胃がんのリンパ節転移判定方法
【課題】胃がんのリンパ節転移判定方法、判定装置及び試薬キットを提供する。
【解決手段】胃がんの患者から採取されたリンパ節組織を用いて調製された検出試料中のサイトケラチン１９のｍＲＮＡを、定量ＲＴ−ＰＣＲ又は定量ＲＴ−ＬＡＭＰ法により増幅・定量する工程と、前記ｍＲＮＡの定量値に基づいて前記胃がんのリンパ節への転移を判定する工程と、を含む胃がんのリンパ節転移判定方法、及び該方法に基づく判定装置、並びに該方法に使用される試薬キット。
【解決手段】胃がんの患者から採取されたリンパ節組織を用いて調製された検出試料中のサイトケラチン１９のｍＲＮＡを、定量ＲＴ−ＰＣＲ又は定量ＲＴ−ＬＡＭＰ法により増幅・定量する工程と、前記ｍＲＮＡの定量値に基づいて前記胃がんのリンパ節への転移を判定する工程と、を含む胃がんのリンパ節転移判定方法、及び該方法に基づく判定装置、並びに該方法に使用される試薬キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、胃がんのリンパ節転移判定方法、判定装置、及びそれに使用される試薬キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
近年臨床診断の分野において遺伝子検査が急速に普及している。遺伝子検査の一例として、がんのリンパ節転移診断がある。がん細胞は、原発巣を離れ、血管やリンパ管を経由して全身に転移する。がんの手術では、できるだけ確実に病巣を取り除くことが必要であるため、転移を正確に検出し、転移の度合いに応じて適切な処置をすることが要求される。このため、術中のがん細胞のリンパ節転移診断は極めて重要な意義を有している。がんのリンパ節転移診断の一手法として、正常細胞には発現しないか若しくは発現量が低く、がん細胞には多く発現するタンパク質の核酸を標的核酸として検出する方法がある。近年の遺伝子解析技術の発展により、生体から切除したリンパ節組織に含まれる標的核酸を増幅し、検出することで、効果的にがん診断を行うことが可能になってきている。
【０００３】
このような、遺伝子検査による特定の組織へのがん転移を検査するために、現在、ＬＡＭＰ法（loop-mediated isothermal amplification method）やＰＣＲ（polymerase chain reaction）法などを用いたがんの遺伝子検査の研究が盛んに行われるようになっている。この遺伝子検査は、組織や細胞などに含まれるがんマーカー（例えば、がん細胞に特異的に発現するタンパク質のｍＲＮＡなど）を検出することにより行うことができる。
【０００４】
がんマーカー（以下、単にマーカーともいう）の一つであるサイトケラチン１９（ＣＫ１９）は、乳がんのリンパ節転移を判定するためのマーカーとして有用であることが知られている。ＣＫ１９は、正常なリンパ節での発現量とリンパ節に転移してきた乳がん細胞での発現量とに有意な差が認められる分子である。
【０００５】
胃がんは、中国、日本、韓国などアジアや南米に患者が多い。日本における胃がんは、２００３年のがんの死亡者数の統計では、男性では肺がんに次いで第２位、女性では大腸がんに次いで第２位である。また、胃がんは自覚症状が少ないため、早期発見が難しく、進行してリンパ節等にも転移することが多い。
【０００６】
従来、胃がんのリンパ節転移を判定するためのマーカーとしては、サイトケラチン２０や癌胎児性抗原が用いられている。しかしながら、胃がんの遺伝子検査に関する報告は少なく、胃がんのリンパ節転移を判定するための、さらなる方法の開発が望まれていた。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明はこのような事情に鑑みてなされたものであり、胃がんのリンパ節転移判定方法、判定装置及び試薬キットを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明の第一の実施形態は、胃がんの転移が疑われるリンパ節組織を用いて調製された検出試料中のサイトケラチン１９のｍＲＮＡを定量する工程と、得られた前記ｍＲＮＡの定量値に基づいて胃がんのリンパ節への転移を判定する工程と、を含む胃がんのリンパ節転移判定方法である。
本発明の第二の実施形態は、胃がんの転移が疑われるリンパ節組織を用いて調製された検出試料中のサイトケラチン１９のｍＲＮＡを定量する定量手段と、得られたｍＲＮＡの定量値に基づいて胃がんのリンパ節への転移を判定する判定手段と、を備える胃がんのリンパ節転移判定装置である。
本発明の第三の実施形態は、検出試料を調製するためのリンパ節組織の前処理液と、サイトケラチン１９を検出し得るプライマを含むプライマ溶液と、核酸増幅法を実施するための酵素を含む酵素溶液と、を有する胃がんのリンパ節転移判定用試薬キットである。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、胃がんのリンパ節転移判定方法、判定装置及び試薬キットを提供することができる。これにより、効果的な胃がんの遺伝子検査を行うことができる。さらに、本発明によれば、胃がんが転移したリンパ節組織における転移巣の転移レベルを判定することができる。転移巣レベルを判定することにより、手術の要否決定のための指標、あるいは術式を決定するための指標を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
本発明の一実施形態において、転移レベルは、胃がんが転移したリンパ節組織において、転移の程度または転移巣の状態を反映するものであれば特に限定されない。転移レベルの指標は、たとえば、転移巣のサイズまたは転移巣におけるがん細胞数として表される。
【００１１】
リンパ節における転移は、大きさに基づいてマイクロメタスタシス（微小転移）とマクロメタスタシスに分類される。転移巣が長径２ｍｍ未満のとき、マイクロメタスタシス（Micro metastasis：微小転移）と呼ばれる。転移巣が長径２ｍｍ以上のとき、マクロメタスタシス（Macro metastasis）と呼ばれる。さらに、0.2mm未満の転移巣は、遊離がん細胞(Isolated Tumor Cell：ITC)と呼ばれる。一般に、マクロメタスタシスと診断されると、転移巣の摘出が必要とされる。マイクロメタスタシスは、転移巣がそれ以上大きくなるかが判断できない状態とされる。本発明の一実施形態において、マイクロメタスタシスとマクロメタスタシスとを識別可能な値に閾値を設定することができる。また、転移巣の大きさに応じて複数の閾値を設定してもよい。
【００１２】
本発明の一実施形態において、用いられる検体としては、胃がんの患者から採取されたリンパ節組織を含む試料を例示することができる。より具体的な検体としては、生検の目的で採取された胃がん近傍のリンパ節組織が挙げられる。
【００１３】
検出試料としては、検体中のサイトケラチン１９のｍＲＮＡを定量できるものであれば、特に制限されるものではない。例えば検体と前処理液とを混合し、前処理液中の検体に対して化学的及び／又は物理的処理を行うことによって、検体に含まれる細胞中のｍＲＮＡを液中に移行（可溶化）させ、ｍＲＮＡを得る。この溶液を検出試料とすることができる。
【００１４】
前処理液としては、検体に含まれる細胞中のｍＲＮＡを可溶化できるものであれば、特に限定されない。前処理液としては、例えば、緩衝液等が挙げられる。緩衝液は、ＲＮＡの分解を抑制するために酸性であることが好ましく、より具体的にはｐＨ２．５〜５．０が好ましく、特に３．０〜４．０が好ましい。ｐＨをこの範囲に保つために、公知の緩衝剤を用いることができ、具体的な緩衝剤としてはグリシン−塩酸緩衝剤などが挙げられる。緩衝剤の濃度は、緩衝液のｐＨを上記の範囲に保つことができるものであれば特に限定されない。
【００１５】
また、前処理液には界面活性剤を含有させることが好ましい。界面活性剤によって細胞膜や核膜が損傷するため、この損傷を通して細胞中の核酸が溶液中に移行しやすくなる。このような作用を有するものであれば界面活性剤の種類は特に限定されないが、非イオン性界面活性剤が好ましく、ポリオキシエチレン系非イオン性界面活性剤がよりこのましい。
特に、次のような一般式：
Ｒ１−Ｒ２−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−Ｈ
（ここで、Ｒ１は炭素数１０〜２２のアルキル基、アルケニル基、アルキニル基、イソオクチル基；Ｒ２は−Ｏ−又は−（Ｃ６Ｈ４）−Ｏ−；ｎは８〜１２０の整数）で表されるポリオキシエチレン系非イオン性界面活性剤が好適である。例えば、ポリオキシエチレンラウリルエーテル、ポリオキシエチレンセチルエーテル、ポリオキシエチレンオレイルエーテル、ポリオキシエチレンミリスチリルエーテル、ポリオキシエチレンステアリルエーテル、ポリオキシエチレンノニルフェニルエーテル、及びポリオキシエチレンイソオクチルフェニルエーテルなどを用いることができる。具体的には、Ｂｒｉｊ３５(ポリオキシエチレン(３５)ラウリルエーテル)などが好適である。前処理液中の界面活性剤の濃度は０．１〜６％（ｖ／ｖ）が好ましく、より好ましくは１〜５％（ｖ／ｖ）である。
【００１６】
また、ｍＲＮＡの定量を後述の核酸増幅法により行う場合は、前処理液にジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を含有させることが好ましい。リンパ節には、核酸増幅における酵素反応を阻害する物質（阻害物質）が含まれていることがあるが、ＤＭＳＯの作用によってこの阻害物質の影響を効果的に低減することができる。また、ＤＭＳＯには核酸増幅酵素の活性の低下を抑制する効果もある。前処理液中のＤＭＳＯの濃度としては、１〜５０％（ｖ／ｖ）が好ましく、５〜３０％（ｖ／ｖ）がより好ましく、１０〜２５％（ｖ／ｖ）が最も好ましい。
【００１７】
上記のような前処理液を用いることにより、市販の精製キットなどを用いて一般的に行われる核酸の抽出・精製を行うことなく、簡便かつ短時間で検出試料を調製することができる。
【００１８】
上記の検体と前処理液との混合割合は、特に限定されないが、検体１ｍｇに対して０．０００１〜０．００５ｍＬ程度の前処理液を用いることができる。上記の混合は、特に限定されないが、例えば室温で検体と前処理液とが充分に混合される程度の時間行うことができる。
【００１９】
検体と前処理液の混合において、検体を前処理液中で破砕するのが好ましい。破砕する方法としては、ホモジナイザーによるホモジナイズ、凍結融解などが挙げられる。ホモジナイザーとしては、当該分野において通常用いられるものを用いることができ、例えばワーリングブレンダー、ポッター・エルベージェム型ホモジナイザー、ポリトロン型ホモジナイザー、ダウンス型ホモジナイザー、フレンチプレス、超音波破砕機などが挙げられる。破砕の条件は、用いる方法及び装置に応じて適宜設定され得る。
【００２０】
上記の方法により破砕された破砕液を、遠心分離、フィルターろ過、カラムクロマトグラフィーなどの通常の精製方法を用いて粗精製することにより検出試料を調製することができる。また、検出試料の状態に応じて、核酸抽出法などの方法によりさらに精製してもよい。
【００２１】
本発明の一実施形態において、検出試料中のサイトケラチン１９のｍＲＮＡの定量は、たとえば、核酸増幅法やＤＮＡチップ等を用いて公知の方法により行うことができる。特に核酸増幅法を用いることが好ましい。
【００２２】
サイトケラチン１９のｍＲＮＡの定量に用いることのできるＤＮＡチップとしては、サイトケラチン１９のｃＤＮＡとハイブリダイズ可能なポリデオキシリボヌクレオチド及び／又はその断片を固定化した基盤を用いることができる。ＤＮＡチップを用いたＲＮＡの検出は、一般的に用いられる公知の方法により行うことができる。例えば、以下のようにして行うことができる。先ず、検出用試料中のｍＲＮＡの３'末端に存在するポリＡ配列に結合するプライマーを用いて逆転写反応を行う。逆転写反応の際に例えばＣｙ３やＣｙ５などの蛍光物質で標識されたヌクレオチドを用いることにより、蛍光標識されたｃＤＮＡが合成される。これを上記のポリデオキシリボヌクレオチドを固定化した基盤と接触させ、このポリヌクレオチドと標識されたｃＤＮＡとの二本鎖を形成させる。ついで、ｃＤＮＡの蛍光を測定することにより、サイトケラチン１９のｍＲＮＡを定量することができる。
【００２３】
サイトケラチン１９のｍＲＮＡの定量に用いることのできる核酸増幅法としては、核酸増幅反応の前に逆転写反応を含む核酸増幅法、例えば、ＲＴ−ＰＣＲ（Reverse Transcription PCR）やＲＴ−ＬＡＭＰ(Reverse Transcription LAMP：LAMP法については米国特許６４１０２７８号公報参照)等の公知の核酸増幅方法を用いることができる。より具体的には、上記の検出試料と、サイトケラチン１９を検出し得るプライマと、核酸増幅法を実施するための酵素とを含む反応液を調製し、得られた反応液を用いて核酸増幅を行い、増幅されたｃＤＮＡを測定することができる。
【００２４】
本発明の一実施形態において、プライマは、プライマ溶液として１つの試薬として提供されてもよい。プライマ溶液は、サイトケラチン１９を検出するためのプライマを含有する溶液であれば、特に制限されるものではない。プライマ溶液としては、溶液中でプライマが安定であり、保存が可能であるものが好ましい。
【００２５】
本発明の一実施形態において、核酸増幅法を実施するための酵素は、酵素溶液として１つの試薬として提供されてもよい。酵素溶液としては、核酸増幅法を実施することができるものであれば、特に制限されるものではない。酵素溶液としては、たとえば、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ（逆転写酵素）及びＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ（以下、単にＤＮＡポリメラーゼともいう）をそれぞれ単独に独立して調製された酵素溶液、又は逆転写酵素及びＤＮＡポリメラーゼを共に含有する酵素溶液を用いることができる。特に、逆転写酵素及びＤＮＡポリメラーゼを共に含む酵素溶液が、反応液の調製における簡便性の観点から望ましい。
【００２６】
逆転写反応及び核酸増幅反応は、プライマの配列等に応じて適宜条件を変更することができる。逆転写反応及び核酸増幅反応の条件は、例えばSambrook, J. et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2nd ed.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, New Yorkに記載されたものを用いることができる。
【００２７】
サイトケラチン１９を検出するためのプライマとしては、サイトケラチン１９のｍＲＮＡまたはそのｃＤＮＡを増幅することができるポリヌクレオチドが挙げられる。その配列は特に限定されないが、具体的には以下の配列番号で示されるプライマが挙げられる。尚、配列番号１及び２に示されるプライマはＲＴ−ＰＣＲに好適なプライマのセットであり、配列番号５〜１０に示されるプライマはＲＴ−ＬＡＭＰに好適なプライマのセットである。
＜ＲＴ−ＰＣＲのプライマ＞
配列番号１：5'-CAGATCGAAGGCCTGAAGGA-3'
配列番号２：5'- CTTGGCCCCTCAGCGTACT-3'
＜ＲＴ−ＬＡＭＰのプライマ＞
配列番号５：5'-GGAGTTCTCAATGGTGGCACCAACTACTACACGACCATCCA-3'
配列番号６：5'-GTCCTGCAGATCGACAACGCCTCCGTCTCAAACTTGGTTCG-3'
配列番号７：5'-TGGTACCAGAAGCAGGGG-3'
配列番号８：5'-GTTGATGTCGGCCTCCACG-3'
配列番号９：5'-AGAATCTTGTCCCGCAGG-3'
配列番号１０：5'-CGTCTGGCTGCAGATGA-3'
【００２８】
上記のプライマは、当該技術において通常用いられる技術により修飾されていてもよい。上記プライマの標識は、放射活性元素又は非放射活性分子を用いて行うことができる。用いられる放射活性同位体としては、32P、33P、35S、3H又は125Iを挙げることができる。非放射活性物質は、ビオチン、アビジン、ストレプトアビジン又はジゴキシゲニンのようなリガンド、ハプテン、色素及び放射線発光性、化学発光性、生物発光性、蛍光又はリン光性の試薬のような発光性試薬から選択される。
【００２９】
逆転写活性を有する酵素及びＤＮＡポリメラーゼは、当該技術においてよく知られたものを用いることができる。逆転写活性を有する酵素としては、AMV (Avian Myeloblastosis Virus) 逆転写酵素、M-MLV (Molony Murine Leukemia Virus) 逆転写酵素などが挙げられる。また、ＤＮＡポリメラーゼとしては、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｂｓｔ ＤＮＡポリメラーゼなどを用いることができる。
【００３０】
上記の核酸増幅により生成した核酸増幅産物を測定することにより、サイトケラチン１９のｍＲＮＡを定量することができる。この際、定量ＲＴ−ＰＣＲ（Quantitative Reverse Transcription-PCR）や定量ＲＴ−ＬＡＭＰ(Quantitative Reverse Transcription-LAMP)等が好ましく用いられる。これらの方法によると、核酸（ｃＤＮＡ）増幅に伴って反応液の光学的状態（濁度、吸光度、蛍光強度など）が変化するため、これをリアルタイムに測定することにより、サイトケラチン１９のｍＲＮＡの定量を行うことができる。
【００３１】
ＲＴ−ＰＣＲの具体例としては、ＴａｑＭａｎ（登録商標）法や、核酸増幅反応前の反応液にＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎを予め添加しておき、増幅反応中にｃＤＮＡの増幅に伴って増加する蛍光強度をリアルタイムに測定するＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ法など、公知のものを用いることができる。サイトケラチン１９のｍＲＮＡの定量値は、反応液の蛍光強度が所定の値に達するまでのサイクル数に基づいて算出することができる。
【００３２】
ＲＴ−ＬＡＭＰを用いる場合、ｃＤＮＡの増幅に伴い副産物としてピロリン酸マグネシウムが多量に生成される。このピロリン酸マグネシウムは不溶性であるため、ピロリン酸マグネシウムの増加に伴って反応液が白濁する。よって、反応液の濁度（又は吸光度）をリアルタイムで光学的に測定することにより、サイトケラチン１９のｍＲＮＡを定量することができる。また、ＲＴ−ＬＡＭＰ法においても、上記ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ法を用いることができる。サイトケラチン１９のｍＲＮＡの定量値は、たとえば、反応液の濁度、吸光度、蛍光強度などが所定の値に達するまでの時間に基づいて算出することができる。
【００３３】
本発明の一実施形態において、胃がんのリンパ節への転移を判定する工程としては、上述した検出試料中のサイトケラチン１９のｍＲＮＡの定量値に基づいて、絶対的又は相対的に胃がんのリンパ節への転移を判定できるものであれば、特に制限されるものではないが、サイトケラチン１９のｍＲＮＡの定量値と閾値とを比較するのが好ましい。
【００３４】
サイトケラチン１９のｍＲＮＡの定量値は、標準化の処理の有無に関わらず、胃がんのリンパ節転移の判定工程に用いることができるが、標準化を行わず、サイトケラチン１９のｍＲＮＡの絶対量を、定量値として用いることが好ましい。
【００３５】
ここで、標準化とは、上記のサイトケラチン１９のｍＲＮＡの定量で得られた定量値を、胃がんの患者から採取されたリンパ節組織を含む試料、即ち検体の量に応じた値に換算することをいう。より具体的には、上記のサイトケラチン１９のｍＲＮＡの定量で得られた定量値を、検体の量あるいは該量を反映する情報、好ましくは内部標準、より好ましくはハウスキーピング遺伝子のｍＲＮＡの量あるいは該量を反映する情報で除すること等を示す。
【００３６】
ハウスキーピング遺伝子とは、多くの組織や細胞に一定量発現していると一般に考えられている遺伝子である。ハウスキーピング遺伝子としては、例えば、β−アクチン、ＧＡＰＤＨ(グリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ)、β２−マイクログロブリン、ＨＰＲＴ１(ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ１)などの遺伝子が挙げられる。また、ハウスキーピング遺伝子のｍＲＮＡの量を反映する情報とは、サイトケラチン１９と同様の方法でハウスキーピング遺伝子の定量を行ったときに得られる情報のことである。
【００３７】
本発明の一実施形態において、検体のハウスキーピング遺伝子のｍＲＮＡの測定値は、標準化のためではなく、正確に核酸増幅反応が行われたか否かを判定するためのコントロールとして用いることもできる。ハウスキーピング遺伝子は殆どの種類の細胞で発現が認められるため、ハウスキーピング遺伝子のｍＲＮＡが検出される場合は、がんマーカーの核酸増幅反応も適切に行われたと考えられる。一方、ハウスキーピング遺伝子のｍＲＮＡが検出されない場合は、たとえば酵素の失活により、核酸増幅反応が正確に行われなかった可能性が考えられる。
【００３８】
本発明の一実施形態において、サイトケラチン１９のｍＲＮＡの絶対量とは、ｍＲＮＡの定量に付された検出試料中における、サイトケラチン１９のｍＲＮＡの絶対量又は該絶対量を反映する情報を示す。絶対量を求める際には、上述のような標準化を行なわない。このような、該絶対量を定量値として用い、予め決められた閾値と直接比較すると、標準化を行ったものより正確に胃がんのリンパ節転移を判定することができる。
【００３９】
従来行われている組織診によるがん転移判定は、組織切片を作成し、染色等の処理を行って検鏡することにより行われる。しかし、検鏡による組織診では組織の一部しか検査できないため、がん細胞を含まない面で切片を作製するとがん細胞を見落とす可能性がある。一方、分子検査によるがん転移判定では、切除した組織試料全体（あるいは切片作製後の余剰の組織試料）を用いることができるため、一部の断面のみで検査する組織診とは違い見落としの可能性が低い。
【００４０】
本発明の一実施形態において、閾値は、胃がんのリンパ節転移が確認された陽性検体に含まれるｍＲＮＡの定量値以下であって、胃がんのリンパ節転移がないことが確認された陰性検体に含まれるｍＲＮＡの定量値よりも高い値に設定することができる。複数の陽性検体のｍＲＮＡ定量値と複数の陰性検体のｍＲＮＡ定量値とを予め測定し、最も高確率に陽性検体と陰性検体とを区別できる値を閾値として設定することが好ましい。より具体的な閾値としては、サイトケラチン１９のｍＲＮＡの定量に定量ＲＴ−ＰＣＲを用いた場合は、８〜６９０コピーが好ましく、定量ＲＴ−ＬＡＭＰを用いた場合は、１０〜２７０コピーが好ましい。
【００４１】
本発明の判定方法の判定工程は、サイトケラチン１９のｍＲＮＡの定量値に基づいて前記胃がんのリンパ節への転移を判定する。また、サイトケラチン１９のｍＲＮＡの定量値と閾値とを比較し、ｍＲＮＡの定量値が閾値よりも高い場合はリンパ節転移が陽性であり、閾値よりも低い場合は陰性であると判定することができる。このような判定結果を得ることにより、術式、切除範囲、術後の治療方針などの決定の指標となり得る。
【００４２】
ｍＲＮＡの定量値は、がん転移レベルに応じて、転移巣の大きさや転移巣に含まれるがん細胞数に相関する。そのため、上記したようにｍＲＮＡの定量値に基づき、リンパ節における転移巣の定量的な測定や段階的な測定を行うことができる。段階的な測定を行う場合は、ｍＲＮＡの定量値と、予め設定された複数の閾値とが比較される。この場合、少なくとも１つの閾値（第１の閾値）は、がん陰性およびがん陽性を識別可能に設定されることが好ましい。これらの閾値は、がんや腫瘍マーカーの種類に応じて適宜設定される。また、転移巣を定量的に測定する場合でも、この第１の閾値を用いて陰性と陽性とを識別し、転移陽性のものに関してがん病巣の定量的測定を行うことが好ましい。
【００４３】
本発明の一実施形態において、第１の閾値は、がん細胞の存在が確認されたリンパ節(陽性検体)に含まれるｍＲＮＡの定量値以下であって、がん細胞が存在しないことが確認されたリンパ節(陰性検体)に含まれるｍＮＲＡの定量値よりも高い値に設定することができる。複数の陽性検体のｍＲＮＡ定量値と複数の陰性検体のｍＲＮＡ定量値とを予め測定し、最も高確率に陽性検体と陰性検体とを区別できる値を閾値として設定することが好ましい。
【００４４】
上記のような段階的な情報を得る場合は、第１の閾値の他にさらに第２の閾値が用いられる。たとえば、上記第１の閾値と、弱陽性と強陽性とを識別可能な第２の閾値とを予め設定する。ｍＲＮＡの定量値が第１の閾値未満であった場合、実質的にがん病巣が存在しない（即ち、がん陰性）と判定することができる。また、ｍＲＮＡの定量値が第１の閾値以上、第２の閾値未満であった場合は、サイズの比較的小さいがん病巣が存在する（がん弱陽性）と判定することができる。さらに、ｍＲＮＡの定量値が第２の閾値以上であった場合は、サイズの比較的大きいがん病巣が存在する（がん強陽性）と判定することができる。
【００４５】
リンパ節における転移は、大きさに基づいてマイクロメタスタシス（微小転移）とマクロメタスタシスに分類される。転移巣が長径２ｍｍ未満のとき、マイクロメタスタシス（Micro metastasis：微小転移）と呼ばれる。転移巣が長径２ｍｍ以上のとき、マクロメタスタシス（Macro metastasis）と呼ばれる。さらに、0.2mm未満の転移巣は、遊離がん細胞(Isolated Tumor Cell：ITC)と呼ばれる。一般に、マクロメタスタシスと診断されると、転移巣の摘出が必要とされる。マイクロメタスタシスは、転移巣がそれ以上大きくなるかが判断できない状態とされる。本発明の一実施形態において、上記の第２の閾値は、マイクロメタスタシスとマクロメタスタシスとを識別可能な値に設定することができる。また、第２の閾値以外にも転移巣の大きさに応じて複数の閾値を設定してもよい。
【００４６】
サイトケラチン１９のｍＲＮＡの発現量を測定することにより、リンパ節中のがん細胞の数やがん病巣のサイズ（面積、体積、質量等）を測定することができる。すなわち、リンパ節におけるサイトケラチン１９のｍＲＮＡ発現量は、胃がん患者のリンパ節摘出範囲を決定するための指標となり得る。たとえば、検査したリンパ節に大きな転移巣がなければ、それ以上範囲を広げて摘出する必要はない。検査したリンパ節に大きな転移巣があれば、さらに広範囲のリンパ節の摘出を行う必要がある。現在の病理診断では、2mmのマクロメタスタシスを確実に検出できるのは、理屈上、リンパ節径が４ｍｍ以下であり、それ以上の大きさのリンパ節では転移巣を見落とす可能性がある。病理診断と本発明の方法を併用すれば、転移巣を見落とす可能性を低下させることができる。
【００４７】
本発明の一実施形態である胃がんのリンパ節転移判定装置は、胃がんの患者から採取されたリンパ節組織を用いて調製された検出試料中のサイトケラチン１９のｍＲＮＡを定量する定量手段と、前記ｍＲＮＡの定量値に基づいて胃がんのリンパ節への転移を判定する判定手段を備えている。
【００４８】
本発明の一実施形態において、定量手段は、胃がんの患者から採取されたリンパ節組織を用いて調製された検出試料中のサイトケラチン１９のｍＲＮＡを定量することができるものであれば、特に限定されない。定量手段としては、ＬＡＭＰ法やＰＣＲ法により増幅された核酸を定量し得る核酸増幅測定装置が好ましい。該核酸増幅測定装置は、検出試料中のサイトケラチン１９のｍＲＮＡをプライマと核酸増幅酵素とにより増幅して得られる核酸増幅産物を測定する測定部を備える。
【００４９】
本発明の一実施形態において、判定手段は、上記の定量手段で定量されたサイトケラチン１９のｍＲＮＡの定量値に基づいて胃がんのリンパ節への転移を、絶対的又は相対的に判定できるものであれば、特に限定されない。判定手段としては、定量値と予め決定された閾値とを比較することによりがんの転移を判定するものが好ましい。定量値は、検出用試料中の前記サイトケラチン１９のｍＲＮＡの絶対量であることが、特に好ましい。また、この装置は、得られた判定結果を表示する表示部を備えていてもよい。
本発明の一実施形態において、装置は、リンパ節組織における転移巣の転移レベルを判定するための指標を得る手段を備える。転移レベルの指標を得る手段は、がんの転移を判定するがん転移判定手段と別の手段であってもよいし、双方の機能を備える１つの手段であってもよい。
【００５０】
胃がんのリンパ節転移判定装置の一実施形態を、図１〜３に示す。図１は、本発明の一実施形態による判定装置の全体構成を示した斜視図である。図２は、図１に示した定量手段としての核酸増幅測定装置の全体構成を示した斜視図である。図３は、図２の核酸増幅測定装置の概略平面図である。
【００５１】
本発明のある実施形態の判定装置は、図１に示すように、核酸増幅測定装置１０１と、該核酸増幅測定装置と有線又は無線による通信ができるように接続された判定手段としてのパーソナルコンピュータ(ＰＣ)１０２とにより構成され得る。
【００５２】
核酸増幅測定装置１０１は、図２に示すように分注機構部１０と、試料セット部２０と、チップセット部３０と、チップ廃棄部４０と、５つの反応検出ブロック５０ａからなる反応検出部５０と、分注機構部１０をＸ軸方向及びＹ軸方向に移送するための移送部６０とを含んでいる。
【００５３】
分注機構部１０は、図２に示すように、移送部６０によりＸ軸方向及びＹ軸方向（水平方向）に移動されるアーム部１１と、アーム部１１に対してそれぞれ独立してＺ軸方向（垂直方向）に移動可能な２連（２本）のシリンジ部１２とを含んでいる。
【００５４】
図２及び図３に示すように、試料セット部２０には、装置の手前から順番に、１０個の試料容器セット孔２１ａ〜２１ｊと、１つの酵素試薬容器セット孔２１ｋ及び１つのプライマ試薬容器セット孔２１ｌとが設けられている。また、１０個の試料容器セット孔２１ａ〜２１ｊは、５行２列に配列するように設けられている。そして、試料容器セット孔２１ｃ及び２１ｄと、試料容器セット孔２１ｅ及び２１ｆと、試料容器セット孔２１ｇ及び２１ｈと、試料容器セット孔２１ｉ及び２１ｊとは、それぞれ、装置の奥側から順に、試料セット位置１、試料セット位置２、試料セット位置３及び試料セット位置４に設けられている。
【００５５】
本実施形態では、正面左側の試料容器セット孔２１ｃ、２１ｅ、２１ｇ及び２１ｉには、予め切除生体組織（リンパ節）を処理（ホモジナイズ、ろ過など）して作製された可溶化抽出液（検出試料）が収容された試料容器２２がセットされる。正面右側の試料容器セット孔２１ｄ、２１ｆ、２１ｈ及び２１ｊには、上記した試料を１０倍に希釈した希釈試料が収容された試料容器２３がセットされる。
【００５６】
試料容器セット孔２１ａには、増幅するべき核酸が正常に増幅することを確認するための陽性コントロールが収容された容器２４が載置されるとともに、試料容器セット孔２１ｂには、増幅するべきでない核酸が正常に増幅しないことを確認するための陰性コントロールを収容した容器２５がセットされる。
【００５７】
酵素試薬容器セット孔２１ｋ及びプライマ試薬容器セット孔２１ｌには、それぞれ、サイトケラチン１９のｍＲＮＡに対応するｃＤＮＡ（以下、単にＣＫ１９ともいう）を増幅するための核酸増幅酵素試薬が収容された酵素試薬容器２６と、ＣＫ１９のプライマ試薬が収容されたプライマ試薬容器２７とがセットされている。
【００５８】
反応検出部５０の各反応検出ブロック５０ａは、図２及び図３に示すように、反応部５１と、２つの濁度検出部５２と、蓋閉機構部５３（図２参照）とから構成されている。各反応検出ブロック５０ａに設けられる反応部５１には、図３に示すように、検出セル５４をセットするための２つの検出セルセット孔５１ａが設けられている。各反応検出ブロック５０ａは、装置の奥側から順に、セルセット位置１、セルセット位置２、セルセット位置３、セルセット位置４及びセルセット位置５に配置されている。
【００５９】
また、濁度検出部５２は、反応部５１の一方の側面側に配置された基板５５ａに取り付けられた４６５ｎｍの波長を有する青色ＬＥＤからなるＬＥＤ光源部５２ａと、反応部５１の他方の側面側に配置された基板５５ｂに取り付けられたフォトダイオード受光部５２ｂとによって構成されている。各反応検出ブロック５０ａには、１つのＬＥＤ光源部５２ａと１つのフォトダイオード受光部５２ｂとからなる１組の濁度検出部５２が２組ずつ配置されている。
【００６０】
また、検出セル５４は、試料を収容するため２つのセル部５４ａと、２つのセル部５４ａを塞ぐ２つの蓋部５４ｂとを有している。
【００６１】
また、移送部６０は、図２に示すように、分注機構部１０をＹ軸方向に移送するための直動ガイド６１及びボールネジ６２と、ボールネジ６２を駆動するためのステッピングモータ６３と、分注機構部１０をＸ軸方向に移送するための直動ガイド６４及びボールネジ６５と、ボールネジ６５を駆動するためのステッピングモータ６６とを含んでいる。なお、分注機構部１０のＸ軸方向及びＹ軸方向への移送は、ステッピングモータ６３及び６６により、それぞれ、ボールネジ６２及び６５を回転させることにより行う。
【００６２】
パーソナルコンピュータ１０２は、図１に示すように、入力機器のキーボード１０２ａ及びマウス１０２ｂと、モニタからなる表示部１０２ｃと、試料の測定結果を分析するＣＰＵ１０２ｄとを含む。
【００６３】
次に、図１〜図３を参照して、本実施形態による判定装置１の動作について説明する。この実施形態では、上記したように、胃がん手術での切除リンパ節組織中に存在するサイトケラチン１９のｍＲＮＡをＬＡＭＰ法により増幅させ、増幅に伴い発生するピロリン酸マグネシウムによる白濁による濁度の変化を測定することによりサイトケラチン１９のｍＲＮＡを定量し、定量値を閾値と比較して該リンパ節へのがんの転移を判定する装置について説明する。
【００６４】
予め切除組織を処理（たとえば、ホモジナイズ、ろ過など）して作製された可溶化抽出液（以下、試料という）が収容された試料容器２２を、試料容器セット孔２１ｃ〜２１ｊにセットする（図２及び図３参照）。陽性コントロールが収容された容器２４及び陰性コントロールが収容された容器２５を、それぞれ、試料容器セット孔２１ａ及び２１ｂ（図３参照）にセットする。酵素試薬容器セット孔２１ｋ及びプライマ試薬容器セット孔２１ｌには、それぞれ、ＣＫ１９の増幅のための核酸増幅酵素試薬が収容された酵素試薬容器２６と、ＣＫ１９の増幅のためのプライマ試薬が収容されたプライマ試薬容器２７とをセットする（図３参照）。チップセット部３０には、それぞれ３６本の使い捨て用のピペットチップ３１が収納された２つのラック３２を設置する。
【００６５】
核酸増幅測定装置１０１の動作がスタートすると、まず、図２に示した移送部６０により分注機構部１０のアーム部１１が初期位置からチップセット部３０に移動され、チップセット部３０において、分注機構部１０の２つのシリンジ部１２が下方向に移動される。これにより、２つのシリンジ部１２のノズル部の先端が２つのピペットチップ３１の上部開口部内に圧入されるので、２つのシリンジ部１２のノズル部の先端にピペットチップ３１が自動的に装着される。そして、２つのシリンジ部１２が上方に移動された後、分注機構部１０のアーム部１１は、ＣＫ１９のプライマ試薬が収容されたプライマ試薬容器２７の上方に向かってＸ軸方向に移動される。そして、プライマ試薬容器２７の上方に位置する一方のシリンジ部１２が下方向に移動されてプライマ試薬が吸引された後、その一方のシリンジ部１２が上方向に移動される。その後、他方のシリンジ部１２が同じプライマ試薬容器２７の上方に位置するまで、移送部６０により分注機構部１０のアーム部１１がＹ軸方向に移動される。そして、他方のシリンジ部１２が下方向に移動されて同じプライマ試薬容器２７からプライマ試薬が吸引された後、その他方のシリンジ部１２が上方向に移動される。このようにして、シリンジ部１２に装着される２つのピペットチップ３１により、プライマ試薬容器２７内のＣＫ１９のプライマ試薬が吸引される。
【００６６】
プライマ試薬を吸引した２つのシリンジ部１２が上方に移動された後、分注機構部１０のアーム部１１は、移送部６０により、最も奥側（装置正面奥側）であるセルセット位置１に位置する反応検出ブロック５０ａの上方に移動される。そして、最も奥側の反応検出ブロック５０ａにおいて、２つのシリンジ部１２が下方向に移動されることにより、２つのシリンジ部１２に装着された２つのピペットチップ３１が、それぞれ、検出セル５４の２つのセル部５４ａ内に挿入される。そして、シリンジ部１２を用いて、ＣＫ１９のプライマ試薬がそれぞれ２つのセル部５４ａに吐出される。シリンジ部１２は、プライマ試薬を吐出したのち、上方に移動される。
【００６７】
プライマ試薬を吐出した２つのシリンジ部１２が上方に移動された後、分注機構部１０のアーム部１１は、移送部６０によりチップ廃棄部４０の上方に向かってＸ軸方向に移動される。そして、チップ廃棄部４０において、ピペットチップ３１の廃棄が行われる。具体的には、２つのシリンジ部１２が下方向に移動されることにより、チップ廃棄部４０の２つのチップ廃棄孔４０ａ（図３参照）内にピペットチップ３１が挿入される。この状態で、分注機構部１０のアーム部１１が移送部６０によりＹ軸方向に移動されることにより、ピペットチップ３１が溝部４０ｂの下に移動される。そして、２つのシリンジ部１２が上方向に移動されることにより、ピペットチップ３１の上面のつば部は、溝部４０ｂの両側の下面に当接してその下面から下方向の力を受けるので、ピペットチップ３１が２つのシリンジ部１２のノズル部から自動的に脱離される。これにより、ピペットチップ３１がチップ廃棄部４０に廃棄される。
【００６８】
次に、同様の動作により、酵素試薬容器２６から酵素試薬が上記のセル部５４ａに吐出され、さらに同様の動作により、試料容器２２及び試料容器２３から試料が上記のセル部５４ａに吐出される。
【００６９】
そして、上記のセル部５４ａ内へのプライマ試薬、酵素試薬、試料の吐出が行われた後、検出セル５４の蓋部５４ｂの蓋閉め動作が行われる。この蓋閉め動作が完了した後、検出セル５４内の液温を約２０℃から約６５℃に加温することにより、ＲＴ−ＬＡＭＰ反応によりＣＫ１９のｍＲＮＡに対応するｃＤＮＡを増幅する。そして、増幅に伴い生成されるピロリン酸マグネシウムによる白濁を比濁法により検出する。具体的には、図３に示したＬＥＤ光源部５２ａ及びフォトダイオード受光部５２ｂを用いて、増幅反応時の検出セル５４内の濁度を検出（モニタリング）することによって、濁度の検出を行う。
【００７０】
試料の濁度データは、核酸増幅測定装置１０１からパーソナルコンピュータ１０２へリアルタイムに送信される。パーソナルコンピュータ１０２のＣＰＵ１０２ｄは、試料の濁度データを予め決められた閾値と比較することにより胃がんのリンパ節転移を判定する。ここで同時に、リンパ節への転移巣のサイズを判定してもよい。
【００７１】
ここで、図４を参照して、パーソナルコンピュータ１０２のＣＰＵ１０２ｄの処理について説明する。まず、ステップＳ１において、ＣＰＵ１０２ｄは、核酸増幅測定装置１０１から試料の濁度データを受信する。次に、ステップＳ２において、ＣＰＵ１０２ｄは、該濁度データと予め設定された閾値とを比較することにより、胃がんのリンパ節転移が陽性であるか、陰性であるかを判定する。そして、ステップＳ３において、ＣＰＵ１０２ｄは、ステップＳ２において判定された結果を表示部１０２ｃに送信する。
【実施例】
【００７２】
本実施例は、胃がんの患者から採取されたリンパ節組織中のＣＫ１９のｍＲＮＡの定量することによる、胃がんのリンパ節転移判定方法について説明する。
【００７３】
実施例１（定量ＲＴ−ＰＣＲによる胃がんのリンパ節転移判定）
（１）検出試料の調製
胃がんの転移が組織学的に認められたリンパ節（陽性リンパ節）１０個及び胃がんの転移が組織学的に認められなかったリンパ節（陰性リンパ節）１０個を用いて、下記のようにして検出試料を調製した。
まず、各リンパ節(約５０〜６００ｍｇ／個)に、ＤＭＳＯを含むｐＨ３．４の処理液(２００ｍＭグリシン−ＨＣｌ、５％ Ｂｒｉｊ３５(ポリオキシエチレン(３５)ラウリルエーテル、SIGMA社製)及び２０％ ＤＭＳＯ(和光純薬)を含む）４ｍＬを添加し、ブレンダーでホモジナイズした。得られたホモジネートを10,000×ｇ、室温で１分間遠心分離し、上清２００μＬからRNeasy Miniキット(キアゲン社製、カタログ番号74014)を用いてＲＮＡを抽出・精製して検出試料を得た。
【００７４】
（２）ＣＫ１９のｍＲＮＡの定量
上記のようにして得られた陽性リンパ節及び陰性リンパ節からの検出試料について、下記のプライマを用いて、リアルタイムＰＣＲ装置（ABI Prism(登録商標) 7000 Sequence Detection System、アプライドバイオシステムズ社）を用いてリアルタイムＲＴ−ＰＣＲを行ない、ＣＫ１９のｍＲＮＡの定量を行なった。
【００７５】
リアルタイムＲＴ−ＰＣＲは、ＲＴ−ＰＣＲキットであるQuanti Tect SYBR Green RT-PCRキット(キアゲン社製、カタログ番号204245)を用い、その使用説明書に従って行なった。反応液の組成及び反応条件は、以下のとおりである。
【００７６】
ＣＫ１９を検出するためのプライマ：
フォワードプライマ：5'-CAGATCGAAGGCCTGAAGGA-3' （配列番号１）
リバースプライマ：5'- CTTGGCCCCTCAGCGTACT-3' （配列番号２）
【００７７】
反応液：
ＲＮａｓｅ ｆｒｅｅ Ｈ2Ｏ １１．１μＬ
２×マスターミックス １２．５０μＬ
１００μＭフォワードプライマ(最終濃度５００ｎＭ) ０．０７５μＬ
１００μＭリバースプライマ(最終濃度５００ｎＭ) ０．０７５μＬ
Quanti Tect RTミックス ０．２５μＬ
検出試料 １．００μＬ
合計 ２５．００μＬ
【００７８】
反応条件
５０℃、３０分
９５℃、１５分
ＰＣＲ：以下の工程を４０サイクル；
９５℃、１５秒
５３℃、３０秒
７２℃、３０秒。
【００７９】
反応液の蛍光強度が基準値（Threshold：上記のリアルタイムＰＣＲ装置に搭載されたＳＤＳソフトウェアで自動的に設定された値）を超えたときのＰＣＲサイクル数を求め、この値に基づいてｍＲＮＡコピー数を算出した。結果を図５に示す。図５の結果から、閾値を検出試料当たり３５０コピーに設定することにより、組織診の結果に合致して胃がんの転移を判定することができることがわかる。
【００８０】
実施例２
ハウスキーピング遺伝子として、上記の検出試料中のβ−アクチンのｍＲＮＡの量を測定した。測定は実施例１のＣＫ１９のｍＲＮＡの測定と同様にして行った。なお、ＰＣＲに用いたプライマは次のとおりであった。
β−アクチンを検出するためのプライマ：
フォワードプライマ：5'- CCACACTGTGCCCATCTACG-3' （配列番号３）
リバースプライマ：5'- AGGATCTTCATGAGGTAGTCAGTCAG-3' （配列番号４）
【００８１】
実施例１で得られたＣＫ１９のｍＲＮＡのコピー数を、ここで得られたβ−アクチンのｍＲＮＡのコピー数で除した（標準化を行った）結果を図６に示す。図６の結果から、ＣＫ１９のｍＲＮＡのコピー数を、ハウスキーピング遺伝子であるβ-アクチンのｍＲＮＡのコピー数で除して標準化した場合も、胃がんのリンパ節転移を判定できることが分かる。
【００８２】
実施例１及び２の結果から、定量ＲＴ−ＰＣＲによるＣＫ１９のｍＲＮＡの定量値から、胃がんのリンパ節転移を判定することが可能であることが、明らかになった。また、定量値は、ＣＫ１９のｍＲＮＡの絶対量のほうが、陽性検体と陰性検体の区別が明瞭であることが、明らかとなった。
【００８３】
実施例３（定量ＲＴ−ＬＡＭＰによる胃がんのリンパ節転移判定）
（１）検出試料の調製
胃がんの転移が組織学的に認められたリンパ節（陽性リンパ節）７個及び胃がんの転移が組織学的に認められなかったリンパ節（陰性リンパ節）８個を用いて、下記のようにして検出試料を調製した。
【００８４】
まず、各リンパ節(約５０〜６００ｍｇ／個)に、ＤＭＳＯを含むｐＨ３．４の処理液(２００ｍＭグリシン−ＨＣｌ、５％ Ｂｒｉｊ３５(ポリオキシエチレン(３５)ラウリルエーテル、SIGMA社製)及び２０％ ＤＭＳＯ(和光純薬)を含む）４ｍＬを添加し、ブレンダーでホモジナイズした。得られたホモジネートを10,000×ｇ、室温で１分間遠心分離し、上清２０μLに処理液１８０μLを加えた２００μLを検出試料とした。
【００８５】
（２）反応液の調製
以下の各成分を混合して13.97μlの反応液を調製した。
750mM トリス緩衝液（pH8.0） 1.00μl
10×Thermopol緩衝液
(ニューイングランドバイオラボラトリー社製) 2.50μl
10mM dNTPs 2.00μl
100mM MgSO4 0.75μl
100mM ジチオスレイトール 1.25μl
2％ Tergitol(シグマアルドリッチジャパン株式会社製) 2.50μl
H2O 3.97μl
【００８６】
（３）酵素試薬の調製
以下の各成分を混合して3.04μlの酵素試薬を調製した。
10U/μl AMV逆転写酵素(プロメガ株式会社製) 0.14μl
8U/μl Bst DNAポリメラーゼ
(ニューイングランドバイオラボラトリー社製) 2.27μl
RNase inhibitor(プロメガ株式会社製) 0.63μl
【００８７】
（４）プライマの調製
以下の各成分を混合して6.00μlのプライマ溶液を調製した。
80pmol/μl forward inner primer 1.00μl
（配列番号５：5'-GGAGTTCTCAATGGTGGCACCAACTACTACACGACCATCCA-3'）
80pmol/μl reverse inner primer 1.00μl
（配列番号６：5'-GTCCTGCAGATCGACAACGCCTCCGTCTCAAACTTGGTTCG-3'）
5pmol/μl forward outer primer 1.00μl
（配列番号７：5'-TGGTACCAGAAGCAGGGG-3'）
5pmol/μl reverse outer primer 1.00μl
（配列番号８：5'-GTTGATGTCGGCCTCCACG-3'）
60pmol/μl forward loop primer 1.00μl
（配列番号９：5'-AGAATCTTGTCCCGCAGG-3'）
60pmol/μl reverse loop primer 1.00μl
（配列番号１０：5'-CGTCTGGCTGCAGATGA-3'）
【００８８】
（５）ＲＴ−ＬＡＭＰ反応液の調製
上記反応液、酵素試薬およびプライマ試薬からなるＲＴ−ＬＡＭＰ反応液を調製した。ＲＴ−ＬＡＭＰ反応液は、ＣＫ１９のｍＲＮＡを鋳型として、ＲＴ−ＬＡＭＰ法によりｃＤＮＡを増幅させるための反応液である。
【００８９】
（６）ＣＫ１９のｍＲＮＡの定量
上記検出試料２μlを、ＲＴ−ＬＡＭＰ反応液２３μlに添加して、リアルタイム濁度測定装置（テラメックス社製ＬＡ−２００）を用い、核酸増幅と同時に副産物として生成する不溶性のピロリン酸マグネシウムの白濁をリアルタイムで測定した。
【００９０】
ＲＴ−ＬＡＭＰ法により各検出試料に含まれるｍＲＮＡに対応するｃＤＮＡが増幅して濁度が０．１に達するまで時間（検出時間）を測定し、この値に基づいて、ＣＫ１９のｍＲＮＡの絶対量を算出した。結果を図７に示す。図７の結果から、閾値を検出試料当たり１４０コピーに設定することにより、組織診の結果に合致して胃がんの転移を判定することができることがわかる。
【００９１】
実施例３の結果から、定量ＲＴ−ＬＡＭＰであっても、ＣＫ１９のｍＲＮＡの定量値から、胃がんのリンパ節転移を判定することが可能であることが、明らかとなった。
【００９２】
以上より、検出試料中のサイトケラチン１９のｍＲＮＡの定量値に基づいて、胃がんのリンパ節転の正確な判定結果を得られることがわかった。また、本発明の胃がんのリンパ節転移判定方法は、ｍＲＮＡの定量方法、特に核酸増幅法の種類を問わず、有効な判定を行うことができることが明らかとなった。
【００９３】
実施例４（定量ＲＴ−ＰＣＲによるリンパ節転移巣サイズの測定）
胃がん患者９名から得たリンパ節１１個について、がん細胞数とCK19 mRNA発現量とを測定した。
【００９４】
（１）転移巣サイズの測定およびがん細胞数の計数
胃がん（非充実低分化腺癌）が転移したリンパ節１１個から、厚さ１０μmの切片を作成し、スライドガラスに載置した。この切片に対して、抗ＣＫ１９抗体及びEnvision Kit（何れもＤＡＫＯ社）を用いて免疫組織化学染色を行った。GS-710 Calibrated Densitometer（バイオラッド社）を用いてこの切片のがん細胞の転移巣サイズ（ｍｍ２）の測定を行った。また、WinROOF(三谷商事株式会社）を用いて、がん細胞の数（細胞数/セクション）を計数した。
【００９５】
（２）ＣＫ１９ｍＲＮＡ定量
上記（１）で切り取った切片に隣接する切片（厚さ約１０μｍ）を切り取り、RNeasy Mini Kit（キアゲン社）を用いてＲＮＡ抽出を行い、ＲＮＡ試料を調製した。このＲＮＡ試料を用いて以下の組成の反応液を調製し、ＴａｑＭａｎ法によって、ＣＫ１９ｍＲＮＡのコピー数（コピー／セクション）を算出した。なお、ＴａｑＭａｎ法による測定は、TaqMan One-step RT-PCR Master Mix及びPrism 7000 Realtime PCR system（何れもアプライドバイオシステムズ社）を用いて添付の使用説明書に従って行われた。
【００９６】
反応液：
ＲＮａｓｅ ｆｒｅｅ Ｈ2Ｏ １０．２０５μＬ
TaqMan 2x Universal PCR Master Mix １２．５μＬ
40X MultiScribe and RNase Inhibitor Mix ０．６３μＬ
１００μＭ フォワードプライマ ０．０７５μＬ
１００μＭ リバースプライマ ０．０７５μＬ
９．７ｐｍｏｌ／μＬ（終濃度２００ｎｍ） TaqManプローブ ０．５１５μＬ
検出試料 １μＬ
合計 ２５．００μＬ
【００９７】
また、ＣＫ１９ ｍＲＮＡ検出のためのプライマ配列及びTaqManプローブの配列は以下の通りである。
フォワードプライマ：5'-CAGATCGAAGGCCTGAAGGA-3'（配列番号１）
リバースプライマ：5'-CTTGGCCCCTCAGCGTACT-3'（配列番号２）
TaqManプローブ：5'-GCCTACCTGAAGAAGAACCATGAGGAGGAA-3'（配列番号１１）
【００９８】
なお、このTaqManプローブは、５'末端には６−カルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ）、３'末端には６−カルボキシ−テトラメチル−ローダミン（ＴＡＭＲＡ）を有する。
【００９９】
反応条件
４８℃、３０分
９５℃、１０分
ＰＣＲ：以下の工程を４０サイクル
９５℃、１５秒
６０℃、１分。
【０１００】
ｍＲＮＡの定量値（コピー／セクション）と、胃がんの転移巣サイズとの関係を図８に示す。定量値とがん細胞数との関係を図９に示す。図８および図９より、ＣＫ１９ｍＲＮＡの定量値は、転移巣のサイズおよびがん細胞数に相関することが認められた。従って、リンパ節のＣＫ１９ｍＲＮＡを定量することにより、転移巣のサイズを予測できることが確認された。
【０１０１】
実施例５（定量ＲＴ−ＬＡＭＰによるリンパ節転移巣サイズの測定）
胃がん患者９名から得たリンパ節１１個について、がん細胞数とCK19 mRNA発現量とを測定した。
【０１０２】
（１）転移巣サイズの測定およびがん細胞数の計数
実施例４（１）に記載の方法にしたがい、胃がん（非充実低分化腺癌）が転移したリンパ節１１個から、厚さ１０μmの切片を作成し、免疫組織化学染色を行った。ついで、実施例４（１）記載の方法にしたがい、それらの切片のがん細胞の転移巣サイズ（ｍｍ２）を測定した。また、実施例４（１）記載の方法にしたがい、がん細胞の数（細胞数/セクション）を計数した。
【０１０３】
（２）ＣＫ１９ｍＲＮＡ定量
上記（１）で切り取った切片に隣接する切片（厚さ約１０μｍ）を切り取り、RNeasy Mini Kit（キアゲン社）を用いてＲＮＡ抽出を行い、ＲＮＡ試料を調製した。ついで、実施例３記載の方法にしたがい、反応液を調製し、ＲＴ−ＬＡＭＰを実施した。
【０１０４】
ｍＲＮＡの定量値（コピー／セクション）と、胃がんの転移巣サイズとの関係を図１０に示す。定量値とがん細胞数との関係を図１１に示す。図１０および図１１より、ＣＫ１９ｍＲＮＡの定量値は、転移巣のサイズおよびがん細胞数に相関することが認められた。従って、リンパ節のＣＫ１９ｍＲＮＡを定量することにより、転移巣のサイズを予測できることが確認された。
【図面の簡単な説明】
【０１０５】
【図１】本発明の一実施形態による判定装置の全体構成を示した斜視図である。
【図２】図１に示した判定装置の定量手段としての核酸増幅測定装置の全体構成を示した斜視図である。
【図３】図２の核酸増幅測定装置の概略平面図である。
【図４】本発明の一実施形態による判定装置の判定手段としてのパーソナルコンピュータのＣＰＵの転移判定フローである。
【図５】実施例１において算出された、胃がんのリンパ節組織中のＣＫ１９のｍＲＮＡのコピー数を示すグラフである。
【図６】実施例２において算出された、胃がんのリンパ節組織中のＣＫ１９のｍＲＮＡの標準化された値を示すグラフである。
【図７】実施例３において算出された、胃がんのリンパ節組織中のＣＫ１９のｍＲＮＡのコピー数を示すグラフである。
【図８】ＣＫ１９のｍＲＮＡ定量値と転移巣サイズとの関係を示すグラフである。
【図９】ＣＫ１９のｍＲＮＡ定量値とがん細胞数との関係を示すグラフである。
【図１０】ＣＫ１９のｍＲＮＡ定量値と転移巣サイズとの関係を示すグラフである。
【図１１】ＣＫ１９のｍＲＮＡ定量値とがん細胞数との関係を示すグラフである。
【符号の説明】
【０１０６】
１ がんの転移判定装置
１０１ 核酸増幅測定装置
５１ 反応部
５２ 濁度検出部
１０２ パーソナルコンピュータ
１０２ｃ 表示部
１０２ｄ ＣＰＵ
【技術分野】
【０００１】
本発明は、胃がんのリンパ節転移判定方法、判定装置、及びそれに使用される試薬キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
近年臨床診断の分野において遺伝子検査が急速に普及している。遺伝子検査の一例として、がんのリンパ節転移診断がある。がん細胞は、原発巣を離れ、血管やリンパ管を経由して全身に転移する。がんの手術では、できるだけ確実に病巣を取り除くことが必要であるため、転移を正確に検出し、転移の度合いに応じて適切な処置をすることが要求される。このため、術中のがん細胞のリンパ節転移診断は極めて重要な意義を有している。がんのリンパ節転移診断の一手法として、正常細胞には発現しないか若しくは発現量が低く、がん細胞には多く発現するタンパク質の核酸を標的核酸として検出する方法がある。近年の遺伝子解析技術の発展により、生体から切除したリンパ節組織に含まれる標的核酸を増幅し、検出することで、効果的にがん診断を行うことが可能になってきている。
【０００３】
このような、遺伝子検査による特定の組織へのがん転移を検査するために、現在、ＬＡＭＰ法（loop-mediated isothermal amplification method）やＰＣＲ（polymerase chain reaction）法などを用いたがんの遺伝子検査の研究が盛んに行われるようになっている。この遺伝子検査は、組織や細胞などに含まれるがんマーカー（例えば、がん細胞に特異的に発現するタンパク質のｍＲＮＡなど）を検出することにより行うことができる。
【０００４】
がんマーカー（以下、単にマーカーともいう）の一つであるサイトケラチン１９（ＣＫ１９）は、乳がんのリンパ節転移を判定するためのマーカーとして有用であることが知られている。ＣＫ１９は、正常なリンパ節での発現量とリンパ節に転移してきた乳がん細胞での発現量とに有意な差が認められる分子である。
【０００５】
胃がんは、中国、日本、韓国などアジアや南米に患者が多い。日本における胃がんは、２００３年のがんの死亡者数の統計では、男性では肺がんに次いで第２位、女性では大腸がんに次いで第２位である。また、胃がんは自覚症状が少ないため、早期発見が難しく、進行してリンパ節等にも転移することが多い。
【０００６】
従来、胃がんのリンパ節転移を判定するためのマーカーとしては、サイトケラチン２０や癌胎児性抗原が用いられている。しかしながら、胃がんの遺伝子検査に関する報告は少なく、胃がんのリンパ節転移を判定するための、さらなる方法の開発が望まれていた。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明はこのような事情に鑑みてなされたものであり、胃がんのリンパ節転移判定方法、判定装置及び試薬キットを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明の第一の実施形態は、胃がんの転移が疑われるリンパ節組織を用いて調製された検出試料中のサイトケラチン１９のｍＲＮＡを定量する工程と、得られた前記ｍＲＮＡの定量値に基づいて胃がんのリンパ節への転移を判定する工程と、を含む胃がんのリンパ節転移判定方法である。
本発明の第二の実施形態は、胃がんの転移が疑われるリンパ節組織を用いて調製された検出試料中のサイトケラチン１９のｍＲＮＡを定量する定量手段と、得られたｍＲＮＡの定量値に基づいて胃がんのリンパ節への転移を判定する判定手段と、を備える胃がんのリンパ節転移判定装置である。
本発明の第三の実施形態は、検出試料を調製するためのリンパ節組織の前処理液と、サイトケラチン１９を検出し得るプライマを含むプライマ溶液と、核酸増幅法を実施するための酵素を含む酵素溶液と、を有する胃がんのリンパ節転移判定用試薬キットである。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、胃がんのリンパ節転移判定方法、判定装置及び試薬キットを提供することができる。これにより、効果的な胃がんの遺伝子検査を行うことができる。さらに、本発明によれば、胃がんが転移したリンパ節組織における転移巣の転移レベルを判定することができる。転移巣レベルを判定することにより、手術の要否決定のための指標、あるいは術式を決定するための指標を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
本発明の一実施形態において、転移レベルは、胃がんが転移したリンパ節組織において、転移の程度または転移巣の状態を反映するものであれば特に限定されない。転移レベルの指標は、たとえば、転移巣のサイズまたは転移巣におけるがん細胞数として表される。
【００１１】
リンパ節における転移は、大きさに基づいてマイクロメタスタシス（微小転移）とマクロメタスタシスに分類される。転移巣が長径２ｍｍ未満のとき、マイクロメタスタシス（Micro metastasis：微小転移）と呼ばれる。転移巣が長径２ｍｍ以上のとき、マクロメタスタシス（Macro metastasis）と呼ばれる。さらに、0.2mm未満の転移巣は、遊離がん細胞(Isolated Tumor Cell：ITC)と呼ばれる。一般に、マクロメタスタシスと診断されると、転移巣の摘出が必要とされる。マイクロメタスタシスは、転移巣がそれ以上大きくなるかが判断できない状態とされる。本発明の一実施形態において、マイクロメタスタシスとマクロメタスタシスとを識別可能な値に閾値を設定することができる。また、転移巣の大きさに応じて複数の閾値を設定してもよい。
【００１２】
本発明の一実施形態において、用いられる検体としては、胃がんの患者から採取されたリンパ節組織を含む試料を例示することができる。より具体的な検体としては、生検の目的で採取された胃がん近傍のリンパ節組織が挙げられる。
【００１３】
検出試料としては、検体中のサイトケラチン１９のｍＲＮＡを定量できるものであれば、特に制限されるものではない。例えば検体と前処理液とを混合し、前処理液中の検体に対して化学的及び／又は物理的処理を行うことによって、検体に含まれる細胞中のｍＲＮＡを液中に移行（可溶化）させ、ｍＲＮＡを得る。この溶液を検出試料とすることができる。
【００１４】
前処理液としては、検体に含まれる細胞中のｍＲＮＡを可溶化できるものであれば、特に限定されない。前処理液としては、例えば、緩衝液等が挙げられる。緩衝液は、ＲＮＡの分解を抑制するために酸性であることが好ましく、より具体的にはｐＨ２．５〜５．０が好ましく、特に３．０〜４．０が好ましい。ｐＨをこの範囲に保つために、公知の緩衝剤を用いることができ、具体的な緩衝剤としてはグリシン−塩酸緩衝剤などが挙げられる。緩衝剤の濃度は、緩衝液のｐＨを上記の範囲に保つことができるものであれば特に限定されない。
【００１５】
また、前処理液には界面活性剤を含有させることが好ましい。界面活性剤によって細胞膜や核膜が損傷するため、この損傷を通して細胞中の核酸が溶液中に移行しやすくなる。このような作用を有するものであれば界面活性剤の種類は特に限定されないが、非イオン性界面活性剤が好ましく、ポリオキシエチレン系非イオン性界面活性剤がよりこのましい。
特に、次のような一般式：
Ｒ１−Ｒ２−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−Ｈ
（ここで、Ｒ１は炭素数１０〜２２のアルキル基、アルケニル基、アルキニル基、イソオクチル基；Ｒ２は−Ｏ−又は−（Ｃ６Ｈ４）−Ｏ−；ｎは８〜１２０の整数）で表されるポリオキシエチレン系非イオン性界面活性剤が好適である。例えば、ポリオキシエチレンラウリルエーテル、ポリオキシエチレンセチルエーテル、ポリオキシエチレンオレイルエーテル、ポリオキシエチレンミリスチリルエーテル、ポリオキシエチレンステアリルエーテル、ポリオキシエチレンノニルフェニルエーテル、及びポリオキシエチレンイソオクチルフェニルエーテルなどを用いることができる。具体的には、Ｂｒｉｊ３５(ポリオキシエチレン(３５)ラウリルエーテル)などが好適である。前処理液中の界面活性剤の濃度は０．１〜６％（ｖ／ｖ）が好ましく、より好ましくは１〜５％（ｖ／ｖ）である。
【００１６】
また、ｍＲＮＡの定量を後述の核酸増幅法により行う場合は、前処理液にジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を含有させることが好ましい。リンパ節には、核酸増幅における酵素反応を阻害する物質（阻害物質）が含まれていることがあるが、ＤＭＳＯの作用によってこの阻害物質の影響を効果的に低減することができる。また、ＤＭＳＯには核酸増幅酵素の活性の低下を抑制する効果もある。前処理液中のＤＭＳＯの濃度としては、１〜５０％（ｖ／ｖ）が好ましく、５〜３０％（ｖ／ｖ）がより好ましく、１０〜２５％（ｖ／ｖ）が最も好ましい。
【００１７】
上記のような前処理液を用いることにより、市販の精製キットなどを用いて一般的に行われる核酸の抽出・精製を行うことなく、簡便かつ短時間で検出試料を調製することができる。
【００１８】
上記の検体と前処理液との混合割合は、特に限定されないが、検体１ｍｇに対して０．０００１〜０．００５ｍＬ程度の前処理液を用いることができる。上記の混合は、特に限定されないが、例えば室温で検体と前処理液とが充分に混合される程度の時間行うことができる。
【００１９】
検体と前処理液の混合において、検体を前処理液中で破砕するのが好ましい。破砕する方法としては、ホモジナイザーによるホモジナイズ、凍結融解などが挙げられる。ホモジナイザーとしては、当該分野において通常用いられるものを用いることができ、例えばワーリングブレンダー、ポッター・エルベージェム型ホモジナイザー、ポリトロン型ホモジナイザー、ダウンス型ホモジナイザー、フレンチプレス、超音波破砕機などが挙げられる。破砕の条件は、用いる方法及び装置に応じて適宜設定され得る。
【００２０】
上記の方法により破砕された破砕液を、遠心分離、フィルターろ過、カラムクロマトグラフィーなどの通常の精製方法を用いて粗精製することにより検出試料を調製することができる。また、検出試料の状態に応じて、核酸抽出法などの方法によりさらに精製してもよい。
【００２１】
本発明の一実施形態において、検出試料中のサイトケラチン１９のｍＲＮＡの定量は、たとえば、核酸増幅法やＤＮＡチップ等を用いて公知の方法により行うことができる。特に核酸増幅法を用いることが好ましい。
【００２２】
サイトケラチン１９のｍＲＮＡの定量に用いることのできるＤＮＡチップとしては、サイトケラチン１９のｃＤＮＡとハイブリダイズ可能なポリデオキシリボヌクレオチド及び／又はその断片を固定化した基盤を用いることができる。ＤＮＡチップを用いたＲＮＡの検出は、一般的に用いられる公知の方法により行うことができる。例えば、以下のようにして行うことができる。先ず、検出用試料中のｍＲＮＡの３'末端に存在するポリＡ配列に結合するプライマーを用いて逆転写反応を行う。逆転写反応の際に例えばＣｙ３やＣｙ５などの蛍光物質で標識されたヌクレオチドを用いることにより、蛍光標識されたｃＤＮＡが合成される。これを上記のポリデオキシリボヌクレオチドを固定化した基盤と接触させ、このポリヌクレオチドと標識されたｃＤＮＡとの二本鎖を形成させる。ついで、ｃＤＮＡの蛍光を測定することにより、サイトケラチン１９のｍＲＮＡを定量することができる。
【００２３】
サイトケラチン１９のｍＲＮＡの定量に用いることのできる核酸増幅法としては、核酸増幅反応の前に逆転写反応を含む核酸増幅法、例えば、ＲＴ−ＰＣＲ（Reverse Transcription PCR）やＲＴ−ＬＡＭＰ(Reverse Transcription LAMP：LAMP法については米国特許６４１０２７８号公報参照)等の公知の核酸増幅方法を用いることができる。より具体的には、上記の検出試料と、サイトケラチン１９を検出し得るプライマと、核酸増幅法を実施するための酵素とを含む反応液を調製し、得られた反応液を用いて核酸増幅を行い、増幅されたｃＤＮＡを測定することができる。
【００２４】
本発明の一実施形態において、プライマは、プライマ溶液として１つの試薬として提供されてもよい。プライマ溶液は、サイトケラチン１９を検出するためのプライマを含有する溶液であれば、特に制限されるものではない。プライマ溶液としては、溶液中でプライマが安定であり、保存が可能であるものが好ましい。
【００２５】
本発明の一実施形態において、核酸増幅法を実施するための酵素は、酵素溶液として１つの試薬として提供されてもよい。酵素溶液としては、核酸増幅法を実施することができるものであれば、特に制限されるものではない。酵素溶液としては、たとえば、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ（逆転写酵素）及びＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ（以下、単にＤＮＡポリメラーゼともいう）をそれぞれ単独に独立して調製された酵素溶液、又は逆転写酵素及びＤＮＡポリメラーゼを共に含有する酵素溶液を用いることができる。特に、逆転写酵素及びＤＮＡポリメラーゼを共に含む酵素溶液が、反応液の調製における簡便性の観点から望ましい。
【００２６】
逆転写反応及び核酸増幅反応は、プライマの配列等に応じて適宜条件を変更することができる。逆転写反応及び核酸増幅反応の条件は、例えばSambrook, J. et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2nd ed.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, New Yorkに記載されたものを用いることができる。
【００２７】
サイトケラチン１９を検出するためのプライマとしては、サイトケラチン１９のｍＲＮＡまたはそのｃＤＮＡを増幅することができるポリヌクレオチドが挙げられる。その配列は特に限定されないが、具体的には以下の配列番号で示されるプライマが挙げられる。尚、配列番号１及び２に示されるプライマはＲＴ−ＰＣＲに好適なプライマのセットであり、配列番号５〜１０に示されるプライマはＲＴ−ＬＡＭＰに好適なプライマのセットである。
＜ＲＴ−ＰＣＲのプライマ＞
配列番号１：5'-CAGATCGAAGGCCTGAAGGA-3'
配列番号２：5'- CTTGGCCCCTCAGCGTACT-3'
＜ＲＴ−ＬＡＭＰのプライマ＞
配列番号５：5'-GGAGTTCTCAATGGTGGCACCAACTACTACACGACCATCCA-3'
配列番号６：5'-GTCCTGCAGATCGACAACGCCTCCGTCTCAAACTTGGTTCG-3'
配列番号７：5'-TGGTACCAGAAGCAGGGG-3'
配列番号８：5'-GTTGATGTCGGCCTCCACG-3'
配列番号９：5'-AGAATCTTGTCCCGCAGG-3'
配列番号１０：5'-CGTCTGGCTGCAGATGA-3'
【００２８】
上記のプライマは、当該技術において通常用いられる技術により修飾されていてもよい。上記プライマの標識は、放射活性元素又は非放射活性分子を用いて行うことができる。用いられる放射活性同位体としては、32P、33P、35S、3H又は125Iを挙げることができる。非放射活性物質は、ビオチン、アビジン、ストレプトアビジン又はジゴキシゲニンのようなリガンド、ハプテン、色素及び放射線発光性、化学発光性、生物発光性、蛍光又はリン光性の試薬のような発光性試薬から選択される。
【００２９】
逆転写活性を有する酵素及びＤＮＡポリメラーゼは、当該技術においてよく知られたものを用いることができる。逆転写活性を有する酵素としては、AMV (Avian Myeloblastosis Virus) 逆転写酵素、M-MLV (Molony Murine Leukemia Virus) 逆転写酵素などが挙げられる。また、ＤＮＡポリメラーゼとしては、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｂｓｔ ＤＮＡポリメラーゼなどを用いることができる。
【００３０】
上記の核酸増幅により生成した核酸増幅産物を測定することにより、サイトケラチン１９のｍＲＮＡを定量することができる。この際、定量ＲＴ−ＰＣＲ（Quantitative Reverse Transcription-PCR）や定量ＲＴ−ＬＡＭＰ(Quantitative Reverse Transcription-LAMP)等が好ましく用いられる。これらの方法によると、核酸（ｃＤＮＡ）増幅に伴って反応液の光学的状態（濁度、吸光度、蛍光強度など）が変化するため、これをリアルタイムに測定することにより、サイトケラチン１９のｍＲＮＡの定量を行うことができる。
【００３１】
ＲＴ−ＰＣＲの具体例としては、ＴａｑＭａｎ（登録商標）法や、核酸増幅反応前の反応液にＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎを予め添加しておき、増幅反応中にｃＤＮＡの増幅に伴って増加する蛍光強度をリアルタイムに測定するＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ法など、公知のものを用いることができる。サイトケラチン１９のｍＲＮＡの定量値は、反応液の蛍光強度が所定の値に達するまでのサイクル数に基づいて算出することができる。
【００３２】
ＲＴ−ＬＡＭＰを用いる場合、ｃＤＮＡの増幅に伴い副産物としてピロリン酸マグネシウムが多量に生成される。このピロリン酸マグネシウムは不溶性であるため、ピロリン酸マグネシウムの増加に伴って反応液が白濁する。よって、反応液の濁度（又は吸光度）をリアルタイムで光学的に測定することにより、サイトケラチン１９のｍＲＮＡを定量することができる。また、ＲＴ−ＬＡＭＰ法においても、上記ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ法を用いることができる。サイトケラチン１９のｍＲＮＡの定量値は、たとえば、反応液の濁度、吸光度、蛍光強度などが所定の値に達するまでの時間に基づいて算出することができる。
【００３３】
本発明の一実施形態において、胃がんのリンパ節への転移を判定する工程としては、上述した検出試料中のサイトケラチン１９のｍＲＮＡの定量値に基づいて、絶対的又は相対的に胃がんのリンパ節への転移を判定できるものであれば、特に制限されるものではないが、サイトケラチン１９のｍＲＮＡの定量値と閾値とを比較するのが好ましい。
【００３４】
サイトケラチン１９のｍＲＮＡの定量値は、標準化の処理の有無に関わらず、胃がんのリンパ節転移の判定工程に用いることができるが、標準化を行わず、サイトケラチン１９のｍＲＮＡの絶対量を、定量値として用いることが好ましい。
【００３５】
ここで、標準化とは、上記のサイトケラチン１９のｍＲＮＡの定量で得られた定量値を、胃がんの患者から採取されたリンパ節組織を含む試料、即ち検体の量に応じた値に換算することをいう。より具体的には、上記のサイトケラチン１９のｍＲＮＡの定量で得られた定量値を、検体の量あるいは該量を反映する情報、好ましくは内部標準、より好ましくはハウスキーピング遺伝子のｍＲＮＡの量あるいは該量を反映する情報で除すること等を示す。
【００３６】
ハウスキーピング遺伝子とは、多くの組織や細胞に一定量発現していると一般に考えられている遺伝子である。ハウスキーピング遺伝子としては、例えば、β−アクチン、ＧＡＰＤＨ(グリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ)、β２−マイクログロブリン、ＨＰＲＴ１(ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ１)などの遺伝子が挙げられる。また、ハウスキーピング遺伝子のｍＲＮＡの量を反映する情報とは、サイトケラチン１９と同様の方法でハウスキーピング遺伝子の定量を行ったときに得られる情報のことである。
【００３７】
本発明の一実施形態において、検体のハウスキーピング遺伝子のｍＲＮＡの測定値は、標準化のためではなく、正確に核酸増幅反応が行われたか否かを判定するためのコントロールとして用いることもできる。ハウスキーピング遺伝子は殆どの種類の細胞で発現が認められるため、ハウスキーピング遺伝子のｍＲＮＡが検出される場合は、がんマーカーの核酸増幅反応も適切に行われたと考えられる。一方、ハウスキーピング遺伝子のｍＲＮＡが検出されない場合は、たとえば酵素の失活により、核酸増幅反応が正確に行われなかった可能性が考えられる。
【００３８】
本発明の一実施形態において、サイトケラチン１９のｍＲＮＡの絶対量とは、ｍＲＮＡの定量に付された検出試料中における、サイトケラチン１９のｍＲＮＡの絶対量又は該絶対量を反映する情報を示す。絶対量を求める際には、上述のような標準化を行なわない。このような、該絶対量を定量値として用い、予め決められた閾値と直接比較すると、標準化を行ったものより正確に胃がんのリンパ節転移を判定することができる。
【００３９】
従来行われている組織診によるがん転移判定は、組織切片を作成し、染色等の処理を行って検鏡することにより行われる。しかし、検鏡による組織診では組織の一部しか検査できないため、がん細胞を含まない面で切片を作製するとがん細胞を見落とす可能性がある。一方、分子検査によるがん転移判定では、切除した組織試料全体（あるいは切片作製後の余剰の組織試料）を用いることができるため、一部の断面のみで検査する組織診とは違い見落としの可能性が低い。
【００４０】
本発明の一実施形態において、閾値は、胃がんのリンパ節転移が確認された陽性検体に含まれるｍＲＮＡの定量値以下であって、胃がんのリンパ節転移がないことが確認された陰性検体に含まれるｍＲＮＡの定量値よりも高い値に設定することができる。複数の陽性検体のｍＲＮＡ定量値と複数の陰性検体のｍＲＮＡ定量値とを予め測定し、最も高確率に陽性検体と陰性検体とを区別できる値を閾値として設定することが好ましい。より具体的な閾値としては、サイトケラチン１９のｍＲＮＡの定量に定量ＲＴ−ＰＣＲを用いた場合は、８〜６９０コピーが好ましく、定量ＲＴ−ＬＡＭＰを用いた場合は、１０〜２７０コピーが好ましい。
【００４１】
本発明の判定方法の判定工程は、サイトケラチン１９のｍＲＮＡの定量値に基づいて前記胃がんのリンパ節への転移を判定する。また、サイトケラチン１９のｍＲＮＡの定量値と閾値とを比較し、ｍＲＮＡの定量値が閾値よりも高い場合はリンパ節転移が陽性であり、閾値よりも低い場合は陰性であると判定することができる。このような判定結果を得ることにより、術式、切除範囲、術後の治療方針などの決定の指標となり得る。
【００４２】
ｍＲＮＡの定量値は、がん転移レベルに応じて、転移巣の大きさや転移巣に含まれるがん細胞数に相関する。そのため、上記したようにｍＲＮＡの定量値に基づき、リンパ節における転移巣の定量的な測定や段階的な測定を行うことができる。段階的な測定を行う場合は、ｍＲＮＡの定量値と、予め設定された複数の閾値とが比較される。この場合、少なくとも１つの閾値（第１の閾値）は、がん陰性およびがん陽性を識別可能に設定されることが好ましい。これらの閾値は、がんや腫瘍マーカーの種類に応じて適宜設定される。また、転移巣を定量的に測定する場合でも、この第１の閾値を用いて陰性と陽性とを識別し、転移陽性のものに関してがん病巣の定量的測定を行うことが好ましい。
【００４３】
本発明の一実施形態において、第１の閾値は、がん細胞の存在が確認されたリンパ節(陽性検体)に含まれるｍＲＮＡの定量値以下であって、がん細胞が存在しないことが確認されたリンパ節(陰性検体)に含まれるｍＮＲＡの定量値よりも高い値に設定することができる。複数の陽性検体のｍＲＮＡ定量値と複数の陰性検体のｍＲＮＡ定量値とを予め測定し、最も高確率に陽性検体と陰性検体とを区別できる値を閾値として設定することが好ましい。
【００４４】
上記のような段階的な情報を得る場合は、第１の閾値の他にさらに第２の閾値が用いられる。たとえば、上記第１の閾値と、弱陽性と強陽性とを識別可能な第２の閾値とを予め設定する。ｍＲＮＡの定量値が第１の閾値未満であった場合、実質的にがん病巣が存在しない（即ち、がん陰性）と判定することができる。また、ｍＲＮＡの定量値が第１の閾値以上、第２の閾値未満であった場合は、サイズの比較的小さいがん病巣が存在する（がん弱陽性）と判定することができる。さらに、ｍＲＮＡの定量値が第２の閾値以上であった場合は、サイズの比較的大きいがん病巣が存在する（がん強陽性）と判定することができる。
【００４５】
リンパ節における転移は、大きさに基づいてマイクロメタスタシス（微小転移）とマクロメタスタシスに分類される。転移巣が長径２ｍｍ未満のとき、マイクロメタスタシス（Micro metastasis：微小転移）と呼ばれる。転移巣が長径２ｍｍ以上のとき、マクロメタスタシス（Macro metastasis）と呼ばれる。さらに、0.2mm未満の転移巣は、遊離がん細胞(Isolated Tumor Cell：ITC)と呼ばれる。一般に、マクロメタスタシスと診断されると、転移巣の摘出が必要とされる。マイクロメタスタシスは、転移巣がそれ以上大きくなるかが判断できない状態とされる。本発明の一実施形態において、上記の第２の閾値は、マイクロメタスタシスとマクロメタスタシスとを識別可能な値に設定することができる。また、第２の閾値以外にも転移巣の大きさに応じて複数の閾値を設定してもよい。
【００４６】
サイトケラチン１９のｍＲＮＡの発現量を測定することにより、リンパ節中のがん細胞の数やがん病巣のサイズ（面積、体積、質量等）を測定することができる。すなわち、リンパ節におけるサイトケラチン１９のｍＲＮＡ発現量は、胃がん患者のリンパ節摘出範囲を決定するための指標となり得る。たとえば、検査したリンパ節に大きな転移巣がなければ、それ以上範囲を広げて摘出する必要はない。検査したリンパ節に大きな転移巣があれば、さらに広範囲のリンパ節の摘出を行う必要がある。現在の病理診断では、2mmのマクロメタスタシスを確実に検出できるのは、理屈上、リンパ節径が４ｍｍ以下であり、それ以上の大きさのリンパ節では転移巣を見落とす可能性がある。病理診断と本発明の方法を併用すれば、転移巣を見落とす可能性を低下させることができる。
【００４７】
本発明の一実施形態である胃がんのリンパ節転移判定装置は、胃がんの患者から採取されたリンパ節組織を用いて調製された検出試料中のサイトケラチン１９のｍＲＮＡを定量する定量手段と、前記ｍＲＮＡの定量値に基づいて胃がんのリンパ節への転移を判定する判定手段を備えている。
【００４８】
本発明の一実施形態において、定量手段は、胃がんの患者から採取されたリンパ節組織を用いて調製された検出試料中のサイトケラチン１９のｍＲＮＡを定量することができるものであれば、特に限定されない。定量手段としては、ＬＡＭＰ法やＰＣＲ法により増幅された核酸を定量し得る核酸増幅測定装置が好ましい。該核酸増幅測定装置は、検出試料中のサイトケラチン１９のｍＲＮＡをプライマと核酸増幅酵素とにより増幅して得られる核酸増幅産物を測定する測定部を備える。
【００４９】
本発明の一実施形態において、判定手段は、上記の定量手段で定量されたサイトケラチン１９のｍＲＮＡの定量値に基づいて胃がんのリンパ節への転移を、絶対的又は相対的に判定できるものであれば、特に限定されない。判定手段としては、定量値と予め決定された閾値とを比較することによりがんの転移を判定するものが好ましい。定量値は、検出用試料中の前記サイトケラチン１９のｍＲＮＡの絶対量であることが、特に好ましい。また、この装置は、得られた判定結果を表示する表示部を備えていてもよい。
本発明の一実施形態において、装置は、リンパ節組織における転移巣の転移レベルを判定するための指標を得る手段を備える。転移レベルの指標を得る手段は、がんの転移を判定するがん転移判定手段と別の手段であってもよいし、双方の機能を備える１つの手段であってもよい。
【００５０】
胃がんのリンパ節転移判定装置の一実施形態を、図１〜３に示す。図１は、本発明の一実施形態による判定装置の全体構成を示した斜視図である。図２は、図１に示した定量手段としての核酸増幅測定装置の全体構成を示した斜視図である。図３は、図２の核酸増幅測定装置の概略平面図である。
【００５１】
本発明のある実施形態の判定装置は、図１に示すように、核酸増幅測定装置１０１と、該核酸増幅測定装置と有線又は無線による通信ができるように接続された判定手段としてのパーソナルコンピュータ(ＰＣ)１０２とにより構成され得る。
【００５２】
核酸増幅測定装置１０１は、図２に示すように分注機構部１０と、試料セット部２０と、チップセット部３０と、チップ廃棄部４０と、５つの反応検出ブロック５０ａからなる反応検出部５０と、分注機構部１０をＸ軸方向及びＹ軸方向に移送するための移送部６０とを含んでいる。
【００５３】
分注機構部１０は、図２に示すように、移送部６０によりＸ軸方向及びＹ軸方向（水平方向）に移動されるアーム部１１と、アーム部１１に対してそれぞれ独立してＺ軸方向（垂直方向）に移動可能な２連（２本）のシリンジ部１２とを含んでいる。
【００５４】
図２及び図３に示すように、試料セット部２０には、装置の手前から順番に、１０個の試料容器セット孔２１ａ〜２１ｊと、１つの酵素試薬容器セット孔２１ｋ及び１つのプライマ試薬容器セット孔２１ｌとが設けられている。また、１０個の試料容器セット孔２１ａ〜２１ｊは、５行２列に配列するように設けられている。そして、試料容器セット孔２１ｃ及び２１ｄと、試料容器セット孔２１ｅ及び２１ｆと、試料容器セット孔２１ｇ及び２１ｈと、試料容器セット孔２１ｉ及び２１ｊとは、それぞれ、装置の奥側から順に、試料セット位置１、試料セット位置２、試料セット位置３及び試料セット位置４に設けられている。
【００５５】
本実施形態では、正面左側の試料容器セット孔２１ｃ、２１ｅ、２１ｇ及び２１ｉには、予め切除生体組織（リンパ節）を処理（ホモジナイズ、ろ過など）して作製された可溶化抽出液（検出試料）が収容された試料容器２２がセットされる。正面右側の試料容器セット孔２１ｄ、２１ｆ、２１ｈ及び２１ｊには、上記した試料を１０倍に希釈した希釈試料が収容された試料容器２３がセットされる。
【００５６】
試料容器セット孔２１ａには、増幅するべき核酸が正常に増幅することを確認するための陽性コントロールが収容された容器２４が載置されるとともに、試料容器セット孔２１ｂには、増幅するべきでない核酸が正常に増幅しないことを確認するための陰性コントロールを収容した容器２５がセットされる。
【００５７】
酵素試薬容器セット孔２１ｋ及びプライマ試薬容器セット孔２１ｌには、それぞれ、サイトケラチン１９のｍＲＮＡに対応するｃＤＮＡ（以下、単にＣＫ１９ともいう）を増幅するための核酸増幅酵素試薬が収容された酵素試薬容器２６と、ＣＫ１９のプライマ試薬が収容されたプライマ試薬容器２７とがセットされている。
【００５８】
反応検出部５０の各反応検出ブロック５０ａは、図２及び図３に示すように、反応部５１と、２つの濁度検出部５２と、蓋閉機構部５３（図２参照）とから構成されている。各反応検出ブロック５０ａに設けられる反応部５１には、図３に示すように、検出セル５４をセットするための２つの検出セルセット孔５１ａが設けられている。各反応検出ブロック５０ａは、装置の奥側から順に、セルセット位置１、セルセット位置２、セルセット位置３、セルセット位置４及びセルセット位置５に配置されている。
【００５９】
また、濁度検出部５２は、反応部５１の一方の側面側に配置された基板５５ａに取り付けられた４６５ｎｍの波長を有する青色ＬＥＤからなるＬＥＤ光源部５２ａと、反応部５１の他方の側面側に配置された基板５５ｂに取り付けられたフォトダイオード受光部５２ｂとによって構成されている。各反応検出ブロック５０ａには、１つのＬＥＤ光源部５２ａと１つのフォトダイオード受光部５２ｂとからなる１組の濁度検出部５２が２組ずつ配置されている。
【００６０】
また、検出セル５４は、試料を収容するため２つのセル部５４ａと、２つのセル部５４ａを塞ぐ２つの蓋部５４ｂとを有している。
【００６１】
また、移送部６０は、図２に示すように、分注機構部１０をＹ軸方向に移送するための直動ガイド６１及びボールネジ６２と、ボールネジ６２を駆動するためのステッピングモータ６３と、分注機構部１０をＸ軸方向に移送するための直動ガイド６４及びボールネジ６５と、ボールネジ６５を駆動するためのステッピングモータ６６とを含んでいる。なお、分注機構部１０のＸ軸方向及びＹ軸方向への移送は、ステッピングモータ６３及び６６により、それぞれ、ボールネジ６２及び６５を回転させることにより行う。
【００６２】
パーソナルコンピュータ１０２は、図１に示すように、入力機器のキーボード１０２ａ及びマウス１０２ｂと、モニタからなる表示部１０２ｃと、試料の測定結果を分析するＣＰＵ１０２ｄとを含む。
【００６３】
次に、図１〜図３を参照して、本実施形態による判定装置１の動作について説明する。この実施形態では、上記したように、胃がん手術での切除リンパ節組織中に存在するサイトケラチン１９のｍＲＮＡをＬＡＭＰ法により増幅させ、増幅に伴い発生するピロリン酸マグネシウムによる白濁による濁度の変化を測定することによりサイトケラチン１９のｍＲＮＡを定量し、定量値を閾値と比較して該リンパ節へのがんの転移を判定する装置について説明する。
【００６４】
予め切除組織を処理（たとえば、ホモジナイズ、ろ過など）して作製された可溶化抽出液（以下、試料という）が収容された試料容器２２を、試料容器セット孔２１ｃ〜２１ｊにセットする（図２及び図３参照）。陽性コントロールが収容された容器２４及び陰性コントロールが収容された容器２５を、それぞれ、試料容器セット孔２１ａ及び２１ｂ（図３参照）にセットする。酵素試薬容器セット孔２１ｋ及びプライマ試薬容器セット孔２１ｌには、それぞれ、ＣＫ１９の増幅のための核酸増幅酵素試薬が収容された酵素試薬容器２６と、ＣＫ１９の増幅のためのプライマ試薬が収容されたプライマ試薬容器２７とをセットする（図３参照）。チップセット部３０には、それぞれ３６本の使い捨て用のピペットチップ３１が収納された２つのラック３２を設置する。
【００６５】
核酸増幅測定装置１０１の動作がスタートすると、まず、図２に示した移送部６０により分注機構部１０のアーム部１１が初期位置からチップセット部３０に移動され、チップセット部３０において、分注機構部１０の２つのシリンジ部１２が下方向に移動される。これにより、２つのシリンジ部１２のノズル部の先端が２つのピペットチップ３１の上部開口部内に圧入されるので、２つのシリンジ部１２のノズル部の先端にピペットチップ３１が自動的に装着される。そして、２つのシリンジ部１２が上方に移動された後、分注機構部１０のアーム部１１は、ＣＫ１９のプライマ試薬が収容されたプライマ試薬容器２７の上方に向かってＸ軸方向に移動される。そして、プライマ試薬容器２７の上方に位置する一方のシリンジ部１２が下方向に移動されてプライマ試薬が吸引された後、その一方のシリンジ部１２が上方向に移動される。その後、他方のシリンジ部１２が同じプライマ試薬容器２７の上方に位置するまで、移送部６０により分注機構部１０のアーム部１１がＹ軸方向に移動される。そして、他方のシリンジ部１２が下方向に移動されて同じプライマ試薬容器２７からプライマ試薬が吸引された後、その他方のシリンジ部１２が上方向に移動される。このようにして、シリンジ部１２に装着される２つのピペットチップ３１により、プライマ試薬容器２７内のＣＫ１９のプライマ試薬が吸引される。
【００６６】
プライマ試薬を吸引した２つのシリンジ部１２が上方に移動された後、分注機構部１０のアーム部１１は、移送部６０により、最も奥側（装置正面奥側）であるセルセット位置１に位置する反応検出ブロック５０ａの上方に移動される。そして、最も奥側の反応検出ブロック５０ａにおいて、２つのシリンジ部１２が下方向に移動されることにより、２つのシリンジ部１２に装着された２つのピペットチップ３１が、それぞれ、検出セル５４の２つのセル部５４ａ内に挿入される。そして、シリンジ部１２を用いて、ＣＫ１９のプライマ試薬がそれぞれ２つのセル部５４ａに吐出される。シリンジ部１２は、プライマ試薬を吐出したのち、上方に移動される。
【００６７】
プライマ試薬を吐出した２つのシリンジ部１２が上方に移動された後、分注機構部１０のアーム部１１は、移送部６０によりチップ廃棄部４０の上方に向かってＸ軸方向に移動される。そして、チップ廃棄部４０において、ピペットチップ３１の廃棄が行われる。具体的には、２つのシリンジ部１２が下方向に移動されることにより、チップ廃棄部４０の２つのチップ廃棄孔４０ａ（図３参照）内にピペットチップ３１が挿入される。この状態で、分注機構部１０のアーム部１１が移送部６０によりＹ軸方向に移動されることにより、ピペットチップ３１が溝部４０ｂの下に移動される。そして、２つのシリンジ部１２が上方向に移動されることにより、ピペットチップ３１の上面のつば部は、溝部４０ｂの両側の下面に当接してその下面から下方向の力を受けるので、ピペットチップ３１が２つのシリンジ部１２のノズル部から自動的に脱離される。これにより、ピペットチップ３１がチップ廃棄部４０に廃棄される。
【００６８】
次に、同様の動作により、酵素試薬容器２６から酵素試薬が上記のセル部５４ａに吐出され、さらに同様の動作により、試料容器２２及び試料容器２３から試料が上記のセル部５４ａに吐出される。
【００６９】
そして、上記のセル部５４ａ内へのプライマ試薬、酵素試薬、試料の吐出が行われた後、検出セル５４の蓋部５４ｂの蓋閉め動作が行われる。この蓋閉め動作が完了した後、検出セル５４内の液温を約２０℃から約６５℃に加温することにより、ＲＴ−ＬＡＭＰ反応によりＣＫ１９のｍＲＮＡに対応するｃＤＮＡを増幅する。そして、増幅に伴い生成されるピロリン酸マグネシウムによる白濁を比濁法により検出する。具体的には、図３に示したＬＥＤ光源部５２ａ及びフォトダイオード受光部５２ｂを用いて、増幅反応時の検出セル５４内の濁度を検出（モニタリング）することによって、濁度の検出を行う。
【００７０】
試料の濁度データは、核酸増幅測定装置１０１からパーソナルコンピュータ１０２へリアルタイムに送信される。パーソナルコンピュータ１０２のＣＰＵ１０２ｄは、試料の濁度データを予め決められた閾値と比較することにより胃がんのリンパ節転移を判定する。ここで同時に、リンパ節への転移巣のサイズを判定してもよい。
【００７１】
ここで、図４を参照して、パーソナルコンピュータ１０２のＣＰＵ１０２ｄの処理について説明する。まず、ステップＳ１において、ＣＰＵ１０２ｄは、核酸増幅測定装置１０１から試料の濁度データを受信する。次に、ステップＳ２において、ＣＰＵ１０２ｄは、該濁度データと予め設定された閾値とを比較することにより、胃がんのリンパ節転移が陽性であるか、陰性であるかを判定する。そして、ステップＳ３において、ＣＰＵ１０２ｄは、ステップＳ２において判定された結果を表示部１０２ｃに送信する。
【実施例】
【００７２】
本実施例は、胃がんの患者から採取されたリンパ節組織中のＣＫ１９のｍＲＮＡの定量することによる、胃がんのリンパ節転移判定方法について説明する。
【００７３】
実施例１（定量ＲＴ−ＰＣＲによる胃がんのリンパ節転移判定）
（１）検出試料の調製
胃がんの転移が組織学的に認められたリンパ節（陽性リンパ節）１０個及び胃がんの転移が組織学的に認められなかったリンパ節（陰性リンパ節）１０個を用いて、下記のようにして検出試料を調製した。
まず、各リンパ節(約５０〜６００ｍｇ／個)に、ＤＭＳＯを含むｐＨ３．４の処理液(２００ｍＭグリシン−ＨＣｌ、５％ Ｂｒｉｊ３５(ポリオキシエチレン(３５)ラウリルエーテル、SIGMA社製)及び２０％ ＤＭＳＯ(和光純薬)を含む）４ｍＬを添加し、ブレンダーでホモジナイズした。得られたホモジネートを10,000×ｇ、室温で１分間遠心分離し、上清２００μＬからRNeasy Miniキット(キアゲン社製、カタログ番号74014)を用いてＲＮＡを抽出・精製して検出試料を得た。
【００７４】
（２）ＣＫ１９のｍＲＮＡの定量
上記のようにして得られた陽性リンパ節及び陰性リンパ節からの検出試料について、下記のプライマを用いて、リアルタイムＰＣＲ装置（ABI Prism(登録商標) 7000 Sequence Detection System、アプライドバイオシステムズ社）を用いてリアルタイムＲＴ−ＰＣＲを行ない、ＣＫ１９のｍＲＮＡの定量を行なった。
【００７５】
リアルタイムＲＴ−ＰＣＲは、ＲＴ−ＰＣＲキットであるQuanti Tect SYBR Green RT-PCRキット(キアゲン社製、カタログ番号204245)を用い、その使用説明書に従って行なった。反応液の組成及び反応条件は、以下のとおりである。
【００７６】
ＣＫ１９を検出するためのプライマ：
フォワードプライマ：5'-CAGATCGAAGGCCTGAAGGA-3' （配列番号１）
リバースプライマ：5'- CTTGGCCCCTCAGCGTACT-3' （配列番号２）
【００７７】
反応液：
ＲＮａｓｅ ｆｒｅｅ Ｈ2Ｏ １１．１μＬ
２×マスターミックス １２．５０μＬ
１００μＭフォワードプライマ(最終濃度５００ｎＭ) ０．０７５μＬ
１００μＭリバースプライマ(最終濃度５００ｎＭ) ０．０７５μＬ
Quanti Tect RTミックス ０．２５μＬ
検出試料 １．００μＬ
合計 ２５．００μＬ
【００７８】
反応条件
５０℃、３０分
９５℃、１５分
ＰＣＲ：以下の工程を４０サイクル；
９５℃、１５秒
５３℃、３０秒
７２℃、３０秒。
【００７９】
反応液の蛍光強度が基準値（Threshold：上記のリアルタイムＰＣＲ装置に搭載されたＳＤＳソフトウェアで自動的に設定された値）を超えたときのＰＣＲサイクル数を求め、この値に基づいてｍＲＮＡコピー数を算出した。結果を図５に示す。図５の結果から、閾値を検出試料当たり３５０コピーに設定することにより、組織診の結果に合致して胃がんの転移を判定することができることがわかる。
【００８０】
実施例２
ハウスキーピング遺伝子として、上記の検出試料中のβ−アクチンのｍＲＮＡの量を測定した。測定は実施例１のＣＫ１９のｍＲＮＡの測定と同様にして行った。なお、ＰＣＲに用いたプライマは次のとおりであった。
β−アクチンを検出するためのプライマ：
フォワードプライマ：5'- CCACACTGTGCCCATCTACG-3' （配列番号３）
リバースプライマ：5'- AGGATCTTCATGAGGTAGTCAGTCAG-3' （配列番号４）
【００８１】
実施例１で得られたＣＫ１９のｍＲＮＡのコピー数を、ここで得られたβ−アクチンのｍＲＮＡのコピー数で除した（標準化を行った）結果を図６に示す。図６の結果から、ＣＫ１９のｍＲＮＡのコピー数を、ハウスキーピング遺伝子であるβ-アクチンのｍＲＮＡのコピー数で除して標準化した場合も、胃がんのリンパ節転移を判定できることが分かる。
【００８２】
実施例１及び２の結果から、定量ＲＴ−ＰＣＲによるＣＫ１９のｍＲＮＡの定量値から、胃がんのリンパ節転移を判定することが可能であることが、明らかになった。また、定量値は、ＣＫ１９のｍＲＮＡの絶対量のほうが、陽性検体と陰性検体の区別が明瞭であることが、明らかとなった。
【００８３】
実施例３（定量ＲＴ−ＬＡＭＰによる胃がんのリンパ節転移判定）
（１）検出試料の調製
胃がんの転移が組織学的に認められたリンパ節（陽性リンパ節）７個及び胃がんの転移が組織学的に認められなかったリンパ節（陰性リンパ節）８個を用いて、下記のようにして検出試料を調製した。
【００８４】
まず、各リンパ節(約５０〜６００ｍｇ／個)に、ＤＭＳＯを含むｐＨ３．４の処理液(２００ｍＭグリシン−ＨＣｌ、５％ Ｂｒｉｊ３５(ポリオキシエチレン(３５)ラウリルエーテル、SIGMA社製)及び２０％ ＤＭＳＯ(和光純薬)を含む）４ｍＬを添加し、ブレンダーでホモジナイズした。得られたホモジネートを10,000×ｇ、室温で１分間遠心分離し、上清２０μLに処理液１８０μLを加えた２００μLを検出試料とした。
【００８５】
（２）反応液の調製
以下の各成分を混合して13.97μlの反応液を調製した。
750mM トリス緩衝液（pH8.0） 1.00μl
10×Thermopol緩衝液
(ニューイングランドバイオラボラトリー社製) 2.50μl
10mM dNTPs 2.00μl
100mM MgSO4 0.75μl
100mM ジチオスレイトール 1.25μl
2％ Tergitol(シグマアルドリッチジャパン株式会社製) 2.50μl
H2O 3.97μl
【００８６】
（３）酵素試薬の調製
以下の各成分を混合して3.04μlの酵素試薬を調製した。
10U/μl AMV逆転写酵素(プロメガ株式会社製) 0.14μl
8U/μl Bst DNAポリメラーゼ
(ニューイングランドバイオラボラトリー社製) 2.27μl
RNase inhibitor(プロメガ株式会社製) 0.63μl
【００８７】
（４）プライマの調製
以下の各成分を混合して6.00μlのプライマ溶液を調製した。
80pmol/μl forward inner primer 1.00μl
（配列番号５：5'-GGAGTTCTCAATGGTGGCACCAACTACTACACGACCATCCA-3'）
80pmol/μl reverse inner primer 1.00μl
（配列番号６：5'-GTCCTGCAGATCGACAACGCCTCCGTCTCAAACTTGGTTCG-3'）
5pmol/μl forward outer primer 1.00μl
（配列番号７：5'-TGGTACCAGAAGCAGGGG-3'）
5pmol/μl reverse outer primer 1.00μl
（配列番号８：5'-GTTGATGTCGGCCTCCACG-3'）
60pmol/μl forward loop primer 1.00μl
（配列番号９：5'-AGAATCTTGTCCCGCAGG-3'）
60pmol/μl reverse loop primer 1.00μl
（配列番号１０：5'-CGTCTGGCTGCAGATGA-3'）
【００８８】
（５）ＲＴ−ＬＡＭＰ反応液の調製
上記反応液、酵素試薬およびプライマ試薬からなるＲＴ−ＬＡＭＰ反応液を調製した。ＲＴ−ＬＡＭＰ反応液は、ＣＫ１９のｍＲＮＡを鋳型として、ＲＴ−ＬＡＭＰ法によりｃＤＮＡを増幅させるための反応液である。
【００８９】
（６）ＣＫ１９のｍＲＮＡの定量
上記検出試料２μlを、ＲＴ−ＬＡＭＰ反応液２３μlに添加して、リアルタイム濁度測定装置（テラメックス社製ＬＡ−２００）を用い、核酸増幅と同時に副産物として生成する不溶性のピロリン酸マグネシウムの白濁をリアルタイムで測定した。
【００９０】
ＲＴ−ＬＡＭＰ法により各検出試料に含まれるｍＲＮＡに対応するｃＤＮＡが増幅して濁度が０．１に達するまで時間（検出時間）を測定し、この値に基づいて、ＣＫ１９のｍＲＮＡの絶対量を算出した。結果を図７に示す。図７の結果から、閾値を検出試料当たり１４０コピーに設定することにより、組織診の結果に合致して胃がんの転移を判定することができることがわかる。
【００９１】
実施例３の結果から、定量ＲＴ−ＬＡＭＰであっても、ＣＫ１９のｍＲＮＡの定量値から、胃がんのリンパ節転移を判定することが可能であることが、明らかとなった。
【００９２】
以上より、検出試料中のサイトケラチン１９のｍＲＮＡの定量値に基づいて、胃がんのリンパ節転の正確な判定結果を得られることがわかった。また、本発明の胃がんのリンパ節転移判定方法は、ｍＲＮＡの定量方法、特に核酸増幅法の種類を問わず、有効な判定を行うことができることが明らかとなった。
【００９３】
実施例４（定量ＲＴ−ＰＣＲによるリンパ節転移巣サイズの測定）
胃がん患者９名から得たリンパ節１１個について、がん細胞数とCK19 mRNA発現量とを測定した。
【００９４】
（１）転移巣サイズの測定およびがん細胞数の計数
胃がん（非充実低分化腺癌）が転移したリンパ節１１個から、厚さ１０μmの切片を作成し、スライドガラスに載置した。この切片に対して、抗ＣＫ１９抗体及びEnvision Kit（何れもＤＡＫＯ社）を用いて免疫組織化学染色を行った。GS-710 Calibrated Densitometer（バイオラッド社）を用いてこの切片のがん細胞の転移巣サイズ（ｍｍ２）の測定を行った。また、WinROOF(三谷商事株式会社）を用いて、がん細胞の数（細胞数/セクション）を計数した。
【００９５】
（２）ＣＫ１９ｍＲＮＡ定量
上記（１）で切り取った切片に隣接する切片（厚さ約１０μｍ）を切り取り、RNeasy Mini Kit（キアゲン社）を用いてＲＮＡ抽出を行い、ＲＮＡ試料を調製した。このＲＮＡ試料を用いて以下の組成の反応液を調製し、ＴａｑＭａｎ法によって、ＣＫ１９ｍＲＮＡのコピー数（コピー／セクション）を算出した。なお、ＴａｑＭａｎ法による測定は、TaqMan One-step RT-PCR Master Mix及びPrism 7000 Realtime PCR system（何れもアプライドバイオシステムズ社）を用いて添付の使用説明書に従って行われた。
【００９６】
反応液：
ＲＮａｓｅ ｆｒｅｅ Ｈ2Ｏ １０．２０５μＬ
TaqMan 2x Universal PCR Master Mix １２．５μＬ
40X MultiScribe and RNase Inhibitor Mix ０．６３μＬ
１００μＭ フォワードプライマ ０．０７５μＬ
１００μＭ リバースプライマ ０．０７５μＬ
９．７ｐｍｏｌ／μＬ（終濃度２００ｎｍ） TaqManプローブ ０．５１５μＬ
検出試料 １μＬ
合計 ２５．００μＬ
【００９７】
また、ＣＫ１９ ｍＲＮＡ検出のためのプライマ配列及びTaqManプローブの配列は以下の通りである。
フォワードプライマ：5'-CAGATCGAAGGCCTGAAGGA-3'（配列番号１）
リバースプライマ：5'-CTTGGCCCCTCAGCGTACT-3'（配列番号２）
TaqManプローブ：5'-GCCTACCTGAAGAAGAACCATGAGGAGGAA-3'（配列番号１１）
【００９８】
なお、このTaqManプローブは、５'末端には６−カルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ）、３'末端には６−カルボキシ−テトラメチル−ローダミン（ＴＡＭＲＡ）を有する。
【００９９】
反応条件
４８℃、３０分
９５℃、１０分
ＰＣＲ：以下の工程を４０サイクル
９５℃、１５秒
６０℃、１分。
【０１００】
ｍＲＮＡの定量値（コピー／セクション）と、胃がんの転移巣サイズとの関係を図８に示す。定量値とがん細胞数との関係を図９に示す。図８および図９より、ＣＫ１９ｍＲＮＡの定量値は、転移巣のサイズおよびがん細胞数に相関することが認められた。従って、リンパ節のＣＫ１９ｍＲＮＡを定量することにより、転移巣のサイズを予測できることが確認された。
【０１０１】
実施例５（定量ＲＴ−ＬＡＭＰによるリンパ節転移巣サイズの測定）
胃がん患者９名から得たリンパ節１１個について、がん細胞数とCK19 mRNA発現量とを測定した。
【０１０２】
（１）転移巣サイズの測定およびがん細胞数の計数
実施例４（１）に記載の方法にしたがい、胃がん（非充実低分化腺癌）が転移したリンパ節１１個から、厚さ１０μmの切片を作成し、免疫組織化学染色を行った。ついで、実施例４（１）記載の方法にしたがい、それらの切片のがん細胞の転移巣サイズ（ｍｍ２）を測定した。また、実施例４（１）記載の方法にしたがい、がん細胞の数（細胞数/セクション）を計数した。
【０１０３】
（２）ＣＫ１９ｍＲＮＡ定量
上記（１）で切り取った切片に隣接する切片（厚さ約１０μｍ）を切り取り、RNeasy Mini Kit（キアゲン社）を用いてＲＮＡ抽出を行い、ＲＮＡ試料を調製した。ついで、実施例３記載の方法にしたがい、反応液を調製し、ＲＴ−ＬＡＭＰを実施した。
【０１０４】
ｍＲＮＡの定量値（コピー／セクション）と、胃がんの転移巣サイズとの関係を図１０に示す。定量値とがん細胞数との関係を図１１に示す。図１０および図１１より、ＣＫ１９ｍＲＮＡの定量値は、転移巣のサイズおよびがん細胞数に相関することが認められた。従って、リンパ節のＣＫ１９ｍＲＮＡを定量することにより、転移巣のサイズを予測できることが確認された。
【図面の簡単な説明】
【０１０５】
【図１】本発明の一実施形態による判定装置の全体構成を示した斜視図である。
【図２】図１に示した判定装置の定量手段としての核酸増幅測定装置の全体構成を示した斜視図である。
【図３】図２の核酸増幅測定装置の概略平面図である。
【図４】本発明の一実施形態による判定装置の判定手段としてのパーソナルコンピュータのＣＰＵの転移判定フローである。
【図５】実施例１において算出された、胃がんのリンパ節組織中のＣＫ１９のｍＲＮＡのコピー数を示すグラフである。
【図６】実施例２において算出された、胃がんのリンパ節組織中のＣＫ１９のｍＲＮＡの標準化された値を示すグラフである。
【図７】実施例３において算出された、胃がんのリンパ節組織中のＣＫ１９のｍＲＮＡのコピー数を示すグラフである。
【図８】ＣＫ１９のｍＲＮＡ定量値と転移巣サイズとの関係を示すグラフである。
【図９】ＣＫ１９のｍＲＮＡ定量値とがん細胞数との関係を示すグラフである。
【図１０】ＣＫ１９のｍＲＮＡ定量値と転移巣サイズとの関係を示すグラフである。
【図１１】ＣＫ１９のｍＲＮＡ定量値とがん細胞数との関係を示すグラフである。
【符号の説明】
【０１０６】
１ がんの転移判定装置
１０１ 核酸増幅測定装置
５１ 反応部
５２ 濁度検出部
１０２ パーソナルコンピュータ
１０２ｃ 表示部
１０２ｄ ＣＰＵ
【特許請求の範囲】
【請求項１】
胃がんの転移が疑われるリンパ節組織を用いて調製された検出試料中のサイトケラチン１９のｍＲＮＡを定量する工程と、
得られたｍＲＮＡの定量値に基づいて前記胃がんのリンパ節への転移を判定する工程と、を含む胃がんのリンパ節転移判定方法。
【請求項２】
ｍＲＮＡの定量値に基づき、胃がんの転移レベルを判定するための指標を得る工程をさらに含む、請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記指標が、転移巣サイズである請求項２記載の方法。
【請求項４】
前記指標が、転移巣のがん細胞数である請求項２または３記載の方法。
【請求項５】
前記定量工程において、前記サイトケラチン１９のｍＲＮＡが、核酸増幅法を用いて定量される、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記核酸増幅法が、定量ＲＴ−ＰＣＲ又は定量ＲＴ−ＬＡＭＰである、請求項５記載の方法。
【請求項７】
前記判定工程が、前記ｍＲＮＡの定量値が過剰のとき、リンパ節転移が陽性であると決定する工程である請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記判定工程が、前記ｍＲＮＡの定量値と予め決定された閾値とを比較し、定量値が閾値と同じまたは閾値未満であるときは胃がんのリンパ節転移陰性であると判定することを含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記判定工程が、前記ｍＲＮＡの定量値と予め決定された閾値とを比較し、定量値が閾値同じまたは閾値を超えるときは胃がんのリンパ節転移陽性であると判定することを含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記ｍＲＮＡの定量値が、前記検出用試料中の前記サイトケラチン１９のｍＲＮＡの絶対量である、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
胃がんの転移が疑われるリンパ節組織を用いて調製された検出試料中のサイトケラチン１９のｍＲＮＡを定量する定量手段と、
得られたｍＲＮＡの定量値に基づいて胃がんのリンパ節への転移を判定する判定手段と、を備える胃がんのリンパ節転移判定装置。
【請求項１２】
得られたｍＲＮＡの定量値に基づき、胃がんの転移レベルを判定するための指標を得る手段を備える、請求項１１記載の装置。
【請求項１３】
検出試料を調製するためのリンパ節組織の前処理液と、
サイトケラチン１９を検出し得るプライマを含むプライマ溶液と、
核酸増幅法を実施するための酵素を含む酵素溶液と、を有する胃がんのリンパ節転移判定用試薬キット。
【請求項１４】
前記前処理液がジメチルスルホキシドを含有する緩衝液である、請求項１１記載のキット。
【請求項１５】
前記酵素溶液が、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ及びＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼを含有する、請求項１３又は１４記載のキット。
【請求項１】
胃がんの転移が疑われるリンパ節組織を用いて調製された検出試料中のサイトケラチン１９のｍＲＮＡを定量する工程と、
得られたｍＲＮＡの定量値に基づいて前記胃がんのリンパ節への転移を判定する工程と、を含む胃がんのリンパ節転移判定方法。
【請求項２】
ｍＲＮＡの定量値に基づき、胃がんの転移レベルを判定するための指標を得る工程をさらに含む、請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記指標が、転移巣サイズである請求項２記載の方法。
【請求項４】
前記指標が、転移巣のがん細胞数である請求項２または３記載の方法。
【請求項５】
前記定量工程において、前記サイトケラチン１９のｍＲＮＡが、核酸増幅法を用いて定量される、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記核酸増幅法が、定量ＲＴ−ＰＣＲ又は定量ＲＴ−ＬＡＭＰである、請求項５記載の方法。
【請求項７】
前記判定工程が、前記ｍＲＮＡの定量値が過剰のとき、リンパ節転移が陽性であると決定する工程である請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記判定工程が、前記ｍＲＮＡの定量値と予め決定された閾値とを比較し、定量値が閾値と同じまたは閾値未満であるときは胃がんのリンパ節転移陰性であると判定することを含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記判定工程が、前記ｍＲＮＡの定量値と予め決定された閾値とを比較し、定量値が閾値同じまたは閾値を超えるときは胃がんのリンパ節転移陽性であると判定することを含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記ｍＲＮＡの定量値が、前記検出用試料中の前記サイトケラチン１９のｍＲＮＡの絶対量である、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
胃がんの転移が疑われるリンパ節組織を用いて調製された検出試料中のサイトケラチン１９のｍＲＮＡを定量する定量手段と、
得られたｍＲＮＡの定量値に基づいて胃がんのリンパ節への転移を判定する判定手段と、を備える胃がんのリンパ節転移判定装置。
【請求項１２】
得られたｍＲＮＡの定量値に基づき、胃がんの転移レベルを判定するための指標を得る手段を備える、請求項１１記載の装置。
【請求項１３】
検出試料を調製するためのリンパ節組織の前処理液と、
サイトケラチン１９を検出し得るプライマを含むプライマ溶液と、
核酸増幅法を実施するための酵素を含む酵素溶液と、を有する胃がんのリンパ節転移判定用試薬キット。
【請求項１４】
前記前処理液がジメチルスルホキシドを含有する緩衝液である、請求項１１記載のキット。
【請求項１５】
前記酵素溶液が、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ及びＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼを含有する、請求項１３又は１４記載のキット。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【公開番号】特開２００８−１９４０２８（Ｐ２００８−１９４０２８Ａ）
【公開日】平成２０年８月２８日（２００８．８．２８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−３３８５８０（Ｐ２００７−３３８５８０）
【出願日】平成１９年１２月２８日（２００７．１２．２８）
【出願人】（３９００１４９６０）シスメックス株式会社 (810)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２０年８月２８日（２００８．８．２８）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年１２月２８日（２００７．１２．２８）
【出願人】（３９００１４９６０）シスメックス株式会社 (810)
【Ｆターム（参考）】
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