脂肪細胞分化促進剤
【課題】糖尿病の予防及び治療に有用で、安全性が高く、副作用を引き起こすリスクを有意に低減可能な脂肪細胞分化促進剤を提供。
【解決手段】分化した脂肪細胞の働きにより、糖尿病のみならず、高脂血症の予防や治療に繋がる、ハラタケ科マッシュルームの水またはエタノール水溶液による抽出物である、細胞分化促進活性を有する脂肪細胞分化促進剤、及びそれを有効成分として含有する糖尿病及び高脂血症の予防や治療が可能な医薬品または食品。
【解決手段】分化した脂肪細胞の働きにより、糖尿病のみならず、高脂血症の予防や治療に繋がる、ハラタケ科マッシュルームの水またはエタノール水溶液による抽出物である、細胞分化促進活性を有する脂肪細胞分化促進剤、及びそれを有効成分として含有する糖尿病及び高脂血症の予防や治療が可能な医薬品または食品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、脂肪細胞分化促進剤、及びこれを含有する医薬品または食品に関する。
【背景技術】
【０００２】
国際糖尿病連合（ＩＤＦ）の発表によると、世界の２００７年現在の糖尿病人口は２億４，６００万人であり、２０２５年には３億８，０００万人に増加すると予測されている。糖尿病は、未治療の状態、または血糖値管理が不十分の状態で放置すると、三大合併症である神経障害、網膜症及び腎症に加えて、脳梗塞、脳卒中、心筋梗塞、皮膚合併症や下肢合併症など、様々な病気を引き起こすことが知られている。そして、現在、世界中で年間約３８０万人が、糖尿病に起因して命を落としている。
【０００３】
糖尿病の原因の一つに、インスリン抵抗性（グルコース代謝の異常）が挙げられる。インスリン抵抗性とは、インスリンの作用効果が低下している状態であり、場合によっては、血糖を調節しようとして体内のインスリン分泌が過剰になり、高インスリン血症に至る。インスリン抵抗性は、肥満体の人に比較的多く見られる。基礎代謝を上回る栄養分が継続的に細胞に取り込まれると脂肪細胞が肥大化し、これにより、インスリンの働きを向上させる物質（アディポネクチン）の分泌量が減る一方、インスリンの働きを阻害する物質（ＴＮＡ−αや遊離脂肪酸）が多く分泌されるようになる。そのため、インスリンの作用効果が低下していき、やがて糖尿病を疾患しうる。
【０００４】
さらに、インスリン抵抗性は、遺伝的影響、並びに特定の栄養素の欠乏、過剰なカロリー摂取及び運動不足などの環境の影響によって生じるものとされている。インスリン抵抗性は、メタボリックシンドロームの主要な因子の１つであることも分かっている。メタボリックシンドロームとは、空腹時の血糖値が高く、糖尿病、高血圧、異常脂血症、腹部肥満、痛風やアテローム性の動脈硬化などを発症させうる総合的な代謝異常をいう。米国では、約４，７００万人もの人間（成人の約４人に１人）がメタボリックシンドロームに罹患していると報告されている（非特許文献１）。
【０００５】
インスリン抵抗性を改善する治療薬の成分として、チアゾリジン誘導体が知られている。該治療薬の作用機序について説明すると、該誘導体が受容体であるＰＰＡＲγに結合し、ＰＰＡＲγの活性を上昇させて、前駆脂肪細胞を肥大化していない正常な脂肪細胞に分化誘導すると同時に、肥大化した脂肪細胞のアポトーシスを誘導する。分化した脂肪細胞は、アディポネクチンを積極的に分泌するため、糖や脂質の代謝が活発になり、血液中からの糖の取り込みが促進され、インスリン抵抗性を改善する。このような脂肪細胞の働きは、糖尿病のみならず、高脂血症の予防や治療に繋がる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】ＪＡＭＡ，２８７，ｐ．３５６−３５９，２００２
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかしながら、上記治療薬は、肝機能障害、浮腫、心肥大やなどの副作用を引き起こす可能性があるという問題があった。
【０００８】
そこで、本発明の目的は、安全性が高く、副作用を引き起こすリスクを低減可能な脂肪細胞分化促進剤を提供することである。
【０００９】
また、本発明の他の目的は、かような脂肪細胞分化促進剤を含有する医薬品または食品を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、安全性が十分に高いと推測される食品を広範にスクリーニングした結果、マッシュルームの抽出物がマウス前駆脂肪細胞（３Ｔ３−Ｌ１）の分化誘導促進作用を有することを見出し、本発明を完成するに至った。さらに、本発明者らは、該抽出物は、糖尿病の予防及び治療に有用であるだけでなく、高脂血症の予防や治療にも有用であることを見出した。
【００１１】
そこで、上記目的を達成するための本発明は、マッシュルームに由来する抽出物から得られ、前駆脂肪細胞から脂肪細胞への細胞分化促進活性を有する、脂肪細胞分化促進剤である。
【００１２】
また、上記目的を達成するための本発明は、前記脂肪細胞分化促進剤を有効成分として含有する、医薬品または食品である。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によれば、前駆脂肪細胞から脂肪細胞への分化が促進されることによって、糖や脂質の代謝が活発になり、血中の糖及び中性脂肪の濃度を低下させることが可能であることから、糖尿病及び高脂血症の予防や治療が可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】実施例２における抽出物５を用いたマウス前駆脂肪細胞（３Ｔ３−Ｌ１）の細胞実験の結果を示す光学顕微鏡写真である。
【図２】実施例４のヒトモニター試験における空腹時血糖値の測定試験の総合的な推移の結果を示すグラフである。
【図３】実施例４のヒトモニター試験における空腹時血糖値の測定試験の検体ごとの推移の結果を示すグラフである。
【図４Ａ】実施例４のヒトモニター試験における空腹時中性脂肪の測定試験のうち、１５０ｍｇ／ｄＬ以上３００ｍｇ／ｄＬ未満の群についての総合的な推移の結果を示すグラフである。
【図４Ｂ】実施例４のヒトモニター試験における空腹時中性脂肪の測定試験のうち、３００ｍｇ／ｄＬ以上の群についての総合的な推移の結果を示すグラフである。
【図５Ａ】実施例４のヒトモニター試験における空腹時中性脂肪の測定試験のうち、１５０ｍｇ／ｄＬ以上３００ｍｇ／ｄＬ未満の群についての検体ごとの推移の結果を示すグラフである。
【図５Ｂ】実施例４のヒトモニター試験における空腹時中性脂肪の測定試験のうち、３００ｍｇ／ｄＬ以上の群についての検体ごとの推移の結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本発明の第一態様は、マッシュルームに由来する抽出物から得られ、前駆脂肪細胞から脂肪細胞への細胞分化促進活性を有する脂肪細胞分化促進剤である。
【００１６】
前記マッシュルームは、生物学的分類でいえば、ハラタケ科（Ａｇａｒｉｃａｃｅａｅ）ハラタケ属（Ａｇａｒｉｃｕｓ）に属するＡｇａｒｉｃｕｓ ｂｉｓｐｏｒｕｓまたはＡｇａｒｉｃｕｓ ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓと表される。
【００１７】
品種に関しては、特に限定されることはなく、ホワイト種、オフホワイト種、クリーム種、ブラウン種、Ａｇａｒｉｃｕｓ ｂｉｔｏｒｑｕｉｓ種などが例示され、いずれも好ましく使用することができる。
【００１８】
また、前記マッシュルームの利用可能な部位についても特に限定されることはなく、傘、ひだ、管孔、柄、肉、つば、つぼ、石突き、グレバ等よりなる部位から選択される一種以上が挙げられる。すなわち、一部位を単独で用いてもよく、また、複数の部位を混合して用いてもよい。
【００１９】
前記マッシュルームに由来する抽出物は、子実体の任意の部位自体若しくはこれを粉砕したもの、各種の溶媒で抽出することにより得ることができる。
【００２０】
前記溶媒としては、水、メタノール、無水エタノール及びエタノール等の低級アルコール、プロピレングリコール及び１，３−ブチレングリコール等の多価アルコール、アセトン等のケトン類、ジエチルエーテル及びジオキサン等のエーテル類、アセトニトリル等のニトリル類、酢酸エチルエステル等のエステル類、ベンゼン及びキシレン等の芳香族類、クロロホルム等の含ハロゲン有機溶媒、ヘキサン及びヘプタン等の脂肪族炭化水素などの有機溶媒よりなる群から選択される一種以上を使用することができる。前記脂肪細胞分化促進剤を食品に含有させる場合には、水及び／またはエタノールを使用することが好ましく、水を使用することがより好ましい。なお、水及びエタノールを混合して使用する場合には、該混合液に対する水の含有率は、１〜９９質量％であることが好ましく、５〜８０質量％であることがより好ましい。
【００２１】
抽出方法については、特に制限されることはないが、常圧または加圧下で、４〜２００℃の温度帯で行われることが好ましく、４０〜１５０℃であることがより好ましい。また、抽出時のｐＨは、１〜１０であることが好ましく、３〜９であることがより好ましい。
【００２２】
上記した条件で抽出を行うことにより、前記抽出物から、脂肪細胞分化促進活性を低下させることなく、脂肪細胞分化促進剤に相当する成分を抽出できる。抽出物そのままの状態で使用することもできるが、抽出物の安定性や品質などの観点から、濾過、合成吸着剤イオン交換樹脂、または活性炭などを用いて吸着、脱色及び／または精製することにより、溶液状、ペースト状、ゲル状または粉末状とすることが好ましい。
【００２３】
また、本発明の第二態様は、前記脂肪細胞分化促進剤を有効成分として含有する、医薬品または食品である。上記第一態様により得られる、マッシュルームに由来する抽出物を、乾燥、濃縮または希釈などにより適宜調製し、場合によってはさらに精製することによって、多様な剤型や形態などを有する医薬品及び食品が得られる。以下、本態様による医薬品及び食品について説明する。
【００２４】
本態様の医薬品としては、インスリン抵抗性に起因する疾病に対する予防剤若しくは治療剤であれば特に制限させることはなく、例えば、糖尿病、高血圧、高脂血症、動脈硬化症などに対する予防剤または治療剤などが挙げられる。
【００２５】
前記医薬品の剤型は、錠剤、丸剤、散剤、粉剤、顆粒剤、シロップ剤、液剤、懸濁剤、乳剤またはカプセル剤などがありえ、これらを患者に経口投与することができる。また、前記医薬品は、軟膏、クリーム、粉状もしくは液状の塗布剤、または貼付剤などの外用剤として経皮的に投与されてもよい。本態様による医薬品の好ましい剤型や投与形態などは、患者の年齢、性別、体質、症状や処置時期などに応じて、医師によって適宜選択される。
【００２６】
一方、前記医薬品のローション剤、クリーム剤及び軟膏などの半固形製剤は、前記医薬品を、脂肪、脂肪油、ラノリン、ワセリン、パラフィン、蝋、硬膏剤、樹脂、プラスチック、グリコール類、高級アルコール、グリセリン、水、乳化剤及び懸濁化剤などよりなる群から選択される一種以上と適宜混和することにより得られる。
【００２７】
前記医薬品に含まれる、本発明による抽出物由来成分の含有量は、抽出方法・条件、投与形態、重篤度や目的とする投与量などによって様々であるが、製剤の全質量に対して０．０１〜８０質量％であることが好ましく、０．１〜５０質量％であることがより好ましい。
【００２８】
また、前記医薬品の投与量は、患者の年齢、体重及び症状、目的とする投与の形態及び方法、治療効果、並びに処置期間などによって異なり、正確な量は医師により決定されるものである。例を挙げるならば、前記医薬品が経口投与される場合には、前記抽出物の投与量換算で、成人に対し１日当り０．１〜２，０００ｍｇを１回または数回に分けて投与されうる。
【００２９】
次に、本態様の食品の種類などについては、特に限定されることはない。すなわち、本発明によるマッシュルームに由来する抽出物には、インスリン抵抗性を改善し、かつ、肝機能障害などの副作用を引き起こすリスクを従来よりも顕著に低減できる脂肪細胞分化促進剤が含まれている。そこで、食事療法は、インスリン抵抗性を改善し、メタボリックシンドロームに罹患するであろう人間に対して、前記食品がメタボリックシンドローム疾患への予防や改善に貢献しうる。
【００３０】
前記食品に含まれる、本発明による抽出物由来成分の含有量は、各食品の組成などによって様々であるため特に限定されることはないが、前記食品の全質量に対して０．０１〜８０質量％であることが好ましく、０．１〜６０質量％であることがより好ましい。上記した範囲内の場合、上記した食事療法などの効果が有意に向上しうる。
【００３１】
前記食品の具体例としては、飴、チューインガム、牛乳、ヨーグルト、乳清飲料、乳酸菌飲料、ジュース、お茶、飲料、アイスクリーム、プディング、水ようかん等が挙げられる。前記食品は、以下に限定されることはないが、前記抽出物に、通常の食品原料として使用されているもの、すなわち、デキストリン、セルロース、ブドウ糖、果糖、ショ糖、マルトース、ソルビトール、ステビオサイド、ルブソサイド、コーンシロップ、乳糖、クエン酸、酒石酸、リンゴ酸、コハク酸、乳酸、Ｌ−アスコルビン酸、ｄｌ−α−トコフェロール、エリソルビン酸ナトリウム、グリセリン、プロピレングリコール、グリセリン脂肪酸エステル、ポリグリセリン脂肪酸エステル、ショ糖脂肪酸エステル、ソルビタン脂肪酸エステル、プロピレングリコール脂肪酸エステル、アラビアガム、カラギーナン、カゼイン、ゼラチン、ペクチン、寒天、ビタミンＢ類、ニコチン酸アミド、パントテン酸カルシウム、アミノ酸類、カルシウム塩類、色素、香料及び保存剤よりなる群から選択される１種以上を適宜配合することによっても得られる。
【００３２】
なお、本発明の範囲は、上記した実施態様に限定されるものではなく、当業者であれば、本発明の要旨を逸脱しない範囲内において種々の変更を加えることができる。
【実施例】
【００３３】
本発明について、下記の実施例によりさらに詳細に説明するが、当該実施例はあくまで例示にすぎず、本発明は以下に限定されることはない。
【００３４】
［実施例１］
（抽出物１〜７の調製方法・条件）
市販のマッシュルーム（Ａｇａｒｉｃｕｓ ｂｉｔｏｒｑｕｉｓ）２００ｇを包丁にて細断後、６００ｍｌの溶媒を加えて攪拌し、有効成分の抽出を行った。なお、抽出条件（抽出温度、時間及び溶媒の種類）を下記表１に示す。なお、抽出に用いた水は、蒸留水であり、ｐＨ調整は行っていない。その後、不溶物をろ過し、得られた上澄み液をエバポレーターで部分濃縮後、凍結乾燥機にて処理を行い、粉末を得た。
【００３５】
（抽出物８の調製方法・条件）
市販のマッシュルーム（Ａｇａｒｉｃｕｓ ｂｉｔｏｒｑｕｉｓ）２００ｇを包丁にて細断後、ｐＨ１に調整した水を６００ｍｌ加えて、攪拌し、有効成分の抽出を行った。なお、抽出条件（抽出温度、時間など）を下記表１に示す。抽出後、不溶物をろ過し、得られた上澄み液のｐＨを水酸化ナトリウム水溶液により７とした。該上澄み液をエバポレーターで部分濃縮後、凍結乾燥機にて処理を行い、粉末を得た。
【００３６】
（抽出物９の調製方法・条件）
市販のマッシュルーム（Ａｇａｒｉｃｕｓ ｂｉｔｏｒｑｕｉｓ）２００ｇを包丁にて細断後、水を６００ｍｌ加えて、オートクレーブ処理による抽出を行った。なお、抽出条件（抽出温度、時間及び溶媒の種類）を下記表１に示す。オートクレーブ終了後、不溶物をろ過し、得られた上澄み液をエバポレーターで部分濃縮後、凍結乾燥機にて処理を行い、粉末を得た。
【００３７】
上記の各抽出物における収率（固形分率）を下記表１に示す。
【００３８】
【表１】
【００３９】
［実施例２］
マッシュルーム抽出物のマウス前駆脂肪細胞（３Ｔ３−Ｌ１）の分化促進活性の評価
マウス前駆脂肪細胞（３Ｔ３−Ｌ１）は、通常培養の条件下においては、線維芽細胞様の形態を示す。しかし、インスリン刺激を与えることにより、３Ｔ３−Ｌ１細胞は、その細胞内に脂肪粒を形成し、脂肪細胞に分化する。よって、前駆脂肪細胞内への脂肪の取り込み量を指標として、前駆脂肪細胞から脂肪細胞への分化促進活性を評価することができる。
【００４０】
３Ｔ３−Ｌ１細胞の脂肪細胞への分化誘導は以下の方法で行った。培養細胞（３Ｔ３−Ｌ１）をトリプシン処理により回収し、４℃、１０００ｒｐｍで３分間遠心分離を行った後、成長培地（ｇｒｏｗｔｈ ｍｅｄｉｕｍ）で細胞を懸濁させ、２４穴プレートの各ウェルに４．２×１０４個となるように細胞をまいた。５％ＣＯ２存在下、３７℃で７２時間培養後、実施例１で得られた抽出物を水に溶解させ１００ｍｇ／ｍｌの濃度とし、ろ過滅菌後、培養液中の最終濃度が１ｍｇ／ｍｌとなるようにウェルに添加し、５％ＣＯ２存在下、３７℃で３０分間静置した。その後、デキサメタゾン（Ｗａｋｏ社）、イソブチルメチルキサンチン（Ｗａｋｏ社）及びインスリン（Ｒｏｃｈｅ社）をそれぞれ最終濃度２０μＭ、１０μＭ及び０．０８５μＭとなるように添加した。４８時間後、成長培地を交換し、同濃度の抽出物を再度添加した。さらに、インスリンを最終濃度０．０８５μＭとなるように加えた。その後、３日間隔で、培地交換、抽出物添加及びインスリンの添加を反復して行い、計９日間培養を行った。得られた細胞をＰＢＳ（−）０．５ｍｌを用いて２回洗浄した後、１０％中性緩衝ホルマリン液０．５ｍｌを静かに加え、３０分間静置することにより固定した。その後、ＰＢＳ（−）０．５ｍｌを用いて１回洗浄し、Ｏｉｌ Ｒｅｄ Ｏ 染色液（Ｏｉｌ Ｒｅｄ Ｏ ６０％イソプロパノール飽和溶液）０．５ｍｌを静かに加え、９０分間静置した。さらにＰＢＳ（−）０．５ｍｌを用いて１回洗浄した後、染色された脂肪粒を光学顕微鏡を用いて観察することにより、分化誘導の有無を下記の方法で評価した。
【００４１】
なお、ポジティブコントロールの細胞群として、上記抽出物を細胞に添加せず、インスリンを最終濃度が１．７μＭとなるように添加した点以外は、上記の方法・条件と同様にして分化誘導させた細胞群を用意した。さらに、ネガティブコントロールの細胞群として、上記抽出物を細胞に添加しない点以外は、上記の方法・条件と同様にして分化誘導させた細胞群を用意した。そして、上記各抽出物を与えられた細胞群（インスリン濃度０．０８５μＭ）、ポジティブコントロールの細胞群（インスリン濃度１．７μＭ）、及びネガティブコントロールの細胞群（インスリン濃度０．０８５μＭ）における分化誘導促進活性を比較した。具体的には、インスリン濃度１．７μＭにおける分化度を１００％、０．０８５μＭにおける分化度を０％とした時の、各抽出物を添加した細胞群における分化度の割合で、分化誘導の促進度を評価した。その際の基準を下記表２に示す。
【００４２】
【表２】
【００４３】
結果を下記表３に示す。
【００４４】
【表３】
【００４５】
上記表３に示した結果より、抽出物１、２、５、６、７、８及び９において、約８０〜１００％の分化度、すなわち優れた分化誘導促進活性が認められることを見出した。
【００４６】
ここで、図１は、上記の抽出物５を用いたマウス前駆脂肪細胞（３Ｔ３−Ｌ１）の細胞実験の結果を示す光学顕微鏡写真である。図中、左はネガティブコントロール群の３Ｔ３−Ｌ１、右は抽出物５を添加した（抽出物濃度：１ｍｇ／ｍｌ）３Ｔ３−Ｌ１をそれぞれ染色した結果を示している。抽出物５を添加すると、脂肪粒が多数発生することが分かる。
【００４７】
［実施例３：マウスを用いたマッシュルーム抽出物の効果試験（動物実験）］
＜試験動物及び飼育条件＞
試験には、薬効薬理試験に一般的に用いられている動物種で、その系統維持が明らかな雄性マウスであるＫＫ−Ａｙ Ｔａ／Ｊｃｌ（ＳＰＦ、日本クレア株式会社）を使用した。動物は、５週齢を入手した。入手後１日の体重範囲は、２３．３〜２８．９ｇであった。入手した動物は、５日間の検疫期間、その後３日間の馴化期間を設け、この間に体重測定を３回、一般状態の観察を１日１回行って、これらに異常の認められなかった動物を試験に用いた。
【００４８】
動物は、設定温度２３℃（実測値：２１．５〜２４．０℃）、設定湿度５５％（実測値：３９．６〜５８．２％）、明暗各１２時間（照明：午前６時〜午後６時）、換気回数１２回／時（フィルターを通した新鮮空気）に維持された飼育室で飼育した。動物は、検疫・馴化期間中及び群分け後を通じて、オートクレーブ処理した床敷を入れた平床式プラスチック製ケージ（Ｗ：１７５×Ｄ：２４５×Ｈ：１２５ｍｍ）を用いて個別飼育をした。ケージ（床敷を含む）及び給水瓶の交換は１週間に２回以上行い、給餌器の交換は２週間に１回以上行った。動物飼育室の清掃・消毒は毎日行った。
【００４９】
飼料は、検疫・馴化期間中及び群分け後のコントロール群では、製造後５ヵ月以内の粉末飼料（ＣＲＦ−１、オリエンタル酵母工業株式会社）を給餌器に入れ、自由に摂取させた。群分け後の抽出物５群では、抽出物５を３％（ｗ／ｗ）混合した飼料を給餌器に入れ、自由に摂取させた。
【００５０】
飲料水は、水道水を、給水瓶を用いて自由に摂取させた。
【００５１】
＜群分け法及び個体識別法＞
群分けは、コンピュータを用いた無作為法により、群分け日の血中グルコース（Ｇｌｕ）及び群分け日の体重がほぼ等しくなるよう、投与開始日に行った。なお、群分け時には、Ｇｌｕの低値または高値を示した動物を群分け対象から除外した。
【００５２】
＜投与＞
投与は、上記の抽出物を混合した飼料を、マウス用粉末給餌器を用いて自由に摂取させた。投与期間は、投与開始日を投与１日とし、３３日間とした。
【００５３】
＜試験群＞
試験群等の詳細について、下記表４にまとめて示す。
【００５４】
【表４】
【００５５】
＜試験方法＞
共通事項として、投与期間中は１日１回、一般状態の観察を行った。以下、各試験方法及びその結果について具体的に説明する。
【００５６】
＜空腹時血糖値の測定試験及びその結果＞
上記の混餌（経口）投与後３２日目に実施した。前日より給水下にて１８時間以上絶食させた動物に対して眼窩静脈叢から約５０μＬ採血し、グルコースＣＩＩ−テストワコー（和光純薬工業株式会社）を使用し、分光光度計（Ｕ−３０１０、日立ハイテクフィールディング）にてＧｌｕを測定した。
【００５７】
結果として、コントロール群では、血糖値は１３０．２±３．８ｍｇ／ｄＬであったのに対し、抽出物５の３％群の血糖値は１１９．１±７．６ｍｇ／ｄＬであり、コントロール群と比較して低値を示した。なお、各個体及び全体の結果を下記表５に示す（Ｇｌｕ（ｍｇ／ｄＬ））。
【００５８】
【表５】
【００５９】
＜ＨｂＡ１ｃの測定試験及びその結果＞
投与３３日に実施した。４％ペントバルビタール麻酔（１ｍＬ／ｋｇ，ｉ．ｐ．）後、注射針を取り付けたポリプロピレン製注射筒を用いてヘパリン存在下で、腹大動脈から採血（約０．８ｍＬ）した。そして、生化学自動分析装置（ＡＵ４００、オリンパス株式会社）を用いて、遠心分離後の残渣についてＨｂＡ１ｃを測定した。
【００６０】
結果として、コントロール群ではＨｂＡ１ｃが５．９±０．３％であったのに対し、抽出物５の３％群ではＨｂＡ１ｃが５．１±０．３％であり、コントロール群と比較してＨｂＡ１ｃは有意に低値であった（ｐ＜０．０５ ｖｓ コントロール群、ｔ検定）。なお、各個体及び全体の結果を下記表６に示す（ＨｂＡ１ｃ（％）：検体投与後３３日）。
【００６１】
【表６】
【００６２】
［実施例４：ヒトを用いたマッシュルーム抽出物の効果試験（臨床実験）］
＜ヒトのモニター試験用の抽出物の調製方法＞
市販の生マッシュルーム７０ｋｇを測り採り、水洗したものに、等量の水道水７０ｋｇを加え、マスコロイダーにて破砕し、マッシュルーム破砕物を得た。得られたマッシュルーム破砕物に、水道水１４０ｋｇを加えた。その後、生マッシュルームの質量に対して、１．０５質量％となるようにクエン酸７３５ｇ添加し、ｐＨを４とした。その後、マッシュルーム破砕物の細胞壁を部分的に分解し、且つ殺菌工程として８５℃で１０分間加熱して、マッシュルーム破砕加熱物を得た。
【００６３】
次に、マッシュルーム破砕加熱物を４０℃まで冷却した後、マッシュルーム破砕加熱物に、生マッシュルームの質量に対して、０．１質量％となるようにセルラーゼ製剤７０ｇを水道水２００ｍｌに懸濁させながら添加し、４０℃で１時間緩やかに攪拌させながら酵素処理を行い、マッシュルーム破砕酵素処理物を得た。
【００６４】
次に、マッシュルーム破砕酵素処理物を６０℃まで加温し、２時間、緩やかに攪拌させながら熱水抽出を行い、マッシュルーム抽出物を得た。
【００６５】
その後、多板式遠心分離機にて遠心分離を行った後、濾紙及びセライト＃２０００で濾過を行い、残渣を除いて抽出液を得た。
【００６６】
得られた抽出液を減圧濃縮機にて６０℃で濃縮して濃縮液を得た。その後、１１０℃で５分間滅菌処理を行い、滅菌抽出液を得た。そして、滅菌抽出液のＢｒｉｘを測定し、固形物換算値に対してデキストリンを３０％添加し、スプレードライ処理により抽出物の乾燥粉末５．４９ｋｇを得た。
【００６７】
＜ヒトモニター試験方法＞
下記の表７に試験項目及び試験内容を纏める。
【００６８】
【表７】
【００６９】
さらに、表８に対象者の内訳を示し、表９に評価項目等を示す。
【００７０】
【表８】
【００７１】
【表９】
【００７２】
＜空腹時血糖値の測定試験及びその推移の結果＞
空腹時血糖値は、ヘキソキナーゼＵＶ法を用いて測定した。その際、機器としてＪＣＡ−ＢＭシリーズ 自動分析装置 クリナライザ（ＪＣＡ−ＢＭ９０２０、日本電子株式会社）を用い、試薬としてクイックオート ネオＧＬＵ−ＨＫ（シノテスト社）を用いた。
【００７３】
試験前の空腹時血糖値が１００ｍｇ／ｄＬ以上の群（７人）において、試験前の血糖値は１１１．０±１４．１ｍｇ／ｄＬであったのに対し、試験後の血糖値は１０７．０±１４．８ｍｇ／ｄＬとなった。かかる結果より、試験前の血糖値と比較して、試験後の血糖値は平均値として約９６％となり、血糖値が低下することが分かった。なお、各個体及び全体の試験前後での結果を下記表１０に示す（Ｇｌｕ（ｍｇ／ｄＬ））。
【００７４】
【表１０】
【００７５】
ここで、表１０に示した結果を図２及び図３に示す。
【００７６】
＜空腹時の中性脂肪値の測定及びその推移の結果＞
中性脂肪（ＴＧ）は、酵素法（ＧＫ−ＧＰＯ・遊離グリセロール）を用いて測定した。その際、機器として日立７６００を用い、試薬としてピュアオートＳ ＴＧ−Ｎ（積水メディカル株式会社）を用いた。
【００７７】
試験前の空腹時血糖値が１５０ｍｇ／ｄＬ以上３００ｍｇ／ｄＬ未満の群（８人）において、試験前の中性脂肪値は２０４．９±４２．０ｍｇ／ｄＬであったのに対し、試験後の中性脂肪値は１３４．１±４３．１ｍｇ／ｄＬであった（ｐ＜０．０１ ｖｓ 試験前、ｔ検定）。一方、３００ｍｇ／ｄＬ以上の群（３人）において、試験前の中性脂肪値は４３０．３±４７．０ｍｇ／ｄＬであったのに対し、試験後の中性脂肪値は２７５±６０．８ｍｇ／ｄＬであった。かかる結果より、試験前の中性脂肪値と比較して、試験後の中性脂肪値は平均値として、それぞれ約６５％（１５０ｍｇ／ｄＬ以上３００ｍｇ／ｄＬ未満の群）及び約６４％（３００ｍｇ／ｄＬ以上の群）となり、試験前後で顕著に中性脂肪値が低下することが分かった。なお、各個体及び全体の試験前後での結果を下記表１１に示す（単位：ｍｇ／ｄＬ）。
【００７８】
【表１１】
【００７９】
ここで、表１１に示した結果を図４Ａ及び図４Ｂ、並びに図５Ａ及び５Ｂに示す。なお、図４Ａ及び図５Ａは１５０ｍｇ／ｄＬ以上３００ｍｇ／ｄＬ未満の群についての結果を表し、図４Ｂ及び図５Ｂは３００ｍｇ／ｄＬ以上の群についての結果を表す。
【産業上の利用可能性】
【００８０】
本発明は、優れた前駆脂肪細胞分化促進作用を有し、かつ安全性も高いため、各種の医薬品または食品に好適に利用可能である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、脂肪細胞分化促進剤、及びこれを含有する医薬品または食品に関する。
【背景技術】
【０００２】
国際糖尿病連合（ＩＤＦ）の発表によると、世界の２００７年現在の糖尿病人口は２億４，６００万人であり、２０２５年には３億８，０００万人に増加すると予測されている。糖尿病は、未治療の状態、または血糖値管理が不十分の状態で放置すると、三大合併症である神経障害、網膜症及び腎症に加えて、脳梗塞、脳卒中、心筋梗塞、皮膚合併症や下肢合併症など、様々な病気を引き起こすことが知られている。そして、現在、世界中で年間約３８０万人が、糖尿病に起因して命を落としている。
【０００３】
糖尿病の原因の一つに、インスリン抵抗性（グルコース代謝の異常）が挙げられる。インスリン抵抗性とは、インスリンの作用効果が低下している状態であり、場合によっては、血糖を調節しようとして体内のインスリン分泌が過剰になり、高インスリン血症に至る。インスリン抵抗性は、肥満体の人に比較的多く見られる。基礎代謝を上回る栄養分が継続的に細胞に取り込まれると脂肪細胞が肥大化し、これにより、インスリンの働きを向上させる物質（アディポネクチン）の分泌量が減る一方、インスリンの働きを阻害する物質（ＴＮＡ−αや遊離脂肪酸）が多く分泌されるようになる。そのため、インスリンの作用効果が低下していき、やがて糖尿病を疾患しうる。
【０００４】
さらに、インスリン抵抗性は、遺伝的影響、並びに特定の栄養素の欠乏、過剰なカロリー摂取及び運動不足などの環境の影響によって生じるものとされている。インスリン抵抗性は、メタボリックシンドロームの主要な因子の１つであることも分かっている。メタボリックシンドロームとは、空腹時の血糖値が高く、糖尿病、高血圧、異常脂血症、腹部肥満、痛風やアテローム性の動脈硬化などを発症させうる総合的な代謝異常をいう。米国では、約４，７００万人もの人間（成人の約４人に１人）がメタボリックシンドロームに罹患していると報告されている（非特許文献１）。
【０００５】
インスリン抵抗性を改善する治療薬の成分として、チアゾリジン誘導体が知られている。該治療薬の作用機序について説明すると、該誘導体が受容体であるＰＰＡＲγに結合し、ＰＰＡＲγの活性を上昇させて、前駆脂肪細胞を肥大化していない正常な脂肪細胞に分化誘導すると同時に、肥大化した脂肪細胞のアポトーシスを誘導する。分化した脂肪細胞は、アディポネクチンを積極的に分泌するため、糖や脂質の代謝が活発になり、血液中からの糖の取り込みが促進され、インスリン抵抗性を改善する。このような脂肪細胞の働きは、糖尿病のみならず、高脂血症の予防や治療に繋がる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】ＪＡＭＡ，２８７，ｐ．３５６−３５９，２００２
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかしながら、上記治療薬は、肝機能障害、浮腫、心肥大やなどの副作用を引き起こす可能性があるという問題があった。
【０００８】
そこで、本発明の目的は、安全性が高く、副作用を引き起こすリスクを低減可能な脂肪細胞分化促進剤を提供することである。
【０００９】
また、本発明の他の目的は、かような脂肪細胞分化促進剤を含有する医薬品または食品を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、安全性が十分に高いと推測される食品を広範にスクリーニングした結果、マッシュルームの抽出物がマウス前駆脂肪細胞（３Ｔ３−Ｌ１）の分化誘導促進作用を有することを見出し、本発明を完成するに至った。さらに、本発明者らは、該抽出物は、糖尿病の予防及び治療に有用であるだけでなく、高脂血症の予防や治療にも有用であることを見出した。
【００１１】
そこで、上記目的を達成するための本発明は、マッシュルームに由来する抽出物から得られ、前駆脂肪細胞から脂肪細胞への細胞分化促進活性を有する、脂肪細胞分化促進剤である。
【００１２】
また、上記目的を達成するための本発明は、前記脂肪細胞分化促進剤を有効成分として含有する、医薬品または食品である。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によれば、前駆脂肪細胞から脂肪細胞への分化が促進されることによって、糖や脂質の代謝が活発になり、血中の糖及び中性脂肪の濃度を低下させることが可能であることから、糖尿病及び高脂血症の予防や治療が可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】実施例２における抽出物５を用いたマウス前駆脂肪細胞（３Ｔ３−Ｌ１）の細胞実験の結果を示す光学顕微鏡写真である。
【図２】実施例４のヒトモニター試験における空腹時血糖値の測定試験の総合的な推移の結果を示すグラフである。
【図３】実施例４のヒトモニター試験における空腹時血糖値の測定試験の検体ごとの推移の結果を示すグラフである。
【図４Ａ】実施例４のヒトモニター試験における空腹時中性脂肪の測定試験のうち、１５０ｍｇ／ｄＬ以上３００ｍｇ／ｄＬ未満の群についての総合的な推移の結果を示すグラフである。
【図４Ｂ】実施例４のヒトモニター試験における空腹時中性脂肪の測定試験のうち、３００ｍｇ／ｄＬ以上の群についての総合的な推移の結果を示すグラフである。
【図５Ａ】実施例４のヒトモニター試験における空腹時中性脂肪の測定試験のうち、１５０ｍｇ／ｄＬ以上３００ｍｇ／ｄＬ未満の群についての検体ごとの推移の結果を示すグラフである。
【図５Ｂ】実施例４のヒトモニター試験における空腹時中性脂肪の測定試験のうち、３００ｍｇ／ｄＬ以上の群についての検体ごとの推移の結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本発明の第一態様は、マッシュルームに由来する抽出物から得られ、前駆脂肪細胞から脂肪細胞への細胞分化促進活性を有する脂肪細胞分化促進剤である。
【００１６】
前記マッシュルームは、生物学的分類でいえば、ハラタケ科（Ａｇａｒｉｃａｃｅａｅ）ハラタケ属（Ａｇａｒｉｃｕｓ）に属するＡｇａｒｉｃｕｓ ｂｉｓｐｏｒｕｓまたはＡｇａｒｉｃｕｓ ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓと表される。
【００１７】
品種に関しては、特に限定されることはなく、ホワイト種、オフホワイト種、クリーム種、ブラウン種、Ａｇａｒｉｃｕｓ ｂｉｔｏｒｑｕｉｓ種などが例示され、いずれも好ましく使用することができる。
【００１８】
また、前記マッシュルームの利用可能な部位についても特に限定されることはなく、傘、ひだ、管孔、柄、肉、つば、つぼ、石突き、グレバ等よりなる部位から選択される一種以上が挙げられる。すなわち、一部位を単独で用いてもよく、また、複数の部位を混合して用いてもよい。
【００１９】
前記マッシュルームに由来する抽出物は、子実体の任意の部位自体若しくはこれを粉砕したもの、各種の溶媒で抽出することにより得ることができる。
【００２０】
前記溶媒としては、水、メタノール、無水エタノール及びエタノール等の低級アルコール、プロピレングリコール及び１，３−ブチレングリコール等の多価アルコール、アセトン等のケトン類、ジエチルエーテル及びジオキサン等のエーテル類、アセトニトリル等のニトリル類、酢酸エチルエステル等のエステル類、ベンゼン及びキシレン等の芳香族類、クロロホルム等の含ハロゲン有機溶媒、ヘキサン及びヘプタン等の脂肪族炭化水素などの有機溶媒よりなる群から選択される一種以上を使用することができる。前記脂肪細胞分化促進剤を食品に含有させる場合には、水及び／またはエタノールを使用することが好ましく、水を使用することがより好ましい。なお、水及びエタノールを混合して使用する場合には、該混合液に対する水の含有率は、１〜９９質量％であることが好ましく、５〜８０質量％であることがより好ましい。
【００２１】
抽出方法については、特に制限されることはないが、常圧または加圧下で、４〜２００℃の温度帯で行われることが好ましく、４０〜１５０℃であることがより好ましい。また、抽出時のｐＨは、１〜１０であることが好ましく、３〜９であることがより好ましい。
【００２２】
上記した条件で抽出を行うことにより、前記抽出物から、脂肪細胞分化促進活性を低下させることなく、脂肪細胞分化促進剤に相当する成分を抽出できる。抽出物そのままの状態で使用することもできるが、抽出物の安定性や品質などの観点から、濾過、合成吸着剤イオン交換樹脂、または活性炭などを用いて吸着、脱色及び／または精製することにより、溶液状、ペースト状、ゲル状または粉末状とすることが好ましい。
【００２３】
また、本発明の第二態様は、前記脂肪細胞分化促進剤を有効成分として含有する、医薬品または食品である。上記第一態様により得られる、マッシュルームに由来する抽出物を、乾燥、濃縮または希釈などにより適宜調製し、場合によってはさらに精製することによって、多様な剤型や形態などを有する医薬品及び食品が得られる。以下、本態様による医薬品及び食品について説明する。
【００２４】
本態様の医薬品としては、インスリン抵抗性に起因する疾病に対する予防剤若しくは治療剤であれば特に制限させることはなく、例えば、糖尿病、高血圧、高脂血症、動脈硬化症などに対する予防剤または治療剤などが挙げられる。
【００２５】
前記医薬品の剤型は、錠剤、丸剤、散剤、粉剤、顆粒剤、シロップ剤、液剤、懸濁剤、乳剤またはカプセル剤などがありえ、これらを患者に経口投与することができる。また、前記医薬品は、軟膏、クリーム、粉状もしくは液状の塗布剤、または貼付剤などの外用剤として経皮的に投与されてもよい。本態様による医薬品の好ましい剤型や投与形態などは、患者の年齢、性別、体質、症状や処置時期などに応じて、医師によって適宜選択される。
【００２６】
一方、前記医薬品のローション剤、クリーム剤及び軟膏などの半固形製剤は、前記医薬品を、脂肪、脂肪油、ラノリン、ワセリン、パラフィン、蝋、硬膏剤、樹脂、プラスチック、グリコール類、高級アルコール、グリセリン、水、乳化剤及び懸濁化剤などよりなる群から選択される一種以上と適宜混和することにより得られる。
【００２７】
前記医薬品に含まれる、本発明による抽出物由来成分の含有量は、抽出方法・条件、投与形態、重篤度や目的とする投与量などによって様々であるが、製剤の全質量に対して０．０１〜８０質量％であることが好ましく、０．１〜５０質量％であることがより好ましい。
【００２８】
また、前記医薬品の投与量は、患者の年齢、体重及び症状、目的とする投与の形態及び方法、治療効果、並びに処置期間などによって異なり、正確な量は医師により決定されるものである。例を挙げるならば、前記医薬品が経口投与される場合には、前記抽出物の投与量換算で、成人に対し１日当り０．１〜２，０００ｍｇを１回または数回に分けて投与されうる。
【００２９】
次に、本態様の食品の種類などについては、特に限定されることはない。すなわち、本発明によるマッシュルームに由来する抽出物には、インスリン抵抗性を改善し、かつ、肝機能障害などの副作用を引き起こすリスクを従来よりも顕著に低減できる脂肪細胞分化促進剤が含まれている。そこで、食事療法は、インスリン抵抗性を改善し、メタボリックシンドロームに罹患するであろう人間に対して、前記食品がメタボリックシンドローム疾患への予防や改善に貢献しうる。
【００３０】
前記食品に含まれる、本発明による抽出物由来成分の含有量は、各食品の組成などによって様々であるため特に限定されることはないが、前記食品の全質量に対して０．０１〜８０質量％であることが好ましく、０．１〜６０質量％であることがより好ましい。上記した範囲内の場合、上記した食事療法などの効果が有意に向上しうる。
【００３１】
前記食品の具体例としては、飴、チューインガム、牛乳、ヨーグルト、乳清飲料、乳酸菌飲料、ジュース、お茶、飲料、アイスクリーム、プディング、水ようかん等が挙げられる。前記食品は、以下に限定されることはないが、前記抽出物に、通常の食品原料として使用されているもの、すなわち、デキストリン、セルロース、ブドウ糖、果糖、ショ糖、マルトース、ソルビトール、ステビオサイド、ルブソサイド、コーンシロップ、乳糖、クエン酸、酒石酸、リンゴ酸、コハク酸、乳酸、Ｌ−アスコルビン酸、ｄｌ−α−トコフェロール、エリソルビン酸ナトリウム、グリセリン、プロピレングリコール、グリセリン脂肪酸エステル、ポリグリセリン脂肪酸エステル、ショ糖脂肪酸エステル、ソルビタン脂肪酸エステル、プロピレングリコール脂肪酸エステル、アラビアガム、カラギーナン、カゼイン、ゼラチン、ペクチン、寒天、ビタミンＢ類、ニコチン酸アミド、パントテン酸カルシウム、アミノ酸類、カルシウム塩類、色素、香料及び保存剤よりなる群から選択される１種以上を適宜配合することによっても得られる。
【００３２】
なお、本発明の範囲は、上記した実施態様に限定されるものではなく、当業者であれば、本発明の要旨を逸脱しない範囲内において種々の変更を加えることができる。
【実施例】
【００３３】
本発明について、下記の実施例によりさらに詳細に説明するが、当該実施例はあくまで例示にすぎず、本発明は以下に限定されることはない。
【００３４】
［実施例１］
（抽出物１〜７の調製方法・条件）
市販のマッシュルーム（Ａｇａｒｉｃｕｓ ｂｉｔｏｒｑｕｉｓ）２００ｇを包丁にて細断後、６００ｍｌの溶媒を加えて攪拌し、有効成分の抽出を行った。なお、抽出条件（抽出温度、時間及び溶媒の種類）を下記表１に示す。なお、抽出に用いた水は、蒸留水であり、ｐＨ調整は行っていない。その後、不溶物をろ過し、得られた上澄み液をエバポレーターで部分濃縮後、凍結乾燥機にて処理を行い、粉末を得た。
【００３５】
（抽出物８の調製方法・条件）
市販のマッシュルーム（Ａｇａｒｉｃｕｓ ｂｉｔｏｒｑｕｉｓ）２００ｇを包丁にて細断後、ｐＨ１に調整した水を６００ｍｌ加えて、攪拌し、有効成分の抽出を行った。なお、抽出条件（抽出温度、時間など）を下記表１に示す。抽出後、不溶物をろ過し、得られた上澄み液のｐＨを水酸化ナトリウム水溶液により７とした。該上澄み液をエバポレーターで部分濃縮後、凍結乾燥機にて処理を行い、粉末を得た。
【００３６】
（抽出物９の調製方法・条件）
市販のマッシュルーム（Ａｇａｒｉｃｕｓ ｂｉｔｏｒｑｕｉｓ）２００ｇを包丁にて細断後、水を６００ｍｌ加えて、オートクレーブ処理による抽出を行った。なお、抽出条件（抽出温度、時間及び溶媒の種類）を下記表１に示す。オートクレーブ終了後、不溶物をろ過し、得られた上澄み液をエバポレーターで部分濃縮後、凍結乾燥機にて処理を行い、粉末を得た。
【００３７】
上記の各抽出物における収率（固形分率）を下記表１に示す。
【００３８】
【表１】
【００３９】
［実施例２］
マッシュルーム抽出物のマウス前駆脂肪細胞（３Ｔ３−Ｌ１）の分化促進活性の評価
マウス前駆脂肪細胞（３Ｔ３−Ｌ１）は、通常培養の条件下においては、線維芽細胞様の形態を示す。しかし、インスリン刺激を与えることにより、３Ｔ３−Ｌ１細胞は、その細胞内に脂肪粒を形成し、脂肪細胞に分化する。よって、前駆脂肪細胞内への脂肪の取り込み量を指標として、前駆脂肪細胞から脂肪細胞への分化促進活性を評価することができる。
【００４０】
３Ｔ３−Ｌ１細胞の脂肪細胞への分化誘導は以下の方法で行った。培養細胞（３Ｔ３−Ｌ１）をトリプシン処理により回収し、４℃、１０００ｒｐｍで３分間遠心分離を行った後、成長培地（ｇｒｏｗｔｈ ｍｅｄｉｕｍ）で細胞を懸濁させ、２４穴プレートの各ウェルに４．２×１０４個となるように細胞をまいた。５％ＣＯ２存在下、３７℃で７２時間培養後、実施例１で得られた抽出物を水に溶解させ１００ｍｇ／ｍｌの濃度とし、ろ過滅菌後、培養液中の最終濃度が１ｍｇ／ｍｌとなるようにウェルに添加し、５％ＣＯ２存在下、３７℃で３０分間静置した。その後、デキサメタゾン（Ｗａｋｏ社）、イソブチルメチルキサンチン（Ｗａｋｏ社）及びインスリン（Ｒｏｃｈｅ社）をそれぞれ最終濃度２０μＭ、１０μＭ及び０．０８５μＭとなるように添加した。４８時間後、成長培地を交換し、同濃度の抽出物を再度添加した。さらに、インスリンを最終濃度０．０８５μＭとなるように加えた。その後、３日間隔で、培地交換、抽出物添加及びインスリンの添加を反復して行い、計９日間培養を行った。得られた細胞をＰＢＳ（−）０．５ｍｌを用いて２回洗浄した後、１０％中性緩衝ホルマリン液０．５ｍｌを静かに加え、３０分間静置することにより固定した。その後、ＰＢＳ（−）０．５ｍｌを用いて１回洗浄し、Ｏｉｌ Ｒｅｄ Ｏ 染色液（Ｏｉｌ Ｒｅｄ Ｏ ６０％イソプロパノール飽和溶液）０．５ｍｌを静かに加え、９０分間静置した。さらにＰＢＳ（−）０．５ｍｌを用いて１回洗浄した後、染色された脂肪粒を光学顕微鏡を用いて観察することにより、分化誘導の有無を下記の方法で評価した。
【００４１】
なお、ポジティブコントロールの細胞群として、上記抽出物を細胞に添加せず、インスリンを最終濃度が１．７μＭとなるように添加した点以外は、上記の方法・条件と同様にして分化誘導させた細胞群を用意した。さらに、ネガティブコントロールの細胞群として、上記抽出物を細胞に添加しない点以外は、上記の方法・条件と同様にして分化誘導させた細胞群を用意した。そして、上記各抽出物を与えられた細胞群（インスリン濃度０．０８５μＭ）、ポジティブコントロールの細胞群（インスリン濃度１．７μＭ）、及びネガティブコントロールの細胞群（インスリン濃度０．０８５μＭ）における分化誘導促進活性を比較した。具体的には、インスリン濃度１．７μＭにおける分化度を１００％、０．０８５μＭにおける分化度を０％とした時の、各抽出物を添加した細胞群における分化度の割合で、分化誘導の促進度を評価した。その際の基準を下記表２に示す。
【００４２】
【表２】
【００４３】
結果を下記表３に示す。
【００４４】
【表３】
【００４５】
上記表３に示した結果より、抽出物１、２、５、６、７、８及び９において、約８０〜１００％の分化度、すなわち優れた分化誘導促進活性が認められることを見出した。
【００４６】
ここで、図１は、上記の抽出物５を用いたマウス前駆脂肪細胞（３Ｔ３−Ｌ１）の細胞実験の結果を示す光学顕微鏡写真である。図中、左はネガティブコントロール群の３Ｔ３−Ｌ１、右は抽出物５を添加した（抽出物濃度：１ｍｇ／ｍｌ）３Ｔ３−Ｌ１をそれぞれ染色した結果を示している。抽出物５を添加すると、脂肪粒が多数発生することが分かる。
【００４７】
［実施例３：マウスを用いたマッシュルーム抽出物の効果試験（動物実験）］
＜試験動物及び飼育条件＞
試験には、薬効薬理試験に一般的に用いられている動物種で、その系統維持が明らかな雄性マウスであるＫＫ−Ａｙ Ｔａ／Ｊｃｌ（ＳＰＦ、日本クレア株式会社）を使用した。動物は、５週齢を入手した。入手後１日の体重範囲は、２３．３〜２８．９ｇであった。入手した動物は、５日間の検疫期間、その後３日間の馴化期間を設け、この間に体重測定を３回、一般状態の観察を１日１回行って、これらに異常の認められなかった動物を試験に用いた。
【００４８】
動物は、設定温度２３℃（実測値：２１．５〜２４．０℃）、設定湿度５５％（実測値：３９．６〜５８．２％）、明暗各１２時間（照明：午前６時〜午後６時）、換気回数１２回／時（フィルターを通した新鮮空気）に維持された飼育室で飼育した。動物は、検疫・馴化期間中及び群分け後を通じて、オートクレーブ処理した床敷を入れた平床式プラスチック製ケージ（Ｗ：１７５×Ｄ：２４５×Ｈ：１２５ｍｍ）を用いて個別飼育をした。ケージ（床敷を含む）及び給水瓶の交換は１週間に２回以上行い、給餌器の交換は２週間に１回以上行った。動物飼育室の清掃・消毒は毎日行った。
【００４９】
飼料は、検疫・馴化期間中及び群分け後のコントロール群では、製造後５ヵ月以内の粉末飼料（ＣＲＦ−１、オリエンタル酵母工業株式会社）を給餌器に入れ、自由に摂取させた。群分け後の抽出物５群では、抽出物５を３％（ｗ／ｗ）混合した飼料を給餌器に入れ、自由に摂取させた。
【００５０】
飲料水は、水道水を、給水瓶を用いて自由に摂取させた。
【００５１】
＜群分け法及び個体識別法＞
群分けは、コンピュータを用いた無作為法により、群分け日の血中グルコース（Ｇｌｕ）及び群分け日の体重がほぼ等しくなるよう、投与開始日に行った。なお、群分け時には、Ｇｌｕの低値または高値を示した動物を群分け対象から除外した。
【００５２】
＜投与＞
投与は、上記の抽出物を混合した飼料を、マウス用粉末給餌器を用いて自由に摂取させた。投与期間は、投与開始日を投与１日とし、３３日間とした。
【００５３】
＜試験群＞
試験群等の詳細について、下記表４にまとめて示す。
【００５４】
【表４】
【００５５】
＜試験方法＞
共通事項として、投与期間中は１日１回、一般状態の観察を行った。以下、各試験方法及びその結果について具体的に説明する。
【００５６】
＜空腹時血糖値の測定試験及びその結果＞
上記の混餌（経口）投与後３２日目に実施した。前日より給水下にて１８時間以上絶食させた動物に対して眼窩静脈叢から約５０μＬ採血し、グルコースＣＩＩ−テストワコー（和光純薬工業株式会社）を使用し、分光光度計（Ｕ−３０１０、日立ハイテクフィールディング）にてＧｌｕを測定した。
【００５７】
結果として、コントロール群では、血糖値は１３０．２±３．８ｍｇ／ｄＬであったのに対し、抽出物５の３％群の血糖値は１１９．１±７．６ｍｇ／ｄＬであり、コントロール群と比較して低値を示した。なお、各個体及び全体の結果を下記表５に示す（Ｇｌｕ（ｍｇ／ｄＬ））。
【００５８】
【表５】
【００５９】
＜ＨｂＡ１ｃの測定試験及びその結果＞
投与３３日に実施した。４％ペントバルビタール麻酔（１ｍＬ／ｋｇ，ｉ．ｐ．）後、注射針を取り付けたポリプロピレン製注射筒を用いてヘパリン存在下で、腹大動脈から採血（約０．８ｍＬ）した。そして、生化学自動分析装置（ＡＵ４００、オリンパス株式会社）を用いて、遠心分離後の残渣についてＨｂＡ１ｃを測定した。
【００６０】
結果として、コントロール群ではＨｂＡ１ｃが５．９±０．３％であったのに対し、抽出物５の３％群ではＨｂＡ１ｃが５．１±０．３％であり、コントロール群と比較してＨｂＡ１ｃは有意に低値であった（ｐ＜０．０５ ｖｓ コントロール群、ｔ検定）。なお、各個体及び全体の結果を下記表６に示す（ＨｂＡ１ｃ（％）：検体投与後３３日）。
【００６１】
【表６】
【００６２】
［実施例４：ヒトを用いたマッシュルーム抽出物の効果試験（臨床実験）］
＜ヒトのモニター試験用の抽出物の調製方法＞
市販の生マッシュルーム７０ｋｇを測り採り、水洗したものに、等量の水道水７０ｋｇを加え、マスコロイダーにて破砕し、マッシュルーム破砕物を得た。得られたマッシュルーム破砕物に、水道水１４０ｋｇを加えた。その後、生マッシュルームの質量に対して、１．０５質量％となるようにクエン酸７３５ｇ添加し、ｐＨを４とした。その後、マッシュルーム破砕物の細胞壁を部分的に分解し、且つ殺菌工程として８５℃で１０分間加熱して、マッシュルーム破砕加熱物を得た。
【００６３】
次に、マッシュルーム破砕加熱物を４０℃まで冷却した後、マッシュルーム破砕加熱物に、生マッシュルームの質量に対して、０．１質量％となるようにセルラーゼ製剤７０ｇを水道水２００ｍｌに懸濁させながら添加し、４０℃で１時間緩やかに攪拌させながら酵素処理を行い、マッシュルーム破砕酵素処理物を得た。
【００６４】
次に、マッシュルーム破砕酵素処理物を６０℃まで加温し、２時間、緩やかに攪拌させながら熱水抽出を行い、マッシュルーム抽出物を得た。
【００６５】
その後、多板式遠心分離機にて遠心分離を行った後、濾紙及びセライト＃２０００で濾過を行い、残渣を除いて抽出液を得た。
【００６６】
得られた抽出液を減圧濃縮機にて６０℃で濃縮して濃縮液を得た。その後、１１０℃で５分間滅菌処理を行い、滅菌抽出液を得た。そして、滅菌抽出液のＢｒｉｘを測定し、固形物換算値に対してデキストリンを３０％添加し、スプレードライ処理により抽出物の乾燥粉末５．４９ｋｇを得た。
【００６７】
＜ヒトモニター試験方法＞
下記の表７に試験項目及び試験内容を纏める。
【００６８】
【表７】
【００６９】
さらに、表８に対象者の内訳を示し、表９に評価項目等を示す。
【００７０】
【表８】
【００７１】
【表９】
【００７２】
＜空腹時血糖値の測定試験及びその推移の結果＞
空腹時血糖値は、ヘキソキナーゼＵＶ法を用いて測定した。その際、機器としてＪＣＡ−ＢＭシリーズ 自動分析装置 クリナライザ（ＪＣＡ−ＢＭ９０２０、日本電子株式会社）を用い、試薬としてクイックオート ネオＧＬＵ−ＨＫ（シノテスト社）を用いた。
【００７３】
試験前の空腹時血糖値が１００ｍｇ／ｄＬ以上の群（７人）において、試験前の血糖値は１１１．０±１４．１ｍｇ／ｄＬであったのに対し、試験後の血糖値は１０７．０±１４．８ｍｇ／ｄＬとなった。かかる結果より、試験前の血糖値と比較して、試験後の血糖値は平均値として約９６％となり、血糖値が低下することが分かった。なお、各個体及び全体の試験前後での結果を下記表１０に示す（Ｇｌｕ（ｍｇ／ｄＬ））。
【００７４】
【表１０】
【００７５】
ここで、表１０に示した結果を図２及び図３に示す。
【００７６】
＜空腹時の中性脂肪値の測定及びその推移の結果＞
中性脂肪（ＴＧ）は、酵素法（ＧＫ−ＧＰＯ・遊離グリセロール）を用いて測定した。その際、機器として日立７６００を用い、試薬としてピュアオートＳ ＴＧ−Ｎ（積水メディカル株式会社）を用いた。
【００７７】
試験前の空腹時血糖値が１５０ｍｇ／ｄＬ以上３００ｍｇ／ｄＬ未満の群（８人）において、試験前の中性脂肪値は２０４．９±４２．０ｍｇ／ｄＬであったのに対し、試験後の中性脂肪値は１３４．１±４３．１ｍｇ／ｄＬであった（ｐ＜０．０１ ｖｓ 試験前、ｔ検定）。一方、３００ｍｇ／ｄＬ以上の群（３人）において、試験前の中性脂肪値は４３０．３±４７．０ｍｇ／ｄＬであったのに対し、試験後の中性脂肪値は２７５±６０．８ｍｇ／ｄＬであった。かかる結果より、試験前の中性脂肪値と比較して、試験後の中性脂肪値は平均値として、それぞれ約６５％（１５０ｍｇ／ｄＬ以上３００ｍｇ／ｄＬ未満の群）及び約６４％（３００ｍｇ／ｄＬ以上の群）となり、試験前後で顕著に中性脂肪値が低下することが分かった。なお、各個体及び全体の試験前後での結果を下記表１１に示す（単位：ｍｇ／ｄＬ）。
【００７８】
【表１１】
【００７９】
ここで、表１１に示した結果を図４Ａ及び図４Ｂ、並びに図５Ａ及び５Ｂに示す。なお、図４Ａ及び図５Ａは１５０ｍｇ／ｄＬ以上３００ｍｇ／ｄＬ未満の群についての結果を表し、図４Ｂ及び図５Ｂは３００ｍｇ／ｄＬ以上の群についての結果を表す。
【産業上の利用可能性】
【００８０】
本発明は、優れた前駆脂肪細胞分化促進作用を有し、かつ安全性も高いため、各種の医薬品または食品に好適に利用可能である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
マッシュルームに由来する抽出物から得られ、前駆脂肪細胞から脂肪細胞への細胞分化促進活性を有する、脂肪細胞分化促進剤。
【請求項２】
前記抽出物は、水またはエタノール水溶液により抽出されたものである、請求項１に記載の脂肪細胞分化促進剤。
【請求項３】
前記脂肪細胞分化促進剤を有効成分として含有する、医薬品または食品。
【請求項１】
マッシュルームに由来する抽出物から得られ、前駆脂肪細胞から脂肪細胞への細胞分化促進活性を有する、脂肪細胞分化促進剤。
【請求項２】
前記抽出物は、水またはエタノール水溶液により抽出されたものである、請求項１に記載の脂肪細胞分化促進剤。
【請求項３】
前記脂肪細胞分化促進剤を有効成分として含有する、医薬品または食品。
【図２】
【図３】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【図５Ａ】
【図５Ｂ】
【図１】
【図３】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【図５Ａ】
【図５Ｂ】
【図１】
【公開番号】特開２００９−２６３３４４（Ｐ２００９−２６３３４４Ａ）
【公開日】平成２１年１１月１２日（２００９．１１．１２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−７０５８６（Ｐ２００９−７０５８６）
【出願日】平成２１年３月２３日（２００９．３．２３）
【出願人】（０００１０６７７１）シーシーアイ株式会社 (245)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２１年１１月１２日（２００９．１１．１２）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年３月２３日（２００９．３．２３）
【出願人】（０００１０６７７１）シーシーアイ株式会社 (245)
【Ｆターム（参考）】
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