組換えプラスミド及びこれにより形質転換された大腸菌並びにこれを使用したユビキチン（Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ）化蛋白質の製造方法
【課題】ユビキチン（Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ）と標的蛋白質を大腸菌内で同時に発現させ、大腸菌内で両蛋白質をユビキチン化させるために使用する組換えプラスミド及び前記組換えプラスミドにより形質転換された大腸菌並びに前記形質転換された大腸菌を使用して未知の標的蛋白質をスクリーニング（同定・検出）する方法及びユビキチンおよびポリユビキチン（Ｐｏｌｙ−Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ）化された標的蛋白質を製造・精製する方法を提供することを目的とする。
【解決手段】（Ａ）ユビキチンを活性化する酵素（Ｅ１）、（Ｂ）ユビキチンと標的蛋白質の結合酵素（Ｅ２）、（Ｃ）ユビキチンと標的蛋白質の連結酵素（Ｅ３）、（Ｄ）ユビキチンを発現することができる組換えプラスミドを使用して大腸菌内で標的蛋白質のユビキチン化を行う。
【解決手段】（Ａ）ユビキチンを活性化する酵素（Ｅ１）、（Ｂ）ユビキチンと標的蛋白質の結合酵素（Ｅ２）、（Ｃ）ユビキチンと標的蛋白質の連結酵素（Ｅ３）、（Ｄ）ユビキチンを発現することができる組換えプラスミドを使用して大腸菌内で標的蛋白質のユビキチン化を行う。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、組換えプラスミド及びこれにより形質転換された大腸菌並びにこれを使用したユビキチン（Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ）化蛋白質の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ユビキチンは７６個のアミノ酸からなる安定性の高いタンパク質であり、ユビキチン様蛋白質ＳＵＭＯまたはＮＥＤＤ８と同様に標的蛋白質に共有結合して蛋白質の機能変換を触媒する修飾分子である。
この蛋白質修飾は蛋白質の翻訳、ＤＮＡ修復、エンドサイトーシス、アミノ酸輸送、翻訳調節、シグナル伝達、さらには蛋白質の分解など多彩な役割に関与している。特に蛋白質の分解に関しては多彩な生体反応を迅速に順序よく、一過的にかつ一方向に決定する合理的な手段として細胞周期・アポトーシス・代謝調節・シグナル伝達・転写制御・ストレス応答・免疫応答など生命活動のさまざまな領域で中心的な役割を果たしている。
ユビキチン化の反応はＥ１、Ｅ２及びＥ３酵素の３つの酵素により触媒される基質修飾反応である。
ユビキチン化される標的蛋白質を同定するには試験管内におけるユビキチン化反応が重要であるが、このためにはユビキチン活性化酵素（Ｅ１）、結合酵素（Ｅ２）、連結酵素（Ｅ３）、さらにはユビキチンが必要となる。
Ｅ１はチオエステル結合を介してユビキチンを活性化し、Ｅ２はＥ１からユビキチンを受け取ってＥ３へ渡すユビキチンの担体として作用する。
Ｅ３はＥ２に結合するユビキチンを基質に連結する触媒活性を持つ。従って、新規のユビキチン化標的蛋白質を試験管内におけるユビキチン化反応を用いてスクリーニングすることは多大な労力が必要となり非常に困難であった。
また、ユビキチンはユビキチン間でも共有結合を繰り返してポリユビキチン鎖を形成する。最も良く知られているユビキチンの機能のひとつ、タンパクの分解マーカー、２６Ｓプロテアソームへのターゲッティングシグナル機能もポリユビキチン化が生じなければならない。
試験管内におけるポリユビキチン化はユビキチン化よりも更に難しいとされており、大腸菌を用いる簡便な方法で製造、および精製することによる大量調整が可能となれば画期的なことである。
前記ＳＵＭＯ化については、組換えベクターを利用して細菌などの宿主細胞中で標的蛋白質をＳＵＭＯ化し蛋白質ポリマー等を大量に生産する方法が知られているがユビキチン化については知られていなかった（例えば特許文献１参照）。
【０００３】
【特許文献１】国際公開第０４／０３１１２４３号パンフレット
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
したがって、本発明の目的は、ユビキチン（Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ）と標的蛋白質を大腸菌内で同時に発現させ、大腸菌内で両蛋白質を結合（ユビキチン（Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ）化）させるために使用する組換えプラスミド及び前記組換えプラスミドにより形質転換された大腸菌並びに前記形質転換された大腸菌を使用して未知の標的蛋白質をスクリーニング（同定・検出）する方法及びユビキチン（Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ）およびポリユビキチン（Ｐｏｌｙ−Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ）化された標的蛋白質を製造・精製する方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者らは上記の目的を達成するために鋭意研究を重ねた結果、大腸菌内でユビキチン（Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ）化に必要な（Ａ）ユビキチン（Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ）を活性化する酵素（Ｅ１）、（Ｂ）ユビキチン（Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ）と標的蛋白質の結合酵素（Ｅ２）、（Ｃ）ユビキチン（Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ）と標的蛋白質の連結酵素（Ｅ３）、（Ｄ）ユビキチン（Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ）を発現することができる組換えプラスミドを使用して大腸菌内で標的蛋白質のユビキチン（Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ）化ができることを見出し、本発明を完成するに至った。
従って、本発明は、
（１）以下の（Ａ）〜（Ｄ）のうち１種又は２種以上をコードする遺伝子を含み大腸菌内で同時に発現できる組換えプラスミドである。
（Ａ）ユビキチン（Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ）を活性化する酵素（Ｅ１）
（Ｂ）ユビキチン（Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ）と標的蛋白質の結合酵素（Ｅ２）
（Ｃ）ユビキチン（Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ）と標的蛋白質の連結酵素（Ｅ３）
（Ｄ）ユビキチン（Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ）。
（２）以下の（Ａ）〜（Ｃ）をコードする遺伝子を含み大腸菌内で同時に発現できる組換えプラスミドである。
（Ａ）ユビキチン（Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ）を活性化する酵素（Ｅ１）
（Ｂ）ユビキチン（Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ）と標的蛋白質の結合酵素（Ｅ２）
（Ｃ）ユビキチン（Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ）。
（３） 以下の（Ａ）〜（Ｄ）をコードする遺伝子を含み大腸菌内で同時に発現できる組換えプラスミドである。
（Ａ）ユビキチン（Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ）を活性化する酵素（Ｅ１）
（Ｂ）ユビキチン（Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ）と標的蛋白質の結合酵素（Ｅ２）
（Ｃ）ユビキチン（Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ）標的蛋白質の連結酵素（Ｅ３）
（Ｄ）ユビキチン（Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ）。
（４）以下の（Ａ）〜（Ｅ）のうち１種又は２種以上をコードする遺伝子を含み大腸菌内で同時に発現できる第１の組換えプラスミド、
（Ａ）ユビキチン（Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ）を活性化する酵素（Ｅ１）
（Ｂ）ユビキチン（Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ）と標的蛋白質の結合酵素（Ｅ２）
（Ｃ）ユビキチン（Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ）と標的蛋白質の連結酵素（Ｅ３）
（Ｄ）ユビキチン（Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ）
（Ｅ）標的蛋白質
及び（Ａ）〜（Ｅ）のうち第１の組換えプラスミドに含まれない残りをコードする遺伝子を含み大腸菌で同時に発現できる第２の組換えプラスミド、を有する形質転換された大腸菌である。
（５）以下の（Ａ）〜（Ｄ）をコードする遺伝子を含み大腸菌内で同時に発現できる組換えプラスミド、
（Ａ）ユビキチン（Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ）を活性化する酵素（Ｅ１）
（Ｂ）ユビキチン（Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ）と標的蛋白質の結合酵素（Ｅ２）
（Ｃ）ユビキチン（Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ）と標的蛋白質の連結酵素（Ｅ３）
（Ｄ）ユビキチン（Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ）
及び以下の（Ｅ）をコードする遺伝子を含み大腸菌内で同時に発現できる組換えプラスミド、
（Ｅ）標的蛋白質
を有する形質転換された大腸菌である。
（６）ユビキチン（Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ）を活性化する酵素（Ｅ１）がＵＢＥ１、ユビキチン（Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ）と標的蛋白質の結合酵素（Ｅ２）がＵＢＣＨ５、ユビキチン（Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ）と標的蛋白質の連結酵素（Ｅ３）がＣＯＰ１であることを特徴とする請求項１又は請求項３に記載の組換えプラスミドである。
（７）受託番号がＦＥＲＭ−Ｐ２０９１７である請求項２に記載の組換えプラスミドである。
（８）受託番号がＦＥＲＭ−Ｐ２０９１８である請求項３に記載の組換えプラスミドである。
（９）請求項４又は請求項５に記載の形質転換された大腸菌を使用したユビキチン（Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ）化蛋白質のスクリーニング方法である。
（１０）請求項４又は請求項５に記載の形質転換された大腸菌を使用したユビキチン（Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ）化蛋白質又はポリユビキチン（ｐｏｌｙ−Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ）化蛋白質の製造方法である。
【発明の効果】
【０００６】
多大な労力なくしてユビキチン（Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ）化された標的蛋白質を得ることが出来るようになったことから、ユビキチン（Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ）による標的蛋白質の機能変換システム、そこから生じる生理作用を研究する上で非常に大きく貢献することができる。
また、本発明のスクリーニング方法は、未知の標的蛋白質を効率良く同定できる方法であり、ユビキチン（Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ）の新たな作用機序、生理的重要性を発見する上で大きく貢献すると考えられる。
同様に未知の標的蛋白質を効率良くポリユビキチン（Ｐｏｌｙ−Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ）化させることは多大な労力が必要であり、その反応の難しさから非常に困難であった。
従来の煩雑な操作を用いることなく融合蛋白質を回収することができる為、解析する上で非常に大きく貢献することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００７】
以下、本発明を詳細に説明する。
ユビキチン（Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ）は、ユビキチン（Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ）を活性化する酵素（Ｅ１）、ユビキチン（Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ）と標的蛋白質の結合酵素（Ｅ２）、ユビキチン（Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ）と標的蛋白質の連結酵素（Ｅ３）からなる複合酵素系によって標的蛋白質に結合する。
Ｅ１としてＵＢＥ１（ユビキチン（Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ）-activating enzyme E1）、Ｅ２としてＵＢＣＨ５（ユビキチン（Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ）-conjugating
enzyme E2D3）、Ｅ３としてＣＯＰ１（constitutive photomorphogenic 1）またはＭＤＭ２（transformed 3T3
cell double minute 2, p53 binding protein）が知られている。しかしながらＥ２，Ｅ３は高度に多様性を持ち標的蛋白質により異なる。
従って実施例ではＣＯＰ１（constitutive photomorphogenic 1）またはＭＤＭ２（transformed
3T3 cell double minute 2）の２種類を用いたがその他のＥ２、Ｅ３を用いることもできる。
【０００８】
ユビキチン（Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ）は標的蛋白質と結合する際、成熟型の構造をとり、そのＣ末端はＧｌｙ−Ｇｌｙで終わっている。
このＣ末端Ｇｌｙ 残基が、標的蛋白質のLysのε‐アミノ基とＡＴＰ-Ｍｇ２＋存在下にてイソペプチド結合して連結することが知られている。
【０００９】
従ってユビキチン（Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ）は成熟型の状態、つまりＣ末端がＧｌｙ−Ｇｌｙとなるように発現するように組換えプラスミドを構築する。
【００１０】
Ｅ３は特に高度に多様性を持ち標的蛋白質ごとに異なる。従って作成した組み換えプラスミドはＥ３部位を自由に組み換えられるように組換えプラスミドを構築する。
【００１１】
ユビキチン（Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ）、ＵＢＥ１、ＵＢＣＨ５、ＣＯＰ１、ＭＤＭ２をコードする遺伝子は、ＧｅｎＢａｎｋにおいてそれぞれＭ１７５９７、ＢＣ０５８６３０、Ｕ３９３１８、ＢＣ０３９７２３、ＢＴ００７２５８として登録されている。
ユビキチン（Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ）、ＵＢＥ１、ＵＢＣＨ５、ＣＯＰ１、ＭＤＭ２及び標的蛋白質をコードする遺伝子にＰＣＲ法によって制限酵素により切断できる配列を付加し、これらを発現することができるプラスミドのプロモーターの下流に挿入し、次いでプロモータごと切り出すか、又は、その部位をコードする遺伝子にＰＣＲ法によって制限酵素により切断できる配列を付加し、これを別のプラスミドに組み込み組換えプラスミドを得て、該組換えプラスミドを大腸菌に導入する。
【００１２】
組換えプラスミドに組み込む遺伝子の組合せは、１つのプラスミドにユビキチン（Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ）、ＵＢＥ１、ＵＢＣＨ５、Ｅ３（ＣＯＰ１またはＭＤＭ２）及び標的蛋白質をコードする遺伝子を組み込んでもよく、２つのプラスミドに適宜選択して組み込んでも良い。
また、組み込む遺伝子は同種のものを複数組み込んでもよい。
【００１３】
ユビキチン（Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ）化蛋白質を大量に製造する場合は、前記のとおりコードする遺伝子を適宜組み込めばよいが、スクリーニングに使用する場合は、ユビキチン（Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ）、ＵＢＥ１、ＵＢＣＨ５、Ｅ３（ＣＯＰ１またはＭＤＭ２）をコードする遺伝子は、第１のプラスミドに、標的蛋白質をコードする遺伝子を第２のプラスミドに組み込む組合せが好ましい。
【００１４】
第１のプラスミドを導入し形質転換した大腸菌に第２のプラスミドを後から導入することができる。
また、逆に第２のプラスミドを導入し形質転換した大腸菌に第１のプラスミドを後から導入することもできる。
【００１５】
２種類のプラスミドを同一大腸菌内へ導入する場合には、プラスミドのＤＮＡ複製開始領域はｐＢＲ３２２とｐ１５Ａ由来のＤＮＡ複製開始領域を持つ組み合わせなど、互換性を持つ組み合わせで用いる。
また、プラスミドには薬剤耐性遺伝子等の選択マーカーを組み込んでおく。選択マーカーとしては、例えば、テトラサイクリン耐性遺伝子またはアンピシリン耐性遺伝子等を使用することができる。
【００１６】
プラスミドとしては、大腸菌において自立複製可能ないしは染色体中への組込みが可能で、上記目的とする遺伝子を転写できる位置にプロモーターを含有しているものが用いられる。
プロモーターはＴａｑプロモーターやＴ7プロモーターを用い、それぞれの遺伝子産物がＩＰＴＧ（isopropyl-1-thio-βloch-D-galactopyranoside）により発現誘導可能となるように設計する。
なお、プラスミドの導入は、従来公知の方法が使用できる。
【００１７】
発現のためのプロモーターは、各蛋白質をコードする遺伝子の上流に個々に組み込みそれぞれが別に発現するように組み込むほか、一括して融合状態で発現するように組み込むこともできるが、融合して発現した場合は蛋白質を切断する等の調整が必要であり、個々に組み込むことが好ましい。
また、プロモーターをプラスミドに個々の蛋白質が発現するように組み込んだ場合は、ターミネーターを特に組み込まなくても終止コドンを遺伝子配列に付加すれば活性を有する酵素を得ることができる。
【００１８】
前記ユビキチン（Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ）には、ＧＳＴ（グルタチオンＳトランスフェラーゼ）、Ｈｉｓ（ポリヒスチジン）などの容易に精製したり検出したりできるように目印となるアミノ酸配列（タグ配列）を付加することができる。
また、標的蛋白質自体に、前記アミノ酸配列（タグ配列）を融合し精製したり検出したりできるようにすることもできる。
【００１９】
構造解析用の大量調整の場合は小さい分子量のタグ配列を用いるか、もしくは精製後に融合部位を特異的なプロテアーゼで切断し目的蛋白質のみを本来の形で取得できるようにプロテアーゼ切断配列を組み込んでおくことが好ましい。
【００２０】
形質転換した大腸菌の選択は、大腸菌を前記選択マーカーに対応する薬剤耐性選択寒天培地プレート等に塗抹して培養し、生じた単一のコロニーを選択することで行うことができる。
【００２１】
形質転換した大腸菌の培養方法は通常の方法に従って行うことができる。
培養する培地は該微生物が資化し得る炭素原、窒素原、無機塩類等を含有し、形質転換体の培養には天然培地、合成培地のいずれも使用することができる。
培養形式、培養温度、培養時間、培地ｐＨ等は、用いる大腸菌に応じて通常行われる条件を採用することができる。
【００２２】
ユビキチン（Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ）化標的蛋白質の単離は、組換プラスミドを導入し形質転換した大腸菌を３７℃にてＯＤが０．１未満から培養を開始し、ＯＤが０．３になるまで培地に培養し、さらにＩＰＴＧを０．２ｍＭ加えて各遺伝子の発現を誘導しながら２５℃にて１６時間以上培養をおこない、培養中にユビキチン（Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ）化標的蛋白質を生成蓄積させ、該培養物より該ユビキチン（Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ）化標的蛋白質を採取することにより行うことができる。
【００２３】
ポリユビキチン（Ｐｏｌｙ−Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ）化標的蛋白質の単離は、組換プラスミドを導入し形質転換した大腸菌（対数増殖期の大腸菌を使用）を抗生物質を含む培地において３７℃にてＯＤが０．１未満から培養を開始し、ＯＤが０．３になるまで培地に培養する（使用したプラスミドがｐ１５Ａ由来ＤＮＡ複製開始領域をもつ場合においてはこの段階では抗生物質を含まない培地を使用する）。ＯＤが０．３になった後、ＩＰＴＧを０．２ｍＭ加えて各遺伝子の発現を誘導しながら２５℃にて１６時間以上培養をおこない、培養中にポリユビキチン（Ｐｏｌｙ−Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ）化標的蛋白質を生成蓄積させ、該培養物より該ポリユビキチン（Ｐｏｌｙ−Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ）化標的蛋白質を採取することにより行うことができる（使用したプラスミドがｐ１５Ａ由来ＤＮＡ複製開始領域をもつ場合においてはＯＤが０．３になった後に抗生物質を加える）。
【００２４】
例えば、菌体を遠心分離で沈殿回収し、水系緩衝液中に懸濁後、超音波破砕機等により大腸菌を破砕する。
遠心分離の後、上澄み液を取り出しユビキチン（Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ）化標的蛋白質またはポリユビキチン（Ｐｏｌｙ−Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ）を得ることができる。
スクリーニングの場合は、例えば上澄み液をＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタン法にてタグ配列の抗体を使用してユビキチン化標的蛋白質を検出する。
大量調整の場合は、例えばＧＳＴがタグとして使用されている場合には、上澄み液を取り出し、グルタチオンセファロースビーズとインキュベートし、ビーズに結合した蛋白質を溶出、もしくはプロテアーゼ切断配列の使用など、タグ配列特異的な精製方法にて通常行われる条件で精製することができる。
【実施例】
【００２５】
以下本発明を実施例により具体的に説明する。
［実施例１］
１．ユビキチン（Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ）をコードする遺伝子の調製
ユビキチン（Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ）をコードする遺伝子は、ＧｅｎＢａｎｋにおいてＭ１７５９７として登録されている
本発明では、発現したとき成熟型になるよう遺伝子を選択し終止コドンを付加した（配列番号１）。
また、発現したとき成熟型になるようＣ末端はＧｌｙ‐Ｇｌｙで終わるように遺伝子をプラスミドに組み込むために両端部に制限酵素で切断できる配列を付加した。
さらにスクリーニングに使用できるよう、ユビキチン（Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ）の前方に検出できるようにＨＡタグ配列を付加した。
ＮｃｏＩにより切断できる配列「５’−ＣＣＡＴＧＧ−３’」及びその上流に「５’−ＧＣＧ−３’」を付加したプライマー（配列番号７）及びＢａｍＨＩにより切断できる配列「５’−ＧＧＡＴＣＣ−３’」及びその上流に「５’−ＧＣＧ−３’」を付加したプライマー（配列番号８）を使用してＰＣＲを行った。
このプライマーによりプラスミドにユビキチン（Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ）をコードする遺伝子を組み込んだときＣ末端はＧｌｙ‐Ｇｌｙとなる成熟型ユビキチン（Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ）をコードする遺伝子を得た。
【００２６】
２．ＵＢＥ１をコードする遺伝子の調製
ＢＥ１をコードする遺伝子は、ＧｅｎＢａｎｋにおいてＢＣ０５８６３０として登録されている（配列番号２）。
本発明では、これらの遺伝子をプラスミドに組み込むために両端部に制限酵素で切断できる配列を付加した。
ＮｃｏＩにより切断できる配列およびその下流にアミノ酸の読み枠が変化しないように２アミノ酸を付加した配列「５’−ＣＣＡＴＧＧＧＡ−３’」及びその上流に「５’−ＧＣＧ−３’」を付加したプライマー（配列番号９）及びＸｈｏＩにより切断できる配列「５’−ＣＴＣＧＡＧ−３’」及びその上流に「５’−ＧＣＧ−３’」を付加したプライマー（配列番号１０）を使用してＰＣＲを行った。
【００２７】
３．ＵＢＣＨ５をコードする遺伝子の調製
ＵＢＣＨ５をコードする遺伝子は、ＧｅｎＢａｎｋにおいてＵ３９３１８として登録されている（配列番号３）。
本発明では、これらの遺伝子をプラスミドに組み込むために両端部に制限酵素で切断できる配列を付加した。
ＮｃｏＩにより切断できる配列「５’−ＣＣＡＴＧＧ−３’」及びその上流に「５’−ＧＣＧ−３’」を付加したプライマー（配列番号１１）及びＢａｍＨＩにより切断できる配列「５’−ＧＧＡＴＣＣ−３’」及びその上流に「５’−ＧＣＧ−３’」を付加したプライマー（配列番号１２）を使用してＰＣＲを行った。
【００２８】
４．ＣＯＰ１をコードする遺伝子の調製
ＣＯＰ１をコードする遺伝子は、ＧｅｎＢａｎｋにおいてＢＣ０３９７２３として登録されている（配列番号４）。
本発明では、これらの遺伝子をプラスミドに組み込むために両端部に制限酵素で切断できる配列を付加した。
ＮｃｏＩにより切断できる配列およびその下流にアミノ酸の読み枠が変化しないように２アミノ酸を付加した配列「５’−ＣＣＡＴＧＧＧＣ−３’」及びその上流に「５’−ＧＣＧ−３’」を付加したプライマー（配列番号１３）及びにＸｈｏＩより切断できる配列「５’−ＣＴＣＧＡＧ−３’」及びその上流に「５’−ＧＣＧ−３’」を付加したプライマー（配列番号１４）を使用してＰＣＲを行った。
【００２９】
５．ＭＤＭ２をコードする遺伝子の調製
ＭＤＭ２をコードする遺伝子は、ＧｅｎＢａｎｋにおいてＢＴ００７２５８として登録されている（配列番号５）。
本発明では、これらの遺伝子をプラスミドに組み込むために両端部に制限酵素で切断できる配列を付加した。
ＮｃｏＩにより切断できる配列およびその下流にアミノ酸の読み枠が変化しないように２アミノ酸を付加した配列「５’−ＣＣＡＴＧＧＴＧ−３’」及びその上流に「５’−ＧＣＧ−３’」を付加したプライマー（配列番号１５）及びにＢａｍＨＩより切断できる配列「５’−ＧＧＡＴＣＣ−３’」及びその上流に「５’−ＧＣＧ−３’」を付加したプライマー（配列番号１６）を使用してＰＣＲを行った。
【００３０】
５．プロモーターの付加
５−１．ユビキチン（Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ）をコードする遺伝子
前記制限酵素により切断できる配列を付加したユビキチン（Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ）をコードする遺伝子を発現プラスミド（ 商品名ｐＥＴ１５ｂ Ｎｏｖａｇｅｎ社製）のＮｃｏＩ−ＢａｍＨＩ部位に組み込んだ。
その後、Ｔ７プロモータとともにＳｐｈＩ−ＢａｍＨＩで切り出した（図１）。
【００３１】
５−２．ＵＢＥ１をコードする遺伝子
前記制限酵素により切断できる配列を付加したＵＢＥ１をコードする遺伝子を発現プラスミド（ 商品名ｐＥＴ１５ｂ Ｎｏｖａｇｅｎ社製）のＮｃｏＩ−ＸｈｏＩ部位に組み込んだ。
その後、Ｔ７プロモータ配列部位を付加したＵＢＥ１を作成するために両端部に制限酵素で切断できる配列を付加した。
Ｔ７プロモータ配列上流にＢｇｌＩＩにより切断できる配列「５’−ＡＧＡＴＣＴ−３’」及びその上流に「５’−ＧＣＧ−３’」を付加したプライマー（配列番号１７）、およびＵＢＥ１より下流にＥｃｏＲＶにより切断できる配列「５’−ＧＡＴＡＴＣ−３’」及びその上流に「５’−ＧＣＧ−３’」を付加したプライマー（配列番号１８）を使用してＰＣＲを行った。
その後、Ｔ７プロモータとともにＢｇｌＩＩ−ＥｃｏＲＶで切り出した（図２）。
【００３２】
５−３．ＵＢＣＨ５をコードする遺伝子
前記制限酵素により切断できる配列を付加したＵＢＣＨ５をコードする遺伝子を発現プラスミド（ 商品名ｐＥＴ１５ｂ Ｎｏｖａｇｅｎ社製）のＮｃｏＩ−ＢａｍＨＩ部位に組み込んだ。
その後、Ｔ７プロモータ配列部位を付加したＵＢＣＨ５を作成するために両端部に制限酵素で切断できる配列を付加した。
Ｔ７プロモータ配列上流にＥｃｏＲＶにより切断できる配列「５’−ＧＡＴＡＴＣ−３’」及びその上流に「５’−ＧＣＧ−３’」を付加したプライマー（配列番号１９）、およびＵＢＣＨ５より下流にＨｉｎｄＩＩＩにより切断できる配列「５’−ＡＡＧＣＴＴ−３’」及びその上流に「５’−ＧＣＧ−３’」を付加したプライマー（配列番号２０）を使用してＰＣＲを行った。
その後、Ｔ７プロモータとともにＥｃｏＲＶ−ＨｉｎｄＩＩＩで切り出した（図３）。
【００３３】
５−４．ＣＯＰ１をコードする遺伝子
前記制限酵素により切断できる配列を付加したＣＯＰ１をコードする遺伝子を発現プラスミド（ 商品名ｐＥＴ１５ｂ Ｎｏｖａｇｅｎ社製）のＮｃｏＩ−ＸｈｏＩ部位に組み込んだ。
その後、Ｔ７プロモータ配列部位を付加したＣＯＰ１を作成するために両端部に制限酵素で切断できる配列を付加した。
Ｔ７プロモータ配列上流にＥｃｏＲＶにより切断できる配列「５’−ＧＡＴＡＴＣ−３’」及びその上流に「５’−ＧＣＧ−３’」を付加したプライマー（配列番号１９）、およびＣＯＰ１より下流にＥｃｏＲＶにより切断できる配列「５’−ＧＡＴＡＴＣ−３’」及びその上流に「５’−ＧＣＧ−３’」を付加したプライマー（配列番号２１）を使用してＰＣＲを行った。
その後、Ｔ７プロモータとともにＥｃｏＲＶ−ＥｃｏＲＶで切り出した（図４）。
【００３４】
５−５．ＭＤＭ２をコードする遺伝子
前記制限酵素により切断できる配列を付加したＭＤＭ２をコードする遺伝子を発現プラスミド（ 商品名ｐＥＴ１５ｂ Ｎｏｖａｇｅｎ社製）のＮｃｏＩ−ＢａｍＨＩ部位に組み込んだ。
その後、Ｔ７プロモータ配列部位を付加したＭＤＭ２を作成するために両端部に制限酵素で切断できる配列を付加した。
Ｔ７プロモータ配列上流にＥｃｏＲＶにより切断できる配列「５’−ＧＡＴＡＴＣ−３’」及びその上流に「５’−ＧＣＧ−３’」を付加したプライマー（配列番号１９）、およびＣＯＰ１より下流にＥｃｏＲＶにより切断できる配列「５’−ＧＡＴＡＴＣ−３’」及びその上流に「５’−ＧＣＧ−３’」を付加したプライマー（配列番号２１）を使用してＰＣＲを行った。
その後、Ｔ７プロモータとともにＥｃｏＲＶ−ＥｃｏＲＶで切り出した（図５）。
【００３５】
６．組換え発現プラスミドの調製
前記プロモータを付加した配列をｐ１５Ａ由来のＤＮＡ複製開始領域を持ち、クロラムフェニコール耐性を持つ発現プラスミド（商品名ｐＡＣＹＣ１８４ ＮＩＰＰＯＮ ＧＥＮＥ社製）へ以下の順番で組み込み本発明の組換えプラスミドを得た（図６）。
まずｐＡＣＹＣ１８４のＳｐｈI−ＢａｍＨＩ部位を切断し、前記５−１で得られたユビキチン（Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ）をコードする遺伝子をｐＡＣＹＣ１８４にライゲーション法により組み込んだ。
【００３６】
次に、ｐＡＣＹＣ１８４へＵＢＥ１をコードする遺伝子を組み込んだ。
ｐＡＣＹＣ１８４をＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＶで切断し、前記５−２で得られたＵＢＥ１をコードする遺伝子をｐＡＣＹＣ１８４にライゲーション法により組み込んだ。
【００３７】
次に、ｐＡＣＹＣ１８４へＵＢＣＨ５をコードする遺伝子を組み込んだ。
ｐＡＣＹＣ１８４をＥｃｏＲＶ−ＨｉｎｄＩＩＩで切断し、前記５−３で得られたＵＢＣＨ５をコードする遺伝子をｐＡＣＹＣ１８４にライゲーション法により組み込んだ。
【００３８】
標的蛋白質の連結酵素（Ｅ３）には特に多様性が認められるため、（Ｅ３）を最後に組み込むことでその多様性に対応できるようにした。
従って、標的蛋白質の連結酵素（Ｅ３）を組み込む前の本プラスミドを独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター（茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６）に、２００６年（平成１８年）５月２２日 受託番号 ＦＥＲＭ ＡＰ−２０９１７として寄託している。
【００３９】
次に、ｐＡＣＹＣ１８４へＣＯＰ１をコードする遺伝子を組み込んだ。
まずｐＡＣＹＣ１８４をＥｃｏＲＶ−ＥｃｏＲＶで切断し、前記５−４で得られたＣＯＰ１をコードする遺伝子をｐＡＣＹＣ１８４にライゲーション法により組み込んだ。
【００４０】
なお、本プラスミドは独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センター（茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６）に、２００６年（平成１８年）５月２２日 受託番号 ＦＥＲＭ ＡＰ−２０９１８として寄託している。
【００４１】
以上のとおり、ｐＡＣＹＣ１８４に前記５．プロモーターの付加により得られた遺伝子を組み込むには組み込む順番が重要である。前記の順番を変更した場合、例えば、ＵＢＥ１をコードする遺伝子を組み込んだ後にユビキチン（Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ）をコードする遺伝子を組み込もうとすると、ＢｇｌＩＩによりＢａｍＨＩが使用できなくなってしまう。
【００４２】
もしくは、ＣＯＰ１の代わりにｐＡＣＹＣ１８４へＭＤＭ２をコードする遺伝子を組み込んだ。この方法は前記と同様である。
【００４３】
［実施例２］
[標的蛋白質のスクリーニング１]
１．ｐ５３を発現できる組換えプラスミドの調製
ユビキチン（Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ）の標的蛋白質であることが知られているｐ５３（p53 cellular tumor antigen）をコードする遺伝子は、ＧｅｎＢａｎｋにおいてＫ０３１９９（配列番号６）として登録されている。
本発明では、これらの遺伝子をプラスミドに組み込むために両端部に制限酵素で切断できる配列を付加した。
ＢａｍＨＩにより切断できる配列「５’−ＧＧＡＴＣＣ−３’」及びその上流に「５’−ＧＣＧ−３’」を付加したプライマー（配列番号２２）及びＸｈｏＩにより切断できる配列「５’−ＣＴＣＧＡＧ−３’」及びその上流に「５’−ＧＣＧ−３’」を付加したプライマー（配列番号２３）を使用してＰＣＲを行った。
増幅した前記両端部に制限酵素で切断できる配列を付加したｐ５３をコードする遺伝子を発現プラスミド(商品ｐＧＥＸ６ｐ２ Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ社製)のＢａｍＨＩ−ＸｈｏＩ部位に導入し、ＧＳＴ−ｐ５３ 蛋白質を大腸菌で発現できる組換えプラスミドを構築した。
【００４４】
２．大腸菌への導入
実施例１で得た組換えプラスミドを大腸菌ＢＬ２１ＤＥ３株に導入した。
前記組換えプラスミドが導入された大腸菌はクロラムフェニコールを含む培地で選別した。
この培地で得られたコロニーより、コンピタントセルを作成した。
前記ｐ５３を発現できる組換えプラスミドを前記コンピタントセルに導入し大腸菌を形質転換しクロラムフェニコール及びアンピシリンを含む培地で選別した。
２つの組換えプラスミドを同時に取り込んだ大腸菌はアンピシリンとクロラムフェニコールの両方を含む培地で選別できる。
【００４５】
３．ユビキチン（Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ）化蛋白質のスクリーニング
ユビキチン（Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ）化標的蛋白質の単離は、組換プラスミドを導入し形質転換した大腸菌を３７℃にてＯＤが０．１未満から培養を開始し、ＯＤが０．３になるまで培地に培養し、さらにＩＰＴＧを０．２ｍＭ加えて各遺伝子の発現を誘導しながら２５℃にて１６時間振盪培養した。
遠心分離により培養液から集菌し、緩衝液に懸濁し、超音波処理により菌体を破砕し遠心分離の後、上澄み液を取り出した。
【００４６】
上記上澄み液をＧＳＴ用精製ビーズ（商品名 Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ
Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４Ｂビーズ Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ社製）とインキュベーションし、ビーズに結合した蛋白質を溶出し精製した。ポリアクリルアミドゲルのウェルに上記蛋白質溶液をアプライしＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、分離した蛋白質をＣＢＢ染色（０．２５％ Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ Ｂｌｕｅ Ｒ−２５０/５０％メタノール/１０％酢酸）にて染色し検出した。
ユビキチン（Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ）に結合したタグ配列の抗体の反応を用いてユビキチン（Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ）化蛋白質をウエスタンブロット法で検出した。
ポリアクリルアミドゲルのウェルに前記上澄み液をアプライしＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った後、分離した蛋白質をゲルからＰＶＤＦ膜に転写した。
ＰＶＤＦ膜を５％スキムミルク／ＰＢＳに浸し、４℃で一夜放置しブロッキングした。
ＨＡタグモノクローナル抗体：１％スキムミルク／ＰＢＳ=１：１５００（Ｗ／Ｖ）の溶液をつくり、室温で１時間反応させ、ＰＢＳ−Ｔで洗浄した。
パーオキシダーゼ標識抗マウスＩｇＧ抗体：１％スキムミルク／ＰＢＳ=１：１５00（Ｗ/Ｖ）の溶液をつくり、室温で１時間反応させ、ＰＢＳ−Ｔで洗浄した。
ＥＣＬ Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔｔｉｎｇ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ(Ａｍｅｒｓｈａｍ ｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ社製) を用い、プロトコルに従い化学発光法で検出した。（図７）
【００４７】
結果を図７に示す。
レーン１はユビキチン（Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ）、Ｅ１、Ｅ２、Ｅ３としてＭＤＭ２を発現する実施例１で得られた発現ベクターとｐ５３を発現できる前記発現ベクターを導入したものである。
レーン２はユビキチン（Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ）、Ｅ１、Ｅ２、Ｅ３としてＣＯＰ１を発現する実施例１で得られた発現ベクターとｐ５３を発現できる前記発現ベクターを導入したものである。
ＣＢＢ染色の結果より、通常のｐ５３の大きさは７５ＫＤａ付近であることが示された。
図７で得られたバンドはユビキチン（Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ）化され通常のｐ５３よりも上部２箇所にシフトしている。
実施例１で得られた発現ベクターにより、ユビキチン（Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ）化されたｐ５３を得ることができた。
【００４８】
［実施例３］［標的蛋白質のスクリーニング２］
実施例２においてｐ５３をユビキチン化が未知の新規蛋白質であるＳ６０に換えた以外は実施例２と同様にして標的蛋白質のスクリーニングを行った。
本発明では、この遺伝子をプラスミドに組み込むために両端部に制限酵素で切断できる配列を付加した。
ＢａｍＨＩにより切断できる配列「５’−ＧＧＡＴＣＣ−３’」及びその上流に「５’−ＧＣＧ−３’」を付加したプライマー及びＸｈｏＩにより切断できる配列「５’−ＣＴＣＧＡＧ−３’」及びその上流に「５’−ＣＡＣ−３’」を付加したプライマーを使用してＰＣＲを行った。
増幅した前記両端部に制限酵素で切断できる配列を付加したＳ６０をコードする遺伝子を発現プラスミド(商品ｐＧＥＸ４Ｔ−１ Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ社製)のＢａｍＨＩ−ＸｈｏＩ部位に導入し、ＧＳＴ−Ｓ６０蛋白質を大腸菌で発現できる組換えプラスミドを構築した。
【００４９】
結果を図８に示す。
レーン１はユビキチン（Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ）、Ｅ１、Ｅ２、Ｅ３としてＭＤＭ２を発現する実施例１で得られた発現ベクターとＳ６０を発現できる前記発現ベクターを導入したものである。
レーン２はユビキチン（Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ）、Ｅ１、Ｅ２、Ｅ３としてＣＯＰ１を発現する実施例１で得られた発現ベクターとＳ６０を発現できる前記発現ベクターを導入したものである。
ＣＢＢ染色の結果より、通常のＳ６０の大きさは６０ＫＤａ付近であることが示された。
図８で得られたバンドはユビキチン（Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ）化され通常のＳ６０よりも上部２箇所にシフトしている。
実施例１で得られた発現ベクターにより、ユビキチン（Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ）化されたＳ６０を得ることができた。
以上実施例２および３より、ユビキチン標的タンパク質の候補群を用いたスクリーニングに利用することが出来る。
【００５０】
［実施例４］
［ポリユビキチン（Ｐｏｌｙ−Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ）化蛋白質の製造］
実施例３において培養条件を以下の条件に換えた以外は実施例３と同様にして標的蛋白質のポリユビキチン化を生じさせた。
実施例１で得た組換えプラスミド、前記Ｓ６０を発現できる組換えプラスミドを大腸菌へ形質転換しクロラムフェニコール及びアンピシリンを含む培地で選別した後、活きの良い状態のまま、アンピシリンのみを含む培地において３７℃にてＯＤが０．１未満から培養を開始し、ＯＤが０．３になるまで培地に培養し、さらにクロラムフェニコール、ＩＰＴＧを０．２ｍＭ加えて各遺伝子の発現を誘導しながら２５℃にて１６時間振盪培養した。
【００５１】
結果を図８に示す。
レーン１は実施例３の条件のままである。
レーン２は実施例４にて培養条件を変更したものである。
レーン２より、ユビキチンが重合したポリユビキチン化が標的タンパク質に生じていることがわかる。
以上実施例４より、ポリユビキチン化タンパク質の製造に利用することが出来る。
【図面の簡単な説明】
【００５２】
【図１】組換えプラスミドに導入する遺伝子（ユビキチン）を示す図である。
【図２】組換えプラスミドに導入する遺伝子（Ｅ１）を示す図である。
【図３】組換えプラスミドに導入する遺伝子（Ｅ２）を示す図である。
【図４】組換えプラスミドに導入する遺伝子（Ｅ３・ＣＯＰ１）を示す図である。
【図５】組換えプラスミドに導入する遺伝子（Ｅ３・ＭＤＭ２）を示す図である。
【図６】本発明の組換えプラスミドを示す図である。
【図７】ユビキチン化蛋白質（ｐ５３）のスクリーニング結果を示す写真である。
【図８】ユビキチン化蛋白質（Ｓ６０）のスクリーニング結果を示す写真である。
【図９】ポリユビキチン化蛋白質（Ｓ６０）を得た結果を示す写真である。
【配列表フリーテキスト】
【００５３】
配列番号７ ： ＰＣＲ用プライマー
配列番号８ ： ＰＣＲ用プライマー
配列番号９ ： ＰＣＲ用プライマー
配列番号１０ ： ＰＣＲ用プライマー
配列番号１１ ： ＰＣＲ用プライマー
配列番号１２ ： ＰＣＲ用プライマー
配列番号１３ ： ＰＣＲ用プライマー
配列番号１４ ： ＰＣＲ用プライマー
配列番号１５ ： ＰＣＲ用プライマー
配列番号１６ ： ＰＣＲ用プライマー
配列番号１７ ： ＰＣＲ用プライマー
配列番号１８ ： ＰＣＲ用プライマー
配列番号１９ ： ＰＣＲ用プライマー
配列番号２０ ： ＰＣＲ用プライマー
配列番号２１ ： ＰＣＲ用プライマー
配列番号２２ ： ＰＣＲ用プライマー
配列番号２３ ： ＰＣＲ用プライマー
【技術分野】
【０００１】
本発明は、組換えプラスミド及びこれにより形質転換された大腸菌並びにこれを使用したユビキチン（Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ）化蛋白質の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ユビキチンは７６個のアミノ酸からなる安定性の高いタンパク質であり、ユビキチン様蛋白質ＳＵＭＯまたはＮＥＤＤ８と同様に標的蛋白質に共有結合して蛋白質の機能変換を触媒する修飾分子である。
この蛋白質修飾は蛋白質の翻訳、ＤＮＡ修復、エンドサイトーシス、アミノ酸輸送、翻訳調節、シグナル伝達、さらには蛋白質の分解など多彩な役割に関与している。特に蛋白質の分解に関しては多彩な生体反応を迅速に順序よく、一過的にかつ一方向に決定する合理的な手段として細胞周期・アポトーシス・代謝調節・シグナル伝達・転写制御・ストレス応答・免疫応答など生命活動のさまざまな領域で中心的な役割を果たしている。
ユビキチン化の反応はＥ１、Ｅ２及びＥ３酵素の３つの酵素により触媒される基質修飾反応である。
ユビキチン化される標的蛋白質を同定するには試験管内におけるユビキチン化反応が重要であるが、このためにはユビキチン活性化酵素（Ｅ１）、結合酵素（Ｅ２）、連結酵素（Ｅ３）、さらにはユビキチンが必要となる。
Ｅ１はチオエステル結合を介してユビキチンを活性化し、Ｅ２はＥ１からユビキチンを受け取ってＥ３へ渡すユビキチンの担体として作用する。
Ｅ３はＥ２に結合するユビキチンを基質に連結する触媒活性を持つ。従って、新規のユビキチン化標的蛋白質を試験管内におけるユビキチン化反応を用いてスクリーニングすることは多大な労力が必要となり非常に困難であった。
また、ユビキチンはユビキチン間でも共有結合を繰り返してポリユビキチン鎖を形成する。最も良く知られているユビキチンの機能のひとつ、タンパクの分解マーカー、２６Ｓプロテアソームへのターゲッティングシグナル機能もポリユビキチン化が生じなければならない。
試験管内におけるポリユビキチン化はユビキチン化よりも更に難しいとされており、大腸菌を用いる簡便な方法で製造、および精製することによる大量調整が可能となれば画期的なことである。
前記ＳＵＭＯ化については、組換えベクターを利用して細菌などの宿主細胞中で標的蛋白質をＳＵＭＯ化し蛋白質ポリマー等を大量に生産する方法が知られているがユビキチン化については知られていなかった（例えば特許文献１参照）。
【０００３】
【特許文献１】国際公開第０４／０３１１２４３号パンフレット
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
したがって、本発明の目的は、ユビキチン（Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ）と標的蛋白質を大腸菌内で同時に発現させ、大腸菌内で両蛋白質を結合（ユビキチン（Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ）化）させるために使用する組換えプラスミド及び前記組換えプラスミドにより形質転換された大腸菌並びに前記形質転換された大腸菌を使用して未知の標的蛋白質をスクリーニング（同定・検出）する方法及びユビキチン（Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ）およびポリユビキチン（Ｐｏｌｙ−Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ）化された標的蛋白質を製造・精製する方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者らは上記の目的を達成するために鋭意研究を重ねた結果、大腸菌内でユビキチン（Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ）化に必要な（Ａ）ユビキチン（Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ）を活性化する酵素（Ｅ１）、（Ｂ）ユビキチン（Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ）と標的蛋白質の結合酵素（Ｅ２）、（Ｃ）ユビキチン（Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ）と標的蛋白質の連結酵素（Ｅ３）、（Ｄ）ユビキチン（Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ）を発現することができる組換えプラスミドを使用して大腸菌内で標的蛋白質のユビキチン（Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ）化ができることを見出し、本発明を完成するに至った。
従って、本発明は、
（１）以下の（Ａ）〜（Ｄ）のうち１種又は２種以上をコードする遺伝子を含み大腸菌内で同時に発現できる組換えプラスミドである。
（Ａ）ユビキチン（Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ）を活性化する酵素（Ｅ１）
（Ｂ）ユビキチン（Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ）と標的蛋白質の結合酵素（Ｅ２）
（Ｃ）ユビキチン（Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ）と標的蛋白質の連結酵素（Ｅ３）
（Ｄ）ユビキチン（Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ）。
（２）以下の（Ａ）〜（Ｃ）をコードする遺伝子を含み大腸菌内で同時に発現できる組換えプラスミドである。
（Ａ）ユビキチン（Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ）を活性化する酵素（Ｅ１）
（Ｂ）ユビキチン（Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ）と標的蛋白質の結合酵素（Ｅ２）
（Ｃ）ユビキチン（Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ）。
（３） 以下の（Ａ）〜（Ｄ）をコードする遺伝子を含み大腸菌内で同時に発現できる組換えプラスミドである。
（Ａ）ユビキチン（Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ）を活性化する酵素（Ｅ１）
（Ｂ）ユビキチン（Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ）と標的蛋白質の結合酵素（Ｅ２）
（Ｃ）ユビキチン（Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ）標的蛋白質の連結酵素（Ｅ３）
（Ｄ）ユビキチン（Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ）。
（４）以下の（Ａ）〜（Ｅ）のうち１種又は２種以上をコードする遺伝子を含み大腸菌内で同時に発現できる第１の組換えプラスミド、
（Ａ）ユビキチン（Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ）を活性化する酵素（Ｅ１）
（Ｂ）ユビキチン（Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ）と標的蛋白質の結合酵素（Ｅ２）
（Ｃ）ユビキチン（Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ）と標的蛋白質の連結酵素（Ｅ３）
（Ｄ）ユビキチン（Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ）
（Ｅ）標的蛋白質
及び（Ａ）〜（Ｅ）のうち第１の組換えプラスミドに含まれない残りをコードする遺伝子を含み大腸菌で同時に発現できる第２の組換えプラスミド、を有する形質転換された大腸菌である。
（５）以下の（Ａ）〜（Ｄ）をコードする遺伝子を含み大腸菌内で同時に発現できる組換えプラスミド、
（Ａ）ユビキチン（Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ）を活性化する酵素（Ｅ１）
（Ｂ）ユビキチン（Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ）と標的蛋白質の結合酵素（Ｅ２）
（Ｃ）ユビキチン（Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ）と標的蛋白質の連結酵素（Ｅ３）
（Ｄ）ユビキチン（Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ）
及び以下の（Ｅ）をコードする遺伝子を含み大腸菌内で同時に発現できる組換えプラスミド、
（Ｅ）標的蛋白質
を有する形質転換された大腸菌である。
（６）ユビキチン（Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ）を活性化する酵素（Ｅ１）がＵＢＥ１、ユビキチン（Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ）と標的蛋白質の結合酵素（Ｅ２）がＵＢＣＨ５、ユビキチン（Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ）と標的蛋白質の連結酵素（Ｅ３）がＣＯＰ１であることを特徴とする請求項１又は請求項３に記載の組換えプラスミドである。
（７）受託番号がＦＥＲＭ−Ｐ２０９１７である請求項２に記載の組換えプラスミドである。
（８）受託番号がＦＥＲＭ−Ｐ２０９１８である請求項３に記載の組換えプラスミドである。
（９）請求項４又は請求項５に記載の形質転換された大腸菌を使用したユビキチン（Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ）化蛋白質のスクリーニング方法である。
（１０）請求項４又は請求項５に記載の形質転換された大腸菌を使用したユビキチン（Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ）化蛋白質又はポリユビキチン（ｐｏｌｙ−Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ）化蛋白質の製造方法である。
【発明の効果】
【０００６】
多大な労力なくしてユビキチン（Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ）化された標的蛋白質を得ることが出来るようになったことから、ユビキチン（Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ）による標的蛋白質の機能変換システム、そこから生じる生理作用を研究する上で非常に大きく貢献することができる。
また、本発明のスクリーニング方法は、未知の標的蛋白質を効率良く同定できる方法であり、ユビキチン（Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ）の新たな作用機序、生理的重要性を発見する上で大きく貢献すると考えられる。
同様に未知の標的蛋白質を効率良くポリユビキチン（Ｐｏｌｙ−Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ）化させることは多大な労力が必要であり、その反応の難しさから非常に困難であった。
従来の煩雑な操作を用いることなく融合蛋白質を回収することができる為、解析する上で非常に大きく貢献することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００７】
以下、本発明を詳細に説明する。
ユビキチン（Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ）は、ユビキチン（Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ）を活性化する酵素（Ｅ１）、ユビキチン（Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ）と標的蛋白質の結合酵素（Ｅ２）、ユビキチン（Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ）と標的蛋白質の連結酵素（Ｅ３）からなる複合酵素系によって標的蛋白質に結合する。
Ｅ１としてＵＢＥ１（ユビキチン（Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ）-activating enzyme E1）、Ｅ２としてＵＢＣＨ５（ユビキチン（Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ）-conjugating
enzyme E2D3）、Ｅ３としてＣＯＰ１（constitutive photomorphogenic 1）またはＭＤＭ２（transformed 3T3
cell double minute 2, p53 binding protein）が知られている。しかしながらＥ２，Ｅ３は高度に多様性を持ち標的蛋白質により異なる。
従って実施例ではＣＯＰ１（constitutive photomorphogenic 1）またはＭＤＭ２（transformed
3T3 cell double minute 2）の２種類を用いたがその他のＥ２、Ｅ３を用いることもできる。
【０００８】
ユビキチン（Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ）は標的蛋白質と結合する際、成熟型の構造をとり、そのＣ末端はＧｌｙ−Ｇｌｙで終わっている。
このＣ末端Ｇｌｙ 残基が、標的蛋白質のLysのε‐アミノ基とＡＴＰ-Ｍｇ２＋存在下にてイソペプチド結合して連結することが知られている。
【０００９】
従ってユビキチン（Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ）は成熟型の状態、つまりＣ末端がＧｌｙ−Ｇｌｙとなるように発現するように組換えプラスミドを構築する。
【００１０】
Ｅ３は特に高度に多様性を持ち標的蛋白質ごとに異なる。従って作成した組み換えプラスミドはＥ３部位を自由に組み換えられるように組換えプラスミドを構築する。
【００１１】
ユビキチン（Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ）、ＵＢＥ１、ＵＢＣＨ５、ＣＯＰ１、ＭＤＭ２をコードする遺伝子は、ＧｅｎＢａｎｋにおいてそれぞれＭ１７５９７、ＢＣ０５８６３０、Ｕ３９３１８、ＢＣ０３９７２３、ＢＴ００７２５８として登録されている。
ユビキチン（Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ）、ＵＢＥ１、ＵＢＣＨ５、ＣＯＰ１、ＭＤＭ２及び標的蛋白質をコードする遺伝子にＰＣＲ法によって制限酵素により切断できる配列を付加し、これらを発現することができるプラスミドのプロモーターの下流に挿入し、次いでプロモータごと切り出すか、又は、その部位をコードする遺伝子にＰＣＲ法によって制限酵素により切断できる配列を付加し、これを別のプラスミドに組み込み組換えプラスミドを得て、該組換えプラスミドを大腸菌に導入する。
【００１２】
組換えプラスミドに組み込む遺伝子の組合せは、１つのプラスミドにユビキチン（Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ）、ＵＢＥ１、ＵＢＣＨ５、Ｅ３（ＣＯＰ１またはＭＤＭ２）及び標的蛋白質をコードする遺伝子を組み込んでもよく、２つのプラスミドに適宜選択して組み込んでも良い。
また、組み込む遺伝子は同種のものを複数組み込んでもよい。
【００１３】
ユビキチン（Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ）化蛋白質を大量に製造する場合は、前記のとおりコードする遺伝子を適宜組み込めばよいが、スクリーニングに使用する場合は、ユビキチン（Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ）、ＵＢＥ１、ＵＢＣＨ５、Ｅ３（ＣＯＰ１またはＭＤＭ２）をコードする遺伝子は、第１のプラスミドに、標的蛋白質をコードする遺伝子を第２のプラスミドに組み込む組合せが好ましい。
【００１４】
第１のプラスミドを導入し形質転換した大腸菌に第２のプラスミドを後から導入することができる。
また、逆に第２のプラスミドを導入し形質転換した大腸菌に第１のプラスミドを後から導入することもできる。
【００１５】
２種類のプラスミドを同一大腸菌内へ導入する場合には、プラスミドのＤＮＡ複製開始領域はｐＢＲ３２２とｐ１５Ａ由来のＤＮＡ複製開始領域を持つ組み合わせなど、互換性を持つ組み合わせで用いる。
また、プラスミドには薬剤耐性遺伝子等の選択マーカーを組み込んでおく。選択マーカーとしては、例えば、テトラサイクリン耐性遺伝子またはアンピシリン耐性遺伝子等を使用することができる。
【００１６】
プラスミドとしては、大腸菌において自立複製可能ないしは染色体中への組込みが可能で、上記目的とする遺伝子を転写できる位置にプロモーターを含有しているものが用いられる。
プロモーターはＴａｑプロモーターやＴ7プロモーターを用い、それぞれの遺伝子産物がＩＰＴＧ（isopropyl-1-thio-βloch-D-galactopyranoside）により発現誘導可能となるように設計する。
なお、プラスミドの導入は、従来公知の方法が使用できる。
【００１７】
発現のためのプロモーターは、各蛋白質をコードする遺伝子の上流に個々に組み込みそれぞれが別に発現するように組み込むほか、一括して融合状態で発現するように組み込むこともできるが、融合して発現した場合は蛋白質を切断する等の調整が必要であり、個々に組み込むことが好ましい。
また、プロモーターをプラスミドに個々の蛋白質が発現するように組み込んだ場合は、ターミネーターを特に組み込まなくても終止コドンを遺伝子配列に付加すれば活性を有する酵素を得ることができる。
【００１８】
前記ユビキチン（Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ）には、ＧＳＴ（グルタチオンＳトランスフェラーゼ）、Ｈｉｓ（ポリヒスチジン）などの容易に精製したり検出したりできるように目印となるアミノ酸配列（タグ配列）を付加することができる。
また、標的蛋白質自体に、前記アミノ酸配列（タグ配列）を融合し精製したり検出したりできるようにすることもできる。
【００１９】
構造解析用の大量調整の場合は小さい分子量のタグ配列を用いるか、もしくは精製後に融合部位を特異的なプロテアーゼで切断し目的蛋白質のみを本来の形で取得できるようにプロテアーゼ切断配列を組み込んでおくことが好ましい。
【００２０】
形質転換した大腸菌の選択は、大腸菌を前記選択マーカーに対応する薬剤耐性選択寒天培地プレート等に塗抹して培養し、生じた単一のコロニーを選択することで行うことができる。
【００２１】
形質転換した大腸菌の培養方法は通常の方法に従って行うことができる。
培養する培地は該微生物が資化し得る炭素原、窒素原、無機塩類等を含有し、形質転換体の培養には天然培地、合成培地のいずれも使用することができる。
培養形式、培養温度、培養時間、培地ｐＨ等は、用いる大腸菌に応じて通常行われる条件を採用することができる。
【００２２】
ユビキチン（Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ）化標的蛋白質の単離は、組換プラスミドを導入し形質転換した大腸菌を３７℃にてＯＤが０．１未満から培養を開始し、ＯＤが０．３になるまで培地に培養し、さらにＩＰＴＧを０．２ｍＭ加えて各遺伝子の発現を誘導しながら２５℃にて１６時間以上培養をおこない、培養中にユビキチン（Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ）化標的蛋白質を生成蓄積させ、該培養物より該ユビキチン（Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ）化標的蛋白質を採取することにより行うことができる。
【００２３】
ポリユビキチン（Ｐｏｌｙ−Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ）化標的蛋白質の単離は、組換プラスミドを導入し形質転換した大腸菌（対数増殖期の大腸菌を使用）を抗生物質を含む培地において３７℃にてＯＤが０．１未満から培養を開始し、ＯＤが０．３になるまで培地に培養する（使用したプラスミドがｐ１５Ａ由来ＤＮＡ複製開始領域をもつ場合においてはこの段階では抗生物質を含まない培地を使用する）。ＯＤが０．３になった後、ＩＰＴＧを０．２ｍＭ加えて各遺伝子の発現を誘導しながら２５℃にて１６時間以上培養をおこない、培養中にポリユビキチン（Ｐｏｌｙ−Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ）化標的蛋白質を生成蓄積させ、該培養物より該ポリユビキチン（Ｐｏｌｙ−Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ）化標的蛋白質を採取することにより行うことができる（使用したプラスミドがｐ１５Ａ由来ＤＮＡ複製開始領域をもつ場合においてはＯＤが０．３になった後に抗生物質を加える）。
【００２４】
例えば、菌体を遠心分離で沈殿回収し、水系緩衝液中に懸濁後、超音波破砕機等により大腸菌を破砕する。
遠心分離の後、上澄み液を取り出しユビキチン（Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ）化標的蛋白質またはポリユビキチン（Ｐｏｌｙ−Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ）を得ることができる。
スクリーニングの場合は、例えば上澄み液をＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタン法にてタグ配列の抗体を使用してユビキチン化標的蛋白質を検出する。
大量調整の場合は、例えばＧＳＴがタグとして使用されている場合には、上澄み液を取り出し、グルタチオンセファロースビーズとインキュベートし、ビーズに結合した蛋白質を溶出、もしくはプロテアーゼ切断配列の使用など、タグ配列特異的な精製方法にて通常行われる条件で精製することができる。
【実施例】
【００２５】
以下本発明を実施例により具体的に説明する。
［実施例１］
１．ユビキチン（Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ）をコードする遺伝子の調製
ユビキチン（Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ）をコードする遺伝子は、ＧｅｎＢａｎｋにおいてＭ１７５９７として登録されている
本発明では、発現したとき成熟型になるよう遺伝子を選択し終止コドンを付加した（配列番号１）。
また、発現したとき成熟型になるようＣ末端はＧｌｙ‐Ｇｌｙで終わるように遺伝子をプラスミドに組み込むために両端部に制限酵素で切断できる配列を付加した。
さらにスクリーニングに使用できるよう、ユビキチン（Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ）の前方に検出できるようにＨＡタグ配列を付加した。
ＮｃｏＩにより切断できる配列「５’−ＣＣＡＴＧＧ−３’」及びその上流に「５’−ＧＣＧ−３’」を付加したプライマー（配列番号７）及びＢａｍＨＩにより切断できる配列「５’−ＧＧＡＴＣＣ−３’」及びその上流に「５’−ＧＣＧ−３’」を付加したプライマー（配列番号８）を使用してＰＣＲを行った。
このプライマーによりプラスミドにユビキチン（Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ）をコードする遺伝子を組み込んだときＣ末端はＧｌｙ‐Ｇｌｙとなる成熟型ユビキチン（Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ）をコードする遺伝子を得た。
【００２６】
２．ＵＢＥ１をコードする遺伝子の調製
ＢＥ１をコードする遺伝子は、ＧｅｎＢａｎｋにおいてＢＣ０５８６３０として登録されている（配列番号２）。
本発明では、これらの遺伝子をプラスミドに組み込むために両端部に制限酵素で切断できる配列を付加した。
ＮｃｏＩにより切断できる配列およびその下流にアミノ酸の読み枠が変化しないように２アミノ酸を付加した配列「５’−ＣＣＡＴＧＧＧＡ−３’」及びその上流に「５’−ＧＣＧ−３’」を付加したプライマー（配列番号９）及びＸｈｏＩにより切断できる配列「５’−ＣＴＣＧＡＧ−３’」及びその上流に「５’−ＧＣＧ−３’」を付加したプライマー（配列番号１０）を使用してＰＣＲを行った。
【００２７】
３．ＵＢＣＨ５をコードする遺伝子の調製
ＵＢＣＨ５をコードする遺伝子は、ＧｅｎＢａｎｋにおいてＵ３９３１８として登録されている（配列番号３）。
本発明では、これらの遺伝子をプラスミドに組み込むために両端部に制限酵素で切断できる配列を付加した。
ＮｃｏＩにより切断できる配列「５’−ＣＣＡＴＧＧ−３’」及びその上流に「５’−ＧＣＧ−３’」を付加したプライマー（配列番号１１）及びＢａｍＨＩにより切断できる配列「５’−ＧＧＡＴＣＣ−３’」及びその上流に「５’−ＧＣＧ−３’」を付加したプライマー（配列番号１２）を使用してＰＣＲを行った。
【００２８】
４．ＣＯＰ１をコードする遺伝子の調製
ＣＯＰ１をコードする遺伝子は、ＧｅｎＢａｎｋにおいてＢＣ０３９７２３として登録されている（配列番号４）。
本発明では、これらの遺伝子をプラスミドに組み込むために両端部に制限酵素で切断できる配列を付加した。
ＮｃｏＩにより切断できる配列およびその下流にアミノ酸の読み枠が変化しないように２アミノ酸を付加した配列「５’−ＣＣＡＴＧＧＧＣ−３’」及びその上流に「５’−ＧＣＧ−３’」を付加したプライマー（配列番号１３）及びにＸｈｏＩより切断できる配列「５’−ＣＴＣＧＡＧ−３’」及びその上流に「５’−ＧＣＧ−３’」を付加したプライマー（配列番号１４）を使用してＰＣＲを行った。
【００２９】
５．ＭＤＭ２をコードする遺伝子の調製
ＭＤＭ２をコードする遺伝子は、ＧｅｎＢａｎｋにおいてＢＴ００７２５８として登録されている（配列番号５）。
本発明では、これらの遺伝子をプラスミドに組み込むために両端部に制限酵素で切断できる配列を付加した。
ＮｃｏＩにより切断できる配列およびその下流にアミノ酸の読み枠が変化しないように２アミノ酸を付加した配列「５’−ＣＣＡＴＧＧＴＧ−３’」及びその上流に「５’−ＧＣＧ−３’」を付加したプライマー（配列番号１５）及びにＢａｍＨＩより切断できる配列「５’−ＧＧＡＴＣＣ−３’」及びその上流に「５’−ＧＣＧ−３’」を付加したプライマー（配列番号１６）を使用してＰＣＲを行った。
【００３０】
５．プロモーターの付加
５−１．ユビキチン（Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ）をコードする遺伝子
前記制限酵素により切断できる配列を付加したユビキチン（Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ）をコードする遺伝子を発現プラスミド（ 商品名ｐＥＴ１５ｂ Ｎｏｖａｇｅｎ社製）のＮｃｏＩ−ＢａｍＨＩ部位に組み込んだ。
その後、Ｔ７プロモータとともにＳｐｈＩ−ＢａｍＨＩで切り出した（図１）。
【００３１】
５−２．ＵＢＥ１をコードする遺伝子
前記制限酵素により切断できる配列を付加したＵＢＥ１をコードする遺伝子を発現プラスミド（ 商品名ｐＥＴ１５ｂ Ｎｏｖａｇｅｎ社製）のＮｃｏＩ−ＸｈｏＩ部位に組み込んだ。
その後、Ｔ７プロモータ配列部位を付加したＵＢＥ１を作成するために両端部に制限酵素で切断できる配列を付加した。
Ｔ７プロモータ配列上流にＢｇｌＩＩにより切断できる配列「５’−ＡＧＡＴＣＴ−３’」及びその上流に「５’−ＧＣＧ−３’」を付加したプライマー（配列番号１７）、およびＵＢＥ１より下流にＥｃｏＲＶにより切断できる配列「５’−ＧＡＴＡＴＣ−３’」及びその上流に「５’−ＧＣＧ−３’」を付加したプライマー（配列番号１８）を使用してＰＣＲを行った。
その後、Ｔ７プロモータとともにＢｇｌＩＩ−ＥｃｏＲＶで切り出した（図２）。
【００３２】
５−３．ＵＢＣＨ５をコードする遺伝子
前記制限酵素により切断できる配列を付加したＵＢＣＨ５をコードする遺伝子を発現プラスミド（ 商品名ｐＥＴ１５ｂ Ｎｏｖａｇｅｎ社製）のＮｃｏＩ−ＢａｍＨＩ部位に組み込んだ。
その後、Ｔ７プロモータ配列部位を付加したＵＢＣＨ５を作成するために両端部に制限酵素で切断できる配列を付加した。
Ｔ７プロモータ配列上流にＥｃｏＲＶにより切断できる配列「５’−ＧＡＴＡＴＣ−３’」及びその上流に「５’−ＧＣＧ−３’」を付加したプライマー（配列番号１９）、およびＵＢＣＨ５より下流にＨｉｎｄＩＩＩにより切断できる配列「５’−ＡＡＧＣＴＴ−３’」及びその上流に「５’−ＧＣＧ−３’」を付加したプライマー（配列番号２０）を使用してＰＣＲを行った。
その後、Ｔ７プロモータとともにＥｃｏＲＶ−ＨｉｎｄＩＩＩで切り出した（図３）。
【００３３】
５−４．ＣＯＰ１をコードする遺伝子
前記制限酵素により切断できる配列を付加したＣＯＰ１をコードする遺伝子を発現プラスミド（ 商品名ｐＥＴ１５ｂ Ｎｏｖａｇｅｎ社製）のＮｃｏＩ−ＸｈｏＩ部位に組み込んだ。
その後、Ｔ７プロモータ配列部位を付加したＣＯＰ１を作成するために両端部に制限酵素で切断できる配列を付加した。
Ｔ７プロモータ配列上流にＥｃｏＲＶにより切断できる配列「５’−ＧＡＴＡＴＣ−３’」及びその上流に「５’−ＧＣＧ−３’」を付加したプライマー（配列番号１９）、およびＣＯＰ１より下流にＥｃｏＲＶにより切断できる配列「５’−ＧＡＴＡＴＣ−３’」及びその上流に「５’−ＧＣＧ−３’」を付加したプライマー（配列番号２１）を使用してＰＣＲを行った。
その後、Ｔ７プロモータとともにＥｃｏＲＶ−ＥｃｏＲＶで切り出した（図４）。
【００３４】
５−５．ＭＤＭ２をコードする遺伝子
前記制限酵素により切断できる配列を付加したＭＤＭ２をコードする遺伝子を発現プラスミド（ 商品名ｐＥＴ１５ｂ Ｎｏｖａｇｅｎ社製）のＮｃｏＩ−ＢａｍＨＩ部位に組み込んだ。
その後、Ｔ７プロモータ配列部位を付加したＭＤＭ２を作成するために両端部に制限酵素で切断できる配列を付加した。
Ｔ７プロモータ配列上流にＥｃｏＲＶにより切断できる配列「５’−ＧＡＴＡＴＣ−３’」及びその上流に「５’−ＧＣＧ−３’」を付加したプライマー（配列番号１９）、およびＣＯＰ１より下流にＥｃｏＲＶにより切断できる配列「５’−ＧＡＴＡＴＣ−３’」及びその上流に「５’−ＧＣＧ−３’」を付加したプライマー（配列番号２１）を使用してＰＣＲを行った。
その後、Ｔ７プロモータとともにＥｃｏＲＶ−ＥｃｏＲＶで切り出した（図５）。
【００３５】
６．組換え発現プラスミドの調製
前記プロモータを付加した配列をｐ１５Ａ由来のＤＮＡ複製開始領域を持ち、クロラムフェニコール耐性を持つ発現プラスミド（商品名ｐＡＣＹＣ１８４ ＮＩＰＰＯＮ ＧＥＮＥ社製）へ以下の順番で組み込み本発明の組換えプラスミドを得た（図６）。
まずｐＡＣＹＣ１８４のＳｐｈI−ＢａｍＨＩ部位を切断し、前記５−１で得られたユビキチン（Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ）をコードする遺伝子をｐＡＣＹＣ１８４にライゲーション法により組み込んだ。
【００３６】
次に、ｐＡＣＹＣ１８４へＵＢＥ１をコードする遺伝子を組み込んだ。
ｐＡＣＹＣ１８４をＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＶで切断し、前記５−２で得られたＵＢＥ１をコードする遺伝子をｐＡＣＹＣ１８４にライゲーション法により組み込んだ。
【００３７】
次に、ｐＡＣＹＣ１８４へＵＢＣＨ５をコードする遺伝子を組み込んだ。
ｐＡＣＹＣ１８４をＥｃｏＲＶ−ＨｉｎｄＩＩＩで切断し、前記５−３で得られたＵＢＣＨ５をコードする遺伝子をｐＡＣＹＣ１８４にライゲーション法により組み込んだ。
【００３８】
標的蛋白質の連結酵素（Ｅ３）には特に多様性が認められるため、（Ｅ３）を最後に組み込むことでその多様性に対応できるようにした。
従って、標的蛋白質の連結酵素（Ｅ３）を組み込む前の本プラスミドを独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター（茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６）に、２００６年（平成１８年）５月２２日 受託番号 ＦＥＲＭ ＡＰ−２０９１７として寄託している。
【００３９】
次に、ｐＡＣＹＣ１８４へＣＯＰ１をコードする遺伝子を組み込んだ。
まずｐＡＣＹＣ１８４をＥｃｏＲＶ−ＥｃｏＲＶで切断し、前記５−４で得られたＣＯＰ１をコードする遺伝子をｐＡＣＹＣ１８４にライゲーション法により組み込んだ。
【００４０】
なお、本プラスミドは独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センター（茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６）に、２００６年（平成１８年）５月２２日 受託番号 ＦＥＲＭ ＡＰ−２０９１８として寄託している。
【００４１】
以上のとおり、ｐＡＣＹＣ１８４に前記５．プロモーターの付加により得られた遺伝子を組み込むには組み込む順番が重要である。前記の順番を変更した場合、例えば、ＵＢＥ１をコードする遺伝子を組み込んだ後にユビキチン（Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ）をコードする遺伝子を組み込もうとすると、ＢｇｌＩＩによりＢａｍＨＩが使用できなくなってしまう。
【００４２】
もしくは、ＣＯＰ１の代わりにｐＡＣＹＣ１８４へＭＤＭ２をコードする遺伝子を組み込んだ。この方法は前記と同様である。
【００４３】
［実施例２］
[標的蛋白質のスクリーニング１]
１．ｐ５３を発現できる組換えプラスミドの調製
ユビキチン（Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ）の標的蛋白質であることが知られているｐ５３（p53 cellular tumor antigen）をコードする遺伝子は、ＧｅｎＢａｎｋにおいてＫ０３１９９（配列番号６）として登録されている。
本発明では、これらの遺伝子をプラスミドに組み込むために両端部に制限酵素で切断できる配列を付加した。
ＢａｍＨＩにより切断できる配列「５’−ＧＧＡＴＣＣ−３’」及びその上流に「５’−ＧＣＧ−３’」を付加したプライマー（配列番号２２）及びＸｈｏＩにより切断できる配列「５’−ＣＴＣＧＡＧ−３’」及びその上流に「５’−ＧＣＧ−３’」を付加したプライマー（配列番号２３）を使用してＰＣＲを行った。
増幅した前記両端部に制限酵素で切断できる配列を付加したｐ５３をコードする遺伝子を発現プラスミド(商品ｐＧＥＸ６ｐ２ Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ社製)のＢａｍＨＩ−ＸｈｏＩ部位に導入し、ＧＳＴ−ｐ５３ 蛋白質を大腸菌で発現できる組換えプラスミドを構築した。
【００４４】
２．大腸菌への導入
実施例１で得た組換えプラスミドを大腸菌ＢＬ２１ＤＥ３株に導入した。
前記組換えプラスミドが導入された大腸菌はクロラムフェニコールを含む培地で選別した。
この培地で得られたコロニーより、コンピタントセルを作成した。
前記ｐ５３を発現できる組換えプラスミドを前記コンピタントセルに導入し大腸菌を形質転換しクロラムフェニコール及びアンピシリンを含む培地で選別した。
２つの組換えプラスミドを同時に取り込んだ大腸菌はアンピシリンとクロラムフェニコールの両方を含む培地で選別できる。
【００４５】
３．ユビキチン（Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ）化蛋白質のスクリーニング
ユビキチン（Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ）化標的蛋白質の単離は、組換プラスミドを導入し形質転換した大腸菌を３７℃にてＯＤが０．１未満から培養を開始し、ＯＤが０．３になるまで培地に培養し、さらにＩＰＴＧを０．２ｍＭ加えて各遺伝子の発現を誘導しながら２５℃にて１６時間振盪培養した。
遠心分離により培養液から集菌し、緩衝液に懸濁し、超音波処理により菌体を破砕し遠心分離の後、上澄み液を取り出した。
【００４６】
上記上澄み液をＧＳＴ用精製ビーズ（商品名 Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ
Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４Ｂビーズ Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ社製）とインキュベーションし、ビーズに結合した蛋白質を溶出し精製した。ポリアクリルアミドゲルのウェルに上記蛋白質溶液をアプライしＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、分離した蛋白質をＣＢＢ染色（０．２５％ Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ Ｂｌｕｅ Ｒ−２５０/５０％メタノール/１０％酢酸）にて染色し検出した。
ユビキチン（Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ）に結合したタグ配列の抗体の反応を用いてユビキチン（Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ）化蛋白質をウエスタンブロット法で検出した。
ポリアクリルアミドゲルのウェルに前記上澄み液をアプライしＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った後、分離した蛋白質をゲルからＰＶＤＦ膜に転写した。
ＰＶＤＦ膜を５％スキムミルク／ＰＢＳに浸し、４℃で一夜放置しブロッキングした。
ＨＡタグモノクローナル抗体：１％スキムミルク／ＰＢＳ=１：１５００（Ｗ／Ｖ）の溶液をつくり、室温で１時間反応させ、ＰＢＳ−Ｔで洗浄した。
パーオキシダーゼ標識抗マウスＩｇＧ抗体：１％スキムミルク／ＰＢＳ=１：１５00（Ｗ/Ｖ）の溶液をつくり、室温で１時間反応させ、ＰＢＳ−Ｔで洗浄した。
ＥＣＬ Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔｔｉｎｇ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ(Ａｍｅｒｓｈａｍ ｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ社製) を用い、プロトコルに従い化学発光法で検出した。（図７）
【００４７】
結果を図７に示す。
レーン１はユビキチン（Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ）、Ｅ１、Ｅ２、Ｅ３としてＭＤＭ２を発現する実施例１で得られた発現ベクターとｐ５３を発現できる前記発現ベクターを導入したものである。
レーン２はユビキチン（Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ）、Ｅ１、Ｅ２、Ｅ３としてＣＯＰ１を発現する実施例１で得られた発現ベクターとｐ５３を発現できる前記発現ベクターを導入したものである。
ＣＢＢ染色の結果より、通常のｐ５３の大きさは７５ＫＤａ付近であることが示された。
図７で得られたバンドはユビキチン（Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ）化され通常のｐ５３よりも上部２箇所にシフトしている。
実施例１で得られた発現ベクターにより、ユビキチン（Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ）化されたｐ５３を得ることができた。
【００４８】
［実施例３］［標的蛋白質のスクリーニング２］
実施例２においてｐ５３をユビキチン化が未知の新規蛋白質であるＳ６０に換えた以外は実施例２と同様にして標的蛋白質のスクリーニングを行った。
本発明では、この遺伝子をプラスミドに組み込むために両端部に制限酵素で切断できる配列を付加した。
ＢａｍＨＩにより切断できる配列「５’−ＧＧＡＴＣＣ−３’」及びその上流に「５’−ＧＣＧ−３’」を付加したプライマー及びＸｈｏＩにより切断できる配列「５’−ＣＴＣＧＡＧ−３’」及びその上流に「５’−ＣＡＣ−３’」を付加したプライマーを使用してＰＣＲを行った。
増幅した前記両端部に制限酵素で切断できる配列を付加したＳ６０をコードする遺伝子を発現プラスミド(商品ｐＧＥＸ４Ｔ−１ Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ社製)のＢａｍＨＩ−ＸｈｏＩ部位に導入し、ＧＳＴ−Ｓ６０蛋白質を大腸菌で発現できる組換えプラスミドを構築した。
【００４９】
結果を図８に示す。
レーン１はユビキチン（Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ）、Ｅ１、Ｅ２、Ｅ３としてＭＤＭ２を発現する実施例１で得られた発現ベクターとＳ６０を発現できる前記発現ベクターを導入したものである。
レーン２はユビキチン（Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ）、Ｅ１、Ｅ２、Ｅ３としてＣＯＰ１を発現する実施例１で得られた発現ベクターとＳ６０を発現できる前記発現ベクターを導入したものである。
ＣＢＢ染色の結果より、通常のＳ６０の大きさは６０ＫＤａ付近であることが示された。
図８で得られたバンドはユビキチン（Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ）化され通常のＳ６０よりも上部２箇所にシフトしている。
実施例１で得られた発現ベクターにより、ユビキチン（Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ）化されたＳ６０を得ることができた。
以上実施例２および３より、ユビキチン標的タンパク質の候補群を用いたスクリーニングに利用することが出来る。
【００５０】
［実施例４］
［ポリユビキチン（Ｐｏｌｙ−Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ）化蛋白質の製造］
実施例３において培養条件を以下の条件に換えた以外は実施例３と同様にして標的蛋白質のポリユビキチン化を生じさせた。
実施例１で得た組換えプラスミド、前記Ｓ６０を発現できる組換えプラスミドを大腸菌へ形質転換しクロラムフェニコール及びアンピシリンを含む培地で選別した後、活きの良い状態のまま、アンピシリンのみを含む培地において３７℃にてＯＤが０．１未満から培養を開始し、ＯＤが０．３になるまで培地に培養し、さらにクロラムフェニコール、ＩＰＴＧを０．２ｍＭ加えて各遺伝子の発現を誘導しながら２５℃にて１６時間振盪培養した。
【００５１】
結果を図８に示す。
レーン１は実施例３の条件のままである。
レーン２は実施例４にて培養条件を変更したものである。
レーン２より、ユビキチンが重合したポリユビキチン化が標的タンパク質に生じていることがわかる。
以上実施例４より、ポリユビキチン化タンパク質の製造に利用することが出来る。
【図面の簡単な説明】
【００５２】
【図１】組換えプラスミドに導入する遺伝子（ユビキチン）を示す図である。
【図２】組換えプラスミドに導入する遺伝子（Ｅ１）を示す図である。
【図３】組換えプラスミドに導入する遺伝子（Ｅ２）を示す図である。
【図４】組換えプラスミドに導入する遺伝子（Ｅ３・ＣＯＰ１）を示す図である。
【図５】組換えプラスミドに導入する遺伝子（Ｅ３・ＭＤＭ２）を示す図である。
【図６】本発明の組換えプラスミドを示す図である。
【図７】ユビキチン化蛋白質（ｐ５３）のスクリーニング結果を示す写真である。
【図８】ユビキチン化蛋白質（Ｓ６０）のスクリーニング結果を示す写真である。
【図９】ポリユビキチン化蛋白質（Ｓ６０）を得た結果を示す写真である。
【配列表フリーテキスト】
【００５３】
配列番号７ ： ＰＣＲ用プライマー
配列番号８ ： ＰＣＲ用プライマー
配列番号９ ： ＰＣＲ用プライマー
配列番号１０ ： ＰＣＲ用プライマー
配列番号１１ ： ＰＣＲ用プライマー
配列番号１２ ： ＰＣＲ用プライマー
配列番号１３ ： ＰＣＲ用プライマー
配列番号１４ ： ＰＣＲ用プライマー
配列番号１５ ： ＰＣＲ用プライマー
配列番号１６ ： ＰＣＲ用プライマー
配列番号１７ ： ＰＣＲ用プライマー
配列番号１８ ： ＰＣＲ用プライマー
配列番号１９ ： ＰＣＲ用プライマー
配列番号２０ ： ＰＣＲ用プライマー
配列番号２１ ： ＰＣＲ用プライマー
配列番号２２ ： ＰＣＲ用プライマー
配列番号２３ ： ＰＣＲ用プライマー
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（Ａ）〜（Ｄ）のうち１種又は２種以上をコードする遺伝子を含み大腸菌内で同時に発現できる組換えプラスミド。
（Ａ）ユビキチン（Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ）を活性化する酵素（Ｅ１）
（Ｂ）ユビキチン（Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ）と標的蛋白質の結合酵素（Ｅ２）
（Ｃ）ユビキチン（Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ）と標的蛋白質の連結酵素（Ｅ３）
（Ｄ）ユビキチン（Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ）。
【請求項２】
以下の（Ａ）〜（Ｃ）をコードする遺伝子を含み大腸菌内で同時に発現できる組換えプラスミド。
（Ａ）ユビキチン（Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ）を活性化する酵素（Ｅ１）
（Ｂ）ユビキチン（Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ）と標的蛋白質の結合酵素（Ｅ２）
（Ｃ）ユビキチン（Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ）。
【請求項３】
以下の（Ａ）〜（Ｄ）をコードする遺伝子を含み大腸菌内で同時に発現できる組換えプラスミド。
（Ａ）ユビキチン（Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ）を活性化する酵素（Ｅ１）
（Ｂ）ユビキチン（Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ）と標的蛋白質の結合酵素（Ｅ２）
（Ｃ）ユビキチン（Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ）標的蛋白質の連結酵素（Ｅ３）
（Ｄ）ユビキチン（Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ）。
【請求項４】
以下の（Ａ）〜（Ｅ）のうち１種又は２種以上をコードする遺伝子を含み大腸菌内で同時に発現できる第１の組換えプラスミド、
（Ａ）ユビキチン（Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ）を活性化する酵素（Ｅ１）
（Ｂ）ユビキチン（Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ）と標的蛋白質の結合酵素（Ｅ２）
（Ｃ）ユビキチン（Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ）と標的蛋白質の連結酵素（Ｅ３）
（Ｄ）ユビキチン（Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ）
（Ｅ）標的蛋白質
及び（Ａ）〜（Ｅ）のうち第１の組換えプラスミドに含まれない残りをコードする遺伝子を含み大腸菌で同時に発現できる第２の組換えプラスミド、を有する形質転換された大腸菌。
【請求項５】
以下の（Ａ）〜（Ｄ）をコードする遺伝子を含み大腸菌内で同時に発現できる組換えプラスミド、
（Ａ）ユビキチン（Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ）を活性化する酵素（Ｅ１）
（Ｂ）ユビキチン（Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ）と標的蛋白質の結合酵素（Ｅ２）
（Ｃ）ユビキチン（Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ）と標的蛋白質の連結酵素（Ｅ３）
（Ｄ）ユビキチン（Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ）
及び以下の（Ｅ）をコードする遺伝子を含み大腸菌内で同時に発現できる組換えプラスミド、
（Ｅ）標的蛋白質
を有する形質転換された大腸菌。
【請求項６】
ユビキチン（Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ）を活性化する酵素（Ｅ１）がＵＢＥ１、ユビキチン（Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ）と標的蛋白質の結合酵素（Ｅ２）がＵＢＣＨ５、ユビキチン（Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ）と標的蛋白質の連結酵素（Ｅ３）がＣＯＰ１であることを特徴とする請求項１又は請求項３に記載の組換えプラスミド。
【請求項７】
受託番号がＦＥＲＭ−Ｐ２０９１７である請求項２に記載の組換えプラスミド。
【請求項８】
受託番号がＦＥＲＭ−Ｐ２０９１８である請求項３に記載の組換えプラスミド。
【請求項９】
請求項４又は請求項５に記載の形質転換された大腸菌を使用したユビキチン（Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ）化蛋白質のスクリーニング方法。
【請求項１０】
請求項４又は請求項５に記載の形質転換された大腸菌を使用したユビキチン（Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ）化蛋白質又はポリユビキチン（ｐｏｌｙ−Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ）化蛋白質の製造方法。
【請求項１】
以下の（Ａ）〜（Ｄ）のうち１種又は２種以上をコードする遺伝子を含み大腸菌内で同時に発現できる組換えプラスミド。
（Ａ）ユビキチン（Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ）を活性化する酵素（Ｅ１）
（Ｂ）ユビキチン（Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ）と標的蛋白質の結合酵素（Ｅ２）
（Ｃ）ユビキチン（Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ）と標的蛋白質の連結酵素（Ｅ３）
（Ｄ）ユビキチン（Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ）。
【請求項２】
以下の（Ａ）〜（Ｃ）をコードする遺伝子を含み大腸菌内で同時に発現できる組換えプラスミド。
（Ａ）ユビキチン（Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ）を活性化する酵素（Ｅ１）
（Ｂ）ユビキチン（Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ）と標的蛋白質の結合酵素（Ｅ２）
（Ｃ）ユビキチン（Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ）。
【請求項３】
以下の（Ａ）〜（Ｄ）をコードする遺伝子を含み大腸菌内で同時に発現できる組換えプラスミド。
（Ａ）ユビキチン（Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ）を活性化する酵素（Ｅ１）
（Ｂ）ユビキチン（Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ）と標的蛋白質の結合酵素（Ｅ２）
（Ｃ）ユビキチン（Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ）標的蛋白質の連結酵素（Ｅ３）
（Ｄ）ユビキチン（Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ）。
【請求項４】
以下の（Ａ）〜（Ｅ）のうち１種又は２種以上をコードする遺伝子を含み大腸菌内で同時に発現できる第１の組換えプラスミド、
（Ａ）ユビキチン（Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ）を活性化する酵素（Ｅ１）
（Ｂ）ユビキチン（Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ）と標的蛋白質の結合酵素（Ｅ２）
（Ｃ）ユビキチン（Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ）と標的蛋白質の連結酵素（Ｅ３）
（Ｄ）ユビキチン（Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ）
（Ｅ）標的蛋白質
及び（Ａ）〜（Ｅ）のうち第１の組換えプラスミドに含まれない残りをコードする遺伝子を含み大腸菌で同時に発現できる第２の組換えプラスミド、を有する形質転換された大腸菌。
【請求項５】
以下の（Ａ）〜（Ｄ）をコードする遺伝子を含み大腸菌内で同時に発現できる組換えプラスミド、
（Ａ）ユビキチン（Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ）を活性化する酵素（Ｅ１）
（Ｂ）ユビキチン（Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ）と標的蛋白質の結合酵素（Ｅ２）
（Ｃ）ユビキチン（Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ）と標的蛋白質の連結酵素（Ｅ３）
（Ｄ）ユビキチン（Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ）
及び以下の（Ｅ）をコードする遺伝子を含み大腸菌内で同時に発現できる組換えプラスミド、
（Ｅ）標的蛋白質
を有する形質転換された大腸菌。
【請求項６】
ユビキチン（Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ）を活性化する酵素（Ｅ１）がＵＢＥ１、ユビキチン（Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ）と標的蛋白質の結合酵素（Ｅ２）がＵＢＣＨ５、ユビキチン（Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ）と標的蛋白質の連結酵素（Ｅ３）がＣＯＰ１であることを特徴とする請求項１又は請求項３に記載の組換えプラスミド。
【請求項７】
受託番号がＦＥＲＭ−Ｐ２０９１７である請求項２に記載の組換えプラスミド。
【請求項８】
受託番号がＦＥＲＭ−Ｐ２０９１８である請求項３に記載の組換えプラスミド。
【請求項９】
請求項４又は請求項５に記載の形質転換された大腸菌を使用したユビキチン（Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ）化蛋白質のスクリーニング方法。
【請求項１０】
請求項４又は請求項５に記載の形質転換された大腸菌を使用したユビキチン（Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ）化蛋白質又はポリユビキチン（ｐｏｌｙ−Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ）化蛋白質の製造方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【公開番号】特開２００７−３１２６５２（Ｐ２００７−３１２６５２Ａ）
【公開日】平成１９年１２月６日（２００７．１２．６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−１４４５８５（Ｐ２００６−１４４５８５）
【出願日】平成１８年５月２４日（２００６．５．２４）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り ２００５年１２月７日 日本分子生物学会主催の「第２８回日本分子生物学会年会」において文書をもって発表
【出願人】（０００２３１６３７）日本製粉株式会社 (144)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１９年１２月６日（２００７．１２．６）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年５月２４日（２００６．５．２４）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り ２００５年１２月７日 日本分子生物学会主催の「第２８回日本分子生物学会年会」において文書をもって発表
【出願人】（０００２３１６３７）日本製粉株式会社 (144)
【Ｆターム（参考）】
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