肝臓卵形細胞の取得方法
【課題】肝臓から肝臓卵形細胞を単離・同定する方法の提供、肝臓卵形細胞を単一細胞培養する方法の提供。
【解決手段】ＣＤ１３３、ＣＤ４５及びＴｅｒ１１９の発現を調べる工程を含む、哺乳動物から肝臓卵形細胞を分離及び／又は取得する方法、特にＣＤ１３３、ＣＤ４５及びＴｅｒ１１９の３つの細胞表面マーカーをＣＤ１３３＋、ＣＤ４５−及びＴｅｒ１１９−のパターンで呈する肝臓卵形細胞を哺乳動物から分離及び／又は取得する。得られた肝臓卵形細胞を、成長因子及び細胞外マトリックスの存在下で培養することを含む、肝臓卵形細胞の単一細胞培養方法。
【解決手段】ＣＤ１３３、ＣＤ４５及びＴｅｒ１１９の発現を調べる工程を含む、哺乳動物から肝臓卵形細胞を分離及び／又は取得する方法、特にＣＤ１３３、ＣＤ４５及びＴｅｒ１１９の３つの細胞表面マーカーをＣＤ１３３＋、ＣＤ４５−及びＴｅｒ１１９−のパターンで呈する肝臓卵形細胞を哺乳動物から分離及び／又は取得する。得られた肝臓卵形細胞を、成長因子及び細胞外マトリックスの存在下で培養することを含む、肝臓卵形細胞の単一細胞培養方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は肝臓の卵形細胞を分離・取得するための方法に関する。より詳細には、本発明は、卵形細胞に特徴的な表現型に基づいて、卵形細胞を選別・分離・取得する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
肝臓は、増殖する細胞区画に応じて２つの異なる方法で再生することができる。部分的な肝切除（ヘパテクトミー：ＰＨ）あるいは化学的な傷害の後に、残った肝組織中の細胞、特に肝臓細胞が迅速に増殖しいかなる肝臓幹細胞や前駆細胞からの寄与もなく無くした細胞を回復することができる。しかしながら、肝臓細胞の増殖が、何らかの慢性的な傷害によって損なわれた場合には、再生のためのシグナルが、肝小葉の門脈周辺に「卵形細胞（oval cell）」と称される小さな上皮細胞の出現を引き起こす。ダメージを受けた肝臓を再生するために劇的に増殖する能力を有すること、及び肝細胞や胆管上皮細胞へと分化する能力を有することから、卵形細胞は、一過的に増幅する肝臓前駆細胞であると考えられている（非特許文献１）。
【０００３】
遠心分離水簸ならびに肝臓実質細胞及び肝臓非実質細胞の種々の特徴についての組織化学的解析により卵形細胞が単離され得ることが報告されている（非特許文献２）。密度勾配遠心法をパンニングあるいはフローサイトメトリーを用いた細胞ソーティングと組み合わせて、さらに卵形細胞を濃縮し、それらのインビトロあるいはインビボでの増殖能及び分化能が調べられている（非特許文献３、４）。これらの手法により単離された細胞集団は非常に多くの卵形細胞を含有するものであったが、依然として他の系列の細胞が混じったものであり、卵形細胞のみを特異的に分離する方法が求められている。
【０００４】
本発明者ら、並びに他の研究者らによって、発生中のマウスの肝臓から肝幹細胞及び前駆細胞を生成するための戦略が報告されている（非特許文献５〜７）が、肝臓卵形細胞のみを他の細胞から完全に引き離して解析することができず、卵形細胞の多能性や組織再構築能を実験的に証明することは困難であった。
【非特許文献１】Fausto N, Campbell JS. The role of hepatocytes and oval cells in liver regeneration and repopulation. Mech Dev 2003; 120: 117-130.
【非特許文献２】Yaswen P, Hayner NT, Fausto N. Isolation of oval cells by centrifugal elutriation and comparison with other cell types purified from normal and preneoplastic livers. Cancer Res 1984; 44: 324-331.
【非特許文献３】Germain L, Noel M, Gourdeau H, et al. Promotion of growth and differentiation of rat ductular oval cells in primary culture. Cancer Res 1988; 48: 368-378.
【非特許文献４】Wang X, Foster M, Al-Dhalimy M, et al. The origin and liver repopulating capacity of murine oval cells. Proc Natl Acad Sci USA 2003; 100 Suppl 1: 11881-11888.
【非特許文献５】Suzuki A, Zheng YW, Kondo R, et al. Flow cytometric separation and enrichment of hepatic progenitor cells in the developing mouse liver. Hepatology 2000; 32: 1230-1239.
【非特許文献６】Suzuki A, Zheng YW, Kaneko S, et al. Clonal identification and characterization of self-renewing pluripotent stem cells in the developing liver. J Cell Biol 2002; 156: 173-184.
【非特許文献７】Tanimizu N, Nishikawa M, Saito H, et al. Isolation of hepatoblasts based on the expression of Dlk/Pref-1. J Cell Sci 2003; 116: 1775-1786.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は肝臓から肝臓卵形細胞を単離・同定する方法を提供することを目的とする。さらに本発明は、肝臓卵形細胞を単一細胞培養する方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、上記課題に鑑み、鋭意検討を行った結果、三種類の細胞表面マーカーの発現状況、具体的にはＣＤ１３３、ＣＤ４５及びＴｅｒ１１９の三種類の細胞表面マーカーの発現状況を調べることによって、肝臓の卵形細胞を高度に分離・取得し得ることを見出し、さらに卵形細胞のクローナルな培養条件を見出して本発明を完成するに至った。すなわち本発明は以下の通りである。
【０００７】
［１］ＣＤ１３３、ＣＤ４５及びＴｅｒ１１９の発現を調べる工程を含む、哺乳動物から肝臓卵形細胞を分離及び／又は取得する方法。
［２］ＣＤ１３３を発現し、ＣＤ４５及びＴｅｒ１１９を発現していない細胞を選別する工程をさらに含む、上記［１］記載の方法。
［３］肝臓卵形細胞の産生を誘導する工程をさらに含む、上記［１］又は［２］記載の方法。
［４］肝臓卵形細胞を成長因子及び細胞外マトリックスの存在下で培養する工程をさらに含む、上記［１］〜［３］のいずれかに記載の方法。
［５］成長因子が、ＨＧＦ及び／又はＥＧＦである、上記［４］記載の方法。
［６］細胞外マトリックスがコラーゲン又はラミニンである、上記［４］記載の方法。
［７］上記［１］〜［６］のいずれかに記載の方法によって哺乳動物の肝臓から分離及び／又は取得される肝臓卵形細胞。
［８］ＣＤ１３３、ＣＤ４５及びＴｅｒ１１９の３つの細胞表面マーカーをＣＤ１３３＋、ＣＤ４５−及びＴｅｒ１１９−のパターンで呈する、肝臓卵形細胞。
［９］哺乳動物の肝臓における分化に影響を及ぼす物質をスクリーニングするための方法であって、以下の工程を含む方法；
(1)肝臓卵形細胞と被検物質とを反応させる工程、
(2)反応後の細胞について肝臓マーカーの発現を測定する工程。
【発明の効果】
【０００８】
肝幹／前駆細胞の最有力候補である卵形細胞は、存在頻度が低いため、通常の細胞分離法では純化することができず、他の細胞が混在した状況でしか解析することができなかった。そのため卵形細胞を成体肝幹/前駆細胞とする実験的証拠はこれまで存在しなかった。卵形細胞の細胞表面に特異的に発現する抗原分子を指標にして卵形細胞を分離・回収する本発明の方法、及び当該卵形細胞の単一細胞培養によって卵形細胞に対する極めて精度の高い機能解析が可能となる。
ヒト肝臓組織、特に、癌等の病態で卵形細胞様の細胞を解析することによって、癌幹細胞としての性質を調べることが可能となる。また、卵形細胞を肝幹／前駆細胞として用いることにより、肝臓における分化を誘導する物質のスクリーニング方法の確立が可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
文中で特に断らない限り、本明細書で用いるすべての技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者に一般に理解されるのと同じ意味をもつ。本明細書に記載されたものと同様又は同等の任意の方法及び材料は、本発明の実施又は試験において使用することができるが、好ましい方法及び材料を以下に記載する。本明細書で言及したすべての刊行物及び特許は、例えば、記載された発明に関連して使用されうる刊行物に記載されている、構築物及び方法論を記載及び開示する目的で、参照として本明細書に組み入れられる。
【００１０】
本発明の取得方法及び培養方法の対象となる肝臓卵形細胞は、任意の哺乳動物の肝臓に由来する。ここで「哺乳動物」とは、具体的にはヒトをはじめウシ、ウマ、イヌ、モルモット、マウス、ラット等が挙げられる。好ましくはヒトであるが、基礎医学的研究の見地からは、マウスやラット等の実験動物としてよく用いられる動物も又、好ましい。
【００１１】
本発明の肝臓卵形細胞は、任意の哺乳動物の肝臓に由来するが、好ましくは肝臓卵形細胞の産生を誘導するような処理が施された肝臓に由来する。肝臓卵形細胞の産生を誘導するような処理としては、例えば３，５−ジエトキシカルボニル−１，４−ジヒドロコリジン（ＤＤＣ）を含む飼料をマウスに与えることによって、マウスの肝臓内で卵形細胞を産生、増殖させることができる（ＤＤＣモデル）。又、発癌剤の一種である２−アセチルアミノフルオレン（２−ＡＡＦ）を投与した後に部分肝切除を行なったラットにおいても、卵形細胞の出現が報告されている（２−ＡＡＦ／ＰＨモデル）。
肝臓、好ましくはＤＤＣを摂食させたマウス等の肝臓は、取り出し細かく切り刻んで、振動等の物理的な手段によって、ＥＧＴＡあるいはＥＤＴＡ等を用いた化学的な処理によって、あるいはコラゲナーゼ、トリプシン、キモトリプシン、ペプシン、ジスパーゼ等のプロテアーゼを用いた酵素的な処理によって細胞を分散することによって単一細胞懸濁液としてから、後述する細胞表面マーカー（ＣＤ１３３、ＣＤ４５及びＴＥＲ１１９）の発現を調べる工程を行なう。
【００１２】
本発明は、ＣＤ１３３、ＣＤ４５及びＴＥＲ１１９の発現を調べる工程を含む、哺乳動物から肝臓卵形細胞を分離及び／又は取得する方法を提供する。ＣＤ１３３（プロミニン−１としても知られている）蛋白質は、５回膜貫通型の糖蛋白質であって、造血幹細胞、前駆細胞のマーカーであると同時に、近年、神経系腫瘍、前立腺癌、大腸癌の癌幹細胞マーカーの一つであることが報告されている。ＣＤ４５は、白血球共通抗原の１種で、赤血球、血小板およびそれらの前駆細胞を除く、すべての造血性細胞に発現していることが知られている。ＴＥＲ１１９は、赤血球系細胞を選別するための有効な細胞表面マーカーであることが知られている。
本発明はこれらの蛋白質またはそれをコードする遺伝子が肝臓卵形細胞においては特有の発現様式を示すという新たな知見に基づいている。
【００１３】
本明細書中、「マーカー」とは特にことわりのない限り、このような肝臓卵形細胞に特有な発現様式を示す一連の蛋白質又はそれをコードする遺伝子から構成される群の各々を意味する。かかるマーカー蛋白質は哺乳動物の種類等によってそのアミノ酸配列が異なる場合があり、本発明においてはその肝臓卵形細胞における発現様式が同じである限り、そのような蛋白質もマーカー蛋白質として使用することができ、本発明の範囲内である。具体的には、それぞれの蛋白質についてアミノ酸配列で４０％以上、好ましくは５０％以上、より好ましくは７０％以上の相同性を有するホモローグも本発明のマーカー蛋白質、すなわちＣＤ１３３、ＣＤ４５及びＴＥＲ１１９として用いることができる。本発明はこれらのマーカー蛋白質及び／またはそれをコードする遺伝子の発現状況を、各マーカー蛋白質またはそれをコードする遺伝子と特異的な親和性を有する物質を用いてそれらの発現を調べる工程を含む。
【００１４】
本明細書中、「用いて」という用語について、その方法は特に限定されず、具体的には、例えばマーカー蛋白質と特異的親和性を有する物質を用いる場合であれば該マーカー蛋白質の抗体との抗原抗体反応を利用する方法が挙げられ、又、マーカー蛋白質をコードする遺伝子と特異的親和性を有する物質を用いる場合であればハイブリダイゼーション反応を利用する方法が挙げられる（詳細な手順については後述する）。
【００１５】
マーカー蛋白質と特異的な親和性を有する物質としては例えば当該蛋白質に特異的親和性を有する抗体またはその断片が挙げられ、その特異的親和性とは抗原・抗体反応により該蛋白質を特異的に認識し、結合する能力のことである。該抗体またはその断片は、当該蛋白質と特異的に結合可能なものであれば特に限定されず、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体およびそれらの機能的断片のいずれであってもよい。これらの抗体あるいはその機能的断片は、通常当分野で行なわれている方法によって製せられる。例えばポリクローナル抗体を用いる場合であれば、該蛋白質をマウスやウサギといった動物の背部皮下あるいは腹腔内あるいは静脈等に注射して免疫し、抗体価が上昇するのを待った後に抗血清を採取する方法が挙げられ、またモノクローナル抗体を用いる場合であれば、常法に従いハイブリドーマを作製して、その分泌液を採取する方法が挙げられる。抗体断片を製造する方法としてはクローニングした抗体遺伝子断片を微生物等に発現させる方法がよく用いられている。当該抗体、抗体断片等の純度は、当該蛋白質との特異的親和性を保持している限り、特に限定されない。これらの抗体またはその断片は、蛍光物質、酵素やラジオアイソトープ等で標識されていてもよい。好ましくは、蛍光物質で標識されている抗体またはその断片である。
さらに、これらは市販されているものを用いても良い。
【００１６】
マーカー蛋白質をコードする遺伝子と特異的な親和性を有する物質としては、例えば当該遺伝子に特異的親和性を有するオリゴまたはポリヌクレオチドプローブ（以下、便宜上単にプローブともいう）、ならびにオリゴまたはポリヌクレオチドプライマー対（以下、便宜上単にプライマー対ともいう）が挙げられ、その特異的親和性とは、目的の遺伝子にのみハイブリダイズする性質を意味し、従って当該遺伝子の全部もしくは一部に完全相補的なものか、もしくは上記性質を満たす範囲で１乃至数個のミスマッチを含んでいても良い。該プローブ、プライマー対は、当該遺伝子に特異的親和性を有するものであれば特に限定されないが、例えば当該遺伝子の塩基配列の全部もしくは一部、ならびにそれらの相補配列を含むオリゴまたはポリヌクレオチド等が挙げられ、検出すべき遺伝子の形態に応じて適宜選択する。当該オリゴまたはポリヌクレオチドは当該遺伝子との特異的親和性を有している限りはその由来は特に限定されず、合成されたものであっても、当該遺伝子から必要な部分を切り出し、通常行なわれる方法によって精製されたものであってもよい。これらのオリゴまたはポリヌクレオチドは、蛍光物質、酵素やラジオアイソトープ等で標識されていてもよい。
【００１７】
本発明の肝臓卵形細胞を分離及び／又は取得する方法は、上記三種類のマーカー蛋白質又はそれをコードする遺伝子とそれぞれ特異的親和性を有する物質を用いてそれらのマーカーの発現状況を解析することにより実施される。かかる解析によりＣＤ１３３＋、ＣＤ４５−及びＴｅｒ１１９−［ＣＤ１３３発現、ＣＤ４５非発現、ＴＥＲ１１９非発現］という特徴を有する細胞を分離することによって、哺乳動物由来の肝臓卵形細胞を得ることができる。すなわち、本発明において分離及び／取得の対象となる、あるいは単一細胞培養の対象となる肝臓卵形細胞は、ＣＤ１３３、ＣＤ４５及びＴｅｒ１１９の３つの細胞表面マーカーをＣＤ１３３＋、ＣＤ４５−及びＴｅｒ１１９−のパターンで呈する。ここで「呈する」とは、それぞれのマーカー蛋白質またはそれをコードする遺伝子を「発現している」あるいは「発現していない」という特徴を有していることを意味する。
【００１８】
各特異的親和性を有する物質を用いて、それぞれのマーカー発現のパターンを呈する細胞を選別、分離する方法は、通常、当分野で行われている方法及びそれらを組み合わせた方法が用いられる。例えば、蛋白質レベルでマーカーを解析する場合、特に細胞を生きた状態で回収する必要性がある場合には、当該物質を標識するための色素を適宜選択して、フローサイトメトリーを利用する方法が好都合である。より好適には、蛍光活性化セルソーター（ＦＡＣＳ：fluorescence-activated cell sorter）を用いて、細胞を分離する。当該装置を用いることにより、目的とする細胞を自動で分離、回収することができる。
同定する場合等、生細胞としての回収が特に必要でない場合には、細胞を破砕し抽出してｍＲＮＡを回収し、ノザンブロットを行ってもよいし、また膜蛋白質を抽出してウエスタンブロットを行うこともできる。
【００１９】
本発明においては、本発明の肝臓卵形細胞の分離及び／又は取得方法を用いて、哺乳動物の肝臓卵形細胞を得ることができる。かかる卵形細胞は、適当な培養条件下で単一細胞培養することができ、さらに生理学的機能を有する細胞、即ち成熟した肝細胞及び胆管上皮細胞へと分化し得る。ここで「適当な培養条件」とは、成長因子及び細胞外マトリックスが存在する培養条件を意味し、例えば、成長因子として肝臓細胞成長因子（hepatocyte growth factor, HGF）及び／又は上皮成長因子（epidermal growth factor, EGF）等のサイトカイン、及び細胞外マトリックスとしてコラーゲン（例えばＩＶ型コラーゲン）又はラミニンを用いた培養条件を意味する。例えば、ＨＧＦ及びＥＧＦを含有する、Suzuki A, Zheng YW, Kondo R, et al. Flow cytometric separation and enrichment of hepatic progenitor cells in the developing mouse liver. Hepatology 2000; 32: 1230-1239.（非特許文献５）に記載の標準培地を好ましく用いることができる。培地中の成長因子の濃度は、肝臓卵形細胞の単一細胞培養及び分化誘導が可能な範囲であれば特に限定されず、また、用いる成長因子の種類によっても異なるが、ＥＧＦの場合には、１０〜４０ｎｇ／ｍＬ、好ましくは２０ｎｇ／ｍＬ程度であり、ＨＧＦの場合には、４０〜８０ｎｇ／ｍＬ、好ましくは５０ｎｇ／ｍＬ程度である。本発明で用いるＥＧＦ及びＨＧＦ等の成長因子は肝臓卵形細胞の単一細胞培養及び分化誘導が可能な限り、その由来は特に限定されず、天然由来のものであっても公知の遺伝子配列やアミノ酸配列等の情報に基づいて合成又は半合成して製造されるものであってもよい。商業的に入手可能なものであってもよい。肝臓卵形細胞の単一細胞培養及び分化誘導が可能な範囲で、ＥＧＦ及びＨＧＦ等の成長因子は改変されたものであってもよい。このような改変には、１個又は複数個のヌクレオチドあるいはアミノ酸の変異、挿入、欠失及び置換が含まれる。改変された成長因子は、当分野で通常実施される手段によって調製することができる。例えば、エキソヌクレアーゼを用いる欠失変異株（ｄｅｌｅｔｉｏｎ ｍｕｔａｎｔ）作製法、カセット変異法等の部位特異的変異（ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）によって成長因子のＤＮＡを人為的に改変させ、該改変ＤＮＡを用いて、所望蛋白質を調製することができる。
【００２０】
本発明において、細胞外マトリックスは、培養容器のコーティング剤として用いられることが好ましく、又簡便である。細胞の培養に用いられる培養容器は、細胞の培養が可能なものであれば特に限定されないが、例えば、フラスコ、組織培養用フラスコ、ディッシュ、ペトリデッシュ、組織培養用ディッシュ、マルチディッシュ、マイクロプレート、マイクロウエルプレート、マルチプレート、マルチウエルプレート、チャンバースライド、シャーレ、チューブ、トレイ、培養バック、ローラーボトルが挙げられる。
【００２１】
細胞外マトリックスによる培養容器のコーティングは、用いる細胞外マトリックスの種類に応じて当分野で通常実施されている方法によって行なうことができる。
【００２２】
その他の培養条件は、適宜設定できる。例えば、培養温度は、特に限定されるものではないが約３０〜４０℃、好ましくは約３７℃である。ＣＯ２濃度は、例えば約１〜１０％、好ましくは約２〜５％である。
【００２３】
本発明において、肝臓卵形細胞の単一細胞培養は、例えば、肝臓細胞懸濁液から、ＦＡＣＳ等の細胞分離技術を用いて分離した、ＣＤ１３３＋、ＣＤ４５−及びＴｅｒ１１９−という細胞表面マーカーの発現パターンを呈する細胞を、９６ウェルプレート等の各ウェルに１つずつ播種し、適当な培養条件下（上述）で培養することによって実施される。
【００２４】
また、肝臓卵形細胞は、適当な培養条件で培養すると、その子孫として、分化した細胞、即ち成熟した肝細胞及び胆管上皮細胞を産生する。肝臓卵形細胞の培養により産生される細胞が分化した細胞（成熟肝細胞及び胆管上皮細胞）であるか否かは、各細胞に特異的に発現している成分を該成分に特異的な親和性を有する物質を用いて検出することによって、あるいは分泌成分を直接解析することによって判定することができる。また形態学的な観察によって判定することができる場合もある。例えば、成熟肝細胞であるか否かは、アルブミン産生能の有無、グリコーゲン蓄積能の有無等を調べることによって、また、胆管上皮細胞であるか否かは、胆管様の管構造の有無、ケラチン産生能の有無等を調べることによって判断することができる。「特異的な親和性を有する物質」としては、各分泌成分に特異的親和性を有する抗体又はその断片や、各分泌成分をコードする遺伝子に特異的親和性を有するオリゴ又はポリヌクレオチドプローブが挙げられる。「抗体又はその断片」及び「オリゴ又はポリヌクレオチドプローブ」の詳細は上記に準じる。
成熟肝細胞に関しては、そのグリコーゲンの蓄積能から、ＰＡＳ染色やアルシアンブルー染色等の染色法によっても判定することもできる。
【００２５】
本発明はさらに、本発明の肝臓卵形細胞を用いて、肝臓卵形細胞の分化に影響を及ぼす物質のスクリーニング方法を提供する。当該方法は少なくとも以下の工程を含む。
(1)肝臓卵形細胞と被検物質とを反応させる工程。
(2)反応後の細胞について肝臓マーカーの発現を測定する工程。
本スクリーニング方法で使用する肝臓卵形細胞は、肝臓の機能細胞へと分化する細胞であれば特に限定されず、好ましくは上述の本発明の方法で分離された肝臓卵形細胞である。該卵形細胞と被検物質との反応は、所望とする分化の種類、分化誘導条件等に応じて適宜設定されるが、通常、３５〜４０℃、数分〜数十日、好ましくは、３６．５〜３７．５℃、５〜３０日間培養する。被検物質との反応後、該卵形細胞の分化の有無、状況を調べる。
【００２６】
肝臓卵形細胞が分化したか否かは、その肝臓のマーカーの発現を測定することにより確認することができる。当該マーカーは所望する機能細胞によって適宜選択される。例えば上述のように、成熟肝細胞への分化であればアルブミン産生、グリコーゲン蓄積を調べることにより、胆管上皮細胞への分化であればケラチン産生等を調べることにより確認できる。被検物質非存在下で肝臓卵形細胞を培養した場合に比べ有意にその肝臓機能細胞への分化を促進あるいは阻害する物質を選抜する。
【００２７】
本発明のスクリーニング方法においてその対象となる被検物質としては、既知もしくは未知の種々の物質が挙げられ、具体的には既知のサイトカイン、細胞外マトリクス、無機化合物あるいは適当な細胞培養株の培養上清や適当なｃＤＮＡライブラリーより得た未知の遺伝子またはそのリコンビナント蛋白質等が例示される。
【００２８】
さらに、形質転換された卵形細胞がげっ歯類及びヒトの両方で肝癌の起源の候補となり得ることが報告されている（参考文献１〜５）ことから、本発明の肝臓卵形細胞を用いて、肝臓における癌発生に影響を及ぼす物質をスクリーニングすることが可能となる。
参考文献１：Factor VM, Radaeva SA. Oval cells-hepatocytes relationships in Dipin-induced hepatocarcinogenesis in mice. Exp Toxicol Pathol 1993; 45: 239-244.
参考文献２：Lowes KN, Brennan BA, Yeoh GC, et al. Oval cell numbers in human chronic liver diseases are directly related to disease severity. Am J Pathol 1999; 154: 537-541.
参考文献３：Prior P. Long-term cancer risk in alcoholism. Alcohol Alcohol 1988; 23: 163-171.
参考文献４：Tsukuma H, Hiyama T, Tanaka S, et al. Risk factors for hepatocellular carcinoma among patients with chronic liver disease. N Engl J Med 1993; 328: 1797-1801.
参考文献５：Deugnier YM, Guyader D, Crantock L, et al. Primary liver cancer in genetic hemochromatosis: a clinical, pathological, and pathogenetic study of 54 cases. Gastroenterology 1993; 104: 228-234.
【実施例】
【００２９】
以下、実施例にそって本発明をさらに詳細に説明するが、これら実施例は本発明の範囲を何ら限定するものではない。また、本発明において使用する試薬や装置、材料は特に言及されない限り、商業的に入手可能である。
【００３０】
（材料と方法）
フローサイトメトリー
卵形細胞を含む細胞懸濁液を、0.1% ＤＤＣ(Sigma-Aldrich)を含む、あるいは含まない飼料で２週間飼育したＣ５７ＢＬ／６野生型マウスあるいはｐ５３−／−マウス（参考文献６）から調製し、続いて以下に示す二重プロテアーゼ消化プロトコルを行なった。肝灌流培地(liver perfusion medium; Invitrogen)及び肝臓細胞分離液(liver digest medium ; Invitrogen)を用いた通常の２工程の灌流の後、未消化の組織をさらにジスパーゼ(1000プロテアーゼ単位/mL; Godoshusei, Japan)を用いて３７℃で３０〜６０分間攪拌しながら消化した。処理後の細胞の生存度は、トリパンブルー色素排除法を用いた解析で９０％を上回っていた。細胞を染色培地(staining medium ; 3%ＦＢＳを含有するＰＢＳ)で洗浄し、次いで、参考文献７に記載の方法に従って蛍光標識した抗体とインキュベートした。フィコエリトリン（ＰＥ）−Ｃｙ７がコンジュゲートされた抗ＣＤ４５モノクローナル抗体及び抗Ｔｅｒ１１９モノクローナル抗体（ｍＡｂ）(Pharmingen)及びフルオロセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）がコンジュゲートされた抗ＣＤ１３３モノクローナル抗体(eBioscience)を用いた。ＦＡＣＳ Ａｒｉａ(BD Biosciences)を用いて、蛍光標識された細胞を解析・分離した。
参考文献６：Tsukada T., et al. Enhanced proliferative potential in culture of cells from p53-deficient mice. Oncogene 1993; 8: 3313-3322.
参考文献７：Suzuki A., et al. Clonal identification and characterization of self-renewing pluripotent stem cells in the developing liver. J Cell Biol 2002; 156: 173-184.
【００３１】
インビトロコロニーアッセイ
低密度培養解析のために、ソートされた細胞を、ＩＶ型コラーゲンをコートした６ウェルプレート(BD Biosciences)に１０００細胞／ウェルの密度で播種し、参考文献８に記載の標準培地を用いて培養した。単一細胞培養解析のために、ＦＡＣＳ Ａｒｉａによるクローン選別で同定された細胞を、ＩＶ型コラーゲンをコートした９６ウェルプレート(BD Biosciences)の個々のウェル中で培養した。培養液としては、Ｅ１３．５胎仔の肝臓細胞を７日間培養することによって得られた馴化培地を５０％添加した標準培地（上述）を用いた。いずれの培養液にもヒト組換えＨＧＦ(50 ng/ml, Sigma-Aldrich)及びＥＧＦ(20 ng/ml, Sigma-Aldrich)が含まれている。形成される大コロニー及び小コロニーの数を、培養８日後に測定した。
参考文献８：Suzuki A., et al. Flow cytometric separation and enrichment of hepatic progenitor cells in the developing mouse liver. Hepatology 2000; 32: 1230-1239.
【００３２】
遺伝子発現解析
ＲＴ−ＰＣＲ及び定量ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）は、参考文献９及び参考文献１０に準じて行なった。下記のプライマー及び／又はプローブ以外は、本発明者らの既報（参考文献７〜９）に準じて各種のＰＣＲプライマー及びプローブを調製した。
ＣＫ７ ＲＴ−ＰＣＲプライマー：
5’-ATC CGC GAG ATC ACC ATC AAT-3’（配列番号１）及び
5’-ATG TGT CTG AGA TCT GCG ACT-3’（配列番号２）
ＣＤ１３３ ｑＰＣＲプライマー／プローブ：
TaqMan Gene Expression Assay ID: Mm00477115_m1 (Applied Biosystems)
ＣＫ７ ｑＰＣＲプライマー／プローブ：
TaqMan Gene Expression Assay ID: Mm00466676_m1 (Applied Biosystems)
参考文献９：Suzuki A., et al. Role for growth factors and extracellular matrix in controlling differentiation of prospectively isolated hepatic stem cells. Development 2003; 130: 2513-2524.
参考文献１０：Suzuki A., et al., Glucagon-like peptide 1 (1-37) converts intestinal epithelial cells into insulin-producing cells. Proc Natl Acad Sci USA 2003; 100: 5034-5039.
【００３３】
免疫染色
組織切片及び培養細胞を固定し、１次抗体とインキュベートした。用いた１次抗体やその入手先、反応条件等を図１にまとめる。１次抗体とのインキュベーション後、切片及び／又は細胞を洗浄し、免疫組織化学のためには、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）をコンジュゲートした２次抗体（用いた１次抗体の種に応じて決定される、１：５００、Dako）と、免疫蛍光染色のためには、Ａｌｅｘａ ４８８−及び／又はＡｌｅｘａ ５５５をコンジュゲートした２次抗体（用いた１次抗体の種に応じて決定される、１：２００、Molecular Probes）及びＤＡＰＩを用いた。
【００３４】
細胞移植
ＤＤＣで処理した肝臓から単離されたＣＤ１３３＋ＣＤ４５−Ｔｅｒ１１９−の表現型を呈する単一細胞を培養・増殖して得られるクローン性の子孫をトリプシン処理し、洗浄し、そして100mlの標準培地に再懸濁した。得られた細胞懸濁液をＦＡＨ欠損レシピエントマウス（後述）の肝臓に脾臓内投与した(４×１０６細胞／マウス)。ＣＤ１３３＋ＣＤ４５−Ｔｅｒ１１９−の表現型を各々呈するクローンを１２個樹立した。そのうち３個のクローンをドナー細胞として移植に用いた（レシピエントのマウスは１クローンにつき６匹用いた）。ＦＡＨ欠損マウスは通常、7.5 mg/lのNTBC (K. Z. Travis氏及びJ. Doe氏より供与された)を含有する飲料水で飼育していた（参考文献１１）が、移植直後にこの処置を止めた。腫瘍形成の解析のためには、ＤＤＣを含む飼料で飼育した野生型マウス及びｐ５３−／−マウスの肝臓から単離されたＣＤ１３３＋ＣＤ４５−Ｔｅｒ１１９−の表現型を呈する単一細胞を培養・増殖して得られるクローン性の子孫をトリプシン処理し、洗浄し、マトリゲル(150ml, BD Biosciences)を含む標準培地(150ml)に再懸濁し、得られた細胞懸濁液をＮＯＤ／ＳＣＩＤレシピエントマウスに皮下注射した(３．５×１０７細胞／マウス、ｎ＝５)。
参考文献１１：Overturf K., et al., Hepatocytes corrected by gene therapy are selected in vivo in a murine model of hereditary tyrosinaemia type I. Nat Genet 1996; 12: 266-273.
【００３５】
マイクロアレイ
ＤＤＣを含まない飼料、あるいは２週間ＤＤＣを含む飼料で飼育したマウスの肝臓から、全ＲＮＡを、RNeasy Mini Kit (Qiagen)を用いて、製造元の指示書に従って調製した。ＤＤＣを含まない飼料、あるいはＤＤＣを含む飼料で飼育したマウスの肝臓における複数の遺伝子発現をOne-Cycle Target Labeling and Control Reagents (Affymetrix)及びGeneChip Mouse Genome 430 2.0 Arrays (Affymetrix)を用いてGeneChip Expression Analysis Technical Manual (Affymetrix)に従って解析した。
【００３６】
ＦＡＨ変異マウスの作製
参考文献１２〜１５に従い、ＴＴ２胚性幹（ＥＳ）細胞における相同組換えによってマウスＦＡＨの標的破壊を行った。ＰＣＲを行ってターゲティングベクター配列の５’アーム(8.2kb)及び３’アーム(5.1kb)を増幅した。用いたプライマーは以下の通り。
５’アーム用プライマー：
5’-GTT TGA GTC GAC CCA ACA AGG ATT ACA TGA GAC CGC C-3’（配列番号３）
5’-TAA GGC GGC CGC GGA TGC TCT TGC CTC CTT CCA TG-3’（配列番号４）
３’アーム用プライマー：
5’-TGC CTC GTC GAC GCG GCC GCG CTG TGA TTG CAT GTG TGA CCT TCC-3’（配列番号５）
5’-CAC CCT CGA GTT AGA CCT GCA GAT GGT AGC CGC C-3’（配列番号６）
ＦＡＨ変異マウス（ヌルアレル）を作製する為の手順を図２Ａに示す。
ＣＤ−１系ホストの胚盤胞にターゲティングされたＥＳ細胞を注入することによって生殖系列のキメラを作製した（参考文献１４）。ＰＣＲによりジェノタイピングを行なった。用いたプライマーは以下の通り。
FAHwt-F: 5’-AGG CCT AAC CTC TTG CTT CAT TCA-3’（配列番号７）
FAHmut-F: 5’-CCA GCT CAT TCC TCC CAC TC-3’（配列番号８）
FAHwt/mut-R; 5’-ATC GGG GTT CCA GAT ACC AC-3’（配列番号９）
野生型にはFAHwt-F及びFAHwt/mut-Rを用い809bpを検出した。
変異型にはFAHmut-F及びFAHwt/mut-Rを用い433bpを検出した。
（図２Ｃ参照）
尚、ＦＡＨ変異体のアクセッション番号（ＲＩＫＥＮ）はＣＤＢ０２０１Ｋである。
参考文献１２：Yagi T., et al. Homologous recombination at c-fyn locus of mouse embryonic stem cells with diphtheria toxin A fragment gene in negative selection. Proc Natl Acad Sci USA 1990; 87: 9918-9922.
参考文献１３：Yagi T., et al. A novel negative selection for homologous recombinants using diphtheria toxin A fragment gene. Anal Biochem 1993; 214: 77-86.
参考文献１４：Yagi T, Tokunaga T, Furuta Y, et al. A novel ES cell line, TT2, with high germline-differentiating potency. Anal Biochem 1993; 214: 70-76.
参考文献１５：Murata T., et al. ang is a novel gene expressed in early neuroectoderm, but its null mutant exhibits no obvious phenotype. Gene Expr Patterns 2004; 5: 171-178.
【００３７】
実施例１：胆管上皮細胞及びＤＤＣで誘導された卵形細胞におけるＣＤ１３３の発現
ＤＤＣを２週間摂食させたマウス（以下ＤＤＣマウスともいう）の肝臓で卵形細胞が生じることを、卵形細胞の特異抗原であるＡ６の免疫組織学的解析によって確認した（図３Ａ）。細胞表面マーカーが卵形細胞上に発現していることを同定する為に、本発明者らは、ＤＤＣを摂食させていないマウス（以下Ｎｏ−ＤＤＣマウスともいう）の肝臓とＤＤＣマウスの肝臓における遺伝子発現をマイクロアレイによって比較した。本解析により、ＤＤＣマウスの肝臓では、サイトケラチン（ＣＫ）１９、α−フェトプロテイン（ＡＦＰ）及びＣＤ３４のより高い発現と、それよりは幾分低いｃ−ｋｉｔ及びＴｈｙ１の発現が確認された。これらの遺伝子はそれぞれ、卵形細胞マーカーとして以前に明らかにされたものである（参考文献１６〜２０）。これらのマーカー遺伝子に加えて、ＣＤ１３３の発現量がＤＤＣマウスの肝臓で４倍以上増加していた（図３Ｂ）。続いて、定量ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）解析を行なって、ＤＤＣを含む飼料で飼育している間中、ＣＤ１３３の発現量が上昇すること、及び卵形細胞マーカーであるＣＫ１９、ＣＫ７及びＡＦＰの発現も上昇することを確認した（図４Ａ）。ＣＤ１３３タンパク質それ自体もまた、ＤＤＣマウスの肝臓中に蓄積していた（図４Ｂ）。興味深いことは、ＣＤ１３３、ＣＫ１９及びＣＫ７のｍＲＮＡの発現レベルがＤＤＣを含む飼料で飼育して、即ちＤＤＣを摂食させて２週間後の時点で同時にピークを迎えるのに対して、ＡＦＰのレベルは、ＤＤＣの摂食を開始してから１週間までに速やかに上昇することである（図４Ａ）。免疫蛍光染色による解析により、Ｎｏ−ＤＤＣマウスの肝臓の胆管上皮細胞及びＤＤＣマウスの肝臓中で増殖している卵形細胞の両方について、ＣＤ１３３が陽性であることがわかった（図４Ｃ〜Ｄ）。以上の結果から、ＣＤ１３３はＤＤＣを摂食させていないマウスの肝臓の胆管上皮細胞及びＤＤＣを摂食させることによって出現する卵形細胞の両方のマーカーとなり得ることが示された。
参考文献１６：Lemire JM, Shiojiri N, Fausto N. Oval cell proliferation and the origin of small hepatocytes in liver injury induced by D-galactosamine. Am J Pathol 1991; 139: 535-552.
参考文献１７：Fujio K, Evarts RP, Hu Z, et al. Expression of stem cell factor and its receptor, c-kit, during liver regeneration from putative stem cells in adult rat. Lab Invest 1994; 70: 511-516.
参考文献１８：Omori N, Omori M, Evarts RP, et al. Partial cloning of rat CD34 cDNA and expression during stem cell-dependent liver regeneration in the adult rat. Hepatology 1997; 26: 720-727.
参考文献１９：Petersen BE, Goff JP, Greenberger JS, et al. Hepatic oval cells express the hematopoietic stem cell marker Thy-1 in the rat. Hepatology 1998; 27: 433-445.
参考文献２０：Matsusaka S, Tsujimura T, Toyosaka A, et al. Role of c-kit receptor tyrosine kinase in development of oval cells in the rat 2-acetylaminofluorene/partial hepatectomy model. Hepatology 1999; 29: 670-676.
【００３８】
実施例２：フローサイトメトリーを用いたＣＤ１３３＋細胞の単離
ＣＤ１３３＋肝臓細胞を単離するために、Ｎｏ−ＤＤＣマウスの肝臓及びＤＤＣマウスの肝臓から得られた単一細胞を、ＣＤ１３３、ＣＤ４５（白血球共通抗原）及びＴｅｒ１１９（グリコホリンによく似た分子で未成熟な赤血球系細胞上に独占的に発現している）の発現に基づきフローサイトメトリーを用いて分画した。非造血系のＣＤ４５−Ｔｅｒ１１９−細胞集団中のＣＤ１３３＋細胞の割合はＤＤＣを摂食させなかったマウスの肝臓に比べＤＤＣを摂食させたマウスの肝臓の方が５倍以上も高かった（図５Ａ）。ＤＤＣマウスの肝臓中でのＣＤ４５＋及びＴｅｒ１１９＋造血系細胞の割合の増加は、ＤＤＣによって引き起こされる炎症反応の増強に関係しているかもしれない。Ｎｏ−ＤＤＣマウスの肝臓及びＤＤＣマウスの肝臓からすぐに単離したＣＤ１３３＋ＣＤ４５−Ｔｅｒ１１９−細胞の免疫蛍光染色解析から、全細胞で、ＣＫ７の発現は認められたがアルブミンの発現は認められなかった（アルブミンは肝臓細胞のマーカータンパク質である）（図５Ｂ）。
次に、Ｎｏ−ＤＤＣマウスの肝臓及びＤＤＣマウスの肝臓から単離されたＣＤ１３３＋ＣＤ４５−Ｔｅｒ１１９−細胞を特徴付けるために、これらの細胞を低密度で培養した。ＩＶ型コラーゲンでコーティングした６ウェルプレートの各ウェルに１０００個の細胞を播種した。６ウェルプレートでは、細胞は増殖しコロニーを形成することができるのでセミ・クローン解析が可能である。この条件で、Ｎｏ−ＤＤＣマウスの肝臓から単離されたＣＤ１３３＋ＣＤ４５−Ｔｅｒ１１９−細胞は、細胞培養８日経過した時点でも、１０〜５０個の細胞から構成される小コロニーを形成するのみであった（図５Ｃ）。一方、ＤＤＣマウスの肝臓から単離されたＣＤ１３３＋ＣＤ４５−Ｔｅｒ１１９−細胞は、小コロニーだけでなく、数百の細胞から構成される大コロニーもまた形成することができた（図５Ｃ）。これら２つの型の細胞コロニーは培養中のそれらの大きさによって容易に区別することができる。ＣＤ１３３＋ＣＤ４５−Ｔｅｒ１１９−細胞を単離し培養すると小コロニー及び大コロニーの両方ともを頻繁に生じたが、ＣＤ４５＋Ｔｅｒ１１９＋細胞亜集団やＣＤ１３３−ＣＤ４５−Ｔｅｒ１１９−細胞亜集団から単離された細胞ではコロニーは形成されないか、されても僅かであった（図５Ｄ）。大コロニーを形成する細胞の出現はＤＤＣ処置に強く依存しており、小コロニーの数もまた、ＤＤＣを摂食させたマウスの肝臓では５倍上昇していた（図５Ｄ）。さらに、ＤＤＣマウスの肝臓由来のＣＤ１３３＋ＣＤ４５−Ｔｅｒ１１９−細胞による大コロニーの形成には、培養条件として、成長因子〔肝臓細胞増殖因子（ＨＧＦ）及び／又は上皮増殖因子（ＥＧＦ）〕と細胞外マトリックス（ＥＣＭ）成分（ＩＶ型コラーゲン又はラミニン）を必要とすることがわかった（図６参照）。
【００３９】
実施例３：単一細胞培養及びＣＤ１３３＋ＣＤ４５−Ｔｅｒ１１９−細胞のクローン解析
ＣＤ１３３＋ＣＤ４５−Ｔｅｒ１１９−細胞の潜在性を調べるために、本発明者らはフローサイトメトリーによって細胞のクローン選別を行い、その後ＩＶ型コラーゲンをコーティングした９６ウェルプレートの各ウェルで細胞を培養することを試みた。セミ・クローナルな低密度培養条件と同様に、ＣＤ１３３＋ＣＤ４５−Ｔｅｒ１１９−細胞亜集団から単離された細胞は、肝臓がＤＤＣ処置を受けたものであるか否かに応じて、各ウェルで小コロニーあるいは大コロニーを形成した（図７）。ＣＤ１３３＋ＣＤ４５−Ｔｅｒ１１９−細胞の単一細胞培養におけるクローナルなコロニー形成により、もとの細胞から分化した細胞の研究及び特徴づけが可能になる。Ａｌｂ及びＣＫ７に対する抗体を用いた免疫蛍光染色解析から、培養６日後及び１８日後では、ＤＤＣマウスの肝臓及びＮｏ−ＤＤＣマウスの肝臓に由来する小コロニーの大部分は、ＣＫ７のみを発現する細胞で構成されていることがわかった（図８Ａ、Ｂ）。対照的に、培養６日後では、大コロニーの半分はＣＫ７＋細胞、Ａｌｂ＋ＣＫ７＋細胞、及び少数のＡｌｂ＋細胞から構成され、残りの半分のコロニーは独占的にＣＫ７＋細胞によって構成されていた（図８Ａ、Ｂ）。しかしながら１８日後には、７０％以上の大コロニーは最終的にはＡｌｂ＋細胞、ＣＫ７＋細胞、及び少数のＡｌｂ＋ＣＫ７＋細胞から構成されるようになった（図８Ａ、Ｂ）。コロニーサイズや培養期間の長さに係らず、Ａｌｂ＋細胞のみで形成されるコロニーは観察されなかった（図８Ｂ）。ＲＴ−ＰＣＲによる解析は、また、大コロニーに含まれる細胞が、肝細胞及び胆管上皮細胞のマーカーをコードしている複数の遺伝子（トリプトファン−２，３−ジオキシゲナーゼ、グルタチオン Ｓ−トランスフェラーゼ、及びグルタミン合成酵素等といった成熟肝細胞で検出される遺伝子を含む）を発現していることを示した（図９）。ｃＫｉｔ、ＣＤ３４及びＴｈｙ１等の卵形細胞のマーカーとして報告されている遺伝子がすべての大コロニーで発現しているわけではないことは興味深い。さらに、３週間以上培養した大コロニーでは、機能的に成熟した肝細胞に類似する、十分にグリコーゲンを蓄積した、多くの二核性のＡｌｂ＋細胞がコロニーの中央付近に出現した（図８Ｃ、Ｄ）。ＤＤＣマウスの肝臓から単離されたＣＤ１３３＋ＣＤ４５−Ｔｅｒ１１９−細胞は、最初はＣＫ７に陽性であるがＡｌｂに対しては陰性である（図５Ｂ）ので、大コロニーを形成することができる細胞は培養過程でＡｌｂ＋の成熟した肝細胞へと分化する子孫を生み出すものと考えられた。
【００４０】
実施例４：ＣＤ１３３＋ＣＤ４５−Ｔｅｒ１１９−細胞の自己複製能
次に、ＤＤＣマウスの肝臓から単離されたＣＤ１３３＋ＣＤ４５−Ｔｅｒ１１９−細胞に自己複製能があるかを調べるためにサブクローニング実験を行なった。ＩＶ型コラーゲンをコーティングした９６ウェルプレートの各ウェル中で形成された個々のクローナルなコロニー中の細胞をトリプシン処理し、ＩＶ型コラーゲンをコーティングした６ウェルプレートに再播種した。培養１４日後、ＤＤＣマウスの肝臓を起源とする継代培養した細胞からは多くの大コロニー（一つのコロニーから５〜１０個のコロニー）が生じたが、Ｎｏ−ＤＤＣマウスの肝臓を用いた場合には大コロニーを生じることはなかった（図１０Ａ）。これらの二次的コロニー中の細胞をトリプシン処理し、クローン選別にかけ単一細胞培養を行なった。再び大コロニーを形成できる再選別された細胞の割合は低かった（１〜３％）が、形成したコロニーの８０％以上において、培養１８日目までにＡｌｂ＋細胞及びＣＫ７＋細胞の両方に分化した細胞が含まれていた（図１０Ｃ）。大コロニーを形成した最初に選別した細胞と同様に、再選別された細胞によって再び形成された大コロニーでは培養過程で次第にＡｌｂ＋細胞を生じるようになったが、Ａｌｂ＋細胞のみを含むコロニーは形成されなかった（図１０Ｃ）。これらのデータは、ＤＤＣを摂食させたマウスの肝臓から単離された、大コロニーを形成するＣＤ１３３＋ＣＤ４５−Ｔｅｒ１１９−細胞がＡｌｂ＋肝細胞及びＣＫ７＋胆管上皮細胞を子孫として生み出すだけでなく、培養中、自己複製する細胞分裂によって肝細胞と胆管上皮細胞へ分化可能な細胞を維持し続けていることを示している。
【００４１】
実施例５：ＣＤ１３３＋ＣＤ４５−Ｔｅｒ１１９−細胞のインビボでの分化能及び肝組織再構築能
傷ついた組織の再構成と機能修復は、器官幹細胞及び器官前駆細胞が有する特別な役割の一つである。以前に報告されたように、ＤＤＣを摂食させた成体マウスの肝臓から単離された卵形細胞には、ＦＡＨ欠損マウスの肝臓に移植することにより肝組織を再構築する能力がある(参考文献２１)。ＤＤＣを摂食させたマウスの肝臓細胞から単離されたＣＤ１３３＋ＣＤ４５−Ｔｅｒ１１９−細胞もまた同様に肝組織を再構築することができ卵形細胞として定義され得るのか否かを決定するために、これらの細胞をＦＡＨ−／−マウスの肝臓に脾臓内移植した。ここで用いたＦＡＨ−／−マウスは、ＦＡＨをターゲット破壊したＥＳ細胞から作製したものであり（上記した、「ＦＡＨ変異マウスの作製」の項を参照、図２）、これらのマウスは他のＦＡＨ変異マウスと表現型の上では識別不可能である。本発明において、本発明者らは、肝組織（すなわち、成熟肝細胞）を再構築できる他の細胞種の混入の可能性を排除するために、単一のＣＤ１３３＋ＣＤ４５−Ｔｅｒ１１９−細胞由来のクローン化した子孫細胞をドナー細胞として用いた。移植後１及び２ヶ月経過した時点で、ＦＡＨ＋ドナー細胞は、全てのレシピエントマウスで広範に生着し、肝小結節を再構築した。これらのマウスは長期間２−（２−ニトロ−４−トリフルオロメチルベンゾイル）−１，３−シクロヘキサンジオン（ＮＴＢＣ）を中止しても生存することができた（図１１Ａ−Ｃ）。さらに、免疫蛍光染色及び過ヨウ素酸シッフ試薬（ＰＡＳ試薬）染色により、ＦＡＨ＋ドナー由来の細胞がＡｌｂを発現し、十分にグリコーゲンを蓄積していることが明らかになった（データ示さず）。これらのデータは、ドナー細胞のプール内に他の細胞系列の混入の可能性がないので、ＤＤＣを摂食させたマウスの肝臓から単離され、増殖しているＣＤ１３３＋ＣＤ４５−Ｔｅｒ１１９−細胞は、形態学上及び機能的に成熟した肝細胞を生み出すことによって肝組織を再構築する能力を有していることを示している。即ち、ＤＤＣを摂食させたマウスの肝臓から単離され、増殖しているＣＤ１３３＋ＣＤ４５−Ｔｅｒ１１９−細胞を肝臓卵形細胞と定義付けすることが可能である。
参考文献２１：Wang X, Foster M, Al-Dhalimy M, et al. The origin and liver repopulating capacity of murine oval cells. Proc Natl Acad Sci USA 2003; 100 Suppl 1: 11881-11888.
【００４２】
実施例６：ｐ５３欠失ＣＤ１３３＋ＣＤ４５−Ｔｅｒ１１９−細胞による肝癌形成
ＤＤＣをマウスに与える実験系と同様に、Ｄｉｐｉｎ（シスプラチン）やコリン欠乏エチオニン添加食を用いたげっ歯類の肝癌発生の幾つかの実験モデルにおいて、並びにより頻度高く肝癌へと進行するヒト肝臓の病変（Ｃ型肝炎ウイルス、ヘモクロマトーシス及びアルコール性肝疾患等）においてもまた卵形細胞が観察されている（参考文献１〜５）。
このことは、形質転換された卵形細胞がげっ歯類及びヒト両方での肝癌の起源の候補となり得ることを示唆している。この考え方は、また、多くのタイプの癌で想定上の癌始原細胞あるいは癌幹細胞の存在を示す最近の証拠によってサポートされている（参考文献２２〜３０）。この考え方に一致して、コリン欠乏エチオニン添加食を与えたｐ５３欠失マウス由来の卵形細胞が不死化細胞株を生み出し、ヌードマウスに注射することによって腫瘍細胞を作り出すことが報告されている（参考文献３１）。
ＣＤ１３３＋ＣＤ４５−Ｔｅｒ１１９−細胞が腫瘍形成を開始し得るのか否かを調べるために、ＤＤＣを摂食させたｐ５３−／−マウスの肝臓からＣＤ１３３＋ＣＤ４５−Ｔｅｒ１１９−細胞を単離した。ＤＤＣを摂食させたｐ５３−／−マウスの肝臓から単離されたＣＤ１３３＋ＣＤ４５−Ｔｅｒ１１９−細胞は、大コロニーを形成し増殖したが、ＤＤＣを摂食させていないｐ５３−／−マウスの肝臓から単離された細胞では大コロニーを形成せず増殖もしなかった。これは野生型マウスの肝臓由来のＣＤ１３３＋ＣＤ４５−Ｔｅｒ１１９−細胞に類似した結果であった（図１２Ａ）。しかしながら、ＤＤＣを摂食させたｐ５３−／−マウスの肝臓から得られたＣＤ１３３＋ＣＤ４５−Ｔｅｒ１１９−細胞は、肝細胞及び胆管上皮細胞へ分化する能力には影響を受けていない（図１２Ｃ−Ｄ）ものの、野生型マウスの肝臓由来のものに比べてよりサイズが小さく、また顕著に高い増殖能を有していた（図１２Ａ−Ｂ）。ＤＤＣを摂食させたｐ５３−／−マウスの肝臓由来のＣＤ１３３＋ＣＤ４５−Ｔｅｒ１１９−細胞から増幅させたクローン性の細胞を、非肥満性糖尿病重症免疫不全（ＮＯＤ／ＳＣＩＤ）マウスに皮下注射して２ヶ月後、Ａｌｂ＋肝細胞及び胆管様構造を形成するケラチン＋胆管上皮細胞を含有する腫瘍が、全動物で形成された。一方、野生型マウス由来の細胞を移植した肝臓では腫瘍は形成されなかった（図１２Ｅ−Ｋ）。従って、ＤＤＣを摂食させたｐ５３−／−マウスの肝臓から単離されたＣＤ１３３＋ＣＤ４５−Ｔｅｒ１１９−細胞は、肝細胞癌及び胆管癌の両方の特徴を有する腫瘍を形成することができ、これらの細胞は、ｐ５３の機能を欠失させることにより腫瘍を引き起こす能力を獲得する肝臓卵形細胞として特徴づけることができる。
参考文献２２： Bonnet D, Dick JE. Human acute myeloid leukemia is organized as a hierarchy that originates from a primitive hematopoietic cell. Nat Med 1997; 3: 730-737.
参考文献２３：Al-Hajj M, Wicha MS, Benito-Hernandez A, et al. Prospective identification of tumorigenic breast cancer cells. Proc Natl Acad Sci USA 2003; 100: 3983-3988.
参考文献２４：Singh SK, Hawkins C, Clarke ID, et al. Identification of human brain tumour initiating cells. Nature 2004; 432: 396-401.
参考文献２５：Collins AT, Berry PA, Hyde C, et al. Prospective identification of tumorigenic prostate cancer stem cells. Cancer Res 2005; 65: 10946-10951.
参考文献２６：Ricci-Vitiani L, Lombardi DG, Pilozzi E, et al. Identification and expansion of human colon-cancer-initiating cells. Nature 2007; 445, 111-115.
参考文献２７：O'Brien CA, Pollett A, Gallinger S, et al. A human colon cancer cell capable of initiating tumour growth in immunodeficient mice. Nature 2007; 445: 106-110.
参考文献２８：Prince ME, Sivanandan R, Kaczorowski A, et al. Identification of a subpopulation of cells with cancer stem cell properties in head and neck squamous cell carcinoma. Proc Natl Acad Sci USA 2007; 104: 973-978.
参考文献２９：Zucchi I, Sanzone S, Astigiano S, et al. The properties of a mammary gland cancer stem cell. Proc Natl Acad Sci USA 2007; 104: 10476-10481.
参考文献３０：Li C, Heidt DG, Dalerba P, et al. Identification of pancreatic cancer stem cells. Cancer Res 2007; 67: 1030-1037.
参考文献３１：Dumble ML, Croager EJ, Yeoh GC, et al. Generation and characterization of p53 null transformed hepatic progenitor cells: oval cells give rise to hepatocellular carcinoma. Carcinogenesis 2002; 23: 435-445.
【配列表フリーテキスト】
【００４３】
配列番号１：ＣＫ７ ＲＴ−ＰＣＲプライマー
配列番号２：ＣＫ７ ＲＴ−ＰＣＲプライマー
配列番号３：ターゲティングベクター配列の５’アーム増幅用プライマー。
配列番号４：ターゲティングベクター配列の５’アーム増幅用プライマー。
配列番号５：ターゲティングベクター配列の３’アーム増幅用プライマー。
配列番号６：ターゲティングベクター配列の３’アーム増幅用プライマー。
配列番号７：プライマー、FAHwt-F
配列番号８：プライマー、FAHmut-F
配列番号９：プライマー、FAHwt/mut-R
【図面の簡単な説明】
【００４４】
【図１】図１は、組織切片及び培養細胞の免疫染色に用いる１次抗体の種類、その入手先、及び反応条件等をまとめた図である。
【図２】図２は、ＦＡＨ変異マウス（ヌルアレル）を作製するための手順を示した図である。（Ａ）ＥＳ細胞における相同組換えによるマウスＦＡＨの標的破壊（Ｂ）もとになるＥＳ細胞及びターゲッティングされたＥＳ細胞ゲノムの５’及び３’プローブを用いたサザンブロット（Ｃ）ＦＡＨ＋／＋野生型、ＦＡＨ＋／−ヘテロ接合体及びＦＡＨ−／−マウスの尾の端から得られたゲノムＤＮＡを用いたＰＣＲジェノタイピングＭ：マーカー
【図３】図３は、卵形細胞が誘導されるのと同時にＣＤ１３３の発現が上昇することを示した図である。（Ａ）Ｎｏ−ＤＤＣマウスの肝臓（上パネル）及びＤＤＣマウスの肝臓（下パネル）におけるＡ６の免疫組織学的染色。ＤＤＣを摂食させて２週間で肝臓の門脈の周辺に卵形細胞の増殖が誘導される。胆管上皮細胞及び卵形細胞の両方でＡ６が発現している。スケールバー；５００μｍ（Ｂ）Ｎｏ−ＤＤＣマウス及びＤＤＣマウス（摂食期間２週間）の肝臓における複数の遺伝子の発現をマイクロアレイ解析により比較した。このグラフは、卵形細胞の増殖が活性化された場合に発現が増加する遺伝子、及びＣＤ１３３の発現のデータを示している。全てのデータは、Ｎｏ−ＤＤＣマウスの肝臓を用いた場合の値で標準化し、何倍の差があるかで示した。
【図４】図４は、胆管上皮細胞及びＤＤＣで誘導された卵形細胞におけるＣＤ１３３の特異的発現を示した図である。（Ａ）Ｎｏ−ＤＤＣマウスの肝臓及びＤＤＣを摂食させた（１〜４週間）マウスの肝臓の、ｑＰＣＲによる遺伝子発現解析の結果を示す。全てのデータは、Ｎｏ−ＤＤＣマウスの肝臓を用いた場合の値で標準化し、何倍の差があるかで示した。平均値±標準偏差（ｎ＝３）で示した。（Ｂ）Ｎｏ−ＤＤＣマウスの肝臓及びＤＤＣを摂食させた（１〜４週間）マウスの肝臓から得られたタンパク質サンプルのウエスタンブロットの結果を示す。（Ｃ−Ｄ）Ｎｏ−ＤＤＣマウスの肝臓及びＤＤＣを摂食させた（２週間）マウスの肝臓の、ＣＤ１３３とＡ６との（図Ｃ）あるいはＣＤ１３３とケラチンとの（図Ｄ）二重免疫蛍光染色の染色像を示す図である。ＤＮＡはＤＡＰＩで染色した。スケールバー；１００μｍ
【図５】図５は、フローサイトメトリーにより単離されたＣＤ１３３＋ＣＤ４５−Ｔｅｒ１１９−細胞のインビトロでのセミ・クローナルなコロニー解析の結果を示した図である。（Ａ）細胞表面マーカーの発現に基づいて、Ｎｏ−ＤＤＣマウスの肝臓由来の細胞及びＤＤＣマウスの肝臓由来の細胞をフローサイトメトリーによって分画した。まず、ＣＤ４５＋細胞及びＴｅｒ１１９＋細胞にゲートをかけ、Ｎｏ−ＤＤＣマウスの肝臓細胞及びＤＤＣマウスの肝臓細胞から血球系細胞を排除した。次いで、ＣＤ４５−Ｔｅｒ１１９−細胞（それぞれの比率は各々の左のパネルに示されている）をＣＤ１３３の発現に基づいてさらに分画した。インビトロのコロニー解析のためには、ソーティングゲートをＣＤ１３３＋ＣＤ４５−Ｔｅｒ１１９−細胞亜集団及びＣＤ１３３−ＣＤ４５−Ｔｅｒ１１９−細胞亜集団に設定した。ＣＤ４５−Ｔｅｒ１１９−細胞におけるＣＤ１３３＋細胞の割合並びに分画していない全細胞におけるＣＤ１３３＋細胞の割合を、各右のパネルに、括弧の外と中に％でそれぞれ示した。アイソタイプコントロール抗体で染色された、Ｎｏ−ＤＤＣマウスの肝臓由来の細胞をコントロールとして用いた（上段のパネル）。（Ｂ）フローサイトメトリーによって、Ｎｏ−ＤＤＣマウスの肝臓及びＤＤＣマウスの肝臓から単離してすぐにガラススライドに接着させたＣＤ１３３＋ＣＤ４５−Ｔｅｒ１１９−細胞に対して、アルブミン（Ａｌｂ）とサイトケラチン（ＣＫ）７との二重免疫蛍光染色を行なった。ＤＮＡはＤＡＰＩで染色した。スケールバー；５０μｍ（Ｃ）Ｎｏ−ＤＤＣマウスの肝臓及びＤＤＣマウスの肝臓から単離したＣＤ１３３＋ＣＤ４５−Ｔｅｒ１１９−細胞は、８日間培養した後、セミ・クローナルなコロニーを形成した。大コロニーは、ＤＤＣマウスの肝臓から得られるＣＤ１３３＋ＣＤ４５−Ｔｅｒ１１９−細胞からのみ形成された。各コロニーの形態を示す。スケールバー；５００μｍ（上段パネル）、１００μｍ（下段パネル）。（Ｄ）Ｎｏ−ＤＤＣマウスの肝臓及びＤＤＣマウスの肝臓由来の各細胞亜集団について１０００細胞あたりの小コロニー及び大コロニーの数を示す。このグラフは、３つの個別に行なった実験中、各細胞亜集団について１２ディッシュの平均を示すものである（平均値±標準偏差）。
【図６】図６は、ＤＤＣマウスの肝臓由来のＣＤ１３３＋ＣＤ４５−Ｔｅｒ１１９−細胞のコロニー形成能が、培養液中の増殖因子（ＧＦ）及び細胞外マトリックス（ＥＣＭ）に強く依存していることを示す図である。（Ａ）ＤＤＣマウスの肝臓からＣＤ１３３＋ＣＤ４５−Ｔｅｒ１１９−細胞を単離し、ＩＶ型コラーゲンでコーティングされた６ウェルプレートのウェル中で、増殖因子の存在下あるいは非存在下、低密度培養条件下で培養した。細胞は培養８日後、ＨＧＦ及び／又はＥＧＦが存在する場合にのみ大コロニーを形成することができた。各コロニーを示す。スケールバー；５００μｍ（上段パネル）、１００μｍ（下段パネル）。（Ｂ）ＤＤＣマウスの肝臓から単離された細胞（ＣＤ１３３＋ＣＤ４５−Ｔｅｒ１１９−細胞）１０００個あたりの小コロニー及び大コロニーの数を示す図である。細胞は、ＩＶ型コラーゲンでコーティングされた６ウェルプレート中、ＨＧＦ及び／又はＥＧＦの存在下、あるいは非存在下で８日間培養してコロニーを形成させた（ｎ＝３、平均値±標準偏差）。（Ｃ）ＤＤＣマウスの肝臓から単離された細胞（ＣＤ１３３＋ＣＤ４５−Ｔｅｒ１１９−細胞）１０００個あたりの小コロニー及び大コロニーの数を示す図である。細胞は、コーティング処理していない６ウェルプレート（コート処理なし）、ＩＶ型コラーゲンでコーティングされた６ウェルプレート、あるいはラミニンでコーティングされた６ウェルプレート中、ＨＧＦ及びＥＧＦの存在下で８日間培養してコロニーを形成させた（ｎ＝８、平均値±標準偏差）。
【図７】図７は、ＣＤ１３３＋ＣＤ４５−Ｔｅｒ１１９−細胞の単一細胞培養とクローナルなコロニー形成を示した図である。（Ａ）Ｎｏ−ＤＤＣマウスの肝臓由来のＣＤ１３３＋ＣＤ４５−Ｔｅｒ１１９−細胞の単一細胞培養。ＩＶ型コラーゲンをコーティングした９６ウェルプレートのウェル中で、培養８日後に形成された代表的な小コロニーを示す。（Ｂ−Ｃ）Ａで示された小コロニーを拡大した像である。スケールバー：５００μｍ（Ｂ）、１００μｍ（Ｃ）（Ｄ）ＤＤＣマウスの肝臓由来のＣＤ１３３＋ＣＤ４５−Ｔｅｒ１１９−細胞の単一細胞培養。ＩＶ型コラーゲンをコーティングした９６ウェルプレートのウェル中で、培養８日後に形成された代表的な大コロニーを示す。（Ｅ−Ｆ）Ｄで示された大コロニーを拡大した像である。スケールバー：５００μｍ（Ｅ）、１００μｍ（Ｆ）
【図８】図８は、ＤＤＣマウスの肝臓由来のＣＤ１３３＋ＣＤ４５−Ｔｅｒ１１９−細胞からの多系列のコロニー形成（インビトロ）を示した図である。（Ａ）Ｎｏ−ＤＤＣマウスの肝臓あるいはＤＤＣマウスの肝臓から単離されたＣＤ１３３＋ＣＤ４５−Ｔｅｒ１１９−細胞の単一細胞培養（６日間及び１８日間）により得られたクローナルなコロニーに対してＡｌｂ及びＣＫ７の二重免疫蛍光染色を行なった。代表的なコロニーを示す。ＤＮＡをＤＡＰＩで染色した（下段パネル）。スケールバー：１００μｍ（Ｂ）Ｎｏ−ＤＤＣマウスの肝臓あるいはＤＤＣマウスの肝臓由来のＣＤ１３３＋ＣＤ４５−Ｔｅｒ１１９−細胞から形成されるコロニーに対して、Ａｌｂ＋細胞及びＣＫ７＋細胞、Ａｌｂ＋細胞及びＣＫ７−細胞、Ａｌｂ−細胞及びＣＫ７＋細胞、又はＡｌｂ−細胞及びＣＫ７−細胞によって構成されているクローナルなコロニーの割合を、Ａｌｂ及びＣＫ７の二重免疫蛍光染色によって測定した。培養６日後、及び１８日後のコロニーについて調べた。Ｎｏ−ＤＤＣマウスの肝臓あるいはＤＤＣマウスの肝臓に由来するＣＤ１３３＋ＣＤ４５−Ｔｅｒ１１９−細胞から形成される小コロニーのデータはよく似ていた。本グラフは３つの独立した実験の平均値を示している（平均値±標準偏差）。各実験で調べたコロニーの数は１６〜６２個である。（Ｃ）Ｎｏ−ＤＤＣマウスとは異なり、ＤＤＣマウスの肝臓に由来するＣＤ１３３＋ＣＤ４５−Ｔｅｒ１１９−細胞は、培養２５日後には、十分にグリコーゲンを蓄積している機能的な成熟肝細胞を生み出すことがＰＡＳ染色によって明らかになった。スケールバー：１００μｍ（Ｄ）クローナルなコロニーについてＡｌｂの免疫蛍光染色を行なうことにより、培養３０日後には、二核性のＡｌｂ＋成熟肝細胞がＤＤＣを摂食させたマウスの肝臓由来のＣＤ１３３＋ＣＤ４５−Ｔｅｒ１１９−細胞から分化してくることが明らかとなった。ＤＮＡはＤＡＰＩで染色した。スケールバー：１００μｍ
【図９】図９は、ＤＤＣマウスの肝臓由来のＣＤ１３３＋ＣＤ４５−Ｔｅｒ１１９−細胞の単一培養細胞によって形成された大コロニー１２株について、各系列のマーカー遺伝子の発現を調べた結果を示した図である。１８日目にＲＴ−ＰＣＲを用いて調べた。
【図１０】図１０は、ＤＤＣマウスの肝臓から単離された１個のＣＤ１３３＋ＣＤ４５−Ｔｅｒ１１９−細胞に由来する二次的にクローン選別された子孫の多能性を示す図である。（Ａ）個々のコロニー内で細胞を１４日間継代培養することにより、ＤＤＣマウスの肝臓から単離されたＣＤ１３３＋ＣＤ４５−Ｔｅｒ１１９−細胞の１つの子孫からは２次的なコロニーが形成されたが、Ｎｏ−ＤＤＣマウスの肝臓から単離されたものからではコロニーは形成されなかった。これらの二次コロニーをＴｕｅｒｋ’ｓ溶液で染色し写真撮影した。さらにＤＤＣマウスの肝臓由来のＣＤ１３３＋ＣＤ４５−Ｔｅｒ１１９−細胞の自己複製能を解析するために、二次コロニーの細胞に対しフローサイトメトリーにより二次クローン選別を行なって単一細胞培養を行なった。（Ｂ）ＤＤＣマウスの肝臓由来のＣＤ１３３＋ＣＤ４５−Ｔｅｒ１１９−細胞の再選別された子孫を単一細胞培養して１８日後、Ａｌｂ及びＣＫ７の二重免疫蛍光染色を行なった。代表的なコロニーを示す。ＤＮＡはＤＡＰＩで染色した。スケールバー：１００μｍ（Ｃ）ＤＤＣマウスの肝臓由来のＣＤ１３３＋ＣＤ４５−Ｔｅｒ１１９−細胞の再選別された子孫から形成されたこれらのコロニーについて、Ａｌｂ＋細胞及びＣＫ７＋細胞、Ａｌｂ＋細胞及びＣＫ７−細胞、Ａｌｂ−細胞及びＣＫ７＋細胞、あるいはＡｌｂ−細胞及びＣＫ７−細胞によって、培養１８日後に構成されるクローナルなコロニーの割合を、Ａｌｂ及びＣＫ７の二重免疫蛍光染色によって測定した。このグラフは、３つの独立した実験の平均値を示すものである（平均値±標準偏差）。各実験で調べたコロニーの数は１２〜２１個である。
【図１１】図１１は、ＤＤＣマウスの肝臓から単離された単一のＣＤ１３３＋ＣＤ４５−Ｔｅｒ１１９−細胞由来の増殖したクローン性の子孫が、インビボで肝組織を再構築することができたことを示した図である。（Ａ）ＮＴＢＣを与えたＦＡＨ−／−マウス（上段パネル）及びＤＤＣを摂食させたマウスの肝臓由来のＣＤ１３３＋ＣＤ４５−Ｔｅｒ１１９−細胞のクローン性の子孫を培養して調製される細胞を移植して２ヶ月後のＦＡＨ−／−マウス（下段パネル）の肝臓について、ＦＡＨの免疫組織化学的染色を行なった。ドナー細胞に由来するＦＡＨ＋肝小結節がレシピエントマウスの肝臓で多く観察された。差込図は各スライドのヘマトキシリン肝臓染色の像を示している。（Ｂ−Ｃ）レシピエントＦＡＨ−／−マウスの肝臓におけるドナー細胞に由来するＦＡＨ＋肝小結節の拡大図である。移植１ヶ月後（Ｂ）及び２ヶ月後（Ｃ）。スケールバー：１００μｍ
【図１２】図１２は、ＤＤＣマウスの肝臓から単離されたｐ５３欠失ＣＤ１３３＋ＣＤ４５−Ｔｅｒ１１９−細胞による肝癌形成の様子を示した図である。（Ａ）ｐ５３の欠落に係らず、クローナルな大コロニー及び小コロニーが、ＤＤＣを摂食させた、あるいは摂食させていないマウスの肝臓から単離された。これは野生型（ｐ５３＋／＋）のマウス由来のＣＤ１３３＋ＣＤ４５−Ｔｅｒ１１９−細胞での結果と同様である。しかしながら、ＤＤＣを摂食させたｐ５３−／−マウスの肝臓に由来するＣＤ１３３＋ＣＤ４５−Ｔｅｒ１１９−細胞から増殖した細胞は、野生型のマウスの肝臓に由来するものに比べて小さかった。スケールバー：１００μｍ（Ｂ）ＤＤＣを摂食させたｐ５３−／−マウスの肝臓から単離された単一のＣＤ１３３＋ＣＤ４５−Ｔｅｒ１１９−細胞のクローン原性の子孫はＤＤＣを摂食させた野生型のマウスに由来するものに比べてより活発に増殖した。ＩＶ型コラーゲンをコーティングした６ウェルプレートの各々に１０００個の細胞を播種した（ｎ＝３、平均値±標準偏差）。（Ｃ−Ｄ）ＤＤＣを摂食させたｐ５３−／−マウスの肝臓由来のＣＤ１３３＋ＣＤ４５−Ｔｅｒ１１９−細胞を１８日間単一細胞培養し、形成された大コロニーについてＡｌｂ及びＣＫ７の二重免疫蛍光染色を行なった（Ｃ）。代表的なコロニーを示す。ＤＮＡはＤＡＰＩで染色した（Ｄ）。スケールバー：５０μｍ（Ｅ）ＤＤＣを摂食させたｐ５３−／−マウスの肝臓由来の単一ＣＤ１３３＋ＣＤ４５−Ｔｅｒ１１９−細胞のクローン性の子孫は、ＮＯＤ／ＳＣＩＤレシピエントマウスに皮下注射２ヵ月後には腫瘍を形成したが、野生型マウス由来のものは腫瘍を形成しなかった。（Ｆ）Ｅに示したレシピエントマウスから解離された腫瘍。スケールバー：１ｃｍ（Ｇ−Ｈ）胆管様構造を有する（Ｈ）あるいは有さない（Ｇ）腫瘍領域のヘマトキシリン−エオシン（ＨＥ）染色。Ｇ−Ｋに示されるデータはＦに存在する腫瘍から得られたものである。スケールバー：１００μｍ（Ｉ−Ｋ）多くのＡｌｂ＋細胞及び僅かなケラチン＋細胞を含有する腫瘍の領域（Ｉ）、胆管様構造を形成する多くのケラチン＋細胞及び僅かなＡｌｂ＋細胞を含有する腫瘍の領域（Ｊ）、及びＡｌｂ＋細胞及び胆管様構造を形成するケラチン＋細胞の両方を含有する腫瘍の領域（Ｋ）。スケールバー：１００μｍ
【技術分野】
【０００１】
本発明は肝臓の卵形細胞を分離・取得するための方法に関する。より詳細には、本発明は、卵形細胞に特徴的な表現型に基づいて、卵形細胞を選別・分離・取得する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
肝臓は、増殖する細胞区画に応じて２つの異なる方法で再生することができる。部分的な肝切除（ヘパテクトミー：ＰＨ）あるいは化学的な傷害の後に、残った肝組織中の細胞、特に肝臓細胞が迅速に増殖しいかなる肝臓幹細胞や前駆細胞からの寄与もなく無くした細胞を回復することができる。しかしながら、肝臓細胞の増殖が、何らかの慢性的な傷害によって損なわれた場合には、再生のためのシグナルが、肝小葉の門脈周辺に「卵形細胞（oval cell）」と称される小さな上皮細胞の出現を引き起こす。ダメージを受けた肝臓を再生するために劇的に増殖する能力を有すること、及び肝細胞や胆管上皮細胞へと分化する能力を有することから、卵形細胞は、一過的に増幅する肝臓前駆細胞であると考えられている（非特許文献１）。
【０００３】
遠心分離水簸ならびに肝臓実質細胞及び肝臓非実質細胞の種々の特徴についての組織化学的解析により卵形細胞が単離され得ることが報告されている（非特許文献２）。密度勾配遠心法をパンニングあるいはフローサイトメトリーを用いた細胞ソーティングと組み合わせて、さらに卵形細胞を濃縮し、それらのインビトロあるいはインビボでの増殖能及び分化能が調べられている（非特許文献３、４）。これらの手法により単離された細胞集団は非常に多くの卵形細胞を含有するものであったが、依然として他の系列の細胞が混じったものであり、卵形細胞のみを特異的に分離する方法が求められている。
【０００４】
本発明者ら、並びに他の研究者らによって、発生中のマウスの肝臓から肝幹細胞及び前駆細胞を生成するための戦略が報告されている（非特許文献５〜７）が、肝臓卵形細胞のみを他の細胞から完全に引き離して解析することができず、卵形細胞の多能性や組織再構築能を実験的に証明することは困難であった。
【非特許文献１】Fausto N, Campbell JS. The role of hepatocytes and oval cells in liver regeneration and repopulation. Mech Dev 2003; 120: 117-130.
【非特許文献２】Yaswen P, Hayner NT, Fausto N. Isolation of oval cells by centrifugal elutriation and comparison with other cell types purified from normal and preneoplastic livers. Cancer Res 1984; 44: 324-331.
【非特許文献３】Germain L, Noel M, Gourdeau H, et al. Promotion of growth and differentiation of rat ductular oval cells in primary culture. Cancer Res 1988; 48: 368-378.
【非特許文献４】Wang X, Foster M, Al-Dhalimy M, et al. The origin and liver repopulating capacity of murine oval cells. Proc Natl Acad Sci USA 2003; 100 Suppl 1: 11881-11888.
【非特許文献５】Suzuki A, Zheng YW, Kondo R, et al. Flow cytometric separation and enrichment of hepatic progenitor cells in the developing mouse liver. Hepatology 2000; 32: 1230-1239.
【非特許文献６】Suzuki A, Zheng YW, Kaneko S, et al. Clonal identification and characterization of self-renewing pluripotent stem cells in the developing liver. J Cell Biol 2002; 156: 173-184.
【非特許文献７】Tanimizu N, Nishikawa M, Saito H, et al. Isolation of hepatoblasts based on the expression of Dlk/Pref-1. J Cell Sci 2003; 116: 1775-1786.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は肝臓から肝臓卵形細胞を単離・同定する方法を提供することを目的とする。さらに本発明は、肝臓卵形細胞を単一細胞培養する方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、上記課題に鑑み、鋭意検討を行った結果、三種類の細胞表面マーカーの発現状況、具体的にはＣＤ１３３、ＣＤ４５及びＴｅｒ１１９の三種類の細胞表面マーカーの発現状況を調べることによって、肝臓の卵形細胞を高度に分離・取得し得ることを見出し、さらに卵形細胞のクローナルな培養条件を見出して本発明を完成するに至った。すなわち本発明は以下の通りである。
【０００７】
［１］ＣＤ１３３、ＣＤ４５及びＴｅｒ１１９の発現を調べる工程を含む、哺乳動物から肝臓卵形細胞を分離及び／又は取得する方法。
［２］ＣＤ１３３を発現し、ＣＤ４５及びＴｅｒ１１９を発現していない細胞を選別する工程をさらに含む、上記［１］記載の方法。
［３］肝臓卵形細胞の産生を誘導する工程をさらに含む、上記［１］又は［２］記載の方法。
［４］肝臓卵形細胞を成長因子及び細胞外マトリックスの存在下で培養する工程をさらに含む、上記［１］〜［３］のいずれかに記載の方法。
［５］成長因子が、ＨＧＦ及び／又はＥＧＦである、上記［４］記載の方法。
［６］細胞外マトリックスがコラーゲン又はラミニンである、上記［４］記載の方法。
［７］上記［１］〜［６］のいずれかに記載の方法によって哺乳動物の肝臓から分離及び／又は取得される肝臓卵形細胞。
［８］ＣＤ１３３、ＣＤ４５及びＴｅｒ１１９の３つの細胞表面マーカーをＣＤ１３３＋、ＣＤ４５−及びＴｅｒ１１９−のパターンで呈する、肝臓卵形細胞。
［９］哺乳動物の肝臓における分化に影響を及ぼす物質をスクリーニングするための方法であって、以下の工程を含む方法；
(1)肝臓卵形細胞と被検物質とを反応させる工程、
(2)反応後の細胞について肝臓マーカーの発現を測定する工程。
【発明の効果】
【０００８】
肝幹／前駆細胞の最有力候補である卵形細胞は、存在頻度が低いため、通常の細胞分離法では純化することができず、他の細胞が混在した状況でしか解析することができなかった。そのため卵形細胞を成体肝幹/前駆細胞とする実験的証拠はこれまで存在しなかった。卵形細胞の細胞表面に特異的に発現する抗原分子を指標にして卵形細胞を分離・回収する本発明の方法、及び当該卵形細胞の単一細胞培養によって卵形細胞に対する極めて精度の高い機能解析が可能となる。
ヒト肝臓組織、特に、癌等の病態で卵形細胞様の細胞を解析することによって、癌幹細胞としての性質を調べることが可能となる。また、卵形細胞を肝幹／前駆細胞として用いることにより、肝臓における分化を誘導する物質のスクリーニング方法の確立が可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
文中で特に断らない限り、本明細書で用いるすべての技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者に一般に理解されるのと同じ意味をもつ。本明細書に記載されたものと同様又は同等の任意の方法及び材料は、本発明の実施又は試験において使用することができるが、好ましい方法及び材料を以下に記載する。本明細書で言及したすべての刊行物及び特許は、例えば、記載された発明に関連して使用されうる刊行物に記載されている、構築物及び方法論を記載及び開示する目的で、参照として本明細書に組み入れられる。
【００１０】
本発明の取得方法及び培養方法の対象となる肝臓卵形細胞は、任意の哺乳動物の肝臓に由来する。ここで「哺乳動物」とは、具体的にはヒトをはじめウシ、ウマ、イヌ、モルモット、マウス、ラット等が挙げられる。好ましくはヒトであるが、基礎医学的研究の見地からは、マウスやラット等の実験動物としてよく用いられる動物も又、好ましい。
【００１１】
本発明の肝臓卵形細胞は、任意の哺乳動物の肝臓に由来するが、好ましくは肝臓卵形細胞の産生を誘導するような処理が施された肝臓に由来する。肝臓卵形細胞の産生を誘導するような処理としては、例えば３，５−ジエトキシカルボニル−１，４−ジヒドロコリジン（ＤＤＣ）を含む飼料をマウスに与えることによって、マウスの肝臓内で卵形細胞を産生、増殖させることができる（ＤＤＣモデル）。又、発癌剤の一種である２−アセチルアミノフルオレン（２−ＡＡＦ）を投与した後に部分肝切除を行なったラットにおいても、卵形細胞の出現が報告されている（２−ＡＡＦ／ＰＨモデル）。
肝臓、好ましくはＤＤＣを摂食させたマウス等の肝臓は、取り出し細かく切り刻んで、振動等の物理的な手段によって、ＥＧＴＡあるいはＥＤＴＡ等を用いた化学的な処理によって、あるいはコラゲナーゼ、トリプシン、キモトリプシン、ペプシン、ジスパーゼ等のプロテアーゼを用いた酵素的な処理によって細胞を分散することによって単一細胞懸濁液としてから、後述する細胞表面マーカー（ＣＤ１３３、ＣＤ４５及びＴＥＲ１１９）の発現を調べる工程を行なう。
【００１２】
本発明は、ＣＤ１３３、ＣＤ４５及びＴＥＲ１１９の発現を調べる工程を含む、哺乳動物から肝臓卵形細胞を分離及び／又は取得する方法を提供する。ＣＤ１３３（プロミニン−１としても知られている）蛋白質は、５回膜貫通型の糖蛋白質であって、造血幹細胞、前駆細胞のマーカーであると同時に、近年、神経系腫瘍、前立腺癌、大腸癌の癌幹細胞マーカーの一つであることが報告されている。ＣＤ４５は、白血球共通抗原の１種で、赤血球、血小板およびそれらの前駆細胞を除く、すべての造血性細胞に発現していることが知られている。ＴＥＲ１１９は、赤血球系細胞を選別するための有効な細胞表面マーカーであることが知られている。
本発明はこれらの蛋白質またはそれをコードする遺伝子が肝臓卵形細胞においては特有の発現様式を示すという新たな知見に基づいている。
【００１３】
本明細書中、「マーカー」とは特にことわりのない限り、このような肝臓卵形細胞に特有な発現様式を示す一連の蛋白質又はそれをコードする遺伝子から構成される群の各々を意味する。かかるマーカー蛋白質は哺乳動物の種類等によってそのアミノ酸配列が異なる場合があり、本発明においてはその肝臓卵形細胞における発現様式が同じである限り、そのような蛋白質もマーカー蛋白質として使用することができ、本発明の範囲内である。具体的には、それぞれの蛋白質についてアミノ酸配列で４０％以上、好ましくは５０％以上、より好ましくは７０％以上の相同性を有するホモローグも本発明のマーカー蛋白質、すなわちＣＤ１３３、ＣＤ４５及びＴＥＲ１１９として用いることができる。本発明はこれらのマーカー蛋白質及び／またはそれをコードする遺伝子の発現状況を、各マーカー蛋白質またはそれをコードする遺伝子と特異的な親和性を有する物質を用いてそれらの発現を調べる工程を含む。
【００１４】
本明細書中、「用いて」という用語について、その方法は特に限定されず、具体的には、例えばマーカー蛋白質と特異的親和性を有する物質を用いる場合であれば該マーカー蛋白質の抗体との抗原抗体反応を利用する方法が挙げられ、又、マーカー蛋白質をコードする遺伝子と特異的親和性を有する物質を用いる場合であればハイブリダイゼーション反応を利用する方法が挙げられる（詳細な手順については後述する）。
【００１５】
マーカー蛋白質と特異的な親和性を有する物質としては例えば当該蛋白質に特異的親和性を有する抗体またはその断片が挙げられ、その特異的親和性とは抗原・抗体反応により該蛋白質を特異的に認識し、結合する能力のことである。該抗体またはその断片は、当該蛋白質と特異的に結合可能なものであれば特に限定されず、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体およびそれらの機能的断片のいずれであってもよい。これらの抗体あるいはその機能的断片は、通常当分野で行なわれている方法によって製せられる。例えばポリクローナル抗体を用いる場合であれば、該蛋白質をマウスやウサギといった動物の背部皮下あるいは腹腔内あるいは静脈等に注射して免疫し、抗体価が上昇するのを待った後に抗血清を採取する方法が挙げられ、またモノクローナル抗体を用いる場合であれば、常法に従いハイブリドーマを作製して、その分泌液を採取する方法が挙げられる。抗体断片を製造する方法としてはクローニングした抗体遺伝子断片を微生物等に発現させる方法がよく用いられている。当該抗体、抗体断片等の純度は、当該蛋白質との特異的親和性を保持している限り、特に限定されない。これらの抗体またはその断片は、蛍光物質、酵素やラジオアイソトープ等で標識されていてもよい。好ましくは、蛍光物質で標識されている抗体またはその断片である。
さらに、これらは市販されているものを用いても良い。
【００１６】
マーカー蛋白質をコードする遺伝子と特異的な親和性を有する物質としては、例えば当該遺伝子に特異的親和性を有するオリゴまたはポリヌクレオチドプローブ（以下、便宜上単にプローブともいう）、ならびにオリゴまたはポリヌクレオチドプライマー対（以下、便宜上単にプライマー対ともいう）が挙げられ、その特異的親和性とは、目的の遺伝子にのみハイブリダイズする性質を意味し、従って当該遺伝子の全部もしくは一部に完全相補的なものか、もしくは上記性質を満たす範囲で１乃至数個のミスマッチを含んでいても良い。該プローブ、プライマー対は、当該遺伝子に特異的親和性を有するものであれば特に限定されないが、例えば当該遺伝子の塩基配列の全部もしくは一部、ならびにそれらの相補配列を含むオリゴまたはポリヌクレオチド等が挙げられ、検出すべき遺伝子の形態に応じて適宜選択する。当該オリゴまたはポリヌクレオチドは当該遺伝子との特異的親和性を有している限りはその由来は特に限定されず、合成されたものであっても、当該遺伝子から必要な部分を切り出し、通常行なわれる方法によって精製されたものであってもよい。これらのオリゴまたはポリヌクレオチドは、蛍光物質、酵素やラジオアイソトープ等で標識されていてもよい。
【００１７】
本発明の肝臓卵形細胞を分離及び／又は取得する方法は、上記三種類のマーカー蛋白質又はそれをコードする遺伝子とそれぞれ特異的親和性を有する物質を用いてそれらのマーカーの発現状況を解析することにより実施される。かかる解析によりＣＤ１３３＋、ＣＤ４５−及びＴｅｒ１１９−［ＣＤ１３３発現、ＣＤ４５非発現、ＴＥＲ１１９非発現］という特徴を有する細胞を分離することによって、哺乳動物由来の肝臓卵形細胞を得ることができる。すなわち、本発明において分離及び／取得の対象となる、あるいは単一細胞培養の対象となる肝臓卵形細胞は、ＣＤ１３３、ＣＤ４５及びＴｅｒ１１９の３つの細胞表面マーカーをＣＤ１３３＋、ＣＤ４５−及びＴｅｒ１１９−のパターンで呈する。ここで「呈する」とは、それぞれのマーカー蛋白質またはそれをコードする遺伝子を「発現している」あるいは「発現していない」という特徴を有していることを意味する。
【００１８】
各特異的親和性を有する物質を用いて、それぞれのマーカー発現のパターンを呈する細胞を選別、分離する方法は、通常、当分野で行われている方法及びそれらを組み合わせた方法が用いられる。例えば、蛋白質レベルでマーカーを解析する場合、特に細胞を生きた状態で回収する必要性がある場合には、当該物質を標識するための色素を適宜選択して、フローサイトメトリーを利用する方法が好都合である。より好適には、蛍光活性化セルソーター（ＦＡＣＳ：fluorescence-activated cell sorter）を用いて、細胞を分離する。当該装置を用いることにより、目的とする細胞を自動で分離、回収することができる。
同定する場合等、生細胞としての回収が特に必要でない場合には、細胞を破砕し抽出してｍＲＮＡを回収し、ノザンブロットを行ってもよいし、また膜蛋白質を抽出してウエスタンブロットを行うこともできる。
【００１９】
本発明においては、本発明の肝臓卵形細胞の分離及び／又は取得方法を用いて、哺乳動物の肝臓卵形細胞を得ることができる。かかる卵形細胞は、適当な培養条件下で単一細胞培養することができ、さらに生理学的機能を有する細胞、即ち成熟した肝細胞及び胆管上皮細胞へと分化し得る。ここで「適当な培養条件」とは、成長因子及び細胞外マトリックスが存在する培養条件を意味し、例えば、成長因子として肝臓細胞成長因子（hepatocyte growth factor, HGF）及び／又は上皮成長因子（epidermal growth factor, EGF）等のサイトカイン、及び細胞外マトリックスとしてコラーゲン（例えばＩＶ型コラーゲン）又はラミニンを用いた培養条件を意味する。例えば、ＨＧＦ及びＥＧＦを含有する、Suzuki A, Zheng YW, Kondo R, et al. Flow cytometric separation and enrichment of hepatic progenitor cells in the developing mouse liver. Hepatology 2000; 32: 1230-1239.（非特許文献５）に記載の標準培地を好ましく用いることができる。培地中の成長因子の濃度は、肝臓卵形細胞の単一細胞培養及び分化誘導が可能な範囲であれば特に限定されず、また、用いる成長因子の種類によっても異なるが、ＥＧＦの場合には、１０〜４０ｎｇ／ｍＬ、好ましくは２０ｎｇ／ｍＬ程度であり、ＨＧＦの場合には、４０〜８０ｎｇ／ｍＬ、好ましくは５０ｎｇ／ｍＬ程度である。本発明で用いるＥＧＦ及びＨＧＦ等の成長因子は肝臓卵形細胞の単一細胞培養及び分化誘導が可能な限り、その由来は特に限定されず、天然由来のものであっても公知の遺伝子配列やアミノ酸配列等の情報に基づいて合成又は半合成して製造されるものであってもよい。商業的に入手可能なものであってもよい。肝臓卵形細胞の単一細胞培養及び分化誘導が可能な範囲で、ＥＧＦ及びＨＧＦ等の成長因子は改変されたものであってもよい。このような改変には、１個又は複数個のヌクレオチドあるいはアミノ酸の変異、挿入、欠失及び置換が含まれる。改変された成長因子は、当分野で通常実施される手段によって調製することができる。例えば、エキソヌクレアーゼを用いる欠失変異株（ｄｅｌｅｔｉｏｎ ｍｕｔａｎｔ）作製法、カセット変異法等の部位特異的変異（ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）によって成長因子のＤＮＡを人為的に改変させ、該改変ＤＮＡを用いて、所望蛋白質を調製することができる。
【００２０】
本発明において、細胞外マトリックスは、培養容器のコーティング剤として用いられることが好ましく、又簡便である。細胞の培養に用いられる培養容器は、細胞の培養が可能なものであれば特に限定されないが、例えば、フラスコ、組織培養用フラスコ、ディッシュ、ペトリデッシュ、組織培養用ディッシュ、マルチディッシュ、マイクロプレート、マイクロウエルプレート、マルチプレート、マルチウエルプレート、チャンバースライド、シャーレ、チューブ、トレイ、培養バック、ローラーボトルが挙げられる。
【００２１】
細胞外マトリックスによる培養容器のコーティングは、用いる細胞外マトリックスの種類に応じて当分野で通常実施されている方法によって行なうことができる。
【００２２】
その他の培養条件は、適宜設定できる。例えば、培養温度は、特に限定されるものではないが約３０〜４０℃、好ましくは約３７℃である。ＣＯ２濃度は、例えば約１〜１０％、好ましくは約２〜５％である。
【００２３】
本発明において、肝臓卵形細胞の単一細胞培養は、例えば、肝臓細胞懸濁液から、ＦＡＣＳ等の細胞分離技術を用いて分離した、ＣＤ１３３＋、ＣＤ４５−及びＴｅｒ１１９−という細胞表面マーカーの発現パターンを呈する細胞を、９６ウェルプレート等の各ウェルに１つずつ播種し、適当な培養条件下（上述）で培養することによって実施される。
【００２４】
また、肝臓卵形細胞は、適当な培養条件で培養すると、その子孫として、分化した細胞、即ち成熟した肝細胞及び胆管上皮細胞を産生する。肝臓卵形細胞の培養により産生される細胞が分化した細胞（成熟肝細胞及び胆管上皮細胞）であるか否かは、各細胞に特異的に発現している成分を該成分に特異的な親和性を有する物質を用いて検出することによって、あるいは分泌成分を直接解析することによって判定することができる。また形態学的な観察によって判定することができる場合もある。例えば、成熟肝細胞であるか否かは、アルブミン産生能の有無、グリコーゲン蓄積能の有無等を調べることによって、また、胆管上皮細胞であるか否かは、胆管様の管構造の有無、ケラチン産生能の有無等を調べることによって判断することができる。「特異的な親和性を有する物質」としては、各分泌成分に特異的親和性を有する抗体又はその断片や、各分泌成分をコードする遺伝子に特異的親和性を有するオリゴ又はポリヌクレオチドプローブが挙げられる。「抗体又はその断片」及び「オリゴ又はポリヌクレオチドプローブ」の詳細は上記に準じる。
成熟肝細胞に関しては、そのグリコーゲンの蓄積能から、ＰＡＳ染色やアルシアンブルー染色等の染色法によっても判定することもできる。
【００２５】
本発明はさらに、本発明の肝臓卵形細胞を用いて、肝臓卵形細胞の分化に影響を及ぼす物質のスクリーニング方法を提供する。当該方法は少なくとも以下の工程を含む。
(1)肝臓卵形細胞と被検物質とを反応させる工程。
(2)反応後の細胞について肝臓マーカーの発現を測定する工程。
本スクリーニング方法で使用する肝臓卵形細胞は、肝臓の機能細胞へと分化する細胞であれば特に限定されず、好ましくは上述の本発明の方法で分離された肝臓卵形細胞である。該卵形細胞と被検物質との反応は、所望とする分化の種類、分化誘導条件等に応じて適宜設定されるが、通常、３５〜４０℃、数分〜数十日、好ましくは、３６．５〜３７．５℃、５〜３０日間培養する。被検物質との反応後、該卵形細胞の分化の有無、状況を調べる。
【００２６】
肝臓卵形細胞が分化したか否かは、その肝臓のマーカーの発現を測定することにより確認することができる。当該マーカーは所望する機能細胞によって適宜選択される。例えば上述のように、成熟肝細胞への分化であればアルブミン産生、グリコーゲン蓄積を調べることにより、胆管上皮細胞への分化であればケラチン産生等を調べることにより確認できる。被検物質非存在下で肝臓卵形細胞を培養した場合に比べ有意にその肝臓機能細胞への分化を促進あるいは阻害する物質を選抜する。
【００２７】
本発明のスクリーニング方法においてその対象となる被検物質としては、既知もしくは未知の種々の物質が挙げられ、具体的には既知のサイトカイン、細胞外マトリクス、無機化合物あるいは適当な細胞培養株の培養上清や適当なｃＤＮＡライブラリーより得た未知の遺伝子またはそのリコンビナント蛋白質等が例示される。
【００２８】
さらに、形質転換された卵形細胞がげっ歯類及びヒトの両方で肝癌の起源の候補となり得ることが報告されている（参考文献１〜５）ことから、本発明の肝臓卵形細胞を用いて、肝臓における癌発生に影響を及ぼす物質をスクリーニングすることが可能となる。
参考文献１：Factor VM, Radaeva SA. Oval cells-hepatocytes relationships in Dipin-induced hepatocarcinogenesis in mice. Exp Toxicol Pathol 1993; 45: 239-244.
参考文献２：Lowes KN, Brennan BA, Yeoh GC, et al. Oval cell numbers in human chronic liver diseases are directly related to disease severity. Am J Pathol 1999; 154: 537-541.
参考文献３：Prior P. Long-term cancer risk in alcoholism. Alcohol Alcohol 1988; 23: 163-171.
参考文献４：Tsukuma H, Hiyama T, Tanaka S, et al. Risk factors for hepatocellular carcinoma among patients with chronic liver disease. N Engl J Med 1993; 328: 1797-1801.
参考文献５：Deugnier YM, Guyader D, Crantock L, et al. Primary liver cancer in genetic hemochromatosis: a clinical, pathological, and pathogenetic study of 54 cases. Gastroenterology 1993; 104: 228-234.
【実施例】
【００２９】
以下、実施例にそって本発明をさらに詳細に説明するが、これら実施例は本発明の範囲を何ら限定するものではない。また、本発明において使用する試薬や装置、材料は特に言及されない限り、商業的に入手可能である。
【００３０】
（材料と方法）
フローサイトメトリー
卵形細胞を含む細胞懸濁液を、0.1% ＤＤＣ(Sigma-Aldrich)を含む、あるいは含まない飼料で２週間飼育したＣ５７ＢＬ／６野生型マウスあるいはｐ５３−／−マウス（参考文献６）から調製し、続いて以下に示す二重プロテアーゼ消化プロトコルを行なった。肝灌流培地(liver perfusion medium; Invitrogen)及び肝臓細胞分離液(liver digest medium ; Invitrogen)を用いた通常の２工程の灌流の後、未消化の組織をさらにジスパーゼ(1000プロテアーゼ単位/mL; Godoshusei, Japan)を用いて３７℃で３０〜６０分間攪拌しながら消化した。処理後の細胞の生存度は、トリパンブルー色素排除法を用いた解析で９０％を上回っていた。細胞を染色培地(staining medium ; 3%ＦＢＳを含有するＰＢＳ)で洗浄し、次いで、参考文献７に記載の方法に従って蛍光標識した抗体とインキュベートした。フィコエリトリン（ＰＥ）−Ｃｙ７がコンジュゲートされた抗ＣＤ４５モノクローナル抗体及び抗Ｔｅｒ１１９モノクローナル抗体（ｍＡｂ）(Pharmingen)及びフルオロセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）がコンジュゲートされた抗ＣＤ１３３モノクローナル抗体(eBioscience)を用いた。ＦＡＣＳ Ａｒｉａ(BD Biosciences)を用いて、蛍光標識された細胞を解析・分離した。
参考文献６：Tsukada T., et al. Enhanced proliferative potential in culture of cells from p53-deficient mice. Oncogene 1993; 8: 3313-3322.
参考文献７：Suzuki A., et al. Clonal identification and characterization of self-renewing pluripotent stem cells in the developing liver. J Cell Biol 2002; 156: 173-184.
【００３１】
インビトロコロニーアッセイ
低密度培養解析のために、ソートされた細胞を、ＩＶ型コラーゲンをコートした６ウェルプレート(BD Biosciences)に１０００細胞／ウェルの密度で播種し、参考文献８に記載の標準培地を用いて培養した。単一細胞培養解析のために、ＦＡＣＳ Ａｒｉａによるクローン選別で同定された細胞を、ＩＶ型コラーゲンをコートした９６ウェルプレート(BD Biosciences)の個々のウェル中で培養した。培養液としては、Ｅ１３．５胎仔の肝臓細胞を７日間培養することによって得られた馴化培地を５０％添加した標準培地（上述）を用いた。いずれの培養液にもヒト組換えＨＧＦ(50 ng/ml, Sigma-Aldrich)及びＥＧＦ(20 ng/ml, Sigma-Aldrich)が含まれている。形成される大コロニー及び小コロニーの数を、培養８日後に測定した。
参考文献８：Suzuki A., et al. Flow cytometric separation and enrichment of hepatic progenitor cells in the developing mouse liver. Hepatology 2000; 32: 1230-1239.
【００３２】
遺伝子発現解析
ＲＴ−ＰＣＲ及び定量ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）は、参考文献９及び参考文献１０に準じて行なった。下記のプライマー及び／又はプローブ以外は、本発明者らの既報（参考文献７〜９）に準じて各種のＰＣＲプライマー及びプローブを調製した。
ＣＫ７ ＲＴ−ＰＣＲプライマー：
5’-ATC CGC GAG ATC ACC ATC AAT-3’（配列番号１）及び
5’-ATG TGT CTG AGA TCT GCG ACT-3’（配列番号２）
ＣＤ１３３ ｑＰＣＲプライマー／プローブ：
TaqMan Gene Expression Assay ID: Mm00477115_m1 (Applied Biosystems)
ＣＫ７ ｑＰＣＲプライマー／プローブ：
TaqMan Gene Expression Assay ID: Mm00466676_m1 (Applied Biosystems)
参考文献９：Suzuki A., et al. Role for growth factors and extracellular matrix in controlling differentiation of prospectively isolated hepatic stem cells. Development 2003; 130: 2513-2524.
参考文献１０：Suzuki A., et al., Glucagon-like peptide 1 (1-37) converts intestinal epithelial cells into insulin-producing cells. Proc Natl Acad Sci USA 2003; 100: 5034-5039.
【００３３】
免疫染色
組織切片及び培養細胞を固定し、１次抗体とインキュベートした。用いた１次抗体やその入手先、反応条件等を図１にまとめる。１次抗体とのインキュベーション後、切片及び／又は細胞を洗浄し、免疫組織化学のためには、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）をコンジュゲートした２次抗体（用いた１次抗体の種に応じて決定される、１：５００、Dako）と、免疫蛍光染色のためには、Ａｌｅｘａ ４８８−及び／又はＡｌｅｘａ ５５５をコンジュゲートした２次抗体（用いた１次抗体の種に応じて決定される、１：２００、Molecular Probes）及びＤＡＰＩを用いた。
【００３４】
細胞移植
ＤＤＣで処理した肝臓から単離されたＣＤ１３３＋ＣＤ４５−Ｔｅｒ１１９−の表現型を呈する単一細胞を培養・増殖して得られるクローン性の子孫をトリプシン処理し、洗浄し、そして100mlの標準培地に再懸濁した。得られた細胞懸濁液をＦＡＨ欠損レシピエントマウス（後述）の肝臓に脾臓内投与した(４×１０６細胞／マウス)。ＣＤ１３３＋ＣＤ４５−Ｔｅｒ１１９−の表現型を各々呈するクローンを１２個樹立した。そのうち３個のクローンをドナー細胞として移植に用いた（レシピエントのマウスは１クローンにつき６匹用いた）。ＦＡＨ欠損マウスは通常、7.5 mg/lのNTBC (K. Z. Travis氏及びJ. Doe氏より供与された)を含有する飲料水で飼育していた（参考文献１１）が、移植直後にこの処置を止めた。腫瘍形成の解析のためには、ＤＤＣを含む飼料で飼育した野生型マウス及びｐ５３−／−マウスの肝臓から単離されたＣＤ１３３＋ＣＤ４５−Ｔｅｒ１１９−の表現型を呈する単一細胞を培養・増殖して得られるクローン性の子孫をトリプシン処理し、洗浄し、マトリゲル(150ml, BD Biosciences)を含む標準培地(150ml)に再懸濁し、得られた細胞懸濁液をＮＯＤ／ＳＣＩＤレシピエントマウスに皮下注射した(３．５×１０７細胞／マウス、ｎ＝５)。
参考文献１１：Overturf K., et al., Hepatocytes corrected by gene therapy are selected in vivo in a murine model of hereditary tyrosinaemia type I. Nat Genet 1996; 12: 266-273.
【００３５】
マイクロアレイ
ＤＤＣを含まない飼料、あるいは２週間ＤＤＣを含む飼料で飼育したマウスの肝臓から、全ＲＮＡを、RNeasy Mini Kit (Qiagen)を用いて、製造元の指示書に従って調製した。ＤＤＣを含まない飼料、あるいはＤＤＣを含む飼料で飼育したマウスの肝臓における複数の遺伝子発現をOne-Cycle Target Labeling and Control Reagents (Affymetrix)及びGeneChip Mouse Genome 430 2.0 Arrays (Affymetrix)を用いてGeneChip Expression Analysis Technical Manual (Affymetrix)に従って解析した。
【００３６】
ＦＡＨ変異マウスの作製
参考文献１２〜１５に従い、ＴＴ２胚性幹（ＥＳ）細胞における相同組換えによってマウスＦＡＨの標的破壊を行った。ＰＣＲを行ってターゲティングベクター配列の５’アーム(8.2kb)及び３’アーム(5.1kb)を増幅した。用いたプライマーは以下の通り。
５’アーム用プライマー：
5’-GTT TGA GTC GAC CCA ACA AGG ATT ACA TGA GAC CGC C-3’（配列番号３）
5’-TAA GGC GGC CGC GGA TGC TCT TGC CTC CTT CCA TG-3’（配列番号４）
３’アーム用プライマー：
5’-TGC CTC GTC GAC GCG GCC GCG CTG TGA TTG CAT GTG TGA CCT TCC-3’（配列番号５）
5’-CAC CCT CGA GTT AGA CCT GCA GAT GGT AGC CGC C-3’（配列番号６）
ＦＡＨ変異マウス（ヌルアレル）を作製する為の手順を図２Ａに示す。
ＣＤ−１系ホストの胚盤胞にターゲティングされたＥＳ細胞を注入することによって生殖系列のキメラを作製した（参考文献１４）。ＰＣＲによりジェノタイピングを行なった。用いたプライマーは以下の通り。
FAHwt-F: 5’-AGG CCT AAC CTC TTG CTT CAT TCA-3’（配列番号７）
FAHmut-F: 5’-CCA GCT CAT TCC TCC CAC TC-3’（配列番号８）
FAHwt/mut-R; 5’-ATC GGG GTT CCA GAT ACC AC-3’（配列番号９）
野生型にはFAHwt-F及びFAHwt/mut-Rを用い809bpを検出した。
変異型にはFAHmut-F及びFAHwt/mut-Rを用い433bpを検出した。
（図２Ｃ参照）
尚、ＦＡＨ変異体のアクセッション番号（ＲＩＫＥＮ）はＣＤＢ０２０１Ｋである。
参考文献１２：Yagi T., et al. Homologous recombination at c-fyn locus of mouse embryonic stem cells with diphtheria toxin A fragment gene in negative selection. Proc Natl Acad Sci USA 1990; 87: 9918-9922.
参考文献１３：Yagi T., et al. A novel negative selection for homologous recombinants using diphtheria toxin A fragment gene. Anal Biochem 1993; 214: 77-86.
参考文献１４：Yagi T, Tokunaga T, Furuta Y, et al. A novel ES cell line, TT2, with high germline-differentiating potency. Anal Biochem 1993; 214: 70-76.
参考文献１５：Murata T., et al. ang is a novel gene expressed in early neuroectoderm, but its null mutant exhibits no obvious phenotype. Gene Expr Patterns 2004; 5: 171-178.
【００３７】
実施例１：胆管上皮細胞及びＤＤＣで誘導された卵形細胞におけるＣＤ１３３の発現
ＤＤＣを２週間摂食させたマウス（以下ＤＤＣマウスともいう）の肝臓で卵形細胞が生じることを、卵形細胞の特異抗原であるＡ６の免疫組織学的解析によって確認した（図３Ａ）。細胞表面マーカーが卵形細胞上に発現していることを同定する為に、本発明者らは、ＤＤＣを摂食させていないマウス（以下Ｎｏ−ＤＤＣマウスともいう）の肝臓とＤＤＣマウスの肝臓における遺伝子発現をマイクロアレイによって比較した。本解析により、ＤＤＣマウスの肝臓では、サイトケラチン（ＣＫ）１９、α−フェトプロテイン（ＡＦＰ）及びＣＤ３４のより高い発現と、それよりは幾分低いｃ−ｋｉｔ及びＴｈｙ１の発現が確認された。これらの遺伝子はそれぞれ、卵形細胞マーカーとして以前に明らかにされたものである（参考文献１６〜２０）。これらのマーカー遺伝子に加えて、ＣＤ１３３の発現量がＤＤＣマウスの肝臓で４倍以上増加していた（図３Ｂ）。続いて、定量ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）解析を行なって、ＤＤＣを含む飼料で飼育している間中、ＣＤ１３３の発現量が上昇すること、及び卵形細胞マーカーであるＣＫ１９、ＣＫ７及びＡＦＰの発現も上昇することを確認した（図４Ａ）。ＣＤ１３３タンパク質それ自体もまた、ＤＤＣマウスの肝臓中に蓄積していた（図４Ｂ）。興味深いことは、ＣＤ１３３、ＣＫ１９及びＣＫ７のｍＲＮＡの発現レベルがＤＤＣを含む飼料で飼育して、即ちＤＤＣを摂食させて２週間後の時点で同時にピークを迎えるのに対して、ＡＦＰのレベルは、ＤＤＣの摂食を開始してから１週間までに速やかに上昇することである（図４Ａ）。免疫蛍光染色による解析により、Ｎｏ−ＤＤＣマウスの肝臓の胆管上皮細胞及びＤＤＣマウスの肝臓中で増殖している卵形細胞の両方について、ＣＤ１３３が陽性であることがわかった（図４Ｃ〜Ｄ）。以上の結果から、ＣＤ１３３はＤＤＣを摂食させていないマウスの肝臓の胆管上皮細胞及びＤＤＣを摂食させることによって出現する卵形細胞の両方のマーカーとなり得ることが示された。
参考文献１６：Lemire JM, Shiojiri N, Fausto N. Oval cell proliferation and the origin of small hepatocytes in liver injury induced by D-galactosamine. Am J Pathol 1991; 139: 535-552.
参考文献１７：Fujio K, Evarts RP, Hu Z, et al. Expression of stem cell factor and its receptor, c-kit, during liver regeneration from putative stem cells in adult rat. Lab Invest 1994; 70: 511-516.
参考文献１８：Omori N, Omori M, Evarts RP, et al. Partial cloning of rat CD34 cDNA and expression during stem cell-dependent liver regeneration in the adult rat. Hepatology 1997; 26: 720-727.
参考文献１９：Petersen BE, Goff JP, Greenberger JS, et al. Hepatic oval cells express the hematopoietic stem cell marker Thy-1 in the rat. Hepatology 1998; 27: 433-445.
参考文献２０：Matsusaka S, Tsujimura T, Toyosaka A, et al. Role of c-kit receptor tyrosine kinase in development of oval cells in the rat 2-acetylaminofluorene/partial hepatectomy model. Hepatology 1999; 29: 670-676.
【００３８】
実施例２：フローサイトメトリーを用いたＣＤ１３３＋細胞の単離
ＣＤ１３３＋肝臓細胞を単離するために、Ｎｏ−ＤＤＣマウスの肝臓及びＤＤＣマウスの肝臓から得られた単一細胞を、ＣＤ１３３、ＣＤ４５（白血球共通抗原）及びＴｅｒ１１９（グリコホリンによく似た分子で未成熟な赤血球系細胞上に独占的に発現している）の発現に基づきフローサイトメトリーを用いて分画した。非造血系のＣＤ４５−Ｔｅｒ１１９−細胞集団中のＣＤ１３３＋細胞の割合はＤＤＣを摂食させなかったマウスの肝臓に比べＤＤＣを摂食させたマウスの肝臓の方が５倍以上も高かった（図５Ａ）。ＤＤＣマウスの肝臓中でのＣＤ４５＋及びＴｅｒ１１９＋造血系細胞の割合の増加は、ＤＤＣによって引き起こされる炎症反応の増強に関係しているかもしれない。Ｎｏ−ＤＤＣマウスの肝臓及びＤＤＣマウスの肝臓からすぐに単離したＣＤ１３３＋ＣＤ４５−Ｔｅｒ１１９−細胞の免疫蛍光染色解析から、全細胞で、ＣＫ７の発現は認められたがアルブミンの発現は認められなかった（アルブミンは肝臓細胞のマーカータンパク質である）（図５Ｂ）。
次に、Ｎｏ−ＤＤＣマウスの肝臓及びＤＤＣマウスの肝臓から単離されたＣＤ１３３＋ＣＤ４５−Ｔｅｒ１１９−細胞を特徴付けるために、これらの細胞を低密度で培養した。ＩＶ型コラーゲンでコーティングした６ウェルプレートの各ウェルに１０００個の細胞を播種した。６ウェルプレートでは、細胞は増殖しコロニーを形成することができるのでセミ・クローン解析が可能である。この条件で、Ｎｏ−ＤＤＣマウスの肝臓から単離されたＣＤ１３３＋ＣＤ４５−Ｔｅｒ１１９−細胞は、細胞培養８日経過した時点でも、１０〜５０個の細胞から構成される小コロニーを形成するのみであった（図５Ｃ）。一方、ＤＤＣマウスの肝臓から単離されたＣＤ１３３＋ＣＤ４５−Ｔｅｒ１１９−細胞は、小コロニーだけでなく、数百の細胞から構成される大コロニーもまた形成することができた（図５Ｃ）。これら２つの型の細胞コロニーは培養中のそれらの大きさによって容易に区別することができる。ＣＤ１３３＋ＣＤ４５−Ｔｅｒ１１９−細胞を単離し培養すると小コロニー及び大コロニーの両方ともを頻繁に生じたが、ＣＤ４５＋Ｔｅｒ１１９＋細胞亜集団やＣＤ１３３−ＣＤ４５−Ｔｅｒ１１９−細胞亜集団から単離された細胞ではコロニーは形成されないか、されても僅かであった（図５Ｄ）。大コロニーを形成する細胞の出現はＤＤＣ処置に強く依存しており、小コロニーの数もまた、ＤＤＣを摂食させたマウスの肝臓では５倍上昇していた（図５Ｄ）。さらに、ＤＤＣマウスの肝臓由来のＣＤ１３３＋ＣＤ４５−Ｔｅｒ１１９−細胞による大コロニーの形成には、培養条件として、成長因子〔肝臓細胞増殖因子（ＨＧＦ）及び／又は上皮増殖因子（ＥＧＦ）〕と細胞外マトリックス（ＥＣＭ）成分（ＩＶ型コラーゲン又はラミニン）を必要とすることがわかった（図６参照）。
【００３９】
実施例３：単一細胞培養及びＣＤ１３３＋ＣＤ４５−Ｔｅｒ１１９−細胞のクローン解析
ＣＤ１３３＋ＣＤ４５−Ｔｅｒ１１９−細胞の潜在性を調べるために、本発明者らはフローサイトメトリーによって細胞のクローン選別を行い、その後ＩＶ型コラーゲンをコーティングした９６ウェルプレートの各ウェルで細胞を培養することを試みた。セミ・クローナルな低密度培養条件と同様に、ＣＤ１３３＋ＣＤ４５−Ｔｅｒ１１９−細胞亜集団から単離された細胞は、肝臓がＤＤＣ処置を受けたものであるか否かに応じて、各ウェルで小コロニーあるいは大コロニーを形成した（図７）。ＣＤ１３３＋ＣＤ４５−Ｔｅｒ１１９−細胞の単一細胞培養におけるクローナルなコロニー形成により、もとの細胞から分化した細胞の研究及び特徴づけが可能になる。Ａｌｂ及びＣＫ７に対する抗体を用いた免疫蛍光染色解析から、培養６日後及び１８日後では、ＤＤＣマウスの肝臓及びＮｏ−ＤＤＣマウスの肝臓に由来する小コロニーの大部分は、ＣＫ７のみを発現する細胞で構成されていることがわかった（図８Ａ、Ｂ）。対照的に、培養６日後では、大コロニーの半分はＣＫ７＋細胞、Ａｌｂ＋ＣＫ７＋細胞、及び少数のＡｌｂ＋細胞から構成され、残りの半分のコロニーは独占的にＣＫ７＋細胞によって構成されていた（図８Ａ、Ｂ）。しかしながら１８日後には、７０％以上の大コロニーは最終的にはＡｌｂ＋細胞、ＣＫ７＋細胞、及び少数のＡｌｂ＋ＣＫ７＋細胞から構成されるようになった（図８Ａ、Ｂ）。コロニーサイズや培養期間の長さに係らず、Ａｌｂ＋細胞のみで形成されるコロニーは観察されなかった（図８Ｂ）。ＲＴ−ＰＣＲによる解析は、また、大コロニーに含まれる細胞が、肝細胞及び胆管上皮細胞のマーカーをコードしている複数の遺伝子（トリプトファン−２，３−ジオキシゲナーゼ、グルタチオン Ｓ−トランスフェラーゼ、及びグルタミン合成酵素等といった成熟肝細胞で検出される遺伝子を含む）を発現していることを示した（図９）。ｃＫｉｔ、ＣＤ３４及びＴｈｙ１等の卵形細胞のマーカーとして報告されている遺伝子がすべての大コロニーで発現しているわけではないことは興味深い。さらに、３週間以上培養した大コロニーでは、機能的に成熟した肝細胞に類似する、十分にグリコーゲンを蓄積した、多くの二核性のＡｌｂ＋細胞がコロニーの中央付近に出現した（図８Ｃ、Ｄ）。ＤＤＣマウスの肝臓から単離されたＣＤ１３３＋ＣＤ４５−Ｔｅｒ１１９−細胞は、最初はＣＫ７に陽性であるがＡｌｂに対しては陰性である（図５Ｂ）ので、大コロニーを形成することができる細胞は培養過程でＡｌｂ＋の成熟した肝細胞へと分化する子孫を生み出すものと考えられた。
【００４０】
実施例４：ＣＤ１３３＋ＣＤ４５−Ｔｅｒ１１９−細胞の自己複製能
次に、ＤＤＣマウスの肝臓から単離されたＣＤ１３３＋ＣＤ４５−Ｔｅｒ１１９−細胞に自己複製能があるかを調べるためにサブクローニング実験を行なった。ＩＶ型コラーゲンをコーティングした９６ウェルプレートの各ウェル中で形成された個々のクローナルなコロニー中の細胞をトリプシン処理し、ＩＶ型コラーゲンをコーティングした６ウェルプレートに再播種した。培養１４日後、ＤＤＣマウスの肝臓を起源とする継代培養した細胞からは多くの大コロニー（一つのコロニーから５〜１０個のコロニー）が生じたが、Ｎｏ−ＤＤＣマウスの肝臓を用いた場合には大コロニーを生じることはなかった（図１０Ａ）。これらの二次的コロニー中の細胞をトリプシン処理し、クローン選別にかけ単一細胞培養を行なった。再び大コロニーを形成できる再選別された細胞の割合は低かった（１〜３％）が、形成したコロニーの８０％以上において、培養１８日目までにＡｌｂ＋細胞及びＣＫ７＋細胞の両方に分化した細胞が含まれていた（図１０Ｃ）。大コロニーを形成した最初に選別した細胞と同様に、再選別された細胞によって再び形成された大コロニーでは培養過程で次第にＡｌｂ＋細胞を生じるようになったが、Ａｌｂ＋細胞のみを含むコロニーは形成されなかった（図１０Ｃ）。これらのデータは、ＤＤＣを摂食させたマウスの肝臓から単離された、大コロニーを形成するＣＤ１３３＋ＣＤ４５−Ｔｅｒ１１９−細胞がＡｌｂ＋肝細胞及びＣＫ７＋胆管上皮細胞を子孫として生み出すだけでなく、培養中、自己複製する細胞分裂によって肝細胞と胆管上皮細胞へ分化可能な細胞を維持し続けていることを示している。
【００４１】
実施例５：ＣＤ１３３＋ＣＤ４５−Ｔｅｒ１１９−細胞のインビボでの分化能及び肝組織再構築能
傷ついた組織の再構成と機能修復は、器官幹細胞及び器官前駆細胞が有する特別な役割の一つである。以前に報告されたように、ＤＤＣを摂食させた成体マウスの肝臓から単離された卵形細胞には、ＦＡＨ欠損マウスの肝臓に移植することにより肝組織を再構築する能力がある(参考文献２１)。ＤＤＣを摂食させたマウスの肝臓細胞から単離されたＣＤ１３３＋ＣＤ４５−Ｔｅｒ１１９−細胞もまた同様に肝組織を再構築することができ卵形細胞として定義され得るのか否かを決定するために、これらの細胞をＦＡＨ−／−マウスの肝臓に脾臓内移植した。ここで用いたＦＡＨ−／−マウスは、ＦＡＨをターゲット破壊したＥＳ細胞から作製したものであり（上記した、「ＦＡＨ変異マウスの作製」の項を参照、図２）、これらのマウスは他のＦＡＨ変異マウスと表現型の上では識別不可能である。本発明において、本発明者らは、肝組織（すなわち、成熟肝細胞）を再構築できる他の細胞種の混入の可能性を排除するために、単一のＣＤ１３３＋ＣＤ４５−Ｔｅｒ１１９−細胞由来のクローン化した子孫細胞をドナー細胞として用いた。移植後１及び２ヶ月経過した時点で、ＦＡＨ＋ドナー細胞は、全てのレシピエントマウスで広範に生着し、肝小結節を再構築した。これらのマウスは長期間２−（２−ニトロ−４−トリフルオロメチルベンゾイル）−１，３−シクロヘキサンジオン（ＮＴＢＣ）を中止しても生存することができた（図１１Ａ−Ｃ）。さらに、免疫蛍光染色及び過ヨウ素酸シッフ試薬（ＰＡＳ試薬）染色により、ＦＡＨ＋ドナー由来の細胞がＡｌｂを発現し、十分にグリコーゲンを蓄積していることが明らかになった（データ示さず）。これらのデータは、ドナー細胞のプール内に他の細胞系列の混入の可能性がないので、ＤＤＣを摂食させたマウスの肝臓から単離され、増殖しているＣＤ１３３＋ＣＤ４５−Ｔｅｒ１１９−細胞は、形態学上及び機能的に成熟した肝細胞を生み出すことによって肝組織を再構築する能力を有していることを示している。即ち、ＤＤＣを摂食させたマウスの肝臓から単離され、増殖しているＣＤ１３３＋ＣＤ４５−Ｔｅｒ１１９−細胞を肝臓卵形細胞と定義付けすることが可能である。
参考文献２１：Wang X, Foster M, Al-Dhalimy M, et al. The origin and liver repopulating capacity of murine oval cells. Proc Natl Acad Sci USA 2003; 100 Suppl 1: 11881-11888.
【００４２】
実施例６：ｐ５３欠失ＣＤ１３３＋ＣＤ４５−Ｔｅｒ１１９−細胞による肝癌形成
ＤＤＣをマウスに与える実験系と同様に、Ｄｉｐｉｎ（シスプラチン）やコリン欠乏エチオニン添加食を用いたげっ歯類の肝癌発生の幾つかの実験モデルにおいて、並びにより頻度高く肝癌へと進行するヒト肝臓の病変（Ｃ型肝炎ウイルス、ヘモクロマトーシス及びアルコール性肝疾患等）においてもまた卵形細胞が観察されている（参考文献１〜５）。
このことは、形質転換された卵形細胞がげっ歯類及びヒト両方での肝癌の起源の候補となり得ることを示唆している。この考え方は、また、多くのタイプの癌で想定上の癌始原細胞あるいは癌幹細胞の存在を示す最近の証拠によってサポートされている（参考文献２２〜３０）。この考え方に一致して、コリン欠乏エチオニン添加食を与えたｐ５３欠失マウス由来の卵形細胞が不死化細胞株を生み出し、ヌードマウスに注射することによって腫瘍細胞を作り出すことが報告されている（参考文献３１）。
ＣＤ１３３＋ＣＤ４５−Ｔｅｒ１１９−細胞が腫瘍形成を開始し得るのか否かを調べるために、ＤＤＣを摂食させたｐ５３−／−マウスの肝臓からＣＤ１３３＋ＣＤ４５−Ｔｅｒ１１９−細胞を単離した。ＤＤＣを摂食させたｐ５３−／−マウスの肝臓から単離されたＣＤ１３３＋ＣＤ４５−Ｔｅｒ１１９−細胞は、大コロニーを形成し増殖したが、ＤＤＣを摂食させていないｐ５３−／−マウスの肝臓から単離された細胞では大コロニーを形成せず増殖もしなかった。これは野生型マウスの肝臓由来のＣＤ１３３＋ＣＤ４５−Ｔｅｒ１１９−細胞に類似した結果であった（図１２Ａ）。しかしながら、ＤＤＣを摂食させたｐ５３−／−マウスの肝臓から得られたＣＤ１３３＋ＣＤ４５−Ｔｅｒ１１９−細胞は、肝細胞及び胆管上皮細胞へ分化する能力には影響を受けていない（図１２Ｃ−Ｄ）ものの、野生型マウスの肝臓由来のものに比べてよりサイズが小さく、また顕著に高い増殖能を有していた（図１２Ａ−Ｂ）。ＤＤＣを摂食させたｐ５３−／−マウスの肝臓由来のＣＤ１３３＋ＣＤ４５−Ｔｅｒ１１９−細胞から増幅させたクローン性の細胞を、非肥満性糖尿病重症免疫不全（ＮＯＤ／ＳＣＩＤ）マウスに皮下注射して２ヶ月後、Ａｌｂ＋肝細胞及び胆管様構造を形成するケラチン＋胆管上皮細胞を含有する腫瘍が、全動物で形成された。一方、野生型マウス由来の細胞を移植した肝臓では腫瘍は形成されなかった（図１２Ｅ−Ｋ）。従って、ＤＤＣを摂食させたｐ５３−／−マウスの肝臓から単離されたＣＤ１３３＋ＣＤ４５−Ｔｅｒ１１９−細胞は、肝細胞癌及び胆管癌の両方の特徴を有する腫瘍を形成することができ、これらの細胞は、ｐ５３の機能を欠失させることにより腫瘍を引き起こす能力を獲得する肝臓卵形細胞として特徴づけることができる。
参考文献２２： Bonnet D, Dick JE. Human acute myeloid leukemia is organized as a hierarchy that originates from a primitive hematopoietic cell. Nat Med 1997; 3: 730-737.
参考文献２３：Al-Hajj M, Wicha MS, Benito-Hernandez A, et al. Prospective identification of tumorigenic breast cancer cells. Proc Natl Acad Sci USA 2003; 100: 3983-3988.
参考文献２４：Singh SK, Hawkins C, Clarke ID, et al. Identification of human brain tumour initiating cells. Nature 2004; 432: 396-401.
参考文献２５：Collins AT, Berry PA, Hyde C, et al. Prospective identification of tumorigenic prostate cancer stem cells. Cancer Res 2005; 65: 10946-10951.
参考文献２６：Ricci-Vitiani L, Lombardi DG, Pilozzi E, et al. Identification and expansion of human colon-cancer-initiating cells. Nature 2007; 445, 111-115.
参考文献２７：O'Brien CA, Pollett A, Gallinger S, et al. A human colon cancer cell capable of initiating tumour growth in immunodeficient mice. Nature 2007; 445: 106-110.
参考文献２８：Prince ME, Sivanandan R, Kaczorowski A, et al. Identification of a subpopulation of cells with cancer stem cell properties in head and neck squamous cell carcinoma. Proc Natl Acad Sci USA 2007; 104: 973-978.
参考文献２９：Zucchi I, Sanzone S, Astigiano S, et al. The properties of a mammary gland cancer stem cell. Proc Natl Acad Sci USA 2007; 104: 10476-10481.
参考文献３０：Li C, Heidt DG, Dalerba P, et al. Identification of pancreatic cancer stem cells. Cancer Res 2007; 67: 1030-1037.
参考文献３１：Dumble ML, Croager EJ, Yeoh GC, et al. Generation and characterization of p53 null transformed hepatic progenitor cells: oval cells give rise to hepatocellular carcinoma. Carcinogenesis 2002; 23: 435-445.
【配列表フリーテキスト】
【００４３】
配列番号１：ＣＫ７ ＲＴ−ＰＣＲプライマー
配列番号２：ＣＫ７ ＲＴ−ＰＣＲプライマー
配列番号３：ターゲティングベクター配列の５’アーム増幅用プライマー。
配列番号４：ターゲティングベクター配列の５’アーム増幅用プライマー。
配列番号５：ターゲティングベクター配列の３’アーム増幅用プライマー。
配列番号６：ターゲティングベクター配列の３’アーム増幅用プライマー。
配列番号７：プライマー、FAHwt-F
配列番号８：プライマー、FAHmut-F
配列番号９：プライマー、FAHwt/mut-R
【図面の簡単な説明】
【００４４】
【図１】図１は、組織切片及び培養細胞の免疫染色に用いる１次抗体の種類、その入手先、及び反応条件等をまとめた図である。
【図２】図２は、ＦＡＨ変異マウス（ヌルアレル）を作製するための手順を示した図である。（Ａ）ＥＳ細胞における相同組換えによるマウスＦＡＨの標的破壊（Ｂ）もとになるＥＳ細胞及びターゲッティングされたＥＳ細胞ゲノムの５’及び３’プローブを用いたサザンブロット（Ｃ）ＦＡＨ＋／＋野生型、ＦＡＨ＋／−ヘテロ接合体及びＦＡＨ−／−マウスの尾の端から得られたゲノムＤＮＡを用いたＰＣＲジェノタイピングＭ：マーカー
【図３】図３は、卵形細胞が誘導されるのと同時にＣＤ１３３の発現が上昇することを示した図である。（Ａ）Ｎｏ−ＤＤＣマウスの肝臓（上パネル）及びＤＤＣマウスの肝臓（下パネル）におけるＡ６の免疫組織学的染色。ＤＤＣを摂食させて２週間で肝臓の門脈の周辺に卵形細胞の増殖が誘導される。胆管上皮細胞及び卵形細胞の両方でＡ６が発現している。スケールバー；５００μｍ（Ｂ）Ｎｏ−ＤＤＣマウス及びＤＤＣマウス（摂食期間２週間）の肝臓における複数の遺伝子の発現をマイクロアレイ解析により比較した。このグラフは、卵形細胞の増殖が活性化された場合に発現が増加する遺伝子、及びＣＤ１３３の発現のデータを示している。全てのデータは、Ｎｏ−ＤＤＣマウスの肝臓を用いた場合の値で標準化し、何倍の差があるかで示した。
【図４】図４は、胆管上皮細胞及びＤＤＣで誘導された卵形細胞におけるＣＤ１３３の特異的発現を示した図である。（Ａ）Ｎｏ−ＤＤＣマウスの肝臓及びＤＤＣを摂食させた（１〜４週間）マウスの肝臓の、ｑＰＣＲによる遺伝子発現解析の結果を示す。全てのデータは、Ｎｏ−ＤＤＣマウスの肝臓を用いた場合の値で標準化し、何倍の差があるかで示した。平均値±標準偏差（ｎ＝３）で示した。（Ｂ）Ｎｏ−ＤＤＣマウスの肝臓及びＤＤＣを摂食させた（１〜４週間）マウスの肝臓から得られたタンパク質サンプルのウエスタンブロットの結果を示す。（Ｃ−Ｄ）Ｎｏ−ＤＤＣマウスの肝臓及びＤＤＣを摂食させた（２週間）マウスの肝臓の、ＣＤ１３３とＡ６との（図Ｃ）あるいはＣＤ１３３とケラチンとの（図Ｄ）二重免疫蛍光染色の染色像を示す図である。ＤＮＡはＤＡＰＩで染色した。スケールバー；１００μｍ
【図５】図５は、フローサイトメトリーにより単離されたＣＤ１３３＋ＣＤ４５−Ｔｅｒ１１９−細胞のインビトロでのセミ・クローナルなコロニー解析の結果を示した図である。（Ａ）細胞表面マーカーの発現に基づいて、Ｎｏ−ＤＤＣマウスの肝臓由来の細胞及びＤＤＣマウスの肝臓由来の細胞をフローサイトメトリーによって分画した。まず、ＣＤ４５＋細胞及びＴｅｒ１１９＋細胞にゲートをかけ、Ｎｏ−ＤＤＣマウスの肝臓細胞及びＤＤＣマウスの肝臓細胞から血球系細胞を排除した。次いで、ＣＤ４５−Ｔｅｒ１１９−細胞（それぞれの比率は各々の左のパネルに示されている）をＣＤ１３３の発現に基づいてさらに分画した。インビトロのコロニー解析のためには、ソーティングゲートをＣＤ１３３＋ＣＤ４５−Ｔｅｒ１１９−細胞亜集団及びＣＤ１３３−ＣＤ４５−Ｔｅｒ１１９−細胞亜集団に設定した。ＣＤ４５−Ｔｅｒ１１９−細胞におけるＣＤ１３３＋細胞の割合並びに分画していない全細胞におけるＣＤ１３３＋細胞の割合を、各右のパネルに、括弧の外と中に％でそれぞれ示した。アイソタイプコントロール抗体で染色された、Ｎｏ−ＤＤＣマウスの肝臓由来の細胞をコントロールとして用いた（上段のパネル）。（Ｂ）フローサイトメトリーによって、Ｎｏ−ＤＤＣマウスの肝臓及びＤＤＣマウスの肝臓から単離してすぐにガラススライドに接着させたＣＤ１３３＋ＣＤ４５−Ｔｅｒ１１９−細胞に対して、アルブミン（Ａｌｂ）とサイトケラチン（ＣＫ）７との二重免疫蛍光染色を行なった。ＤＮＡはＤＡＰＩで染色した。スケールバー；５０μｍ（Ｃ）Ｎｏ−ＤＤＣマウスの肝臓及びＤＤＣマウスの肝臓から単離したＣＤ１３３＋ＣＤ４５−Ｔｅｒ１１９−細胞は、８日間培養した後、セミ・クローナルなコロニーを形成した。大コロニーは、ＤＤＣマウスの肝臓から得られるＣＤ１３３＋ＣＤ４５−Ｔｅｒ１１９−細胞からのみ形成された。各コロニーの形態を示す。スケールバー；５００μｍ（上段パネル）、１００μｍ（下段パネル）。（Ｄ）Ｎｏ−ＤＤＣマウスの肝臓及びＤＤＣマウスの肝臓由来の各細胞亜集団について１０００細胞あたりの小コロニー及び大コロニーの数を示す。このグラフは、３つの個別に行なった実験中、各細胞亜集団について１２ディッシュの平均を示すものである（平均値±標準偏差）。
【図６】図６は、ＤＤＣマウスの肝臓由来のＣＤ１３３＋ＣＤ４５−Ｔｅｒ１１９−細胞のコロニー形成能が、培養液中の増殖因子（ＧＦ）及び細胞外マトリックス（ＥＣＭ）に強く依存していることを示す図である。（Ａ）ＤＤＣマウスの肝臓からＣＤ１３３＋ＣＤ４５−Ｔｅｒ１１９−細胞を単離し、ＩＶ型コラーゲンでコーティングされた６ウェルプレートのウェル中で、増殖因子の存在下あるいは非存在下、低密度培養条件下で培養した。細胞は培養８日後、ＨＧＦ及び／又はＥＧＦが存在する場合にのみ大コロニーを形成することができた。各コロニーを示す。スケールバー；５００μｍ（上段パネル）、１００μｍ（下段パネル）。（Ｂ）ＤＤＣマウスの肝臓から単離された細胞（ＣＤ１３３＋ＣＤ４５−Ｔｅｒ１１９−細胞）１０００個あたりの小コロニー及び大コロニーの数を示す図である。細胞は、ＩＶ型コラーゲンでコーティングされた６ウェルプレート中、ＨＧＦ及び／又はＥＧＦの存在下、あるいは非存在下で８日間培養してコロニーを形成させた（ｎ＝３、平均値±標準偏差）。（Ｃ）ＤＤＣマウスの肝臓から単離された細胞（ＣＤ１３３＋ＣＤ４５−Ｔｅｒ１１９−細胞）１０００個あたりの小コロニー及び大コロニーの数を示す図である。細胞は、コーティング処理していない６ウェルプレート（コート処理なし）、ＩＶ型コラーゲンでコーティングされた６ウェルプレート、あるいはラミニンでコーティングされた６ウェルプレート中、ＨＧＦ及びＥＧＦの存在下で８日間培養してコロニーを形成させた（ｎ＝８、平均値±標準偏差）。
【図７】図７は、ＣＤ１３３＋ＣＤ４５−Ｔｅｒ１１９−細胞の単一細胞培養とクローナルなコロニー形成を示した図である。（Ａ）Ｎｏ−ＤＤＣマウスの肝臓由来のＣＤ１３３＋ＣＤ４５−Ｔｅｒ１１９−細胞の単一細胞培養。ＩＶ型コラーゲンをコーティングした９６ウェルプレートのウェル中で、培養８日後に形成された代表的な小コロニーを示す。（Ｂ−Ｃ）Ａで示された小コロニーを拡大した像である。スケールバー：５００μｍ（Ｂ）、１００μｍ（Ｃ）（Ｄ）ＤＤＣマウスの肝臓由来のＣＤ１３３＋ＣＤ４５−Ｔｅｒ１１９−細胞の単一細胞培養。ＩＶ型コラーゲンをコーティングした９６ウェルプレートのウェル中で、培養８日後に形成された代表的な大コロニーを示す。（Ｅ−Ｆ）Ｄで示された大コロニーを拡大した像である。スケールバー：５００μｍ（Ｅ）、１００μｍ（Ｆ）
【図８】図８は、ＤＤＣマウスの肝臓由来のＣＤ１３３＋ＣＤ４５−Ｔｅｒ１１９−細胞からの多系列のコロニー形成（インビトロ）を示した図である。（Ａ）Ｎｏ−ＤＤＣマウスの肝臓あるいはＤＤＣマウスの肝臓から単離されたＣＤ１３３＋ＣＤ４５−Ｔｅｒ１１９−細胞の単一細胞培養（６日間及び１８日間）により得られたクローナルなコロニーに対してＡｌｂ及びＣＫ７の二重免疫蛍光染色を行なった。代表的なコロニーを示す。ＤＮＡをＤＡＰＩで染色した（下段パネル）。スケールバー：１００μｍ（Ｂ）Ｎｏ−ＤＤＣマウスの肝臓あるいはＤＤＣマウスの肝臓由来のＣＤ１３３＋ＣＤ４５−Ｔｅｒ１１９−細胞から形成されるコロニーに対して、Ａｌｂ＋細胞及びＣＫ７＋細胞、Ａｌｂ＋細胞及びＣＫ７−細胞、Ａｌｂ−細胞及びＣＫ７＋細胞、又はＡｌｂ−細胞及びＣＫ７−細胞によって構成されているクローナルなコロニーの割合を、Ａｌｂ及びＣＫ７の二重免疫蛍光染色によって測定した。培養６日後、及び１８日後のコロニーについて調べた。Ｎｏ−ＤＤＣマウスの肝臓あるいはＤＤＣマウスの肝臓に由来するＣＤ１３３＋ＣＤ４５−Ｔｅｒ１１９−細胞から形成される小コロニーのデータはよく似ていた。本グラフは３つの独立した実験の平均値を示している（平均値±標準偏差）。各実験で調べたコロニーの数は１６〜６２個である。（Ｃ）Ｎｏ−ＤＤＣマウスとは異なり、ＤＤＣマウスの肝臓に由来するＣＤ１３３＋ＣＤ４５−Ｔｅｒ１１９−細胞は、培養２５日後には、十分にグリコーゲンを蓄積している機能的な成熟肝細胞を生み出すことがＰＡＳ染色によって明らかになった。スケールバー：１００μｍ（Ｄ）クローナルなコロニーについてＡｌｂの免疫蛍光染色を行なうことにより、培養３０日後には、二核性のＡｌｂ＋成熟肝細胞がＤＤＣを摂食させたマウスの肝臓由来のＣＤ１３３＋ＣＤ４５−Ｔｅｒ１１９−細胞から分化してくることが明らかとなった。ＤＮＡはＤＡＰＩで染色した。スケールバー：１００μｍ
【図９】図９は、ＤＤＣマウスの肝臓由来のＣＤ１３３＋ＣＤ４５−Ｔｅｒ１１９−細胞の単一培養細胞によって形成された大コロニー１２株について、各系列のマーカー遺伝子の発現を調べた結果を示した図である。１８日目にＲＴ−ＰＣＲを用いて調べた。
【図１０】図１０は、ＤＤＣマウスの肝臓から単離された１個のＣＤ１３３＋ＣＤ４５−Ｔｅｒ１１９−細胞に由来する二次的にクローン選別された子孫の多能性を示す図である。（Ａ）個々のコロニー内で細胞を１４日間継代培養することにより、ＤＤＣマウスの肝臓から単離されたＣＤ１３３＋ＣＤ４５−Ｔｅｒ１１９−細胞の１つの子孫からは２次的なコロニーが形成されたが、Ｎｏ−ＤＤＣマウスの肝臓から単離されたものからではコロニーは形成されなかった。これらの二次コロニーをＴｕｅｒｋ’ｓ溶液で染色し写真撮影した。さらにＤＤＣマウスの肝臓由来のＣＤ１３３＋ＣＤ４５−Ｔｅｒ１１９−細胞の自己複製能を解析するために、二次コロニーの細胞に対しフローサイトメトリーにより二次クローン選別を行なって単一細胞培養を行なった。（Ｂ）ＤＤＣマウスの肝臓由来のＣＤ１３３＋ＣＤ４５−Ｔｅｒ１１９−細胞の再選別された子孫を単一細胞培養して１８日後、Ａｌｂ及びＣＫ７の二重免疫蛍光染色を行なった。代表的なコロニーを示す。ＤＮＡはＤＡＰＩで染色した。スケールバー：１００μｍ（Ｃ）ＤＤＣマウスの肝臓由来のＣＤ１３３＋ＣＤ４５−Ｔｅｒ１１９−細胞の再選別された子孫から形成されたこれらのコロニーについて、Ａｌｂ＋細胞及びＣＫ７＋細胞、Ａｌｂ＋細胞及びＣＫ７−細胞、Ａｌｂ−細胞及びＣＫ７＋細胞、あるいはＡｌｂ−細胞及びＣＫ７−細胞によって、培養１８日後に構成されるクローナルなコロニーの割合を、Ａｌｂ及びＣＫ７の二重免疫蛍光染色によって測定した。このグラフは、３つの独立した実験の平均値を示すものである（平均値±標準偏差）。各実験で調べたコロニーの数は１２〜２１個である。
【図１１】図１１は、ＤＤＣマウスの肝臓から単離された単一のＣＤ１３３＋ＣＤ４５−Ｔｅｒ１１９−細胞由来の増殖したクローン性の子孫が、インビボで肝組織を再構築することができたことを示した図である。（Ａ）ＮＴＢＣを与えたＦＡＨ−／−マウス（上段パネル）及びＤＤＣを摂食させたマウスの肝臓由来のＣＤ１３３＋ＣＤ４５−Ｔｅｒ１１９−細胞のクローン性の子孫を培養して調製される細胞を移植して２ヶ月後のＦＡＨ−／−マウス（下段パネル）の肝臓について、ＦＡＨの免疫組織化学的染色を行なった。ドナー細胞に由来するＦＡＨ＋肝小結節がレシピエントマウスの肝臓で多く観察された。差込図は各スライドのヘマトキシリン肝臓染色の像を示している。（Ｂ−Ｃ）レシピエントＦＡＨ−／−マウスの肝臓におけるドナー細胞に由来するＦＡＨ＋肝小結節の拡大図である。移植１ヶ月後（Ｂ）及び２ヶ月後（Ｃ）。スケールバー：１００μｍ
【図１２】図１２は、ＤＤＣマウスの肝臓から単離されたｐ５３欠失ＣＤ１３３＋ＣＤ４５−Ｔｅｒ１１９−細胞による肝癌形成の様子を示した図である。（Ａ）ｐ５３の欠落に係らず、クローナルな大コロニー及び小コロニーが、ＤＤＣを摂食させた、あるいは摂食させていないマウスの肝臓から単離された。これは野生型（ｐ５３＋／＋）のマウス由来のＣＤ１３３＋ＣＤ４５−Ｔｅｒ１１９−細胞での結果と同様である。しかしながら、ＤＤＣを摂食させたｐ５３−／−マウスの肝臓に由来するＣＤ１３３＋ＣＤ４５−Ｔｅｒ１１９−細胞から増殖した細胞は、野生型のマウスの肝臓に由来するものに比べて小さかった。スケールバー：１００μｍ（Ｂ）ＤＤＣを摂食させたｐ５３−／−マウスの肝臓から単離された単一のＣＤ１３３＋ＣＤ４５−Ｔｅｒ１１９−細胞のクローン原性の子孫はＤＤＣを摂食させた野生型のマウスに由来するものに比べてより活発に増殖した。ＩＶ型コラーゲンをコーティングした６ウェルプレートの各々に１０００個の細胞を播種した（ｎ＝３、平均値±標準偏差）。（Ｃ−Ｄ）ＤＤＣを摂食させたｐ５３−／−マウスの肝臓由来のＣＤ１３３＋ＣＤ４５−Ｔｅｒ１１９−細胞を１８日間単一細胞培養し、形成された大コロニーについてＡｌｂ及びＣＫ７の二重免疫蛍光染色を行なった（Ｃ）。代表的なコロニーを示す。ＤＮＡはＤＡＰＩで染色した（Ｄ）。スケールバー：５０μｍ（Ｅ）ＤＤＣを摂食させたｐ５３−／−マウスの肝臓由来の単一ＣＤ１３３＋ＣＤ４５−Ｔｅｒ１１９−細胞のクローン性の子孫は、ＮＯＤ／ＳＣＩＤレシピエントマウスに皮下注射２ヵ月後には腫瘍を形成したが、野生型マウス由来のものは腫瘍を形成しなかった。（Ｆ）Ｅに示したレシピエントマウスから解離された腫瘍。スケールバー：１ｃｍ（Ｇ−Ｈ）胆管様構造を有する（Ｈ）あるいは有さない（Ｇ）腫瘍領域のヘマトキシリン−エオシン（ＨＥ）染色。Ｇ−Ｋに示されるデータはＦに存在する腫瘍から得られたものである。スケールバー：１００μｍ（Ｉ−Ｋ）多くのＡｌｂ＋細胞及び僅かなケラチン＋細胞を含有する腫瘍の領域（Ｉ）、胆管様構造を形成する多くのケラチン＋細胞及び僅かなＡｌｂ＋細胞を含有する腫瘍の領域（Ｊ）、及びＡｌｂ＋細胞及び胆管様構造を形成するケラチン＋細胞の両方を含有する腫瘍の領域（Ｋ）。スケールバー：１００μｍ
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＣＤ１３３、ＣＤ４５及びＴｅｒ１１９の発現を調べる工程を含む、哺乳動物から肝臓卵形細胞を分離及び／又は取得する方法。
【請求項２】
ＣＤ１３３を発現し、ＣＤ４５及びＴｅｒ１１９を発現していない細胞を選別する工程をさらに含む、請求項１記載の方法。
【請求項３】
肝臓卵形細胞の産生を誘導する工程をさらに含む、請求項１又は２記載の方法。
【請求項４】
肝臓卵形細胞を成長因子及び細胞外マトリックスの存在下で培養する工程をさらに含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
成長因子が、ＨＧＦ及び／又はＥＧＦである、請求項４記載の方法。
【請求項６】
細胞外マトリックスがコラーゲン又はラミニンである、請求項４記載の方法。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法によって哺乳動物の肝臓から分離及び／又は取得される肝臓卵形細胞。
【請求項８】
ＣＤ１３３、ＣＤ４５及びＴｅｒ１１９の３つの細胞表面マーカーをＣＤ１３３＋、ＣＤ４５−及びＴｅｒ１１９−のパターンで呈する、肝臓卵形細胞。
【請求項９】
哺乳動物の肝臓における分化に影響を及ぼす物質をスクリーニングするための方法であって、以下の工程を含む方法；
(1)肝臓卵形細胞と被検物質とを反応させる工程、
(2)反応後の細胞について肝臓マーカーの発現を測定する工程。
【請求項１】
ＣＤ１３３、ＣＤ４５及びＴｅｒ１１９の発現を調べる工程を含む、哺乳動物から肝臓卵形細胞を分離及び／又は取得する方法。
【請求項２】
ＣＤ１３３を発現し、ＣＤ４５及びＴｅｒ１１９を発現していない細胞を選別する工程をさらに含む、請求項１記載の方法。
【請求項３】
肝臓卵形細胞の産生を誘導する工程をさらに含む、請求項１又は２記載の方法。
【請求項４】
肝臓卵形細胞を成長因子及び細胞外マトリックスの存在下で培養する工程をさらに含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
成長因子が、ＨＧＦ及び／又はＥＧＦである、請求項４記載の方法。
【請求項６】
細胞外マトリックスがコラーゲン又はラミニンである、請求項４記載の方法。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法によって哺乳動物の肝臓から分離及び／又は取得される肝臓卵形細胞。
【請求項８】
ＣＤ１３３、ＣＤ４５及びＴｅｒ１１９の３つの細胞表面マーカーをＣＤ１３３＋、ＣＤ４５−及びＴｅｒ１１９−のパターンで呈する、肝臓卵形細胞。
【請求項９】
哺乳動物の肝臓における分化に影響を及ぼす物質をスクリーニングするための方法であって、以下の工程を含む方法；
(1)肝臓卵形細胞と被検物質とを反応させる工程、
(2)反応後の細胞について肝臓マーカーの発現を測定する工程。
【図１】
【図９】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図９】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【公開番号】特開２００９−１９５１４２（Ｐ２００９−１９５１４２Ａ）
【公開日】平成２１年９月３日（２００９．９．３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−３９０１５（Ｐ２００８−３９０１５）
【出願日】平成２０年２月２０日（２００８．２．２０）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り 平成１９年１２月１１日及び平成１９年１２月１２日 特定非営利活動法人日本分子生物学会及び社団法人日本生化学会主催のＢＭＢ２００７（第３０回日本分子生物学会年会・第８０回日本生化学会大会 合同大会）において、文書を持って発表（「ＢＭＢ２００７（第３０回日本分子生物学会年会・第８０回日本生化学会大会 合同大会）講演要旨集」（平成１９年１１月２５日発行）において要旨を掲載）
【出願人】（５０３３５９８２１）独立行政法人理化学研究所 (1,056)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２１年９月３日（２００９．９．３）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年２月２０日（２００８．２．２０）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り 平成１９年１２月１１日及び平成１９年１２月１２日 特定非営利活動法人日本分子生物学会及び社団法人日本生化学会主催のＢＭＢ２００７（第３０回日本分子生物学会年会・第８０回日本生化学会大会 合同大会）において、文書を持って発表（「ＢＭＢ２００７（第３０回日本分子生物学会年会・第８０回日本生化学会大会 合同大会）講演要旨集」（平成１９年１１月２５日発行）において要旨を掲載）
【出願人】（５０３３５９８２１）独立行政法人理化学研究所 (1,056)
【Ｆターム（参考）】
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