組換えフィブリノゲン高産生細胞の作製方法及び高産生細胞
フィブリノゲンを構成する３種のタンパク質、α鎖（もしくはα鎖の異型）、β鎖、γ鎖（もしくはγ鎖の異型）をコードする遺伝子を動物細胞に組み込む際に、それぞれの遺伝子の構成比を、γ鎖（及び／もしくはγ鎖の異型）遺伝子が、α鎖（及び／もしくはα鎖の異型）遺伝子及びβ鎖遺伝子に対して等量から１０００倍量にする、さらにはバキュロウイルスＰ３５遺伝子を用いて組換えフィブリノゲン高産生細胞を作製する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願発明は、血漿タンパク質の一つであるフィブリノゲンを多量に生産する組換えフィブリノゲン産生細胞の作製方法に関する。更に詳細には、フィブリノゲンを構成する３種のタンパク質、α鎖（もしくはα鎖の異型）、β鎖及びγ鎖（もしくはγ鎖の異型）をコードする遺伝子を、それぞれの構成比がα鎖（及び／もしくはα鎖の異型）遺伝子及びβ鎖遺伝子の総数に対してγ鎖（及び／もしくはγ鎖の異型）遺伝子の数が等量から１０００倍量となるように、動物細胞に組込む工程、さらには産生量増強因子を組み込む工程を含む当該組換えフィブリノゲン産生細胞の作製方法及び当該方法により得られる組換えフィブリノゲン高産生細胞、及びこれらにより得られたフィブリノゲンに関する。
【背景技術】
【０００２】
フィブリノゲンは、血液凝固因子の一つとして、生体が傷害を受けた時に血液を凝固する働きを担う。第一の機能は損傷部位でフィブリンクロットと呼ばれる血栓の本体を形成することであり、第二の機能は、血小板凝集に必要な粘着タンパク質として働くことである。フィブリノゲンの血中濃度は、通常約３ｍｇ／ｍｌであり、アルブミン、免疫グロブリンＧについで３番目に高い。
【０００３】
フィブリノゲンは、α鎖、β鎖及びγ鎖と呼ばれる３種の異なったポリペプチドを２本ずつ有する計６本のポリペプチドからなる巨大糖蛋白質である。ポリペプチドの個々の分子量はα鎖が約６７０００、β鎖が約５６０００，γ鎖が約４７５００であり、これらが集合したフィブリノゲンの分子量は、約３４００００に達する（非特許文献１参照）。フィブリノゲン分子は、Ｓ−Ｓ結合したα鎖、β鎖及びγ鎖の半分子（α−β−γ）が、さらにＳ−Ｓ結合したダイマー（α−β−γ）２を形成しており、形状的には３つのノジュラー（結節・球状）構造を有している。すなわち、中央のＥ領域とその両外側に対称的に配置された２つのＤ領域、その間をつなぐ桿状部からなる構造をとっている。
【０００４】
血中のフィブリノゲンには、分子サイズの異なる異型ポリペプチドを有することに起因するヘテロな分子が存在する。例えば、γ鎖にはγ’鎖（あるいはγＢ鎖）と呼ばれる異型の存在が報告されており、これは、γ鎖のアミノ酸配列の４０８位に２０個のアミノ酸残基が付加した計４２７個のアミノ酸残基からなるポリペプチドであることが明らかにされている（非特許文献２参照）。また、α鎖にもαＥと呼ばれる異型が存在し、このポリペプチドは、α鎖のアミノ酸配列の６１２位に２３６個のアミノ酸残基が伸長した計８４７個のアミノ酸残基を有することが報告されている（非特許文献３参照）。γ’やαＥを有するヘテロなフィブリノゲンは、通常のフィブリノゲンと比較して、その凝固能、線溶耐性能に顕著な差は認められない。しかしながら、これらの分子種については研究段階にあり、未だ詳細な機能は解明されていない。
【０００５】
フィブリノゲン製剤は、静脈投与するなどの方法により血液中のフィブリノゲン濃度を高めることによって重篤な出血を阻止するのに効果的であり、たとえば敗血症における汎発性血管内凝固症候群（ＤＩＣ）のような、血液凝固因子の消費状態の改善や先天性および後天性のフィブリノゲン欠乏症における補充療法に使用される。
また、フィブリンの膠着性を利用した組織接着剤としても広く利用されている（非特許文献４参照）。この生体由来接着剤は、フィブリノゲンが生体内でゲル化することを利用したもので、止血、創傷部位の閉鎖、神経、腱、血管や組織などの接着または縫合補強、肺におけるエアーリークの閉鎖など広範にわたって使用される。また、近年フィブリノゲンをコラーゲンなどのシートに付着させることにより利便性を高めた製剤も販売されている。
【０００６】
現在、医薬品として用いられているフィブリノゲンはヒト血漿から調製されたもので、その問題点として、１）不特定多数のヒトから集めた血漿を使用するために、ＨＡＶ、ＨＢＶ、ＨＣＶ、ＨＥＶ、ＴＴＶなどの肝炎を引き起こすウイルス、ＨＩＶなどの免疫不全症を引き起こすウイルス、ＣＪＤを引き起こす異常プリオンなどの感染性病原体混入の危険性があること、２）また、日本では血漿は献血によって供給されており、将来的な安定供給が問題視されること、などが挙げられている。
これらの問題を解決するために、従来からフィブリノゲンの組換え化が試みられてきた。例えば、大腸菌では、フィブリノゲンγ鎖の菌体内発現には成功しているが、α鎖、β鎖、γ鎖の３つのタンパク質を同時に発現させ、機能的なフィブリノゲン分子を産生させたとの報告はない。また、酵母を用いた発現系でも一時期分泌発現に成功したとの報告もあったが、最終的には再現性が取れずその報告を取り下げている（非特許文献５参照）。このように、未だ、大腸菌や酵母を用いてフィブリノゲンを発現させることに成功したとの報告はない。
【０００７】
一方、動物細胞では、ＢＨＫ細胞（非特許文献６参照）やＣＯＳ細胞（非特許文献７参照）、ＣＨＯ細胞（非特許文献８、９、１０及び特許文献１参照）を用いて発現が試みられているが、その産生量は、１〜１５μｇ／ｍｌ程度にとどまっている。これらの場合、メタロチオネインプロモーター、Ｒｏｕｓ ｓａｒｃｏｍａ ｖｉｒｕｓ ＬＴＲプロモーター、ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ ２ ｍａｊｏｒ ｌａｔｅプロモーターの何れかを用い、選択マーカーとしてアミノグリコシド３’ホスホトランスフェラーゼ（ｎｅｏ）遺伝子、ジヒドロ葉酸還元酵素（ｄｈｆｒ）遺伝子、ｈｉｓｔｉｄｉｎｏｌ耐性遺伝子の何れか若しくはこれらの組み合わせで使用している。いずれの場合も、α鎖、β鎖、γ鎖を各々コードする遺伝子の発現ベクターを各々単独に構築し、３者で同時にトランスフェクションするか、あるいはα鎖、γ鎖若しくはβ鎖、γ鎖遺伝子を有する各々２つの発現ベクターで先に形質転換した細胞に、後からβ鎖、α鎖遺伝子を有する発現ベクターを導入する方法、さらにはα鎖とγ鎖遺伝子を有するプラスミドとβ鎖遺伝子を有するプラスミドを等量混合して導入する方法がとられている。いずれの場合も特に導入する際の各遺伝子の構成比に関する記載はなく、一般的な手法通りに各遺伝子を均等に導入していると思われる。現在使用されている血液由来のフィブリノゲンを用いた医薬品では、例えば、フィブリン糊製剤では約８０ｍｇ／ｄｏｓｅのフィブリノゲンが使われており、前述の十数μｇ／ｍｌ程度の発現量では製造施設が大規模にならざるを得ず、必然的に高コストになってしまう。遺伝子組換え技術によりフィブリノゲンを実用的なレベルで製造するためには高産生細胞（例えば、フィブリノゲンの発現量が１００μｇ／ｍｌ以上）が必要であるが、現在、これを満足する組換え動物細胞を用いた発現系の報告はみられない。
【０００８】
一方、組換えフィブリノゲン産生細胞を培養する場合には、通常の動物細胞の培養と同様の問題点が考えられる。一般的に、タンパク質が分泌タンパク質の場合、培養上清に目的タンパク質が回収できるので、適当な培地中で組換え動物細胞を培養し、一定期間培養した後、培養上清を一括して回収する（バッチ培養）か、随時適当量の培地の抜き取り、添加を連続的に行う方法（パフュージョン培養）が用いられている。いずれにしても、目的分泌タンパク質を産生する組換え動物細胞の数の増加とともに分泌タンパク質の培地への蓄積（産生）量が増加する。細胞の増殖は、細胞が対数的に増殖する対数期と細胞数が見かけ上一定の定常期、それから細胞が死滅し、数が減少する死滅期の３つの期間に分けられる。分泌タンパク質の産生を増加させるためには、定常期での組換え動物細胞の細胞密度を可能な限り高くし、その期間をできるだけ長く維持することが重要である。特に、バッチ培養の場合、一定量の培地の中で組換え動物細胞を増殖させるので、この中で分泌タンパク質の産生量を伸ばすために定常期の細胞密度を可能な限り高くし、なおかつその時期をできるだけ維持しようと様々な試みがなされてきた。
【０００９】
このような育種的な方法とは別の方法として、宿主細胞を改造する試みも行われてきた。例えば、細胞死抑制因子（ａｎｔｉ−ａｐｏｐｔｏｔｉｃ ｆａｃｔｏｒ）を用いる方法が試みられている。この方法は細胞死抑制因子遺伝子を、タンパク質を産生している組換え動物細胞中で発現させ、その細胞に栄養飢餓などによって生じるプログラムされた細胞死（アポトーシス）を抑制する能力を付与し、定常期を延長しようという試みである。
【００１０】
アポトーシスの起こるメカニズムとして非特許文献１１によれば、次のように考えられている。栄養枯渇などの様々な細胞死刺激が細胞に伝わると転写因子やキナーゼを含む各種タンパク質を介して、そのシグナルはミトコンドリアに伝達される。シグナルをうけたミトコンドリアはアポトーシスシグナル伝達因子（ＡＩＦ、シトクロムｃなど）を細胞質中に放出する。シトクロムｃは細胞質に存在するＡｐａｆ−１（ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ−１）とｐｒｏ−ｃａｓｐａｓｅ−９に結合し複合体を形成し、ｃａｓｐａｓｅ−９を活性化する。活性化されたカスペースカスケードは細胞質内あるいは核内の各種基質を切断し、様々なアポトーシスに特徴的な形態学的、生化学的変化（アクチン分解、ＤＮＡ断片化、染色体凝集など）を誘導する。このようなアポトーシスを抑制する因子としてＢｃｌ−２（Ｂ ｃｅｌｌ ｌｙｍｐｈｏｍａ／ｌｅｕｋｅｍｉａ ２）がよく知られている。Ｂｃｌ−２遺伝子はヒト濾胞性リンパ腫に高頻度に見られる癌遺伝子として発見された。現在Ｂｃｌ−２に相同性の高いドメイン（ＢＨ１−４）をもつ多くのファミリー遺伝子が同定されている。ファミリーにはアポトーシスに抑制的に働く因子と促進的に働く因子があり、抑制的因子として、例えばＢｃｌ−ｘＬ、Ｂｃｌ−ｗ、Ｍｃｌ−１、Ａ１、ＢＨＲＦ１、Ｅ１Ｂ−１９Ｋ、Ｃｅｄ−９などが知られており、前述のシトクロムｃ放出阻害や、Ａｐａｆ−１とｐｒｏｃａｓｐａｓｅ−９に結合することによってシグナル伝達を阻止していると考えられている。このように抑制的なＢｃｌ−２ファミリーはカスペースカスケードの上流で機能すると考えられている。
【００１１】
一方、カスペースカスケードの下流に作用（カスペースの活性を直接的に阻害）して細胞死抑制効果を示す因子も知られている。例えば、バキュロウイルス科に属するＡｃＮＰＶ（Ａｕｔｏｇｒｏｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ ｎｕｃｌｅａｒ ｐｏｌｙｈｅｄｒｏｓｉｓ ｖｉｒｕｓ）のＰ３５タンパク質はカスペースの基質として切断され、その断片がほとんど全てのカスペースと安定的な複合体を形成してその活性を阻害する。従って、種々のアポトーシスを抑制することができる。ＡｃＮＰＶに近縁なＢｍＮＰＶ（Ｂｏｍｂｙｘ ｍｏｒｉ ｎｕｃｌｅａｒ ｐｏｌｙｈｅｄｒｏｓｉｓ ｖｉｒｕｓ）もＰ３５遺伝子を持っている。また、牛痘ウイルスのｃｒｍＡはｃａｓｐａｓｅ−１様プロテアーゼやｃａｓｐａｓｅ−８，−１０に特異的に結合し、これを阻害することによりアポトーシスを抑制できる。また、ヘルペスウイルス由来のｖ−ＦＬＩＰは２つのＤＥＤ（ｄｅａｔｈ ｅｆｆｅｃｔｏｒ ｄｏｍａｉｎ）ドメインを持ち、ＦＡＤＤ（Ｆａｓ−ａｓｓｏｃｉａｔｉｎｇ Ｐｒｏｔｅｉｎ ｗｉｔｈ ｄｅａｔｈ ｄｏｍａｉｎ）と結合することによってｃａｓｐａｓｅ−８の活性化を抑制する。
【００１２】
さらに、バキュロウイルス科のＣｐＧＶ（Ｃｉｄｉａ ｐｏｍｏｎｅｌｌａ ｇｒａｎｕｌｏｓｉｓ ｖｉｒｕｓ）やＯｐＭＮＰＶ（Ｏｒｇｙｉａ ｐｓｅｕｄｏｔｓｕｇａｔａ ｍｕｌｔｉｎｕｃｌｅｏｃａｐｓｉｄ ｎｕｃｌｅｏｐｏｌｙｈｅｄｒｏｖｉｒｕｓ）をはじめとする多くの類縁のウイルスには、Ｐ３５遺伝子とは別に、その発現産物がカスペース活性を直接阻害するｖ−ＩＡＰ（ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｏｆ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ）遺伝子が同定されている。現在までにｖ−ＩＡＰのホモログとして、ウイルス以外にショウジョウバエや哺乳類でｃ−ＩＡＰ１／ｈｉａ−２、ｃ−ＩＡＰ２／ｈｉａ−１、ＸＩＡＰ、ＮＡＩＰ、ｓｕｒｖｉｖｉｎ、ＴＩＡＰ、Ａｐｏｌｌｏｎ、ＤＩＡＰ１、ＤＩＡＰ２、ＳｆＩＡＰ、ＩＴＡなど数種類のＢＩＲ（ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ ＩＡＰ ｒｅｐｅａｔ）を持つＩＡＰファミリーが同定されている。
しかし、カスケードの上流に作用するＢｃｌ−２、Ｂｃｌ−ｘＬ、Ｅ１Ｂ−１９ＫなどのＢｃｌ−２ファミリー由来の細胞死抑制因子を用いた産生量増強方法はいずれも細胞死を抑制し、増殖曲線の定常期を延長することができたにもかかわらず、期待通りには産生量が増加しない場合が多かった。これらのことから、これらの因子には直接的なタンパク質の産生量を増強する効果はないか、あっても特殊な環境下で発揮されると考えられる。一方、カスケードの下流に作用するカスペース阻害作用因子については、組換えタンパク質産生細胞において産生量増強効果との関連を調べたとの報告はほとんどなく、その効果については不明であった。
【特許文献１】Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｐａｔｅｎｔ ６０３７４５７
【非特許文献１】「止血・血栓・線溶」松田、鈴木編集、中外医学社（１９９４）
【非特許文献２】ＣｈｕｎｇＤＥとＤａｖｉｅ ＥＷ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２３，４２３２（１９８４）
【非特許文献３】ＬａｗｒｅｎｃｅＹＦら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３１，１１９６８（１９９２）
【非特許文献４】「特集・生体接着剤」Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ，６，９−７２（１９９７）
【非特許文献５】ＲｅｄｍａｎＣＭ，Ｋｕｄｒｙｋ Ｂ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７４，５５４（１９９９）
【非特許文献６】ＦａｒｒｅｌｌＤＨら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３０，９４１４（１９９１）
【非特許文献７】ＲｏｙＳＮら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６６，４７５８（１９９１）
【非特許文献８】ＬｏｒｄＳＴら，Ｂｌｏｏｄ Ｃｏａｇｕｌ Ｆｉｂｒｉｎｏｌｙｓｉｓ，４，５５（１９９３）
【非特許文献９】ＢｉｎｎｉｅＣＧら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３２，１０７（１９９３）
【非特許文献１０】ＬｏｒｄＳＴら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．３５，２３４２（１９９６）
【非特許文献１１】「アポトーシスと疾患中枢神経系疾患編」水野美邦編、医薬ジャーナル（２０００）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
以上述べてきたように、血液由来のフィブリノゲン製剤の製造・販売においては、感染性病原体の混入や市場への安定供給という点を危惧しなければならない。これらの問題点を解決する為に、遺伝子組換え技術によるフィブリノゲンの生産が試みられているが、これまでに報告されている発現量では、製造コストの面で実用化することが困難と予想され、改善・改良が望まれるところである。さらに、産生量増強に従来用いられてきた定常期延長因子の作用には不明なところが多く、その詳細な検討が要望されていた。
【００１４】
したがって、本願発明は、ヒトフィブリノゲンを高発現する組換えヒトフィブリノゲン高産生細胞の作製方法を提供することを目的とする。
【００１５】
また、本願発明の他の目的は、組換えフィブリノゲン高産生細胞の作製に当たり、バキュロウイルスＰ３５による産生量増強作用の影響を解明し、フィブリノゲンの更なる産生量増強方法を提供することにある。
【００１６】
さらに、本願発明の他の目的は、当該方法により得られる組換えヒトフィブリノゲン高産生細胞及びフィブリノゲンを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
本願発明者らは、上記の目的を達成する為に鋭意研究を重ねた結果、ヒトフィブリノゲンを構成する３種のタンパク質のうち、α鎖（及び／もしくはα鎖の異型）遺伝子及びβ鎖遺伝子の総数に対してγ鎖（及び／もしくはγ鎖の異型）遺伝子の数が等量から１０００倍量となるよう、例えば、α鎖及びγ鎖をコードする遺伝子を組込んだ発現ベクターとβ鎖及びγ鎖をコードする遺伝子を組み込んだ発現ベクターを等量混合し、これを用いて動物細胞を形質転換することにより、容易にヒトフィブリノゲンを高発現する組換え動物細胞を作製できることを見出し、本願発明を完成するに至った。
【００１８】
従って、本願発明は、α鎖及びγ鎖含有発現ベクターとβ鎖及びγ鎖含有発現ベクターを等量混合した発現ベクターを用いて動物細胞を形質転換する工程を含む組換えヒトフィブリノゲン高産生細胞の作製方法を包含する。
【００１９】
さらに、本願発明者らは、別の角度から産生量増強を達成する為に鋭意研究を重ねた結果、動物細胞にさらに、バキュロウイルスＰ３５遺伝子を用いて形質転換させることにより、更なる産生量の増強が図れることを見出した。さらに、この産生量の増強は、この因子が産生量の増強要因としてタンパク質生合成活性の増強に寄与した場合と、アポトーシス活性阻害に寄与した場合との２通りが考えられることを明らかにし、前者の場合は、アポトーシスの発生時期まで待たなくとも産生量の増強が得られるため、培地を選ばず、産業上の利用価値が非常に高いことが判明した。
【００２０】
従って、本願発明は、フィブリノゲン産生細胞に同時または異なる時期にバキュロウイルスＰ３５遺伝子を用いて形質転換させることにより、更なる産生量の増強を図ることができる組換えフィブリノゲン高産生細胞の作製方法を包含する。
【００２１】
また、本願発明は、上記の方法により得られた、ヒトフィブリノゲンを高発現する組換えヒトフィブリノゲン高産生細胞及びフィブリノゲンを包含する。
【発明の効果】
【００２２】
本願発明のヒトフィブリノゲンを構成する３種のタンパク質をコードした遺伝子の混合発現方法によれば、ヒトフィブリノゲンを高発現する組換え産生細胞及びその作製方法が提供される。その結果、約１００〜１５２０μｇ／ｍｌの産生量がもたらされる。本願発明の組換えヒトフィブリノゲン産生細胞が生産するヒトフィブリノゲンの量は、これまでに報告されている遺伝子組換え技術によるフィブリノゲンの発現量（〜１５μｇ／ｍｌ）を大きく上回るものである。さらに、本願発明の産生量増強因子遺伝子による形質転換をおこなった場合は、７０４〜３９５２μｇ／ｍｌという従来技術による産生量を遙かに超えた産生量がもたらされ、今後市場への大量供給が可能となる。さらに、その培養方法には、限定がなく、アポトーシスの到来前でも産生量の増加が図れるので、短期間で大量の産生量を得ることが可能である。故に、本願発明の組換えヒトフィブリノゲン産生細胞は、実用的なレベルでのヒトフィブリノゲンの製造方法の確立を可能にし、当該製造方法が確立されることによってヒトフィブリノゲンの市場への安定供給が確保される。
【００２３】
また、本発明方法より得られる組換えヒトフィブリノゲン産生細胞を用いれば、従来の血液を原料として製造した場合に危惧される感染性病原体の混入やその他の血液由来成分の関与を排除することができ、より安全なヒトフィブリノゲン製剤を効率よく大量に製造・供給することが可能となる。このように本願発明の方法は、ヒト血漿由来以外のフィブリノゲンを高産生する組換えフィブリノゲン産生細胞の作製方法としても利用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】組換えフィブリノゲン産生細胞を作製するための発現ベクターを示した図面である。
【図２】産生されたフィブリノゲンのウエスタンブロットプロファイルの結果を示した図面である。レーン１：Ｍａｒｋｅｒ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｒａｉｎｂｏｗ Ｍａｒｋｅｒ ７５６）、レーン２：Ｂｏｌｈｅａｌ（化血研製：血漿由来のフィブリノゲンを含むバイヤル１を規定通りに溶解し、そのフィブリノゲン量を８０ｍｇ／ｍｌとして計算し、ＰＢＳで希釈した。１μｇ／ｌａｎｅ）、レーン３：ＣＨ００１−１−２培養上清（８μｌ／ｌａｎｅ）、レーン４：ＣＨ００１−１−２培養上清（２４μｌ／ｌａｎｅ）
【図３】バキュロウイルスＰ３５遺伝子発現細胞を作製するための発現ベクターを示した図面である。
【図４】バキュロウイルスＰ３５遺伝子を発現している細胞と発現していない細胞のスピナー培養における細胞密度、生存率、フィブリノゲン産生量についての経時変化を示した図である。
【図５】バキュロウイルスＰ３５遺伝子を発現している細胞と発現していない細胞のスピナー培養における細胞密度、生存率、フィブリノゲン産生量についての経時変化を示した図である。
【図６】バキュロウイルスＰ３５遺伝子を発現している細胞と発現していない細胞のスピナー培養における細胞密度、生存率、フィブリノゲン産生量についての経時変化を示した図である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２５】
本願発明の方法は、フィブリノゲンを構成する３種の蛋白質、α鎖、β鎖及びγ鎖をコードする遺伝子を、各遺伝子の構成比がα鎖（及び／もしくはα鎖の異型）遺伝子及びβ鎖遺伝子の総数に対してγ鎖（及び／もしくはγ鎖の異型）遺伝子の数が等量から１０００倍量となるように動物細胞に組込む工程を含む組換えフィブリノゲン産生細胞の作製方法によって特徴付けられる。さらに、産生量増強因子であるバキュロウイルスＰ３５遺伝子による形質転換によって特徴付けられる。
本願発明では、主としてヒトのフィブリノゲンを取り扱うが、ヒトに限らず他の動物のフィブリノゲン産生細胞を作製する方法としても用いることができる。本願発明で用いるヒトフィブリノゲンの構成ポリペプチド、α鎖、β鎖及びγ鎖をコードする遺伝子としては、最終的に発現産物がアッセンブルしてヒトフィブリノゲン分子を形成できる遺伝子であれば、ｃＤＮＡ及び染色体遺伝子の何れも使用できる。
前述したように、α鎖及びγ鎖には、それぞれαＥ鎖及びγ’（γＢ）鎖と呼ばれる異型が存在する。これらに加えて今後新たに見出されるかもしれない他の異型ポリペプチドをコードする遺伝子も、その発現産物がフィブリノゲン分子を構成するタンパク質として機能するならば、同様に、本願発明に使用することが可能である。
【００２６】
所望の遺伝子は、例えば、文献（Ｒｉｘｏｎ ＭＷら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２２，３２３７（１９８３）、Ｃｈｕｎｇ ＤＷら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２２，３２４４（１９８３）、Ｃｈｕｎｇ ＤＷら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２２，３２５０（１９８３）、非特許文献２、３参照）に各々報告されている配列を元にＰＣＲ用プライマーをデザインし、ヒト肝臓などフィブリノゲンを産生している臓器や細胞由来のｃＤＮＡを鋳型にしてＰＣＲを行うことにより取得できる。
より具体的には、フィブリノゲンのα鎖、β鎖、γ鎖、αＥ鎖及びγ’鎖をコードするｃＤＮＡは、以下のように調製される。まず、ヒト肝細胞から全ＲＮＡを抽出し、この中からｍＲＮＡを精製する。得られたｍＲＮＡをｃＤＮＡに変換した後、それぞれの遺伝子配列に合わせてデザインされたＰＣＲプライマーを用い、ＰＣＲ反応を行い、得られたＰＣＲ産物をプラスミドベクターに組込み大腸菌に導入する。大腸菌コロニーの中から目的の蛋白をコードするｃＤＮＡを有するクローンを選択する。上記の全ＲＮＡの抽出には、市販のＴＲＩｚｏｌ試薬（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ社）、ＩＳＯＧＥＮ（ニッポンジーン社）等の試薬、ｍＲＮＡの精製には、ｍＲＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ａｍｅｒｓｈａｍ ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓ社）などの市販キット、ｃＤＮＡへの変換には、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ｐｌａｓｍｉｄ ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ ｃＤＮＡ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ ｐｌａｓｍｉｄ ｃｌｏｎｉｎｇ（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ社）などの市販のｃＤＮＡライブラリー作製キットがそれぞれ使用される。ヒトフィブリノゲン遺伝子を取得する場合は、市販のｃＤＮＡライブラリー、例えば、Ｈｕｍａｎ Ｌｉｖｅｒ Ｍａｒａｔｈｏｎ−Ｒｅａｄｙ ｃＤＮＡ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）が用いられる。ＰＣＲ用プライマーは、ＤＮＡ合成受託機関（例えばＱＩＡＧＥＮ社）などに依頼すれば容易に入手可能である。この時、５’側にＫＯＺＡＫ配列（Ｋｏｚａｋ Ｍ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１９６，９４７（１９８７））及び適切な制限酵素切断部位の配列を付加することが望ましい。好ましくは、配列番号１から６、１３、１５に記載の合成ＤＮＡがプライマーとして用いられる。ＰＣＲ反応は、市販のＡｄｖａｎｔａｇｅ ＨＦ−２ ＰＣＲ Ｋｉｔ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を用い、添付のプロトコールに従って行えばよい。ＰＣＲにより得られたＤＮＡ断片の塩基配列は、ＴＡクローニングキット（インビトロジェン社）等を用いてクローニングした後、ＤＮＡシークエンサー、例えば、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ３１０ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｚｅｒ（ＰＥバイオシステムズ社）により決定される。
【００２７】
このようにして得られるフィブリノゲン遺伝子、好ましくは、配列番号７から９、１４、１６記載の配列を有する遺伝子断片を用いて動物細胞に組み込む為の発現ベクターが構築される。動物細胞を宿主とする発現ベクターには特段の制約はないが、プラスミド、ウイルスベクター等を用いることができる。当該発現ベクターに含まれるプロモーターは、宿主として用いる動物細胞との組み合わせにより、ＳＶ４０初期、ＳＶ４０後期、サイトメガロウイルスプロモーター、ニワトリβアクチンなど、最終的にアッセンブルしたフィブリノゲンが得られるのであれば如何なるものでも良い。好ましくは、ニワトリβ−アクチンプロモーター系発現プラスミドｐＣＡＧＧ（特開平３−１６８０８７）が使用される。選択や遺伝子増幅のマーカー遺伝子として、アミノグリコシド３’ホスホトランスフェラーゼ（ｎｅｏ）遺伝子やジヒドロ葉酸還元酵素（ｄｈｆｒ）遺伝子、ピューロマイシン耐性酵素遺伝子、グルタミン合成酵素（ＧＳ）遺伝子など一般に知られる選択や遺伝子増幅用のマーカー遺伝子（Ｋｒｉｅｇｌｅｒ Ｍ著、加藤郁之進 監訳、ラボマニュアル動物細胞の遺伝子工学、宝酒造（１９９４））が利用できる。
【００２８】
以上述べた要素を組み合わせて構築される発現ベクターの好ましい例として、γ鎖及びβ鎖をコードする遺伝子を有する発現ベクターとγ鎖及びα鎖をコードする遺伝子を有する発現ベクターが挙げられる。より好ましくは、図１に示すｐＣＡＧＧＤ−ＧＢ（フィブリノゲンγ鎖とβ鎖をコードする遺伝子を１個ずつ持ち、選択マーカーとしてｄｈｆｒ遺伝子を持つ）とｐＣＡＧＧＤＮ５−ＧＡ（フィブリノゲンγ鎖とα鎖をコードする遺伝子を１個ずつ持ち、選択マーカーとしてｄｈｆｒ遺伝子及びｎｅｏ遺伝子を持つ）が挙げられる。この２種類の発現ベクターは、α鎖及びβ鎖遺伝子に対するγ鎖遺伝子の構成比が等量となるように等量混合され、動物細胞に導入される。しかしながら、本願発明はこの例に限定されるものではない。本願発明の最も重要な点は、最終的に宿主細胞に導入されたフィブリノゲンを構成する３種のポリペプチド、α鎖、β鎖及びγ鎖をコードする各遺伝子の宿主細胞内での構成比が、α鎖（及び／もしくはα鎖の異型）遺伝子及びβ鎖遺伝子の総数に対してγ鎖（及び／もしくはγ鎖の異型）遺伝子の数を等量以上になるように組み込むことである。ここで、本願発明において「組み込む」とは、遺伝子を細胞に導入する工程のみならず導入された遺伝子を何らかの方法で遺伝子増幅する工程、最終的に遺伝子が宿主細胞ゲノムにインテグレートされた状態を包含することとする。遺伝子の構成比は、遺伝子を導入する工程やゲノム中に導入された遺伝子を増幅させる工程において調節することが可能である。例えば、ｄｈｆｒ遺伝子を用いてメトトレキセートなどの薬剤を用いて遺伝子増幅を行えば、目的遺伝子の数をゲノム中で数コピーから２０００コピーまで増やすことが可能である（Ｉｍａｎ ＡＭらＪ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．，２６２，７３６８，１９８７；Ｌａｕ ＹＦらＭｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，４，１４６９，１９８４；Ｃｒｏｕｓｅ ＧＦらＭｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，３，２５７，１９８３）。このことは、γ鎖遺伝子選択的にｄｈｆｒ遺伝子を付加して宿主細胞ゲノムに導入し、メトトレキセートなどの薬剤を用いて遺伝子増幅を行えば、γ鎖遺伝子特異的に数コピーから２０００コピーまで遺伝子数を増やすことが可能であることを示しており、技術的に、α鎖β鎖遺伝子の総数に対してそのような等倍から１０００倍の構成比にすることが可能であることを示している。従って、組み込まれる遺伝子の構成比は、α鎖（及び／もしくはα鎖の異型）遺伝子及びβ鎖遺伝子の総数に対してγ鎖（及び／もしくはγ鎖の異型）遺伝子の数を等量〜１０００倍ぐらいまで調節可能である。
【００２９】
また、遺伝子を導入する工程においても、α鎖、β鎖及びγ鎖をコードする遺伝子を用いて動物細胞を形質転換する際に、その導入遺伝子の構成比においてγ鎖が少なくとも他の２つα鎖及びβ鎖をコードする遺伝子に比べ等量から１０００倍量になるように調整して形質転換を行えば良い。中でも最も好ましい比率として等量から３倍量があげられる。これらの要件を満たす方法なら、上記のように各鎖をコードする遺伝子が一つの発現ベクターに存在する必要はなく、例えば、前述したようにα鎖とβ鎖を１個ずつ有する発現ベクターとγ鎖を２個有する発現ベクターとを等量混合して、構成比を１：１：２にし、これを動物細胞に導入することもできる。あるいは、α鎖、β鎖及びγ鎖が単独で発現するように構築した発現ベクターを、それぞれ１：１：２〜６の割合で混合したもので動物細胞を形質転換することもできる。若しくは、一つの発現ベクター内にα鎖、β鎖及びγ鎖の各遺伝子の構成比が１：１：２〜６となるように構築された発現ベクターを用いて動物細胞を形質転換しても良い。さらには、前述の１：１：２〜６の比率に加え、１：２：３〜９、１：３：４〜１２、２：３：５〜１５（あるいは２：１：３〜９、３：１：４〜１２、３：２：５〜１５）など、α鎖（及び／もしくはα鎖の異型）遺伝子及びβ鎖遺伝子の総数に対してγ鎖（及び／もしくはγ鎖の異型）遺伝子の数が等量から３倍量となるような比率であれば、本願発明の要件を満たす。また、全ての遺伝子を同時に動物細胞内に導入するのではなく、別々の時期に選択マーカーを変えて動物細胞に順次導入し、最終的に細胞内に導入されるα鎖、β鎖及びγ鎖の各遺伝子の構成比が前述の比（等倍から１０００倍）になるようにしてもよい。また、先述のように導入工程時には上記比率でなくとも、γ鎖遺伝子を有する発現ベクターにｄｈｆｒやＧＳ遺伝子など遺伝子増幅を可能にする選択マーカーを付加し、細胞内で上記比率（等倍から１０００倍）になるように遺伝子増幅を行っても構わない。
【００３０】
産生量増強因子としてはタンパク質生合成活性を増加させる作用及び／又はカスペースを阻害する作用を持つ因子が使用できるが、その代表例としてバキュロウイルス（ＡｃＮＰＶあるいはＢｍＮＰＶ）のＰ３５遺伝子があげられる。例えば、バキュロウイルス（ＡｃＮＰＶ）Ｐ３５遺伝子は、文献（Ｆｒｉｅｓｅｎ，Ｐ．Ｄ．ａｎｄ Ｍｉｌｌｅｒ，Ｌ．Ｋ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６１，２２６４−２２７２（１９８７））に報告されている配列を元にＰＣＲ用プライマーをデザインし、バキュロウイルス感染細胞やウイルスゲノムそのものを鋳型にしてＰＣＲを行うことにより取得できる。好ましくは、配列番号１０、１１に記載の合成ＤＮＡがプライマーとして用いられる。ＰＣＲ反応は、市販のＡｄｖａｎｔａｇｅ ＨＦ−２ ＰＣＲ Ｋｉｔ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を用い、添付のプロトコールに従って行えばよい。ＰＣＲにより得られたＤＮＡ断片の塩基配列は、ＴＡクローニングキット（インビトロジェン社）等を用いてクローニングした後、ＤＮＡシークエンサー、例えば、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ３１０ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｚｅｒ（ＰＥバイオシステムズ社）により決定される。このようにして得られるＰ３５遺伝子、好ましくは、配列番号１２記載の配列を有する遺伝子断片を用いて動物細胞に組み込む為の発現ベクターが構築される。その好ましい例として図３に示すベクターがあげられる。これらは動物細胞に導入されるが、しかしながら、本願発明はこれらの例に限定されるものではない。バキュロウイルスＰ３５遺伝子に代表される産生量増強作用を持つ因子をコードする遺伝子とフィブリノゲンを構成するα鎖、β鎖、γ鎖の３種の遺伝子に代表される目的とする産生遺伝子が同一細胞内で同時に発現できる形であれば特段の制限はない。バキュロウイルスＰ３５遺伝子をコードする遺伝子の発現ベクターと、フィブリノゲンを構成するα鎖、β鎖、γ鎖の３種の遺伝子の発現ベクターの導入時期や導入の順番にも特段の制限はない。例えば、宿主細胞に産生量増強作用をもつ因子をコードする遺伝子の発現ベクターとフィブリノゲン発現ベクターを同時に導入しても良いし、別々の時期に導入しても構わない。予め宿主細胞に産生量増強作用をもつ因子をコードする遺伝子の発現ベクターを導入して新たな宿主細胞とすれば、より一層汎用性が増す。ただし、産生量増強作用をもつ因子をコードする遺伝子を有する発現ベクターとフィブリノゲン遺伝子を有する発現ベクターとを別々の時期に宿主細胞に導入させる場合には、それぞれの発現ベクターの持つ選択マーカー遺伝子に各々異なったものを使う必要がある。
【００３１】
発現ベクターを導入する宿主細胞として、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞やＳＰ２／０等マウスミエローマ細胞、ＢＨＫ細胞、２９３細胞、ＣＯＳ細胞など様々な動物細胞が利用可能であるが、発現ベクターに使用されるプロモーター、選択及び遺伝子増幅用マーカー遺伝子に合わせて適当な細胞を選択すれば良い。例えば、ニワトリβ−アクチンプロモーター系発現プラスミドを用いて構築した発現ベクターには、ＢＨＫ２１細胞やＣＨＯ細胞ＤＧ４４株などが使用される。
【００３２】
宿主細胞を形質転換するときには公知の方法を利用すればよい。例えば、リン酸カルシウム法、ＤＥＡＥデキストラン法、リポフェクチン系のリポソームを用いる方法、プロトプラストポリエチレングリコール融合法、エレクトロポレーション法などが利用でき、使用する宿主細胞により適当な方法を選択すればよい（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ（３ｒｄ Ｅｄ．），Ｖｏｌ ３，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（２００１））。
【００３３】
形質転換細胞の選択・増殖には、一般に動物細胞を形質転換する時に行われる方法を使用すればよい。例えば、形質転換後の細胞は、ＣＨＯ−Ｓ−ＳＦＭＩＩ培地（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ）、ＩＳ ＣＨＯ−Ｖ培地（アイエスジャパン）、ＹＭＭ培地等無血清培地やＭＥＭアルファ培地、ＲＰＭＩ培地、ダルベッコＭＥＭ培地（いずれもＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ）に５−１０％程度のウシ胎児血清を添加した血清培地などの一般的に動物細胞培養に用いられる培地に、使用する選択マーカーに合わせてメトトレキサート、Ｇ４１８、ピューロマイシン等を添加した選択培地を用いて、適宜培地交換をしながら、３７℃前後で１０〜１４日間程度培養される。この培養により、形質転換されていない細胞は死滅し、形質転換した細胞のみが増殖してくる。更に、形質転換細胞に対して、限界希釈法などの方法により、目的とするフィブリノゲン産生細胞株の選択及びクローン化が行われる。培養方法には、細胞の種類によってフィブリノゲンの検出・発現量の測定には、一般に蛋白質やポリペプチドの検出に用いられる方法、すなわち、ＥＬＩＳＡ，ＲＩＡ，ＷＢ，ＳＤＳ−ＰＡＧＥ等の方法を利用すれば良い。また、フィブリノゲンの活性であるクロッティングを直接測定しても良い。
【００３４】
このようにして得られた本願発明の組換えフィブリノゲン産生細胞は、血清含有の培地中において細胞約５ｘ１０４個／ｍｌで播種し、４日間培養することによって培養液１ｍｌあたり〜約１００μｇのフィブリノゲンを発現し、且つ無血清培地中においてもこのフィブリノゲン産生量を低下することなく増殖することができ、約１．６ｘ１０５個／ｍｌで播種し、約２週間のスピナー培養で培養液１ｍｌあたり〜約２７０μｇの産生量（潜在的な産生量として〜１５２０μｇ／ｍｌ）を達成できる有用な細胞である。また、さらに従来技術によるフィブリノゲンの産生量は最大約１５μｇ／ｍｌであったが、本発明によりＰ３５遺伝子を導入した場合スピナー培養レベルで約４２倍の産生量増強効果がもたらされた。また、Ｐ３５遺伝子が導入された場合には単純計算で約７０４〜３９５２μｇ／ｍｌの潜在的な産生量をもつと推定される。
従来のアポトーシス抑制活性による産生増強効果は、栄養状態の悪くなる培養後期、酪酸などのように細胞毒性を示す濃度域で発現増強活性を示すような薬剤や細胞毒性を示すような何らかの因子との混合培養などタンパク質産生細胞にアポトーシスを誘導する条件下での培養に置いて最も良く効果を示すと考えられてきた。本願発明は、このような特殊条件下でなく、一般的な培養条件下、すなわち通常の生存率が低下しない時期での培養にも効果を発揮する。この点が、これまでのアポトーシス抑制因子による産生量増強とは明確に異なる。本願発明は、フェドバッチ培養、パフュージョン培養など育種方法との併用も可能であるので組換え細胞のフィブリノゲン産生能をさらに増強することができる。ゆえに本発明は、従来では、動物細胞では生産が難しく、産業化が難しかったフィブリノゲン生産の事業化ならびに、すでに事業化されているフィブリノゲン生産においても更なる産生量増強による大幅なコストダウンを可能にするものである。
以下に、実施例を挙げて本願発明をさらに具体的に説明するが、この例示に限定されるものではない。なお、以下に示す実施例では、特に断りのない限り、和光純薬、宝酒造、東洋紡およびＮｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ社、アマシャムファルマシア社、バイオラド社、シグマ社、ギブコＢＲＬ社製の試薬を使用した。
【実施例１】
【００３５】
（フィブリノゲン遺伝子の単離）
ヒトフィブリノゲン遺伝子は、Ｈｕｍａｎ Ｌｉｖｅｒ Ｍａｒａｔｈｏｎ−Ｒｅａｄｙ ｃＤＮＡ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）をテンプレートとし、プライマーとしてＫｏｚａｋ配列および必要な酵素ｓｉｔｅを加えたものをα鎖、β鎖、γ鎖用にそれぞれ２本ずつ作製し（配列番号１〜６）、Ａｄｖａｎｔａｇｅ ＨＦ−２ ＰＣＲ Ｋｉｔ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を用いてキットのプロトコールに従ってＰＣＲ反応を行った。この結果、α鎖、β鎖、γ鎖それぞれにＰＣＲ増幅のバンドが検出された。そのサイズは既知のα鎖、β鎖、γ鎖ｃＤＮＡ遺伝子のサイズと一致していたため、これらの遺伝子をＴＡクローニングキット（インビトロジェン）を用いてクローニング（各々ｐＦｂｇＡ、ｐＦｂｇＢ、ｐＦｂｇＧ）し、その塩基配列の決定をＡＢＩ ＰＲＩＳＭ３１０ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｚｅｒ（ＰＥバイオシステムズ）を用いて行った。その結果、配列番号７〜９にそれぞれ示すＦｂｇＡ、ＦｂｇＢ、ＦｂｇＧ遺伝子が得られた。
【実施例２】
【００３６】
（フィブリノゲン遺伝子発現ベクターの構築）
本実施例に用いたフィブリノゲンβ鎖及びγ鎖遺伝子発現ベクターｐＣＡＧＧＤ−ＧＢならびに、フィブリノゲンα鎖及びγ鎖遺伝子発現ベクターｐＣＡＧＧＤＮ５−ＧＡは以下のようにして構築した。ｐＣＡＧＧＤ−ＧＢについては、まず、ｐＣＡＧＧ−Ｓ１ ｄｈｆｒ（ＷＯ ０３／００４６４１）をＢａｍＨＩにて消化し、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼによる末端平滑化を行い、リン酸化ＮｏｔＩリンカー（宝）を用いてｌｉｇａｔｉｏｎすることによりｐＣＡＧＧ−Ｓ１ ｄｈｆｒＮを構築し、これのＳａｌＩサイトにｐＦｂｇＧ由来のＦｂｇＧ遺伝子のＳａｌＩ断片を組込み、ｐＣＡＧＧＤ−Ｇを構築した。さらに、ｐＣＡＧＧ（Ｘｈｏ）（ＷＯ ０３／００４６４１）をＳａｌＩで消化し、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼによる末端平滑化を行い、リン酸化ＮｏｔＩリンカー（宝）を用いてｌｉｇａｔｉｏｎすることによりｐＣＡＧＧ（Ｘｈｏ）Ｎを構築し、このプラスミドのＸｂａＩ−ＢａｍＨＩサイトに、ｐＣＡＧＧ−Ｓ１（ＷＯ ０３／００４６４１）のＳａｌＩを含むＸｂａＩ−ＢａｍＨＩ断片を組込み、得られたプラスミドのＢａｍＨＩサイトを消化し、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼによる末端平滑化を行い、リン酸化ＮｏｔＩリンカー（宝）を用いてｌｉｇａｔｉｏｎすることによりｐＣＡＧＧ−Ｓ１ ２Ｎを構築した。このｐＣＡＧＧ−Ｓ１ ２ＮのＳａｌＩサイトにｐＦｂｇＢ由来のＦｂｇＢ遺伝子のＳａｌＩ断片を組込み、ｐＣＡＧＧ−Ｂを構築した。ｐＣＡＧＧＤ−ＧのＮｏｔＩサイトにｐＣＡＧＧ−ＢのＦｂｇＢ遺伝子を含むＮｏｔＩ断片を組込み、最終的なフィブリノゲンβ鎖とγ鎖の発現ベクターｐＣＡＧＧＤ−ＧＢ（図１）を構築した。
【００３７】
一方、ｐＣＡＧＧＤＮ５−ＧＡについては、最初にｐＣＡＧＧ−Ｓ１ ｄｈｆｒ ｎｅｏ（ＷＯ ０３／００４６４１）を不完全なＢａｍＨＩ消化を行い、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼによる末端平滑化後、そのまま自己ｌｉｇａｔｉｏｎすることにより２つあるＢａｍＨＩサイトのうちｎｅｏ遺伝子の３’側にあるＢａｍＨＩサイトを欠失させ、さらにＢａｍＨＩで消化して、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼによる末端平滑化後、リン酸化ＮｏｔＩリンカー（宝）を用いてｌｉｇａｔｉｏｎすることによりｐＣＡＧＧ−Ｓ１ ｄｈｆｒ ｎｅｏＮ（ｐＣＡＧＧＤＮ５−ＮｏｔＩ）を構築した。このｐＣＡＧＧ−Ｓ１ ｄｈｆｒ ｎｅｏＮのＳａｌＩサイトにｐＦｂｇＧ由来のＦｂｇＧ遺伝子を含むＳａｌＩ断片を挿入して構築したプラスミドのＮｏｔＩサイトに、ｐＣＡＧＧ−Ｓ１ ２ＮのＳａｌＩサイトにｐＦｂｇＡ由来のＦｂｇＡ遺伝子を含むＳａｌＩ断片を挿入して構築したｐＣＡＧＧ−ＡのＦｂｇＡ遺伝子を含むＮｏｔＩ断片を組込み、ｐＣＡＧＧＤＮ５−ＧＡ（図１）を構築した。
【実施例３】
【００３８】
（組換えフィブリノゲン発現細胞の作製：発現ベクターの細胞への導入、遺伝子増幅、クローニング）
実施例２で構築したフィブリノゲン発現プラスミドｐＣＡＧＧＤ−ＧＢ及びｐＣＡＧＧＤＮ５−ＧＡを用いて以下に述べる方法にて、ＣＨＯ ＤＧ４４（Ｕｒｌａｕｂ Ｇら，Ｓｏｍａｔｉｃ ｃｅｌｌ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．，１２，５５５（１９８６）、以下ＣＨＯ）細胞を形質転換した。形質転換の前日にＣＨＯ細胞を６ｗｅｌｌプレートに１−０．５×１０５ｃｅｌｌｓ／２ｍｌ／ｗｅｌｌの細胞密度で１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ、ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ社製）を含むＹＭＭ培地（インシュリン・トランスフェリン・エタノールアミン・亜セレン酸ナトリウムを含むアミノ酸・ビタミンを強化した核酸不含ＭＥＭアルファ培地）を用い播種した。３７℃、５％ＣＯ２培養装置で一夜培養の後、リポソーム系形質転換試薬、ＴｒａｎｓＩＴ−ＬＴ１（宝）あるいはリポフェクトアミン２０００（インビトロジェン）を用いて、あらかじめフィブリノゲン発現プラスミドｐＣＡＧＧＤ−ＧＢ及びｐＣＡＧＧＤＮ５−ＧＡを各々等量混合し、ＰｖｕＩで消化・線状化しておいたものを導入ＤＮＡとして、それぞれのプロトコールに従いトランスフェクションを行った。３７℃、５％ＣＯ２培養装置で一夜培養した後、選択培地、１０％透析ＦＣＳ（ｄ−ＦＣＳ：ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ社製）、０．５ｍｇ／ｍｌ Ｇｅｎｅｔｉｃｉｎ（Ｇ４１８：ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ社製）、１００ｎＭメトトレキサート（ＭＴＸ：和光純薬工業製）を含むＹＭＭ培地、あるいは１０％ ｄ−ＦＣＳ、０．５ｍｇ／ｍｌ Ｇ４１８を含むＹＭＭ培地に培地交換した。３〜４日毎に培地を交換しながら３７℃、５％ＣＯ２培養装置で培養を続けることで選択を行い、形質転換体を得た。
【００３９】
得られた形質転換細胞のフィブリノゲン産生をＥＬＩＳＡにて測定した。ＥＬＩＳＡは以下に示す手順にて実施した。ＰＢＳ（１３７ｍＭ ＮａＣｌ，８ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４−１２Ｈ２Ｏ，２．７ｍＭ ＫＣｌ，１．５ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４）で１０μｇ／ｍｌに調製した抗ヒトフィブリノゲン・ウサギポリクローナル抗体（Ｄａｋｏ Ｃｙｔｏｍａｔｉｏｎ）１００μｌをイムノモジュールプレート（ヌンク Ｃ８−４４５１０１）にアプライし、４℃に一晩置くことで固相化を行った。固相化したプレートの抗体溶液を除き、ＰＢＳ ３９０μｌにて３回洗浄した。続いて、ＰＢＳで４倍に希釈したブロックエース（大日本製薬）を３７０μｌアプライし、室温で３０分から２時間、ブロッキングを行った。ブロッキング後、ブロッキング液を除き、サンプル（培養上清）およびスタンダードを１００μｌアプライした。サンプル（フィブリノゲン産生細胞の培養上清）は、ＰＢＳで１０倍に希釈したブロックエースを用いて１００〜８００倍に希釈した。スタンダードには、Ｂｏｌｈｅａｌ（化血研製：血漿由来のフィブリノゲンを含むバイヤル１を規定通りに溶解し、そのフィブリノゲン量を８０ｍｇ／ｍｌとして計算し、ＰＢＳで１ｍｇ／ｍｌに希釈した。）をサンプルと同じ希釈液にて１００ｎｇ／ｍｌ〜１ｎｇ／ｍｌに希釈したものを用いた。サンプルおよびスタンダードは、プレートにアプライ後、３７℃で１時間反応させた。反応終了後、洗浄液（０．０５％ Ｔｗｅｅｎ−２０／ＰＢＳ）３９０μｌにて４回洗浄を行い、続いて、サンプル希釈に用いた溶液（ＰＢＳで１０倍に希釈したブロックエース）で８０００倍に希釈した抗ヒトフィブリノゲン・ウサギポリクローナル抗体・パーオキシダーゼ標識を１００μｌアプライし、３７℃で１時間反応させた。反応終了後、洗浄液（０．０５％ Ｔｗｅｅｎ−２０／ＰＢＳ）３９０μｌにて４回洗浄を行った。発色は、ＴＭＢ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ Ｋｉｔ（Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ＆Ｐｅｒｒｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．）１００μｌをアプライし、暗所で３０分静置後、１規定硫酸１００μｌで反応を停止した。反応停止後３０分以内に、プレートリーダー（モレキュラーデバイス）にて、４５０ｎｍ−６５０ｎｍの吸光度を測定し、検量線からフィブリノゲン濃度を求めた。
【００４０】
このＥＬＩＳＡにてフィブリノゲン産生能の高い形質転換細胞を選び出し、次にＭＴＸ遺伝子増幅を行った。１０％ ｄ−ＦＣＳ、０．５ｍｇ／ｍｌ Ｇ４１８を含み、段階的にＭＴＸ濃度を上げたＹＭＭ培地に細胞を懸濁し、２４ｗｅｌｌプレートに５ｘ１０４ｃｅｌｌｓ／０．５ｍｌ／ｗｅｌｌにて播種し、３〜４日毎に培地を交換しながら３７℃、５％ＣＯ２培養装置で培養を続けることで選択を行い、高濃度のＭＴＸに耐性の形質転換体を得た。表１にその代表的な結果を示す（表中「＊」：細胞がコンフル時に新しい培地に完全に交換し、一夜培養した培養上清中の産生量）。
【００４１】
【表１】
【００４２】
このような組換えフィブリノゲン産生細胞のクローニングを行った。１０％ ｄ−ＦＣＳ、０．５ｍｇ／ｍｌ Ｇ４１８、１００ｎＭ ＭＴＸを含むＹＭＭ培地に細胞を懸濁し、９６ｗｅｌｌプレートに１個／ｗｅｌｌの濃度で２００μｌ／ｗｅｌｌずつ播種することで限界希釈によるクローニングを行った。得られたクローンについて、コンフル時に新しい培地に完全に交換し、一夜培養した培養上清中の産生量を調べたところ、〜５６．８μｇ／ｍｌに達するクローンが得られた。その中の一つのクローンＣＨ００２−２４−４を１０％ ｄ−ＦＣＳ、０．５ｍｇ／ｍｌ Ｇ４１８、１００ｎＭ ＭＴＸを含むＹＭＭ培地に細胞を懸濁し、６ｗｅｌｌプレートに２ｘ１０５ｃｅｌｌｓ／２ｍｌ／ｗｅｌｌで播種し、４日間の培養を行い、培養上清中のフィブリノゲンの量をＥＬＩＳＡ法にて測定したところ、１０３．３μｇ／ｍｌに達しており、組換え動物細胞によるフィブリノゲンの産生量として１００μｇ／ｍｌのオーダーを初めて超えたことを示した。
【実施例４】
【００４３】
（産生されたフィブリノゲンのウエスタンブロット解析）
産生されたフィブリノゲンのウエスタンブロットを行った。フィブリノゲン・サンプルとして、ＣＨ００１−１−２細胞を２×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌの密度で１０％ ｄ−ＦＣＳを含むＹＭＭ培地を用い播種し、一夜培養し、翌日培地を、ＦＣＳを含まないＹＭＭ培地に交換し、３７℃、５％ＣＯ２培養装置で４日間培養後、その培養上清中に存在するフィブリノゲンを解析に用いた。
サンプルを５ｘＳＤＳ処理バッファー（０．３１２５Ｍ Ｔｒｉｓ，５％ ＳＤＳ，２５％グリセロール，０．０５％ブロモフェノールブルー，５％ ２−メルカプトエタノールｐＨ６．８）と１：４で混合し、１００℃、５分間ボイルした。これらのサンプルをゲルとしてパジェル５−２０％（ＡＴＴＯ）を使用し、泳動条件として４０ｍＡ定電流、１．５時間で電気泳動を行った。泳動後、ゲルとＩｍｍｏｂｉｌｏｎ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｍｅｍｂｒａｎｅｓ（以下Ｍｅｍｂｒａｎｅ：ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ）を密着させ、ホライズブロット（ＡＴＴＯ）を用いて１００ｍＡ定電流、２５分間でＭｅｍｂｒａｎｅに泳動タンパク質をトランスファーした。Ｍｅｍｂｒａｎｅはブロックエース（大日本製薬）原液で１時間室温にてブロッキングし、次に抗ヒトフィブリノーゲン・ウサギポリクローナル抗体（Ｄａｋｏ Ｃｙｔｏｍａｔｉｏｎ）０．５５μｇ／ｍｌを含む１０％ブロックエース，０．０５％ Ｔｗｅｅｎ−２０／ＴＢＳ（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ，１５０ｍＭ ＮａＣｌ ｐＨ７．５）に浸し、３７℃、３０分間振盪した。さらに０．０５％ Ｔｗｅｅｎ−２０／ＴＢＳで５分振盪を３回繰り返して洗浄した後、さらにＴＢＳで３回洗浄し、ブロックエース（大日本製薬）原液で５分間室温にてブロッキングした。続いて、１０％ブロックエース，０．０５％ Ｔｗｅｅｎ−２０／ＴＢＳにて３０００倍に希釈されたＧｏａｔ Ａｎｔｉ−Ｒａｂｂｉｔ ＩｇＧ−Ａｌｋａｌｉｎｅ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ（ＢＩＯＳＯＵＲＣＥ）溶液に浸し、３７℃、３０分間振盪した。０．０５％ Ｔｗｅｅｎ−２０／ＴＢＳで５分振盪を３回繰り返して洗浄した後、さらにＴＢＳで３回洗浄し、Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（ＫＰＬ）で発色させた。
その結果を図２に示す。還元下において、ＣＨ００１−１−２培養上清中に産生されたフィブリノゲンは血漿由来のフィブリノゲンを含むボルヒールと同じサイズの蛋白があることが確認された。また、これら３本のバンドは既知のフィブリノゲン各鎖の分子量と一致していた（α鎖；６６ｋＤａ、β鎖；５２ｋＤａ、γ鎖；４６．５ｋＤａ）。
【実施例５】
【００４４】
（組換えフィブリノゲン産生細胞の無血清培養）
組換えフィブリノゲン産生細胞の無血清培養時の産生能を調べた。実施例３において１００μｇ／ｍｌ以上の産生量を示したクローンＣＨ００２−２４−４を、ＰＢＳにて２回洗浄後、表２に示す培地（ＣＨＯ−Ｓ−ＳＦＭＩＩ、ＩＳ ＣＨＯ−Ｖは無血清培地、１０％ｄ−ＦＣＳ／ＹＭＭは血清培地）にそれぞれ懸濁し、１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌで２ｍｌ／ｗｅｌｌ ｏｆ ６ｗｅｌｌプレートで播種し、４日間培養を行い、得られた細胞数のカウントと培養上清中のフィブリノゲン産生量を前述のＥＬＩＳＡにて測定した。その結果、表２に示すように、１ｘ１０４ｃｅｌｌｓ当たりのフィブリノゲン産生能は、血清培地（１０％ｄ−ＦＣＳを含むＹＭＭ培地）を用いた場合より高く、無血清培地でも血清培地と同等以上の産生能力があることが示された。このことは、一般的な高密度培養の場合１〜２ｘ１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌは達成可能であるので、培養条件さえ良ければ、単純計算で約４４０〜１５２０μｇ／ｍｌ以上のフィブリノゲンを産生させる潜在能力があることを示している。
【００４５】
【表２】
【００４６】
さらに、このＣＨＯ−Ｓ−ＳＦＭＩＩ培地で増殖したＣＨ００２−２４−４細胞を、同じくＣＨＯ−Ｓ−ＳＦＭＩＩを基本とした無血清培地１００ｍｌに１．６ｘ１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌで播種し、ｔｅｃｈｎｅ社製のスピンナーフラスコを用いた約２週間の浮遊培養（回転数４５ｒｐｍ）で２７２．７μｇ／ｍｌという、産生量を達成した。また、別クローンＣＨ００４−２Ａ４−３細胞を同じく、ＣＨＯ−Ｓ−ＳＦＭＩＩを基本とした無血清培地１００ｍｌに８ｘ１０４ｃｅｌｌｓ／ｍｌで播種し、ｔｅｃｈｎｅ社製のスピンナーフラスコを用いた約２週間の浮遊培養（回転数４５ｒｐｍ）で９８．２μｇ／ｍｌを達成している。このように、本願発明の方法により確立した細胞が、フィブリノゲン産生に関して無血清培地で〜約２７０μｇ／ｍｌの産生量を達成し、これまでにない高産生細胞であることが示された。
【実施例６】
【００４７】
（Ｐ３５遺伝子のクローニングと発現ベクター構築）
バキュロウイルスＡｃＮＰＶ（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ ｎｕｃｌｅａｒ ｐｏｌｙｈｅｄｏｒｏｓｉｓ ｖｉｒｕｓ：Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎより購入）由来のウイルス液（２ｘ１０７ｐｆ／ｍｌ）からプロテナーゼＫ処理、フェノール抽出によりウイルスゲノムを調製し、これを鋳型として、プライマーとしてＫｏｚａｋ配列および必要な酵素ｓｉｔｅを加えたものを５’用、３’用の２本作製し（配列番号１０、１１）、Ａｄｖａｎｔａｇｅ ＨＦ−２ ＰＣＲ Ｋｉｔ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を用いてＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ産物のサイズは既知のＰ３５遺伝子のサイズと一致していたため、これをＴＡクローニング（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）した。得られたプラスミドについて、その塩基配列の決定をＡＢＩ ＰＲＩＳＭ３１０ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｚｅｒ（ＰＥバイオシステムズ）を用いて行った結果、文献（Ｆｒｉｅｓｅｎ ＰＤ，Ｍｉｌｌｅｒ ＬＫ．，Ｊ Ｖｉｒｏｌ．６１（７）：２２６４−７２．１９８７）の配列と同じ配列を持ったＰ３５遺伝子クローン（配列番号１２）が得られた。
【００４８】
すでにフィブリノゲンを発現している細胞にＰ３５遺伝子を導入するために、まず選択マーカーとしてｐｕｒｏｍｙｃｉｎ耐性遺伝子をもったベクターを構築した。２３番目のセリンをアルギニンに変換した変異ＤＨＦＲを持った発現プラスミドｐＣＡＧＧ−Ｓ１ ｍｄｈｆｒ（ＷＯ ０３／００４６４１）のＳａｐＩ、ＮｏｔＩサイト間にＢａｍＨＩサイトを挿入するために、ＧＧＣ ＣＧＣ ＧＧＡ ＴＣＣ ＧＣＴ ＣＴＴ ＣＣ及びＡＧＣ ＧＧＡ ＡＧＡ ＧＣＧ ＧＡＴ ＣＣＧ Ｃの２つのリンカーを合成し、リンカーライゲーションを行い、ｐＣＡＧＧＭ５を構築した。さらに、ｐＣＡＧＧＭ５のＢａｍＨＩ消化を行い、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼによる末端平滑化後、ＸｈｏＩリンカー（宝）を用いたリンカーライゲーションさせることによりＸｈｏＩを導入した。このプラスミドのＸｈｏＩサイトにｐＰＧＫＰｕｒｏ（Ｗａｔａｎａｂｅ，Ｓ．，Ｋａｉ，Ｎ．，Ｙａｓｕｄａ，Ｍ．，Ｋｏｈｍｕｒａ，Ｎ．，Ｓａｎｂｏ，Ｍ．，Ｍｉｓｈｉｎａ，Ｍ．，ａｎｄ Ｙａｇｉ，Ｔ．（１９９５）．）のｐｕｒｏｍｙｃｉｎ耐性遺伝子を含むＳａｌＩ断片を挿入してｐＣＡＧＧＭＰ５−ＮｏｔＩを構築した。次にこのプラスミドから変異ＤＨＦＲ（ｍｄｈｆｒ）遺伝子を含むＳａｌＩ−ＮｏｔＩ断片を除き、代わりにｐＣＡＧＧＤＮ５−ＮｏｔＩのＤＨＦＲ遺伝子を含むＳａｌＩ−ＮｏｔＩ断片を挿入してｐＣＡＧＧＤＰ５−ＮｏｔＩを構築した。ｐＣＡＧＧＤＰ５−ＮｏｔＩのＳａｌＩサイトにＰＣＲクローニングしたＰ３５遺伝子のＸｈｏＩ断片を挿入し、目的のｐＣＡＧＧＤＰ５−Ｐ３５（図３）を構築した。
【実施例７】
【００４９】
（Ｐ３５遺伝子形質転換細胞）
実施例６で構築したＰ３５発現プラスミドｐＣＡＧＧＤＰ５−Ｐ３５を用いて以下に述べる方法にて、実施例３で得られた組換えフィブリノゲン産生クローン、ＣＨ００２−２４−４細胞を形質転換した。ＣＨ００２−２４−４細胞を１２ｗｅｌｌプレートに１−０．５×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌ／ｗｅｌｌの細胞密度でＣＨＯ−Ｓ−ＳＦＭＩＩ培地（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ）を用い播種した。リポソーム系形質転換試薬であるリポフェクトアミン２０００（インビトロジェン）を用いて、あらかじめＰ３５発現プラスミドｐＣＡＧＧＤＰ５−Ｐ３５をＰｖｕＩで消化・線状化しておいたものを導入ＤＮＡとして、リポフェクトアミン２０００のプロトコールに従いトランスフェクションを行った。３７℃、５％ＣＯ２培養装置で一夜培養した後、選択培地として４μｇ／ｍｌ ｐｕｒｏｍｙｃｉｎ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を含むＣＨＯ−Ｓ−ＳＦＭＩＩ培地に交換した。３〜４日毎に培地を交換しながら３７℃、５％ＣＯ２培養装置で培養を続けることで選択を行い、形質転換体を得た。
【００５０】
導入したＰ３５遺伝子の効果を調べるために、得られたＰ３５遺伝子形質転換体の一つであるＰ９ＧＤ細胞とその親株である２−２４−４細胞をＣＨＯ−Ｓ−ＳＦＭＩＩ培地１００ｍｌに約１．０ｘ１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌで播種し、ｔｅｃｈｎｅ社製のスピンナーフラスコを用いた約２週間の浮遊培養（回転数４５ｒｐｍ）を行い、増殖曲線、生存率、フィブリノゲン産生量を調べた。その結果、図４に示すように、最大細胞密度でＰ９ＧＤ細胞が２．２ｘ１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌ、２−２４−４細胞が７．２ｘ１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌと約３倍に増加していた。また、Ｐ９ＧＤ細胞が５０％生存率に達するのが２−２４−４細胞に比べ３日遅くなった。結果として、培養１５日目の産生量は、Ｐ９ＧＤ細胞が３６５．２μｇ／ｍｌに対し２−２４−４細胞は１６２．７μｇ／ｍｌとなり約２．２倍に増加した。さらに、ＣＨＯ−Ｓ−ＳＦＭＩＩ培地を基本とし栄養成分を強化した改良型無血清培地を用いて同様にスピナー培養を行ったところ、図５に示すように生存率ではほとんど差が無かったが、最大細胞密度ではＰ９ＧＤ細胞の２．５ｘ１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌに対し、２−２４−４細胞が９．４ｘ１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌと約２．６倍に増加していた。さらに、培養１５日での産生量については、Ｐ９ＧＤ細胞が４６３．７μｇ／ｍｌに対し２−２４−４細胞は２９５．６μｇ／ｍｌとなり約１．６倍に増加した。
【００５１】
Ｐ９ＧＤ細胞のクローニングを行った。ＣＨＯ−Ｓ−ＳＦＭＩＩ培地を基本とした改良型無血清培地に細胞を懸濁し、９６ｗｅｌｌプレートに５０個／２００μｌ／ｗｅｌｌずつ播種することでクローニングを行った。得られたクローンＰ９ＧＤ−１０Ｃについて、Ｐ９ＧＤ細胞と同様にＣＨＯ−Ｓ−ＳＦＭＩＩ培地を基本とし栄養成分を強化した改良型無血清培地を用いて同様にスピナー培養を行ったところ、生存率、到達生細胞密度には差が無く、培養１３日での産生量が６３１．５μｇ／ｍｌとなり、２−２４−４細胞の２３９．８μｇ／ｍｌに対して約２．６倍に増加した（図６）。生存率、生細胞数に差がないことからＰ３５の抗アポトーシス作用ではなく、Ｐ３５のもつタンパク質生合成活性増強作用によって産生量が増大したと考えられた。
課題を解決するための手段の項で述べたように本発明以前に知られていたフィブリノゲンの最大産生量は約１５μｇ／ｍｌであったが、本発明によりＰ３５遺伝子を導入した場合、スピナー培養レベルで６３１．５μｇ／ｍｌとなり、約４２倍の産生量増強効果がもたらされた。また、Ｐ３５遺伝子導入の親株となった２−２４−４細胞の潜在的なフィブリノゲン産生能力が４４０〜１５２０μｇ／ｍｌ以上と推定されているので、Ｐ３５遺伝子が導入された場合には約１．６〜２．６倍の効果があることから、単純計算で約７０４〜３９５２μｇ／ｍｌの潜在的な産生量をもつと推定される。このように、本願発明の方法により確立された細胞がこれまでにないフィブリノゲンを高産生する細胞であることが示された。
【産業上の利用可能性】
【００５２】
本願発明により得られる組換えヒトフィブリノゲン産生細胞は、フィブリノゲンを高産生するので、モノクローナル・ポリクローナル抗体を作製する際の抗原として、あるいは、抗ヒトフィブリノゲン抗体とフィブリノゲンとの結合に関する研究材料として利用できる。更に、本願発明で得られるフィブリノゲンは、血液由来のフィブリノゲンと異なり、フィブリノゲン以外の血液凝固や線溶関連の因子を含まない純粋なフィブリノゲンとして調製可能である。従って、血液凝固・線溶に関連した研究の研究材料としても有用である。また、フィブリノゲンを抗原として単独で又は種々の安定剤、保護剤、防腐剤等の添加物と共に用いることにより、各種疾病に対する病態悪化阻止、予防または治療剤等医薬品の提供を可能ならしめるものである。例えば、ＤＩＣのような、血液凝固因子の消費状態の改善や先天性および後天性のフィブリノゲン欠乏症における補充療法に使用される。
【００５３】
また、本願発明の組換えヒトフィブリノゲンは、フィブリンの膠着性を利用して組織接着剤として、止血、創傷部位の閉鎖、神経、腱、血管や組織などの接着または縫合補強、肺におけるエアーリークの閉鎖など広範にわたる治療、あるいは組織再生を目的とした再生医療の基剤に対する好適な薬として利用される。
このように、本願発明の方法により得られる組換えフィブリノゲン産生細胞及び当該細胞により得られる組換えヒトフィブリノゲンは、医療及び研究分野において多大なる貢献をするものである。
【技術分野】
【０００１】
本願発明は、血漿タンパク質の一つであるフィブリノゲンを多量に生産する組換えフィブリノゲン産生細胞の作製方法に関する。更に詳細には、フィブリノゲンを構成する３種のタンパク質、α鎖（もしくはα鎖の異型）、β鎖及びγ鎖（もしくはγ鎖の異型）をコードする遺伝子を、それぞれの構成比がα鎖（及び／もしくはα鎖の異型）遺伝子及びβ鎖遺伝子の総数に対してγ鎖（及び／もしくはγ鎖の異型）遺伝子の数が等量から１０００倍量となるように、動物細胞に組込む工程、さらには産生量増強因子を組み込む工程を含む当該組換えフィブリノゲン産生細胞の作製方法及び当該方法により得られる組換えフィブリノゲン高産生細胞、及びこれらにより得られたフィブリノゲンに関する。
【背景技術】
【０００２】
フィブリノゲンは、血液凝固因子の一つとして、生体が傷害を受けた時に血液を凝固する働きを担う。第一の機能は損傷部位でフィブリンクロットと呼ばれる血栓の本体を形成することであり、第二の機能は、血小板凝集に必要な粘着タンパク質として働くことである。フィブリノゲンの血中濃度は、通常約３ｍｇ／ｍｌであり、アルブミン、免疫グロブリンＧについで３番目に高い。
【０００３】
フィブリノゲンは、α鎖、β鎖及びγ鎖と呼ばれる３種の異なったポリペプチドを２本ずつ有する計６本のポリペプチドからなる巨大糖蛋白質である。ポリペプチドの個々の分子量はα鎖が約６７０００、β鎖が約５６０００，γ鎖が約４７５００であり、これらが集合したフィブリノゲンの分子量は、約３４００００に達する（非特許文献１参照）。フィブリノゲン分子は、Ｓ−Ｓ結合したα鎖、β鎖及びγ鎖の半分子（α−β−γ）が、さらにＳ−Ｓ結合したダイマー（α−β−γ）２を形成しており、形状的には３つのノジュラー（結節・球状）構造を有している。すなわち、中央のＥ領域とその両外側に対称的に配置された２つのＤ領域、その間をつなぐ桿状部からなる構造をとっている。
【０００４】
血中のフィブリノゲンには、分子サイズの異なる異型ポリペプチドを有することに起因するヘテロな分子が存在する。例えば、γ鎖にはγ’鎖（あるいはγＢ鎖）と呼ばれる異型の存在が報告されており、これは、γ鎖のアミノ酸配列の４０８位に２０個のアミノ酸残基が付加した計４２７個のアミノ酸残基からなるポリペプチドであることが明らかにされている（非特許文献２参照）。また、α鎖にもαＥと呼ばれる異型が存在し、このポリペプチドは、α鎖のアミノ酸配列の６１２位に２３６個のアミノ酸残基が伸長した計８４７個のアミノ酸残基を有することが報告されている（非特許文献３参照）。γ’やαＥを有するヘテロなフィブリノゲンは、通常のフィブリノゲンと比較して、その凝固能、線溶耐性能に顕著な差は認められない。しかしながら、これらの分子種については研究段階にあり、未だ詳細な機能は解明されていない。
【０００５】
フィブリノゲン製剤は、静脈投与するなどの方法により血液中のフィブリノゲン濃度を高めることによって重篤な出血を阻止するのに効果的であり、たとえば敗血症における汎発性血管内凝固症候群（ＤＩＣ）のような、血液凝固因子の消費状態の改善や先天性および後天性のフィブリノゲン欠乏症における補充療法に使用される。
また、フィブリンの膠着性を利用した組織接着剤としても広く利用されている（非特許文献４参照）。この生体由来接着剤は、フィブリノゲンが生体内でゲル化することを利用したもので、止血、創傷部位の閉鎖、神経、腱、血管や組織などの接着または縫合補強、肺におけるエアーリークの閉鎖など広範にわたって使用される。また、近年フィブリノゲンをコラーゲンなどのシートに付着させることにより利便性を高めた製剤も販売されている。
【０００６】
現在、医薬品として用いられているフィブリノゲンはヒト血漿から調製されたもので、その問題点として、１）不特定多数のヒトから集めた血漿を使用するために、ＨＡＶ、ＨＢＶ、ＨＣＶ、ＨＥＶ、ＴＴＶなどの肝炎を引き起こすウイルス、ＨＩＶなどの免疫不全症を引き起こすウイルス、ＣＪＤを引き起こす異常プリオンなどの感染性病原体混入の危険性があること、２）また、日本では血漿は献血によって供給されており、将来的な安定供給が問題視されること、などが挙げられている。
これらの問題を解決するために、従来からフィブリノゲンの組換え化が試みられてきた。例えば、大腸菌では、フィブリノゲンγ鎖の菌体内発現には成功しているが、α鎖、β鎖、γ鎖の３つのタンパク質を同時に発現させ、機能的なフィブリノゲン分子を産生させたとの報告はない。また、酵母を用いた発現系でも一時期分泌発現に成功したとの報告もあったが、最終的には再現性が取れずその報告を取り下げている（非特許文献５参照）。このように、未だ、大腸菌や酵母を用いてフィブリノゲンを発現させることに成功したとの報告はない。
【０００７】
一方、動物細胞では、ＢＨＫ細胞（非特許文献６参照）やＣＯＳ細胞（非特許文献７参照）、ＣＨＯ細胞（非特許文献８、９、１０及び特許文献１参照）を用いて発現が試みられているが、その産生量は、１〜１５μｇ／ｍｌ程度にとどまっている。これらの場合、メタロチオネインプロモーター、Ｒｏｕｓ ｓａｒｃｏｍａ ｖｉｒｕｓ ＬＴＲプロモーター、ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ ２ ｍａｊｏｒ ｌａｔｅプロモーターの何れかを用い、選択マーカーとしてアミノグリコシド３’ホスホトランスフェラーゼ（ｎｅｏ）遺伝子、ジヒドロ葉酸還元酵素（ｄｈｆｒ）遺伝子、ｈｉｓｔｉｄｉｎｏｌ耐性遺伝子の何れか若しくはこれらの組み合わせで使用している。いずれの場合も、α鎖、β鎖、γ鎖を各々コードする遺伝子の発現ベクターを各々単独に構築し、３者で同時にトランスフェクションするか、あるいはα鎖、γ鎖若しくはβ鎖、γ鎖遺伝子を有する各々２つの発現ベクターで先に形質転換した細胞に、後からβ鎖、α鎖遺伝子を有する発現ベクターを導入する方法、さらにはα鎖とγ鎖遺伝子を有するプラスミドとβ鎖遺伝子を有するプラスミドを等量混合して導入する方法がとられている。いずれの場合も特に導入する際の各遺伝子の構成比に関する記載はなく、一般的な手法通りに各遺伝子を均等に導入していると思われる。現在使用されている血液由来のフィブリノゲンを用いた医薬品では、例えば、フィブリン糊製剤では約８０ｍｇ／ｄｏｓｅのフィブリノゲンが使われており、前述の十数μｇ／ｍｌ程度の発現量では製造施設が大規模にならざるを得ず、必然的に高コストになってしまう。遺伝子組換え技術によりフィブリノゲンを実用的なレベルで製造するためには高産生細胞（例えば、フィブリノゲンの発現量が１００μｇ／ｍｌ以上）が必要であるが、現在、これを満足する組換え動物細胞を用いた発現系の報告はみられない。
【０００８】
一方、組換えフィブリノゲン産生細胞を培養する場合には、通常の動物細胞の培養と同様の問題点が考えられる。一般的に、タンパク質が分泌タンパク質の場合、培養上清に目的タンパク質が回収できるので、適当な培地中で組換え動物細胞を培養し、一定期間培養した後、培養上清を一括して回収する（バッチ培養）か、随時適当量の培地の抜き取り、添加を連続的に行う方法（パフュージョン培養）が用いられている。いずれにしても、目的分泌タンパク質を産生する組換え動物細胞の数の増加とともに分泌タンパク質の培地への蓄積（産生）量が増加する。細胞の増殖は、細胞が対数的に増殖する対数期と細胞数が見かけ上一定の定常期、それから細胞が死滅し、数が減少する死滅期の３つの期間に分けられる。分泌タンパク質の産生を増加させるためには、定常期での組換え動物細胞の細胞密度を可能な限り高くし、その期間をできるだけ長く維持することが重要である。特に、バッチ培養の場合、一定量の培地の中で組換え動物細胞を増殖させるので、この中で分泌タンパク質の産生量を伸ばすために定常期の細胞密度を可能な限り高くし、なおかつその時期をできるだけ維持しようと様々な試みがなされてきた。
【０００９】
このような育種的な方法とは別の方法として、宿主細胞を改造する試みも行われてきた。例えば、細胞死抑制因子（ａｎｔｉ−ａｐｏｐｔｏｔｉｃ ｆａｃｔｏｒ）を用いる方法が試みられている。この方法は細胞死抑制因子遺伝子を、タンパク質を産生している組換え動物細胞中で発現させ、その細胞に栄養飢餓などによって生じるプログラムされた細胞死（アポトーシス）を抑制する能力を付与し、定常期を延長しようという試みである。
【００１０】
アポトーシスの起こるメカニズムとして非特許文献１１によれば、次のように考えられている。栄養枯渇などの様々な細胞死刺激が細胞に伝わると転写因子やキナーゼを含む各種タンパク質を介して、そのシグナルはミトコンドリアに伝達される。シグナルをうけたミトコンドリアはアポトーシスシグナル伝達因子（ＡＩＦ、シトクロムｃなど）を細胞質中に放出する。シトクロムｃは細胞質に存在するＡｐａｆ−１（ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ−１）とｐｒｏ−ｃａｓｐａｓｅ−９に結合し複合体を形成し、ｃａｓｐａｓｅ−９を活性化する。活性化されたカスペースカスケードは細胞質内あるいは核内の各種基質を切断し、様々なアポトーシスに特徴的な形態学的、生化学的変化（アクチン分解、ＤＮＡ断片化、染色体凝集など）を誘導する。このようなアポトーシスを抑制する因子としてＢｃｌ−２（Ｂ ｃｅｌｌ ｌｙｍｐｈｏｍａ／ｌｅｕｋｅｍｉａ ２）がよく知られている。Ｂｃｌ−２遺伝子はヒト濾胞性リンパ腫に高頻度に見られる癌遺伝子として発見された。現在Ｂｃｌ−２に相同性の高いドメイン（ＢＨ１−４）をもつ多くのファミリー遺伝子が同定されている。ファミリーにはアポトーシスに抑制的に働く因子と促進的に働く因子があり、抑制的因子として、例えばＢｃｌ−ｘＬ、Ｂｃｌ−ｗ、Ｍｃｌ−１、Ａ１、ＢＨＲＦ１、Ｅ１Ｂ−１９Ｋ、Ｃｅｄ−９などが知られており、前述のシトクロムｃ放出阻害や、Ａｐａｆ−１とｐｒｏｃａｓｐａｓｅ−９に結合することによってシグナル伝達を阻止していると考えられている。このように抑制的なＢｃｌ−２ファミリーはカスペースカスケードの上流で機能すると考えられている。
【００１１】
一方、カスペースカスケードの下流に作用（カスペースの活性を直接的に阻害）して細胞死抑制効果を示す因子も知られている。例えば、バキュロウイルス科に属するＡｃＮＰＶ（Ａｕｔｏｇｒｏｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ ｎｕｃｌｅａｒ ｐｏｌｙｈｅｄｒｏｓｉｓ ｖｉｒｕｓ）のＰ３５タンパク質はカスペースの基質として切断され、その断片がほとんど全てのカスペースと安定的な複合体を形成してその活性を阻害する。従って、種々のアポトーシスを抑制することができる。ＡｃＮＰＶに近縁なＢｍＮＰＶ（Ｂｏｍｂｙｘ ｍｏｒｉ ｎｕｃｌｅａｒ ｐｏｌｙｈｅｄｒｏｓｉｓ ｖｉｒｕｓ）もＰ３５遺伝子を持っている。また、牛痘ウイルスのｃｒｍＡはｃａｓｐａｓｅ−１様プロテアーゼやｃａｓｐａｓｅ−８，−１０に特異的に結合し、これを阻害することによりアポトーシスを抑制できる。また、ヘルペスウイルス由来のｖ−ＦＬＩＰは２つのＤＥＤ（ｄｅａｔｈ ｅｆｆｅｃｔｏｒ ｄｏｍａｉｎ）ドメインを持ち、ＦＡＤＤ（Ｆａｓ−ａｓｓｏｃｉａｔｉｎｇ Ｐｒｏｔｅｉｎ ｗｉｔｈ ｄｅａｔｈ ｄｏｍａｉｎ）と結合することによってｃａｓｐａｓｅ−８の活性化を抑制する。
【００１２】
さらに、バキュロウイルス科のＣｐＧＶ（Ｃｉｄｉａ ｐｏｍｏｎｅｌｌａ ｇｒａｎｕｌｏｓｉｓ ｖｉｒｕｓ）やＯｐＭＮＰＶ（Ｏｒｇｙｉａ ｐｓｅｕｄｏｔｓｕｇａｔａ ｍｕｌｔｉｎｕｃｌｅｏｃａｐｓｉｄ ｎｕｃｌｅｏｐｏｌｙｈｅｄｒｏｖｉｒｕｓ）をはじめとする多くの類縁のウイルスには、Ｐ３５遺伝子とは別に、その発現産物がカスペース活性を直接阻害するｖ−ＩＡＰ（ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｏｆ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ）遺伝子が同定されている。現在までにｖ−ＩＡＰのホモログとして、ウイルス以外にショウジョウバエや哺乳類でｃ−ＩＡＰ１／ｈｉａ−２、ｃ−ＩＡＰ２／ｈｉａ−１、ＸＩＡＰ、ＮＡＩＰ、ｓｕｒｖｉｖｉｎ、ＴＩＡＰ、Ａｐｏｌｌｏｎ、ＤＩＡＰ１、ＤＩＡＰ２、ＳｆＩＡＰ、ＩＴＡなど数種類のＢＩＲ（ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ ＩＡＰ ｒｅｐｅａｔ）を持つＩＡＰファミリーが同定されている。
しかし、カスケードの上流に作用するＢｃｌ−２、Ｂｃｌ−ｘＬ、Ｅ１Ｂ−１９ＫなどのＢｃｌ−２ファミリー由来の細胞死抑制因子を用いた産生量増強方法はいずれも細胞死を抑制し、増殖曲線の定常期を延長することができたにもかかわらず、期待通りには産生量が増加しない場合が多かった。これらのことから、これらの因子には直接的なタンパク質の産生量を増強する効果はないか、あっても特殊な環境下で発揮されると考えられる。一方、カスケードの下流に作用するカスペース阻害作用因子については、組換えタンパク質産生細胞において産生量増強効果との関連を調べたとの報告はほとんどなく、その効果については不明であった。
【特許文献１】Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｐａｔｅｎｔ ６０３７４５７
【非特許文献１】「止血・血栓・線溶」松田、鈴木編集、中外医学社（１９９４）
【非特許文献２】ＣｈｕｎｇＤＥとＤａｖｉｅ ＥＷ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２３，４２３２（１９８４）
【非特許文献３】ＬａｗｒｅｎｃｅＹＦら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３１，１１９６８（１９９２）
【非特許文献４】「特集・生体接着剤」Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ，６，９−７２（１９９７）
【非特許文献５】ＲｅｄｍａｎＣＭ，Ｋｕｄｒｙｋ Ｂ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７４，５５４（１９９９）
【非特許文献６】ＦａｒｒｅｌｌＤＨら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３０，９４１４（１９９１）
【非特許文献７】ＲｏｙＳＮら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６６，４７５８（１９９１）
【非特許文献８】ＬｏｒｄＳＴら，Ｂｌｏｏｄ Ｃｏａｇｕｌ Ｆｉｂｒｉｎｏｌｙｓｉｓ，４，５５（１９９３）
【非特許文献９】ＢｉｎｎｉｅＣＧら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３２，１０７（１９９３）
【非特許文献１０】ＬｏｒｄＳＴら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．３５，２３４２（１９９６）
【非特許文献１１】「アポトーシスと疾患中枢神経系疾患編」水野美邦編、医薬ジャーナル（２０００）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
以上述べてきたように、血液由来のフィブリノゲン製剤の製造・販売においては、感染性病原体の混入や市場への安定供給という点を危惧しなければならない。これらの問題点を解決する為に、遺伝子組換え技術によるフィブリノゲンの生産が試みられているが、これまでに報告されている発現量では、製造コストの面で実用化することが困難と予想され、改善・改良が望まれるところである。さらに、産生量増強に従来用いられてきた定常期延長因子の作用には不明なところが多く、その詳細な検討が要望されていた。
【００１４】
したがって、本願発明は、ヒトフィブリノゲンを高発現する組換えヒトフィブリノゲン高産生細胞の作製方法を提供することを目的とする。
【００１５】
また、本願発明の他の目的は、組換えフィブリノゲン高産生細胞の作製に当たり、バキュロウイルスＰ３５による産生量増強作用の影響を解明し、フィブリノゲンの更なる産生量増強方法を提供することにある。
【００１６】
さらに、本願発明の他の目的は、当該方法により得られる組換えヒトフィブリノゲン高産生細胞及びフィブリノゲンを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
本願発明者らは、上記の目的を達成する為に鋭意研究を重ねた結果、ヒトフィブリノゲンを構成する３種のタンパク質のうち、α鎖（及び／もしくはα鎖の異型）遺伝子及びβ鎖遺伝子の総数に対してγ鎖（及び／もしくはγ鎖の異型）遺伝子の数が等量から１０００倍量となるよう、例えば、α鎖及びγ鎖をコードする遺伝子を組込んだ発現ベクターとβ鎖及びγ鎖をコードする遺伝子を組み込んだ発現ベクターを等量混合し、これを用いて動物細胞を形質転換することにより、容易にヒトフィブリノゲンを高発現する組換え動物細胞を作製できることを見出し、本願発明を完成するに至った。
【００１８】
従って、本願発明は、α鎖及びγ鎖含有発現ベクターとβ鎖及びγ鎖含有発現ベクターを等量混合した発現ベクターを用いて動物細胞を形質転換する工程を含む組換えヒトフィブリノゲン高産生細胞の作製方法を包含する。
【００１９】
さらに、本願発明者らは、別の角度から産生量増強を達成する為に鋭意研究を重ねた結果、動物細胞にさらに、バキュロウイルスＰ３５遺伝子を用いて形質転換させることにより、更なる産生量の増強が図れることを見出した。さらに、この産生量の増強は、この因子が産生量の増強要因としてタンパク質生合成活性の増強に寄与した場合と、アポトーシス活性阻害に寄与した場合との２通りが考えられることを明らかにし、前者の場合は、アポトーシスの発生時期まで待たなくとも産生量の増強が得られるため、培地を選ばず、産業上の利用価値が非常に高いことが判明した。
【００２０】
従って、本願発明は、フィブリノゲン産生細胞に同時または異なる時期にバキュロウイルスＰ３５遺伝子を用いて形質転換させることにより、更なる産生量の増強を図ることができる組換えフィブリノゲン高産生細胞の作製方法を包含する。
【００２１】
また、本願発明は、上記の方法により得られた、ヒトフィブリノゲンを高発現する組換えヒトフィブリノゲン高産生細胞及びフィブリノゲンを包含する。
【発明の効果】
【００２２】
本願発明のヒトフィブリノゲンを構成する３種のタンパク質をコードした遺伝子の混合発現方法によれば、ヒトフィブリノゲンを高発現する組換え産生細胞及びその作製方法が提供される。その結果、約１００〜１５２０μｇ／ｍｌの産生量がもたらされる。本願発明の組換えヒトフィブリノゲン産生細胞が生産するヒトフィブリノゲンの量は、これまでに報告されている遺伝子組換え技術によるフィブリノゲンの発現量（〜１５μｇ／ｍｌ）を大きく上回るものである。さらに、本願発明の産生量増強因子遺伝子による形質転換をおこなった場合は、７０４〜３９５２μｇ／ｍｌという従来技術による産生量を遙かに超えた産生量がもたらされ、今後市場への大量供給が可能となる。さらに、その培養方法には、限定がなく、アポトーシスの到来前でも産生量の増加が図れるので、短期間で大量の産生量を得ることが可能である。故に、本願発明の組換えヒトフィブリノゲン産生細胞は、実用的なレベルでのヒトフィブリノゲンの製造方法の確立を可能にし、当該製造方法が確立されることによってヒトフィブリノゲンの市場への安定供給が確保される。
【００２３】
また、本発明方法より得られる組換えヒトフィブリノゲン産生細胞を用いれば、従来の血液を原料として製造した場合に危惧される感染性病原体の混入やその他の血液由来成分の関与を排除することができ、より安全なヒトフィブリノゲン製剤を効率よく大量に製造・供給することが可能となる。このように本願発明の方法は、ヒト血漿由来以外のフィブリノゲンを高産生する組換えフィブリノゲン産生細胞の作製方法としても利用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】組換えフィブリノゲン産生細胞を作製するための発現ベクターを示した図面である。
【図２】産生されたフィブリノゲンのウエスタンブロットプロファイルの結果を示した図面である。レーン１：Ｍａｒｋｅｒ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｒａｉｎｂｏｗ Ｍａｒｋｅｒ ７５６）、レーン２：Ｂｏｌｈｅａｌ（化血研製：血漿由来のフィブリノゲンを含むバイヤル１を規定通りに溶解し、そのフィブリノゲン量を８０ｍｇ／ｍｌとして計算し、ＰＢＳで希釈した。１μｇ／ｌａｎｅ）、レーン３：ＣＨ００１−１−２培養上清（８μｌ／ｌａｎｅ）、レーン４：ＣＨ００１−１−２培養上清（２４μｌ／ｌａｎｅ）
【図３】バキュロウイルスＰ３５遺伝子発現細胞を作製するための発現ベクターを示した図面である。
【図４】バキュロウイルスＰ３５遺伝子を発現している細胞と発現していない細胞のスピナー培養における細胞密度、生存率、フィブリノゲン産生量についての経時変化を示した図である。
【図５】バキュロウイルスＰ３５遺伝子を発現している細胞と発現していない細胞のスピナー培養における細胞密度、生存率、フィブリノゲン産生量についての経時変化を示した図である。
【図６】バキュロウイルスＰ３５遺伝子を発現している細胞と発現していない細胞のスピナー培養における細胞密度、生存率、フィブリノゲン産生量についての経時変化を示した図である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２５】
本願発明の方法は、フィブリノゲンを構成する３種の蛋白質、α鎖、β鎖及びγ鎖をコードする遺伝子を、各遺伝子の構成比がα鎖（及び／もしくはα鎖の異型）遺伝子及びβ鎖遺伝子の総数に対してγ鎖（及び／もしくはγ鎖の異型）遺伝子の数が等量から１０００倍量となるように動物細胞に組込む工程を含む組換えフィブリノゲン産生細胞の作製方法によって特徴付けられる。さらに、産生量増強因子であるバキュロウイルスＰ３５遺伝子による形質転換によって特徴付けられる。
本願発明では、主としてヒトのフィブリノゲンを取り扱うが、ヒトに限らず他の動物のフィブリノゲン産生細胞を作製する方法としても用いることができる。本願発明で用いるヒトフィブリノゲンの構成ポリペプチド、α鎖、β鎖及びγ鎖をコードする遺伝子としては、最終的に発現産物がアッセンブルしてヒトフィブリノゲン分子を形成できる遺伝子であれば、ｃＤＮＡ及び染色体遺伝子の何れも使用できる。
前述したように、α鎖及びγ鎖には、それぞれαＥ鎖及びγ’（γＢ）鎖と呼ばれる異型が存在する。これらに加えて今後新たに見出されるかもしれない他の異型ポリペプチドをコードする遺伝子も、その発現産物がフィブリノゲン分子を構成するタンパク質として機能するならば、同様に、本願発明に使用することが可能である。
【００２６】
所望の遺伝子は、例えば、文献（Ｒｉｘｏｎ ＭＷら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２２，３２３７（１９８３）、Ｃｈｕｎｇ ＤＷら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２２，３２４４（１９８３）、Ｃｈｕｎｇ ＤＷら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２２，３２５０（１９８３）、非特許文献２、３参照）に各々報告されている配列を元にＰＣＲ用プライマーをデザインし、ヒト肝臓などフィブリノゲンを産生している臓器や細胞由来のｃＤＮＡを鋳型にしてＰＣＲを行うことにより取得できる。
より具体的には、フィブリノゲンのα鎖、β鎖、γ鎖、αＥ鎖及びγ’鎖をコードするｃＤＮＡは、以下のように調製される。まず、ヒト肝細胞から全ＲＮＡを抽出し、この中からｍＲＮＡを精製する。得られたｍＲＮＡをｃＤＮＡに変換した後、それぞれの遺伝子配列に合わせてデザインされたＰＣＲプライマーを用い、ＰＣＲ反応を行い、得られたＰＣＲ産物をプラスミドベクターに組込み大腸菌に導入する。大腸菌コロニーの中から目的の蛋白をコードするｃＤＮＡを有するクローンを選択する。上記の全ＲＮＡの抽出には、市販のＴＲＩｚｏｌ試薬（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ社）、ＩＳＯＧＥＮ（ニッポンジーン社）等の試薬、ｍＲＮＡの精製には、ｍＲＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ａｍｅｒｓｈａｍ ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓ社）などの市販キット、ｃＤＮＡへの変換には、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ｐｌａｓｍｉｄ ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ ｃＤＮＡ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ ｐｌａｓｍｉｄ ｃｌｏｎｉｎｇ（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ社）などの市販のｃＤＮＡライブラリー作製キットがそれぞれ使用される。ヒトフィブリノゲン遺伝子を取得する場合は、市販のｃＤＮＡライブラリー、例えば、Ｈｕｍａｎ Ｌｉｖｅｒ Ｍａｒａｔｈｏｎ−Ｒｅａｄｙ ｃＤＮＡ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）が用いられる。ＰＣＲ用プライマーは、ＤＮＡ合成受託機関（例えばＱＩＡＧＥＮ社）などに依頼すれば容易に入手可能である。この時、５’側にＫＯＺＡＫ配列（Ｋｏｚａｋ Ｍ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１９６，９４７（１９８７））及び適切な制限酵素切断部位の配列を付加することが望ましい。好ましくは、配列番号１から６、１３、１５に記載の合成ＤＮＡがプライマーとして用いられる。ＰＣＲ反応は、市販のＡｄｖａｎｔａｇｅ ＨＦ−２ ＰＣＲ Ｋｉｔ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を用い、添付のプロトコールに従って行えばよい。ＰＣＲにより得られたＤＮＡ断片の塩基配列は、ＴＡクローニングキット（インビトロジェン社）等を用いてクローニングした後、ＤＮＡシークエンサー、例えば、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ３１０ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｚｅｒ（ＰＥバイオシステムズ社）により決定される。
【００２７】
このようにして得られるフィブリノゲン遺伝子、好ましくは、配列番号７から９、１４、１６記載の配列を有する遺伝子断片を用いて動物細胞に組み込む為の発現ベクターが構築される。動物細胞を宿主とする発現ベクターには特段の制約はないが、プラスミド、ウイルスベクター等を用いることができる。当該発現ベクターに含まれるプロモーターは、宿主として用いる動物細胞との組み合わせにより、ＳＶ４０初期、ＳＶ４０後期、サイトメガロウイルスプロモーター、ニワトリβアクチンなど、最終的にアッセンブルしたフィブリノゲンが得られるのであれば如何なるものでも良い。好ましくは、ニワトリβ−アクチンプロモーター系発現プラスミドｐＣＡＧＧ（特開平３−１６８０８７）が使用される。選択や遺伝子増幅のマーカー遺伝子として、アミノグリコシド３’ホスホトランスフェラーゼ（ｎｅｏ）遺伝子やジヒドロ葉酸還元酵素（ｄｈｆｒ）遺伝子、ピューロマイシン耐性酵素遺伝子、グルタミン合成酵素（ＧＳ）遺伝子など一般に知られる選択や遺伝子増幅用のマーカー遺伝子（Ｋｒｉｅｇｌｅｒ Ｍ著、加藤郁之進 監訳、ラボマニュアル動物細胞の遺伝子工学、宝酒造（１９９４））が利用できる。
【００２８】
以上述べた要素を組み合わせて構築される発現ベクターの好ましい例として、γ鎖及びβ鎖をコードする遺伝子を有する発現ベクターとγ鎖及びα鎖をコードする遺伝子を有する発現ベクターが挙げられる。より好ましくは、図１に示すｐＣＡＧＧＤ−ＧＢ（フィブリノゲンγ鎖とβ鎖をコードする遺伝子を１個ずつ持ち、選択マーカーとしてｄｈｆｒ遺伝子を持つ）とｐＣＡＧＧＤＮ５−ＧＡ（フィブリノゲンγ鎖とα鎖をコードする遺伝子を１個ずつ持ち、選択マーカーとしてｄｈｆｒ遺伝子及びｎｅｏ遺伝子を持つ）が挙げられる。この２種類の発現ベクターは、α鎖及びβ鎖遺伝子に対するγ鎖遺伝子の構成比が等量となるように等量混合され、動物細胞に導入される。しかしながら、本願発明はこの例に限定されるものではない。本願発明の最も重要な点は、最終的に宿主細胞に導入されたフィブリノゲンを構成する３種のポリペプチド、α鎖、β鎖及びγ鎖をコードする各遺伝子の宿主細胞内での構成比が、α鎖（及び／もしくはα鎖の異型）遺伝子及びβ鎖遺伝子の総数に対してγ鎖（及び／もしくはγ鎖の異型）遺伝子の数を等量以上になるように組み込むことである。ここで、本願発明において「組み込む」とは、遺伝子を細胞に導入する工程のみならず導入された遺伝子を何らかの方法で遺伝子増幅する工程、最終的に遺伝子が宿主細胞ゲノムにインテグレートされた状態を包含することとする。遺伝子の構成比は、遺伝子を導入する工程やゲノム中に導入された遺伝子を増幅させる工程において調節することが可能である。例えば、ｄｈｆｒ遺伝子を用いてメトトレキセートなどの薬剤を用いて遺伝子増幅を行えば、目的遺伝子の数をゲノム中で数コピーから２０００コピーまで増やすことが可能である（Ｉｍａｎ ＡＭらＪ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．，２６２，７３６８，１９８７；Ｌａｕ ＹＦらＭｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，４，１４６９，１９８４；Ｃｒｏｕｓｅ ＧＦらＭｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，３，２５７，１９８３）。このことは、γ鎖遺伝子選択的にｄｈｆｒ遺伝子を付加して宿主細胞ゲノムに導入し、メトトレキセートなどの薬剤を用いて遺伝子増幅を行えば、γ鎖遺伝子特異的に数コピーから２０００コピーまで遺伝子数を増やすことが可能であることを示しており、技術的に、α鎖β鎖遺伝子の総数に対してそのような等倍から１０００倍の構成比にすることが可能であることを示している。従って、組み込まれる遺伝子の構成比は、α鎖（及び／もしくはα鎖の異型）遺伝子及びβ鎖遺伝子の総数に対してγ鎖（及び／もしくはγ鎖の異型）遺伝子の数を等量〜１０００倍ぐらいまで調節可能である。
【００２９】
また、遺伝子を導入する工程においても、α鎖、β鎖及びγ鎖をコードする遺伝子を用いて動物細胞を形質転換する際に、その導入遺伝子の構成比においてγ鎖が少なくとも他の２つα鎖及びβ鎖をコードする遺伝子に比べ等量から１０００倍量になるように調整して形質転換を行えば良い。中でも最も好ましい比率として等量から３倍量があげられる。これらの要件を満たす方法なら、上記のように各鎖をコードする遺伝子が一つの発現ベクターに存在する必要はなく、例えば、前述したようにα鎖とβ鎖を１個ずつ有する発現ベクターとγ鎖を２個有する発現ベクターとを等量混合して、構成比を１：１：２にし、これを動物細胞に導入することもできる。あるいは、α鎖、β鎖及びγ鎖が単独で発現するように構築した発現ベクターを、それぞれ１：１：２〜６の割合で混合したもので動物細胞を形質転換することもできる。若しくは、一つの発現ベクター内にα鎖、β鎖及びγ鎖の各遺伝子の構成比が１：１：２〜６となるように構築された発現ベクターを用いて動物細胞を形質転換しても良い。さらには、前述の１：１：２〜６の比率に加え、１：２：３〜９、１：３：４〜１２、２：３：５〜１５（あるいは２：１：３〜９、３：１：４〜１２、３：２：５〜１５）など、α鎖（及び／もしくはα鎖の異型）遺伝子及びβ鎖遺伝子の総数に対してγ鎖（及び／もしくはγ鎖の異型）遺伝子の数が等量から３倍量となるような比率であれば、本願発明の要件を満たす。また、全ての遺伝子を同時に動物細胞内に導入するのではなく、別々の時期に選択マーカーを変えて動物細胞に順次導入し、最終的に細胞内に導入されるα鎖、β鎖及びγ鎖の各遺伝子の構成比が前述の比（等倍から１０００倍）になるようにしてもよい。また、先述のように導入工程時には上記比率でなくとも、γ鎖遺伝子を有する発現ベクターにｄｈｆｒやＧＳ遺伝子など遺伝子増幅を可能にする選択マーカーを付加し、細胞内で上記比率（等倍から１０００倍）になるように遺伝子増幅を行っても構わない。
【００３０】
産生量増強因子としてはタンパク質生合成活性を増加させる作用及び／又はカスペースを阻害する作用を持つ因子が使用できるが、その代表例としてバキュロウイルス（ＡｃＮＰＶあるいはＢｍＮＰＶ）のＰ３５遺伝子があげられる。例えば、バキュロウイルス（ＡｃＮＰＶ）Ｐ３５遺伝子は、文献（Ｆｒｉｅｓｅｎ，Ｐ．Ｄ．ａｎｄ Ｍｉｌｌｅｒ，Ｌ．Ｋ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６１，２２６４−２２７２（１９８７））に報告されている配列を元にＰＣＲ用プライマーをデザインし、バキュロウイルス感染細胞やウイルスゲノムそのものを鋳型にしてＰＣＲを行うことにより取得できる。好ましくは、配列番号１０、１１に記載の合成ＤＮＡがプライマーとして用いられる。ＰＣＲ反応は、市販のＡｄｖａｎｔａｇｅ ＨＦ−２ ＰＣＲ Ｋｉｔ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を用い、添付のプロトコールに従って行えばよい。ＰＣＲにより得られたＤＮＡ断片の塩基配列は、ＴＡクローニングキット（インビトロジェン社）等を用いてクローニングした後、ＤＮＡシークエンサー、例えば、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ３１０ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｚｅｒ（ＰＥバイオシステムズ社）により決定される。このようにして得られるＰ３５遺伝子、好ましくは、配列番号１２記載の配列を有する遺伝子断片を用いて動物細胞に組み込む為の発現ベクターが構築される。その好ましい例として図３に示すベクターがあげられる。これらは動物細胞に導入されるが、しかしながら、本願発明はこれらの例に限定されるものではない。バキュロウイルスＰ３５遺伝子に代表される産生量増強作用を持つ因子をコードする遺伝子とフィブリノゲンを構成するα鎖、β鎖、γ鎖の３種の遺伝子に代表される目的とする産生遺伝子が同一細胞内で同時に発現できる形であれば特段の制限はない。バキュロウイルスＰ３５遺伝子をコードする遺伝子の発現ベクターと、フィブリノゲンを構成するα鎖、β鎖、γ鎖の３種の遺伝子の発現ベクターの導入時期や導入の順番にも特段の制限はない。例えば、宿主細胞に産生量増強作用をもつ因子をコードする遺伝子の発現ベクターとフィブリノゲン発現ベクターを同時に導入しても良いし、別々の時期に導入しても構わない。予め宿主細胞に産生量増強作用をもつ因子をコードする遺伝子の発現ベクターを導入して新たな宿主細胞とすれば、より一層汎用性が増す。ただし、産生量増強作用をもつ因子をコードする遺伝子を有する発現ベクターとフィブリノゲン遺伝子を有する発現ベクターとを別々の時期に宿主細胞に導入させる場合には、それぞれの発現ベクターの持つ選択マーカー遺伝子に各々異なったものを使う必要がある。
【００３１】
発現ベクターを導入する宿主細胞として、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞やＳＰ２／０等マウスミエローマ細胞、ＢＨＫ細胞、２９３細胞、ＣＯＳ細胞など様々な動物細胞が利用可能であるが、発現ベクターに使用されるプロモーター、選択及び遺伝子増幅用マーカー遺伝子に合わせて適当な細胞を選択すれば良い。例えば、ニワトリβ−アクチンプロモーター系発現プラスミドを用いて構築した発現ベクターには、ＢＨＫ２１細胞やＣＨＯ細胞ＤＧ４４株などが使用される。
【００３２】
宿主細胞を形質転換するときには公知の方法を利用すればよい。例えば、リン酸カルシウム法、ＤＥＡＥデキストラン法、リポフェクチン系のリポソームを用いる方法、プロトプラストポリエチレングリコール融合法、エレクトロポレーション法などが利用でき、使用する宿主細胞により適当な方法を選択すればよい（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ（３ｒｄ Ｅｄ．），Ｖｏｌ ３，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（２００１））。
【００３３】
形質転換細胞の選択・増殖には、一般に動物細胞を形質転換する時に行われる方法を使用すればよい。例えば、形質転換後の細胞は、ＣＨＯ−Ｓ−ＳＦＭＩＩ培地（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ）、ＩＳ ＣＨＯ−Ｖ培地（アイエスジャパン）、ＹＭＭ培地等無血清培地やＭＥＭアルファ培地、ＲＰＭＩ培地、ダルベッコＭＥＭ培地（いずれもＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ）に５−１０％程度のウシ胎児血清を添加した血清培地などの一般的に動物細胞培養に用いられる培地に、使用する選択マーカーに合わせてメトトレキサート、Ｇ４１８、ピューロマイシン等を添加した選択培地を用いて、適宜培地交換をしながら、３７℃前後で１０〜１４日間程度培養される。この培養により、形質転換されていない細胞は死滅し、形質転換した細胞のみが増殖してくる。更に、形質転換細胞に対して、限界希釈法などの方法により、目的とするフィブリノゲン産生細胞株の選択及びクローン化が行われる。培養方法には、細胞の種類によってフィブリノゲンの検出・発現量の測定には、一般に蛋白質やポリペプチドの検出に用いられる方法、すなわち、ＥＬＩＳＡ，ＲＩＡ，ＷＢ，ＳＤＳ−ＰＡＧＥ等の方法を利用すれば良い。また、フィブリノゲンの活性であるクロッティングを直接測定しても良い。
【００３４】
このようにして得られた本願発明の組換えフィブリノゲン産生細胞は、血清含有の培地中において細胞約５ｘ１０４個／ｍｌで播種し、４日間培養することによって培養液１ｍｌあたり〜約１００μｇのフィブリノゲンを発現し、且つ無血清培地中においてもこのフィブリノゲン産生量を低下することなく増殖することができ、約１．６ｘ１０５個／ｍｌで播種し、約２週間のスピナー培養で培養液１ｍｌあたり〜約２７０μｇの産生量（潜在的な産生量として〜１５２０μｇ／ｍｌ）を達成できる有用な細胞である。また、さらに従来技術によるフィブリノゲンの産生量は最大約１５μｇ／ｍｌであったが、本発明によりＰ３５遺伝子を導入した場合スピナー培養レベルで約４２倍の産生量増強効果がもたらされた。また、Ｐ３５遺伝子が導入された場合には単純計算で約７０４〜３９５２μｇ／ｍｌの潜在的な産生量をもつと推定される。
従来のアポトーシス抑制活性による産生増強効果は、栄養状態の悪くなる培養後期、酪酸などのように細胞毒性を示す濃度域で発現増強活性を示すような薬剤や細胞毒性を示すような何らかの因子との混合培養などタンパク質産生細胞にアポトーシスを誘導する条件下での培養に置いて最も良く効果を示すと考えられてきた。本願発明は、このような特殊条件下でなく、一般的な培養条件下、すなわち通常の生存率が低下しない時期での培養にも効果を発揮する。この点が、これまでのアポトーシス抑制因子による産生量増強とは明確に異なる。本願発明は、フェドバッチ培養、パフュージョン培養など育種方法との併用も可能であるので組換え細胞のフィブリノゲン産生能をさらに増強することができる。ゆえに本発明は、従来では、動物細胞では生産が難しく、産業化が難しかったフィブリノゲン生産の事業化ならびに、すでに事業化されているフィブリノゲン生産においても更なる産生量増強による大幅なコストダウンを可能にするものである。
以下に、実施例を挙げて本願発明をさらに具体的に説明するが、この例示に限定されるものではない。なお、以下に示す実施例では、特に断りのない限り、和光純薬、宝酒造、東洋紡およびＮｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ社、アマシャムファルマシア社、バイオラド社、シグマ社、ギブコＢＲＬ社製の試薬を使用した。
【実施例１】
【００３５】
（フィブリノゲン遺伝子の単離）
ヒトフィブリノゲン遺伝子は、Ｈｕｍａｎ Ｌｉｖｅｒ Ｍａｒａｔｈｏｎ−Ｒｅａｄｙ ｃＤＮＡ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）をテンプレートとし、プライマーとしてＫｏｚａｋ配列および必要な酵素ｓｉｔｅを加えたものをα鎖、β鎖、γ鎖用にそれぞれ２本ずつ作製し（配列番号１〜６）、Ａｄｖａｎｔａｇｅ ＨＦ−２ ＰＣＲ Ｋｉｔ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を用いてキットのプロトコールに従ってＰＣＲ反応を行った。この結果、α鎖、β鎖、γ鎖それぞれにＰＣＲ増幅のバンドが検出された。そのサイズは既知のα鎖、β鎖、γ鎖ｃＤＮＡ遺伝子のサイズと一致していたため、これらの遺伝子をＴＡクローニングキット（インビトロジェン）を用いてクローニング（各々ｐＦｂｇＡ、ｐＦｂｇＢ、ｐＦｂｇＧ）し、その塩基配列の決定をＡＢＩ ＰＲＩＳＭ３１０ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｚｅｒ（ＰＥバイオシステムズ）を用いて行った。その結果、配列番号７〜９にそれぞれ示すＦｂｇＡ、ＦｂｇＢ、ＦｂｇＧ遺伝子が得られた。
【実施例２】
【００３６】
（フィブリノゲン遺伝子発現ベクターの構築）
本実施例に用いたフィブリノゲンβ鎖及びγ鎖遺伝子発現ベクターｐＣＡＧＧＤ−ＧＢならびに、フィブリノゲンα鎖及びγ鎖遺伝子発現ベクターｐＣＡＧＧＤＮ５−ＧＡは以下のようにして構築した。ｐＣＡＧＧＤ−ＧＢについては、まず、ｐＣＡＧＧ−Ｓ１ ｄｈｆｒ（ＷＯ ０３／００４６４１）をＢａｍＨＩにて消化し、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼによる末端平滑化を行い、リン酸化ＮｏｔＩリンカー（宝）を用いてｌｉｇａｔｉｏｎすることによりｐＣＡＧＧ−Ｓ１ ｄｈｆｒＮを構築し、これのＳａｌＩサイトにｐＦｂｇＧ由来のＦｂｇＧ遺伝子のＳａｌＩ断片を組込み、ｐＣＡＧＧＤ−Ｇを構築した。さらに、ｐＣＡＧＧ（Ｘｈｏ）（ＷＯ ０３／００４６４１）をＳａｌＩで消化し、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼによる末端平滑化を行い、リン酸化ＮｏｔＩリンカー（宝）を用いてｌｉｇａｔｉｏｎすることによりｐＣＡＧＧ（Ｘｈｏ）Ｎを構築し、このプラスミドのＸｂａＩ−ＢａｍＨＩサイトに、ｐＣＡＧＧ−Ｓ１（ＷＯ ０３／００４６４１）のＳａｌＩを含むＸｂａＩ−ＢａｍＨＩ断片を組込み、得られたプラスミドのＢａｍＨＩサイトを消化し、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼによる末端平滑化を行い、リン酸化ＮｏｔＩリンカー（宝）を用いてｌｉｇａｔｉｏｎすることによりｐＣＡＧＧ−Ｓ１ ２Ｎを構築した。このｐＣＡＧＧ−Ｓ１ ２ＮのＳａｌＩサイトにｐＦｂｇＢ由来のＦｂｇＢ遺伝子のＳａｌＩ断片を組込み、ｐＣＡＧＧ−Ｂを構築した。ｐＣＡＧＧＤ−ＧのＮｏｔＩサイトにｐＣＡＧＧ−ＢのＦｂｇＢ遺伝子を含むＮｏｔＩ断片を組込み、最終的なフィブリノゲンβ鎖とγ鎖の発現ベクターｐＣＡＧＧＤ−ＧＢ（図１）を構築した。
【００３７】
一方、ｐＣＡＧＧＤＮ５−ＧＡについては、最初にｐＣＡＧＧ−Ｓ１ ｄｈｆｒ ｎｅｏ（ＷＯ ０３／００４６４１）を不完全なＢａｍＨＩ消化を行い、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼによる末端平滑化後、そのまま自己ｌｉｇａｔｉｏｎすることにより２つあるＢａｍＨＩサイトのうちｎｅｏ遺伝子の３’側にあるＢａｍＨＩサイトを欠失させ、さらにＢａｍＨＩで消化して、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼによる末端平滑化後、リン酸化ＮｏｔＩリンカー（宝）を用いてｌｉｇａｔｉｏｎすることによりｐＣＡＧＧ−Ｓ１ ｄｈｆｒ ｎｅｏＮ（ｐＣＡＧＧＤＮ５−ＮｏｔＩ）を構築した。このｐＣＡＧＧ−Ｓ１ ｄｈｆｒ ｎｅｏＮのＳａｌＩサイトにｐＦｂｇＧ由来のＦｂｇＧ遺伝子を含むＳａｌＩ断片を挿入して構築したプラスミドのＮｏｔＩサイトに、ｐＣＡＧＧ−Ｓ１ ２ＮのＳａｌＩサイトにｐＦｂｇＡ由来のＦｂｇＡ遺伝子を含むＳａｌＩ断片を挿入して構築したｐＣＡＧＧ−ＡのＦｂｇＡ遺伝子を含むＮｏｔＩ断片を組込み、ｐＣＡＧＧＤＮ５−ＧＡ（図１）を構築した。
【実施例３】
【００３８】
（組換えフィブリノゲン発現細胞の作製：発現ベクターの細胞への導入、遺伝子増幅、クローニング）
実施例２で構築したフィブリノゲン発現プラスミドｐＣＡＧＧＤ−ＧＢ及びｐＣＡＧＧＤＮ５−ＧＡを用いて以下に述べる方法にて、ＣＨＯ ＤＧ４４（Ｕｒｌａｕｂ Ｇら，Ｓｏｍａｔｉｃ ｃｅｌｌ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．，１２，５５５（１９８６）、以下ＣＨＯ）細胞を形質転換した。形質転換の前日にＣＨＯ細胞を６ｗｅｌｌプレートに１−０．５×１０５ｃｅｌｌｓ／２ｍｌ／ｗｅｌｌの細胞密度で１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ、ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ社製）を含むＹＭＭ培地（インシュリン・トランスフェリン・エタノールアミン・亜セレン酸ナトリウムを含むアミノ酸・ビタミンを強化した核酸不含ＭＥＭアルファ培地）を用い播種した。３７℃、５％ＣＯ２培養装置で一夜培養の後、リポソーム系形質転換試薬、ＴｒａｎｓＩＴ−ＬＴ１（宝）あるいはリポフェクトアミン２０００（インビトロジェン）を用いて、あらかじめフィブリノゲン発現プラスミドｐＣＡＧＧＤ−ＧＢ及びｐＣＡＧＧＤＮ５−ＧＡを各々等量混合し、ＰｖｕＩで消化・線状化しておいたものを導入ＤＮＡとして、それぞれのプロトコールに従いトランスフェクションを行った。３７℃、５％ＣＯ２培養装置で一夜培養した後、選択培地、１０％透析ＦＣＳ（ｄ−ＦＣＳ：ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ社製）、０．５ｍｇ／ｍｌ Ｇｅｎｅｔｉｃｉｎ（Ｇ４１８：ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ社製）、１００ｎＭメトトレキサート（ＭＴＸ：和光純薬工業製）を含むＹＭＭ培地、あるいは１０％ ｄ−ＦＣＳ、０．５ｍｇ／ｍｌ Ｇ４１８を含むＹＭＭ培地に培地交換した。３〜４日毎に培地を交換しながら３７℃、５％ＣＯ２培養装置で培養を続けることで選択を行い、形質転換体を得た。
【００３９】
得られた形質転換細胞のフィブリノゲン産生をＥＬＩＳＡにて測定した。ＥＬＩＳＡは以下に示す手順にて実施した。ＰＢＳ（１３７ｍＭ ＮａＣｌ，８ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４−１２Ｈ２Ｏ，２．７ｍＭ ＫＣｌ，１．５ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４）で１０μｇ／ｍｌに調製した抗ヒトフィブリノゲン・ウサギポリクローナル抗体（Ｄａｋｏ Ｃｙｔｏｍａｔｉｏｎ）１００μｌをイムノモジュールプレート（ヌンク Ｃ８−４４５１０１）にアプライし、４℃に一晩置くことで固相化を行った。固相化したプレートの抗体溶液を除き、ＰＢＳ ３９０μｌにて３回洗浄した。続いて、ＰＢＳで４倍に希釈したブロックエース（大日本製薬）を３７０μｌアプライし、室温で３０分から２時間、ブロッキングを行った。ブロッキング後、ブロッキング液を除き、サンプル（培養上清）およびスタンダードを１００μｌアプライした。サンプル（フィブリノゲン産生細胞の培養上清）は、ＰＢＳで１０倍に希釈したブロックエースを用いて１００〜８００倍に希釈した。スタンダードには、Ｂｏｌｈｅａｌ（化血研製：血漿由来のフィブリノゲンを含むバイヤル１を規定通りに溶解し、そのフィブリノゲン量を８０ｍｇ／ｍｌとして計算し、ＰＢＳで１ｍｇ／ｍｌに希釈した。）をサンプルと同じ希釈液にて１００ｎｇ／ｍｌ〜１ｎｇ／ｍｌに希釈したものを用いた。サンプルおよびスタンダードは、プレートにアプライ後、３７℃で１時間反応させた。反応終了後、洗浄液（０．０５％ Ｔｗｅｅｎ−２０／ＰＢＳ）３９０μｌにて４回洗浄を行い、続いて、サンプル希釈に用いた溶液（ＰＢＳで１０倍に希釈したブロックエース）で８０００倍に希釈した抗ヒトフィブリノゲン・ウサギポリクローナル抗体・パーオキシダーゼ標識を１００μｌアプライし、３７℃で１時間反応させた。反応終了後、洗浄液（０．０５％ Ｔｗｅｅｎ−２０／ＰＢＳ）３９０μｌにて４回洗浄を行った。発色は、ＴＭＢ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ Ｋｉｔ（Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ＆Ｐｅｒｒｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．）１００μｌをアプライし、暗所で３０分静置後、１規定硫酸１００μｌで反応を停止した。反応停止後３０分以内に、プレートリーダー（モレキュラーデバイス）にて、４５０ｎｍ−６５０ｎｍの吸光度を測定し、検量線からフィブリノゲン濃度を求めた。
【００４０】
このＥＬＩＳＡにてフィブリノゲン産生能の高い形質転換細胞を選び出し、次にＭＴＸ遺伝子増幅を行った。１０％ ｄ−ＦＣＳ、０．５ｍｇ／ｍｌ Ｇ４１８を含み、段階的にＭＴＸ濃度を上げたＹＭＭ培地に細胞を懸濁し、２４ｗｅｌｌプレートに５ｘ１０４ｃｅｌｌｓ／０．５ｍｌ／ｗｅｌｌにて播種し、３〜４日毎に培地を交換しながら３７℃、５％ＣＯ２培養装置で培養を続けることで選択を行い、高濃度のＭＴＸに耐性の形質転換体を得た。表１にその代表的な結果を示す（表中「＊」：細胞がコンフル時に新しい培地に完全に交換し、一夜培養した培養上清中の産生量）。
【００４１】
【表１】
【００４２】
このような組換えフィブリノゲン産生細胞のクローニングを行った。１０％ ｄ−ＦＣＳ、０．５ｍｇ／ｍｌ Ｇ４１８、１００ｎＭ ＭＴＸを含むＹＭＭ培地に細胞を懸濁し、９６ｗｅｌｌプレートに１個／ｗｅｌｌの濃度で２００μｌ／ｗｅｌｌずつ播種することで限界希釈によるクローニングを行った。得られたクローンについて、コンフル時に新しい培地に完全に交換し、一夜培養した培養上清中の産生量を調べたところ、〜５６．８μｇ／ｍｌに達するクローンが得られた。その中の一つのクローンＣＨ００２−２４−４を１０％ ｄ−ＦＣＳ、０．５ｍｇ／ｍｌ Ｇ４１８、１００ｎＭ ＭＴＸを含むＹＭＭ培地に細胞を懸濁し、６ｗｅｌｌプレートに２ｘ１０５ｃｅｌｌｓ／２ｍｌ／ｗｅｌｌで播種し、４日間の培養を行い、培養上清中のフィブリノゲンの量をＥＬＩＳＡ法にて測定したところ、１０３．３μｇ／ｍｌに達しており、組換え動物細胞によるフィブリノゲンの産生量として１００μｇ／ｍｌのオーダーを初めて超えたことを示した。
【実施例４】
【００４３】
（産生されたフィブリノゲンのウエスタンブロット解析）
産生されたフィブリノゲンのウエスタンブロットを行った。フィブリノゲン・サンプルとして、ＣＨ００１−１−２細胞を２×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌの密度で１０％ ｄ−ＦＣＳを含むＹＭＭ培地を用い播種し、一夜培養し、翌日培地を、ＦＣＳを含まないＹＭＭ培地に交換し、３７℃、５％ＣＯ２培養装置で４日間培養後、その培養上清中に存在するフィブリノゲンを解析に用いた。
サンプルを５ｘＳＤＳ処理バッファー（０．３１２５Ｍ Ｔｒｉｓ，５％ ＳＤＳ，２５％グリセロール，０．０５％ブロモフェノールブルー，５％ ２−メルカプトエタノールｐＨ６．８）と１：４で混合し、１００℃、５分間ボイルした。これらのサンプルをゲルとしてパジェル５−２０％（ＡＴＴＯ）を使用し、泳動条件として４０ｍＡ定電流、１．５時間で電気泳動を行った。泳動後、ゲルとＩｍｍｏｂｉｌｏｎ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｍｅｍｂｒａｎｅｓ（以下Ｍｅｍｂｒａｎｅ：ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ）を密着させ、ホライズブロット（ＡＴＴＯ）を用いて１００ｍＡ定電流、２５分間でＭｅｍｂｒａｎｅに泳動タンパク質をトランスファーした。Ｍｅｍｂｒａｎｅはブロックエース（大日本製薬）原液で１時間室温にてブロッキングし、次に抗ヒトフィブリノーゲン・ウサギポリクローナル抗体（Ｄａｋｏ Ｃｙｔｏｍａｔｉｏｎ）０．５５μｇ／ｍｌを含む１０％ブロックエース，０．０５％ Ｔｗｅｅｎ−２０／ＴＢＳ（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ，１５０ｍＭ ＮａＣｌ ｐＨ７．５）に浸し、３７℃、３０分間振盪した。さらに０．０５％ Ｔｗｅｅｎ−２０／ＴＢＳで５分振盪を３回繰り返して洗浄した後、さらにＴＢＳで３回洗浄し、ブロックエース（大日本製薬）原液で５分間室温にてブロッキングした。続いて、１０％ブロックエース，０．０５％ Ｔｗｅｅｎ−２０／ＴＢＳにて３０００倍に希釈されたＧｏａｔ Ａｎｔｉ−Ｒａｂｂｉｔ ＩｇＧ−Ａｌｋａｌｉｎｅ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ（ＢＩＯＳＯＵＲＣＥ）溶液に浸し、３７℃、３０分間振盪した。０．０５％ Ｔｗｅｅｎ−２０／ＴＢＳで５分振盪を３回繰り返して洗浄した後、さらにＴＢＳで３回洗浄し、Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（ＫＰＬ）で発色させた。
その結果を図２に示す。還元下において、ＣＨ００１−１−２培養上清中に産生されたフィブリノゲンは血漿由来のフィブリノゲンを含むボルヒールと同じサイズの蛋白があることが確認された。また、これら３本のバンドは既知のフィブリノゲン各鎖の分子量と一致していた（α鎖；６６ｋＤａ、β鎖；５２ｋＤａ、γ鎖；４６．５ｋＤａ）。
【実施例５】
【００４４】
（組換えフィブリノゲン産生細胞の無血清培養）
組換えフィブリノゲン産生細胞の無血清培養時の産生能を調べた。実施例３において１００μｇ／ｍｌ以上の産生量を示したクローンＣＨ００２−２４−４を、ＰＢＳにて２回洗浄後、表２に示す培地（ＣＨＯ−Ｓ−ＳＦＭＩＩ、ＩＳ ＣＨＯ−Ｖは無血清培地、１０％ｄ−ＦＣＳ／ＹＭＭは血清培地）にそれぞれ懸濁し、１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌで２ｍｌ／ｗｅｌｌ ｏｆ ６ｗｅｌｌプレートで播種し、４日間培養を行い、得られた細胞数のカウントと培養上清中のフィブリノゲン産生量を前述のＥＬＩＳＡにて測定した。その結果、表２に示すように、１ｘ１０４ｃｅｌｌｓ当たりのフィブリノゲン産生能は、血清培地（１０％ｄ−ＦＣＳを含むＹＭＭ培地）を用いた場合より高く、無血清培地でも血清培地と同等以上の産生能力があることが示された。このことは、一般的な高密度培養の場合１〜２ｘ１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌは達成可能であるので、培養条件さえ良ければ、単純計算で約４４０〜１５２０μｇ／ｍｌ以上のフィブリノゲンを産生させる潜在能力があることを示している。
【００４５】
【表２】
【００４６】
さらに、このＣＨＯ−Ｓ−ＳＦＭＩＩ培地で増殖したＣＨ００２−２４−４細胞を、同じくＣＨＯ−Ｓ−ＳＦＭＩＩを基本とした無血清培地１００ｍｌに１．６ｘ１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌで播種し、ｔｅｃｈｎｅ社製のスピンナーフラスコを用いた約２週間の浮遊培養（回転数４５ｒｐｍ）で２７２．７μｇ／ｍｌという、産生量を達成した。また、別クローンＣＨ００４−２Ａ４−３細胞を同じく、ＣＨＯ−Ｓ−ＳＦＭＩＩを基本とした無血清培地１００ｍｌに８ｘ１０４ｃｅｌｌｓ／ｍｌで播種し、ｔｅｃｈｎｅ社製のスピンナーフラスコを用いた約２週間の浮遊培養（回転数４５ｒｐｍ）で９８．２μｇ／ｍｌを達成している。このように、本願発明の方法により確立した細胞が、フィブリノゲン産生に関して無血清培地で〜約２７０μｇ／ｍｌの産生量を達成し、これまでにない高産生細胞であることが示された。
【実施例６】
【００４７】
（Ｐ３５遺伝子のクローニングと発現ベクター構築）
バキュロウイルスＡｃＮＰＶ（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ ｎｕｃｌｅａｒ ｐｏｌｙｈｅｄｏｒｏｓｉｓ ｖｉｒｕｓ：Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎより購入）由来のウイルス液（２ｘ１０７ｐｆ／ｍｌ）からプロテナーゼＫ処理、フェノール抽出によりウイルスゲノムを調製し、これを鋳型として、プライマーとしてＫｏｚａｋ配列および必要な酵素ｓｉｔｅを加えたものを５’用、３’用の２本作製し（配列番号１０、１１）、Ａｄｖａｎｔａｇｅ ＨＦ−２ ＰＣＲ Ｋｉｔ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を用いてＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ産物のサイズは既知のＰ３５遺伝子のサイズと一致していたため、これをＴＡクローニング（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）した。得られたプラスミドについて、その塩基配列の決定をＡＢＩ ＰＲＩＳＭ３１０ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｚｅｒ（ＰＥバイオシステムズ）を用いて行った結果、文献（Ｆｒｉｅｓｅｎ ＰＤ，Ｍｉｌｌｅｒ ＬＫ．，Ｊ Ｖｉｒｏｌ．６１（７）：２２６４−７２．１９８７）の配列と同じ配列を持ったＰ３５遺伝子クローン（配列番号１２）が得られた。
【００４８】
すでにフィブリノゲンを発現している細胞にＰ３５遺伝子を導入するために、まず選択マーカーとしてｐｕｒｏｍｙｃｉｎ耐性遺伝子をもったベクターを構築した。２３番目のセリンをアルギニンに変換した変異ＤＨＦＲを持った発現プラスミドｐＣＡＧＧ−Ｓ１ ｍｄｈｆｒ（ＷＯ ０３／００４６４１）のＳａｐＩ、ＮｏｔＩサイト間にＢａｍＨＩサイトを挿入するために、ＧＧＣ ＣＧＣ ＧＧＡ ＴＣＣ ＧＣＴ ＣＴＴ ＣＣ及びＡＧＣ ＧＧＡ ＡＧＡ ＧＣＧ ＧＡＴ ＣＣＧ Ｃの２つのリンカーを合成し、リンカーライゲーションを行い、ｐＣＡＧＧＭ５を構築した。さらに、ｐＣＡＧＧＭ５のＢａｍＨＩ消化を行い、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼによる末端平滑化後、ＸｈｏＩリンカー（宝）を用いたリンカーライゲーションさせることによりＸｈｏＩを導入した。このプラスミドのＸｈｏＩサイトにｐＰＧＫＰｕｒｏ（Ｗａｔａｎａｂｅ，Ｓ．，Ｋａｉ，Ｎ．，Ｙａｓｕｄａ，Ｍ．，Ｋｏｈｍｕｒａ，Ｎ．，Ｓａｎｂｏ，Ｍ．，Ｍｉｓｈｉｎａ，Ｍ．，ａｎｄ Ｙａｇｉ，Ｔ．（１９９５）．）のｐｕｒｏｍｙｃｉｎ耐性遺伝子を含むＳａｌＩ断片を挿入してｐＣＡＧＧＭＰ５−ＮｏｔＩを構築した。次にこのプラスミドから変異ＤＨＦＲ（ｍｄｈｆｒ）遺伝子を含むＳａｌＩ−ＮｏｔＩ断片を除き、代わりにｐＣＡＧＧＤＮ５−ＮｏｔＩのＤＨＦＲ遺伝子を含むＳａｌＩ−ＮｏｔＩ断片を挿入してｐＣＡＧＧＤＰ５−ＮｏｔＩを構築した。ｐＣＡＧＧＤＰ５−ＮｏｔＩのＳａｌＩサイトにＰＣＲクローニングしたＰ３５遺伝子のＸｈｏＩ断片を挿入し、目的のｐＣＡＧＧＤＰ５−Ｐ３５（図３）を構築した。
【実施例７】
【００４９】
（Ｐ３５遺伝子形質転換細胞）
実施例６で構築したＰ３５発現プラスミドｐＣＡＧＧＤＰ５−Ｐ３５を用いて以下に述べる方法にて、実施例３で得られた組換えフィブリノゲン産生クローン、ＣＨ００２−２４−４細胞を形質転換した。ＣＨ００２−２４−４細胞を１２ｗｅｌｌプレートに１−０．５×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌ／ｗｅｌｌの細胞密度でＣＨＯ−Ｓ−ＳＦＭＩＩ培地（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ）を用い播種した。リポソーム系形質転換試薬であるリポフェクトアミン２０００（インビトロジェン）を用いて、あらかじめＰ３５発現プラスミドｐＣＡＧＧＤＰ５−Ｐ３５をＰｖｕＩで消化・線状化しておいたものを導入ＤＮＡとして、リポフェクトアミン２０００のプロトコールに従いトランスフェクションを行った。３７℃、５％ＣＯ２培養装置で一夜培養した後、選択培地として４μｇ／ｍｌ ｐｕｒｏｍｙｃｉｎ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を含むＣＨＯ−Ｓ−ＳＦＭＩＩ培地に交換した。３〜４日毎に培地を交換しながら３７℃、５％ＣＯ２培養装置で培養を続けることで選択を行い、形質転換体を得た。
【００５０】
導入したＰ３５遺伝子の効果を調べるために、得られたＰ３５遺伝子形質転換体の一つであるＰ９ＧＤ細胞とその親株である２−２４−４細胞をＣＨＯ−Ｓ−ＳＦＭＩＩ培地１００ｍｌに約１．０ｘ１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌで播種し、ｔｅｃｈｎｅ社製のスピンナーフラスコを用いた約２週間の浮遊培養（回転数４５ｒｐｍ）を行い、増殖曲線、生存率、フィブリノゲン産生量を調べた。その結果、図４に示すように、最大細胞密度でＰ９ＧＤ細胞が２．２ｘ１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌ、２−２４−４細胞が７．２ｘ１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌと約３倍に増加していた。また、Ｐ９ＧＤ細胞が５０％生存率に達するのが２−２４−４細胞に比べ３日遅くなった。結果として、培養１５日目の産生量は、Ｐ９ＧＤ細胞が３６５．２μｇ／ｍｌに対し２−２４−４細胞は１６２．７μｇ／ｍｌとなり約２．２倍に増加した。さらに、ＣＨＯ−Ｓ−ＳＦＭＩＩ培地を基本とし栄養成分を強化した改良型無血清培地を用いて同様にスピナー培養を行ったところ、図５に示すように生存率ではほとんど差が無かったが、最大細胞密度ではＰ９ＧＤ細胞の２．５ｘ１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌに対し、２−２４−４細胞が９．４ｘ１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌと約２．６倍に増加していた。さらに、培養１５日での産生量については、Ｐ９ＧＤ細胞が４６３．７μｇ／ｍｌに対し２−２４−４細胞は２９５．６μｇ／ｍｌとなり約１．６倍に増加した。
【００５１】
Ｐ９ＧＤ細胞のクローニングを行った。ＣＨＯ−Ｓ−ＳＦＭＩＩ培地を基本とした改良型無血清培地に細胞を懸濁し、９６ｗｅｌｌプレートに５０個／２００μｌ／ｗｅｌｌずつ播種することでクローニングを行った。得られたクローンＰ９ＧＤ−１０Ｃについて、Ｐ９ＧＤ細胞と同様にＣＨＯ−Ｓ−ＳＦＭＩＩ培地を基本とし栄養成分を強化した改良型無血清培地を用いて同様にスピナー培養を行ったところ、生存率、到達生細胞密度には差が無く、培養１３日での産生量が６３１．５μｇ／ｍｌとなり、２−２４−４細胞の２３９．８μｇ／ｍｌに対して約２．６倍に増加した（図６）。生存率、生細胞数に差がないことからＰ３５の抗アポトーシス作用ではなく、Ｐ３５のもつタンパク質生合成活性増強作用によって産生量が増大したと考えられた。
課題を解決するための手段の項で述べたように本発明以前に知られていたフィブリノゲンの最大産生量は約１５μｇ／ｍｌであったが、本発明によりＰ３５遺伝子を導入した場合、スピナー培養レベルで６３１．５μｇ／ｍｌとなり、約４２倍の産生量増強効果がもたらされた。また、Ｐ３５遺伝子導入の親株となった２−２４−４細胞の潜在的なフィブリノゲン産生能力が４４０〜１５２０μｇ／ｍｌ以上と推定されているので、Ｐ３５遺伝子が導入された場合には約１．６〜２．６倍の効果があることから、単純計算で約７０４〜３９５２μｇ／ｍｌの潜在的な産生量をもつと推定される。このように、本願発明の方法により確立された細胞がこれまでにないフィブリノゲンを高産生する細胞であることが示された。
【産業上の利用可能性】
【００５２】
本願発明により得られる組換えヒトフィブリノゲン産生細胞は、フィブリノゲンを高産生するので、モノクローナル・ポリクローナル抗体を作製する際の抗原として、あるいは、抗ヒトフィブリノゲン抗体とフィブリノゲンとの結合に関する研究材料として利用できる。更に、本願発明で得られるフィブリノゲンは、血液由来のフィブリノゲンと異なり、フィブリノゲン以外の血液凝固や線溶関連の因子を含まない純粋なフィブリノゲンとして調製可能である。従って、血液凝固・線溶に関連した研究の研究材料としても有用である。また、フィブリノゲンを抗原として単独で又は種々の安定剤、保護剤、防腐剤等の添加物と共に用いることにより、各種疾病に対する病態悪化阻止、予防または治療剤等医薬品の提供を可能ならしめるものである。例えば、ＤＩＣのような、血液凝固因子の消費状態の改善や先天性および後天性のフィブリノゲン欠乏症における補充療法に使用される。
【００５３】
また、本願発明の組換えヒトフィブリノゲンは、フィブリンの膠着性を利用して組織接着剤として、止血、創傷部位の閉鎖、神経、腱、血管や組織などの接着または縫合補強、肺におけるエアーリークの閉鎖など広範にわたる治療、あるいは組織再生を目的とした再生医療の基剤に対する好適な薬として利用される。
このように、本願発明の方法により得られる組換えフィブリノゲン産生細胞及び当該細胞により得られる組換えヒトフィブリノゲンは、医療及び研究分野において多大なる貢献をするものである。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
フィブリノゲンを高産生する組換えフィブリノゲン産生細胞を作製する方法であって、フィブリノゲンを構成するポリペプチドであるα鎖（及び／もしくはα鎖の異型）、β鎖及びγ鎖（及び／もしくはγ鎖の異型）をコードする遺伝子を、γ鎖（及び／もしくはγ鎖の異型）遺伝子の数がα鎖（及び／もしくはα鎖の異型）遺伝子及びβ鎖遺伝子の総数の１〜１０００倍量となるように、動物細胞に組込むことを特徴とする組換えフィブリノゲン高産生細胞作製方法。
【請求項２】
γ鎖遺伝子の数がα鎖遺伝子及びβ鎖遺伝子の総数と同じであることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項３】
α鎖及びγ鎖をコードする遺伝子を有するベクターとβ鎖及びγ鎖をコードする遺伝子を有する発現ベクターとを混合して用いることを特徴とする請求項１又は２記載の方法。
【請求項４】
α鎖及びγ鎖をコードする遺伝子を各１個ずつ有するベクターとβ鎖及びγ鎖をコードする遺伝子を各１個ずつ有する発現ベクターとを等量混合して用いることを特徴とする請求項３記載の方法。
【請求項５】
図１に記載の発現ベクターｐＣＡＧＧＤ−ＧＢ及びｐＣＡＧＧＤＮ５−ＧＡを等量混合し、これを動物細胞に組込むことを特徴とする請求項１ないし４の何れかに記載の方法。
【請求項６】
α鎖及びβ鎖をコードする遺伝子を有するベクターとγ鎖をコードする遺伝子を有する発現ベクターとを混合して用いることを特徴とする請求項１又は２記載の方法。
【請求項７】
α鎖をコードする遺伝子を有する発現ベクター、β鎖をコードする遺伝子を有する発現ベクター及びγ鎖をコードする遺伝子を有する発現ベクターを混合して用いることを特徴とする請求項１又は２記載の方法。
【請求項８】
ＳＶ４０初期プロモーター、ＳＶ４０後期プロモーター、サイトメガロウイルスプロモーター及びニワトリβ−アクチンプロモーターからなる群より選択されるプロモーター並びにアミノグリコシド３’ホスホトランスフェラーゼ（ｎｅｏ）遺伝子、ピューロマイシン耐性遺伝子、ジヒドロ葉酸還元酵素（ｄｈｆｒ）遺伝子及びグルタミン合成酵素（ＧＳ）遺伝子からなる群より選択される遺伝子増幅用マーカー遺伝子を有する発現ベクターを用いることを特徴とする請求項１ないし７の何れかに記載の方法。
【請求項９】
ニワトリβ−アクチンプロモーター及びジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子を有する発現ベクターを用いることを特徴とする請求項８記載の方法。
【請求項１０】
α鎖をコードする遺伝子として、α鎖をコードする遺伝子及びその異型であるαＥ鎖をコードする遺伝子の両方もしくは何れか片方を組み込むことを特徴とする請求項１ないし９の何れかに記載の方法。
【請求項１１】
γ鎖をコードする遺伝子として、γ鎖をコードする遺伝子及びその異型であるγ’鎖をコードする遺伝子の両方もしくは何れか片方を組み込むことを特徴とする請求項１ないし９の何れかに記載の方法。
【請求項１２】
γ鎖をコードする遺伝子として、γ鎖をコードする遺伝子及びその異型であるγ’鎖をコードする遺伝子の両方もしくは何れか片方を組込み、且つ、α鎖をコードする遺伝子として、α鎖をコードする遺伝子及びその異型であるαＥ鎖をコードする遺伝子の両方もしくは何れか片方を組み込むことを特徴とする請求項１ないし９の何れかに記載の方法。
【請求項１３】
動物細胞が、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞）、マウスミエローマ細胞、ＢＨＫ細胞、２９３細胞及びＣＯＳ細胞からなる群より選択されることを特徴とする請求項１ないし１２の何れかに記載の方法
【請求項１４】
チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞）がＤＧ４４株であることを特徴とする請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
フィブリノゲンを高産生する組換えフィブリノゲン産生細胞を作製する方法であって、請求項１から１４の何れかに記載の組換えフィブリノゲン高産生細胞作製方法に加えて、フィブリノゲンを構成するポリペプチドをコードする遺伝子と同時又は異なる時期に、バキュロウイルスＰ３５遺伝子を動物細胞に組み込むことを特徴とする組換えフィブリノゲン高産生細胞作製方法。
【請求項１６】
請求項１ないし１５の何れかに記載の方法により得られた組換えフィブリノゲン高産生細胞。
【請求項１７】
請求項１５に記載の方法によって得られた組換え動物細胞を用いてアポトーシスを誘導しない条件下の培養方法で培養することによりフィブリノゲンを大量産生する方法。
【請求項１８】
請求項１６記載の組換え動物細胞を用いたフィブリノゲンの大量産生する方法において、フェドバッチ培養方法、潅流培養方法、栄養強化培地を用いた培養方法の何れかで培養することを特徴とするフィブリノゲンを大量産生する方法。
【請求項１９】
請求項１６記載の組換え動物細胞を用いたフィブリノゲンを大量産生する方法において、無血清培地を用いることを特徴とするフィブリノゲンを大量産生する方法。
【請求項２０】
フィブリノゲンの産生量を約４０００μｇ／ｍｌまで増加させ得ることを特徴とする請求項１７ないし１９の何れかに記載のフィブリノゲンを大量産生する方法。
【請求項２１】
請求項１６記載の組換えフィブリノゲン高産生細胞を用いて産生されたフィブリノゲン。
【請求項２２】
請求項１７ないし２０の何れかに記載の方法を用いて産生されたフィブリノゲン。
【請求項１】
フィブリノゲンを高産生する組換えフィブリノゲン産生細胞を作製する方法であって、フィブリノゲンを構成するポリペプチドであるα鎖（及び／もしくはα鎖の異型）、β鎖及びγ鎖（及び／もしくはγ鎖の異型）をコードする遺伝子を、γ鎖（及び／もしくはγ鎖の異型）遺伝子の数がα鎖（及び／もしくはα鎖の異型）遺伝子及びβ鎖遺伝子の総数の１〜１０００倍量となるように、動物細胞に組込むことを特徴とする組換えフィブリノゲン高産生細胞作製方法。
【請求項２】
γ鎖遺伝子の数がα鎖遺伝子及びβ鎖遺伝子の総数と同じであることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項３】
α鎖及びγ鎖をコードする遺伝子を有するベクターとβ鎖及びγ鎖をコードする遺伝子を有する発現ベクターとを混合して用いることを特徴とする請求項１又は２記載の方法。
【請求項４】
α鎖及びγ鎖をコードする遺伝子を各１個ずつ有するベクターとβ鎖及びγ鎖をコードする遺伝子を各１個ずつ有する発現ベクターとを等量混合して用いることを特徴とする請求項３記載の方法。
【請求項５】
図１に記載の発現ベクターｐＣＡＧＧＤ−ＧＢ及びｐＣＡＧＧＤＮ５−ＧＡを等量混合し、これを動物細胞に組込むことを特徴とする請求項１ないし４の何れかに記載の方法。
【請求項６】
α鎖及びβ鎖をコードする遺伝子を有するベクターとγ鎖をコードする遺伝子を有する発現ベクターとを混合して用いることを特徴とする請求項１又は２記載の方法。
【請求項７】
α鎖をコードする遺伝子を有する発現ベクター、β鎖をコードする遺伝子を有する発現ベクター及びγ鎖をコードする遺伝子を有する発現ベクターを混合して用いることを特徴とする請求項１又は２記載の方法。
【請求項８】
ＳＶ４０初期プロモーター、ＳＶ４０後期プロモーター、サイトメガロウイルスプロモーター及びニワトリβ−アクチンプロモーターからなる群より選択されるプロモーター並びにアミノグリコシド３’ホスホトランスフェラーゼ（ｎｅｏ）遺伝子、ピューロマイシン耐性遺伝子、ジヒドロ葉酸還元酵素（ｄｈｆｒ）遺伝子及びグルタミン合成酵素（ＧＳ）遺伝子からなる群より選択される遺伝子増幅用マーカー遺伝子を有する発現ベクターを用いることを特徴とする請求項１ないし７の何れかに記載の方法。
【請求項９】
ニワトリβ−アクチンプロモーター及びジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子を有する発現ベクターを用いることを特徴とする請求項８記載の方法。
【請求項１０】
α鎖をコードする遺伝子として、α鎖をコードする遺伝子及びその異型であるαＥ鎖をコードする遺伝子の両方もしくは何れか片方を組み込むことを特徴とする請求項１ないし９の何れかに記載の方法。
【請求項１１】
γ鎖をコードする遺伝子として、γ鎖をコードする遺伝子及びその異型であるγ’鎖をコードする遺伝子の両方もしくは何れか片方を組み込むことを特徴とする請求項１ないし９の何れかに記載の方法。
【請求項１２】
γ鎖をコードする遺伝子として、γ鎖をコードする遺伝子及びその異型であるγ’鎖をコードする遺伝子の両方もしくは何れか片方を組込み、且つ、α鎖をコードする遺伝子として、α鎖をコードする遺伝子及びその異型であるαＥ鎖をコードする遺伝子の両方もしくは何れか片方を組み込むことを特徴とする請求項１ないし９の何れかに記載の方法。
【請求項１３】
動物細胞が、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞）、マウスミエローマ細胞、ＢＨＫ細胞、２９３細胞及びＣＯＳ細胞からなる群より選択されることを特徴とする請求項１ないし１２の何れかに記載の方法
【請求項１４】
チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞）がＤＧ４４株であることを特徴とする請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
フィブリノゲンを高産生する組換えフィブリノゲン産生細胞を作製する方法であって、請求項１から１４の何れかに記載の組換えフィブリノゲン高産生細胞作製方法に加えて、フィブリノゲンを構成するポリペプチドをコードする遺伝子と同時又は異なる時期に、バキュロウイルスＰ３５遺伝子を動物細胞に組み込むことを特徴とする組換えフィブリノゲン高産生細胞作製方法。
【請求項１６】
請求項１ないし１５の何れかに記載の方法により得られた組換えフィブリノゲン高産生細胞。
【請求項１７】
請求項１５に記載の方法によって得られた組換え動物細胞を用いてアポトーシスを誘導しない条件下の培養方法で培養することによりフィブリノゲンを大量産生する方法。
【請求項１８】
請求項１６記載の組換え動物細胞を用いたフィブリノゲンの大量産生する方法において、フェドバッチ培養方法、潅流培養方法、栄養強化培地を用いた培養方法の何れかで培養することを特徴とするフィブリノゲンを大量産生する方法。
【請求項１９】
請求項１６記載の組換え動物細胞を用いたフィブリノゲンを大量産生する方法において、無血清培地を用いることを特徴とするフィブリノゲンを大量産生する方法。
【請求項２０】
フィブリノゲンの産生量を約４０００μｇ／ｍｌまで増加させ得ることを特徴とする請求項１７ないし１９の何れかに記載のフィブリノゲンを大量産生する方法。
【請求項２１】
請求項１６記載の組換えフィブリノゲン高産生細胞を用いて産生されたフィブリノゲン。
【請求項２２】
請求項１７ないし２０の何れかに記載の方法を用いて産生されたフィブリノゲン。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０１０１７８
【国際公開日】平成１７年２月３日（２００５．２．３）
【発行日】平成１９年１０月４日（２００７．１０．４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００５−５１２０６５（Ｐ２００５−５１２０６５）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＪＰ２００４／０１０７０５
【国際出願日】平成１６年７月２８日（２００４．７．２８）
【出願人】（０００１７３５５５）財団法人化学及血清療法研究所 (86)
【Ｆターム（参考）】
【国際公開日】平成１７年２月３日（２００５．２．３）
【発行日】平成１９年１０月４日（２００７．１０．４）
【国際特許分類】
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＪＰ２００４／０１０７０５
【国際出願日】平成１６年７月２８日（２００４．７．２８）
【出願人】（０００１７３５５５）財団法人化学及血清療法研究所 (86)
【Ｆターム（参考）】
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