胃ガンの検出用マーカー
【課題】胃ガン検出用の遺伝子及び/又はタンパク質のマーカーの提供。
【解決手段】GTM遺伝子ファミリーのメンバーを、胃の腫瘍組織及び他の腫瘍組織で過剰発現させ、それにより胃及び他のタイプのガンのためのマーカーとして使用する。GTMタンパク質はガン細胞から放出され、そして血清及び/又は他の体液中にその検出を可能とする程、充分な高濃度に達する。胃ガン診断の有益なツールとしてGTMの検出及び定量のための方法及び検査キット。
【解決手段】GTM遺伝子ファミリーのメンバーを、胃の腫瘍組織及び他の腫瘍組織で過剰発現させ、それにより胃及び他のタイプのガンのためのマーカーとして使用する。GTMタンパク質はガン細胞から放出され、そして血清及び/又は他の体液中にその検出を可能とする程、充分な高濃度に達する。胃ガン診断の有益なツールとしてGTMの検出及び定量のための方法及び検査キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願
本出願は、米国特許法119条の優先権を、2003年7月17日に出願され、発明の名称が「胃ガンの検出用マーカー」であり、発明者としてParry John Guilfordが挙げられた、米国暫定特許出願第60/487,906号に主張する。
【0002】
背景技術
本発明は、ガンの検出に関する。特には、本発明はガン検出用の遺伝子及び/又はタンパク質マーカーの使用に関し、そしてより特には、胃ガン検出用の遺伝子及び/又はタンパク質のマーカーの使用に関する。
【0003】
技術背景
ガン患者の生存は、ガンがいつ検出され、そして早期に治療されるかにより大きく高まる。胃ガンの場合は、早期のステージの症状であると診断された患者は、進行した症状であると診断された患者が約10%の5年生存率であるのに比較して、90%の5年生存率を有する。しかし、胃ガン患者の大多数が、現在進行した症状にある。従って、開発が胃ガンの早期診断に至れば、患者にとっては予後が改善されうる。
【0004】
体液、例えば血液、尿、腹腔洗浄液や大便抽出物を含む生物試料中の、特異的なガン関連マーカーの同定により、早期治療及び予後の改善に至る、早期ガン診断に有効なアプローチを提供することができる。特異的なガンマーカーはまた、症状の進行をモニターする手段も提供し、外科的、放射線療法及び化学療法での治療の有効性を追跡するのを可能とする。しかし、多数の主要なガンにとって、入手可能なマーカーは感受性及び特異性が不充分である。例えば、最も頻繁に用いられる胃ガン用マーカー、ca19〜9、ca72〜4及び絨毛胚性抗原(CEA)は、全てのステージの胃腫瘍の約15〜50%を検出するのみであり、早期ステージの症状については約2〜11%に低下する。このように、患者や保健の開業医に症状はないと信じさせることとなる偽陰性の検査が非常に高頻度にあり、実際、患者が即時の注意を必要とする重篤なガンを有していることもある。さらに、これらのマーカーは、良性の胃の症状が影響する個体の1/3にまで、偽陽性シグナルを与えることもある。
【0005】
発明の要約
このように、ガンの存在を検出するためのよりよい方法が即時に必要である。本発明の観点では、早期ステージのガンの検出を提供し、そして偽陽性及び偽陰性の検査結果の頻度を減少できる方法、組成物及び装置を提供する。
【0006】
ある実施態様では、分子分析を用いて、非悪性の胃組織に比較して、胃の腫瘍組織で過剰発現している遺伝子を同定することができる。このような分析には、マイクロアレイや定量ポリメラーゼ連鎖反応(qPCR)法が挙げられる。これらの遺伝子をコード化したガン遺伝子及びタンパク質を、本明細書においては胃の腫瘍マーカー(GTM)と呼ぶ。用語GTMは、マーカーが胃の腫瘍のみに特異的であるであることを要するものではないと解されるであろう。むしろ、GTMの発現は、悪性又は非悪性の腫瘍、例えば、特に胃、膀胱、大腸、膵臓、卵巣、皮膚(例えば、メラノーマ)、肝臓、食道、子宮体及び脳のガン、その他といった、他の腫瘍タイプで増大してもよい。しかし、用語GTMは、従来技術のマーカー、ca19〜9、ca72〜4及びCEAを含まないものと、解するべきである。いくつかのGTMは、高度な信頼性で胃ガンを診断するのに足る過剰発現をしており、そして他の場合には、2以上のGTMの過剰発現により、胃ガンの信頼できる診断を提供することができる。
【0007】
ある実施態様では、マイクロアレイ法を用いて、ガンに関する1以上の遺伝子の過剰発現のパターンを検出することができる。
【0008】
他の実施態様では、定量ポリメラーゼ連鎖反応(qPCR)を用いて、腫瘍又は他の生物試料中に過剰発現したマーカーの存在を同定することができる。
【0009】
本明細書中に開示するGTM検出のいくつかの実施態様は、腫瘍細胞中での高い選択的様式での過剰発現であり、(そして仮にあったとしても、非腫瘍細胞では、ほとんどないが)唯一に過剰発現したGTMの測定によりガンに敏感で、かつ正確な検出を可能にする。他の実施態様では、2、3又はそれ以上のGTMの過剰発現を試料中に検出してもよく、またより確かな診断を提供することができる。
【0010】
タンパク質をコード化する選択遺伝子は、細胞により分泌していてもよく、あるいは細胞から貫いていてもよい。これらのタンパク質は、単独又は互いの組合せのいずれかで、胃ガン診断用の血清又は体液マーカーとして、又は確定した症状の進行をモニターするマーカーとして、有用である。タンパク質マーカーの検出は、当該技術分野で既知の方法を用いて実施することができ、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗血清などの使用が挙げられる。
【図面の簡単な説明】
【0011】
本発明を、その特異的な実施態様を参照して、そして図面を参照して説明するが、図中:
【図1】図1は、本発明の胃ガン用マーカー及びマーカーのオリゴヌクレオチド配列の表を示す。
【図2】図2は、マイクロアレイ法を用いて実施した研究で得られた結果の表を示す。
【図3】図3は、定量PCRを用いて実施した研究で得られた結果の表を示す。
【図4a】図4a〜dは、アレイ及びqPCR法を用いて得られたlog2倍の結果間の関係を示し、図中データは、4つの胃ガンマーカーについて中央値の正常を中心とする。灰色の四角は、非悪性(「正常」)試料に対応し、そして黒色の三角は、腫瘍試料に対応する。図4a:ASPN。図4b:SPP1。図4c:SPARC。図4d:MMP12。
【図4b】図4a〜dは、アレイ及びqPCR法を用いて得られたlog2倍の結果間の関係を示し、図中データは、4つの胃ガンマーカーについて中央値の正常を中心とする。灰色の四角は、非悪性(「正常」)試料に対応し、そして黒色の三角は、腫瘍試料に対応する。図4a:ASPN。図4b:SPP1。図4c:SPARC。図4d:MMP12。
【図4c】図4a〜dは、アレイ及びqPCR法を用いて得られたlog2倍の結果間の関係を示し、図中データは、4つの胃ガンマーカーについて中央値の正常を中心とする。灰色の四角は、非悪性(「正常」)試料に対応し、そして黒色の三角は、腫瘍試料に対応する。図4a:ASPN。図4b:SPP1。図4c:SPARC。図4d:MMP12。
【図4d】図4a〜dは、アレイ及びqPCR法を用いて得られたlog2倍の結果間の関係を示し、図中データは、4つの胃ガンマーカーについて中央値の正常を中心とする。灰色の四角は、非悪性(「正常」)試料に対応し、そして黒色の三角は、腫瘍試料に対応する。図4a:ASPN。図4b:SPP1。図4c:SPARC。図4d:MMP12。
【図5a】図5a〜5wは、種々の腫瘍マーカーの定量PCR研究から得られた相対頻度対log2倍変化のデータを示すヒストグラムを表わす。図5a:ASPN;図5b:CST1、2及び4;図5c:CSPG2;図5d:IGFBP7;図5e:INHBA;図5f:LOXL2;図5g:LUM;図5h:SFRP4;図5i:SPARC;図5j:SPP1;図5k:THBS2;図5l:TIMP1;図5m:アドリカン;図5n:PRS11;図5o:ASAH1;図5p:SFRP2;図5q:GGH;図5r:MMP12;図5s:KLK10;図5t:LEPRE1;図5u:TG;図5v:EFEMP2及び図5w:TGFBI。
【図5b】図5a〜5wは、種々の腫瘍マーカーの定量PCR研究から得られた相対頻度対log2倍変化のデータを示すヒストグラムを表わす。図5a:ASPN;図5b:CST1、2及び4;図5c:CSPG2;図5d:IGFBP7;図5e:INHBA;図5f:LOXL2;図5g:LUM;図5h:SFRP4;図5i:SPARC;図5j:SPP1;図5k:THBS2;図5l:TIMP1;図5m:アドリカン;図5n:PRS11;図5o:ASAH1;図5p:SFRP2;図5q:GGH;図5r:MMP12;図5s:KLK10;図5t:LEPRE1;図5u:TG;図5v:EFEMP2及び図5w:TGFBI。
【図5c】図5a〜5wは、種々の腫瘍マーカーの定量PCR研究から得られた相対頻度対log2倍変化のデータを示すヒストグラムを表わす。図5a:ASPN;図5b:CST1、2及び4;図5c:CSPG2;図5d:IGFBP7;図5e:INHBA;図5f:LOXL2;図5g:LUM;図5h:SFRP4;図5i:SPARC;図5j:SPP1;図5k:THBS2;図5l:TIMP1;図5m:アドリカン;図5n:PRS11;図5o:ASAH1;図5p:SFRP2;図5q:GGH;図5r:MMP12;図5s:KLK10;図5t:LEPRE1;図5u:TG;図5v:EFEMP2及び図5w:TGFBI。
【図5d】図5a〜5wは、種々の腫瘍マーカーの定量PCR研究から得られた相対頻度対log2倍変化のデータを示すヒストグラムを表わす。図5a:ASPN;図5b:CST1、2及び4;図5c:CSPG2;図5d:IGFBP7;図5e:INHBA;図5f:LOXL2;図5g:LUM;図5h:SFRP4;図5i:SPARC;図5j:SPP1;図5k:THBS2;図5l:TIMP1;図5m:アドリカン;図5n:PRS11;図5o:ASAH1;図5p:SFRP2;図5q:GGH;図5r:MMP12;図5s:KLK10;図5t:LEPRE1;図5u:TG;図5v:EFEMP2及び図5w:TGFBI。
【図5e】図5a〜5wは、種々の腫瘍マーカーの定量PCR研究から得られた相対頻度対log2倍変化のデータを示すヒストグラムを表わす。図5a:ASPN;図5b:CST1、2及び4;図5c:CSPG2;図5d:IGFBP7;図5e:INHBA;図5f:LOXL2;図5g:LUM;図5h:SFRP4;図5i:SPARC;図5j:SPP1;図5k:THBS2;図5l:TIMP1;図5m:アドリカン;図5n:PRS11;図5o:ASAH1;図5p:SFRP2;図5q:GGH;図5r:MMP12;図5s:KLK10;図5t:LEPRE1;図5u:TG;図5v:EFEMP2及び図5w:TGFBI。
【図5f】図5a〜5wは、種々の腫瘍マーカーの定量PCR研究から得られた相対頻度対log2倍変化のデータを示すヒストグラムを表わす。図5a:ASPN;図5b:CST1、2及び4;図5c:CSPG2;図5d:IGFBP7;図5e:INHBA;図5f:LOXL2;図5g:LUM;図5h:SFRP4;図5i:SPARC;図5j:SPP1;図5k:THBS2;図5l:TIMP1;図5m:アドリカン;図5n:PRS11;図5o:ASAH1;図5p:SFRP2;図5q:GGH;図5r:MMP12;図5s:KLK10;図5t:LEPRE1;図5u:TG;図5v:EFEMP2及び図5w:TGFBI。
【図5g】図5a〜5wは、種々の腫瘍マーカーの定量PCR研究から得られた相対頻度対log2倍変化のデータを示すヒストグラムを表わす。図5a:ASPN;図5b:CST1、2及び4;図5c:CSPG2;図5d:IGFBP7;図5e:INHBA;図5f:LOXL2;図5g:LUM;図5h:SFRP4;図5i:SPARC;図5j:SPP1;図5k:THBS2;図5l:TIMP1;図5m:アドリカン;図5n:PRS11;図5o:ASAH1;図5p:SFRP2;図5q:GGH;図5r:MMP12;図5s:KLK10;図5t:LEPRE1;図5u:TG;図5v:EFEMP2及び図5w:TGFBI。
【図5h】図5a〜5wは、種々の腫瘍マーカーの定量PCR研究から得られた相対頻度対log2倍変化のデータを示すヒストグラムを表わす。図5a:ASPN;図5b:CST1、2及び4;図5c:CSPG2;図5d:IGFBP7;図5e:INHBA;図5f:LOXL2;図5g:LUM;図5h:SFRP4;図5i:SPARC;図5j:SPP1;図5k:THBS2;図5l:TIMP1;図5m:アドリカン;図5n:PRS11;図5o:ASAH1;図5p:SFRP2;図5q:GGH;図5r:MMP12;図5s:KLK10;図5t:LEPRE1;図5u:TG;図5v:EFEMP2及び図5w:TGFBI。
【図5i】図5a〜5wは、種々の腫瘍マーカーの定量PCR研究から得られた相対頻度対log2倍変化のデータを示すヒストグラムを表わす。図5a:ASPN;図5b:CST1、2及び4;図5c:CSPG2;図5d:IGFBP7;図5e:INHBA;図5f:LOXL2;図5g:LUM;図5h:SFRP4;図5i:SPARC;図5j:SPP1;図5k:THBS2;図5l:TIMP1;図5m:アドリカン;図5n:PRS11;図5o:ASAH1;図5p:SFRP2;図5q:GGH;図5r:MMP12;図5s:KLK10;図5t:LEPRE1;図5u:TG;図5v:EFEMP2及び図5w:TGFBI。
【図5j】図5a〜5wは、種々の腫瘍マーカーの定量PCR研究から得られた相対頻度対log2倍変化のデータを示すヒストグラムを表わす。図5a:ASPN;図5b:CST1、2及び4;図5c:CSPG2;図5d:IGFBP7;図5e:INHBA;図5f:LOXL2;図5g:LUM;図5h:SFRP4;図5i:SPARC;図5j:SPP1;図5k:THBS2;図5l:TIMP1;図5m:アドリカン;図5n:PRS11;図5o:ASAH1;図5p:SFRP2;図5q:GGH;図5r:MMP12;図5s:KLK10;図5t:LEPRE1;図5u:TG;図5v:EFEMP2及び図5w:TGFBI。
【図5k】図5a〜5wは、種々の腫瘍マーカーの定量PCR研究から得られた相対頻度対log2倍変化のデータを示すヒストグラムを表わす。図5a:ASPN;図5b:CST1、2及び4;図5c:CSPG2;図5d:IGFBP7;図5e:INHBA;図5f:LOXL2;図5g:LUM;図5h:SFRP4;図5i:SPARC;図5j:SPP1;図5k:THBS2;図5l:TIMP1;図5m:アドリカン;図5n:PRS11;図5o:ASAH1;図5p:SFRP2;図5q:GGH;図5r:MMP12;図5s:KLK10;図5t:LEPRE1;図5u:TG;図5v:EFEMP2及び図5w:TGFBI。
【図5l】図5a〜5wは、種々の腫瘍マーカーの定量PCR研究から得られた相対頻度対log2倍変化のデータを示すヒストグラムを表わす。図5a:ASPN;図5b:CST1、2及び4;図5c:CSPG2;図5d:IGFBP7;図5e:INHBA;図5f:LOXL2;図5g:LUM;図5h:SFRP4;図5i:SPARC;図5j:SPP1;図5k:THBS2;図5l:TIMP1;図5m:アドリカン;図5n:PRS11;図5o:ASAH1;図5p:SFRP2;図5q:GGH;図5r:MMP12;図5s:KLK10;図5t:LEPRE1;図5u:TG;図5v:EFEMP2及び図5w:TGFBI。
【図5m】図5a〜5wは、種々の腫瘍マーカーの定量PCR研究から得られた相対頻度対log2倍変化のデータを示すヒストグラムを表わす。図5a:ASPN;図5b:CST1、2及び4;図5c:CSPG2;図5d:IGFBP7;図5e:INHBA;図5f:LOXL2;図5g:LUM;図5h:SFRP4;図5i:SPARC;図5j:SPP1;図5k:THBS2;図5l:TIMP1;図5m:アドリカン;図5n:PRS11;図5o:ASAH1;図5p:SFRP2;図5q:GGH;図5r:MMP12;図5s:KLK10;図5t:LEPRE1;図5u:TG;図5v:EFEMP2及び図5w:TGFBI。
【図5n】図5a〜5wは、種々の腫瘍マーカーの定量PCR研究から得られた相対頻度対log2倍変化のデータを示すヒストグラムを表わす。図5a:ASPN;図5b:CST1、2及び4;図5c:CSPG2;図5d:IGFBP7;図5e:INHBA;図5f:LOXL2;図5g:LUM;図5h:SFRP4;図5i:SPARC;図5j:SPP1;図5k:THBS2;図5l:TIMP1;図5m:アドリカン;図5n:PRS11;図5o:ASAH1;図5p:SFRP2;図5q:GGH;図5r:MMP12;図5s:KLK10;図5t:LEPRE1;図5u:TG;図5v:EFEMP2及び図5w:TGFBI。
【図5o】図5a〜5wは、種々の腫瘍マーカーの定量PCR研究から得られた相対頻度対log2倍変化のデータを示すヒストグラムを表わす。図5a:ASPN;図5b:CST1、2及び4;図5c:CSPG2;図5d:IGFBP7;図5e:INHBA;図5f:LOXL2;図5g:LUM;図5h:SFRP4;図5i:SPARC;図5j:SPP1;図5k:THBS2;図5l:TIMP1;図5m:アドリカン;図5n:PRS11;図5o:ASAH1;図5p:SFRP2;図5q:GGH;図5r:MMP12;図5s:KLK10;図5t:LEPRE1;図5u:TG;図5v:EFEMP2及び図5w:TGFBI。
【図5p】図5a〜5wは、種々の腫瘍マーカーの定量PCR研究から得られた相対頻度対log2倍変化のデータを示すヒストグラムを表わす。図5a:ASPN;図5b:CST1、2及び4;図5c:CSPG2;図5d:IGFBP7;図5e:INHBA;図5f:LOXL2;図5g:LUM;図5h:SFRP4;図5i:SPARC;図5j:SPP1;図5k:THBS2;図5l:TIMP1;図5m:アドリカン;図5n:PRS11;図5o:ASAH1;図5p:SFRP2;図5q:GGH;図5r:MMP12;図5s:KLK10;図5t:LEPRE1;図5u:TG;図5v:EFEMP2及び図5w:TGFBI。
【図5q】図5a〜5wは、種々の腫瘍マーカーの定量PCR研究から得られた相対頻度対log2倍変化のデータを示すヒストグラムを表わす。図5a:ASPN;図5b:CST1、2及び4;図5c:CSPG2;図5d:IGFBP7;図5e:INHBA;図5f:LOXL2;図5g:LUM;図5h:SFRP4;図5i:SPARC;図5j:SPP1;図5k:THBS2;図5l:TIMP1;図5m:アドリカン;図5n:PRS11;図5o:ASAH1;図5p:SFRP2;図5q:GGH;図5r:MMP12;図5s:KLK10;図5t:LEPRE1;図5u:TG;図5v:EFEMP2及び図5w:TGFBI。
【図5r】図5a〜5wは、種々の腫瘍マーカーの定量PCR研究から得られた相対頻度対log2倍変化のデータを示すヒストグラムを表わす。図5a:ASPN;図5b:CST1、2及び4;図5c:CSPG2;図5d:IGFBP7;図5e:INHBA;図5f:LOXL2;図5g:LUM;図5h:SFRP4;図5i:SPARC;図5j:SPP1;図5k:THBS2;図5l:TIMP1;図5m:アドリカン;図5n:PRS11;図5o:ASAH1;図5p:SFRP2;図5q:GGH;図5r:MMP12;図5s:KLK10;図5t:LEPRE1;図5u:TG;図5v:EFEMP2及び図5w:TGFBI。
【図5s】図5a〜5wは、種々の腫瘍マーカーの定量PCR研究から得られた相対頻度対log2倍変化のデータを示すヒストグラムを表わす。図5a:ASPN;図5b:CST1、2及び4;図5c:CSPG2;図5d:IGFBP7;図5e:INHBA;図5f:LOXL2;図5g:LUM;図5h:SFRP4;図5i:SPARC;図5j:SPP1;図5k:THBS2;図5l:TIMP1;図5m:アドリカン;図5n:PRS11;図5o:ASAH1;図5p:SFRP2;図5q:GGH;図5r:MMP12;図5s:KLK10;図5t:LEPRE1;図5u:TG;図5v:EFEMP2及び図5w:TGFBI。
【図5t】図5a〜5wは、種々の腫瘍マーカーの定量PCR研究から得られた相対頻度対log2倍変化のデータを示すヒストグラムを表わす。図5a:ASPN;図5b:CST1、2及び4;図5c:CSPG2;図5d:IGFBP7;図5e:INHBA;図5f:LOXL2;図5g:LUM;図5h:SFRP4;図5i:SPARC;図5j:SPP1;図5k:THBS2;図5l:TIMP1;図5m:アドリカン;図5n:PRS11;図5o:ASAH1;図5p:SFRP2;図5q:GGH;図5r:MMP12;図5s:KLK10;図5t:LEPRE1;図5u:TG;図5v:EFEMP2及び図5w:TGFBI。
【図5u】図5a〜5wは、種々の腫瘍マーカーの定量PCR研究から得られた相対頻度対log2倍変化のデータを示すヒストグラムを表わす。図5a:ASPN;図5b:CST1、2及び4;図5c:CSPG2;図5d:IGFBP7;図5e:INHBA;図5f:LOXL2;図5g:LUM;図5h:SFRP4;図5i:SPARC;図5j:SPP1;図5k:THBS2;図5l:TIMP1;図5m:アドリカン;図5n:PRS11;図5o:ASAH1;図5p:SFRP2;図5q:GGH;図5r:MMP12;図5s:KLK10;図5t:LEPRE1;図5u:TG;図5v:EFEMP2及び図5w:TGFBI。
【図5v】図5a〜5wは、種々の腫瘍マーカーの定量PCR研究から得られた相対頻度対log2倍変化のデータを示すヒストグラムを表わす。図5a:ASPN;図5b:CST1、2及び4;図5c:CSPG2;図5d:IGFBP7;図5e:INHBA;図5f:LOXL2;図5g:LUM;図5h:SFRP4;図5i:SPARC;図5j:SPP1;図5k:THBS2;図5l:TIMP1;図5m:アドリカン;図5n:PRS11;図5o:ASAH1;図5p:SFRP2;図5q:GGH;図5r:MMP12;図5s:KLK10;図5t:LEPRE1;図5u:TG;図5v:EFEMP2及び図5w:TGFBI。
【図5w】図5a〜5wは、種々の腫瘍マーカーの定量PCR研究から得られた相対頻度対log2倍変化のデータを示すヒストグラムを表わす。図5a:ASPN;図5b:CST1、2及び4;図5c:CSPG2;図5d:IGFBP7;図5e:INHBA;図5f:LOXL2;図5g:LUM;図5h:SFRP4;図5i:SPARC;図5j:SPP1;図5k:THBS2;図5l:TIMP1;図5m:アドリカン;図5n:PRS11;図5o:ASAH1;図5p:SFRP2;図5q:GGH;図5r:MMP12;図5s:KLK10;図5t:LEPRE1;図5u:TG;図5v:EFEMP2及び図5w:TGFBI。
【図6】図6は、中央値の正常発現の95パーセンタイル値(95th percentile)より高い発現を有するマーカーの数を示すヒストグラムである。結果は、qPCR基づき、腫瘍試料ごとに別々に示されている。
【図7a】図7a〜cは、腫瘍マーカーであるCEAについての遺伝子発現に比較した、個々の腫瘍試料及び非悪性試料中のマーカーの相対log2発現を示すグラフを表わす。CEAは、胃ガンの進行をモニターするために現在最も用いられる血清マーカーである。
【図7b】図7a〜cは、腫瘍マーカーであるCEAについての遺伝子発現に比較した、個々の腫瘍試料及び非悪性試料中のマーカーの相対log2発現を示すグラフを表わす。CEAは、胃ガンの進行をモニターするために現在最も用いられる血清マーカーである。
【図7c】図7a〜cは、腫瘍マーカーであるCEAについての遺伝子発現に比較した、個々の腫瘍試料及び非悪性試料中のマーカーの相対log2発現を示すグラフを表わす。CEAは、胃ガンの進行をモニターするために現在最も用いられる血清マーカーである。
【図8】図8は、図3を補足する表を示す。図8は、候補の腫瘍マーカーについてのqPCRにより決定される発現レベルを要約するが、対にしたデータを用いて(すなわち、同一個体の腫瘍(「T」)及び非悪性(「N」)試料)T:N比率を提供する。図8はまた、図3には含まれない追加のマーカー、すなわちMMP2、CGR11、TGFB1、PCSK5、SERPINB5、SERPINH1を含む。比較のため、確立した血清のマーカー遺伝子であるCEAXAM5(CEA)の発現レベルも示す。29個のマーカーのうち27個はCEA以上の中央値T:N差異(a median T:N difference)を有する。さらに、CEAに比較して、マーカーのうち29個/29個が、腫瘍試料中の発現が正常試料中の発現を超える対にした試料をより高いパーセンテージで有する。3個のマーカー、CST1、2、44、ASPN及びSFRP4は、対にした腫瘍と正常試料との間で100%の区別を示した。これらのマーカーの遺伝子配列、及びそれを検出するために用いたプライマー及びプローブの配置は本明細書中に示す。
【図9a】図9a〜dは、対にした試料を用いた、40人の患者における29個の胃ガンマーカーについてのそれぞれの、そして中央値T:Nの倍変化のデータを表わす。
【図9b】図9a〜dは、対にした試料を用いた、40人の患者における29個の胃ガンマーカーについてのそれぞれの、そして中央値T:Nの倍変化のデータを表わす。
【図9c】図9a〜dは、対にした試料を用いた、40人の患者における29個の胃ガンマーカーについてのそれぞれの、そして中央値T:Nの倍変化のデータを表わす。
【図9d】図9a〜dは、対にした試料を用いた、40人の患者における29個の胃ガンマーカーについてのそれぞれの、そして中央値T:Nの倍変化のデータを表わす。
【図10a】図10a〜1−adは、CEA及び本発明の他のGTMの発現における、腫瘍ステージとlog2倍変化のグラフを表わす。図10a:アドリカン;図10b:ASPN;図10c:CSPG2;図10d:CST1、2、4;図10e:EFEMP2;図10f:GGF;図10g:INHBA;図10h:IGFBP7;図10i:KLK10;図10j:LEPRE1;図10k:LUM;図10l:LOXL2;図10m:MMP12;図10n:TIMP1;図10o:ASAH1;図10p:SPP1;図10q:SFRP2;図10r:SFRP4;図10s:SPARC;図10t:PRSS11;図10u:THBS2;図10v:TG;図10w:TGFBI;図10x:CGR11;図10y:SERPINH1;図10z:MMP2;図10aa:PCSK5;図10ab:SERPINB5;図10ac:TGFB1及び図10ad:CEA(CEACAM5)。
【図10b】図10a〜1−adは、CEA及び本発明の他のGTMの発現における、腫瘍ステージとlog2倍変化のグラフを表わす。図10a:アドリカン;図10b:ASPN;図10c:CSPG2;図10d:CST1、2、4;図10e:EFEMP2;図10f:GGF;図10g:INHBA;図10h:IGFBP7;図10i:KLK10;図10j:LEPRE1;図10k:LUM;図10l:LOXL2;図10m:MMP12;図10n:TIMP1;図10o:ASAH1;図10p:SPP1;図10q:SFRP2;図10r:SFRP4;図10s:SPARC;図10t:PRSS11;図10u:THBS2;図10v:TG;図10w:TGFBI;図10x:CGR11;図10y:SERPINH1;図10z:MMP2;図10aa:PCSK5;図10ab:SERPINB5;図10ac:TGFB1及び図10ad:CEA(CEACAM5)。
【図10c】図10a〜1−adは、CEA及び本発明の他のGTMの発現における、腫瘍ステージとlog2倍変化のグラフを表わす。図10a:アドリカン;図10b:ASPN;図10c:CSPG2;図10d:CST1、2、4;図10e:EFEMP2;図10f:GGF;図10g:INHBA;図10h:IGFBP7;図10i:KLK10;図10j:LEPRE1;図10k:LUM;図10l:LOXL2;図10m:MMP12;図10n:TIMP1;図10o:ASAH1;図10p:SPP1;図10q:SFRP2;図10r:SFRP4;図10s:SPARC;図10t:PRSS11;図10u:THBS2;図10v:TG;図10w:TGFBI;図10x:CGR11;図10y:SERPINH1;図10z:MMP2;図10aa:PCSK5;図10ab:SERPINB5;図10ac:TGFB1及び図10ad:CEA(CEACAM5)。
【図10d】図10a〜1−adは、CEA及び本発明の他のGTMの発現における、腫瘍ステージとlog2倍変化のグラフを表わす。図10a:アドリカン;図10b:ASPN;図10c:CSPG2;図10d:CST1、2、4;図10e:EFEMP2;図10f:GGF;図10g:INHBA;図10h:IGFBP7;図10i:KLK10;図10j:LEPRE1;図10k:LUM;図10l:LOXL2;図10m:MMP12;図10n:TIMP1;図10o:ASAH1;図10p:SPP1;図10q:SFRP2;図10r:SFRP4;図10s:SPARC;図10t:PRSS11;図10u:THBS2;図10v:TG;図10w:TGFBI;図10x:CGR11;図10y:SERPINH1;図10z:MMP2;図10aa:PCSK5;図10ab:SERPINB5;図10ac:TGFB1及び図10ad:CEA(CEACAM5)。
【図10e】図10a〜1−adは、CEA及び本発明の他のGTMの発現における、腫瘍ステージとlog2倍変化のグラフを表わす。図10a:アドリカン;図10b:ASPN;図10c:CSPG2;図10d:CST1、2、4;図10e:EFEMP2;図10f:GGF;図10g:INHBA;図10h:IGFBP7;図10i:KLK10;図10j:LEPRE1;図10k:LUM;図10l:LOXL2;図10m:MMP12;図10n:TIMP1;図10o:ASAH1;図10p:SPP1;図10q:SFRP2;図10r:SFRP4;図10s:SPARC;図10t:PRSS11;図10u:THBS2;図10v:TG;図10w:TGFBI;図10x:CGR11;図10y:SERPINH1;図10z:MMP2;図10aa:PCSK5;図10ab:SERPINB5;図10ac:TGFB1及び図10ad:CEA(CEACAM5)。
【図10f】図10a〜1−adは、CEA及び本発明の他のGTMの発現における、腫瘍ステージとlog2倍変化のグラフを表わす。図10a:アドリカン;図10b:ASPN;図10c:CSPG2;図10d:CST1、2、4;図10e:EFEMP2;図10f:GGF;図10g:INHBA;図10h:IGFBP7;図10i:KLK10;図10j:LEPRE1;図10k:LUM;図10l:LOXL2;図10m:MMP12;図10n:TIMP1;図10o:ASAH1;図10p:SPP1;図10q:SFRP2;図10r:SFRP4;図10s:SPARC;図10t:PRSS11;図10u:THBS2;図10v:TG;図10w:TGFBI;図10x:CGR11;図10y:SERPINH1;図10z:MMP2;図10aa:PCSK5;図10ab:SERPINB5;図10ac:TGFB1及び図10ad:CEA(CEACAM5)。
【図10g】図10a〜1−adは、CEA及び本発明の他のGTMの発現における、腫瘍ステージとlog2倍変化のグラフを表わす。図10a:アドリカン;図10b:ASPN;図10c:CSPG2;図10d:CST1、2、4;図10e:EFEMP2;図10f:GGF;図10g:INHBA;図10h:IGFBP7;図10i:KLK10;図10j:LEPRE1;図10k:LUM;図10l:LOXL2;図10m:MMP12;図10n:TIMP1;図10o:ASAH1;図10p:SPP1;図10q:SFRP2;図10r:SFRP4;図10s:SPARC;図10t:PRSS11;図10u:THBS2;図10v:TG;図10w:TGFBI;図10x:CGR11;図10y:SERPINH1;図10z:MMP2;図10aa:PCSK5;図10ab:SERPINB5;図10ac:TGFB1及び図10ad:CEA(CEACAM5)。
【図10h】図10a〜1−adは、CEA及び本発明の他のGTMの発現における、腫瘍ステージとlog2倍変化のグラフを表わす。図10a:アドリカン;図10b:ASPN;図10c:CSPG2;図10d:CST1、2、4;図10e:EFEMP2;図10f:GGF;図10g:INHBA;図10h:IGFBP7;図10i:KLK10;図10j:LEPRE1;図10k:LUM;図10l:LOXL2;図10m:MMP12;図10n:TIMP1;図10o:ASAH1;図10p:SPP1;図10q:SFRP2;図10r:SFRP4;図10s:SPARC;図10t:PRSS11;図10u:THBS2;図10v:TG;図10w:TGFBI;図10x:CGR11;図10y:SERPINH1;図10z:MMP2;図10aa:PCSK5;図10ab:SERPINB5;図10ac:TGFB1及び図10ad:CEA(CEACAM5)。
【図10i】図10a〜1−adは、CEA及び本発明の他のGTMの発現における、腫瘍ステージとlog2倍変化のグラフを表わす。図10a:アドリカン;図10b:ASPN;図10c:CSPG2;図10d:CST1、2、4;図10e:EFEMP2;図10f:GGF;図10g:INHBA;図10h:IGFBP7;図10i:KLK10;図10j:LEPRE1;図10k:LUM;図10l:LOXL2;図10m:MMP12;図10n:TIMP1;図10o:ASAH1;図10p:SPP1;図10q:SFRP2;図10r:SFRP4;図10s:SPARC;図10t:PRSS11;図10u:THBS2;図10v:TG;図10w:TGFBI;図10x:CGR11;図10y:SERPINH1;図10z:MMP2;図10aa:PCSK5;図10ab:SERPINB5;図10ac:TGFB1及び図10ad:CEA(CEACAM5)。
【図10j】図10a〜1−adは、CEA及び本発明の他のGTMの発現における、腫瘍ステージとlog2倍変化のグラフを表わす。図10a:アドリカン;図10b:ASPN;図10c:CSPG2;図10d:CST1、2、4;図10e:EFEMP2;図10f:GGF;図10g:INHBA;図10h:IGFBP7;図10i:KLK10;図10j:LEPRE1;図10k:LUM;図10l:LOXL2;図10m:MMP12;図10n:TIMP1;図10o:ASAH1;図10p:SPP1;図10q:SFRP2;図10r:SFRP4;図10s:SPARC;図10t:PRSS11;図10u:THBS2;図10v:TG;図10w:TGFBI;図10x:CGR11;図10y:SERPINH1;図10z:MMP2;図10aa:PCSK5;図10ab:SERPINB5;図10ac:TGFB1及び図10ad:CEA(CEACAM5)。
【図10k】図10a〜1−adは、CEA及び本発明の他のGTMの発現における、腫瘍ステージとlog2倍変化のグラフを表わす。図10a:アドリカン;図10b:ASPN;図10c:CSPG2;図10d:CST1、2、4;図10e:EFEMP2;図10f:GGF;図10g:INHBA;図10h:IGFBP7;図10i:KLK10;図10j:LEPRE1;図10k:LUM;図10l:LOXL2;図10m:MMP12;図10n:TIMP1;図10o:ASAH1;図10p:SPP1;図10q:SFRP2;図10r:SFRP4;図10s:SPARC;図10t:PRSS11;図10u:THBS2;図10v:TG;図10w:TGFBI;図10x:CGR11;図10y:SERPINH1;図10z:MMP2;図10aa:PCSK5;図10ab:SERPINB5;図10ac:TGFB1及び図10ad:CEA(CEACAM5)。
【図10l】図10a〜1−adは、CEA及び本発明の他のGTMの発現における、腫瘍ステージとlog2倍変化のグラフを表わす。図10a:アドリカン;図10b:ASPN;図10c:CSPG2;図10d:CST1、2、4;図10e:EFEMP2;図10f:GGF;図10g:INHBA;図10h:IGFBP7;図10i:KLK10;図10j:LEPRE1;図10k:LUM;図10l:LOXL2;図10m:MMP12;図10n:TIMP1;図10o:ASAH1;図10p:SPP1;図10q:SFRP2;図10r:SFRP4;図10s:SPARC;図10t:PRSS11;図10u:THBS2;図10v:TG;図10w:TGFBI;図10x:CGR11;図10y:SERPINH1;図10z:MMP2;図10aa:PCSK5;図10ab:SERPINB5;図10ac:TGFB1及び図10ad:CEA(CEACAM5)。
【図10m】図10a〜1−adは、CEA及び本発明の他のGTMの発現における、腫瘍ステージとlog2倍変化のグラフを表わす。図10a:アドリカン;図10b:ASPN;図10c:CSPG2;図10d:CST1、2、4;図10e:EFEMP2;図10f:GGF;図10g:INHBA;図10h:IGFBP7;図10i:KLK10;図10j:LEPRE1;図10k:LUM;図10l:LOXL2;図10m:MMP12;図10n:TIMP1;図10o:ASAH1;図10p:SPP1;図10q:SFRP2;図10r:SFRP4;図10s:SPARC;図10t:PRSS11;図10u:THBS2;図10v:TG;図10w:TGFBI;図10x:CGR11;図10y:SERPINH1;図10z:MMP2;図10aa:PCSK5;図10ab:SERPINB5;図10ac:TGFB1及び図10ad:CEA(CEACAM5)。
【図10n】図10a〜1−adは、CEA及び本発明の他のGTMの発現における、腫瘍ステージとlog2倍変化のグラフを表わす。図10a:アドリカン;図10b:ASPN;図10c:CSPG2;図10d:CST1、2、4;図10e:EFEMP2;図10f:GGF;図10g:INHBA;図10h:IGFBP7;図10i:KLK10;図10j:LEPRE1;図10k:LUM;図10l:LOXL2;図10m:MMP12;図10n:TIMP1;図10o:ASAH1;図10p:SPP1;図10q:SFRP2;図10r:SFRP4;図10s:SPARC;図10t:PRSS11;図10u:THBS2;図10v:TG;図10w:TGFBI;図10x:CGR11;図10y:SERPINH1;図10z:MMP2;図10aa:PCSK5;図10ab:SERPINB5;図10ac:TGFB1及び図10ad:CEA(CEACAM5)。
【図10o】図10a〜1−adは、CEA及び本発明の他のGTMの発現における、腫瘍ステージとlog2倍変化のグラフを表わす。図10a:アドリカン;図10b:ASPN;図10c:CSPG2;図10d:CST1、2、4;図10e:EFEMP2;図10f:GGF;図10g:INHBA;図10h:IGFBP7;図10i:KLK10;図10j:LEPRE1;図10k:LUM;図10l:LOXL2;図10m:MMP12;図10n:TIMP1;図10o:ASAH1;図10p:SPP1;図10q:SFRP2;図10r:SFRP4;図10s:SPARC;図10t:PRSS11;図10u:THBS2;図10v:TG;図10w:TGFBI;図10x:CGR11;図10y:SERPINH1;図10z:MMP2;図10aa:PCSK5;図10ab:SERPINB5;図10ac:TGFB1及び図10ad:CEA(CEACAM5)。
【図10p】図10a〜1−adは、CEA及び本発明の他のGTMの発現における、腫瘍ステージとlog2倍変化のグラフを表わす。図10a:アドリカン;図10b:ASPN;図10c:CSPG2;図10d:CST1、2、4;図10e:EFEMP2;図10f:GGF;図10g:INHBA;図10h:IGFBP7;図10i:KLK10;図10j:LEPRE1;図10k:LUM;図10l:LOXL2;図10m:MMP12;図10n:TIMP1;図10o:ASAH1;図10p:SPP1;図10q:SFRP2;図10r:SFRP4;図10s:SPARC;図10t:PRSS11;図10u:THBS2;図10v:TG;図10w:TGFBI;図10x:CGR11;図10y:SERPINH1;図10z:MMP2;図10aa:PCSK5;図10ab:SERPINB5;図10ac:TGFB1及び図10ad:CEA(CEACAM5)。
【図10q】図10a〜1−adは、CEA及び本発明の他のGTMの発現における、腫瘍ステージとlog2倍変化のグラフを表わす。図10a:アドリカン;図10b:ASPN;図10c:CSPG2;図10d:CST1、2、4;図10e:EFEMP2;図10f:GGF;図10g:INHBA;図10h:IGFBP7;図10i:KLK10;図10j:LEPRE1;図10k:LUM;図10l:LOXL2;図10m:MMP12;図10n:TIMP1;図10o:ASAH1;図10p:SPP1;図10q:SFRP2;図10r:SFRP4;図10s:SPARC;図10t:PRSS11;図10u:THBS2;図10v:TG;図10w:TGFBI;図10x:CGR11;図10y:SERPINH1;図10z:MMP2;図10aa:PCSK5;図10ab:SERPINB5;図10ac:TGFB1及び図10ad:CEA(CEACAM5)。
【図10r】図10a〜1−adは、CEA及び本発明の他のGTMの発現における、腫瘍ステージとlog2倍変化のグラフを表わす。図10a:アドリカン;図10b:ASPN;図10c:CSPG2;図10d:CST1、2、4;図10e:EFEMP2;図10f:GGF;図10g:INHBA;図10h:IGFBP7;図10i:KLK10;図10j:LEPRE1;図10k:LUM;図10l:LOXL2;図10m:MMP12;図10n:TIMP1;図10o:ASAH1;図10p:SPP1;図10q:SFRP2;図10r:SFRP4;図10s:SPARC;図10t:PRSS11;図10u:THBS2;図10v:TG;図10w:TGFBI;図10x:CGR11;図10y:SERPINH1;図10z:MMP2;図10aa:PCSK5;図10ab:SERPINB5;図10ac:TGFB1及び図10ad:CEA(CEACAM5)。
【図10s】図10a〜1−adは、CEA及び本発明の他のGTMの発現における、腫瘍ステージとlog2倍変化のグラフを表わす。図10a:アドリカン;図10b:ASPN;図10c:CSPG2;図10d:CST1、2、4;図10e:EFEMP2;図10f:GGF;図10g:INHBA;図10h:IGFBP7;図10i:KLK10;図10j:LEPRE1;図10k:LUM;図10l:LOXL2;図10m:MMP12;図10n:TIMP1;図10o:ASAH1;図10p:SPP1;図10q:SFRP2;図10r:SFRP4;図10s:SPARC;図10t:PRSS11;図10u:THBS2;図10v:TG;図10w:TGFBI;図10x:CGR11;図10y:SERPINH1;図10z:MMP2;図10aa:PCSK5;図10ab:SERPINB5;図10ac:TGFB1及び図10ad:CEA(CEACAM5)。
【図10t】図10a〜1−adは、CEA及び本発明の他のGTMの発現における、腫瘍ステージとlog2倍変化のグラフを表わす。図10a:アドリカン;図10b:ASPN;図10c:CSPG2;図10d:CST1、2、4;図10e:EFEMP2;図10f:GGF;図10g:INHBA;図10h:IGFBP7;図10i:KLK10;図10j:LEPRE1;図10k:LUM;図10l:LOXL2;図10m:MMP12;図10n:TIMP1;図10o:ASAH1;図10p:SPP1;図10q:SFRP2;図10r:SFRP4;図10s:SPARC;図10t:PRSS11;図10u:THBS2;図10v:TG;図10w:TGFBI;図10x:CGR11;図10y:SERPINH1;図10z:MMP2;図10aa:PCSK5;図10ab:SERPINB5;図10ac:TGFB1及び図10ad:CEA(CEACAM5)。
【図10u】図10a〜1−adは、CEA及び本発明の他のGTMの発現における、腫瘍ステージとlog2倍変化のグラフを表わす。図10a:アドリカン;図10b:ASPN;図10c:CSPG2;図10d:CST1、2、4;図10e:EFEMP2;図10f:GGF;図10g:INHBA;図10h:IGFBP7;図10i:KLK10;図10j:LEPRE1;図10k:LUM;図10l:LOXL2;図10m:MMP12;図10n:TIMP1;図10o:ASAH1;図10p:SPP1;図10q:SFRP2;図10r:SFRP4;図10s:SPARC;図10t:PRSS11;図10u:THBS2;図10v:TG;図10w:TGFBI;図10x:CGR11;図10y:SERPINH1;図10z:MMP2;図10aa:PCSK5;図10ab:SERPINB5;図10ac:TGFB1及び図10ad:CEA(CEACAM5)。
【図10v】図10a〜1−adは、CEA及び本発明の他のGTMの発現における、腫瘍ステージとlog2倍変化のグラフを表わす。図10a:アドリカン;図10b:ASPN;図10c:CSPG2;図10d:CST1、2、4;図10e:EFEMP2;図10f:GGF;図10g:INHBA;図10h:IGFBP7;図10i:KLK10;図10j:LEPRE1;図10k:LUM;図10l:LOXL2;図10m:MMP12;図10n:TIMP1;図10o:ASAH1;図10p:SPP1;図10q:SFRP2;図10r:SFRP4;図10s:SPARC;図10t:PRSS11;図10u:THBS2;図10v:TG;図10w:TGFBI;図10x:CGR11;図10y:SERPINH1;図10z:MMP2;図10aa:PCSK5;図10ab:SERPINB5;図10ac:TGFB1及び図10ad:CEA(CEACAM5)。
【図10w】図10a〜1−adは、CEA及び本発明の他のGTMの発現における、腫瘍ステージとlog2倍変化のグラフを表わす。図10a:アドリカン;図10b:ASPN;図10c:CSPG2;図10d:CST1、2、4;図10e:EFEMP2;図10f:GGF;図10g:INHBA;図10h:IGFBP7;図10i:KLK10;図10j:LEPRE1;図10k:LUM;図10l:LOXL2;図10m:MMP12;図10n:TIMP1;図10o:ASAH1;図10p:SPP1;図10q:SFRP2;図10r:SFRP4;図10s:SPARC;図10t:PRSS11;図10u:THBS2;図10v:TG;図10w:TGFBI;図10x:CGR11;図10y:SERPINH1;図10z:MMP2;図10aa:PCSK5;図10ab:SERPINB5;図10ac:TGFB1及び図10ad:CEA(CEACAM5)。
【図10x】図10a〜1−adは、CEA及び本発明の他のGTMの発現における、腫瘍ステージとlog2倍変化のグラフを表わす。図10a:アドリカン;図10b:ASPN;図10c:CSPG2;図10d:CST1、2、4;図10e:EFEMP2;図10f:GGF;図10g:INHBA;図10h:IGFBP7;図10i:KLK10;図10j:LEPRE1;図10k:LUM;図10l:LOXL2;図10m:MMP12;図10n:TIMP1;図10o:ASAH1;図10p:SPP1;図10q:SFRP2;図10r:SFRP4;図10s:SPARC;図10t:PRSS11;図10u:THBS2;図10v:TG;図10w:TGFBI;図10x:CGR11;図10y:SERPINH1;図10z:MMP2;図10aa:PCSK5;図10ab:SERPINB5;図10ac:TGFB1及び図10ad:CEA(CEACAM5)。
【図10y】図10a〜1−adは、CEA及び本発明の他のGTMの発現における、腫瘍ステージとlog2倍変化のグラフを表わす。図10a:アドリカン;図10b:ASPN;図10c:CSPG2;図10d:CST1、2、4;図10e:EFEMP2;図10f:GGF;図10g:INHBA;図10h:IGFBP7;図10i:KLK10;図10j:LEPRE1;図10k:LUM;図10l:LOXL2;図10m:MMP12;図10n:TIMP1;図10o:ASAH1;図10p:SPP1;図10q:SFRP2;図10r:SFRP4;図10s:SPARC;図10t:PRSS11;図10u:THBS2;図10v:TG;図10w:TGFBI;図10x:CGR11;図10y:SERPINH1;図10z:MMP2;図10aa:PCSK5;図10ab:SERPINB5;図10ac:TGFB1及び図10ad:CEA(CEACAM5)。
【図10z】図10a〜1−adは、CEA及び本発明の他のGTMの発現における、腫瘍ステージとlog2倍変化のグラフを表わす。図10a:アドリカン;図10b:ASPN;図10c:CSPG2;図10d:CST1、2、4;図10e:EFEMP2;図10f:GGF;図10g:INHBA;図10h:IGFBP7;図10i:KLK10;図10j:LEPRE1;図10k:LUM;図10l:LOXL2;図10m:MMP12;図10n:TIMP1;図10o:ASAH1;図10p:SPP1;図10q:SFRP2;図10r:SFRP4;図10s:SPARC;図10t:PRSS11;図10u:THBS2;図10v:TG;図10w:TGFBI;図10x:CGR11;図10y:SERPINH1;図10z:MMP2;図10aa:PCSK5;図10ab:SERPINB5;図10ac:TGFB1及び図10ad:CEA(CEACAM5)。
【図10aa】図10a〜1−adは、CEA及び本発明の他のGTMの発現における、腫瘍ステージとlog2倍変化のグラフを表わす。図10a:アドリカン;図10b:ASPN;図10c:CSPG2;図10d:CST1、2、4;図10e:EFEMP2;図10f:GGF;図10g:INHBA;図10h:IGFBP7;図10i:KLK10;図10j:LEPRE1;図10k:LUM;図10l:LOXL2;図10m:MMP12;図10n:TIMP1;図10o:ASAH1;図10p:SPP1;図10q:SFRP2;図10r:SFRP4;図10s:SPARC;図10t:PRSS11;図10u:THBS2;図10v:TG;図10w:TGFBI;図10x:CGR11;図10y:SERPINH1;図10z:MMP2;図10aa:PCSK5;図10ab:SERPINB5;図10ac:TGFB1及び図10ad:CEA(CEACAM5)。
【図10ab】図10a〜1−adは、CEA及び本発明の他のGTMの発現における、腫瘍ステージとlog2倍変化のグラフを表わす。図10a:アドリカン;図10b:ASPN;図10c:CSPG2;図10d:CST1、2、4;図10e:EFEMP2;図10f:GGF;図10g:INHBA;図10h:IGFBP7;図10i:KLK10;図10j:LEPRE1;図10k:LUM;図10l:LOXL2;図10m:MMP12;図10n:TIMP1;図10o:ASAH1;図10p:SPP1;図10q:SFRP2;図10r:SFRP4;図10s:SPARC;図10t:PRSS11;図10u:THBS2;図10v:TG;図10w:TGFBI;図10x:CGR11;図10y:SERPINH1;図10z:MMP2;図10aa:PCSK5;図10ab:SERPINB5;図10ac:TGFB1及び図10ad:CEA(CEACAM5)。
【図10ac】図10a〜1−adは、CEA及び本発明の他のGTMの発現における、腫瘍ステージとlog2倍変化のグラフを表わす。図10a:アドリカン;図10b:ASPN;図10c:CSPG2;図10d:CST1、2、4;図10e:EFEMP2;図10f:GGF;図10g:INHBA;図10h:IGFBP7;図10i:KLK10;図10j:LEPRE1;図10k:LUM;図10l:LOXL2;図10m:MMP12;図10n:TIMP1;図10o:ASAH1;図10p:SPP1;図10q:SFRP2;図10r:SFRP4;図10s:SPARC;図10t:PRSS11;図10u:THBS2;図10v:TG;図10w:TGFBI;図10x:CGR11;図10y:SERPINH1;図10z:MMP2;図10aa:PCSK5;図10ab:SERPINB5;図10ac:TGFB1及び図10ad:CEA(CEACAM5)。
【図10ad】図10a〜1−adは、CEA及び本発明の他のGTMの発現における、腫瘍ステージとlog2倍変化のグラフを表わす。図10a:アドリカン;図10b:ASPN;図10c:CSPG2;図10d:CST1、2、4;図10e:EFEMP2;図10f:GGF;図10g:INHBA;図10h:IGFBP7;図10i:KLK10;図10j:LEPRE1;図10k:LUM;図10l:LOXL2;図10m:MMP12;図10n:TIMP1;図10o:ASAH1;図10p:SPP1;図10q:SFRP2;図10r:SFRP4;図10s:SPARC;図10t:PRSS11;図10u:THBS2;図10v:TG;図10w:TGFBI;図10x:CGR11;図10y:SERPINH1;図10z:MMP2;図10aa:PCSK5;図10ab:SERPINB5;図10ac:TGFB1及び図10ad:CEA(CEACAM5)。
【図11a】図11a〜adは、本発明の29個のGTM及びCEAの発現における腫瘍タイプ(広範性(D)及び腸性(I))とlog2倍変化のグラフを表わす。図11a:アドリカン;図11b:ASPN;図11c:CSPG2;図11d:CST1、2、4;図11e:EFEMP2;図11f:GGH;図11g:INHBA;図11h:IGFBP7;図11i:KLK10;図11j:LEPRE1;図11k:LUM;図11l:LOXL2;図11m:MMP12;図11n:TIMP1;図11o:ASAH1;図11p:SPP1;図11q:SFRP2;図11r:SFRP4;図11s:SPARC;図11t:PRSS11;図11u:THBS2;図11v:TG;図11w:TGFBI;図11x:CGR11;図11y:SERPINH1;図11z:MMP2;図11aa:PCSK5;図11ab:SERPINB5;図11ac:TGFB1及び図11ad:CEA(CEACAM5)。
【図11b】図11a〜adは、本発明の29個のGTM及びCEAの発現における腫瘍タイプ(広範性(D)及び腸性(I))とlog2倍変化のグラフを表わす。図11a:アドリカン;図11b:ASPN;図11c:CSPG2;図11d:CST1、2、4;図11e:EFEMP2;図11f:GGH;図11g:INHBA;図11h:IGFBP7;図11i:KLK10;図11j:LEPRE1;図11k:LUM;図11l:LOXL2;図11m:MMP12;図11n:TIMP1;図11o:ASAH1;図11p:SPP1;図11q:SFRP2;図11r:SFRP4;図11s:SPARC;図11t:PRSS11;図11u:THBS2;図11v:TG;図11w:TGFBI;図11x:CGR11;図11y:SERPINH1;図11z:MMP2;図11aa:PCSK5;図11ab:SERPINB5;図11ac:TGFB1及び図11ad:CEA(CEACAM5)。
【図11c】図11a〜adは、本発明の29個のGTM及びCEAの発現における腫瘍タイプ(広範性(D)及び腸性(I))とlog2倍変化のグラフを表わす。図11a:アドリカン;図11b:ASPN;図11c:CSPG2;図11d:CST1、2、4;図11e:EFEMP2;図11f:GGH;図11g:INHBA;図11h:IGFBP7;図11i:KLK10;図11j:LEPRE1;図11k:LUM;図11l:LOXL2;図11m:MMP12;図11n:TIMP1;図11o:ASAH1;図11p:SPP1;図11q:SFRP2;図11r:SFRP4;図11s:SPARC;図11t:PRSS11;図11u:THBS2;図11v:TG;図11w:TGFBI;図11x:CGR11;図11y:SERPINH1;図11z:MMP2;図11aa:PCSK5;図11ab:SERPINB5;図11ac:TGFB1及び図11ad:CEA(CEACAM5)。
【図11d】図11a〜adは、本発明の29個のGTM及びCEAの発現における腫瘍タイプ(広範性(D)及び腸性(I))とlog2倍変化のグラフを表わす。図11a:アドリカン;図11b:ASPN;図11c:CSPG2;図11d:CST1、2、4;図11e:EFEMP2;図11f:GGH;図11g:INHBA;図11h:IGFBP7;図11i:KLK10;図11j:LEPRE1;図11k:LUM;図11l:LOXL2;図11m:MMP12;図11n:TIMP1;図11o:ASAH1;図11p:SPP1;図11q:SFRP2;図11r:SFRP4;図11s:SPARC;図11t:PRSS11;図11u:THBS2;図11v:TG;図11w:TGFBI;図11x:CGR11;図11y:SERPINH1;図11z:MMP2;図11aa:PCSK5;図11ab:SERPINB5;図11ac:TGFB1及び図11ad:CEA(CEACAM5)。
【図11e】図11a〜adは、本発明の29個のGTM及びCEAの発現における腫瘍タイプ(広範性(D)及び腸性(I))とlog2倍変化のグラフを表わす。図11a:アドリカン;図11b:ASPN;図11c:CSPG2;図11d:CST1、2、4;図11e:EFEMP2;図11f:GGH;図11g:INHBA;図11h:IGFBP7;図11i:KLK10;図11j:LEPRE1;図11k:LUM;図11l:LOXL2;図11m:MMP12;図11n:TIMP1;図11o:ASAH1;図11p:SPP1;図11q:SFRP2;図11r:SFRP4;図11s:SPARC;図11t:PRSS11;図11u:THBS2;図11v:TG;図11w:TGFBI;図11x:CGR11;図11y:SERPINH1;図11z:MMP2;図11aa:PCSK5;図11ab:SERPINB5;図11ac:TGFB1及び図11ad:CEA(CEACAM5)。
【図11f】図11a〜adは、本発明の29個のGTM及びCEAの発現における腫瘍タイプ(広範性(D)及び腸性(I))とlog2倍変化のグラフを表わす。図11a:アドリカン;図11b:ASPN;図11c:CSPG2;図11d:CST1、2、4;図11e:EFEMP2;図11f:GGH;図11g:INHBA;図11h:IGFBP7;図11i:KLK10;図11j:LEPRE1;図11k:LUM;図11l:LOXL2;図11m:MMP12;図11n:TIMP1;図11o:ASAH1;図11p:SPP1;図11q:SFRP2;図11r:SFRP4;図11s:SPARC;図11t:PRSS11;図11u:THBS2;図11v:TG;図11w:TGFBI;図11x:CGR11;図11y:SERPINH1;図11z:MMP2;図11aa:PCSK5;図11ab:SERPINB5;図11ac:TGFB1及び図11ad:CEA(CEACAM5)。
【図11g】図11a〜adは、本発明の29個のGTM及びCEAの発現における腫瘍タイプ(広範性(D)及び腸性(I))とlog2倍変化のグラフを表わす。図11a:アドリカン;図11b:ASPN;図11c:CSPG2;図11d:CST1、2、4;図11e:EFEMP2;図11f:GGH;図11g:INHBA;図11h:IGFBP7;図11i:KLK10;図11j:LEPRE1;図11k:LUM;図11l:LOXL2;図11m:MMP12;図11n:TIMP1;図11o:ASAH1;図11p:SPP1;図11q:SFRP2;図11r:SFRP4;図11s:SPARC;図11t:PRSS11;図11u:THBS2;図11v:TG;図11w:TGFBI;図11x:CGR11;図11y:SERPINH1;図11z:MMP2;図11aa:PCSK5;図11ab:SERPINB5;図11ac:TGFB1及び図11ad:CEA(CEACAM5)。
【図11h】図11a〜adは、本発明の29個のGTM及びCEAの発現における腫瘍タイプ(広範性(D)及び腸性(I))とlog2倍変化のグラフを表わす。図11a:アドリカン;図11b:ASPN;図11c:CSPG2;図11d:CST1、2、4;図11e:EFEMP2;図11f:GGH;図11g:INHBA;図11h:IGFBP7;図11i:KLK10;図11j:LEPRE1;図11k:LUM;図11l:LOXL2;図11m:MMP12;図11n:TIMP1;図11o:ASAH1;図11p:SPP1;図11q:SFRP2;図11r:SFRP4;図11s:SPARC;図11t:PRSS11;図11u:THBS2;図11v:TG;図11w:TGFBI;図11x:CGR11;図11y:SERPINH1;図11z:MMP2;図11aa:PCSK5;図11ab:SERPINB5;図11ac:TGFB1及び図11ad:CEA(CEACAM5)。
【図11i】図11a〜adは、本発明の29個のGTM及びCEAの発現における腫瘍タイプ(広範性(D)及び腸性(I))とlog2倍変化のグラフを表わす。図11a:アドリカン;図11b:ASPN;図11c:CSPG2;図11d:CST1、2、4;図11e:EFEMP2;図11f:GGH;図11g:INHBA;図11h:IGFBP7;図11i:KLK10;図11j:LEPRE1;図11k:LUM;図11l:LOXL2;図11m:MMP12;図11n:TIMP1;図11o:ASAH1;図11p:SPP1;図11q:SFRP2;図11r:SFRP4;図11s:SPARC;図11t:PRSS11;図11u:THBS2;図11v:TG;図11w:TGFBI;図11x:CGR11;図11y:SERPINH1;図11z:MMP2;図11aa:PCSK5;図11ab:SERPINB5;図11ac:TGFB1及び図11ad:CEA(CEACAM5)。
【図11j】図11a〜adは、本発明の29個のGTM及びCEAの発現における腫瘍タイプ(広範性(D)及び腸性(I))とlog2倍変化のグラフを表わす。図11a:アドリカン;図11b:ASPN;図11c:CSPG2;図11d:CST1、2、4;図11e:EFEMP2;図11f:GGH;図11g:INHBA;図11h:IGFBP7;図11i:KLK10;図11j:LEPRE1;図11k:LUM;図11l:LOXL2;図11m:MMP12;図11n:TIMP1;図11o:ASAH1;図11p:SPP1;図11q:SFRP2;図11r:SFRP4;図11s:SPARC;図11t:PRSS11;図11u:THBS2;図11v:TG;図11w:TGFBI;図11x:CGR11;図11y:SERPINH1;図11z:MMP2;図11aa:PCSK5;図11ab:SERPINB5;図11ac:TGFB1及び図11ad:CEA(CEACAM5)。
【図11k】図11a〜adは、本発明の29個のGTM及びCEAの発現における腫瘍タイプ(広範性(D)及び腸性(I))とlog2倍変化のグラフを表わす。図11a:アドリカン;図11b:ASPN;図11c:CSPG2;図11d:CST1、2、4;図11e:EFEMP2;図11f:GGH;図11g:INHBA;図11h:IGFBP7;図11i:KLK10;図11j:LEPRE1;図11k:LUM;図11l:LOXL2;図11m:MMP12;図11n:TIMP1;図11o:ASAH1;図11p:SPP1;図11q:SFRP2;図11r:SFRP4;図11s:SPARC;図11t:PRSS11;図11u:THBS2;図11v:TG;図11w:TGFBI;図11x:CGR11;図11y:SERPINH1;図11z:MMP2;図11aa:PCSK5;図11ab:SERPINB5;図11ac:TGFB1及び図11ad:CEA(CEACAM5)。
【図11l】図11a〜adは、本発明の29個のGTM及びCEAの発現における腫瘍タイプ(広範性(D)及び腸性(I))とlog2倍変化のグラフを表わす。図11a:アドリカン;図11b:ASPN;図11c:CSPG2;図11d:CST1、2、4;図11e:EFEMP2;図11f:GGH;図11g:INHBA;図11h:IGFBP7;図11i:KLK10;図11j:LEPRE1;図11k:LUM;図11l:LOXL2;図11m:MMP12;図11n:TIMP1;図11o:ASAH1;図11p:SPP1;図11q:SFRP2;図11r:SFRP4;図11s:SPARC;図11t:PRSS11;図11u:THBS2;図11v:TG;図11w:TGFBI;図11x:CGR11;図11y:SERPINH1;図11z:MMP2;図11aa:PCSK5;図11ab:SERPINB5;図11ac:TGFB1及び図11ad:CEA(CEACAM5)。
【図11m】図11a〜adは、本発明の29個のGTM及びCEAの発現における腫瘍タイプ(広範性(D)及び腸性(I))とlog2倍変化のグラフを表わす。図11a:アドリカン;図11b:ASPN;図11c:CSPG2;図11d:CST1、2、4;図11e:EFEMP2;図11f:GGH;図11g:INHBA;図11h:IGFBP7;図11i:KLK10;図11j:LEPRE1;図11k:LUM;図11l:LOXL2;図11m:MMP12;図11n:TIMP1;図11o:ASAH1;図11p:SPP1;図11q:SFRP2;図11r:SFRP4;図11s:SPARC;図11t:PRSS11;図11u:THBS2;図11v:TG;図11w:TGFBI;図11x:CGR11;図11y:SERPINH1;図11z:MMP2;図11aa:PCSK5;図11ab:SERPINB5;図11ac:TGFB1及び図11ad:CEA(CEACAM5)。
【図11n】図11a〜adは、本発明の29個のGTM及びCEAの発現における腫瘍タイプ(広範性(D)及び腸性(I))とlog2倍変化のグラフを表わす。図11a:アドリカン;図11b:ASPN;図11c:CSPG2;図11d:CST1、2、4;図11e:EFEMP2;図11f:GGH;図11g:INHBA;図11h:IGFBP7;図11i:KLK10;図11j:LEPRE1;図11k:LUM;図11l:LOXL2;図11m:MMP12;図11n:TIMP1;図11o:ASAH1;図11p:SPP1;図11q:SFRP2;図11r:SFRP4;図11s:SPARC;図11t:PRSS11;図11u:THBS2;図11v:TG;図11w:TGFBI;図11x:CGR11;図11y:SERPINH1;図11z:MMP2;図11aa:PCSK5;図11ab:SERPINB5;図11ac:TGFB1及び図11ad:CEA(CEACAM5)。
【図11o】図11a〜adは、本発明の29個のGTM及びCEAの発現における腫瘍タイプ(広範性(D)及び腸性(I))とlog2倍変化のグラフを表わす。図11a:アドリカン;図11b:ASPN;図11c:CSPG2;図11d:CST1、2、4;図11e:EFEMP2;図11f:GGH;図11g:INHBA;図11h:IGFBP7;図11i:KLK10;図11j:LEPRE1;図11k:LUM;図11l:LOXL2;図11m:MMP12;図11n:TIMP1;図11o:ASAH1;図11p:SPP1;図11q:SFRP2;図11r:SFRP4;図11s:SPARC;図11t:PRSS11;図11u:THBS2;図11v:TG;図11w:TGFBI;図11x:CGR11;図11y:SERPINH1;図11z:MMP2;図11aa:PCSK5;図11ab:SERPINB5;図11ac:TGFB1及び図11ad:CEA(CEACAM5)。
【図11p】図11a〜adは、本発明の29個のGTM及びCEAの発現における腫瘍タイプ(広範性(D)及び腸性(I))とlog2倍変化のグラフを表わす。図11a:アドリカン;図11b:ASPN;図11c:CSPG2;図11d:CST1、2、4;図11e:EFEMP2;図11f:GGH;図11g:INHBA;図11h:IGFBP7;図11i:KLK10;図11j:LEPRE1;図11k:LUM;図11l:LOXL2;図11m:MMP12;図11n:TIMP1;図11o:ASAH1;図11p:SPP1;図11q:SFRP2;図11r:SFRP4;図11s:SPARC;図11t:PRSS11;図11u:THBS2;図11v:TG;図11w:TGFBI;図11x:CGR11;図11y:SERPINH1;図11z:MMP2;図11aa:PCSK5;図11ab:SERPINB5;図11ac:TGFB1及び図11ad:CEA(CEACAM5)。
【図11q】図11a〜adは、本発明の29個のGTM及びCEAの発現における腫瘍タイプ(広範性(D)及び腸性(I))とlog2倍変化のグラフを表わす。図11a:アドリカン;図11b:ASPN;図11c:CSPG2;図11d:CST1、2、4;図11e:EFEMP2;図11f:GGH;図11g:INHBA;図11h:IGFBP7;図11i:KLK10;図11j:LEPRE1;図11k:LUM;図11l:LOXL2;図11m:MMP12;図11n:TIMP1;図11o:ASAH1;図11p:SPP1;図11q:SFRP2;図11r:SFRP4;図11s:SPARC;図11t:PRSS11;図11u:THBS2;図11v:TG;図11w:TGFBI;図11x:CGR11;図11y:SERPINH1;図11z:MMP2;図11aa:PCSK5;図11ab:SERPINB5;図11ac:TGFB1及び図11ad:CEA(CEACAM5)。
【図11r】図11a〜adは、本発明の29個のGTM及びCEAの発現における腫瘍タイプ(広範性(D)及び腸性(I))とlog2倍変化のグラフを表わす。図11a:アドリカン;図11b:ASPN;図11c:CSPG2;図11d:CST1、2、4;図11e:EFEMP2;図11f:GGH;図11g:INHBA;図11h:IGFBP7;図11i:KLK10;図11j:LEPRE1;図11k:LUM;図11l:LOXL2;図11m:MMP12;図11n:TIMP1;図11o:ASAH1;図11p:SPP1;図11q:SFRP2;図11r:SFRP4;図11s:SPARC;図11t:PRSS11;図11u:THBS2;図11v:TG;図11w:TGFBI;図11x:CGR11;図11y:SERPINH1;図11z:MMP2;図11aa:PCSK5;図11ab:SERPINB5;図11ac:TGFB1及び図11ad:CEA(CEACAM5)。
【図11s】図11a〜adは、本発明の29個のGTM及びCEAの発現における腫瘍タイプ(広範性(D)及び腸性(I))とlog2倍変化のグラフを表わす。図11a:アドリカン;図11b:ASPN;図11c:CSPG2;図11d:CST1、2、4;図11e:EFEMP2;図11f:GGH;図11g:INHBA;図11h:IGFBP7;図11i:KLK10;図11j:LEPRE1;図11k:LUM;図11l:LOXL2;図11m:MMP12;図11n:TIMP1;図11o:ASAH1;図11p:SPP1;図11q:SFRP2;図11r:SFRP4;図11s:SPARC;図11t:PRSS11;図11u:THBS2;図11v:TG;図11w:TGFBI;図11x:CGR11;図11y:SERPINH1;図11z:MMP2;図11aa:PCSK5;図11ab:SERPINB5;図11ac:TGFB1及び図11ad:CEA(CEACAM5)。
【図11t】図11a〜adは、本発明の29個のGTM及びCEAの発現における腫瘍タイプ(広範性(D)及び腸性(I))とlog2倍変化のグラフを表わす。図11a:アドリカン;図11b:ASPN;図11c:CSPG2;図11d:CST1、2、4;図11e:EFEMP2;図11f:GGH;図11g:INHBA;図11h:IGFBP7;図11i:KLK10;図11j:LEPRE1;図11k:LUM;図11l:LOXL2;図11m:MMP12;図11n:TIMP1;図11o:ASAH1;図11p:SPP1;図11q:SFRP2;図11r:SFRP4;図11s:SPARC;図11t:PRSS11;図11u:THBS2;図11v:TG;図11w:TGFBI;図11x:CGR11;図11y:SERPINH1;図11z:MMP2;図11aa:PCSK5;図11ab:SERPINB5;図11ac:TGFB1及び図11ad:CEA(CEACAM5)。
【図11u】図11a〜adは、本発明の29個のGTM及びCEAの発現における腫瘍タイプ(広範性(D)及び腸性(I))とlog2倍変化のグラフを表わす。図11a:アドリカン;図11b:ASPN;図11c:CSPG2;図11d:CST1、2、4;図11e:EFEMP2;図11f:GGH;図11g:INHBA;図11h:IGFBP7;図11i:KLK10;図11j:LEPRE1;図11k:LUM;図11l:LOXL2;図11m:MMP12;図11n:TIMP1;図11o:ASAH1;図11p:SPP1;図11q:SFRP2;図11r:SFRP4;図11s:SPARC;図11t:PRSS11;図11u:THBS2;図11v:TG;図11w:TGFBI;図11x:CGR11;図11y:SERPINH1;図11z:MMP2;図11aa:PCSK5;図11ab:SERPINB5;図11ac:TGFB1及び図11ad:CEA(CEACAM5)。
【図11v】図11a〜adは、本発明の29個のGTM及びCEAの発現における腫瘍タイプ(広範性(D)及び腸性(I))とlog2倍変化のグラフを表わす。図11a:アドリカン;図11b:ASPN;図11c:CSPG2;図11d:CST1、2、4;図11e:EFEMP2;図11f:GGH;図11g:INHBA;図11h:IGFBP7;図11i:KLK10;図11j:LEPRE1;図11k:LUM;図11l:LOXL2;図11m:MMP12;図11n:TIMP1;図11o:ASAH1;図11p:SPP1;図11q:SFRP2;図11r:SFRP4;図11s:SPARC;図11t:PRSS11;図11u:THBS2;図11v:TG;図11w:TGFBI;図11x:CGR11;図11y:SERPINH1;図11z:MMP2;図11aa:PCSK5;図11ab:SERPINB5;図11ac:TGFB1及び図11ad:CEA(CEACAM5)。
【図11w】図11a〜adは、本発明の29個のGTM及びCEAの発現における腫瘍タイプ(広範性(D)及び腸性(I))とlog2倍変化のグラフを表わす。図11a:アドリカン;図11b:ASPN;図11c:CSPG2;図11d:CST1、2、4;図11e:EFEMP2;図11f:GGH;図11g:INHBA;図11h:IGFBP7;図11i:KLK10;図11j:LEPRE1;図11k:LUM;図11l:LOXL2;図11m:MMP12;図11n:TIMP1;図11o:ASAH1;図11p:SPP1;図11q:SFRP2;図11r:SFRP4;図11s:SPARC;図11t:PRSS11;図11u:THBS2;図11v:TG;図11w:TGFBI;図11x:CGR11;図11y:SERPINH1;図11z:MMP2;図11aa:PCSK5;図11ab:SERPINB5;図11ac:TGFB1及び図11ad:CEA(CEACAM5)。
【図11x】図11a〜adは、本発明の29個のGTM及びCEAの発現における腫瘍タイプ(広範性(D)及び腸性(I))とlog2倍変化のグラフを表わす。図11a:アドリカン;図11b:ASPN;図11c:CSPG2;図11d:CST1、2、4;図11e:EFEMP2;図11f:GGH;図11g:INHBA;図11h:IGFBP7;図11i:KLK10;図11j:LEPRE1;図11k:LUM;図11l:LOXL2;図11m:MMP12;図11n:TIMP1;図11o:ASAH1;図11p:SPP1;図11q:SFRP2;図11r:SFRP4;図11s:SPARC;図11t:PRSS11;図11u:THBS2;図11v:TG;図11w:TGFBI;図11x:CGR11;図11y:SERPINH1;図11z:MMP2;図11aa:PCSK5;図11ab:SERPINB5;図11ac:TGFB1及び図11ad:CEA(CEACAM5)。
【図11y】図11a〜adは、本発明の29個のGTM及びCEAの発現における腫瘍タイプ(広範性(D)及び腸性(I))とlog2倍変化のグラフを表わす。図11a:アドリカン;図11b:ASPN;図11c:CSPG2;図11d:CST1、2、4;図11e:EFEMP2;図11f:GGH;図11g:INHBA;図11h:IGFBP7;図11i:KLK10;図11j:LEPRE1;図11k:LUM;図11l:LOXL2;図11m:MMP12;図11n:TIMP1;図11o:ASAH1;図11p:SPP1;図11q:SFRP2;図11r:SFRP4;図11s:SPARC;図11t:PRSS11;図11u:THBS2;図11v:TG;図11w:TGFBI;図11x:CGR11;図11y:SERPINH1;図11z:MMP2;図11aa:PCSK5;図11ab:SERPINB5;図11ac:TGFB1及び図11ad:CEA(CEACAM5)。
【図11z】図11a〜adは、本発明の29個のGTM及びCEAの発現における腫瘍タイプ(広範性(D)及び腸性(I))とlog2倍変化のグラフを表わす。図11a:アドリカン;図11b:ASPN;図11c:CSPG2;図11d:CST1、2、4;図11e:EFEMP2;図11f:GGH;図11g:INHBA;図11h:IGFBP7;図11i:KLK10;図11j:LEPRE1;図11k:LUM;図11l:LOXL2;図11m:MMP12;図11n:TIMP1;図11o:ASAH1;図11p:SPP1;図11q:SFRP2;図11r:SFRP4;図11s:SPARC;図11t:PRSS11;図11u:THBS2;図11v:TG;図11w:TGFBI;図11x:CGR11;図11y:SERPINH1;図11z:MMP2;図11aa:PCSK5;図11ab:SERPINB5;図11ac:TGFB1及び図11ad:CEA(CEACAM5)。
【図11aa】図11a〜adは、本発明の29個のGTM及びCEAの発現における腫瘍タイプ(広範性(D)及び腸性(I))とlog2倍変化のグラフを表わす。図11a:アドリカン;図11b:ASPN;図11c:CSPG2;図11d:CST1、2、4;図11e:EFEMP2;図11f:GGH;図11g:INHBA;図11h:IGFBP7;図11i:KLK10;図11j:LEPRE1;図11k:LUM;図11l:LOXL2;図11m:MMP12;図11n:TIMP1;図11o:ASAH1;図11p:SPP1;図11q:SFRP2;図11r:SFRP4;図11s:SPARC;図11t:PRSS11;図11u:THBS2;図11v:TG;図11w:TGFBI;図11x:CGR11;図11y:SERPINH1;図11z:MMP2;図11aa:PCSK5;図11ab:SERPINB5;図11ac:TGFB1及び図11ad:CEA(CEACAM5)。
【図11ab】図11a〜adは、本発明の29個のGTM及びCEAの発現における腫瘍タイプ(広範性(D)及び腸性(I))とlog2倍変化のグラフを表わす。図11a:アドリカン;図11b:ASPN;図11c:CSPG2;図11d:CST1、2、4;図11e:EFEMP2;図11f:GGH;図11g:INHBA;図11h:IGFBP7;図11i:KLK10;図11j:LEPRE1;図11k:LUM;図11l:LOXL2;図11m:MMP12;図11n:TIMP1;図11o:ASAH1;図11p:SPP1;図11q:SFRP2;図11r:SFRP4;図11s:SPARC;図11t:PRSS11;図11u:THBS2;図11v:TG;図11w:TGFBI;図11x:CGR11;図11y:SERPINH1;図11z:MMP2;図11aa:PCSK5;図11ab:SERPINB5;図11ac:TGFB1及び図11ad:CEA(CEACAM5)。
【図11ac】図11a〜adは、本発明の29個のGTM及びCEAの発現における腫瘍タイプ(広範性(D)及び腸性(I))とlog2倍変化のグラフを表わす。図11a:アドリカン;図11b:ASPN;図11c:CSPG2;図11d:CST1、2、4;図11e:EFEMP2;図11f:GGH;図11g:INHBA;図11h:IGFBP7;図11i:KLK10;図11j:LEPRE1;図11k:LUM;図11l:LOXL2;図11m:MMP12;図11n:TIMP1;図11o:ASAH1;図11p:SPP1;図11q:SFRP2;図11r:SFRP4;図11s:SPARC;図11t:PRSS11;図11u:THBS2;図11v:TG;図11w:TGFBI;図11x:CGR11;図11y:SERPINH1;図11z:MMP2;図11aa:PCSK5;図11ab:SERPINB5;図11ac:TGFB1及び図11ad:CEA(CEACAM5)。
【図11ad】図11a〜adは、本発明の29個のGTM及びCEAの発現における腫瘍タイプ(広範性(D)及び腸性(I))とlog2倍変化のグラフを表わす。図11a:アドリカン;図11b:ASPN;図11c:CSPG2;図11d:CST1、2、4;図11e:EFEMP2;図11f:GGH;図11g:INHBA;図11h:IGFBP7;図11i:KLK10;図11j:LEPRE1;図11k:LUM;図11l:LOXL2;図11m:MMP12;図11n:TIMP1;図11o:ASAH1;図11p:SPP1;図11q:SFRP2;図11r:SFRP4;図11s:SPARC;図11t:PRSS11;図11u:THBS2;図11v:TG;図11w:TGFBI;図11x:CGR11;図11y:SERPINH1;図11z:MMP2;図11aa:PCSK5;図11ab:SERPINB5;図11ac:TGFB1及び図11ad:CEA(CEACAM5)。
【図12】図12は、胃腫瘍試料及び非悪性胃試料のシリーズにおける、3個のマーカー、SERPINH1、CST1、2,4及びINHBAを示す3次元グラフを表わす。
【図13】図13は、腫瘍組織と非悪性組織との間を正確に区別する能力についての複数マーカーの効果を示す表を表わす。表は、qPCRデータを元に正常分布から導いた。
【図14】図14は、腫瘍及び非腫瘍組織に由来する4個の腫瘍マーカーのウェスタンブロットである。
【図15】図15は、胃腫瘍及び血清中の腫瘍マーカーSPARCのウェスタンブロットである。
【図16】図16は、胃細胞株であるAGSの上清中のシスタチンSNを表わす免疫ブロットである。
【0012】
詳細な説明
定義
本発明の実施態様を詳細に説明する前に、本明細書で用いる用語のいくつかの定義を記載することが有益である。
【0013】
用語「GTM」又は「胃の腫瘍マーカー」又は「GTMファミリーのメンバー」とは、胃ガンに関連する遺伝子、遺伝子フラグメント、RNA、RNAフラグメント、タンパク質若しくはタンパク質フラグメント、又は他の同定分子を意味するが、胃ガンと関連する従来技術で既知の分子、ca19〜9、ca72〜4及びCEAは含まない。GTMの例は、本明細書の以下に挙げる。
【0014】
用語「マーカー」とは、定量的又は定性的に生物現象の存在に関連する分子を意味する。「マーカー」とは、例えばGTMであるが、「マーカー」には、代謝産物、副産物も、状態に潜在するメカニズムに直接又は間接に関連するかどうかに関わらず含まれる。
【0015】
用語「qPCR」とは、定量ポリメラーゼ連鎖反応を意味する。
【0016】
用語「発現」とは、遺伝子又は遺伝子の部分からのmRNAの産生を含み、そしてRNA又は遺伝子若しくは遺伝子の部分によりコードされたタンパク質の産生も含み、そして発現に関連する検出材料の出現も含む。例えば、遺伝子又は他のオリゴヌクレオチド、タンパク質又はタンパク質フラグメントへの、結合リガンド、例えば抗体の結合、及び結合リガンドの可視化が、用語「発現」の範疇に含まれる。そのため、免疫ブロット、例えばウェスタンブロットについてのスポット密度の増大は、潜在する生物分子の用語「発現」に含まれる。
【0017】
用語「CPN2」とは、ヒトのカルボキシペプチダーゼN、ポリペプチド2、83kDa鎖;そしてカルボキシペプチダーゼNを意味する。
【0018】
用語「HAPLN4」とは、ヒトのヒアルロナン糖タンパク質連結タンパク質4を意味する。
【0019】
用語、「MMP12」とは、ヒトのマトリックスメタロプロテイナーゼ12を意味する。
【0020】
用語「INHBA」とは、ヒトのインヒビン、ベータA(アクチビンA、アクチビンAB又はアルファポリペプチダーゼも含む)を意味する。
【0021】
用語「IGFBP7」とは、ヒトのインシュリン様成長因子7を意味する。
【0022】
用語「GGH」とは、ヒトのガンマ−グルタミル加水分解酵素(抱合体、フォリルポリガンマグルタミル加水分解酵素としても知られる)を意味する。
【0023】
用語「LEPRE1」とは、ヒトのロイシンプロリンに富んだプロテオグリカン(leucine proline-enriched proteoglycan)(レプレカン1としても知られる)を意味する。
【0024】
用語「CST4」とは、ヒトのシスタチンSを意味する。
【0025】
用語「SFRP4」とは、ヒトの分泌フリズルド関連タンパク質4(secreted frizzled-related protein 4)を意味する。
【0026】
用語「ASPN」とは、ヒトのアスポリン(asporin)(LRRクラス1としても知られる)を意味する。
【0027】
用語「CGREF1」又は「CGR11」とは、EFハンドドメイン1(EF hand domain 1)を有するヒトの細胞成長制御因子を意味する。
【0028】
用語「KLK」とは、ヒトのカリクレイン10、変異体1又はヒトのカリクレイン10、変異体2又は他に特に特定しない場合は両者を意味する。
【0029】
用語「TIMP1」とは、ヒトのメタロプロテイナーゼ1の組織阻害剤(赤血球増強活性又はコラゲナーゼ阻害剤としても知られる)を意味する。
【0030】
用語「SPARC」とは、酸性のシステインリッチなヒトの分泌タンパク質(オステオネクチンとしても知られる)を意味する。
【0031】
用語「TGFBI」とは、ベータ−誘導、68kDaのヒトの形質転換成長因子を意味する。
【0032】
用語「EFEMP2」とは、ヒトのEGF−含有フィブリン様細胞外マトリックスタンパク質2を意味する。
【0033】
用語「LUM」とは、ヒトのルミカン(lumican)を意味する。
【0034】
用語「SNN」とは、ヒトのスタニン(stannin)を意味する。
【0035】
用語「SPP1」とは、ヒトの分泌ホスホタンパク質1(オステオポンチン、又は骨シアロタンパク質I又は早期Tリンパ球活性化1としても知られる)を意味する。
【0036】
用語「CSPG2」とは、ヒトのコンドロイチン硫酸プロテオグリカン2(バーシカンとしても知られる)を意味する。
【0037】
用語「ASAH1」とは、ヒトのN−アシルスフィンゴシンアミド加水分解酵素の変異体1又はN−アシルスフィンゴシンアミド加水分解酵素の変異体2又はN−アシルスフィンゴシンアミド加水分解酵素変異体1及び2の両者(セラミダーゼ1の変異体1及び2としても知られる)を意味する。
【0038】
用語「PRSS11」とは、ヒトのセリン11のプロテアーゼ(IGF結合セリンプロテアーゼとしても知られる)を意味する。
【0039】
用語「SFRP2」とは、ヒトの分泌フリズルド関連タンパク質2を意味する。
【0040】
用語「PLA2G12B」とは、ヒトのホスホリパーゼA2、グループXIIBを意味する。
【0041】
用語「SPON2」とは、細胞外マトリックスタンパク質のヒトのスポンディン2を意味する。
【0042】
用語「OLFM1」とは、ヒトのオルファクトメディン1を意味する。
【0043】
用語「TSRC1」とは、ヒトのトロンボスポンディン反復含有1(thrombospondin repeat containing 1)を意味する。
【0044】
用語「THBS2」とは、ヒトのトロンボスポンディン2を意味する。
【0045】
用語「アドリカン」とは、DKFZp564I1922を意味する。
【0046】
用語「CST2」とは、ヒトのシスタチンSAを意味する。
【0047】
用語「CST1」とは、ヒトのシスタチンSNを意味する。
【0048】
用語「LOXL2」とは、ヒトのリシルオキシダーゼ様酵素2を意味する。
【0049】
用語「TG」とは、ヒトのサイログロブリンを意味する。
【0050】
用語「TGFB1」とは、ヒトの形質転換成長因子のベータ1を意味する。
【0051】
用語「SERPINH1」とは、ヒトのセリン又はシステインプロテイナーゼ阻害剤クレードH(熱ショックタンパク質47、メンバー1、又はコラーゲン結合タンパク質1としても知られる)を意味する。
【0052】
用語「SERPINB5」とは、ヒトのセリン又はシステインプロテイナーゼ阻害剤クレードB(オボアルブミン、メンバー5としても知られる)を意味する。
【0053】
用語「CEACAM5」又は「CEA」とは、ヒトのガン胎児性抗原関連細胞接着分子5を意味する。
【0054】
用語「MMP2」とは、ヒトのマトリックスメタロプロテイナーゼ2(ゼラチナーゼA、又は72kDaのゼラチナーゼ、又は72kDaのタイプIVコラゲナーゼとしても知られる)を意味する。
【0055】
用語「PCSK5」とは、ヒトのプロタンパク質転換酵素サブチリシン/ケクシンタイプ5を意味する。
【0056】
前記用語は、タンパク質、DNA配列及び/又はRNA配列を指すこともあると、理解されるであろう。前記用語は、本明細書に表わしたものと同様の配列を有する非ヒトタンパク質、DNA及び/又はRNAを指すことがあるとも、理解されるであろう。
【0057】
本発明の実施態様の記載
胃ガンを含む腫瘍の検出及び評価のためのマーカーを、従来技術のマーカーより、胃ガン検出においてより高い信頼性を有するものとして提供する。用語「信頼性」には、偽陽性及び/又は偽陰性がないことを含む。そのため、より信頼性が高いマーカーでは、そのマーカーを用いてなされる診断に関して、偽陽性及び/又は偽陰性がより少ない。従って、ある実施態様ではマーカーの提供により、約50%である従来技術のマーカーの信頼性より高い信頼性で、胃ガンの検出が可能となる。他の実施態様では、約70%より高い信頼性を、他の実施態様では、約73%より高く、さらに他の実施態様では、約80%より高く、なおもさらなる実施態様では、約90%より高く、なおも他では、約95%より高く、なおもさらなる実施態様では、約98%よりも高く、そしてある実施態様では、約100%である信頼性を有するマーカーが提供される。
【0058】
このように、我々は驚くべきことに、その存在が胃腫瘍に関連する多数の遺伝子及びタンパク質を見いだした。従って、遺伝子産物(例えばmRNAのようなオリゴヌクレオチド)並びにそのようなオリゴヌクレオチドから翻訳されたタンパク質及びペプチドの検出により、腫瘍、例えば胃の腫瘍を診断することができる。胃の腫瘍を有する患者から、そして同じ被検者の非悪性組織から採取した試料のアレイ分析が、多数の胃の腫瘍で、ある遺伝子の過剰発現の特異的なパターンが症状に関連するという驚くべき発見をもたらした。
【0059】
ガンのマーカーは、ガンのマーカーに対して生じた抗体を用いて検出することもできる。
【0060】
このように、多数のガンマーカーの発現の存在及び量を分析することにより、診断の感度を高める一方で、偽陽性及び/又は偽陰性結果を減少することができる。
【0061】
ガン検出への一般的アプローチ
以下のアプローチは限定的な方法ではなく、GTMファミリーのメンバーを用いた胃ガンを含むガン検出に用いることができる。
・GTM遺伝子産物に選択的なオリゴヌクレオチドプローブを用いたマイクロアレイアプローチ。
・マーカー特異的なプライマー及びプローブを用いた、腫瘍試料及び正常試料についてのリアルタイム定量PCR(qPCR)。
・酵素連結免疫学的アッセイ(ELISA)。
・胃の腫瘍及びリンパ節転移についての抗マーカー抗体を用いた免疫組織化学。
・結腸直腸、膵臓、卵巣、メラノーマ、肝臓、食道、膀胱、子宮及び脳といった、しかしこれらに限定されない他の腫瘍についての抗マーカー抗体を用いた免疫組織化学。
・腫瘍除去手術の前後に採取した胃ガン患者の血清中のマーカーファミリーのメンバーの免疫検出。
・健康な個体及び非悪性症状、例えば胃炎、潰瘍、胃粘膜化生や異形成を有する個体の血清中のマーカーファミリーのメンバーの免疫検出。
・結腸直腸、膵臓、卵巣、メラノーマ、肝臓、食道、膀胱、子宮及び脳といった、しかしこれらに限定されない他の腫瘍を有する患者におけるマーカーファミリーのメンバーの免疫検出。
・血清、リンパ液、腹膜液、脳脊髄液、滑液などの体液におけるマーカーの検出。
・胃ガン患者の胃液、腹腔洗浄液、尿及び大便中のマーカーファミリーのメンバーの免疫検出。アレイ法及び/又はqPCRを用いる。
・コンピュータを用いたアレイ又はqPCRデータの分析。一次データを集め、そして倍変化分析を、胃の腫瘍遺伝子発現と非腫瘍組織における同一遺伝子の発現のレベルの比較により実施した。発現が増大するに至る閾値を提供する(例えば、1.5×増大、2倍増大、そして代替的な実施態様では、3倍増大、4倍増大又は5倍増大)。発現が増大するに至る他の閾値は、本発明の範囲を脱することなく選択することができると、認められる。腫瘍遺伝子の発現についてのさらなる分析には、発現の増大を表わすこれらの遺伝子と、腫瘍診断を提供する既知の胃の腫瘍の発現プロフィールとのマッチングが含まれる。
【0062】
ある観点では、本発明は、
(a)生物試料を提供すること;及び
(b)該試料中のGTMファミリーのメンバーの過剰発現を検出すること
を含むガンの検出方法を提供する。
【0063】
他の観点では、本発明は、GTM mRNAの過剰発現を検出する工程を含む。
【0064】
他の観点では、本発明は、GTMタンパク質の過剰発現を検出する工程を含む。
【0065】
なおさらなる観点では、本発明は、GTMペプチドの過剰発現を検出する工程を含む。
【0066】
なおさらなる観点では、本発明は、
その上にGTM捕獲試薬を有する基材;及び
該基材に関連する検出器であって、該捕獲試薬と関連するGTMを検出することができる該検出器(ここで捕獲試薬にはオリゴヌクレオチド又は抗体を含む)
を含むGTMを検出する装置を含む。
【0067】
さらなる観点では、
基材;
1以上のGTM特異的オリゴヌクレオチド及びGTM特異的抗体を含むGTM捕獲試薬;及び
使用のための指令
を含む、ガン検出キットを含む。
【0068】
なおさらなる本発明の観点では、
前記GTMに特異的なフォワードプライマー;
該GTMについて特異的なリバースプライマー;
PCR試薬;
反応バイアル;及び
使用のための指令を含む、qPCRを用いたGTMの検出方法を含む。
【0069】
さらなる本発明の観点では、
前記GTMタンパク質又はペプチドについての捕獲試薬を有する基材;
該GTMタンパク質又はペプチドに特異的な抗体;
該GTMタンパク質又はペプチドについての結合抗体を標識できる試薬;及び
使用のための指令
を含む、GTMタンパク質又はペプチドの存在の検出キットを含む。
【0070】
さらなる本発明の観点では、本発明は、工程を含む、モノクローナル交代の製造方法を含む。
【0071】
なおさらなる観点では、本発明は、
胃ガンの疑いがある患者から試料を提供すること;
ELISA法を用いてGTMタンパク質の存在を測定すること
の工程を含む。胃ガンの検出方法を含む。
【0072】
本明細書中に説明するように、腫瘍の検出は、1個以上の腫瘍特異的マーカーの発現を測定することにより達成することができる。我々は予期せぬことに、GTMの発現増大と、診断した胃ガンの存在との間の関連性が非常に高いことを見いだした。検出した最小有意連関は、p値が約1.6×10−6であった。多くの連関はp値が10−20未満であり、有意であった。このように高い有意性では、複数のGTMにおいて発現の増大を検出する必要はないであろう。しかし、本発明のGTMにおける余剰は、信頼性を高めて胃ガンを検出することを可能とする。
【0073】
本明細書で提供する方法は、高い感度のアッセイも含む。qPCRは非常に感度があり、そして試料中の非常に低いコピー数(例えば、1〜100)の遺伝子産物を検出するのに用いることができる。このような感度により、胃ガンに関連する事象の非常に早期の検出をなすことが可能となる。
【0074】
方法
以下の一般的方法を用いて、胃の腫瘍に関連するマーカーの分子同定への種々のアプローチの適合性を評価する。
【0075】
腫瘍収集
胃の腫瘍試料及び非悪性の胃組織を、韓国のソウル国立大学病院とニュージーランド国のDunedin病院で切除した外科標本から収集した。胃ガンの診断は症状、身体所見及び組織の組織学的検査に基づいてした。
【0076】
RNA抽出
いくつかの実施態様では、胃の腫瘍に関連する遺伝子の発現を、腫瘍から採取した試料のRNAの変化を決定することにより分析した。凍結した外科標本を、OCT培地中に包理した。60μmの切片をマイクロトームを用いて組織塊からスライスし、TriReagent:水(3:1)混合物中でホモジナイズし、次にクロロホルムで抽出した。次に全RNAを、RNeasyTM 手法(Qiagen)を用いて水相から精製した。RNAを16個のガン細胞株からも抽出し、そして参考RNAとして用いるために集めた。
【0077】
マイクロアレイスライド調製
エポキシ被覆したガラススライドをMWG Biotech、ドイツ国エバースバーグから得て、そして〜30,000の50merオリゴヌクレオチドを、Gene Machinesマイクロアレイロボットを用いて、製造者のプロトコールに従って、プリントした。該当するオリゴヌクレオチドの参照番号(MWGオリゴ#)、並びにNCBI mRNA及びタンパク質参照配列を、図2に示す。本発明のGTMの全長DNA配列を、本明細書の以下に示す。
【0078】
RNA標識及びハイブリダイゼーション
cDNAを、10μgの全RNAからSuperscriptIIリバース転写酵素(Invitrogen)を用いて、5−(3−アミノアリル)−2’デオキシウリジン−5’−トリリン酸塩を含有する反応で転写させた。次に反応をMicroconカラム内で脱イオン化して、Cy3又はCy5と共に炭酸水素塩緩衝液中、1時間室温でインキュベートした。取り込まれなかった色素をQiaquickカラム(Qiagen)を用いて除去し、そして試料をSpeedVac内で15μlに濃縮した。次にCy3及びCy5で標識したcDNAを、Ambion ULTRAhyb緩衝液と混合し、100℃で2時間変性し、そしてマイクロアレイスライドへ、ハイブリダイゼーションチャンバー内で42℃16時間ハイブリダイズした。次にスライドを洗浄し、そしてAxon 4000Aスキャナーにおいて2つのパワー設定で2回スキャンし、遺伝子発現についての一次蛍光データを得た。
【0079】
基準化手順
腫瘍及び非悪性組織からのガン遺伝子発現を比較するため、GenepixTM ソフトウェアにより検出した中央値の蛍光強度を、部分的バックグランドの蛍光強度を引き算して補正した。バックグランド補正したゼロ未満の強度を有するスポットは、排除した。基準化を容易にするため、強度比率及び全体的なスポット強度を、log変換した。log変換した強度比率を色素及び空間的バイアスについて、LOCFITTM パッケージで実施した位置回帰を用いて補正した。log変換した強度比率を、全体のスポット強度及び位置に関して同時に復帰(regress)させた。位置的な復帰の残りにより、補正したlog倍変化を提供した。質的なコントロールのため、それぞれ基準化したマイクロアレイの比率をスポット強度及び配置に関してプロットした。続いてプロットを、残存の可能性がある人工物について可視的に点検した。さらに、分散分析(ANOVA)モデルをピンチップバイアスの検出に適用した。基準化の全結果及びパラメータを、統計分析のためのPostgresデータベースに挿入した。
【0080】
統計分析
腫瘍試料対正常組織での遺伝子発現における統計的に有意な変化を、測定したアレイ間の倍変化により同定した.これを成すために、log2(比率)をスケールして、アレイ当たりの同じ全体標準偏差を得た。この標準化手法により、平均組織内クラスの変動を減じた。log2(比率)をさらにシフトして、各オリゴヌクレオチドについてのゼロの中央値を得、結果の可視的な点検を容易にした。次に倍変化に基づくランク検定を用いて、ノイズロバスト性を改善した。この検定は、2つの工程:(i)アレイ内の倍変化のランク(Rfc)の計算、及び(ii)正常組織についての中央値(Rfc)の腫瘍組織についての中央値(Rfc)からの引き算からなる。両中央値ランクの差異が、図2にある倍変化ランクのスコアを決める。2つのさらなる統計検定:1)Bonferroni調整のあるなしでの、2つの試料のスチューデントt−検定及び2)Wilcoxon検定も、この標準的データについて実施した。
【0081】
マーカーの組合せの統計分析
腫瘍及び非悪性試料間を区別するために2又は3個のマーカーの用いた組合せを用いた値を決定するために、40対の試料(同一患者からの腫瘍及び非悪性試料)からのqPCRデータを、以下の分析に用いた。非悪性及び腫瘍試料についての正常分布を、試料平均及び標準偏差を用いて発生させた。腫瘍発現データから得た値が非悪性の分布において定義した閾値(例えば、50%、70%、73%、80%、90%、95%、98%、99%又は100%)を超えるであろう見込みを、次に決定した(すなわち、感度)。マーカーの組合せについて、少なくとも1個のマーカーが閾値を超える見込みを決定した。
【0082】
【表1】
【0083】
定量リアルタイムPCR
他の実施態様では、リアルタイム又は定量のPCR(qPCR)を、PCR鋳型コピー数の絶対又は相対の定量に用いることができる。TaqmanTM プローブ及びプライマーセットを、Primer Express V2.0TM (Applied Biosystems)を用いて設計した。可能であれば、全ての可能性のあるスプライス変異体を得られた単位複製配列(amplicon)に含め、単位複製配列はMWG−Biotech誘導マイクロアレイオリゴヌクレオチドによりカバーした領域に優先して与えた。あるいは、標的遺伝子が所望とする単位複製配列をカバーするAssay-on-DemandTM 発現アッセイ(Applied Biosystems)により表わされる場合は、これらを用いた。qPCRに用いた遺伝子の名前、シンボル、Applied Biosystems「assay on demand」数、フォワードプライマー、リバースプライマー及びプローブ配列を、表1及び図1に示す。組織内で設計したアッサイでは、プライマー濃度をSYBR緑色標識プロトコール及び参照RNAから作製したcDNAを用いて滴定した。増幅を、ABI PrismTM 7000配列検出システムで、標準的なサイクル条件下で実施した。単一の増幅産物を解離曲線において認めると、最適プライマー濃度及び最終濃度250nMでの5’FAM−3’TAMRAリン酸塩TaqmanTM プローブ(Proligo)を用いて、標準曲線を625倍濃度の範囲を超えて、作製した。0.98を超える回帰係数を有する標準曲線を与えるアッセイを、続きのアッセイに用いた。他の実施態様では、回帰係数が高い必要はないと解されるであろう。むしろ、どのような標準曲線でも、回帰係数が発現における差異を統計的に有意に決定させる程度に、充分高い限り用いることができる。このような回帰係数は、代替的な実施態様においては、約0.7より、約0.8より、約0.9より、又は約0.95より高ければよい。
【0084】
アッセイを、単一のcDNAにより表わされる各RNA試料を有する2つの96ウェルプレートについて実施した。各プレートは、参照cDNA標準曲線を、625倍濃度範囲を超えて、二つ組で含んだ。分析は、ΔCT(標的遺伝子CT−平均参照cDNA CT)を計算することからなった。ΔCTは、陰性log2倍変化に対して直接比例する。次に、中央値の非悪性log2倍変化に相対するlog2倍変化を計算した(log2倍変化−中央値の正常なlog2倍変化)。次にこれらの倍変化を、頻度クラスに集めて、そしてグラフにした。
【0085】
ガンのマーカー遺伝子のマイクロアレイ分析
58個の胃の腫瘍及び58個の非悪性の(「正常な」)胃組織の試料からのRNAを、Cy5で標識し、そして二つ組で又は三つ組でCY3で標識した参照RNAとハイブリダイズした。次に正常化後、29,718個の各遺伝子における発現の変化を、3つの測定:(i)倍変化:非悪性試料における中央値のレベルで割った腫瘍試料中の遺伝子の中央値の発現(標準化していない)の比率、(ii)倍変化のランク及び(iii)観察した倍変化が有意である統計的見込みにより見積もった。
【0086】
胃の悪性腫瘍についての血清マーカーの選択
ある実施態様では、ガンのマーカーは、血清のような体液に見いだすことができる。血清マーカーは、(i)分泌タンパク質に、又は膜を外側から貫くタンパク質に、特徴的なシグナル配列の存在、(ii)非悪性コントロールに比較した、腫瘍における過剰発現(倍変化)の中央値のレベル、(iii)腫瘍と非悪性コントロールとの間の発現ランクにおける中央値の変化、そして(iv)腫瘍及び非悪性のコントロールにおける発現範囲の間の重なりの度合いに基づくアレイデータから、選択した。
【0087】
全部で29個のGTMは、そのコード配列の5’末端にシグナルペプチド配列を有することが分かっている。シグナル配列は、GTMタンパク質を原形質膜を通して細胞外区画へ輸送するための標的となる(Gunner von Heijne、Journal of Molecular Biology 173: 243〜251(1984年))。さらに、GTMのいずれも、全長タンパク質が原形質膜内に保持されるという結果となる膜貫通型配列のモチーフを有していない。それ故に、本発明の全てのGTMマーカーは、細胞外区画中に分泌されるようであり、従って毛細血管により、又はリンパ管系へ、次に脈管構造中へ輸送されることにより吸収され、脈管構造と接触しうる。結果として、これらの腫瘍由来のマーカーのそれぞれが血液中に存在することとなる。
【0088】
次に、腫瘍試料のうち>50%が、非悪性の範囲の95パーセンタイル値内の発現レベルを示した場合は、遺伝子を排除した。腫瘍試料における過剰発現の度合いのバリエーションは、腫瘍の異質性のみでなく、腫瘍試料と「正常」組織、例えば筋肉、間質細胞及び非悪性上皮腺との混成の程度によるバリエーションをも反映する。この「正常」の混成は、約25%の中央値を有する5〜70%範囲である。他の遺伝子は、造血細胞での高い相対発現、又は化生性の胃組織における発現上昇のため、排除した。正常細胞又はマーカーを正常に発現する細胞による混成の度合いに応じて、異なる閾値範囲を選択し、これによりガン起源と正常起源との間に充分な分別をなしうることが、解されるであろう。
【0089】
有用であると見いだしたGTMには、例えば以下のマーカー:カルボキシペプチダーゼN、ポリペプチド2、83kDa鎖(カルボキシペプチダーゼNとしても知られる)(CPN2)、マトリックスメタロプロテイナーゼ12(MMP12)、インヒビン(「INHBA」)、インシュリン様成長因子7(「IGFBP7」)、ガンマ−グルタミル加水分解酵素(「GGH」)、ロイシンプロリンに富んだプロテオグリカン(「LEPRE1」)、シスタチンS(「CST4」)、分泌フリズルド関連タンパク質4(「SFRP4」)、アスポリン(「ASPN」)、EFハンドドメイン1を有する細胞成長制御因子(「CGREF1」)、カリクレイン10(KLK10)、メタロプロテイナーゼ1の組織阻害剤(「TIMP1」)、酸性のシステインリッチな分泌タンパク質(「SPARC」)、形質転換成長因子、β−誘導(「TGFBI」)、EGF−含有フィブリン様細胞外マトリックスタンパク質2(「EFEMP2」)、ルミカン(「LUM」)、スタニン(「SNN」)、分泌ホスホタンパク質1(「SPP1」)、コンドロイチン硫酸プロテオグリカン2(「CSPG2」)、N−アシルスフィンゴシンアミド加水分解酵素(「ASAH1」)、セリンプロテアーゼ11(「PRSS11」)、分泌フリズルド関連タンパク質2(「SFRP2」)、ホスホリパーゼA2、グループXIIB(「PLA2G12B」)、スポンディン2、細胞外マトリックスタンパク質(「SPON2」)、オルファクトメディン1(「OLFM1」)、トロンボスポンディン反復含有1(「TSRC1」)、トロンボスポンディン2(「THBS2」)、アドリカン、シスタチンSA(「CST2」)、シスタチンSN(「CST1」)、リシルオキシダーゼ様酵素2(「LOXL2」)、サイログロブリン(「TG」)、形質転換成長因子ベータ1(「TGFB1」)、セリン又はシステインプロテイナーゼ阻害剤クレードH(「SERPINH1」)、セリン又はシステインプロテイナーゼ阻害剤クレードB(「SERPINB5」)、マトリックスメタロプロテイナーゼ2(「MMP2」)、プロタンパク質転換酵素サブチリシン(subtilisin)/ケクシン(kexin)タイプ5(「PCSK5」)及びヒアルロナンプロテオグリカン連結タンパク質4(「HAPLN4」)の遺伝子(DNA)、相補的DNA(cDNA)、RNA、タンパク質及びタンパク質フラグメントが挙げられる。
【0090】
情報の同定に加えて、本発明のGTMのDNA配列を、本明細書の以下に示す。
【0091】
【表2】
【0092】
免疫組織化学
8μMの凍結切片を組織塊から切り出し、そしてAPESスライドにマウントした。次に組織をアセトン中に10分間固定し、空気乾燥した。次にスライドをメタノール中0.3%の過酸化水素に10分間浸し、そしてリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で洗浄した。スライドを適切な動物の20%血清中でインキュベートすることにより、非特異的結合部位をブロックし、そして再度PBSで洗浄した。次に1%血清を含有するPBSで希釈した一次抗体をスライドに加えた。1時間インキュベーション後、スライドを再度PBSで洗浄して、二次抗体とさらに1時間インキュベーションした。PBSでの最終洗浄後、Tris緩衝食塩水(TBS)に溶解したテトラヒドロ塩化ジアミノベンジジンを用いて二次抗体を検出して、TBS及び水で洗浄した。次にスライドをヘモトキシリンで対比染色し、そして光学顕微鏡で観察した。
【0093】
ある実施態様では、胃の腫瘍を本発明のガンマーカーに基づいた染色を用いて、生体内原位置(in situ)で局在化することができる。少なくとも1個のマーカーが、コンゴーレッド又は等価物、非特異的アミロイド染色を用いて可視化することができるアミロイド構造を形成するであろう。
【0094】
体液中の胃ガンマーカーについての検査
いくつかの実施態様では、GTMについてのアッセイを、望ましくは血液、血漿、血清、例えば腹腔洗浄を用いて得た腹水から得た試料、又は他の体液、例えば尿、リンパ液、脳脊髄液、胃液又は大便試料について実施することができる。
【0095】
一般には、これらの液体中のオリゴヌクレオチド、タンパク質及びペプチドについてのアッセイ方法は、当該技術分野で既知である。オリゴヌクレオチドの検出は、ノーザンブロット、サザンブロット又はマイクロアレイ法又はqPCRのようなハイブリダイゼーション法を用いて実施するとよい。タンパク質を検出する方法としては、例えば酵素連結免疫吸着測定法(ELISA)、抗体を有するタンパク質チップ、懸濁ビーズラジオイムノアッセイ(RIA)、ウェスタンブロッティング及びレクチン結合が挙げられる。しかし説明目的として、GTMの液体レベルを、サンドウィッチタイプの酵素連結免疫吸着測定法(ELISA)を用いて定量するとよい。血漿アッセイでは、5μLアリコートの適切に希釈した試料又は段階的に希釈した標準GTM及び75μLのペルオキシダーゼ抱合抗ヒトGTM抗体を、マイクロタイタープレートのウェルに加える。30℃で30分間のインキュベーション期間の後、ウェルをリン酸緩衝食塩水(PBS)中0.05%のTween20を用いて洗浄し、結合していない抗体を除去する。GTMと抗GTM抗体との結合複合体を、次にo−フェニレンジアミン含有H2O2と共に15分間30℃でインキュベーションする。1MのH2SO4を加えて反応を止め、そして492nmでの吸光度をマイクロタイタープレートリーダーで測定する。
【0096】
抗GTM抗体はモノクローナル抗体又はポリクローナル抗血清であってもよいと、解されるであろう。他のいずれの体液であっても適切に研究しうることも、解されるであろう。
【0097】
あるマーカーは、血漿又は血清に存在すると知られる。これらとしては、オステオポンチン(Hotteら、Cancer95(3): 507〜510(2002年))、前立腺特異的抗原(Martinら、Prostate Cancer Prostatic Dis.(2004年3月9日)(Pub Med No: PMID: 15007379)、サイログロブリン(Hallら、Laryngoscope 113(1): 77〜81(2003年); Mazzaferriら、J. Clin. Endocrinol. Metab.88(4): 1433〜14421(2003年))、マトリックスメタロプロテイナーゼ2及び9(Kuoら、Clin. Chem. Acta.294(1〜2): 157〜168(2000年))、CEA及びTIMP1(Pellegriniら、Cancer Immunol. Immunother. 49(7): 388〜394(2000年))が挙げられる。このように、前記マーカーのうちのいくつかはGTMについても有用なマーカーであるため、血漿、血清又は他の液体アッセイをその検出及び定量用にすでに入手可能である。多くのタンパク質は(1)細胞により分泌される、(2)細胞膜から脱落する、又は(3)細胞死の際に細胞から欠失する、のいずれかであるため、他のGTMも体液、例えば血漿、血清などに存在する。従って、本発明の実施態様では、都合よく得られた試料中のGTMの検出が有用であり、望ましく、そして胃ガン診断の基準となりうるであろう。
【0098】
ウェスタン分析
タンパク質を、TriReagent及びグアニジンHCl抽出法を用いて、胃組織から抽出した。RNAのTriReagent抽出からの非水相を、1.5容量のエタノールと混合し、そして遠心分離してDNA及びOCT培地を除去した。0.5mlの上清を0.75mlのイソプロパノールと混合し、室温で10分間インキュベートし、そして次に遠心分離した。ペレットを95%エタノール中の0.3Mグアニジン1mlで3回、そしてエタノール単独で1回洗浄し、次に50μlの1%SDSに再懸濁した。
【0099】
タンパク質を定量し、そしてSDSポリアクリルアミドゲル上で標準的な方法を用いて電気泳動した。要約すると、分離したタンパク質をPVDF膜へ、BioRad trans-blot電気泳動トランスファーセルを用いて、標準的な方法論により移した。次に膜を脱脂粉乳を含有する溶液で30分間ブロックし、一次抗体と共に2時間室温でインキュベートした。洗浄後、膜を二次抗体と共に1時間室温でインキュベートした。最終洗浄後、結合した抗体をECL検出システム(Amersham Biosciences)を用いて可視化した。
【0100】
血清中のマーカーの検出は、既知の方法を用いて血清試料を提供し、次に血清試料を、目的タンパク質に対するオリゴヌクレオチドプローブ又は抗体のいずれかを用いる分析に付すことにより、成すことができる。ウェスタンブロッティング分析のようなイムノブロッティングは、選択的に発現したタンパク質が血清中に存在するかどうかを決定するためには、特に有用であろう。さらに、他の体液がマーカーを含んでもよく、そして腹水、脳脊髄液などが挙げられる。マーカーが分泌され、生理学的な意味で、有用である必要はない。むしろ、マーカータンパク質又は遺伝子が血清に入るメカニズムであれば、検出可能で、定量可能なレベルのマーカーの産生において有効であろう。このように、細胞からの可溶性タンパク質の正常な分泌、血漿膜からの膜タンパク質の脱落、選択的にスプライスしたmRNA型又はそれから発現したタンパク質の分泌、細胞死(アポトーシスであっても)は、充分なレベルのマーカーを産生し、有用となる。種々のガンタイプについての治療の有効性を診断及び/又は評価するツールとして、血清マーカーを使用する裏付けは増えている。
【0101】
Yoshikawaら(Cancer Letters、151: 81〜86(2000年))は、胃ガンを有する患者の血漿中のマトリックスメタロプロテイナーゼ−1の組織阻害剤を記載している。
【0102】
Rudlandら(Cancer Research 62: 3417〜3427(2002年))は、ヒトの乳ガンにおける転移関連タンパク質としてオステオポンチンを記載している。
【0103】
Buckhaultsら(Cancer Research 61: 6996〜7001(2002年))は、結腸直腸の腫瘍で発現した分泌のそして細胞表面の遺伝子を記載している。
【0104】
Kimら(JAMA 287(13): 1671〜1679(2002年))は、卵巣ガンに可能性のある診断の生物マーカーとして、オステオポンチンを記載している。
【0105】
Hotteら(AJ. American Cancer Society 95(3): 507〜512(2002年))は、ヒトの体液中に検出可能であり、そしてある悪性腫瘍に関連するタンパク質として、血漿オステオポンチンを記載している。
【0106】
Martinら(Prostate Cancer Prostatic Dis.2004年3月9日(PMID: 15007379)(要約))は、前立腺ガンの検出用マーカーとして、ヒトのカリクレイン2、前立腺特異的抗原(PSA)及び遊離のPSAの使用を記載している。
【0107】
Hallら(Laryngoscope 113(1): 77〜81(2003年)(PMID: 12679418)(要約))は、甲状腺ガンにおける血清サイログロブリンの予測値を記載している。
【0108】
Mazzaferriら(J.Clin. Endocrinol. Metab. 88(4): 1433〜1441(2003年)(要約))は、甲状腺ガン腫を有する患者のための、可能なモニター法としてサイログロブリンを記載している。
【0109】
Whitleyら(Clin.Lab.Med. 24(1): 29〜47(2004年)(要約))は、甲状腺ガン腫のための血清マーカーとしてサイログロブリンを記載している。
【0110】
Kuoら(Clin.Chim.Acta. 294(1〜2): 157〜168(2000年)(要約))は、HCF及びHBV感染した患者における、血清マトリックスメタロプロテイナーゼ2及び9を記載している。
【0111】
Koopmanら(Cancer Epidemiol. Biomarkers Prev 13(3): 487〜491(2004年)(要約))は、膵臓腺ガン用の生物マーカーとして、オステオポンチンを記載する。
【0112】
Pellegriniら(Cancer Immunol. Immunother. 49(7): 388〜394(2000年)(要約))は、準浸潤性の結腸直腸ガン用マーカーとして可溶性ガン胎児性抗原の測定を記載する。
【0113】
このように、我々は胃ガンを検出し、そして評価するための試薬、装置及びキットを開発するのに有用である多数の遺伝子及び/又はタンパク質を同定した。胃の1個以上のマーカーを単独で又は組合せで用いて、胃ガンのための信頼できる分子検査を提供する。
【0114】
実施例
本明細書に記載する実施例は、本発明の実施態様を説明する目的にある。他の実施態様、分析方法及びタイプは、分子診断技術分野の通常の技術者の理解の内にあり、そして本明細書に詳細に説明する必要はない。当該技術分野にある他の実施態様は、本発明の部分であると見なされる。
【0115】
実施例1:胃の悪性腫瘍のためのマーカーの同定
図2は、前記判定基準を用いて選択した胃の悪性腫瘍のための38個のマーカーを用いた研究結果を示す表を表わす。図2には、遺伝子のシンボル(「シンボル」)、MWGオリゴ番号、NCBI mRNA参照配列番号、タンパク質参照配列番号、腫瘍と非腫瘍遺伝子発現との間の倍変化、マイクロアレイ分析における他の遺伝子に相対する倍変化ランク、オリジナルの未調整スチューデントt−検定の結果、Bonferroni調整p値の結果、及び2試料Wilcoxon検定の結果が含まれる。
【0116】
これらの34個の遺伝子についての中央値の倍変化(腫瘍:非悪性組織)は1.6〜7の範囲であり、そして倍変化ランクにおける中央値の変化は〜16,995〜25,783の範囲であった。倍変化ランクにおける最大の可能な変化は、〜29,718であった。示した各マーカーについて、ガンマーカーとしてのその特異性の統計的有意性は、非常に高いことがわかった。Bonferroni調整p値は、一般に、全て10−6以下であり、これらのマーカーを用いた診断が非常に高く胃ガンに関連することを示した。
【0117】
3つのシスタチン(CST1、CST2及びCST4)は相同性が高く、そしてマイクロアレイ上では同じオリゴヌクレオチドにより表わされ、特に記載しない限り、「CST1、2、4」として集約的に引用する。
【0118】
図2に表わした全てのタンパク質は、SMARTパッケージ(European Molecular Biology Laboratory)を用いて、シグナルペプチドを有すると予測した。シグナルペプチドは合成したタンパク質を細胞外区画へとターゲットし、それにより腸管液へ分泌され、そこから血液に接触することができると知られる。実際、本発明のタンパク質のうちのいくつかを、血清中に検出した。
【0119】
図2に表わした遺伝子のいくつかは、胃ガンの進行をモニターするために臨床現場で最もよく用いられるマーカーであるCEAに対応するアレイ上の2つのオリゴヌクレオチドより高い強度ランクでの変化を表わした。
【0120】
実施例2:qPCR分析
より感度があり、そして正確な定量性がある遺伝子発現を、qPCRを用いて図3に示した遺伝子のサブセットについて得た。46個の腫瘍及び49個の非悪性試料のRNAを、マイクロアレイ分析(図2)により同定した23個の遺伝子について分析したが、結果を図3に示す。図3には、遺伝子シンボル、ガンと正常な組織との間の中央値の倍変化、そして非悪性試料での発現レベルの95パーセンタイル値より高い発現レベルを有する腫瘍試料の%を挙げる。12個の腫瘍試料及び9個の正常な試料を、高い(>75%)正常細胞の混成、高度の壊死(>40%)又はマイクロアレイでの弱いハイブリダイゼーションシグナルにより、分析から排除した。これらの23個の遺伝子についての中央値の倍変化(中央値の非悪性組織の発現に比較した腫瘍組織)は、3〜525倍の範囲であった(図3)。
【0121】
遺伝子ASPN、CST1、2、4、LOXL2、TIMP1、SPP1、SFRP4、INHBA、THBS2及びSPARCの発現レベルは、腫瘍において、≧90%の場合で、非悪性の範囲の95パーセンタイル値より高かった(図3)。遺伝子の残りについては、腫瘍での発現は>50%の試料において95パーセンタイル値より高かった。各腫瘍の過剰発現した、95パーセンタイル値より高い少なくとも7個の遺伝子は、マーカーの組合せにより全ての胃の腫瘍の包括的適用範囲に至ることを示す。
【0122】
実施例3:qPCRを用いたアレイデータの確認
アレイデータを、定量の、リアルタイムPCR(qPCR)を用いて、腫瘍及び非悪性試料について、24個の遺伝子のためのプローブで確認した。24個全ての遺伝子について研究し、20個については2つの技術間で強い相関を示した。これらの分析のうち4つを、図4a〜4dに示すが、これらはアレイ及びqPCR法を用いて検出した4個の選択したガンマーカーについての相対発現のグラフを表わす。図4の各グラフについて、横軸は遺伝子発現におけるアレイのlog2倍変化を表わし、そして縦軸は遺伝子発現におけるqPCRのlog2倍変化を表わす。方法間で共変化する関係(co-variant relationship)で示したように、我々は2つの方法間には強い相関があることが分かった。強い相関は、マイクロアレイ倍変化分析とqPCRとの両者が、胃ガンマーカー遺伝子の発現における変化を検出するのに適した方法であり、それ故に正確で、感度のあるスクリーニング法として用いることができることを示す。図4a〜4dから、アレイ法よりqPCR法では、発現における変化を検出するに際し、より敏感となりうることも解される。このように、早期の検出が特に望ましい場合では、qPCRが特に有用であろう。
【0123】
図5a〜5wは、正常組織(白棒)及び腫瘍組織(黒棒)の両者における23個の遺伝子シリーズのそれぞれの発現の観察頻度(縦軸)と、その遺伝子の発現におけるlog2倍変化(横軸)とを比較するヒストグラムを表わす。頻度分布曲線間の重なりの程度が低いことを熟考すると、これらの23個の遺伝子のそれぞれについて、正常と腫瘍組織間の頻度分布において、実質的な区別があることを、我々は驚くべきことに見いだした。例えば、図5bはCST1、2,4についての結果を表わすが、これについて1つだけ正常な試料が腫瘍範囲内での発現レベルを有することを観察した。他の場合(例えば、図5n;PRS11について)では、各頻度分布曲線は相対的に狭く、そしてある程度の重なりがある。しかし、このマーカーについてさえも、中央値のlog2倍変化は遺伝子発現量の実質的な区別を示した。他の場合(例えば、図5a;ASPNについて)では、いくらか重なりがあるとはいえ、正常と腫瘍試料との間の中央値のlog2倍発現の明確な区別があった。
【0124】
図6は、正常な試料に比較して、腫瘍試料で有意に増大した発現(「過剰発現」)を表わす遺伝子の数(縦軸)、及び検査した個体試料のヒストグラムを表わす。各場合において、腫瘍試料は上昇した発現レベルを有する多様な遺伝子を表わした。発現が増大した遺伝子の最低の数は7であり、試料E123に見られた。この発見は、多様な遺伝子が正常な組織に相対して過剰発現する場合には、ガン検出の信頼性が非常に高くなり、ガン診断をより確かにすることを示す。しかし、いくつかの場合では、1個のマーカー遺伝子の発現の上昇で、ガン診断を導くのに充分となる。
【0125】
胃ガン検出のために現在最も頻繁に用いられている血清マーカーであるCEAとの我々の事前比較は、腫瘍と正常試料との間のアレイデータの強度ランクにおける差異に基づいていた。この比較は、マーカーとCEAについてのqPCRデータを用いて立証した。
【0126】
図7a〜7cは、腫瘍マーカーであるCEAについての遺伝子発現に比較した、個体の腫瘍試料及び非悪性試料におけるマーカーの相対log2発現(参照RNA調製に比較して)のグラフを表わす。CEAは、胃ガンの進行をモニターするために、現在最も用いられる血清マーカーである。ゼロ点は、各マーカーについての正常な発現の中央値と定義される。腫瘍試料と正常試料とにおけるCEA遺伝子(CEACAM5)の発現間には広範囲の重なりがあることがわかる。この重なりは、胃ガンマーカー、ASPN、CSPG2、CST1、2、4、IGFBP7、INHBA、LOXL2、LUM、SFRP4、SPARC、SPP1、THBS2、TIMP1、アドリカン、LEPRE1及びEFEMP2では、著しく少ない。図7b〜7cにおける他のマーカー、ASAH1、SFRP2、GGH、MMP12、KLK10、TG、PRSS11及びTGFBIについては、腫瘍発現の範囲と非悪性組織発現の範囲との間の重なりは、前記マーカーについての重なりより大きいが、なおもCEAのものよりは小さく、本明細書に記載する新規マーカーの全てがCEAより定量的によく、従ってより信頼できる診断を提供することができる。
【0127】
変化しやすい組織の扱いの効果を最小とするために、腫瘍:正常(非悪性)倍変化を、同一患者に由来する腫瘍及び非悪性組織のqPCRデータを用いて計算した。このように対にした分析は、異なる個体での遺伝子発現のバックグラウンドレベルにおける差異を補正し、そしてRNAの質についての組織取り扱いの効果を最小とする。例えば、切除した胃を室温で1時間すると、正常及び腫瘍試料からの転写物は同じ程度で分解することとなる。
【0128】
図8は、マーカーについてのqPCRにより決定したT:N発現レベルをまとめるが、同一個体からの対となるデータ(すなわち、腫瘍及び非悪性試料)を用いた。図8は、図3に含まれない6個の遺伝子についての発現データも含む。追加で研究した遺伝子は、MMP2、CGR11、TGFB1、PCSK5、SERPINB5及びSERPINH1である。同定した情報及びプローブは、図1及び2に示す。図8は、「対の」試料を用いた、これらの40人の患者における、29個の胃ガンマーカーについての中央値のT:N倍変化及び最大値のT:N倍変化を示す。29個のマーカーのうち27個は、従来技術のマーカーであるCEAより大きいか、又は等しい中央値のT:N差異を有する。マーカーのうち29個/29個が、腫瘍試料での発現が正常試料での発現を超える対の試料を、より高い百分率で有する。
【0129】
図9a〜9dは、同一個体の腫瘍及び正常組織からのデータのスキャタードットプロットを表わす。各点は、患者内での、非悪性組織での発現に相対する腫瘍組織でのマーカーの発現における倍変化を表わす。研究したマーカーは全て、CEAよりも、非腫瘍組織からの腫瘍の区別がよい。3個のマーカー、CST1、2、4、ASPN及びSFRP4は、対にした腫瘍及び正常試料間で100%の区別を示した。すなわち、これらのマーカーについては、どの腫瘍組織も同一個体の対応する非腫瘍組織より発現が高かった。多くの他の腫瘍マーカー、例えばアドリカン、CSPG2、EFEMP2、IGFBP7、INHBA、LOXL2、LUM、SERPINH1、SPARC、SPP1、TGFbI、THBS2及びTIMP1は、それぞれが2又は3個の、腫瘍組織の発現が非腫瘍組織のものより低い点を有していた。このように、これらのマーカーについては、腫瘍及び非腫瘍組織の全ての一対が偽陰性を生む尤度は比較的低い(例えば、40個のうち3個又は7.5%;40個のうち2個又は5%;40個のうち1個又は2.5%)。このように、たとえ直前に挙げた他のマーカーを用いたとしても、患者個体からの多様な試料の使用が、信頼できる診断情報を生むこととなる。
【0130】
これらのマーカーの遺伝子配列、及びそれらを検出するために用いるプライマー及びプローブの位置を、本明細書に前記する。
【0131】
マーカー遺伝子の過剰発現が胃の腫瘍のステージとは独立しているのか否かを決定するために、対にしたT:Nlog2倍変化を、腫瘍ステージに対してプロットした(図10a〜10ad)。腫瘍ステージについての発現のステージ依存は、図8に挙げた26個のマーカーについては観察されなかった。これらのマーカーは、遅いステージの腫瘍だけでなく、早いステージにおいても同様に過剰発現した。しかし、KLK10はステージ1及びステージ2の腫瘍においてより一貫した過剰発現を示し、そしてPCSK5及びSERPINB5はステージ4の腫瘍でより一貫した過剰発現を示した。従って、KLK10、PCSK5及びSERPINB5は、胃の腫瘍ステージを決定するために用いることができる。
【0132】
同様の分析では、対にしたT:Nlog2倍変化を、腫瘍(広範性タイプ又は腸管性タイプのいずれか)のLauren分類に対してプロットした。図11a〜11adは、29個のGTMがそれぞれ、腫瘍のタイプが腸管性(I)であるか、広範性(D)であるかに関わらず、腫瘍と非腫瘍組織を区別したことを示す。
【0133】
実施例4:複数マーカーの使用
前記したように、あるマーカーは、試料の100%で、腫瘍を非腫瘍組織から区別する能力を表わす。また他のマーカーは、前記したように、組合せにおいて、腫瘍組織を非腫瘍組織から非常に高い程度で区別するに達することができる。図12は、胃の腫瘍試料と非悪性の胃試料のシリーズについて、log2T:N倍変化として表わした、3個のマーカー、SERPINH1、CST1、2、4及びINHBAの発現の3次元プロットを表わす。2つの試料グループ間に、完全な分別がある。
【0134】
マーカーの組合せを用いた腫瘍と非腫瘍試料の成功した区別の信頼性を、図13にまとめた統計分析によりさらに説明する。対にした腫瘍と非悪性試料とからqPCR遺伝子発現を用いて得たデータの正常分布を比較したこの分析は、用いるマーカーの数を増やすと、検査感度について腫瘍と非悪性試料間とを区別する効果を示す(95%の固定した特異性を有する)。29個のマーカーのうち、単独でこの分析に用いた場合に90、95又は99%より高い感度を有するものはわずかしかないが、2個又は3個のマーカーの組合せにより多数の組合せで達する高い感度を可能とした。例えば、3個のマーカーの50の組合せでは、腫瘍と非悪性試料との区別を、≧99%の感度及び≧95%の特異性で区別する。
【0135】
実施例5:胃の腫瘍マーカータンパク質の検出
なおさらなる実施態様では、GTMタンパク質を診断の基準として検出することができる。ある状態、特定の試料、例えば細胞を含まない試料におけるmRNAの濃度では、マイクロアレイ又はqPCR法のいずれかを用いて、遺伝子発現の上昇を検出することは難しいであろう。このように、ある実施態様では、GTMタンパク質の検出を全タンパク質、タンパク質(ペプチド)のフラグメント又はタンパク質コアのいずれかに対する抗体を用いて成すことができる。タンパク質及びペプチドの発現を検出し、そして定量する方法は、当該技術分野で既知であり、そしてタンパク質又はペプチドに対する特異的抗体に頼る方法を挙げることができる。モノクローナル抗体及びポリクローナル抗血清は、当該技術分野で周知の方法を用いて作製することができ、本明細書においてさらに記載する必要はない。
【0136】
GTMタンパク質を用いて、腫瘍を非腫瘍組織から区別することができることを実証するために、市販の抗体をSPARC(R&D Systems; cat#AF941)、THBS2(Santa Cruz Biotechnology Inc; cat#sc-7655)、CSPG2(Calbiochem; cat#428060)及びIGFBP7(R&D Systems; cat#AF1334)に対して得た。追加でポリクローナル抗体を、ウサギ(Alpha Diagnostic International Inc;サンアントニオ)で、シスタチンSNペプチド配列50〜66(C)
FAISEYNKATKDDYYRR 配列番号:108
に対して生じさせた。
【0137】
これらの抗体を、腫瘍及び非悪性組織の免疫組織化学的又はウェスタン分析に用いた。これらのマーカーは、強い腫瘍:正常の差異を、タンパク質レベルで示した。これにより、これらの遺伝子についてRNAレベルで観察した過剰発現がタンパク質レベルでも起きていることを確認した。
【0138】
図14は、2対の腫瘍及び非悪性組織から、SPARC、CST1(シスタチンSN)、IGFBP7及びTHBS2にコードされているタンパク質に対する抗体を用いて抽出した総タンパク質のウェスタンブロット分析を示す。各マーカーについて、シグナルは非悪性試料より腫瘍試料において有意により高い。
【0139】
シスタチンSNに対して生じた抗体は、それぞれ約34、45及び65kDaの分子量に相当する3本の主要なバンドを検出した。最も低い分子量のバンドを、図14に示す。そのタンパク質種は、コントロールのシスタチンSNタンパク質より大きく、腫瘍により産生したタンパク質が翻訳後修飾又は多量体化を受けたことを示唆する。CSTタンパク質の分子量における差異に応答するメカニズムに関わらず、図14はCST発現が非腫瘍組織では低く、しかし腫瘍由来タンパク質のブロットでは容易に観察されることを実証した。
【0140】
図14はまた、SPRCタンパク質が非腫瘍組織におけるよりも腫瘍組織では高い度合いで実質的に発現することも示す。SPARCタンパク質は、血清で検出されたこのタンパク質の形態よりゲル移動が遅く(図15)、悪性の胃細胞により産生されるタンパク質において異なる翻訳後修飾が生じていることも示す。このような修飾に応答しうるメカニズムに関わらず、SPARCは非悪性組織に相対して腫瘍組織では過剰発現するという発見は、SPARCが有用なタンパク質マーカーであることを示す。同様に、IGFBP7及びTHBS2も非悪性組織に相対して腫瘍組織では過剰発現を示す。
【0141】
腫瘍及び非悪性組織の免疫組織化学分析を、CSPG2(バーシカン)及びCST1(シスタチンSN)とコード化したタンパク質に対する抗体を用いて実施した。バーシカンに対する抗体を用いた組織の免疫組織化学分析では、腫瘍組織の細胞外マトリックスにおいて強い染色を同定したが、非悪性組織ではなかった。抗シスタチンSN抗体を用いた場合では、腫瘍細胞の外側周辺領域で、強い染色を観察した。非悪性細胞では、抗体を用いた染色はより弱く、そして組織の粘膜表面上及び胃小窩の裏打ちのみに観察した。これにより、非悪性細胞では、シスタチンSNタンパク質は細胞から粘膜表面上へ配向するが、細胞外空間中へはしないことを実証した。従って、シスタチンSNタンパク質は非悪性組織よりも腫瘍組織においてより高い量で産生しているのみならず、非悪性組織により産生するタンパク質とは異なり、腫瘍のシスタチンSNは組織の脈管構造と直接接触する。これらの観察を広げるため、シスタチンSNを胃ガン細胞株、AGSの上清からモノクローナル抗体(R&D Systems; cat#MAB1285)を用いて免疫沈降させた(図16)。多量のシスタチンSNを上清中に検出し、このタンパク質が胃上皮細胞により産生され、そして分泌することを確認した。
【0142】
実施例6:血清中の腫瘍マーカーの分析
迅速なスクリーニングに有用なマーカーとしては、マーカーが血清中に検出に充分なレベルで存在することが望ましい。図8に記載したあるタンパク質は、血液中へ検出可能なレベルで胃ガンから分泌しているであろう。胃の腫瘍から血液中へ検出可能なレベルで分泌すると分かったマーカーは、TIMP1である。しかし、タンパク質が粘膜表面以外の細胞表面のいずれかから分泌又は脱落しているのなら、腸液と接触するであろう。そこから、直接血液の供給中へ毛細血管を通して、又はリンパ系を介して通過することができる。このように、いかなる脱落GTMであっても血液中に存在するであろう。オステオポンチン、サイログロブリン並びにMMPのメンバー及びカリクレインのファミリーは、以前に患者の血清中に上皮ガンの範囲で上昇すると記載されているが、胃ガンについては記載されていない。これらの所見は、本研究におけるマーカーについての選択基準、すなわち腫瘍組織での分泌タンパク質の過剰発現ではあるが、非悪性組織ではない過剰発現を、血清中のマーカーを検出するために有効に用いることができ、そしてそれにより組織又は臓器の生検がなくとも、実質的に臨床で使用できることを示唆する。
【0143】
図15からは、血清SPARCが、血液細胞が産生するSPARCより低い分子量を有する腫瘍SPARCで、異なる分子量を有すること(ウェスタンブロットにおいて本明細書に表わした)は明らかである。このように、SPARCが腫瘍及び非腫瘍血液細胞により産生されるにしても、腫瘍SPARCの存在を、分子量を用いて、例えばウェスタン分析を用いて決定するように、又は腫瘍細胞が産生するグリコシル化タンパク質に特異的な抗体を用いて決定することができる。
【0144】
別の研究では、我々は胃ガン細胞株であるAGSの上清中にシスタチンSNを検出した。図16は、培地単独又は培養AGS細胞株からの上清のウェスタンブロット分析を表わす。図16の右側レーンは、シスタチンSNタンパク質に相当する濃いバンドを示す。
【0145】
このように、我々は図10から、本発明のGTMが、症状進行の早期、中期又は末期ステージでの胃ガン診断に適切であると結論づけた。
【0146】
あるマーカーはグリコシル化しているとはいえ、グリコシル化パターンのバリエーションは、ある状況では、通常のグリコシル化パターンを欠いたGTM形態の検出ミスに至る。このように、本発明のある実施態様では、GTM免疫原として、脱グリコシル化GTM又は脱グリコシル化GTMフラグメントを挙げることができる。脱グリコシル化は、当該技術分野で既知の1以上のグリコシダーゼを用いて成すとよい。あるいはGTM cDNAを、E.coliなどの原核細胞株といったグリコシル化を欠く細胞株で発現させ、それにより非グリコシル化タンパク質又はペプチドを産生していてもよい。グリコシル化のレベル及び質は、糖側鎖についての本質的な前駆体の存在に敏感であることも解されるであろう。このように、本質的な糖がない場合は、「正常な」グリコシル化が起こらず、むしろより短いか、又は側鎖が欠失した糖が見いだされるであろう。このような「グリコシル化変異体」を免疫原として用いて、マーカー遺伝子の異なるタイプに特異的な抗体を産生することができる。
【0147】
さらに、あるGTMは、ホモ若しくはヘテロの二量体、又は多量体型の他のタイプを形成するかもしれない。例えば、インヒビンベータAは47kDaであり、97kDa分子量のホモ二量体(アクチビンA)、及び45kDaタンパク質インヒビンベータBとの92kDaのヘテロ二量体(ヘテロ二量体はアクチビンABとして既知である)を形成することができる。このように、分子量を提供するウェスタン分析又は他のタイプのアッセイは、GTMの一量体型の検出のみに限る必要のないと、解されるであろう。むしろ、分子量に関わらず、GTMのいずれの型でも検出できることが、容易に解されるであろう。このように、GTMの多量体型の検出を用いて、胃ガンの存在を診断することが容易にできる。さらに、胃の腫瘍(広範性又は胃腸管性)のステージ(1〜4)又はタイプに選択的なこれらのGTMについては、多量体型の検出が、胃ガンのステージ又はタイプを評価するのに適切な標的を提供することができる。
【0148】
一旦GTMに対する抗体又は抗血清を産生すると、このような抗体調製を種々の方法に用いることができる。まず、酵素結合免疫吸着検定(ELISA)又は放射免疫測定法(RIA)を用いて、GTMタンパク質又はペプチドを定量することができる。免疫検出は、組織試料において免疫組織化学を用いて成すことができる。これらの方法は当該技術分野において全て既知であり、そして本明細書中にさらに記載する必要はない。
【0149】
実施例7:GTMオリゴヌクレオチドを含むベクター
本発明の他の実施態様には、マーカー遺伝子又はその部分(「マーカーペプチド」)又はマーカー遺伝子産物のin vitro発現に有用なベクターが含まれる。例えば、本明細書中のGTMをコードするためのオリゴヌクレオチドを有するベクターを作製するとよい。多くのこのようなベクターは、当該技術分野で既知の標準的なベクターに基づくとよい。本発明はまた、種々の細胞株にトランスフェクションして、GTM産生細胞株を調製するために用いることができるベクターを含み、これを用いて所望とする量のGTMを、GTM検出のための特異的抗体又は他の試薬の開発のために、又はGTMのために開発したアッセイの標準化のために産生することができる。
【0150】
このようなベクターを製造するためには、全オープンリーディングフレーム又は発現させるタンパク質の部分をコードしているこのようなオープンリーディングフレームの部分を含むオリゴヌクレオチドを、オリゴヌクレオチド配列に動作可能に連結したプロモーター領域、1以上のエンハンサー領域を、開始コドン、オープンリーディングフレーム及び終結コドンとともに含むベクター中に挿入するとよいと、解される。発現ベクターを産生する方法は当該技術分野で既知であり、本明細書で反復する必要はない。
【0151】
1以上の選択可能なマーカーを発現ベクターに挿入して、目的の発現ベクターを含むように選択した細胞株を拡張させることができるとも、解されるであろう。さらに、当該技術分野で既知のリーダー配列を、インフレームで、発現細胞におけるタンパク質又はタンパク質フラグメントの直接分泌、内部貯蔵又は膜に入れるため、挿入してもよい。
【0152】
実施例8:GTM含有ベクターでトランスフェクションした細胞
なおもさらなる実施態様では、GTM、GTMフラグメント又はペプチドマーカーを発現することができる細胞が提供される。原核及び真核細胞共に、このように用いることができる。例えば、E.coli(原核細胞)を用いて、多量の成熟グリコシル化を欠いたGTMを産生することができる(特定のGTMが通常はグリコシル化されている場合)。COS細胞、293細胞及び種々の他の真核細胞を用いて、グリコシル化したか、又は適切な折りたたみを有し、それによりGTMタンパク質の天然型の3次元構造を有するGTMを産生してもよい。このような細胞をトランスフェクションする方法は当該技術分野で既知であり、さらに本明細書中に記載する必要はない。
【0153】
実施例9:キット
本発明の発見に基づき、検査キットのいくつかのタイプを作ってもよい。まずは、キットを検出分子(又は「捕獲試薬」)でプレロードされた検出装置を有するように作製するとよい。GTM mRNAを検出するための実施態様では、このような装置は、検出するmRNAとハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを捕獲試薬として有する基材(例えば、ガラス、シリコン、石英、金属など)を含むとよい。いくつかの実施態様では、mRNAの直接検出を、基材上のオリゴヌクレオチドへmRNA(cy3、cy5での標識、放射標識又は他の標識)をハイブリダイズさせることにより成すとよい。他の実施態様では、mRNAの検出は、まずは所望とするmRNAに相補的なDNA(cDNA)を作製することにより成すとよい。次に、標識したcDNAを基材上のオリゴヌクレオチドにハイブリダイズさせ、そして検出するとよい。
【0154】
採用する検出方法に関わらず、検査するGTM発現の、標準的な発現基準との比較が望ましい。例えば、RNA発現を全細胞DNA、構成的に発現するRNA(例えば、リボソームRNA)又は他の相対的な一定のマーカーの発現に標準化するとよい。
【0155】
抗体を、捕獲試薬としてキットに用いることもできる。いくつかの実施態様では、基材(例えば、マルチウェルプレート)は、そこへ付着した特異的なGTM捕獲試薬を有するとよい。いくつかの実施態様では、キットがブロッキング試薬を含んで有していてもよい。ブロッキング試薬は、非特異的な結合を低減するために用いるとよい。例えば、非特異的なオリゴヌクレオチド結合は、サケ精子DNAなどの、GTMオリゴヌクレオチドを含まない、好都合ないずれかの供給源からの過剰のDNAを用いて低減することができる。非特異的な抗体結合は、血清アルブミンなどの過剰のブロッキングタンパク質を用いて低減してもよい。オリゴヌクレオチド及びタンパク質を検出する多数の方法が、当該技術分野では既知であり、そして特異的にGTM関連分子を検出することができるいかなるストラテジーを用いてもよく、本発明の範囲内にあることが解されるであろう。
【0156】
抗体検出の際に頼る実施態様では、GTMタンパク質又はペプチドを細胞ごとを基礎に、全細胞、組織又は液体のタンパク質、液体容量、組織塊(重量)を基礎に発現させるとよい。さらに、血清中のGTMはアルブミンなどの相対的に高く豊富な血清タンパク質を基礎に発現させるとよい。
【0157】
基材に加えて、検査キットは、捕獲試薬(プローブなど)、洗浄溶液(例えば、SSC、他の塩、緩衝液、界面活性剤など)だけでなく、検出部分(例えば、cy3、cy5、放射標識など)を含んでよい。キットは、使用のための指令及びパッケージを含んでもよい。
【0158】
本発明をその特異的な実施態様を参照して記載したとはいえ、開示したマーカーの使用に関する他の実施態様を、本発明の範囲から逸脱するこなく用いることができると、解されるであろう。
【産業上の利用可能性】
【0159】
GTMファミリーのメンバーを検出する方法としては、マイクロアレイ及び/又はリアルタイムPCR法を用いた核酸検出、並びにタンパク質及びペプチドの検出が挙げられる。本発明の組成物及び方法は、症状の診断装置及びキット、診断、治療効果を高めることにおいて、そして生物試料中のGTMファミリーのメンバーの発現を測定するのに適切な試薬を製造するために、有用である。
【技術分野】
【0001】
関連出願
本出願は、米国特許法119条の優先権を、2003年7月17日に出願され、発明の名称が「胃ガンの検出用マーカー」であり、発明者としてParry John Guilfordが挙げられた、米国暫定特許出願第60/487,906号に主張する。
【0002】
背景技術
本発明は、ガンの検出に関する。特には、本発明はガン検出用の遺伝子及び/又はタンパク質マーカーの使用に関し、そしてより特には、胃ガン検出用の遺伝子及び/又はタンパク質のマーカーの使用に関する。
【0003】
技術背景
ガン患者の生存は、ガンがいつ検出され、そして早期に治療されるかにより大きく高まる。胃ガンの場合は、早期のステージの症状であると診断された患者は、進行した症状であると診断された患者が約10%の5年生存率であるのに比較して、90%の5年生存率を有する。しかし、胃ガン患者の大多数が、現在進行した症状にある。従って、開発が胃ガンの早期診断に至れば、患者にとっては予後が改善されうる。
【0004】
体液、例えば血液、尿、腹腔洗浄液や大便抽出物を含む生物試料中の、特異的なガン関連マーカーの同定により、早期治療及び予後の改善に至る、早期ガン診断に有効なアプローチを提供することができる。特異的なガンマーカーはまた、症状の進行をモニターする手段も提供し、外科的、放射線療法及び化学療法での治療の有効性を追跡するのを可能とする。しかし、多数の主要なガンにとって、入手可能なマーカーは感受性及び特異性が不充分である。例えば、最も頻繁に用いられる胃ガン用マーカー、ca19〜9、ca72〜4及び絨毛胚性抗原(CEA)は、全てのステージの胃腫瘍の約15〜50%を検出するのみであり、早期ステージの症状については約2〜11%に低下する。このように、患者や保健の開業医に症状はないと信じさせることとなる偽陰性の検査が非常に高頻度にあり、実際、患者が即時の注意を必要とする重篤なガンを有していることもある。さらに、これらのマーカーは、良性の胃の症状が影響する個体の1/3にまで、偽陽性シグナルを与えることもある。
【0005】
発明の要約
このように、ガンの存在を検出するためのよりよい方法が即時に必要である。本発明の観点では、早期ステージのガンの検出を提供し、そして偽陽性及び偽陰性の検査結果の頻度を減少できる方法、組成物及び装置を提供する。
【0006】
ある実施態様では、分子分析を用いて、非悪性の胃組織に比較して、胃の腫瘍組織で過剰発現している遺伝子を同定することができる。このような分析には、マイクロアレイや定量ポリメラーゼ連鎖反応(qPCR)法が挙げられる。これらの遺伝子をコード化したガン遺伝子及びタンパク質を、本明細書においては胃の腫瘍マーカー(GTM)と呼ぶ。用語GTMは、マーカーが胃の腫瘍のみに特異的であるであることを要するものではないと解されるであろう。むしろ、GTMの発現は、悪性又は非悪性の腫瘍、例えば、特に胃、膀胱、大腸、膵臓、卵巣、皮膚(例えば、メラノーマ)、肝臓、食道、子宮体及び脳のガン、その他といった、他の腫瘍タイプで増大してもよい。しかし、用語GTMは、従来技術のマーカー、ca19〜9、ca72〜4及びCEAを含まないものと、解するべきである。いくつかのGTMは、高度な信頼性で胃ガンを診断するのに足る過剰発現をしており、そして他の場合には、2以上のGTMの過剰発現により、胃ガンの信頼できる診断を提供することができる。
【0007】
ある実施態様では、マイクロアレイ法を用いて、ガンに関する1以上の遺伝子の過剰発現のパターンを検出することができる。
【0008】
他の実施態様では、定量ポリメラーゼ連鎖反応(qPCR)を用いて、腫瘍又は他の生物試料中に過剰発現したマーカーの存在を同定することができる。
【0009】
本明細書中に開示するGTM検出のいくつかの実施態様は、腫瘍細胞中での高い選択的様式での過剰発現であり、(そして仮にあったとしても、非腫瘍細胞では、ほとんどないが)唯一に過剰発現したGTMの測定によりガンに敏感で、かつ正確な検出を可能にする。他の実施態様では、2、3又はそれ以上のGTMの過剰発現を試料中に検出してもよく、またより確かな診断を提供することができる。
【0010】
タンパク質をコード化する選択遺伝子は、細胞により分泌していてもよく、あるいは細胞から貫いていてもよい。これらのタンパク質は、単独又は互いの組合せのいずれかで、胃ガン診断用の血清又は体液マーカーとして、又は確定した症状の進行をモニターするマーカーとして、有用である。タンパク質マーカーの検出は、当該技術分野で既知の方法を用いて実施することができ、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗血清などの使用が挙げられる。
【図面の簡単な説明】
【0011】
本発明を、その特異的な実施態様を参照して、そして図面を参照して説明するが、図中:
【図1】図1は、本発明の胃ガン用マーカー及びマーカーのオリゴヌクレオチド配列の表を示す。
【図2】図2は、マイクロアレイ法を用いて実施した研究で得られた結果の表を示す。
【図3】図3は、定量PCRを用いて実施した研究で得られた結果の表を示す。
【図4a】図4a〜dは、アレイ及びqPCR法を用いて得られたlog2倍の結果間の関係を示し、図中データは、4つの胃ガンマーカーについて中央値の正常を中心とする。灰色の四角は、非悪性(「正常」)試料に対応し、そして黒色の三角は、腫瘍試料に対応する。図4a:ASPN。図4b:SPP1。図4c:SPARC。図4d:MMP12。
【図4b】図4a〜dは、アレイ及びqPCR法を用いて得られたlog2倍の結果間の関係を示し、図中データは、4つの胃ガンマーカーについて中央値の正常を中心とする。灰色の四角は、非悪性(「正常」)試料に対応し、そして黒色の三角は、腫瘍試料に対応する。図4a:ASPN。図4b:SPP1。図4c:SPARC。図4d:MMP12。
【図4c】図4a〜dは、アレイ及びqPCR法を用いて得られたlog2倍の結果間の関係を示し、図中データは、4つの胃ガンマーカーについて中央値の正常を中心とする。灰色の四角は、非悪性(「正常」)試料に対応し、そして黒色の三角は、腫瘍試料に対応する。図4a:ASPN。図4b:SPP1。図4c:SPARC。図4d:MMP12。
【図4d】図4a〜dは、アレイ及びqPCR法を用いて得られたlog2倍の結果間の関係を示し、図中データは、4つの胃ガンマーカーについて中央値の正常を中心とする。灰色の四角は、非悪性(「正常」)試料に対応し、そして黒色の三角は、腫瘍試料に対応する。図4a:ASPN。図4b:SPP1。図4c:SPARC。図4d:MMP12。
【図5a】図5a〜5wは、種々の腫瘍マーカーの定量PCR研究から得られた相対頻度対log2倍変化のデータを示すヒストグラムを表わす。図5a:ASPN;図5b:CST1、2及び4;図5c:CSPG2;図5d:IGFBP7;図5e:INHBA;図5f:LOXL2;図5g:LUM;図5h:SFRP4;図5i:SPARC;図5j:SPP1;図5k:THBS2;図5l:TIMP1;図5m:アドリカン;図5n:PRS11;図5o:ASAH1;図5p:SFRP2;図5q:GGH;図5r:MMP12;図5s:KLK10;図5t:LEPRE1;図5u:TG;図5v:EFEMP2及び図5w:TGFBI。
【図5b】図5a〜5wは、種々の腫瘍マーカーの定量PCR研究から得られた相対頻度対log2倍変化のデータを示すヒストグラムを表わす。図5a:ASPN;図5b:CST1、2及び4;図5c:CSPG2;図5d:IGFBP7;図5e:INHBA;図5f:LOXL2;図5g:LUM;図5h:SFRP4;図5i:SPARC;図5j:SPP1;図5k:THBS2;図5l:TIMP1;図5m:アドリカン;図5n:PRS11;図5o:ASAH1;図5p:SFRP2;図5q:GGH;図5r:MMP12;図5s:KLK10;図5t:LEPRE1;図5u:TG;図5v:EFEMP2及び図5w:TGFBI。
【図5c】図5a〜5wは、種々の腫瘍マーカーの定量PCR研究から得られた相対頻度対log2倍変化のデータを示すヒストグラムを表わす。図5a:ASPN;図5b:CST1、2及び4;図5c:CSPG2;図5d:IGFBP7;図5e:INHBA;図5f:LOXL2;図5g:LUM;図5h:SFRP4;図5i:SPARC;図5j:SPP1;図5k:THBS2;図5l:TIMP1;図5m:アドリカン;図5n:PRS11;図5o:ASAH1;図5p:SFRP2;図5q:GGH;図5r:MMP12;図5s:KLK10;図5t:LEPRE1;図5u:TG;図5v:EFEMP2及び図5w:TGFBI。
【図5d】図5a〜5wは、種々の腫瘍マーカーの定量PCR研究から得られた相対頻度対log2倍変化のデータを示すヒストグラムを表わす。図5a:ASPN;図5b:CST1、2及び4;図5c:CSPG2;図5d:IGFBP7;図5e:INHBA;図5f:LOXL2;図5g:LUM;図5h:SFRP4;図5i:SPARC;図5j:SPP1;図5k:THBS2;図5l:TIMP1;図5m:アドリカン;図5n:PRS11;図5o:ASAH1;図5p:SFRP2;図5q:GGH;図5r:MMP12;図5s:KLK10;図5t:LEPRE1;図5u:TG;図5v:EFEMP2及び図5w:TGFBI。
【図5e】図5a〜5wは、種々の腫瘍マーカーの定量PCR研究から得られた相対頻度対log2倍変化のデータを示すヒストグラムを表わす。図5a:ASPN;図5b:CST1、2及び4;図5c:CSPG2;図5d:IGFBP7;図5e:INHBA;図5f:LOXL2;図5g:LUM;図5h:SFRP4;図5i:SPARC;図5j:SPP1;図5k:THBS2;図5l:TIMP1;図5m:アドリカン;図5n:PRS11;図5o:ASAH1;図5p:SFRP2;図5q:GGH;図5r:MMP12;図5s:KLK10;図5t:LEPRE1;図5u:TG;図5v:EFEMP2及び図5w:TGFBI。
【図5f】図5a〜5wは、種々の腫瘍マーカーの定量PCR研究から得られた相対頻度対log2倍変化のデータを示すヒストグラムを表わす。図5a:ASPN;図5b:CST1、2及び4;図5c:CSPG2;図5d:IGFBP7;図5e:INHBA;図5f:LOXL2;図5g:LUM;図5h:SFRP4;図5i:SPARC;図5j:SPP1;図5k:THBS2;図5l:TIMP1;図5m:アドリカン;図5n:PRS11;図5o:ASAH1;図5p:SFRP2;図5q:GGH;図5r:MMP12;図5s:KLK10;図5t:LEPRE1;図5u:TG;図5v:EFEMP2及び図5w:TGFBI。
【図5g】図5a〜5wは、種々の腫瘍マーカーの定量PCR研究から得られた相対頻度対log2倍変化のデータを示すヒストグラムを表わす。図5a:ASPN;図5b:CST1、2及び4;図5c:CSPG2;図5d:IGFBP7;図5e:INHBA;図5f:LOXL2;図5g:LUM;図5h:SFRP4;図5i:SPARC;図5j:SPP1;図5k:THBS2;図5l:TIMP1;図5m:アドリカン;図5n:PRS11;図5o:ASAH1;図5p:SFRP2;図5q:GGH;図5r:MMP12;図5s:KLK10;図5t:LEPRE1;図5u:TG;図5v:EFEMP2及び図5w:TGFBI。
【図5h】図5a〜5wは、種々の腫瘍マーカーの定量PCR研究から得られた相対頻度対log2倍変化のデータを示すヒストグラムを表わす。図5a:ASPN;図5b:CST1、2及び4;図5c:CSPG2;図5d:IGFBP7;図5e:INHBA;図5f:LOXL2;図5g:LUM;図5h:SFRP4;図5i:SPARC;図5j:SPP1;図5k:THBS2;図5l:TIMP1;図5m:アドリカン;図5n:PRS11;図5o:ASAH1;図5p:SFRP2;図5q:GGH;図5r:MMP12;図5s:KLK10;図5t:LEPRE1;図5u:TG;図5v:EFEMP2及び図5w:TGFBI。
【図5i】図5a〜5wは、種々の腫瘍マーカーの定量PCR研究から得られた相対頻度対log2倍変化のデータを示すヒストグラムを表わす。図5a:ASPN;図5b:CST1、2及び4;図5c:CSPG2;図5d:IGFBP7;図5e:INHBA;図5f:LOXL2;図5g:LUM;図5h:SFRP4;図5i:SPARC;図5j:SPP1;図5k:THBS2;図5l:TIMP1;図5m:アドリカン;図5n:PRS11;図5o:ASAH1;図5p:SFRP2;図5q:GGH;図5r:MMP12;図5s:KLK10;図5t:LEPRE1;図5u:TG;図5v:EFEMP2及び図5w:TGFBI。
【図5j】図5a〜5wは、種々の腫瘍マーカーの定量PCR研究から得られた相対頻度対log2倍変化のデータを示すヒストグラムを表わす。図5a:ASPN;図5b:CST1、2及び4;図5c:CSPG2;図5d:IGFBP7;図5e:INHBA;図5f:LOXL2;図5g:LUM;図5h:SFRP4;図5i:SPARC;図5j:SPP1;図5k:THBS2;図5l:TIMP1;図5m:アドリカン;図5n:PRS11;図5o:ASAH1;図5p:SFRP2;図5q:GGH;図5r:MMP12;図5s:KLK10;図5t:LEPRE1;図5u:TG;図5v:EFEMP2及び図5w:TGFBI。
【図5k】図5a〜5wは、種々の腫瘍マーカーの定量PCR研究から得られた相対頻度対log2倍変化のデータを示すヒストグラムを表わす。図5a:ASPN;図5b:CST1、2及び4;図5c:CSPG2;図5d:IGFBP7;図5e:INHBA;図5f:LOXL2;図5g:LUM;図5h:SFRP4;図5i:SPARC;図5j:SPP1;図5k:THBS2;図5l:TIMP1;図5m:アドリカン;図5n:PRS11;図5o:ASAH1;図5p:SFRP2;図5q:GGH;図5r:MMP12;図5s:KLK10;図5t:LEPRE1;図5u:TG;図5v:EFEMP2及び図5w:TGFBI。
【図5l】図5a〜5wは、種々の腫瘍マーカーの定量PCR研究から得られた相対頻度対log2倍変化のデータを示すヒストグラムを表わす。図5a:ASPN;図5b:CST1、2及び4;図5c:CSPG2;図5d:IGFBP7;図5e:INHBA;図5f:LOXL2;図5g:LUM;図5h:SFRP4;図5i:SPARC;図5j:SPP1;図5k:THBS2;図5l:TIMP1;図5m:アドリカン;図5n:PRS11;図5o:ASAH1;図5p:SFRP2;図5q:GGH;図5r:MMP12;図5s:KLK10;図5t:LEPRE1;図5u:TG;図5v:EFEMP2及び図5w:TGFBI。
【図5m】図5a〜5wは、種々の腫瘍マーカーの定量PCR研究から得られた相対頻度対log2倍変化のデータを示すヒストグラムを表わす。図5a:ASPN;図5b:CST1、2及び4;図5c:CSPG2;図5d:IGFBP7;図5e:INHBA;図5f:LOXL2;図5g:LUM;図5h:SFRP4;図5i:SPARC;図5j:SPP1;図5k:THBS2;図5l:TIMP1;図5m:アドリカン;図5n:PRS11;図5o:ASAH1;図5p:SFRP2;図5q:GGH;図5r:MMP12;図5s:KLK10;図5t:LEPRE1;図5u:TG;図5v:EFEMP2及び図5w:TGFBI。
【図5n】図5a〜5wは、種々の腫瘍マーカーの定量PCR研究から得られた相対頻度対log2倍変化のデータを示すヒストグラムを表わす。図5a:ASPN;図5b:CST1、2及び4;図5c:CSPG2;図5d:IGFBP7;図5e:INHBA;図5f:LOXL2;図5g:LUM;図5h:SFRP4;図5i:SPARC;図5j:SPP1;図5k:THBS2;図5l:TIMP1;図5m:アドリカン;図5n:PRS11;図5o:ASAH1;図5p:SFRP2;図5q:GGH;図5r:MMP12;図5s:KLK10;図5t:LEPRE1;図5u:TG;図5v:EFEMP2及び図5w:TGFBI。
【図5o】図5a〜5wは、種々の腫瘍マーカーの定量PCR研究から得られた相対頻度対log2倍変化のデータを示すヒストグラムを表わす。図5a:ASPN;図5b:CST1、2及び4;図5c:CSPG2;図5d:IGFBP7;図5e:INHBA;図5f:LOXL2;図5g:LUM;図5h:SFRP4;図5i:SPARC;図5j:SPP1;図5k:THBS2;図5l:TIMP1;図5m:アドリカン;図5n:PRS11;図5o:ASAH1;図5p:SFRP2;図5q:GGH;図5r:MMP12;図5s:KLK10;図5t:LEPRE1;図5u:TG;図5v:EFEMP2及び図5w:TGFBI。
【図5p】図5a〜5wは、種々の腫瘍マーカーの定量PCR研究から得られた相対頻度対log2倍変化のデータを示すヒストグラムを表わす。図5a:ASPN;図5b:CST1、2及び4;図5c:CSPG2;図5d:IGFBP7;図5e:INHBA;図5f:LOXL2;図5g:LUM;図5h:SFRP4;図5i:SPARC;図5j:SPP1;図5k:THBS2;図5l:TIMP1;図5m:アドリカン;図5n:PRS11;図5o:ASAH1;図5p:SFRP2;図5q:GGH;図5r:MMP12;図5s:KLK10;図5t:LEPRE1;図5u:TG;図5v:EFEMP2及び図5w:TGFBI。
【図5q】図5a〜5wは、種々の腫瘍マーカーの定量PCR研究から得られた相対頻度対log2倍変化のデータを示すヒストグラムを表わす。図5a:ASPN;図5b:CST1、2及び4;図5c:CSPG2;図5d:IGFBP7;図5e:INHBA;図5f:LOXL2;図5g:LUM;図5h:SFRP4;図5i:SPARC;図5j:SPP1;図5k:THBS2;図5l:TIMP1;図5m:アドリカン;図5n:PRS11;図5o:ASAH1;図5p:SFRP2;図5q:GGH;図5r:MMP12;図5s:KLK10;図5t:LEPRE1;図5u:TG;図5v:EFEMP2及び図5w:TGFBI。
【図5r】図5a〜5wは、種々の腫瘍マーカーの定量PCR研究から得られた相対頻度対log2倍変化のデータを示すヒストグラムを表わす。図5a:ASPN;図5b:CST1、2及び4;図5c:CSPG2;図5d:IGFBP7;図5e:INHBA;図5f:LOXL2;図5g:LUM;図5h:SFRP4;図5i:SPARC;図5j:SPP1;図5k:THBS2;図5l:TIMP1;図5m:アドリカン;図5n:PRS11;図5o:ASAH1;図5p:SFRP2;図5q:GGH;図5r:MMP12;図5s:KLK10;図5t:LEPRE1;図5u:TG;図5v:EFEMP2及び図5w:TGFBI。
【図5s】図5a〜5wは、種々の腫瘍マーカーの定量PCR研究から得られた相対頻度対log2倍変化のデータを示すヒストグラムを表わす。図5a:ASPN;図5b:CST1、2及び4;図5c:CSPG2;図5d:IGFBP7;図5e:INHBA;図5f:LOXL2;図5g:LUM;図5h:SFRP4;図5i:SPARC;図5j:SPP1;図5k:THBS2;図5l:TIMP1;図5m:アドリカン;図5n:PRS11;図5o:ASAH1;図5p:SFRP2;図5q:GGH;図5r:MMP12;図5s:KLK10;図5t:LEPRE1;図5u:TG;図5v:EFEMP2及び図5w:TGFBI。
【図5t】図5a〜5wは、種々の腫瘍マーカーの定量PCR研究から得られた相対頻度対log2倍変化のデータを示すヒストグラムを表わす。図5a:ASPN;図5b:CST1、2及び4;図5c:CSPG2;図5d:IGFBP7;図5e:INHBA;図5f:LOXL2;図5g:LUM;図5h:SFRP4;図5i:SPARC;図5j:SPP1;図5k:THBS2;図5l:TIMP1;図5m:アドリカン;図5n:PRS11;図5o:ASAH1;図5p:SFRP2;図5q:GGH;図5r:MMP12;図5s:KLK10;図5t:LEPRE1;図5u:TG;図5v:EFEMP2及び図5w:TGFBI。
【図5u】図5a〜5wは、種々の腫瘍マーカーの定量PCR研究から得られた相対頻度対log2倍変化のデータを示すヒストグラムを表わす。図5a:ASPN;図5b:CST1、2及び4;図5c:CSPG2;図5d:IGFBP7;図5e:INHBA;図5f:LOXL2;図5g:LUM;図5h:SFRP4;図5i:SPARC;図5j:SPP1;図5k:THBS2;図5l:TIMP1;図5m:アドリカン;図5n:PRS11;図5o:ASAH1;図5p:SFRP2;図5q:GGH;図5r:MMP12;図5s:KLK10;図5t:LEPRE1;図5u:TG;図5v:EFEMP2及び図5w:TGFBI。
【図5v】図5a〜5wは、種々の腫瘍マーカーの定量PCR研究から得られた相対頻度対log2倍変化のデータを示すヒストグラムを表わす。図5a:ASPN;図5b:CST1、2及び4;図5c:CSPG2;図5d:IGFBP7;図5e:INHBA;図5f:LOXL2;図5g:LUM;図5h:SFRP4;図5i:SPARC;図5j:SPP1;図5k:THBS2;図5l:TIMP1;図5m:アドリカン;図5n:PRS11;図5o:ASAH1;図5p:SFRP2;図5q:GGH;図5r:MMP12;図5s:KLK10;図5t:LEPRE1;図5u:TG;図5v:EFEMP2及び図5w:TGFBI。
【図5w】図5a〜5wは、種々の腫瘍マーカーの定量PCR研究から得られた相対頻度対log2倍変化のデータを示すヒストグラムを表わす。図5a:ASPN;図5b:CST1、2及び4;図5c:CSPG2;図5d:IGFBP7;図5e:INHBA;図5f:LOXL2;図5g:LUM;図5h:SFRP4;図5i:SPARC;図5j:SPP1;図5k:THBS2;図5l:TIMP1;図5m:アドリカン;図5n:PRS11;図5o:ASAH1;図5p:SFRP2;図5q:GGH;図5r:MMP12;図5s:KLK10;図5t:LEPRE1;図5u:TG;図5v:EFEMP2及び図5w:TGFBI。
【図6】図6は、中央値の正常発現の95パーセンタイル値(95th percentile)より高い発現を有するマーカーの数を示すヒストグラムである。結果は、qPCR基づき、腫瘍試料ごとに別々に示されている。
【図7a】図7a〜cは、腫瘍マーカーであるCEAについての遺伝子発現に比較した、個々の腫瘍試料及び非悪性試料中のマーカーの相対log2発現を示すグラフを表わす。CEAは、胃ガンの進行をモニターするために現在最も用いられる血清マーカーである。
【図7b】図7a〜cは、腫瘍マーカーであるCEAについての遺伝子発現に比較した、個々の腫瘍試料及び非悪性試料中のマーカーの相対log2発現を示すグラフを表わす。CEAは、胃ガンの進行をモニターするために現在最も用いられる血清マーカーである。
【図7c】図7a〜cは、腫瘍マーカーであるCEAについての遺伝子発現に比較した、個々の腫瘍試料及び非悪性試料中のマーカーの相対log2発現を示すグラフを表わす。CEAは、胃ガンの進行をモニターするために現在最も用いられる血清マーカーである。
【図8】図8は、図3を補足する表を示す。図8は、候補の腫瘍マーカーについてのqPCRにより決定される発現レベルを要約するが、対にしたデータを用いて(すなわち、同一個体の腫瘍(「T」)及び非悪性(「N」)試料)T:N比率を提供する。図8はまた、図3には含まれない追加のマーカー、すなわちMMP2、CGR11、TGFB1、PCSK5、SERPINB5、SERPINH1を含む。比較のため、確立した血清のマーカー遺伝子であるCEAXAM5(CEA)の発現レベルも示す。29個のマーカーのうち27個はCEA以上の中央値T:N差異(a median T:N difference)を有する。さらに、CEAに比較して、マーカーのうち29個/29個が、腫瘍試料中の発現が正常試料中の発現を超える対にした試料をより高いパーセンテージで有する。3個のマーカー、CST1、2、44、ASPN及びSFRP4は、対にした腫瘍と正常試料との間で100%の区別を示した。これらのマーカーの遺伝子配列、及びそれを検出するために用いたプライマー及びプローブの配置は本明細書中に示す。
【図9a】図9a〜dは、対にした試料を用いた、40人の患者における29個の胃ガンマーカーについてのそれぞれの、そして中央値T:Nの倍変化のデータを表わす。
【図9b】図9a〜dは、対にした試料を用いた、40人の患者における29個の胃ガンマーカーについてのそれぞれの、そして中央値T:Nの倍変化のデータを表わす。
【図9c】図9a〜dは、対にした試料を用いた、40人の患者における29個の胃ガンマーカーについてのそれぞれの、そして中央値T:Nの倍変化のデータを表わす。
【図9d】図9a〜dは、対にした試料を用いた、40人の患者における29個の胃ガンマーカーについてのそれぞれの、そして中央値T:Nの倍変化のデータを表わす。
【図10a】図10a〜1−adは、CEA及び本発明の他のGTMの発現における、腫瘍ステージとlog2倍変化のグラフを表わす。図10a:アドリカン;図10b:ASPN;図10c:CSPG2;図10d:CST1、2、4;図10e:EFEMP2;図10f:GGF;図10g:INHBA;図10h:IGFBP7;図10i:KLK10;図10j:LEPRE1;図10k:LUM;図10l:LOXL2;図10m:MMP12;図10n:TIMP1;図10o:ASAH1;図10p:SPP1;図10q:SFRP2;図10r:SFRP4;図10s:SPARC;図10t:PRSS11;図10u:THBS2;図10v:TG;図10w:TGFBI;図10x:CGR11;図10y:SERPINH1;図10z:MMP2;図10aa:PCSK5;図10ab:SERPINB5;図10ac:TGFB1及び図10ad:CEA(CEACAM5)。
【図10b】図10a〜1−adは、CEA及び本発明の他のGTMの発現における、腫瘍ステージとlog2倍変化のグラフを表わす。図10a:アドリカン;図10b:ASPN;図10c:CSPG2;図10d:CST1、2、4;図10e:EFEMP2;図10f:GGF;図10g:INHBA;図10h:IGFBP7;図10i:KLK10;図10j:LEPRE1;図10k:LUM;図10l:LOXL2;図10m:MMP12;図10n:TIMP1;図10o:ASAH1;図10p:SPP1;図10q:SFRP2;図10r:SFRP4;図10s:SPARC;図10t:PRSS11;図10u:THBS2;図10v:TG;図10w:TGFBI;図10x:CGR11;図10y:SERPINH1;図10z:MMP2;図10aa:PCSK5;図10ab:SERPINB5;図10ac:TGFB1及び図10ad:CEA(CEACAM5)。
【図10c】図10a〜1−adは、CEA及び本発明の他のGTMの発現における、腫瘍ステージとlog2倍変化のグラフを表わす。図10a:アドリカン;図10b:ASPN;図10c:CSPG2;図10d:CST1、2、4;図10e:EFEMP2;図10f:GGF;図10g:INHBA;図10h:IGFBP7;図10i:KLK10;図10j:LEPRE1;図10k:LUM;図10l:LOXL2;図10m:MMP12;図10n:TIMP1;図10o:ASAH1;図10p:SPP1;図10q:SFRP2;図10r:SFRP4;図10s:SPARC;図10t:PRSS11;図10u:THBS2;図10v:TG;図10w:TGFBI;図10x:CGR11;図10y:SERPINH1;図10z:MMP2;図10aa:PCSK5;図10ab:SERPINB5;図10ac:TGFB1及び図10ad:CEA(CEACAM5)。
【図10d】図10a〜1−adは、CEA及び本発明の他のGTMの発現における、腫瘍ステージとlog2倍変化のグラフを表わす。図10a:アドリカン;図10b:ASPN;図10c:CSPG2;図10d:CST1、2、4;図10e:EFEMP2;図10f:GGF;図10g:INHBA;図10h:IGFBP7;図10i:KLK10;図10j:LEPRE1;図10k:LUM;図10l:LOXL2;図10m:MMP12;図10n:TIMP1;図10o:ASAH1;図10p:SPP1;図10q:SFRP2;図10r:SFRP4;図10s:SPARC;図10t:PRSS11;図10u:THBS2;図10v:TG;図10w:TGFBI;図10x:CGR11;図10y:SERPINH1;図10z:MMP2;図10aa:PCSK5;図10ab:SERPINB5;図10ac:TGFB1及び図10ad:CEA(CEACAM5)。
【図10e】図10a〜1−adは、CEA及び本発明の他のGTMの発現における、腫瘍ステージとlog2倍変化のグラフを表わす。図10a:アドリカン;図10b:ASPN;図10c:CSPG2;図10d:CST1、2、4;図10e:EFEMP2;図10f:GGF;図10g:INHBA;図10h:IGFBP7;図10i:KLK10;図10j:LEPRE1;図10k:LUM;図10l:LOXL2;図10m:MMP12;図10n:TIMP1;図10o:ASAH1;図10p:SPP1;図10q:SFRP2;図10r:SFRP4;図10s:SPARC;図10t:PRSS11;図10u:THBS2;図10v:TG;図10w:TGFBI;図10x:CGR11;図10y:SERPINH1;図10z:MMP2;図10aa:PCSK5;図10ab:SERPINB5;図10ac:TGFB1及び図10ad:CEA(CEACAM5)。
【図10f】図10a〜1−adは、CEA及び本発明の他のGTMの発現における、腫瘍ステージとlog2倍変化のグラフを表わす。図10a:アドリカン;図10b:ASPN;図10c:CSPG2;図10d:CST1、2、4;図10e:EFEMP2;図10f:GGF;図10g:INHBA;図10h:IGFBP7;図10i:KLK10;図10j:LEPRE1;図10k:LUM;図10l:LOXL2;図10m:MMP12;図10n:TIMP1;図10o:ASAH1;図10p:SPP1;図10q:SFRP2;図10r:SFRP4;図10s:SPARC;図10t:PRSS11;図10u:THBS2;図10v:TG;図10w:TGFBI;図10x:CGR11;図10y:SERPINH1;図10z:MMP2;図10aa:PCSK5;図10ab:SERPINB5;図10ac:TGFB1及び図10ad:CEA(CEACAM5)。
【図10g】図10a〜1−adは、CEA及び本発明の他のGTMの発現における、腫瘍ステージとlog2倍変化のグラフを表わす。図10a:アドリカン;図10b:ASPN;図10c:CSPG2;図10d:CST1、2、4;図10e:EFEMP2;図10f:GGF;図10g:INHBA;図10h:IGFBP7;図10i:KLK10;図10j:LEPRE1;図10k:LUM;図10l:LOXL2;図10m:MMP12;図10n:TIMP1;図10o:ASAH1;図10p:SPP1;図10q:SFRP2;図10r:SFRP4;図10s:SPARC;図10t:PRSS11;図10u:THBS2;図10v:TG;図10w:TGFBI;図10x:CGR11;図10y:SERPINH1;図10z:MMP2;図10aa:PCSK5;図10ab:SERPINB5;図10ac:TGFB1及び図10ad:CEA(CEACAM5)。
【図10h】図10a〜1−adは、CEA及び本発明の他のGTMの発現における、腫瘍ステージとlog2倍変化のグラフを表わす。図10a:アドリカン;図10b:ASPN;図10c:CSPG2;図10d:CST1、2、4;図10e:EFEMP2;図10f:GGF;図10g:INHBA;図10h:IGFBP7;図10i:KLK10;図10j:LEPRE1;図10k:LUM;図10l:LOXL2;図10m:MMP12;図10n:TIMP1;図10o:ASAH1;図10p:SPP1;図10q:SFRP2;図10r:SFRP4;図10s:SPARC;図10t:PRSS11;図10u:THBS2;図10v:TG;図10w:TGFBI;図10x:CGR11;図10y:SERPINH1;図10z:MMP2;図10aa:PCSK5;図10ab:SERPINB5;図10ac:TGFB1及び図10ad:CEA(CEACAM5)。
【図10i】図10a〜1−adは、CEA及び本発明の他のGTMの発現における、腫瘍ステージとlog2倍変化のグラフを表わす。図10a:アドリカン;図10b:ASPN;図10c:CSPG2;図10d:CST1、2、4;図10e:EFEMP2;図10f:GGF;図10g:INHBA;図10h:IGFBP7;図10i:KLK10;図10j:LEPRE1;図10k:LUM;図10l:LOXL2;図10m:MMP12;図10n:TIMP1;図10o:ASAH1;図10p:SPP1;図10q:SFRP2;図10r:SFRP4;図10s:SPARC;図10t:PRSS11;図10u:THBS2;図10v:TG;図10w:TGFBI;図10x:CGR11;図10y:SERPINH1;図10z:MMP2;図10aa:PCSK5;図10ab:SERPINB5;図10ac:TGFB1及び図10ad:CEA(CEACAM5)。
【図10j】図10a〜1−adは、CEA及び本発明の他のGTMの発現における、腫瘍ステージとlog2倍変化のグラフを表わす。図10a:アドリカン;図10b:ASPN;図10c:CSPG2;図10d:CST1、2、4;図10e:EFEMP2;図10f:GGF;図10g:INHBA;図10h:IGFBP7;図10i:KLK10;図10j:LEPRE1;図10k:LUM;図10l:LOXL2;図10m:MMP12;図10n:TIMP1;図10o:ASAH1;図10p:SPP1;図10q:SFRP2;図10r:SFRP4;図10s:SPARC;図10t:PRSS11;図10u:THBS2;図10v:TG;図10w:TGFBI;図10x:CGR11;図10y:SERPINH1;図10z:MMP2;図10aa:PCSK5;図10ab:SERPINB5;図10ac:TGFB1及び図10ad:CEA(CEACAM5)。
【図10k】図10a〜1−adは、CEA及び本発明の他のGTMの発現における、腫瘍ステージとlog2倍変化のグラフを表わす。図10a:アドリカン;図10b:ASPN;図10c:CSPG2;図10d:CST1、2、4;図10e:EFEMP2;図10f:GGF;図10g:INHBA;図10h:IGFBP7;図10i:KLK10;図10j:LEPRE1;図10k:LUM;図10l:LOXL2;図10m:MMP12;図10n:TIMP1;図10o:ASAH1;図10p:SPP1;図10q:SFRP2;図10r:SFRP4;図10s:SPARC;図10t:PRSS11;図10u:THBS2;図10v:TG;図10w:TGFBI;図10x:CGR11;図10y:SERPINH1;図10z:MMP2;図10aa:PCSK5;図10ab:SERPINB5;図10ac:TGFB1及び図10ad:CEA(CEACAM5)。
【図10l】図10a〜1−adは、CEA及び本発明の他のGTMの発現における、腫瘍ステージとlog2倍変化のグラフを表わす。図10a:アドリカン;図10b:ASPN;図10c:CSPG2;図10d:CST1、2、4;図10e:EFEMP2;図10f:GGF;図10g:INHBA;図10h:IGFBP7;図10i:KLK10;図10j:LEPRE1;図10k:LUM;図10l:LOXL2;図10m:MMP12;図10n:TIMP1;図10o:ASAH1;図10p:SPP1;図10q:SFRP2;図10r:SFRP4;図10s:SPARC;図10t:PRSS11;図10u:THBS2;図10v:TG;図10w:TGFBI;図10x:CGR11;図10y:SERPINH1;図10z:MMP2;図10aa:PCSK5;図10ab:SERPINB5;図10ac:TGFB1及び図10ad:CEA(CEACAM5)。
【図10m】図10a〜1−adは、CEA及び本発明の他のGTMの発現における、腫瘍ステージとlog2倍変化のグラフを表わす。図10a:アドリカン;図10b:ASPN;図10c:CSPG2;図10d:CST1、2、4;図10e:EFEMP2;図10f:GGF;図10g:INHBA;図10h:IGFBP7;図10i:KLK10;図10j:LEPRE1;図10k:LUM;図10l:LOXL2;図10m:MMP12;図10n:TIMP1;図10o:ASAH1;図10p:SPP1;図10q:SFRP2;図10r:SFRP4;図10s:SPARC;図10t:PRSS11;図10u:THBS2;図10v:TG;図10w:TGFBI;図10x:CGR11;図10y:SERPINH1;図10z:MMP2;図10aa:PCSK5;図10ab:SERPINB5;図10ac:TGFB1及び図10ad:CEA(CEACAM5)。
【図10n】図10a〜1−adは、CEA及び本発明の他のGTMの発現における、腫瘍ステージとlog2倍変化のグラフを表わす。図10a:アドリカン;図10b:ASPN;図10c:CSPG2;図10d:CST1、2、4;図10e:EFEMP2;図10f:GGF;図10g:INHBA;図10h:IGFBP7;図10i:KLK10;図10j:LEPRE1;図10k:LUM;図10l:LOXL2;図10m:MMP12;図10n:TIMP1;図10o:ASAH1;図10p:SPP1;図10q:SFRP2;図10r:SFRP4;図10s:SPARC;図10t:PRSS11;図10u:THBS2;図10v:TG;図10w:TGFBI;図10x:CGR11;図10y:SERPINH1;図10z:MMP2;図10aa:PCSK5;図10ab:SERPINB5;図10ac:TGFB1及び図10ad:CEA(CEACAM5)。
【図10o】図10a〜1−adは、CEA及び本発明の他のGTMの発現における、腫瘍ステージとlog2倍変化のグラフを表わす。図10a:アドリカン;図10b:ASPN;図10c:CSPG2;図10d:CST1、2、4;図10e:EFEMP2;図10f:GGF;図10g:INHBA;図10h:IGFBP7;図10i:KLK10;図10j:LEPRE1;図10k:LUM;図10l:LOXL2;図10m:MMP12;図10n:TIMP1;図10o:ASAH1;図10p:SPP1;図10q:SFRP2;図10r:SFRP4;図10s:SPARC;図10t:PRSS11;図10u:THBS2;図10v:TG;図10w:TGFBI;図10x:CGR11;図10y:SERPINH1;図10z:MMP2;図10aa:PCSK5;図10ab:SERPINB5;図10ac:TGFB1及び図10ad:CEA(CEACAM5)。
【図10p】図10a〜1−adは、CEA及び本発明の他のGTMの発現における、腫瘍ステージとlog2倍変化のグラフを表わす。図10a:アドリカン;図10b:ASPN;図10c:CSPG2;図10d:CST1、2、4;図10e:EFEMP2;図10f:GGF;図10g:INHBA;図10h:IGFBP7;図10i:KLK10;図10j:LEPRE1;図10k:LUM;図10l:LOXL2;図10m:MMP12;図10n:TIMP1;図10o:ASAH1;図10p:SPP1;図10q:SFRP2;図10r:SFRP4;図10s:SPARC;図10t:PRSS11;図10u:THBS2;図10v:TG;図10w:TGFBI;図10x:CGR11;図10y:SERPINH1;図10z:MMP2;図10aa:PCSK5;図10ab:SERPINB5;図10ac:TGFB1及び図10ad:CEA(CEACAM5)。
【図10q】図10a〜1−adは、CEA及び本発明の他のGTMの発現における、腫瘍ステージとlog2倍変化のグラフを表わす。図10a:アドリカン;図10b:ASPN;図10c:CSPG2;図10d:CST1、2、4;図10e:EFEMP2;図10f:GGF;図10g:INHBA;図10h:IGFBP7;図10i:KLK10;図10j:LEPRE1;図10k:LUM;図10l:LOXL2;図10m:MMP12;図10n:TIMP1;図10o:ASAH1;図10p:SPP1;図10q:SFRP2;図10r:SFRP4;図10s:SPARC;図10t:PRSS11;図10u:THBS2;図10v:TG;図10w:TGFBI;図10x:CGR11;図10y:SERPINH1;図10z:MMP2;図10aa:PCSK5;図10ab:SERPINB5;図10ac:TGFB1及び図10ad:CEA(CEACAM5)。
【図10r】図10a〜1−adは、CEA及び本発明の他のGTMの発現における、腫瘍ステージとlog2倍変化のグラフを表わす。図10a:アドリカン;図10b:ASPN;図10c:CSPG2;図10d:CST1、2、4;図10e:EFEMP2;図10f:GGF;図10g:INHBA;図10h:IGFBP7;図10i:KLK10;図10j:LEPRE1;図10k:LUM;図10l:LOXL2;図10m:MMP12;図10n:TIMP1;図10o:ASAH1;図10p:SPP1;図10q:SFRP2;図10r:SFRP4;図10s:SPARC;図10t:PRSS11;図10u:THBS2;図10v:TG;図10w:TGFBI;図10x:CGR11;図10y:SERPINH1;図10z:MMP2;図10aa:PCSK5;図10ab:SERPINB5;図10ac:TGFB1及び図10ad:CEA(CEACAM5)。
【図10s】図10a〜1−adは、CEA及び本発明の他のGTMの発現における、腫瘍ステージとlog2倍変化のグラフを表わす。図10a:アドリカン;図10b:ASPN;図10c:CSPG2;図10d:CST1、2、4;図10e:EFEMP2;図10f:GGF;図10g:INHBA;図10h:IGFBP7;図10i:KLK10;図10j:LEPRE1;図10k:LUM;図10l:LOXL2;図10m:MMP12;図10n:TIMP1;図10o:ASAH1;図10p:SPP1;図10q:SFRP2;図10r:SFRP4;図10s:SPARC;図10t:PRSS11;図10u:THBS2;図10v:TG;図10w:TGFBI;図10x:CGR11;図10y:SERPINH1;図10z:MMP2;図10aa:PCSK5;図10ab:SERPINB5;図10ac:TGFB1及び図10ad:CEA(CEACAM5)。
【図10t】図10a〜1−adは、CEA及び本発明の他のGTMの発現における、腫瘍ステージとlog2倍変化のグラフを表わす。図10a:アドリカン;図10b:ASPN;図10c:CSPG2;図10d:CST1、2、4;図10e:EFEMP2;図10f:GGF;図10g:INHBA;図10h:IGFBP7;図10i:KLK10;図10j:LEPRE1;図10k:LUM;図10l:LOXL2;図10m:MMP12;図10n:TIMP1;図10o:ASAH1;図10p:SPP1;図10q:SFRP2;図10r:SFRP4;図10s:SPARC;図10t:PRSS11;図10u:THBS2;図10v:TG;図10w:TGFBI;図10x:CGR11;図10y:SERPINH1;図10z:MMP2;図10aa:PCSK5;図10ab:SERPINB5;図10ac:TGFB1及び図10ad:CEA(CEACAM5)。
【図10u】図10a〜1−adは、CEA及び本発明の他のGTMの発現における、腫瘍ステージとlog2倍変化のグラフを表わす。図10a:アドリカン;図10b:ASPN;図10c:CSPG2;図10d:CST1、2、4;図10e:EFEMP2;図10f:GGF;図10g:INHBA;図10h:IGFBP7;図10i:KLK10;図10j:LEPRE1;図10k:LUM;図10l:LOXL2;図10m:MMP12;図10n:TIMP1;図10o:ASAH1;図10p:SPP1;図10q:SFRP2;図10r:SFRP4;図10s:SPARC;図10t:PRSS11;図10u:THBS2;図10v:TG;図10w:TGFBI;図10x:CGR11;図10y:SERPINH1;図10z:MMP2;図10aa:PCSK5;図10ab:SERPINB5;図10ac:TGFB1及び図10ad:CEA(CEACAM5)。
【図10v】図10a〜1−adは、CEA及び本発明の他のGTMの発現における、腫瘍ステージとlog2倍変化のグラフを表わす。図10a:アドリカン;図10b:ASPN;図10c:CSPG2;図10d:CST1、2、4;図10e:EFEMP2;図10f:GGF;図10g:INHBA;図10h:IGFBP7;図10i:KLK10;図10j:LEPRE1;図10k:LUM;図10l:LOXL2;図10m:MMP12;図10n:TIMP1;図10o:ASAH1;図10p:SPP1;図10q:SFRP2;図10r:SFRP4;図10s:SPARC;図10t:PRSS11;図10u:THBS2;図10v:TG;図10w:TGFBI;図10x:CGR11;図10y:SERPINH1;図10z:MMP2;図10aa:PCSK5;図10ab:SERPINB5;図10ac:TGFB1及び図10ad:CEA(CEACAM5)。
【図10w】図10a〜1−adは、CEA及び本発明の他のGTMの発現における、腫瘍ステージとlog2倍変化のグラフを表わす。図10a:アドリカン;図10b:ASPN;図10c:CSPG2;図10d:CST1、2、4;図10e:EFEMP2;図10f:GGF;図10g:INHBA;図10h:IGFBP7;図10i:KLK10;図10j:LEPRE1;図10k:LUM;図10l:LOXL2;図10m:MMP12;図10n:TIMP1;図10o:ASAH1;図10p:SPP1;図10q:SFRP2;図10r:SFRP4;図10s:SPARC;図10t:PRSS11;図10u:THBS2;図10v:TG;図10w:TGFBI;図10x:CGR11;図10y:SERPINH1;図10z:MMP2;図10aa:PCSK5;図10ab:SERPINB5;図10ac:TGFB1及び図10ad:CEA(CEACAM5)。
【図10x】図10a〜1−adは、CEA及び本発明の他のGTMの発現における、腫瘍ステージとlog2倍変化のグラフを表わす。図10a:アドリカン;図10b:ASPN;図10c:CSPG2;図10d:CST1、2、4;図10e:EFEMP2;図10f:GGF;図10g:INHBA;図10h:IGFBP7;図10i:KLK10;図10j:LEPRE1;図10k:LUM;図10l:LOXL2;図10m:MMP12;図10n:TIMP1;図10o:ASAH1;図10p:SPP1;図10q:SFRP2;図10r:SFRP4;図10s:SPARC;図10t:PRSS11;図10u:THBS2;図10v:TG;図10w:TGFBI;図10x:CGR11;図10y:SERPINH1;図10z:MMP2;図10aa:PCSK5;図10ab:SERPINB5;図10ac:TGFB1及び図10ad:CEA(CEACAM5)。
【図10y】図10a〜1−adは、CEA及び本発明の他のGTMの発現における、腫瘍ステージとlog2倍変化のグラフを表わす。図10a:アドリカン;図10b:ASPN;図10c:CSPG2;図10d:CST1、2、4;図10e:EFEMP2;図10f:GGF;図10g:INHBA;図10h:IGFBP7;図10i:KLK10;図10j:LEPRE1;図10k:LUM;図10l:LOXL2;図10m:MMP12;図10n:TIMP1;図10o:ASAH1;図10p:SPP1;図10q:SFRP2;図10r:SFRP4;図10s:SPARC;図10t:PRSS11;図10u:THBS2;図10v:TG;図10w:TGFBI;図10x:CGR11;図10y:SERPINH1;図10z:MMP2;図10aa:PCSK5;図10ab:SERPINB5;図10ac:TGFB1及び図10ad:CEA(CEACAM5)。
【図10z】図10a〜1−adは、CEA及び本発明の他のGTMの発現における、腫瘍ステージとlog2倍変化のグラフを表わす。図10a:アドリカン;図10b:ASPN;図10c:CSPG2;図10d:CST1、2、4;図10e:EFEMP2;図10f:GGF;図10g:INHBA;図10h:IGFBP7;図10i:KLK10;図10j:LEPRE1;図10k:LUM;図10l:LOXL2;図10m:MMP12;図10n:TIMP1;図10o:ASAH1;図10p:SPP1;図10q:SFRP2;図10r:SFRP4;図10s:SPARC;図10t:PRSS11;図10u:THBS2;図10v:TG;図10w:TGFBI;図10x:CGR11;図10y:SERPINH1;図10z:MMP2;図10aa:PCSK5;図10ab:SERPINB5;図10ac:TGFB1及び図10ad:CEA(CEACAM5)。
【図10aa】図10a〜1−adは、CEA及び本発明の他のGTMの発現における、腫瘍ステージとlog2倍変化のグラフを表わす。図10a:アドリカン;図10b:ASPN;図10c:CSPG2;図10d:CST1、2、4;図10e:EFEMP2;図10f:GGF;図10g:INHBA;図10h:IGFBP7;図10i:KLK10;図10j:LEPRE1;図10k:LUM;図10l:LOXL2;図10m:MMP12;図10n:TIMP1;図10o:ASAH1;図10p:SPP1;図10q:SFRP2;図10r:SFRP4;図10s:SPARC;図10t:PRSS11;図10u:THBS2;図10v:TG;図10w:TGFBI;図10x:CGR11;図10y:SERPINH1;図10z:MMP2;図10aa:PCSK5;図10ab:SERPINB5;図10ac:TGFB1及び図10ad:CEA(CEACAM5)。
【図10ab】図10a〜1−adは、CEA及び本発明の他のGTMの発現における、腫瘍ステージとlog2倍変化のグラフを表わす。図10a:アドリカン;図10b:ASPN;図10c:CSPG2;図10d:CST1、2、4;図10e:EFEMP2;図10f:GGF;図10g:INHBA;図10h:IGFBP7;図10i:KLK10;図10j:LEPRE1;図10k:LUM;図10l:LOXL2;図10m:MMP12;図10n:TIMP1;図10o:ASAH1;図10p:SPP1;図10q:SFRP2;図10r:SFRP4;図10s:SPARC;図10t:PRSS11;図10u:THBS2;図10v:TG;図10w:TGFBI;図10x:CGR11;図10y:SERPINH1;図10z:MMP2;図10aa:PCSK5;図10ab:SERPINB5;図10ac:TGFB1及び図10ad:CEA(CEACAM5)。
【図10ac】図10a〜1−adは、CEA及び本発明の他のGTMの発現における、腫瘍ステージとlog2倍変化のグラフを表わす。図10a:アドリカン;図10b:ASPN;図10c:CSPG2;図10d:CST1、2、4;図10e:EFEMP2;図10f:GGF;図10g:INHBA;図10h:IGFBP7;図10i:KLK10;図10j:LEPRE1;図10k:LUM;図10l:LOXL2;図10m:MMP12;図10n:TIMP1;図10o:ASAH1;図10p:SPP1;図10q:SFRP2;図10r:SFRP4;図10s:SPARC;図10t:PRSS11;図10u:THBS2;図10v:TG;図10w:TGFBI;図10x:CGR11;図10y:SERPINH1;図10z:MMP2;図10aa:PCSK5;図10ab:SERPINB5;図10ac:TGFB1及び図10ad:CEA(CEACAM5)。
【図10ad】図10a〜1−adは、CEA及び本発明の他のGTMの発現における、腫瘍ステージとlog2倍変化のグラフを表わす。図10a:アドリカン;図10b:ASPN;図10c:CSPG2;図10d:CST1、2、4;図10e:EFEMP2;図10f:GGF;図10g:INHBA;図10h:IGFBP7;図10i:KLK10;図10j:LEPRE1;図10k:LUM;図10l:LOXL2;図10m:MMP12;図10n:TIMP1;図10o:ASAH1;図10p:SPP1;図10q:SFRP2;図10r:SFRP4;図10s:SPARC;図10t:PRSS11;図10u:THBS2;図10v:TG;図10w:TGFBI;図10x:CGR11;図10y:SERPINH1;図10z:MMP2;図10aa:PCSK5;図10ab:SERPINB5;図10ac:TGFB1及び図10ad:CEA(CEACAM5)。
【図11a】図11a〜adは、本発明の29個のGTM及びCEAの発現における腫瘍タイプ(広範性(D)及び腸性(I))とlog2倍変化のグラフを表わす。図11a:アドリカン;図11b:ASPN;図11c:CSPG2;図11d:CST1、2、4;図11e:EFEMP2;図11f:GGH;図11g:INHBA;図11h:IGFBP7;図11i:KLK10;図11j:LEPRE1;図11k:LUM;図11l:LOXL2;図11m:MMP12;図11n:TIMP1;図11o:ASAH1;図11p:SPP1;図11q:SFRP2;図11r:SFRP4;図11s:SPARC;図11t:PRSS11;図11u:THBS2;図11v:TG;図11w:TGFBI;図11x:CGR11;図11y:SERPINH1;図11z:MMP2;図11aa:PCSK5;図11ab:SERPINB5;図11ac:TGFB1及び図11ad:CEA(CEACAM5)。
【図11b】図11a〜adは、本発明の29個のGTM及びCEAの発現における腫瘍タイプ(広範性(D)及び腸性(I))とlog2倍変化のグラフを表わす。図11a:アドリカン;図11b:ASPN;図11c:CSPG2;図11d:CST1、2、4;図11e:EFEMP2;図11f:GGH;図11g:INHBA;図11h:IGFBP7;図11i:KLK10;図11j:LEPRE1;図11k:LUM;図11l:LOXL2;図11m:MMP12;図11n:TIMP1;図11o:ASAH1;図11p:SPP1;図11q:SFRP2;図11r:SFRP4;図11s:SPARC;図11t:PRSS11;図11u:THBS2;図11v:TG;図11w:TGFBI;図11x:CGR11;図11y:SERPINH1;図11z:MMP2;図11aa:PCSK5;図11ab:SERPINB5;図11ac:TGFB1及び図11ad:CEA(CEACAM5)。
【図11c】図11a〜adは、本発明の29個のGTM及びCEAの発現における腫瘍タイプ(広範性(D)及び腸性(I))とlog2倍変化のグラフを表わす。図11a:アドリカン;図11b:ASPN;図11c:CSPG2;図11d:CST1、2、4;図11e:EFEMP2;図11f:GGH;図11g:INHBA;図11h:IGFBP7;図11i:KLK10;図11j:LEPRE1;図11k:LUM;図11l:LOXL2;図11m:MMP12;図11n:TIMP1;図11o:ASAH1;図11p:SPP1;図11q:SFRP2;図11r:SFRP4;図11s:SPARC;図11t:PRSS11;図11u:THBS2;図11v:TG;図11w:TGFBI;図11x:CGR11;図11y:SERPINH1;図11z:MMP2;図11aa:PCSK5;図11ab:SERPINB5;図11ac:TGFB1及び図11ad:CEA(CEACAM5)。
【図11d】図11a〜adは、本発明の29個のGTM及びCEAの発現における腫瘍タイプ(広範性(D)及び腸性(I))とlog2倍変化のグラフを表わす。図11a:アドリカン;図11b:ASPN;図11c:CSPG2;図11d:CST1、2、4;図11e:EFEMP2;図11f:GGH;図11g:INHBA;図11h:IGFBP7;図11i:KLK10;図11j:LEPRE1;図11k:LUM;図11l:LOXL2;図11m:MMP12;図11n:TIMP1;図11o:ASAH1;図11p:SPP1;図11q:SFRP2;図11r:SFRP4;図11s:SPARC;図11t:PRSS11;図11u:THBS2;図11v:TG;図11w:TGFBI;図11x:CGR11;図11y:SERPINH1;図11z:MMP2;図11aa:PCSK5;図11ab:SERPINB5;図11ac:TGFB1及び図11ad:CEA(CEACAM5)。
【図11e】図11a〜adは、本発明の29個のGTM及びCEAの発現における腫瘍タイプ(広範性(D)及び腸性(I))とlog2倍変化のグラフを表わす。図11a:アドリカン;図11b:ASPN;図11c:CSPG2;図11d:CST1、2、4;図11e:EFEMP2;図11f:GGH;図11g:INHBA;図11h:IGFBP7;図11i:KLK10;図11j:LEPRE1;図11k:LUM;図11l:LOXL2;図11m:MMP12;図11n:TIMP1;図11o:ASAH1;図11p:SPP1;図11q:SFRP2;図11r:SFRP4;図11s:SPARC;図11t:PRSS11;図11u:THBS2;図11v:TG;図11w:TGFBI;図11x:CGR11;図11y:SERPINH1;図11z:MMP2;図11aa:PCSK5;図11ab:SERPINB5;図11ac:TGFB1及び図11ad:CEA(CEACAM5)。
【図11f】図11a〜adは、本発明の29個のGTM及びCEAの発現における腫瘍タイプ(広範性(D)及び腸性(I))とlog2倍変化のグラフを表わす。図11a:アドリカン;図11b:ASPN;図11c:CSPG2;図11d:CST1、2、4;図11e:EFEMP2;図11f:GGH;図11g:INHBA;図11h:IGFBP7;図11i:KLK10;図11j:LEPRE1;図11k:LUM;図11l:LOXL2;図11m:MMP12;図11n:TIMP1;図11o:ASAH1;図11p:SPP1;図11q:SFRP2;図11r:SFRP4;図11s:SPARC;図11t:PRSS11;図11u:THBS2;図11v:TG;図11w:TGFBI;図11x:CGR11;図11y:SERPINH1;図11z:MMP2;図11aa:PCSK5;図11ab:SERPINB5;図11ac:TGFB1及び図11ad:CEA(CEACAM5)。
【図11g】図11a〜adは、本発明の29個のGTM及びCEAの発現における腫瘍タイプ(広範性(D)及び腸性(I))とlog2倍変化のグラフを表わす。図11a:アドリカン;図11b:ASPN;図11c:CSPG2;図11d:CST1、2、4;図11e:EFEMP2;図11f:GGH;図11g:INHBA;図11h:IGFBP7;図11i:KLK10;図11j:LEPRE1;図11k:LUM;図11l:LOXL2;図11m:MMP12;図11n:TIMP1;図11o:ASAH1;図11p:SPP1;図11q:SFRP2;図11r:SFRP4;図11s:SPARC;図11t:PRSS11;図11u:THBS2;図11v:TG;図11w:TGFBI;図11x:CGR11;図11y:SERPINH1;図11z:MMP2;図11aa:PCSK5;図11ab:SERPINB5;図11ac:TGFB1及び図11ad:CEA(CEACAM5)。
【図11h】図11a〜adは、本発明の29個のGTM及びCEAの発現における腫瘍タイプ(広範性(D)及び腸性(I))とlog2倍変化のグラフを表わす。図11a:アドリカン;図11b:ASPN;図11c:CSPG2;図11d:CST1、2、4;図11e:EFEMP2;図11f:GGH;図11g:INHBA;図11h:IGFBP7;図11i:KLK10;図11j:LEPRE1;図11k:LUM;図11l:LOXL2;図11m:MMP12;図11n:TIMP1;図11o:ASAH1;図11p:SPP1;図11q:SFRP2;図11r:SFRP4;図11s:SPARC;図11t:PRSS11;図11u:THBS2;図11v:TG;図11w:TGFBI;図11x:CGR11;図11y:SERPINH1;図11z:MMP2;図11aa:PCSK5;図11ab:SERPINB5;図11ac:TGFB1及び図11ad:CEA(CEACAM5)。
【図11i】図11a〜adは、本発明の29個のGTM及びCEAの発現における腫瘍タイプ(広範性(D)及び腸性(I))とlog2倍変化のグラフを表わす。図11a:アドリカン;図11b:ASPN;図11c:CSPG2;図11d:CST1、2、4;図11e:EFEMP2;図11f:GGH;図11g:INHBA;図11h:IGFBP7;図11i:KLK10;図11j:LEPRE1;図11k:LUM;図11l:LOXL2;図11m:MMP12;図11n:TIMP1;図11o:ASAH1;図11p:SPP1;図11q:SFRP2;図11r:SFRP4;図11s:SPARC;図11t:PRSS11;図11u:THBS2;図11v:TG;図11w:TGFBI;図11x:CGR11;図11y:SERPINH1;図11z:MMP2;図11aa:PCSK5;図11ab:SERPINB5;図11ac:TGFB1及び図11ad:CEA(CEACAM5)。
【図11j】図11a〜adは、本発明の29個のGTM及びCEAの発現における腫瘍タイプ(広範性(D)及び腸性(I))とlog2倍変化のグラフを表わす。図11a:アドリカン;図11b:ASPN;図11c:CSPG2;図11d:CST1、2、4;図11e:EFEMP2;図11f:GGH;図11g:INHBA;図11h:IGFBP7;図11i:KLK10;図11j:LEPRE1;図11k:LUM;図11l:LOXL2;図11m:MMP12;図11n:TIMP1;図11o:ASAH1;図11p:SPP1;図11q:SFRP2;図11r:SFRP4;図11s:SPARC;図11t:PRSS11;図11u:THBS2;図11v:TG;図11w:TGFBI;図11x:CGR11;図11y:SERPINH1;図11z:MMP2;図11aa:PCSK5;図11ab:SERPINB5;図11ac:TGFB1及び図11ad:CEA(CEACAM5)。
【図11k】図11a〜adは、本発明の29個のGTM及びCEAの発現における腫瘍タイプ(広範性(D)及び腸性(I))とlog2倍変化のグラフを表わす。図11a:アドリカン;図11b:ASPN;図11c:CSPG2;図11d:CST1、2、4;図11e:EFEMP2;図11f:GGH;図11g:INHBA;図11h:IGFBP7;図11i:KLK10;図11j:LEPRE1;図11k:LUM;図11l:LOXL2;図11m:MMP12;図11n:TIMP1;図11o:ASAH1;図11p:SPP1;図11q:SFRP2;図11r:SFRP4;図11s:SPARC;図11t:PRSS11;図11u:THBS2;図11v:TG;図11w:TGFBI;図11x:CGR11;図11y:SERPINH1;図11z:MMP2;図11aa:PCSK5;図11ab:SERPINB5;図11ac:TGFB1及び図11ad:CEA(CEACAM5)。
【図11l】図11a〜adは、本発明の29個のGTM及びCEAの発現における腫瘍タイプ(広範性(D)及び腸性(I))とlog2倍変化のグラフを表わす。図11a:アドリカン;図11b:ASPN;図11c:CSPG2;図11d:CST1、2、4;図11e:EFEMP2;図11f:GGH;図11g:INHBA;図11h:IGFBP7;図11i:KLK10;図11j:LEPRE1;図11k:LUM;図11l:LOXL2;図11m:MMP12;図11n:TIMP1;図11o:ASAH1;図11p:SPP1;図11q:SFRP2;図11r:SFRP4;図11s:SPARC;図11t:PRSS11;図11u:THBS2;図11v:TG;図11w:TGFBI;図11x:CGR11;図11y:SERPINH1;図11z:MMP2;図11aa:PCSK5;図11ab:SERPINB5;図11ac:TGFB1及び図11ad:CEA(CEACAM5)。
【図11m】図11a〜adは、本発明の29個のGTM及びCEAの発現における腫瘍タイプ(広範性(D)及び腸性(I))とlog2倍変化のグラフを表わす。図11a:アドリカン;図11b:ASPN;図11c:CSPG2;図11d:CST1、2、4;図11e:EFEMP2;図11f:GGH;図11g:INHBA;図11h:IGFBP7;図11i:KLK10;図11j:LEPRE1;図11k:LUM;図11l:LOXL2;図11m:MMP12;図11n:TIMP1;図11o:ASAH1;図11p:SPP1;図11q:SFRP2;図11r:SFRP4;図11s:SPARC;図11t:PRSS11;図11u:THBS2;図11v:TG;図11w:TGFBI;図11x:CGR11;図11y:SERPINH1;図11z:MMP2;図11aa:PCSK5;図11ab:SERPINB5;図11ac:TGFB1及び図11ad:CEA(CEACAM5)。
【図11n】図11a〜adは、本発明の29個のGTM及びCEAの発現における腫瘍タイプ(広範性(D)及び腸性(I))とlog2倍変化のグラフを表わす。図11a:アドリカン;図11b:ASPN;図11c:CSPG2;図11d:CST1、2、4;図11e:EFEMP2;図11f:GGH;図11g:INHBA;図11h:IGFBP7;図11i:KLK10;図11j:LEPRE1;図11k:LUM;図11l:LOXL2;図11m:MMP12;図11n:TIMP1;図11o:ASAH1;図11p:SPP1;図11q:SFRP2;図11r:SFRP4;図11s:SPARC;図11t:PRSS11;図11u:THBS2;図11v:TG;図11w:TGFBI;図11x:CGR11;図11y:SERPINH1;図11z:MMP2;図11aa:PCSK5;図11ab:SERPINB5;図11ac:TGFB1及び図11ad:CEA(CEACAM5)。
【図11o】図11a〜adは、本発明の29個のGTM及びCEAの発現における腫瘍タイプ(広範性(D)及び腸性(I))とlog2倍変化のグラフを表わす。図11a:アドリカン;図11b:ASPN;図11c:CSPG2;図11d:CST1、2、4;図11e:EFEMP2;図11f:GGH;図11g:INHBA;図11h:IGFBP7;図11i:KLK10;図11j:LEPRE1;図11k:LUM;図11l:LOXL2;図11m:MMP12;図11n:TIMP1;図11o:ASAH1;図11p:SPP1;図11q:SFRP2;図11r:SFRP4;図11s:SPARC;図11t:PRSS11;図11u:THBS2;図11v:TG;図11w:TGFBI;図11x:CGR11;図11y:SERPINH1;図11z:MMP2;図11aa:PCSK5;図11ab:SERPINB5;図11ac:TGFB1及び図11ad:CEA(CEACAM5)。
【図11p】図11a〜adは、本発明の29個のGTM及びCEAの発現における腫瘍タイプ(広範性(D)及び腸性(I))とlog2倍変化のグラフを表わす。図11a:アドリカン;図11b:ASPN;図11c:CSPG2;図11d:CST1、2、4;図11e:EFEMP2;図11f:GGH;図11g:INHBA;図11h:IGFBP7;図11i:KLK10;図11j:LEPRE1;図11k:LUM;図11l:LOXL2;図11m:MMP12;図11n:TIMP1;図11o:ASAH1;図11p:SPP1;図11q:SFRP2;図11r:SFRP4;図11s:SPARC;図11t:PRSS11;図11u:THBS2;図11v:TG;図11w:TGFBI;図11x:CGR11;図11y:SERPINH1;図11z:MMP2;図11aa:PCSK5;図11ab:SERPINB5;図11ac:TGFB1及び図11ad:CEA(CEACAM5)。
【図11q】図11a〜adは、本発明の29個のGTM及びCEAの発現における腫瘍タイプ(広範性(D)及び腸性(I))とlog2倍変化のグラフを表わす。図11a:アドリカン;図11b:ASPN;図11c:CSPG2;図11d:CST1、2、4;図11e:EFEMP2;図11f:GGH;図11g:INHBA;図11h:IGFBP7;図11i:KLK10;図11j:LEPRE1;図11k:LUM;図11l:LOXL2;図11m:MMP12;図11n:TIMP1;図11o:ASAH1;図11p:SPP1;図11q:SFRP2;図11r:SFRP4;図11s:SPARC;図11t:PRSS11;図11u:THBS2;図11v:TG;図11w:TGFBI;図11x:CGR11;図11y:SERPINH1;図11z:MMP2;図11aa:PCSK5;図11ab:SERPINB5;図11ac:TGFB1及び図11ad:CEA(CEACAM5)。
【図11r】図11a〜adは、本発明の29個のGTM及びCEAの発現における腫瘍タイプ(広範性(D)及び腸性(I))とlog2倍変化のグラフを表わす。図11a:アドリカン;図11b:ASPN;図11c:CSPG2;図11d:CST1、2、4;図11e:EFEMP2;図11f:GGH;図11g:INHBA;図11h:IGFBP7;図11i:KLK10;図11j:LEPRE1;図11k:LUM;図11l:LOXL2;図11m:MMP12;図11n:TIMP1;図11o:ASAH1;図11p:SPP1;図11q:SFRP2;図11r:SFRP4;図11s:SPARC;図11t:PRSS11;図11u:THBS2;図11v:TG;図11w:TGFBI;図11x:CGR11;図11y:SERPINH1;図11z:MMP2;図11aa:PCSK5;図11ab:SERPINB5;図11ac:TGFB1及び図11ad:CEA(CEACAM5)。
【図11s】図11a〜adは、本発明の29個のGTM及びCEAの発現における腫瘍タイプ(広範性(D)及び腸性(I))とlog2倍変化のグラフを表わす。図11a:アドリカン;図11b:ASPN;図11c:CSPG2;図11d:CST1、2、4;図11e:EFEMP2;図11f:GGH;図11g:INHBA;図11h:IGFBP7;図11i:KLK10;図11j:LEPRE1;図11k:LUM;図11l:LOXL2;図11m:MMP12;図11n:TIMP1;図11o:ASAH1;図11p:SPP1;図11q:SFRP2;図11r:SFRP4;図11s:SPARC;図11t:PRSS11;図11u:THBS2;図11v:TG;図11w:TGFBI;図11x:CGR11;図11y:SERPINH1;図11z:MMP2;図11aa:PCSK5;図11ab:SERPINB5;図11ac:TGFB1及び図11ad:CEA(CEACAM5)。
【図11t】図11a〜adは、本発明の29個のGTM及びCEAの発現における腫瘍タイプ(広範性(D)及び腸性(I))とlog2倍変化のグラフを表わす。図11a:アドリカン;図11b:ASPN;図11c:CSPG2;図11d:CST1、2、4;図11e:EFEMP2;図11f:GGH;図11g:INHBA;図11h:IGFBP7;図11i:KLK10;図11j:LEPRE1;図11k:LUM;図11l:LOXL2;図11m:MMP12;図11n:TIMP1;図11o:ASAH1;図11p:SPP1;図11q:SFRP2;図11r:SFRP4;図11s:SPARC;図11t:PRSS11;図11u:THBS2;図11v:TG;図11w:TGFBI;図11x:CGR11;図11y:SERPINH1;図11z:MMP2;図11aa:PCSK5;図11ab:SERPINB5;図11ac:TGFB1及び図11ad:CEA(CEACAM5)。
【図11u】図11a〜adは、本発明の29個のGTM及びCEAの発現における腫瘍タイプ(広範性(D)及び腸性(I))とlog2倍変化のグラフを表わす。図11a:アドリカン;図11b:ASPN;図11c:CSPG2;図11d:CST1、2、4;図11e:EFEMP2;図11f:GGH;図11g:INHBA;図11h:IGFBP7;図11i:KLK10;図11j:LEPRE1;図11k:LUM;図11l:LOXL2;図11m:MMP12;図11n:TIMP1;図11o:ASAH1;図11p:SPP1;図11q:SFRP2;図11r:SFRP4;図11s:SPARC;図11t:PRSS11;図11u:THBS2;図11v:TG;図11w:TGFBI;図11x:CGR11;図11y:SERPINH1;図11z:MMP2;図11aa:PCSK5;図11ab:SERPINB5;図11ac:TGFB1及び図11ad:CEA(CEACAM5)。
【図11v】図11a〜adは、本発明の29個のGTM及びCEAの発現における腫瘍タイプ(広範性(D)及び腸性(I))とlog2倍変化のグラフを表わす。図11a:アドリカン;図11b:ASPN;図11c:CSPG2;図11d:CST1、2、4;図11e:EFEMP2;図11f:GGH;図11g:INHBA;図11h:IGFBP7;図11i:KLK10;図11j:LEPRE1;図11k:LUM;図11l:LOXL2;図11m:MMP12;図11n:TIMP1;図11o:ASAH1;図11p:SPP1;図11q:SFRP2;図11r:SFRP4;図11s:SPARC;図11t:PRSS11;図11u:THBS2;図11v:TG;図11w:TGFBI;図11x:CGR11;図11y:SERPINH1;図11z:MMP2;図11aa:PCSK5;図11ab:SERPINB5;図11ac:TGFB1及び図11ad:CEA(CEACAM5)。
【図11w】図11a〜adは、本発明の29個のGTM及びCEAの発現における腫瘍タイプ(広範性(D)及び腸性(I))とlog2倍変化のグラフを表わす。図11a:アドリカン;図11b:ASPN;図11c:CSPG2;図11d:CST1、2、4;図11e:EFEMP2;図11f:GGH;図11g:INHBA;図11h:IGFBP7;図11i:KLK10;図11j:LEPRE1;図11k:LUM;図11l:LOXL2;図11m:MMP12;図11n:TIMP1;図11o:ASAH1;図11p:SPP1;図11q:SFRP2;図11r:SFRP4;図11s:SPARC;図11t:PRSS11;図11u:THBS2;図11v:TG;図11w:TGFBI;図11x:CGR11;図11y:SERPINH1;図11z:MMP2;図11aa:PCSK5;図11ab:SERPINB5;図11ac:TGFB1及び図11ad:CEA(CEACAM5)。
【図11x】図11a〜adは、本発明の29個のGTM及びCEAの発現における腫瘍タイプ(広範性(D)及び腸性(I))とlog2倍変化のグラフを表わす。図11a:アドリカン;図11b:ASPN;図11c:CSPG2;図11d:CST1、2、4;図11e:EFEMP2;図11f:GGH;図11g:INHBA;図11h:IGFBP7;図11i:KLK10;図11j:LEPRE1;図11k:LUM;図11l:LOXL2;図11m:MMP12;図11n:TIMP1;図11o:ASAH1;図11p:SPP1;図11q:SFRP2;図11r:SFRP4;図11s:SPARC;図11t:PRSS11;図11u:THBS2;図11v:TG;図11w:TGFBI;図11x:CGR11;図11y:SERPINH1;図11z:MMP2;図11aa:PCSK5;図11ab:SERPINB5;図11ac:TGFB1及び図11ad:CEA(CEACAM5)。
【図11y】図11a〜adは、本発明の29個のGTM及びCEAの発現における腫瘍タイプ(広範性(D)及び腸性(I))とlog2倍変化のグラフを表わす。図11a:アドリカン;図11b:ASPN;図11c:CSPG2;図11d:CST1、2、4;図11e:EFEMP2;図11f:GGH;図11g:INHBA;図11h:IGFBP7;図11i:KLK10;図11j:LEPRE1;図11k:LUM;図11l:LOXL2;図11m:MMP12;図11n:TIMP1;図11o:ASAH1;図11p:SPP1;図11q:SFRP2;図11r:SFRP4;図11s:SPARC;図11t:PRSS11;図11u:THBS2;図11v:TG;図11w:TGFBI;図11x:CGR11;図11y:SERPINH1;図11z:MMP2;図11aa:PCSK5;図11ab:SERPINB5;図11ac:TGFB1及び図11ad:CEA(CEACAM5)。
【図11z】図11a〜adは、本発明の29個のGTM及びCEAの発現における腫瘍タイプ(広範性(D)及び腸性(I))とlog2倍変化のグラフを表わす。図11a:アドリカン;図11b:ASPN;図11c:CSPG2;図11d:CST1、2、4;図11e:EFEMP2;図11f:GGH;図11g:INHBA;図11h:IGFBP7;図11i:KLK10;図11j:LEPRE1;図11k:LUM;図11l:LOXL2;図11m:MMP12;図11n:TIMP1;図11o:ASAH1;図11p:SPP1;図11q:SFRP2;図11r:SFRP4;図11s:SPARC;図11t:PRSS11;図11u:THBS2;図11v:TG;図11w:TGFBI;図11x:CGR11;図11y:SERPINH1;図11z:MMP2;図11aa:PCSK5;図11ab:SERPINB5;図11ac:TGFB1及び図11ad:CEA(CEACAM5)。
【図11aa】図11a〜adは、本発明の29個のGTM及びCEAの発現における腫瘍タイプ(広範性(D)及び腸性(I))とlog2倍変化のグラフを表わす。図11a:アドリカン;図11b:ASPN;図11c:CSPG2;図11d:CST1、2、4;図11e:EFEMP2;図11f:GGH;図11g:INHBA;図11h:IGFBP7;図11i:KLK10;図11j:LEPRE1;図11k:LUM;図11l:LOXL2;図11m:MMP12;図11n:TIMP1;図11o:ASAH1;図11p:SPP1;図11q:SFRP2;図11r:SFRP4;図11s:SPARC;図11t:PRSS11;図11u:THBS2;図11v:TG;図11w:TGFBI;図11x:CGR11;図11y:SERPINH1;図11z:MMP2;図11aa:PCSK5;図11ab:SERPINB5;図11ac:TGFB1及び図11ad:CEA(CEACAM5)。
【図11ab】図11a〜adは、本発明の29個のGTM及びCEAの発現における腫瘍タイプ(広範性(D)及び腸性(I))とlog2倍変化のグラフを表わす。図11a:アドリカン;図11b:ASPN;図11c:CSPG2;図11d:CST1、2、4;図11e:EFEMP2;図11f:GGH;図11g:INHBA;図11h:IGFBP7;図11i:KLK10;図11j:LEPRE1;図11k:LUM;図11l:LOXL2;図11m:MMP12;図11n:TIMP1;図11o:ASAH1;図11p:SPP1;図11q:SFRP2;図11r:SFRP4;図11s:SPARC;図11t:PRSS11;図11u:THBS2;図11v:TG;図11w:TGFBI;図11x:CGR11;図11y:SERPINH1;図11z:MMP2;図11aa:PCSK5;図11ab:SERPINB5;図11ac:TGFB1及び図11ad:CEA(CEACAM5)。
【図11ac】図11a〜adは、本発明の29個のGTM及びCEAの発現における腫瘍タイプ(広範性(D)及び腸性(I))とlog2倍変化のグラフを表わす。図11a:アドリカン;図11b:ASPN;図11c:CSPG2;図11d:CST1、2、4;図11e:EFEMP2;図11f:GGH;図11g:INHBA;図11h:IGFBP7;図11i:KLK10;図11j:LEPRE1;図11k:LUM;図11l:LOXL2;図11m:MMP12;図11n:TIMP1;図11o:ASAH1;図11p:SPP1;図11q:SFRP2;図11r:SFRP4;図11s:SPARC;図11t:PRSS11;図11u:THBS2;図11v:TG;図11w:TGFBI;図11x:CGR11;図11y:SERPINH1;図11z:MMP2;図11aa:PCSK5;図11ab:SERPINB5;図11ac:TGFB1及び図11ad:CEA(CEACAM5)。
【図11ad】図11a〜adは、本発明の29個のGTM及びCEAの発現における腫瘍タイプ(広範性(D)及び腸性(I))とlog2倍変化のグラフを表わす。図11a:アドリカン;図11b:ASPN;図11c:CSPG2;図11d:CST1、2、4;図11e:EFEMP2;図11f:GGH;図11g:INHBA;図11h:IGFBP7;図11i:KLK10;図11j:LEPRE1;図11k:LUM;図11l:LOXL2;図11m:MMP12;図11n:TIMP1;図11o:ASAH1;図11p:SPP1;図11q:SFRP2;図11r:SFRP4;図11s:SPARC;図11t:PRSS11;図11u:THBS2;図11v:TG;図11w:TGFBI;図11x:CGR11;図11y:SERPINH1;図11z:MMP2;図11aa:PCSK5;図11ab:SERPINB5;図11ac:TGFB1及び図11ad:CEA(CEACAM5)。
【図12】図12は、胃腫瘍試料及び非悪性胃試料のシリーズにおける、3個のマーカー、SERPINH1、CST1、2,4及びINHBAを示す3次元グラフを表わす。
【図13】図13は、腫瘍組織と非悪性組織との間を正確に区別する能力についての複数マーカーの効果を示す表を表わす。表は、qPCRデータを元に正常分布から導いた。
【図14】図14は、腫瘍及び非腫瘍組織に由来する4個の腫瘍マーカーのウェスタンブロットである。
【図15】図15は、胃腫瘍及び血清中の腫瘍マーカーSPARCのウェスタンブロットである。
【図16】図16は、胃細胞株であるAGSの上清中のシスタチンSNを表わす免疫ブロットである。
【0012】
詳細な説明
定義
本発明の実施態様を詳細に説明する前に、本明細書で用いる用語のいくつかの定義を記載することが有益である。
【0013】
用語「GTM」又は「胃の腫瘍マーカー」又は「GTMファミリーのメンバー」とは、胃ガンに関連する遺伝子、遺伝子フラグメント、RNA、RNAフラグメント、タンパク質若しくはタンパク質フラグメント、又は他の同定分子を意味するが、胃ガンと関連する従来技術で既知の分子、ca19〜9、ca72〜4及びCEAは含まない。GTMの例は、本明細書の以下に挙げる。
【0014】
用語「マーカー」とは、定量的又は定性的に生物現象の存在に関連する分子を意味する。「マーカー」とは、例えばGTMであるが、「マーカー」には、代謝産物、副産物も、状態に潜在するメカニズムに直接又は間接に関連するかどうかに関わらず含まれる。
【0015】
用語「qPCR」とは、定量ポリメラーゼ連鎖反応を意味する。
【0016】
用語「発現」とは、遺伝子又は遺伝子の部分からのmRNAの産生を含み、そしてRNA又は遺伝子若しくは遺伝子の部分によりコードされたタンパク質の産生も含み、そして発現に関連する検出材料の出現も含む。例えば、遺伝子又は他のオリゴヌクレオチド、タンパク質又はタンパク質フラグメントへの、結合リガンド、例えば抗体の結合、及び結合リガンドの可視化が、用語「発現」の範疇に含まれる。そのため、免疫ブロット、例えばウェスタンブロットについてのスポット密度の増大は、潜在する生物分子の用語「発現」に含まれる。
【0017】
用語「CPN2」とは、ヒトのカルボキシペプチダーゼN、ポリペプチド2、83kDa鎖;そしてカルボキシペプチダーゼNを意味する。
【0018】
用語「HAPLN4」とは、ヒトのヒアルロナン糖タンパク質連結タンパク質4を意味する。
【0019】
用語、「MMP12」とは、ヒトのマトリックスメタロプロテイナーゼ12を意味する。
【0020】
用語「INHBA」とは、ヒトのインヒビン、ベータA(アクチビンA、アクチビンAB又はアルファポリペプチダーゼも含む)を意味する。
【0021】
用語「IGFBP7」とは、ヒトのインシュリン様成長因子7を意味する。
【0022】
用語「GGH」とは、ヒトのガンマ−グルタミル加水分解酵素(抱合体、フォリルポリガンマグルタミル加水分解酵素としても知られる)を意味する。
【0023】
用語「LEPRE1」とは、ヒトのロイシンプロリンに富んだプロテオグリカン(leucine proline-enriched proteoglycan)(レプレカン1としても知られる)を意味する。
【0024】
用語「CST4」とは、ヒトのシスタチンSを意味する。
【0025】
用語「SFRP4」とは、ヒトの分泌フリズルド関連タンパク質4(secreted frizzled-related protein 4)を意味する。
【0026】
用語「ASPN」とは、ヒトのアスポリン(asporin)(LRRクラス1としても知られる)を意味する。
【0027】
用語「CGREF1」又は「CGR11」とは、EFハンドドメイン1(EF hand domain 1)を有するヒトの細胞成長制御因子を意味する。
【0028】
用語「KLK」とは、ヒトのカリクレイン10、変異体1又はヒトのカリクレイン10、変異体2又は他に特に特定しない場合は両者を意味する。
【0029】
用語「TIMP1」とは、ヒトのメタロプロテイナーゼ1の組織阻害剤(赤血球増強活性又はコラゲナーゼ阻害剤としても知られる)を意味する。
【0030】
用語「SPARC」とは、酸性のシステインリッチなヒトの分泌タンパク質(オステオネクチンとしても知られる)を意味する。
【0031】
用語「TGFBI」とは、ベータ−誘導、68kDaのヒトの形質転換成長因子を意味する。
【0032】
用語「EFEMP2」とは、ヒトのEGF−含有フィブリン様細胞外マトリックスタンパク質2を意味する。
【0033】
用語「LUM」とは、ヒトのルミカン(lumican)を意味する。
【0034】
用語「SNN」とは、ヒトのスタニン(stannin)を意味する。
【0035】
用語「SPP1」とは、ヒトの分泌ホスホタンパク質1(オステオポンチン、又は骨シアロタンパク質I又は早期Tリンパ球活性化1としても知られる)を意味する。
【0036】
用語「CSPG2」とは、ヒトのコンドロイチン硫酸プロテオグリカン2(バーシカンとしても知られる)を意味する。
【0037】
用語「ASAH1」とは、ヒトのN−アシルスフィンゴシンアミド加水分解酵素の変異体1又はN−アシルスフィンゴシンアミド加水分解酵素の変異体2又はN−アシルスフィンゴシンアミド加水分解酵素変異体1及び2の両者(セラミダーゼ1の変異体1及び2としても知られる)を意味する。
【0038】
用語「PRSS11」とは、ヒトのセリン11のプロテアーゼ(IGF結合セリンプロテアーゼとしても知られる)を意味する。
【0039】
用語「SFRP2」とは、ヒトの分泌フリズルド関連タンパク質2を意味する。
【0040】
用語「PLA2G12B」とは、ヒトのホスホリパーゼA2、グループXIIBを意味する。
【0041】
用語「SPON2」とは、細胞外マトリックスタンパク質のヒトのスポンディン2を意味する。
【0042】
用語「OLFM1」とは、ヒトのオルファクトメディン1を意味する。
【0043】
用語「TSRC1」とは、ヒトのトロンボスポンディン反復含有1(thrombospondin repeat containing 1)を意味する。
【0044】
用語「THBS2」とは、ヒトのトロンボスポンディン2を意味する。
【0045】
用語「アドリカン」とは、DKFZp564I1922を意味する。
【0046】
用語「CST2」とは、ヒトのシスタチンSAを意味する。
【0047】
用語「CST1」とは、ヒトのシスタチンSNを意味する。
【0048】
用語「LOXL2」とは、ヒトのリシルオキシダーゼ様酵素2を意味する。
【0049】
用語「TG」とは、ヒトのサイログロブリンを意味する。
【0050】
用語「TGFB1」とは、ヒトの形質転換成長因子のベータ1を意味する。
【0051】
用語「SERPINH1」とは、ヒトのセリン又はシステインプロテイナーゼ阻害剤クレードH(熱ショックタンパク質47、メンバー1、又はコラーゲン結合タンパク質1としても知られる)を意味する。
【0052】
用語「SERPINB5」とは、ヒトのセリン又はシステインプロテイナーゼ阻害剤クレードB(オボアルブミン、メンバー5としても知られる)を意味する。
【0053】
用語「CEACAM5」又は「CEA」とは、ヒトのガン胎児性抗原関連細胞接着分子5を意味する。
【0054】
用語「MMP2」とは、ヒトのマトリックスメタロプロテイナーゼ2(ゼラチナーゼA、又は72kDaのゼラチナーゼ、又は72kDaのタイプIVコラゲナーゼとしても知られる)を意味する。
【0055】
用語「PCSK5」とは、ヒトのプロタンパク質転換酵素サブチリシン/ケクシンタイプ5を意味する。
【0056】
前記用語は、タンパク質、DNA配列及び/又はRNA配列を指すこともあると、理解されるであろう。前記用語は、本明細書に表わしたものと同様の配列を有する非ヒトタンパク質、DNA及び/又はRNAを指すことがあるとも、理解されるであろう。
【0057】
本発明の実施態様の記載
胃ガンを含む腫瘍の検出及び評価のためのマーカーを、従来技術のマーカーより、胃ガン検出においてより高い信頼性を有するものとして提供する。用語「信頼性」には、偽陽性及び/又は偽陰性がないことを含む。そのため、より信頼性が高いマーカーでは、そのマーカーを用いてなされる診断に関して、偽陽性及び/又は偽陰性がより少ない。従って、ある実施態様ではマーカーの提供により、約50%である従来技術のマーカーの信頼性より高い信頼性で、胃ガンの検出が可能となる。他の実施態様では、約70%より高い信頼性を、他の実施態様では、約73%より高く、さらに他の実施態様では、約80%より高く、なおもさらなる実施態様では、約90%より高く、なおも他では、約95%より高く、なおもさらなる実施態様では、約98%よりも高く、そしてある実施態様では、約100%である信頼性を有するマーカーが提供される。
【0058】
このように、我々は驚くべきことに、その存在が胃腫瘍に関連する多数の遺伝子及びタンパク質を見いだした。従って、遺伝子産物(例えばmRNAのようなオリゴヌクレオチド)並びにそのようなオリゴヌクレオチドから翻訳されたタンパク質及びペプチドの検出により、腫瘍、例えば胃の腫瘍を診断することができる。胃の腫瘍を有する患者から、そして同じ被検者の非悪性組織から採取した試料のアレイ分析が、多数の胃の腫瘍で、ある遺伝子の過剰発現の特異的なパターンが症状に関連するという驚くべき発見をもたらした。
【0059】
ガンのマーカーは、ガンのマーカーに対して生じた抗体を用いて検出することもできる。
【0060】
このように、多数のガンマーカーの発現の存在及び量を分析することにより、診断の感度を高める一方で、偽陽性及び/又は偽陰性結果を減少することができる。
【0061】
ガン検出への一般的アプローチ
以下のアプローチは限定的な方法ではなく、GTMファミリーのメンバーを用いた胃ガンを含むガン検出に用いることができる。
・GTM遺伝子産物に選択的なオリゴヌクレオチドプローブを用いたマイクロアレイアプローチ。
・マーカー特異的なプライマー及びプローブを用いた、腫瘍試料及び正常試料についてのリアルタイム定量PCR(qPCR)。
・酵素連結免疫学的アッセイ(ELISA)。
・胃の腫瘍及びリンパ節転移についての抗マーカー抗体を用いた免疫組織化学。
・結腸直腸、膵臓、卵巣、メラノーマ、肝臓、食道、膀胱、子宮及び脳といった、しかしこれらに限定されない他の腫瘍についての抗マーカー抗体を用いた免疫組織化学。
・腫瘍除去手術の前後に採取した胃ガン患者の血清中のマーカーファミリーのメンバーの免疫検出。
・健康な個体及び非悪性症状、例えば胃炎、潰瘍、胃粘膜化生や異形成を有する個体の血清中のマーカーファミリーのメンバーの免疫検出。
・結腸直腸、膵臓、卵巣、メラノーマ、肝臓、食道、膀胱、子宮及び脳といった、しかしこれらに限定されない他の腫瘍を有する患者におけるマーカーファミリーのメンバーの免疫検出。
・血清、リンパ液、腹膜液、脳脊髄液、滑液などの体液におけるマーカーの検出。
・胃ガン患者の胃液、腹腔洗浄液、尿及び大便中のマーカーファミリーのメンバーの免疫検出。アレイ法及び/又はqPCRを用いる。
・コンピュータを用いたアレイ又はqPCRデータの分析。一次データを集め、そして倍変化分析を、胃の腫瘍遺伝子発現と非腫瘍組織における同一遺伝子の発現のレベルの比較により実施した。発現が増大するに至る閾値を提供する(例えば、1.5×増大、2倍増大、そして代替的な実施態様では、3倍増大、4倍増大又は5倍増大)。発現が増大するに至る他の閾値は、本発明の範囲を脱することなく選択することができると、認められる。腫瘍遺伝子の発現についてのさらなる分析には、発現の増大を表わすこれらの遺伝子と、腫瘍診断を提供する既知の胃の腫瘍の発現プロフィールとのマッチングが含まれる。
【0062】
ある観点では、本発明は、
(a)生物試料を提供すること;及び
(b)該試料中のGTMファミリーのメンバーの過剰発現を検出すること
を含むガンの検出方法を提供する。
【0063】
他の観点では、本発明は、GTM mRNAの過剰発現を検出する工程を含む。
【0064】
他の観点では、本発明は、GTMタンパク質の過剰発現を検出する工程を含む。
【0065】
なおさらなる観点では、本発明は、GTMペプチドの過剰発現を検出する工程を含む。
【0066】
なおさらなる観点では、本発明は、
その上にGTM捕獲試薬を有する基材;及び
該基材に関連する検出器であって、該捕獲試薬と関連するGTMを検出することができる該検出器(ここで捕獲試薬にはオリゴヌクレオチド又は抗体を含む)
を含むGTMを検出する装置を含む。
【0067】
さらなる観点では、
基材;
1以上のGTM特異的オリゴヌクレオチド及びGTM特異的抗体を含むGTM捕獲試薬;及び
使用のための指令
を含む、ガン検出キットを含む。
【0068】
なおさらなる本発明の観点では、
前記GTMに特異的なフォワードプライマー;
該GTMについて特異的なリバースプライマー;
PCR試薬;
反応バイアル;及び
使用のための指令を含む、qPCRを用いたGTMの検出方法を含む。
【0069】
さらなる本発明の観点では、
前記GTMタンパク質又はペプチドについての捕獲試薬を有する基材;
該GTMタンパク質又はペプチドに特異的な抗体;
該GTMタンパク質又はペプチドについての結合抗体を標識できる試薬;及び
使用のための指令
を含む、GTMタンパク質又はペプチドの存在の検出キットを含む。
【0070】
さらなる本発明の観点では、本発明は、工程を含む、モノクローナル交代の製造方法を含む。
【0071】
なおさらなる観点では、本発明は、
胃ガンの疑いがある患者から試料を提供すること;
ELISA法を用いてGTMタンパク質の存在を測定すること
の工程を含む。胃ガンの検出方法を含む。
【0072】
本明細書中に説明するように、腫瘍の検出は、1個以上の腫瘍特異的マーカーの発現を測定することにより達成することができる。我々は予期せぬことに、GTMの発現増大と、診断した胃ガンの存在との間の関連性が非常に高いことを見いだした。検出した最小有意連関は、p値が約1.6×10−6であった。多くの連関はp値が10−20未満であり、有意であった。このように高い有意性では、複数のGTMにおいて発現の増大を検出する必要はないであろう。しかし、本発明のGTMにおける余剰は、信頼性を高めて胃ガンを検出することを可能とする。
【0073】
本明細書で提供する方法は、高い感度のアッセイも含む。qPCRは非常に感度があり、そして試料中の非常に低いコピー数(例えば、1〜100)の遺伝子産物を検出するのに用いることができる。このような感度により、胃ガンに関連する事象の非常に早期の検出をなすことが可能となる。
【0074】
方法
以下の一般的方法を用いて、胃の腫瘍に関連するマーカーの分子同定への種々のアプローチの適合性を評価する。
【0075】
腫瘍収集
胃の腫瘍試料及び非悪性の胃組織を、韓国のソウル国立大学病院とニュージーランド国のDunedin病院で切除した外科標本から収集した。胃ガンの診断は症状、身体所見及び組織の組織学的検査に基づいてした。
【0076】
RNA抽出
いくつかの実施態様では、胃の腫瘍に関連する遺伝子の発現を、腫瘍から採取した試料のRNAの変化を決定することにより分析した。凍結した外科標本を、OCT培地中に包理した。60μmの切片をマイクロトームを用いて組織塊からスライスし、TriReagent:水(3:1)混合物中でホモジナイズし、次にクロロホルムで抽出した。次に全RNAを、RNeasyTM 手法(Qiagen)を用いて水相から精製した。RNAを16個のガン細胞株からも抽出し、そして参考RNAとして用いるために集めた。
【0077】
マイクロアレイスライド調製
エポキシ被覆したガラススライドをMWG Biotech、ドイツ国エバースバーグから得て、そして〜30,000の50merオリゴヌクレオチドを、Gene Machinesマイクロアレイロボットを用いて、製造者のプロトコールに従って、プリントした。該当するオリゴヌクレオチドの参照番号(MWGオリゴ#)、並びにNCBI mRNA及びタンパク質参照配列を、図2に示す。本発明のGTMの全長DNA配列を、本明細書の以下に示す。
【0078】
RNA標識及びハイブリダイゼーション
cDNAを、10μgの全RNAからSuperscriptIIリバース転写酵素(Invitrogen)を用いて、5−(3−アミノアリル)−2’デオキシウリジン−5’−トリリン酸塩を含有する反応で転写させた。次に反応をMicroconカラム内で脱イオン化して、Cy3又はCy5と共に炭酸水素塩緩衝液中、1時間室温でインキュベートした。取り込まれなかった色素をQiaquickカラム(Qiagen)を用いて除去し、そして試料をSpeedVac内で15μlに濃縮した。次にCy3及びCy5で標識したcDNAを、Ambion ULTRAhyb緩衝液と混合し、100℃で2時間変性し、そしてマイクロアレイスライドへ、ハイブリダイゼーションチャンバー内で42℃16時間ハイブリダイズした。次にスライドを洗浄し、そしてAxon 4000Aスキャナーにおいて2つのパワー設定で2回スキャンし、遺伝子発現についての一次蛍光データを得た。
【0079】
基準化手順
腫瘍及び非悪性組織からのガン遺伝子発現を比較するため、GenepixTM ソフトウェアにより検出した中央値の蛍光強度を、部分的バックグランドの蛍光強度を引き算して補正した。バックグランド補正したゼロ未満の強度を有するスポットは、排除した。基準化を容易にするため、強度比率及び全体的なスポット強度を、log変換した。log変換した強度比率を色素及び空間的バイアスについて、LOCFITTM パッケージで実施した位置回帰を用いて補正した。log変換した強度比率を、全体のスポット強度及び位置に関して同時に復帰(regress)させた。位置的な復帰の残りにより、補正したlog倍変化を提供した。質的なコントロールのため、それぞれ基準化したマイクロアレイの比率をスポット強度及び配置に関してプロットした。続いてプロットを、残存の可能性がある人工物について可視的に点検した。さらに、分散分析(ANOVA)モデルをピンチップバイアスの検出に適用した。基準化の全結果及びパラメータを、統計分析のためのPostgresデータベースに挿入した。
【0080】
統計分析
腫瘍試料対正常組織での遺伝子発現における統計的に有意な変化を、測定したアレイ間の倍変化により同定した.これを成すために、log2(比率)をスケールして、アレイ当たりの同じ全体標準偏差を得た。この標準化手法により、平均組織内クラスの変動を減じた。log2(比率)をさらにシフトして、各オリゴヌクレオチドについてのゼロの中央値を得、結果の可視的な点検を容易にした。次に倍変化に基づくランク検定を用いて、ノイズロバスト性を改善した。この検定は、2つの工程:(i)アレイ内の倍変化のランク(Rfc)の計算、及び(ii)正常組織についての中央値(Rfc)の腫瘍組織についての中央値(Rfc)からの引き算からなる。両中央値ランクの差異が、図2にある倍変化ランクのスコアを決める。2つのさらなる統計検定:1)Bonferroni調整のあるなしでの、2つの試料のスチューデントt−検定及び2)Wilcoxon検定も、この標準的データについて実施した。
【0081】
マーカーの組合せの統計分析
腫瘍及び非悪性試料間を区別するために2又は3個のマーカーの用いた組合せを用いた値を決定するために、40対の試料(同一患者からの腫瘍及び非悪性試料)からのqPCRデータを、以下の分析に用いた。非悪性及び腫瘍試料についての正常分布を、試料平均及び標準偏差を用いて発生させた。腫瘍発現データから得た値が非悪性の分布において定義した閾値(例えば、50%、70%、73%、80%、90%、95%、98%、99%又は100%)を超えるであろう見込みを、次に決定した(すなわち、感度)。マーカーの組合せについて、少なくとも1個のマーカーが閾値を超える見込みを決定した。
【0082】
【表1】
【0083】
定量リアルタイムPCR
他の実施態様では、リアルタイム又は定量のPCR(qPCR)を、PCR鋳型コピー数の絶対又は相対の定量に用いることができる。TaqmanTM プローブ及びプライマーセットを、Primer Express V2.0TM (Applied Biosystems)を用いて設計した。可能であれば、全ての可能性のあるスプライス変異体を得られた単位複製配列(amplicon)に含め、単位複製配列はMWG−Biotech誘導マイクロアレイオリゴヌクレオチドによりカバーした領域に優先して与えた。あるいは、標的遺伝子が所望とする単位複製配列をカバーするAssay-on-DemandTM 発現アッセイ(Applied Biosystems)により表わされる場合は、これらを用いた。qPCRに用いた遺伝子の名前、シンボル、Applied Biosystems「assay on demand」数、フォワードプライマー、リバースプライマー及びプローブ配列を、表1及び図1に示す。組織内で設計したアッサイでは、プライマー濃度をSYBR緑色標識プロトコール及び参照RNAから作製したcDNAを用いて滴定した。増幅を、ABI PrismTM 7000配列検出システムで、標準的なサイクル条件下で実施した。単一の増幅産物を解離曲線において認めると、最適プライマー濃度及び最終濃度250nMでの5’FAM−3’TAMRAリン酸塩TaqmanTM プローブ(Proligo)を用いて、標準曲線を625倍濃度の範囲を超えて、作製した。0.98を超える回帰係数を有する標準曲線を与えるアッセイを、続きのアッセイに用いた。他の実施態様では、回帰係数が高い必要はないと解されるであろう。むしろ、どのような標準曲線でも、回帰係数が発現における差異を統計的に有意に決定させる程度に、充分高い限り用いることができる。このような回帰係数は、代替的な実施態様においては、約0.7より、約0.8より、約0.9より、又は約0.95より高ければよい。
【0084】
アッセイを、単一のcDNAにより表わされる各RNA試料を有する2つの96ウェルプレートについて実施した。各プレートは、参照cDNA標準曲線を、625倍濃度範囲を超えて、二つ組で含んだ。分析は、ΔCT(標的遺伝子CT−平均参照cDNA CT)を計算することからなった。ΔCTは、陰性log2倍変化に対して直接比例する。次に、中央値の非悪性log2倍変化に相対するlog2倍変化を計算した(log2倍変化−中央値の正常なlog2倍変化)。次にこれらの倍変化を、頻度クラスに集めて、そしてグラフにした。
【0085】
ガンのマーカー遺伝子のマイクロアレイ分析
58個の胃の腫瘍及び58個の非悪性の(「正常な」)胃組織の試料からのRNAを、Cy5で標識し、そして二つ組で又は三つ組でCY3で標識した参照RNAとハイブリダイズした。次に正常化後、29,718個の各遺伝子における発現の変化を、3つの測定:(i)倍変化:非悪性試料における中央値のレベルで割った腫瘍試料中の遺伝子の中央値の発現(標準化していない)の比率、(ii)倍変化のランク及び(iii)観察した倍変化が有意である統計的見込みにより見積もった。
【0086】
胃の悪性腫瘍についての血清マーカーの選択
ある実施態様では、ガンのマーカーは、血清のような体液に見いだすことができる。血清マーカーは、(i)分泌タンパク質に、又は膜を外側から貫くタンパク質に、特徴的なシグナル配列の存在、(ii)非悪性コントロールに比較した、腫瘍における過剰発現(倍変化)の中央値のレベル、(iii)腫瘍と非悪性コントロールとの間の発現ランクにおける中央値の変化、そして(iv)腫瘍及び非悪性のコントロールにおける発現範囲の間の重なりの度合いに基づくアレイデータから、選択した。
【0087】
全部で29個のGTMは、そのコード配列の5’末端にシグナルペプチド配列を有することが分かっている。シグナル配列は、GTMタンパク質を原形質膜を通して細胞外区画へ輸送するための標的となる(Gunner von Heijne、Journal of Molecular Biology 173: 243〜251(1984年))。さらに、GTMのいずれも、全長タンパク質が原形質膜内に保持されるという結果となる膜貫通型配列のモチーフを有していない。それ故に、本発明の全てのGTMマーカーは、細胞外区画中に分泌されるようであり、従って毛細血管により、又はリンパ管系へ、次に脈管構造中へ輸送されることにより吸収され、脈管構造と接触しうる。結果として、これらの腫瘍由来のマーカーのそれぞれが血液中に存在することとなる。
【0088】
次に、腫瘍試料のうち>50%が、非悪性の範囲の95パーセンタイル値内の発現レベルを示した場合は、遺伝子を排除した。腫瘍試料における過剰発現の度合いのバリエーションは、腫瘍の異質性のみでなく、腫瘍試料と「正常」組織、例えば筋肉、間質細胞及び非悪性上皮腺との混成の程度によるバリエーションをも反映する。この「正常」の混成は、約25%の中央値を有する5〜70%範囲である。他の遺伝子は、造血細胞での高い相対発現、又は化生性の胃組織における発現上昇のため、排除した。正常細胞又はマーカーを正常に発現する細胞による混成の度合いに応じて、異なる閾値範囲を選択し、これによりガン起源と正常起源との間に充分な分別をなしうることが、解されるであろう。
【0089】
有用であると見いだしたGTMには、例えば以下のマーカー:カルボキシペプチダーゼN、ポリペプチド2、83kDa鎖(カルボキシペプチダーゼNとしても知られる)(CPN2)、マトリックスメタロプロテイナーゼ12(MMP12)、インヒビン(「INHBA」)、インシュリン様成長因子7(「IGFBP7」)、ガンマ−グルタミル加水分解酵素(「GGH」)、ロイシンプロリンに富んだプロテオグリカン(「LEPRE1」)、シスタチンS(「CST4」)、分泌フリズルド関連タンパク質4(「SFRP4」)、アスポリン(「ASPN」)、EFハンドドメイン1を有する細胞成長制御因子(「CGREF1」)、カリクレイン10(KLK10)、メタロプロテイナーゼ1の組織阻害剤(「TIMP1」)、酸性のシステインリッチな分泌タンパク質(「SPARC」)、形質転換成長因子、β−誘導(「TGFBI」)、EGF−含有フィブリン様細胞外マトリックスタンパク質2(「EFEMP2」)、ルミカン(「LUM」)、スタニン(「SNN」)、分泌ホスホタンパク質1(「SPP1」)、コンドロイチン硫酸プロテオグリカン2(「CSPG2」)、N−アシルスフィンゴシンアミド加水分解酵素(「ASAH1」)、セリンプロテアーゼ11(「PRSS11」)、分泌フリズルド関連タンパク質2(「SFRP2」)、ホスホリパーゼA2、グループXIIB(「PLA2G12B」)、スポンディン2、細胞外マトリックスタンパク質(「SPON2」)、オルファクトメディン1(「OLFM1」)、トロンボスポンディン反復含有1(「TSRC1」)、トロンボスポンディン2(「THBS2」)、アドリカン、シスタチンSA(「CST2」)、シスタチンSN(「CST1」)、リシルオキシダーゼ様酵素2(「LOXL2」)、サイログロブリン(「TG」)、形質転換成長因子ベータ1(「TGFB1」)、セリン又はシステインプロテイナーゼ阻害剤クレードH(「SERPINH1」)、セリン又はシステインプロテイナーゼ阻害剤クレードB(「SERPINB5」)、マトリックスメタロプロテイナーゼ2(「MMP2」)、プロタンパク質転換酵素サブチリシン(subtilisin)/ケクシン(kexin)タイプ5(「PCSK5」)及びヒアルロナンプロテオグリカン連結タンパク質4(「HAPLN4」)の遺伝子(DNA)、相補的DNA(cDNA)、RNA、タンパク質及びタンパク質フラグメントが挙げられる。
【0090】
情報の同定に加えて、本発明のGTMのDNA配列を、本明細書の以下に示す。
【0091】
【表2】
【0092】
免疫組織化学
8μMの凍結切片を組織塊から切り出し、そしてAPESスライドにマウントした。次に組織をアセトン中に10分間固定し、空気乾燥した。次にスライドをメタノール中0.3%の過酸化水素に10分間浸し、そしてリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で洗浄した。スライドを適切な動物の20%血清中でインキュベートすることにより、非特異的結合部位をブロックし、そして再度PBSで洗浄した。次に1%血清を含有するPBSで希釈した一次抗体をスライドに加えた。1時間インキュベーション後、スライドを再度PBSで洗浄して、二次抗体とさらに1時間インキュベーションした。PBSでの最終洗浄後、Tris緩衝食塩水(TBS)に溶解したテトラヒドロ塩化ジアミノベンジジンを用いて二次抗体を検出して、TBS及び水で洗浄した。次にスライドをヘモトキシリンで対比染色し、そして光学顕微鏡で観察した。
【0093】
ある実施態様では、胃の腫瘍を本発明のガンマーカーに基づいた染色を用いて、生体内原位置(in situ)で局在化することができる。少なくとも1個のマーカーが、コンゴーレッド又は等価物、非特異的アミロイド染色を用いて可視化することができるアミロイド構造を形成するであろう。
【0094】
体液中の胃ガンマーカーについての検査
いくつかの実施態様では、GTMについてのアッセイを、望ましくは血液、血漿、血清、例えば腹腔洗浄を用いて得た腹水から得た試料、又は他の体液、例えば尿、リンパ液、脳脊髄液、胃液又は大便試料について実施することができる。
【0095】
一般には、これらの液体中のオリゴヌクレオチド、タンパク質及びペプチドについてのアッセイ方法は、当該技術分野で既知である。オリゴヌクレオチドの検出は、ノーザンブロット、サザンブロット又はマイクロアレイ法又はqPCRのようなハイブリダイゼーション法を用いて実施するとよい。タンパク質を検出する方法としては、例えば酵素連結免疫吸着測定法(ELISA)、抗体を有するタンパク質チップ、懸濁ビーズラジオイムノアッセイ(RIA)、ウェスタンブロッティング及びレクチン結合が挙げられる。しかし説明目的として、GTMの液体レベルを、サンドウィッチタイプの酵素連結免疫吸着測定法(ELISA)を用いて定量するとよい。血漿アッセイでは、5μLアリコートの適切に希釈した試料又は段階的に希釈した標準GTM及び75μLのペルオキシダーゼ抱合抗ヒトGTM抗体を、マイクロタイタープレートのウェルに加える。30℃で30分間のインキュベーション期間の後、ウェルをリン酸緩衝食塩水(PBS)中0.05%のTween20を用いて洗浄し、結合していない抗体を除去する。GTMと抗GTM抗体との結合複合体を、次にo−フェニレンジアミン含有H2O2と共に15分間30℃でインキュベーションする。1MのH2SO4を加えて反応を止め、そして492nmでの吸光度をマイクロタイタープレートリーダーで測定する。
【0096】
抗GTM抗体はモノクローナル抗体又はポリクローナル抗血清であってもよいと、解されるであろう。他のいずれの体液であっても適切に研究しうることも、解されるであろう。
【0097】
あるマーカーは、血漿又は血清に存在すると知られる。これらとしては、オステオポンチン(Hotteら、Cancer95(3): 507〜510(2002年))、前立腺特異的抗原(Martinら、Prostate Cancer Prostatic Dis.(2004年3月9日)(Pub Med No: PMID: 15007379)、サイログロブリン(Hallら、Laryngoscope 113(1): 77〜81(2003年); Mazzaferriら、J. Clin. Endocrinol. Metab.88(4): 1433〜14421(2003年))、マトリックスメタロプロテイナーゼ2及び9(Kuoら、Clin. Chem. Acta.294(1〜2): 157〜168(2000年))、CEA及びTIMP1(Pellegriniら、Cancer Immunol. Immunother. 49(7): 388〜394(2000年))が挙げられる。このように、前記マーカーのうちのいくつかはGTMについても有用なマーカーであるため、血漿、血清又は他の液体アッセイをその検出及び定量用にすでに入手可能である。多くのタンパク質は(1)細胞により分泌される、(2)細胞膜から脱落する、又は(3)細胞死の際に細胞から欠失する、のいずれかであるため、他のGTMも体液、例えば血漿、血清などに存在する。従って、本発明の実施態様では、都合よく得られた試料中のGTMの検出が有用であり、望ましく、そして胃ガン診断の基準となりうるであろう。
【0098】
ウェスタン分析
タンパク質を、TriReagent及びグアニジンHCl抽出法を用いて、胃組織から抽出した。RNAのTriReagent抽出からの非水相を、1.5容量のエタノールと混合し、そして遠心分離してDNA及びOCT培地を除去した。0.5mlの上清を0.75mlのイソプロパノールと混合し、室温で10分間インキュベートし、そして次に遠心分離した。ペレットを95%エタノール中の0.3Mグアニジン1mlで3回、そしてエタノール単独で1回洗浄し、次に50μlの1%SDSに再懸濁した。
【0099】
タンパク質を定量し、そしてSDSポリアクリルアミドゲル上で標準的な方法を用いて電気泳動した。要約すると、分離したタンパク質をPVDF膜へ、BioRad trans-blot電気泳動トランスファーセルを用いて、標準的な方法論により移した。次に膜を脱脂粉乳を含有する溶液で30分間ブロックし、一次抗体と共に2時間室温でインキュベートした。洗浄後、膜を二次抗体と共に1時間室温でインキュベートした。最終洗浄後、結合した抗体をECL検出システム(Amersham Biosciences)を用いて可視化した。
【0100】
血清中のマーカーの検出は、既知の方法を用いて血清試料を提供し、次に血清試料を、目的タンパク質に対するオリゴヌクレオチドプローブ又は抗体のいずれかを用いる分析に付すことにより、成すことができる。ウェスタンブロッティング分析のようなイムノブロッティングは、選択的に発現したタンパク質が血清中に存在するかどうかを決定するためには、特に有用であろう。さらに、他の体液がマーカーを含んでもよく、そして腹水、脳脊髄液などが挙げられる。マーカーが分泌され、生理学的な意味で、有用である必要はない。むしろ、マーカータンパク質又は遺伝子が血清に入るメカニズムであれば、検出可能で、定量可能なレベルのマーカーの産生において有効であろう。このように、細胞からの可溶性タンパク質の正常な分泌、血漿膜からの膜タンパク質の脱落、選択的にスプライスしたmRNA型又はそれから発現したタンパク質の分泌、細胞死(アポトーシスであっても)は、充分なレベルのマーカーを産生し、有用となる。種々のガンタイプについての治療の有効性を診断及び/又は評価するツールとして、血清マーカーを使用する裏付けは増えている。
【0101】
Yoshikawaら(Cancer Letters、151: 81〜86(2000年))は、胃ガンを有する患者の血漿中のマトリックスメタロプロテイナーゼ−1の組織阻害剤を記載している。
【0102】
Rudlandら(Cancer Research 62: 3417〜3427(2002年))は、ヒトの乳ガンにおける転移関連タンパク質としてオステオポンチンを記載している。
【0103】
Buckhaultsら(Cancer Research 61: 6996〜7001(2002年))は、結腸直腸の腫瘍で発現した分泌のそして細胞表面の遺伝子を記載している。
【0104】
Kimら(JAMA 287(13): 1671〜1679(2002年))は、卵巣ガンに可能性のある診断の生物マーカーとして、オステオポンチンを記載している。
【0105】
Hotteら(AJ. American Cancer Society 95(3): 507〜512(2002年))は、ヒトの体液中に検出可能であり、そしてある悪性腫瘍に関連するタンパク質として、血漿オステオポンチンを記載している。
【0106】
Martinら(Prostate Cancer Prostatic Dis.2004年3月9日(PMID: 15007379)(要約))は、前立腺ガンの検出用マーカーとして、ヒトのカリクレイン2、前立腺特異的抗原(PSA)及び遊離のPSAの使用を記載している。
【0107】
Hallら(Laryngoscope 113(1): 77〜81(2003年)(PMID: 12679418)(要約))は、甲状腺ガンにおける血清サイログロブリンの予測値を記載している。
【0108】
Mazzaferriら(J.Clin. Endocrinol. Metab. 88(4): 1433〜1441(2003年)(要約))は、甲状腺ガン腫を有する患者のための、可能なモニター法としてサイログロブリンを記載している。
【0109】
Whitleyら(Clin.Lab.Med. 24(1): 29〜47(2004年)(要約))は、甲状腺ガン腫のための血清マーカーとしてサイログロブリンを記載している。
【0110】
Kuoら(Clin.Chim.Acta. 294(1〜2): 157〜168(2000年)(要約))は、HCF及びHBV感染した患者における、血清マトリックスメタロプロテイナーゼ2及び9を記載している。
【0111】
Koopmanら(Cancer Epidemiol. Biomarkers Prev 13(3): 487〜491(2004年)(要約))は、膵臓腺ガン用の生物マーカーとして、オステオポンチンを記載する。
【0112】
Pellegriniら(Cancer Immunol. Immunother. 49(7): 388〜394(2000年)(要約))は、準浸潤性の結腸直腸ガン用マーカーとして可溶性ガン胎児性抗原の測定を記載する。
【0113】
このように、我々は胃ガンを検出し、そして評価するための試薬、装置及びキットを開発するのに有用である多数の遺伝子及び/又はタンパク質を同定した。胃の1個以上のマーカーを単独で又は組合せで用いて、胃ガンのための信頼できる分子検査を提供する。
【0114】
実施例
本明細書に記載する実施例は、本発明の実施態様を説明する目的にある。他の実施態様、分析方法及びタイプは、分子診断技術分野の通常の技術者の理解の内にあり、そして本明細書に詳細に説明する必要はない。当該技術分野にある他の実施態様は、本発明の部分であると見なされる。
【0115】
実施例1:胃の悪性腫瘍のためのマーカーの同定
図2は、前記判定基準を用いて選択した胃の悪性腫瘍のための38個のマーカーを用いた研究結果を示す表を表わす。図2には、遺伝子のシンボル(「シンボル」)、MWGオリゴ番号、NCBI mRNA参照配列番号、タンパク質参照配列番号、腫瘍と非腫瘍遺伝子発現との間の倍変化、マイクロアレイ分析における他の遺伝子に相対する倍変化ランク、オリジナルの未調整スチューデントt−検定の結果、Bonferroni調整p値の結果、及び2試料Wilcoxon検定の結果が含まれる。
【0116】
これらの34個の遺伝子についての中央値の倍変化(腫瘍:非悪性組織)は1.6〜7の範囲であり、そして倍変化ランクにおける中央値の変化は〜16,995〜25,783の範囲であった。倍変化ランクにおける最大の可能な変化は、〜29,718であった。示した各マーカーについて、ガンマーカーとしてのその特異性の統計的有意性は、非常に高いことがわかった。Bonferroni調整p値は、一般に、全て10−6以下であり、これらのマーカーを用いた診断が非常に高く胃ガンに関連することを示した。
【0117】
3つのシスタチン(CST1、CST2及びCST4)は相同性が高く、そしてマイクロアレイ上では同じオリゴヌクレオチドにより表わされ、特に記載しない限り、「CST1、2、4」として集約的に引用する。
【0118】
図2に表わした全てのタンパク質は、SMARTパッケージ(European Molecular Biology Laboratory)を用いて、シグナルペプチドを有すると予測した。シグナルペプチドは合成したタンパク質を細胞外区画へとターゲットし、それにより腸管液へ分泌され、そこから血液に接触することができると知られる。実際、本発明のタンパク質のうちのいくつかを、血清中に検出した。
【0119】
図2に表わした遺伝子のいくつかは、胃ガンの進行をモニターするために臨床現場で最もよく用いられるマーカーであるCEAに対応するアレイ上の2つのオリゴヌクレオチドより高い強度ランクでの変化を表わした。
【0120】
実施例2:qPCR分析
より感度があり、そして正確な定量性がある遺伝子発現を、qPCRを用いて図3に示した遺伝子のサブセットについて得た。46個の腫瘍及び49個の非悪性試料のRNAを、マイクロアレイ分析(図2)により同定した23個の遺伝子について分析したが、結果を図3に示す。図3には、遺伝子シンボル、ガンと正常な組織との間の中央値の倍変化、そして非悪性試料での発現レベルの95パーセンタイル値より高い発現レベルを有する腫瘍試料の%を挙げる。12個の腫瘍試料及び9個の正常な試料を、高い(>75%)正常細胞の混成、高度の壊死(>40%)又はマイクロアレイでの弱いハイブリダイゼーションシグナルにより、分析から排除した。これらの23個の遺伝子についての中央値の倍変化(中央値の非悪性組織の発現に比較した腫瘍組織)は、3〜525倍の範囲であった(図3)。
【0121】
遺伝子ASPN、CST1、2、4、LOXL2、TIMP1、SPP1、SFRP4、INHBA、THBS2及びSPARCの発現レベルは、腫瘍において、≧90%の場合で、非悪性の範囲の95パーセンタイル値より高かった(図3)。遺伝子の残りについては、腫瘍での発現は>50%の試料において95パーセンタイル値より高かった。各腫瘍の過剰発現した、95パーセンタイル値より高い少なくとも7個の遺伝子は、マーカーの組合せにより全ての胃の腫瘍の包括的適用範囲に至ることを示す。
【0122】
実施例3:qPCRを用いたアレイデータの確認
アレイデータを、定量の、リアルタイムPCR(qPCR)を用いて、腫瘍及び非悪性試料について、24個の遺伝子のためのプローブで確認した。24個全ての遺伝子について研究し、20個については2つの技術間で強い相関を示した。これらの分析のうち4つを、図4a〜4dに示すが、これらはアレイ及びqPCR法を用いて検出した4個の選択したガンマーカーについての相対発現のグラフを表わす。図4の各グラフについて、横軸は遺伝子発現におけるアレイのlog2倍変化を表わし、そして縦軸は遺伝子発現におけるqPCRのlog2倍変化を表わす。方法間で共変化する関係(co-variant relationship)で示したように、我々は2つの方法間には強い相関があることが分かった。強い相関は、マイクロアレイ倍変化分析とqPCRとの両者が、胃ガンマーカー遺伝子の発現における変化を検出するのに適した方法であり、それ故に正確で、感度のあるスクリーニング法として用いることができることを示す。図4a〜4dから、アレイ法よりqPCR法では、発現における変化を検出するに際し、より敏感となりうることも解される。このように、早期の検出が特に望ましい場合では、qPCRが特に有用であろう。
【0123】
図5a〜5wは、正常組織(白棒)及び腫瘍組織(黒棒)の両者における23個の遺伝子シリーズのそれぞれの発現の観察頻度(縦軸)と、その遺伝子の発現におけるlog2倍変化(横軸)とを比較するヒストグラムを表わす。頻度分布曲線間の重なりの程度が低いことを熟考すると、これらの23個の遺伝子のそれぞれについて、正常と腫瘍組織間の頻度分布において、実質的な区別があることを、我々は驚くべきことに見いだした。例えば、図5bはCST1、2,4についての結果を表わすが、これについて1つだけ正常な試料が腫瘍範囲内での発現レベルを有することを観察した。他の場合(例えば、図5n;PRS11について)では、各頻度分布曲線は相対的に狭く、そしてある程度の重なりがある。しかし、このマーカーについてさえも、中央値のlog2倍変化は遺伝子発現量の実質的な区別を示した。他の場合(例えば、図5a;ASPNについて)では、いくらか重なりがあるとはいえ、正常と腫瘍試料との間の中央値のlog2倍発現の明確な区別があった。
【0124】
図6は、正常な試料に比較して、腫瘍試料で有意に増大した発現(「過剰発現」)を表わす遺伝子の数(縦軸)、及び検査した個体試料のヒストグラムを表わす。各場合において、腫瘍試料は上昇した発現レベルを有する多様な遺伝子を表わした。発現が増大した遺伝子の最低の数は7であり、試料E123に見られた。この発見は、多様な遺伝子が正常な組織に相対して過剰発現する場合には、ガン検出の信頼性が非常に高くなり、ガン診断をより確かにすることを示す。しかし、いくつかの場合では、1個のマーカー遺伝子の発現の上昇で、ガン診断を導くのに充分となる。
【0125】
胃ガン検出のために現在最も頻繁に用いられている血清マーカーであるCEAとの我々の事前比較は、腫瘍と正常試料との間のアレイデータの強度ランクにおける差異に基づいていた。この比較は、マーカーとCEAについてのqPCRデータを用いて立証した。
【0126】
図7a〜7cは、腫瘍マーカーであるCEAについての遺伝子発現に比較した、個体の腫瘍試料及び非悪性試料におけるマーカーの相対log2発現(参照RNA調製に比較して)のグラフを表わす。CEAは、胃ガンの進行をモニターするために、現在最も用いられる血清マーカーである。ゼロ点は、各マーカーについての正常な発現の中央値と定義される。腫瘍試料と正常試料とにおけるCEA遺伝子(CEACAM5)の発現間には広範囲の重なりがあることがわかる。この重なりは、胃ガンマーカー、ASPN、CSPG2、CST1、2、4、IGFBP7、INHBA、LOXL2、LUM、SFRP4、SPARC、SPP1、THBS2、TIMP1、アドリカン、LEPRE1及びEFEMP2では、著しく少ない。図7b〜7cにおける他のマーカー、ASAH1、SFRP2、GGH、MMP12、KLK10、TG、PRSS11及びTGFBIについては、腫瘍発現の範囲と非悪性組織発現の範囲との間の重なりは、前記マーカーについての重なりより大きいが、なおもCEAのものよりは小さく、本明細書に記載する新規マーカーの全てがCEAより定量的によく、従ってより信頼できる診断を提供することができる。
【0127】
変化しやすい組織の扱いの効果を最小とするために、腫瘍:正常(非悪性)倍変化を、同一患者に由来する腫瘍及び非悪性組織のqPCRデータを用いて計算した。このように対にした分析は、異なる個体での遺伝子発現のバックグラウンドレベルにおける差異を補正し、そしてRNAの質についての組織取り扱いの効果を最小とする。例えば、切除した胃を室温で1時間すると、正常及び腫瘍試料からの転写物は同じ程度で分解することとなる。
【0128】
図8は、マーカーについてのqPCRにより決定したT:N発現レベルをまとめるが、同一個体からの対となるデータ(すなわち、腫瘍及び非悪性試料)を用いた。図8は、図3に含まれない6個の遺伝子についての発現データも含む。追加で研究した遺伝子は、MMP2、CGR11、TGFB1、PCSK5、SERPINB5及びSERPINH1である。同定した情報及びプローブは、図1及び2に示す。図8は、「対の」試料を用いた、これらの40人の患者における、29個の胃ガンマーカーについての中央値のT:N倍変化及び最大値のT:N倍変化を示す。29個のマーカーのうち27個は、従来技術のマーカーであるCEAより大きいか、又は等しい中央値のT:N差異を有する。マーカーのうち29個/29個が、腫瘍試料での発現が正常試料での発現を超える対の試料を、より高い百分率で有する。
【0129】
図9a〜9dは、同一個体の腫瘍及び正常組織からのデータのスキャタードットプロットを表わす。各点は、患者内での、非悪性組織での発現に相対する腫瘍組織でのマーカーの発現における倍変化を表わす。研究したマーカーは全て、CEAよりも、非腫瘍組織からの腫瘍の区別がよい。3個のマーカー、CST1、2、4、ASPN及びSFRP4は、対にした腫瘍及び正常試料間で100%の区別を示した。すなわち、これらのマーカーについては、どの腫瘍組織も同一個体の対応する非腫瘍組織より発現が高かった。多くの他の腫瘍マーカー、例えばアドリカン、CSPG2、EFEMP2、IGFBP7、INHBA、LOXL2、LUM、SERPINH1、SPARC、SPP1、TGFbI、THBS2及びTIMP1は、それぞれが2又は3個の、腫瘍組織の発現が非腫瘍組織のものより低い点を有していた。このように、これらのマーカーについては、腫瘍及び非腫瘍組織の全ての一対が偽陰性を生む尤度は比較的低い(例えば、40個のうち3個又は7.5%;40個のうち2個又は5%;40個のうち1個又は2.5%)。このように、たとえ直前に挙げた他のマーカーを用いたとしても、患者個体からの多様な試料の使用が、信頼できる診断情報を生むこととなる。
【0130】
これらのマーカーの遺伝子配列、及びそれらを検出するために用いるプライマー及びプローブの位置を、本明細書に前記する。
【0131】
マーカー遺伝子の過剰発現が胃の腫瘍のステージとは独立しているのか否かを決定するために、対にしたT:Nlog2倍変化を、腫瘍ステージに対してプロットした(図10a〜10ad)。腫瘍ステージについての発現のステージ依存は、図8に挙げた26個のマーカーについては観察されなかった。これらのマーカーは、遅いステージの腫瘍だけでなく、早いステージにおいても同様に過剰発現した。しかし、KLK10はステージ1及びステージ2の腫瘍においてより一貫した過剰発現を示し、そしてPCSK5及びSERPINB5はステージ4の腫瘍でより一貫した過剰発現を示した。従って、KLK10、PCSK5及びSERPINB5は、胃の腫瘍ステージを決定するために用いることができる。
【0132】
同様の分析では、対にしたT:Nlog2倍変化を、腫瘍(広範性タイプ又は腸管性タイプのいずれか)のLauren分類に対してプロットした。図11a〜11adは、29個のGTMがそれぞれ、腫瘍のタイプが腸管性(I)であるか、広範性(D)であるかに関わらず、腫瘍と非腫瘍組織を区別したことを示す。
【0133】
実施例4:複数マーカーの使用
前記したように、あるマーカーは、試料の100%で、腫瘍を非腫瘍組織から区別する能力を表わす。また他のマーカーは、前記したように、組合せにおいて、腫瘍組織を非腫瘍組織から非常に高い程度で区別するに達することができる。図12は、胃の腫瘍試料と非悪性の胃試料のシリーズについて、log2T:N倍変化として表わした、3個のマーカー、SERPINH1、CST1、2、4及びINHBAの発現の3次元プロットを表わす。2つの試料グループ間に、完全な分別がある。
【0134】
マーカーの組合せを用いた腫瘍と非腫瘍試料の成功した区別の信頼性を、図13にまとめた統計分析によりさらに説明する。対にした腫瘍と非悪性試料とからqPCR遺伝子発現を用いて得たデータの正常分布を比較したこの分析は、用いるマーカーの数を増やすと、検査感度について腫瘍と非悪性試料間とを区別する効果を示す(95%の固定した特異性を有する)。29個のマーカーのうち、単独でこの分析に用いた場合に90、95又は99%より高い感度を有するものはわずかしかないが、2個又は3個のマーカーの組合せにより多数の組合せで達する高い感度を可能とした。例えば、3個のマーカーの50の組合せでは、腫瘍と非悪性試料との区別を、≧99%の感度及び≧95%の特異性で区別する。
【0135】
実施例5:胃の腫瘍マーカータンパク質の検出
なおさらなる実施態様では、GTMタンパク質を診断の基準として検出することができる。ある状態、特定の試料、例えば細胞を含まない試料におけるmRNAの濃度では、マイクロアレイ又はqPCR法のいずれかを用いて、遺伝子発現の上昇を検出することは難しいであろう。このように、ある実施態様では、GTMタンパク質の検出を全タンパク質、タンパク質(ペプチド)のフラグメント又はタンパク質コアのいずれかに対する抗体を用いて成すことができる。タンパク質及びペプチドの発現を検出し、そして定量する方法は、当該技術分野で既知であり、そしてタンパク質又はペプチドに対する特異的抗体に頼る方法を挙げることができる。モノクローナル抗体及びポリクローナル抗血清は、当該技術分野で周知の方法を用いて作製することができ、本明細書においてさらに記載する必要はない。
【0136】
GTMタンパク質を用いて、腫瘍を非腫瘍組織から区別することができることを実証するために、市販の抗体をSPARC(R&D Systems; cat#AF941)、THBS2(Santa Cruz Biotechnology Inc; cat#sc-7655)、CSPG2(Calbiochem; cat#428060)及びIGFBP7(R&D Systems; cat#AF1334)に対して得た。追加でポリクローナル抗体を、ウサギ(Alpha Diagnostic International Inc;サンアントニオ)で、シスタチンSNペプチド配列50〜66(C)
FAISEYNKATKDDYYRR 配列番号:108
に対して生じさせた。
【0137】
これらの抗体を、腫瘍及び非悪性組織の免疫組織化学的又はウェスタン分析に用いた。これらのマーカーは、強い腫瘍:正常の差異を、タンパク質レベルで示した。これにより、これらの遺伝子についてRNAレベルで観察した過剰発現がタンパク質レベルでも起きていることを確認した。
【0138】
図14は、2対の腫瘍及び非悪性組織から、SPARC、CST1(シスタチンSN)、IGFBP7及びTHBS2にコードされているタンパク質に対する抗体を用いて抽出した総タンパク質のウェスタンブロット分析を示す。各マーカーについて、シグナルは非悪性試料より腫瘍試料において有意により高い。
【0139】
シスタチンSNに対して生じた抗体は、それぞれ約34、45及び65kDaの分子量に相当する3本の主要なバンドを検出した。最も低い分子量のバンドを、図14に示す。そのタンパク質種は、コントロールのシスタチンSNタンパク質より大きく、腫瘍により産生したタンパク質が翻訳後修飾又は多量体化を受けたことを示唆する。CSTタンパク質の分子量における差異に応答するメカニズムに関わらず、図14はCST発現が非腫瘍組織では低く、しかし腫瘍由来タンパク質のブロットでは容易に観察されることを実証した。
【0140】
図14はまた、SPRCタンパク質が非腫瘍組織におけるよりも腫瘍組織では高い度合いで実質的に発現することも示す。SPARCタンパク質は、血清で検出されたこのタンパク質の形態よりゲル移動が遅く(図15)、悪性の胃細胞により産生されるタンパク質において異なる翻訳後修飾が生じていることも示す。このような修飾に応答しうるメカニズムに関わらず、SPARCは非悪性組織に相対して腫瘍組織では過剰発現するという発見は、SPARCが有用なタンパク質マーカーであることを示す。同様に、IGFBP7及びTHBS2も非悪性組織に相対して腫瘍組織では過剰発現を示す。
【0141】
腫瘍及び非悪性組織の免疫組織化学分析を、CSPG2(バーシカン)及びCST1(シスタチンSN)とコード化したタンパク質に対する抗体を用いて実施した。バーシカンに対する抗体を用いた組織の免疫組織化学分析では、腫瘍組織の細胞外マトリックスにおいて強い染色を同定したが、非悪性組織ではなかった。抗シスタチンSN抗体を用いた場合では、腫瘍細胞の外側周辺領域で、強い染色を観察した。非悪性細胞では、抗体を用いた染色はより弱く、そして組織の粘膜表面上及び胃小窩の裏打ちのみに観察した。これにより、非悪性細胞では、シスタチンSNタンパク質は細胞から粘膜表面上へ配向するが、細胞外空間中へはしないことを実証した。従って、シスタチンSNタンパク質は非悪性組織よりも腫瘍組織においてより高い量で産生しているのみならず、非悪性組織により産生するタンパク質とは異なり、腫瘍のシスタチンSNは組織の脈管構造と直接接触する。これらの観察を広げるため、シスタチンSNを胃ガン細胞株、AGSの上清からモノクローナル抗体(R&D Systems; cat#MAB1285)を用いて免疫沈降させた(図16)。多量のシスタチンSNを上清中に検出し、このタンパク質が胃上皮細胞により産生され、そして分泌することを確認した。
【0142】
実施例6:血清中の腫瘍マーカーの分析
迅速なスクリーニングに有用なマーカーとしては、マーカーが血清中に検出に充分なレベルで存在することが望ましい。図8に記載したあるタンパク質は、血液中へ検出可能なレベルで胃ガンから分泌しているであろう。胃の腫瘍から血液中へ検出可能なレベルで分泌すると分かったマーカーは、TIMP1である。しかし、タンパク質が粘膜表面以外の細胞表面のいずれかから分泌又は脱落しているのなら、腸液と接触するであろう。そこから、直接血液の供給中へ毛細血管を通して、又はリンパ系を介して通過することができる。このように、いかなる脱落GTMであっても血液中に存在するであろう。オステオポンチン、サイログロブリン並びにMMPのメンバー及びカリクレインのファミリーは、以前に患者の血清中に上皮ガンの範囲で上昇すると記載されているが、胃ガンについては記載されていない。これらの所見は、本研究におけるマーカーについての選択基準、すなわち腫瘍組織での分泌タンパク質の過剰発現ではあるが、非悪性組織ではない過剰発現を、血清中のマーカーを検出するために有効に用いることができ、そしてそれにより組織又は臓器の生検がなくとも、実質的に臨床で使用できることを示唆する。
【0143】
図15からは、血清SPARCが、血液細胞が産生するSPARCより低い分子量を有する腫瘍SPARCで、異なる分子量を有すること(ウェスタンブロットにおいて本明細書に表わした)は明らかである。このように、SPARCが腫瘍及び非腫瘍血液細胞により産生されるにしても、腫瘍SPARCの存在を、分子量を用いて、例えばウェスタン分析を用いて決定するように、又は腫瘍細胞が産生するグリコシル化タンパク質に特異的な抗体を用いて決定することができる。
【0144】
別の研究では、我々は胃ガン細胞株であるAGSの上清中にシスタチンSNを検出した。図16は、培地単独又は培養AGS細胞株からの上清のウェスタンブロット分析を表わす。図16の右側レーンは、シスタチンSNタンパク質に相当する濃いバンドを示す。
【0145】
このように、我々は図10から、本発明のGTMが、症状進行の早期、中期又は末期ステージでの胃ガン診断に適切であると結論づけた。
【0146】
あるマーカーはグリコシル化しているとはいえ、グリコシル化パターンのバリエーションは、ある状況では、通常のグリコシル化パターンを欠いたGTM形態の検出ミスに至る。このように、本発明のある実施態様では、GTM免疫原として、脱グリコシル化GTM又は脱グリコシル化GTMフラグメントを挙げることができる。脱グリコシル化は、当該技術分野で既知の1以上のグリコシダーゼを用いて成すとよい。あるいはGTM cDNAを、E.coliなどの原核細胞株といったグリコシル化を欠く細胞株で発現させ、それにより非グリコシル化タンパク質又はペプチドを産生していてもよい。グリコシル化のレベル及び質は、糖側鎖についての本質的な前駆体の存在に敏感であることも解されるであろう。このように、本質的な糖がない場合は、「正常な」グリコシル化が起こらず、むしろより短いか、又は側鎖が欠失した糖が見いだされるであろう。このような「グリコシル化変異体」を免疫原として用いて、マーカー遺伝子の異なるタイプに特異的な抗体を産生することができる。
【0147】
さらに、あるGTMは、ホモ若しくはヘテロの二量体、又は多量体型の他のタイプを形成するかもしれない。例えば、インヒビンベータAは47kDaであり、97kDa分子量のホモ二量体(アクチビンA)、及び45kDaタンパク質インヒビンベータBとの92kDaのヘテロ二量体(ヘテロ二量体はアクチビンABとして既知である)を形成することができる。このように、分子量を提供するウェスタン分析又は他のタイプのアッセイは、GTMの一量体型の検出のみに限る必要のないと、解されるであろう。むしろ、分子量に関わらず、GTMのいずれの型でも検出できることが、容易に解されるであろう。このように、GTMの多量体型の検出を用いて、胃ガンの存在を診断することが容易にできる。さらに、胃の腫瘍(広範性又は胃腸管性)のステージ(1〜4)又はタイプに選択的なこれらのGTMについては、多量体型の検出が、胃ガンのステージ又はタイプを評価するのに適切な標的を提供することができる。
【0148】
一旦GTMに対する抗体又は抗血清を産生すると、このような抗体調製を種々の方法に用いることができる。まず、酵素結合免疫吸着検定(ELISA)又は放射免疫測定法(RIA)を用いて、GTMタンパク質又はペプチドを定量することができる。免疫検出は、組織試料において免疫組織化学を用いて成すことができる。これらの方法は当該技術分野において全て既知であり、そして本明細書中にさらに記載する必要はない。
【0149】
実施例7:GTMオリゴヌクレオチドを含むベクター
本発明の他の実施態様には、マーカー遺伝子又はその部分(「マーカーペプチド」)又はマーカー遺伝子産物のin vitro発現に有用なベクターが含まれる。例えば、本明細書中のGTMをコードするためのオリゴヌクレオチドを有するベクターを作製するとよい。多くのこのようなベクターは、当該技術分野で既知の標準的なベクターに基づくとよい。本発明はまた、種々の細胞株にトランスフェクションして、GTM産生細胞株を調製するために用いることができるベクターを含み、これを用いて所望とする量のGTMを、GTM検出のための特異的抗体又は他の試薬の開発のために、又はGTMのために開発したアッセイの標準化のために産生することができる。
【0150】
このようなベクターを製造するためには、全オープンリーディングフレーム又は発現させるタンパク質の部分をコードしているこのようなオープンリーディングフレームの部分を含むオリゴヌクレオチドを、オリゴヌクレオチド配列に動作可能に連結したプロモーター領域、1以上のエンハンサー領域を、開始コドン、オープンリーディングフレーム及び終結コドンとともに含むベクター中に挿入するとよいと、解される。発現ベクターを産生する方法は当該技術分野で既知であり、本明細書で反復する必要はない。
【0151】
1以上の選択可能なマーカーを発現ベクターに挿入して、目的の発現ベクターを含むように選択した細胞株を拡張させることができるとも、解されるであろう。さらに、当該技術分野で既知のリーダー配列を、インフレームで、発現細胞におけるタンパク質又はタンパク質フラグメントの直接分泌、内部貯蔵又は膜に入れるため、挿入してもよい。
【0152】
実施例8:GTM含有ベクターでトランスフェクションした細胞
なおもさらなる実施態様では、GTM、GTMフラグメント又はペプチドマーカーを発現することができる細胞が提供される。原核及び真核細胞共に、このように用いることができる。例えば、E.coli(原核細胞)を用いて、多量の成熟グリコシル化を欠いたGTMを産生することができる(特定のGTMが通常はグリコシル化されている場合)。COS細胞、293細胞及び種々の他の真核細胞を用いて、グリコシル化したか、又は適切な折りたたみを有し、それによりGTMタンパク質の天然型の3次元構造を有するGTMを産生してもよい。このような細胞をトランスフェクションする方法は当該技術分野で既知であり、さらに本明細書中に記載する必要はない。
【0153】
実施例9:キット
本発明の発見に基づき、検査キットのいくつかのタイプを作ってもよい。まずは、キットを検出分子(又は「捕獲試薬」)でプレロードされた検出装置を有するように作製するとよい。GTM mRNAを検出するための実施態様では、このような装置は、検出するmRNAとハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを捕獲試薬として有する基材(例えば、ガラス、シリコン、石英、金属など)を含むとよい。いくつかの実施態様では、mRNAの直接検出を、基材上のオリゴヌクレオチドへmRNA(cy3、cy5での標識、放射標識又は他の標識)をハイブリダイズさせることにより成すとよい。他の実施態様では、mRNAの検出は、まずは所望とするmRNAに相補的なDNA(cDNA)を作製することにより成すとよい。次に、標識したcDNAを基材上のオリゴヌクレオチドにハイブリダイズさせ、そして検出するとよい。
【0154】
採用する検出方法に関わらず、検査するGTM発現の、標準的な発現基準との比較が望ましい。例えば、RNA発現を全細胞DNA、構成的に発現するRNA(例えば、リボソームRNA)又は他の相対的な一定のマーカーの発現に標準化するとよい。
【0155】
抗体を、捕獲試薬としてキットに用いることもできる。いくつかの実施態様では、基材(例えば、マルチウェルプレート)は、そこへ付着した特異的なGTM捕獲試薬を有するとよい。いくつかの実施態様では、キットがブロッキング試薬を含んで有していてもよい。ブロッキング試薬は、非特異的な結合を低減するために用いるとよい。例えば、非特異的なオリゴヌクレオチド結合は、サケ精子DNAなどの、GTMオリゴヌクレオチドを含まない、好都合ないずれかの供給源からの過剰のDNAを用いて低減することができる。非特異的な抗体結合は、血清アルブミンなどの過剰のブロッキングタンパク質を用いて低減してもよい。オリゴヌクレオチド及びタンパク質を検出する多数の方法が、当該技術分野では既知であり、そして特異的にGTM関連分子を検出することができるいかなるストラテジーを用いてもよく、本発明の範囲内にあることが解されるであろう。
【0156】
抗体検出の際に頼る実施態様では、GTMタンパク質又はペプチドを細胞ごとを基礎に、全細胞、組織又は液体のタンパク質、液体容量、組織塊(重量)を基礎に発現させるとよい。さらに、血清中のGTMはアルブミンなどの相対的に高く豊富な血清タンパク質を基礎に発現させるとよい。
【0157】
基材に加えて、検査キットは、捕獲試薬(プローブなど)、洗浄溶液(例えば、SSC、他の塩、緩衝液、界面活性剤など)だけでなく、検出部分(例えば、cy3、cy5、放射標識など)を含んでよい。キットは、使用のための指令及びパッケージを含んでもよい。
【0158】
本発明をその特異的な実施態様を参照して記載したとはいえ、開示したマーカーの使用に関する他の実施態様を、本発明の範囲から逸脱するこなく用いることができると、解されるであろう。
【産業上の利用可能性】
【0159】
GTMファミリーのメンバーを検出する方法としては、マイクロアレイ及び/又はリアルタイムPCR法を用いた核酸検出、並びにタンパク質及びペプチドの検出が挙げられる。本発明の組成物及び方法は、症状の診断装置及びキット、診断、治療効果を高めることにおいて、そして生物試料中のGTMファミリーのメンバーの発現を測定するのに適切な試薬を製造するために、有用である。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
(a)生物試料を提供すること;及び
(b)該試料中のGTMファミリーのメンバーの過剰発現を検出すること
を含む、胃ガンの検出方法。
【請求項2】
前記GTMファミリーのメンバーが、カルボキシペプチダーゼN、ポリペプチド2、83kDa鎖(CPN2)、マトリックスメタロプロテイナーゼ12(MMP12)、インヒビン(「INHBA」)、インシュリン様成長因子7(「IGFBP7」)、ガンマ−グルタミル加水分解酵素(「GGH」)、ロイシンプロリンに富んだプロテオグリカン(「LEPRE1」)、シスタチンS(「CST4」)、分泌フリズルド関連タンパク質4(「SFRP4」)、アスポリン(「ASPN」)、EF ハンドドメイン1を有する細胞成長制御因子(「CGREF1」)、カリクレイン10(KLK10)、メタロプロテイナーゼ1の組織阻害剤(「TIMP1」)、酸性のシステインリッチな分泌タンパク質(「SPARC」)、形質転換成長因子、β−誘導(「TGFBI」)、EGF−含有フィブリン様細胞外マトリックスタンパク質2(「EFEMP2」)、ルミカン(「LUM」)、スタニン(「SNN」)、分泌ホスホタンパク質1(「SPP1」)、コンドロイチン硫酸プロテオグリカン2(「CSPG2」)、N−アシルスフィンゴシンアミド加水分解酵素(「ASAH1」)、セリンプロテアーゼ11(「PRSS11」)、分泌フリズルド関連タンパク質2(「SFRP2」)、ホスホロリパーゼA2、グループXIIB(「PLA2G12B」)、スポンディン2、細胞外マトリックスタンパク質(「SPON2」)、オルファクトメディン(「OLFM1」)、トロンボスポンディン反復含有1(「TSRC1」)、トロンボスポンディン2(「THBS2」)、アドリカン、シスタチンSA(「CST2」)、シスタチンSN(「CST1」)、リシルオキシダーゼ様酵素2(「LOXL2」)、サイログロブリン(「TG」)、形質転換成長因子ベータ1(「TGFB1」)、セリン又はシステインプロテイナーゼ阻害剤クレードH(「SERPINH1」)、セリン又はシステインプロテイナーゼ阻害剤クレードB(「SERPINB5」)、マトリックスメタロプロテイナーゼ2(「MMP2」)、プロタンパク質転換酵素サブチリシン/ケクシンタイプ5(「PCSK5」)及びヒアルロナン糖タンパク質連結タンパク質4(「HAPLN4」)からなる群から選択される、請求項1記載の方法。
【請求項3】
前記検出工程を、GTM mRNAの過剰発現を検出することにより実施する、請求項1又は2記載の方法。
【請求項4】
前記検出工程を、GMT cDNAの過剰発現を検出することにより実施する、請求項1又は2記載の方法。
【請求項5】
前記検出工程を、前記GMT cDNAの少なくとも部分に相補的なオリゴヌクレオチドを用いて実施する、請求項4記載の方法。
【請求項6】
前記検出工程を、フォワードプライマー及びリバースプライマーを用いたqPCR法を用いて実施する、請求項4記載の方法。
【請求項7】
前記検出工程を、GTMタンパク質の過剰発現を検出することにより実施する、請求項1又は2記載の方法。
【請求項8】
前記検出工程を、GTMペプチドの過剰発現を検出することにより実施する、請求項1又は2記載の方法。
【請求項9】
前記検出工程を、前記GMTに対する抗体を用いて実施する、請求項7又は8記載の方法。
【請求項10】
前記検出工程を、サンドウィッチタイプのイムノアッセイ法を用いて実施する、請求項7〜9のいずれか1項に記載の方法。
【請求項11】
前記抗体が、モノクローナル抗体である、請求項7〜10のいずれか1項に記載の方法。
【請求項12】
前記抗体が、ポリクローナル抗血清である、請求項7〜10のいずれか1項に記載の方法。
【請求項13】
その上にGTM捕獲試薬を有する基材、及び
該基材に関連する検出器であって、該捕獲試薬と関連するGTMを検出することができる該検出器
を含む、GTMを検出する装置。
【請求項14】
前記GTM捕獲試薬が、オリゴヌクレオチドである、請求項13記載の装置。
【請求項15】
前記GTM捕獲試薬が、GTMオリゴヌクレオチド、GTMタンパク質又はGTMペプチドのいずれかに特異的な抗体である、請求項13記載の装置。
【請求項16】
その上にGTM捕獲試薬を有する基材;
前記GMT捕獲作用剤とGMTとの複合体を可視化する手段;
試薬;及び
使用のための指令
を含む、ガン検出キット。
【請求項17】
前記GTM捕獲試薬が、GTM特異的オリゴヌクレオチドである、請求項16記載のキット。
【請求項18】
前記GTM捕獲試薬が、GTMオリゴヌクレオチド、GTMタンパク質又はGTMペプチドに選択的なGTM特異的抗体である、請求項16記載のキット。
【請求項19】
胃ガンの疑いがある患者から検査試料を提供すること;
該検査試料中のGTMタンパク質の存在を測定すること;及び
該検査試料中のGTM存在量を、胃ガンでない被検者からのコントロールの試料から得た値と比較すること、
の工程を含む、胃ガンの検出方法。
【請求項20】
検査の被検者からの検査試料を提供すること;
前記検査試料中のGTMの存在を測定すること;及び
前記検査試料中のGTM存在量を、胃ガンでない被検者からのコントロールの試料から得た値と比較すること、
の工程を含む、胃ガンのスクリーニング方法。
【請求項21】
前記GTMが、GTMタンパク質又はペプチドである、請求項19記載の方法。
【請求項22】
前記GTMが、GTMに特異的なオリゴヌクレオチドである、請求項19記載の方法。
【請求項23】
前記オリゴヌクレオチドが、DNAである、請求項22記載の方法。
【請求項24】
前記オリゴヌクレオチドが、RNAである、請求項22記載の方法。
【請求項25】
前記測定工程が、ELISAアッセイを用いる、請求項18〜24のいずれか1項に記載の方法。
【請求項26】
前記検査試料を血漿から得る、請求項19〜21のいずれか1項に記載の方法。
【請求項27】
前記検査試料を組織、尿、胃液、血清及び大便から得る、請求項19〜21のいずれか1項に記載の方法。
【請求項1】
(a)生物試料を提供すること;及び
(b)該試料中のGTMファミリーのメンバーの過剰発現を検出すること
を含む、胃ガンの検出方法。
【請求項2】
前記GTMファミリーのメンバーが、カルボキシペプチダーゼN、ポリペプチド2、83kDa鎖(CPN2)、マトリックスメタロプロテイナーゼ12(MMP12)、インヒビン(「INHBA」)、インシュリン様成長因子7(「IGFBP7」)、ガンマ−グルタミル加水分解酵素(「GGH」)、ロイシンプロリンに富んだプロテオグリカン(「LEPRE1」)、シスタチンS(「CST4」)、分泌フリズルド関連タンパク質4(「SFRP4」)、アスポリン(「ASPN」)、EF ハンドドメイン1を有する細胞成長制御因子(「CGREF1」)、カリクレイン10(KLK10)、メタロプロテイナーゼ1の組織阻害剤(「TIMP1」)、酸性のシステインリッチな分泌タンパク質(「SPARC」)、形質転換成長因子、β−誘導(「TGFBI」)、EGF−含有フィブリン様細胞外マトリックスタンパク質2(「EFEMP2」)、ルミカン(「LUM」)、スタニン(「SNN」)、分泌ホスホタンパク質1(「SPP1」)、コンドロイチン硫酸プロテオグリカン2(「CSPG2」)、N−アシルスフィンゴシンアミド加水分解酵素(「ASAH1」)、セリンプロテアーゼ11(「PRSS11」)、分泌フリズルド関連タンパク質2(「SFRP2」)、ホスホロリパーゼA2、グループXIIB(「PLA2G12B」)、スポンディン2、細胞外マトリックスタンパク質(「SPON2」)、オルファクトメディン(「OLFM1」)、トロンボスポンディン反復含有1(「TSRC1」)、トロンボスポンディン2(「THBS2」)、アドリカン、シスタチンSA(「CST2」)、シスタチンSN(「CST1」)、リシルオキシダーゼ様酵素2(「LOXL2」)、サイログロブリン(「TG」)、形質転換成長因子ベータ1(「TGFB1」)、セリン又はシステインプロテイナーゼ阻害剤クレードH(「SERPINH1」)、セリン又はシステインプロテイナーゼ阻害剤クレードB(「SERPINB5」)、マトリックスメタロプロテイナーゼ2(「MMP2」)、プロタンパク質転換酵素サブチリシン/ケクシンタイプ5(「PCSK5」)及びヒアルロナン糖タンパク質連結タンパク質4(「HAPLN4」)からなる群から選択される、請求項1記載の方法。
【請求項3】
前記検出工程を、GTM mRNAの過剰発現を検出することにより実施する、請求項1又は2記載の方法。
【請求項4】
前記検出工程を、GMT cDNAの過剰発現を検出することにより実施する、請求項1又は2記載の方法。
【請求項5】
前記検出工程を、前記GMT cDNAの少なくとも部分に相補的なオリゴヌクレオチドを用いて実施する、請求項4記載の方法。
【請求項6】
前記検出工程を、フォワードプライマー及びリバースプライマーを用いたqPCR法を用いて実施する、請求項4記載の方法。
【請求項7】
前記検出工程を、GTMタンパク質の過剰発現を検出することにより実施する、請求項1又は2記載の方法。
【請求項8】
前記検出工程を、GTMペプチドの過剰発現を検出することにより実施する、請求項1又は2記載の方法。
【請求項9】
前記検出工程を、前記GMTに対する抗体を用いて実施する、請求項7又は8記載の方法。
【請求項10】
前記検出工程を、サンドウィッチタイプのイムノアッセイ法を用いて実施する、請求項7〜9のいずれか1項に記載の方法。
【請求項11】
前記抗体が、モノクローナル抗体である、請求項7〜10のいずれか1項に記載の方法。
【請求項12】
前記抗体が、ポリクローナル抗血清である、請求項7〜10のいずれか1項に記載の方法。
【請求項13】
その上にGTM捕獲試薬を有する基材、及び
該基材に関連する検出器であって、該捕獲試薬と関連するGTMを検出することができる該検出器
を含む、GTMを検出する装置。
【請求項14】
前記GTM捕獲試薬が、オリゴヌクレオチドである、請求項13記載の装置。
【請求項15】
前記GTM捕獲試薬が、GTMオリゴヌクレオチド、GTMタンパク質又はGTMペプチドのいずれかに特異的な抗体である、請求項13記載の装置。
【請求項16】
その上にGTM捕獲試薬を有する基材;
前記GMT捕獲作用剤とGMTとの複合体を可視化する手段;
試薬;及び
使用のための指令
を含む、ガン検出キット。
【請求項17】
前記GTM捕獲試薬が、GTM特異的オリゴヌクレオチドである、請求項16記載のキット。
【請求項18】
前記GTM捕獲試薬が、GTMオリゴヌクレオチド、GTMタンパク質又はGTMペプチドに選択的なGTM特異的抗体である、請求項16記載のキット。
【請求項19】
胃ガンの疑いがある患者から検査試料を提供すること;
該検査試料中のGTMタンパク質の存在を測定すること;及び
該検査試料中のGTM存在量を、胃ガンでない被検者からのコントロールの試料から得た値と比較すること、
の工程を含む、胃ガンの検出方法。
【請求項20】
検査の被検者からの検査試料を提供すること;
前記検査試料中のGTMの存在を測定すること;及び
前記検査試料中のGTM存在量を、胃ガンでない被検者からのコントロールの試料から得た値と比較すること、
の工程を含む、胃ガンのスクリーニング方法。
【請求項21】
前記GTMが、GTMタンパク質又はペプチドである、請求項19記載の方法。
【請求項22】
前記GTMが、GTMに特異的なオリゴヌクレオチドである、請求項19記載の方法。
【請求項23】
前記オリゴヌクレオチドが、DNAである、請求項22記載の方法。
【請求項24】
前記オリゴヌクレオチドが、RNAである、請求項22記載の方法。
【請求項25】
前記測定工程が、ELISAアッセイを用いる、請求項18〜24のいずれか1項に記載の方法。
【請求項26】
前記検査試料を血漿から得る、請求項19〜21のいずれか1項に記載の方法。
【請求項27】
前記検査試料を組織、尿、胃液、血清及び大便から得る、請求項19〜21のいずれか1項に記載の方法。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4a】
【図4b】
【図4c】
【図4d】
【図5a】
【図5b】
【図5c】
【図5d】
【図5e】
【図5f】
【図5g】
【図5h】
【図5i】
【図5j】
【図5k】
【図5l】
【図5m】
【図5n】
【図5o】
【図5p】
【図5q】
【図5r】
【図5s】
【図5t】
【図5u】
【図5v】
【図5w】
【図6】
【図7a】
【図7b】
【図7c】
【図8】
【図9a】
【図9b】
【図9c】
【図9d】
【図10a】
【図10b】
【図10c】
【図10d】
【図10e】
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【図10n】
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【図10w】
【図10x】
【図10y】
【図10z】
【図10aa】
【図10ab】
【図10ac】
【図10ad】
【図11a】
【図11b】
【図11c】
【図11d】
【図11e】
【図11f】
【図11g】
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【図11i】
【図11j】
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【図11n】
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【図11x】
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【図11aa】
【図11ab】
【図11ac】
【図11ad】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図2】
【図3】
【図4a】
【図4b】
【図4c】
【図4d】
【図5a】
【図5b】
【図5c】
【図5d】
【図5e】
【図5f】
【図5g】
【図5h】
【図5i】
【図5j】
【図5k】
【図5l】
【図5m】
【図5n】
【図5o】
【図5p】
【図5q】
【図5r】
【図5s】
【図5t】
【図5u】
【図5v】
【図5w】
【図6】
【図7a】
【図7b】
【図7c】
【図8】
【図9a】
【図9b】
【図9c】
【図9d】
【図10a】
【図10b】
【図10c】
【図10d】
【図10e】
【図10f】
【図10g】
【図10h】
【図10i】
【図10j】
【図10k】
【図10l】
【図10m】
【図10n】
【図10o】
【図10p】
【図10q】
【図10r】
【図10s】
【図10t】
【図10u】
【図10v】
【図10w】
【図10x】
【図10y】
【図10z】
【図10aa】
【図10ab】
【図10ac】
【図10ad】
【図11a】
【図11b】
【図11c】
【図11d】
【図11e】
【図11f】
【図11g】
【図11h】
【図11i】
【図11j】
【図11k】
【図11l】
【図11m】
【図11n】
【図11o】
【図11p】
【図11q】
【図11r】
【図11s】
【図11t】
【図11u】
【図11v】
【図11w】
【図11x】
【図11y】
【図11z】
【図11aa】
【図11ab】
【図11ac】
【図11ad】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【公開番号】特開2011−250795(P2011−250795A)
【公開日】平成23年12月15日(2011.12.15)
【国際特許分類】
【外国語出願】
【出願番号】特願2011−168671(P2011−168671)
【出願日】平成23年8月1日(2011.8.1)
【分割の表示】特願2006−520378(P2006−520378)の分割
【原出願日】平成16年7月16日(2004.7.16)
【出願人】(504350120)パシフィック エッジ バイオテクノロジー リミティド (9)
【Fターム(参考)】
【公開日】平成23年12月15日(2011.12.15)
【国際特許分類】
【出願番号】特願2011−168671(P2011−168671)
【出願日】平成23年8月1日(2011.8.1)
【分割の表示】特願2006−520378(P2006−520378)の分割
【原出願日】平成16年7月16日(2004.7.16)
【出願人】(504350120)パシフィック エッジ バイオテクノロジー リミティド (9)
【Fターム(参考)】
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