明のさらなる目的は、高い熱安定性を有し、診断試薬およびタンパク質製剤の貯蔵期間を延長する、診断およびバイオテクノロジー用途に適したポリペプチドを提供することである。
【００１３】
最近、Kwonら（BMB reports 2008, 41(2), 108-111）に報告されたとおり、いくつかの大腸菌（E. coli）タンパク質は、４９℃を大幅に超える温度でも安定であり可溶性である。高温に晒されても可溶性であったタンパク質がＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動により同定された。この研究は、種々の温度でインキュベートされた後の大腸菌（E. coli）の超音波処理抽出物を用いて行われた。同定された１７種の熱安定タンパク質のうち、６種のタンパク質（ＧｒｏＥＬ、ＧｒｏＥＳ、ＤｎａＫ、ＦｋｐＡ、トリガー因子、ＥＦ−Ｔｓ）が推定上のフォールディングヘルパーであった。特筆すべきこととして、この実験は大腸菌（E. coli）の無細胞溶解物を用いて行われ、それぞれのタンパク質の溶解性のみが安定性の評価基準とされた。
【００１４】
しかしながら、タンパク質の溶解性と安定性の間には、大きな違いがある。タンパク質の溶解性は、安定性が最大となる条件では多くの場合に最小値に達することは当技術分野では周知の事実である。例えば、あるタンパク質の熱力学的安定性は、バッファー溶液のｐＨが当該タンパク質のｐＩと一致するときに最大となる。にもかかわらず、まさにこの条件下では、タンパク質の溶解性は最小となる。別の一般的な例としては、硫酸アンモニウムまたは他のコスモトロピック物質によるタンパク質の塩析がある。この場合にも、タンパク質の安定性が増すと共にその溶解性は減少する（硫酸アンモニウムは強力なコスモトロピック物質であり、すなわちタンパク質構造を安定化させる）。
【００１５】
WO 2007/077008は、例えば大腸菌（E. coli）ＳｌｙＤのような非ヒトシャペロンのポリペプチド結合部分ならびにそのＮ末端およびＣ末端的に融合されたヒトＦＫＢＰ型ペプチジル−プロリル−シス／トランスイソメラーゼを含有する、組換え的に製造されたキメラ融合タンパク質を開示する。ＳｌｐＡのシャペロン部分を使用する類似の融合ポリペプチドも開示された。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１６】
【特許文献１】米国特許第6,207,420号
【特許文献２】WO 03/000877
【特許文献３】WO 2007/077008
【非特許文献】
【００１７】
【非特許文献１】Hottenrottら 1997, JBC 272/25, 15697-15701
【非特許文献２】Scholzら 2005, JMB 345, 1229-1241
【非特許文献３】Kwonら BMB reports 2008, 41(2), 108-111
【発明の概要】
【００１８】
驚くべきことに、ＳｌｐＡ、特に大腸菌（E. coli）ＳｌｐＡは、融合パートナーとして使用したときに、他の標的ポリペプチドに熱安定性を付与することができる。Hottenrottら（上掲）に報告されたように、ＳｌｐＡは比較的弱いペプチジル−プロリルシス／トランスイソメラーゼ活性を有する酵素である。予期せぬことに、ＳｌｐＡは顕著なシャペロン特性も示し、さらに驚くべきことに、ＳｌｐＡは高い固有の安定性を有し、融合された標的ポリペプチドに熱安定性を付与するため、標的ポリペプチドは熱誘導性凝集の影響を受けにくくなる。近い関係にあるＳｌｙＤは熱による逆フォールディングの中間点が約４２℃という若干の安定性を示すに過ぎないのに対して、ＳｌｐＡはその天然のフォールディングを少なくとも５０℃までは保ち、熱による逆フォールディングの中間点（融解温度と定義される）は約５６℃である。これはＳｌｙＤおよびＳｌｐＡが近い関係にあり（ＳｌｐＡはＳｌｙＤ様タンパク質の略称である）、両方が増殖の最高温度が４９℃である大腸菌（E. coli）のような中等温度生物由来の単量体タンパク質であることに照らすと不可解である。最も驚くべきことは、中等温度生物である大腸菌（E. coli）が、抜群の熱安定性とシャペロン特性を併せ持つＳｌｐＡのような推定上のフォールディングヘルパーを保有していることである。
【００１９】
発明の概要
本発明は、ＳｌｐＡシャペロンおよび標的ポリペプチドを含む融合タンパク質をコードする組換えＤＮＡ分子、および該融合タンパク質をコードする対応する発現ベクター、ならびに該発現ベクターで形質転換された宿主細胞に関する。本発明の別の態様は、該融合タンパク質の製造方法、ならびに、ＳｌｐＡシャペロンおよび標的ポリペプチドを含む組換え的に製造された融合タンパク質である。本発明のさらなる態様は、イムノアッセイでの結合パートナー（例えば抗原、酵素または組換え較正物質）としての、または干渉を低減するための手段としての組換え的に製造された融合タンパク質の使用である。さらに本発明は、標的ポリペプチドに対する抗体を製造するための免疫原としての該組換え的に製造された融合タンパク質の使用、およびワクチン製造での該組換え的に製造された融合タンパク質の使用に関する。また別の態様は、組換え的に製造された融合タンパク質を用いたイムノアッセイでのアナライトの検出方法、ならびにＳｌｐＡシャペロンおよび標的ポリペプチドを含む組換え的に製造された融合タンパク質を含有する試薬キットである。さらなる態様は、イムノアッセイにおける干渉および交差反応の低減のためのＳｌｐＡの使用に関する。本発明のさらなる態様は、バイオテクノロジー用途のための、ＳｌｐＡおよび標的タンパク質を含む可溶性であり機能性である複合体の使用に関し、このとき該標的タンパク質は治療または診断上価値のあるタンパク質であり得る。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】大腸菌（E. coli）由来ＳｌｐＡの近紫外ＣＤスペクトルを示す。スペクトルは温度自動調節されたセルホルダーを備えたJasco-720分光偏光計を用いて２０℃で記録した。タンパク質濃度は１ｃｍキュベット内で４１７μＭであった。バッファーは５０ｍＭリン酸カリウムｐＨ７．５、１００ｍＭ ＫＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡであった。バンド幅は２ｎｍであり、解像度は０．５ｎｍであり、スキャン速度は２秒の応答で５０ｎｍ／分であった。シグナル／ノイズ比を改善するために、スペクトルを９回記録し平均した。シグナルは平均残存楕円率（ｄｅｇ ｃｍ２ ｄｍｏｌ−１として示す）に変換した。スペクトルはネイティブ様のフォールディングされたタンパク質を示し、シグナル最大値は２６２ｎｍのときに得られる。
【図２】大腸菌（E. coli）由来ＳｌｙＤの近紫外ＣＤスペクトルを示す。スペクトルは温度自動調節されたセルホルダーを備えたJasco-720分光偏光計を用いて２０℃で記録した。タンパク質濃度は１ｃｍキュベット内で２００μＭであった。バッファーは５０ｍＭリン酸カリウムｐＨ７．５、１００ｍＭ ＫＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡであった。バンド幅は２ｎｍであり、解像度は０．５ｎｍであり、スキャン速度は１秒の応答で５０ｎｍ／分であった。シグナル／ノイズ比を改善するために、スペクトルを９回記録し平均した。シグナルは平均残存楕円率（ｄｅｇ ｃｍ２ ｄｍｏｌ−１として示す）に変換した。ＳｌｙＤのスペクトルはＳｌｐＡのスペクトルと著しく異なる。該スペクトルはネイティブ様のフォールディングされたタンパク質を示し、シグナル最大値は２７５ｎｍのときに得られる。
【図３】２７５ｎｍ（ＳｌｙＤ）および２６２ｎｍ（ＳｌｐＡ）における近紫外ＣＤによりモニタリングされるＳｌｙＤおよびＳｌｐＡの熱誘導性の逆フォールディング遷移を示す。融解曲線はネイティブな分子の画分に対して標準化されている。ＳｌｙＤおよびＳｌｐＡの両方の逆フォールディングは完全に可逆的であり、ネイティブな分子の近紫外ＣＤシグナルは、サンプルを周囲温度まで冷ますと、熱遷移後に完全に回復することが可能である。融解温度（すなわち分子の５０％がフォールディングされ５０％が未フォールディングである温度）はＳｌｙＤについては４２℃でありＳｌｐＡについては５６℃である。図３はＳｌｐＡの優れた熱安定性を明確に実証している。
【図４】ＳｌｐＡ−ｇｐ４１融合タンパク質の近紫外ＣＤスペクトルを示す。スペクトルは温度自動調節されたセルホルダーを備えたJasco-720分光偏光計を用いて２０℃にて記録した。タンパク質濃度は１ｃｍキュベットにて１８．７μＭであった。バッファーは５０ｍＭリン酸カリウム（ｐＨ７．５）、１００ｍＭ ＫＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡであった。バンド幅は２．０ｎｍであり、解像度は０．５ｎｍであり、スキャン速度は２秒の応答にて５０ｎｍ／分であった。シグナル／ノイズ比を改善するために、スペクトルを９回記録し平均した。シグナルを平均残存楕円率（ｄｅｇ ｃｍ２ ｄｍｏｌ−１として示す）に変換した。スペクトルはネイティブ様のフォールディングされたタンパク質を示す。２９３ｎｍにおけるシグナル最小値は、トリプトファン残基が豊富であり２８０ｎｍを超える光を吸収するネイティブ様にフォールディングされたｇｐ４１エクトドメイン断片を示す。２９０ｎｍ付近の波形はＳｌｐＡ−ｇｐ４１融合ポリペプチド内のｇｐ４１部分のネイティブ様フォールディングを明確に示す。
【図５】ＳｌｙＤ−ｇｐ４１融合タンパク質の近紫外ＣＤスペクトルを示す。スペクトルは温度自動調節されたセルホルダーを備えたJasco-720分光偏光計を用いて２０℃にて記録した。タンパク質濃度は１ｃｍキュベット内で１４．４μＭであった。バッファーは５０ｍＭリン酸カリウム（ｐＨ７．５）、１００ｍＭ ＫＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡであった。バンド幅は２．０ｎｍであり、解像度は０．５ｎｍであり、スキャン速度は２秒の応答にて５０ｎｍ／分であった。シグナル／ノイズ比を改善するために、スペクトルを９回記録し平均した。シグナルを平均残存楕円率（ｄｅｇ ｃｍ２ ｄｍｏｌ−１として示す）に変換した。２９３ｎｍにおけるシグナル最小値は、トリプトファン残基が豊富であり２８０ｎｍを超える光を吸収するネイティブ様にフォールディングされたｇｐ４１エクトドメイン断片を示す。２９０ｎｍ付近の波形はＳｌｙＤ−ｇｐ４１融合ポリペプチド内のｇｐ４１部分のネイティブ様フォールディングを強く示す。
【図６】ＳｌｙＤ−ｇｐ４１（図６Ａ）およびＳｌｐＡ−ｇｐ４１（図６Ｂ）の熱誘導性逆フォールディングを２７０ｎｍにおける円偏光二色性シグナルの減少によりモニタリングした。それぞれのシャペロン融合パートナーの逆フォールディングは可溶化能力の喪失と共に進行し、極めて疎水性であるｇｐ４１部分の自発的凝集につながる。凝集の開始温度はＳｌｙＤ−ｇｐ４１については約４０℃であり、ＳｌｐＡ−ｇｐ４１については約５６℃である。楕円率はミリ度（ｍｄｅｇ）で示し、（不可逆の）凝集が生じる臨界的温度境界を点線により強調する。
【図７】２８０ｎｍの近紫外ＣＤによりモニタリングしたＳｌｙＤ−ｇＧ１（２６−１８９）の熱誘導性の逆フォールディング遷移を示す。融合タンパク質の楕円率は温度の関数としてミリ度（ｍｄｅｇ）で示す。ＳｌｙＤ−ｇＧ１（２６−１８９）の逆フォールディングは大部分が可逆的であり、サンプルを周囲温度に冷ましたときに、ネイティブな融合ポリペプチドの近紫外ＣＤシグナルの大部分は回復する。ＳｌｙＤ−ｇＧ１（２６−１８９）の融解温度（すなわち分子の５０％がフォールディングされ５０％が未フォールディングである温度）は約５３℃である。
【図８】２２０ｎｍにて遠紫外ＣＤによりモニタリングしたＳｌｐＡ−ｇＧ１（２６−１８９）の熱誘導性の逆フォールディング遷移を示す。融合タンパク質の楕円率は温度の関数としてミリ度（ｍｄｅｇ）で示す。ＳｌｐＡ−ｇＧ１（２６−１８９）の逆フォールディングの大部分は可逆的であり、サンプルを室温まで冷ますとネイティブな融合ポリペプチドの遠紫外ＣＤシグナルの大部分は回復する。ＳｌｐＡ−ｇＧ１（２６−１８９）の融解温度（すなわち分子の５０％がフォールディングされ５０％が未フォールディングである温度）は約６３℃である。これはＳｌｙＤ−ｇＧ１（２６−１８９）と比較したときに、ＳｌｐＡ−ｇＧ１（２６−１８９）の熱安定性が優れていることを明確に実証する。
【図９】実施例４に記載の自動化Elecsys（登録商標）分析器での、ＳｌｐＡ−ｇＧ１（２６−１８９）およびＳｌｙＤ−ｇＧ１（２６−１８９）のヒト抗ＨＳＶ−１陽性および抗ＨＳＶ−１陰性血清との免疫学的反応性を示す。表１は、両方の抗原変異体の、過酷な一晩の６０℃での熱処理の前および後の性能を示す。実験の結果は、熱ストレスを施したＳｌｐＡ−ｇＧ１（２６−１８９）が熱ストレスを施したＳｌｙＤ−ｇＧ１（２６−１８９）よりも二重の意味で優れていることを明確に示す。第１に、抗ＨＳＶ−１陽性血清でのシグナル回復（表１の上半分）は熱ストレスを施したＳｌｐＡ融合ポリペプチドの方が顕著に高かった。第２に、抗ＨＳＶ−１陰性血清でのバックグラウンドシグナルの増加（表１の下半分）は、熱ストレスを施したＳｌｐＡ融合ポリペプチドの方が顕著に低かった。この両方の効果は、イムノアッセイのシグナル動態を改善し、ＳｌｐＡの、取扱困難な標的タンパク質に安定性と溶解性を付与する融合パートナーとしての利点を際立たせる。したがってイムノアッセイの感度は、ＳｌｐＡを、それと近い関係にあるＳｌｙＤの代わりに、融合パートナーとして使用することにより保証することができる。
【００２１】
配列表の簡単な説明
配列番号１は、SwissProtデータベース登録番号P0AEM0から取得した大腸菌（E. coli）ＳｌｐＡの完全アミノ酸配列（１４９アミノ酸）を示す：
【００２２】
配列番号２は、実施例の章に用いた、大腸菌（E. coli）ＳｌｐＡのアミノ酸配列（アミノ酸、セリン２〜グルタミン酸１４８）を示す。Ｎ末端メチオニンは大腸菌（E. coli）では翻訳と共に除去される。クローニングを容易にするために、Ｃ末端のアラニンも除いた。さらに、タンパク質の精製と再フォールディングを容易にするために、Ｃ末端にヘキサヒスチジンタグを付加した：
【００２３】
配列番号３は、大腸菌（E. coli）ＳｌｐＡ−ｇｐ４１のアミノ酸配列を示す。ｇｐ４１部分はＨＩＶ１ ｇｐ４１のアミノ酸５３６〜６８１を有し、ＳｌｐＡ部分はアミノ酸１〜１４６を有する。該配列は融合タンパク質の精製と再フォールディングを容易にするために付加したＣ末端のヘキサヒスチジンタグを有する：
【００２４】
配列番号４は、大腸菌（E. coli）ＳｌｐＡ−ＳｌｐＡ−ｇｐ４１のアミノ酸配列を示す。２つのＳｌｐＡ単位が、非常に凝集傾向の強い標的ポリペプチドであるＨＩＶ ｇｐ４１エクトドメインに連結されている。第１のＳｌｐＡ単位はアミノ酸１〜１４６を含み、第２のＳｌｐＡ単位はアミノ酸２〜１４９を含む（両方のＳｌｐＡ変異体は機能と安定性に関して完全に等価である）。融合タンパク質の精製と再フォールディングを容易にするために、Ｃ末端ヘキサヒスチジンタグを付加した：
【００２５】
配列番号５は、大腸菌（E. coli）ＳｌｙＤ−ｇｐ４１のアミノ酸配列を示す。該タンパク質の精製とｉｎ ｖｉｔｒｏでの再フォールディングを容易にするためにＣ末端ヘキサヒスチジンタグを付加した：
【００２６】
配列番号６は、大腸菌（E. coli）ＳｌｙＤ−ＳｌｙＤ−ｇｐ４１のアミノ酸配列を示す。２つのＳｌｙＤ単位が標的ポリペプチドｇｐ４１に融合されている。該タンパク質の精製とｉｎ ｖｉｔｒｏでの再フォールディングを容易にするためにＣ末端ヘキサヒスチジンタグを付加した：
【００２７】
配列番号７は、融合ポリペプチドＳｌｐＡ−ｇＧ１のアミノ酸配列を示す。１つのＳｌｐＡ単位が標的ポリペプチドｇＧ１（実施例４で使用したように、ヒト単純ヘルペスウイルスＨＳＶ−１抗原ｇＧ１のアミノ酸２６〜１８９を含む）に融合されている：
【００２８】
配列番号８は、融合ポリペプチドＳｌｙＤ−ｇＧ１のアミノ酸配列を示す。１つのＳｌｙＤ単位が標的ポリペプチドｇＧ１（実施例４で使用したように、ヒト単純ヘルペスウイルスＨＳＶ−１抗原ｇＧ１のアミノ酸２６〜１８９を含む）に融合されている：
【００２９】
配列番号９は、Swiss Prot ID: Q9CKP2による、パスツレラ・ムルトシダ（Pasteurella multocida）ＳｌｙＤのアミノ酸配列（全長）を示す：
【００３０】
配列番号10は、C末端を切断したシステイン不含のパスツレラ・ムルトシダ（Pasteurella multocida）ＳｌｙＤ変異体のアミノ酸配列を示す。好ましくはこれを、二重抗原サンドイッチイムノアッセイに使用するための融合タンパク質中のシャペロン単位（ＰｍＳ ＳｌｙＤ １−１５６）として使用する：
【００３１】
配列番号１１は、Swiss Prot ID P45523による大腸菌（E. coli）ＦｋｐＡのアミノ酸配列（全長）を示す：
【００３２】
配列番号１２は、二重抗原サンドイッチイムノアッセイに使用するための融合タンパク質中のシャペロン単位として好適に使用される大腸菌（E. coli）ＦｋｐＡのアミノ酸配列部分を示す。該配列はＮ末端シグナル配列（アミノ酸残基１〜２５）を欠き、成熟ＦｋｐＡ（ＦｋｐＡ ２６−２７０）に実質的に対応する：
【００３３】
配列番号１３はエプスタイン・バーウイルス核抗原１（ＥＢＶ核抗原１、すなわちＥＢＮＡ−１）の４０１〜６４１位、（ＥＢＶ＝ＨＨＶ−４＝ヒトヘルペスウイルス４）；株Ｂ９５−８のアミノ酸配列を示す。ＥＢＮＡ−１の完全アミノ酸配列は６４１残基からなり、Swiss Prot ID P03211として取得可能である。天然に存在するシステイン残基はＥＢＮＡ−１の抗原性には不要であり、精製工程を簡便にするため、およびネイティブ様のフォールディングされた可溶性タンパク質の収率を高めるために、アラニンに変更した（下線で示す）：
【００３４】
配列番号１４は、Swiss Prot ID P14348による、エプスタイン・バーウイルスタンパク質ｐ１８のアミノ酸１〜１７６（オープンリーディングフレームＢＦＲＦ３、ＨＨＶ−４／Ｂ９５−８）のアミノ酸配列を示す。アミノ酸５６位における天然に存在するシステイン残基はＥＢＶ ｐ１８の抗原性には不要であり、精製工程を簡便にするため、およびネイティブ様のフォールディングされた可溶性タンパク質の収率を高めるために、アラニンに変更した（下線で示す）：
【００３５】
配列番号１５は、Swiss Prot ID P14348による、エプスタイン・バーウイルスタンパク質ｐ１８のＣ末端部分、アミノ酸１０５〜１７６（オープンリーディングフレームＢＦＲＦ３、ＨＨＶ−４／Ｂ９５−８）のアミノ酸配列を示す：
【００３６】
配列番号１６は、Swiss Prot ID P03197による、エプスタイン・バーウイルスタンパク質ｐ２３のアミノ酸１〜１６２（オープンリーディングフレームＢＬＲＦ２、ＨＨＶ−４／Ｂ９５−８）のアミノ酸配列を示す。アミノ酸４６位における天然に存在するシステイン残基はＥＢＶ ｐ２３の抗原性には不要であり、精製工程を簡便にするため、およびネイティブ様のフォールディングされた可溶性タンパク質の収率を高めるために、アラニンに変更した（下線で示す）：
【００３７】
配列番号１７は、ＳｌｐＡおよび標的ポリペプチドを含む発現カセットのクローニングのために実施例１に使用し示した、グリシンリッチなリンカーペプチド配列Ｌ＝（ＧＧＧＳ）５ＧＧＧを示す：
【発明を実施するための形態】
【００３８】
発明の詳細な説明
本発明の一態様は、融合タンパク質をコードする組換えＤＮＡ分子であって、機能的に連結された、標的ポリペプチドをコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列と、その上流または下流にある、ＳｌｐＡシャペロン単位をコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列とを含む、組換えＤＮＡ分子である。
【００３９】
「組換えＤＮＡ分子」という用語は、２つの、別の状況では分離されている配列セグメントの連結により作製されるＤＮＡ分子を言い、該連結は遺伝子工学技術または化学合成によりポリヌクレオチドの単離された部分同士を人工的に操作することにより行われる。その際、所望の機能のポリヌクレオチドセグメントを一緒に連結させて、所望の機能の組み合わせを生み出すことができる。
【００４０】
ポリヌクレオチド配列は、それらが互いに機能的な関係に配置されるときに、機能的に連結されている。例えば、あるプロモーターがコード配列の転写または発現を制御するならば、このプロモーターは該コード配列に機能的に連結されている。一般に「機能的に連結された」とは、連結された配列が連続していることを意味し、必要であれば２つのタンパク質コード領域を連続かつリーディングフレームが揃うように一緒にすることを意味する。しかしながら、エンハンサーのような特定の遺伝的エレメントは離れていても、すなわち連続していなくても機能的に連結しうることが周知である。
【００４１】
「上流」および「下流」という用語は機能により定義され、コードヌクレオチド配列鎖の方向または極性について言う。「上流」方向とは、当該ヌクレオチドが所定のポリヌクレオチド配列の５’方向に位置する、すなわち開始ヌクレオチド方向に位置することを意味する。アミノ酸配列に関する「上流」という用語は、Ｎ末端方向、すなわちポリペプチド鎖の開始位置に向かう方向に位置するアミノ酸を意味する。好ましくは、ＳｌｐＡシャペロン単位をコードするヌクレオチド配列は、標的ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の上流に位置する。
【００４２】
「下流」方向とは、当該ヌクレオチドがポリヌクレオチドの３’方向に位置する、すなわちヌクレオチド配列の末尾方向に位置することを意味する。アミノ酸配列に関する「下流」という用語は、Ｃ末端方向、すなわちポリペプチド鎖の末尾方向に位置するアミノ酸を意味する。
【００４３】
ポリヌクレオチドは、そのネイティブな状態でまたは当技術分野で公知の手法により操作されたときに、該ポリヌクレオチドがヌクレオチド鋳型に転写され得るおよび／またはポリペプチドまたはその断片を生じるよう翻訳され得るときに、当該ポリペプチドを「コードする」または「コードしている」と言う。
【００４４】
本発明の別の態様は、機能的に連結された、標的ポリペプチドをコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列および、その上流または下流にある、ＳｌｐＡシャペロンをコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列を含む組換えＤＮＡ分子を含む発現ベクターである。
【００４５】
宿主に導入するために調製されたＤＮＡ構築物は、典型的にはその宿主により認識される複製システムを含み、これは所望の標的融合ペプチドをコードする意図されるＤＮＡ断片を含み、また、好ましくはポリペプチドコード部分に機能的に連結された転写および翻訳開始調節配列も含む。発現系（発現ベクター）には、例えば、複製起点または自己複製配列（ＡＲＳ）および発現制御配列、プロモーター、エンハンサーおよび必要なプロセシング情報部位、例えばリボソーム結合部位、ＲＮＡスプライシング部位、ポリアデニル化部位、転写終結配列、およびｍＲＮＡ安定化配列が含まれ得る。
【００４６】
適当なプロモーターおよび他の必要なベクター配列は、宿主内で機能するよう選択する。細菌、酵母、哺乳動物、昆虫、植物または他の細胞での発現に有用な多数のベクターが当技術分野で公知であり市販されている。さらに、遺伝子の複数コピーが得られるように、構築物を増幅可能な遺伝子に連結させることもできる。
【００４７】
発現およびクローニングベクターは多くの場合、選択マーカー、すなわち該ベクターで形質転換された宿主細胞の生存または増殖に必要なタンパク質をコードする遺伝子を含むが、かかるマーカー遺伝子は宿主細胞に共に導入される別のポリヌクレオチド配列が保有してもよい。該マーカー遺伝子を発現する宿主細胞のみが選択的条件下で生存および／または増殖する。典型的な選択遺伝子としては、限定するものではないが、（ａ）抗生物質もしくは他の有毒物質（例えばアンピシリン、テトラサイクリン、など）に対する耐性を付与するタンパク質、（ｂ）栄養要求性の欠乏症を補完するタンパク質、または（ｃ）複合培地からは得られない重要な栄養素を供給するタンパク質をコードする遺伝子が挙げられる。適当な選択遺伝子は宿主細胞に応じて選ばれ、種々の宿主について適当なマーカーが当技術分野で公知である。
【００４８】
対象のポリヌクレオチドを含むベクターは、当技術分野で既知のどのような方法により宿主細胞に導入してもよい。こうした方法は当該宿主系の種類に応じて異なり、塩化カルシウム、塩化ルビジウム、リン酸カルシウム、ＤＥＡＥ−デキストラン、および他の物質を用いたトランスフェクション、ならびにウイルスによる感染が挙げられるがこれに限らない。多量の本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチドは、適合可能な宿主細胞内でベクターまたは他の発現ビヒクル中の本発明のポリヌクレオチドを発現させることで調製することができる。最も一般的に用いられる原核生物宿主は大腸菌（Escherichia coli）の株であるが、枯草菌（Bacillus subtilis）のような他の原核生物を使用することもできる。
【００４９】
大腸菌（Escherichia coli）での発現は、本発明を実施する好ましい様式の一つである。少なくとも１つのＳｌｐＡ単位および少なくとも１つの標的ポリペプチドＸ単位を含む融合タンパク質の発現、または可溶性ＳｌｐＡ−Ｘ複合体を得るためのＳｌｐＡとＸの共発現は、ＳｌｐＡとＸが共有結合により連結されているか否かを問わず、原核生物でも真核生物宿主細胞でも実施可能である。
【００５０】
本発明におけるベクターの構築には慣用のライゲーション技術を用いる。単離されたプラスミドまたはＤＮＡ断片を切断し、調整し、所望の形態に再度ラーゲーションして、必要なプラスミドを作製する。所望であれば、構築されたプラスミド中に正しい配列があることを確認するための分析を公知の様式で行う。発現ベクターの構築、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写産物の調製、ＤＮＡの宿主細胞への導入、および発現と機能の評価の分析を実施するための好適な方法は当業者に知られている。遺伝子の存在、増幅および／または発現は、サンプルから直接測定することができる。これには例えば、適切に標識されたプローブ（本明細書に提供する配列に基づくものであり得る）を用いる、慣用のサザンブロッティング、ｍＲＮＡの転写を定量するためのノーザンブロッティング、ドットブロット（ＤＮＡまたはＲＮＡ分析）、またはｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションによる。当業者は所望であればこうした方法をどのように改変できるか、容易に想定することができる。
【００５１】
本発明のさらなる実施形態は、機能的に連結された、標的ポリペプチドをコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列、およびその上流または下流のＳｌｐＡシャペロンをコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列を含む組換えＤＮＡ分子を含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞である。
【００５２】
本発明の別の実施形態は、原核生物または真核生物宿主でのＳｌｐＡおよび標的ポリペプチドの共発現方法に関する。これにより過剰産生されるＳｌｐＡは標的ポリペプチドと相互作用して可溶性で非共有結合性の複合体を形成し、これがネイティブ様にフォールディングされ、かつ活性な標的ポリペプチドの調製を促進する。このことは、ＳｌｐＡおよび標的ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列が同じベクター中に配置され、同一または異なるプロモーターにより制御され得ることを意味する。あるいは、ＳｌｐＡおよび標的ポリペプチドをコードするＤＮＡ分子は、異なる適合性のベクター上に配置されていてもよい。ＳｌｐＡと標的ポリペプチドの同時発現のためには、宿主細胞を両方のベクターで形質転換する。好ましくは、標的タンパク質およびＳｌｐＡをコードする遺伝子は、異なる誘導物質に応答する異なるプロモーターにより制御される。したがって、ＳｌｐＡと標的タンパク質の誘導は、制御され規定された様式で同時にまたは連続して行うことができる。例えば、機能性のシャペロンの基底レベルをつくり出すためにまずＳｌｐＡ発現を誘導し、次いでその後、標的遺伝子の誘導を行うことができる。この連続的な手法とは別に、フォールディングヘルパーおよび標的ポリペプチドの同時誘導も可能であり、同様に可溶性で機能的な標的タンパク質を生じ得る。ＳｌｐＡおよび標的タンパク質をコードする遺伝子はそれぞれ、同一または異なるベクター上に配置され得る。
【００５３】
「融合タンパク質」という用語は、別の状況では分離されている２つのポリペプチドが単一のポリペプチド鎖に機能的に結合されていることを意味する。該融合タンパク質のそれぞれの要素、すなわちＳｌｐＡシャペロン部分および標的ポリペプチド部分（標的ポリペプチドＸとも言う）は、互いに直接隣接していてもよい。あるいは、それぞれの要素は１〜１００アミノ酸残基、好ましくは５〜３０アミノ酸残基、最も好ましくは約２０アミノ酸残基のリンカーにより隔てられている。当業者が理解するように、かかるリンカーポリペプチドは、意図する用途に最適となるように、特に長さ、柔軟性、電荷および親水性を考慮して、設計される。リンカーポリペプチド配列はまた、タンパク質分解的な切断部位を有しうる。場合により、融合タンパク質は、フォールディングが行われるべき所望の区画へとタンパク質を標的化するためのシグナルペプチド配列をも含み得る。
【００５４】
本発明によると、２以上の標的ポリペプチドＸ、例えば２つ、３つまたは４つの標的ポリペプチドのコピーが融合タンパク質の一部を構成してもよい。一例として、ＳｌｐＡ−Ｘ２とは、１つのＳｌｐＡ単位が２つのＸ型の標的ポリペプチド単位に融合していることを意味する。単一の標的ポリペプチド単位は、リンカーポリペプチド部分により離れていてもいなくてもよい。該融合タンパク質は少なくとも１つのＳｌｐＡシャペロン単位を含有する。同様に、タンデム、３重またはさらに高次の組み合わせ（例えばＳｌｐＡ−ＳｌｐＡ−ＸまたはＳｌｐＡ−ＳｌｐＡ−ＳｌｐＡ−Ｘ）により、融合タンパク質が構成されていてもよい。同様に、標的ポリペプチドが少なくとも２つのシャペロン単位により挟まれている融合タンパク質（例えばＳｌｐＡ−Ｘ−ＳｌｐＡまたはＳｌｐＡ−ＳｌｐＡ−Ｘ−ＳｌｐＡ−ＳｌｐＡ）も本発明の一部である。
【００５５】
ＳｌｐＡはＦＫＢＰファミリーの推定上のペプチジルプロリルシス／トランスイソメラーゼである。SwissProt 登録番号P0AEM0として公開されている大腸菌（E. coli）ＳｌｐＡアミノ酸配列を配列番号１に示す。
【００５６】
本発明において、「ＳｌｐＡシャペロンをコードするヌクレオチド配列」という用語は、ＳｌｐＡのポリペプチド結合部分を含むポリペプチド断片をコードするヌクレオチド配列を言う。シャペロンの「ポリペプチド結合部分」という用語は、シャペロンの結合能のある部分、すなわち対象または基質ポリペプチド鎖に結合しそれを保持し、したがって該ポリペプチド鎖を隔離して凝集傾向のあるフォールディング中間体の濃度を低減し、その後のフォールディングを促進する部分を言う。ＳｌｐＡの「ポリペプチド結合部分」のことをＩＦドメイン（ｉｎｓｅｒｔ ｉｎ ｆｌａｐ ｄｏｍａｉｎ）とも呼ぶ。自律的なフォールディング単位と定義されるタンパク質ドメインは、適切な再フォールディング条件下で水溶液中でネイティブ様の安定なフォールディングをとることができる。「ポリペプチド結合部分」、「ＩＦループ」、ＩＦドメインまたはシャペロンドメインという用語は、同意語として使用することができる。
【００５７】
本発明の「ＳｌｐＡ」または「ＳｌｐＡシャペロン」または「ＳｌｐＡ単位」は、ＳｌｐＡのポリペプチド結合部分またはＩＦドメインを含む。好ましくは、大腸菌（E. coli）ＳｌｐＡ分子全体を融合パートナーとして使用する。あるいは、ＳｌｐＡ ＩＦドメインを融合パートナーとして用いる。これはＮ末端が配列番号２のアミノ酸番号５９〜７８に位置する任意のアミノ酸から開始され、Ｃ末端が配列番号２のアミノ酸番号１２５〜１３９に位置する任意のアミノ酸で終わる断片を少なくとも含む。最も好ましいのは、Ｎ末端が配列番号２のアミノ酸番号７２（バリン７２）で開始され、Ｃ末端が配列番号２のアミノ酸番号１３２（トレオニン１３２）で終了するポリペプチドをコードする配列である。本発明によれば、ＳｌｐＡはこのシャペロンの成熟した非ヒト化形態を言う。これは、ＳｌｐＡシャペロンが、ＦＫＢＰ１２またはどのような他のヒトＦＫＢＰのＮ末端もしくはＣ末端隣接配列をも有しないことを意味する。
【００５８】
本発明によれば、プロリルイソメラーゼとシャペロン活性の組み合わさった、他の生物由来のＳｌｐＡシャペロンホモログをフォールディングヘルパーとして使用することができる。かかるＳｌｐＡホモログは以下の生物に由来し得る（Swiss ProtデータベースＩＤ番号を括弧内に示す）：シゲラ・フレキシネリ（Shigella flexneri）（Prot. ID. P0AEM3）、シゲラ・ソネイ（Shigella sonnei）（Prot. ID Q3Z5Y2）、志賀赤痢菌（Shigella dysenteriae）（Prot. ID Q32K69）、シトロバクター・コセリ（Citrobacter Koseri）（Prot. ID A8ALT4）、チフス菌（Salmonella typhi）（Prot. IDQ8XG79）、ネズミチフス菌（Salmonella typhimurium）（Prot. ID Q7CR92）、パラチフス菌（Salmonella paratyphi）AおよびB（Prot. ID Q5PKI5およびA9MYG7）、サルモネラ・コレラスイス（Salmonella choleraesuis）（Prot. ID Q57TL3）、肺炎桿菌（Klebsiella pneumoniae）（Q9RF46）、サルモネラ・アリゾナエ（Salmonella arizonae）（Prot. ID A9MR44）、エンテロバクター属種（Enterobacter sp.）（Prot. ID A4W6E3）、エンテロバクター・サカザキ（Enterobacter sakazakii）（A7MIM1）、セラチア・プロテアマキュランス（Serratia proteamaculans）（Prot. ID A8G9L6）、ペスト菌（Yersinia pestis）（Prot. ID Q8CZP4またはQ0WJI9）、仮性結核菌（Yersinia pseudotuberculosis）（Prot. ID A7FMD5）、エルシニア・エンテロコリチカ（Yersinia enterolitica）（A1JJE3）、エルウィニア・カロトボーラ（Erwinia carotovora）（Prot. ID Q6D0C5）、フォトラブダス・ルミネッセンス（Photorabdus luminescens）（Prot. ID Q7N8X0）、ソダリス・グロッシニジウス（Sodalis glossinidius）（Prot. ID Q2NVY4）、イディオマリナ・バルチカ（Idiomarina baltica）（Prot. ID A3WMS1）、ビブリオ・ハーベイ（Vibrio harveyi）（Prot. ID A6ATG3またはA7MTD8）、ビブリオ・バルニフィカス（Vibrio vulnificus）（Prot. ID Q7MNM6またはQ8DES9）、ビブリオ・カンプベリー（Vibrio campbellii）（Prot. ID A8T7R0）、ビブリオ・シロニイ（Vibrio shilonii）（Prot. ID A6D8Q3）、ビブリオ・スプレンディダス（Vibrio splendidus）（Prot. ID A3UXQ8）、イディオマリナ・ロイヒエンシス（Idiomarina loihiensis）（Prot. ID Q5QZR6）、ビブリオ・アルギノリティカス（Vibrio alginolyticus）（Prot. ID Q1V5T9）、アエロモナス・サルモニシダ（Aeromonas salmonicida）（Prot. ID A4SIX7）、フォトバクテリウム属種（Photobacterium sp.）（Q2C7V1）、ビブリオ・パラヘモリティカス（Vibrio parahaemolyticus）（Prot. ID Q87S88またはA6B565）、シュードアルテロモナス・アトランティカ（Pseudoalteromonas atlantica）（Prot. ID Q15R06）、コレラ菌（Vibrio cholerae）（Prot. ID A5F8X4、もしくはQ9KU45、もしくはA6Y5H7、もしくはA6XZU4、もしくはA6ADB4、もしくはA6A5W5、もしくはA3H4C9、もしくはA3GPA9、もしくはA3EG01、もしくはA2PSS5、もしくはA2P8T9、もしくはA1F6Q8）、アエロモナス・ヒドロフィラ（Aeromonas hydrophila）（Prot. ID A0KG41）、ビブリオ・アングスタム（Vibrio angustum）（Prot. ID Q1ZMQ4）、モリテーラ属種（Moritella sp.）（Prot. ID A6FG75）、シュードアルテロモナス・ハロプランクティス（Pseudoalteromonas haloplanktis）（Prot. ID Q3IEA0）、アルテロモナデールス・バクテリウム（Alteromonadales bacterium）（Prot. ID A0Y1B2）、サイクロモナス・イングラハミー（Psychromonas ingrahamii）（Prot. ID A1SZP1）、ビブリオ・フィシェリィー（Vibrio fischeri）（Prot. ID Q5E7N2 またはA9IPH0）、フォトバクテリウム・プロファンダム（Photobacterium profundum）（Prot. ID Q1Z378またはQ6LUK9）、シュードアルテロモナス・チュニカータ（Pseudoalteromonas tunicata）（Prot. ID A4C627）、サイクロモナス属種（Psychromonas sp.）（Prot. ID Q1ZHS3）、レイネカ属種（Reineka sp.）（Prot. ID A4BJL0）、ビブリオ・サイクロエリサス（Vibrio psychroerythus）（Prot. ID Q486T8）、シュワネラ・アマゾネンシス（Shewanella amazonensis）（Prot. ID A1S427）、シュワネラ属種（Shewanella sp.）（Prot. ID Q0HFZ1、もしくはQ0HS84、もしくはA0KZY9）、シュワネラ・ペアレアナ（Shewanella pealeana）（Prot. ID A8H1H5）、シュワネラ・フリジディマリナ（Shewanella frigidimarina）（Prot. ID Q07Z37）、シュワネラ・デニトリフィカンス（Shewanella denitrificans）（Prot. ID Q12KM6）、シュワネラ・ロイヒカ（Shewanella loihica）（Prot. ID A3QBX4）、およびシュワネラ・プトレフェーシェンス（Shewanella putrefaciens）（Prot. ID A4Y4A6）。
【００５９】
本発明によれば、ＳｌｐＡシャペロン配列は、ＳｌｐＡシャペロンの全体的な構造、機能および安定性が維持されるならば、アミノ酸置換、好ましくは相同性の置換、欠失および挿入により改変されていてもよい。かかるＳｌｐＡ変異体の機能の保持は、調べている標的ポリペプチドおよびＳｌｐＡシャペロン配列を含む融合タンパク質の融解温度を決定することにより容易に試験することができる。融解温度は、５０％の分子がフォールディングされ、５０％の分子が未フォールディングである温度と定義される。すなわち融解温度は、所定のバッファー系と所定のタンパク質濃度での熱誘導性の逆フォールディング遷移の中間点を表す。芳香族残基の含有量に応じて、タンパク質の融解温度を、ＵＶ吸収、蛍光または円偏光二色性のような単純な分光学的調査によりモニタリングすることができる。特に円偏光二色性は、タンパク質の二次構造（アミドＣＤまたは遠紫外ＣＤ）におけるかまたは三次構造（芳香族ＣＤまたは近紫外ＣＤ）におけるコンホメーション変化をモニタリングするのに適している。
【００６０】
近紫外ＣＤにより評価されるＳｌｐＡの熱誘導性の逆フォールディングからは、逆フォールディング過程が完全に可逆的であること、すなわちサンプルが９５℃から周囲温度、つまり１５〜２５℃まで冷却されるとＳｌｐＡが自発的にそのネイティブなコンホメーションに再び戻ることが明らかにされている。このフォールディングと逆フォールディングの可逆性は、バイオテクノロジー用途における理想的なフォールディングヘルパーにとって極めて重要な前提条件である。多くの場合、組換え融合タンパク質は、強く過剰産生されると大腸菌（E. coli）細胞質内で封入体として蓄積する。この場合、７．０Ｍ塩化グアニジンもしくは尿素のような他のカオトロピック物質に溶解された細菌細胞または封入体から出発して、強力で効果的な再生プロトコルを構築する必要がある。所望の対象タンパク質のｉｎ ｖｉｔｒｏでの再フォールディングを助けるには、どのようなシャペロン融合パートナーの再フォールディングも、十分に強固、効果的、そして可逆的でなければならないことは自明であろう。従来技術で公知の多数の融合パートナー、例えばＮｕｓＡ、ＭＢＰ（マルトース結合タンパク質）およびＧＳＴ（グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ）は、宿主細胞内で翻訳されるとき非常に強力なｄｅ ｎｏｖｏフォールディングを示すが、熱または化学的に誘導される逆フォールディング後は容易に再フォールディングすることができない。したがってこうした融合パートナーは、宿主系内での標的タンパク質の可溶性の発現を目的として使用される。該融合パートナーが、宿主細胞内での翻訳に際して、ｄｅ ｎｏｖｏフォールディング中に対象タンパク質に溶解性を付与することができないと、凝集した融合タンパク質をｉｎ ｖｉｔｒｏ再生手段により回収することは困難になる。本発明によれば、ＳｌｐＡのような完全に可逆性の融合パートナーは、宿主細胞でのｄｅ ｎｏｖｏフォールディングに際して可溶性タンパク質の産生をもたらすことから、明確な利点を有する。さらにＳｌｐＡは、そのフォールディング可逆性ゆえに、宿主細胞での大量過剰産生により不溶性の封入体として蓄積した融合ポリペプチドのｉｎ ｖｉｔｒｏ再フォールディングを助けるために使用することができる。本発明によれば、逆フォールディングの完全な可逆性と高い固有安定性および実質的なシャペロン特性との組み合わせは、融合パートナーの重要な前提条件である。ＳｌｐＡはこうした基準を完全に満たす。
【００６１】
本発明によれば、ＳｌｐＡシャペロンをコードする１以上、好ましくは２つのヌクレオチド配列が標的ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の上流に配置され、その結果、２つの隣接するＳｌｐＡ単位を含むタンデムＳｌｐＡシャペロンが生じる。ＳｌｐＡシャペロンをコードするこの１以上のヌクレオチド配列は、１〜１００アミノ酸のペプチドリンカーを（インフレームで）コードするヌクレオチド配列により隔てられていてもよい。この２つのＳｌｐＡシャペロン単位をコードするに当たり、異なるヌクレオチド配列を用いることができる。同様に、融合ポリペプチド内の他の全ての高度に反復的なエレメント、例えばリンカーまたはスペーサー部分をコードするに当たり異なるヌクレオチド配列を用いるべきである。こうしたヌクレオチド配列は、大腸菌（E. coli）宿主での意図しない組換えイベントに起因するＳｌｐＡコード配列の喪失を避けるために、縮重しているべきである。同一または繰り返しのアミノ酸配列について異なるコドンを慎重に選択することにより、発現カセットの安定性を保証することができる。
【００６２】
本発明の「標的ポリペプチド」は、溶解性または安定性が制限されており、好適ではない条件下で凝集する傾向があり、フォールディングヘルパーによる補助または支援を必要とするどのようなポリペプチドであってもよく（すなわちどのようなアミノ酸配列を有してもよい）、ただしＦＫ５０６結合タンパク質（ＦＫＢＰ）、特にヒトＦＫ５０６結合タンパク質は標的ポリペプチドから除外される。これはヒトＦＫＢＰ１２のようなＦＫ５０６結合タンパク質が標的ポリペプチドから除外されることを意味する。好ましい実施形態では、凝集傾向を示しかつ／または熱ストレスに感受性であるポリペプチドを標的ポリペプチドとして用いることができる。さらに、酵素活性のあるポリペプチドは本発明における好ましい標的ポリペプチドである。特に、疎水性基質を受容しターンオーバーさせる酵素（したがって該酵素自身が疎水性表面パターンを有する）は本発明における好ましい標的ポリペプチドである。さらなる好ましい実施形態では、細菌性またはウイルス性タンパク質またはプリオンタンパク質または関節リウマチに関連するタンパク質を標的ポリペプチドとして使用する。
【００６３】
哺乳動物病原体のどのような構造的、膜会合型、膜結合型、または分泌型の遺伝子産物を標的ポリペプチドとして用いてもよい。哺乳動物病原体としては、哺乳動物宿主に感染するかまたは寄生することのできるウイルス、細菌、単細胞または多細胞寄生生物が挙げられる。例えば、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、ワクシニアウイルス、ポリオウイルス、アデノウイルス、インフルエンザウイルス、Ａ型肝炎ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、デングウイルス、日本脳炎ウイルス、水痘帯状疱疹ウイルス、サイトメガロウイルス、エプスタイン・バーウイルス、ロタウイルス、ならびに麻疹、黄熱病、流行性耳下腺炎、狂犬病、ヘルペス、インフルエンザ、パラインフルエンザなどを引き起こすウイルスなどのウイルスに由来するポリペプチドを、本発明の融合タンパク質での標的ポリペプチドとして使用することができる。例えばコレラ菌（Vibrio cholerae）、チフス菌（Salmonella typhi）、梅毒トレポネーマ（Treponema pallidum）、ヘリコバクター・ピロリ菌（Helicobacter pylori）、百日咳菌（Bordetella pertussis）、肺炎連鎖球菌（Streptococcus pneumoniae）、ヘモフィルス・インフルエンザエ菌（Haemophilus influenzae）、破傷風菌（Clostridium tetani）、ジフテリア菌（Corynebacterium diphtheriae）、ハンセン菌（Mycobacterium leprae）、リケッチア・リケッチイ（R. rickettsii）、赤痢菌（Shigella）、淋菌（Neisseria gonorrhoeae）、髄膜炎菌（Neisseria meningitidis）、コクシジオイデス・イミティス（Coccidioides immitis）、ボレリア・ブルグドルフェリ（Borrelia burgdorferi）などに由来する細菌性タンパク質を標的ポリペプチドとして使用することができる。
【００６４】
本発明の方法により好ましく製造される標的ポリペプチドのさらなる例としては、酵素、サイトカイン、増殖因子、ホルモン、ワクチン、抗体などの哺乳動物遺伝子産物が挙げられる。より詳細には、本発明の好ましい過剰発現遺伝子産物としては、エリスロポエチン、インスリン、ソマトトロピン、成長ホルモン放出因子、血小板由来増殖因子、上皮成長因子、トランスフォーミング増殖因子α、トランスフォーミング増殖因子、上皮増殖因子、線維芽細胞増殖因子、神経成長因子、インスリン様増殖因子Ｉ、インスリン様増殖因子ＩＩ、凝固因子ＶＩＩＩ、スーパーオキシドジスムターゼ、インターフェロン、γ−インターフェロン、インターロイキン−１、インターロイキン−２、インターロイキン−３、インターロイキン−４、インターロイキン−５、インターロイキン−６、顆粒球コロニー刺激因子、多分化コロニー刺激因子、顆粒球マクロファージ刺激因子、マクロファージコロニー刺激因子、Ｔ細胞増殖因子、リンホトキシンなどの遺伝子産物が挙げられる。好ましい過剰発現遺伝子産物はヒト遺伝子産物である。
【００６５】
診断用途において、例えば測定対象のアナライトが抗体であるときには、標的ポリペプチドは測定対象の抗体により認識される少なくとも１つのエピトープを有する。このようなエピトープは、診断に関連するエピトープとも呼ばれる。本発明の標的ポリペプチドはまた、単一の組換えポリペプチドとして発現されるように構築された複数の異なるタンパク質由来の診断に関連するエピトープのような配列を含みうる。好ましくは、標的ポリペプチドは長さが１０〜５００アミノ酸である。
【００６６】
最も好ましくは、標的ポリペプチドは、ＨＩＶ−１由来のｇｐ４１およびｐ１７、ＨＩＶ−２由来のｇｐ３６およびｐ１６、ＨＴＬＶ−Ｉ／ＩＩ由来のｇｐ２１のようなレトロウイルスタンパク質からなる群、ルベラウイルス由来のＥ１およびＥ２のようなウイルスエンベロープタンパク質からなる群、またはβ−ＡＰ４２（アルツハイマーペプチド）もしくはプリオンタンパク質のようなアミロイド生成性タンパク質からなる群のメンバーである。
【００６７】
また、単純ヘルペスウイルス１由来の糖タンパク質Ｇ１および単純ヘルペスウイルス２由来の糖タンパク質Ｇ２も、標的ポリペプチドとして好ましい。より正確には、これらに対応する、シグナル配列および膜貫通領域を欠いた糖タンパク質断片（ｇＧ１ ２６−１８９、ｇＧ２ ３４３−５９４）は好適な標的ポリペプチドである。
【００６８】
標的ポリペプチドとしてさらに好ましいのは、ヒトサイトメガロウイルス由来の以下のタンパク質およびタンパク質断片である：ｐｐ２８（１５−１７９）、ｐｐ１５０（８２１−１０４８）、ｐｐ１５０（５４７−７２５）、ｐｐ１５０（４９５−８５４）、ｐ３８（１０５−３０８）、ｐ３８（１０５−３７３）、ｐ３８（２０９−３０８）、ｐ５２（２５４−２９３）、ｐ５２（２９５−３３０）、ｐ５２（２９８−４３３）、ｇＢ（６７−８４）、ｐｐ６５（３７２−５４９）、およびｐｐ６５（３７２−４５８）。
【００６９】
また、トレポネーマ・パリダム（Treponema pallidum）由来の以下のタンパク質およびタンパク質断片も好ましい：ＴｐＮ１７（２３−１５６）、ＴｐＮ４７（２１−４３４）、ＴｐＮ１５（２３−１４２）、ＴｍｐＡ（２３−３４５）、およびＴｐＯ４５３（２７−２８７）。大腸菌（E. coli）宿主での発現時の細胞質への局在化を確実にするために、これらのトレポネーマ抗原全種のシグナル配列は除去されている。
【００７０】
さらなる好ましい標的ポリペプチドは、ボレリア由来の以下のタンパク質およびタンパク質断片である：内在的フラジェリン断片ｐ４１ｉ（１３７−２６２）、ＶｌｓＥ（ＩＲ６／Ｃ６）、ＤｂｐＡ（２６−１７５）、ＯｓｐＢ（１７−２９６）、およびＯｓｐＣ（１９−２１４）。
【００７１】
さらなる好ましい標的ポリペプチドはエプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）由来のタンパク質であり、例えば配列番号１３に示すＥＢＶ核抗原１（ＥＢＮＡ−１）、配列番号１４および１５にそれぞれ示すｐ１８のポリペプチドおよび断片、ならびに配列番号１６に示すｐ２３に由来するポリペプチドである。
【００７２】
こうした標的ポリペプチドはいずれも、ＳｌｐＡシャペロンに融合されたときに、アナライト（例えば標的ポリペプチドに対する抗体）の検出のための結合パートナーとしてイムノアッセイにおいて使用することができ、または以下に詳述するイムノアッセイにおける標準または較正用物質として使用することができる。
【００７３】
本発明のさらなる実施形態は、融合タンパク質の製造方法であって、以下のステップ：
（ａ）標的ポリペプチドをコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列、およびその上流または下流にあるＳｌｐＡシャペロンをコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列を含む宿主細胞を培養するステップ、
（ｂ）該融合タンパク質を発現させるステップ、
（ｃ）該融合タンパク質を精製するステップ、および
（ｄ）該融合タンパク質を可溶性かつネイティブ様のまたは免疫反応性（すなわち抗原性）のコンホメーションに再フォールディングさせるステップ
を含む方法である。この方法により製造される融合タンパク質も本発明の一態様である。
【００７４】
本発明の融合タンパク質は高い溶解性を示す。これらは細胞質ゾルにて低速で過剰発現されると主に可溶性画分に蓄積される。細胞増殖および誘導の条件に応じて、特に強力に過剰発現されると、ＳｌｐＡ−Ｘ遺伝子産物は封入体内に蓄積することもある。通常、当業者は可溶性の標的ポリペプチドを大腸菌（E. coli）細胞質ゾルにて過剰発現させようとする。次いで細胞を超音波処理またはリゾチーム／ＥＤＴＡを併用した処理により破壊し、推定上のネイティブ様フォールディングされた標的タンパク質を可溶性画分から分離する。これはＳｌｐＡ−Ｘ融合タンパク質について実行可能であり、標的ポリペプチドＸが十分に高い固有溶解性を有する場合には可溶性物質がもたらされる。標的ポリペプチドＸが非常に疎水性であり凝集傾向が強い場合には、マトリックス支援再生アプローチにてＳｌｐＡの効果的で強力な再フォールディング特性を利用する別の方法を用いることができる。細胞は適切なバッファー条件下、例えばカオトロピック物質（これらには強力な変性作用があり、疎水性の細胞成分や封入体でさえも可溶化させるが、ただし構造的完全性は犠牲にされる）中で溶解される。融合タンパク質がヘキサヒスチジン部分でＮ末端またはＣ末端にタグ付けされている場合、それらは未フォールディング状態でも金属含有カラム（Ｎｉ−ＮＴＡまたはＺｎ２＋またはＣｕ２＋担体）に特異的に結合することができる。固相に固定化されると、該分子は適切なバッファー条件下で容易にそして効率的に再フォールディングする。このいわゆるマトリックス支援再生（多種の取扱困難なタンパク質の再フォールディング収率を増大されることが示されている）は共有結合したＳｌｐＡにより強力に支援されるが、該ＳｌｐＡはそのシャペロン特性ゆえにフォールディング中間体中の疎水性パッチを認識しそれを可逆的にマスキングすると考えられる。実施例にて詳述する適切な精製および再フォールディングプロトコルは当業者に周知である。
【００７５】
本発明のさらなる態様はＳｌｐＡおよび標的ポリペプチド配列を含む任意の複合体に関し、これにはＳｌｐＡを任意のタンパク質製剤に添加することも含まれる。本発明のさらなる態様は、ＳｌｐＡに対応する少なくとも１つのポリペプチド配列および標的ポリペプチドに対応する少なくとも１つのポリペプチド配列を含む組換え的に製造された融合タンパク質に関する。本発明のさらなる態様は、単独での、または組換えもしくは合成起源の標的ポリペプチドとの組み合わせでの、合成的に製造されたＳｌｐＡに関する。
【００７６】
本発明によれば、ＳｌｐＡシャペロンは融合パートナーとして使用されたときに取扱困難な標的ポリペプチドの熱安定性を向上させることができる。ＳｌｐＡは、融合された標的ポリペプチドに熱安定性を付与し、このことにより実施例に示すように標的ポリペプチドは熱誘導性凝集の影響を受けにくくなる。大腸菌（E. coli）ＳｌｙＤに融合された非常に凝集傾向の強い標的タンパク質を熱ストレスに曝すと、得られる融合タンパク質は約４２℃で熱誘導性の凝集を開始するが、この温度はＳｌｙＤの固有安定性と概ね一致する。同じ標的タンパク質をＳｌｐＡ、好ましくは大腸菌（E. coli）ＳｌｐＡに融合させると、これは約５６℃まで安定であり可溶性である。例えば、ＳｌｙＤおよびＨＩＶタンパク質ｇｐ４１（配列番号５）由来の断片５３６−６８１を有する融合タンパク質は温度４２℃にて凝集し始めるのに対して、本発明にしたがい大腸菌（E. coli）ＳｌｐＡ（配列番号３）に融合された同じ標的タンパク質は５０℃を超える温度でも熱安定である。融合タンパク質の一部としてのＳｌｐＡは取扱困難なまたは凝集傾向の強いタンパク質を熱誘導性変性に続く凝集から保護することが見て取れる。
【００７７】
ＳｌｐＡの融合体が、さほど凝集傾向の強くないタンパク質またはタンパク質断片に対しても有益な効果を発揮することも見て取れる。ＨＳＶ−１由来の糖タンパク質Ｇ１の断片であるｇＧ１（２６−１８９）をＳｌｙＤに融合させると、得られる融合タンパク質は大部分が可逆的な様式で熱により逆フォールディング可能であり、このとき融解温度は約５３℃である（図７）。しかしながら、同じ断片をＳｌｐＡに融合させると、得られる融合タンパク質は約６３℃という熱誘導逆フォールディングの中間点温度を示す（図８）。明らかにｇＧ１融合ポリペプチドの安定性は、融合パートナーとしてＳｌｙＤをＳｌｐＡに置き換えると、１０℃ほどシフトする。この知見は、ＳｌｐＡ−Ｘ融合ポリペプチドがそのＳｌｙＤ−Ｘ対応物と比較して優れた安定性特性を有することを明確に実証している。
【００７８】
ＳｌｐＡ融合ポリペプチドのこのような優れた安定性特性がイムノアッセイにも反映されるか否かを明らかにするために、ＳｌｙＤ−ｇＧ１およびＳｌｐＡ−ｇＧ１の熱チャレンジされたサンプルを、抗ＨＳＶ陽性および陰性ヒト血清（実施例４）と共に用いて、熱ストレス後に回復するその免疫応答性に関して評価した。ストレスを加えていないサンプルと比較すると、明確な結果が観察された（実施例４および図９を参照されたい）：熱処理されたＳｌｙＤ−ｇＧ１およびＳｌｐＡ−ｇＧ１と抗ＨＳＶ陽性血清とにより生じるシグナルは全ての事例において減少したが、シグナル喪失はＳｌｙＤ融合変異体について大幅に顕著であった。逆に、熱処理されたＳｌｙＤ−ｇＧ１およびＳｌｐＡ−ｇＧ１と抗ＨＳＶ陰性血清とにより生じるバックグラウンドシグナルは全ての事例において増加した（ルテニウムコンジュゲート化抗原の凝集が進行していることを示す）が、やはりシグナル高の増加はＳｌｙＤ融合変異体の方が大幅に顕著であった。したがって該陽性および陰性血清の両方におけるシグナル出力から（すなわちシグナル動態に鑑みて）、ＳｌｐＡはｇＧ１（２６−１８９）のための融合パートナーとしてＳｌｙＤに明らかに勝る。明らかに、ＳｌｙＤの代わりにＳｌｐＡを融合パートナーとして用いることは、陰性血清における低いシグナルレベルおよび陽性血清における高いシグナル回復の両方を保証する。手短に述べると、ＳｌｐＡを融合パートナーとして用いることは、免疫グロブリンアナライトの検出用のポリペプチド抗原を含有するイムノアッセイキットを過酷な処理に供した後でさえも、その抜群のシグナル動態を保証する。十分に長くかつ柔軟な架橋物質（標準的な化学的手法による）を介して標的分子と共有結合しているＳｌｐＡまたは関連するシャペロンモジュールが、類似の可溶化効果を示すことは容易に想定できる。融合ポリペプチドが実現可能でない場合には、シャペロンと標的分子を別々に製造して再フォールディングさせ、その後共有結合により連結させる。
【００７９】
本発明のさらなる態様は、ＳｌｐＡシャペロンおよび標的ポリペプチドを含む、組換え的にまたは合成的に製造された融合タンパク質の、イムノアッセイにおける結合パートナーとしての使用に関する。イムノアッセイならびに種々の同種および異種成分試験フォーマットは当業者に周知である。これらは当業者に知られている任意の生物学的液体について実施することができる。好ましいサンプルは全血、血清、血漿、尿または唾液などの体液である。
【００８０】
ＳｌｐＡおよび少なくとも１つの標的ポリペプチドを含む本発明の融合ポリペプチドは、標準または較正用物質としても使用することができる。ＳｌｐＡは、イムノアッセイにおいて較正用物質として必要な扱いにくいタンパク質についても好適な融合パートナーである。例えば、本発明者らはＳｌｐＡと融合したトロポニンＩ変異体（残基１〜２０９を含む）をクローニングし、発現させ、精製した。得られた融合ポリペプチドＳｌｐＡ−トロポニンＩは可溶性であり免疫反応性であることが明らかになり、トロポニンＩイムノアッセイにおける標準較正物質として非常に適切であった。ＳｌｐＡ融合パートナーのために、トロポニンＩ部分の安定性は、単離されたトロポニンＩ（わずかにしか安定ではなく、好適なバッファー条件下でさえも自発的に凝集する）と比較して大幅に向上している。可溶性で安定な較正物質または標準物質を製造するための、取扱困難なタンパク質と組み合わせたＳｌｐＡの使用は、本発明のさらなる実施形態である。さらなる態様は、標的タンパク質の凝集を防ぎその溶解性を改善するための、ＳｌｐＡの添加物としての使用である。
【００８１】
本発明のさらなる実施形態は、単離されたサンプル中のアナライトに特異的な抗体の検出方法であって、以下のステップ：
（ａ）体液サンプルを、ＳｌｐＡシャペロンに対応する少なくとも１つのポリペプチドおよび標的ポリペプチドに対応する少なくとも１つのポリペプチドを含む融合タンパク質と混合することにより免疫反応性混合物を形成させるステップ、
（ｂ）該体液サンプル中に存在するアナライトに対する抗体が該融合タンパク質と免疫反応するのに十分な時間、該免疫反応性混合物を維持して、免疫反応生成物を形成させるステップ、ならびに
（ｃ）該免疫反応生成物のいずれかの存在を検出するステップ
を含む方法である。
【００８２】
好ましい実施形態において、特定の抗体の検出は、いわゆる二重抗原サンドイッチ試験（ＤＡＧＳ；ブリッジ試験とも言う）により行うことができる。この試験は、測定対象の当該特定の抗体アナライトが２つの同一または類似の抗原の間にブリッジを形成する異成分系フォーマットである。このフォーマットはハイスループット自動化分析器に容易に応用することができる。より詳細には、測定対象の抗体は、固相への固定化を仲介する第１抗原と、そして標識（すなわちシグナリング部分、例えば発色性、蛍光性、化学発光性、電気化学発光の標識または当業者に公知の他の標識）を有する第２抗原と、免疫複合体または免疫反応生成物を形成し、このことにより液体と固相の分離後に特異的に結合した抗体を定量的または定性的に検出することができる。したがって、調べている抗体がサンプル中に存在する場合にのみブリッジが形成され、シグナルが検出される。このようなアッセイフォーマットでは本発明の融合タンパク質を結合パートナーとして使用することができ、このとき固相に結合した抗原もしくは標識化抗原、またはその両方が大腸菌（E. coli）ＳｌｐＡシャペロンおよび標的ポリペプチドを含む融合タンパク質である。標的ポリペプチドは融合タンパク質の抗原性部分を構成する。
【００８３】
本発明の好ましい実施形態は、特定の抗体の検出のためのいわゆる非対称二重抗原サンドイッチ試験であり、ここではそれぞれがシャペロンと標的ポリペプチドを含む第１融合タンパク質および第２融合タンパク質を使用する。このフォーマットのことを非対称と呼ぶのは、両方の融合タンパク質のシャペロン単位が互いに異なるからである。例えば、第１融合タンパク質は、少なくとも１つのＳｌｐＡシャペロン単位および少なくとも１つの標的ポリペプチド単位を含むことができ、固相への特異的結合を仲介する部分、例えばストレプトアビジンコーティングされた固相に結合するビオチンを含むこともできる。第２融合タンパク質は、ＳｌｐＡとは異なる少なくとも１つのシャペロン単位および第１融合タンパク質の標的ポリペプチドと同一または類似の少なくとも１つの標的ポリペプチド単位を含み得る。さらに、後者の融合タンパク質はシグナル出力のためのシグナリング部分またはレポーター基を有し得る。
【００８４】
好ましくは、第２融合タンパク質のシャペロン単位も周囲温度で十分な固有柔軟性を有する（すなわち動的結合活性が高い）熱安定性のシャペロンである。第２融合タンパク質のシャペロン単位として好適な候補は、例えばＦｋｐＡ（融解温度約５０℃）およびパスツレラ・ムルトシダ（Pasteurella multocida）由来のＳｌｙＤオルソログのＣ末端切断型（システイン不含）変異体（融解温度約４９℃）である。この両種のシャペロンのアミノ酸配列（融合タンパク質中で好ましくはシャペロン単位として使用される完全配列および部分配列）を配列番号９〜１２に示す。第１および第２融合タンパク質のシャペロン単位は交換可能であり、すなわちＳｌｐＡが第２融合タンパク質の一部であってもよく、この場合、他方の熱安定性シャペロン（例えばＦｋｐＡまたはパスツレラ・ムルトシダ（Pasteurella multocida）のＳｌｙＤオルソログ）が第１融合タンパク質の一部であり得る。第１および第２融合タンパク質は、特定の抗体アナライトについて検査中のサンプルに同時にまたは連続的に加える。サンプル中に存在する場合に抗体は第１および第２融合タンパク質の標的ポリペプチド単位に結合し、そのことにより該第１および第２融合タンパク質の標的ポリペプチド部分を架橋し、免疫反応生成物または免疫複合体が生じる。
【００８５】
免疫複合体の形成の前、後、またはそれと同時に、マイクロビーズまたはＥＬＩＳＡプレートのような固相を作用させ、それにより第１融合タンパク質が固相に結合する。その結果、前記第１融合タンパク質、検出対象の抗体および前記第２融合タンパク質を含む免疫反応生成物（すなわち免疫複合体）全体が固相に結合する。固相の液相からの分離後に、免疫反応生成物の存在を検出することができる。別の方法として、第１融合タンパク質中に存在するシャペロン単位が第２融合タンパク質のためのシャペロン単位として利用可能であり、その逆もまた可能である。しかしながら、シャペロン単位は好ましくは両種の融合タンパク質において異なっているべきである。なぜなら、サンプル中のこれらのシャペロンに対する抗体の存在に起因する融合タンパク質の非アナライト特異的架橋の（予期しない）可能性があるからである。別の方法として、アッセイのいずれの側にも同一のシャペロン融合パートナーを用いる特異性の高いＤＡＧＳイムノアッセイも実施可能である。この場合、アッセイの開発者は、使用する融合パートナーに対する抗体がヒト血清のかなりの部分に存在する可能性が高いことを考慮しなければならない。こうした抗体はシグナリングポリペプチドを固相に架橋し、シグナルを増大させ、したがって偽陽性結果を生じる可能性がある。そのような干渉を回避するためには、融合パートナー（すなわちシャペロン単位）を、高度に多量体化されかつ未標識の形態でサンプルに抗干渉物質として加える。抗干渉物質は、融合パートナー、リンカー部分、スペーサーおよびタグ配列ならびに純正の抗原の一部ではないあらゆる他の部分に対する免疫グロブリンを効率的に捕捉するように設計する。化学的に多量体化された（すなわち架橋された）抗干渉物質は、その高いエピトープ密度ゆえに、抗シャペロン抗体の結合に関して標識化された融合ポリペプチドと効率的に競合することができる。このようにして望ましくない特異性の免疫グロブリンに起因する干渉を好適に信頼できる様式で排除することができる。体液などのあらゆる生物学的液体をサンプルとして使用することができる。好ましくは、血液、血清、血漿、尿または唾液を使用する。
【００８６】
標識基またはシグナリング基は、あらゆる公知の検出可能マーカーの群、例えば色素、発光標識化基、例えば化学発光基、例えば、アクリジニウムエステルもしくはジオキセタン、または蛍光色素、例えば、フルオレセイン、クマリン、ローダミン、オキサジン、レゾルフィン、シアニンおよびその誘導体から選択することができる。標識基の他の例は、発光金属錯体、例えばルテニウムもしくはユーロピウム錯体、例えばＥＬＩＳＡに用いる酵素、または放射性同位体である。
【００８７】
免疫複合体または免疫反応生成物の固相への結合は、例えばビオチンとストレプトアビジンのような生物学的に関連のある結合ペアの片方のパートナーを用いて行うことができる。好ましくは、ビオチンが本発明の融合タンパク質にカップリングされている。このビオチン・融合タンパク質コンジュゲートは、ストレプトアビジンコーティングされた固相に高い親和性で結合する。
【００８８】
アナライトの例はいずれも「標的ポリペプチド」の章において記載した病原因子およびこうした病原因子に対する抗体である。例えば本発明によれば、好ましくは、ＨＩＶ（ヒト免疫不全ウイルス）、ＨＴＬＶ−１／ＨＴＬＶ−ＩＩ（ヒトＴ細胞リンパ球向性ウイルスＩおよびＩＩ）、ＨＣＶ（Ｃ型肝炎ウイルス）、ＨＢＶ（Ｂ型肝炎ウイルス）、ＨＡＶ（Ａ型肝炎ウイルス）、ＨＣＭＶ（ヒトサイトメガロウイルス）、ＨＳＶ−１／−２（単純ヘルペスウイルス１型および２型）、ＥＢＶ（エプスタイン・バーウイルス）、水痘帯状疱疹ウイルス、ヒトヘルペスウイルス６、ヒトヘルペスウイルス７、ヒトヘルペスウイルス８、ルベラウイルス、トレポネーマ・パリダム（Treponema pallidum）、ヘリコバクター・ピロリ（Helicobacter pylori）、ボレリア（ボレリア・ブルグドフェリ（B. burgdorferi）、ボレリア・アフゼリー（B. afzelii）、ボレリア・ガリーニー（B. garinii））、トリパノソーマ・クルージィ（Trypanosoma cruzi）、およびトキソプラズマ原虫（Toxoplasma gondii）に対する抗体が特異的に検出可能である。
【００８９】
本発明のさらなる実施形態は、アナライトに対する抗体の検出用の試薬キットであり、該キットは標的ペプチドに対応する少なくとも１つのポリペプチド配列およびＳｌｐＡに対応する少なくとも１つのポリペプチド配列を有する融合タンパク質を含有する。かかる試薬キットのさらなる構成要素は当業者に知られており、バッファー、保存剤、標識物質および使用説明書などが挙げられる。
【００９０】
本発明のさらなる実施形態としては、組換え的にまたは合成的に製造された本発明の融合タンパク質の、イムノアッセイにおける干渉の低減のための使用、ならびに実験動物の免疫およびワクチンの製造のためのその使用が挙げられる。
【００９１】
本発明の別の実施形態は、ＳｌｐＡに対応する少なくとも１つのポリペプチド配列および標的ペプチドに対応する少なくとも１つのポリペプチド配列を含む、組換え的にまたは合成的に製造された融合タンパク質ならびに製薬上許容される賦形剤を含んでなる組成物に関する。
【００９２】
本発明によれば、ＳｌｐＡは、それを精製された形態で標的ポリペプチドに加えることにより、標的ポリペプチドのフォールディングヘルパーとして使用可能であり、これはＳｌｐＡを安定化または可溶化物質として任意のタンパク質製剤に加えることも包含する。例えば、ＳｌｐＡおよびペプチジルプロリルシス／トランスイソメラーゼのＦＫＢＰファミリー由来の関連フォールディングヘルパーを標的ポリペプチドのバイオテクノロジー的製造工程中にまたはその後に添加することができ、このことにより標的ポリペプチドに可溶性または熱安定性が付与される。かかるバイオテクノロジー用途としては、例えば酵素、インスリンのようなペプチドホルモン、またはより一般的には商用価値のあるタンパク質の工業的大規模生産が挙げられる。
【００９３】
本発明のさらなる実施形態において、ＳｌｐＡは、偽陽性結果を生じる免疫学的交差反応または干渉を低減または抑制するために、イムノアッセイ、特に二重抗原サンドイッチイムノアッセイフォーマットにおいて添加物として使用可能である。
【００９４】
より詳細には、イムノアッセイにおいて、ＳｌｐＡ−ＸまたはＳｌｐＡ−ＳｌｐＡ−Ｘ融合タンパク質を免疫グロブリンアナライトの検出のための抗原として用いることができ、このときＸはアナライト特異的抗体が結合する標的ポリペプチドである。干渉を低減するためにＳｌｐＡまたはＳｌｐＡ−ＳｌｐＡを抗干渉物質として添加し、シャペロン単位を介した免疫学的交差反応を回避する。好ましくは、エピトープ密度を高め、ＩｇＧおよびＩｇＭ分子のＳｌｐＡ、リンカー部分またはヘキサヒスチジンタグに対する結合を助けるために、ＳｌｐＡまたはＳｌｐＡ−ＳｌｐＡは、化学的に多量体化された形態で添加する。
【００９５】
ＳｌｐＡは標的分子に可溶性と安定性を付与するが、それは、当該特定の標的分子以外の他の部分または基と同様に、対応するイムノアッセイの特異性を低下させる免疫学的交差反応を引き起こし得る。この特異性の問題を克服するために、未標識のＳｌｐＡまたはＳｌｐＡ−ＳｌｐＡを、多量体化された形態でイムノアッセイ試薬中に提供する。このＳｌｐＡまたはＳｌｐＡ−ＳｌｐＡポリペプチドは、ＳｌｐＡ単位自身、任意のリンカーまたはスペーサーセグメント、ヘキサヒスチジンまたは他のタグモチーフおよびさらには標識部分など、不活性化形態でも交差反応を引き起こす可能性のあるすべてのエレメントを含む。こうした潜在的に干渉傾向のあるモチーフは、化学的架橋ゆえに、高いエピトープ密度で交差反応性抗体に供され、こうした潜在的に干渉性の抗体に結合しそれを中和するのに適している。この抗干渉効果以外にも、ＳｌｐＡまたはＳｌｐＡ−ＳｌｐＡ多量体はさらなる有利な効果を有し得る。すなわち、高度に多量体性のシャペロンであることから、これらはどのような固相表面の疎水性表面（例えばビーズ、マイクロタイタープレートおよびチューブまたは容器壁面）にも吸着可能であると考えられ、したがって必須の免疫学的成分の非特異的吸着を低減させる。さらに、これらは、そのシャペロン特性ゆえに他の免疫学的成分の溶解性にも寄与する可能性があり、これは多量体化された形態でさらに顕著であり得る。
【実施例】
【００９６】
本願発明を実施例によりさらに説明する。
【００９７】
実施例１
ＳｌｐＡおよびＳｌｙＤ融合ポリペプチドのクローニングと精製
発現カセットのクローニング
Novagen社（Madison, WI, USA）のｐＥＴ２４ａ発現プラスミドをもとに、ＳｌｙＤまたはＳｌｐＡ融合ポリペプチドをコードする発現カセットを得た。ｇｐ４１エクトドメインの配列はSwissProtデータベースから取得した。ｇｐ４１（ａａ５３６−６８１）をそのＮ末端にインフレームで融合されたグリシンリッチなリンカー領域と共にコードする合成遺伝子を、Medigenomix社（Martinsried, Germany）から購入した。コード領域の５’末端および３’末端にはそれぞれＢａｍＨＩおよびＸｈｏＩ制限部位がある。グリシンリッチなリンカー領域により連結され、そのＣ末端にさらなるリンカー領域の一部分を有する２つのＳｌｐＡ単位（配列番号１、SwissProt登録番号P0AEM0の残基１−１４６および２−１４９）をコードするさらなる合成遺伝子も同様にMedigenomix社から購入した。このカセットの５’末端および３’末端にはそれぞれＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩ制限部位がある。これらの遺伝子および制限部位は、単純なライゲーションによりＳｌｐＡ−ＳｌｐＡとｇｐ４１エクトドメイン断片をインフレームで融合できるように設計してあった。意図しない組換え反応を回避するため、および大腸菌（E. coli）宿主内での発現カセットの遺伝的安定性を向上させるために、ＳｌｐＡ単位をコードするヌクレオチド配列ならびに伸長されたリンカー領域をコードするヌクレオチド配列を縮重させた。すなわち、同一のアミノ酸配列をコードするに当たって、異なるコドンの組み合わせを使用した。
【００９８】
ｐＥＴ２４ａベクターをＮｄｅＩおよびＸｈｏＩで消化し、ＨＩＶ−１ ｇｐ４１エクトドメイン断片５３６−６８１にインフレームで融合されたタンデムＳｌｐＡを含むカセットを挿入した。ＳｌｐＡまたはタンデムＳｌｐＡの代わりにＳｌｙＤまたはタンデムＳｌｙＤを含む発現カセット、ならびにｇｐ４１と異なる標的ポリペプチドを含む発現カセットも、同様に構築した。全ての組換え融合ポリペプチド変異体は、Ｎｉ−ＮＴＡ支援精製および再フォールディングを容易にするためのＣ末端ヘキサヒスチジンタグを有していた。それぞれの発現カセットに点突然変異、欠失および伸長変異体または制限部位を生成するためにQuikChange（Stratagene社、La Jolla、CA、USA）および標準ＰＣＲ技術を用いた。
【００９９】
下の模式図は、得られるＨＩＶ−１ ｇｐ４１エクトドメイン断片５３６−６８１とそのＮ末端にインフレームで融合された２つのタンデムＳｌｐＡシャペロンを示す。
【０１００】
得られたプラスミドのインサートを配列決定し、所望の融合タンパク質をコードすることを確認した。完全アミノ酸配列を配列番号４に示す。リンカーＬのアミノ酸配列は配列番号１７に示す。
【０１０１】
ＳｌｐＡ、ＳｌｙＤならびにＳｌｐＡ、ＳｌｙＤ、およびＦｋｐＡを含む融合タンパク質の精製
ＳｌｙＤ、ＳｌｐＡ、および全ての融合タンパク質変異体は、実質的に同じプロトコルを用いて精製した。特定のｐＥＴ２４ａ発現プラスミドを担持する大腸菌（E. coli）ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞を３７℃にてカナマイシン（３０μｇ／ｍＬ）を添加したＬＢ培地でＯＤ６００１．５まで増殖させ、１ｍＭのイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトシドを添加することにより細胞質過剰発現を誘導した。誘導から３時間後に、細胞を遠心分離（５０００ｇにて２０分）により回収し、凍結し、−２０℃にて保存した。細胞を溶解させるために、凍結したペレットを氷冷５０ｍＭリン酸カリウムｐＨ８．０、７．０Ｍ ＧｄｍＣｌ、５ｍＭイミダゾールに再懸濁し、この懸濁物を２時間、氷上で攪拌し、細胞を完全に溶解させた。遠心分離と濾過（硝酸セルロースメンブレン、０．４５μｍ／０．２μｍ）の後に、溶解物を、５．０ｍＭ ＴＣＥＰを含む溶解バッファーで平衡化したＮｉ−ＮＴＡカラムに加えた。その後の洗浄ステップは、それぞれの標的タンパク質に合わせ、５０ｍＭリン酸カリウムｐＨ８．０、７．０Ｍ ＧｄｍＣｌ、５．０ｍＭ ＴＣＥＰ中の５〜１５ｍＭイミダゾールとした。少なくとも１０〜１５容の洗浄バッファーを加えた。次いで、ＧｄｍＣｌ溶液を５０ｍＭリン酸カリウムｐＨ７．８、１００ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭイミダゾール、５．０ｍＭ ＴＣＥＰで置換し、マトリックス結合タンパク質の立体構造的再フォールディングを誘導した。共に精製されるプロテアーゼの再活性化を避けるために、プロテアーゼ阻害剤カクテル（Complete（登録商標）ＥＤＴＡフリー、Roche社）を再フォールディングバッファーに追加した。合計１５〜２０カラム容量の再フォールディングバッファーを一晩かけて添加した。次いでＴＣＥＰおよびComplete（登録商標）ＥＤＴＡフリー阻害剤カクテルの両方を、３〜５カラム容量の５０ｍＭリン酸カリウムｐＨ７．８、１００ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭイミダゾールを用いた洗浄により除去した。次いでネイティブなタンパク質を同じバッファー中の２５０ｍＭイミダゾールにより溶出させた。タンパク質含有画分はトリシン−ＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いて純度を評価し、プールした。最後に前記タンパク質をサイズ排除クロマトグラフィー（Superdex HiLoad、Amersham Pharmacia社）に供し、タンパク質含有画分をプールしAmicon cell（YM10）で濃縮した。
【０１０２】
組み合わせた精製および再フォールディングプロトコルにより、１ｇの大腸菌（E. coli）湿細胞から、それぞれの標的タンパク質に応じて、約５〜２０ｍｇのタンパク質が得られた。
【０１０３】
実施例２
分光学的測定
タンパク質の二次および三次構造の両方を評価するためにここで選択した方法は、円偏光二色性分光法（ＣＤ）である。芳香族領域（２６０〜３２０ｎｍ）における楕円率はタンパク質内の三次的接触（すなわち規則的にフォールディングされたタンパク質の球状構造）を反映するのに対して、アミド領域（１９０〜２５０ｎｍ）における楕円率は、タンパク質骨格における規則的な繰り返しエレメント、すなわち二次構造を反映する。
【０１０４】
タンパク質濃度測定は、Uvikon XL二重光線分光光度計を用いて行った。モル吸光係数 （ε２８０）は、Pace(1995), Protein Sci. 4, 2411-2423に記載の方法を用いて決定した。
【０１０５】
近紫外ＣＤスペクトルは、温度自動調節されたセルホルダーを備えたJasco-720分光偏光計で記録し、平均残存楕円率に変換した。バッファーは５０〜１５０ｍＭリン酸カリウムｐＨ７．５、１００ｍＭ ＫＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡとした。光路は０．５ｃｍまたは１．０ｃｍとし、タンパク質濃度は２０〜５００μＭとした。バンド幅は２ｎｍとし、スキャン速度は５０ｎｍ／分とし、解像度は０．５ｎｍとし、応答は１または２秒とした。シグナル／ノイズ比を改善するために、スペクトルを９回測定し平均した。
【０１０６】
遠紫外ＣＤスペクトルは、温度自動調節されたセルホルダーを備えたJasco-720分光偏光計で測定し、平均残存楕円率に変換した。バッファーは１０ｍＭリン酸カリウムｐＨ７．５、２５ｍＭ ＫＣｌ、０．５ｍＭ ＥＤＴＡとした。光路は０．２ｃｍとし、タンパク質濃度は２．５〜２０μＭとした。バンド幅は２ｎｍとし、スキャン速度は５０ｎｍ／分とし、解像度は０．５ｎｍとし、応答は１または２秒とした。シグナル／ノイズ比を改善するために、スペクトルを９回測定し平均した。
【０１０７】
実施例３
ビオチンおよびルテニウム部分の融合タンパク質へのカップリング
融合ポリペプチドのリシンε−アミノ基を、１０〜２０ｍｇ／ｍＬのタンパク質濃度にて、Ｎ−ヒドロキシ−スクシンイミド活性化ビオチンおよびルテニウム標識でそれぞれ修飾した。標識／タンパク質比は、それぞれの融合タンパク質に応じて、２：１〜５：１（モル：モル）とした。反応バッファーは１５０ｍＭリン酸カリウムｐＨ８．０、１００ｍＭ ＫＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡとした。反応は室温で１５分間行い、緩衝化Ｌ−リシンを最終濃度１０ｍＭまで添加することにより停止させた。標識の加水分解による不活性化を回避するために、それぞれのストック溶液は乾燥ＤＭＳＯ（seccosolv（登録商標）等級、Merck社、Germany）中で調製した。調べた全ての融合タンパク質は、反応バッファー中の最大１５％までのＤＭＳＯ濃度を許容した。カップリング反応後に、未反応の遊離標識は、粗製のタンパク質コンジュゲートをゲル濾過カラム（Superdex 200 HiLoad）に通すことにより除去した。
【０１０８】
実施例４
ポリペプチド融合タンパク質の免疫学的反応性
種々の融合タンパク質の免疫学的反応性（すなわち抗原性）を、自動化されたElecsys（登録商標）2010分析器（Roche Diagnostics GmbH社）で評価した。Elecsys（登録商標）はRocheグループの登録商標である。測定は二重抗原サンドイッチフォーマットで行った。
【０１０９】
Elecsys（登録商標）2010でのシグナル検出は電気化学発光に基づく。ビオチンコンジュゲート（すなわち捕捉抗原）はストレプトアビジンコーティングされた磁気ビーズの表面に固定化し、検出抗原は複合体化されたルテニウムカチオン（レドックス状態２＋および３＋の間を遷移する）をシグナリング部分として有する。特定の免疫グロブリンアナライトの存在下で、発色性のルテニウム複合体を固相と架橋し、白金電極による励起後に６２０ｎｍにて発光させる。シグナル出力は任意の光単位で示す。
【０１１０】
捕捉抗原および検出抗原のいずれについても、ＨＳＶ−１特異的抗原性配列としてＨＳＶ−１抗原ｇＧ１（アミノ酸２６−１８９、配列番号７および８を参照されたい）を有する融合ポリペプチドをアッセイに使用した。ｇＧ１抗原はＳｌｐＡまたはＳｌｙＤのいずれかに融合させた。二重抗原サンドイッチイムノアッセイにおいてＳｌｐＡ−ｇＧ１（２６−１８９）−ビオチンコンジュゲートをＳｌｐＡ−ｇＧ１（２６−１８９）−ルテニウム複合体コンジュゲート（本発明）と共に、それぞれ１００ｎｇ／ｍＬの濃度で加えた。同様に、ＳｌｙＤ−ｇＧ１（２６−１８９）−ビオチンコンジュゲートをＳｌｙＤ−ｇＧ１（２６−１８９）−ルテニウム複合体コンジュゲート（比較例）と共に、それぞれ１００ｎｇ／ｍＬの濃度で加えた。
【０１１１】
ｇＧ１（２６−１８９）の融合ポリペプチド変異体のビオチンコンジュゲートおよびルテニウムコンジュゲートを、それぞれ１００ｎｇ／ｍＬの濃度にて、抗ＨＳＶ−１陽性血清に対するその反応性について評価した。シャペロン融合単位を介する免疫学的交差反応を回避するために、全ての測定において、未標識の化学的に多量体化されたＳｌｙＤ−ＳｌｙＤを抗干渉物質として反応バッファーに加えた。１１の抗ＨＳＶ−１陰性ヒト血清を対照として用いた。
【０１１２】
融合タンパク質の耐熱性を調べるために、ＳｌｙＤ−ｇＧ１およびＳｌｐＡ−ｇＧ１を以下の過酷な温度条件に供した：ＳｌｙＤ−ｇＧ１およびＳｌｐＡ−ｇＧ１（タンパク質は５０ｍＭリン酸カリウムｐＨ７．５、１００ｍＭ ＫＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ中に存在）を６０℃で一晩インキュベートした。ｇＧ１−ビオチンコンジュゲートの濃度はそれぞれ約１．３ｍｇ／ｍＬであり、ｇＧ１−ルテニウムコンジュゲートの濃度はそれぞれ約０．６ｍｇ／ｍＬであった。その後、熱ストレスを加えたサンプルを、上記実験条件下でElecsys（登録商標）2010自動分析器を用いてその残存免疫学的反応性について評価した。ＳｌｙＤ−ｇＧ１およびＳｌｐＡ−ｇＧ１の未チャレンジサンプル（２〜８℃にて保存）を参照として使用した。
【０１１３】
実験の結果を表１（図９）に示す。
【０１１４】
表１は、実施例４に記載した自動化Elecsys（登録商標）分析器での、ＳｌｐＡ−ｇＧ１（２６−１８９）またはＳｌｙＤ−ｇＧ１（２６−１８９）とヒト抗ＨＳＶ−１陽性または抗ＨＳＶ−１陰性血清との免疫学的反応性を示す。過酷な６０℃での一晩の熱処理の前および後の両種の抗原変異体の性能を示す。実験の結果は、熱ストレスを加えたＳｌｐＡ−ｇＧ１（２６−１８９）が熱ストレスを加えたＳｌｙＤ−ｇＧ１（２６−１８９）よりも二重の意味で優れていることを明確に実証している。第１に、抗ＨＳＶ−１陽性血清での特異的シグナル回復（表１の上段）は、熱チャレンジしたＳｌｐＡ融合ポリペプチドの方が顕著に高い。第２に、抗ＨＳＶ−１陰性血清での非特異的バックグラウンドシグナルの増加（表１の下段）は熱チャレンジされたＳｌｐＡ融合ポリペプチドの方が顕著に低い。ＳｌｙＤ融合ポリペプチドの熱処理後のバックグラウンドシグナルには著明な増加が観察された（表１の右欄、バックグラウンドシグナルの約１００〜９００％の増大）。
【０１１５】
しかし、本発明のＳｌｐＡ融合ポリペプチドを使用した場合、熱ストレスの後のバックグラウンドシグナルの増加は無視できるほど低く、すなわち１つの事例を除き、バックグラウンドシグナルの増加は２０％未満である。その１つの事例（血清サンプルTrina 07/06-533）では、４８％というバックグラウンドシグナルの増大が見られた。代わりにＳｌｙＤ融合ポリペプチドを使用した場合には、当該サンプル（Trina 07/06-533）は８００％を超えるバックグラウンドシグナルの増加を示した。このことは、ＳｌｐＡ融合ポリペプチドが、元から若干高いバックグラウンドシグナルを生じる取扱困難なサンプルについても、バックグラウンドシグナルを実質的に低減できることを示す。イムノアッセイの開発では低いバックグラウンドシグナルが非常に望ましい。なぜなら、それにより製造者は低いカットオフ値を設定することができるからである。一般に、感度について言うと、アッセイ性能を向上させるためには、バックグラウンドシグナルを低減させることが必要である。なぜなら、カットオフ値よりも高いシグナルを生じるサンプルは陽性と判断され（すなわち当該サンプルは対象のアナライトを含むと推定される）、カットオフ値を下回るシグナルを生じるサンプルは陰性と判断されるからである。このことから、そもそもなぜ低いカットオフが必要なのかが容易に理解されよう。すなわち、カットオフが低いほど、アナライトを低濃度で含む（それに付随して生じるシグナルも低い）サンプルでも、正しく低い陽性と判断される可能性は高くなる。したがってイムノアッセイの感度は、免疫学的成分から内在的に生じるバックグラウンドシグナルの低減により向上させることができる。したがって、ＳｌｐＡをフォールディングヘルパーとして使用することは、イムノアッセイの長期的感度を改善し保証することに明確に寄与する。
【０１１６】
まとめると、ＳｌｐＡを含む融合ポリペプチドは、融合された標的ポリペプチドの安定性と溶解性の両方を増大させ、特に、通常はネイティブなフォールディングを崩し凝集反応をもたらすような極限的条件（熱ストレスなど）下でそれらを増大させる。簡潔に述べると、ＳｌｐＡは優秀なフォールディングヘルパーであり、望ましくない条件下でさえもその対象タンパク質の完全性を保護し、該対象タンパク質の活性なコンホメーションへの再フォールディングを促進し、それらを溶解状態に保つ。したがってＳｌｐＡとの融合、またはより単純にはＳｌｐＡの添加は、診断および他のバイオテクノロジー用途を意図するタンパク質製剤中で標的分子を安定化するための優秀な手段である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＳｌｐＡシャペロンおよび標的ポリペプチドを含む融合タンパク質、これら融合タンパク質を組換え的に発現、精製および再フォールディングする方法、タンパク質および酵素バイオテクノロジーにおけるその使用、および特に診断におけるその応用に関する。さらに本発明は、バイオテクノロジー用途のための標的ポリペプチドまたは酵素の可溶性、活性、安定性および／またはフォールディングの可逆性を増大させることを意図した、ＳｌｐＡおよび標的ポリペプチドを含んでなるあらゆる複合体に関する。
【背景技術】
【０００２】
タンパク質フォールディングはネイティブな状態と未フォールディングの状態の間の微小なギブス自由エネルギーの差により駆動される自発的な現象である。構造がほとんど確定していないポリペプチド鎖は、フォールディングの過程において、タンパク質のネイティブなコンホメーションまたは三次構造と呼ばれる構造を選択していく。不完全にフォールディングされた分子の凝集は生成的なフォールディングと競合し、これは大きな問題となり、ｉｎ ｖｉｖｏおよびｉｎ ｖｉｔｒｏの両方でフォールディング収率に影響を及ぼす。生きた細胞では、フォールディングはヘルパータンパク質が支援する。フォールディングヘルパーは、他のタンパク質のフォールディングを支援し、その構造的完全性を維持するポリペプチドである。該ヘルパーはその標的ポリペプチド鎖と可逆的に相互作用することにより該標的の正しいフォールディングを促進する能力を有し、そのことにより凝集のような有害な副反応を防止する。これはｉｎ ｖｉｖｏでもｉｎ ｖｉｔｒｏでも起こり、バイオテクノロジーの諸課題において、こうしたフォールディングヘルパーの用途の数はかつてないほど増加している。一般にフォールディングヘルパーはフォールディング触媒とシャペロンに細分化される。
【０００３】
シャペロンは、変性した、部分的に変性した、または単純にそのままのポリペプチドの疎水性表面に可逆的に結合し、そのことによりタンパク質を復元する、またはタンパク質を溶解状態に保つことを支援する。シャペロンは、疎水性表面に可逆的に結合しそれをマスキングすることにより、凝集傾向のあるフォールディング中間体および凝集傾向のあるフォールディングされたタンパク質の濃度を下げる。つまり、シャペロンは、単純な結合機能を発揮している。対照的にフォールディング触媒（例えばジスルフィドオキシドレダクターゼおよびペプチジル−プロリルシス／トランスイソメラーゼ）はタンパク質フォールディングの律速工程を促進し、したがってフォールディング中間体の寿命を短縮する。フォールディング触媒は、その触媒機能により凝集傾向のあるフォールディング中間体の濃度を低下させる。フォールディング触媒の重要な一群のことをペプチジルプロリルシス／トランスイソメラーゼ（ＰＰＩアーゼ）と言う。
【０００４】
配列類似性、タンパク質位相幾何および免疫抑制分子の結合に基づき、プロリルイソメラーゼは、３つの異なるファミリー、すなわちシクロフィリン、パラブリンおよびＦＫ５０６結合タンパク質（すなわち頭字語ＦＫＢＰ）に分類される。ＦＫＢＰは、ＦＫ５０６、ラパマイシンおよび関連するマクロライド誘導体に結合してこれらにより阻害されるが、これらは免疫抑制剤としても使用されている。
【０００５】
大腸菌（E. coli）のペプチジルプロリルシス／トランスイソメラーゼのＦＫＢＰファミリーに属する推定上のフォールディングヘルパーはＳｌｐＡであり、ＳｌｐＡとは「ＳｌｙＤ様プロテインＡ」の頭字語である（Hottenrottら 1997, JBC 272/25, 15697-15701）。今日までの、ＳｌｐＡおよび大腸菌（E. coli）内でのその生理学的な役割に関する情報は不十分である。ＳｌｐＡの微弱なプロリルイソメラーゼ活性が報告されているが、このタンパク質はこれまでどちらかといえば不可解とされてきた。これまでに、ＳｌｐＡの物理化学的性質または考えられるシャペロン特性に関する情報は不足しており、大腸菌（E. coli）細胞質ゾルでのＳｌｐＡの機能は検討されたことすらない。
【０００６】
多くの診断用途では組換え的に製造されたタンパク質が結合パートナーとして、例えばある特定の免疫グロブリンアナライトの検出のために設計されたイムノアッセイにおける抗原として使用される。こうした抗原は、調べているサンプルまたはアッセイ混合物中に存在する特定の基を認識し、それに結合することが意図された標的部分または抗原性ポリペプチドを構成する部分を有する融合タンパク質として製造することができる。該組換え的に製造される融合タンパク質の他方の部分は、特異性を付与する抗原性部分に融合され、該タンパク質のクローニング、発現、過剰産生、フォールディング／再フォールディングおよび精製を容易にし、該タンパク質の溶解性、安定性またはフォールディングの可逆性を増大させるためのポリペプチド部分である。組換え的に製造された融合タンパク質の合成は従来技術に詳述されている。また、シャペロンを、標的ポリペプチドの発現、フォールディング、精製、可溶化および全体としての安定性の増大のための補助分子としての役割を果たす融合タンパク質の一部として使用するのが有利であることもよく知られている。
【０００７】
米国特許第6,207,420号はタンパク質の発現のための融合タンパク質システムであって、標的ポリペプチド部分と融合ペプチド部分のアミノ酸配列が異なる生物に由来するシステムを開示する。最近、ＦｋｐＡおよびＳｌｙＤが組換えタンパク質の製造において融合モジュールとして好適であることが示された。両種のシャペロンは、原核生物宿主内でのその対象タンパク質の発現速度を増大させ、正しい再フォールディングを助け、レトロウイルス膜貫通タンパク質のような極めて凝集傾向の強いタンパク質でさえも、全体としてのその可溶性を増大させる（Scholzら 2005, JMB 345, 1229-1241およびWO 03/000877）。
【０００８】
ＦｋｐＡおよびＳｌｙＤは、一方では取扱困難なまたは凝集傾向のあるタンパク質を助けて、診断試薬中で、より一般的にはバイオテクノロジー用途において、該タンパク質のネイティブな構造を維持するのに特に有用であるが、なおも熱安定性の問題は残されている。タンパク質のネイティブなコンホメーションは、ファン・デル・ワールス接触、水素結合、塩橋および疎水性相互作用の慎重にバランスされたネットワークにより安定化されている。こうした接触は対応するタンパク質の微小環境に最適化されており、ｐＨ、イオン強度または温度の変化は実際にフォールディングした分子および未フォールディング分子の間の平衡を乱しシフトさせる。温度の上昇はタンパク質を変性させるのに特に適しており、これは多くの場合、完全または部分的に未フォールディングの分子の凝集をもたらす。熱により誘発されるタンパク質凝集は機能の喪失を伴い、これはあらゆるタンパク質製剤について大きな問題となる。高温、より一般的には、熱ストレスが、タンパク質試薬または製剤の不適切な輸送または貯蔵中に生じ得ることは容易に想像できる。
【０００９】
ＳｌｙＤのようなシャペロン融合モジュールについては、約４２℃という温度で熱誘導性の逆フォールディング（アンフォールディング）の開始が見られる。これは、例えばタンパク質製剤の輸送、積込み、または貯蔵に使用されるコンテナの冷却機構に不具合が生じたときに、容易に超過される温度である。標的タンパク質Ｘが非常に疎水性であり、その融合パートナーのシャペロン活性に完全に依存する場合、完全な状態の融合ポリペプチドは、ＳｌｙＤモジュールが逆フォールディングされると直ちに凝集し、それと当時にその可溶化機能も失われる。言い換えると、Ｘが非常に疎水性であり凝集傾向の強い対象タンパク質の場合、ＳｌｙＤの安定性がＳｌｙＤ−Ｘ融合ポリペプチド全体の安定性を制限する。
【００１０】
ＦｋｐＡを含む融合タンパク質は若干高い安定性を示し、これは二量体型ＦｋｐＡキャリアーモジュールの固有の熱安定性が高いことに起因している可能性がある。大腸菌（E. coli）ＳｌｙＤの融解温度は約４２℃と決定されているが、これに対してＦｋｐＡは最大で約５０℃まで比較的安定である。しかしながら、以下に記載する理由により、高い固有の安定性を有する別の機能性シャペロン変異体を提供する緊急の必要性がなおもある。
【００１１】
二重抗原サンドイッチ（ＤＡＧＳ）フォーマットの異種イムノアッセイでは、例えばある抗原の２種の変異体をアッセイのそれぞれの側に使用する。一方の変異体は固相に対して親和性の高い標識を有し、他方の変異体はシグナル出力を生成するためのシグナリング部分を有する。この抗原変異体をそれぞれヘルパー配列、すなわちキャリアーまたは融合モジュールに融合させることができる。少なくとも１つのシャペロン（または機能性のポリペプチド結合ドメイン、すなわちシャペロンドメイン）が標的ポリペプチドに連結または融合され、フォールディングを促進し、安定性と溶解性を増大させ、標的ポリペプチドを適当なコンホメーションに保ち、このことにより決定すべき抗体アナライトは標的ポリペプチドを特異的に認識しそれに結合することができる。好ましくは、アッセイに固有の対称性を崩すために、免疫学的ブリッジアッセイのいずれの側にもそれぞれ異なるシャペロンを融合パートナーとして使用する。キャリアーまたは融合モジュールは異なるが、いずれの側（すなわち捕捉側および検出側）の標的ポリペプチドも同一または類似であるアッセイフォーマットのことも非対称ＤＡＧＳフォーマットと呼ぶことができる。ＤＡＧＳアッセイのそれぞれの側に異なる融合モジュールを使用することで、キャリアモジュールに起因する免疫学的交差反応およびそれに付随する誤った高いシグナルのリスクを大幅に低減することができる。
【００１２】
明らかに、アッセイ全体の安定性は、最も低い固有安定性を有する免疫学的成分によって制限される。非対称ＤＡＧＳにおいてＦｋｐＡおよびＳｌｙＤを融合パートナーとして使用すると、全体の安定性を制限する融合パートナーはＳｌｙＤである。したがって、完全に機能的にＳｌｙＤに取って代わることができ、かつ本質的に熱ストレスに対して内在的により安定な他のシャペロンを見出す必要がある。好熱性または超好熱性生物由来のＳｌｙＤホモログが多数記載されているが、単純にこうしたタンパク質を融合パートナーとして使用するには障害がある。こうしたタンパク質は６０℃よりも大幅に高い温度に最適化され進化したため、熱力学的安定性が極めて高い。その結果、安定および超安定なタンパク質は室温では比較的硬直的になる傾向があり、すなわち標的分子に動的に結合するための必須条件である柔軟性は失われる。タンパク質の安定性はその柔軟性と機能の両方と引き替えにしか高めることができないことは一般に受け入れられており、このことは多くの場合、高度に安定なタンパク質を室温で用いることを妨げる。したがって本発明の目的は、中等温度生物から熱安定なフォールディングヘルパーを同定することである。本発明のさらなる目的は、高い熱安定性を有し、診断試薬およびタンパク質製剤の貯蔵期間を延長する、診断およびバイオテクノロジー用途に適したポリペプチドを提供することである。
【００１３】
最近、Kwonら（BMB reports 2008, 41(2), 108-111）に報告されたとおり、いくつかの大腸菌（E. coli）タンパク質は、４９℃を大幅に超える温度でも安定であり可溶性である。高温に晒されても可溶性であったタンパク質がＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動により同定された。この研究は、種々の温度でインキュベートされた後の大腸菌（E. coli）の超音波処理抽出物を用いて行われた。同定された１７種の熱安定タンパク質のうち、６種のタンパク質（ＧｒｏＥＬ、ＧｒｏＥＳ、ＤｎａＫ、ＦｋｐＡ、トリガー因子、ＥＦ−Ｔｓ）が推定上のフォールディングヘルパーであった。特筆すべきこととして、この実験は大腸菌（E. coli）の無細胞溶解物を用いて行われ、それぞれのタンパク質の溶解性のみが安定性の評価基準とされた。
【００１４】
しかしながら、タンパク質の溶解性と安定性の間には、大きな違いがある。タンパク質の溶解性は、安定性が最大となる条件では多くの場合に最小値に達することは当技術分野では周知の事実である。例えば、あるタンパク質の熱力学的安定性は、バッファー溶液のｐＨが当該タンパク質のｐＩと一致するときに最大となる。にもかかわらず、まさにこの条件下では、タンパク質の溶解性は最小となる。別の一般的な例としては、硫酸アンモニウムまたは他のコスモトロピック物質によるタンパク質の塩析がある。この場合にも、タンパク質の安定性が増すと共にその溶解性は減少する（硫酸アンモニウムは強力なコスモトロピック物質であり、すなわちタンパク質構造を安定化させる）。
【００１５】
WO 2007/077008は、例えば大腸菌（E. coli）ＳｌｙＤのような非ヒトシャペロンのポリペプチド結合部分ならびにそのＮ末端およびＣ末端的に融合されたヒトＦＫＢＰ型ペプチジル−プロリル−シス／トランスイソメラーゼを含有する、組換え的に製造されたキメラ融合タンパク質を開示する。ＳｌｐＡのシャペロン部分を使用する類似の融合ポリペプチドも開示された。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１６】
【特許文献１】米国特許第6,207,420号
【特許文献２】WO 03/000877
【特許文献３】WO 2007/077008
【非特許文献】
【００１７】
【非特許文献１】Hottenrottら 1997, JBC 272/25, 15697-15701
【非特許文献２】Scholzら 2005, JMB 345, 1229-1241
【非特許文献３】Kwonら BMB reports 2008, 41(2), 108-111
【発明の概要】
【００１８】
驚くべきことに、ＳｌｐＡ、特に大腸菌（E. coli）ＳｌｐＡは、融合パートナーとして使用したときに、他の標的ポリペプチドに熱安定性を付与することができる。Hottenrottら（上掲）に報告されたように、ＳｌｐＡは比較的弱いペプチジル−プロリルシス／トランスイソメラーゼ活性を有する酵素である。予期せぬことに、ＳｌｐＡは顕著なシャペロン特性も示し、さらに驚くべきことに、ＳｌｐＡは高い固有の安定性を有し、融合された標的ポリペプチドに熱安定性を付与するため、標的ポリペプチドは熱誘導性凝集の影響を受けにくくなる。近い関係にあるＳｌｙＤは熱による逆フォールディングの中間点が約４２℃という若干の安定性を示すに過ぎないのに対して、ＳｌｐＡはその天然のフォールディングを少なくとも５０℃までは保ち、熱による逆フォールディングの中間点（融解温度と定義される）は約５６℃である。これはＳｌｙＤおよびＳｌｐＡが近い関係にあり（ＳｌｐＡはＳｌｙＤ様タンパク質の略称である）、両方が増殖の最高温度が４９℃である大腸菌（E. coli）のような中等温度生物由来の単量体タンパク質であることに照らすと不可解である。最も驚くべきことは、中等温度生物である大腸菌（E. coli）が、抜群の熱安定性とシャペロン特性を併せ持つＳｌｐＡのような推定上のフォールディングヘルパーを保有していることである。
【００１９】
発明の概要
本発明は、ＳｌｐＡシャペロンおよび標的ポリペプチドを含む融合タンパク質をコードする組換えＤＮＡ分子、および該融合タンパク質をコードする対応する発現ベクター、ならびに該発現ベクターで形質転換された宿主細胞に関する。本発明の別の態様は、該融合タンパク質の製造方法、ならびに、ＳｌｐＡシャペロンおよび標的ポリペプチドを含む組換え的に製造された融合タンパク質である。本発明のさらなる態様は、イムノアッセイでの結合パートナー（例えば抗原、酵素または組換え較正物質）としての、または干渉を低減するための手段としての組換え的に製造された融合タンパク質の使用である。さらに本発明は、標的ポリペプチドに対する抗体を製造するための免疫原としての該組換え的に製造された融合タンパク質の使用、およびワクチン製造での該組換え的に製造された融合タンパク質の使用に関する。また別の態様は、組換え的に製造された融合タンパク質を用いたイムノアッセイでのアナライトの検出方法、ならびにＳｌｐＡシャペロンおよび標的ポリペプチドを含む組換え的に製造された融合タンパク質を含有する試薬キットである。さらなる態様は、イムノアッセイにおける干渉および交差反応の低減のためのＳｌｐＡの使用に関する。本発明のさらなる態様は、バイオテクノロジー用途のための、ＳｌｐＡおよび標的タンパク質を含む可溶性であり機能性である複合体の使用に関し、このとき該標的タンパク質は治療または診断上価値のあるタンパク質であり得る。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】大腸菌（E. coli）由来ＳｌｐＡの近紫外ＣＤスペクトルを示す。スペクトルは温度自動調節されたセルホルダーを備えたJasco-720分光偏光計を用いて２０℃で記録した。タンパク質濃度は１ｃｍキュベット内で４１７μＭであった。バッファーは５０ｍＭリン酸カリウムｐＨ７．５、１００ｍＭ ＫＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡであった。バンド幅は２ｎｍであり、解像度は０．５ｎｍであり、スキャン速度は２秒の応答で５０ｎｍ／分であった。シグナル／ノイズ比を改善するために、スペクトルを９回記録し平均した。シグナルは平均残存楕円率（ｄｅｇ ｃｍ２ ｄｍｏｌ−１として示す）に変換した。スペクトルはネイティブ様のフォールディングされたタンパク質を示し、シグナル最大値は２６２ｎｍのときに得られる。
【図２】大腸菌（E. coli）由来ＳｌｙＤの近紫外ＣＤスペクトルを示す。スペクトルは温度自動調節されたセルホルダーを備えたJasco-720分光偏光計を用いて２０℃で記録した。タンパク質濃度は１ｃｍキュベット内で２００μＭであった。バッファーは５０ｍＭリン酸カリウムｐＨ７．５、１００ｍＭ ＫＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡであった。バンド幅は２ｎｍであり、解像度は０．５ｎｍであり、スキャン速度は１秒の応答で５０ｎｍ／分であった。シグナル／ノイズ比を改善するために、スペクトルを９回記録し平均した。シグナルは平均残存楕円率（ｄｅｇ ｃｍ２ ｄｍｏｌ−１として示す）に変換した。ＳｌｙＤのスペクトルはＳｌｐＡのスペクトルと著しく異なる。該スペクトルはネイティブ様のフォールディングされたタンパク質を示し、シグナル最大値は２７５ｎｍのときに得られる。
【図３】２７５ｎｍ（ＳｌｙＤ）および２６２ｎｍ（ＳｌｐＡ）における近紫外ＣＤによりモニタリングされるＳｌｙＤおよびＳｌｐＡの熱誘導性の逆フォールディング遷移を示す。融解曲線はネイティブな分子の画分に対して標準化されている。ＳｌｙＤおよびＳｌｐＡの両方の逆フォールディングは完全に可逆的であり、ネイティブな分子の近紫外ＣＤシグナルは、サンプルを周囲温度まで冷ますと、熱遷移後に完全に回復することが可能である。融解温度（すなわち分子の５０％がフォールディングされ５０％が未フォールディングである温度）はＳｌｙＤについては４２℃でありＳｌｐＡについては５６℃である。図３はＳｌｐＡの優れた熱安定性を明確に実証している。
【図４】ＳｌｐＡ−ｇｐ４１融合タンパク質の近紫外ＣＤスペクトルを示す。スペクトルは温度自動調節されたセルホルダーを備えたJasco-720分光偏光計を用いて２０℃にて記録した。タンパク質濃度は１ｃｍキュベットにて１８．７μＭであった。バッファーは５０ｍＭリン酸カリウム（ｐＨ７．５）、１００ｍＭ ＫＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡであった。バンド幅は２．０ｎｍであり、解像度は０．５ｎｍであり、スキャン速度は２秒の応答にて５０ｎｍ／分であった。シグナル／ノイズ比を改善するために、スペクトルを９回記録し平均した。シグナルを平均残存楕円率（ｄｅｇ ｃｍ２ ｄｍｏｌ−１として示す）に変換した。スペクトルはネイティブ様のフォールディングされたタンパク質を示す。２９３ｎｍにおけるシグナル最小値は、トリプトファン残基が豊富であり２８０ｎｍを超える光を吸収するネイティブ様にフォールディングされたｇｐ４１エクトドメイン断片を示す。２９０ｎｍ付近の波形はＳｌｐＡ−ｇｐ４１融合ポリペプチド内のｇｐ４１部分のネイティブ様フォールディングを明確に示す。
【図５】ＳｌｙＤ−ｇｐ４１融合タンパク質の近紫外ＣＤスペクトルを示す。スペクトルは温度自動調節されたセルホルダーを備えたJasco-720分光偏光計を用いて２０℃にて記録した。タンパク質濃度は１ｃｍキュベット内で１４．４μＭであった。バッファーは５０ｍＭリン酸カリウム（ｐＨ７．５）、１００ｍＭ ＫＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡであった。バンド幅は２．０ｎｍであり、解像度は０．５ｎｍであり、スキャン速度は２秒の応答にて５０ｎｍ／分であった。シグナル／ノイズ比を改善するために、スペクトルを９回記録し平均した。シグナルを平均残存楕円率（ｄｅｇ ｃｍ２ ｄｍｏｌ−１として示す）に変換した。２９３ｎｍにおけるシグナル最小値は、トリプトファン残基が豊富であり２８０ｎｍを超える光を吸収するネイティブ様にフォールディングされたｇｐ４１エクトドメイン断片を示す。２９０ｎｍ付近の波形はＳｌｙＤ−ｇｐ４１融合ポリペプチド内のｇｐ４１部分のネイティブ様フォールディングを強く示す。
【図６】ＳｌｙＤ−ｇｐ４１（図６Ａ）およびＳｌｐＡ−ｇｐ４１（図６Ｂ）の熱誘導性逆フォールディングを２７０ｎｍにおける円偏光二色性シグナルの減少によりモニタリングした。それぞれのシャペロン融合パートナーの逆フォールディングは可溶化能力の喪失と共に進行し、極めて疎水性であるｇｐ４１部分の自発的凝集につながる。凝集の開始温度はＳｌｙＤ−ｇｐ４１については約４０℃であり、ＳｌｐＡ−ｇｐ４１については約５６℃である。楕円率はミリ度（ｍｄｅｇ）で示し、（不可逆の）凝集が生じる臨界的温度境界を点線により強調する。
【図７】２８０ｎｍの近紫外ＣＤによりモニタリングしたＳｌｙＤ−ｇＧ１（２６−１８９）の熱誘導性の逆フォールディング遷移を示す。融合タンパク質の楕円率は温度の関数としてミリ度（ｍｄｅｇ）で示す。ＳｌｙＤ−ｇＧ１（２６−１８９）の逆フォールディングは大部分が可逆的であり、サンプルを周囲温度に冷ましたときに、ネイティブな融合ポリペプチドの近紫外ＣＤシグナルの大部分は回復する。ＳｌｙＤ−ｇＧ１（２６−１８９）の融解温度（すなわち分子の５０％がフォールディングされ５０％が未フォールディングである温度）は約５３℃である。
【図８】２２０ｎｍにて遠紫外ＣＤによりモニタリングしたＳｌｐＡ−ｇＧ１（２６−１８９）の熱誘導性の逆フォールディング遷移を示す。融合タンパク質の楕円率は温度の関数としてミリ度（ｍｄｅｇ）で示す。ＳｌｐＡ−ｇＧ１（２６−１８９）の逆フォールディングの大部分は可逆的であり、サンプルを室温まで冷ますとネイティブな融合ポリペプチドの遠紫外ＣＤシグナルの大部分は回復する。ＳｌｐＡ−ｇＧ１（２６−１８９）の融解温度（すなわち分子の５０％がフォールディングされ５０％が未フォールディングである温度）は約６３℃である。これはＳｌｙＤ−ｇＧ１（２６−１８９）と比較したときに、ＳｌｐＡ−ｇＧ１（２６−１８９）の熱安定性が優れていることを明確に実証する。
【図９】実施例４に記載の自動化Elecsys（登録商標）分析器での、ＳｌｐＡ−ｇＧ１（２６−１８９）およびＳｌｙＤ−ｇＧ１（２６−１８９）のヒト抗ＨＳＶ−１陽性および抗ＨＳＶ−１陰性血清との免疫学的反応性を示す。表１は、両方の抗原変異体の、過酷な一晩の６０℃での熱処理の前および後の性能を示す。実験の結果は、熱ストレスを施したＳｌｐＡ−ｇＧ１（２６−１８９）が熱ストレスを施したＳｌｙＤ−ｇＧ１（２６−１８９）よりも二重の意味で優れていることを明確に示す。第１に、抗ＨＳＶ−１陽性血清でのシグナル回復（表１の上半分）は熱ストレスを施したＳｌｐＡ融合ポリペプチドの方が顕著に高かった。第２に、抗ＨＳＶ−１陰性血清でのバックグラウンドシグナルの増加（表１の下半分）は、熱ストレスを施したＳｌｐＡ融合ポリペプチドの方が顕著に低かった。この両方の効果は、イムノアッセイのシグナル動態を改善し、ＳｌｐＡの、取扱困難な標的タンパク質に安定性と溶解性を付与する融合パートナーとしての利点を際立たせる。したがってイムノアッセイの感度は、ＳｌｐＡを、それと近い関係にあるＳｌｙＤの代わりに、融合パートナーとして使用することにより保証することができる。
【００２１】
配列表の簡単な説明
配列番号１は、SwissProtデータベース登録番号P0AEM0から取得した大腸菌（E. coli）ＳｌｐＡの完全アミノ酸配列（１４９アミノ酸）を示す：
【００２２】
配列番号２は、実施例の章に用いた、大腸菌（E. coli）ＳｌｐＡのアミノ酸配列（アミノ酸、セリン２〜グルタミン酸１４８）を示す。Ｎ末端メチオニンは大腸菌（E. coli）では翻訳と共に除去される。クローニングを容易にするために、Ｃ末端のアラニンも除いた。さらに、タンパク質の精製と再フォールディングを容易にするために、Ｃ末端にヘキサヒスチジンタグを付加した：
【００２３】
配列番号３は、大腸菌（E. coli）ＳｌｐＡ−ｇｐ４１のアミノ酸配列を示す。ｇｐ４１部分はＨＩＶ１ ｇｐ４１のアミノ酸５３６〜６８１を有し、ＳｌｐＡ部分はアミノ酸１〜１４６を有する。該配列は融合タンパク質の精製と再フォールディングを容易にするために付加したＣ末端のヘキサヒスチジンタグを有する：
【００２４】
配列番号４は、大腸菌（E. coli）ＳｌｐＡ−ＳｌｐＡ−ｇｐ４１のアミノ酸配列を示す。２つのＳｌｐＡ単位が、非常に凝集傾向の強い標的ポリペプチドであるＨＩＶ ｇｐ４１エクトドメインに連結されている。第１のＳｌｐＡ単位はアミノ酸１〜１４６を含み、第２のＳｌｐＡ単位はアミノ酸２〜１４９を含む（両方のＳｌｐＡ変異体は機能と安定性に関して完全に等価である）。融合タンパク質の精製と再フォールディングを容易にするために、Ｃ末端ヘキサヒスチジンタグを付加した：
【００２５】
配列番号５は、大腸菌（E. coli）ＳｌｙＤ−ｇｐ４１のアミノ酸配列を示す。該タンパク質の精製とｉｎ ｖｉｔｒｏでの再フォールディングを容易にするためにＣ末端ヘキサヒスチジンタグを付加した：
【００２６】
配列番号６は、大腸菌（E. coli）ＳｌｙＤ−ＳｌｙＤ−ｇｐ４１のアミノ酸配列を示す。２つのＳｌｙＤ単位が標的ポリペプチドｇｐ４１に融合されている。該タンパク質の精製とｉｎ ｖｉｔｒｏでの再フォールディングを容易にするためにＣ末端ヘキサヒスチジンタグを付加した：
【００２７】
配列番号７は、融合ポリペプチドＳｌｐＡ−ｇＧ１のアミノ酸配列を示す。１つのＳｌｐＡ単位が標的ポリペプチドｇＧ１（実施例４で使用したように、ヒト単純ヘルペスウイルスＨＳＶ−１抗原ｇＧ１のアミノ酸２６〜１８９を含む）に融合されている：
【００２８】
配列番号８は、融合ポリペプチドＳｌｙＤ−ｇＧ１のアミノ酸配列を示す。１つのＳｌｙＤ単位が標的ポリペプチドｇＧ１（実施例４で使用したように、ヒト単純ヘルペスウイルスＨＳＶ−１抗原ｇＧ１のアミノ酸２６〜１８９を含む）に融合されている：
【００２９】
配列番号９は、Swiss Prot ID: Q9CKP2による、パスツレラ・ムルトシダ（Pasteurella multocida）ＳｌｙＤのアミノ酸配列（全長）を示す：
【００３０】
配列番号10は、C末端を切断したシステイン不含のパスツレラ・ムルトシダ（Pasteurella multocida）ＳｌｙＤ変異体のアミノ酸配列を示す。好ましくはこれを、二重抗原サンドイッチイムノアッセイに使用するための融合タンパク質中のシャペロン単位（ＰｍＳ ＳｌｙＤ １−１５６）として使用する：
【００３１】
配列番号１１は、Swiss Prot ID P45523による大腸菌（E. coli）ＦｋｐＡのアミノ酸配列（全長）を示す：
【００３２】
配列番号１２は、二重抗原サンドイッチイムノアッセイに使用するための融合タンパク質中のシャペロン単位として好適に使用される大腸菌（E. coli）ＦｋｐＡのアミノ酸配列部分を示す。該配列はＮ末端シグナル配列（アミノ酸残基１〜２５）を欠き、成熟ＦｋｐＡ（ＦｋｐＡ ２６−２７０）に実質的に対応する：
【００３３】
配列番号１３はエプスタイン・バーウイルス核抗原１（ＥＢＶ核抗原１、すなわちＥＢＮＡ−１）の４０１〜６４１位、（ＥＢＶ＝ＨＨＶ−４＝ヒトヘルペスウイルス４）；株Ｂ９５−８のアミノ酸配列を示す。ＥＢＮＡ−１の完全アミノ酸配列は６４１残基からなり、Swiss Prot ID P03211として取得可能である。天然に存在するシステイン残基はＥＢＮＡ−１の抗原性には不要であり、精製工程を簡便にするため、およびネイティブ様のフォールディングされた可溶性タンパク質の収率を高めるために、アラニンに変更した（下線で示す）：
【００３４】
配列番号１４は、Swiss Prot ID P14348による、エプスタイン・バーウイルスタンパク質ｐ１８のアミノ酸１〜１７６（オープンリーディングフレームＢＦＲＦ３、ＨＨＶ−４／Ｂ９５−８）のアミノ酸配列を示す。アミノ酸５６位における天然に存在するシステイン残基はＥＢＶ ｐ１８の抗原性には不要であり、精製工程を簡便にするため、およびネイティブ様のフォールディングされた可溶性タンパク質の収率を高めるために、アラニンに変更した（下線で示す）：
【００３５】
配列番号１５は、Swiss Prot ID P14348による、エプスタイン・バーウイルスタンパク質ｐ１８のＣ末端部分、アミノ酸１０５〜１７６（オープンリーディングフレームＢＦＲＦ３、ＨＨＶ−４／Ｂ９５−８）のアミノ酸配列を示す：
【００３６】
配列番号１６は、Swiss Prot ID P03197による、エプスタイン・バーウイルスタンパク質ｐ２３のアミノ酸１〜１６２（オープンリーディングフレームＢＬＲＦ２、ＨＨＶ−４／Ｂ９５−８）のアミノ酸配列を示す。アミノ酸４６位における天然に存在するシステイン残基はＥＢＶ ｐ２３の抗原性には不要であり、精製工程を簡便にするため、およびネイティブ様のフォールディングされた可溶性タンパク質の収率を高めるために、アラニンに変更した（下線で示す）：
【００３７】
配列番号１７は、ＳｌｐＡおよび標的ポリペプチドを含む発現カセットのクローニングのために実施例１に使用し示した、グリシンリッチなリンカーペプチド配列Ｌ＝（ＧＧＧＳ）５ＧＧＧを示す：
【発明を実施するための形態】
【００３８】
発明の詳細な説明
本発明の一態様は、融合タンパク質をコードする組換えＤＮＡ分子であって、機能的に連結された、標的ポリペプチドをコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列と、その上流または下流にある、ＳｌｐＡシャペロン単位をコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列とを含む、組換えＤＮＡ分子である。
【００３９】
「組換えＤＮＡ分子」という用語は、２つの、別の状況では分離されている配列セグメントの連結により作製されるＤＮＡ分子を言い、該連結は遺伝子工学技術または化学合成によりポリヌクレオチドの単離された部分同士を人工的に操作することにより行われる。その際、所望の機能のポリヌクレオチドセグメントを一緒に連結させて、所望の機能の組み合わせを生み出すことができる。
【００４０】
ポリヌクレオチド配列は、それらが互いに機能的な関係に配置されるときに、機能的に連結されている。例えば、あるプロモーターがコード配列の転写または発現を制御するならば、このプロモーターは該コード配列に機能的に連結されている。一般に「機能的に連結された」とは、連結された配列が連続していることを意味し、必要であれば２つのタンパク質コード領域を連続かつリーディングフレームが揃うように一緒にすることを意味する。しかしながら、エンハンサーのような特定の遺伝的エレメントは離れていても、すなわち連続していなくても機能的に連結しうることが周知である。
【００４１】
「上流」および「下流」という用語は機能により定義され、コードヌクレオチド配列鎖の方向または極性について言う。「上流」方向とは、当該ヌクレオチドが所定のポリヌクレオチド配列の５’方向に位置する、すなわち開始ヌクレオチド方向に位置することを意味する。アミノ酸配列に関する「上流」という用語は、Ｎ末端方向、すなわちポリペプチド鎖の開始位置に向かう方向に位置するアミノ酸を意味する。好ましくは、ＳｌｐＡシャペロン単位をコードするヌクレオチド配列は、標的ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の上流に位置する。
【００４２】
「下流」方向とは、当該ヌクレオチドがポリヌクレオチドの３’方向に位置する、すなわちヌクレオチド配列の末尾方向に位置することを意味する。アミノ酸配列に関する「下流」という用語は、Ｃ末端方向、すなわちポリペプチド鎖の末尾方向に位置するアミノ酸を意味する。
【００４３】
ポリヌクレオチドは、そのネイティブな状態でまたは当技術分野で公知の手法により操作されたときに、該ポリヌクレオチドがヌクレオチド鋳型に転写され得るおよび／またはポリペプチドまたはその断片を生じるよう翻訳され得るときに、当該ポリペプチドを「コードする」または「コードしている」と言う。
【００４４】
本発明の別の態様は、機能的に連結された、標的ポリペプチドをコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列および、その上流または下流にある、ＳｌｐＡシャペロンをコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列を含む組換えＤＮＡ分子を含む発現ベクターである。
【００４５】
宿主に導入するために調製されたＤＮＡ構築物は、典型的にはその宿主により認識される複製システムを含み、これは所望の標的融合ペプチドをコードする意図されるＤＮＡ断片を含み、また、好ましくはポリペプチドコード部分に機能的に連結された転写および翻訳開始調節配列も含む。発現系（発現ベクター）には、例えば、複製起点または自己複製配列（ＡＲＳ）および発現制御配列、プロモーター、エンハンサーおよび必要なプロセシング情報部位、例えばリボソーム結合部位、ＲＮＡスプライシング部位、ポリアデニル化部位、転写終結配列、およびｍＲＮＡ安定化配列が含まれ得る。
【００４６】
適当なプロモーターおよび他の必要なベクター配列は、宿主内で機能するよう選択する。細菌、酵母、哺乳動物、昆虫、植物または他の細胞での発現に有用な多数のベクターが当技術分野で公知であり市販されている。さらに、遺伝子の複数コピーが得られるように、構築物を増幅可能な遺伝子に連結させることもできる。
【００４７】
発現およびクローニングベクターは多くの場合、選択マーカー、すなわち該ベクターで形質転換された宿主細胞の生存または増殖に必要なタンパク質をコードする遺伝子を含むが、かかるマーカー遺伝子は宿主細胞に共に導入される別のポリヌクレオチド配列が保有してもよい。該マーカー遺伝子を発現する宿主細胞のみが選択的条件下で生存および／または増殖する。典型的な選択遺伝子としては、限定するものではないが、（ａ）抗生物質もしくは他の有毒物質（例えばアンピシリン、テトラサイクリン、など）に対する耐性を付与するタンパク質、（ｂ）栄養要求性の欠乏症を補完するタンパク質、または（ｃ）複合培地からは得られない重要な栄養素を供給するタンパク質をコードする遺伝子が挙げられる。適当な選択遺伝子は宿主細胞に応じて選ばれ、種々の宿主について適当なマーカーが当技術分野で公知である。
【００４８】
対象のポリヌクレオチドを含むベクターは、当技術分野で既知のどのような方法により宿主細胞に導入してもよい。こうした方法は当該宿主系の種類に応じて異なり、塩化カルシウム、塩化ルビジウム、リン酸カルシウム、ＤＥＡＥ−デキストラン、および他の物質を用いたトランスフェクション、ならびにウイルスによる感染が挙げられるがこれに限らない。多量の本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチドは、適合可能な宿主細胞内でベクターまたは他の発現ビヒクル中の本発明のポリヌクレオチドを発現させることで調製することができる。最も一般的に用いられる原核生物宿主は大腸菌（Escherichia coli）の株であるが、枯草菌（Bacillus subtilis）のような他の原核生物を使用することもできる。
【００４９】
大腸菌（Escherichia coli）での発現は、本発明を実施する好ましい様式の一つである。少なくとも１つのＳｌｐＡ単位および少なくとも１つの標的ポリペプチドＸ単位を含む融合タンパク質の発現、または可溶性ＳｌｐＡ−Ｘ複合体を得るためのＳｌｐＡとＸの共発現は、ＳｌｐＡとＸが共有結合により連結されているか否かを問わず、原核生物でも真核生物宿主細胞でも実施可能である。
【００５０】
本発明におけるベクターの構築には慣用のライゲーション技術を用いる。単離されたプラスミドまたはＤＮＡ断片を切断し、調整し、所望の形態に再度ラーゲーションして、必要なプラスミドを作製する。所望であれば、構築されたプラスミド中に正しい配列があることを確認するための分析を公知の様式で行う。発現ベクターの構築、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写産物の調製、ＤＮＡの宿主細胞への導入、および発現と機能の評価の分析を実施するための好適な方法は当業者に知られている。遺伝子の存在、増幅および／または発現は、サンプルから直接測定することができる。これには例えば、適切に標識されたプローブ（本明細書に提供する配列に基づくものであり得る）を用いる、慣用のサザンブロッティング、ｍＲＮＡの転写を定量するためのノーザンブロッティング、ドットブロット（ＤＮＡまたはＲＮＡ分析）、またはｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションによる。当業者は所望であればこうした方法をどのように改変できるか、容易に想定することができる。
【００５１】
本発明のさらなる実施形態は、機能的に連結された、標的ポリペプチドをコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列、およびその上流または下流のＳｌｐＡシャペロンをコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列を含む組換えＤＮＡ分子を含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞である。
【００５２】
本発明の別の実施形態は、原核生物または真核生物宿主でのＳｌｐＡおよび標的ポリペプチドの共発現方法に関する。これにより過剰産生されるＳｌｐＡは標的ポリペプチドと相互作用して可溶性で非共有結合性の複合体を形成し、これがネイティブ様にフォールディングされ、かつ活性な標的ポリペプチドの調製を促進する。このことは、ＳｌｐＡおよび標的ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列が同じベクター中に配置され、同一または異なるプロモーターにより制御され得ることを意味する。あるいは、ＳｌｐＡおよび標的ポリペプチドをコードするＤＮＡ分子は、異なる適合性のベクター上に配置されていてもよい。ＳｌｐＡと標的ポリペプチドの同時発現のためには、宿主細胞を両方のベクターで形質転換する。好ましくは、標的タンパク質およびＳｌｐＡをコードする遺伝子は、異なる誘導物質に応答する異なるプロモーターにより制御される。したがって、ＳｌｐＡと標的タンパク質の誘導は、制御され規定された様式で同時にまたは連続して行うことができる。例えば、機能性のシャペロンの基底レベルをつくり出すためにまずＳｌｐＡ発現を誘導し、次いでその後、標的遺伝子の誘導を行うことができる。この連続的な手法とは別に、フォールディングヘルパーおよび標的ポリペプチドの同時誘導も可能であり、同様に可溶性で機能的な標的タンパク質を生じ得る。ＳｌｐＡおよび標的タンパク質をコードする遺伝子はそれぞれ、同一または異なるベクター上に配置され得る。
【００５３】
「融合タンパク質」という用語は、別の状況では分離されている２つのポリペプチドが単一のポリペプチド鎖に機能的に結合されていることを意味する。該融合タンパク質のそれぞれの要素、すなわちＳｌｐＡシャペロン部分および標的ポリペプチド部分（標的ポリペプチドＸとも言う）は、互いに直接隣接していてもよい。あるいは、それぞれの要素は１〜１００アミノ酸残基、好ましくは５〜３０アミノ酸残基、最も好ましくは約２０アミノ酸残基のリンカーにより隔てられている。当業者が理解するように、かかるリンカーポリペプチドは、意図する用途に最適となるように、特に長さ、柔軟性、電荷および親水性を考慮して、設計される。リンカーポリペプチド配列はまた、タンパク質分解的な切断部位を有しうる。場合により、融合タンパク質は、フォールディングが行われるべき所望の区画へとタンパク質を標的化するためのシグナルペプチド配列をも含み得る。
【００５４】
本発明によると、２以上の標的ポリペプチドＸ、例えば２つ、３つまたは４つの標的ポリペプチドのコピーが融合タンパク質の一部を構成してもよい。一例として、ＳｌｐＡ−Ｘ２とは、１つのＳｌｐＡ単位が２つのＸ型の標的ポリペプチド単位に融合していることを意味する。単一の標的ポリペプチド単位は、リンカーポリペプチド部分により離れていてもいなくてもよい。該融合タンパク質は少なくとも１つのＳｌｐＡシャペロン単位を含有する。同様に、タンデム、３重またはさらに高次の組み合わせ（例えばＳｌｐＡ−ＳｌｐＡ−ＸまたはＳｌｐＡ−ＳｌｐＡ−ＳｌｐＡ−Ｘ）により、融合タンパク質が構成されていてもよい。同様に、標的ポリペプチドが少なくとも２つのシャペロン単位により挟まれている融合タンパク質（例えばＳｌｐＡ−Ｘ−ＳｌｐＡまたはＳｌｐＡ−ＳｌｐＡ−Ｘ−ＳｌｐＡ−ＳｌｐＡ）も本発明の一部である。
【００５５】
ＳｌｐＡはＦＫＢＰファミリーの推定上のペプチジルプロリルシス／トランスイソメラーゼである。SwissProt 登録番号P0AEM0として公開されている大腸菌（E. coli）ＳｌｐＡアミノ酸配列を配列番号１に示す。
【００５６】
本発明において、「ＳｌｐＡシャペロンをコードするヌクレオチド配列」という用語は、ＳｌｐＡのポリペプチド結合部分を含むポリペプチド断片をコードするヌクレオチド配列を言う。シャペロンの「ポリペプチド結合部分」という用語は、シャペロンの結合能のある部分、すなわち対象または基質ポリペプチド鎖に結合しそれを保持し、したがって該ポリペプチド鎖を隔離して凝集傾向のあるフォールディング中間体の濃度を低減し、その後のフォールディングを促進する部分を言う。ＳｌｐＡの「ポリペプチド結合部分」のことをＩＦドメイン（ｉｎｓｅｒｔ ｉｎ ｆｌａｐ ｄｏｍａｉｎ）とも呼ぶ。自律的なフォールディング単位と定義されるタンパク質ドメインは、適切な再フォールディング条件下で水溶液中でネイティブ様の安定なフォールディングをとることができる。「ポリペプチド結合部分」、「ＩＦループ」、ＩＦドメインまたはシャペロンドメインという用語は、同意語として使用することができる。
【００５７】
本発明の「ＳｌｐＡ」または「ＳｌｐＡシャペロン」または「ＳｌｐＡ単位」は、ＳｌｐＡのポリペプチド結合部分またはＩＦドメインを含む。好ましくは、大腸菌（E. coli）ＳｌｐＡ分子全体を融合パートナーとして使用する。あるいは、ＳｌｐＡ ＩＦドメインを融合パートナーとして用いる。これはＮ末端が配列番号２のアミノ酸番号５９〜７８に位置する任意のアミノ酸から開始され、Ｃ末端が配列番号２のアミノ酸番号１２５〜１３９に位置する任意のアミノ酸で終わる断片を少なくとも含む。最も好ましいのは、Ｎ末端が配列番号２のアミノ酸番号７２（バリン７２）で開始され、Ｃ末端が配列番号２のアミノ酸番号１３２（トレオニン１３２）で終了するポリペプチドをコードする配列である。本発明によれば、ＳｌｐＡはこのシャペロンの成熟した非ヒト化形態を言う。これは、ＳｌｐＡシャペロンが、ＦＫＢＰ１２またはどのような他のヒトＦＫＢＰのＮ末端もしくはＣ末端隣接配列をも有しないことを意味する。
【００５８】
本発明によれば、プロリルイソメラーゼとシャペロン活性の組み合わさった、他の生物由来のＳｌｐＡシャペロンホモログをフォールディングヘルパーとして使用することができる。かかるＳｌｐＡホモログは以下の生物に由来し得る（Swiss ProtデータベースＩＤ番号を括弧内に示す）：シゲラ・フレキシネリ（Shigella flexneri）（Prot. ID. P0AEM3）、シゲラ・ソネイ（Shigella sonnei）（Prot. ID Q3Z5Y2）、志賀赤痢菌（Shigella dysenteriae）（Prot. ID Q32K69）、シトロバクター・コセリ（Citrobacter Koseri）（Prot. ID A8ALT4）、チフス菌（Salmonella typhi）（Prot. IDQ8XG79）、ネズミチフス菌（Salmonella typhimurium）（Prot. ID Q7CR92）、パラチフス菌（Salmonella paratyphi）AおよびB（Prot. ID Q5PKI5およびA9MYG7）、サルモネラ・コレラスイス（Salmonella choleraesuis）（Prot. ID Q57TL3）、肺炎桿菌（Klebsiella pneumoniae）（Q9RF46）、サルモネラ・アリゾナエ（Salmonella arizonae）（Prot. ID A9MR44）、エンテロバクター属種（Enterobacter sp.）（Prot. ID A4W6E3）、エンテロバクター・サカザキ（Enterobacter sakazakii）（A7MIM1）、セラチア・プロテアマキュランス（Serratia proteamaculans）（Prot. ID A8G9L6）、ペスト菌（Yersinia pestis）（Prot. ID Q8CZP4またはQ0WJI9）、仮性結核菌（Yersinia pseudotuberculosis）（Prot. ID A7FMD5）、エルシニア・エンテロコリチカ（Yersinia enterolitica）（A1JJE3）、エルウィニア・カロトボーラ（Erwinia carotovora）（Prot. ID Q6D0C5）、フォトラブダス・ルミネッセンス（Photorabdus luminescens）（Prot. ID Q7N8X0）、ソダリス・グロッシニジウス（Sodalis glossinidius）（Prot. ID Q2NVY4）、イディオマリナ・バルチカ（Idiomarina baltica）（Prot. ID A3WMS1）、ビブリオ・ハーベイ（Vibrio harveyi）（Prot. ID A6ATG3またはA7MTD8）、ビブリオ・バルニフィカス（Vibrio vulnificus）（Prot. ID Q7MNM6またはQ8DES9）、ビブリオ・カンプベリー（Vibrio campbellii）（Prot. ID A8T7R0）、ビブリオ・シロニイ（Vibrio shilonii）（Prot. ID A6D8Q3）、ビブリオ・スプレンディダス（Vibrio splendidus）（Prot. ID A3UXQ8）、イディオマリナ・ロイヒエンシス（Idiomarina loihiensis）（Prot. ID Q5QZR6）、ビブリオ・アルギノリティカス（Vibrio alginolyticus）（Prot. ID Q1V5T9）、アエロモナス・サルモニシダ（Aeromonas salmonicida）（Prot. ID A4SIX7）、フォトバクテリウム属種（Photobacterium sp.）（Q2C7V1）、ビブリオ・パラヘモリティカス（Vibrio parahaemolyticus）（Prot. ID Q87S88またはA6B565）、シュードアルテロモナス・アトランティカ（Pseudoalteromonas atlantica）（Prot. ID Q15R06）、コレラ菌（Vibrio cholerae）（Prot. ID A5F8X4、もしくはQ9KU45、もしくはA6Y5H7、もしくはA6XZU4、もしくはA6ADB4、もしくはA6A5W5、もしくはA3H4C9、もしくはA3GPA9、もしくはA3EG01、もしくはA2PSS5、もしくはA2P8T9、もしくはA1F6Q8）、アエロモナス・ヒドロフィラ（Aeromonas hydrophila）（Prot. ID A0KG41）、ビブリオ・アングスタム（Vibrio angustum）（Prot. ID Q1ZMQ4）、モリテーラ属種（Moritella sp.）（Prot. ID A6FG75）、シュードアルテロモナス・ハロプランクティス（Pseudoalteromonas haloplanktis）（Prot. ID Q3IEA0）、アルテロモナデールス・バクテリウム（Alteromonadales bacterium）（Prot. ID A0Y1B2）、サイクロモナス・イングラハミー（Psychromonas ingrahamii）（Prot. ID A1SZP1）、ビブリオ・フィシェリィー（Vibrio fischeri）（Prot. ID Q5E7N2 またはA9IPH0）、フォトバクテリウム・プロファンダム（Photobacterium profundum）（Prot. ID Q1Z378またはQ6LUK9）、シュードアルテロモナス・チュニカータ（Pseudoalteromonas tunicata）（Prot. ID A4C627）、サイクロモナス属種（Psychromonas sp.）（Prot. ID Q1ZHS3）、レイネカ属種（Reineka sp.）（Prot. ID A4BJL0）、ビブリオ・サイクロエリサス（Vibrio psychroerythus）（Prot. ID Q486T8）、シュワネラ・アマゾネンシス（Shewanella amazonensis）（Prot. ID A1S427）、シュワネラ属種（Shewanella sp.）（Prot. ID Q0HFZ1、もしくはQ0HS84、もしくはA0KZY9）、シュワネラ・ペアレアナ（Shewanella pealeana）（Prot. ID A8H1H5）、シュワネラ・フリジディマリナ（Shewanella frigidimarina）（Prot. ID Q07Z37）、シュワネラ・デニトリフィカンス（Shewanella denitrificans）（Prot. ID Q12KM6）、シュワネラ・ロイヒカ（Shewanella loihica）（Prot. ID A3QBX4）、およびシュワネラ・プトレフェーシェンス（Shewanella putrefaciens）（Prot. ID A4Y4A6）。
【００５９】
本発明によれば、ＳｌｐＡシャペロン配列は、ＳｌｐＡシャペロンの全体的な構造、機能および安定性が維持されるならば、アミノ酸置換、好ましくは相同性の置換、欠失および挿入により改変されていてもよい。かかるＳｌｐＡ変異体の機能の保持は、調べている標的ポリペプチドおよびＳｌｐＡシャペロン配列を含む融合タンパク質の融解温度を決定することにより容易に試験することができる。融解温度は、５０％の分子がフォールディングされ、５０％の分子が未フォールディングである温度と定義される。すなわち融解温度は、所定のバッファー系と所定のタンパク質濃度での熱誘導性の逆フォールディング遷移の中間点を表す。芳香族残基の含有量に応じて、タンパク質の融解温度を、ＵＶ吸収、蛍光または円偏光二色性のような単純な分光学的調査によりモニタリングすることができる。特に円偏光二色性は、タンパク質の二次構造（アミドＣＤまたは遠紫外ＣＤ）におけるかまたは三次構造（芳香族ＣＤまたは近紫外ＣＤ）におけるコンホメーション変化をモニタリングするのに適している。
【００６０】
近紫外ＣＤにより評価されるＳｌｐＡの熱誘導性の逆フォールディングからは、逆フォールディング過程が完全に可逆的であること、すなわちサンプルが９５℃から周囲温度、つまり１５〜２５℃まで冷却されるとＳｌｐＡが自発的にそのネイティブなコンホメーションに再び戻ることが明らかにされている。このフォールディングと逆フォールディングの可逆性は、バイオテクノロジー用途における理想的なフォールディングヘルパーにとって極めて重要な前提条件である。多くの場合、組換え融合タンパク質は、強く過剰産生されると大腸菌（E. coli）細胞質内で封入体として蓄積する。この場合、７．０Ｍ塩化グアニジンもしくは尿素のような他のカオトロピック物質に溶解された細菌細胞または封入体から出発して、強力で効果的な再生プロトコルを構築する必要がある。所望の対象タンパク質のｉｎ ｖｉｔｒｏでの再フォールディングを助けるには、どのようなシャペロン融合パートナーの再フォールディングも、十分に強固、効果的、そして可逆的でなければならないことは自明であろう。従来技術で公知の多数の融合パートナー、例えばＮｕｓＡ、ＭＢＰ（マルトース結合タンパク質）およびＧＳＴ（グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ）は、宿主細胞内で翻訳されるとき非常に強力なｄｅ ｎｏｖｏフォールディングを示すが、熱または化学的に誘導される逆フォールディング後は容易に再フォールディングすることができない。したがってこうした融合パートナーは、宿主系内での標的タンパク質の可溶性の発現を目的として使用される。該融合パートナーが、宿主細胞内での翻訳に際して、ｄｅ ｎｏｖｏフォールディング中に対象タンパク質に溶解性を付与することができないと、凝集した融合タンパク質をｉｎ ｖｉｔｒｏ再生手段により回収することは困難になる。本発明によれば、ＳｌｐＡのような完全に可逆性の融合パートナーは、宿主細胞でのｄｅ ｎｏｖｏフォールディングに際して可溶性タンパク質の産生をもたらすことから、明確な利点を有する。さらにＳｌｐＡは、そのフォールディング可逆性ゆえに、宿主細胞での大量過剰産生により不溶性の封入体として蓄積した融合ポリペプチドのｉｎ ｖｉｔｒｏ再フォールディングを助けるために使用することができる。本発明によれば、逆フォールディングの完全な可逆性と高い固有安定性および実質的なシャペロン特性との組み合わせは、融合パートナーの重要な前提条件である。ＳｌｐＡはこうした基準を完全に満たす。
【００６１】
本発明によれば、ＳｌｐＡシャペロンをコードする１以上、好ましくは２つのヌクレオチド配列が標的ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の上流に配置され、その結果、２つの隣接するＳｌｐＡ単位を含むタンデムＳｌｐＡシャペロンが生じる。ＳｌｐＡシャペロンをコードするこの１以上のヌクレオチド配列は、１〜１００アミノ酸のペプチドリンカーを（インフレームで）コードするヌクレオチド配列により隔てられていてもよい。この２つのＳｌｐＡシャペロン単位をコードするに当たり、異なるヌクレオチド配列を用いることができる。同様に、融合ポリペプチド内の他の全ての高度に反復的なエレメント、例えばリンカーまたはスペーサー部分をコードするに当たり異なるヌクレオチド配列を用いるべきである。こうしたヌクレオチド配列は、大腸菌（E. coli）宿主での意図しない組換えイベントに起因するＳｌｐＡコード配列の喪失を避けるために、縮重しているべきである。同一または繰り返しのアミノ酸配列について異なるコドンを慎重に選択することにより、発現カセットの安定性を保証することができる。
【００６２】
本発明の「標的ポリペプチド」は、溶解性または安定性が制限されており、好適ではない条件下で凝集する傾向があり、フォールディングヘルパーによる補助または支援を必要とするどのようなポリペプチドであってもよく（すなわちどのようなアミノ酸配列を有してもよい）、ただしＦＫ５０６結合タンパク質（ＦＫＢＰ）、特にヒトＦＫ５０６結合タンパク質は標的ポリペプチドから除外される。これはヒトＦＫＢＰ１２のようなＦＫ５０６結合タンパク質が標的ポリペプチドから除外されることを意味する。好ましい実施形態では、凝集傾向を示しかつ／または熱ストレスに感受性であるポリペプチドを標的ポリペプチドとして用いることができる。さらに、酵素活性のあるポリペプチドは本発明における好ましい標的ポリペプチドである。特に、疎水性基質を受容しターンオーバーさせる酵素（したがって該酵素自身が疎水性表面パターンを有する）は本発明における好ましい標的ポリペプチドである。さらなる好ましい実施形態では、細菌性またはウイルス性タンパク質またはプリオンタンパク質または関節リウマチに関連するタンパク質を標的ポリペプチドとして使用する。
【００６３】
哺乳動物病原体のどのような構造的、膜会合型、膜結合型、または分泌型の遺伝子産物を標的ポリペプチドとして用いてもよい。哺乳動物病原体としては、哺乳動物宿主に感染するかまたは寄生することのできるウイルス、細菌、単細胞または多細胞寄生生物が挙げられる。例えば、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、ワクシニアウイルス、ポリオウイルス、アデノウイルス、インフルエンザウイルス、Ａ型肝炎ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、デングウイルス、日本脳炎ウイルス、水痘帯状疱疹ウイルス、サイトメガロウイルス、エプスタイン・バーウイルス、ロタウイルス、ならびに麻疹、黄熱病、流行性耳下腺炎、狂犬病、ヘルペス、インフルエンザ、パラインフルエンザなどを引き起こすウイルスなどのウイルスに由来するポリペプチドを、本発明の融合タンパク質での標的ポリペプチドとして使用することができる。例えばコレラ菌（Vibrio cholerae）、チフス菌（Salmonella typhi）、梅毒トレポネーマ（Treponema pallidum）、ヘリコバクター・ピロリ菌（Helicobacter pylori）、百日咳菌（Bordetella pertussis）、肺炎連鎖球菌（Streptococcus pneumoniae）、ヘモフィルス・インフルエンザエ菌（Haemophilus influenzae）、破傷風菌（Clostridium tetani）、ジフテリア菌（Corynebacterium diphtheriae）、ハンセン菌（Mycobacterium leprae）、リケッチア・リケッチイ（R. rickettsii）、赤痢菌（Shigella）、淋菌（Neisseria gonorrhoeae）、髄膜炎菌（Neisseria meningitidis）、コクシジオイデス・イミティス（Coccidioides immitis）、ボレリア・ブルグドルフェリ（Borrelia burgdorferi）などに由来する細菌性タンパク質を標的ポリペプチドとして使用することができる。
【００６４】
本発明の方法により好ましく製造される標的ポリペプチドのさらなる例としては、酵素、サイトカイン、増殖因子、ホルモン、ワクチン、抗体などの哺乳動物遺伝子産物が挙げられる。より詳細には、本発明の好ましい過剰発現遺伝子産物としては、エリスロポエチン、インスリン、ソマトトロピン、成長ホルモン放出因子、血小板由来増殖因子、上皮成長因子、トランスフォーミング増殖因子α、トランスフォーミング増殖因子、上皮増殖因子、線維芽細胞増殖因子、神経成長因子、インスリン様増殖因子Ｉ、インスリン様増殖因子ＩＩ、凝固因子ＶＩＩＩ、スーパーオキシドジスムターゼ、インターフェロン、γ−インターフェロン、インターロイキン−１、インターロイキン−２、インターロイキン−３、インターロイキン−４、インターロイキン−５、インターロイキン−６、顆粒球コロニー刺激因子、多分化コロニー刺激因子、顆粒球マクロファージ刺激因子、マクロファージコロニー刺激因子、Ｔ細胞増殖因子、リンホトキシンなどの遺伝子産物が挙げられる。好ましい過剰発現遺伝子産物はヒト遺伝子産物である。
【００６５】
診断用途において、例えば測定対象のアナライトが抗体であるときには、標的ポリペプチドは測定対象の抗体により認識される少なくとも１つのエピトープを有する。このようなエピトープは、診断に関連するエピトープとも呼ばれる。本発明の標的ポリペプチドはまた、単一の組換えポリペプチドとして発現されるように構築された複数の異なるタンパク質由来の診断に関連するエピトープのような配列を含みうる。好ましくは、標的ポリペプチドは長さが１０〜５００アミノ酸である。
【００６６】
最も好ましくは、標的ポリペプチドは、ＨＩＶ−１由来のｇｐ４１およびｐ１７、ＨＩＶ−２由来のｇｐ３６およびｐ１６、ＨＴＬＶ−Ｉ／ＩＩ由来のｇｐ２１のようなレトロウイルスタンパク質からなる群、ルベラウイルス由来のＥ１およびＥ２のようなウイルスエンベロープタンパク質からなる群、またはβ−ＡＰ４２（アルツハイマーペプチド）もしくはプリオンタンパク質のようなアミロイド生成性タンパク質からなる群のメンバーである。
【００６７】
また、単純ヘルペスウイルス１由来の糖タンパク質Ｇ１および単純ヘルペスウイルス２由来の糖タンパク質Ｇ２も、標的ポリペプチドとして好ましい。より正確には、これらに対応する、シグナル配列および膜貫通領域を欠いた糖タンパク質断片（ｇＧ１ ２６−１８９、ｇＧ２ ３４３−５９４）は好適な標的ポリペプチドである。
【００６８】
標的ポリペプチドとしてさらに好ましいのは、ヒトサイトメガロウイルス由来の以下のタンパク質およびタンパク質断片である：ｐｐ２８（１５−１７９）、ｐｐ１５０（８２１−１０４８）、ｐｐ１５０（５４７−７２５）、ｐｐ１５０（４９５−８５４）、ｐ３８（１０５−３０８）、ｐ３８（１０５−３７３）、ｐ３８（２０９−３０８）、ｐ５２（２５４−２９３）、ｐ５２（２９５−３３０）、ｐ５２（２９８−４３３）、ｇＢ（６７−８４）、ｐｐ６５（３７２−５４９）、およびｐｐ６５（３７２−４５８）。
【００６９】
また、トレポネーマ・パリダム（Treponema pallidum）由来の以下のタンパク質およびタンパク質断片も好ましい：ＴｐＮ１７（２３−１５６）、ＴｐＮ４７（２１−４３４）、ＴｐＮ１５（２３−１４２）、ＴｍｐＡ（２３−３４５）、およびＴｐＯ４５３（２７−２８７）。大腸菌（E. coli）宿主での発現時の細胞質への局在化を確実にするために、これらのトレポネーマ抗原全種のシグナル配列は除去されている。
【００７０】
さらなる好ましい標的ポリペプチドは、ボレリア由来の以下のタンパク質およびタンパク質断片である：内在的フラジェリン断片ｐ４１ｉ（１３７−２６２）、ＶｌｓＥ（ＩＲ６／Ｃ６）、ＤｂｐＡ（２６−１７５）、ＯｓｐＢ（１７−２９６）、およびＯｓｐＣ（１９−２１４）。
【００７１】
さらなる好ましい標的ポリペプチドはエプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）由来のタンパク質であり、例えば配列番号１３に示すＥＢＶ核抗原１（ＥＢＮＡ−１）、配列番号１４および１５にそれぞれ示すｐ１８のポリペプチドおよび断片、ならびに配列番号１６に示すｐ２３に由来するポリペプチドである。
【００７２】
こうした標的ポリペプチドはいずれも、ＳｌｐＡシャペロンに融合されたときに、アナライト（例えば標的ポリペプチドに対する抗体）の検出のための結合パートナーとしてイムノアッセイにおいて使用することができ、または以下に詳述するイムノアッセイにおける標準または較正用物質として使用することができる。
【００７３】
本発明のさらなる実施形態は、融合タンパク質の製造方法であって、以下のステップ：
（ａ）標的ポリペプチドをコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列、およびその上流または下流にあるＳｌｐＡシャペロンをコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列を含む宿主細胞を培養するステップ、
（ｂ）該融合タンパク質を発現させるステップ、
（ｃ）該融合タンパク質を精製するステップ、および
（ｄ）該融合タンパク質を可溶性かつネイティブ様のまたは免疫反応性（すなわち抗原性）のコンホメーションに再フォールディングさせるステップ
を含む方法である。この方法により製造される融合タンパク質も本発明の一態様である。
【００７４】
本発明の融合タンパク質は高い溶解性を示す。これらは細胞質ゾルにて低速で過剰発現されると主に可溶性画分に蓄積される。細胞増殖および誘導の条件に応じて、特に強力に過剰発現されると、ＳｌｐＡ−Ｘ遺伝子産物は封入体内に蓄積することもある。通常、当業者は可溶性の標的ポリペプチドを大腸菌（E. coli）細胞質ゾルにて過剰発現させようとする。次いで細胞を超音波処理またはリゾチーム／ＥＤＴＡを併用した処理により破壊し、推定上のネイティブ様フォールディングされた標的タンパク質を可溶性画分から分離する。これはＳｌｐＡ−Ｘ融合タンパク質について実行可能であり、標的ポリペプチドＸが十分に高い固有溶解性を有する場合には可溶性物質がもたらされる。標的ポリペプチドＸが非常に疎水性であり凝集傾向が強い場合には、マトリックス支援再生アプローチにてＳｌｐＡの効果的で強力な再フォールディング特性を利用する別の方法を用いることができる。細胞は適切なバッファー条件下、例えばカオトロピック物質（これらには強力な変性作用があり、疎水性の細胞成分や封入体でさえも可溶化させるが、ただし構造的完全性は犠牲にされる）中で溶解される。融合タンパク質がヘキサヒスチジン部分でＮ末端またはＣ末端にタグ付けされている場合、それらは未フォールディング状態でも金属含有カラム（Ｎｉ−ＮＴＡまたはＺｎ２＋またはＣｕ２＋担体）に特異的に結合することができる。固相に固定化されると、該分子は適切なバッファー条件下で容易にそして効率的に再フォールディングする。このいわゆるマトリックス支援再生（多種の取扱困難なタンパク質の再フォールディング収率を増大されることが示されている）は共有結合したＳｌｐＡにより強力に支援されるが、該ＳｌｐＡはそのシャペロン特性ゆえにフォールディング中間体中の疎水性パッチを認識しそれを可逆的にマスキングすると考えられる。実施例にて詳述する適切な精製および再フォールディングプロトコルは当業者に周知である。
【００７５】
本発明のさらなる態様はＳｌｐＡおよび標的ポリペプチド配列を含む任意の複合体に関し、これにはＳｌｐＡを任意のタンパク質製剤に添加することも含まれる。本発明のさらなる態様は、ＳｌｐＡに対応する少なくとも１つのポリペプチド配列および標的ポリペプチドに対応する少なくとも１つのポリペプチド配列を含む組換え的に製造された融合タンパク質に関する。本発明のさらなる態様は、単独での、または組換えもしくは合成起源の標的ポリペプチドとの組み合わせでの、合成的に製造されたＳｌｐＡに関する。
【００７６】
本発明によれば、ＳｌｐＡシャペロンは融合パートナーとして使用されたときに取扱困難な標的ポリペプチドの熱安定性を向上させることができる。ＳｌｐＡは、融合された標的ポリペプチドに熱安定性を付与し、このことにより実施例に示すように標的ポリペプチドは熱誘導性凝集の影響を受けにくくなる。大腸菌（E. coli）ＳｌｙＤに融合された非常に凝集傾向の強い標的タンパク質を熱ストレスに曝すと、得られる融合タンパク質は約４２℃で熱誘導性の凝集を開始するが、この温度はＳｌｙＤの固有安定性と概ね一致する。同じ標的タンパク質をＳｌｐＡ、好ましくは大腸菌（E. coli）ＳｌｐＡに融合させると、これは約５６℃まで安定であり可溶性である。例えば、ＳｌｙＤおよびＨＩＶタンパク質ｇｐ４１（配列番号５）由来の断片５３６−６８１を有する融合タンパク質は温度４２℃にて凝集し始めるのに対して、本発明にしたがい大腸菌（E. coli）ＳｌｐＡ（配列番号３）に融合された同じ標的タンパク質は５０℃を超える温度でも熱安定である。融合タンパク質の一部としてのＳｌｐＡは取扱困難なまたは凝集傾向の強いタンパク質を熱誘導性変性に続く凝集から保護することが見て取れる。
【００７７】
ＳｌｐＡの融合体が、さほど凝集傾向の強くないタンパク質またはタンパク質断片に対しても有益な効果を発揮することも見て取れる。ＨＳＶ−１由来の糖タンパク質Ｇ１の断片であるｇＧ１（２６−１８９）をＳｌｙＤに融合させると、得られる融合タンパク質は大部分が可逆的な様式で熱により逆フォールディング可能であり、このとき融解温度は約５３℃である（図７）。しかしながら、同じ断片をＳｌｐＡに融合させると、得られる融合タンパク質は約６３℃という熱誘導逆フォールディングの中間点温度を示す（図８）。明らかにｇＧ１融合ポリペプチドの安定性は、融合パートナーとしてＳｌｙＤをＳｌｐＡに置き換えると、１０℃ほどシフトする。この知見は、ＳｌｐＡ−Ｘ融合ポリペプチドがそのＳｌｙＤ−Ｘ対応物と比較して優れた安定性特性を有することを明確に実証している。
【００７８】
ＳｌｐＡ融合ポリペプチドのこのような優れた安定性特性がイムノアッセイにも反映されるか否かを明らかにするために、ＳｌｙＤ−ｇＧ１およびＳｌｐＡ−ｇＧ１の熱チャレンジされたサンプルを、抗ＨＳＶ陽性および陰性ヒト血清（実施例４）と共に用いて、熱ストレス後に回復するその免疫応答性に関して評価した。ストレスを加えていないサンプルと比較すると、明確な結果が観察された（実施例４および図９を参照されたい）：熱処理されたＳｌｙＤ−ｇＧ１およびＳｌｐＡ−ｇＧ１と抗ＨＳＶ陽性血清とにより生じるシグナルは全ての事例において減少したが、シグナル喪失はＳｌｙＤ融合変異体について大幅に顕著であった。逆に、熱処理されたＳｌｙＤ−ｇＧ１およびＳｌｐＡ−ｇＧ１と抗ＨＳＶ陰性血清とにより生じるバックグラウンドシグナルは全ての事例において増加した（ルテニウムコンジュゲート化抗原の凝集が進行していることを示す）が、やはりシグナル高の増加はＳｌｙＤ融合変異体の方が大幅に顕著であった。したがって該陽性および陰性血清の両方におけるシグナル出力から（すなわちシグナル動態に鑑みて）、ＳｌｐＡはｇＧ１（２６−１８９）のための融合パートナーとしてＳｌｙＤに明らかに勝る。明らかに、ＳｌｙＤの代わりにＳｌｐＡを融合パートナーとして用いることは、陰性血清における低いシグナルレベルおよび陽性血清における高いシグナル回復の両方を保証する。手短に述べると、ＳｌｐＡを融合パートナーとして用いることは、免疫グロブリンアナライトの検出用のポリペプチド抗原を含有するイムノアッセイキットを過酷な処理に供した後でさえも、その抜群のシグナル動態を保証する。十分に長くかつ柔軟な架橋物質（標準的な化学的手法による）を介して標的分子と共有結合しているＳｌｐＡまたは関連するシャペロンモジュールが、類似の可溶化効果を示すことは容易に想定できる。融合ポリペプチドが実現可能でない場合には、シャペロンと標的分子を別々に製造して再フォールディングさせ、その後共有結合により連結させる。
【００７９】
本発明のさらなる態様は、ＳｌｐＡシャペロンおよび標的ポリペプチドを含む、組換え的にまたは合成的に製造された融合タンパク質の、イムノアッセイにおける結合パートナーとしての使用に関する。イムノアッセイならびに種々の同種および異種成分試験フォーマットは当業者に周知である。これらは当業者に知られている任意の生物学的液体について実施することができる。好ましいサンプルは全血、血清、血漿、尿または唾液などの体液である。
【００８０】
ＳｌｐＡおよび少なくとも１つの標的ポリペプチドを含む本発明の融合ポリペプチドは、標準または較正用物質としても使用することができる。ＳｌｐＡは、イムノアッセイにおいて較正用物質として必要な扱いにくいタンパク質についても好適な融合パートナーである。例えば、本発明者らはＳｌｐＡと融合したトロポニンＩ変異体（残基１〜２０９を含む）をクローニングし、発現させ、精製した。得られた融合ポリペプチドＳｌｐＡ−トロポニンＩは可溶性であり免疫反応性であることが明らかになり、トロポニンＩイムノアッセイにおける標準較正物質として非常に適切であった。ＳｌｐＡ融合パートナーのために、トロポニンＩ部分の安定性は、単離されたトロポニンＩ（わずかにしか安定ではなく、好適なバッファー条件下でさえも自発的に凝集する）と比較して大幅に向上している。可溶性で安定な較正物質または標準物質を製造するための、取扱困難なタンパク質と組み合わせたＳｌｐＡの使用は、本発明のさらなる実施形態である。さらなる態様は、標的タンパク質の凝集を防ぎその溶解性を改善するための、ＳｌｐＡの添加物としての使用である。
【００８１】
本発明のさらなる実施形態は、単離されたサンプル中のアナライトに特異的な抗体の検出方法であって、以下のステップ：
（ａ）体液サンプルを、ＳｌｐＡシャペロンに対応する少なくとも１つのポリペプチドおよび標的ポリペプチドに対応する少なくとも１つのポリペプチドを含む融合タンパク質と混合することにより免疫反応性混合物を形成させるステップ、
（ｂ）該体液サンプル中に存在するアナライトに対する抗体が該融合タンパク質と免疫反応するのに十分な時間、該免疫反応性混合物を維持して、免疫反応生成物を形成させるステップ、ならびに
（ｃ）該免疫反応生成物のいずれかの存在を検出するステップ
を含む方法である。
【００８２】
好ましい実施形態において、特定の抗体の検出は、いわゆる二重抗原サンドイッチ試験（ＤＡＧＳ；ブリッジ試験とも言う）により行うことができる。この試験は、測定対象の当該特定の抗体アナライトが２つの同一または類似の抗原の間にブリッジを形成する異成分系フォーマットである。このフォーマットはハイスループット自動化分析器に容易に応用することができる。より詳細には、測定対象の抗体は、固相への固定化を仲介する第１抗原と、そして標識（すなわちシグナリング部分、例えば発色性、蛍光性、化学発光性、電気化学発光の標識または当業者に公知の他の標識）を有する第２抗原と、免疫複合体または免疫反応生成物を形成し、このことにより液体と固相の分離後に特異的に結合した抗体を定量的または定性的に検出することができる。したがって、調べている抗体がサンプル中に存在する場合にのみブリッジが形成され、シグナルが検出される。このようなアッセイフォーマットでは本発明の融合タンパク質を結合パートナーとして使用することができ、このとき固相に結合した抗原もしくは標識化抗原、またはその両方が大腸菌（E. coli）ＳｌｐＡシャペロンおよび標的ポリペプチドを含む融合タンパク質である。標的ポリペプチドは融合タンパク質の抗原性部分を構成する。
【００８３】
本発明の好ましい実施形態は、特定の抗体の検出のためのいわゆる非対称二重抗原サンドイッチ試験であり、ここではそれぞれがシャペロンと標的ポリペプチドを含む第１融合タンパク質および第２融合タンパク質を使用する。このフォーマットのことを非対称と呼ぶのは、両方の融合タンパク質のシャペロン単位が互いに異なるからである。例えば、第１融合タンパク質は、少なくとも１つのＳｌｐＡシャペロン単位および少なくとも１つの標的ポリペプチド単位を含むことができ、固相への特異的結合を仲介する部分、例えばストレプトアビジンコーティングされた固相に結合するビオチンを含むこともできる。第２融合タンパク質は、ＳｌｐＡとは異なる少なくとも１つのシャペロン単位および第１融合タンパク質の標的ポリペプチドと同一または類似の少なくとも１つの標的ポリペプチド単位を含み得る。さらに、後者の融合タンパク質はシグナル出力のためのシグナリング部分またはレポーター基を有し得る。
【００８４】
好ましくは、第２融合タンパク質のシャペロン単位も周囲温度で十分な固有柔軟性を有する（すなわち動的結合活性が高い）熱安定性のシャペロンである。第２融合タンパク質のシャペロン単位として好適な候補は、例えばＦｋｐＡ（融解温度約５０℃）およびパスツレラ・ムルトシダ（Pasteurella multocida）由来のＳｌｙＤオルソログのＣ末端切断型（システイン不含）変異体（融解温度約４９℃）である。この両種のシャペロンのアミノ酸配列（融合タンパク質中で好ましくはシャペロン単位として使用される完全配列および部分配列）を配列番号９〜１２に示す。第１および第２融合タンパク質のシャペロン単位は交換可能であり、すなわちＳｌｐＡが第２融合タンパク質の一部であってもよく、この場合、他方の熱安定性シャペロン（例えばＦｋｐＡまたはパスツレラ・ムルトシダ（Pasteurella multocida）のＳｌｙＤオルソログ）が第１融合タンパク質の一部であり得る。第１および第２融合タンパク質は、特定の抗体アナライトについて検査中のサンプルに同時にまたは連続的に加える。サンプル中に存在する場合に抗体は第１および第２融合タンパク質の標的ポリペプチド単位に結合し、そのことにより該第１および第２融合タンパク質の標的ポリペプチド部分を架橋し、免疫反応生成物または免疫複合体が生じる。
【００８５】
免疫複合体の形成の前、後、またはそれと同時に、マイクロビーズまたはＥＬＩＳＡプレートのような固相を作用させ、それにより第１融合タンパク質が固相に結合する。その結果、前記第１融合タンパク質、検出対象の抗体および前記第２融合タンパク質を含む免疫反応生成物（すなわち免疫複合体）全体が固相に結合する。固相の液相からの分離後に、免疫反応生成物の存在を検出することができる。別の方法として、第１融合タンパク質中に存在するシャペロン単位が第２融合タンパク質のためのシャペロン単位として利用可能であり、その逆もまた可能である。しかしながら、シャペロン単位は好ましくは両種の融合タンパク質において異なっているべきである。なぜなら、サンプル中のこれらのシャペロンに対する抗体の存在に起因する融合タンパク質の非アナライト特異的架橋の（予期しない）可能性があるからである。別の方法として、アッセイのいずれの側にも同一のシャペロン融合パートナーを用いる特異性の高いＤＡＧＳイムノアッセイも実施可能である。この場合、アッセイの開発者は、使用する融合パートナーに対する抗体がヒト血清のかなりの部分に存在する可能性が高いことを考慮しなければならない。こうした抗体はシグナリングポリペプチドを固相に架橋し、シグナルを増大させ、したがって偽陽性結果を生じる可能性がある。そのような干渉を回避するためには、融合パートナー（すなわちシャペロン単位）を、高度に多量体化されかつ未標識の形態でサンプルに抗干渉物質として加える。抗干渉物質は、融合パートナー、リンカー部分、スペーサーおよびタグ配列ならびに純正の抗原の一部ではないあらゆる他の部分に対する免疫グロブリンを効率的に捕捉するように設計する。化学的に多量体化された（すなわち架橋された）抗干渉物質は、その高いエピトープ密度ゆえに、抗シャペロン抗体の結合に関して標識化された融合ポリペプチドと効率的に競合することができる。このようにして望ましくない特異性の免疫グロブリンに起因する干渉を好適に信頼できる様式で排除することができる。体液などのあらゆる生物学的液体をサンプルとして使用することができる。好ましくは、血液、血清、血漿、尿または唾液を使用する。
【００８６】
標識基またはシグナリング基は、あらゆる公知の検出可能マーカーの群、例えば色素、発光標識化基、例えば化学発光基、例えば、アクリジニウムエステルもしくはジオキセタン、または蛍光色素、例えば、フルオレセイン、クマリン、ローダミン、オキサジン、レゾルフィン、シアニンおよびその誘導体から選択することができる。標識基の他の例は、発光金属錯体、例えばルテニウムもしくはユーロピウム錯体、例えばＥＬＩＳＡに用いる酵素、または放射性同位体である。
【００８７】
免疫複合体または免疫反応生成物の固相への結合は、例えばビオチンとストレプトアビジンのような生物学的に関連のある結合ペアの片方のパートナーを用いて行うことができる。好ましくは、ビオチンが本発明の融合タンパク質にカップリングされている。このビオチン・融合タンパク質コンジュゲートは、ストレプトアビジンコーティングされた固相に高い親和性で結合する。
【００８８】
アナライトの例はいずれも「標的ポリペプチド」の章において記載した病原因子およびこうした病原因子に対する抗体である。例えば本発明によれば、好ましくは、ＨＩＶ（ヒト免疫不全ウイルス）、ＨＴＬＶ−１／ＨＴＬＶ−ＩＩ（ヒトＴ細胞リンパ球向性ウイルスＩおよびＩＩ）、ＨＣＶ（Ｃ型肝炎ウイルス）、ＨＢＶ（Ｂ型肝炎ウイルス）、ＨＡＶ（Ａ型肝炎ウイルス）、ＨＣＭＶ（ヒトサイトメガロウイルス）、ＨＳＶ−１／−２（単純ヘルペスウイルス１型および２型）、ＥＢＶ（エプスタイン・バーウイルス）、水痘帯状疱疹ウイルス、ヒトヘルペスウイルス６、ヒトヘルペスウイルス７、ヒトヘルペスウイルス８、ルベラウイルス、トレポネーマ・パリダム（Treponema pallidum）、ヘリコバクター・ピロリ（Helicobacter pylori）、ボレリア（ボレリア・ブルグドフェリ（B. burgdorferi）、ボレリア・アフゼリー（B. afzelii）、ボレリア・ガリーニー（B. garinii））、トリパノソーマ・クルージィ（Trypanosoma cruzi）、およびトキソプラズマ原虫（Toxoplasma gondii）に対する抗体が特異的に検出可能である。
【００８９】
本発明のさらなる実施形態は、アナライトに対する抗体の検出用の試薬キットであり、該キットは標的ペプチドに対応する少なくとも１つのポリペプチド配列およびＳｌｐＡに対応する少なくとも１つのポリペプチド配列を有する融合タンパク質を含有する。かかる試薬キットのさらなる構成要素は当業者に知られており、バッファー、保存剤、標識物質および使用説明書などが挙げられる。
【００９０】
本発明のさらなる実施形態としては、組換え的にまたは合成的に製造された本発明の融合タンパク質の、イムノアッセイにおける干渉の低減のための使用、ならびに実験動物の免疫およびワクチンの製造のためのその使用が挙げられる。
【００９１】
本発明の別の実施形態は、ＳｌｐＡに対応する少なくとも１つのポリペプチド配列および標的ペプチドに対応する少なくとも１つのポリペプチド配列を含む、組換え的にまたは合成的に製造された融合タンパク質ならびに製薬上許容される賦形剤を含んでなる組成物に関する。
【００９２】
本発明によれば、ＳｌｐＡは、それを精製された形態で標的ポリペプチドに加えることにより、標的ポリペプチドのフォールディングヘルパーとして使用可能であり、これはＳｌｐＡを安定化または可溶化物質として任意のタンパク質製剤に加えることも包含する。例えば、ＳｌｐＡおよびペプチジルプロリルシス／トランスイソメラーゼのＦＫＢＰファミリー由来の関連フォールディングヘルパーを標的ポリペプチドのバイオテクノロジー的製造工程中にまたはその後に添加することができ、このことにより標的ポリペプチドに可溶性または熱安定性が付与される。かかるバイオテクノロジー用途としては、例えば酵素、インスリンのようなペプチドホルモン、またはより一般的には商用価値のあるタンパク質の工業的大規模生産が挙げられる。
【００９３】
本発明のさらなる実施形態において、ＳｌｐＡは、偽陽性結果を生じる免疫学的交差反応または干渉を低減または抑制するために、イムノアッセイ、特に二重抗原サンドイッチイムノアッセイフォーマットにおいて添加物として使用可能である。
【００９４】
より詳細には、イムノアッセイにおいて、ＳｌｐＡ−ＸまたはＳｌｐＡ−ＳｌｐＡ−Ｘ融合タンパク質を免疫グロブリンアナライトの検出のための抗原として用いることができ、このときＸはアナライト特異的抗体が結合する標的ポリペプチドである。干渉を低減するためにＳｌｐＡまたはＳｌｐＡ−ＳｌｐＡを抗干渉物質として添加し、シャペロン単位を介した免疫学的交差反応を回避する。好ましくは、エピトープ密度を高め、ＩｇＧおよびＩｇＭ分子のＳｌｐＡ、リンカー部分またはヘキサヒスチジンタグに対する結合を助けるために、ＳｌｐＡまたはＳｌｐＡ−ＳｌｐＡは、化学的に多量体化された形態で添加する。
【００９５】
ＳｌｐＡは標的分子に可溶性と安定性を付与するが、それは、当該特定の標的分子以外の他の部分または基と同様に、対応するイムノアッセイの特異性を低下させる免疫学的交差反応を引き起こし得る。この特異性の問題を克服するために、未標識のＳｌｐＡまたはＳｌｐＡ−ＳｌｐＡを、多量体化された形態でイムノアッセイ試薬中に提供する。このＳｌｐＡまたはＳｌｐＡ−ＳｌｐＡポリペプチドは、ＳｌｐＡ単位自身、任意のリンカーまたはスペーサーセグメント、ヘキサヒスチジンまたは他のタグモチーフおよびさらには標識部分など、不活性化形態でも交差反応を引き起こす可能性のあるすべてのエレメントを含む。こうした潜在的に干渉傾向のあるモチーフは、化学的架橋ゆえに、高いエピトープ密度で交差反応性抗体に供され、こうした潜在的に干渉性の抗体に結合しそれを中和するのに適している。この抗干渉効果以外にも、ＳｌｐＡまたはＳｌｐＡ−ＳｌｐＡ多量体はさらなる有利な効果を有し得る。すなわち、高度に多量体性のシャペロンであることから、これらはどのような固相表面の疎水性表面（例えばビーズ、マイクロタイタープレートおよびチューブまたは容器壁面）にも吸着可能であると考えられ、したがって必須の免疫学的成分の非特異的吸着を低減させる。さらに、これらは、そのシャペロン特性ゆえに他の免疫学的成分の溶解性にも寄与する可能性があり、これは多量体化された形態でさらに顕著であり得る。
【実施例】
【００９６】
本願発明を実施例によりさらに説明する。
【００９７】
実施例１
ＳｌｐＡおよびＳｌｙＤ融合ポリペプチドのクローニングと精製
発現カセットのクローニング
Novagen社（Madison, WI, USA）のｐＥＴ２４ａ発現プラスミドをもとに、ＳｌｙＤまたはＳｌｐＡ融合ポリペプチドをコードする発現カセットを得た。ｇｐ４１エクトドメインの配列はSwissProtデータベースから取得した。ｇｐ４１（ａａ５３６−６８１）をそのＮ末端にインフレームで融合されたグリシンリッチなリンカー領域と共にコードする合成遺伝子を、Medigenomix社（Martinsried, Germany）から購入した。コード領域の５’末端および３’末端にはそれぞれＢａｍＨＩおよびＸｈｏＩ制限部位がある。グリシンリッチなリンカー領域により連結され、そのＣ末端にさらなるリンカー領域の一部分を有する２つのＳｌｐＡ単位（配列番号１、SwissProt登録番号P0AEM0の残基１−１４６および２−１４９）をコードするさらなる合成遺伝子も同様にMedigenomix社から購入した。このカセットの５’末端および３’末端にはそれぞれＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩ制限部位がある。これらの遺伝子および制限部位は、単純なライゲーションによりＳｌｐＡ−ＳｌｐＡとｇｐ４１エクトドメイン断片をインフレームで融合できるように設計してあった。意図しない組換え反応を回避するため、および大腸菌（E. coli）宿主内での発現カセットの遺伝的安定性を向上させるために、ＳｌｐＡ単位をコードするヌクレオチド配列ならびに伸長されたリンカー領域をコードするヌクレオチド配列を縮重させた。すなわち、同一のアミノ酸配列をコードするに当たって、異なるコドンの組み合わせを使用した。
【００９８】
ｐＥＴ２４ａベクターをＮｄｅＩおよびＸｈｏＩで消化し、ＨＩＶ−１ ｇｐ４１エクトドメイン断片５３６−６８１にインフレームで融合されたタンデムＳｌｐＡを含むカセットを挿入した。ＳｌｐＡまたはタンデムＳｌｐＡの代わりにＳｌｙＤまたはタンデムＳｌｙＤを含む発現カセット、ならびにｇｐ４１と異なる標的ポリペプチドを含む発現カセットも、同様に構築した。全ての組換え融合ポリペプチド変異体は、Ｎｉ−ＮＴＡ支援精製および再フォールディングを容易にするためのＣ末端ヘキサヒスチジンタグを有していた。それぞれの発現カセットに点突然変異、欠失および伸長変異体または制限部位を生成するためにQuikChange（Stratagene社、La Jolla、CA、USA）および標準ＰＣＲ技術を用いた。
【００９９】
下の模式図は、得られるＨＩＶ−１ ｇｐ４１エクトドメイン断片５３６−６８１とそのＮ末端にインフレームで融合された２つのタンデムＳｌｐＡシャペロンを示す。
【０１００】
得られたプラスミドのインサートを配列決定し、所望の融合タンパク質をコードすることを確認した。完全アミノ酸配列を配列番号４に示す。リンカーＬのアミノ酸配列は配列番号１７に示す。
【０１０１】
ＳｌｐＡ、ＳｌｙＤならびにＳｌｐＡ、ＳｌｙＤ、およびＦｋｐＡを含む融合タンパク質の精製
ＳｌｙＤ、ＳｌｐＡ、および全ての融合タンパク質変異体は、実質的に同じプロトコルを用いて精製した。特定のｐＥＴ２４ａ発現プラスミドを担持する大腸菌（E. coli）ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞を３７℃にてカナマイシン（３０μｇ／ｍＬ）を添加したＬＢ培地でＯＤ６００１．５まで増殖させ、１ｍＭのイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトシドを添加することにより細胞質過剰発現を誘導した。誘導から３時間後に、細胞を遠心分離（５０００ｇにて２０分）により回収し、凍結し、−２０℃にて保存した。細胞を溶解させるために、凍結したペレットを氷冷５０ｍＭリン酸カリウムｐＨ８．０、７．０Ｍ ＧｄｍＣｌ、５ｍＭイミダゾールに再懸濁し、この懸濁物を２時間、氷上で攪拌し、細胞を完全に溶解させた。遠心分離と濾過（硝酸セルロースメンブレン、０．４５μｍ／０．２μｍ）の後に、溶解物を、５．０ｍＭ ＴＣＥＰを含む溶解バッファーで平衡化したＮｉ−ＮＴＡカラムに加えた。その後の洗浄ステップは、それぞれの標的タンパク質に合わせ、５０ｍＭリン酸カリウムｐＨ８．０、７．０Ｍ ＧｄｍＣｌ、５．０ｍＭ ＴＣＥＰ中の５〜１５ｍＭイミダゾールとした。少なくとも１０〜１５容の洗浄バッファーを加えた。次いで、ＧｄｍＣｌ溶液を５０ｍＭリン酸カリウムｐＨ７．８、１００ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭイミダゾール、５．０ｍＭ ＴＣＥＰで置換し、マトリックス結合タンパク質の立体構造的再フォールディングを誘導した。共に精製されるプロテアーゼの再活性化を避けるために、プロテアーゼ阻害剤カクテル（Complete（登録商標）ＥＤＴＡフリー、Roche社）を再フォールディングバッファーに追加した。合計１５〜２０カラム容量の再フォールディングバッファーを一晩かけて添加した。次いでＴＣＥＰおよびComplete（登録商標）ＥＤＴＡフリー阻害剤カクテルの両方を、３〜５カラム容量の５０ｍＭリン酸カリウムｐＨ７．８、１００ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭイミダゾールを用いた洗浄により除去した。次いでネイティブなタンパク質を同じバッファー中の２５０ｍＭイミダゾールにより溶出させた。タンパク質含有画分はトリシン−ＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いて純度を評価し、プールした。最後に前記タンパク質をサイズ排除クロマトグラフィー（Superdex HiLoad、Amersham Pharmacia社）に供し、タンパク質含有画分をプールしAmicon cell（YM10）で濃縮した。
【０１０２】
組み合わせた精製および再フォールディングプロトコルにより、１ｇの大腸菌（E. coli）湿細胞から、それぞれの標的タンパク質に応じて、約５〜２０ｍｇのタンパク質が得られた。
【０１０３】
実施例２
分光学的測定
タンパク質の二次および三次構造の両方を評価するためにここで選択した方法は、円偏光二色性分光法（ＣＤ）である。芳香族領域（２６０〜３２０ｎｍ）における楕円率はタンパク質内の三次的接触（すなわち規則的にフォールディングされたタンパク質の球状構造）を反映するのに対して、アミド領域（１９０〜２５０ｎｍ）における楕円率は、タンパク質骨格における規則的な繰り返しエレメント、すなわち二次構造を反映する。
【０１０４】
タンパク質濃度測定は、Uvikon XL二重光線分光光度計を用いて行った。モル吸光係数 （ε２８０）は、Pace(1995), Protein Sci. 4, 2411-2423に記載の方法を用いて決定した。
【０１０５】
近紫外ＣＤスペクトルは、温度自動調節されたセルホルダーを備えたJasco-720分光偏光計で記録し、平均残存楕円率に変換した。バッファーは５０〜１５０ｍＭリン酸カリウムｐＨ７．５、１００ｍＭ ＫＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡとした。光路は０．５ｃｍまたは１．０ｃｍとし、タンパク質濃度は２０〜５００μＭとした。バンド幅は２ｎｍとし、スキャン速度は５０ｎｍ／分とし、解像度は０．５ｎｍとし、応答は１または２秒とした。シグナル／ノイズ比を改善するために、スペクトルを９回測定し平均した。
【０１０６】
遠紫外ＣＤスペクトルは、温度自動調節されたセルホルダーを備えたJasco-720分光偏光計で測定し、平均残存楕円率に変換した。バッファーは１０ｍＭリン酸カリウムｐＨ７．５、２５ｍＭ ＫＣｌ、０．５ｍＭ ＥＤＴＡとした。光路は０．２ｃｍとし、タンパク質濃度は２．５〜２０μＭとした。バンド幅は２ｎｍとし、スキャン速度は５０ｎｍ／分とし、解像度は０．５ｎｍとし、応答は１または２秒とした。シグナル／ノイズ比を改善するために、スペクトルを９回測定し平均した。
【０１０７】
実施例３
ビオチンおよびルテニウム部分の融合タンパク質へのカップリング
融合ポリペプチドのリシンε−アミノ基を、１０〜２０ｍｇ／ｍＬのタンパク質濃度にて、Ｎ−ヒドロキシ−スクシンイミド活性化ビオチンおよびルテニウム標識でそれぞれ修飾した。標識／タンパク質比は、それぞれの融合タンパク質に応じて、２：１〜５：１（モル：モル）とした。反応バッファーは１５０ｍＭリン酸カリウムｐＨ８．０、１００ｍＭ ＫＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡとした。反応は室温で１５分間行い、緩衝化Ｌ−リシンを最終濃度１０ｍＭまで添加することにより停止させた。標識の加水分解による不活性化を回避するために、それぞれのストック溶液は乾燥ＤＭＳＯ（seccosolv（登録商標）等級、Merck社、Germany）中で調製した。調べた全ての融合タンパク質は、反応バッファー中の最大１５％までのＤＭＳＯ濃度を許容した。カップリング反応後に、未反応の遊離標識は、粗製のタンパク質コンジュゲートをゲル濾過カラム（Superdex 200 HiLoad）に通すことにより除去した。
【０１０８】
実施例４
ポリペプチド融合タンパク質の免疫学的反応性
種々の融合タンパク質の免疫学的反応性（すなわち抗原性）を、自動化されたElecsys（登録商標）2010分析器（Roche Diagnostics GmbH社）で評価した。Elecsys（登録商標）はRocheグループの登録商標である。測定は二重抗原サンドイッチフォーマットで行った。
【０１０９】
Elecsys（登録商標）2010でのシグナル検出は電気化学発光に基づく。ビオチンコンジュゲート（すなわち捕捉抗原）はストレプトアビジンコーティングされた磁気ビーズの表面に固定化し、検出抗原は複合体化されたルテニウムカチオン（レドックス状態２＋および３＋の間を遷移する）をシグナリング部分として有する。特定の免疫グロブリンアナライトの存在下で、発色性のルテニウム複合体を固相と架橋し、白金電極による励起後に６２０ｎｍにて発光させる。シグナル出力は任意の光単位で示す。
【０１１０】
捕捉抗原および検出抗原のいずれについても、ＨＳＶ−１特異的抗原性配列としてＨＳＶ−１抗原ｇＧ１（アミノ酸２６−１８９、配列番号７および８を参照されたい）を有する融合ポリペプチドをアッセイに使用した。ｇＧ１抗原はＳｌｐＡまたはＳｌｙＤのいずれかに融合させた。二重抗原サンドイッチイムノアッセイにおいてＳｌｐＡ−ｇＧ１（２６−１８９）−ビオチンコンジュゲートをＳｌｐＡ−ｇＧ１（２６−１８９）−ルテニウム複合体コンジュゲート（本発明）と共に、それぞれ１００ｎｇ／ｍＬの濃度で加えた。同様に、ＳｌｙＤ−ｇＧ１（２６−１８９）−ビオチンコンジュゲートをＳｌｙＤ−ｇＧ１（２６−１８９）−ルテニウム複合体コンジュゲート（比較例）と共に、それぞれ１００ｎｇ／ｍＬの濃度で加えた。
【０１１１】
ｇＧ１（２６−１８９）の融合ポリペプチド変異体のビオチンコンジュゲートおよびルテニウムコンジュゲートを、それぞれ１００ｎｇ／ｍＬの濃度にて、抗ＨＳＶ−１陽性血清に対するその反応性について評価した。シャペロン融合単位を介する免疫学的交差反応を回避するために、全ての測定において、未標識の化学的に多量体化されたＳｌｙＤ−ＳｌｙＤを抗干渉物質として反応バッファーに加えた。１１の抗ＨＳＶ−１陰性ヒト血清を対照として用いた。
【０１１２】
融合タンパク質の耐熱性を調べるために、ＳｌｙＤ−ｇＧ１およびＳｌｐＡ−ｇＧ１を以下の過酷な温度条件に供した：ＳｌｙＤ−ｇＧ１およびＳｌｐＡ−ｇＧ１（タンパク質は５０ｍＭリン酸カリウムｐＨ７．５、１００ｍＭ ＫＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ中に存在）を６０℃で一晩インキュベートした。ｇＧ１−ビオチンコンジュゲートの濃度はそれぞれ約１．３ｍｇ／ｍＬであり、ｇＧ１−ルテニウムコンジュゲートの濃度はそれぞれ約０．６ｍｇ／ｍＬであった。その後、熱ストレスを加えたサンプルを、上記実験条件下でElecsys（登録商標）2010自動分析器を用いてその残存免疫学的反応性について評価した。ＳｌｙＤ−ｇＧ１およびＳｌｐＡ−ｇＧ１の未チャレンジサンプル（２〜８℃にて保存）を参照として使用した。
【０１１３】
実験の結果を表１（図９）に示す。
【０１１４】
表１は、実施例４に記載した自動化Elecsys（登録商標）分析器での、ＳｌｐＡ−ｇＧ１（２６−１８９）またはＳｌｙＤ−ｇＧ１（２６−１８９）とヒト抗ＨＳＶ−１陽性または抗ＨＳＶ−１陰性血清との免疫学的反応性を示す。過酷な６０℃での一晩の熱処理の前および後の両種の抗原変異体の性能を示す。実験の結果は、熱ストレスを加えたＳｌｐＡ−ｇＧ１（２６−１８９）が熱ストレスを加えたＳｌｙＤ−ｇＧ１（２６−１８９）よりも二重の意味で優れていることを明確に実証している。第１に、抗ＨＳＶ−１陽性血清での特異的シグナル回復（表１の上段）は、熱チャレンジしたＳｌｐＡ融合ポリペプチドの方が顕著に高い。第２に、抗ＨＳＶ−１陰性血清での非特異的バックグラウンドシグナルの増加（表１の下段）は熱チャレンジされたＳｌｐＡ融合ポリペプチドの方が顕著に低い。ＳｌｙＤ融合ポリペプチドの熱処理後のバックグラウンドシグナルには著明な増加が観察された（表１の右欄、バックグラウンドシグナルの約１００〜９００％の増大）。
【０１１５】
しかし、本発明のＳｌｐＡ融合ポリペプチドを使用した場合、熱ストレスの後のバックグラウンドシグナルの増加は無視できるほど低く、すなわち１つの事例を除き、バックグラウンドシグナルの増加は２０％未満である。その１つの事例（血清サンプルTrina 07/06-533）では、４８％というバックグラウンドシグナルの増大が見られた。代わりにＳｌｙＤ融合ポリペプチドを使用した場合には、当該サンプル（Trina 07/06-533）は８００％を超えるバックグラウンドシグナルの増加を示した。このことは、ＳｌｐＡ融合ポリペプチドが、元から若干高いバックグラウンドシグナルを生じる取扱困難なサンプルについても、バックグラウンドシグナルを実質的に低減できることを示す。イムノアッセイの開発では低いバックグラウンドシグナルが非常に望ましい。なぜなら、それにより製造者は低いカットオフ値を設定することができるからである。一般に、感度について言うと、アッセイ性能を向上させるためには、バックグラウンドシグナルを低減させることが必要である。なぜなら、カットオフ値よりも高いシグナルを生じるサンプルは陽性と判断され（すなわち当該サンプルは対象のアナライトを含むと推定される）、カットオフ値を下回るシグナルを生じるサンプルは陰性と判断されるからである。このことから、そもそもなぜ低いカットオフが必要なのかが容易に理解されよう。すなわち、カットオフが低いほど、アナライトを低濃度で含む（それに付随して生じるシグナルも低い）サンプルでも、正しく低い陽性と判断される可能性は高くなる。したがってイムノアッセイの感度は、免疫学的成分から内在的に生じるバックグラウンドシグナルの低減により向上させることができる。したがって、ＳｌｐＡをフォールディングヘルパーとして使用することは、イムノアッセイの長期的感度を改善し保証することに明確に寄与する。
【０１１６】
まとめると、ＳｌｐＡを含む融合ポリペプチドは、融合された標的ポリペプチドの安定性と溶解性の両方を増大させ、特に、通常はネイティブなフォールディングを崩し凝集反応をもたらすような極限的条件（熱ストレスなど）下でそれらを増大させる。簡潔に述べると、ＳｌｐＡは優秀なフォールディングヘルパーであり、望ましくない条件下でさえもその対象タンパク質の完全性を保護し、該対象タンパク質の活性なコンホメーションへの再フォールディングを促進し、それらを溶解状態に保つ。したがってＳｌｐＡとの融合、またはより単純にはＳｌｐＡの添加は、診断および他のバイオテクノロジー用途を意図するタンパク質製剤中で標的分子を安定化するための優秀な手段である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
融合タンパク質をコードする組換えＤＮＡ分子であって、標的ポリペプチドをコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列と、その上流または下流に、ＳｌｐＡシャペロンをコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列とを含み、ここで、ヒトＦＫ５０６結合タンパク質（ＦＫＢＰ）は標的ポリペプチドから除かれる、上記組換えＤＮＡ分子。
【請求項２】
機能的に連結された、請求項１に記載の組換えＤＮＡ分子を含む発現ベクター。
【請求項３】
請求項２に記載の発現ベクターで形質転換された宿主細胞。
【請求項４】
以下のステップ：
（ａ）請求項３に記載の宿主細胞を培養するステップ、
（ｂ）前記融合タンパク質を発現させるステップ、
（ｃ）該融合タンパク質を精製するステップ、および
（ｄ）該融合タンパク質を可溶性かつ免疫反応性のコンホメーションに再フォールディングさせるステップ
を含む、融合タンパク質の製造方法。
【請求項５】
ＳｌｐＡシャペロンに対応する少なくとも１つのポリペプチドと、標的ポリペプチドに対応する少なくとも１つのポリペプチドとを含む、組換え的に製造された融合タンパク質であって、ここで、ヒトＦＫ５０６結合タンパク質（ＦＫＢＰ）は標的ポリペプチドから除かれる、上記融合タンパク質。
【請求項６】
イムノアッセイでの結合パートナーとしての、請求項５に記載の組換え的に製造された融合タンパク質の使用。
【請求項７】
イムノアッセイでの干渉の低減のための手段としての、請求項５に記載の組換え的に製造された融合タンパク質の使用。
【請求項８】
前記標的ポリペプチドに対する抗体の製造のための免疫原としての、請求項５に記載の組換え的に製造された融合タンパク質の使用。
【請求項９】
ワクチン製造での、請求項５に記載の組換え的に製造された融合タンパク質の使用。
【請求項１０】
請求項５に記載の組換え的に製造された融合タンパク質および製薬上許容される賦形剤を含む組成物。
【請求項１１】
単離されたサンプル中のアナライトに特異的な抗体の検出方法であって、以下のステップ：
（ａ）体液サンプルを請求項５に記載の融合タンパク質と混合することにより免疫反応性混合物を形成させるステップ、
（ｂ）該体液サンプル中に存在する該アナライトに対する抗体が該融合タンパク質と免疫反応するのに十分な時間、該免疫反応性混合物を維持して、免疫反応生成物を形成させるステップ、および
（ｃ）該免疫反応生成物のいずれかの存在を検出するステップ
を含む、上記方法。
【請求項１２】
単離されたサンプル中のアナライトに対する抗体の検出方法での、請求項５に記載の融合タンパク質の使用。
【請求項１３】
請求項５に記載の融合タンパク質を含有する、アナライトに対する抗体の検出のための試薬キット。
【請求項１４】
干渉および免疫学的交差反応の低減のための、イムノアッセイでの添加剤としてのＳｌｐＡの使用。
【請求項１５】
標的タンパク質の溶解性を改善し、凝集を防止するための添加剤としてのＳｌｐＡの使用。
【請求項１】
融合タンパク質をコードする組換えＤＮＡ分子であって、標的ポリペプチドをコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列と、その上流または下流に、ＳｌｐＡシャペロンをコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列とを含み、ここで、ヒトＦＫ５０６結合タンパク質（ＦＫＢＰ）は標的ポリペプチドから除かれる、上記組換えＤＮＡ分子。
【請求項２】
機能的に連結された、請求項１に記載の組換えＤＮＡ分子を含む発現ベクター。
【請求項３】
請求項２に記載の発現ベクターで形質転換された宿主細胞。
【請求項４】
以下のステップ：
（ａ）請求項３に記載の宿主細胞を培養するステップ、
（ｂ）前記融合タンパク質を発現させるステップ、
（ｃ）該融合タンパク質を精製するステップ、および
（ｄ）該融合タンパク質を可溶性かつ免疫反応性のコンホメーションに再フォールディングさせるステップ
を含む、融合タンパク質の製造方法。
【請求項５】
ＳｌｐＡシャペロンに対応する少なくとも１つのポリペプチドと、標的ポリペプチドに対応する少なくとも１つのポリペプチドとを含む、組換え的に製造された融合タンパク質であって、ここで、ヒトＦＫ５０６結合タンパク質（ＦＫＢＰ）は標的ポリペプチドから除かれる、上記融合タンパク質。
【請求項６】
イムノアッセイでの結合パートナーとしての、請求項５に記載の組換え的に製造された融合タンパク質の使用。
【請求項７】
イムノアッセイでの干渉の低減のための手段としての、請求項５に記載の組換え的に製造された融合タンパク質の使用。
【請求項８】
前記標的ポリペプチドに対する抗体の製造のための免疫原としての、請求項５に記載の組換え的に製造された融合タンパク質の使用。
【請求項９】
ワクチン製造での、請求項５に記載の組換え的に製造された融合タンパク質の使用。
【請求項１０】
請求項５に記載の組換え的に製造された融合タンパク質および製薬上許容される賦形剤を含む組成物。
【請求項１１】
単離されたサンプル中のアナライトに特異的な抗体の検出方法であって、以下のステップ：
（ａ）体液サンプルを請求項５に記載の融合タンパク質と混合することにより免疫反応性混合物を形成させるステップ、
（ｂ）該体液サンプル中に存在する該アナライトに対する抗体が該融合タンパク質と免疫反応するのに十分な時間、該免疫反応性混合物を維持して、免疫反応生成物を形成させるステップ、および
（ｃ）該免疫反応生成物のいずれかの存在を検出するステップ
を含む、上記方法。
【請求項１２】
単離されたサンプル中のアナライトに対する抗体の検出方法での、請求項５に記載の融合タンパク質の使用。
【請求項１３】
請求項５に記載の融合タンパク質を含有する、アナライトに対する抗体の検出のための試薬キット。
【請求項１４】
干渉および免疫学的交差反応の低減のための、イムノアッセイでの添加剤としてのＳｌｐＡの使用。
【請求項１５】
標的タンパク質の溶解性を改善し、凝集を防止するための添加剤としてのＳｌｐＡの使用。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【公開番号】特開２００９−２８４９０２（Ｐ２００９−２８４９０２Ａ）
【公開日】平成２１年１２月１０日（２００９．１２．１０）
【国際特許分類】
【外国語出願】
【出願番号】特願２００９−１２４８０３（Ｐ２００９−１２４８０３）
【出願日】平成２１年５月２５日（２００９．５．２５）
【出願人】（５９１００３０１３）エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲー (1,754)
【氏名又は名称原語表記】Ｆ． ＨＯＦＦＭＡＮＮ−ＬＡ ＲＯＣＨＥ ＡＫＴＩＥＮＧＥＳＥＬＬＳＣＨＡＦＴ
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２１年１２月１０日（２００９．１２．１０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−１２４８０３（Ｐ２００９−１２４８０３）
【出願日】平成２１年５月２５日（２００９．５．２５）
【出願人】（５９１００３０１３）エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲー (1,754)
【氏名又は名称原語表記】Ｆ． ＨＯＦＦＭＡＮＮ−ＬＡ ＲＯＣＨＥ ＡＫＴＩＥＮＧＥＳＥＬＬＳＣＨＡＦＴ
【Ｆターム（参考）】
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