肝疾患の診断のための及び該疾患の治療用の分子のスクリーニングのための方法
本発明は、肝細胞もしくは組織における又は循環（血液、血漿、血清）中のアポリポタンパク質Ａ４の発現を測定することよりなる肝疾患の診断方法に関する。化合物を哺乳動物と接触させることによる、該疾患を治療するための分子のスクリーニング方法、および哺乳動物の肝由来細胞における又は循環中のアポリポタンパク質Ａ４の発現の測定方法も開示する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は肝疾患の診断方法に関する。本発明はまた、該疾患の治療用の分子のスクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
アポリポタンパク質Ａ４（アポＡ４）は豊富な循環アポリポタンパク質である。このタンパク質の発現は、げっ歯類の視床下部、小腸および肝臓において実証されている。マウスの血漿中に見出されるアポＡ４のほとんどは小腸由来であると考えられている（Ｗｕら，ＪＢＣ ２５４，７３１６−７３２２ １９７９）。ヒトにおけるアポＡ４の合成は小腸に限定されることがＥｌｓｈｏｕｒｂａｇｙ（ＪＢＣ ２６２ １９８７）により記載されている。アポＡ４は多数の機能を有する。それは、肝組織からのコレステロールの流れの活性化およびリポタンパク質リパーゼ活性の刺激のような種々のメカニズムにより脂質の輸送および代謝を調節する（Ｓｔａｎら，Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ ａｃｔａ，１６３１ ２００３，１７７−１８７）。アポＡ４は満腹因子であることも公知である。
【０００３】
肝疾患は重大な公衆衛生問題の１つである。したがって、特異的かつ高感度なアッセイ方法を用いて、すべての肝疾患を可能な限り早期に診断することが不可欠である。
【発明の開示】
【０００４】
驚くべきことに、本出願人は、アポＡ４がヒトにおいて肝臓内で発現されること、およびアポＡ４をコードする遺伝子の肝発現のレベルが肝疾患において有意に上昇することを実証した。
【０００５】
本発明の主題は、肝細胞もしくは組織またはこれらの細胞および組織の抽出物における或いは血液およびその誘導体におけるアポＡ４の発現の測定を含む、肝疾患の検出、診断またはその予後の提供方法である。
【０００６】
したがって、本発明の主題は、肝細胞または組織においてだけでなく、肝臓由来のアポＡ４が存在する血液においても、アポＡ４の発現を測定することである。そのような方法は、
・肝細胞もしくは組織またはこれらの細胞および組織の抽出物あるいは血液またはその誘導体を単離し、
・アポＡ４の発現を測定する工程を含みうる。
【０００７】
そのような抽出物は肝細胞および組織の溶解（ｌｙｓｉｓ）により得られうる。「肝疾患」なる語は、慢性であるか病因性であるかにかかわらず肝組織および細胞に影響を及ぼす任意の疾患（アルコール性、ウイルス性、毒性、食物関連、環境性など）を意味すると意図される。
より詳しくは、本発明の主題は、脂肪肝炎、肝臓発癌、肝硬変、ウイルス性肝炎、肝細胞不全、胆汁うっ滞、門脈高血圧、脂肪症および脂肪肝炎、肝静脈および動脈疾患、線維症、肥満ならびにメタボリックシンドロームの検出、診断またはその予後の提供方法である。
「血液誘導体」なる語は、物理的処理（例えば、遠心分離）、生物学的処理（例えば、凝血）もしくは化学的処理またはそのような誘導体を得るための任意の他の処理により血液から誘導される任意の細胞性または無細胞性画分を意味すると意図される。
そのような誘導体は、好ましくは、血漿および血清である。
本発明の好ましい実施形態においては、該方法は、肝疾患を診断し又はその予後を提供することが望まれる個体の肝細胞または組織におけるアポＡ４をコードする遺伝子から転写されたメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の量の測定を含む。
該哺乳動物の肝細胞もしくは組織または血液中およびその誘導体中の細胞を取り出し、特にメッセンジャーＲＮＡおよびタンパク質の分解を防ぐために当業者に公知の方法により処理し、ついで、アポＡ４をコードする遺伝子により転写されたメッセンジャーＲＮＡの量を測定する。
特に有利には、転写されたメッセンジャーＲＮＡの量を、定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）またはＱＰＣＲとして公知の方法に従う増幅により測定する。
この技術により、全ＲＮＡを抽出し、精製し、該抽出物中に含有されるメッセンジャーＲＮＡをまず、逆転写酵素を使用して相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）に変換する。
本発明において好ましく使用されるポリメラーゼはＴａｑポリメラーゼであるが、それは、ポリメラーゼ活性を有しＰＣＲの実施のための条件下で使用されうる任意の他の酵素でありうる。この酵素は、その特性により、各合成サイクルにおいて初期ＤＮＡの量を倍加することを可能にする。
生物学的サンプル中に含有されるｍＲＮＡから誘導されたｃＤＮＡの分析は、リアルタイム定量的ＰＣＲにより行う。アポＡ４配列に特異的なプライマーおよびプローブを使用して、以下の工程：
・該サンプルから調製されたｃＤＮＡを加熱することによる、増幅すべき鎖の分離、
・該プローブの、およびセンスおよびアンチセンスプライマーのペアのハイブリダイゼーション、ならびに
・ポリメラーゼでの伸長によるＤＮＡ鎖のデノボ（ｄｅ ｎｏｖｏ）合成
を含むサイクルの反復を実質的に含む方法により、該ｃＤＮＡを分析する。
【０００８】
有利には、センスおよびアンチセンスプライマーは少なくとも１５個のヌクレオチドを含み、配列番号１３（Ｇｅｎｅｂａｎｋ番号ＮＭ ０００４８２）の配列に対応するヒトアポＡ４配列またはそれに相補的な配列に対して少なくとも８０％、好ましくは９０％、より好ましくは９５％の同一性を示す。該増幅反応の経過中、配列番号１３（Ｇｅｎｅｂａｎｋ番号ＮＭ ０００４８２）の配列に対応するヒトアポＡ４配列またはそれに相補的な配列に対して少なくとも８０％、好ましくは９０％、より好ましくは９５％の同一性を示し少なくとも１５ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドよりなるプローブを使用して、反応産物または増幅産物を検出する。
【０００９】
２つのプライマーはそれぞれ、ＤＮＡ断片の増幅を可能にするよう、センスおよびアンチセンス鎖上で選択される。プローブのほうは、それらの２つのプライマーの位置により範囲が定められた増幅から生じたＤＮＡ断片にハイブリダイズするよう標的化される。有利には、該プローブは、該プライマーの理論Ｔｍ値より約１０℃±０．５℃高い理論融点Ｔｍを有する。該オリゴヌクレオチド（プライマーおよびプローブ）は、好ましくは、１５〜２５ヌクレオチドを含む。該方法は、測定可能な量の増幅産物（ｎ＝４０）が得られるのを可能にするのに十分なサイクル数にわたって行われる。ヒトアポＡ４をコードする遺伝子を増幅するのに使用するプライマーは、好ましくは、配列：
配列番号１：ｇｃａｇｃｔｇｇｃｔｃｃｃｔａｔｇｃｔ、
および
配列番号２：ｇｇａａｇｇｔｃａｇｇｃｃｃｔｃａａｇ
を有する。該プローブは、好ましくは、配列番号３：ｃａｃｇｃａｇｇａｇａａｇｃｔｃａａｃｃａｃｃａの配列を有する。
【００１０】
本発明の好ましい実施形態においては、該プローブは可視化分子または分子系を含有する。該可視化系は、好ましくは、該プローブの５’末端および３’末端にそれぞれ結合しているレポーター着色剤および蛍光消光着色剤よりなる。有利な実施形態においては、該可視化系は、該プローブの５’位および３’位にそれぞれ結合している６−カルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ）および６−カルボキシテトラメチルローダミン（ＴＡＭＲＡ）により代表される「レポーター／消光剤」ペアよりなる。本発明において該ＰＣＲを行うためには、ＰＣＲ技術の一般的総説ならびに試薬およびサーモサイクルの製造業者および流通業者からの説明、特に、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（１９９９）により公開されている「Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ ｏｆ ＤＮＡ／ＲＮＡ Ｕｓｉｎｇ Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ ＰＣＲ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ」なる題名の使用説明書、およびＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ （Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ １９８９）が参照されうる。
【００１１】
ＱＰＣＲによる検出方法の利点の１つは、ＰＣＲサイクル中に得られた蛍光を読み取ることによりＰＣＲ産物の分析がＰＣＲサイクルの終了時に直接行われることである。したがって、後続の分析で汚染される危険性を伴う該ＰＣＲ産物の取り扱いの必要がない。
【００１２】
また、該反応の開始時に使用される標的の数の定量は非常に信頼しうるものであり再現性有るものである。ＰＣＲ産物は該ＰＣＲサイクル中に蛍光プローブにより検出される。後者は、ＰＣＲ産物を検出するために必要であり、該検出は、指数的ＰＣＲ段階の真ん中の時点で生じ、最終時点で生じるのではない。したがって、この検出原理は、より高感度であり、より特異的である。
【００１３】
ＱＰＣＲのもう１つの利点は、「ホットスタート（ｈｏｔ ｓｔａｒｔ）」原理により非特異的増幅が回避されることであり、該リアルタイムＰＣＲは、最初の変性時に活性化される熱安定ＤＮＡポリメラーゼの存在下で行われる。
【００１４】
本発明のもう１つの実施形態においては、本発明の方法は、肝細胞もしくは組織において又は血液およびその誘導体において発現されたアポＡ４タンパク質またはタンパク質断片の量の測定を含む。
【００１５】
特に有利には、アポＡ４タンパク質またはタンパク質断片の量は、このタンパク質に特異的な少なくとも１つの抗体を使用して測定される。
これらの抗体は、精製ヒトアポＡ４タンパク質または約２０アミノ酸のアポＡ４のペプチド配列エマルションを、場合によってはアジュバント、例えばフロイントアジュバントの存在下、動物（例えば、げっ歯類）に注射することよりなる方法により得られうる。該注射を繰返し、抗血清を集める。
肝アポＡ４を定量することが望まれる個体の肝細胞もしくは組織において又は血液およびその誘導体において発現されたアポＡ４とこれらの抗体との結合の測定は任意の適当な手段により行われうる。好ましくは、それはＥＬＩＳＡ（酵素結合イムノソルベントアッセイの略）技術により、より一層好ましくは、「サンドイッチ」法により行われうる。「サンドイッチ」法は２つの抗体を使用するものであり、第１の捕捉抗体はマイクロプレートのような固相に結合しており、第２の検出抗体は、該タンパク質を定量することを可能にする。この技術においては、該検出抗体はペルオキシダーゼに結合されている。アポＡ４タンパク質に結合した抗体を未結合抗体から単離し、ペルオキシダーゼの基質、好ましくはＯ−フェニレンジアミン二塩酸塩と接触させる。該比色反応は、結合した抗体の数を定量することを可能にし、その結果、結合したタンパク質の量を定量することを可能にする。この比色反応は、適当な装置を使用して、例えば光学濃度を測定することにより測定される。
該反応の増幅は、少なくとも２つの抗体、すなわち、第１に、ペルオキシダーゼに結合していない抗アポＡ４抗体、そして第２に、第１抗体を認識するペルオキシダーゼ結合抗体を使用して行われうる。
また、該抗体−アポＡ４複合体を支持体に結合させて該複合体の単離および未結合抗体からの分離を促進するために、もう１つの抗アポＡ４抗体が使用されうる。
【００１６】
これらの抗体とアポＡ４との結合は、放射性同位体で標識された抗体を使用することによっても測定されうる。この実施形態においては、アポＡ４タンパク質に結合した抗体を単離し、該抗体−アポＡ４複合体の放射能を、使用した同位体に適した測定装置を使用して測定する。
【００１７】
アポＡ４タンパク質をアッセイするためには、ＥＬＩＳＡおよび放射性同位体技術以外の技術、例えばネフェロメトリーおよびタービジメトリーも用いられうる。該抗体の製造ならびにＥＬＩＳＡおよび放射性同位体技術の使用のためには、特に、マニュアル“Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ”（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ（１９８８）が参照されうる。
【００１８】
本発明の主題はまた、肝疾患の予防または治療において使用するための化合物をスクリーニングする方法であって、
・該化合物を哺乳動物と接触させ、
・該哺乳動物の肝由来の細胞において又は血液において又は血液および血液細胞誘導体においてアポＡ４の発現を測定する工程を含む方法である。
【００１９】
アポＡ４の発現の測定が行われうる細胞または血液を有する哺乳動物は、アポＡ４が肝臓内で発現される任意の哺乳動物である。それは、有利には、げっ歯類であり、好ましくは、マウスである。有利には、天然の肥満傾向にある動物系統を使用する。
例えば、Ｂａｌｂｃ ＢｙＪ、ＤＩＯ Ｂａｌｂｃ ＢｙＪ、ＤＩＯ Ｂａｌｂｃ ＡｎＮまたはＤＩＯ Ｃ５７Ｂｌ／６Ｊ系統が好ましく使用される。
アポＡ４の発現の測定は、該哺乳動物の肝細胞もしくは組織において又は血液およびその誘導体において発現されたアポＡ４の量を測定することにより、あるいは前記のとおり該哺乳動物の肝細胞もしくは組織において発現されるアポＡ４をコードする遺伝子により転写されたメッセンジャーＲＮＡの量を測定することにより行われうる。
【００２０】
本発明は以下の実施例により例示されるが、これらは本発明を限定するものではない。
【実施例１】
【００２１】
転写されたメッセンジャーＲＮＡおよび血漿アポＡ４タンパク質の定量による正常マウス（Ｃ５７ Ｂｌ６）または肥満マウス（Ｃ５７ Ｂｌ６／ｏｂｏｂ）におけるアポＡ４の発現の測定
１．材料および方法
実験プロトコール
血液を正常マウス（Ｃ５７ Ｂｌ６）または肥満マウス（Ｃ５７ Ｂｌ６／ｏｂｏｂ）から採取し、１０ ０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、血漿を取り出した。
【００２２】
一片の肝臓（７５〜１３０ｍｇ）を摘出し、１．５ｍｌのＲＮＡ Ｌａｔｅｒ（Ａｍｂｉｏｍ）を含有する２ｍｌチューブ内に配置した。
【００２３】
アポＡ４ ｍＲＮＡおよびタンパク質をアッセイするために、該肝臓および該血漿を−２０℃で保存した。
【００２４】
マウスアポＡ４の発現のリアルタイムＱＰＣＲ分析
この主に２工程の技術は以下を含む。
１．全ＲＮＡの抽出および精製、ならびにそれに続く、該サンプル中に含有されるｍＲＮＡの、相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）への変換、
２．リアルタイム定量ＰＣＲにより行う該ｃＤＮＡの分析。該遺伝子の相対発現は、変動しない内部参照遺伝子、例えばベータ２−ミクログロブリンまたは１８ＳリボソームＲＮＡに対する％として示される。
【００２５】
７９００ＨＴ Ｆａｓｔ Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ配列分析装置および増幅用試薬はＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓにより提供される。
【００２６】
方法：
組織ライセートの調製
８０ｍｇのマウス肝臓を切り出し、いずれかの操作の前にＲＮＡを可能な限り完全に維持するために、それを直ちに２ｍｌのＲＮＡｌａｔｅｒに漬ける。肝臓片をエッペンドルフチューブ内に乾燥転移し、それに２ｍｌの溶解バッファー（全ＲＮＡ抽出キット；ＱＩＡＧＥＮにより販売されているＲＮｅａｓｙ Ｍｉｄｉ Ｋｉｔ）および２個の鋼製球（直径３ｍｍ）を加える。Ｔｉｓｓｕｅｌｙｓｅｒ（ＱＩＡＧＥＮにより販売されている）を使用して、３０Ｈｚで５分間の攪拌により組織溶解を行う。この段階で、該ライセートを−２０℃で保存することが可能である。
【００２７】
全ＲＮＡの抽出
該ライセートを１４ ０００×ｇで３分間遠心分離し、ＱＩＡｓｈｒｅｄｄｅｒ（ＱＩＡＧＥＮにより販売されている）（３×０．７ｍｌ）上で濾過する。ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｄｉキットのプロトコールに従い、ＤＮアーゼ工程で抽出を行う。最終工程は１５０μｌの水中での全ＲＮＡの溶出である。
ＲＮＡ濃度を、２６０ｎｍの光学濃度（ＯＤ）を測定することにより得る。
【００２８】
相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）の合成
Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＩＩ逆転写キット（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮにより販売されている）を使用して、５μｇの全ＲＮＡからｃＤＮＡを合成する。得られたｃＤＮＡを２０μｌの最終容量中に回収する。
【００２９】
７９００ＨＴ上でのＰＣＲによる遺伝子発現の分析
バッファー、ＰＣＲ反応に必要なポリメラーゼならびに定量すべき遺伝子に特異的なプライマーおよびプローブを特に含有する１５μｌの反応混合物にｃＤＮＡの５μｌの希釈液を加える。後者はＴａｑｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ａｓｓａｙｓの形態で該供給業者から入手可能である。ベータ２−ミクログロブリン（Ｂ２−ｍ）遺伝子または１８ＳリボソームＲＮＡを内部参照体として使用する。ヒトおよびマウスアポＡ４およびベータ２−ｍをコードする遺伝子を増幅するために使用するプライマーおよびプローブの配列を表ＶＩＩに示す（配列番号１〜配列番号１２）。
遺伝子増幅反応は９６ウェルまたは３８４ウェルマイクロプレート内で、温度サイクル（９５℃／１５秒の変性、ついでハイブリダイゼーション、および６０℃／１分の合成）を用いて行う。該分析を９０分間続ける。
増幅速度論（サイクル数の関数としての増幅シグナル）を指数段階の線形表示で分析する（ソフトウェア：ＳＤＳ Ｅｎｔｅｒｐｒｉｓｅ Ｄａｔａｂａｓｅ）。
一定の増幅シグナルで測定されるサイクル数であるＣｔがこの段階で定められ、Ｃｔは、起源サンプル内に存在するメッセンジャーＲＮＡの量に反比例する。標的遺伝子（アポＡ４）と内部参照体（Ｂ２−ｍ）との間のＣｔにおける差（ΔＣｔ）は、関係式Ｑ＝（２）−ΔＣｔ（値は参照遺伝子に対する％として与えられる）から、相対存在量を与える。
【００３０】
ＥＬＩＳＡサンドイッチ法を用いるマウスにおける血漿中のアポＡ４の量の測定
抗体
捕捉抗体は、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．（２１４５ Ｄｅｌａｗａｒｅ Ａｖｅｎｕｅ Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ ９５０６０ Ｕ．Ｓ．Ａ．）により販売されているヤギ抗アポＡ４抗体である。マウスＡ４に対する抗血清を、マウスアポＡ４のＣ末端配列（アミノ酸３６１−３８０）に対応するペプチドで免疫化されたウサギから得る。
完全フロイントアジュバント中の担体タンパク質（ＫＬＨ）に結合しているペプチドのエマルションを該動物に皮下注射する。不完全フロイントアジュバント中の結合ペプチドのエマルションの後続の注射を行う。３回目の追加免疫の１０日後に抗血清を集め、クロマトグラフィーゲルに結合したペプチド上のアフィニティークロマトグラフィーにより該抗体を精製する。
【００３１】
ＥＬＩＳＡサンドイッチ法の実施
ＰＢＳ中の４μｇ／ｍｌのヤギ抗アポＡ４抗体１００μｌを９６ウェルプレートのウェル内で２０℃で４時間インキュベートする。０．１％のｔｗｅｅｎ ２０を含有するＰＢＳで洗浄した後、非特異的結合部位を、０．５％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含有するＰＢＳバッファーで室温で６０分間ブロッキングする。
１００μｌの血漿サンプル（１／３０００〜１／２０ ０００の、０．１％ ＢＳＡを含有するＰＢＳ中の希釈液）を加え、４℃で一晩インキュベートする。
洗浄後、０．１μｇ／ｍｌの１００μｌのウサギポリクローナル抗マウスアポＡ４抗体を加え、室温で１時間インキュベートする。洗浄後、１００μｌの抗ウサギＩｇＧ−ペルオキシダーゼ結合体（ＰＩＥＲＣＥ；０．１％ ＢＳＡを含有するＰＢＳ中、１／２００）を加え、室温で１時間インキュベートする。洗浄後、Ｏ−フェニレンジアミンおよび過酸化水素（これはペルオキシダーゼの基質（Ｓｉｇｍａ）である）を含有する１５０μｌの溶液を加える。２０分後、反応を停止させるために５０μｌの３Ｍ Ｈ２ＳＯ４を加え、４９２ｎｍの光学濃度を測定する。
【００３２】
２．結果
表ＩＡはマウスにおけるアポＡ４の組織分布を示す。アポＡ４は平滑筋、小腸、肝臓、結腸、胎盤、胃、卵巣、直腸、脂肪組織などにおいて発現される。小腸において強い発現が認められる。
【００３３】
表ＩＢは、小腸における強い発現および種々の領域（十二指腸、空腸、回腸）におけるアポＡ４の位置を証明している。
【００３４】
表ＩＩは肝臓および血漿におけるアポＡ４の発現を示し、正常マウスと肥満マウスとを比較した場合に、この発現が肝臓および血漿において上昇することを示している。
【実施例２】
【００３５】
転写されたメッセンジャーＲＮＡの定量によるヒトにおけるアポＡ４の発現の測定
マウス肝臓からの調製に関する前記実施例に記載されているとおりに、ヒト肝臓からｃＤＮＡを調製し、測定を行う。
【００３６】
ヒトアポＡ４発現のリアルタイムＱＰＣＲ分析の結果
表ＩＩＩはヒトにおけるアポＡ４の組織分布、すなわち、子宮底、食道、網膜、胎盤、精巣上体および脂肪組織における存在を示す。文献からのデータに一致して、小腸において強い発現が認められる。
全肝臓においては発現はほとんど認められないが、該発現は肝門系領域に集中しているらしい。
【００３７】
表ＩＶ−Ａは、小腸の領域（空腸、回腸、十二指腸）におけるアポＡ４の位置の結果を証明している。
肝臓におけるアポＡ４の局所発現は、ある病態生理学的状態（肝門系）に、より関連していることも示されている（表ＩＶ−Ｂ）。
【００３８】
この結果は表Ｖ−ＡおよびＶＩにおいて証明されており、これらの表は一緒になって、病的な肝臓および正常な肝臓の種々のサンプルに関するアポＡ４の分析を示している。
高い値は以下の病態に相関している：肝硬変、ループスおよび梗塞。
【００３９】
これらの状態に関する潜在的マーカーとしてのアポＡ４の特異性は、アポＡ４とその他のクラスのアポリポタンパク質（アポＡ１、アポＡ２およびアポＡ５）とを比較した分析により示されている（表ＩＶおよびＶ−Ｂ）。
【実施例３】
【００４０】
ＥＬＩＳＡサンドイッチ法によるヒトの血漿におけるアポＡ４タンパク質の量の測定
抗体
捕捉抗体は、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．（２１４５ Ｄｅｌａｗａｒｅ Ａｖｅｎｕｅ Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ ９５０６０ Ｕ．Ｓ．Ａ．）により販売されているヤギ抗アポＡ４抗体である。
【００４１】
Ｗｅｉｎｂｅｒｇ ＲＢ，Ｈｏｐｋｉｎｓ ＲＡ，Ｊｏｎｅｓ ＪＢ．（Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１９９６；２６３：２８２−９６．Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，ｉｓｏｆｏｒｍ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ，ａｎｄ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ Ａ４）により記載されているとおりに、精製ヒトアポＡ４をヒト血清から得る。
【００４２】
ヒトアポＡ４に対する抗血清をウサギから得る。完全フロイントアジュバント中の精製ｈ−アポＡ４のエマルションを該動物に皮下注射する。不完全フロイントアジュバント中の精製アポＡ４のエマルションの後続の注射を行う。
３回目の追加免疫の１０日後に抗血清を集める。
【００４３】
ＥＬＩＳＡサンドイッチ法の実施
９６ウェルプレートのウェルをＰＢＳ中の４μｇ／ｍｌのヤギ抗アポＡ４抗体１００μｌと共に２０℃で４時間インキュベートする。
０．１％のｔｗｅｅｎ ２０を含有するＰＢＳで洗浄した後、非特異的結合部位を、０．５％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含有するＰＢＳバッファーで室温で６０分間ブロッキングする。
１００μｌの血漿サンプル（１／３０００〜１／２０ ０００の、０．１％ ＢＳＡを含有するＰＢＳ中の希釈液）を加え、４℃で一晩インキュベートする。洗浄後、１００μｌのウサギ抗ヒトアポＡ４ポリクローナル血清抗体（ＰＢＳ−ＢＳＡ中で１／５０００希釈されたもの）を加え、室温で１時間インキュベートする。洗浄後、１００μｌの抗ウサギＩｇＧ−ペルオキシダーゼ結合体（ＰＩＥＲＣＥ；０．１％ ＢＳＡを含有するＰＢＳ中、１／２００）を加え、室温で１時間インキュベートする。洗浄後、Ｏ−フェニレンジアミンおよび過酸化水素（これはペルオキシダーゼの基質（Ｓｉｇｍａ）である）を含有する１５０μｌの溶液を加える。
２０分後、反応を停止させるために５０μｌの３Ｍ Ｈ２ＳＯ４を加え、４９２ｎｍの光学濃度を測定する。
【実施例４】
【００４４】
肥満およびヒト肝アポＡ４
過体重患者の肝臓におけるアポＡ４の発現を分析することにより、肥満に焦点を合わせた研究を行った。この病理はボディ・マス指数（ＢＭＩ＝ｋｇ単位の体重／（メートル単位の身長）２）に相関している。正常な体重負荷はＢＭＩ＜２５に対応する。
実験的に、Ａｓｔｅｒａｎｄ，Ｉｎｃ．（ＴｅｃｈＯｎｅ Ｂｌｄｇ，Ｓｕｉｔｅ ５０１，４４０ Ｂｕｒｒｏｕｇｈｓ，Ｄｅｔｒｏｉｔ ＭＩ ４８２０２，ＵＳ）により提供されるヒト肝臓ＲＮＡの集合体を使用して、前記のＱＰＣＲ技術により、アポリポタンパク質の発現を分析した。
【００４５】
結果を表ＶＩＩＩに示す。アポＡ４の発現率（％）とボディ・マス指数との間に直接的な正の関係が認められる。
【００４６】
これらの結果は、肥満の診断または予後および治療追跡におけるマーカーとしてのアポＡ４の使用の妥当性を示している。
【００４７】
【表１】
【００４８】
【表２】
【００４９】
【表３】
【００５０】
【表４】
【００５１】
【表５】
【００５２】
【表６】
【００５３】
【表７】
【００５４】
【表８】
【００５５】
【表９】
【００５６】
【表１０】
【００５７】
【表１１】
【技術分野】
【０００１】
本出願は肝疾患の診断方法に関する。本発明はまた、該疾患の治療用の分子のスクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
アポリポタンパク質Ａ４（アポＡ４）は豊富な循環アポリポタンパク質である。このタンパク質の発現は、げっ歯類の視床下部、小腸および肝臓において実証されている。マウスの血漿中に見出されるアポＡ４のほとんどは小腸由来であると考えられている（Ｗｕら，ＪＢＣ ２５４，７３１６−７３２２ １９７９）。ヒトにおけるアポＡ４の合成は小腸に限定されることがＥｌｓｈｏｕｒｂａｇｙ（ＪＢＣ ２６２ １９８７）により記載されている。アポＡ４は多数の機能を有する。それは、肝組織からのコレステロールの流れの活性化およびリポタンパク質リパーゼ活性の刺激のような種々のメカニズムにより脂質の輸送および代謝を調節する（Ｓｔａｎら，Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ ａｃｔａ，１６３１ ２００３，１７７−１８７）。アポＡ４は満腹因子であることも公知である。
【０００３】
肝疾患は重大な公衆衛生問題の１つである。したがって、特異的かつ高感度なアッセイ方法を用いて、すべての肝疾患を可能な限り早期に診断することが不可欠である。
【発明の開示】
【０００４】
驚くべきことに、本出願人は、アポＡ４がヒトにおいて肝臓内で発現されること、およびアポＡ４をコードする遺伝子の肝発現のレベルが肝疾患において有意に上昇することを実証した。
【０００５】
本発明の主題は、肝細胞もしくは組織またはこれらの細胞および組織の抽出物における或いは血液およびその誘導体におけるアポＡ４の発現の測定を含む、肝疾患の検出、診断またはその予後の提供方法である。
【０００６】
したがって、本発明の主題は、肝細胞または組織においてだけでなく、肝臓由来のアポＡ４が存在する血液においても、アポＡ４の発現を測定することである。そのような方法は、
・肝細胞もしくは組織またはこれらの細胞および組織の抽出物あるいは血液またはその誘導体を単離し、
・アポＡ４の発現を測定する工程を含みうる。
【０００７】
そのような抽出物は肝細胞および組織の溶解（ｌｙｓｉｓ）により得られうる。「肝疾患」なる語は、慢性であるか病因性であるかにかかわらず肝組織および細胞に影響を及ぼす任意の疾患（アルコール性、ウイルス性、毒性、食物関連、環境性など）を意味すると意図される。
より詳しくは、本発明の主題は、脂肪肝炎、肝臓発癌、肝硬変、ウイルス性肝炎、肝細胞不全、胆汁うっ滞、門脈高血圧、脂肪症および脂肪肝炎、肝静脈および動脈疾患、線維症、肥満ならびにメタボリックシンドロームの検出、診断またはその予後の提供方法である。
「血液誘導体」なる語は、物理的処理（例えば、遠心分離）、生物学的処理（例えば、凝血）もしくは化学的処理またはそのような誘導体を得るための任意の他の処理により血液から誘導される任意の細胞性または無細胞性画分を意味すると意図される。
そのような誘導体は、好ましくは、血漿および血清である。
本発明の好ましい実施形態においては、該方法は、肝疾患を診断し又はその予後を提供することが望まれる個体の肝細胞または組織におけるアポＡ４をコードする遺伝子から転写されたメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の量の測定を含む。
該哺乳動物の肝細胞もしくは組織または血液中およびその誘導体中の細胞を取り出し、特にメッセンジャーＲＮＡおよびタンパク質の分解を防ぐために当業者に公知の方法により処理し、ついで、アポＡ４をコードする遺伝子により転写されたメッセンジャーＲＮＡの量を測定する。
特に有利には、転写されたメッセンジャーＲＮＡの量を、定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）またはＱＰＣＲとして公知の方法に従う増幅により測定する。
この技術により、全ＲＮＡを抽出し、精製し、該抽出物中に含有されるメッセンジャーＲＮＡをまず、逆転写酵素を使用して相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）に変換する。
本発明において好ましく使用されるポリメラーゼはＴａｑポリメラーゼであるが、それは、ポリメラーゼ活性を有しＰＣＲの実施のための条件下で使用されうる任意の他の酵素でありうる。この酵素は、その特性により、各合成サイクルにおいて初期ＤＮＡの量を倍加することを可能にする。
生物学的サンプル中に含有されるｍＲＮＡから誘導されたｃＤＮＡの分析は、リアルタイム定量的ＰＣＲにより行う。アポＡ４配列に特異的なプライマーおよびプローブを使用して、以下の工程：
・該サンプルから調製されたｃＤＮＡを加熱することによる、増幅すべき鎖の分離、
・該プローブの、およびセンスおよびアンチセンスプライマーのペアのハイブリダイゼーション、ならびに
・ポリメラーゼでの伸長によるＤＮＡ鎖のデノボ（ｄｅ ｎｏｖｏ）合成
を含むサイクルの反復を実質的に含む方法により、該ｃＤＮＡを分析する。
【０００８】
有利には、センスおよびアンチセンスプライマーは少なくとも１５個のヌクレオチドを含み、配列番号１３（Ｇｅｎｅｂａｎｋ番号ＮＭ ０００４８２）の配列に対応するヒトアポＡ４配列またはそれに相補的な配列に対して少なくとも８０％、好ましくは９０％、より好ましくは９５％の同一性を示す。該増幅反応の経過中、配列番号１３（Ｇｅｎｅｂａｎｋ番号ＮＭ ０００４８２）の配列に対応するヒトアポＡ４配列またはそれに相補的な配列に対して少なくとも８０％、好ましくは９０％、より好ましくは９５％の同一性を示し少なくとも１５ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドよりなるプローブを使用して、反応産物または増幅産物を検出する。
【０００９】
２つのプライマーはそれぞれ、ＤＮＡ断片の増幅を可能にするよう、センスおよびアンチセンス鎖上で選択される。プローブのほうは、それらの２つのプライマーの位置により範囲が定められた増幅から生じたＤＮＡ断片にハイブリダイズするよう標的化される。有利には、該プローブは、該プライマーの理論Ｔｍ値より約１０℃±０．５℃高い理論融点Ｔｍを有する。該オリゴヌクレオチド（プライマーおよびプローブ）は、好ましくは、１５〜２５ヌクレオチドを含む。該方法は、測定可能な量の増幅産物（ｎ＝４０）が得られるのを可能にするのに十分なサイクル数にわたって行われる。ヒトアポＡ４をコードする遺伝子を増幅するのに使用するプライマーは、好ましくは、配列：
配列番号１：ｇｃａｇｃｔｇｇｃｔｃｃｃｔａｔｇｃｔ、
および
配列番号２：ｇｇａａｇｇｔｃａｇｇｃｃｃｔｃａａｇ
を有する。該プローブは、好ましくは、配列番号３：ｃａｃｇｃａｇｇａｇａａｇｃｔｃａａｃｃａｃｃａの配列を有する。
【００１０】
本発明の好ましい実施形態においては、該プローブは可視化分子または分子系を含有する。該可視化系は、好ましくは、該プローブの５’末端および３’末端にそれぞれ結合しているレポーター着色剤および蛍光消光着色剤よりなる。有利な実施形態においては、該可視化系は、該プローブの５’位および３’位にそれぞれ結合している６−カルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ）および６−カルボキシテトラメチルローダミン（ＴＡＭＲＡ）により代表される「レポーター／消光剤」ペアよりなる。本発明において該ＰＣＲを行うためには、ＰＣＲ技術の一般的総説ならびに試薬およびサーモサイクルの製造業者および流通業者からの説明、特に、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（１９９９）により公開されている「Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ ｏｆ ＤＮＡ／ＲＮＡ Ｕｓｉｎｇ Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ ＰＣＲ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ」なる題名の使用説明書、およびＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ （Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ １９８９）が参照されうる。
【００１１】
ＱＰＣＲによる検出方法の利点の１つは、ＰＣＲサイクル中に得られた蛍光を読み取ることによりＰＣＲ産物の分析がＰＣＲサイクルの終了時に直接行われることである。したがって、後続の分析で汚染される危険性を伴う該ＰＣＲ産物の取り扱いの必要がない。
【００１２】
また、該反応の開始時に使用される標的の数の定量は非常に信頼しうるものであり再現性有るものである。ＰＣＲ産物は該ＰＣＲサイクル中に蛍光プローブにより検出される。後者は、ＰＣＲ産物を検出するために必要であり、該検出は、指数的ＰＣＲ段階の真ん中の時点で生じ、最終時点で生じるのではない。したがって、この検出原理は、より高感度であり、より特異的である。
【００１３】
ＱＰＣＲのもう１つの利点は、「ホットスタート（ｈｏｔ ｓｔａｒｔ）」原理により非特異的増幅が回避されることであり、該リアルタイムＰＣＲは、最初の変性時に活性化される熱安定ＤＮＡポリメラーゼの存在下で行われる。
【００１４】
本発明のもう１つの実施形態においては、本発明の方法は、肝細胞もしくは組織において又は血液およびその誘導体において発現されたアポＡ４タンパク質またはタンパク質断片の量の測定を含む。
【００１５】
特に有利には、アポＡ４タンパク質またはタンパク質断片の量は、このタンパク質に特異的な少なくとも１つの抗体を使用して測定される。
これらの抗体は、精製ヒトアポＡ４タンパク質または約２０アミノ酸のアポＡ４のペプチド配列エマルションを、場合によってはアジュバント、例えばフロイントアジュバントの存在下、動物（例えば、げっ歯類）に注射することよりなる方法により得られうる。該注射を繰返し、抗血清を集める。
肝アポＡ４を定量することが望まれる個体の肝細胞もしくは組織において又は血液およびその誘導体において発現されたアポＡ４とこれらの抗体との結合の測定は任意の適当な手段により行われうる。好ましくは、それはＥＬＩＳＡ（酵素結合イムノソルベントアッセイの略）技術により、より一層好ましくは、「サンドイッチ」法により行われうる。「サンドイッチ」法は２つの抗体を使用するものであり、第１の捕捉抗体はマイクロプレートのような固相に結合しており、第２の検出抗体は、該タンパク質を定量することを可能にする。この技術においては、該検出抗体はペルオキシダーゼに結合されている。アポＡ４タンパク質に結合した抗体を未結合抗体から単離し、ペルオキシダーゼの基質、好ましくはＯ−フェニレンジアミン二塩酸塩と接触させる。該比色反応は、結合した抗体の数を定量することを可能にし、その結果、結合したタンパク質の量を定量することを可能にする。この比色反応は、適当な装置を使用して、例えば光学濃度を測定することにより測定される。
該反応の増幅は、少なくとも２つの抗体、すなわち、第１に、ペルオキシダーゼに結合していない抗アポＡ４抗体、そして第２に、第１抗体を認識するペルオキシダーゼ結合抗体を使用して行われうる。
また、該抗体−アポＡ４複合体を支持体に結合させて該複合体の単離および未結合抗体からの分離を促進するために、もう１つの抗アポＡ４抗体が使用されうる。
【００１６】
これらの抗体とアポＡ４との結合は、放射性同位体で標識された抗体を使用することによっても測定されうる。この実施形態においては、アポＡ４タンパク質に結合した抗体を単離し、該抗体−アポＡ４複合体の放射能を、使用した同位体に適した測定装置を使用して測定する。
【００１７】
アポＡ４タンパク質をアッセイするためには、ＥＬＩＳＡおよび放射性同位体技術以外の技術、例えばネフェロメトリーおよびタービジメトリーも用いられうる。該抗体の製造ならびにＥＬＩＳＡおよび放射性同位体技術の使用のためには、特に、マニュアル“Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ”（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ（１９８８）が参照されうる。
【００１８】
本発明の主題はまた、肝疾患の予防または治療において使用するための化合物をスクリーニングする方法であって、
・該化合物を哺乳動物と接触させ、
・該哺乳動物の肝由来の細胞において又は血液において又は血液および血液細胞誘導体においてアポＡ４の発現を測定する工程を含む方法である。
【００１９】
アポＡ４の発現の測定が行われうる細胞または血液を有する哺乳動物は、アポＡ４が肝臓内で発現される任意の哺乳動物である。それは、有利には、げっ歯類であり、好ましくは、マウスである。有利には、天然の肥満傾向にある動物系統を使用する。
例えば、Ｂａｌｂｃ ＢｙＪ、ＤＩＯ Ｂａｌｂｃ ＢｙＪ、ＤＩＯ Ｂａｌｂｃ ＡｎＮまたはＤＩＯ Ｃ５７Ｂｌ／６Ｊ系統が好ましく使用される。
アポＡ４の発現の測定は、該哺乳動物の肝細胞もしくは組織において又は血液およびその誘導体において発現されたアポＡ４の量を測定することにより、あるいは前記のとおり該哺乳動物の肝細胞もしくは組織において発現されるアポＡ４をコードする遺伝子により転写されたメッセンジャーＲＮＡの量を測定することにより行われうる。
【００２０】
本発明は以下の実施例により例示されるが、これらは本発明を限定するものではない。
【実施例１】
【００２１】
転写されたメッセンジャーＲＮＡおよび血漿アポＡ４タンパク質の定量による正常マウス（Ｃ５７ Ｂｌ６）または肥満マウス（Ｃ５７ Ｂｌ６／ｏｂｏｂ）におけるアポＡ４の発現の測定
１．材料および方法
実験プロトコール
血液を正常マウス（Ｃ５７ Ｂｌ６）または肥満マウス（Ｃ５７ Ｂｌ６／ｏｂｏｂ）から採取し、１０ ０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、血漿を取り出した。
【００２２】
一片の肝臓（７５〜１３０ｍｇ）を摘出し、１．５ｍｌのＲＮＡ Ｌａｔｅｒ（Ａｍｂｉｏｍ）を含有する２ｍｌチューブ内に配置した。
【００２３】
アポＡ４ ｍＲＮＡおよびタンパク質をアッセイするために、該肝臓および該血漿を−２０℃で保存した。
【００２４】
マウスアポＡ４の発現のリアルタイムＱＰＣＲ分析
この主に２工程の技術は以下を含む。
１．全ＲＮＡの抽出および精製、ならびにそれに続く、該サンプル中に含有されるｍＲＮＡの、相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）への変換、
２．リアルタイム定量ＰＣＲにより行う該ｃＤＮＡの分析。該遺伝子の相対発現は、変動しない内部参照遺伝子、例えばベータ２−ミクログロブリンまたは１８ＳリボソームＲＮＡに対する％として示される。
【００２５】
７９００ＨＴ Ｆａｓｔ Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ配列分析装置および増幅用試薬はＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓにより提供される。
【００２６】
方法：
組織ライセートの調製
８０ｍｇのマウス肝臓を切り出し、いずれかの操作の前にＲＮＡを可能な限り完全に維持するために、それを直ちに２ｍｌのＲＮＡｌａｔｅｒに漬ける。肝臓片をエッペンドルフチューブ内に乾燥転移し、それに２ｍｌの溶解バッファー（全ＲＮＡ抽出キット；ＱＩＡＧＥＮにより販売されているＲＮｅａｓｙ Ｍｉｄｉ Ｋｉｔ）および２個の鋼製球（直径３ｍｍ）を加える。Ｔｉｓｓｕｅｌｙｓｅｒ（ＱＩＡＧＥＮにより販売されている）を使用して、３０Ｈｚで５分間の攪拌により組織溶解を行う。この段階で、該ライセートを−２０℃で保存することが可能である。
【００２７】
全ＲＮＡの抽出
該ライセートを１４ ０００×ｇで３分間遠心分離し、ＱＩＡｓｈｒｅｄｄｅｒ（ＱＩＡＧＥＮにより販売されている）（３×０．７ｍｌ）上で濾過する。ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｄｉキットのプロトコールに従い、ＤＮアーゼ工程で抽出を行う。最終工程は１５０μｌの水中での全ＲＮＡの溶出である。
ＲＮＡ濃度を、２６０ｎｍの光学濃度（ＯＤ）を測定することにより得る。
【００２８】
相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）の合成
Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＩＩ逆転写キット（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮにより販売されている）を使用して、５μｇの全ＲＮＡからｃＤＮＡを合成する。得られたｃＤＮＡを２０μｌの最終容量中に回収する。
【００２９】
７９００ＨＴ上でのＰＣＲによる遺伝子発現の分析
バッファー、ＰＣＲ反応に必要なポリメラーゼならびに定量すべき遺伝子に特異的なプライマーおよびプローブを特に含有する１５μｌの反応混合物にｃＤＮＡの５μｌの希釈液を加える。後者はＴａｑｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ａｓｓａｙｓの形態で該供給業者から入手可能である。ベータ２−ミクログロブリン（Ｂ２−ｍ）遺伝子または１８ＳリボソームＲＮＡを内部参照体として使用する。ヒトおよびマウスアポＡ４およびベータ２−ｍをコードする遺伝子を増幅するために使用するプライマーおよびプローブの配列を表ＶＩＩに示す（配列番号１〜配列番号１２）。
遺伝子増幅反応は９６ウェルまたは３８４ウェルマイクロプレート内で、温度サイクル（９５℃／１５秒の変性、ついでハイブリダイゼーション、および６０℃／１分の合成）を用いて行う。該分析を９０分間続ける。
増幅速度論（サイクル数の関数としての増幅シグナル）を指数段階の線形表示で分析する（ソフトウェア：ＳＤＳ Ｅｎｔｅｒｐｒｉｓｅ Ｄａｔａｂａｓｅ）。
一定の増幅シグナルで測定されるサイクル数であるＣｔがこの段階で定められ、Ｃｔは、起源サンプル内に存在するメッセンジャーＲＮＡの量に反比例する。標的遺伝子（アポＡ４）と内部参照体（Ｂ２−ｍ）との間のＣｔにおける差（ΔＣｔ）は、関係式Ｑ＝（２）−ΔＣｔ（値は参照遺伝子に対する％として与えられる）から、相対存在量を与える。
【００３０】
ＥＬＩＳＡサンドイッチ法を用いるマウスにおける血漿中のアポＡ４の量の測定
抗体
捕捉抗体は、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．（２１４５ Ｄｅｌａｗａｒｅ Ａｖｅｎｕｅ Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ ９５０６０ Ｕ．Ｓ．Ａ．）により販売されているヤギ抗アポＡ４抗体である。マウスＡ４に対する抗血清を、マウスアポＡ４のＣ末端配列（アミノ酸３６１−３８０）に対応するペプチドで免疫化されたウサギから得る。
完全フロイントアジュバント中の担体タンパク質（ＫＬＨ）に結合しているペプチドのエマルションを該動物に皮下注射する。不完全フロイントアジュバント中の結合ペプチドのエマルションの後続の注射を行う。３回目の追加免疫の１０日後に抗血清を集め、クロマトグラフィーゲルに結合したペプチド上のアフィニティークロマトグラフィーにより該抗体を精製する。
【００３１】
ＥＬＩＳＡサンドイッチ法の実施
ＰＢＳ中の４μｇ／ｍｌのヤギ抗アポＡ４抗体１００μｌを９６ウェルプレートのウェル内で２０℃で４時間インキュベートする。０．１％のｔｗｅｅｎ ２０を含有するＰＢＳで洗浄した後、非特異的結合部位を、０．５％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含有するＰＢＳバッファーで室温で６０分間ブロッキングする。
１００μｌの血漿サンプル（１／３０００〜１／２０ ０００の、０．１％ ＢＳＡを含有するＰＢＳ中の希釈液）を加え、４℃で一晩インキュベートする。
洗浄後、０．１μｇ／ｍｌの１００μｌのウサギポリクローナル抗マウスアポＡ４抗体を加え、室温で１時間インキュベートする。洗浄後、１００μｌの抗ウサギＩｇＧ−ペルオキシダーゼ結合体（ＰＩＥＲＣＥ；０．１％ ＢＳＡを含有するＰＢＳ中、１／２００）を加え、室温で１時間インキュベートする。洗浄後、Ｏ−フェニレンジアミンおよび過酸化水素（これはペルオキシダーゼの基質（Ｓｉｇｍａ）である）を含有する１５０μｌの溶液を加える。２０分後、反応を停止させるために５０μｌの３Ｍ Ｈ２ＳＯ４を加え、４９２ｎｍの光学濃度を測定する。
【００３２】
２．結果
表ＩＡはマウスにおけるアポＡ４の組織分布を示す。アポＡ４は平滑筋、小腸、肝臓、結腸、胎盤、胃、卵巣、直腸、脂肪組織などにおいて発現される。小腸において強い発現が認められる。
【００３３】
表ＩＢは、小腸における強い発現および種々の領域（十二指腸、空腸、回腸）におけるアポＡ４の位置を証明している。
【００３４】
表ＩＩは肝臓および血漿におけるアポＡ４の発現を示し、正常マウスと肥満マウスとを比較した場合に、この発現が肝臓および血漿において上昇することを示している。
【実施例２】
【００３５】
転写されたメッセンジャーＲＮＡの定量によるヒトにおけるアポＡ４の発現の測定
マウス肝臓からの調製に関する前記実施例に記載されているとおりに、ヒト肝臓からｃＤＮＡを調製し、測定を行う。
【００３６】
ヒトアポＡ４発現のリアルタイムＱＰＣＲ分析の結果
表ＩＩＩはヒトにおけるアポＡ４の組織分布、すなわち、子宮底、食道、網膜、胎盤、精巣上体および脂肪組織における存在を示す。文献からのデータに一致して、小腸において強い発現が認められる。
全肝臓においては発現はほとんど認められないが、該発現は肝門系領域に集中しているらしい。
【００３７】
表ＩＶ−Ａは、小腸の領域（空腸、回腸、十二指腸）におけるアポＡ４の位置の結果を証明している。
肝臓におけるアポＡ４の局所発現は、ある病態生理学的状態（肝門系）に、より関連していることも示されている（表ＩＶ−Ｂ）。
【００３８】
この結果は表Ｖ−ＡおよびＶＩにおいて証明されており、これらの表は一緒になって、病的な肝臓および正常な肝臓の種々のサンプルに関するアポＡ４の分析を示している。
高い値は以下の病態に相関している：肝硬変、ループスおよび梗塞。
【００３９】
これらの状態に関する潜在的マーカーとしてのアポＡ４の特異性は、アポＡ４とその他のクラスのアポリポタンパク質（アポＡ１、アポＡ２およびアポＡ５）とを比較した分析により示されている（表ＩＶおよびＶ−Ｂ）。
【実施例３】
【００４０】
ＥＬＩＳＡサンドイッチ法によるヒトの血漿におけるアポＡ４タンパク質の量の測定
抗体
捕捉抗体は、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．（２１４５ Ｄｅｌａｗａｒｅ Ａｖｅｎｕｅ Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ ９５０６０ Ｕ．Ｓ．Ａ．）により販売されているヤギ抗アポＡ４抗体である。
【００４１】
Ｗｅｉｎｂｅｒｇ ＲＢ，Ｈｏｐｋｉｎｓ ＲＡ，Ｊｏｎｅｓ ＪＢ．（Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１９９６；２６３：２８２−９６．Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，ｉｓｏｆｏｒｍ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ，ａｎｄ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ Ａ４）により記載されているとおりに、精製ヒトアポＡ４をヒト血清から得る。
【００４２】
ヒトアポＡ４に対する抗血清をウサギから得る。完全フロイントアジュバント中の精製ｈ−アポＡ４のエマルションを該動物に皮下注射する。不完全フロイントアジュバント中の精製アポＡ４のエマルションの後続の注射を行う。
３回目の追加免疫の１０日後に抗血清を集める。
【００４３】
ＥＬＩＳＡサンドイッチ法の実施
９６ウェルプレートのウェルをＰＢＳ中の４μｇ／ｍｌのヤギ抗アポＡ４抗体１００μｌと共に２０℃で４時間インキュベートする。
０．１％のｔｗｅｅｎ ２０を含有するＰＢＳで洗浄した後、非特異的結合部位を、０．５％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含有するＰＢＳバッファーで室温で６０分間ブロッキングする。
１００μｌの血漿サンプル（１／３０００〜１／２０ ０００の、０．１％ ＢＳＡを含有するＰＢＳ中の希釈液）を加え、４℃で一晩インキュベートする。洗浄後、１００μｌのウサギ抗ヒトアポＡ４ポリクローナル血清抗体（ＰＢＳ−ＢＳＡ中で１／５０００希釈されたもの）を加え、室温で１時間インキュベートする。洗浄後、１００μｌの抗ウサギＩｇＧ−ペルオキシダーゼ結合体（ＰＩＥＲＣＥ；０．１％ ＢＳＡを含有するＰＢＳ中、１／２００）を加え、室温で１時間インキュベートする。洗浄後、Ｏ−フェニレンジアミンおよび過酸化水素（これはペルオキシダーゼの基質（Ｓｉｇｍａ）である）を含有する１５０μｌの溶液を加える。
２０分後、反応を停止させるために５０μｌの３Ｍ Ｈ２ＳＯ４を加え、４９２ｎｍの光学濃度を測定する。
【実施例４】
【００４４】
肥満およびヒト肝アポＡ４
過体重患者の肝臓におけるアポＡ４の発現を分析することにより、肥満に焦点を合わせた研究を行った。この病理はボディ・マス指数（ＢＭＩ＝ｋｇ単位の体重／（メートル単位の身長）２）に相関している。正常な体重負荷はＢＭＩ＜２５に対応する。
実験的に、Ａｓｔｅｒａｎｄ，Ｉｎｃ．（ＴｅｃｈＯｎｅ Ｂｌｄｇ，Ｓｕｉｔｅ ５０１，４４０ Ｂｕｒｒｏｕｇｈｓ，Ｄｅｔｒｏｉｔ ＭＩ ４８２０２，ＵＳ）により提供されるヒト肝臓ＲＮＡの集合体を使用して、前記のＱＰＣＲ技術により、アポリポタンパク質の発現を分析した。
【００４５】
結果を表ＶＩＩＩに示す。アポＡ４の発現率（％）とボディ・マス指数との間に直接的な正の関係が認められる。
【００４６】
これらの結果は、肥満の診断または予後および治療追跡におけるマーカーとしてのアポＡ４の使用の妥当性を示している。
【００４７】
【表１】
【００４８】
【表２】
【００４９】
【表３】
【００５０】
【表４】
【００５１】
【表５】
【００５２】
【表６】
【００５３】
【表７】
【００５４】
【表８】
【００５５】
【表９】
【００５６】
【表１０】
【００５７】
【表１１】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
肝細胞もしくは組織または血液およびその誘導体におけるアポＡ４の発現の測定を含んでなる、肝疾患の診断またはその予後の提供方法。
【請求項２】
・肝細胞もしくは組織またはこれらの細胞および組織の抽出物あるいは血液またはその誘導体を単離し、および
・アポＡ４の発現を測定する工程を含む、請求項１記載の方法。
【請求項３】
肝細胞または組織において発現される、アポＡ４をコードする遺伝子により転写されたメッセンジャーＲＮＡの量の測定を含むことを特徴とする、請求項１および２のいずれか１項記載の方法。
【請求項４】
転写されたメッセンジャーＲＮＡの量をＰＣＲ法により測定することを特徴とする、請求項３記載の方法。
【請求項５】
転写されたメッセンジャーＲＮＡの量を定量的ＰＣＲ法の手段により測定することを特徴とする、請求項４記載の方法。
【請求項６】
肝細胞もしくは組織または血液およびその誘導体において発現されたアポＡ４タンパク質の量の測定を含むことを特徴とする、請求項１および２のいずれか１項記載の方法。
【請求項７】
アポＡ４の量を、このタンパク質に特異的な少なくとも１つの抗体を使用して測定することを特徴とする、請求項６記載の方法。
【請求項８】
特異的抗体がペルオキシダーゼに結合されているか、または放射性同位体で標識されていることを特徴とする、請求項７記載の方法。
【請求項９】
タンパク質への抗体の結合をＥＬＩＳＡ技術により測定することを特徴とする、請求項７および８のいずれか１項記載の方法。
【請求項１０】
肝疾患の予防または治療において使用するための化合物をスクリーニングまたは検出する方法であって、
・該化合物を哺乳動物と接触させ、および
・該哺乳動物の肝由来の細胞において又は血液および血液細胞誘導体においてアポＡ４の発現を測定する工程を含んでなる方法。
【請求項１１】
該哺乳動物の肝細胞もしくは組織または血液およびその誘導体において発現されたアポＡ４の量の測定を含むことを特徴とする、請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
該哺乳動物の肝細胞もしくは組織または血液および血液誘導体において発現されたアポＡ４をコードする遺伝子により転写されたメッセンジャーＲＮＡの量の測定を含むことを特徴とする、請求項１０記載の方法。
【請求項１３】
該哺乳動物がＢａｌｂｃ ＢｙＪ、ＤＩＯ Ｂａｌｂｃ ＢｙＪ、ＤＩＯ Ｂａｌｂｃ ＡｎＮまたはＤＩＯ Ｃ５７Ｂｌ／６Ｊ系統のマウスであることを特徴とする、請求項１０から１２のいずれか１項記載の方法。
【請求項１】
肝細胞もしくは組織または血液およびその誘導体におけるアポＡ４の発現の測定を含んでなる、肝疾患の診断またはその予後の提供方法。
【請求項２】
・肝細胞もしくは組織またはこれらの細胞および組織の抽出物あるいは血液またはその誘導体を単離し、および
・アポＡ４の発現を測定する工程を含む、請求項１記載の方法。
【請求項３】
肝細胞または組織において発現される、アポＡ４をコードする遺伝子により転写されたメッセンジャーＲＮＡの量の測定を含むことを特徴とする、請求項１および２のいずれか１項記載の方法。
【請求項４】
転写されたメッセンジャーＲＮＡの量をＰＣＲ法により測定することを特徴とする、請求項３記載の方法。
【請求項５】
転写されたメッセンジャーＲＮＡの量を定量的ＰＣＲ法の手段により測定することを特徴とする、請求項４記載の方法。
【請求項６】
肝細胞もしくは組織または血液およびその誘導体において発現されたアポＡ４タンパク質の量の測定を含むことを特徴とする、請求項１および２のいずれか１項記載の方法。
【請求項７】
アポＡ４の量を、このタンパク質に特異的な少なくとも１つの抗体を使用して測定することを特徴とする、請求項６記載の方法。
【請求項８】
特異的抗体がペルオキシダーゼに結合されているか、または放射性同位体で標識されていることを特徴とする、請求項７記載の方法。
【請求項９】
タンパク質への抗体の結合をＥＬＩＳＡ技術により測定することを特徴とする、請求項７および８のいずれか１項記載の方法。
【請求項１０】
肝疾患の予防または治療において使用するための化合物をスクリーニングまたは検出する方法であって、
・該化合物を哺乳動物と接触させ、および
・該哺乳動物の肝由来の細胞において又は血液および血液細胞誘導体においてアポＡ４の発現を測定する工程を含んでなる方法。
【請求項１１】
該哺乳動物の肝細胞もしくは組織または血液およびその誘導体において発現されたアポＡ４の量の測定を含むことを特徴とする、請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
該哺乳動物の肝細胞もしくは組織または血液および血液誘導体において発現されたアポＡ４をコードする遺伝子により転写されたメッセンジャーＲＮＡの量の測定を含むことを特徴とする、請求項１０記載の方法。
【請求項１３】
該哺乳動物がＢａｌｂｃ ＢｙＪ、ＤＩＯ Ｂａｌｂｃ ＢｙＪ、ＤＩＯ Ｂａｌｂｃ ＡｎＮまたはＤＩＯ Ｃ５７Ｂｌ／６Ｊ系統のマウスであることを特徴とする、請求項１０から１２のいずれか１項記載の方法。
【公表番号】特表２００９−５１５５１４（Ｐ２００９−５１５５１４Ａ）
【公表日】平成２１年４月１６日（２００９．４．１６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−５３９４７２（Ｐ２００８−５３９４７２）
【出願日】平成１８年１１月１０日（２００６．１１．１０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＦＲ２００６／００２５０３
【国際公開番号】ＷＯ２００７／０５７５４８
【国際公開日】平成１９年５月２４日（２００７．５．２４）
【出願人】（５０４４５６７９８）サノフイ−アベンテイス (433)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２１年４月１６日（２００９．４．１６）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年１１月１０日（２００６．１１．１０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＦＲ２００６／００２５０３
【国際公開番号】ＷＯ２００７／０５７５４８
【国際公開日】平成１９年５月２４日（２００７．５．２４）
【出願人】（５０４４５６７９８）サノフイ−アベンテイス (433)
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]