組織工学用多孔質足場の調製方法
本発明は、組織工学用多孔質足場の調製方法に関する。本発明の他の目的は、前記の方法によって得られる多孔質足場を提供し、その多孔質足場を組織工学、細胞培養および細胞送達に使用することである。本発明の方法は、ａ）ある量の少なくとも１種の多糖および１種の架橋剤を含むアルカリ性水溶液を調製するステップと、ｂ）ステップａ）の水溶液を凍結させるステップと、ｃ）ステップｂ）の凍結溶液を昇華させるステップとからなるステップを含み、ステップａ）の溶液中で多糖の架橋結合が起こる前にステップｂ）を行うことを特徴とする。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、組織工学用多孔質足場の調製方法に関する。本発明の他の目的は、前記の方法によって得られる多孔質足場、ならびにその多孔質足場の、組織工学、細胞培養および細胞送達への使用を提供することである。
【背景技術】
【０００２】
組織工学は一般的に、移植に適した足場の上またはその内部への細胞の播種によって、組織または器官の相当物を作出することであると定義される。足場上に組織または器官の相当物を形成するためには、足場は生体適合性でなければならず、細胞がその足場上に付着して増殖できなければならない。したがってこれらの足場は、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏでの細胞の増殖のための基材とみなすことができる。
【０００３】
理想的な生体適合性足場の特質としては、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏでの細胞増殖を補助する能力、さまざまな細胞型または細胞系列の増殖を補助する能力、必要とされるさまざまな程度の柔軟性または強剛性を有する能力、さまざまな程度の生分解性を有する能力、ｉｎ ｖｉｖｏの目的部位に、二次傷害を誘導することなく導入される能力、ならびに所望の作用部位に薬物、細胞および／または生理活性物質を送達するためのビヒクルまたはリザーバとなる能力が挙げられるであろう。
【０００４】
多くの異なる足場材料が、組織再生誘導法に用いるために、および／または生体適合性表面として利用されてきた。足場が徐々に分解され、最終的には細胞−足場構造は完全に細胞に置き換わるので、生物分解性のポリマー材料が好ましい場合が多い。組織の増殖または再生を補助すると言われている、有用な足場となる可能性がある多くの候補物質としては、ゲル、泡沫、シート、ならびに形態および形状が異なる多数の多孔質粒子状構造物が挙げられる。
【０００５】
組織工学または組織培養に有用であることが開示されている多種多様の天然ポリマーとしては、フィブロネクチン、各型コラーゲン、およびラミニン、ならびにケラチン、フィブリンおよびフィブリノーゲン、ヒアルロン酸、ヘパリン硫酸、コンドロイチン硫酸などの細胞外マトリックスの種々の成分が挙げられる。
【０００６】
他の使用されていた一般的なポリマーとしては、ポリ（ラクチド−ｃｏ−グリコリド）（ＰＬＧ）が挙げられる。ＰＬＧは、体内への使用についてＦＤＡから承認された、力学的に強い、加水分解可能なポリマーである（Ｔｈｏｍｓｏｎ ＲＣ，Ｙａｓｚｅｍｓｋｉ ＭＪ，Ｐｏｗｅｒｓ ＪＭ，Ｍｉｋｏｓ ＡＧ．Ｆａｂｒｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｂｉｏｄｅｇｒａｄａｂｌｅ ｐｏｌｙｍｅｒ ｓｃａｆｆｏｌｄｓ ｔｏ ｅｎｇｉｎｅｅｒ ｔｒａｂｅｃｕｌａｒ ｂｏｎｅ．Ｊ Ｂｉｏｍａｔｅｒ Ｓｃｉ Ｐｏｌｙｍ Ｅｄ．１９９５；７（１）：２３−３８；Ｗｏｎｇ ＷＨ．Ｍｏｏｎｅｙ ＤＪ．Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ ｂｉｏｄｅｇｒａｄａｂｌｅ ｐｏｌｙｍｅｒｓ ｕｓｅｄ ａｓ ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｍａｔｒｉｃｅｓ ｆｏｒ ｔｉｓｓｕｅ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ．Ｉｎ：Ａｔａｌａ Ａ，Ｍｏｏｎｅｙ ＤＪ，ｅｄｉｔｏｒｓ；Ｌａｎｇｅｒ Ｒ，Ｖａｃａｎｔｉ ＪＰ，ａｓｓｏｃｉａｔｅ ｅｄｉｔｏｒｓ．Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｂｉｏｄｅｇｒａｄａｂｌｅ ｐｏｌｙｍｅｒ ｓｃａｆｆｏｌｄｓ．Ｂｏｓｔｏｎ：Ｂｉｒｋｈａｕｓｅｒ：１９９７．ｐ．５１−８２．）。しかし、ＰＬＧは疎水性であり、一般に比較的厳密な条件下で加工され、したがって、因子の組み込みおよび生存細胞の封入が潜在的に難題になる。
【０００７】
代替として、水分を多く含むポリマー材料（含水率が３０重量％よりも高い）である種々のヒドロゲルが足場材料として使用されている。これらは、合成由来かまたは天然由来の親水性ポリマー鎖で構成されている。ヒドロゲルの構造的な完全性は、種々の化学結合および物理的相互作用を介してポリマー鎖間で形成される架橋結合に左右される。これらの用途で用いられるヒドロゲルは、一般に分解可能であり、比較的緩やかな条件下で処理でき、多くの組織および細胞外マトリックスと同様の力学的特性および構造的特性を有し、最小限の侵襲で送達可能である（Ｌｅｅ ＫＹ，Ｍｏｏｎｅｙ ＤＪ．Ｈｙｄｒｏｇｅｌｓ ｆｏｒ ｔｉｓｓｕｅ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ．Ｃｈｅｍ Ｒｅｖ．２００１ Ｊｕｌ；１０１（７）：１８６９−７９．）。したがって、種々のポリマーがヒドロゲルの調製に使用されている。これらのポリマーとしては、例えば、コラーゲン、ゼラチン、ヒアルロン酸（ＨＡ）およびキトサンが挙げられる。
【０００８】
天然多糖の使用についても、それら多糖が非抗原性かつ非免疫原性であり、抗血栓作用および血管増殖因子との相互作用を示すものもあることから、ヒドロゲルに基づいた足場調製の有望な代替であることが示されている。さらに、多糖は可塑性を有するので、これらの多糖ベースのヒドロゲルは種々の形態に造形することができ、治療用の生体インプラント材料または生体グラフト材料の設計を可能にしうる。
【０００９】
例えば、Ｃｈａｏｕａｔらは（Ｃｈａｏｕａｔ Ｍ，Ｌｅ Ｖｉｓａｇｅ Ｃ，Ａｕｔｉｓｓｉｅｒ Ａ，Ｃｈａｕｂｅｔ Ｆ，Ｌｅｔｏｕｒｎｅｕｒ Ｄ．Ｔｈｅ ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｓｍａｌｌ−ｄｉａｍｅｔｅｒ ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ−ｂａｓｅｄ ａｒｔｅｒｉａｌ ｇｒａｆｔ ｉｎ ｒａｔｓ．Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ．２００６ Ｎｏｖ；２７（３２）：５５４６−５３．Ｅｐｕｂ ２００６ Ｊｕｌ ２０．）、プルランとデキストランの混合物を用いて調製した、新規の多糖ベースの足場を設計した。架橋剤のトリメタリン酸三ナトリウム（ＳＴＭＰ）を用いて、多糖を化学的に架橋結合させた。その後、この足場を用いて調製した動脈材料の有効性をｉｎ ｖｉｖｏで実証した。
【００１０】
しかし、Ｃｈａｏｕａｔら（２００６）の記載のように、足場の調製に多糖を使用することが有利であるにもかかわらず、医療目的での有効利用を想定するには、いまだに得られる足場の多孔度の欠如が欠点になっている。実際、多孔性は、足場内での細胞の増殖、統合、および分化を可能にし、その材料が、ｉｎ ｖｉｖｏで組織または器官を再構築するための細胞リザーバとして使用されるようにするために不可欠な特徴である。
【００１１】
したがって、本技術分野には、治療目的に使用可能な多孔質足場マトリックスを調製する方法を開発する必要性が今なお存在している。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
したがって、本発明の目的は、
ａ）ある量の少なくとも１種の多糖および１種の架橋剤を含むアルカリ性水溶液を調製するステップと、
ｂ）ステップａ）の水溶液を凍結させるステップと、
ｃ）ステップｂ）の凍結溶液を昇華させるステップと
からなるステップを含む、多孔質足場の調製方法であって、ステップａ）の溶液中で多糖の架橋結合が起こる前にステップｂ）を行うことを特徴とする方法を提供することである。
【００１３】
本発明によれば、「ステップａ）の溶液中で多糖の架橋結合が起こる前にステップｂ）を行う」とは、多糖の架橋結合が昇華ステップ（ステップｃ））中に起こることを意味する。
【００１４】
本発明の他の目的は、前記の方法によって得られる多孔質足場を提供することである。
【００１５】
本発明のさらに他の目的は、本発明の多孔質足場の組織工学への使用を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
定義
本明細書で使用する「多糖」という用語は、２つ以上の単糖ユニットを含む分子を指す。
【００１７】
本明細書で使用する「アルカリ性溶液」という用語は、ｐＨが７より上である溶液を指す。
【００１８】
本明細書で使用する「水溶液」という用語は、溶媒が水である溶液を指す。
【００１９】
「架橋結合」という用語は、あるポリマー鎖と他のポリマー鎖との間の共有結合による連結を指す。
【００２０】
本明細書で使用する「足場」は、１種または複数種の多糖鎖の三次元網目構造を含む半固体系であると定義される。そのような構造は、使用する多糖（または複数の多糖）の特性、ならびに網目構造の性質および密度によって、平衡状態において種々の量の水を含むことができる。
【００２１】
「架橋剤」という用語は、本発明の多糖の鎖間に架橋結合を導入できるような任意の作用剤を含む。
【００２２】
本明細書で使用する「生分解性の」という用語は、排出可能な、またはさらに代謝可能な非毒性の化合物にｉｎ ｖｉｖｏで分解される材料を指す。
【００２３】
「昇華」という用語は、固体状態から蒸気の状態に直接移行する物理的な段階を指す。より詳細には、昇華は、物質が固体から気体に、液相を経ずに至るというプロセスである。溶液は、凍結乾燥プロセスを通じて昇華させることができる。
【００２４】
「凍結乾燥」という用語は、溶媒（すなわち、水）を凍結させ、次いで凍結状態で気化させることによる、高真空下における急速冷凍した材料の乾燥についての用語である。
【００２５】
多孔質足場とその調製方法
本発明の第１の目的は、
ａ）ある量の少なくとも１種の多糖および１種の架橋剤を含むアルカリ性水溶液を調製するステップと、
ｂ）ステップａ）の水溶液を凍結させるステップと、
ｃ）ステップｂ）の凍結溶液を昇華させるステップと
からなるステップを含む多孔質足場の調製方法であって、ステップａ）の溶液中で多糖の架橋結合が起こる前にステップｂ）を行うことを特徴とする方法に関する。
【００２６】
本発明によれば、「ステップａ）の溶液中で多糖の架橋結合が起こる前にステップｂ）を行う」とは、多糖の架橋結合が昇華ステップ（ステップｃ））中に起こることを意味する。
【００２７】
本発明においては、任意の種類の多糖が使用可能である。合成多糖または天然多糖は、本発明の目的のために二者択一的に使用してよい。例えば、適切な天然多糖としては、デキストラン、寒天、アルギン酸、ヒアルロン酸、イヌリン、プルラン、ヘパリン、フコイダン、キトサン、スクレログルカン、カードラン、デンプン、セルロース、およびそれらの混合物が挙げられるが、それらに限定されない。例えば、酸性基（カルボキシル基、硫酸基、リン酸基）、アミノ基（エチレンアミン、ジエチルアミノエチルアミン、プロピルアミン）、疎水基（アルキル基、ベンジル基）を有する化学修飾された多糖も含んでよい。所望の多糖を生成させるために用いることができる単糖類としては、リボース、グルコース、マンノース、ガラクトース、フルクトース、ソルボース、ソルビトール、マンニトール、イジトール、ズルシトール、およびそれらの混合物が挙げられるが、それらに限定されない。これらの化合物の多くは、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｉｃｈｉｇａｎ，ＵＳ）などの会社が市販している。
【００２８】
多糖の好ましい重量平均分子量は、約１０，０００ダルトン〜約２，０００，０００ダルトンであり、より好ましくは約１０，０００ダルトン〜約５００，０００ダルトンであり、最も好ましくは約１０，０００ダルトン〜約２００，０００ダルトンである。
【００２９】
本発明の一実施形態において、本発明の足場を調製するために使用される多糖（複数可）は、デキストラン、寒天、プルラン、イヌリン、スクレログリカン、カードラン、デンプン、セルロース、またはそれらの混合物などの中性多糖である。好ましい実施形態において、本発明の足場を調製するためにプルランとデキストランとの混合物が使用される。例えば、前記混合物は２５％のデキストランと、７５％のプルランとで構成される。
【００３０】
本発明の他の実施形態において、本発明の足場を調製するために使用される多糖（複数可）は、キトサン、ＤＥＡＥ−デキストラン、およびそれらの混合物などの正電荷を持つ多糖である。
【００３１】
本発明の他の実施形態において、本発明の足場を調製するために使用される多糖（複数可）は、アルギン酸、ヒアルロン酸、ヘパリン、フコイダン、およびそれらの混合物などの負電荷を持つ多糖である。
【００３２】
本発明の他の実施形態において、本発明の足場を調製するために使用される多糖（複数可）は、中性多糖と負電荷を持つ多糖との混合物であり、ここで負電荷を持つ多糖はその混合物の１〜２０％、好ましくは５〜１０％を示す。
【００３３】
ある特定の実施形態において、架橋剤は、トリメタリン酸三ナトリウム（ＳＴＭＰ）、オキシ塩化リン（ＰＯＣｌ３）、エピクロロヒドリン、ホルムアルデヒド、水溶性カルボジイミド、グルタルアルデヒド、または多糖を架橋結合させるのに適切なその他の任意の化合物からなる群から選択される。好ましい実施形態において、架橋剤はＳＴＭＰである。水溶液中の架橋剤の濃度（ｗ／ｖ）は、約１％〜約６％であり、より好ましくは約２％〜約６％であり、最も好ましくは約２％〜約３％である。架橋剤の使用推奨量は、多糖と架橋剤の重量比が２０：１〜１：１、好ましくは１５：１〜１：１、より好ましくは１０：１〜１：１の範囲になる量である。これらの化合物の多くは、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｉｃｈｉｇａｎ，ＵＳ）などの会社が市販している。
【００３４】
多糖を含む水溶液は、企図する用途によって、種々の添加剤をさらに含んでよい。添加剤は多糖と適合性があり、多糖（複数可）の有効な架橋結合を妨害しないことが好ましい。使用する添加剤の量は、個々の用途によって決まり、当業者は実験の常法を用いてそれを容易に決定することができる。
【００３５】
多糖を含む水溶液は、場合によって、少なくとも１種の抗菌剤を含んでよい。適切な抗菌性保存剤は当技術分野において周知である。適切な抗菌剤の例としては、メチルパラベン、エチルパラベン、プロピルパラベン、およびブチルパラベンなどのアルキルパラベン、クレゾール、クロロクレゾール、ヒドロキノン、安息香酸ナトリウム、安息香酸カリウム、トリクロサン、およびクロルヘキシジンが挙げられるが、それらに限定されない。使用することができる抗細菌剤および抗感染剤の他の例としては、リファンピシン、ミノサイクリン、クロルヘキシジン、銀イオン剤、および銀ベースの組成物が挙げられるが、それらに限定されない。
【００３６】
多糖を含む水溶液は、場合によって、溶液の可視性を増大させるために少なくとも１種の着色剤も含んでよい。適切な着色剤には、染料、顔料、および天然着色料が含まれる。適切な着色剤の例としては、アルシアンブルー、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、およびＦＩＴＣ−デキストランが挙げられるが、それらに限定されない。
【００３７】
多糖を含む水溶液は、場合によって、少なくとも１種の界面活性剤も含んでよい。本明細書で使用する界面活性剤とは、水の表面張力を弱める化合物を指す。界面活性剤は、ラウリル硫酸ナトリウムなどのイオン性界面活性剤、またはポリオキシエチレンエーテル、ポリオキシエチレンエステル、およびポリオキシエチレンソルビタンなどの中性界面活性剤であってよい。
【００３８】
ステップａ）の溶液中で多糖の架橋結合が起こる前にステップｂ）を行うことは、本発明に不可欠な特徴である（実施例１を参照されたい）。水溶液中での架橋結合を調節するための主要因子は、温度と時間である。多糖の架橋結合を回避する、または著しく制限するために、水溶液は３７℃以下、より好ましくは４℃〜２５℃で構成される温度で調製することができる。さらに、ステップｂ）は、前記多糖の架橋結合を回避するために、できるだけ速やかに実施することができる。
【００３９】
水溶液を調製したら、それを凍結させる。水溶液の凍結は、異なる速度（例えば、℃／分）で行ってよい。例えば、約１℃／分〜約２００℃／分の速さ、好ましくは約１℃／分〜約２０℃／分の速さ、最も好ましくは約５℃／分〜約１０℃／分の速さで凍結させてよい。溶液は、液体窒素で、またはドライアイスで凍結させることができる。
【００４０】
水溶液が凍結したら、昇華が起こりうる。好ましい実施形態において、本発明による多孔質足場の調製方法は、凍結乾燥のプロセスを含む。
【００４１】
したがって、本発明によると、凍結乾燥のプロセスは、水溶液中で架橋結合が起こる前に行われる必要がある。
【００４２】
凍結乾燥は、当技術分野で公知の任意の装置を用いて行うことができる。凍結乾燥機には基本的に、ロータリーエバポレーター、多岐管式凍結乾燥機、および棚式凍結乾燥機の３種類がある。そのような装置は、当技術分野において周知であり、ｆｒｅｅｚｅ−ｄｒｙｅｒ Ｌｙｏｖａｃ（ＧＴ２，ＳＴＥＲＩＳ Ｒｏｔａｒｙ ｖａｎｅ ｐｕｍｐ，ＢＯＣ ＥＤＷＡＲＤＳ）など市販されている。
【００４３】
基本的に、急速冷凍した水溶液をチャンバー内に置く。次に、チャンバーの温度を、液化した蒸気の沸点より高いレベルまで上昇させ、それによって蒸気を蒸発させて除去する。例えば、チャンバーの温度は−７０℃〜−１℃、好ましくは−７０℃〜−４０℃、より好ましくは約−５０℃〜−４０℃であってよい。チャンバーの加熱は、チャンバーの圧力を減少させる真空の流れを伴う。一般的にチャンバーの真空は０．１ｍＢａｒ〜約６．５ｍＢａｒである。
【００４４】
凍結乾燥は、少なくとも水分の９８．５％、好ましくは、少なくとも水分の９９％、より好ましくは、少なくとも水分の９９．５％を除去するのに十分な時間行う。
【００４５】
水溶液を凍結させることによって、水から氷粒子が形成される。いかなる理論にも縛られずに、上記の温度、圧力条件下で凍結溶液に含まれる水分を昇華させ、したがって、それによって、材料内の、それまで氷粒子が占有していた空間に間隙が残り、それに応じて形成された多孔質足場が生成する。驚いたことに、架橋結合のプロセスは凍結乾燥のプロセス中に起こる。
【００４６】
したがって、結果生成する足場の物質密度および孔のサイズは、凍結溶液の凍結乾燥速度を調節することによって変化する。凍結乾燥プロセスにおいて不可欠なパラメーターは、真空度である。実施例において、本発明者らは実際に、真空度が異なると、足場中にはサイズと密度が異なる孔ができることを示した。
【００４７】
足場の孔の平均サイズは、約１μｍ〜約５００μｍ、好ましくは約１５０μｍ〜約３５０μｍ、より好ましくは約１７５μｍ〜約３００μｍである。孔の密度は約４％〜約７５％、好ましくは約４％〜約５０％である。
【００４８】
他の実施形態において、本発明の方法は、本発明に従って調製した足場に含水させることからなるステップをさらに含む。前記含水は、足場を水溶液（例えば、脱イオン水、逆浸透膜でろ過した水、生理食塩水、または適切な有効成分を含む水溶液）中に、所望の含水率を有する足場が生成するのに十分な時間、浸すことにより行う。例えば、含水率が最大である足場を所望の場合、足場が、そのサイズ、または体積が最大になるまで膨張するのに十分な時間、足場を水溶液に浸す。一般には、少なくとも約１時間、好ましくは少なくとも約２時間、より好ましくは約４時間〜約２４時間、足場を水溶液に浸す。当然のことながら、足場を所望のレベルまで含水させるために必要な時間は、使用する多糖の組成、足場のサイズ（例えば、厚さ）、および水溶液の温度と粘度、ならびに他の因子などいくつかの因子に左右される。
【００４９】
ある特定の実施形態において、含水した足場の含水率は８０％、好ましく９０％、より好ましくは９５％である。
【００５０】
他の特定の実施形態において、本発明の方法を用いて得られる多孔質足場を所望の形態にできるように、凍結および昇華の前に、多糖水溶液を型に注ぎ込むことができる。任意の幾何学的な型を本発明に従って使用してよい。サイズの異なるものも想定してよい。例えば、一般に、中心軸を有する管状の型に水溶液を注ぎ込んで、多孔質足場が所望の外径と内径を有する管状になるようにすることができる（実施例６を参照されたい）。型は、任意の材料から調製してよいが、好ましい材料は、テフロン（登録商標）などの粘着しない表面を有するものである。
【００５１】
あるいは、本発明の足場は、所望のサイズおよび形になるよう切断し、造形してよい。
【００５２】
本発明の方法は、任意の適切なプロセスを用いて足場を滅菌するステップをさらに含んでよい。足場は、任意の適切な時点で滅菌することができるが、足場に含水させた後に滅菌するのが好ましい。適切な非放射線滅菌の技法としては、ＵＶ照射、ガスプラズマ、または酸化エチレンなどの当技術分野において公知の方法が挙げられるが、それらに限定されない。例えば、Ａｂｔｏｘ，ｌｎｃ、Ｍｕｎｄｅｌｅｉｎ、ＩＩＩｉｎｏｉｓから入手可能な滅菌システム、商品名ＰｌａｚＬｙｔｅを用いて、または米国特許第５４１３７６０号および米国特許第５６０３８９５号に開示されているガスプラズマ滅菌プロセスに従って、足場を滅菌することができる。
【００５３】
本発明の方法によって生成する足場は、任意の適切な包装材で包装することができる。包装材を破るまで足場の無菌性が保たれるような包装材が望ましい。
【００５４】
他の実施形態において、多孔質足場に１つまたは複数の生体分子を組み込むことができる。他の実施形態において、生体分子は、薬物、ホルモン、抗生物質、抗菌物質、染料、放射性物質、蛍光物質、抗細菌物質、化学薬品、または作用物質、それらの任意の組合せを含んでよい。この物質は、治療効果の増大、可視性の増大、適正な配向指示、感染への抵抗、治癒の促進、柔軟性の増加、または他の任意の望ましい効果を目的として使用してよい。前記実施形態において、上記に記載の１つまたは複数の生体分子を含む本発明の足場は、活性剤の放出制御系として用いることができる。
【００５５】
一実施形態において、生体分子は、走化性物質、抗生物質、ステロイド性もしくは非ステロイド性の鎮痛剤、抗炎症薬、免疫抑制剤、抗がん剤、種々のタンパク質（短鎖ペプチド、骨形態形成タンパク質、糖タンパク質、およびリポタンパク質など）；細胞付着の介在物質；生理活性リガンド；インテグリン結合配列；リガンド；種々の増殖作用物質および／または分化剤（上皮細胞増殖因子、ＩＧＦ−Ｉ、ＩＧＦ−ＩＩ、ＴＧＦ−β、増殖因子および分化因子、ストロマ細胞由来因子ＳＤＦ−１；血管内皮細胞増殖因子、線維芽細胞増殖因子、血小板由来増殖因子、インスリン由来増殖因子、および形質転換増殖因子、副甲状腺ホルモン、副甲状腺ホルモン関連ペプチド、ｂＦＧＦ；ＴＧＦβスーパーファミリー因子；ＢＭＰ−２；ＢＭＰ−４；ＢＭＰ−６；ＢＭＰ−１２；ソニックヘッジホッグ；ＧＤＦ５；ＧＤＦ６；ＧＤＦ８；ＰＤＧＦなど）；特異的な増殖因子の上方制御に影響を及ぼす小分子；テネイシン−Ｃ；ヒアルロン酸；コンドロイチン硫酸；フィブロネクチン；デコリン；トロンボエラスチン）；トロンビン由来ペプチド；ヘパリン結合ドメイン；ヘパリン；ヘパラン硫酸；ＤＮＡ断片、ＤＮＡプラスミド、Ｓｉ−ＲＮＡ、トランスフェクション試薬、またはそれらの任意の組合せを含んでよい。
【００５６】
一実施形態において、増殖因子として、ヘパリン結合増殖因子（ＨＢＧＦ）、形質転換増殖因子αまたは形質転換増殖因子β（ＴＧＦ）、α線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ）、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）、およびＳＤＦ−１、同様の血管形成因子の一部が挙げられる。他の実施形態において、因子として、インスリン、グルカゴン、およびエストロゲンなどのホルモンが挙げられる。ある実施形態では、神経成長因子（ＮＧＦ）または筋肉形態形成因子（ＭＭＦ）などの因子を組み込むことが望ましい場合がある。ある実施形態において、ＴＮＦα／β、またはマトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）を組み込む。
【００５７】
さらに、本発明の足場は、場合によって、インドメタシン、アセチルサルチル酸、イブプロフェン、スリンダク、ピロキシカム、およびナプロキセンなどの抗炎症剤；トロンビン、フィブリノーゲン、ホモシステイン、およびエストラムスチンなどの血栓形成剤；ならびに硫酸バリウム、金粒子、および酸化鉄ナノ粒子（ＵＳＰＩＯ）などの放射線を通さない化合物を含んでよい。
【００５８】
さらに、本発明の足場は、場合によって、抗ビタミンＫもしくはアスピリンなどの抗血栓剤、アスピリン、チエノピリジン、ジピリダモール、もしくはクロピドグレルなどの抗血小板剤（アデノシン二リン酸（ＡＤＰ）誘導性の血小板凝集を選択的かつ可逆的に阻害する）、またはヘパリンなどの抗凝固剤を含んでよい。ヘパリン（抗凝固剤）とチロフィバン（抗血小板剤）の組合せが、血栓および血栓塞栓の両方を減少させるのに有効であることが示されており、これを本発明の足場に組み込むことができる。用量依存的な抗血小板特性および抗増殖特性を有する可能なイソフラボンであり、原発性血栓症の原因であるコラーゲン誘導性の血小板凝集を阻害するゲニステインも、本発明の足場に組み込むことができる。
【００５９】
本発明の足場の使用方法
本発明の足場は、特に組織工学、組織修復、または組織再生に適している。多孔度の違いにより、足場の適当な領域への異なる細胞型の移入が促進されうる。他の実施形態において、多孔度の違いにより、組織の発生／修復／再生の適当な構造化に必要な、足場を構成する細胞型間における適当な細胞間連結の発生が促進されうる。例えば、細胞突起の伸長は、足場材料の多様な多孔度を介してより適当になるよう適応されうる。したがって、足場は任意の組織の細胞を含んでよい。
【００６０】
ある特定の実施形態において、前記足場に細胞を播種する。他の実施形態において、本発明の足場を、所望の細胞を含む培養溶液中に、その細胞が足場全体に浸透できるのに十分な時間浸す。
【００６１】
他の実施形態において、本発明の足場は、培養物中の播種細胞の生存率および増殖を、長時間にわたって、分化を誘導せずに補助することが可能である。
【００６２】
他の実施形態において、本発明の足場は、非刺激性の細胞増殖環境（増殖促進剤による活性化がない）を提供する。
【００６３】
他の実施形態において、本発明の足場は、組織増殖、骨の再建、創傷治癒、腫瘍形成（移動と浸潤を含む）、および血管新生などの生理学的、病理学的なプロセスの研究に用いることができる。足場により、内因性因子を含まない制御された形で、特定のプロセスを調節および研究できるような、規定され、かつ制御された環境の作出が可能になる。
【００６４】
具体的には、本発明の足場は、診断用量または毒性用量に関する三次元培養に使用可能である。この実施形態において、本発明の足場は、製品の毒性について、三次元環境に存在する細胞に対して直接評価することを可能にする。前記実施形態において、本発明の足場を、肝細胞、胚性幹細胞、上皮細胞、ケラチノサイト、または人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）などの、製品の毒性および／または薬理作用を評価するために有用な細胞の培養に使用する。
【００６５】
他の実施形態において、本発明の足場は、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏでの複数の細胞型の増殖および分化を補助することが可能である。
【００６６】
他の実施形態において、細胞は幹細胞または前駆細胞である。他の実施形態において、細胞は、軟骨細胞；線維軟骨細胞；骨細胞；骨芽細胞；破骨細胞；滑膜細胞；骨髄細胞；間葉細胞；上皮細胞、肝細胞、筋細胞；間質細胞；幹細胞；胚性幹細胞；脂肪組織由来の前駆体細胞；末梢血前駆細胞；成体組織から単離された幹細胞；人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）；遺伝子形質転換細胞；軟骨細胞と他の細胞の組合せ；骨細胞と他の細胞の組合せ；滑膜細胞と他の細胞の組合せ；骨髄細胞と他の細胞の組合せ；間葉細胞と他の細胞の組合せ；間質細胞と他の細胞の組合せ；幹細胞と他の細胞の組合せ；胚性幹細胞と他の細胞の組合せ；成体組織から単離された前駆細胞と他の細胞の組合せ；末梢血前駆細胞と他の細胞の組合せ；成体細胞から単離された幹細胞と他の細胞の組合せ；および遺伝子形質転換細胞と他の細胞の組合せが挙げられるが、それらに限定されない。
【００６７】
他の実施形態において、本発明の足場および方法に使用するためのこれらの細胞はどれも、例えば、それらの一部が血管形成因子でもある、ヘパリン結合性増殖因子（ＨＢＧＦ）、形質転換増殖因子αまたは形質転換増殖因子β（ＴＧＦβ）、α線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ）、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）、およびＳＤＦ−１などの所望の分子を発現するように遺伝子改変してよい。他の実施形態において、発現される因子として、インスリン、グルカゴン、およびエストロゲンなどのホルモンが挙げられる。他の実施形態において、神経成長因子（ＮＧＦ）もしくは筋肉形態形成因子（ＭＭＦ）などの因子が発現され、または他の実施形態において、ＴＮＦα／βが発現される。
【００６８】
ある特定の実施形態において、本発明の足場は、例えばＣｈａｏｕａｔら（Ｃｈａｏｕａｔ Ｍ，Ｌｅ Ｖｉｓａｇｅ Ｃ，Ａｕｔｉｓｓｉｅｒ Ａ，Ｃｈａｕｂｅｔ Ｆ，Ｌｅｔｏｕｒｎｅｕｒ Ｄ．Ｔｈｅ ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｓｍａｌｌ−ｄｉａｍｅｔｅｒ ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ−ｂａｓｅｄ ａｒｔｅｒｉａｌ ｇｒａｆｔ ｉｎ ｒａｔｓ．Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ．２００６ Ｎｏｖ；２７（３２）：５５４６−５３．Ｅｐｕｂ ２００６ Ｊｕｌ ２０．）の記載のような、損傷した動脈を交換するための代用血管を調製するのに適している。そのような代用物は、本発明の方法に従って、上記の型を用いて調製することができる。次いでそのような代用物に細胞集団を含めてｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏで血管を再構築することができる。他の実施形態において、細胞として、間葉幹細胞（ＭＳＣ）、内皮前駆細胞（ＥＰＣ）、内皮細胞、線維芽細胞、および平滑筋細胞が挙げられるが、それらに限定されない。
【００６９】
他の特定の実施形態において、本発明の足場は、軟骨または骨のインプラントを調製するのに適している。そのような場合に、本発明の足場に、軟骨細胞；骨細胞；骨芽細胞；破骨細胞；血管細胞、またはそれらの混合物を担持させることができ、分化誘導剤の存在下で培養することができる。
【００７０】
移植部位は、治療が必要な罹患／損傷組織によって決まる。例えば、関節軟骨、関節半月、および骨の構造欠陥を治療するために、細胞を播種した足場複合体を欠陥部位に設置して損傷組織の修復を促進する。
【００７１】
中枢神経系（ＣＮＳ）の損傷の場合、足場複合体には、成体神経幹細胞、胚性幹細胞、グリア細胞、およびセルトリ細胞の組合せを播種してよい。好ましい実施形態において、足場複合体には、異種源または同種源の形質転換細胞系由来のセルトリ細胞を神経幹細胞と組み合わせて播種してよい。セルトリ細胞は、幹細胞を加えてその後損傷部位に移植するまでの間、足場複合体と一緒に培養してよい。この手法により、細胞治療のＣＮＳへの適用の主要な障害の１つ、すなわち、移植術後の幹細胞の生存についての障害を回避できる。多数のセルトリ細胞を封入した足場複合体により、幹細胞の生存により適した環境が提供されうる。
【００７２】
したがって、本発明に従って調製される多孔質ポリマー足場は、人工血管、人工食道、人工膀胱、人工神経、人工心臓、人工心臓弁、人工皮膚、整形外科用インプラント、人工筋肉、人工靱帯、人工呼吸器などの人工組織または人工器官を製造するための原料として有効に使用できる。さらに、本発明の多孔質ポリマー足場は、他種の生体材料上またはその内部に、また組織もしくは器官由来の機能性細胞と一緒に配合することまたは組み込むことによって、ハイブリッド組織の形で調製できる。ハイブリッド組織には、例えば、細胞の機能性、組織の再生などの維持など、種々の生物医学的な用途がありうる。
【００７３】
あるいは、本発明の足場は、治療上の細胞送達のために使用できる。実際、本発明の足場は、治療目的または診断目的で患者に投与可能な細胞送達系を調製するための原料として用いることができる。ある特定の実施形態において、本発明の足場は、細胞、優先的には自己細胞に担持させることが可能なパッチ、生体膜、または包帯材の調製に使用できる。ヒト細胞および動物細胞は細胞培養後に得ることができ、また凍結貯蔵細胞から直接得ることができる。例えば、本発明の足場は、皮膚を再構築または治癒するために皮膚に塗布可能な、細胞含有包帯材の調製に用いることができる。あるいは、前記包帯材は、虚血（心筋梗塞）を治療するために患者の心臓への投与に用いることができる。したがって、これらの実施形態において、足場中に封入された細胞は、標的とする組織または器官内に移動できる。
【００７４】
他の実施形態において、本発明の足場は、細胞培養に用いることができる。次いで適当な増殖因子を加えることにより細胞を刺激して、分化または他の生理学的プロセスに発展させる。細胞を未分化状態で維持するために、または細胞を特定の経路に分化させるために、１種または複数種のサイトカイン、増殖因子、ホルモン、またはそれらの組合せを含む培養培地を用いてよい。
【００７５】
より具体的には、本発明の足場は、対象分子の生成に用いることができる。実際に、本発明の足場は、細胞が所望の分子を生成できるように、細胞をバイオリアクター中に固定するための生物環境を提供するために用いることができる。本発明の足場は、培養細胞を力学的、生化学的に保護する。
【００７６】
したがって、足場は、タンパク質、有機分子、およびヌクレオチドなどの所望の分子を生成させるための細胞リザーバとして役立つ。例えば、対象のタンパク質としては、増殖因子、ホルモン、シグナル分子、細胞増殖の阻害剤、および抗体などが挙げられるが、それらに限定されない。本発明の足場は、モノクローナル抗体の生成に関して特に興味深い。本発明の足場は、香料、治療用分子などの有機分子の生成にも適切でありうる。
【００７７】
この目的で、本発明の足場には、原核細胞および真核細胞を含む任意の細胞型を担持させてよい。例えば、本発明の足場は、細菌、酵母細胞、哺乳動物細胞、昆虫細胞、植物細胞などを担持させてよい。具体例として、Ｅ．ｃｏｌｉ、クリベロマイセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）酵母もしくはサッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）酵母、哺乳動物細胞系（例えば、ベロ細胞、ＣＨＯ細胞、３Ｔ３細胞、ＣＯＳ細胞など）、ならびに初代もしくは樹立された哺乳動物細胞培養物（例えば、リンパ芽球、線維芽細胞、胚細胞、上皮細胞、神経細胞、脂肪細胞などから生成）が挙げられる。より具体的には、本発明は、雑種細胞などの樹立細胞系の使用を企図している。あるいは、上記の所望の分子を発現するように細胞を遺伝子改変してよい。
【００７８】
本発明の足場に細胞を担持させ、一定時間培養することができ、次いで細胞を足場から回収／抽出／分離して、治療用途もしくは診断用途、または細胞分析などにさらに使用できる。足場からの細胞の分離は、プルラナーゼなどの足場を分解できる酵素の使用、および／またはコラゲナーゼ、エラスターゼもしくはトリプシンなどの細胞を剥離できる酵素、もしくはＥＤＴＡなどの細胞剥離溶液の使用を伴ってよい。
【００７９】
本発明についてさらに、以下の図および実施例に照らして例示する。
【図面の簡単な説明】
【００８０】
【図１】再含水後の円形多孔質足場の肉眼的外観を示す写真である。
【図２】ＥＳＥＭによって、凍結乾燥条件（真空度、ｍｂａｒ）に応じて肉眼観察した、含水した多孔質足場の写真である。スケールバー：２００ミクロン、高倍率（５０ミクロン）を除く。
【図３】０．１ｍｂａｒで調製した乾燥多孔質足場（左）、６．５ｍｂａｒで調製した乾燥多孔質足場（右）をＳＥＭによって観察した写真である。
【図４】０．１ｍｂａｒまたは６．５ｍｂａｒで調製した多孔質足場切片をＨ＆Ｅ染色して観察した写真である（倍率４０倍）。
【図５】凍結乾燥の圧力に応じた膨張の割合を示すグラフである。
【図６】多孔質足場からのノルキロフサシン放出と、孔形成剤の非存在下で調製した非多孔質足場からのノルキロフサシン放出を比較したグラフである。
【実施例】
【００８１】
＜実施例１＞
多糖ベースの足場の調製
プルラン／デキストラン７５：２５、水中総濃度２４．５％（ｗ／ｖ）の混合物（プルラン、ＭＷ２００，０００、Ｈａｙａｓｈｉｂａｒａ Ｉｎｃ．Ｏｋａｙａｍａ，Ｊａｐａｎ；デキストラン、ＭＷ５００，０００、Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を調製した。アルカリ性条件下で、架橋剤のトリメタリン酸ナトリウム（ＳＴＭＰ）（１１％（ｗ／ｖ）、Ｓｉｇｍａ）を用いて多糖を化学的に架橋結合させた。簡単に言えば、多糖溶液９ｍＬを、１０ＭのＮａＯＨ１ｍＬと混合し、次いでその混合物に水１ｍＬ中ＳＴＭＰ３００ｍｇの水溶液を加えた。その溶液をすぐに６０ｍｍのペトリ皿中に注ぎ込み、次いで−８０℃で保管した。Ｌｙｏｖａｃ ｆｒｅｅｚｅ−ｄｒｙｅｒ （ＧＴ２，ＳＴＥＲＩＳ Ｒｏｔａｒｙ ｖａｎｅ ｐｕｍｐ，ＢＯＣ ＥＤＷＡＲＤＳ）内での凍結乾燥プロセス中に、凍結した混合物を架橋結合させた。水分を完全に除去できるように足場を２４時間凍結乾燥させた。凍結乾燥プロセス中に架橋結合した足場は不透明で若干もろいものであった。その足場は所望のサイズと形状に容易に切断でき、再含水させることができるものであった（図１）。
【００８２】
５０℃で化学的に架橋結合を行った後に得られた足場を凍結乾燥させることにより、対照実験を行った。しかし、これらの乾燥足場は、その全体構造が凍結乾燥プロセス後に破損したために、ほどよく再含水させることができなかった。他の実験を、プロセス中の架橋剤を除いて行った。この条件では、凍結乾燥プロトコールによって溶液のみがもたらされ、足場にならなかった。
【００８３】
＜実施例２＞
凍結乾燥条件の影響
実施例１に従って多糖足場の調製を行った。凍結乾燥ステップでは、制御漏出量によって異なる真空度を調整した（０．１ｍｂａｒ、０．７５ｍｂａｒ、３ｍｂａｒ、１．５ｍｂａｒ、および６．５ｍｂａｒ）。
【００８４】
結果生じた足場について、環境制御型走査電子顕微鏡（ＥＳＥＭ）および走査電子顕微鏡（ＳＥＭ）を用いて特性決定した。ＥＳＥＭ技法は試料の脱水を少しも必要としないので、含水した状態の足場の表面を、ＥＳＥＭ− ＦＥＧ（Ｐｈｉｌｉｐｓ ＸＬ ３０，Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ、圧力４トルにおける加速電圧１５ｋＶ）を用いて直接観察した。膨張した状態の足場のＥＳＥＭ画像は、これらの足場が多孔質であることを示している（図２）。０．１ｍｂａｒ（高真空度）で凍結乾燥させた足場の孔は、６．５ｍｂａｒ（低真空度）で調製した足場よりも直径が大きかった。真空度が低い条件については、足場の網目構造がより良好に組織化され、足場全体で相互接続した孔が均質であった。乾燥足場のＳＥＭ画像により、凍結乾燥プロセス中に架橋結合させた足場が多孔質であることが確認された（図３）。組織染色のために、足場を４％のパラホルムアルデヒド／ＰＢＳで固定し、次いでそれをＯＣＴ包埋し（Ｔｉｓｓｕｅ Ｔｅｃｋ−ＯＣＴ（ＥＭＳ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＰＡ）、液体窒素冷却イソペンタンで凍結させた。凍結試料を、クリオスタット（Ｌｅｉｃａ ＣＭ １９００）を用いて凍結切片化した（１０μｍの切片）。足場切片についてヘマトキシリン／エオジン染色を行い、足場の構造を可視化した。
【００８５】
足場の組織切片の外観は、電子顕微鏡画像（図４）と一致していた。足場内部の多孔質構造は、凍結乾燥時の真空度を変えることにより調節できた。低真空度（６．５ｍｂａｒ）で架橋結合させた足場は、ゆるんだ網目構造を示した高真空度（０．１ｍｂａｒ）で架橋結合させた足場に比べて、小さい孔を有する構造であった。
【００８６】
＜実施例３＞
膨張の割合
実施例２に従って多糖足場の調製を行った。凍結乾燥させた足場を、かみそりで切断して長方形の足場（２．５ｃｍ×２ｃｍ、厚さ３ｍｍ）を得た。足場を脱イオン水で洗浄して緩衝塩を全て除去し、次いで５０℃で３６時間、脱水した。試料の乾燥重量（乾燥Ｗ）と、脱イオン水で２４時間再含水させた後の膨張状態の重量（膨張Ｗ）を、電子てんびん（ＡＧ ２０４ Ｄｅｌｔａｒａｎｇｅ（登録商標）ｍｅｔｔｌｅｒ Ｔｏｌｅｄｏ；最大８１ｇ／２１０ｇ；ｄ＝０．１ｍｇ／１ｍｇ）を用いて測定した。計量前に、膨張した足場を柔らかい紙の上に注意深く置いて過剰な水分を除去した。それぞれの実験を３連で行った。膨張の割合を次式に従って計算した。膨張の割合＝（膨張Ｗ−乾燥Ｗ）／乾燥Ｗ）×１００。
【００８７】
多孔質足場の膨張の割合は、凍結乾燥時の真空度の上昇とともに上昇する（図５）。最も低い真空度（６．５ｍｂａｒ）で調製した足場が、膨張の割合が最も低いことがわかった。
【００８８】
＜実施例４＞
細胞浸潤
ウィスターラット由来の大腿骨骨髄間葉系幹細胞（ＭＳＣ）を実施例１の通りに調製した足場で培養した。円形の穿孔器を用いて、直径６ｍｍ、厚さ１ｍｍの円形の多孔質足場を切り出した。細胞を播種する前に、３７℃で２４時間、２４ウェルプレートの培養培地中で足場を平衡化させた。培養培地は、１０％のウシ胎児血清と１％のペニシリン／ストレプトマイシン（Ｓｉｇｍａ）を含む低グルコースＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ，Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）からなるものを使用した。細胞を足場の上部に播種した（足場あたり細胞１０６個の細胞密度）。アルコルビン酸（５０μｇ／ｍｌ）を補充した培養培地を２〜３日ごとに取り替えた。試料を培養物中で最大１週間維持した。培養培地中でインキュベートした非播種の多孔質足場を対照として用いた。動物由来およびヒト由来の一次血管平滑筋細胞および内皮細胞などの他の細胞型を用いて同様の実験を首尾よく行った。
【００８９】
−最初の付着
足場にＭＳＣを浸潤させながら、多孔質足場の表面に細胞を２時間未満付着させた。
【００９０】
−細胞追跡
播種ステップの前に蛍光染料ＰＫＨ２６（Ｓｉｇｍａ）を用い、製造者の取扱説明書に従って細胞標識することにより、細胞追跡を行った。細胞を非標識足場とＦＩＴＣ−足場の両方に播種した。次いで細胞播種した足場を４％のパラホルムアルデヒド／ＰＢＳで固定した後、共焦点顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ ＬＳＭ ５１０）で分析した。
【００９１】
ＰＫＨ２６標識したＭＳＣを、足場の孔中くまなく追跡した。１日目と７日目に、７０ミクロンと１９０ミクロンの深さでゲル内の細胞分布の代表的な画像を撮った。共焦画像のＺ軸投影により、ゲル内の細胞浸潤が確認された。１日目〜７日目に足場内の細胞密度が増加したことが認められた。
【００９２】
−細胞の生存率
生存細胞によって加水分解され、それによって強度な均一の緑色蛍光（波長４８５〜５３５ｎｍ）を生成するポリアニオン系染料である、カルセインＡＭ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ ＣＡ）を用いて、細胞の生存率をアッセイした。この染料を、１日目、５日目、および７日目に、製造者の取扱説明書に従って、多孔質の非標識足場およびＦＩＴＣ−足場に加えた。次いでこの播種された足場を４％のパラホルムアルデヒド／ＰＢＳで固定した後、共焦点顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ ＬＳＭ ５１０）で分析して、足場およびＦＩＴＣ−足場内の細胞分布を可視化した。
【００９３】
このアッセイにより、１日目と７日目に、細胞のほとんどが多孔質足場の表面および内部に生存していることが確認された。
【００９４】
＜実施例５＞
足場内へのタンパク質の組み込み
実施例１に従い、ゼラチンおよびＩ型コラーゲンなどの接着タンパク質を組み込むために以下の改変を加えて、多糖足場を調製した。ゼラチンに関しては、多糖溶液９ｍＬを１０ＭのＮａＯＨ１ｍＬと混合し、次いでその混合物にゼラチン５００μｇを含む水１ｍＬ中ＳＴＭＰ３００ｍｇの水溶液（０．１％のゼラチン溶液５００μＬ）を加えた。Ｉ型コラーゲンの組み込みに関しては、多糖溶液に０．４％のコラーゲン溶液（Ｕｐｓｔａｔｅ ＃０８１１５）５００μＬを加えた後に架橋剤（５００μＬ中３００ｍｇ）を加えた。足場の厚い切片のクーマシーブルー染色およびシリウスレッド染色により、足場内のタンパク質分布が確認された。平均タンパク質含量は、足場直径６ｍｍにつきゼラチン約１μｇ、および足場直径６ｍｍにつきコラーゲン４μｇであると見積もられた。
【００９５】
＜実施例６＞
代用血管としての管状足場
実施例１に記載の通り調製した多糖ベースの管状足場は、代用血管として使用できうる。
【００９６】
実施例１に記載の通りに調製した水溶液を、２０Ｇの針とキャップとからなる自家製の管状型に注ぎ込んだ。針（２０Ｇ×１１／２’’または０．９×４０ｍｍ）を、滑らかな管腔表面（管腔直径２ｍｍ）を作るための中心軸として用いた。多糖／ＳＴＭＰ溶液を１ｍｌのシリンジを用いて針のキャップを通して針内に注入した。結果生じた管状足場の内径と外径はどちらも、針とそのキャップのサイズによって決まる（１８Ｇまたは２１Ｇの針を用いた試料も調製した）。
【００９７】
実施例１に従って、型をすぐに−８０℃で凍結させた。次に、混合物を上記の通りに凍結乾燥させた。凍結乾燥後、足場を型から容易に取り出した。ＰＢＳで再含水させた後、管状足場を得た。平滑筋細胞または間葉幹細胞などの細胞を、再含水プロセス中に管状足場に播種でき、次いで内皮細胞または内皮前駆細胞などの他の細胞を管状足場の管腔に担持させることができる。
【００９８】
＜実施例７＞
足場内への薬物の組み込み
実施例１に従い、ノルフロキサシンなどの薬物を組み込むために以下の改変を加えて、多糖足場を調製した。ノルフロキサシンは、フルオロキノロン系カルボン酸であり、広く使用されている抗菌剤である。現在ノルフロキサシンは、主にその水溶性の低さに起因して、生体利用率が低いモデル化合物とされている。固体状態のノルフロキサシン（Ｓｉｇｍａ）（６０ｍｇ）を多糖溶液（１０ｇ）に加え、その混合物を、均一になるまで撹拌した。次いで、結果生じた混合物を１０ＭのＮａＯＨ１ｍＬと混合し、次いでその混合物に水１ｍＬ中ＳＴＭＰ３００ｍｇの水溶液を加えた。次いで、実施例１に従って架橋結合プロセスを行った。
【００９９】
ＰＢＳ中、３７℃で最大２４時間、多孔質足場をインキュベートすることにより、放出特性を得た。上清中のノルフロキサシン含量を２７４ｎｍにおける分光光度でアッセイした。図６は、多孔質足場からのノルフロキサシン放出と、孔形成剤の非存在下で調製した非多孔質足場からのノルフロキサシン放出との比較を例示している。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、組織工学用多孔質足場の調製方法に関する。本発明の他の目的は、前記の方法によって得られる多孔質足場、ならびにその多孔質足場の、組織工学、細胞培養および細胞送達への使用を提供することである。
【背景技術】
【０００２】
組織工学は一般的に、移植に適した足場の上またはその内部への細胞の播種によって、組織または器官の相当物を作出することであると定義される。足場上に組織または器官の相当物を形成するためには、足場は生体適合性でなければならず、細胞がその足場上に付着して増殖できなければならない。したがってこれらの足場は、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏでの細胞の増殖のための基材とみなすことができる。
【０００３】
理想的な生体適合性足場の特質としては、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏでの細胞増殖を補助する能力、さまざまな細胞型または細胞系列の増殖を補助する能力、必要とされるさまざまな程度の柔軟性または強剛性を有する能力、さまざまな程度の生分解性を有する能力、ｉｎ ｖｉｖｏの目的部位に、二次傷害を誘導することなく導入される能力、ならびに所望の作用部位に薬物、細胞および／または生理活性物質を送達するためのビヒクルまたはリザーバとなる能力が挙げられるであろう。
【０００４】
多くの異なる足場材料が、組織再生誘導法に用いるために、および／または生体適合性表面として利用されてきた。足場が徐々に分解され、最終的には細胞−足場構造は完全に細胞に置き換わるので、生物分解性のポリマー材料が好ましい場合が多い。組織の増殖または再生を補助すると言われている、有用な足場となる可能性がある多くの候補物質としては、ゲル、泡沫、シート、ならびに形態および形状が異なる多数の多孔質粒子状構造物が挙げられる。
【０００５】
組織工学または組織培養に有用であることが開示されている多種多様の天然ポリマーとしては、フィブロネクチン、各型コラーゲン、およびラミニン、ならびにケラチン、フィブリンおよびフィブリノーゲン、ヒアルロン酸、ヘパリン硫酸、コンドロイチン硫酸などの細胞外マトリックスの種々の成分が挙げられる。
【０００６】
他の使用されていた一般的なポリマーとしては、ポリ（ラクチド−ｃｏ−グリコリド）（ＰＬＧ）が挙げられる。ＰＬＧは、体内への使用についてＦＤＡから承認された、力学的に強い、加水分解可能なポリマーである（Ｔｈｏｍｓｏｎ ＲＣ，Ｙａｓｚｅｍｓｋｉ ＭＪ，Ｐｏｗｅｒｓ ＪＭ，Ｍｉｋｏｓ ＡＧ．Ｆａｂｒｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｂｉｏｄｅｇｒａｄａｂｌｅ ｐｏｌｙｍｅｒ ｓｃａｆｆｏｌｄｓ ｔｏ ｅｎｇｉｎｅｅｒ ｔｒａｂｅｃｕｌａｒ ｂｏｎｅ．Ｊ Ｂｉｏｍａｔｅｒ Ｓｃｉ Ｐｏｌｙｍ Ｅｄ．１９９５；７（１）：２３−３８；Ｗｏｎｇ ＷＨ．Ｍｏｏｎｅｙ ＤＪ．Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ ｂｉｏｄｅｇｒａｄａｂｌｅ ｐｏｌｙｍｅｒｓ ｕｓｅｄ ａｓ ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｍａｔｒｉｃｅｓ ｆｏｒ ｔｉｓｓｕｅ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ．Ｉｎ：Ａｔａｌａ Ａ，Ｍｏｏｎｅｙ ＤＪ，ｅｄｉｔｏｒｓ；Ｌａｎｇｅｒ Ｒ，Ｖａｃａｎｔｉ ＪＰ，ａｓｓｏｃｉａｔｅ ｅｄｉｔｏｒｓ．Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｂｉｏｄｅｇｒａｄａｂｌｅ ｐｏｌｙｍｅｒ ｓｃａｆｆｏｌｄｓ．Ｂｏｓｔｏｎ：Ｂｉｒｋｈａｕｓｅｒ：１９９７．ｐ．５１−８２．）。しかし、ＰＬＧは疎水性であり、一般に比較的厳密な条件下で加工され、したがって、因子の組み込みおよび生存細胞の封入が潜在的に難題になる。
【０００７】
代替として、水分を多く含むポリマー材料（含水率が３０重量％よりも高い）である種々のヒドロゲルが足場材料として使用されている。これらは、合成由来かまたは天然由来の親水性ポリマー鎖で構成されている。ヒドロゲルの構造的な完全性は、種々の化学結合および物理的相互作用を介してポリマー鎖間で形成される架橋結合に左右される。これらの用途で用いられるヒドロゲルは、一般に分解可能であり、比較的緩やかな条件下で処理でき、多くの組織および細胞外マトリックスと同様の力学的特性および構造的特性を有し、最小限の侵襲で送達可能である（Ｌｅｅ ＫＹ，Ｍｏｏｎｅｙ ＤＪ．Ｈｙｄｒｏｇｅｌｓ ｆｏｒ ｔｉｓｓｕｅ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ．Ｃｈｅｍ Ｒｅｖ．２００１ Ｊｕｌ；１０１（７）：１８６９−７９．）。したがって、種々のポリマーがヒドロゲルの調製に使用されている。これらのポリマーとしては、例えば、コラーゲン、ゼラチン、ヒアルロン酸（ＨＡ）およびキトサンが挙げられる。
【０００８】
天然多糖の使用についても、それら多糖が非抗原性かつ非免疫原性であり、抗血栓作用および血管増殖因子との相互作用を示すものもあることから、ヒドロゲルに基づいた足場調製の有望な代替であることが示されている。さらに、多糖は可塑性を有するので、これらの多糖ベースのヒドロゲルは種々の形態に造形することができ、治療用の生体インプラント材料または生体グラフト材料の設計を可能にしうる。
【０００９】
例えば、Ｃｈａｏｕａｔらは（Ｃｈａｏｕａｔ Ｍ，Ｌｅ Ｖｉｓａｇｅ Ｃ，Ａｕｔｉｓｓｉｅｒ Ａ，Ｃｈａｕｂｅｔ Ｆ，Ｌｅｔｏｕｒｎｅｕｒ Ｄ．Ｔｈｅ ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｓｍａｌｌ−ｄｉａｍｅｔｅｒ ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ−ｂａｓｅｄ ａｒｔｅｒｉａｌ ｇｒａｆｔ ｉｎ ｒａｔｓ．Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ．２００６ Ｎｏｖ；２７（３２）：５５４６−５３．Ｅｐｕｂ ２００６ Ｊｕｌ ２０．）、プルランとデキストランの混合物を用いて調製した、新規の多糖ベースの足場を設計した。架橋剤のトリメタリン酸三ナトリウム（ＳＴＭＰ）を用いて、多糖を化学的に架橋結合させた。その後、この足場を用いて調製した動脈材料の有効性をｉｎ ｖｉｖｏで実証した。
【００１０】
しかし、Ｃｈａｏｕａｔら（２００６）の記載のように、足場の調製に多糖を使用することが有利であるにもかかわらず、医療目的での有効利用を想定するには、いまだに得られる足場の多孔度の欠如が欠点になっている。実際、多孔性は、足場内での細胞の増殖、統合、および分化を可能にし、その材料が、ｉｎ ｖｉｖｏで組織または器官を再構築するための細胞リザーバとして使用されるようにするために不可欠な特徴である。
【００１１】
したがって、本技術分野には、治療目的に使用可能な多孔質足場マトリックスを調製する方法を開発する必要性が今なお存在している。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
したがって、本発明の目的は、
ａ）ある量の少なくとも１種の多糖および１種の架橋剤を含むアルカリ性水溶液を調製するステップと、
ｂ）ステップａ）の水溶液を凍結させるステップと、
ｃ）ステップｂ）の凍結溶液を昇華させるステップと
からなるステップを含む、多孔質足場の調製方法であって、ステップａ）の溶液中で多糖の架橋結合が起こる前にステップｂ）を行うことを特徴とする方法を提供することである。
【００１３】
本発明によれば、「ステップａ）の溶液中で多糖の架橋結合が起こる前にステップｂ）を行う」とは、多糖の架橋結合が昇華ステップ（ステップｃ））中に起こることを意味する。
【００１４】
本発明の他の目的は、前記の方法によって得られる多孔質足場を提供することである。
【００１５】
本発明のさらに他の目的は、本発明の多孔質足場の組織工学への使用を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
定義
本明細書で使用する「多糖」という用語は、２つ以上の単糖ユニットを含む分子を指す。
【００１７】
本明細書で使用する「アルカリ性溶液」という用語は、ｐＨが７より上である溶液を指す。
【００１８】
本明細書で使用する「水溶液」という用語は、溶媒が水である溶液を指す。
【００１９】
「架橋結合」という用語は、あるポリマー鎖と他のポリマー鎖との間の共有結合による連結を指す。
【００２０】
本明細書で使用する「足場」は、１種または複数種の多糖鎖の三次元網目構造を含む半固体系であると定義される。そのような構造は、使用する多糖（または複数の多糖）の特性、ならびに網目構造の性質および密度によって、平衡状態において種々の量の水を含むことができる。
【００２１】
「架橋剤」という用語は、本発明の多糖の鎖間に架橋結合を導入できるような任意の作用剤を含む。
【００２２】
本明細書で使用する「生分解性の」という用語は、排出可能な、またはさらに代謝可能な非毒性の化合物にｉｎ ｖｉｖｏで分解される材料を指す。
【００２３】
「昇華」という用語は、固体状態から蒸気の状態に直接移行する物理的な段階を指す。より詳細には、昇華は、物質が固体から気体に、液相を経ずに至るというプロセスである。溶液は、凍結乾燥プロセスを通じて昇華させることができる。
【００２４】
「凍結乾燥」という用語は、溶媒（すなわち、水）を凍結させ、次いで凍結状態で気化させることによる、高真空下における急速冷凍した材料の乾燥についての用語である。
【００２５】
多孔質足場とその調製方法
本発明の第１の目的は、
ａ）ある量の少なくとも１種の多糖および１種の架橋剤を含むアルカリ性水溶液を調製するステップと、
ｂ）ステップａ）の水溶液を凍結させるステップと、
ｃ）ステップｂ）の凍結溶液を昇華させるステップと
からなるステップを含む多孔質足場の調製方法であって、ステップａ）の溶液中で多糖の架橋結合が起こる前にステップｂ）を行うことを特徴とする方法に関する。
【００２６】
本発明によれば、「ステップａ）の溶液中で多糖の架橋結合が起こる前にステップｂ）を行う」とは、多糖の架橋結合が昇華ステップ（ステップｃ））中に起こることを意味する。
【００２７】
本発明においては、任意の種類の多糖が使用可能である。合成多糖または天然多糖は、本発明の目的のために二者択一的に使用してよい。例えば、適切な天然多糖としては、デキストラン、寒天、アルギン酸、ヒアルロン酸、イヌリン、プルラン、ヘパリン、フコイダン、キトサン、スクレログルカン、カードラン、デンプン、セルロース、およびそれらの混合物が挙げられるが、それらに限定されない。例えば、酸性基（カルボキシル基、硫酸基、リン酸基）、アミノ基（エチレンアミン、ジエチルアミノエチルアミン、プロピルアミン）、疎水基（アルキル基、ベンジル基）を有する化学修飾された多糖も含んでよい。所望の多糖を生成させるために用いることができる単糖類としては、リボース、グルコース、マンノース、ガラクトース、フルクトース、ソルボース、ソルビトール、マンニトール、イジトール、ズルシトール、およびそれらの混合物が挙げられるが、それらに限定されない。これらの化合物の多くは、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｉｃｈｉｇａｎ，ＵＳ）などの会社が市販している。
【００２８】
多糖の好ましい重量平均分子量は、約１０，０００ダルトン〜約２，０００，０００ダルトンであり、より好ましくは約１０，０００ダルトン〜約５００，０００ダルトンであり、最も好ましくは約１０，０００ダルトン〜約２００，０００ダルトンである。
【００２９】
本発明の一実施形態において、本発明の足場を調製するために使用される多糖（複数可）は、デキストラン、寒天、プルラン、イヌリン、スクレログリカン、カードラン、デンプン、セルロース、またはそれらの混合物などの中性多糖である。好ましい実施形態において、本発明の足場を調製するためにプルランとデキストランとの混合物が使用される。例えば、前記混合物は２５％のデキストランと、７５％のプルランとで構成される。
【００３０】
本発明の他の実施形態において、本発明の足場を調製するために使用される多糖（複数可）は、キトサン、ＤＥＡＥ−デキストラン、およびそれらの混合物などの正電荷を持つ多糖である。
【００３１】
本発明の他の実施形態において、本発明の足場を調製するために使用される多糖（複数可）は、アルギン酸、ヒアルロン酸、ヘパリン、フコイダン、およびそれらの混合物などの負電荷を持つ多糖である。
【００３２】
本発明の他の実施形態において、本発明の足場を調製するために使用される多糖（複数可）は、中性多糖と負電荷を持つ多糖との混合物であり、ここで負電荷を持つ多糖はその混合物の１〜２０％、好ましくは５〜１０％を示す。
【００３３】
ある特定の実施形態において、架橋剤は、トリメタリン酸三ナトリウム（ＳＴＭＰ）、オキシ塩化リン（ＰＯＣｌ３）、エピクロロヒドリン、ホルムアルデヒド、水溶性カルボジイミド、グルタルアルデヒド、または多糖を架橋結合させるのに適切なその他の任意の化合物からなる群から選択される。好ましい実施形態において、架橋剤はＳＴＭＰである。水溶液中の架橋剤の濃度（ｗ／ｖ）は、約１％〜約６％であり、より好ましくは約２％〜約６％であり、最も好ましくは約２％〜約３％である。架橋剤の使用推奨量は、多糖と架橋剤の重量比が２０：１〜１：１、好ましくは１５：１〜１：１、より好ましくは１０：１〜１：１の範囲になる量である。これらの化合物の多くは、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｉｃｈｉｇａｎ，ＵＳ）などの会社が市販している。
【００３４】
多糖を含む水溶液は、企図する用途によって、種々の添加剤をさらに含んでよい。添加剤は多糖と適合性があり、多糖（複数可）の有効な架橋結合を妨害しないことが好ましい。使用する添加剤の量は、個々の用途によって決まり、当業者は実験の常法を用いてそれを容易に決定することができる。
【００３５】
多糖を含む水溶液は、場合によって、少なくとも１種の抗菌剤を含んでよい。適切な抗菌性保存剤は当技術分野において周知である。適切な抗菌剤の例としては、メチルパラベン、エチルパラベン、プロピルパラベン、およびブチルパラベンなどのアルキルパラベン、クレゾール、クロロクレゾール、ヒドロキノン、安息香酸ナトリウム、安息香酸カリウム、トリクロサン、およびクロルヘキシジンが挙げられるが、それらに限定されない。使用することができる抗細菌剤および抗感染剤の他の例としては、リファンピシン、ミノサイクリン、クロルヘキシジン、銀イオン剤、および銀ベースの組成物が挙げられるが、それらに限定されない。
【００３６】
多糖を含む水溶液は、場合によって、溶液の可視性を増大させるために少なくとも１種の着色剤も含んでよい。適切な着色剤には、染料、顔料、および天然着色料が含まれる。適切な着色剤の例としては、アルシアンブルー、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、およびＦＩＴＣ−デキストランが挙げられるが、それらに限定されない。
【００３７】
多糖を含む水溶液は、場合によって、少なくとも１種の界面活性剤も含んでよい。本明細書で使用する界面活性剤とは、水の表面張力を弱める化合物を指す。界面活性剤は、ラウリル硫酸ナトリウムなどのイオン性界面活性剤、またはポリオキシエチレンエーテル、ポリオキシエチレンエステル、およびポリオキシエチレンソルビタンなどの中性界面活性剤であってよい。
【００３８】
ステップａ）の溶液中で多糖の架橋結合が起こる前にステップｂ）を行うことは、本発明に不可欠な特徴である（実施例１を参照されたい）。水溶液中での架橋結合を調節するための主要因子は、温度と時間である。多糖の架橋結合を回避する、または著しく制限するために、水溶液は３７℃以下、より好ましくは４℃〜２５℃で構成される温度で調製することができる。さらに、ステップｂ）は、前記多糖の架橋結合を回避するために、できるだけ速やかに実施することができる。
【００３９】
水溶液を調製したら、それを凍結させる。水溶液の凍結は、異なる速度（例えば、℃／分）で行ってよい。例えば、約１℃／分〜約２００℃／分の速さ、好ましくは約１℃／分〜約２０℃／分の速さ、最も好ましくは約５℃／分〜約１０℃／分の速さで凍結させてよい。溶液は、液体窒素で、またはドライアイスで凍結させることができる。
【００４０】
水溶液が凍結したら、昇華が起こりうる。好ましい実施形態において、本発明による多孔質足場の調製方法は、凍結乾燥のプロセスを含む。
【００４１】
したがって、本発明によると、凍結乾燥のプロセスは、水溶液中で架橋結合が起こる前に行われる必要がある。
【００４２】
凍結乾燥は、当技術分野で公知の任意の装置を用いて行うことができる。凍結乾燥機には基本的に、ロータリーエバポレーター、多岐管式凍結乾燥機、および棚式凍結乾燥機の３種類がある。そのような装置は、当技術分野において周知であり、ｆｒｅｅｚｅ−ｄｒｙｅｒ Ｌｙｏｖａｃ（ＧＴ２，ＳＴＥＲＩＳ Ｒｏｔａｒｙ ｖａｎｅ ｐｕｍｐ，ＢＯＣ ＥＤＷＡＲＤＳ）など市販されている。
【００４３】
基本的に、急速冷凍した水溶液をチャンバー内に置く。次に、チャンバーの温度を、液化した蒸気の沸点より高いレベルまで上昇させ、それによって蒸気を蒸発させて除去する。例えば、チャンバーの温度は−７０℃〜−１℃、好ましくは−７０℃〜−４０℃、より好ましくは約−５０℃〜−４０℃であってよい。チャンバーの加熱は、チャンバーの圧力を減少させる真空の流れを伴う。一般的にチャンバーの真空は０．１ｍＢａｒ〜約６．５ｍＢａｒである。
【００４４】
凍結乾燥は、少なくとも水分の９８．５％、好ましくは、少なくとも水分の９９％、より好ましくは、少なくとも水分の９９．５％を除去するのに十分な時間行う。
【００４５】
水溶液を凍結させることによって、水から氷粒子が形成される。いかなる理論にも縛られずに、上記の温度、圧力条件下で凍結溶液に含まれる水分を昇華させ、したがって、それによって、材料内の、それまで氷粒子が占有していた空間に間隙が残り、それに応じて形成された多孔質足場が生成する。驚いたことに、架橋結合のプロセスは凍結乾燥のプロセス中に起こる。
【００４６】
したがって、結果生成する足場の物質密度および孔のサイズは、凍結溶液の凍結乾燥速度を調節することによって変化する。凍結乾燥プロセスにおいて不可欠なパラメーターは、真空度である。実施例において、本発明者らは実際に、真空度が異なると、足場中にはサイズと密度が異なる孔ができることを示した。
【００４７】
足場の孔の平均サイズは、約１μｍ〜約５００μｍ、好ましくは約１５０μｍ〜約３５０μｍ、より好ましくは約１７５μｍ〜約３００μｍである。孔の密度は約４％〜約７５％、好ましくは約４％〜約５０％である。
【００４８】
他の実施形態において、本発明の方法は、本発明に従って調製した足場に含水させることからなるステップをさらに含む。前記含水は、足場を水溶液（例えば、脱イオン水、逆浸透膜でろ過した水、生理食塩水、または適切な有効成分を含む水溶液）中に、所望の含水率を有する足場が生成するのに十分な時間、浸すことにより行う。例えば、含水率が最大である足場を所望の場合、足場が、そのサイズ、または体積が最大になるまで膨張するのに十分な時間、足場を水溶液に浸す。一般には、少なくとも約１時間、好ましくは少なくとも約２時間、より好ましくは約４時間〜約２４時間、足場を水溶液に浸す。当然のことながら、足場を所望のレベルまで含水させるために必要な時間は、使用する多糖の組成、足場のサイズ（例えば、厚さ）、および水溶液の温度と粘度、ならびに他の因子などいくつかの因子に左右される。
【００４９】
ある特定の実施形態において、含水した足場の含水率は８０％、好ましく９０％、より好ましくは９５％である。
【００５０】
他の特定の実施形態において、本発明の方法を用いて得られる多孔質足場を所望の形態にできるように、凍結および昇華の前に、多糖水溶液を型に注ぎ込むことができる。任意の幾何学的な型を本発明に従って使用してよい。サイズの異なるものも想定してよい。例えば、一般に、中心軸を有する管状の型に水溶液を注ぎ込んで、多孔質足場が所望の外径と内径を有する管状になるようにすることができる（実施例６を参照されたい）。型は、任意の材料から調製してよいが、好ましい材料は、テフロン（登録商標）などの粘着しない表面を有するものである。
【００５１】
あるいは、本発明の足場は、所望のサイズおよび形になるよう切断し、造形してよい。
【００５２】
本発明の方法は、任意の適切なプロセスを用いて足場を滅菌するステップをさらに含んでよい。足場は、任意の適切な時点で滅菌することができるが、足場に含水させた後に滅菌するのが好ましい。適切な非放射線滅菌の技法としては、ＵＶ照射、ガスプラズマ、または酸化エチレンなどの当技術分野において公知の方法が挙げられるが、それらに限定されない。例えば、Ａｂｔｏｘ，ｌｎｃ、Ｍｕｎｄｅｌｅｉｎ、ＩＩＩｉｎｏｉｓから入手可能な滅菌システム、商品名ＰｌａｚＬｙｔｅを用いて、または米国特許第５４１３７６０号および米国特許第５６０３８９５号に開示されているガスプラズマ滅菌プロセスに従って、足場を滅菌することができる。
【００５３】
本発明の方法によって生成する足場は、任意の適切な包装材で包装することができる。包装材を破るまで足場の無菌性が保たれるような包装材が望ましい。
【００５４】
他の実施形態において、多孔質足場に１つまたは複数の生体分子を組み込むことができる。他の実施形態において、生体分子は、薬物、ホルモン、抗生物質、抗菌物質、染料、放射性物質、蛍光物質、抗細菌物質、化学薬品、または作用物質、それらの任意の組合せを含んでよい。この物質は、治療効果の増大、可視性の増大、適正な配向指示、感染への抵抗、治癒の促進、柔軟性の増加、または他の任意の望ましい効果を目的として使用してよい。前記実施形態において、上記に記載の１つまたは複数の生体分子を含む本発明の足場は、活性剤の放出制御系として用いることができる。
【００５５】
一実施形態において、生体分子は、走化性物質、抗生物質、ステロイド性もしくは非ステロイド性の鎮痛剤、抗炎症薬、免疫抑制剤、抗がん剤、種々のタンパク質（短鎖ペプチド、骨形態形成タンパク質、糖タンパク質、およびリポタンパク質など）；細胞付着の介在物質；生理活性リガンド；インテグリン結合配列；リガンド；種々の増殖作用物質および／または分化剤（上皮細胞増殖因子、ＩＧＦ−Ｉ、ＩＧＦ−ＩＩ、ＴＧＦ−β、増殖因子および分化因子、ストロマ細胞由来因子ＳＤＦ−１；血管内皮細胞増殖因子、線維芽細胞増殖因子、血小板由来増殖因子、インスリン由来増殖因子、および形質転換増殖因子、副甲状腺ホルモン、副甲状腺ホルモン関連ペプチド、ｂＦＧＦ；ＴＧＦβスーパーファミリー因子；ＢＭＰ−２；ＢＭＰ−４；ＢＭＰ−６；ＢＭＰ−１２；ソニックヘッジホッグ；ＧＤＦ５；ＧＤＦ６；ＧＤＦ８；ＰＤＧＦなど）；特異的な増殖因子の上方制御に影響を及ぼす小分子；テネイシン−Ｃ；ヒアルロン酸；コンドロイチン硫酸；フィブロネクチン；デコリン；トロンボエラスチン）；トロンビン由来ペプチド；ヘパリン結合ドメイン；ヘパリン；ヘパラン硫酸；ＤＮＡ断片、ＤＮＡプラスミド、Ｓｉ−ＲＮＡ、トランスフェクション試薬、またはそれらの任意の組合せを含んでよい。
【００５６】
一実施形態において、増殖因子として、ヘパリン結合増殖因子（ＨＢＧＦ）、形質転換増殖因子αまたは形質転換増殖因子β（ＴＧＦ）、α線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ）、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）、およびＳＤＦ−１、同様の血管形成因子の一部が挙げられる。他の実施形態において、因子として、インスリン、グルカゴン、およびエストロゲンなどのホルモンが挙げられる。ある実施形態では、神経成長因子（ＮＧＦ）または筋肉形態形成因子（ＭＭＦ）などの因子を組み込むことが望ましい場合がある。ある実施形態において、ＴＮＦα／β、またはマトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）を組み込む。
【００５７】
さらに、本発明の足場は、場合によって、インドメタシン、アセチルサルチル酸、イブプロフェン、スリンダク、ピロキシカム、およびナプロキセンなどの抗炎症剤；トロンビン、フィブリノーゲン、ホモシステイン、およびエストラムスチンなどの血栓形成剤；ならびに硫酸バリウム、金粒子、および酸化鉄ナノ粒子（ＵＳＰＩＯ）などの放射線を通さない化合物を含んでよい。
【００５８】
さらに、本発明の足場は、場合によって、抗ビタミンＫもしくはアスピリンなどの抗血栓剤、アスピリン、チエノピリジン、ジピリダモール、もしくはクロピドグレルなどの抗血小板剤（アデノシン二リン酸（ＡＤＰ）誘導性の血小板凝集を選択的かつ可逆的に阻害する）、またはヘパリンなどの抗凝固剤を含んでよい。ヘパリン（抗凝固剤）とチロフィバン（抗血小板剤）の組合せが、血栓および血栓塞栓の両方を減少させるのに有効であることが示されており、これを本発明の足場に組み込むことができる。用量依存的な抗血小板特性および抗増殖特性を有する可能なイソフラボンであり、原発性血栓症の原因であるコラーゲン誘導性の血小板凝集を阻害するゲニステインも、本発明の足場に組み込むことができる。
【００５９】
本発明の足場の使用方法
本発明の足場は、特に組織工学、組織修復、または組織再生に適している。多孔度の違いにより、足場の適当な領域への異なる細胞型の移入が促進されうる。他の実施形態において、多孔度の違いにより、組織の発生／修復／再生の適当な構造化に必要な、足場を構成する細胞型間における適当な細胞間連結の発生が促進されうる。例えば、細胞突起の伸長は、足場材料の多様な多孔度を介してより適当になるよう適応されうる。したがって、足場は任意の組織の細胞を含んでよい。
【００６０】
ある特定の実施形態において、前記足場に細胞を播種する。他の実施形態において、本発明の足場を、所望の細胞を含む培養溶液中に、その細胞が足場全体に浸透できるのに十分な時間浸す。
【００６１】
他の実施形態において、本発明の足場は、培養物中の播種細胞の生存率および増殖を、長時間にわたって、分化を誘導せずに補助することが可能である。
【００６２】
他の実施形態において、本発明の足場は、非刺激性の細胞増殖環境（増殖促進剤による活性化がない）を提供する。
【００６３】
他の実施形態において、本発明の足場は、組織増殖、骨の再建、創傷治癒、腫瘍形成（移動と浸潤を含む）、および血管新生などの生理学的、病理学的なプロセスの研究に用いることができる。足場により、内因性因子を含まない制御された形で、特定のプロセスを調節および研究できるような、規定され、かつ制御された環境の作出が可能になる。
【００６４】
具体的には、本発明の足場は、診断用量または毒性用量に関する三次元培養に使用可能である。この実施形態において、本発明の足場は、製品の毒性について、三次元環境に存在する細胞に対して直接評価することを可能にする。前記実施形態において、本発明の足場を、肝細胞、胚性幹細胞、上皮細胞、ケラチノサイト、または人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）などの、製品の毒性および／または薬理作用を評価するために有用な細胞の培養に使用する。
【００６５】
他の実施形態において、本発明の足場は、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏでの複数の細胞型の増殖および分化を補助することが可能である。
【００６６】
他の実施形態において、細胞は幹細胞または前駆細胞である。他の実施形態において、細胞は、軟骨細胞；線維軟骨細胞；骨細胞；骨芽細胞；破骨細胞；滑膜細胞；骨髄細胞；間葉細胞；上皮細胞、肝細胞、筋細胞；間質細胞；幹細胞；胚性幹細胞；脂肪組織由来の前駆体細胞；末梢血前駆細胞；成体組織から単離された幹細胞；人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）；遺伝子形質転換細胞；軟骨細胞と他の細胞の組合せ；骨細胞と他の細胞の組合せ；滑膜細胞と他の細胞の組合せ；骨髄細胞と他の細胞の組合せ；間葉細胞と他の細胞の組合せ；間質細胞と他の細胞の組合せ；幹細胞と他の細胞の組合せ；胚性幹細胞と他の細胞の組合せ；成体組織から単離された前駆細胞と他の細胞の組合せ；末梢血前駆細胞と他の細胞の組合せ；成体細胞から単離された幹細胞と他の細胞の組合せ；および遺伝子形質転換細胞と他の細胞の組合せが挙げられるが、それらに限定されない。
【００６７】
他の実施形態において、本発明の足場および方法に使用するためのこれらの細胞はどれも、例えば、それらの一部が血管形成因子でもある、ヘパリン結合性増殖因子（ＨＢＧＦ）、形質転換増殖因子αまたは形質転換増殖因子β（ＴＧＦβ）、α線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ）、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）、およびＳＤＦ−１などの所望の分子を発現するように遺伝子改変してよい。他の実施形態において、発現される因子として、インスリン、グルカゴン、およびエストロゲンなどのホルモンが挙げられる。他の実施形態において、神経成長因子（ＮＧＦ）もしくは筋肉形態形成因子（ＭＭＦ）などの因子が発現され、または他の実施形態において、ＴＮＦα／βが発現される。
【００６８】
ある特定の実施形態において、本発明の足場は、例えばＣｈａｏｕａｔら（Ｃｈａｏｕａｔ Ｍ，Ｌｅ Ｖｉｓａｇｅ Ｃ，Ａｕｔｉｓｓｉｅｒ Ａ，Ｃｈａｕｂｅｔ Ｆ，Ｌｅｔｏｕｒｎｅｕｒ Ｄ．Ｔｈｅ ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｓｍａｌｌ−ｄｉａｍｅｔｅｒ ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ−ｂａｓｅｄ ａｒｔｅｒｉａｌ ｇｒａｆｔ ｉｎ ｒａｔｓ．Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ．２００６ Ｎｏｖ；２７（３２）：５５４６−５３．Ｅｐｕｂ ２００６ Ｊｕｌ ２０．）の記載のような、損傷した動脈を交換するための代用血管を調製するのに適している。そのような代用物は、本発明の方法に従って、上記の型を用いて調製することができる。次いでそのような代用物に細胞集団を含めてｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏで血管を再構築することができる。他の実施形態において、細胞として、間葉幹細胞（ＭＳＣ）、内皮前駆細胞（ＥＰＣ）、内皮細胞、線維芽細胞、および平滑筋細胞が挙げられるが、それらに限定されない。
【００６９】
他の特定の実施形態において、本発明の足場は、軟骨または骨のインプラントを調製するのに適している。そのような場合に、本発明の足場に、軟骨細胞；骨細胞；骨芽細胞；破骨細胞；血管細胞、またはそれらの混合物を担持させることができ、分化誘導剤の存在下で培養することができる。
【００７０】
移植部位は、治療が必要な罹患／損傷組織によって決まる。例えば、関節軟骨、関節半月、および骨の構造欠陥を治療するために、細胞を播種した足場複合体を欠陥部位に設置して損傷組織の修復を促進する。
【００７１】
中枢神経系（ＣＮＳ）の損傷の場合、足場複合体には、成体神経幹細胞、胚性幹細胞、グリア細胞、およびセルトリ細胞の組合せを播種してよい。好ましい実施形態において、足場複合体には、異種源または同種源の形質転換細胞系由来のセルトリ細胞を神経幹細胞と組み合わせて播種してよい。セルトリ細胞は、幹細胞を加えてその後損傷部位に移植するまでの間、足場複合体と一緒に培養してよい。この手法により、細胞治療のＣＮＳへの適用の主要な障害の１つ、すなわち、移植術後の幹細胞の生存についての障害を回避できる。多数のセルトリ細胞を封入した足場複合体により、幹細胞の生存により適した環境が提供されうる。
【００７２】
したがって、本発明に従って調製される多孔質ポリマー足場は、人工血管、人工食道、人工膀胱、人工神経、人工心臓、人工心臓弁、人工皮膚、整形外科用インプラント、人工筋肉、人工靱帯、人工呼吸器などの人工組織または人工器官を製造するための原料として有効に使用できる。さらに、本発明の多孔質ポリマー足場は、他種の生体材料上またはその内部に、また組織もしくは器官由来の機能性細胞と一緒に配合することまたは組み込むことによって、ハイブリッド組織の形で調製できる。ハイブリッド組織には、例えば、細胞の機能性、組織の再生などの維持など、種々の生物医学的な用途がありうる。
【００７３】
あるいは、本発明の足場は、治療上の細胞送達のために使用できる。実際、本発明の足場は、治療目的または診断目的で患者に投与可能な細胞送達系を調製するための原料として用いることができる。ある特定の実施形態において、本発明の足場は、細胞、優先的には自己細胞に担持させることが可能なパッチ、生体膜、または包帯材の調製に使用できる。ヒト細胞および動物細胞は細胞培養後に得ることができ、また凍結貯蔵細胞から直接得ることができる。例えば、本発明の足場は、皮膚を再構築または治癒するために皮膚に塗布可能な、細胞含有包帯材の調製に用いることができる。あるいは、前記包帯材は、虚血（心筋梗塞）を治療するために患者の心臓への投与に用いることができる。したがって、これらの実施形態において、足場中に封入された細胞は、標的とする組織または器官内に移動できる。
【００７４】
他の実施形態において、本発明の足場は、細胞培養に用いることができる。次いで適当な増殖因子を加えることにより細胞を刺激して、分化または他の生理学的プロセスに発展させる。細胞を未分化状態で維持するために、または細胞を特定の経路に分化させるために、１種または複数種のサイトカイン、増殖因子、ホルモン、またはそれらの組合せを含む培養培地を用いてよい。
【００７５】
より具体的には、本発明の足場は、対象分子の生成に用いることができる。実際に、本発明の足場は、細胞が所望の分子を生成できるように、細胞をバイオリアクター中に固定するための生物環境を提供するために用いることができる。本発明の足場は、培養細胞を力学的、生化学的に保護する。
【００７６】
したがって、足場は、タンパク質、有機分子、およびヌクレオチドなどの所望の分子を生成させるための細胞リザーバとして役立つ。例えば、対象のタンパク質としては、増殖因子、ホルモン、シグナル分子、細胞増殖の阻害剤、および抗体などが挙げられるが、それらに限定されない。本発明の足場は、モノクローナル抗体の生成に関して特に興味深い。本発明の足場は、香料、治療用分子などの有機分子の生成にも適切でありうる。
【００７７】
この目的で、本発明の足場には、原核細胞および真核細胞を含む任意の細胞型を担持させてよい。例えば、本発明の足場は、細菌、酵母細胞、哺乳動物細胞、昆虫細胞、植物細胞などを担持させてよい。具体例として、Ｅ．ｃｏｌｉ、クリベロマイセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）酵母もしくはサッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）酵母、哺乳動物細胞系（例えば、ベロ細胞、ＣＨＯ細胞、３Ｔ３細胞、ＣＯＳ細胞など）、ならびに初代もしくは樹立された哺乳動物細胞培養物（例えば、リンパ芽球、線維芽細胞、胚細胞、上皮細胞、神経細胞、脂肪細胞などから生成）が挙げられる。より具体的には、本発明は、雑種細胞などの樹立細胞系の使用を企図している。あるいは、上記の所望の分子を発現するように細胞を遺伝子改変してよい。
【００７８】
本発明の足場に細胞を担持させ、一定時間培養することができ、次いで細胞を足場から回収／抽出／分離して、治療用途もしくは診断用途、または細胞分析などにさらに使用できる。足場からの細胞の分離は、プルラナーゼなどの足場を分解できる酵素の使用、および／またはコラゲナーゼ、エラスターゼもしくはトリプシンなどの細胞を剥離できる酵素、もしくはＥＤＴＡなどの細胞剥離溶液の使用を伴ってよい。
【００７９】
本発明についてさらに、以下の図および実施例に照らして例示する。
【図面の簡単な説明】
【００８０】
【図１】再含水後の円形多孔質足場の肉眼的外観を示す写真である。
【図２】ＥＳＥＭによって、凍結乾燥条件（真空度、ｍｂａｒ）に応じて肉眼観察した、含水した多孔質足場の写真である。スケールバー：２００ミクロン、高倍率（５０ミクロン）を除く。
【図３】０．１ｍｂａｒで調製した乾燥多孔質足場（左）、６．５ｍｂａｒで調製した乾燥多孔質足場（右）をＳＥＭによって観察した写真である。
【図４】０．１ｍｂａｒまたは６．５ｍｂａｒで調製した多孔質足場切片をＨ＆Ｅ染色して観察した写真である（倍率４０倍）。
【図５】凍結乾燥の圧力に応じた膨張の割合を示すグラフである。
【図６】多孔質足場からのノルキロフサシン放出と、孔形成剤の非存在下で調製した非多孔質足場からのノルキロフサシン放出を比較したグラフである。
【実施例】
【００８１】
＜実施例１＞
多糖ベースの足場の調製
プルラン／デキストラン７５：２５、水中総濃度２４．５％（ｗ／ｖ）の混合物（プルラン、ＭＷ２００，０００、Ｈａｙａｓｈｉｂａｒａ Ｉｎｃ．Ｏｋａｙａｍａ，Ｊａｐａｎ；デキストラン、ＭＷ５００，０００、Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を調製した。アルカリ性条件下で、架橋剤のトリメタリン酸ナトリウム（ＳＴＭＰ）（１１％（ｗ／ｖ）、Ｓｉｇｍａ）を用いて多糖を化学的に架橋結合させた。簡単に言えば、多糖溶液９ｍＬを、１０ＭのＮａＯＨ１ｍＬと混合し、次いでその混合物に水１ｍＬ中ＳＴＭＰ３００ｍｇの水溶液を加えた。その溶液をすぐに６０ｍｍのペトリ皿中に注ぎ込み、次いで−８０℃で保管した。Ｌｙｏｖａｃ ｆｒｅｅｚｅ−ｄｒｙｅｒ （ＧＴ２，ＳＴＥＲＩＳ Ｒｏｔａｒｙ ｖａｎｅ ｐｕｍｐ，ＢＯＣ ＥＤＷＡＲＤＳ）内での凍結乾燥プロセス中に、凍結した混合物を架橋結合させた。水分を完全に除去できるように足場を２４時間凍結乾燥させた。凍結乾燥プロセス中に架橋結合した足場は不透明で若干もろいものであった。その足場は所望のサイズと形状に容易に切断でき、再含水させることができるものであった（図１）。
【００８２】
５０℃で化学的に架橋結合を行った後に得られた足場を凍結乾燥させることにより、対照実験を行った。しかし、これらの乾燥足場は、その全体構造が凍結乾燥プロセス後に破損したために、ほどよく再含水させることができなかった。他の実験を、プロセス中の架橋剤を除いて行った。この条件では、凍結乾燥プロトコールによって溶液のみがもたらされ、足場にならなかった。
【００８３】
＜実施例２＞
凍結乾燥条件の影響
実施例１に従って多糖足場の調製を行った。凍結乾燥ステップでは、制御漏出量によって異なる真空度を調整した（０．１ｍｂａｒ、０．７５ｍｂａｒ、３ｍｂａｒ、１．５ｍｂａｒ、および６．５ｍｂａｒ）。
【００８４】
結果生じた足場について、環境制御型走査電子顕微鏡（ＥＳＥＭ）および走査電子顕微鏡（ＳＥＭ）を用いて特性決定した。ＥＳＥＭ技法は試料の脱水を少しも必要としないので、含水した状態の足場の表面を、ＥＳＥＭ− ＦＥＧ（Ｐｈｉｌｉｐｓ ＸＬ ３０，Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ、圧力４トルにおける加速電圧１５ｋＶ）を用いて直接観察した。膨張した状態の足場のＥＳＥＭ画像は、これらの足場が多孔質であることを示している（図２）。０．１ｍｂａｒ（高真空度）で凍結乾燥させた足場の孔は、６．５ｍｂａｒ（低真空度）で調製した足場よりも直径が大きかった。真空度が低い条件については、足場の網目構造がより良好に組織化され、足場全体で相互接続した孔が均質であった。乾燥足場のＳＥＭ画像により、凍結乾燥プロセス中に架橋結合させた足場が多孔質であることが確認された（図３）。組織染色のために、足場を４％のパラホルムアルデヒド／ＰＢＳで固定し、次いでそれをＯＣＴ包埋し（Ｔｉｓｓｕｅ Ｔｅｃｋ−ＯＣＴ（ＥＭＳ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＰＡ）、液体窒素冷却イソペンタンで凍結させた。凍結試料を、クリオスタット（Ｌｅｉｃａ ＣＭ １９００）を用いて凍結切片化した（１０μｍの切片）。足場切片についてヘマトキシリン／エオジン染色を行い、足場の構造を可視化した。
【００８５】
足場の組織切片の外観は、電子顕微鏡画像（図４）と一致していた。足場内部の多孔質構造は、凍結乾燥時の真空度を変えることにより調節できた。低真空度（６．５ｍｂａｒ）で架橋結合させた足場は、ゆるんだ網目構造を示した高真空度（０．１ｍｂａｒ）で架橋結合させた足場に比べて、小さい孔を有する構造であった。
【００８６】
＜実施例３＞
膨張の割合
実施例２に従って多糖足場の調製を行った。凍結乾燥させた足場を、かみそりで切断して長方形の足場（２．５ｃｍ×２ｃｍ、厚さ３ｍｍ）を得た。足場を脱イオン水で洗浄して緩衝塩を全て除去し、次いで５０℃で３６時間、脱水した。試料の乾燥重量（乾燥Ｗ）と、脱イオン水で２４時間再含水させた後の膨張状態の重量（膨張Ｗ）を、電子てんびん（ＡＧ ２０４ Ｄｅｌｔａｒａｎｇｅ（登録商標）ｍｅｔｔｌｅｒ Ｔｏｌｅｄｏ；最大８１ｇ／２１０ｇ；ｄ＝０．１ｍｇ／１ｍｇ）を用いて測定した。計量前に、膨張した足場を柔らかい紙の上に注意深く置いて過剰な水分を除去した。それぞれの実験を３連で行った。膨張の割合を次式に従って計算した。膨張の割合＝（膨張Ｗ−乾燥Ｗ）／乾燥Ｗ）×１００。
【００８７】
多孔質足場の膨張の割合は、凍結乾燥時の真空度の上昇とともに上昇する（図５）。最も低い真空度（６．５ｍｂａｒ）で調製した足場が、膨張の割合が最も低いことがわかった。
【００８８】
＜実施例４＞
細胞浸潤
ウィスターラット由来の大腿骨骨髄間葉系幹細胞（ＭＳＣ）を実施例１の通りに調製した足場で培養した。円形の穿孔器を用いて、直径６ｍｍ、厚さ１ｍｍの円形の多孔質足場を切り出した。細胞を播種する前に、３７℃で２４時間、２４ウェルプレートの培養培地中で足場を平衡化させた。培養培地は、１０％のウシ胎児血清と１％のペニシリン／ストレプトマイシン（Ｓｉｇｍａ）を含む低グルコースＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ，Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）からなるものを使用した。細胞を足場の上部に播種した（足場あたり細胞１０６個の細胞密度）。アルコルビン酸（５０μｇ／ｍｌ）を補充した培養培地を２〜３日ごとに取り替えた。試料を培養物中で最大１週間維持した。培養培地中でインキュベートした非播種の多孔質足場を対照として用いた。動物由来およびヒト由来の一次血管平滑筋細胞および内皮細胞などの他の細胞型を用いて同様の実験を首尾よく行った。
【００８９】
−最初の付着
足場にＭＳＣを浸潤させながら、多孔質足場の表面に細胞を２時間未満付着させた。
【００９０】
−細胞追跡
播種ステップの前に蛍光染料ＰＫＨ２６（Ｓｉｇｍａ）を用い、製造者の取扱説明書に従って細胞標識することにより、細胞追跡を行った。細胞を非標識足場とＦＩＴＣ−足場の両方に播種した。次いで細胞播種した足場を４％のパラホルムアルデヒド／ＰＢＳで固定した後、共焦点顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ ＬＳＭ ５１０）で分析した。
【００９１】
ＰＫＨ２６標識したＭＳＣを、足場の孔中くまなく追跡した。１日目と７日目に、７０ミクロンと１９０ミクロンの深さでゲル内の細胞分布の代表的な画像を撮った。共焦画像のＺ軸投影により、ゲル内の細胞浸潤が確認された。１日目〜７日目に足場内の細胞密度が増加したことが認められた。
【００９２】
−細胞の生存率
生存細胞によって加水分解され、それによって強度な均一の緑色蛍光（波長４８５〜５３５ｎｍ）を生成するポリアニオン系染料である、カルセインＡＭ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ ＣＡ）を用いて、細胞の生存率をアッセイした。この染料を、１日目、５日目、および７日目に、製造者の取扱説明書に従って、多孔質の非標識足場およびＦＩＴＣ−足場に加えた。次いでこの播種された足場を４％のパラホルムアルデヒド／ＰＢＳで固定した後、共焦点顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ ＬＳＭ ５１０）で分析して、足場およびＦＩＴＣ−足場内の細胞分布を可視化した。
【００９３】
このアッセイにより、１日目と７日目に、細胞のほとんどが多孔質足場の表面および内部に生存していることが確認された。
【００９４】
＜実施例５＞
足場内へのタンパク質の組み込み
実施例１に従い、ゼラチンおよびＩ型コラーゲンなどの接着タンパク質を組み込むために以下の改変を加えて、多糖足場を調製した。ゼラチンに関しては、多糖溶液９ｍＬを１０ＭのＮａＯＨ１ｍＬと混合し、次いでその混合物にゼラチン５００μｇを含む水１ｍＬ中ＳＴＭＰ３００ｍｇの水溶液（０．１％のゼラチン溶液５００μＬ）を加えた。Ｉ型コラーゲンの組み込みに関しては、多糖溶液に０．４％のコラーゲン溶液（Ｕｐｓｔａｔｅ ＃０８１１５）５００μＬを加えた後に架橋剤（５００μＬ中３００ｍｇ）を加えた。足場の厚い切片のクーマシーブルー染色およびシリウスレッド染色により、足場内のタンパク質分布が確認された。平均タンパク質含量は、足場直径６ｍｍにつきゼラチン約１μｇ、および足場直径６ｍｍにつきコラーゲン４μｇであると見積もられた。
【００９５】
＜実施例６＞
代用血管としての管状足場
実施例１に記載の通り調製した多糖ベースの管状足場は、代用血管として使用できうる。
【００９６】
実施例１に記載の通りに調製した水溶液を、２０Ｇの針とキャップとからなる自家製の管状型に注ぎ込んだ。針（２０Ｇ×１１／２’’または０．９×４０ｍｍ）を、滑らかな管腔表面（管腔直径２ｍｍ）を作るための中心軸として用いた。多糖／ＳＴＭＰ溶液を１ｍｌのシリンジを用いて針のキャップを通して針内に注入した。結果生じた管状足場の内径と外径はどちらも、針とそのキャップのサイズによって決まる（１８Ｇまたは２１Ｇの針を用いた試料も調製した）。
【００９７】
実施例１に従って、型をすぐに−８０℃で凍結させた。次に、混合物を上記の通りに凍結乾燥させた。凍結乾燥後、足場を型から容易に取り出した。ＰＢＳで再含水させた後、管状足場を得た。平滑筋細胞または間葉幹細胞などの細胞を、再含水プロセス中に管状足場に播種でき、次いで内皮細胞または内皮前駆細胞などの他の細胞を管状足場の管腔に担持させることができる。
【００９８】
＜実施例７＞
足場内への薬物の組み込み
実施例１に従い、ノルフロキサシンなどの薬物を組み込むために以下の改変を加えて、多糖足場を調製した。ノルフロキサシンは、フルオロキノロン系カルボン酸であり、広く使用されている抗菌剤である。現在ノルフロキサシンは、主にその水溶性の低さに起因して、生体利用率が低いモデル化合物とされている。固体状態のノルフロキサシン（Ｓｉｇｍａ）（６０ｍｇ）を多糖溶液（１０ｇ）に加え、その混合物を、均一になるまで撹拌した。次いで、結果生じた混合物を１０ＭのＮａＯＨ１ｍＬと混合し、次いでその混合物に水１ｍＬ中ＳＴＭＰ３００ｍｇの水溶液を加えた。次いで、実施例１に従って架橋結合プロセスを行った。
【００９９】
ＰＢＳ中、３７℃で最大２４時間、多孔質足場をインキュベートすることにより、放出特性を得た。上清中のノルフロキサシン含量を２７４ｎｍにおける分光光度でアッセイした。図６は、多孔質足場からのノルフロキサシン放出と、孔形成剤の非存在下で調製した非多孔質足場からのノルフロキサシン放出との比較を例示している。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）ある量の少なくとも１種の多糖および１種の架橋剤を含むアルカリ性水溶液を調製するステップと、
ｂ）ステップａ）の水溶液を凍結させるステップと、
ｃ）ステップｂ）の凍結溶液を昇華させるステップと
からなるステップを含む、多孔質足場の調製方法であって、ステップａ）の溶液中で多糖の架橋結合が起こる前にステップｂ）を行うことを特徴とする方法。
【請求項２】
前記多糖が、デキストラン、寒天、アルギン酸、ヒアルロン酸、イヌリン、プルラン、ヘパリン、キトサン、およびフコイダンからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記架橋剤が、トリメタリン酸三ナトリウム（ＳＴＭＰ）、オキシ塩化リン（ＰＯＣｌ３）、エピクロロヒドリン、ホルムアルデヒド、水溶性カルボジイミド、およびグルタルアルデヒドからなる群から選択される、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記架橋剤がトリメタリン酸三ナトリウム（ＳＴＭＰ）である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
ステップａ）の水溶液を凍結乾燥する、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
ステップａ）の水溶液を、０．１ｍＢａｒ〜６．５ｍＢａｒの圧力下で凍結乾燥する、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
ステップａ）の水溶液を、ステップｂ）の前に型に注ぎ込む、請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記足場を造形する、請求項１から７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
ステップｃ）で得られた足場に再度含水させることからなるステップをさらに含む、請求項１から８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
請求項１から９のいずれか一項に記載の方法によって得られる多孔質足場。
【請求項１１】
孔のサイズが１μｍ〜５００μｍで構成されている、請求項１０に記載の多孔質足場。
【請求項１２】
多孔度が４％〜５０％で構成されている、請求項１０または１１に記載の多孔質足場。
【請求項１３】
ある量の細胞を担持していることを特徴とする、請求項１０から１２のいずれか一項に記載の多孔質足場。
【請求項１４】
細胞が、酵母細胞、哺乳動物細胞、昆虫細胞、および植物細胞からなる群から選択される、請求項１３に記載の多孔質足場。
【請求項１５】
哺乳動物細胞が、軟骨細胞；線維軟骨細胞；骨細胞；骨芽細胞；破骨細胞；筋細胞；滑膜細胞；骨髄細胞；間葉細胞；上皮細胞、肝細胞、間質細胞；幹細胞；胚性幹細胞；脂肪組織由来の前駆体細胞；末梢血前駆細胞；成体組織から単離された幹細胞；および遺伝子形質転換細胞からなる群から選択される、請求項１４に記載の多孔質足場。
【請求項１６】
組織工学、三次元細胞培養、または治療上での細胞送達のための、請求項１０から１５のいずれか一項に記載の多孔質足場。
【請求項１７】
請求項１０から１３のいずれか一項に記載の足場を用いて作製された代用血管。
【請求項１８】
請求項１０から１３のいずれか一項に記載の足場を用いて作製された、軟骨または骨のインプラント。
【請求項１９】
製品の毒性評価および／または薬理学評価のための、請求項１０から１３のいずれか一項に記載の足場の使用。
【請求項２０】
請求項１０から１３のいずれか一項に記載の足場を用いて作製された、活性薬剤の放出制御系。
【請求項１】
ａ）ある量の少なくとも１種の多糖および１種の架橋剤を含むアルカリ性水溶液を調製するステップと、
ｂ）ステップａ）の水溶液を凍結させるステップと、
ｃ）ステップｂ）の凍結溶液を昇華させるステップと
からなるステップを含む、多孔質足場の調製方法であって、ステップａ）の溶液中で多糖の架橋結合が起こる前にステップｂ）を行うことを特徴とする方法。
【請求項２】
前記多糖が、デキストラン、寒天、アルギン酸、ヒアルロン酸、イヌリン、プルラン、ヘパリン、キトサン、およびフコイダンからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記架橋剤が、トリメタリン酸三ナトリウム（ＳＴＭＰ）、オキシ塩化リン（ＰＯＣｌ３）、エピクロロヒドリン、ホルムアルデヒド、水溶性カルボジイミド、およびグルタルアルデヒドからなる群から選択される、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記架橋剤がトリメタリン酸三ナトリウム（ＳＴＭＰ）である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
ステップａ）の水溶液を凍結乾燥する、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
ステップａ）の水溶液を、０．１ｍＢａｒ〜６．５ｍＢａｒの圧力下で凍結乾燥する、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
ステップａ）の水溶液を、ステップｂ）の前に型に注ぎ込む、請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記足場を造形する、請求項１から７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
ステップｃ）で得られた足場に再度含水させることからなるステップをさらに含む、請求項１から８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
請求項１から９のいずれか一項に記載の方法によって得られる多孔質足場。
【請求項１１】
孔のサイズが１μｍ〜５００μｍで構成されている、請求項１０に記載の多孔質足場。
【請求項１２】
多孔度が４％〜５０％で構成されている、請求項１０または１１に記載の多孔質足場。
【請求項１３】
ある量の細胞を担持していることを特徴とする、請求項１０から１２のいずれか一項に記載の多孔質足場。
【請求項１４】
細胞が、酵母細胞、哺乳動物細胞、昆虫細胞、および植物細胞からなる群から選択される、請求項１３に記載の多孔質足場。
【請求項１５】
哺乳動物細胞が、軟骨細胞；線維軟骨細胞；骨細胞；骨芽細胞；破骨細胞；筋細胞；滑膜細胞；骨髄細胞；間葉細胞；上皮細胞、肝細胞、間質細胞；幹細胞；胚性幹細胞；脂肪組織由来の前駆体細胞；末梢血前駆細胞；成体組織から単離された幹細胞；および遺伝子形質転換細胞からなる群から選択される、請求項１４に記載の多孔質足場。
【請求項１６】
組織工学、三次元細胞培養、または治療上での細胞送達のための、請求項１０から１５のいずれか一項に記載の多孔質足場。
【請求項１７】
請求項１０から１３のいずれか一項に記載の足場を用いて作製された代用血管。
【請求項１８】
請求項１０から１３のいずれか一項に記載の足場を用いて作製された、軟骨または骨のインプラント。
【請求項１９】
製品の毒性評価および／または薬理学評価のための、請求項１０から１３のいずれか一項に記載の足場の使用。
【請求項２０】
請求項１０から１３のいずれか一項に記載の足場を用いて作製された、活性薬剤の放出制御系。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【公表番号】特表２０１１−５００１１９（Ｐ２０１１−５００１１９Ａ）
【公表日】平成２３年１月６日（２０１１．１．６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−５２８４２０（Ｐ２０１０−５２８４２０）
【出願日】平成２０年１０月１０日（２００８．１０．１０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００８／０６３６７２
【国際公開番号】ＷＯ２００９／０４７３４７
【国際公開日】平成２１年４月１６日（２００９．４．１６）
【出願人】（５９９１７６５０６）アンセルム（アンスチチュ ナショナル ドゥ ラ サンテ エ ドゥ ラ ルシェルシュ メディカル） (23)
【出願人】（５０６４０２３００）ユニヴェルシテ パリ セット−デニス ディデロ (4)
【氏名又は名称原語表記】ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＥ ＰＡＲＩＳ ７−ＤＥＮＩＳ ＤＩＤＥＲＯＴ
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２３年１月６日（２０１１．１．６）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年１０月１０日（２００８．１０．１０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００８／０６３６７２
【国際公開番号】ＷＯ２００９／０４７３４７
【国際公開日】平成２１年４月１６日（２００９．４．１６）
【出願人】（５９９１７６５０６）アンセルム（アンスチチュ ナショナル ドゥ ラ サンテ エ ドゥ ラ ルシェルシュ メディカル） (23)
【出願人】（５０６４０２３００）ユニヴェルシテ パリ セット−デニス ディデロ (4)
【氏名又は名称原語表記】ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＥ ＰＡＲＩＳ ７−ＤＥＮＩＳ ＤＩＤＥＲＯＴ
【Ｆターム（参考）】
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