線維素原及び線維素溶解酵素としてのクロマルハナバチ毒液由来のセリンプロテアーゼ
【課題】血栓形成の主要成分のうちの一つである線維素原及び線維素を溶解できるクロマルハナバチ毒液由来のセリンプロテアーゼと、前記マルハナバチ毒液由来のセリンプロテアーゼを含む血栓症治療用組成物を提供する。
【解決手段】クロマルハナバチ毒液由来のセリンプロテアーゼはトロンビン前駆体を活性化させ、直接的に線維素原及び線維素を溶解できることを特徴とする。
【解決手段】クロマルハナバチ毒液由来のセリンプロテアーゼはトロンビン前駆体を活性化させ、直接的に線維素原及び線維素を溶解できることを特徴とする。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はトロンビン前駆体を活性化させ、直接的に線維素原及び線維素を溶解できるクロマルハナバチ毒液由来のセリンプロテアーゼに関する。
【背景技術】
【０００２】
ハチは動物や昆虫のような侵略者または捕食者からそれらの集団を保護するために、効果的な防御手段であるハチ毒を有している。ハチ毒は様々な種類の毒液タンパク質もしくはペプチドにて構成されており、メリチン［Gauldie et al., Eur. J. Biochem., 61:369-376(1976)］、ホスホリパーゼＡ2（ＰＬＡ2）［Six & Dennis, Biochim. Biophys. Acta 1488:1-19(2000)］、アパミン［Banks et al., Nature 282:415-417(1979)］、ヒアルロニダーゼ［Kreil, Protein Sci., 4:1666-1669(1995)］、セリンプロテアーゼ［Winningham KM et al. J Allergy Clin Immunol 2004;114:928-33］などが知られている。東洋では多様なハチ毒成分を医薬分野で利用するために、ハチ毒の薬理効果に対する研究を行っている［Mirshafiey A. Neuropharmacology 2007;53:353-61］。ハチの中でも人と最も関わりのある代表的なハチは、一般的に養蜂と花粉媒介昆虫として利用されているミツバチとマルハナバチである［Velthuis HHW et al. Apidologie 2006;37:421-51］。
【０００３】
ミツバチはマルハナバチに比べて５倍以上の毒液を放出するが、マルハナバチは何度も毒液を放出でき、毒針を損失しない差異点がある［Hoffman DR et al. Ann Allergy 1984;52:276-8］。マルハナバチ毒液のセリンプロテアーゼ(Venom Serine Protease of Bombus ignites (Bi-VSP))はホスホリパーゼＡ2（ＰＬＡ2）とボンボリチンと共にマルハナバチのハチ毒の主要構成成分である［Hoffman DR et al. J Allergy Clin Immunol 2001;108:855-60］。
【０００４】
セリンプロテアーゼは多様な生物から発見され、触媒残基であるヒスチジン（Ｈｉｓ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ）、セリン（Ｓｅｒ）が保全された生化学的で構造的な毒性を有している。また、セリンプロテアーゼは多様な機能を有し、消化、免疫反応、補体活性、細胞分化、そして止血に主要な役割をする［Neurath H. et al. Science 1984;224:350-7; Krem MM. et al. Trends Biochem Sci 2002;27:67-74］。特に、ヘビ毒液のセリンプロテアーゼは主要毒成分の一つとして知られており、ヘビ毒液のセリンプロテアーゼはほ乳類内の止血、及び血栓症に関するものとして知られている［Braud S et al. Biochimie 82 (2000) 851-859; Matsui T et al. (2000) Biochim Biophys Acta 1477:146-156; Kini RM (2005) Pathophysiol Haemost Thrombo 34:200-204; Swenson S et al. (2005) Toxicon 45:1021-1039］。
【０００５】
しかし、セリンプロテアーゼの遺伝子、及び止血と血栓症のメカニズムにおける役割は未だ明らかにされていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】大韓民国特許出願第２００９−１３１３１号
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Gauldie et al., Eur. J. Biochem., 61:369-376(1976)
【非特許文献２】Six & Dennis, Biochim. Biophys. Acta 1488:1-19(2000)
【非特許文献３】Banks et al., Nature 282:415-417(1979)
【非特許文献４】Kreil, Protein Sci., 4:1666-1669(1995)
【非特許文献５】Winningham KM et al. J Allergy Clin Immunol 2004;114:928-33
【非特許文献６】Mirshafiey A. Neuropharmacology 2007;53:353-61
【非特許文献７】Velthuis HHW et al. Apidologie 2006;37:421-51
【非特許文献８】Hoffman DR et al. Ann Allergy 1984;52:276-8
【非特許文献９】Hoffman DR et al. J Allergy Clin Immunol 2001;108:855-60
【非特許文献１０】Neurath H. et al. Science 1984;224:350-7; Krem MM. et al.
【非特許文献１１】Trends Biochem Sci 2002;27:67-74
【非特許文献１２】Braud S et al. Biochimie 82 (2000) 851-859
【非特許文献１３】Je et al., Biotechnol. Lett., 23:575-582(2001)
【非特許文献１４】Choo et al., Mol. Cell. Neurisci., 38:224-235(2008)
【非特許文献１５】Speijer H et al. J Biol Chem 1986;261:13258-67
【非特許文献１６】Matsui T et al. Eur J Biochem 1998;252:569-75
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
そこで、本発明の発明者はクロマルハナバチ毒液に含まれたセリンプロテアーゼがトロンビン前駆体を活性化させ、直接的に線維素原及び線維素を溶解でき、血液凝固メカニズムに影響を及ぼすことを発見することで、本発明を完成するに至った。
【０００９】
従って、本発明の目的は、血栓形成の主要成分のうちの一つである線維素原及び線維素を溶解できる配列番号１によって表されたクロマルハナバチ毒液由来のセリンプロテアーゼを提供することにある。
【００１０】
更に、本発明の目的は、前記クロマルハナバチ毒液由来のセリンプロテアーゼを含む血栓症治療用組成物を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明はトロンビン前駆体を活性化させ、直接的に線維素原及び線維素を溶解できる配列番号１のクロマルハナバチ毒液由来のセリンプロテアーゼをその特徴とする。
【００１２】
更に、本発明は前記クロマルハナバチ毒液由来のセリンプロテアーゼを含む血栓症治療用組成物をまた別の特徴とする。
【発明の効果】
【００１３】
本発明のクロマルハナバチ毒液由来のセリンプロテアーゼはトロンビン前駆体を活性化させ、直接的に線維素原及び線維素を溶解でき、血栓症治療用の開発に寄与することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】クロマルハナバチ毒液のセリンプロテアーゼ（Ｂｉ−ＶＳＰ）のｃＤＮＡのヌクレオチド配列を表したものである。四角枠のＡＴＧは開始コドンを、下線のＴＡＡは終結コドンを表す。
【図２】クロマルハナバチ毒液のセリンプロテアーゼ（Ｂｉ−ＶＳＰ）のｃＤＮＡから演繹されたアミノ酸配列である。三角（▽）はシグナル配列であるプレペプチドとクリップ領域を含むプロペプチドを区分し、三角（▼）はクリップ領域を含むプロペプチドとセリンプロテアーゼ領域を区分する（クリップ領域は、三組のジスルフィド結合を形成する六つの完全に保存されたシステイン残基を有する）。
【図３ａ】クロマルハナバチ毒液のセリンプロテアーゼ（Ｂｉ−ＶＳＰ）のゲノムＤＮＡのヌクレオチド配列を表したものである。
【図３ｂ】クロマルハナバチ毒液のセリンプロテアーゼ（Ｂｉ−ＶＳＰ）のゲノムＤＮＡのヌクレオチド配列を表したものである。
【図４】クロマルハナバチの働き蜂の脂肪体、中腸、筋肉及び毒腺からＲＮＡを抽出してクロマルハナバチ毒液のセリンプロテアーゼ（Ｂｉ−ＶＳＰ）ｃＤＮＡをプローブにてノーザンブロット分析した結果である。
【図５】精製した組換えクロマルハナバチ毒液のセリンプロテアーゼ（Ｂｉ−ｐｒｏＶＳＰ）の電気泳動写真（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）（左）及びバキュロウィルスに感染させた昆虫の細胞から精製した組換えクロマルハナバチ毒液のセリンプロテアーゼ（Ｂｉ−ｐｒｏＶＳＰ）をＢａｌｂ／ｃハツカネズミに注射して製作された抗Ｂｉ−ｐｒｏＶＳＰ抗体を利用してウェスタンブロット分析した写真（右）である。
【図６】クロマルハナバチの働き蜂の毒腺、毒液嚢及び分泌された毒液のタンパク質の電気泳動写真（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）（左）及びウェスタンブロット分析写真（右）である。左の矢印はＢｉ−ｐｒｏＶＳＰの位置を示す。Ｂｉ−ｐｒｏＶＳＰはクロマルハナバチ毒液の非活性タンパク質分解酵素を表し、Ｂｉ−ＶＳＰは活性化されたタンパク質分解酵素を表す。
【図７】本発明のクロマルハナバチ毒液のセリンプロテアーゼ（Ｂｉ−ＶＳＰ）のタンパク質電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）及び糖タンパク質染色写真である。糖タンパク質でないダイズトリプシン阻害剤が陰性対照として、糖タンパク質である西洋ワサビペルオキシターゼが陽性対照として使用されている。
【図８】クロマルハナバチ毒液のセリンプロテアーゼ（Ｂｉ−ＶＳＰ）と既知のヘビ毒セリンプロテアーゼのアミノ酸配列を比較したものである。セリンプロテアーゼ領域に保全された三つの触媒、ヒスチジン（Ｈｉｓ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ）、セリン（Ｓｅｒ）は星印（＊）にて表した。
【図９】実施例４で説明されるように、クロマルハナバチ毒液のセリンプロテアーゼ（Ｂｉ−ＶＳＰ）とヒトのトロンビン前駆体を活性化させた後、時間の経過に従って１４％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにて分析した結果である。数字はトロンビン前駆体がＢｉ−ＶＳＰで培養された時間（分）を示す。
【図１０】実施例５で説明されるように、クロマルハナバチ毒液セリンプロテアーゼ（Ｂｉ−ＶＳＰ）でヒトの線維素原を加水分解させた後、時間の経過に従って１４％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにて分析した結果である。数字は線維素原がＢｉ−ＶＳＰで培養された時間（分）を示す。
【図１１】実施例６で説明されるように、線維素プレート上のクロマルハナバチ毒液のセリンプロテアーゼ（Ｂｉ−ＶＳＰ）の酵素活性の検出の写真である。様々な濃度のクロマルハナバチ毒液のセリンプロテアーゼ（Ｂｉ−ＶＳＰ）を線維素プレートに滴下し、様々な時間の期間で培養する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
本発明はクロマルハナバチ（Bombus ignitus）毒液に含まれており、トロンビン前駆体の活性化及び線維素及び線維素原の溶解機能を有するセリンプロテアーゼに関する。
【００１６】
クロマルハナバチ毒液中のセリンプロテアーゼの遺伝子は、本発明の発明者らにより初めて分離されたものであり、未だその特徴は具体的にされておらず、本発明の発明者らは前記セリンプロテアーゼ領域を含む毒液セリンプロテアーゼコード化酵素のヌクレオチド配列を大韓民国特許出願第２００９−１３１３１号（２００９．２．１７）に出願したところがある。
【００１７】
前記クロマルハナバチ毒液のセリンプロテアーゼ領域は配列番号１のように２４７個のアミノ酸からなる成熟（活性）タンパク質であり、既存のヘビ毒液セリンプロテアーゼ領域のアミノ酸の数やその配列自体で相当な差がある。
【００１８】
前記クロマルハナバチ毒液のセリンプロテアーゼはクロマルハナバチの毒液嚢に貯蔵されている毒液を抽出して高速タンパク質液体クロマトグラフィを使用したゲルろ過クロマトグラフィにより分離される。
【００１９】
前記クロマルハナバチ毒液のセリンプロテアーゼは血液凝固因子であるトロンビン前駆体をトロンビンに活性化でき、また、直接的に線維素原と反応して線維素原を線維素に溶解でき、漸次的に線維素を線維素溶解物に溶解できる。
【００２０】
従って、本発明のセリンプロテアーゼは深部静脈血栓症と末梢動脈疾患などの治療に使用され、血管手術後に起き得る事故や血管の中に再発生し得る血栓症を減らすことができる。
【００２１】
本発明は下記の実施例により、より具体的に理解することができる。しかし、下記の実施例は本発明を例示するためのものであり、本発明の保護範囲を制限するものではない。
【実施例１】
【００２２】
クロマルハナバチ毒液のセリンプロテアーゼ遺伝子のクローニング
農村振興庁の国立農業科学院農業生物部から分譲されたクロマルハナバチの働き蜂の毒腺からＳＶ Ｔｏｔａｌ ＲＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（プロメガ社、米）を使用してトータルＲＮＡを抽出した。抽出したトータルＲＮＡからＰｏｌｙＡＴｔｒａｃｔ ｍＲＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（プロメガ社、米）を使用してプロメガ社が提示した方法に従って抽出したｐｏｌｙ（Ａ）＋ｍＲＮＡをＵｎｉ−ＺＡＰ ＸＲベクターとＧｉｇａｐａｃｋ III Ｇｏｌｄ Ｐａｃｋａｇｉｎｇ Ｅｘｔｒａｃｔ（ストラタジーン社、米）によりｃＤＮＡライブラリーを作製し、遺伝子発現配列タグ（ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｔａｇｓ、ＥＳＴｓ）を分析した。
【００２３】
ＤＮＡ抽出にはＷｉｚａｒｄ ｍｉｎｉ−ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（プロメガ社、米）を使用した。ＤＮＡ塩基配列は自動化ＤＮＡ配列分析器（アプライドバイオシステムズ社、米）にて配列を分析した。その塩基配列はＮＣＢＩ(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST)のＢＬＡＳＴプログラムにより比較した。その結果、クロマルハナバチの毒腺ＥＳＴｓ分析により３６０個のアミノ酸をコーティングしているクロマルハナバチ毒液のセリンプロテアーゼ（Ｂｉ−ＶＳＰ）遺伝子の配列番号２の塩基配列を有するｃＤＮＡをクローニングした（図１）。クロマルハナバチ毒液のセリンプロテアーゼ（Ｂｉ−ＶＳＰ）ｃＤＮＡから演繹した配列番号３のアミノ酸配列（図２）のデータベース分析の結果、昆虫由来のＰＡＰ酵素グループであるのチョウセンクロコガネ （Ｈｏｌｏｔｒｉｃｈｉａ Ｄｉｏｍｐｈａｌｉａ ＰＰＡＦ−I）（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＢＡＡ３４６４２）、チョウセンクロコガネ（ Ｈ．Ｄｉｏｍｐｈａｌｉａ ＰＰＡＦ−III）（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＢＡＣ１５６０４）、カイコ（ Ｂｏｍｂｙｘ ｍｏｒｉ ＰＰＡＦ−３）（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＡＡＬ３１７０７）、キイロショウジョウバエ （Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ ＭＰ１）（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＮＰ_６４９５６０）、キイロショウジョウバエ （Ｄ．ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ ｅａｓｔｅｒ）（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＮＰ_５２４３６２）及びタバコスズメガ （Ｍａｎｄｕｃａ ｓｅｘｔａ ＰＡＰ−I）（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＡＡＸ１８６３６）と相同性が確認され、クリップ領域にシステイン残基が保全され、セリンプロテアーゼ領域にヒスチジン（Ｈ）、アスパラギン酸（Ｄ）、セリン（Ｓ）残基が保全されていることが確認された。前記分析を通してクロマルハナバチ毒液のセリンプロテアーゼ（Ｂｉ−ＶＳＰ）は２６のアミノ酸からなるシグナル配列であるプレペプチド領域と、クリップ領域を含む８７のアミノ酸からなるプロペプチド領域と、２４７のアミノ酸からなる成熟タンパク質であるセリンプロテアーゼ領域とから構成されていることが確認された。
【００２４】
更に、クロマルハナバチ毒液のセリンプロテアーゼ（Ｂｉ−ＶＳＰ）ｃＤＮＡの塩基配列を基に下記表１のプライマーを作製してＰＣＲの増幅によりクロマルハナバチ毒液のセリンプロテアーゼ（Ｂｉ−ＶＳＰ）遺伝子のゲノムＤＮＡを合成した。
【００２５】
【表１】
【００２６】
Ｗｉｚａｒｄ Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（プロメガ社、米）を使用してクロマルハナバチのゲノムＤＮＡを単離し、前記プライマー及びＰＣＲ ｐｒｅｍｉｘ Ｋｉｔ（バイオニア、韓国）を使用してクロマルハナバチ毒液のセリンプロテアーゼ（Ｂｉ−ＶＳＰ）遺伝子のゲノムＤＮＡを増幅させた。このとき、ＰＣＲ反応として、９５℃で５分間の変性、６０℃で１分間のアニーリング、７２℃で３分間の重合反応の一連のサイクルを３５サイクル実施した。
【００２７】
ＰＣＲ反応によって増幅させたＤＮＡを自動化ＤＮＡ配列分析器で分析した結果、クロマルハナバチ毒液のセリンプロテアーゼ（Ｂｉ−ＶＳＰ）遺伝子のゲノムＤＮＡは６個のエクソンと５個のイントロンで構成されており、開始コドンと終止コドンまでのＤＮＡの全長は４５０５塩基対であることを確認した（図３ａ、図３ｂ）。
【実施例２】
【００２８】
クロマルハナバチ毒液のセリンプロテアーゼ（Ｂｉ−ＶＳＰ）の毒腺の特異発現、切断及びＯ−糖鎖付加
クロマルハナバチの働き蜂の脂肪体、中腸、筋肉及び毒腺からＲＮＡをトータルＲＮＡＩｓｏｌａｔｉｏｎ キット（プロメガ社、米）を使用して抽出した。抽出したＲＮＡはレーン当り５μｇで１．０％ホルムアルデヒドアガロースゲルで電気泳動された後、そのゲルはナイロンブロッティングメンブレン（Schleicher & Schuell社、独）に転移され、Ｐｒｉｍｅ−Ｉｔ II Ｒａｎｄｏｍ Ｐｒｉｍｅｒ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｋｉｔ（ストラタジーン社、米）を利用して［α−32Ｐ］ｄＣＴＰ（アマシャム社、米）で標識されたクロマルハナバチ毒液のセリンプロテアーゼ（Ｂｉ−ＶＳＰ）のｃＤＮＡのプローブと４２℃でハイブリダイゼーションしてノーザンブロット分析を実施した。その結果、クロマルハナバチ毒液のセリンプロテアーゼ（Ｂｉ−ＶＳＰ）ｍＲＮＡは毒腺のパターンで検出された（図４）。
【００２９】
クロマルハナバチ毒液のセリンプロテアーゼ（Ｂｉ−ＶＳＰ）の抗体を作製するために、クロマルハナバチ毒液のセリンプロテアーゼ（Ｂｉ−ＶＳＰ）のｃＤＮＡを昆虫Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ核多角体病ウイルス転移ベクターｐＢＡＣ１（クロンテック社、米）の制限酵素ＢａｍＨI−ＸｈｏI領域間に挿入した後、１００ｎｇの転移ベクターと５００ｎｇのｂＡｃＧＯＺＡウイルスＤＮＡ［Je et al., Biotechnol. Lett., 23:575-582(2001)］と共に、リポフェクション（クロンテック社、米）を使用して昆虫細胞株Ｓｆ９（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ９）にコトランスフェクションした。５日後、得られた培養液を回収してクロマルハナバチの組換え毒セリンプロテアーゼ（Ｂｉ−ｐｒｏＶＳＰ）を発現する組換えＡｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ核多角体病ウイルスを作製した。組換えＡｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ核多角体病ウイルスはＳｆ９細胞株で増殖し、組換え毒セリンプロテアーゼ（Ｂｉ−ｐｒｏＶＳＰ）をＨｉｓＴｒａｐ ｃｏｌｕｍｎ（アマシャムバイオサイエンス社、米）を使用して分離した。分離された組換え毒セリンプロテアーゼ（Ｂｉ−ｐｒｏＶＳＰ）をＢａｌｂ／ｃハツカネズミに注射してポリクローナル抗体を作製した［Choo et al., Mol. Cell. Neurisci., 38:224-235(2008)］。分離されたクロマルハナバチ毒液のセリンプロテアーゼ（Ｂｉ−ＶＳＰ）と前記抗体を使用してウェスタンブロット分析を行った（図５）。
【００３０】
毒腺、毒液嚢、放射された毒で毒タンパク質サンプルを準備して１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで電気泳動した後、前記抗体を用いてウェスタンブロット分析を行った。その結果、毒腺では、不活性な形態のクロマルハナバチ毒液の毒セリンプロテアーゼ（Ｂｉ−ＰｒｏＶＳＰ）と活性化された形態のクロマルハナバチ毒液の毒セリンプロテアーゼ（Ｂｉ−ＶＳＰ）が存在し、毒液嚢と放射された毒には、活性化された形態のクロマルハナバチ毒液のセリンプロテアーゼ（Ｂｉ−ＶＳＰ）だけが存在した（図６）。このような結果から、クロマルハナバチ毒液のセリンプロテアーゼ（Ｂｉ−ＶＳＰ）は毒腺で発現し、活性化された形態に切断されて毒液嚢に貯蔵された後に放射されることが確認できた。
【００３１】
クロマルハナバチ毒液のセリンプロテアーゼ（Ｂｉ−ＰｒｏＶＳＰ）が活性化形態の毒セリン（Ｂｉ−ＶＳＰ）から分離される領域を調べるために、３４ｋＤａのクロマルハナバチ毒液のセリンプロテアーゼ（Ｂｉ−ＶＳＰ）をポリビニリデンジフルオライド（ＰＶＤＦ）膜（アプライドバイオシステムズ社、米）に転移させてエドマン分解法にてＮ−末端領域を分析した。このような結果、図２に表したように、クロマルハナバチ毒液のセリンプロテアーゼ（Ｂｉ−ｐｒｏＶＳＰ）は１１３番目のアミノ酸Ａｒｇと１１４番目のアミノ酸Ｖａｌとの間で切断されて、２４７個のアミノ酸からなるセリンプロテアーゼから構成された活性化形態の毒セリンプロテアーゼ（Ｂｉ−ＶＳＰ）に転換されることが分かった。
【００３２】
本発明のセリンプロテアーゼは配列番号１で示された２４７個のアミノ酸からなる活性化形態の毒セリンプロテアーゼである。
【００３３】
２４７個のアミノ酸で構成されたセリンプロテアーゼの計算による推定分子量は２７ｋＤａである。しかし、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で分子量は３４ｋＤａで表すが、これは約２０％の糖を含むためである。クロマルハナバチ毒液のセリンプロテアーゼはＮ−糖鎖付加部位が存在しないが、Ｏ−糖鎖付加部位は存在した。これを確認するために、Ｇｅｌ／Ｃｏｄｅ糖タンパク質染色キット（ピアース社、米）を用いて、活性化形態のクロマルハナバチ毒液のセリンプロテアーゼの糖タンパク質染色を行った。その結果、活性化形態のクロマルハナバチ毒液のセリンプロテアーゼはＯ−糖鎖付加された糖タンパク質であることが確認できた（図７）。
【実施例３】
【００３４】
クロマルハナバチ毒液のセリンプロテアーゼとヘビ毒液のセリンプロテアーゼのアミノ酸配列の比較
クロマルハナバチ毒液のセリンプロテアーゼとヘビ毒のセリンプロテアーゼの塩基配列をＮＣＢＩ（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST）のＢＬＡＳＴプログラムにより比較した。上記二つのセリンプロテアーゼのアミノ酸配列を比較した時、クロマルハナバチのセリンプロテアーゼ（Ｂｉ−ＶＳＰ）は血液凝固メカニズムのトロンビン前駆体活性化因子として機能するＯｓｃｕｔａｒｉｎ Ｃ（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＡＹ９４０２０４）、トロンビンと類似活性を有するバトロキソビン（Ｂａｔｒｏｘｏｂｉｎ）（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＡＡＡ４８５５３）、プラスミン前駆体をプラスミンに活性化させるＴＳＶ−ＰＡ（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．Ｑ９１５１６）、ＰＡ−ＢＪ（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．Ｐ８１８２４）、ハリステーゼ（Ｈａｌｙｓｔａｓｅ）（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．Ｐ８１１７６）及びＲＶＶ−Ｖ（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．Ｐ１８９６４）と一定部分が相同性を有し、セリンプロテアーゼ領域にヒスチジン、アスパラギン酸、セリン残基がよく保全されていた（図８）。
【実施例４】
【００３５】
クロマルハナバチ毒液のセリンプロテアーゼのトロンビン前駆体活性化因子としての役割
クロマルハナバチ毒液のセリンプロテアーゼ（Ｂｉ−ＶＳＰ）の血液凝固の重要な役割を行うトロンビン前駆体であるプロトロンビンとの活性反応を審査するために、下記の実験を実施した。
【００３６】
１００ｍＭ のＮａＣｌと５ｍＭ ＣａＣｌ2を緩衝材として含有している５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）にヒトの血液凝固因子であるトロンビン前駆体２μｇ（シグマ社）とクロマルハナバチの毒液嚢から精製した毒液のセリンプロテアーゼ２ｎｇを希釈して、３７℃で反応させて、その混合液を１４％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルに通過させて時間の経過による反応結果を確認した［Speijer H et al. J Biol Chem 1986;261:13258-67］。反応の５分後、トロンビン前駆体は活性化形態のトロンビンに変換し始め、反応の６０分後にトロンビンに完全に変換されたことを確認した（図９）。これは血液凝固メカニズムで血液凝固因子Ｘａ（Ｆａｃｔｏｒ Ｘａ）のメカニズムと類似していた。
【実施例５】
【００３７】
クロマルハナバチ毒液のセリンプロテアーゼの線維素原溶解酵素としての役割
１０μｇのヒトの線維素前駆体である線維素原（ＭＰバイオメディカル社、Ｓｏｌｏｎ、ＯＨ、米）とクロマルハナバチ毒液嚢から精製したセリンプロテアーゼ０．２５μｇを５０ｍＭの Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）緩衝剤で希釈し、３７℃で反応させて、その混合液を１４％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルに通過させて時間の経過による反応結果を確認した［Matsui T et al. Eur J Biochem 1998;252:569-75］。
【００３８】
その結果、クロマルハナバチ毒液のセリンプロテアーゼ（Ｂｉ−ＶＳＰ）は線維素の凝固現象を示さなかったが、線維素原Ａα、Ｂβ、γ鎖を加水分解した。Ａα鎖は反応から５分以内に完全に加水分解され、Ｂβ鎖とγ鎖は６０分以内に完全に加水分解された。これはクロマルハナバチ毒液のセリンプロテアーゼ（Ｂｉ−ＶＳＰ）が線維素原を加水分解するトロンビンのような酵素活性を有することを意味する。６０分後から７２０分以内に線維素原から転換された線維素が完全に線維素分解物（ＦＤＰ）に転換された。クロマルハナバチ毒液のセリンプロテアーゼ（Ｂｉ−ＶＳＰ）が線維素分解が可能なタンパク質酵素であるプラスミンのような活性を有していることが確認された（図１０）。
【実施例６】
【００３９】
クロマルハナバチ毒液のセリンプロテアーゼの線維素原溶解酵素の検証
前記実施例５に示されたように、クロマルハナバチ毒液のセリンプロテアーゼ（Ｂｉ−ＶＳＰ）に対する線維素原の反応実験を通して、クロマルハナバチ毒液のセリンプロテアーゼ（Ｂｉ−ＶＳＰ）は線維素原を線維素に明確に溶解させるだけでなく、線維素を線維素分解物に変換させるということをＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で確認した。
【００４０】
更に、クロマルハナバチ毒液のセリンプロテアーゼの線維素溶解能力に対する更に具体的で可視的な結果を導き出すために、フィブリン平板分析法を実施した。１０ｍＬ当り０．６％の線維素原をホウ酸塩緩衝剤（ｐＨ７．８）に入れ、３０℃で１時間溶解した後、１０ｍＬをプレートに移した。線維素原を線維素に転換させるために、トロンビン４０ユニットを線維素原が入った平板に入れた後、よく希釈して室温で反応させて固めた［Astrup T. et al. Arch. Biochem. Biophys.(1991). 40, 346-351］。線維素プレートに精製したクロマルハナバチ毒液のセリンプロテアーゼを濃度別（０、１、２、３、５μｇ）に処理して、３７℃で時間単位（３、５、７、９時間）で反応させて線維素に対する溶解能力を確認した結果、濃度別に溶解に対するホワイトゾーンの生成を確認した（図１１）。これを通してクロマルハナバチ毒液のセリンプロテアーゼが効果的に線維素を溶解する活性があることが確認できた。
なお、本発明は、他の形式、構造、配列、及び割合で実施可能であり、他の成分、物質、構成要素を使用可能なことは当業者には明確である。従って、開示された実施例は全ての点で実例とみなされるが、本発明を制限するものではなく、また本発明の範囲は添付の請求項に示されているが、上記記載に制限されるものではない。
【技術分野】
【０００１】
本発明はトロンビン前駆体を活性化させ、直接的に線維素原及び線維素を溶解できるクロマルハナバチ毒液由来のセリンプロテアーゼに関する。
【背景技術】
【０００２】
ハチは動物や昆虫のような侵略者または捕食者からそれらの集団を保護するために、効果的な防御手段であるハチ毒を有している。ハチ毒は様々な種類の毒液タンパク質もしくはペプチドにて構成されており、メリチン［Gauldie et al., Eur. J. Biochem., 61:369-376(1976)］、ホスホリパーゼＡ2（ＰＬＡ2）［Six & Dennis, Biochim. Biophys. Acta 1488:1-19(2000)］、アパミン［Banks et al., Nature 282:415-417(1979)］、ヒアルロニダーゼ［Kreil, Protein Sci., 4:1666-1669(1995)］、セリンプロテアーゼ［Winningham KM et al. J Allergy Clin Immunol 2004;114:928-33］などが知られている。東洋では多様なハチ毒成分を医薬分野で利用するために、ハチ毒の薬理効果に対する研究を行っている［Mirshafiey A. Neuropharmacology 2007;53:353-61］。ハチの中でも人と最も関わりのある代表的なハチは、一般的に養蜂と花粉媒介昆虫として利用されているミツバチとマルハナバチである［Velthuis HHW et al. Apidologie 2006;37:421-51］。
【０００３】
ミツバチはマルハナバチに比べて５倍以上の毒液を放出するが、マルハナバチは何度も毒液を放出でき、毒針を損失しない差異点がある［Hoffman DR et al. Ann Allergy 1984;52:276-8］。マルハナバチ毒液のセリンプロテアーゼ(Venom Serine Protease of Bombus ignites (Bi-VSP))はホスホリパーゼＡ2（ＰＬＡ2）とボンボリチンと共にマルハナバチのハチ毒の主要構成成分である［Hoffman DR et al. J Allergy Clin Immunol 2001;108:855-60］。
【０００４】
セリンプロテアーゼは多様な生物から発見され、触媒残基であるヒスチジン（Ｈｉｓ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ）、セリン（Ｓｅｒ）が保全された生化学的で構造的な毒性を有している。また、セリンプロテアーゼは多様な機能を有し、消化、免疫反応、補体活性、細胞分化、そして止血に主要な役割をする［Neurath H. et al. Science 1984;224:350-7; Krem MM. et al. Trends Biochem Sci 2002;27:67-74］。特に、ヘビ毒液のセリンプロテアーゼは主要毒成分の一つとして知られており、ヘビ毒液のセリンプロテアーゼはほ乳類内の止血、及び血栓症に関するものとして知られている［Braud S et al. Biochimie 82 (2000) 851-859; Matsui T et al. (2000) Biochim Biophys Acta 1477:146-156; Kini RM (2005) Pathophysiol Haemost Thrombo 34:200-204; Swenson S et al. (2005) Toxicon 45:1021-1039］。
【０００５】
しかし、セリンプロテアーゼの遺伝子、及び止血と血栓症のメカニズムにおける役割は未だ明らかにされていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】大韓民国特許出願第２００９−１３１３１号
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Gauldie et al., Eur. J. Biochem., 61:369-376(1976)
【非特許文献２】Six & Dennis, Biochim. Biophys. Acta 1488:1-19(2000)
【非特許文献３】Banks et al., Nature 282:415-417(1979)
【非特許文献４】Kreil, Protein Sci., 4:1666-1669(1995)
【非特許文献５】Winningham KM et al. J Allergy Clin Immunol 2004;114:928-33
【非特許文献６】Mirshafiey A. Neuropharmacology 2007;53:353-61
【非特許文献７】Velthuis HHW et al. Apidologie 2006;37:421-51
【非特許文献８】Hoffman DR et al. Ann Allergy 1984;52:276-8
【非特許文献９】Hoffman DR et al. J Allergy Clin Immunol 2001;108:855-60
【非特許文献１０】Neurath H. et al. Science 1984;224:350-7; Krem MM. et al.
【非特許文献１１】Trends Biochem Sci 2002;27:67-74
【非特許文献１２】Braud S et al. Biochimie 82 (2000) 851-859
【非特許文献１３】Je et al., Biotechnol. Lett., 23:575-582(2001)
【非特許文献１４】Choo et al., Mol. Cell. Neurisci., 38:224-235(2008)
【非特許文献１５】Speijer H et al. J Biol Chem 1986;261:13258-67
【非特許文献１６】Matsui T et al. Eur J Biochem 1998;252:569-75
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
そこで、本発明の発明者はクロマルハナバチ毒液に含まれたセリンプロテアーゼがトロンビン前駆体を活性化させ、直接的に線維素原及び線維素を溶解でき、血液凝固メカニズムに影響を及ぼすことを発見することで、本発明を完成するに至った。
【０００９】
従って、本発明の目的は、血栓形成の主要成分のうちの一つである線維素原及び線維素を溶解できる配列番号１によって表されたクロマルハナバチ毒液由来のセリンプロテアーゼを提供することにある。
【００１０】
更に、本発明の目的は、前記クロマルハナバチ毒液由来のセリンプロテアーゼを含む血栓症治療用組成物を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明はトロンビン前駆体を活性化させ、直接的に線維素原及び線維素を溶解できる配列番号１のクロマルハナバチ毒液由来のセリンプロテアーゼをその特徴とする。
【００１２】
更に、本発明は前記クロマルハナバチ毒液由来のセリンプロテアーゼを含む血栓症治療用組成物をまた別の特徴とする。
【発明の効果】
【００１３】
本発明のクロマルハナバチ毒液由来のセリンプロテアーゼはトロンビン前駆体を活性化させ、直接的に線維素原及び線維素を溶解でき、血栓症治療用の開発に寄与することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】クロマルハナバチ毒液のセリンプロテアーゼ（Ｂｉ−ＶＳＰ）のｃＤＮＡのヌクレオチド配列を表したものである。四角枠のＡＴＧは開始コドンを、下線のＴＡＡは終結コドンを表す。
【図２】クロマルハナバチ毒液のセリンプロテアーゼ（Ｂｉ−ＶＳＰ）のｃＤＮＡから演繹されたアミノ酸配列である。三角（▽）はシグナル配列であるプレペプチドとクリップ領域を含むプロペプチドを区分し、三角（▼）はクリップ領域を含むプロペプチドとセリンプロテアーゼ領域を区分する（クリップ領域は、三組のジスルフィド結合を形成する六つの完全に保存されたシステイン残基を有する）。
【図３ａ】クロマルハナバチ毒液のセリンプロテアーゼ（Ｂｉ−ＶＳＰ）のゲノムＤＮＡのヌクレオチド配列を表したものである。
【図３ｂ】クロマルハナバチ毒液のセリンプロテアーゼ（Ｂｉ−ＶＳＰ）のゲノムＤＮＡのヌクレオチド配列を表したものである。
【図４】クロマルハナバチの働き蜂の脂肪体、中腸、筋肉及び毒腺からＲＮＡを抽出してクロマルハナバチ毒液のセリンプロテアーゼ（Ｂｉ−ＶＳＰ）ｃＤＮＡをプローブにてノーザンブロット分析した結果である。
【図５】精製した組換えクロマルハナバチ毒液のセリンプロテアーゼ（Ｂｉ−ｐｒｏＶＳＰ）の電気泳動写真（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）（左）及びバキュロウィルスに感染させた昆虫の細胞から精製した組換えクロマルハナバチ毒液のセリンプロテアーゼ（Ｂｉ−ｐｒｏＶＳＰ）をＢａｌｂ／ｃハツカネズミに注射して製作された抗Ｂｉ−ｐｒｏＶＳＰ抗体を利用してウェスタンブロット分析した写真（右）である。
【図６】クロマルハナバチの働き蜂の毒腺、毒液嚢及び分泌された毒液のタンパク質の電気泳動写真（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）（左）及びウェスタンブロット分析写真（右）である。左の矢印はＢｉ−ｐｒｏＶＳＰの位置を示す。Ｂｉ−ｐｒｏＶＳＰはクロマルハナバチ毒液の非活性タンパク質分解酵素を表し、Ｂｉ−ＶＳＰは活性化されたタンパク質分解酵素を表す。
【図７】本発明のクロマルハナバチ毒液のセリンプロテアーゼ（Ｂｉ−ＶＳＰ）のタンパク質電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）及び糖タンパク質染色写真である。糖タンパク質でないダイズトリプシン阻害剤が陰性対照として、糖タンパク質である西洋ワサビペルオキシターゼが陽性対照として使用されている。
【図８】クロマルハナバチ毒液のセリンプロテアーゼ（Ｂｉ−ＶＳＰ）と既知のヘビ毒セリンプロテアーゼのアミノ酸配列を比較したものである。セリンプロテアーゼ領域に保全された三つの触媒、ヒスチジン（Ｈｉｓ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ）、セリン（Ｓｅｒ）は星印（＊）にて表した。
【図９】実施例４で説明されるように、クロマルハナバチ毒液のセリンプロテアーゼ（Ｂｉ−ＶＳＰ）とヒトのトロンビン前駆体を活性化させた後、時間の経過に従って１４％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにて分析した結果である。数字はトロンビン前駆体がＢｉ−ＶＳＰで培養された時間（分）を示す。
【図１０】実施例５で説明されるように、クロマルハナバチ毒液セリンプロテアーゼ（Ｂｉ−ＶＳＰ）でヒトの線維素原を加水分解させた後、時間の経過に従って１４％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにて分析した結果である。数字は線維素原がＢｉ−ＶＳＰで培養された時間（分）を示す。
【図１１】実施例６で説明されるように、線維素プレート上のクロマルハナバチ毒液のセリンプロテアーゼ（Ｂｉ−ＶＳＰ）の酵素活性の検出の写真である。様々な濃度のクロマルハナバチ毒液のセリンプロテアーゼ（Ｂｉ−ＶＳＰ）を線維素プレートに滴下し、様々な時間の期間で培養する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
本発明はクロマルハナバチ（Bombus ignitus）毒液に含まれており、トロンビン前駆体の活性化及び線維素及び線維素原の溶解機能を有するセリンプロテアーゼに関する。
【００１６】
クロマルハナバチ毒液中のセリンプロテアーゼの遺伝子は、本発明の発明者らにより初めて分離されたものであり、未だその特徴は具体的にされておらず、本発明の発明者らは前記セリンプロテアーゼ領域を含む毒液セリンプロテアーゼコード化酵素のヌクレオチド配列を大韓民国特許出願第２００９−１３１３１号（２００９．２．１７）に出願したところがある。
【００１７】
前記クロマルハナバチ毒液のセリンプロテアーゼ領域は配列番号１のように２４７個のアミノ酸からなる成熟（活性）タンパク質であり、既存のヘビ毒液セリンプロテアーゼ領域のアミノ酸の数やその配列自体で相当な差がある。
【００１８】
前記クロマルハナバチ毒液のセリンプロテアーゼはクロマルハナバチの毒液嚢に貯蔵されている毒液を抽出して高速タンパク質液体クロマトグラフィを使用したゲルろ過クロマトグラフィにより分離される。
【００１９】
前記クロマルハナバチ毒液のセリンプロテアーゼは血液凝固因子であるトロンビン前駆体をトロンビンに活性化でき、また、直接的に線維素原と反応して線維素原を線維素に溶解でき、漸次的に線維素を線維素溶解物に溶解できる。
【００２０】
従って、本発明のセリンプロテアーゼは深部静脈血栓症と末梢動脈疾患などの治療に使用され、血管手術後に起き得る事故や血管の中に再発生し得る血栓症を減らすことができる。
【００２１】
本発明は下記の実施例により、より具体的に理解することができる。しかし、下記の実施例は本発明を例示するためのものであり、本発明の保護範囲を制限するものではない。
【実施例１】
【００２２】
クロマルハナバチ毒液のセリンプロテアーゼ遺伝子のクローニング
農村振興庁の国立農業科学院農業生物部から分譲されたクロマルハナバチの働き蜂の毒腺からＳＶ Ｔｏｔａｌ ＲＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（プロメガ社、米）を使用してトータルＲＮＡを抽出した。抽出したトータルＲＮＡからＰｏｌｙＡＴｔｒａｃｔ ｍＲＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（プロメガ社、米）を使用してプロメガ社が提示した方法に従って抽出したｐｏｌｙ（Ａ）＋ｍＲＮＡをＵｎｉ−ＺＡＰ ＸＲベクターとＧｉｇａｐａｃｋ III Ｇｏｌｄ Ｐａｃｋａｇｉｎｇ Ｅｘｔｒａｃｔ（ストラタジーン社、米）によりｃＤＮＡライブラリーを作製し、遺伝子発現配列タグ（ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｔａｇｓ、ＥＳＴｓ）を分析した。
【００２３】
ＤＮＡ抽出にはＷｉｚａｒｄ ｍｉｎｉ−ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（プロメガ社、米）を使用した。ＤＮＡ塩基配列は自動化ＤＮＡ配列分析器（アプライドバイオシステムズ社、米）にて配列を分析した。その塩基配列はＮＣＢＩ(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST)のＢＬＡＳＴプログラムにより比較した。その結果、クロマルハナバチの毒腺ＥＳＴｓ分析により３６０個のアミノ酸をコーティングしているクロマルハナバチ毒液のセリンプロテアーゼ（Ｂｉ−ＶＳＰ）遺伝子の配列番号２の塩基配列を有するｃＤＮＡをクローニングした（図１）。クロマルハナバチ毒液のセリンプロテアーゼ（Ｂｉ−ＶＳＰ）ｃＤＮＡから演繹した配列番号３のアミノ酸配列（図２）のデータベース分析の結果、昆虫由来のＰＡＰ酵素グループであるのチョウセンクロコガネ （Ｈｏｌｏｔｒｉｃｈｉａ Ｄｉｏｍｐｈａｌｉａ ＰＰＡＦ−I）（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＢＡＡ３４６４２）、チョウセンクロコガネ（ Ｈ．Ｄｉｏｍｐｈａｌｉａ ＰＰＡＦ−III）（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＢＡＣ１５６０４）、カイコ（ Ｂｏｍｂｙｘ ｍｏｒｉ ＰＰＡＦ−３）（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＡＡＬ３１７０７）、キイロショウジョウバエ （Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ ＭＰ１）（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＮＰ_６４９５６０）、キイロショウジョウバエ （Ｄ．ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ ｅａｓｔｅｒ）（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＮＰ_５２４３６２）及びタバコスズメガ （Ｍａｎｄｕｃａ ｓｅｘｔａ ＰＡＰ−I）（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＡＡＸ１８６３６）と相同性が確認され、クリップ領域にシステイン残基が保全され、セリンプロテアーゼ領域にヒスチジン（Ｈ）、アスパラギン酸（Ｄ）、セリン（Ｓ）残基が保全されていることが確認された。前記分析を通してクロマルハナバチ毒液のセリンプロテアーゼ（Ｂｉ−ＶＳＰ）は２６のアミノ酸からなるシグナル配列であるプレペプチド領域と、クリップ領域を含む８７のアミノ酸からなるプロペプチド領域と、２４７のアミノ酸からなる成熟タンパク質であるセリンプロテアーゼ領域とから構成されていることが確認された。
【００２４】
更に、クロマルハナバチ毒液のセリンプロテアーゼ（Ｂｉ−ＶＳＰ）ｃＤＮＡの塩基配列を基に下記表１のプライマーを作製してＰＣＲの増幅によりクロマルハナバチ毒液のセリンプロテアーゼ（Ｂｉ−ＶＳＰ）遺伝子のゲノムＤＮＡを合成した。
【００２５】
【表１】
【００２６】
Ｗｉｚａｒｄ Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（プロメガ社、米）を使用してクロマルハナバチのゲノムＤＮＡを単離し、前記プライマー及びＰＣＲ ｐｒｅｍｉｘ Ｋｉｔ（バイオニア、韓国）を使用してクロマルハナバチ毒液のセリンプロテアーゼ（Ｂｉ−ＶＳＰ）遺伝子のゲノムＤＮＡを増幅させた。このとき、ＰＣＲ反応として、９５℃で５分間の変性、６０℃で１分間のアニーリング、７２℃で３分間の重合反応の一連のサイクルを３５サイクル実施した。
【００２７】
ＰＣＲ反応によって増幅させたＤＮＡを自動化ＤＮＡ配列分析器で分析した結果、クロマルハナバチ毒液のセリンプロテアーゼ（Ｂｉ−ＶＳＰ）遺伝子のゲノムＤＮＡは６個のエクソンと５個のイントロンで構成されており、開始コドンと終止コドンまでのＤＮＡの全長は４５０５塩基対であることを確認した（図３ａ、図３ｂ）。
【実施例２】
【００２８】
クロマルハナバチ毒液のセリンプロテアーゼ（Ｂｉ−ＶＳＰ）の毒腺の特異発現、切断及びＯ−糖鎖付加
クロマルハナバチの働き蜂の脂肪体、中腸、筋肉及び毒腺からＲＮＡをトータルＲＮＡＩｓｏｌａｔｉｏｎ キット（プロメガ社、米）を使用して抽出した。抽出したＲＮＡはレーン当り５μｇで１．０％ホルムアルデヒドアガロースゲルで電気泳動された後、そのゲルはナイロンブロッティングメンブレン（Schleicher & Schuell社、独）に転移され、Ｐｒｉｍｅ−Ｉｔ II Ｒａｎｄｏｍ Ｐｒｉｍｅｒ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｋｉｔ（ストラタジーン社、米）を利用して［α−32Ｐ］ｄＣＴＰ（アマシャム社、米）で標識されたクロマルハナバチ毒液のセリンプロテアーゼ（Ｂｉ−ＶＳＰ）のｃＤＮＡのプローブと４２℃でハイブリダイゼーションしてノーザンブロット分析を実施した。その結果、クロマルハナバチ毒液のセリンプロテアーゼ（Ｂｉ−ＶＳＰ）ｍＲＮＡは毒腺のパターンで検出された（図４）。
【００２９】
クロマルハナバチ毒液のセリンプロテアーゼ（Ｂｉ−ＶＳＰ）の抗体を作製するために、クロマルハナバチ毒液のセリンプロテアーゼ（Ｂｉ−ＶＳＰ）のｃＤＮＡを昆虫Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ核多角体病ウイルス転移ベクターｐＢＡＣ１（クロンテック社、米）の制限酵素ＢａｍＨI−ＸｈｏI領域間に挿入した後、１００ｎｇの転移ベクターと５００ｎｇのｂＡｃＧＯＺＡウイルスＤＮＡ［Je et al., Biotechnol. Lett., 23:575-582(2001)］と共に、リポフェクション（クロンテック社、米）を使用して昆虫細胞株Ｓｆ９（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ９）にコトランスフェクションした。５日後、得られた培養液を回収してクロマルハナバチの組換え毒セリンプロテアーゼ（Ｂｉ−ｐｒｏＶＳＰ）を発現する組換えＡｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ核多角体病ウイルスを作製した。組換えＡｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ核多角体病ウイルスはＳｆ９細胞株で増殖し、組換え毒セリンプロテアーゼ（Ｂｉ−ｐｒｏＶＳＰ）をＨｉｓＴｒａｐ ｃｏｌｕｍｎ（アマシャムバイオサイエンス社、米）を使用して分離した。分離された組換え毒セリンプロテアーゼ（Ｂｉ−ｐｒｏＶＳＰ）をＢａｌｂ／ｃハツカネズミに注射してポリクローナル抗体を作製した［Choo et al., Mol. Cell. Neurisci., 38:224-235(2008)］。分離されたクロマルハナバチ毒液のセリンプロテアーゼ（Ｂｉ−ＶＳＰ）と前記抗体を使用してウェスタンブロット分析を行った（図５）。
【００３０】
毒腺、毒液嚢、放射された毒で毒タンパク質サンプルを準備して１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで電気泳動した後、前記抗体を用いてウェスタンブロット分析を行った。その結果、毒腺では、不活性な形態のクロマルハナバチ毒液の毒セリンプロテアーゼ（Ｂｉ−ＰｒｏＶＳＰ）と活性化された形態のクロマルハナバチ毒液の毒セリンプロテアーゼ（Ｂｉ−ＶＳＰ）が存在し、毒液嚢と放射された毒には、活性化された形態のクロマルハナバチ毒液のセリンプロテアーゼ（Ｂｉ−ＶＳＰ）だけが存在した（図６）。このような結果から、クロマルハナバチ毒液のセリンプロテアーゼ（Ｂｉ−ＶＳＰ）は毒腺で発現し、活性化された形態に切断されて毒液嚢に貯蔵された後に放射されることが確認できた。
【００３１】
クロマルハナバチ毒液のセリンプロテアーゼ（Ｂｉ−ＰｒｏＶＳＰ）が活性化形態の毒セリン（Ｂｉ−ＶＳＰ）から分離される領域を調べるために、３４ｋＤａのクロマルハナバチ毒液のセリンプロテアーゼ（Ｂｉ−ＶＳＰ）をポリビニリデンジフルオライド（ＰＶＤＦ）膜（アプライドバイオシステムズ社、米）に転移させてエドマン分解法にてＮ−末端領域を分析した。このような結果、図２に表したように、クロマルハナバチ毒液のセリンプロテアーゼ（Ｂｉ−ｐｒｏＶＳＰ）は１１３番目のアミノ酸Ａｒｇと１１４番目のアミノ酸Ｖａｌとの間で切断されて、２４７個のアミノ酸からなるセリンプロテアーゼから構成された活性化形態の毒セリンプロテアーゼ（Ｂｉ−ＶＳＰ）に転換されることが分かった。
【００３２】
本発明のセリンプロテアーゼは配列番号１で示された２４７個のアミノ酸からなる活性化形態の毒セリンプロテアーゼである。
【００３３】
２４７個のアミノ酸で構成されたセリンプロテアーゼの計算による推定分子量は２７ｋＤａである。しかし、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で分子量は３４ｋＤａで表すが、これは約２０％の糖を含むためである。クロマルハナバチ毒液のセリンプロテアーゼはＮ−糖鎖付加部位が存在しないが、Ｏ−糖鎖付加部位は存在した。これを確認するために、Ｇｅｌ／Ｃｏｄｅ糖タンパク質染色キット（ピアース社、米）を用いて、活性化形態のクロマルハナバチ毒液のセリンプロテアーゼの糖タンパク質染色を行った。その結果、活性化形態のクロマルハナバチ毒液のセリンプロテアーゼはＯ−糖鎖付加された糖タンパク質であることが確認できた（図７）。
【実施例３】
【００３４】
クロマルハナバチ毒液のセリンプロテアーゼとヘビ毒液のセリンプロテアーゼのアミノ酸配列の比較
クロマルハナバチ毒液のセリンプロテアーゼとヘビ毒のセリンプロテアーゼの塩基配列をＮＣＢＩ（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST）のＢＬＡＳＴプログラムにより比較した。上記二つのセリンプロテアーゼのアミノ酸配列を比較した時、クロマルハナバチのセリンプロテアーゼ（Ｂｉ−ＶＳＰ）は血液凝固メカニズムのトロンビン前駆体活性化因子として機能するＯｓｃｕｔａｒｉｎ Ｃ（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＡＹ９４０２０４）、トロンビンと類似活性を有するバトロキソビン（Ｂａｔｒｏｘｏｂｉｎ）（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＡＡＡ４８５５３）、プラスミン前駆体をプラスミンに活性化させるＴＳＶ−ＰＡ（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．Ｑ９１５１６）、ＰＡ−ＢＪ（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．Ｐ８１８２４）、ハリステーゼ（Ｈａｌｙｓｔａｓｅ）（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．Ｐ８１１７６）及びＲＶＶ−Ｖ（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．Ｐ１８９６４）と一定部分が相同性を有し、セリンプロテアーゼ領域にヒスチジン、アスパラギン酸、セリン残基がよく保全されていた（図８）。
【実施例４】
【００３５】
クロマルハナバチ毒液のセリンプロテアーゼのトロンビン前駆体活性化因子としての役割
クロマルハナバチ毒液のセリンプロテアーゼ（Ｂｉ−ＶＳＰ）の血液凝固の重要な役割を行うトロンビン前駆体であるプロトロンビンとの活性反応を審査するために、下記の実験を実施した。
【００３６】
１００ｍＭ のＮａＣｌと５ｍＭ ＣａＣｌ2を緩衝材として含有している５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）にヒトの血液凝固因子であるトロンビン前駆体２μｇ（シグマ社）とクロマルハナバチの毒液嚢から精製した毒液のセリンプロテアーゼ２ｎｇを希釈して、３７℃で反応させて、その混合液を１４％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルに通過させて時間の経過による反応結果を確認した［Speijer H et al. J Biol Chem 1986;261:13258-67］。反応の５分後、トロンビン前駆体は活性化形態のトロンビンに変換し始め、反応の６０分後にトロンビンに完全に変換されたことを確認した（図９）。これは血液凝固メカニズムで血液凝固因子Ｘａ（Ｆａｃｔｏｒ Ｘａ）のメカニズムと類似していた。
【実施例５】
【００３７】
クロマルハナバチ毒液のセリンプロテアーゼの線維素原溶解酵素としての役割
１０μｇのヒトの線維素前駆体である線維素原（ＭＰバイオメディカル社、Ｓｏｌｏｎ、ＯＨ、米）とクロマルハナバチ毒液嚢から精製したセリンプロテアーゼ０．２５μｇを５０ｍＭの Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）緩衝剤で希釈し、３７℃で反応させて、その混合液を１４％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルに通過させて時間の経過による反応結果を確認した［Matsui T et al. Eur J Biochem 1998;252:569-75］。
【００３８】
その結果、クロマルハナバチ毒液のセリンプロテアーゼ（Ｂｉ−ＶＳＰ）は線維素の凝固現象を示さなかったが、線維素原Ａα、Ｂβ、γ鎖を加水分解した。Ａα鎖は反応から５分以内に完全に加水分解され、Ｂβ鎖とγ鎖は６０分以内に完全に加水分解された。これはクロマルハナバチ毒液のセリンプロテアーゼ（Ｂｉ−ＶＳＰ）が線維素原を加水分解するトロンビンのような酵素活性を有することを意味する。６０分後から７２０分以内に線維素原から転換された線維素が完全に線維素分解物（ＦＤＰ）に転換された。クロマルハナバチ毒液のセリンプロテアーゼ（Ｂｉ−ＶＳＰ）が線維素分解が可能なタンパク質酵素であるプラスミンのような活性を有していることが確認された（図１０）。
【実施例６】
【００３９】
クロマルハナバチ毒液のセリンプロテアーゼの線維素原溶解酵素の検証
前記実施例５に示されたように、クロマルハナバチ毒液のセリンプロテアーゼ（Ｂｉ−ＶＳＰ）に対する線維素原の反応実験を通して、クロマルハナバチ毒液のセリンプロテアーゼ（Ｂｉ−ＶＳＰ）は線維素原を線維素に明確に溶解させるだけでなく、線維素を線維素分解物に変換させるということをＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で確認した。
【００４０】
更に、クロマルハナバチ毒液のセリンプロテアーゼの線維素溶解能力に対する更に具体的で可視的な結果を導き出すために、フィブリン平板分析法を実施した。１０ｍＬ当り０．６％の線維素原をホウ酸塩緩衝剤（ｐＨ７．８）に入れ、３０℃で１時間溶解した後、１０ｍＬをプレートに移した。線維素原を線維素に転換させるために、トロンビン４０ユニットを線維素原が入った平板に入れた後、よく希釈して室温で反応させて固めた［Astrup T. et al. Arch. Biochem. Biophys.(1991). 40, 346-351］。線維素プレートに精製したクロマルハナバチ毒液のセリンプロテアーゼを濃度別（０、１、２、３、５μｇ）に処理して、３７℃で時間単位（３、５、７、９時間）で反応させて線維素に対する溶解能力を確認した結果、濃度別に溶解に対するホワイトゾーンの生成を確認した（図１１）。これを通してクロマルハナバチ毒液のセリンプロテアーゼが効果的に線維素を溶解する活性があることが確認できた。
なお、本発明は、他の形式、構造、配列、及び割合で実施可能であり、他の成分、物質、構成要素を使用可能なことは当業者には明確である。従って、開示された実施例は全ての点で実例とみなされるが、本発明を制限するものではなく、また本発明の範囲は添付の請求項に示されているが、上記記載に制限されるものではない。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
トロンビン前駆体を活性化させることを特徴とする配列番号１のクロマルハナバチ毒液から単離したセリンプロテアーゼ。
【請求項２】
線維素原を線維素に溶解させることを特徴とする配列番号１のクロマルハナバチ毒液から単離したセリンプロテアーゼ。
【請求項３】
線維素溶解活性を有することを特徴とする配列番号１のクロマルハナバチ毒液から単離したセリンプロテアーゼ。
【請求項４】
請求項１乃至３から選択されたいずれか１項のクロマルハナバチ毒液から単離したセリンプロテアーゼを含むことを特徴とする血栓症治療用組成物。
【請求項１】
トロンビン前駆体を活性化させることを特徴とする配列番号１のクロマルハナバチ毒液から単離したセリンプロテアーゼ。
【請求項２】
線維素原を線維素に溶解させることを特徴とする配列番号１のクロマルハナバチ毒液から単離したセリンプロテアーゼ。
【請求項３】
線維素溶解活性を有することを特徴とする配列番号１のクロマルハナバチ毒液から単離したセリンプロテアーゼ。
【請求項４】
請求項１乃至３から選択されたいずれか１項のクロマルハナバチ毒液から単離したセリンプロテアーゼを含むことを特徴とする血栓症治療用組成物。
【図１】
【図２】
【図３ａ】
【図３ｂ】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図２】
【図３ａ】
【図３ｂ】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【公開番号】特開２０１１−１６０７９３（Ｐ２０１１−１６０７９３Ａ）
【公開日】平成２３年８月２５日（２０１１．８．２５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−１２３２６２（Ｐ２０１０−１２３２６２）
【出願日】平成２２年５月２８日（２０１０．５．２８）
【出願人】（５１０１５０３８５）ドン ア ユニバーシティー リサーチ ファンデーション フォー インダストリ アカデミー コーポレーション (1)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２３年８月２５日（２０１１．８．２５）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年５月２８日（２０１０．５．２８）
【出願人】（５１０１５０３８５）ドン ア ユニバーシティー リサーチ ファンデーション フォー インダストリ アカデミー コーポレーション (1)
【Ｆターム（参考）】
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