【課題】操作した組換え部位および組換えタンパク質を使用してＤＮＡ分子のセグメントを移動または交換し、所望の特徴および／またはＤＮＡセグメントを有するキメラのＤＮＡ分子を提供する。
【解決手段】核酸セグメントを移動または交換するための、核酸、ベクターおよび方法。および種々のベクター内に、核酸分子をクローニングまたはサブクローニングするインビトロおよびインビボでの、核酸、ベクター、および方法の使用による組換えクローニング。

【特許請求の範囲】
【請求項１】
１つ以上の所望の核酸分子をクローンニングまたはサブクロ
ーニングする方法であって、以下：
（ａ）インビトロまたはインビボで以下を組合せる工程、
（ｉ）少なくとも２つの組換え部位と隣接する１つ以上の所望の核酸セ
グメントを含む１つ以上の挿入ドナー分子であって、ここで該組換え部位は実質
的に互いに組換わらない、挿入ドナー分子；
（ｉｉ）少なくとも２つの組換え部位を含む１つ以上のベクタードナー
分子であって、ここで、該組換え部位は実質的に互いに組換わらない、ベクター
ドナー分子；および、
（ｉｉｉ）１つ以上の部位特異的組換えタンパク質；
（ｂ）１つ以上の該所望のセグメントを１つ以上の該ベクタードナー分子に移
すのに十分な条件下で該組合せ物をインキュベートし、これによって１つ以上の
所望の産物核酸分子を生成する、工程；
（ｃ）インビトロまたはインビボで以下を組合せる工程
（ｉ）２つ以上の組換え部位と隣接する該所望のセグメントを含む１つ
以上の該産物分子であって、ここで、該組換え部位は実質的に互いに組換わらな
い、産物分子；
（ｉｉ）２つ以上の組換え部位を含む１つ以上の異なるベクタードナー
分子であって、ここで、該組換え部位は実質的に互いに組換わらない、ベクター
ドナー分子；および
（ｉｉｉ）１つ以上の部位特異的組換えタンパク質；ならびに
（ｄ）１つ以上の該所望のセグメントを１つ以上の異なるベクタードナー分子
に移すのに十分な条件下で該組合せ物をインキュベートし、これにより１つ以上
の異なる産物分子を生成する工程、
を包含する、方法。
【請求項２】
１つ以上の前記所望のセグメントを前記異なるベクタードナ
ー分子に移すのに十分な条件下で、１つ以上の異なるベクタードナー分子と前記
異なる産物分子とをインキュベートする工程をさらに包含する、請求項１に記載
の方法。
【請求項３】
所望の核酸分子をクローニングまたはサブクローニングする
方法であって、以下：
（ａ）インビトロまたはインビボで以下を組合せる工程、
（ｉ）２つ以上の組換え部位と隣接する１つ以上の核酸セグメントを含
む１つ以上の挿入ドナー分子であって、ここで、該組換え部位は実質的に互いに
組換わらない、挿入ドナー分子、
（ｉｉ）２つ以上の組換え部位を含む２つ以上の異なるベクタードナー
分子であって、ここで該組換え部位は実質的に互いに組換わらないベクタードナ
ー分子；および、
（ｉｉｉ）１つ以上の部位特異的組換えタンパク質；ならびに、
（ｂ）１つ以上の該所望のセグメントを該異なるベクタードナー分子に移すの
に十分な条件下で該組合せ物をインキュベートし、これによって２つ以上の異な
る産物分子を生成する工程、
を包含する、方法。
【請求項４】
前記挿入ドナー分子がゲノムＤＮＡ由来である、請求項１ま
たは請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記挿入ドナー分子がｃＤＮＡ由来である、請求項１または
請求項３に記載の方法。
【請求項６】
前記挿入ドナー分子が化学合成により生成される、請求項１
または請求項３に記載の方法。
【請求項７】
前記ベクタードナー分子が少なくとも１つの選択マーカーを
含む、請求項１または請求項３に記載の方法。
【請求項８】
請求項７に記載の方法であって、ここで、前記選択マーカー
が以下：
（ａ）レシピエント細胞が耐性を提供されなければ毒性である化合物に対する
該耐性をレシピエント細胞に提供する産物をコードするＤＮＡセグメント；
（ｂ）ＤＮＡセグメントがコードしなければレシピエント細胞において欠けて
いる産物をコードする該ＤＮＡセグメント；
（ｃ）レシピエント細胞中の遺伝子産物の活性を抑制する産物をコードするＤ
ＮＡセグメント；
（ｄ）同定され得る産物をコードするＤＮＡセグメント；
（ｅ）レシピエント細胞中で細胞機能を阻害する産物をコードするＤＮＡセグ
メント；
（ｆ）上記（ａ）〜（ｅ）の任意の該ＤＮＡセグメントの活性を阻害するＤＮ
Ａセグメント；
（ｇ）基質を修飾する産物に結合するＤＮＡセグメント；
（ｈ）タンパク質、ＲＮＡ、ＤＮＡ、または化学物質により認識され得る特定
のヌクレオチド認識配列をコードするＤＮＡセグメント；
（ｉ）欠失した場合に、レシピエント細胞内の特定の化合物による細胞の殺傷
に対する感受性を直接的または間接的に与える、ＤＮＡセグメント；
（ｊ）レシピエント細胞中で毒性である産物をコードするＤＮＡセグメント；
ならびに、
（ｋ）所望の分子を単離または同定するために使用され得るＤＮＡセグメント
、
からなる群から選択された少なくとも１つのＤＮＡセグメントを含む、方法。
【請求項９】
前記選択マーカーが、抗生物質耐性遺伝子、ｔＲＮＡ遺伝子
、栄養要求性マーカー、毒性遺伝子、表現型マーカー、アンチセンスオリゴヌク
レオチド、制限エンドヌクレアーゼ、制限エンドヌクレアーゼ切断部位、酵素切
断部位、タンパク質結合部位、およびＰＣＲプライマー配列に相補的な配列から
なる群より選択される少なくとも１つのマーカーを含む、請求項８に記載の方法
。
【請求項１０】
前記ベクタードナー分子が原核生物および／または真核生
物ベクターを含む、請求項１または請求項３に記載の方法。
【請求項１１】
前記真核生物ベクターが、酵母細胞、植物細胞、魚細胞、
真核生物細胞、哺乳動物細胞、および／または昆虫細胞中で増殖および／または
複製するベクターを含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記原核生物ベクターが、グラム陰性またはグラム陽性細
菌中で増殖および／または複製するベクターを含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
前記原核生物ベクターが、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属、Ｓ
ａｌｍｏｎｅｌｌａ属、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ属およ
び／またはＰｓｅｕｄｅｍｏｎａｓ属の細菌中で増殖および／または複製するベ
クターを含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記原核生物ベクターが、Ｅ．ｃｏｌｉ中で増殖および／
または複製するベクターを含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記ベクタードナー分子が、クローニングベクター、配列
決定ベクター、発現ベクター、融合ベクター、２−ハイブリッドベクター、逆２
−ハイブリッドベクター、またはその誘導体または改変体からなる群から選択さ
れる、請求項１０に記載の方法。
【請求項１６】
前記真核生物ベクターが、ｐＦａｓｔＢａｃ、ｐＦａｓｔ
Ｂａｃ ＨＴ、ｐＦａｓｔＢａｃ ＤＵＡＬ、ｐＳＦＶ、ｐＴｅｔ−Ｓｐｌｉｃ
ｅ、ｐＥＵＫ−Ｃ１、ｐＰＵＲ、ｐＭＡＭ、ｐＭＡＭｎｅｏ、ｐＢＩ１０１、ｐ
ＢＩ１２１、ｐＤＲ２、ｐＣＭＶＥＢＮＡ、ＹＡＣｎｅｏ、ｐＳＶＫ３、ｐＳＶ
Ｌ、ｐＭＳＧ、ｐＣＨ１１０、ｐＫＫ２３２−８、ｐ３’ＳＳ、ｐＸＴ１、ｐＳ
Ｇ５、ｐＰｂａｃ、ｐＭｂａｃ、ｐＭＣ１ｎｅｏ、およびｐＯＧ４４、ｐＹＥＳ
２、ｐＡＣ３６０、ｐＢｌｕｅＢａｃＨｉｓ、ｐＶＬ１３９２、ｐＢｌｕｅＢａ
ｃＩＩＩ、ｐＣＤＭ８、ｐｃＤＮＡ１、ｐＺｅｏＳＶ、ｐｃＤＮＡ３、ｐＲＥＰ
４、ｐＣＥＰ４、ならびにｐＥＢＶＨｉｓまたはその誘導体もしくは改変体から
なる群より選択される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１７】
前記原核生物ベクターが、ｐｃＤＮＡＩＩ、ｐＳＬ３０１
、ｐＳＥ２８０、ｐＳＥ３８０、ｐＳＥ４２０、ｐＴｒｃＨｉｓ、ｐＲＳＥＴ、
ｐＧＥＭＥＸ−１、ｐＧＥＭＥＸ−２、ｐＥＴ、ｐＴｒｃ９９Ａ、ｐＫＫ２２３
−３、ｐＧＥＸ、ｐＥＺＺ１８、ｐＲＩＴ２Ｔ、ｐＭＣ１８７１、ｐＫＫ２３３
−２、ｐＫＫ３８８−１、ならびにｐＰｒｏＥｘ−ＨＴまたはその誘導体もしく
は改変体からなる群から選択される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１８】
前記２−ハイブリッドおよび逆２−ハイブリッドベクター
が、ｐＰＣ８６、ｐＤＢＬｅｕ、ｐＤＢＴｒｐ、ｐＰＣ９７、ｐ２．５、ｐＧＡ
Ｄ１−３、ｐＧＡＤ１０、ｐＡＣｔ、ｐＡＣＴ２、ｐＧＡＤＧＬ、ｐＧＡＤＧＨ
、ｐＡＳ２−１、ｐＧＡＤ４２４、ｐＧＢＴ８、ｐＧＢＴ９、ｐＧＡＤ−ＧＡＬ
４、ｐＬｅｘＡ、ｐＢＤ−ＧＡＬ４、ｐＨＩＳｉ、ｐＨＩＳｉ−１、ｐｌａｃＺ
ｉ、ｐＢ４２ＡＤ、ｐＤＧ２０２、ｐＪＫ２０２、ｐＪＧ４−５、ｐＮＬｅｘＡ
およびにｐＹＥＳＴｒｐまたはその誘導体もしくは改変体からなる群より選択さ
れる、請求項１５に記載の方法。
【請求項１９】
前記挿入ドナー分子がベクターを含む、請求項１または請
求項３に記載の方法。
【請求項２０】
前記挿入ドナー分子が増幅により生成されたＤＮＡセグメ
ントを含む、請求項１または請求項３に記載の方法。
【請求項２１】
前記増幅がＰＣＲである、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記挿入ドナーが直鎖状である、請求項２１に記載の方法
。
【請求項２３】
前記挿入ドナーが、前記直鎖状分子の片側または両側の末
端でまたはその近傍で少なくとも１つの組換え部位を含む、請求項２２に記載の
方法。
【請求項２４】
前記組換え部位がｌｏｘＰ、ａｔｔＢ、ａｔｔＰ、ａｔｔ
Ｌ、およびａｔｔＲからなる群より選択される、請求項１または請求項３に記載
の方法。
【請求項２５】
前記組換えタンパク質が、Ｉｎｔ、Ｃｒｅ、Ｆｌｐ、Ｒｅ
ｓからなる群より選択される、請求項１または請求項３に記載の方法。
【請求項２６】
２つ以上の組換え部位またはその部分を含む核酸分子を調
製する方法であって、以下：
（ａ）核酸鋳型と、ポリメラーゼ活性を有するポリペプチド、および１つ以上
の組換え部位またはその部分を含む１つ以上のプライマーとを混合する工程；な
らびに、
（ｂ）全てまたは一部の該鋳型に相補的であり、かつ１つ以上の組換え部位ま
たはその部分を含む核酸分子を合成するのに十分な条件下で該混合物をインキュ
ベートする工程、
を包含する、方法。
【請求項２７】
請求項２６に記載の方法であって、前記第１の核酸分子の
全てまたは一部と相補的な第２の核酸分子を合成するのに十分な条件下で、１つ
以上の組換え部位またはその部分を含む１つ以上のプライマーの存在下において
、前記合成された分子をインキュベートする工程であって、これによって２つ以
上の組換え部位またはその部分を含有する２本鎖核酸分子を生成する工程をさら
に包含する、方法。
【請求項２８】
前記組換え部位またはその部分が、前記合成された二本鎖
核酸分子の１つ以上の末端またはその近傍に位置する、請求項２７に記載の方法
。
【請求項２９】
前記鋳型がＲＮＡまたはＤＮＡである請求項２７に記載の
方法。
【請求項３０】
前記ＲＮＡが、ｍＲＮＡまたはポリＡ ＲＮＡ分子である
、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記ポリペプチドが、逆転写酵素またはＤＮＡポリメラー
ゼからなる群より選択される、請求項２７に記載の方法。
【請求項３２】
前記ＤＮＡポリメラーゼが耐熱性ＤＮＡポリメラーゼであ
る、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
請求項３２に記載の方法であって、前記耐熱性ＤＮＡポリ
メラーゼが、Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ（Ｔｔｈ）ＤＮＡポリ
メラーゼ、Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ（Ｔａｑ）ＤＮＡポリメラーゼ
、Ｔｈｅｒｍａｔｏｇａ ｎｅｏｐｏｌｉｔａｎａ（Ｔｎｅ）ＤＮＡポリメラー
ゼ、Ｔｈｅｒｍａｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａ（Ｔｍａ）ＤＮＡポリメラーゼ、
Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｌｉｔｏｒａｌｉｓ（ＴｌｉまたはＶＥＮＴ（登録
商標））ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｓｕｓ（Ｐｆ
ｕまたはＤＥＥＰＶＥＮＴ（登録商標））ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｙｒｏｃｏｃ
ｃｕｓ ｗｏｏｓｉｉ（Ｐｗｏ）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔ
ｅｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ（Ｂｓｔ）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｓｕｌｆｏｌ
ｏｂｕｓ ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ（Ｓａｃ）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈ
ｅｒｍｏｐｌａｓｍａ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍ（Ｔａｃ）ＤＮＡポリメラーゼ
、Ｔｈｅｒｍｕｓ ｆｌａｖｕｓ（Ｔｆｌ／Ｔｕｂ）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈ
ｅｒｍｕｓ ｒｕｂｅｒ（Ｔｒｕ）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｕｓ ｂｒ
ｏｃｋｉａｎｕｓ（ＤＹＮＡＺＹＭＥ（登録商標））ＤＮＡポリメラーゼ、Ｍｅ
ｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃｕｍ（Ｍ
ｔｈ）ＤＮＡポリメラーゼ、ならびにそれらの変異体、改変体および誘導体から
なる群より選択される、方法。
【請求項３４】
前記第１のおよび第２の核酸分子を増幅する工程をさらに
包含する、請求項２７に記載の方法。
【請求項３５】
請求項３４に記載の方法であって、ここで前記増幅は以下
の工程：
（ａ）前記第１の核酸分子と、該第１の核酸分子の一部と相補的である第１の
プライマーとを、および第２の核酸分子と、該第２の核酸分子の一部と相補的で
ある第２のプライマーとを、ポリメラーゼ活性を有するポリペプチドとともに接
触させる工程；
（ｂ）該第１の核酸分子の全てまたは一部に相補的な第３の核酸分子を形成し
、かつ該第２の核酸分子の全てまたは一部に相補的な第４の核酸分子を形成する
のに十分な条件下で、前記混合物をインキュベートする工程；
（ｃ）該第１および第３、ならびに該第２および第４の核酸分子を変性する工
程；ならびに
（ｄ）工程（ａ）〜（ｃ）を１回以上繰り返す工程を包含する方法であって、
ここで該第１のプライマーおよび／または該第２のプライマーが、１つ以上の組
換え部位またはその部分を含む方法、
により達成される、方法。
【請求項３６】
核酸分子を増幅する方法であって、以下の工程：
（ａ）第１の核酸分子と、該第１の核酸分子の一部と相補的である第１プライ
マーとを、および第２の核酸分子と、該第２の核酸分子の一部と相補的である第
２のプライマーとをポリメラーゼ活性を有するポリペプチドとともに接触させる
工程；
（ｂ）該第１の核酸分子の全てまたは一部に相補的な第３の核酸分子を形成し
、かつ該第２の核酸分子の全てまたは一部に相補的な第４の核酸分子を形成する
のに十分な条件下で、該混合物をインキュベートする工程；
（ｃ）該第１および第３、ならびに該第２および第４の核酸分子を変性する工
程；ならびに
（ｄ）工程（ａ）〜（ｃ）を１回以上繰り返す工程を包含する方法であって、
ここで該第１のプライマーおよび／または第２のプライマーが、１つ以上の組換
え部位またはその部分を含む、方法。
【請求項３７】
１つ以上のｃＤＮＡ分子またはｃＤＮＡ分子の集団を生成
する方法であって、以下の工程：
（ａ）ＲＮＡ鋳型またはＲＮＡ鋳型の集団と、逆転写酵素および１つ以上のプ
ライマーとを混合する工程であって、該プライマーは１つ以上の組換え部位また
はその部分を含む、工程；ならびに
（ｂ）該鋳型の全てまたは一部と相補的な第１のＤＮＡ分子を作製するのに十
分な条件下で該混合物をインキュベートし、これにより１つ以上の組換え部位ま
たはその部分を含有する第１のＤＮＡ分子を形成する工程、
を包含する、方法。
【請求項３８】
請求項３７に記載の方法であって、前記第１のＤＮＡ分子
の全てまたは一部に相補的な第２のＤＮＡ分子を作製するのに十分な条件下で１
つ以上の組換え部位またはその部分を含む１つ以上のプライマーとともに該第１
のＤＮＡ分子をインキュベートし、これにより１つ以上の組換え部位またはその
部分を含む二本鎖ＤＮＡ分子を生成する工程をさらに包含する、方法。
【請求項３９】
前記二本鎖ＤＮＡ分子が直鎖状である、請求項３８に記載
の方法。
【請求項４０】
前記二本鎖ＤＮＡ分子が、該二本鎖ＤＮＡ分子の片側また
は両側の末端で、またはその近傍で、１つ以上の組換え部位またはその部分を含
む、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
１つ以上の組換え部位を含む１つ以上の核酸分子を合成す
る方法であって、以下の工程：
（ａ）１つ以上の直鎖状核酸分子を得る工程；および、
（ｂ）該分子を、１つ以上のアダプターを該直鎖状核酸分子の１つ以上の末端
に添加するのに十分な条件下で、１つ以上の組換え部位またはその部分を含む１
つ以上の該アダプターと接触させる工程、
を包含する、方法。
【請求項４２】
前記直鎖状核酸分子がゲノムＤＮＡ由来である、請求項４
１に記載の方法。
【請求項４３】
前記直鎖状核酸分子がｃＤＮＡ由来である、請求項４１に
記載の方法。
【請求項４４】
前記直鎖状核酸分子が機械的または酵素学的技術により生
成される、請求項４１に記載の方法。
【請求項４５】
前記直鎖状核酸分子が、１つ以上の制限エンドヌクレアー
ゼを用いて１つ以上の核酸分子を消化することにより生成される、請求項４１に
記載の方法。
【請求項４６】
１つ以上の組換え部位またはその部分を１つ以上の核酸分
子に添加する方法であって、以下の工程：
（ａ）１つ以上の核酸分子を、１つ以上の組換え部位またはその部分を含む１
つ以上の組込み配列と接触させる工程；および、
（ｂ）該組込み配列を該核酸分子に取り込むのに十分な条件下で該混合物をイ
ンキュベートする工程、
を包含する、方法。
【請求項４７】
前記組込み配列が、トランスポゾン、組込みウイルス、組
込みエレメント、インテグロン（ｉｎｔｅｇｒｏｎ）、および組換え配列からな
る群より選択される、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
前記組込み配列がゲノムＤＮＡに添加される、請求項４７
に記載の方法。
【請求項４９】
請求項１、３、２７、３７、４１、および４６に記載の任
意の１つのプロセスにより生成される産物。
【請求項５０】
前記セグメントが化学合成により生成される、請求項１ま
たは３に記載の方法。
【請求項５１】
前記組込み配列がベクターに添加される、請求項４７に記
載の方法。

【図１】

【図２Ａ】

【図２Ｂ】

【図２Ｃ】

【図２Ｄ】

【図２Ｅ】

【図２Ｆ】

【図３Ａ】

【図３Ｂ】

【図３Ｃ】

【図３Ｄ】

【図３Ｅ】

【図３Ｆ】

【図４Ａ】

【図４Ｂ】

【図４Ｃ】

【図４Ｄ】

【図４Ｅ】

【図４Ｆ】

【図５Ａ】

【図５Ｂ】

【図５Ｃ】

【図５Ｄ】

【図５Ｅ】

【図５Ｆ】

【図５Ｇ】

【図５Ｈ】

【図６Ａ】

【図６Ｂ】

【図７Ａ】

【図７Ｂ】

【図７Ｃ】

【図７Ｄ】

【図８Ａ】

【図８Ｂ】

【図８Ｃ】

【図８Ｄ】

【図８Ｅ】

【図８Ｆ】

【図８Ｇ】

【図８Ｈ】

【図８Ｉ】

【図８Ｊ】

【図８Ｋ】

【図９Ａ】

【図９Ｂ】

【図９Ｃ】

【図１０Ａ】

【図１０Ｂ】

【図１０Ｃ】

【図１０Ｄ】

【図１１Ａ】

【図１１Ｂ】

【図１１Ｃ】

【図１２Ａ】

【図１２Ｂ】

【図１２Ｃ】

【図１２Ｄ】

【公開番号】特開２００９−１３６２９７（Ｐ２００９−１３６２９７Ａ）
【公開日】平成２１年６月２５日（２００９．６．２５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−２２２７８（Ｐ２００９−２２２７８）
【出願日】平成２１年２月３日（２００９．２．３）
【分割の表示】特願２０００−５１８０６９（Ｐ２０００−５１８０６９）の分割
【原出願日】平成１０年１０月２６日（１９９８．１０．２６）
【出願人】（５０２２２１２８２）ライフ　テクノロジーズ　コーポレーション (113)
【Ｆターム（参考）】