組換えタンパク質発現の誘導剤
本発明は、芳香族カルボン酸化合物、アセトアミド化合物及び／またはヒドロキサム酸化合物、ならびにそれを含有する培養物を用いて、哺乳動物細胞によるポリペプチド、所望により組換えポリペプチドの生産を増加させる方法を、提供する。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の属する分野
本発明の属する分野は、細胞培養における、ポリペプチドの生産、特に組換えポリペプチドの生産である。
【０００２】
背景
ポリペプチドは、診断、治療、農業、栄養及び研究への多様な応用において、有用である。ポリペプチドは、自然源から単離可能であるが、特定のポリペプチドを大量に自然源から単離するには、高額の費用がかかる可能性がある。また、ポリペプチドは、原料物質におけるバリエーションによって、均一な品質でない可能性がある。組換えＤＮＡ技術によって、より均一で、かつ費用効率の高い、特定のポリペプチドの大規模な生産が可能となる。
【０００３】
組換えポリペプチド生産の一つの目標は、最大の可能な生産性を得るように、培養条件を最適化することである。生産性をさらに増加させることは、経済的に重要である可能性がある。細胞培養において生産性を増加させる方法のいくつかには、富栄養培地の使用、生産中のモル浸透圧濃度の監視、細胞培養の特定期における温度の低減、及び／または酪酸ナトリウムの添加が、含まれる（例えば、米国特許第５，７０５，３６４を参照されたい）。
【０００４】
しかしながら、ポリペプチドに基づくより多くの薬物が臨床有効性を示し、かつ市販量の増量が必要とされるため、利用可能な培養施設が限定されるようになる。したがって、各細胞培養施行によって得られる組換えポリペプチドの収率を継続的に改良する、当該技術分野における必要性が、依然として存在する。
【０００５】
概要
本明細書において報告される実験データによって示されるように、芳香族カルボン酸、アセトアミド及び／またはヒドロキサム酸は、哺乳動物細胞株からのポリペプチド、特に組換えポリペプチドの生産を劇的に誘導することが可能な化合物である。さらに、これらの化合物は、ポリペプチドの発現をさらに増加させるために、互いに、及び／または他の誘導方法と組み合わせて、用いられることが可能である。
【０００６】
発明の詳細な説明
「抗体」は、ポリペプチドまたはポリペプチド複合体であって、そのそれぞれは、少なくとも一つの可変抗体免疫グロブリンドメイン及び少なくとも一つの定常抗体免疫グロブリンドメインを含む。抗体は、単鎖抗体、ダイマー抗体、または、非限定的にヘテロダイマー抗体を含む、いくつかのさらに高次のポリペプチド複合体であってもよい。「ヒト抗体」は、究極的にはヒトを起源とする核酸によってコードされる抗体である。このような抗体を、非ヒト細胞または生物体において発現させることが可能である。例えば、ヒト抗体をコードするＤＮＡを、組織培養細胞内に導入し、そして形質転換された細胞株において発現させることが可能である。あるいは、ヒト抗体を、例えばＭｅｎｄｅｚら（（１９９７年）、Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １６（４）：１４６−５６）において記載されたトランスジェニックマウスなどの、トランスジェニック動物において発現させることが可能である。このようなトランスジェニックマウスは、米国特許第６，２３５，８８３ Ｂ１において、完全ヒト抗体を作製するのに利用されている。ヒト抗体を、ハイブリドーマ細胞においても発現させることが可能である。「ヒト化抗体」は、例えば、米国特許第５，５５８，８６４及び第５，６９３，７６１、ならびに国際特許出願ＷＯ ９２／１１０１８において説明されるように、非ヒト由来の相補性決定領域（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３）と、ヒト抗体における配列と一致する（及び、ヒトを起源としてもよい）他の領域とを含む、キメラ抗体である。
【０００７】
「定常抗体免疫グロブリンドメイン」は、ヒトまたは動物を起源とするＣＬ、ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３もしくはＣＨ４ドメインに一致するかまたは実質的に類似した、免疫グロブリンドメインである。例えば、Ｈａｓｅｍａｎｎ及びＣａｐｒａ、Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ、Ｗｉｌｌｉａｍ Ｅ．Ｐａｕｌ編集、Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、第２版、２０９，２１０−２１８（１９８９年）；Ｋａｂａｔら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、米国保健省（１９９１年）を、参照されたい。
【０００８】
「抗体のＦｃ部分」は、ヒトまたは動物の免疫グロブリンドメインＣＨ２及びＣＨ３、あるいはこれらに実質的に類似した免疫グロブリンドメインを含む。考察については、Ｈａｓｅｍａｎｎ及びＣａｐｒａ、同上、２１２−２１３、及び、Ｋａｂａｔら、同上、を参照されたい。
【０００９】
ポリペプチドの発現を可能にする組換え核酸配列が、組換えイルスを用いたウイルス感染、トランスフェクション、形質転換または電気穿孔などの「遺伝子操作」法を用いて細胞内に導入されている場合に、細胞は、特定のポリペプチドを発現するように「遺伝子操作され」ている。例えば、Ｋａｕｆｍａｎら（１９９０年）、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８５：４８７−５１１；Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ａｕｓｕｂｅｌら編集（Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ社、ニューヨーク州、１９８８年、及び四半期毎の更新版）を参照されたい。例えば、Ｂ型肝炎ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、アデノウイルス等などの改変されていない自然発生ウイルスを用いた感染は、本明細書において意味するような遺伝子操作にはならない。「遺伝子操作」の語とは、より高いレベルまたはより低いレベルで遺伝子を発現する宿主細胞、あるいは変異型遺伝子を発現する宿主細胞を作り出すのに用いられる、組換えＤＮＡまたはＲＮＡ法を指す。言い換えれば、細胞に、組換えポリヌクレオチド分子をトランスフェクト、形質転換または形質導入し、それによって、細胞に所望のポリペプチド発現の改変をもたらすように、細胞が改変されている。本発明の目的上、細胞融合の結果として得られるハイブリドーマ細胞株によって生産される抗体は、「組換えポリペプチド」ではない。さらに、ウイルス感染の結果として細胞により生産されるウイルスポリペプチドもまた、ウイルス核酸が、細胞への感染前に遺伝子操作によって改変されているのでなければ、本明細書において意味するような「組換えポリペプチド」ではない。「遺伝子操作」法はまた、当該技術分野において周知の多数の他の方法のうち、非限定的に、ポリメラーゼ連鎖反応を用いた核酸の増幅、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）中にクローニングすることによる組換えＤＮＡ分子の構築、核酸の制限酵素消化、核酸の連結、及び核酸末端への塩基の転移を含む、多数の方法も包含する。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版、第１〜３巻、コールドスプリングハーバー研究所、１９８９年を参照されたい。目的のポリペプチドを発現するように細胞及び／または細胞株を遺伝子操作するための、方法ならびにベクターは、当業者に周知である。遺伝子操作技術としては、これに限定されないが、発現ベクター、標的相同組換え及び遺伝子活性化（例えば、米国特許第５，２７２，０７１、Ｃｈａｐｐｅｌ）、ならびに操作された転写因子によるトランス活性化（例えば、Ｓｅｇａｌら、１９９９年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９６（６）：２７５８−６３を参照されたい）が挙げられる。所望により、ポリペプチドを、例えば、天然でそのポリペプチドの生産を導かないプロモーターなどの、異種調節エレメントの制御下で、発現させてもよい。例えば、プロモーターは、哺乳動物のポリペプチドの発現を導く、強力なウイルスプロモーター（例えば、ＣＭＶ、ＳＶ４０）であることが可能である。宿主細胞は、ポリペプチドを正常に生産しても、または生産しなくてもよい。例えば、宿主細胞は、ヒトポリペプチドを生産するように遺伝子操作されているＣＨＯ細胞であることが可能であり、このことは、ヒトポリペプチドをコードする核酸が、ＣＨＯ細胞中に導入されていることを意味する。あるいは、宿主細胞は、正常には非常に低レベルにのみ存在するヒトポリペプチドのレベルを増加させて生産するように遺伝子操作されている（例えば、内因性プロモーターを強力なウイルスのプロモーターによって置換することにより）ヒト細胞であることが、可能である。
【００１０】
「増殖期」は、培養細胞が急速に分割し、そして数が増加する期間を、意味する。増殖期中に、細胞は、培地中で、かつ細胞増殖を最大限にするように設計された条件下で、一般には培養される。
【００１１】
「ハイブリッド極性化合物」は、無極性の炭素鎖によって分離された二つの極性基を有する化合物である。これには、ヘキサメチレンビスアセトアミド（ＨＭＢＡ）、ならびに同時係属中の出願第１０／４００，３３４、及び以下参考文献：Ｒｉｃｈｏｎら（１９９８年）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９５：３００３−０７；Ｍａｒｋｓら（１９９４年）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９１；１０２５１−５４；及び米国特許第５，０５５，６０８及び６，０８７，３６７において論じられている他の分子が、含まれる。
【００１２】
芳香族カルボン酸化合物、アセトアミド化合物及びヒドロキサム酸化合物などの誘導剤を含有する培養物（ｃｕｌｔｕｒｅ）中で生産されるポリペプチド量が、該誘導剤を含有しない、他の点では同一の培養物中で生産されるポリペプチド量よりも多いならば、ポリペプチドの生産は、該誘導剤の添加によって、「増加」している。同様に、３７℃以外の温度にてインキュベートされた培養物中で生産されるポリペプチド量が、３７℃にてインキュベートされた、他の点では同一の培養物中で生産されるポリペプチド量よりも多いならば、ポリペプチドの生産は、３７℃以外の温度での増殖によって「増加」している。典型的には、化合物または誘導剤に曝露された細胞を、細胞及び培地を回収しそしてポリペプチドの生産を評価する前に、少なくとも約２日間、より典型的には約５〜１０日間、そしてときにはさらに長期間、培養維持するであろう。
【００１３】
「多量体化ドメイン」は、その下で、共有または非共有相互作用を介して他のポリペプチド分子と結合する性向を与える、ポリペプチド分子内のドメインである。
「自然発生ポリペプチド」は、天然に生じるポリペプチド、すなわち、遺伝子操作されていない細胞によって生産されることが可能なポリペプチドである。このようなポリペプチドは、これを生産するように遺伝子操作された細胞によっても、生産されてよい。
【００１４】
「ポリペプチド」は、ペプチド結合によって連結した少なくとも６アミノ酸の連鎖を意味する。所望により、ポリペプチドは、ペプチド結合によって連結した、少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０または３００アミノ酸を含むことが可能である。
【００１５】
「生産用培地」は、生産期において細胞を培養するのに用いられるよう設計された細胞培養培地を、意味する。
「生産期」は、細胞が最大量の組換えポリペプチドを生産している期間を、意味する。生産期は、増殖期におけるよりも細胞分割が少ないことによって、かつ、ポリペプチドの生産を最大限にするよう設計された培地及び培養条件を用いることによって、特徴付けられる。
【００１６】
「組換え融合ポリペプチド」は、少なくとも二つのポリペプチドのすべてまたは一部の融合であって、遺伝子操作法を用いて作製される。
「組換えポリペプチド」は、遺伝子操作過程の結果として得られるポリペプチドである。本発明の目的上、細胞融合の結果として得られたハイブリドーマ細胞株によって生産される抗体は、「組換えポリペプチド」ではない。さらに、自然発生ウイルスによるウイルス感染の結果として細胞によって生産されるウイルスタンパク質も、ウイルス核酸が、細胞への感染前に遺伝子操作によって改変されているのでなければ、本明細書において意味する「組換えポリペプチド」でない。
【００１７】
「実質的に類似した」ポリペプチドは、アミノ酸配列において、互いに、少なくとも８０％、所望により少なくとも９０％同一であり、そして改変されていないポリペプチドの生物学的活性を維持または望ましいように改変する。保存的アミノ酸置換は、生物学的活性に影響を及ぼす可能性はあまりなく、非限定的に、以下：Ａｌａ←Ｓｅｒ、Ｖａｌ←Ｉｌｅ、Ａｓｐ←Ｇｌｕ、Ｔｈｒ←Ｓｅｒ、Ａｌａ←Ｇｌｙ、Ａｌａ←Ｔｈｒ、Ｓｅｒ←Ａｓｎ、Ａｌａ←Ｖａｌ、Ｓｅｒ←Ｇｌｙ、Ｔｙｒ←Ｐｈｅ、Ａｌａ←Ｐｒｏ、Ｌｙｓ←Ａｒｇ、Ａｓｐ←Ａｓｎ、Ｌｅｕ←Ｉｌｅ、Ｌｅｕ←Ｖａｌ、Ａｌａ←Ｇｌｕ、Ａｓｐ←Ｇｌｙ、及びこれらの反対の変更を、含む。例えば、Ｎｅｕｒａｔｈら、Ｔｈｅ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ、アカデミックプレス社、ニューヨーク州（１９７９年）を参照されたい。加えて、アミノ酸の以下６群のメンバー内でのアミノ酸の変換は、本発明の目的上、保存的置換であると考えられるであろう。該群とは、１）メチオニン、アラニン、バリン、ロイシン及びイソロイシン；２）システイン、セリン、トレオニン、アスパラギン及びグルタミン；３）アスパラギン酸及びグルタミン酸；４）ヒスチジン、リジン及びアルギニン；５）グリシン及びプロリン；ならびに、６）トリプトファン、チロシン及びフェニルアラニンである。二つのアミノ酸配列の同一性（ｉｄｅｎｔｉｔｙ）を、目視による点検及び数学的計算によって決定することが可能であり、より好ましくは、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ（ＧＣＧ；マディソン、ウィスコンシン州）のウィスコンシンパッケージ・バージョン１０．０プログラム「ＧＡＰ」（Ｄｅｖｅｒｅｕｘら（１９８４年）、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１２：３８７）などのコンピュータープログラムまたは他の匹敵するプログラムなどのコンピュータープログラムを用いて配列情報を比較することによって、比較を行う。「ＧＡＰ」プログラムの好ましいデフォルトパラメーターは、（１）Ｓｈｅｗａｒｔｚ及びＤａｙｈｏｆｆ編集、Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ、３５３〜３５８頁（１９７９年）によって記載されたような、Ｇｒｉｂｓｋｏｖ及びＢｕｒｇｅｓｓ（１９８６年）、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１４：６７４５のアミノ酸重量の比較マトリックス、または他の匹敵する比較マトリックス；（２）各ギャップにつき３０ペナルティ、及びアミノ酸配列の各ギャップにおける各シンボルにつき追加の１ペナルティ；（３）エンドギャップにペナルティなし；ならびに、（４）長いギャップに最大ペナルティなし：を含む。配列比較分野の当業者によって用いられる他のプログラムを、用いてもよい。
【００１８】
「移行期」は、「増殖期」と「生産期」との間の細胞培養期間を意味する。移行期において、培地及び環境条件は、増殖を最大にするよう設計されたものから、ポリペプチド生産を最大にするよう設計されたものへと、典型的には移行する。
【００１９】
「可変抗体免疫グロブリンドメイン」は、ヒトまたは動物を起源とするＶＬもしくはＶＨドメインと同一または実質的に類似した、免疫グロブリンドメインである。
本発明は、特定のポリペプチドを生産するように遺伝子操作されていてもよい哺乳動物細胞を培養するための改良された方法を、対象とする。具体的には、本発明は、特定のポリペプチドの生産を最大にする培養方法を対象とする。これはまた、培養哺乳動物細胞からこのようなポリペプチドを生産し、そして得る方法も、対象とする。ポリペプチドは、診断、治療、農業、栄養及び研究への非常に多様な応用において、有用である。
【００２０】
本明細書において報告される実験データによって示されるように、別々に、または様々な組み合わせで用いられた、芳香族カルボン酸化合物、アセトアミド化合物及びヒドロキサム酸化合物は、ＣＨＯ細胞株からの組換えポリペプチド生産を劇的に誘導することが可能であることが、発見された。これらの化合物は、９６ウェルでの蛍光タンパク質に基づくアッセイにおいて、誘導剤としてまず同定された。アデノウイルスのトリパータイトリーダを含む、ＥＡＳＥ／ＣＭＶプロモーターの制御下でＤｓＲｅｄを発現するコンストラクトを、発現の指標として用いて、種々の化合物をアッセイした。次いで、ＤｓＲｅｄ発現を、特により低温にて誘導するようにみえたこれらの化合物を、他の組換えポリペプチドの誘導についてのアッセイにて、さらに検討した。これらの実験は、化学物質のサブセットを、組換えタンパク質発現の強力な誘導剤として同定することへと導いた。概して、化合物は三つの大まかな分類：芳香族カルボン酸化合物、アセトアミド化合物及びヒドロキサム酸化合物に分けられた。追加実験により、１より多くのこれらの分類の化合物の組み合わせが、ポリペプチド発現の誘導、特に組換えタンパク質の生産をさらに増加させることが可能であることが、示された。このように、これらの化合物を誘導剤として用いることで、実質的に、製造費用を低下させ、かつ／または工場生産力の必要性を減少させることが可能である。
【００２１】
本発明の実施に際して有用な芳香族カルボン酸は、化学式Ｘ−Ｙ−Ｚの化合物であって、ここでＸは、芳香族基、例えば５、６または７員炭素環、であり、Ｙは、１〜２０またはそれより多くの炭素、好ましくは２〜１０炭素、より好ましくは２〜５炭素のアルキル基を有する連結部分であり、そしてＺはカルボン酸基である。芳香族基は、置換されることも、または置換されないことも可能であり；置換されたフェニル基を用いるならば、置換は、メタ及びオルソ置換基でも許容可能であるが、好ましくはパラ配位である。芳香族基は、特に有利と思われる；この基が直鎖または分鎖アルキルによって置換されるならば、このような化合物はあまり同じようには作用せず、そして色素基または三酸塩基は陰性であることが、見いだされている。例えば、ピメリン酸、メチルコハク酸及びクエン酸二水素ナトリウムは、誘導剤としては効力がなかった。組換えポリペプチド生産の誘導剤としての有用性が本明細書に記載されている、これらの芳香族カルボン酸の図解例は、以下のとおりである：
芳香族カルボン酸分類：
ヒドロ桂皮酸（ＨＣＡ）
【００２２】
【化１】
【００２３】
３−（４−メチルフェニル）プロピオン酸
【００２４】
【化２】
【００２５】
４−フェニル酪酸
【００２６】
【化３】
【００２７】
４−（４−アミノフェニル）酪酸
【００２８】
【化４】
【００２９】
５−フェニル吉草酸（５−ＰＶＡ）
【００３０】
【化５】
【００３１】
ポリペプチド生産を増加させるのに用いられることが可能な他の化合物は：３−（４−ヒドロキシフェニル）プロピオン酸；３−（２−メチルフェニル）プロピオン酸；４−（４−メトキシフェニル）酪酸；４−（４−アミノフェニル）酪酸；３−（２−ヒドロキシフェニル）プロピオン酸；６−フェニルヘキサン酸；３，４−ジフルオロヒドロ桂皮酸；及び、２−メチルインドール−３−酢酸である。さらに、用いられることが可能な他の化合物は：３−（３−メトキシフェニル）プロピオン酸；６−ベンジルオキシカルボニルアミノヘキサン酸；３−［４−（トリフルオロメチル）フェニル］プロピオン酸；３−（４−アミノフェニル）プロピオン酸；３−（４−フルオロフェニル）プロピオン酸；２−チエニル酢酸、及び３−（３，４−ジメトキシフェニル）プロピオン酸である。
【００３２】
加えて、本発明は、アセトアミドをポリペプチド生産の誘導剤として用いることを、包含する。同時係属中の特許出願第１０／４００，３３４は、ハイブリッド極性化合物を誘導剤として用いることについて記載しており、そのいくつかはアセトアミド類である。しかしながら、本明細書に記載されるように、ハイブリッド極性化合物でないアセトアミド（すなわち、ただ一つの極性基−アセトアミド基を含有する）もまた、組換えポリペプチド生産を誘導することが可能である。このような非ハイブリッド極性アセトアミドは、アルキル鎖が約３２〜約２０炭素長のアルキルアセトアミドであることが可能である。単独でまたは他の化合物と組み合わせて誘導剤として用いられることが可能なアセトアミドの例は、以下を含む。
【００３３】
アセトアミド分類：
ヘキサメチレンビスアセトアミド（ＨＭＢＡ）（ハイブリッド極性化合物）
【００３４】
【化６】
【００３５】
Ｎ−ブチルアセトアミド
【００３６】
【化７】
【００３７】
さらに、組換えポリペプチド生産の誘導剤として用いられることが可能な別分類の化合物は、ヒドロキサム酸である。本発明は、ハイブリッド極性化合物でないヒドロキサム酸を誘導剤として用いることを、包含する。本明細書において有用であることが示されている化合物の例は、以下のとおりである：
ヘキサノヒドロキサム酸（ＨＨＡ）
【００３８】
【化８】
【００３９】
３−フェニルプロピオノヒドロキサム酸
【００４０】
【化９】
【００４１】
ベンゾヒドロキサム酸
【００４２】
【化１０】
【００４３】
オクタン−１，８−ジヒドロキサム酸
【００４４】
【化１１】
【００４５】
具体的には、上記に例示された任意の芳香族カルボン酸化合物、アセトアミド化合物及びヒドロキサム酸化合物を生産期の細胞培養に加えることによって、組換えポリペプチドの生産を増強することが可能であることが、多数の異なる化合物のスクリーニングを介して、見いだされている。さらに、１より多くの上記分類から選択されたこのような化合物を、組換えポリペプチドの生産を増強するために、組み合わせて加えることが可能である。
【００４６】
さらに、例えば、約２９℃〜約３６℃、約２９℃〜約３５℃、及び／または約３０℃〜約３３℃の温度での細胞培養などの、生産を増加させる他の方法もまた、１またはそれより多くのこれらの化学誘導剤と組み合わせて用いられることが可能である。所望により、本発明の方法を用いる細胞培養を、増殖期とは区別される生産期に行うことが可能である。増殖期は、例えば、温度の移行、及び／または、例えば１またはそれより多くの誘導剤を添加するなどの培地の変化によって、生産期と区別されることが可能である。
【００４７】
一つの側面において、本発明は、ポリペプチドを生産するように遺伝子操作されている哺乳動物細胞を培養中増殖させること；及び、１またはそれより多くの芳香族カルボン酸化合物、アセトアミド化合物及びヒドロキサム酸化合物を培養物に加えることを含む方法を、提供する。遺伝子操作された細胞は、ポリペプチドをコードする組換えベクターで形質転換されている細胞であってもよい。加えて、ポリペプチドを、例えばＣＭＶプロモーターまたはＳＶ４０プロモーターなどの異種プロモーターの制御下で、発現させてもよい。典型的には、細胞は、ポリペプチドを天然で発現しないか、またはポリペプチドを天然で非常に低レベルに発現する（遺伝子操作されていない場合）。別の側面において、本発明は、ポリペプチドを生産するように遺伝子操作された細胞、生産用培地、ならびに芳香族カルボン酸化合物、アセトアミド化合物及び／またはヒドロキサム酸化合物を含有する培養物（ｃｕｌｔｕｒｅ）を、提供する。
【００４８】
加えて、本発明の方法及び組成物を、任意の他の公知の、または未だ発見されていない、組換えポリペプチド生産の誘導方法と組み合わせて、用いることが可能である。このような技術は、ほんの数例を挙げると、低温への移行、アルカン酸の添加（Ｅｔｃｈｅｖｅｒｒｙらによる米国特許第５，７０５，３６４に記載され、該出願は、参照によって本明細書に援用される）、ハイブリッド双極性化合物、キサンチン、ＤＭＦ及びＤＭＳＯ、ならびに、未だ記載されておらず、かつ／または発見されていない誘導技術（例えば、２００３年３月２７日に出願された、同時係属中の特許出願第１０／４００，３３４を参照されたく、該出願は、参照によって本明細書に援用される）を含む。本明細書では、ポリペプチド生産を「誘導すること」または「誘導」とは、細胞によって作られた所望のポリペプチドの総量を最大にするように設計された一連の条件下で細胞を培養することを、指す。「誘導剤」は、培養培地に加えられる場合に、少なくともいくつかの細胞株において所望のポリペプチドの生産を増加させることが可能な剤である。
【００４９】
芳香族カルボン酸化合物、アセトアミド化合物及び／またはヒドロキサム酸化合物の添加を、互いに、及び／または他のタンパク質誘導技術と組み合わせることで、ポリペプチド誘導に対する相乗効果を得ることが可能であり、これによって、これらの化合物の添加を減らし、及び／または他の誘導剤の添加を減らし、及び／または温度の移行を少なくすることが可能となる。他の誘導方法を、化合物の添加とほぼ同時に、及び／または添加前、及び／または添加後に行うことが可能である。例えば、培養温度を第０日に移行させ、次いでこれらの化合物のうちの一つ、及び所望により他の化学誘導剤を、その後に、例えば１〜数時間または１〜数日後に加えることが可能である。このようなプロトコールは、完全誘導する前に、播かれた培養物をさらにいくらか増殖させることを可能とする。さらに、芳香族カルボン酸化合物、アセトアミド化合物及び／またはヒドロキサム酸化合物の複数回の添加を、他の誘導剤の添加または培地条件の変化の有無にかかわらず、約１２、２４、４８及び／または７２時間あるいはそれより長期に分けて、生産期において培養物中に加えることが可能である。例えば、誘導剤を、第０日に、及び第４日に再び、加えることが可能である。あるいは、誘導剤を、温度移行後１、２、３または４日に、初めて加えることが可能である。
【００５０】
一つの側面において、本発明は、低温への移行（誘導剤化合物（単数または複数）添加時、添加前及び／または添加後に、培地の温度を、最適増殖温度（通常はおよそ３７℃）から、より低温（通常は約２９℃〜約３６℃、及び所望により約３０℃〜約３４℃）に移行）を行うことを伴う。
【００５１】
細胞株間で、種々の誘導剤の有効性に個体差がある。例えば、酪酸ナトリウムは広く用いられている誘導剤であるにもかかわらず、いくつかの細胞株においては、ポリペプチド生産に対する効果を持たないか、負の効果を持つ。異なる誘導剤または異なる濃度の同じ誘導剤が、異なる細胞株に対して適切である可能性がある。さらに、異なる温度が、異なる細胞株に対して適切である可能性がある。このばらつきにもかかわらず、芳香族カルボン酸、アセトアミド及びヒドロキサム酸などの誘導剤は、多様な細胞株において有用である可能性がある。
【００５２】
特定の化合物に対する最適濃度は、その活性及びそれが用いられる細胞株によって変動するであろうし、そして本明細書において提供される所定の方法及びガイダンスを用いて、当業者によって決定されることが可能である。例えば、ヒドロ桂皮酸（ＨＣＡ）、３−（４−メチルフェニル）プロピオン酸、４−フェニル酪酸、４−（４−アミノフェニル）酪酸及び５−フェニル吉草酸などの化合物は、約０．０１ｍＭ〜約２０ｍＭ、好ましくは約０．１ｍＭ〜約５ｍＭ、そしてより好ましくは約０．２〜２ｍＭの濃度で、加えられることが可能である。ヘキサノヒドロキサム酸（ＨＨＡ）及び３−フェニルプロピノヒドロキサム酸などの化合物は、それよりも若干低い濃度で用いられるべきであり、したがって、約０．０１μＭ〜約１ｍＭ、好ましくは約０．１μＭ〜約５０μＭ、そしてより好ましくは約１〜２０μＭの濃度で、加えられることが可能である。
【００５３】
発現に特に好ましいポリペプチドは、バイオロジックとしても知られる、ポリペプチドに基づく薬物である。好ましくは、該ポリペプチドは、細胞外産物として分泌される。生産されているポリペプチドは、自然発生ポリペプチドと同一もしくは実質的に類似した、ポリペプチドの一部または全部を含むことが可能であり、かつ／あるいは、これは、組換え融合ポリペプチドであっても、または組換え融合ポリペプチドなくてもよい。所望により、該ポリペプチドは、ヒトポリペプチド、その断片、または少なくとも１５アミノ酸長である実質的に類似したポリペプチドであってもよい。これは、非抗体ポリペプチド及び／または抗体を含んでもよい。これは、細胞内で生産されてもよく、またはこれを回収可能な培養培地中に分泌されてもよい。これは、可溶性ポリペプチドであっても、または可溶性ポリペプチドでなくてもよい。
【００５４】
生産されているポリペプチドは、自然発生ポリペプチドと同一もしくは実質的に類似した、ポリペプチドの一部または全部を含むことが可能であり、かつ／あるいは、これは、組換え融合ポリペプチドであっても、または組換え融合ポリペプチドなくてもよい。これは、非抗体ポリペプチド及び／または抗体を含んでもよい。これは、細胞内で生産されてもよく、またはこれを回収可能な培養培地中に分泌されてもよい。
【００５５】
本発明は、任意のほとんどのポリペプチドの生産を誘導するのに用いられることが可能であり、そして、その発現が例えばウイルスのプロモーターなどの強力なプロモーターの制御下にあるポリペプチド、及び／またはアデノウイルスの三部（ｔｒｉｐａｒｔｉｔｅ）リーダーエレメントを有するメッセージ上にコードされるポリペプチドに対して、特に有利である。タンパク質を生産するのに用いることが可能な、有用な発現ベクターの例は、国際出願ＷＯ ０１／２７２９９、及びＭｃＭａｈａｎら（１９９１年）、ＥＭＢＯ Ｊ．１０：２８２１に開示されており、後者は、あるウイルスプロモーターであるＣＭＶプロモーターを用いるｐＤＣ４０９ベクターについて記載されている。タンパク質は、少なくとも約１０アミノ酸、所望により約２５、７５または１００アミノ酸のポリペプチドであると、一般に理解されている。
【００５６】
概して、本発明の方法は、組換えポリペプチドの生産を誘導するのに有用である。本発明の方法を用いて生産可能ないくつかのポリペプチドには、以下のポリペプチドのうちの一つの全部もしくは一部と同一または実質的に類似したアミノ酸配列を含むポリペプチドが含まれる：ｆｌｔ３リガンド（国際出願ＷＯ ９４／２８３９１に記載され、該出願は、参照によって本明細書に援用される）、ＣＤ４０リガンド（米国特許第６，０８７，３２９に記載され、該出願は、参照によって本明細書に援用される）、エリスロポエチン、トロンボポエチン、カルシトニン、レプチン、ＩＬ−２、アンジオポエチン−２（Ｍａｉｓｏｎｐｉｅｒｒｅら（１９９７年）、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７７（５３２２）：５５−６０に記載され、参照によって本明細書に援用される）、Ｆａｓリガンド、ＮＦ−κＢの受容体活性化因子に対するリガンド（ＲＡＮＫＬ、国際出願ＷＯ ０１／３６６３７に記載され、該出願は、参照によって本明細書に援用される）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）関連アポトーシス誘導リガンド（ＴＲＡＩＬ、国際出願ＷＯ ９７／０１６３３に記載され、該出願は、参照によって本明細書に援用される）、胸腺間質由来リンフォポエチン、顆粒球コロニー刺激因子、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ、豪州特許第５８８８１９に記載され、該出願は、参照によって本明細書に援用される）、肥満細胞増殖因子、幹細胞増殖因子（米国特許第６，２０４，３５３に記載され、該出願は、参照によって本明細書に援用される）、上皮増殖因子、ケラチノサイト増殖因子、巨核球増殖発達因子、ＲＡＮＴＥＳ、成長ホルモン、インスリン、インスリノトロピン、インスリン様成長因子、副甲状腺ホルモン、インターフェロン（αインターフェロン、γインターフェロン及びコンセンサスインターフェロンを含む）（米国特許第４，６９５，６２３及び第４，８９７４７１に記載されたものなどであり、その双方は、参照によって本明細書に援用される）、神経成長因子、脳由来神経栄養因子、シナプトタグミン様タンパク質（ＳＬＰ １〜５）、ニューロトロフィン−３、グルカゴン、インターロイキン１〜１８、コロニー刺激因子、リンフォトキシン−β、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、白血球抑制因子、オンコスタチン−Ｍ、ならびに、細胞表面分子であるＥＬＫ及びＨｅｋに対する種々のリガンド（ｅｐｈ関連キナーゼまたはＬＥＲＫＳに対するリガンドなど）。本発明の方法にしたがって生産可能なポリペプチドについての記載は、例えば、Ｈｕｍａｎ Ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ：Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｆｏｒ Ｂａｓｉｃ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、第ＩＩ巻（Ａｇｇａｒｗａｌ及びＧｕｔｔｅｒｍａｎ編集、Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社、ケンブリッジ、マサチューセッツ州、１９９８年）；Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ（ＭａｃＫａｙ及びＬｅｉｇｈ編集、オックスフォード大学プレス・Ｉｎｃ．、ニューヨーク州、１９９３年）；及び、Ｔｈｅ Ｃｙｔｏｋｉｎｅ Ｈａｎｄｂｏｏｋ（Ａ．Ｗ．Ｔｈｏｍｐｓｏｎ編集、アカデミックプレス社、サンディエゴ、カリフォルニア州、１９９１年）に見つけられ、そのすべては、参照によって本明細書に援用される。
【００５７】
本発明の方法を用いて生産されることが可能な他のポリペプチドとしては、任意の上記ポリペプチドに対する受容体、このような受容体もしくは任意の上記ポリペプチドのアンタゴニスト、及び／またはこのような受容体またはアンタゴニストに実質的に類似したポリペプチドの、アミノ酸配列の全部あるいは一部を含むポリペプチドが、挙げられる。これらの受容体及びアンタゴニストには：両方の型の腫瘍壊死因子受容体（米国特許第５，３９５，７６０及び米国特許第５，６１０，２７９に記載されている、ｐ５５及びｐ７５と称されるＴＮＦＲであって、該出願の双方は、参照によって本明細書に援用される）、インターロイキン−１（ＩＬ−１）受容体（Ｉ型及びＩＩ型；欧州特許第０ ４６０ ８４６、米国特許第４，９６８，６０７及び米国特許第５，７６７，０６４に記載され、そのすべては、参照によって本明細書に援用される）、ＩＬ−１受容体アンタゴニスト（米国特許第６，３３７，０７２に記載されたもので、参照によって本明細書に援用される）、ＩＬ−１アンタゴニストまたは阻害剤（米国特許第５，９８１，７１３、第６，０９６，７２８及び第５，０７５，２２２に記載されたもので、そのすべては、参照によって本明細書に援用される）、ＩＬ−２受容体、ＩＬ−４受容体（欧州特許第０ ３６７ ５６６及び米国特許第５，８５６，２９６に記載され、その双方は、参照によって本明細書に援用される）、ＩＬ−１５受容体、ＩＬ−１７受容体、ＩＬ−１８受容体、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子受容体、顆粒球コロニー刺激因子受容体、オンコスタチン−Ｍ及び白血球抑制因子に対する受容体、ＮＦ−κＢの受容体活性化因子（ＷＯ ０１／３６６３７及び米国特許第６，２７１，３４９に記載されている、ＲＡＮＫＬであって、該出願の双方は、参照によって本明細書に援用される）、オステオプロテジェリン（例えば、米国特許第６，０１５，９３８に記載され、参照によって本明細書に援用される）、ＴＲＡＩＬに対する受容体（ＴＲＡＩＬ受容体１、２、３及び４を含む）、ならびに、Ｆａｓまたはアポトーシス誘導受容体（ＡＩＲ）などのデスドメインを含む受容体が、含まれる。
【００５８】
本発明の過程を用いて生産されることが可能な他のポリペプチドとしては、分化抗原（ＣＤポリペプチドと称される）もしくはそのリガンド、またはこれらのいずれかに実質的に類似したポリペプチドの、アミノ酸配列の全部あるいは一部を含むポリペプチドが、挙げられる。このような抗原は、Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ Ｔｙｐｉｎｇ ＶＩ（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ ＶＩｔｈ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｗｏｒｋｓｈｏｐ ａｎｄ Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ、Ｋｉｓｈｉｍｏｔｏ、Ｋｉｋｕｔａｎｉら編集、神戸市、日本、１９９６年。該文献は、参照によって本明細書に援用される）において開示されている。同様なＣＤポリペプチドは、それに続くワークショップにおいて開示されている。このような抗原の例としては、ＣＤ２２、ＣＤ２７、ＣＤ３０、ＣＤ３９、ＣＤ４０及びそれに対するリガンド（ＣＤ２７リガンド、ＣＤ３０リガンド等）が挙げられる。該ＣＤ抗原のいくつかは、ＴＮＦ受容体ファミリーメンバーであって、これには、４１ＢＢ及びＯＸ４０もまた含まれる。該リガンドは、しばしば、４１ＢＢリガンド及びＯＸ４０リガンドのような、ＴＮＦファミリーメンバーである。したがって、ＴＮＦ及びＴＮＦＲファミリーメンバーもまた、本発明を用いて精製されることが可能である。
【００５９】
酵素的に活性なポリペプチドまたはそのリガンドもまた、本発明の方法にしたがって生産されることが可能である。その例としては、以下のポリペプチドもしくはそのリガンド、またはこれらのうちの一つに実質的に類似したポリペプチドの全部あるいは一部を含むポリペプチドが、挙げられる：メタロプロテイナーゼ−ディスインテグリンファミリーメンバー、種々のキナーゼ、グルコセレブロシダーゼ、スーパーオキシドジスムターゼ、組織プラスミノーゲン活性化因子、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、アポリポタンパク質Ｅ、アポリポタンパク質Ａ〜Ｉ、グロビン、ＩＬ−２アンタゴニスト、α−１抗トリプシン、ＴＮＦ−α変換酵素、任意の上記酵素に対するリガンド、ならびに多数の他の酵素及びそのリガンド。
【００６０】
本発明の方法はまた、抗体またはその一部分、及びキメラ抗体、すなわち１またはそれより多くのマウス可変抗体免疫グロブリンドメイン、その断片、または実質的に類似したタンパク質と連結したヒト定常抗体免疫グロブリンドメインを有する抗体を、生産するのに用いられることが、可能である。本発明の方法はまた、抗体と細胞毒性物質または発光物質を含む複合体を生産するのに用いられることも可能である。このような物質としては、メイタンシン誘導体（ＤＭ１など）；エンテロトキシン（ブドウ球菌のエンテロトキシンなど）；ヨウ素同位体（ヨウ素−１２５など）；テクニウム同位体（Ｔｃ−９９ｍなど）；シアニン蛍光色素（Ｃｙ５．５．１８など）；及び、リボソーム不活化ポリペプチド（ブーガニン、ゲロニンまたはサポニン−Ｓ６など）：が挙げられる。本発明はまた、特定の標的タンパク質と結合し、そしてその活性を修飾するように、ｉｎ ｖｉｔｒｏにて選択されたキメラタンパク質を生産するのに用いられることも可能であって、このようなキメラタンパク質は、国際出願ＷＯ ０１／８３５２５及びＷＯ ００／２４７８２に記載されたものなどであり、該出願の双方は、参照によって本明細書に援用される。本発明の方法によって生産されることが可能な、抗体、ｉｎ ｖｉｔｒｏにて選択されたキメラタンパク質、あるいは、抗体／細胞毒素または抗体／発光原子団複合体の例としては、これに限定されないが、上記タンパク質及び／または以下の抗原を含むポリペプチドの、任意の一つまたは組み合わせを認識するものが、挙げられる：ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１４、ＣＤ１８、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２５、ＣＤ３３、ＣＤ４０、ＣＤ４４、ＣＤ５２、ＣＤ８０（Ｂ７．１）、ＣＤ８６（Ｂ７．２）、ＣＤ１４７、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−７、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−８、ＩＬ−１０、ＩＬ−２受容体、ＩＬ−４受容体、ＩＬ−６受容体、ＩＬ−１３受容体、ＩＬ−１８受容体サブユニット、ＰＤＧＦ−β及びそのアナログ（米国特許第５，２７２，０６４及び第５，１４９，７９２に記載されたものなど）、ＶＥＧＦ、ＴＧＦ、ＴＧＦ−β２、ＴＧＦ−β１、ＥＧＦ受容体（米国特許第６，２３５，８８３ Ｂ１に記載されたものを含み、該出願は、参照によって本明細書に援用される）、ＶＥＧＦ受容体、肝細胞増殖因子、オステオプロテジェリンリガンド、インターフェロンγ、Ｂリンパ球刺激因子（ＢｌｙＳ、またはＢＡＦＦ、ＴＨＡＮＫ、ＴＡＬＬ−１及びｚＴＮＦ４としても知られる；Ｄｏ及びＣｈｅｎ−Ｋｉａｎｇ（２００２年）、Ｃｙｔｏｋｉｎｅ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ Ｒｅｖ．１３（１）：１９−２５を参照されたい）、Ｃ５補体、ＩｇＥ、腫瘍抗原ＣＡ１２５、腫瘍抗原ＭＵＣ１、ＰＥＭ抗原、ＬＣＧ（肺癌に関連して発現する遺伝子産物）、ＨＥＲ−２、腫瘍関連糖タンパク質ＴＡＧ−７２、ＳＫ−１抗原、結腸癌及び／または膵臓癌患者の血清中に高レベルで存在する腫瘍関連エピトープ、癌関連エピトープまたはポリペプチド（胸部、結腸、偏平上皮細胞、前立腺、膵臓、肺及び／または腎臓癌細胞に、かつ／あるいは、メラノーマ、グリオーマまたは神経芽腫細胞に、発現する）、腫瘍の壊死中心（ｎｅｃｒｏｔｉｃ ｃｏｒｅ）、インテグリンα４β７、インテグリンＶＬＡ−４、Ｂ２インテグリン、ＴＲＡＩＬ受容体１、２、３及び４、ＲＡＮＫ、ＲＡＮＫリガンド、ＴＮＦ−α、接着分子ＶＡＰ−１、上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）、細胞内接着分子−３（ＩＣＡＭ−３）、ロイコインテグリンアドヘシン、血小板糖タンパク質ｇｐ ＩＩｂ／ＩＩＩａ、心臓ミオシン重鎖、副甲状腺ホルモン、ｒＮＡＰｃ２（第ＶＩＩａ因子−組織因子の阻害剤）、ＭＨＣ Ｉ、癌胎児抗原（ＣＥＡ）、α−フェトプロテイン（ＡＦＰ）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、ＣＴＬＡ−４（細胞毒性Ｔリンパ球関連抗原）、Ｆｃ−γ−１受容体、ＨＬＡ−ＤＲ １０β、ＨＬＡ−ＤＲ抗原、Ｌ−セレクチン、Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ Ｓｙｎｃｉｔｉａｌウイルス、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、ストレプトコッカス・ミュータンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓ）、ならびに黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）。
【００６１】
本発明はまた、腫瘍抗原ｇｐ７２を標的とする抗体；ガングリオシドＧＤ３に対する抗体；ガングリオシドＧＤ２に対する抗体；またはこれらに実質的に類似した抗体：に対する抗イディオタイプを含む、抗イディオタイプ抗体もしくは実質的に類似したポリペプチドの、全部または一部を生産するのに、用いられてもよい。
【００６２】
本発明の方法はまた、任意の上記ポリペプチドを含む組換え融合ポリペプチドを生産するのに用いられることも可能である。例えば、上記ポリペプチドのうちの一つに加えて、ロイシンジッパー、コイルドコイル、抗体のＦｃ部分、または実質的に類似したタンパク質などの多量体化ドメインを含む、組換え融合ポリペプチドを、本発明の方法を用いて生産することが可能である。例えば、ＷＯ９４／１０３０８；Ｌｏｖｅｊｏｙら（１９９３年）、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５９：１２８８−１２９３；Ｈａｒｂｕｒｙら（１９９３年）、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６２：１４０１−０５；Ｈａｒｂｕｒｙら（１９９４年）、Ｎａｔｕｒｅ ３７１：８０−８３；Ｈａｋａｎｓｓｏｎら（１９９９年）、Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ７：２５５−６４を参照されたく、そのすべては、参照によって本明細書に援用される。このような組換え融合ポリペプチドには、ＴＮＦＲまたはＲＡＮＫの一部分が、抗体のＦｃ部分と融合しているポリペプチド（ＴＮＦＲ：ＦｃまたはＲＡＮＫ：Ｆｃ）が、具体的には含まれる。ＴＮＦＲ：Ｆｃは、ＴＮＦＲの細胞外ドメインと融合した抗体のＦｃ部分を含み、該細胞外ドメインは、米国特許第５，３９５，７６０（参照によって本明細書に援用される）の図２Ａのアミノ酸１〜１６３、１〜１８５または１〜２３５に実質的に類似したアミノ酸配列を含む。ＲＡＮＫ：Ｆｃは、国際出願ＷＯ ０１／３６６３７において記載され、該出願は、参照によって本明細書に援用される。
【００６３】
好ましくは、該ポリペプチドを、例えば、天然にはそのポリペプチドの生産を導かないプロモーターなどの、異種調節エレメントの制御下で、発現する。例えば、プロモーターは、哺乳動物のポリペプチドの発現を導く、強力なウイルスプロモーター（例えば、ＣＭＶ、ＳＶ４０）であることが可能である。宿主細胞は、ポリペプチドを通常に生産しても、または生産しなくてもよい。例えば、宿主細胞は、ヒトポリペプチドを生産するように遺伝子操作されているＣＨＯ細胞であることが可能であり、このことは、ヒトポリペプチドをコードする核酸が、ＣＨＯ細胞中に導入されていることを意味する。あるいは、宿主細胞は、通常には非常に低レベルにのみ存在するヒトポリペプチドのレベルを増加させて生産するように遺伝子操作されている（例えば、内因性プロモーターを強力なウイルスのプロモーターによって置換することにより）ヒト細胞であることが、可能である。組換えポリペプチドを生産させるために、組換えポリペプチドをコードする発現ベクターを、例えば、トランスフェクションまたはウイルス感染によって、実質的に均一な培養宿主細胞に移行させることが可能である。発現ベクターは、遺伝子操作法を用いて構築可能であり、適切な調節配列に機能可能なように連結されている目的のポリペプチドをコードする核酸を含むことが可能である。
【００６４】
調節配列は、典型的には、哺乳動物、微生物、ウイルス及び／または昆虫の遺伝子に由来する。調節配列の例としては、転写プロモーター、オペレーター及びエンハンサー、リボソーム結合部位（例えば、Ｋｏｚａｋ（１９９１年）、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６：１９８６７−１９８７０を参照されたい）、転写及び翻訳の開始及び終結を制御するための適切な配列、ポリアデニル化シグナル（例えば、ＭｃＬａｕｃｈｌａｎら（１９８８年）、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１６：５３２３−３３）、ならびに、マトリックス及び足場付着（ｓｃａｆｆｏｌｄ ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ）部位（Ｐｈｉ−Ｖａｎら（１９８８年）、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１０：２３０２−０７；Ｓｔｉｅｆら（１９８９年）、Ｎａｔｕｒｅ ３４１：３４２−３５；Ｂｏｎｉｆｅｒら（１９９０年）、ＥＭＢＯ Ｊ．９：２８４３−３８を参照されたい）が挙げられる。調節配列がポリペプチドをコードする配列と機能的に関連する場合に、ヌクレオチド配列は、機能可能に連結されている。したがって、プロモーターのヌクレオチド配列が、ポリペプチドをコードする配列の転写を制御するならば、プロモーターのヌクレオチド配列は、該コード配列と機能可能なように連結されている。一般的に、選択マーカーをコードする遺伝子が、組換え細胞の同定を容易にするために、発現ベクター中に組み込まれる。
【００６５】
哺乳動物宿主細胞の発現ベクターの転写及び翻訳制御配列を、ウイルスゲノムから切り出すことが可能である。一般的に用いられるプロモーター配列及びエンハンサー配列は、ポリオーマウイルス、アデノウイルス２、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）及びヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）に由来する。例えば、前初期遺伝子１のヒトＣＭＶプロモーター／エンハンサーを、用いてもよい。例えば、Ｐａｔｔｅｒｓｏｎら（１９９４年）、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．４０：６９１−９８を参照されたい。ＳＶ４０ウイルスゲノム由来のＤＮＡ配列、例えば、ＳＶ４０の起点、初期及び後期プロモーター、エンハンサー、スプライスならびにポリアデニル化部位を、哺乳動物宿主細胞において構造遺伝子配列を発現させるための他の遺伝要素を提供するために用いることが可能である。ウイルスの初期及び後期プロモーターは、双方がウイルスゲノムから断片として容易に入手されるため、特に有用であり、ウイルスの複製起点を含有することが可能である（Ｆｉｅｒｓら（１９７８年）、Ｎａｔｕｒｅ ２７３：１１３；Ｋａｕｆｍａｎ（１９９０年）、Ｍｅｔｈ．ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８５：４８７−５１１）。ＳＶ４０ウイルスの複製起点部位に位置する、ＨｉｎｄＩＩＩ部位からＢｇｌＩ部位にかけて広がるおよそ２５０ｂｐ配列が含まれるならば、より小さな、またはより大きなＳＶ４０断片を用いることも可能である。
【００６６】
加えて、適切な天然または異種シグナルペプチド（リーダー配列）をコードする配列を、組換えポリペプチドの細胞外分泌を促進するために、発現ベクターに組み込むことが可能である。シグナルペプチドは、細胞から分泌されるときに、組換えポリペプチドから切断されるであろう。シグナルぺプチドまたはリーダーの選択は、組換えポリペプチドが生産されることになる宿主細胞の種類に依存する。哺乳動物宿主細胞において機能的であるシグナルペプチドの例としては、米国特許第４，９６５，１９５に記載されるインターロイキン−７（ＩＬ−７）のシグナル配列、Ｃｏｓｍａｎら（１９８４年）、Ｎａｔｕｒｅ ３１２：７６８に記載されるインターロイキン−２受容体のシグナル配列；欧州特許第３６７，５６６に記載されるインターロイキン−４受容体のシグナルペプチド、米国特許第４，９６８，６０７に記載されるＩ型インターロイキン−１受容体のシグナルペプチド；及び、欧州特許第０ ４６０ ８４６に記載されるＩＩ型インターロイキン−１受容体のシグナルペプチドが挙げられる。
【００６７】
ＤＮＡを哺乳動物細胞に導入するための確立された方法について、記載されている。Ｋａｕｆｍａｎ，Ｒ．Ｊ．，Ｌａｒｇｅ Ｓｃａｌｅ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ，１９９０年、１５〜６９頁。陽イオン性脂質試薬であるＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（商標）、ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（商標）−２０００またはＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（商標）−ＰＬＵＳ（インビトロジェン社から購入可能）などの、市販の試薬を用いた追加のプロトコールを、細胞にトランスフェクトするのに用いることが可能である。ＦＥＬＧＮＥＲら（１９８７年）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８４：７４１３−７４１７。加えて、電気穿孔または核酸でコーティングされた微粒子銃を、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版、第１〜３巻、コールドスプリングハーバー研究所プレス（１９８９年）、及び、Ｆｉｔｚｐａｔｒｉｃｋ−ＭｃＥｌｌｉｇｏｔｔ（１９９２年）、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ニューヨーク州）１０（９）：１０３６−４０におけるものなどの手順を用いて哺乳動物細胞にトランスフェクトするのに、用いることが可能である。安定な形質転換体の選択を、例えば細胞毒性薬物耐性などの、当該技術分野において公知の方法を用いて、行うことが可能である。概して、安定な形質転換体は、宿主細胞中に、染色体に取り込まれた導入ポリヌクレオチドを有する。Ｋａｕｆｍａｎら（（１９９０年）、Ｍｅｔｈ．ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １８５：４８７−５１１）は、ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）耐性などのいくつかの選択スキームについて記載している。ＤＨＦＲ選択に適切な宿主株は、ＤＨＦＲを欠損するＣＨＯ ＤＸ−Ｂ１１株であることが可能である。Ｕｒｌａｕｂ及びＣｈａｓｉｎ（１９８０年）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７７：４２１６−４２２０。ＤＨＦＲのｃＤＮＡを発現しているプラスミドを、ＤＸ−Ｂ１１株に導入することが可能であり、そして、プラスミドを含有する細胞のみが、適切な選択培地において増殖可能である。発現ベクター内に取り込まれることが可能な選択マーカーの他の例としては、Ｇ４１８及びハイグロマイシンＢなどの、抗生物質に対する耐性を授与するｃＤＮＡが挙げられる。ベクターを保有する細胞を、これらの化合物に対する耐性に基づいて選択することが可能である。
【００６８】
哺乳動物発現ベクター由来の異種遺伝子の発現を改良することが示されているさらなる制御配列としては、ＣＨＯ細胞由来の発現増大配列エレメント（ＥＡＳＥ）（Ｍｏｒｒｉｓら、Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、５２９〜５３４頁（１９９７年）；米国特許第６，３１２，９５１ Ｂ１、第６，０２７，９１５及び第６，３０９，８４１ Ｂ１）などのエレメント、ならびにトリパータイトリーダー（ＴＰＬ）及びアデノウイルス２由来のＶＡ遺伝子のＲＮＡ（Ｇｉｎｇｅｒａｓら（１９８２年）、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５７：１３４７５−１３４９１）が挙げられる。ウイルスを起源とする内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）配列は、ジシストロン性（ｄｉｃｉｓｔｒｏｎｉｃ）ｍＲＮＡが効率的に翻訳されることを可能にする（Ｏｈ及びＳａｒｎｏｗ（１９９３年）、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ３：２９５−３００；Ｒａｍｅｓｈら（１９９６年）、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２４：２６９７−２７００）。選択マーカー（例えば、ＤＨＦＲ）遺伝子が後に続く、ジシストロン性ｍＲＮＡの一部としての、異種ｃＤＮＡの発現は、宿主細胞のトランスフェクション効率及び異種ｃＤＮＡの発現を改良することが示されている（Ｋａｕｆｍａｎら（１９９０年）、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８５：４８７−５１１）。ジシストロン性ｍＲＮＡを使用する典型的な発現ベクターは、Ｍｏｓｓｅｒら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ２２：１５０−１６１（１９９７年）によって記載されているｐＴＲ−ＤＣ／ＧＦＰ、及び、Ｍｏｒｒｉｓら、Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、５２９〜５３４頁に記載されているｐ２Ａ５Ｉである。
【００６９】
有用な高発現ベクターであるｐＣＡＶＮＯＴについては、Ｍｏｓｌｅｙら（（１９８９年）、Ｃｅｌｌ ５９：３３５−３４８）によって記載されている。哺乳動物宿主細胞において用いるための他の発現ベクターを、Ｏｋａｙａｍａ及びＢｅｒｇ（（１９８３年）、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．３：２８０）によって開示されているように、構築することが可能である。Ｃ１２７マウス乳房上皮細胞において哺乳動物ｃＤＮＡを安定で高レベルに発現させるための有用な系は、Ｃｏｓｍａｎら（（１９８６年）、Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２３：９３５）によって記載されるように、実質的には構築されることが可能である。Ｃｏｓｍａｎら（（１９８４年）、Ｎａｔｕｒｅ ３１２：７６８）によって記載された、有用な高発現ベクターであるＰＭＬＳＶ Ｎ１／Ｎ４は、ＡＴＣＣ ３９８９０として寄託されている。さらなる有用な哺乳動物発現ベクターが、欧州特許第−Ａ−０ ３６７ ５６６及びＷＯ ０１／２７７２９９ Ａ１に記載されている。該ベクターは、レトロウイルス由来であることが可能である。天然のシグナル配列の代わりに、以下の配列のうちの一つなどの、異種シグナル配列を付加することが、可能である：米国特許第４，９６５，１９５に記載されたＩＬ−７のシグナル配列；Ｃｏｓｍａｎら（Ｎａｔｕｒｅ ３１２：７６８（１９８４年））に記載されたＩＬ−２受容体のシグナル配列；欧州特許第０ ３６７ ５６６に記載されたＩＬ−４のシグナルペプチド；米国特許第４，９６８，６０７に記載されたＩ型ＩＬ−１受容体のシグナルぺプチド；及び、欧州特許第０ ４６０ ８４６に記載されたＩＩ型ＩＬ−１受容体のシグナル配列。
【００７０】
ポリペプチドは、真核細胞において組換えによって生産されることが可能であり、そして好ましくは、細胞培養にて増殖するように適応された宿主細胞によって分泌される。所望により、本発明において用いるための宿主細胞は、好ましくは哺乳動物細胞である。該細胞はまた、目的の遺伝子を発現するように遺伝子操作されることが可能であり、細胞培養にて増殖するように適応された哺乳動物の生産細胞であることが可能であり、及び／または、同種の細胞株であることが可能である。業界で一般的に用いられるこのような細胞の例は、ＶＥＲＯ、ＢＨＫ、ＨｅＬａ、ＣＶ１（Ｃｏｓを含む）、ＭＤＣＫ、２９３、３Ｔ３、骨髄腫細胞株（例えば、ＮＳＯ、ＮＳ１）、ＰＣ１２、ＷＩ３８細胞、及びチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞であって、これらは、いくつかの複合組換えポリペプチド、例えばサイトカイン、凝固因子及び抗体の生産に、広く用いられている（Ｂｒａｓｅｌら（１９９６年）、Ｂｌｏｏｄ ８８：２００４−２０１２；Ｋａｕｆｍａｎら（１９８８年）、Ｊ．Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２６３：６３５２−６３６２；ＭｃＫｉｎｎｏｎら（１９９１年）、Ｊ Ｍｏｌ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ ６：２３１−２３９；Ｗｏｏｄら（１９９０年）、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４５：３０１１−３０１６）。ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）欠損変異細胞株（Ｕｒｌａｕｂら（１９８０年）、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ７７：４２１６−４２２０、参照によって本明細書に援用される）である、ＤＸＢ１１及びＤＧ−４４は、効率的なＤＨＦＲ選択及び増幅遺伝子発現系が、これらの細胞において高レベルの組換えポリペプチドの発現を可能にするため、望ましいＣＨＯ宿主細胞株である（Ｋａｕｆｍａｎ Ｒ．Ｊ．（１９９０年）、Ｍｅｔｈ Ｅｎｚｙｍｏｌ １８５：５３７−５６６、参照によって本明細書に援用される）。加えて、これらの細胞は、接着培養または懸濁培養として操作しやすく、そして比較的良好な遺伝子安定性を示しやすい。ＣＨＯ細胞、及び該細胞において発現する組換えポリペプチドは、詳細に特徴付けられ、そして、臨床用市販製造における使用を、規制当局によって認められている。本発明の方法を、抗体を生産するハイブリドーマ細胞株を用いて、実行することも可能である。ハイブリドーマ株の作製方法は、当該技術分野において周知である。例えば、Ｂｅｒｚｏｆｓｋｙら、Ｐａｕｌ編集、Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、第２版、３１５〜３５６頁のうちの３４７〜３５０頁、Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ Ｌｔｄ．、ニューヨーク州（１９８９年）を参照されたい。上記株由来の細胞株もまた、本発明を実行するのに適している。
【００７１】
本発明において、哺乳動物宿主細胞は、抗体または組換えポリペプチドであることが可能である、目的のポリペプチドの生産を促進する条件下で、培養される。基本の細胞培養培地処方物は、当該技術分野において周知である。これらの基本の細胞培養培地処方物に、当業者は、アミノ酸、塩類、糖類、ビタミン、ホルモン、成長因子、バッファー、抗生物質、脂質、微量元素等などの成分を、培養する宿主細胞の要求性に応じて、加えるであろう。培養培地は、血清及び／またはタンパク質を含有しても、または含有しなくてもよい。血清非含有及び／または合成（ｄｅｆｉｎｅｄ）培養培地を含む、種々の組織培養培地が、細胞培養用に市販されている。組織培養培地は、本発明の目的上、ｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞培養において、動物細胞及び好ましくは哺乳動物細胞の増殖に適した培地として、定義される。典型的には、組織培養培地は、バッファー、塩類、エネルギー源、アミノ酸、ビタミン及び微量必須元素を含有する。適切な培養真核細胞の増殖を補助することが可能な任意の培地を、用いることが可能であり；本発明は、培養真核細胞、特に哺乳動物細胞に幅広く応用可能であり、そして培地の選択は、本発明には重大ではない。本発明における使用に適した組織培養培地は、例えばＡＴＣＣ（マナサス、バージニア州）から市販されている。例えば、以下の培地の任意の一つまたは組み合わせを、用いることが可能である：アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションまたはＪＲＨ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社、ならびに他の業者から入手可能なものの中でも特に、ＲＰＭＩ−１６４０培地、ＲＰＭＩ−１６４１培地、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、最小必須培地イーグル、Ｆ−１２Ｋ培地、ハムＦ１２培地、イスコフ改変ダルベッコ培地、マッコイ５Ａ培地、ライボビッツＬ−１５培地、及び、ＥＸ−ＣＥＬＬ（商標）３００シリーズ（ＪＲＨ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社、レネクサ、カンザス州、米国から入手可能）などの血清非含有培地。血清非含有及び／またはペプトン非含有の合成培地を用いる場合、培地は、通常、アミノ酸及び微量元素が非常に豊富である。例えば、Ｍａｔｈｅｒらによる米国特許第５，１２２，４６９、及びＫｅｅｎらによる第５，６３３，１６２を参照されたい。
【００７２】
本発明の方法及び組成物において、細胞は、血清非含有、タンパク質非含有、成長因子非含有及び／またはペプトン非含有培地にて、増殖可能である。培地に適用される「血清非含有」の語は、胎児ウシ血清などの血清を含有しない、任意の哺乳動物細胞培養培地を含む。培地に適用される「インスリン非含有」の語は、外因性インスリンを添加されていない任意の培地を含む。外因性とは、この文脈においては、細胞の培養自体によって生産されるもの以外のことを意味する。培地に適用される「ＩＧＦ−１非含有」の語は、外因性インスリン様成長因子−１（ＩＧＦ−１）またはアナログ（例えば、ＬｏｎｇＲ３、［Ａｌａ３１］、またはＧｒｏＰｅｐ Ｌｔｄ．、セバートン、南オーストラリアから入手可能な［Ｌｅｕ２４］［Ａｌａ３１］ＩｇＦ−１アナログなど）を添加されていない任意の培地を含む。培地に適用される「成長因子非含有」の語は、外因性成長因子（例えば、インスリン、ＩＧＦ−１）を添加されていない任意の培地を含む。培地に適用される「タンパク質非含有」の語は、例えばトランスフェリンならびにタンパク質成長因子であるＩＧＦ−１及びインスリンなどの、外因性に添加されたタンパク質を含有しない培地を含む。タンパク質非含有培地は、ペプトンを有しても、または有しなくてもよい。培地に適用される「ペプトン非含有」の語は、例えば動物及び／または植物のタンパク質加水分解物などの、外因性タンパク質の加水分解物が添加されていない任意の培地を含む。培地からペプトンを除くことは、ロット間のばらつきを減じ、そしてろ過などの処理を強化するという利点がある。化学合成培地は、すべての成分が合成され、そして純粋な原料、好ましくは非動物原料から得られる培地である。
【００７３】
当業者はまた、特定の培養宿主細胞における細胞増殖、細胞生存性及び／または組換えポリペプチド生産を最大限にするように開発されている、多くの個別化された（ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌｉｚｅｄ）た培地処方物の一つを用いることを、選択してもよい。本発明にしたがった方法を、市販の細胞培養培地と、または特定の細胞株で用いるために個々に処方されている細胞培養培地と組み合わせて、用いてもよい。例えば、ポリペプチドの生産増加を補助することが可能な富栄養培地は、例えば１：１、１：２、１：３、１：４、１：５、１：６、１：７、１：８もしくはさらに１：１５までの比率で、またはそれよりも高比率で配合された、例えばＤＭＥＭとハムＦ１２培地などの、２またはそれより多くの市販の培地を混合したものを含んでもよい。あるいは、または加えて、培地は、アミノ酸またはペプトンなどの栄養素を添加することによって、富栄養であることが可能であり、かつ／あるいは、培地（または、以下に記すものを除くその成分のほとんど）を、その通常の推奨される濃度よりも高濃度で、例えば２Ｘ、３Ｘ、４Ｘ、５Ｘ、６Ｘ、７Ｘ、８Ｘまたはさらにそれよりも高濃度で、用いることが可能である。本明細書では、「１Ｘ」は標準濃度を意味し、例えば、「２Ｘ」は標準濃度の２倍を意味する。いずれのこれらの実施態様においても、塩類などの浸透圧に実質的に影響を及ぼすことが可能な培地成分を、培地の浸透圧が許容範囲外に外れるような濃度に増加させることはできない。したがって、培地は、例えば、１Ｘのみで存在することが可能な塩類を除くすべての成分について、８Ｘであってもよい。富栄養培地は、血清非含有及び／またはタンパク質非含有であってもよい。さらに、培地は、例えばビタミン、アミノ酸及び代謝前駆体などの、枯渇してくる可能性のある培地成分を補給するために、培養が維持されている間、定期的に補充されてもよい。当該技術分野において公知のように、異なる培地及び温度は、異なる細胞株にいくらか異なる影響を有し、そして同じ培地及び温度が、すべての細胞株に適するわけではない。
【００７４】
哺乳動物細胞の適切な培養条件は、当該技術分野において公知である。例えば、Ａｎｉｍａｌ ｃｅｌｌ ｃｕｌｔｕｒｅ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｄ．Ｒｉｃｋｗｏｏｄ編集、オックスフォード大学プレス、ニューヨーク州（１９９２年）を参照されたい。哺乳動物細胞は、懸濁液中で、または固体基質に接着させた状態で、培養されてもよい。さらに、哺乳動物細胞は、例えば、流動床バイオリアクター、ホローファイバーバイオリアクター、ローラーボトル、振盪フラスコまたは撹拌槽バイオリアクターなどにおいて、マイクロキャリアの有無にかかわらず、培養されてもよく、そして、回分、半回分、連続、半連続または灌流の方法で操作されてもよい。
【００７５】
本発明の方法を、単一期と複数期双方の培養過程において組換えポリペプチド生産を改良するのに用いることが可能である。単一期の過程では、細胞を培養環境中に接種し、そして開示された方法を、単一の生産期において用いる。複数段階の工程では、細胞を、２またはそれより多くの異なった期に培養する。例えば、細胞を、まず増殖期に、細胞増殖及び生存性を最大限にする環境条件下で培養させてもよく、次いで、ポリペプチド生産を最大限にする条件下の生産期に移行させてもよい。増殖期及び生産期は、１またはそれより多くの移行期によって先行されるか、または分けられてもよい。複数期の過程において、本発明にしたがった方法は、少なくとも生産期において用いられる。増殖期は、生産期よりも高温にて起こってもよい。例えば、増殖期は、約３５℃〜約３８℃の第一温度にて起こってもよく、そして生産期は、約２９℃〜約３６℃、所望により約３０℃〜約３３℃の第二温度にて起こってもよい。例えば芳香族カルボン酸、アセトアミド及び／またはヒドロキサム酸などの、ポリペプチド生産の化学誘導剤（ならびに、所望により他の誘導剤）を、温度移行と同時、移行前及び／または移行後に、添加してもよい。誘導剤を温度移行後に添加する場合、温度移行後１時間〜５日、所望により１〜２日に、添加することが可能である。
【００７６】
本発明の方法を用いて誘導後に、次いで、その結果として得られた発現ポリペプチドを回収することが可能である。加えて、該ポリペプチドを、このような培養物または成分から（例えば、培養培地または細胞抽出物または体液から）、公知の過程を用いて精製または部分精製することが可能である。「部分精製される」とは、ある分画手順または手順を実施したが、しかし所望のポリペプチドよりも多くのポリペプチド種（少なくとも１０％）が存在することを、意味する。「精製される」とは、ポリペプチドが本質的に均一であること、すなわち混入しているポリペプチドの存在が１％未満であることを、意味する。分画手順は、これに限定されないが、１またはそれより多くのろ過、遠心分離、沈澱、相分離、アフィニティ精製、ゲルろ過、イオン交換クロマトグラフィ、疎水性相互作用クロマトグラフィ（ＨＩＣ；フェニルエーテル、ブチルエーテルまたはプロピルエーテルなどの樹脂を用いる）、ＨＰＬＣ、または上記のある組み合わせの、１またはそれより多くの工程を含むことが可能である。
【００７７】
例えば、ポリペプチドの精製は、ポリペプチドと結合するであろう剤を含有するアフィニティカラム；コンカナバリンＡ−アガロース、ヘパリン−ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ（登録商標）（東洋曹達工業株式会社、日本）またはチバクローム・ブルー３ＧＡ ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（商標登録）（ファルマシア・ファイン・ケミカルズ・Ｉｎｃ．、ニューヨーク州）などのアフィニティ樹脂での、１またはそれより多くのカラム工程；溶出を含む１またはそれより多くの工程；及び／または、イムノアフィニティクロマトグラフィを含む。ポリペプチドを、精製を容易にする形態で発現させることが可能である。例えば、これを、マルトース結合ポリペプチド（ＭＢＰ）、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）またはチオレドキシン（ＴＲＸ）との融合ポリペプチドなどの、融合ポリペプチドとして、発現させてもよい。このような融合ポリペプチドを発現させ、そして精製するためのキットが、ニューイングランド・バイオラボ社（ビバリー、マサチューセッツ州）、ファルマシア社（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ニュージャージー州）及びインビトロジェン社から、それぞれ市販されている。ポリペプチドを、エピトープで標識し、続いてそのエピトープに対する特異的な抗体を用いることによって精製することが可能である。一つのこのようなエピトープ（ＦＬＡＧ（登録商標））が、コダック社（ニューヘイブン、コネチカット州）から市販されている。発現させたポリペプチドをアフィニティ精製するために、組換えポリペプチドに対するモノクローナル抗体などの、ポリペプチド結合タンパク質を含むアフィニティカラムを利用することもまた可能である。他の種類のアフィニティ精製工程は、プロテインＡまたはプロテインＧカラムであることが可能であり、その親和剤は、Ｆｃドメインを含有するタンパク質と結合する。ポリペプチドを、例えば、高塩濃度の溶出バッファーに入れ、次いでより低塩濃度の使用バッファー中に透析するか、あるいは利用するアフィニティマトリックスに依存してｐＨまたは他の成分を変えることによるなどの、慣用の技術を用いて、アフィニティカラムから除去することが可能であり、あるいは、アフィニティ部分の自然発生基質を用いて、競合的に除去することが可能である。
【００７８】
所望の最終純度は、ポリペプチドの使用目的によって決まる。例えば、ポリペプチドをｉｎ ｖｉｖｏで投与する場合には、比較的高純度が望ましい。このような場合、ポリペプチドは、他のポリペプチドに相当するポリペプチドバンドが、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）による解析において検出されないほど、精製される。関連分野の当業者は、該ポリペプチドに相当する複数のバンドが、差次的なグリコシル化、差次的な翻訳後のプロセシング等によって、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより可視化されることが可能なことを、認識するであろう。所望により、本発明のポリペプチドは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる解析において単一のポリペプチドバンドによって示されるように、実質的に均一に精製されていてもよい。該ポリペプチドバンドは、銀染色、クマシーブルー染色、または（該ポリペプチドが放射性標識されているならば）オートラジオグラフィによって可視化されることが可能である。
【００７９】
本発明はまた、該ポリペプチドをさらに処方することも、所望により包含する。「処方すること」の語は、該ポリペプチドが、バッファー交換され、無菌化され、バルク包装され、かつ／または最終的な使用者のために包装されることが可能なことを、意味する。本発明の目的上、「無菌バルク形態」の語は、処方物に、微生物混入がないかまたは本質的になく（食品及び／または薬物の目的では、ある程度は許容可能である）、そして処方物が決められた組成及び濃度であることを、意味する。「無菌の単位用量形態」の語は、顧客及び／もしくは患者への投与または消費に応じた形態を、意味する。このような組成物は、生理学的に許容可能な希釈剤、キャリアーまたは賦形剤などの他の成分と組み合わせて、有効量のポリペプチドを含むことが可能である。「生理学的に許容可能な」の語は、活性成分の生物学的活性の有効性を妨げない非毒性物質を、意味する。
【００８０】
投与に適した処方物は、抗酸化剤、バッファー、静菌剤、及びレシピエントの血液と等張の処方物を与える溶質を含有してもよい、水溶性及び非水溶性無菌注射用溶液；ならびに、懸濁化剤または増粘剤を含んでもよい、水溶性及び非水溶性の無菌懸濁液を、含む。該ポリペプチドを、医薬的に有用な組成物を調製するのに用いられる公知の方法にしたがって、処方することが可能である。これらを、唯一の活性物質として、または所与の適応に適した他の公知の活性物質とともに、医薬的に許容可能な希釈剤（例えば、生理食塩液、トリス−ＨＣｌ、酢酸及びリン酸緩衝溶液）、保存剤（例えば、チメロサール、ベンジルアルコール、パラベン）、乳化剤、可溶化剤、アジュバント及び／またはキャリアーと組み合わせて混合することが可能である。医薬組成物に適した処方物は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第１６版、１９８０年、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ、イーストン、ペンシルバニア州に記載されたものを含む。加えて、このような組成物は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、金属イオンと錯体を形成するか、あるいは、ポリ酢酸、ポリグリコール酸、ヒドロゲル、デキストラン等などの高分子化合物に取り込まれるか、あるいは、リポソーム、マイクロエマルジョン、ミセル、単層もしくは多重層ベシクル、赤血球ゴーストまたはスフェロブラストに取り込まれることが、可能である。リポソーム処方物に適した脂質としては、非限定的に、モノグリセリド、ジグリセリド、スルファチド、リゾレシチン、リン脂質、サポニン、胆汁酸等が挙げられる。このようなリポソーム処方物の調製は、例えば、米国特許第４，２３５，８７１、第４，５０１，７２８、第４，８３７，０２８及び第４，７３７，３２３に開示されているように、当該技術分野における技能水準内にある。このような組成物は、物理的状態、溶解性、安定性、ｉｎ ｖｉｖｏ放出速度、及びｉｎ ｖｉｖｏクリアランス速度に影響を与えるであろうし、したがって、キャリアーの特性が選択された投与経路によって決められるように、目的とする出願に応じて選択される。使用に適した徐放の形態としては、これに限定されないが、徐々に溶解する生体適合性ポリマー中に封入され（米国特許第６，０３６，９７８に記載されているアルギン酸微粒子など）、このようなポリマー（局所に適用されるヒドロゲルを含む）と混合され、かつ／または生体適合性の半透性移植片中に入れられた、ポリペプチドが挙げられる。
【００８１】
本発明について記載したことから、以下の実施例を、例証として、そして非限定的に、提供する。
（実施例１）
０．５ｍＭヒドロ桂皮酸を用いた結果
米国特許第６，０２７，９１５に記載されるようなＥＡＳＥ／ＣＭＶプロモーター系の制御下に、蛍光レポーター遺伝子ＤｓＲｅｄ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社、パロアルト、カリフォルニア州）をコードする遺伝子を配置する発現ベクターを、ＣＨＯ細胞にトランスフェクトした。細胞プールを、発現ベクターの存在について−ＧＨＴ培地中で選択し、次いで、９６ウェル形式にて血清非含有培地中に蒔いた。ヒドロ桂皮酸を、０．５ｍＭにて試験ウェルに加え、温度を３７℃から３１℃に減じ、そして低下させた温度にて培養を６日間続けた。ＤｓＲｅｄ蛍光を、Ｗａｌｌａｃ Ｖｉｃｔｏｒ２マルチラベル・マイクロプレートリーダー（パーキンエルマー・ライフサイエンスイズ社、ボストン、マサチューセッツ州）においてアッセイした。合計３実験において、１生細胞あたりのＤｓＲｅｄ発現が、対照と比較して平均６０％増加した。
【００８２】
次いで、この化合物の誘導能を、異なる組換えタンパク質において、異なる形式にて試験した。この場合、細胞は、ＩＩ型ＩＬ１受容体の可溶型（米国特許第６，５２１，７４０を参照されたく、該出願は、参照により本明細書に援用される）を発現するＣＨＯ細胞株であった。細胞を、振盪フラスコにおいて血清非含有培地中で増殖させ、ヒドロ桂皮酸を０．５ｍＭの濃度となるように加え、そしてインキュベーションを３１℃にて９〜１０日間続けた。合計５実験において、ＩＬ１ＲＩＩ発現の平均増加は、対照と比較して２２％であった。
【００８３】
試験した別の細胞株は、ＴＮＦ受容体の可溶型であるＴＮＦＲ：Ｆｃ（米国特許第５，６０５，６９０、該出願は、参照により本明細書に援用される）を発現するＣＨＯ細胞であった。細胞を、血清含有培地中で３７℃にて増殖させた後、細胞を、血清非含有培地と０．５ｍＭヒドロ桂皮酸を含有する振盪フラスコに移し替え、そしてこれらの誘導条件下で、低下させた温度にて、さらに７日間インキュベートした。インキュベーション期間終了時に、ヒドロ桂皮酸含有培地中で増殖させた細胞は、対照細胞と比較して、２０％のＴＮＦＲ：Ｆｃ発現増加を示した。
【００８４】
加えて、ＩＬ４受容体に対する抗体をコードする発現ベクターをトランスフェクトしたＣＨＯ細胞プールについて、試験した（米国特許第５，７１７，０７２を参照されたく、該出願は、参照により本明細書に援用される）。増幅させていないプールを、９６ウェルプレートにおける血清非含有培地に蒔き、そして誘導剤とともに３７℃にて４日間インキュベートした。合計３つの異なる実験において、ヒドロ桂皮酸に曝露されたプールは、対照と比較して、平均５％の抗体発現増加を示した。
【００８５】
（実施例２）
０．５ｍＭ ３−（４−メチルフェニル）プロピオン酸を用いた結果
ＣＨＯ細胞プールに、先の実施例１にて上述の蛍光レポーター遺伝子ＤｓＲｅｄをコードする遺伝子を配置する発現ベクターをトランスフェクトし、０．５ｍＭ ３−（４−メチルフェニル）プロピオン酸による誘導についても、９６ウェル形式にて試験した。プールを、３１℃にて６日間インキュベートした。少なくとも３つの異なる実験において、３−（４−メチルフェニル）プロピオン酸とともにインキュベートされたプールでは、１生細胞あたりのＤｓＲｅｄ発現が、対照と比較して平均７０％増加した。
【００８６】
次いで、この化合物の誘導能を、ＩＩ型ＩＬ１受容体の可溶型を発現するＣＨＯ細胞株を用いて、振盪フラスコの形式にて確認した。細胞を、振盪フラスコにおいて血清非含有培地中で増殖させ、３−（４−メチルフェニル）プロピオン酸を０．５ｍＭの濃度となるように加え、そしてインキュベーションを３１℃にて９〜１０日間続けた。合計２実験において、対照と比較したＩＬ１ＲＩＩ発現の平均増加は、１５％であった。
【００８７】
（実施例３）
０．５ｍＭ ４−フェニル酪酸を用いた結果
ＣＨＯ細胞プールに、先の実施例１にて上述の蛍光レポーター遺伝子ＤｓＲｅｄをコードする遺伝子を配置する発現ベクターをトランスフェクトし、０．５ｍＭ ４−フェニル酪酸による誘導についても、９６ウェル形式にて試験した。プールを、３１℃にて６日間インキュベートした。３つの異なる実験において、４−フェニル酪酸とともにインキュベートされたプールでは、１生細胞あたりのＤｓＲｅｄ発現が、対照と比較して平均６０％増加した。
【００８８】
次いで、この化合物の誘導能を、ＩＩ型ＩＬ１受容体の可溶型を発現するＣＨＯ細胞株を用いて、振盪フラスコの形式にて確認した。細胞を、振盪フラスコにおいて血清非含有培地中で増殖させ、４−フェニル酪酸を０．５ｍＭの濃度となるように加え、そしてインキュベーションを３１℃にて９〜１０日間続けた。４−フェニル酪酸の存在下で増殖させた細胞株では、ＩＬ１ＲＩＩ発現が対照と比較して２１％増加した。
【００８９】
（実施例４）
０．５ｍＭ ４−（４−アミノフェニル）酪酸を用いた結果
ＣＨＯ細胞プールに、先の実施例１にて上述の蛍光レポーター遺伝子ＤｓＲｅｄをコードする遺伝子を配置する発現ベクターをトランスフェクトし、０．５ｍＭ ４−（４−アミノフェニル）酪酸による誘導についても、９６ウェル形式にて試験した。プールを、３１℃にて６日間インキュベートした。３つの異なる実験において、４−（４−アミノフェニル）酪酸とともにインキュベートされたプールでは、１生細胞あたりのＤｓＲｅｄ発現が、対照と比較して平均７０％増加した。
【００９０】
次いで、この化合物の誘導能を、ＩＩ型ＩＬ１受容体の可溶型を発現するＣＨＯ細胞株を用いて、振盪フラスコの形式にて確認した。細胞を、振盪フラスコにおいて血清非含有培地中で増殖させ、４−（４−アミノフェニル）酪酸を０．５ｍＭの濃度となるように加え、そしてインキュベーションを３１℃にて９〜１０日間続けた。３実験において、４−（４−アミノフェニル）酪酸の存在下で増殖させた細胞株では、ＩＬ１ＲＩＩ発現が対照と比較して平均２２％増加した。
【００９１】
（実施例５）
０．５ｍＭ ５−フェニル吉草酸を用いた結果
ＣＨＯ細胞プールに、先の実施例１にて上述の蛍光レポーター遺伝子ＤｓＲｅｄをコードする遺伝子を配置する発現ベクターをトランスフェクトし、０．５ｍＭ ５−フェニル吉草酸による誘導についても、９６ウェル形式にて試験した。プールを、３１℃にて６日間インキュベートした。３つの異なる実験において、５−フェニル吉草酸とともにインキュベートされたプールでは、１生細胞あたりのＤｓＲｅｄ発現が、対照と比較して平均４０％増加した。
【００９２】
次いで、この化合物の誘導能を、ＩＩ型ＩＬ１受容体の可溶型を発現するＣＨＯ細胞株を用いて、振盪フラスコの形式にて確認した。細胞を、振盪フラスコにおいて血清非含有培地中で増殖させ、５−フェニル吉草酸を０．５ｍＭの濃度となるように加え、そしてインキュベーションを３１℃にて９〜１０日間続けた。５−フェニル吉草酸の存在下で増殖させた細胞株では、ＩＬ１ＲＩＩ発現が対照と比較して４４％増加した。
【００９３】
試験した別の細胞株は、先の実施例１にて上述のＴＮＦＲ：Ｆｃ（エタナーセプト）を発現するＣＨＯ細胞であった。細胞を、血清含有培地中で３７℃にて増殖させた後、細胞を、血清非含有培地と０．５ｍＭ ５−フェニル吉草酸を含有する振盪フラスコに移し替え、そしてこれらの誘導条件下で、低下させた温度にて、さらに７日間インキュベートした。インキュベーション期間終了時に、５−フェニル吉草酸含有培地中で増殖させた細胞は、対照細胞と比較して、３３％のＴＮＦＲ：Ｆｃ発現増加を示した。
【００９４】
加えて、ＩＬ４受容体に対する抗体をコードする発現ベクターをトランスフェクトしたＣＨＯ細胞プールについて、試験した。増幅させていないプールを、９６ウェルプレートに蒔き、そして誘導剤とともに３７℃にて４日間インキュベートした。合計２つの異なる実験において、５−フェニル吉草酸に曝露されたプールは、対照と比較して、平均４０％の抗体発現増加を示した。この増加のほとんどは、第３日には増加がなかったことから、培養最終日に起こった。
【００９５】
（実施例６）
１．０ｍＭ Ｎ−ブチルアセトアミド
ＣＨＯ細胞プールに、先の実施例１にて上述の蛍光レポーター遺伝子ＤｓＲｅｄをコードする遺伝子を配置する発現ベクターをトランスフェクトし、１．０ｍＭ Ｎ−ブチルアセトアミドによる誘導についても、９６ウェル形式にて試験した。プールを、３１℃にて６日間インキュベートした。２つの異なる実験において、Ｎ−ブチルアセトアミドとともにインキュベートされたプールでは、１生細胞あたりのＤｓＲｅｄ発現が、対照と比較して平均７７％増加した。
【００９６】
（実施例７）
１０／２０μＭヘキサノヒドロキサム酸（ＨＨＡ）
ＣＨＯ細胞プールに、先の実施例１にて上述の蛍光レポーター遺伝子ＤｓＲｅｄをコードする遺伝子を配置する発現ベクターをトランスフェクトし、１０μＭヘキサノヒドロキサム酸（ＨＨＡ）による誘導についても、９６ウェル形式にて試験した。プールを、３１℃にて６日間インキュベートした。ＨＨＡとともにインキュベートされたプールでは、ＤｓＲｅｄ発現が、対照と比較して４８％増加した。
【００９７】
次いで、この化合物の誘導能を、ＩＩ型ＩＬ１受容体の可溶型を発現するＣＨＯ細胞株を用いて、振盪フラスコの形式にて確認した。細胞を、振盪フラスコにおいて血清非含有培地中で増殖させ、ＨＨＡを１０μＭの濃度となるように加え、そしてインキュベーションを３１℃にて９日間続けた。１０μＭ ＨＨＡの存在下で増殖させた細胞株では、ＩＬ１ＲＩＩ発現が対照と比較して１９％増加した。
【００９８】
試験した別の細胞株は、先の実施例１にて上述のＴＮＦＲ：Ｆｃ（エタナーセプト）を発現するＣＨＯ細胞であった。細胞を、血清含有培地中で３７℃にて増殖させた後、細胞を、血清非含有培地と、１０μＭまたは２０μＭにて加えられたＨＨＡを含有する振盪フラスコに移し替え、そしてこれらの誘導条件下で、低下させた温度にて、さらに７日間インキュベートした。インキュベーション期間終了時に、１０μＭ ＨＨＡ含有培地中で増殖させた細胞は、対照細胞と比較して１９％のＴＮＦＲ：Ｆｃ発現増加を示し、２０μＭ中で増殖させた細胞は、対照細胞と比較して１１％のＴＮＦＲ：Ｆｃ発現増加を示した。
【００９９】
加えて、ＩＬ４受容体に対する抗体をコードする発現ベクターをトランスフェクトしたＣＨＯ細胞プールについて、試験した。血清非含有培地中の増幅させていないプールを、９６ウェルプレートに蒔き、そして誘導剤とともに３７℃にて４日間インキュベートした。２つの異なる実験において、ＨＨＡに曝露されたプールでは、対照と比較して、抗体発現が有意に増加しなかった。
【０１００】
（実施例８）
１０μＭ ＨＨＡ＋１ｍＭ ＨＭＢＡ
これらの実験では、２つの異なる誘導剤の組み合わせを用いた。以下の結果から分かるように、異なる種類の誘導剤を組み合わせることで、誘導に関して相加的増加を超えた増加をもたらすことが可能である。
【０１０１】
ＣＨＯ細胞プールに、先の実施例１にて上述の蛍光レポーター遺伝子ＤｓＲｅｄをコードする遺伝子を配置する発現ベクターをトランスフェクトし、１０μＭ ＨＨＡと１ｍＭ ＨＭＢＡによる誘導についても、９６ウェル形式にて試験した。プールを、３１℃にて６日間インキュベートした。ＨＭＢＡのみとともにインキュベートされたプールは、対照と比較して２０％のＤｓＲｅｄ発現増加を示したが、ＨＨＡとＨＭＢＡとの組み合わせとともにインキュベートされたプールは、９８％の増加を示した。実施例７にも記載したように、ＨＨＡ単独では、４８％の増加がもたらされたのみであった。このように、これらの２つの化合物は、組み合わせて用いられた場合に、少なくとも相加的な効果を有する。
【０１０２】
細胞を種々の濃度のＨＨＡとＨＭＢＡでインキュベートした、同様な実験から得たデータを、図１に示す。このグラフから分かるように、約５μＭ〜約１００μＭのＨＨＡ濃度と約０．５ｍＭ〜約１０ｍＭのＨＭＢＡ濃度は、個々に用いられた場合、蛍光マーカーであるＤｓＲｅｄの発現を増加させることが可能であった。しかしながら、これらの化合物を組み合わせた場合、発現は、著しく増加した。
【０１０３】
試験した別の細胞株は、先の実施例１にて上述のＴＮＦＲ：Ｆｃ（エタナーセプト）を発現するＣＨＯ細胞であった。細胞を、血清含有培地中で３７℃にて増殖させた後、細胞を、血清非含有培地を含有する振盪フラスコに移し替えた。１０μＭのＨＨＡを加え、そして１ｍＭのＨＭＢＡを加えて、そして細胞を、これらの誘導条件下で、低下させた温度にて、さらに７日間インキュベートした。インキュベーション期間終了時に、１．０ｍＭ ＨＭＢＡ含有培地中で増殖させた細胞は、対照細胞と比較して１４％のＴＮＦＲ：Ｆｃ発現増加を示し、一方、１０μＭ ＨＨＡ＋１．０ｍＭ ＨＭＢＡの組み合わせにおいて増殖させた細胞は、対照細胞と比較して２６％のＴＮＦＲ：Ｆｃ発現増加を示した。
【０１０４】
加えて、ＩＬ４受容体に対する抗体をコードする発現ベクターをトランスフェクトしたＣＨＯ細胞プールについて、試験した。増幅させていないプールを、９６ウェルプレートにおける血清非含有培地中に蒔き、そして１０μＭ ＨＨＡ＋１．０ｍＭ ＨＭＢＡとともに３７℃にて４日間インキュベートした。２つの異なる実験において、１０μＭ ＨＨＡ＋１．０ｍＭ ＨＭＢＡの組み合わせに曝露されたプールは、対照と比較して、３２％の抗体発現増加を示した。しかしながら、いずれかの化合物を個々に用いた場合、抗体発現に有意な増加はなかった。この結果は、これらの化合物が相乗的に作用して、組換えタンパク質の発現を増加させることが可能であることを、示唆している。
【０１０５】
（実施例９）
１０μＭ ３−フェニルプロピオノヒドロキサム酸＋１ｍＭ ＨＭＢＡ
ＩＬ４受容体に対する抗体をコードする発現ベクターをトランスフェクトしたＣＨＯ細胞プールについて、別の化合物の組み合わせ（この場合、１０μＭ ３−フェニルプロピオノヒドロキサム酸＋１ｍＭ ＨＭＢＡ）を用いて、試験した。増幅させていないプールを、９６ウェルプレートにおける血清非含有培地中に蒔き、そしてこの組み合わせとともに３７℃にて４日間インキュベートした。３−フェニルプロピオノヒドロキサム酸＋１ｍＭ ＨＭＢＡの組み合わせに曝露されたプールは、対照と比較して、４０％の抗体発現増加を示した。しかしながら、いずれかの化合物を個々に用いた場合、抗体発現に有意な増加はなかった。特に、実施例８の結果と併せて解釈した場合、この結果は、アセトアミド化合物とヒドロキサム酸化合物との組み合わせが、相乗的に作用して、組換えタンパク質の発現を増加させることが可能であることを、示唆している。
【０１０６】
特定の実施態様についての上述の記載は、他者が、本明細書において示された包括的な概念から逸脱することなく、種々の出願のためにこのような実施態様を容易に修正及び／または適用可能なように、本発明の一般的な本質を示している。いかなるこのような応用または修正も、開示された実施態様と同等の意味及び範囲の内に包含されることが、意図される。本明細書で用いられる語法及び専門用語は、説明を目的とし、かつ限定を目的としない。
【図面の簡単な説明】
【０１０７】
【図１】図１は、化合物の組み合わせがレポーター遺伝子の誘導に及ぼす影響を示すグラフである。ＥＡＳＥ／ＣＭＶプロモーターの制御下で蛍光マーカータンパク質であるＤｓＲｅｄを発現する細胞プールを、示された量の化合物存在下で、９６ウェルプレートにおいて３５℃にて６日間培養した。蛍光量を、化合物濃度の関数としてプロットした。誘導に用いた化合物は、ヘキサノヒドロキサム酸（ＨＨＡ）（ひし形）、ヘキサメチレンビスアセトアミド（ＨＭＢＡ）（正方形）及びＨＨＡ＋ＨＭＢＡ両方（三角）であった。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の属する分野
本発明の属する分野は、細胞培養における、ポリペプチドの生産、特に組換えポリペプチドの生産である。
【０００２】
背景
ポリペプチドは、診断、治療、農業、栄養及び研究への多様な応用において、有用である。ポリペプチドは、自然源から単離可能であるが、特定のポリペプチドを大量に自然源から単離するには、高額の費用がかかる可能性がある。また、ポリペプチドは、原料物質におけるバリエーションによって、均一な品質でない可能性がある。組換えＤＮＡ技術によって、より均一で、かつ費用効率の高い、特定のポリペプチドの大規模な生産が可能となる。
【０００３】
組換えポリペプチド生産の一つの目標は、最大の可能な生産性を得るように、培養条件を最適化することである。生産性をさらに増加させることは、経済的に重要である可能性がある。細胞培養において生産性を増加させる方法のいくつかには、富栄養培地の使用、生産中のモル浸透圧濃度の監視、細胞培養の特定期における温度の低減、及び／または酪酸ナトリウムの添加が、含まれる（例えば、米国特許第５，７０５，３６４を参照されたい）。
【０００４】
しかしながら、ポリペプチドに基づくより多くの薬物が臨床有効性を示し、かつ市販量の増量が必要とされるため、利用可能な培養施設が限定されるようになる。したがって、各細胞培養施行によって得られる組換えポリペプチドの収率を継続的に改良する、当該技術分野における必要性が、依然として存在する。
【０００５】
概要
本明細書において報告される実験データによって示されるように、芳香族カルボン酸、アセトアミド及び／またはヒドロキサム酸は、哺乳動物細胞株からのポリペプチド、特に組換えポリペプチドの生産を劇的に誘導することが可能な化合物である。さらに、これらの化合物は、ポリペプチドの発現をさらに増加させるために、互いに、及び／または他の誘導方法と組み合わせて、用いられることが可能である。
【０００６】
発明の詳細な説明
「抗体」は、ポリペプチドまたはポリペプチド複合体であって、そのそれぞれは、少なくとも一つの可変抗体免疫グロブリンドメイン及び少なくとも一つの定常抗体免疫グロブリンドメインを含む。抗体は、単鎖抗体、ダイマー抗体、または、非限定的にヘテロダイマー抗体を含む、いくつかのさらに高次のポリペプチド複合体であってもよい。「ヒト抗体」は、究極的にはヒトを起源とする核酸によってコードされる抗体である。このような抗体を、非ヒト細胞または生物体において発現させることが可能である。例えば、ヒト抗体をコードするＤＮＡを、組織培養細胞内に導入し、そして形質転換された細胞株において発現させることが可能である。あるいは、ヒト抗体を、例えばＭｅｎｄｅｚら（（１９９７年）、Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １６（４）：１４６−５６）において記載されたトランスジェニックマウスなどの、トランスジェニック動物において発現させることが可能である。このようなトランスジェニックマウスは、米国特許第６，２３５，８８３ Ｂ１において、完全ヒト抗体を作製するのに利用されている。ヒト抗体を、ハイブリドーマ細胞においても発現させることが可能である。「ヒト化抗体」は、例えば、米国特許第５，５５８，８６４及び第５，６９３，７６１、ならびに国際特許出願ＷＯ ９２／１１０１８において説明されるように、非ヒト由来の相補性決定領域（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３）と、ヒト抗体における配列と一致する（及び、ヒトを起源としてもよい）他の領域とを含む、キメラ抗体である。
【０００７】
「定常抗体免疫グロブリンドメイン」は、ヒトまたは動物を起源とするＣＬ、ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３もしくはＣＨ４ドメインに一致するかまたは実質的に類似した、免疫グロブリンドメインである。例えば、Ｈａｓｅｍａｎｎ及びＣａｐｒａ、Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ、Ｗｉｌｌｉａｍ Ｅ．Ｐａｕｌ編集、Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、第２版、２０９，２１０−２１８（１９８９年）；Ｋａｂａｔら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、米国保健省（１９９１年）を、参照されたい。
【０００８】
「抗体のＦｃ部分」は、ヒトまたは動物の免疫グロブリンドメインＣＨ２及びＣＨ３、あるいはこれらに実質的に類似した免疫グロブリンドメインを含む。考察については、Ｈａｓｅｍａｎｎ及びＣａｐｒａ、同上、２１２−２１３、及び、Ｋａｂａｔら、同上、を参照されたい。
【０００９】
ポリペプチドの発現を可能にする組換え核酸配列が、組換えイルスを用いたウイルス感染、トランスフェクション、形質転換または電気穿孔などの「遺伝子操作」法を用いて細胞内に導入されている場合に、細胞は、特定のポリペプチドを発現するように「遺伝子操作され」ている。例えば、Ｋａｕｆｍａｎら（１９９０年）、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８５：４８７−５１１；Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ａｕｓｕｂｅｌら編集（Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ社、ニューヨーク州、１９８８年、及び四半期毎の更新版）を参照されたい。例えば、Ｂ型肝炎ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、アデノウイルス等などの改変されていない自然発生ウイルスを用いた感染は、本明細書において意味するような遺伝子操作にはならない。「遺伝子操作」の語とは、より高いレベルまたはより低いレベルで遺伝子を発現する宿主細胞、あるいは変異型遺伝子を発現する宿主細胞を作り出すのに用いられる、組換えＤＮＡまたはＲＮＡ法を指す。言い換えれば、細胞に、組換えポリヌクレオチド分子をトランスフェクト、形質転換または形質導入し、それによって、細胞に所望のポリペプチド発現の改変をもたらすように、細胞が改変されている。本発明の目的上、細胞融合の結果として得られるハイブリドーマ細胞株によって生産される抗体は、「組換えポリペプチド」ではない。さらに、ウイルス感染の結果として細胞により生産されるウイルスポリペプチドもまた、ウイルス核酸が、細胞への感染前に遺伝子操作によって改変されているのでなければ、本明細書において意味するような「組換えポリペプチド」ではない。「遺伝子操作」法はまた、当該技術分野において周知の多数の他の方法のうち、非限定的に、ポリメラーゼ連鎖反応を用いた核酸の増幅、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）中にクローニングすることによる組換えＤＮＡ分子の構築、核酸の制限酵素消化、核酸の連結、及び核酸末端への塩基の転移を含む、多数の方法も包含する。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版、第１〜３巻、コールドスプリングハーバー研究所、１９８９年を参照されたい。目的のポリペプチドを発現するように細胞及び／または細胞株を遺伝子操作するための、方法ならびにベクターは、当業者に周知である。遺伝子操作技術としては、これに限定されないが、発現ベクター、標的相同組換え及び遺伝子活性化（例えば、米国特許第５，２７２，０７１、Ｃｈａｐｐｅｌ）、ならびに操作された転写因子によるトランス活性化（例えば、Ｓｅｇａｌら、１９９９年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９６（６）：２７５８−６３を参照されたい）が挙げられる。所望により、ポリペプチドを、例えば、天然でそのポリペプチドの生産を導かないプロモーターなどの、異種調節エレメントの制御下で、発現させてもよい。例えば、プロモーターは、哺乳動物のポリペプチドの発現を導く、強力なウイルスプロモーター（例えば、ＣＭＶ、ＳＶ４０）であることが可能である。宿主細胞は、ポリペプチドを正常に生産しても、または生産しなくてもよい。例えば、宿主細胞は、ヒトポリペプチドを生産するように遺伝子操作されているＣＨＯ細胞であることが可能であり、このことは、ヒトポリペプチドをコードする核酸が、ＣＨＯ細胞中に導入されていることを意味する。あるいは、宿主細胞は、正常には非常に低レベルにのみ存在するヒトポリペプチドのレベルを増加させて生産するように遺伝子操作されている（例えば、内因性プロモーターを強力なウイルスのプロモーターによって置換することにより）ヒト細胞であることが、可能である。
【００１０】
「増殖期」は、培養細胞が急速に分割し、そして数が増加する期間を、意味する。増殖期中に、細胞は、培地中で、かつ細胞増殖を最大限にするように設計された条件下で、一般には培養される。
【００１１】
「ハイブリッド極性化合物」は、無極性の炭素鎖によって分離された二つの極性基を有する化合物である。これには、ヘキサメチレンビスアセトアミド（ＨＭＢＡ）、ならびに同時係属中の出願第１０／４００，３３４、及び以下参考文献：Ｒｉｃｈｏｎら（１９９８年）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９５：３００３−０７；Ｍａｒｋｓら（１９９４年）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９１；１０２５１−５４；及び米国特許第５，０５５，６０８及び６，０８７，３６７において論じられている他の分子が、含まれる。
【００１２】
芳香族カルボン酸化合物、アセトアミド化合物及びヒドロキサム酸化合物などの誘導剤を含有する培養物（ｃｕｌｔｕｒｅ）中で生産されるポリペプチド量が、該誘導剤を含有しない、他の点では同一の培養物中で生産されるポリペプチド量よりも多いならば、ポリペプチドの生産は、該誘導剤の添加によって、「増加」している。同様に、３７℃以外の温度にてインキュベートされた培養物中で生産されるポリペプチド量が、３７℃にてインキュベートされた、他の点では同一の培養物中で生産されるポリペプチド量よりも多いならば、ポリペプチドの生産は、３７℃以外の温度での増殖によって「増加」している。典型的には、化合物または誘導剤に曝露された細胞を、細胞及び培地を回収しそしてポリペプチドの生産を評価する前に、少なくとも約２日間、より典型的には約５〜１０日間、そしてときにはさらに長期間、培養維持するであろう。
【００１３】
「多量体化ドメイン」は、その下で、共有または非共有相互作用を介して他のポリペプチド分子と結合する性向を与える、ポリペプチド分子内のドメインである。
「自然発生ポリペプチド」は、天然に生じるポリペプチド、すなわち、遺伝子操作されていない細胞によって生産されることが可能なポリペプチドである。このようなポリペプチドは、これを生産するように遺伝子操作された細胞によっても、生産されてよい。
【００１４】
「ポリペプチド」は、ペプチド結合によって連結した少なくとも６アミノ酸の連鎖を意味する。所望により、ポリペプチドは、ペプチド結合によって連結した、少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０または３００アミノ酸を含むことが可能である。
【００１５】
「生産用培地」は、生産期において細胞を培養するのに用いられるよう設計された細胞培養培地を、意味する。
「生産期」は、細胞が最大量の組換えポリペプチドを生産している期間を、意味する。生産期は、増殖期におけるよりも細胞分割が少ないことによって、かつ、ポリペプチドの生産を最大限にするよう設計された培地及び培養条件を用いることによって、特徴付けられる。
【００１６】
「組換え融合ポリペプチド」は、少なくとも二つのポリペプチドのすべてまたは一部の融合であって、遺伝子操作法を用いて作製される。
「組換えポリペプチド」は、遺伝子操作過程の結果として得られるポリペプチドである。本発明の目的上、細胞融合の結果として得られたハイブリドーマ細胞株によって生産される抗体は、「組換えポリペプチド」ではない。さらに、自然発生ウイルスによるウイルス感染の結果として細胞によって生産されるウイルスタンパク質も、ウイルス核酸が、細胞への感染前に遺伝子操作によって改変されているのでなければ、本明細書において意味する「組換えポリペプチド」でない。
【００１７】
「実質的に類似した」ポリペプチドは、アミノ酸配列において、互いに、少なくとも８０％、所望により少なくとも９０％同一であり、そして改変されていないポリペプチドの生物学的活性を維持または望ましいように改変する。保存的アミノ酸置換は、生物学的活性に影響を及ぼす可能性はあまりなく、非限定的に、以下：Ａｌａ←Ｓｅｒ、Ｖａｌ←Ｉｌｅ、Ａｓｐ←Ｇｌｕ、Ｔｈｒ←Ｓｅｒ、Ａｌａ←Ｇｌｙ、Ａｌａ←Ｔｈｒ、Ｓｅｒ←Ａｓｎ、Ａｌａ←Ｖａｌ、Ｓｅｒ←Ｇｌｙ、Ｔｙｒ←Ｐｈｅ、Ａｌａ←Ｐｒｏ、Ｌｙｓ←Ａｒｇ、Ａｓｐ←Ａｓｎ、Ｌｅｕ←Ｉｌｅ、Ｌｅｕ←Ｖａｌ、Ａｌａ←Ｇｌｕ、Ａｓｐ←Ｇｌｙ、及びこれらの反対の変更を、含む。例えば、Ｎｅｕｒａｔｈら、Ｔｈｅ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ、アカデミックプレス社、ニューヨーク州（１９７９年）を参照されたい。加えて、アミノ酸の以下６群のメンバー内でのアミノ酸の変換は、本発明の目的上、保存的置換であると考えられるであろう。該群とは、１）メチオニン、アラニン、バリン、ロイシン及びイソロイシン；２）システイン、セリン、トレオニン、アスパラギン及びグルタミン；３）アスパラギン酸及びグルタミン酸；４）ヒスチジン、リジン及びアルギニン；５）グリシン及びプロリン；ならびに、６）トリプトファン、チロシン及びフェニルアラニンである。二つのアミノ酸配列の同一性（ｉｄｅｎｔｉｔｙ）を、目視による点検及び数学的計算によって決定することが可能であり、より好ましくは、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ（ＧＣＧ；マディソン、ウィスコンシン州）のウィスコンシンパッケージ・バージョン１０．０プログラム「ＧＡＰ」（Ｄｅｖｅｒｅｕｘら（１９８４年）、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１２：３８７）などのコンピュータープログラムまたは他の匹敵するプログラムなどのコンピュータープログラムを用いて配列情報を比較することによって、比較を行う。「ＧＡＰ」プログラムの好ましいデフォルトパラメーターは、（１）Ｓｈｅｗａｒｔｚ及びＤａｙｈｏｆｆ編集、Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ、３５３〜３５８頁（１９７９年）によって記載されたような、Ｇｒｉｂｓｋｏｖ及びＢｕｒｇｅｓｓ（１９８６年）、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１４：６７４５のアミノ酸重量の比較マトリックス、または他の匹敵する比較マトリックス；（２）各ギャップにつき３０ペナルティ、及びアミノ酸配列の各ギャップにおける各シンボルにつき追加の１ペナルティ；（３）エンドギャップにペナルティなし；ならびに、（４）長いギャップに最大ペナルティなし：を含む。配列比較分野の当業者によって用いられる他のプログラムを、用いてもよい。
【００１８】
「移行期」は、「増殖期」と「生産期」との間の細胞培養期間を意味する。移行期において、培地及び環境条件は、増殖を最大にするよう設計されたものから、ポリペプチド生産を最大にするよう設計されたものへと、典型的には移行する。
【００１９】
「可変抗体免疫グロブリンドメイン」は、ヒトまたは動物を起源とするＶＬもしくはＶＨドメインと同一または実質的に類似した、免疫グロブリンドメインである。
本発明は、特定のポリペプチドを生産するように遺伝子操作されていてもよい哺乳動物細胞を培養するための改良された方法を、対象とする。具体的には、本発明は、特定のポリペプチドの生産を最大にする培養方法を対象とする。これはまた、培養哺乳動物細胞からこのようなポリペプチドを生産し、そして得る方法も、対象とする。ポリペプチドは、診断、治療、農業、栄養及び研究への非常に多様な応用において、有用である。
【００２０】
本明細書において報告される実験データによって示されるように、別々に、または様々な組み合わせで用いられた、芳香族カルボン酸化合物、アセトアミド化合物及びヒドロキサム酸化合物は、ＣＨＯ細胞株からの組換えポリペプチド生産を劇的に誘導することが可能であることが、発見された。これらの化合物は、９６ウェルでの蛍光タンパク質に基づくアッセイにおいて、誘導剤としてまず同定された。アデノウイルスのトリパータイトリーダを含む、ＥＡＳＥ／ＣＭＶプロモーターの制御下でＤｓＲｅｄを発現するコンストラクトを、発現の指標として用いて、種々の化合物をアッセイした。次いで、ＤｓＲｅｄ発現を、特により低温にて誘導するようにみえたこれらの化合物を、他の組換えポリペプチドの誘導についてのアッセイにて、さらに検討した。これらの実験は、化学物質のサブセットを、組換えタンパク質発現の強力な誘導剤として同定することへと導いた。概して、化合物は三つの大まかな分類：芳香族カルボン酸化合物、アセトアミド化合物及びヒドロキサム酸化合物に分けられた。追加実験により、１より多くのこれらの分類の化合物の組み合わせが、ポリペプチド発現の誘導、特に組換えタンパク質の生産をさらに増加させることが可能であることが、示された。このように、これらの化合物を誘導剤として用いることで、実質的に、製造費用を低下させ、かつ／または工場生産力の必要性を減少させることが可能である。
【００２１】
本発明の実施に際して有用な芳香族カルボン酸は、化学式Ｘ−Ｙ−Ｚの化合物であって、ここでＸは、芳香族基、例えば５、６または７員炭素環、であり、Ｙは、１〜２０またはそれより多くの炭素、好ましくは２〜１０炭素、より好ましくは２〜５炭素のアルキル基を有する連結部分であり、そしてＺはカルボン酸基である。芳香族基は、置換されることも、または置換されないことも可能であり；置換されたフェニル基を用いるならば、置換は、メタ及びオルソ置換基でも許容可能であるが、好ましくはパラ配位である。芳香族基は、特に有利と思われる；この基が直鎖または分鎖アルキルによって置換されるならば、このような化合物はあまり同じようには作用せず、そして色素基または三酸塩基は陰性であることが、見いだされている。例えば、ピメリン酸、メチルコハク酸及びクエン酸二水素ナトリウムは、誘導剤としては効力がなかった。組換えポリペプチド生産の誘導剤としての有用性が本明細書に記載されている、これらの芳香族カルボン酸の図解例は、以下のとおりである：
芳香族カルボン酸分類：
ヒドロ桂皮酸（ＨＣＡ）
【００２２】
【化１】
【００２３】
３−（４−メチルフェニル）プロピオン酸
【００２４】
【化２】
【００２５】
４−フェニル酪酸
【００２６】
【化３】
【００２７】
４−（４−アミノフェニル）酪酸
【００２８】
【化４】
【００２９】
５−フェニル吉草酸（５−ＰＶＡ）
【００３０】
【化５】
【００３１】
ポリペプチド生産を増加させるのに用いられることが可能な他の化合物は：３−（４−ヒドロキシフェニル）プロピオン酸；３−（２−メチルフェニル）プロピオン酸；４−（４−メトキシフェニル）酪酸；４−（４−アミノフェニル）酪酸；３−（２−ヒドロキシフェニル）プロピオン酸；６−フェニルヘキサン酸；３，４−ジフルオロヒドロ桂皮酸；及び、２−メチルインドール−３−酢酸である。さらに、用いられることが可能な他の化合物は：３−（３−メトキシフェニル）プロピオン酸；６−ベンジルオキシカルボニルアミノヘキサン酸；３−［４−（トリフルオロメチル）フェニル］プロピオン酸；３−（４−アミノフェニル）プロピオン酸；３−（４−フルオロフェニル）プロピオン酸；２−チエニル酢酸、及び３−（３，４−ジメトキシフェニル）プロピオン酸である。
【００３２】
加えて、本発明は、アセトアミドをポリペプチド生産の誘導剤として用いることを、包含する。同時係属中の特許出願第１０／４００，３３４は、ハイブリッド極性化合物を誘導剤として用いることについて記載しており、そのいくつかはアセトアミド類である。しかしながら、本明細書に記載されるように、ハイブリッド極性化合物でないアセトアミド（すなわち、ただ一つの極性基−アセトアミド基を含有する）もまた、組換えポリペプチド生産を誘導することが可能である。このような非ハイブリッド極性アセトアミドは、アルキル鎖が約３２〜約２０炭素長のアルキルアセトアミドであることが可能である。単独でまたは他の化合物と組み合わせて誘導剤として用いられることが可能なアセトアミドの例は、以下を含む。
【００３３】
アセトアミド分類：
ヘキサメチレンビスアセトアミド（ＨＭＢＡ）（ハイブリッド極性化合物）
【００３４】
【化６】
【００３５】
Ｎ−ブチルアセトアミド
【００３６】
【化７】
【００３７】
さらに、組換えポリペプチド生産の誘導剤として用いられることが可能な別分類の化合物は、ヒドロキサム酸である。本発明は、ハイブリッド極性化合物でないヒドロキサム酸を誘導剤として用いることを、包含する。本明細書において有用であることが示されている化合物の例は、以下のとおりである：
ヘキサノヒドロキサム酸（ＨＨＡ）
【００３８】
【化８】
【００３９】
３−フェニルプロピオノヒドロキサム酸
【００４０】
【化９】
【００４１】
ベンゾヒドロキサム酸
【００４２】
【化１０】
【００４３】
オクタン−１，８−ジヒドロキサム酸
【００４４】
【化１１】
【００４５】
具体的には、上記に例示された任意の芳香族カルボン酸化合物、アセトアミド化合物及びヒドロキサム酸化合物を生産期の細胞培養に加えることによって、組換えポリペプチドの生産を増強することが可能であることが、多数の異なる化合物のスクリーニングを介して、見いだされている。さらに、１より多くの上記分類から選択されたこのような化合物を、組換えポリペプチドの生産を増強するために、組み合わせて加えることが可能である。
【００４６】
さらに、例えば、約２９℃〜約３６℃、約２９℃〜約３５℃、及び／または約３０℃〜約３３℃の温度での細胞培養などの、生産を増加させる他の方法もまた、１またはそれより多くのこれらの化学誘導剤と組み合わせて用いられることが可能である。所望により、本発明の方法を用いる細胞培養を、増殖期とは区別される生産期に行うことが可能である。増殖期は、例えば、温度の移行、及び／または、例えば１またはそれより多くの誘導剤を添加するなどの培地の変化によって、生産期と区別されることが可能である。
【００４７】
一つの側面において、本発明は、ポリペプチドを生産するように遺伝子操作されている哺乳動物細胞を培養中増殖させること；及び、１またはそれより多くの芳香族カルボン酸化合物、アセトアミド化合物及びヒドロキサム酸化合物を培養物に加えることを含む方法を、提供する。遺伝子操作された細胞は、ポリペプチドをコードする組換えベクターで形質転換されている細胞であってもよい。加えて、ポリペプチドを、例えばＣＭＶプロモーターまたはＳＶ４０プロモーターなどの異種プロモーターの制御下で、発現させてもよい。典型的には、細胞は、ポリペプチドを天然で発現しないか、またはポリペプチドを天然で非常に低レベルに発現する（遺伝子操作されていない場合）。別の側面において、本発明は、ポリペプチドを生産するように遺伝子操作された細胞、生産用培地、ならびに芳香族カルボン酸化合物、アセトアミド化合物及び／またはヒドロキサム酸化合物を含有する培養物（ｃｕｌｔｕｒｅ）を、提供する。
【００４８】
加えて、本発明の方法及び組成物を、任意の他の公知の、または未だ発見されていない、組換えポリペプチド生産の誘導方法と組み合わせて、用いることが可能である。このような技術は、ほんの数例を挙げると、低温への移行、アルカン酸の添加（Ｅｔｃｈｅｖｅｒｒｙらによる米国特許第５，７０５，３６４に記載され、該出願は、参照によって本明細書に援用される）、ハイブリッド双極性化合物、キサンチン、ＤＭＦ及びＤＭＳＯ、ならびに、未だ記載されておらず、かつ／または発見されていない誘導技術（例えば、２００３年３月２７日に出願された、同時係属中の特許出願第１０／４００，３３４を参照されたく、該出願は、参照によって本明細書に援用される）を含む。本明細書では、ポリペプチド生産を「誘導すること」または「誘導」とは、細胞によって作られた所望のポリペプチドの総量を最大にするように設計された一連の条件下で細胞を培養することを、指す。「誘導剤」は、培養培地に加えられる場合に、少なくともいくつかの細胞株において所望のポリペプチドの生産を増加させることが可能な剤である。
【００４９】
芳香族カルボン酸化合物、アセトアミド化合物及び／またはヒドロキサム酸化合物の添加を、互いに、及び／または他のタンパク質誘導技術と組み合わせることで、ポリペプチド誘導に対する相乗効果を得ることが可能であり、これによって、これらの化合物の添加を減らし、及び／または他の誘導剤の添加を減らし、及び／または温度の移行を少なくすることが可能となる。他の誘導方法を、化合物の添加とほぼ同時に、及び／または添加前、及び／または添加後に行うことが可能である。例えば、培養温度を第０日に移行させ、次いでこれらの化合物のうちの一つ、及び所望により他の化学誘導剤を、その後に、例えば１〜数時間または１〜数日後に加えることが可能である。このようなプロトコールは、完全誘導する前に、播かれた培養物をさらにいくらか増殖させることを可能とする。さらに、芳香族カルボン酸化合物、アセトアミド化合物及び／またはヒドロキサム酸化合物の複数回の添加を、他の誘導剤の添加または培地条件の変化の有無にかかわらず、約１２、２４、４８及び／または７２時間あるいはそれより長期に分けて、生産期において培養物中に加えることが可能である。例えば、誘導剤を、第０日に、及び第４日に再び、加えることが可能である。あるいは、誘導剤を、温度移行後１、２、３または４日に、初めて加えることが可能である。
【００５０】
一つの側面において、本発明は、低温への移行（誘導剤化合物（単数または複数）添加時、添加前及び／または添加後に、培地の温度を、最適増殖温度（通常はおよそ３７℃）から、より低温（通常は約２９℃〜約３６℃、及び所望により約３０℃〜約３４℃）に移行）を行うことを伴う。
【００５１】
細胞株間で、種々の誘導剤の有効性に個体差がある。例えば、酪酸ナトリウムは広く用いられている誘導剤であるにもかかわらず、いくつかの細胞株においては、ポリペプチド生産に対する効果を持たないか、負の効果を持つ。異なる誘導剤または異なる濃度の同じ誘導剤が、異なる細胞株に対して適切である可能性がある。さらに、異なる温度が、異なる細胞株に対して適切である可能性がある。このばらつきにもかかわらず、芳香族カルボン酸、アセトアミド及びヒドロキサム酸などの誘導剤は、多様な細胞株において有用である可能性がある。
【００５２】
特定の化合物に対する最適濃度は、その活性及びそれが用いられる細胞株によって変動するであろうし、そして本明細書において提供される所定の方法及びガイダンスを用いて、当業者によって決定されることが可能である。例えば、ヒドロ桂皮酸（ＨＣＡ）、３−（４−メチルフェニル）プロピオン酸、４−フェニル酪酸、４−（４−アミノフェニル）酪酸及び５−フェニル吉草酸などの化合物は、約０．０１ｍＭ〜約２０ｍＭ、好ましくは約０．１ｍＭ〜約５ｍＭ、そしてより好ましくは約０．２〜２ｍＭの濃度で、加えられることが可能である。ヘキサノヒドロキサム酸（ＨＨＡ）及び３−フェニルプロピノヒドロキサム酸などの化合物は、それよりも若干低い濃度で用いられるべきであり、したがって、約０．０１μＭ〜約１ｍＭ、好ましくは約０．１μＭ〜約５０μＭ、そしてより好ましくは約１〜２０μＭの濃度で、加えられることが可能である。
【００５３】
発現に特に好ましいポリペプチドは、バイオロジックとしても知られる、ポリペプチドに基づく薬物である。好ましくは、該ポリペプチドは、細胞外産物として分泌される。生産されているポリペプチドは、自然発生ポリペプチドと同一もしくは実質的に類似した、ポリペプチドの一部または全部を含むことが可能であり、かつ／あるいは、これは、組換え融合ポリペプチドであっても、または組換え融合ポリペプチドなくてもよい。所望により、該ポリペプチドは、ヒトポリペプチド、その断片、または少なくとも１５アミノ酸長である実質的に類似したポリペプチドであってもよい。これは、非抗体ポリペプチド及び／または抗体を含んでもよい。これは、細胞内で生産されてもよく、またはこれを回収可能な培養培地中に分泌されてもよい。これは、可溶性ポリペプチドであっても、または可溶性ポリペプチドでなくてもよい。
【００５４】
生産されているポリペプチドは、自然発生ポリペプチドと同一もしくは実質的に類似した、ポリペプチドの一部または全部を含むことが可能であり、かつ／あるいは、これは、組換え融合ポリペプチドであっても、または組換え融合ポリペプチドなくてもよい。これは、非抗体ポリペプチド及び／または抗体を含んでもよい。これは、細胞内で生産されてもよく、またはこれを回収可能な培養培地中に分泌されてもよい。
【００５５】
本発明は、任意のほとんどのポリペプチドの生産を誘導するのに用いられることが可能であり、そして、その発現が例えばウイルスのプロモーターなどの強力なプロモーターの制御下にあるポリペプチド、及び／またはアデノウイルスの三部（ｔｒｉｐａｒｔｉｔｅ）リーダーエレメントを有するメッセージ上にコードされるポリペプチドに対して、特に有利である。タンパク質を生産するのに用いることが可能な、有用な発現ベクターの例は、国際出願ＷＯ ０１／２７２９９、及びＭｃＭａｈａｎら（１９９１年）、ＥＭＢＯ Ｊ．１０：２８２１に開示されており、後者は、あるウイルスプロモーターであるＣＭＶプロモーターを用いるｐＤＣ４０９ベクターについて記載されている。タンパク質は、少なくとも約１０アミノ酸、所望により約２５、７５または１００アミノ酸のポリペプチドであると、一般に理解されている。
【００５６】
概して、本発明の方法は、組換えポリペプチドの生産を誘導するのに有用である。本発明の方法を用いて生産可能ないくつかのポリペプチドには、以下のポリペプチドのうちの一つの全部もしくは一部と同一または実質的に類似したアミノ酸配列を含むポリペプチドが含まれる：ｆｌｔ３リガンド（国際出願ＷＯ ９４／２８３９１に記載され、該出願は、参照によって本明細書に援用される）、ＣＤ４０リガンド（米国特許第６，０８７，３２９に記載され、該出願は、参照によって本明細書に援用される）、エリスロポエチン、トロンボポエチン、カルシトニン、レプチン、ＩＬ−２、アンジオポエチン−２（Ｍａｉｓｏｎｐｉｅｒｒｅら（１９９７年）、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７７（５３２２）：５５−６０に記載され、参照によって本明細書に援用される）、Ｆａｓリガンド、ＮＦ−κＢの受容体活性化因子に対するリガンド（ＲＡＮＫＬ、国際出願ＷＯ ０１／３６６３７に記載され、該出願は、参照によって本明細書に援用される）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）関連アポトーシス誘導リガンド（ＴＲＡＩＬ、国際出願ＷＯ ９７／０１６３３に記載され、該出願は、参照によって本明細書に援用される）、胸腺間質由来リンフォポエチン、顆粒球コロニー刺激因子、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ、豪州特許第５８８８１９に記載され、該出願は、参照によって本明細書に援用される）、肥満細胞増殖因子、幹細胞増殖因子（米国特許第６，２０４，３５３に記載され、該出願は、参照によって本明細書に援用される）、上皮増殖因子、ケラチノサイト増殖因子、巨核球増殖発達因子、ＲＡＮＴＥＳ、成長ホルモン、インスリン、インスリノトロピン、インスリン様成長因子、副甲状腺ホルモン、インターフェロン（αインターフェロン、γインターフェロン及びコンセンサスインターフェロンを含む）（米国特許第４，６９５，６２３及び第４，８９７４７１に記載されたものなどであり、その双方は、参照によって本明細書に援用される）、神経成長因子、脳由来神経栄養因子、シナプトタグミン様タンパク質（ＳＬＰ １〜５）、ニューロトロフィン−３、グルカゴン、インターロイキン１〜１８、コロニー刺激因子、リンフォトキシン−β、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、白血球抑制因子、オンコスタチン−Ｍ、ならびに、細胞表面分子であるＥＬＫ及びＨｅｋに対する種々のリガンド（ｅｐｈ関連キナーゼまたはＬＥＲＫＳに対するリガンドなど）。本発明の方法にしたがって生産可能なポリペプチドについての記載は、例えば、Ｈｕｍａｎ Ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ：Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｆｏｒ Ｂａｓｉｃ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、第ＩＩ巻（Ａｇｇａｒｗａｌ及びＧｕｔｔｅｒｍａｎ編集、Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社、ケンブリッジ、マサチューセッツ州、１９９８年）；Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ（ＭａｃＫａｙ及びＬｅｉｇｈ編集、オックスフォード大学プレス・Ｉｎｃ．、ニューヨーク州、１９９３年）；及び、Ｔｈｅ Ｃｙｔｏｋｉｎｅ Ｈａｎｄｂｏｏｋ（Ａ．Ｗ．Ｔｈｏｍｐｓｏｎ編集、アカデミックプレス社、サンディエゴ、カリフォルニア州、１９９１年）に見つけられ、そのすべては、参照によって本明細書に援用される。
【００５７】
本発明の方法を用いて生産されることが可能な他のポリペプチドとしては、任意の上記ポリペプチドに対する受容体、このような受容体もしくは任意の上記ポリペプチドのアンタゴニスト、及び／またはこのような受容体またはアンタゴニストに実質的に類似したポリペプチドの、アミノ酸配列の全部あるいは一部を含むポリペプチドが、挙げられる。これらの受容体及びアンタゴニストには：両方の型の腫瘍壊死因子受容体（米国特許第５，３９５，７６０及び米国特許第５，６１０，２７９に記載されている、ｐ５５及びｐ７５と称されるＴＮＦＲであって、該出願の双方は、参照によって本明細書に援用される）、インターロイキン−１（ＩＬ−１）受容体（Ｉ型及びＩＩ型；欧州特許第０ ４６０ ８４６、米国特許第４，９６８，６０７及び米国特許第５，７６７，０６４に記載され、そのすべては、参照によって本明細書に援用される）、ＩＬ−１受容体アンタゴニスト（米国特許第６，３３７，０７２に記載されたもので、参照によって本明細書に援用される）、ＩＬ−１アンタゴニストまたは阻害剤（米国特許第５，９８１，７１３、第６，０９６，７２８及び第５，０７５，２２２に記載されたもので、そのすべては、参照によって本明細書に援用される）、ＩＬ−２受容体、ＩＬ−４受容体（欧州特許第０ ３６７ ５６６及び米国特許第５，８５６，２９６に記載され、その双方は、参照によって本明細書に援用される）、ＩＬ−１５受容体、ＩＬ−１７受容体、ＩＬ−１８受容体、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子受容体、顆粒球コロニー刺激因子受容体、オンコスタチン−Ｍ及び白血球抑制因子に対する受容体、ＮＦ−κＢの受容体活性化因子（ＷＯ ０１／３６６３７及び米国特許第６，２７１，３４９に記載されている、ＲＡＮＫＬであって、該出願の双方は、参照によって本明細書に援用される）、オステオプロテジェリン（例えば、米国特許第６，０１５，９３８に記載され、参照によって本明細書に援用される）、ＴＲＡＩＬに対する受容体（ＴＲＡＩＬ受容体１、２、３及び４を含む）、ならびに、Ｆａｓまたはアポトーシス誘導受容体（ＡＩＲ）などのデスドメインを含む受容体が、含まれる。
【００５８】
本発明の過程を用いて生産されることが可能な他のポリペプチドとしては、分化抗原（ＣＤポリペプチドと称される）もしくはそのリガンド、またはこれらのいずれかに実質的に類似したポリペプチドの、アミノ酸配列の全部あるいは一部を含むポリペプチドが、挙げられる。このような抗原は、Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ Ｔｙｐｉｎｇ ＶＩ（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ ＶＩｔｈ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｗｏｒｋｓｈｏｐ ａｎｄ Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ、Ｋｉｓｈｉｍｏｔｏ、Ｋｉｋｕｔａｎｉら編集、神戸市、日本、１９９６年。該文献は、参照によって本明細書に援用される）において開示されている。同様なＣＤポリペプチドは、それに続くワークショップにおいて開示されている。このような抗原の例としては、ＣＤ２２、ＣＤ２７、ＣＤ３０、ＣＤ３９、ＣＤ４０及びそれに対するリガンド（ＣＤ２７リガンド、ＣＤ３０リガンド等）が挙げられる。該ＣＤ抗原のいくつかは、ＴＮＦ受容体ファミリーメンバーであって、これには、４１ＢＢ及びＯＸ４０もまた含まれる。該リガンドは、しばしば、４１ＢＢリガンド及びＯＸ４０リガンドのような、ＴＮＦファミリーメンバーである。したがって、ＴＮＦ及びＴＮＦＲファミリーメンバーもまた、本発明を用いて精製されることが可能である。
【００５９】
酵素的に活性なポリペプチドまたはそのリガンドもまた、本発明の方法にしたがって生産されることが可能である。その例としては、以下のポリペプチドもしくはそのリガンド、またはこれらのうちの一つに実質的に類似したポリペプチドの全部あるいは一部を含むポリペプチドが、挙げられる：メタロプロテイナーゼ−ディスインテグリンファミリーメンバー、種々のキナーゼ、グルコセレブロシダーゼ、スーパーオキシドジスムターゼ、組織プラスミノーゲン活性化因子、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、アポリポタンパク質Ｅ、アポリポタンパク質Ａ〜Ｉ、グロビン、ＩＬ−２アンタゴニスト、α−１抗トリプシン、ＴＮＦ−α変換酵素、任意の上記酵素に対するリガンド、ならびに多数の他の酵素及びそのリガンド。
【００６０】
本発明の方法はまた、抗体またはその一部分、及びキメラ抗体、すなわち１またはそれより多くのマウス可変抗体免疫グロブリンドメイン、その断片、または実質的に類似したタンパク質と連結したヒト定常抗体免疫グロブリンドメインを有する抗体を、生産するのに用いられることが、可能である。本発明の方法はまた、抗体と細胞毒性物質または発光物質を含む複合体を生産するのに用いられることも可能である。このような物質としては、メイタンシン誘導体（ＤＭ１など）；エンテロトキシン（ブドウ球菌のエンテロトキシンなど）；ヨウ素同位体（ヨウ素−１２５など）；テクニウム同位体（Ｔｃ−９９ｍなど）；シアニン蛍光色素（Ｃｙ５．５．１８など）；及び、リボソーム不活化ポリペプチド（ブーガニン、ゲロニンまたはサポニン−Ｓ６など）：が挙げられる。本発明はまた、特定の標的タンパク質と結合し、そしてその活性を修飾するように、ｉｎ ｖｉｔｒｏにて選択されたキメラタンパク質を生産するのに用いられることも可能であって、このようなキメラタンパク質は、国際出願ＷＯ ０１／８３５２５及びＷＯ ００／２４７８２に記載されたものなどであり、該出願の双方は、参照によって本明細書に援用される。本発明の方法によって生産されることが可能な、抗体、ｉｎ ｖｉｔｒｏにて選択されたキメラタンパク質、あるいは、抗体／細胞毒素または抗体／発光原子団複合体の例としては、これに限定されないが、上記タンパク質及び／または以下の抗原を含むポリペプチドの、任意の一つまたは組み合わせを認識するものが、挙げられる：ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１４、ＣＤ１８、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２５、ＣＤ３３、ＣＤ４０、ＣＤ４４、ＣＤ５２、ＣＤ８０（Ｂ７．１）、ＣＤ８６（Ｂ７．２）、ＣＤ１４７、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−７、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−８、ＩＬ−１０、ＩＬ−２受容体、ＩＬ−４受容体、ＩＬ−６受容体、ＩＬ−１３受容体、ＩＬ−１８受容体サブユニット、ＰＤＧＦ−β及びそのアナログ（米国特許第５，２７２，０６４及び第５，１４９，７９２に記載されたものなど）、ＶＥＧＦ、ＴＧＦ、ＴＧＦ−β２、ＴＧＦ−β１、ＥＧＦ受容体（米国特許第６，２３５，８８３ Ｂ１に記載されたものを含み、該出願は、参照によって本明細書に援用される）、ＶＥＧＦ受容体、肝細胞増殖因子、オステオプロテジェリンリガンド、インターフェロンγ、Ｂリンパ球刺激因子（ＢｌｙＳ、またはＢＡＦＦ、ＴＨＡＮＫ、ＴＡＬＬ−１及びｚＴＮＦ４としても知られる；Ｄｏ及びＣｈｅｎ−Ｋｉａｎｇ（２００２年）、Ｃｙｔｏｋｉｎｅ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ Ｒｅｖ．１３（１）：１９−２５を参照されたい）、Ｃ５補体、ＩｇＥ、腫瘍抗原ＣＡ１２５、腫瘍抗原ＭＵＣ１、ＰＥＭ抗原、ＬＣＧ（肺癌に関連して発現する遺伝子産物）、ＨＥＲ−２、腫瘍関連糖タンパク質ＴＡＧ−７２、ＳＫ−１抗原、結腸癌及び／または膵臓癌患者の血清中に高レベルで存在する腫瘍関連エピトープ、癌関連エピトープまたはポリペプチド（胸部、結腸、偏平上皮細胞、前立腺、膵臓、肺及び／または腎臓癌細胞に、かつ／あるいは、メラノーマ、グリオーマまたは神経芽腫細胞に、発現する）、腫瘍の壊死中心（ｎｅｃｒｏｔｉｃ ｃｏｒｅ）、インテグリンα４β７、インテグリンＶＬＡ−４、Ｂ２インテグリン、ＴＲＡＩＬ受容体１、２、３及び４、ＲＡＮＫ、ＲＡＮＫリガンド、ＴＮＦ−α、接着分子ＶＡＰ−１、上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）、細胞内接着分子−３（ＩＣＡＭ−３）、ロイコインテグリンアドヘシン、血小板糖タンパク質ｇｐ ＩＩｂ／ＩＩＩａ、心臓ミオシン重鎖、副甲状腺ホルモン、ｒＮＡＰｃ２（第ＶＩＩａ因子−組織因子の阻害剤）、ＭＨＣ Ｉ、癌胎児抗原（ＣＥＡ）、α−フェトプロテイン（ＡＦＰ）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、ＣＴＬＡ−４（細胞毒性Ｔリンパ球関連抗原）、Ｆｃ−γ−１受容体、ＨＬＡ−ＤＲ １０β、ＨＬＡ−ＤＲ抗原、Ｌ−セレクチン、Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ Ｓｙｎｃｉｔｉａｌウイルス、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、ストレプトコッカス・ミュータンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓ）、ならびに黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）。
【００６１】
本発明はまた、腫瘍抗原ｇｐ７２を標的とする抗体；ガングリオシドＧＤ３に対する抗体；ガングリオシドＧＤ２に対する抗体；またはこれらに実質的に類似した抗体：に対する抗イディオタイプを含む、抗イディオタイプ抗体もしくは実質的に類似したポリペプチドの、全部または一部を生産するのに、用いられてもよい。
【００６２】
本発明の方法はまた、任意の上記ポリペプチドを含む組換え融合ポリペプチドを生産するのに用いられることも可能である。例えば、上記ポリペプチドのうちの一つに加えて、ロイシンジッパー、コイルドコイル、抗体のＦｃ部分、または実質的に類似したタンパク質などの多量体化ドメインを含む、組換え融合ポリペプチドを、本発明の方法を用いて生産することが可能である。例えば、ＷＯ９４／１０３０８；Ｌｏｖｅｊｏｙら（１９９３年）、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５９：１２８８−１２９３；Ｈａｒｂｕｒｙら（１９９３年）、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６２：１４０１−０５；Ｈａｒｂｕｒｙら（１９９４年）、Ｎａｔｕｒｅ ３７１：８０−８３；Ｈａｋａｎｓｓｏｎら（１９９９年）、Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ７：２５５−６４を参照されたく、そのすべては、参照によって本明細書に援用される。このような組換え融合ポリペプチドには、ＴＮＦＲまたはＲＡＮＫの一部分が、抗体のＦｃ部分と融合しているポリペプチド（ＴＮＦＲ：ＦｃまたはＲＡＮＫ：Ｆｃ）が、具体的には含まれる。ＴＮＦＲ：Ｆｃは、ＴＮＦＲの細胞外ドメインと融合した抗体のＦｃ部分を含み、該細胞外ドメインは、米国特許第５，３９５，７６０（参照によって本明細書に援用される）の図２Ａのアミノ酸１〜１６３、１〜１８５または１〜２３５に実質的に類似したアミノ酸配列を含む。ＲＡＮＫ：Ｆｃは、国際出願ＷＯ ０１／３６６３７において記載され、該出願は、参照によって本明細書に援用される。
【００６３】
好ましくは、該ポリペプチドを、例えば、天然にはそのポリペプチドの生産を導かないプロモーターなどの、異種調節エレメントの制御下で、発現する。例えば、プロモーターは、哺乳動物のポリペプチドの発現を導く、強力なウイルスプロモーター（例えば、ＣＭＶ、ＳＶ４０）であることが可能である。宿主細胞は、ポリペプチドを通常に生産しても、または生産しなくてもよい。例えば、宿主細胞は、ヒトポリペプチドを生産するように遺伝子操作されているＣＨＯ細胞であることが可能であり、このことは、ヒトポリペプチドをコードする核酸が、ＣＨＯ細胞中に導入されていることを意味する。あるいは、宿主細胞は、通常には非常に低レベルにのみ存在するヒトポリペプチドのレベルを増加させて生産するように遺伝子操作されている（例えば、内因性プロモーターを強力なウイルスのプロモーターによって置換することにより）ヒト細胞であることが、可能である。組換えポリペプチドを生産させるために、組換えポリペプチドをコードする発現ベクターを、例えば、トランスフェクションまたはウイルス感染によって、実質的に均一な培養宿主細胞に移行させることが可能である。発現ベクターは、遺伝子操作法を用いて構築可能であり、適切な調節配列に機能可能なように連結されている目的のポリペプチドをコードする核酸を含むことが可能である。
【００６４】
調節配列は、典型的には、哺乳動物、微生物、ウイルス及び／または昆虫の遺伝子に由来する。調節配列の例としては、転写プロモーター、オペレーター及びエンハンサー、リボソーム結合部位（例えば、Ｋｏｚａｋ（１９９１年）、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６：１９８６７−１９８７０を参照されたい）、転写及び翻訳の開始及び終結を制御するための適切な配列、ポリアデニル化シグナル（例えば、ＭｃＬａｕｃｈｌａｎら（１９８８年）、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１６：５３２３−３３）、ならびに、マトリックス及び足場付着（ｓｃａｆｆｏｌｄ ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ）部位（Ｐｈｉ−Ｖａｎら（１９８８年）、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１０：２３０２−０７；Ｓｔｉｅｆら（１９８９年）、Ｎａｔｕｒｅ ３４１：３４２−３５；Ｂｏｎｉｆｅｒら（１９９０年）、ＥＭＢＯ Ｊ．９：２８４３−３８を参照されたい）が挙げられる。調節配列がポリペプチドをコードする配列と機能的に関連する場合に、ヌクレオチド配列は、機能可能に連結されている。したがって、プロモーターのヌクレオチド配列が、ポリペプチドをコードする配列の転写を制御するならば、プロモーターのヌクレオチド配列は、該コード配列と機能可能なように連結されている。一般的に、選択マーカーをコードする遺伝子が、組換え細胞の同定を容易にするために、発現ベクター中に組み込まれる。
【００６５】
哺乳動物宿主細胞の発現ベクターの転写及び翻訳制御配列を、ウイルスゲノムから切り出すことが可能である。一般的に用いられるプロモーター配列及びエンハンサー配列は、ポリオーマウイルス、アデノウイルス２、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）及びヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）に由来する。例えば、前初期遺伝子１のヒトＣＭＶプロモーター／エンハンサーを、用いてもよい。例えば、Ｐａｔｔｅｒｓｏｎら（１９９４年）、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．４０：６９１−９８を参照されたい。ＳＶ４０ウイルスゲノム由来のＤＮＡ配列、例えば、ＳＶ４０の起点、初期及び後期プロモーター、エンハンサー、スプライスならびにポリアデニル化部位を、哺乳動物宿主細胞において構造遺伝子配列を発現させるための他の遺伝要素を提供するために用いることが可能である。ウイルスの初期及び後期プロモーターは、双方がウイルスゲノムから断片として容易に入手されるため、特に有用であり、ウイルスの複製起点を含有することが可能である（Ｆｉｅｒｓら（１９７８年）、Ｎａｔｕｒｅ ２７３：１１３；Ｋａｕｆｍａｎ（１９９０年）、Ｍｅｔｈ．ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８５：４８７−５１１）。ＳＶ４０ウイルスの複製起点部位に位置する、ＨｉｎｄＩＩＩ部位からＢｇｌＩ部位にかけて広がるおよそ２５０ｂｐ配列が含まれるならば、より小さな、またはより大きなＳＶ４０断片を用いることも可能である。
【００６６】
加えて、適切な天然または異種シグナルペプチド（リーダー配列）をコードする配列を、組換えポリペプチドの細胞外分泌を促進するために、発現ベクターに組み込むことが可能である。シグナルペプチドは、細胞から分泌されるときに、組換えポリペプチドから切断されるであろう。シグナルぺプチドまたはリーダーの選択は、組換えポリペプチドが生産されることになる宿主細胞の種類に依存する。哺乳動物宿主細胞において機能的であるシグナルペプチドの例としては、米国特許第４，９６５，１９５に記載されるインターロイキン−７（ＩＬ−７）のシグナル配列、Ｃｏｓｍａｎら（１９８４年）、Ｎａｔｕｒｅ ３１２：７６８に記載されるインターロイキン−２受容体のシグナル配列；欧州特許第３６７，５６６に記載されるインターロイキン−４受容体のシグナルペプチド、米国特許第４，９６８，６０７に記載されるＩ型インターロイキン−１受容体のシグナルペプチド；及び、欧州特許第０ ４６０ ８４６に記載されるＩＩ型インターロイキン−１受容体のシグナルペプチドが挙げられる。
【００６７】
ＤＮＡを哺乳動物細胞に導入するための確立された方法について、記載されている。Ｋａｕｆｍａｎ，Ｒ．Ｊ．，Ｌａｒｇｅ Ｓｃａｌｅ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ，１９９０年、１５〜６９頁。陽イオン性脂質試薬であるＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（商標）、ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（商標）−２０００またはＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（商標）−ＰＬＵＳ（インビトロジェン社から購入可能）などの、市販の試薬を用いた追加のプロトコールを、細胞にトランスフェクトするのに用いることが可能である。ＦＥＬＧＮＥＲら（１９８７年）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８４：７４１３−７４１７。加えて、電気穿孔または核酸でコーティングされた微粒子銃を、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版、第１〜３巻、コールドスプリングハーバー研究所プレス（１９８９年）、及び、Ｆｉｔｚｐａｔｒｉｃｋ−ＭｃＥｌｌｉｇｏｔｔ（１９９２年）、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ニューヨーク州）１０（９）：１０３６−４０におけるものなどの手順を用いて哺乳動物細胞にトランスフェクトするのに、用いることが可能である。安定な形質転換体の選択を、例えば細胞毒性薬物耐性などの、当該技術分野において公知の方法を用いて、行うことが可能である。概して、安定な形質転換体は、宿主細胞中に、染色体に取り込まれた導入ポリヌクレオチドを有する。Ｋａｕｆｍａｎら（（１９９０年）、Ｍｅｔｈ．ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １８５：４８７−５１１）は、ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）耐性などのいくつかの選択スキームについて記載している。ＤＨＦＲ選択に適切な宿主株は、ＤＨＦＲを欠損するＣＨＯ ＤＸ−Ｂ１１株であることが可能である。Ｕｒｌａｕｂ及びＣｈａｓｉｎ（１９８０年）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７７：４２１６−４２２０。ＤＨＦＲのｃＤＮＡを発現しているプラスミドを、ＤＸ−Ｂ１１株に導入することが可能であり、そして、プラスミドを含有する細胞のみが、適切な選択培地において増殖可能である。発現ベクター内に取り込まれることが可能な選択マーカーの他の例としては、Ｇ４１８及びハイグロマイシンＢなどの、抗生物質に対する耐性を授与するｃＤＮＡが挙げられる。ベクターを保有する細胞を、これらの化合物に対する耐性に基づいて選択することが可能である。
【００６８】
哺乳動物発現ベクター由来の異種遺伝子の発現を改良することが示されているさらなる制御配列としては、ＣＨＯ細胞由来の発現増大配列エレメント（ＥＡＳＥ）（Ｍｏｒｒｉｓら、Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、５２９〜５３４頁（１９９７年）；米国特許第６，３１２，９５１ Ｂ１、第６，０２７，９１５及び第６，３０９，８４１ Ｂ１）などのエレメント、ならびにトリパータイトリーダー（ＴＰＬ）及びアデノウイルス２由来のＶＡ遺伝子のＲＮＡ（Ｇｉｎｇｅｒａｓら（１９８２年）、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５７：１３４７５−１３４９１）が挙げられる。ウイルスを起源とする内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）配列は、ジシストロン性（ｄｉｃｉｓｔｒｏｎｉｃ）ｍＲＮＡが効率的に翻訳されることを可能にする（Ｏｈ及びＳａｒｎｏｗ（１９９３年）、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ３：２９５−３００；Ｒａｍｅｓｈら（１９９６年）、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２４：２６９７−２７００）。選択マーカー（例えば、ＤＨＦＲ）遺伝子が後に続く、ジシストロン性ｍＲＮＡの一部としての、異種ｃＤＮＡの発現は、宿主細胞のトランスフェクション効率及び異種ｃＤＮＡの発現を改良することが示されている（Ｋａｕｆｍａｎら（１９９０年）、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８５：４８７−５１１）。ジシストロン性ｍＲＮＡを使用する典型的な発現ベクターは、Ｍｏｓｓｅｒら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ２２：１５０−１６１（１９９７年）によって記載されているｐＴＲ−ＤＣ／ＧＦＰ、及び、Ｍｏｒｒｉｓら、Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、５２９〜５３４頁に記載されているｐ２Ａ５Ｉである。
【００６９】
有用な高発現ベクターであるｐＣＡＶＮＯＴについては、Ｍｏｓｌｅｙら（（１９８９年）、Ｃｅｌｌ ５９：３３５−３４８）によって記載されている。哺乳動物宿主細胞において用いるための他の発現ベクターを、Ｏｋａｙａｍａ及びＢｅｒｇ（（１９８３年）、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．３：２８０）によって開示されているように、構築することが可能である。Ｃ１２７マウス乳房上皮細胞において哺乳動物ｃＤＮＡを安定で高レベルに発現させるための有用な系は、Ｃｏｓｍａｎら（（１９８６年）、Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２３：９３５）によって記載されるように、実質的には構築されることが可能である。Ｃｏｓｍａｎら（（１９８４年）、Ｎａｔｕｒｅ ３１２：７６８）によって記載された、有用な高発現ベクターであるＰＭＬＳＶ Ｎ１／Ｎ４は、ＡＴＣＣ ３９８９０として寄託されている。さらなる有用な哺乳動物発現ベクターが、欧州特許第−Ａ−０ ３６７ ５６６及びＷＯ ０１／２７７２９９ Ａ１に記載されている。該ベクターは、レトロウイルス由来であることが可能である。天然のシグナル配列の代わりに、以下の配列のうちの一つなどの、異種シグナル配列を付加することが、可能である：米国特許第４，９６５，１９５に記載されたＩＬ−７のシグナル配列；Ｃｏｓｍａｎら（Ｎａｔｕｒｅ ３１２：７６８（１９８４年））に記載されたＩＬ−２受容体のシグナル配列；欧州特許第０ ３６７ ５６６に記載されたＩＬ−４のシグナルペプチド；米国特許第４，９６８，６０７に記載されたＩ型ＩＬ−１受容体のシグナルぺプチド；及び、欧州特許第０ ４６０ ８４６に記載されたＩＩ型ＩＬ−１受容体のシグナル配列。
【００７０】
ポリペプチドは、真核細胞において組換えによって生産されることが可能であり、そして好ましくは、細胞培養にて増殖するように適応された宿主細胞によって分泌される。所望により、本発明において用いるための宿主細胞は、好ましくは哺乳動物細胞である。該細胞はまた、目的の遺伝子を発現するように遺伝子操作されることが可能であり、細胞培養にて増殖するように適応された哺乳動物の生産細胞であることが可能であり、及び／または、同種の細胞株であることが可能である。業界で一般的に用いられるこのような細胞の例は、ＶＥＲＯ、ＢＨＫ、ＨｅＬａ、ＣＶ１（Ｃｏｓを含む）、ＭＤＣＫ、２９３、３Ｔ３、骨髄腫細胞株（例えば、ＮＳＯ、ＮＳ１）、ＰＣ１２、ＷＩ３８細胞、及びチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞であって、これらは、いくつかの複合組換えポリペプチド、例えばサイトカイン、凝固因子及び抗体の生産に、広く用いられている（Ｂｒａｓｅｌら（１９９６年）、Ｂｌｏｏｄ ８８：２００４−２０１２；Ｋａｕｆｍａｎら（１９８８年）、Ｊ．Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２６３：６３５２−６３６２；ＭｃＫｉｎｎｏｎら（１９９１年）、Ｊ Ｍｏｌ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ ６：２３１−２３９；Ｗｏｏｄら（１９９０年）、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４５：３０１１−３０１６）。ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）欠損変異細胞株（Ｕｒｌａｕｂら（１９８０年）、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ７７：４２１６−４２２０、参照によって本明細書に援用される）である、ＤＸＢ１１及びＤＧ−４４は、効率的なＤＨＦＲ選択及び増幅遺伝子発現系が、これらの細胞において高レベルの組換えポリペプチドの発現を可能にするため、望ましいＣＨＯ宿主細胞株である（Ｋａｕｆｍａｎ Ｒ．Ｊ．（１９９０年）、Ｍｅｔｈ Ｅｎｚｙｍｏｌ １８５：５３７−５６６、参照によって本明細書に援用される）。加えて、これらの細胞は、接着培養または懸濁培養として操作しやすく、そして比較的良好な遺伝子安定性を示しやすい。ＣＨＯ細胞、及び該細胞において発現する組換えポリペプチドは、詳細に特徴付けられ、そして、臨床用市販製造における使用を、規制当局によって認められている。本発明の方法を、抗体を生産するハイブリドーマ細胞株を用いて、実行することも可能である。ハイブリドーマ株の作製方法は、当該技術分野において周知である。例えば、Ｂｅｒｚｏｆｓｋｙら、Ｐａｕｌ編集、Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、第２版、３１５〜３５６頁のうちの３４７〜３５０頁、Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ Ｌｔｄ．、ニューヨーク州（１９８９年）を参照されたい。上記株由来の細胞株もまた、本発明を実行するのに適している。
【００７１】
本発明において、哺乳動物宿主細胞は、抗体または組換えポリペプチドであることが可能である、目的のポリペプチドの生産を促進する条件下で、培養される。基本の細胞培養培地処方物は、当該技術分野において周知である。これらの基本の細胞培養培地処方物に、当業者は、アミノ酸、塩類、糖類、ビタミン、ホルモン、成長因子、バッファー、抗生物質、脂質、微量元素等などの成分を、培養する宿主細胞の要求性に応じて、加えるであろう。培養培地は、血清及び／またはタンパク質を含有しても、または含有しなくてもよい。血清非含有及び／または合成（ｄｅｆｉｎｅｄ）培養培地を含む、種々の組織培養培地が、細胞培養用に市販されている。組織培養培地は、本発明の目的上、ｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞培養において、動物細胞及び好ましくは哺乳動物細胞の増殖に適した培地として、定義される。典型的には、組織培養培地は、バッファー、塩類、エネルギー源、アミノ酸、ビタミン及び微量必須元素を含有する。適切な培養真核細胞の増殖を補助することが可能な任意の培地を、用いることが可能であり；本発明は、培養真核細胞、特に哺乳動物細胞に幅広く応用可能であり、そして培地の選択は、本発明には重大ではない。本発明における使用に適した組織培養培地は、例えばＡＴＣＣ（マナサス、バージニア州）から市販されている。例えば、以下の培地の任意の一つまたは組み合わせを、用いることが可能である：アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションまたはＪＲＨ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社、ならびに他の業者から入手可能なものの中でも特に、ＲＰＭＩ−１６４０培地、ＲＰＭＩ−１６４１培地、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、最小必須培地イーグル、Ｆ−１２Ｋ培地、ハムＦ１２培地、イスコフ改変ダルベッコ培地、マッコイ５Ａ培地、ライボビッツＬ−１５培地、及び、ＥＸ−ＣＥＬＬ（商標）３００シリーズ（ＪＲＨ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社、レネクサ、カンザス州、米国から入手可能）などの血清非含有培地。血清非含有及び／またはペプトン非含有の合成培地を用いる場合、培地は、通常、アミノ酸及び微量元素が非常に豊富である。例えば、Ｍａｔｈｅｒらによる米国特許第５，１２２，４６９、及びＫｅｅｎらによる第５，６３３，１６２を参照されたい。
【００７２】
本発明の方法及び組成物において、細胞は、血清非含有、タンパク質非含有、成長因子非含有及び／またはペプトン非含有培地にて、増殖可能である。培地に適用される「血清非含有」の語は、胎児ウシ血清などの血清を含有しない、任意の哺乳動物細胞培養培地を含む。培地に適用される「インスリン非含有」の語は、外因性インスリンを添加されていない任意の培地を含む。外因性とは、この文脈においては、細胞の培養自体によって生産されるもの以外のことを意味する。培地に適用される「ＩＧＦ−１非含有」の語は、外因性インスリン様成長因子−１（ＩＧＦ−１）またはアナログ（例えば、ＬｏｎｇＲ３、［Ａｌａ３１］、またはＧｒｏＰｅｐ Ｌｔｄ．、セバートン、南オーストラリアから入手可能な［Ｌｅｕ２４］［Ａｌａ３１］ＩｇＦ−１アナログなど）を添加されていない任意の培地を含む。培地に適用される「成長因子非含有」の語は、外因性成長因子（例えば、インスリン、ＩＧＦ−１）を添加されていない任意の培地を含む。培地に適用される「タンパク質非含有」の語は、例えばトランスフェリンならびにタンパク質成長因子であるＩＧＦ−１及びインスリンなどの、外因性に添加されたタンパク質を含有しない培地を含む。タンパク質非含有培地は、ペプトンを有しても、または有しなくてもよい。培地に適用される「ペプトン非含有」の語は、例えば動物及び／または植物のタンパク質加水分解物などの、外因性タンパク質の加水分解物が添加されていない任意の培地を含む。培地からペプトンを除くことは、ロット間のばらつきを減じ、そしてろ過などの処理を強化するという利点がある。化学合成培地は、すべての成分が合成され、そして純粋な原料、好ましくは非動物原料から得られる培地である。
【００７３】
当業者はまた、特定の培養宿主細胞における細胞増殖、細胞生存性及び／または組換えポリペプチド生産を最大限にするように開発されている、多くの個別化された（ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌｉｚｅｄ）た培地処方物の一つを用いることを、選択してもよい。本発明にしたがった方法を、市販の細胞培養培地と、または特定の細胞株で用いるために個々に処方されている細胞培養培地と組み合わせて、用いてもよい。例えば、ポリペプチドの生産増加を補助することが可能な富栄養培地は、例えば１：１、１：２、１：３、１：４、１：５、１：６、１：７、１：８もしくはさらに１：１５までの比率で、またはそれよりも高比率で配合された、例えばＤＭＥＭとハムＦ１２培地などの、２またはそれより多くの市販の培地を混合したものを含んでもよい。あるいは、または加えて、培地は、アミノ酸またはペプトンなどの栄養素を添加することによって、富栄養であることが可能であり、かつ／あるいは、培地（または、以下に記すものを除くその成分のほとんど）を、その通常の推奨される濃度よりも高濃度で、例えば２Ｘ、３Ｘ、４Ｘ、５Ｘ、６Ｘ、７Ｘ、８Ｘまたはさらにそれよりも高濃度で、用いることが可能である。本明細書では、「１Ｘ」は標準濃度を意味し、例えば、「２Ｘ」は標準濃度の２倍を意味する。いずれのこれらの実施態様においても、塩類などの浸透圧に実質的に影響を及ぼすことが可能な培地成分を、培地の浸透圧が許容範囲外に外れるような濃度に増加させることはできない。したがって、培地は、例えば、１Ｘのみで存在することが可能な塩類を除くすべての成分について、８Ｘであってもよい。富栄養培地は、血清非含有及び／またはタンパク質非含有であってもよい。さらに、培地は、例えばビタミン、アミノ酸及び代謝前駆体などの、枯渇してくる可能性のある培地成分を補給するために、培養が維持されている間、定期的に補充されてもよい。当該技術分野において公知のように、異なる培地及び温度は、異なる細胞株にいくらか異なる影響を有し、そして同じ培地及び温度が、すべての細胞株に適するわけではない。
【００７４】
哺乳動物細胞の適切な培養条件は、当該技術分野において公知である。例えば、Ａｎｉｍａｌ ｃｅｌｌ ｃｕｌｔｕｒｅ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｄ．Ｒｉｃｋｗｏｏｄ編集、オックスフォード大学プレス、ニューヨーク州（１９９２年）を参照されたい。哺乳動物細胞は、懸濁液中で、または固体基質に接着させた状態で、培養されてもよい。さらに、哺乳動物細胞は、例えば、流動床バイオリアクター、ホローファイバーバイオリアクター、ローラーボトル、振盪フラスコまたは撹拌槽バイオリアクターなどにおいて、マイクロキャリアの有無にかかわらず、培養されてもよく、そして、回分、半回分、連続、半連続または灌流の方法で操作されてもよい。
【００７５】
本発明の方法を、単一期と複数期双方の培養過程において組換えポリペプチド生産を改良するのに用いることが可能である。単一期の過程では、細胞を培養環境中に接種し、そして開示された方法を、単一の生産期において用いる。複数段階の工程では、細胞を、２またはそれより多くの異なった期に培養する。例えば、細胞を、まず増殖期に、細胞増殖及び生存性を最大限にする環境条件下で培養させてもよく、次いで、ポリペプチド生産を最大限にする条件下の生産期に移行させてもよい。増殖期及び生産期は、１またはそれより多くの移行期によって先行されるか、または分けられてもよい。複数期の過程において、本発明にしたがった方法は、少なくとも生産期において用いられる。増殖期は、生産期よりも高温にて起こってもよい。例えば、増殖期は、約３５℃〜約３８℃の第一温度にて起こってもよく、そして生産期は、約２９℃〜約３６℃、所望により約３０℃〜約３３℃の第二温度にて起こってもよい。例えば芳香族カルボン酸、アセトアミド及び／またはヒドロキサム酸などの、ポリペプチド生産の化学誘導剤（ならびに、所望により他の誘導剤）を、温度移行と同時、移行前及び／または移行後に、添加してもよい。誘導剤を温度移行後に添加する場合、温度移行後１時間〜５日、所望により１〜２日に、添加することが可能である。
【００７６】
本発明の方法を用いて誘導後に、次いで、その結果として得られた発現ポリペプチドを回収することが可能である。加えて、該ポリペプチドを、このような培養物または成分から（例えば、培養培地または細胞抽出物または体液から）、公知の過程を用いて精製または部分精製することが可能である。「部分精製される」とは、ある分画手順または手順を実施したが、しかし所望のポリペプチドよりも多くのポリペプチド種（少なくとも１０％）が存在することを、意味する。「精製される」とは、ポリペプチドが本質的に均一であること、すなわち混入しているポリペプチドの存在が１％未満であることを、意味する。分画手順は、これに限定されないが、１またはそれより多くのろ過、遠心分離、沈澱、相分離、アフィニティ精製、ゲルろ過、イオン交換クロマトグラフィ、疎水性相互作用クロマトグラフィ（ＨＩＣ；フェニルエーテル、ブチルエーテルまたはプロピルエーテルなどの樹脂を用いる）、ＨＰＬＣ、または上記のある組み合わせの、１またはそれより多くの工程を含むことが可能である。
【００７７】
例えば、ポリペプチドの精製は、ポリペプチドと結合するであろう剤を含有するアフィニティカラム；コンカナバリンＡ−アガロース、ヘパリン−ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ（登録商標）（東洋曹達工業株式会社、日本）またはチバクローム・ブルー３ＧＡ ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（商標登録）（ファルマシア・ファイン・ケミカルズ・Ｉｎｃ．、ニューヨーク州）などのアフィニティ樹脂での、１またはそれより多くのカラム工程；溶出を含む１またはそれより多くの工程；及び／または、イムノアフィニティクロマトグラフィを含む。ポリペプチドを、精製を容易にする形態で発現させることが可能である。例えば、これを、マルトース結合ポリペプチド（ＭＢＰ）、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）またはチオレドキシン（ＴＲＸ）との融合ポリペプチドなどの、融合ポリペプチドとして、発現させてもよい。このような融合ポリペプチドを発現させ、そして精製するためのキットが、ニューイングランド・バイオラボ社（ビバリー、マサチューセッツ州）、ファルマシア社（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ニュージャージー州）及びインビトロジェン社から、それぞれ市販されている。ポリペプチドを、エピトープで標識し、続いてそのエピトープに対する特異的な抗体を用いることによって精製することが可能である。一つのこのようなエピトープ（ＦＬＡＧ（登録商標））が、コダック社（ニューヘイブン、コネチカット州）から市販されている。発現させたポリペプチドをアフィニティ精製するために、組換えポリペプチドに対するモノクローナル抗体などの、ポリペプチド結合タンパク質を含むアフィニティカラムを利用することもまた可能である。他の種類のアフィニティ精製工程は、プロテインＡまたはプロテインＧカラムであることが可能であり、その親和剤は、Ｆｃドメインを含有するタンパク質と結合する。ポリペプチドを、例えば、高塩濃度の溶出バッファーに入れ、次いでより低塩濃度の使用バッファー中に透析するか、あるいは利用するアフィニティマトリックスに依存してｐＨまたは他の成分を変えることによるなどの、慣用の技術を用いて、アフィニティカラムから除去することが可能であり、あるいは、アフィニティ部分の自然発生基質を用いて、競合的に除去することが可能である。
【００７８】
所望の最終純度は、ポリペプチドの使用目的によって決まる。例えば、ポリペプチドをｉｎ ｖｉｖｏで投与する場合には、比較的高純度が望ましい。このような場合、ポリペプチドは、他のポリペプチドに相当するポリペプチドバンドが、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）による解析において検出されないほど、精製される。関連分野の当業者は、該ポリペプチドに相当する複数のバンドが、差次的なグリコシル化、差次的な翻訳後のプロセシング等によって、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより可視化されることが可能なことを、認識するであろう。所望により、本発明のポリペプチドは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる解析において単一のポリペプチドバンドによって示されるように、実質的に均一に精製されていてもよい。該ポリペプチドバンドは、銀染色、クマシーブルー染色、または（該ポリペプチドが放射性標識されているならば）オートラジオグラフィによって可視化されることが可能である。
【００７９】
本発明はまた、該ポリペプチドをさらに処方することも、所望により包含する。「処方すること」の語は、該ポリペプチドが、バッファー交換され、無菌化され、バルク包装され、かつ／または最終的な使用者のために包装されることが可能なことを、意味する。本発明の目的上、「無菌バルク形態」の語は、処方物に、微生物混入がないかまたは本質的になく（食品及び／または薬物の目的では、ある程度は許容可能である）、そして処方物が決められた組成及び濃度であることを、意味する。「無菌の単位用量形態」の語は、顧客及び／もしくは患者への投与または消費に応じた形態を、意味する。このような組成物は、生理学的に許容可能な希釈剤、キャリアーまたは賦形剤などの他の成分と組み合わせて、有効量のポリペプチドを含むことが可能である。「生理学的に許容可能な」の語は、活性成分の生物学的活性の有効性を妨げない非毒性物質を、意味する。
【００８０】
投与に適した処方物は、抗酸化剤、バッファー、静菌剤、及びレシピエントの血液と等張の処方物を与える溶質を含有してもよい、水溶性及び非水溶性無菌注射用溶液；ならびに、懸濁化剤または増粘剤を含んでもよい、水溶性及び非水溶性の無菌懸濁液を、含む。該ポリペプチドを、医薬的に有用な組成物を調製するのに用いられる公知の方法にしたがって、処方することが可能である。これらを、唯一の活性物質として、または所与の適応に適した他の公知の活性物質とともに、医薬的に許容可能な希釈剤（例えば、生理食塩液、トリス−ＨＣｌ、酢酸及びリン酸緩衝溶液）、保存剤（例えば、チメロサール、ベンジルアルコール、パラベン）、乳化剤、可溶化剤、アジュバント及び／またはキャリアーと組み合わせて混合することが可能である。医薬組成物に適した処方物は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第１６版、１９８０年、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ、イーストン、ペンシルバニア州に記載されたものを含む。加えて、このような組成物は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、金属イオンと錯体を形成するか、あるいは、ポリ酢酸、ポリグリコール酸、ヒドロゲル、デキストラン等などの高分子化合物に取り込まれるか、あるいは、リポソーム、マイクロエマルジョン、ミセル、単層もしくは多重層ベシクル、赤血球ゴーストまたはスフェロブラストに取り込まれることが、可能である。リポソーム処方物に適した脂質としては、非限定的に、モノグリセリド、ジグリセリド、スルファチド、リゾレシチン、リン脂質、サポニン、胆汁酸等が挙げられる。このようなリポソーム処方物の調製は、例えば、米国特許第４，２３５，８７１、第４，５０１，７２８、第４，８３７，０２８及び第４，７３７，３２３に開示されているように、当該技術分野における技能水準内にある。このような組成物は、物理的状態、溶解性、安定性、ｉｎ ｖｉｖｏ放出速度、及びｉｎ ｖｉｖｏクリアランス速度に影響を与えるであろうし、したがって、キャリアーの特性が選択された投与経路によって決められるように、目的とする出願に応じて選択される。使用に適した徐放の形態としては、これに限定されないが、徐々に溶解する生体適合性ポリマー中に封入され（米国特許第６，０３６，９７８に記載されているアルギン酸微粒子など）、このようなポリマー（局所に適用されるヒドロゲルを含む）と混合され、かつ／または生体適合性の半透性移植片中に入れられた、ポリペプチドが挙げられる。
【００８１】
本発明について記載したことから、以下の実施例を、例証として、そして非限定的に、提供する。
（実施例１）
０．５ｍＭヒドロ桂皮酸を用いた結果
米国特許第６，０２７，９１５に記載されるようなＥＡＳＥ／ＣＭＶプロモーター系の制御下に、蛍光レポーター遺伝子ＤｓＲｅｄ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社、パロアルト、カリフォルニア州）をコードする遺伝子を配置する発現ベクターを、ＣＨＯ細胞にトランスフェクトした。細胞プールを、発現ベクターの存在について−ＧＨＴ培地中で選択し、次いで、９６ウェル形式にて血清非含有培地中に蒔いた。ヒドロ桂皮酸を、０．５ｍＭにて試験ウェルに加え、温度を３７℃から３１℃に減じ、そして低下させた温度にて培養を６日間続けた。ＤｓＲｅｄ蛍光を、Ｗａｌｌａｃ Ｖｉｃｔｏｒ２マルチラベル・マイクロプレートリーダー（パーキンエルマー・ライフサイエンスイズ社、ボストン、マサチューセッツ州）においてアッセイした。合計３実験において、１生細胞あたりのＤｓＲｅｄ発現が、対照と比較して平均６０％増加した。
【００８２】
次いで、この化合物の誘導能を、異なる組換えタンパク質において、異なる形式にて試験した。この場合、細胞は、ＩＩ型ＩＬ１受容体の可溶型（米国特許第６，５２１，７４０を参照されたく、該出願は、参照により本明細書に援用される）を発現するＣＨＯ細胞株であった。細胞を、振盪フラスコにおいて血清非含有培地中で増殖させ、ヒドロ桂皮酸を０．５ｍＭの濃度となるように加え、そしてインキュベーションを３１℃にて９〜１０日間続けた。合計５実験において、ＩＬ１ＲＩＩ発現の平均増加は、対照と比較して２２％であった。
【００８３】
試験した別の細胞株は、ＴＮＦ受容体の可溶型であるＴＮＦＲ：Ｆｃ（米国特許第５，６０５，６９０、該出願は、参照により本明細書に援用される）を発現するＣＨＯ細胞であった。細胞を、血清含有培地中で３７℃にて増殖させた後、細胞を、血清非含有培地と０．５ｍＭヒドロ桂皮酸を含有する振盪フラスコに移し替え、そしてこれらの誘導条件下で、低下させた温度にて、さらに７日間インキュベートした。インキュベーション期間終了時に、ヒドロ桂皮酸含有培地中で増殖させた細胞は、対照細胞と比較して、２０％のＴＮＦＲ：Ｆｃ発現増加を示した。
【００８４】
加えて、ＩＬ４受容体に対する抗体をコードする発現ベクターをトランスフェクトしたＣＨＯ細胞プールについて、試験した（米国特許第５，７１７，０７２を参照されたく、該出願は、参照により本明細書に援用される）。増幅させていないプールを、９６ウェルプレートにおける血清非含有培地に蒔き、そして誘導剤とともに３７℃にて４日間インキュベートした。合計３つの異なる実験において、ヒドロ桂皮酸に曝露されたプールは、対照と比較して、平均５％の抗体発現増加を示した。
【００８５】
（実施例２）
０．５ｍＭ ３−（４−メチルフェニル）プロピオン酸を用いた結果
ＣＨＯ細胞プールに、先の実施例１にて上述の蛍光レポーター遺伝子ＤｓＲｅｄをコードする遺伝子を配置する発現ベクターをトランスフェクトし、０．５ｍＭ ３−（４−メチルフェニル）プロピオン酸による誘導についても、９６ウェル形式にて試験した。プールを、３１℃にて６日間インキュベートした。少なくとも３つの異なる実験において、３−（４−メチルフェニル）プロピオン酸とともにインキュベートされたプールでは、１生細胞あたりのＤｓＲｅｄ発現が、対照と比較して平均７０％増加した。
【００８６】
次いで、この化合物の誘導能を、ＩＩ型ＩＬ１受容体の可溶型を発現するＣＨＯ細胞株を用いて、振盪フラスコの形式にて確認した。細胞を、振盪フラスコにおいて血清非含有培地中で増殖させ、３−（４−メチルフェニル）プロピオン酸を０．５ｍＭの濃度となるように加え、そしてインキュベーションを３１℃にて９〜１０日間続けた。合計２実験において、対照と比較したＩＬ１ＲＩＩ発現の平均増加は、１５％であった。
【００８７】
（実施例３）
０．５ｍＭ ４−フェニル酪酸を用いた結果
ＣＨＯ細胞プールに、先の実施例１にて上述の蛍光レポーター遺伝子ＤｓＲｅｄをコードする遺伝子を配置する発現ベクターをトランスフェクトし、０．５ｍＭ ４−フェニル酪酸による誘導についても、９６ウェル形式にて試験した。プールを、３１℃にて６日間インキュベートした。３つの異なる実験において、４−フェニル酪酸とともにインキュベートされたプールでは、１生細胞あたりのＤｓＲｅｄ発現が、対照と比較して平均６０％増加した。
【００８８】
次いで、この化合物の誘導能を、ＩＩ型ＩＬ１受容体の可溶型を発現するＣＨＯ細胞株を用いて、振盪フラスコの形式にて確認した。細胞を、振盪フラスコにおいて血清非含有培地中で増殖させ、４−フェニル酪酸を０．５ｍＭの濃度となるように加え、そしてインキュベーションを３１℃にて９〜１０日間続けた。４−フェニル酪酸の存在下で増殖させた細胞株では、ＩＬ１ＲＩＩ発現が対照と比較して２１％増加した。
【００８９】
（実施例４）
０．５ｍＭ ４−（４−アミノフェニル）酪酸を用いた結果
ＣＨＯ細胞プールに、先の実施例１にて上述の蛍光レポーター遺伝子ＤｓＲｅｄをコードする遺伝子を配置する発現ベクターをトランスフェクトし、０．５ｍＭ ４−（４−アミノフェニル）酪酸による誘導についても、９６ウェル形式にて試験した。プールを、３１℃にて６日間インキュベートした。３つの異なる実験において、４−（４−アミノフェニル）酪酸とともにインキュベートされたプールでは、１生細胞あたりのＤｓＲｅｄ発現が、対照と比較して平均７０％増加した。
【００９０】
次いで、この化合物の誘導能を、ＩＩ型ＩＬ１受容体の可溶型を発現するＣＨＯ細胞株を用いて、振盪フラスコの形式にて確認した。細胞を、振盪フラスコにおいて血清非含有培地中で増殖させ、４−（４−アミノフェニル）酪酸を０．５ｍＭの濃度となるように加え、そしてインキュベーションを３１℃にて９〜１０日間続けた。３実験において、４−（４−アミノフェニル）酪酸の存在下で増殖させた細胞株では、ＩＬ１ＲＩＩ発現が対照と比較して平均２２％増加した。
【００９１】
（実施例５）
０．５ｍＭ ５−フェニル吉草酸を用いた結果
ＣＨＯ細胞プールに、先の実施例１にて上述の蛍光レポーター遺伝子ＤｓＲｅｄをコードする遺伝子を配置する発現ベクターをトランスフェクトし、０．５ｍＭ ５−フェニル吉草酸による誘導についても、９６ウェル形式にて試験した。プールを、３１℃にて６日間インキュベートした。３つの異なる実験において、５−フェニル吉草酸とともにインキュベートされたプールでは、１生細胞あたりのＤｓＲｅｄ発現が、対照と比較して平均４０％増加した。
【００９２】
次いで、この化合物の誘導能を、ＩＩ型ＩＬ１受容体の可溶型を発現するＣＨＯ細胞株を用いて、振盪フラスコの形式にて確認した。細胞を、振盪フラスコにおいて血清非含有培地中で増殖させ、５−フェニル吉草酸を０．５ｍＭの濃度となるように加え、そしてインキュベーションを３１℃にて９〜１０日間続けた。５−フェニル吉草酸の存在下で増殖させた細胞株では、ＩＬ１ＲＩＩ発現が対照と比較して４４％増加した。
【００９３】
試験した別の細胞株は、先の実施例１にて上述のＴＮＦＲ：Ｆｃ（エタナーセプト）を発現するＣＨＯ細胞であった。細胞を、血清含有培地中で３７℃にて増殖させた後、細胞を、血清非含有培地と０．５ｍＭ ５−フェニル吉草酸を含有する振盪フラスコに移し替え、そしてこれらの誘導条件下で、低下させた温度にて、さらに７日間インキュベートした。インキュベーション期間終了時に、５−フェニル吉草酸含有培地中で増殖させた細胞は、対照細胞と比較して、３３％のＴＮＦＲ：Ｆｃ発現増加を示した。
【００９４】
加えて、ＩＬ４受容体に対する抗体をコードする発現ベクターをトランスフェクトしたＣＨＯ細胞プールについて、試験した。増幅させていないプールを、９６ウェルプレートに蒔き、そして誘導剤とともに３７℃にて４日間インキュベートした。合計２つの異なる実験において、５−フェニル吉草酸に曝露されたプールは、対照と比較して、平均４０％の抗体発現増加を示した。この増加のほとんどは、第３日には増加がなかったことから、培養最終日に起こった。
【００９５】
（実施例６）
１．０ｍＭ Ｎ−ブチルアセトアミド
ＣＨＯ細胞プールに、先の実施例１にて上述の蛍光レポーター遺伝子ＤｓＲｅｄをコードする遺伝子を配置する発現ベクターをトランスフェクトし、１．０ｍＭ Ｎ−ブチルアセトアミドによる誘導についても、９６ウェル形式にて試験した。プールを、３１℃にて６日間インキュベートした。２つの異なる実験において、Ｎ−ブチルアセトアミドとともにインキュベートされたプールでは、１生細胞あたりのＤｓＲｅｄ発現が、対照と比較して平均７７％増加した。
【００９６】
（実施例７）
１０／２０μＭヘキサノヒドロキサム酸（ＨＨＡ）
ＣＨＯ細胞プールに、先の実施例１にて上述の蛍光レポーター遺伝子ＤｓＲｅｄをコードする遺伝子を配置する発現ベクターをトランスフェクトし、１０μＭヘキサノヒドロキサム酸（ＨＨＡ）による誘導についても、９６ウェル形式にて試験した。プールを、３１℃にて６日間インキュベートした。ＨＨＡとともにインキュベートされたプールでは、ＤｓＲｅｄ発現が、対照と比較して４８％増加した。
【００９７】
次いで、この化合物の誘導能を、ＩＩ型ＩＬ１受容体の可溶型を発現するＣＨＯ細胞株を用いて、振盪フラスコの形式にて確認した。細胞を、振盪フラスコにおいて血清非含有培地中で増殖させ、ＨＨＡを１０μＭの濃度となるように加え、そしてインキュベーションを３１℃にて９日間続けた。１０μＭ ＨＨＡの存在下で増殖させた細胞株では、ＩＬ１ＲＩＩ発現が対照と比較して１９％増加した。
【００９８】
試験した別の細胞株は、先の実施例１にて上述のＴＮＦＲ：Ｆｃ（エタナーセプト）を発現するＣＨＯ細胞であった。細胞を、血清含有培地中で３７℃にて増殖させた後、細胞を、血清非含有培地と、１０μＭまたは２０μＭにて加えられたＨＨＡを含有する振盪フラスコに移し替え、そしてこれらの誘導条件下で、低下させた温度にて、さらに７日間インキュベートした。インキュベーション期間終了時に、１０μＭ ＨＨＡ含有培地中で増殖させた細胞は、対照細胞と比較して１９％のＴＮＦＲ：Ｆｃ発現増加を示し、２０μＭ中で増殖させた細胞は、対照細胞と比較して１１％のＴＮＦＲ：Ｆｃ発現増加を示した。
【００９９】
加えて、ＩＬ４受容体に対する抗体をコードする発現ベクターをトランスフェクトしたＣＨＯ細胞プールについて、試験した。血清非含有培地中の増幅させていないプールを、９６ウェルプレートに蒔き、そして誘導剤とともに３７℃にて４日間インキュベートした。２つの異なる実験において、ＨＨＡに曝露されたプールでは、対照と比較して、抗体発現が有意に増加しなかった。
【０１００】
（実施例８）
１０μＭ ＨＨＡ＋１ｍＭ ＨＭＢＡ
これらの実験では、２つの異なる誘導剤の組み合わせを用いた。以下の結果から分かるように、異なる種類の誘導剤を組み合わせることで、誘導に関して相加的増加を超えた増加をもたらすことが可能である。
【０１０１】
ＣＨＯ細胞プールに、先の実施例１にて上述の蛍光レポーター遺伝子ＤｓＲｅｄをコードする遺伝子を配置する発現ベクターをトランスフェクトし、１０μＭ ＨＨＡと１ｍＭ ＨＭＢＡによる誘導についても、９６ウェル形式にて試験した。プールを、３１℃にて６日間インキュベートした。ＨＭＢＡのみとともにインキュベートされたプールは、対照と比較して２０％のＤｓＲｅｄ発現増加を示したが、ＨＨＡとＨＭＢＡとの組み合わせとともにインキュベートされたプールは、９８％の増加を示した。実施例７にも記載したように、ＨＨＡ単独では、４８％の増加がもたらされたのみであった。このように、これらの２つの化合物は、組み合わせて用いられた場合に、少なくとも相加的な効果を有する。
【０１０２】
細胞を種々の濃度のＨＨＡとＨＭＢＡでインキュベートした、同様な実験から得たデータを、図１に示す。このグラフから分かるように、約５μＭ〜約１００μＭのＨＨＡ濃度と約０．５ｍＭ〜約１０ｍＭのＨＭＢＡ濃度は、個々に用いられた場合、蛍光マーカーであるＤｓＲｅｄの発現を増加させることが可能であった。しかしながら、これらの化合物を組み合わせた場合、発現は、著しく増加した。
【０１０３】
試験した別の細胞株は、先の実施例１にて上述のＴＮＦＲ：Ｆｃ（エタナーセプト）を発現するＣＨＯ細胞であった。細胞を、血清含有培地中で３７℃にて増殖させた後、細胞を、血清非含有培地を含有する振盪フラスコに移し替えた。１０μＭのＨＨＡを加え、そして１ｍＭのＨＭＢＡを加えて、そして細胞を、これらの誘導条件下で、低下させた温度にて、さらに７日間インキュベートした。インキュベーション期間終了時に、１．０ｍＭ ＨＭＢＡ含有培地中で増殖させた細胞は、対照細胞と比較して１４％のＴＮＦＲ：Ｆｃ発現増加を示し、一方、１０μＭ ＨＨＡ＋１．０ｍＭ ＨＭＢＡの組み合わせにおいて増殖させた細胞は、対照細胞と比較して２６％のＴＮＦＲ：Ｆｃ発現増加を示した。
【０１０４】
加えて、ＩＬ４受容体に対する抗体をコードする発現ベクターをトランスフェクトしたＣＨＯ細胞プールについて、試験した。増幅させていないプールを、９６ウェルプレートにおける血清非含有培地中に蒔き、そして１０μＭ ＨＨＡ＋１．０ｍＭ ＨＭＢＡとともに３７℃にて４日間インキュベートした。２つの異なる実験において、１０μＭ ＨＨＡ＋１．０ｍＭ ＨＭＢＡの組み合わせに曝露されたプールは、対照と比較して、３２％の抗体発現増加を示した。しかしながら、いずれかの化合物を個々に用いた場合、抗体発現に有意な増加はなかった。この結果は、これらの化合物が相乗的に作用して、組換えタンパク質の発現を増加させることが可能であることを、示唆している。
【０１０５】
（実施例９）
１０μＭ ３−フェニルプロピオノヒドロキサム酸＋１ｍＭ ＨＭＢＡ
ＩＬ４受容体に対する抗体をコードする発現ベクターをトランスフェクトしたＣＨＯ細胞プールについて、別の化合物の組み合わせ（この場合、１０μＭ ３−フェニルプロピオノヒドロキサム酸＋１ｍＭ ＨＭＢＡ）を用いて、試験した。増幅させていないプールを、９６ウェルプレートにおける血清非含有培地中に蒔き、そしてこの組み合わせとともに３７℃にて４日間インキュベートした。３−フェニルプロピオノヒドロキサム酸＋１ｍＭ ＨＭＢＡの組み合わせに曝露されたプールは、対照と比較して、４０％の抗体発現増加を示した。しかしながら、いずれかの化合物を個々に用いた場合、抗体発現に有意な増加はなかった。特に、実施例８の結果と併せて解釈した場合、この結果は、アセトアミド化合物とヒドロキサム酸化合物との組み合わせが、相乗的に作用して、組換えタンパク質の発現を増加させることが可能であることを、示唆している。
【０１０６】
特定の実施態様についての上述の記載は、他者が、本明細書において示された包括的な概念から逸脱することなく、種々の出願のためにこのような実施態様を容易に修正及び／または適用可能なように、本発明の一般的な本質を示している。いかなるこのような応用または修正も、開示された実施態様と同等の意味及び範囲の内に包含されることが、意図される。本明細書で用いられる語法及び専門用語は、説明を目的とし、かつ限定を目的としない。
【図面の簡単な説明】
【０１０７】
【図１】図１は、化合物の組み合わせがレポーター遺伝子の誘導に及ぼす影響を示すグラフである。ＥＡＳＥ／ＣＭＶプロモーターの制御下で蛍光マーカータンパク質であるＤｓＲｅｄを発現する細胞プールを、示された量の化合物存在下で、９６ウェルプレートにおいて３５℃にて６日間培養した。蛍光量を、化合物濃度の関数としてプロットした。誘導に用いた化合物は、ヘキサノヒドロキサム酸（ＨＨＡ）（ひし形）、ヘキサメチレンビスアセトアミド（ＨＭＢＡ）（正方形）及びＨＨＡ＋ＨＭＢＡ両方（三角）であった。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
芳香族カルボン酸化合物を含有する培養培地中で、哺乳動物細胞を培養すること、ここで、哺乳動物細胞は目的のポリペプチドを分泌し、そして、芳香族カルボン酸化合物の存在は、目的のポリペプチドの生産を増加させる；及び、
目的のポリペプチドを、哺乳動物細胞から分離すること；
を含む方法。
【請求項２】
非ハイブリッド極性アセトアミド化合物を含有する培養培地中で、哺乳動物細胞を培養すること、ここで、哺乳動物細胞は目的のポリペプチドを分泌し、そして、アセトアミド化合物の存在は、目的のポリペプチドの生産を増加させる；及び、
目的のポリペプチドを、哺乳動物細胞から分離すること；
を含む方法。
【請求項３】
ヒドロキサム酸化合物を含有する培養培地中で、哺乳動物細胞を培養すること、ここで、哺乳動物細胞は目的のポリペプチドを分泌し、そして、ヒドロキサム酸化合物の存在は、目的のポリペプチドの生産を増加させる；及び、
目的のポリペプチドを、哺乳動物細胞から分離すること；
を含む方法。
【請求項４】
培養培地の温度を３７℃未満の温度に下げることをさらに含む、請求項１〜３のいずれか一つに記載の方法。
【請求項５】
温度を約２９℃〜約３４℃に下げる、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
哺乳動物細胞が、ＣＭＶプロモーターの制御下で目的のポリペプチドを発現する、請求項１〜３のいずれか一つに記載の方法。
【請求項７】
芳香族カルボン酸化合物が、ヒドロ桂皮酸、３−（４−メチルフェニル）プロピオン酸、４−フェニル酪酸、４−（４−アミノフェニル）酪酸、３−（４−アミノフェニル）プロピオン酸；３−（４−フルオロフェニル）プロピオン酸；２−チエニル酢酸、及び５−フェニル吉草酸からなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
アセトアミド化合物が、Ｎ−ブチルアセトアミドである、請求項２に記載の方法。
【請求項９】
ヒドロキサム酸化合物が、ヘキサノヒドロキサム酸（ＨＨＡ）及び／または３−フェニルプロピオノヒドロキサム酸である、請求項３に記載の方法。
【請求項１０】
ポリペプチドが、組換え組換え融合ポリペプチドである、請求項１〜３のいずれか一つに記載の方法。
【請求項１１】
ポリペプチドが、ヒトまたはヒト化抗体である、請求項１〜３のいずれか一つに記載の方法。
【請求項１２】
芳香族カルボン酸化合物、アセトアミド化合物またはヒドロキサム酸化合物の培養物中濃度が、約０．００１ｍＭ〜約３ｍＭである、請求項１〜３のいずれか一つに記載の方法。
【請求項１３】
アセトアミド化合物を培養物に加えることをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
アセトアミド化合物が、ヘキサメチレンビスアセトアミド（ＨＭＢＡ）及び／またはＮ−ブチルアセトアミドである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
ヒドロキサム酸化合物を培養物に加えることをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
ヒドロキサム酸化合物が、ヘキサノヒドロキサム酸（ＨＨＡ）、ベンゾヒドロキサム酸、オクタン−１，８−ジヒドロキサム酸及び／または３−フェニルプロピオノヒドロキサム酸である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
ヒドロキサム酸化合物を培養物に加えることをさらに含む、請求項２に記載の方法。
【請求項１８】
ヒドロキサム酸化合物が、ヘキサノヒドロキサム酸（ＨＨＡ）及び／または３−フェニルプロピオノヒドロキサム酸である、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
アセトアミド化合物を培養物に加えることをさらに含む、請求項３に記載の方法。
【請求項２０】
アセトアミド化合物が、ヘキサメチレンビスアセトアミド（ＨＭＢＡ）及び／またはＮ−ブチルアセトアミドである、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
哺乳動物細胞がＣＨＯ細胞である、請求項１〜３のいずれか一つに記載の方法。
【請求項２２】
ＣＨＯ細胞が、芳香族カルボン酸化合物、非ハイブリッド極性アセトアミド化合物またはヒドロキサム酸化合物に少なくとも約５日間曝露される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
培養培地が血清非含有である、請求項１〜３のいずれか一つに記載の方法。
【請求項２４】
ポリペプチドを精製することをさらに含む、請求項１〜３のいずれか一つに記載の方法。
【請求項２５】
哺乳動物細胞が、約２９℃〜約３６℃の第二温度での生産期へ移行される前に、約３５℃〜約３８℃の第一温度での増殖期において培養され；かつ、
芳香族カルボン酸化合物、非ハイブリッド極性アセトアミド化合物またはヒドロキサム酸化合物が、生産期へ移行後に加えられる；
請求項１〜３のいずれか一つに記載の方法。
【請求項２６】
組換えポリペプチドを生産するための方法であって、
組換えポリペプチドを生産するように遺伝子操作されているＣＨＯ細胞を培養すること；及び、
芳香族カルボン酸、非ハイブリッド極性アセトアミド及びヒドロキサム酸からなる群より選択される少なくとも一つの化合物を培養培地に加えること、ここで、化合物の添加は、組換えポリペプチドの生産を増加させる；
を含む、上記方法。
【請求項２７】
ＣＨＯ細胞が、組換えポリペプチドをコードする組換えベクターで形質転換されている細胞の後代（ｐｒｏｇｅｎｙ）であり、かつ組換えベクターがＣＭＶプロモーターを含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
化合物が、約０．００１ｍＭ〜約３ｍＭの濃度にて培養培地に加えられる、請求項２６に記載の方法。
【請求項２９】
組換えポリペプチドを培地から回収することをさらに含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項３０】
組換えポリペプチドを処方することをさらに含む、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
化合物を複数加えることをさらに含む、請求項２９に記載の方法。
【請求項３２】
ＣＨＯ細胞が、約２９℃〜約３５℃の温度にて培養される、請求項２６に記載の方法。
【請求項３３】
ＣＨＯ細胞が、約２９℃〜約３５℃の第二温度へ移行される前に、約３６℃〜約３８℃の第一温度にて培養され、かつ、化合物が、第一温度から第二温度への移行後に加えられる、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
ポリペプチドを生産するように遺伝子操作されたＣＨＯ細胞、生産用培地、ならびに、芳香族カルボン酸、非ハイブリッド極性アセトアミド及びヒドロキサム酸からなる群より選択される少なくとも一つの化合物を含む、培養物。
【請求項３５】
化合物の濃度が、約０．０１ｍＭ〜約３ｍＭである、請求項３４に記載の培養物。
【請求項３６】
生産用培地が血清非含有である、請求項３４に記載の培養物。
【請求項１】
芳香族カルボン酸化合物を含有する培養培地中で、哺乳動物細胞を培養すること、ここで、哺乳動物細胞は目的のポリペプチドを分泌し、そして、芳香族カルボン酸化合物の存在は、目的のポリペプチドの生産を増加させる；及び、
目的のポリペプチドを、哺乳動物細胞から分離すること；
を含む方法。
【請求項２】
非ハイブリッド極性アセトアミド化合物を含有する培養培地中で、哺乳動物細胞を培養すること、ここで、哺乳動物細胞は目的のポリペプチドを分泌し、そして、アセトアミド化合物の存在は、目的のポリペプチドの生産を増加させる；及び、
目的のポリペプチドを、哺乳動物細胞から分離すること；
を含む方法。
【請求項３】
ヒドロキサム酸化合物を含有する培養培地中で、哺乳動物細胞を培養すること、ここで、哺乳動物細胞は目的のポリペプチドを分泌し、そして、ヒドロキサム酸化合物の存在は、目的のポリペプチドの生産を増加させる；及び、
目的のポリペプチドを、哺乳動物細胞から分離すること；
を含む方法。
【請求項４】
培養培地の温度を３７℃未満の温度に下げることをさらに含む、請求項１〜３のいずれか一つに記載の方法。
【請求項５】
温度を約２９℃〜約３４℃に下げる、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
哺乳動物細胞が、ＣＭＶプロモーターの制御下で目的のポリペプチドを発現する、請求項１〜３のいずれか一つに記載の方法。
【請求項７】
芳香族カルボン酸化合物が、ヒドロ桂皮酸、３−（４−メチルフェニル）プロピオン酸、４−フェニル酪酸、４−（４−アミノフェニル）酪酸、３−（４−アミノフェニル）プロピオン酸；３−（４−フルオロフェニル）プロピオン酸；２−チエニル酢酸、及び５−フェニル吉草酸からなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
アセトアミド化合物が、Ｎ−ブチルアセトアミドである、請求項２に記載の方法。
【請求項９】
ヒドロキサム酸化合物が、ヘキサノヒドロキサム酸（ＨＨＡ）及び／または３−フェニルプロピオノヒドロキサム酸である、請求項３に記載の方法。
【請求項１０】
ポリペプチドが、組換え組換え融合ポリペプチドである、請求項１〜３のいずれか一つに記載の方法。
【請求項１１】
ポリペプチドが、ヒトまたはヒト化抗体である、請求項１〜３のいずれか一つに記載の方法。
【請求項１２】
芳香族カルボン酸化合物、アセトアミド化合物またはヒドロキサム酸化合物の培養物中濃度が、約０．００１ｍＭ〜約３ｍＭである、請求項１〜３のいずれか一つに記載の方法。
【請求項１３】
アセトアミド化合物を培養物に加えることをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
アセトアミド化合物が、ヘキサメチレンビスアセトアミド（ＨＭＢＡ）及び／またはＮ−ブチルアセトアミドである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
ヒドロキサム酸化合物を培養物に加えることをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
ヒドロキサム酸化合物が、ヘキサノヒドロキサム酸（ＨＨＡ）、ベンゾヒドロキサム酸、オクタン−１，８−ジヒドロキサム酸及び／または３−フェニルプロピオノヒドロキサム酸である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
ヒドロキサム酸化合物を培養物に加えることをさらに含む、請求項２に記載の方法。
【請求項１８】
ヒドロキサム酸化合物が、ヘキサノヒドロキサム酸（ＨＨＡ）及び／または３−フェニルプロピオノヒドロキサム酸である、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
アセトアミド化合物を培養物に加えることをさらに含む、請求項３に記載の方法。
【請求項２０】
アセトアミド化合物が、ヘキサメチレンビスアセトアミド（ＨＭＢＡ）及び／またはＮ−ブチルアセトアミドである、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
哺乳動物細胞がＣＨＯ細胞である、請求項１〜３のいずれか一つに記載の方法。
【請求項２２】
ＣＨＯ細胞が、芳香族カルボン酸化合物、非ハイブリッド極性アセトアミド化合物またはヒドロキサム酸化合物に少なくとも約５日間曝露される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
培養培地が血清非含有である、請求項１〜３のいずれか一つに記載の方法。
【請求項２４】
ポリペプチドを精製することをさらに含む、請求項１〜３のいずれか一つに記載の方法。
【請求項２５】
哺乳動物細胞が、約２９℃〜約３６℃の第二温度での生産期へ移行される前に、約３５℃〜約３８℃の第一温度での増殖期において培養され；かつ、
芳香族カルボン酸化合物、非ハイブリッド極性アセトアミド化合物またはヒドロキサム酸化合物が、生産期へ移行後に加えられる；
請求項１〜３のいずれか一つに記載の方法。
【請求項２６】
組換えポリペプチドを生産するための方法であって、
組換えポリペプチドを生産するように遺伝子操作されているＣＨＯ細胞を培養すること；及び、
芳香族カルボン酸、非ハイブリッド極性アセトアミド及びヒドロキサム酸からなる群より選択される少なくとも一つの化合物を培養培地に加えること、ここで、化合物の添加は、組換えポリペプチドの生産を増加させる；
を含む、上記方法。
【請求項２７】
ＣＨＯ細胞が、組換えポリペプチドをコードする組換えベクターで形質転換されている細胞の後代（ｐｒｏｇｅｎｙ）であり、かつ組換えベクターがＣＭＶプロモーターを含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
化合物が、約０．００１ｍＭ〜約３ｍＭの濃度にて培養培地に加えられる、請求項２６に記載の方法。
【請求項２９】
組換えポリペプチドを培地から回収することをさらに含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項３０】
組換えポリペプチドを処方することをさらに含む、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
化合物を複数加えることをさらに含む、請求項２９に記載の方法。
【請求項３２】
ＣＨＯ細胞が、約２９℃〜約３５℃の温度にて培養される、請求項２６に記載の方法。
【請求項３３】
ＣＨＯ細胞が、約２９℃〜約３５℃の第二温度へ移行される前に、約３６℃〜約３８℃の第一温度にて培養され、かつ、化合物が、第一温度から第二温度への移行後に加えられる、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
ポリペプチドを生産するように遺伝子操作されたＣＨＯ細胞、生産用培地、ならびに、芳香族カルボン酸、非ハイブリッド極性アセトアミド及びヒドロキサム酸からなる群より選択される少なくとも一つの化合物を含む、培養物。
【請求項３５】
化合物の濃度が、約０．０１ｍＭ〜約３ｍＭである、請求項３４に記載の培養物。
【請求項３６】
生産用培地が血清非含有である、請求項３４に記載の培養物。
【公表番号】特表２００７−５２５１７６（Ｐ２００７−５２５１７６Ａ）
【公表日】平成１９年９月６日（２００７．９．６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−５１３２６３（Ｐ２００６−５１３２６３）
【出願日】平成１６年４月２３日（２００４．４．２３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０１２５９０
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０９６８３３
【国際公開日】平成１６年１１月１１日（２００４．１１．１１）
【出願人】（５９１１２３６０９）イミュネックス・コーポレーション (24)
【氏名又は名称原語表記】ＩＭＭＵＮＥＸ ＣＯＲＰＯＲＡＴＩＯＮ
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１９年９月６日（２００７．９．６）
【国際特許分類】
【出願日】平成１６年４月２３日（２００４．４．２３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０１２５９０
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０９６８３３
【国際公開日】平成１６年１１月１１日（２００４．１１．１１）
【出願人】（５９１１２３６０９）イミュネックス・コーポレーション (24)
【氏名又は名称原語表記】ＩＭＭＵＮＥＸ ＣＯＲＰＯＲＡＴＩＯＮ
【Ｆターム（参考）】
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