脳への送達のための抗体および免疫複合体のバインダーとしてのプロテインＡをディスプレイする繊維状バクテリオファージ
本発明は、プロテインＡまたは抗体のＦｃ部分に結合することができるそのフラグメントもしくは変異体を非繊維状バクテリオファージ分子としてその表面にディスプレイする繊維状バクテリオファージ、ならびにプロテインＡまたはそのフラグメントもしくは変異体にそのＦｃ部分により結合した抗体または抗原−抗体免疫複合体を含む、ファージディスプレイビヒクルに関する。このファージディスプレイビヒクルは、医薬組成物に処方されそして脳の疾患、障害または状態を処置／抑制または診断するのに使用することができる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、脳への抗体および免疫複合体の送達のための繊維状バクテリオファージディスプレイビヒクルならびに診断および治療におけるその使用に関する。
【０００２】
関連技術の説明
ファージディスプレイ
コンビナトリアルファージディスプレイペプチドライブラリーは、タンパク質：タンパク質相互作用を研究するための効率的な手段を提供する。この技術は、対応する遺伝子的青写真と関連したランダムペプチドの非常に大きいコレクションの産生に頼る(Scott et al, 1990; Dower, 1992; Lane et al, 1993; Cortese et al, 1994; Cortese et al, 1995; Cortese et al, 19956)。ランダムペプチドの提示は、Ｍ１３、ｆｄおよびｆ１などの繊維状バクテリオファージの外側表面に発現されたキメラタンパク質を構築することによりしばしば達成される。この提示は、所望の結合性を有するペプチドのアフィニティー単離および同定をもたらす結合アッセイを受けやすいレパートリーおよび特異化されたスクリーニングスキーム（バイオパニングと呼ばれる(Parmley et al, 1988)）を作る。この方法において、レセプターに結合するペプチド(Koivunen et al, 1995; Wrighton et al, 1996; Sparks et al, 1994; Rasqualini et al,1996)、酵素に結合するペプチド（Matthews et al, 1993; Schmitz et al, 1996）または抗体に結合するペプチド(Scott et al, 1990; Cwirla et al, 1990; Felici et al, 1991; Juzzago et al, 1993; Hoess et al, 1993; Bonnycastle et al, 1966)は効果的に選ばれた。
【０００３】
繊維状バクテリオファージは、Ｆエピソームを担持するEscherichia coli細胞に感染する非溶菌性雄特異的バクテリオファージである(概説として、Model et al, 1988参照)。繊維状ファージ粒子は、環状一本鎖ＤＮＡゲノム（＋鎖）を含有する９００nm長および１０nmの細い管状構造のように見える。ファージのライフサイクルは、バクテリアのＦ線毛へのファージの結合、次いでホストへの一本鎖ＤＮＡゲノムの侵入を含む。環状一本鎖ＤＮＡは、ホスト複製装置により認識されそして相補性第２ＤＮＡ鎖の合成はファージｏｒｉ（−）構造において開始される。二本鎖ＤＮＡ複製形体は、ｏｒｉ（＋）構造で開始する一本鎖ＤＮＡ環状ファージゲノムの合成のためのテンプレートである。これらは、最終的にビリオンにパッケージされそしてファージ粒子は溶菌またはホストへの見かけの損傷を引き起こさないでバクテリアから押し出される。
【０００４】
ペプチドディスプレイシステムは、ファージの２つの構造タンパク質：ｐＩＩＩ（Ｐ３）タンパク質およびｐＶＩＩＩタンパク質を利用した。ｐＩＩＩタンパク質は、ファージ当たり５コピーで存在しそしてビリオンの１つの先端に排他的に見出される(Goldsmith et al, 1977)。ｐＩＩＩタンパク質のＮ末端ドメインは、感染プロセスのために必要なノブ様構造を形成する。(Gray et al, 1981)。それは、Ｆ線毛の先端へのファージの吸着および次いでバクテリアホスト細胞への一本鎖ＤＮＡの透過およびトランスロケーションを可能とする(Holliger et al, 1997)。ｐＩＩＩタンパク質は、広範な改変を許容することができ、したがってそのＮ末端にペプチドを発現するのに使用された。外来ペプチドは、６５までのアミノ酸残基の長さであったが(Bluthner et al, 1996; Kay et al, 1993)、ある場合には、ｐＩＩＩ機能に顕著に影響を与えることなく完全長タンパク質と同じ大きさですらあった(McCafferty et al, 1990; McCafferty et al, 1992)。
【０００５】
一本鎖ファージＤＮＡを取り囲んでいる円筒形タンパク質エンベロープは、２７００コピーの主要コートタンパク質、ｐＶＩＩＩ、５０アミノ酸残基からなるα−ヘリカルサブユニットからなる。ｐＶＩＩＩタンパク質それ自体は、タンパク質のαヘリックスがビリオンの長軸に対して浅い角度で位置して、ヘリカルパターンで配置されている(Marvin et al, 1994)。このタンパク質の一次構造は、３つの別々のドメイン：（１）酸性アミノ酸に富みそして外側環境に暴露されたＮ末端部分；（２）（ｉ）ファージ粒子におけるサブユニット：サブユニット相互作用および（ｉｉ）ホスト細胞における膜貫通機能の責任を担う中心疎水性ドメイン；および（３）ファージの内部に埋め込まれておりそしてファージＤＮＡと関連しているＣ末端でクラスター化された塩基性アミノ酸を含有する第３ドメインを含有する。ｐＶＩＩＩは、２３アミノ酸リーダーペプチドを含有するプレコートタンパク質として合成され、該リーダーペプチドはバクテリアの内側膜を横切ってトランスロケーションされると開裂されて成熟５０残基膜貫通タンパク質を生じさせる(Sugimoto et al, 1977)。ディスプレイスカフォールドとしてのｐＶＩＩＩの使用は、それがそのＮ末端に６より長くない残基のペプチドの付加を許容するという事実により妨害される。より大きいインサートはファージアセンブリーを妨害する。しかしながら、より大きいペプチドの導入は、リコンビナントペプチド含有ｐＶＩＩＩタンパク質を野生型ｐＶＩＩＩとｉｎ ｖｉｖｏ混合することにより、混合モザイクファージが産生されるシステムにおいて可能である(Felicit et al, 1991; Greenwood et al, 1991; Willis et al, 1993) 。これは、ファージ粒子のアセンブリー期間中野生型コートタンパク質を点在させたファージ表面で低密度（粒子につき１０〜数１００コピー）でキメラｐＶＩＩＩタンパク質の組み込みを可能とする。モザイクファージ゛の発生を可能とする２つのシステムが使用された：Smith(Smith, 1993)により命名された「タイプ８＋８」および「タイプ８８」システム。
【０００６】
「タイプ８＋８」はシステムは、２つの異なる遺伝子単位において別々に位置した２つのｐＶＩＩＩ遺伝子を有することに基づいている(Felicit et al, 1991; Greenwood et al, 1991; Willis et al, 1993)。リコンビナントｐＶＩＩＩ遺伝子は、ファージミド、即ち、その自身の複製起点に加えて、ファージの複製起点およびパッケージングシグナルを含有するプラスミド上に位置している。野生型ｐＶＩＩＩタンパク質は、ファージミドを抱えるバクテリアにヘルパーファージを重複感染させることにより供給される。更に、ヘルパーファージは、ファージミドおよびヘルパーゲノムの両方をビリオンにパッケージするファージ複製およびアセンブリー装置を与える。したがって、２つのタイプの粒子は、このようなバクテリア、ヘルパーおよびファージミドにより分泌され、その両方がリコンビナントｐＶＩＩＩタンパク質および野生型ｐＶＩＩＩタンパク質の混合物を組み込んでいる。
【０００７】
「タイプ８８」システムは、１つのおよび同じ感染性ファージゲノムにおいて２つのｐＶＩＩＩ遺伝子を含有することにより恩恵を受ける。したがって、これはヘルパーファージおよび重複感染を不要にする。更にたった１つのタイプのモザイクファージが産生される。
【０００８】
ファージゲノムは、１０のタンパク質をコードし（ＰＩ〜ＰＸ）、そのすべては感染性子孫の産生のために必須である(Felicit et al, 1991)。タンパク質のための遺伝子は、２つの非コード領域により分離された２つの堅く詰め込まれた転写単位において構成される(Van Wezenbeek et al, 1980)。「遺伝子間領域」（ｐＩＶとｐＩＩ遺伝子間に位置しているものとして定義された）と呼ばれる1つの非コード領域は、ＤＮＡ複製の（＋）および（−）起点およびカプシド形成の開始を可能とするファージのパッケージングシグナルを含有する。この遺伝子間領域の一部は必須ではない(Kim et al, 1981; Dotto et al, 1984)。更に、この領域は、いくつかの部位で外来ＤＮＡの挿入を許容することができことが見出された(Messing, 1983; Moses et al, 1980; Zacher et al, 1980)。ファージの第２非コード領域は、ｐＶＩＩＩとｐＩＩＩ遺伝子間に位置し、そしてPluckthun(Krebber et al, 1995)により例示されたとおり外来リコンビナント遺伝子を組み込むためにも使用された。
【０００９】
ファージディスプレイによる免疫化
エピトープからなる低分子合成ペプチドは、ペプチドの化学合成を必要とする一般に不十分な抗原でありそして大きな担体にカップリングされる必要があるが、その場合ですら、それらは低アフィニティー免疫応答を誘導する可能性がある。抗原としてＥＦＲＨペプチドのみをディスプレイする繊維状ファージを使用して抗ＡβＰ抗体を生じさせるための免疫感作の方法が本発明者の研究所で開発された(Frenkel et al., 2000 and 2001)。繊維状バクテリオファージは、ファージコートタンパク質をコードする遺伝子の５’端部にランダムなオリゴヌクレオチドをクローニングすることにより発生したペプチドの大きなレパートリーのそれらの表面での「ディスプレイ」のために近年広範に使用されている(Scott and Smith, 1990; Scott, 1992)。最近報告されたとおり、繊維状バクテリオファージは、種々の生物学的製剤における外来ペプチドの発現および提示のための優れたビヒクルである(Greenwood et al., 1993; Medynski, 1994)。繊維状ファージの投与は、ファージ効果システムに対する強い免疫学的応答を誘導する(Willis et al., 1993; Meola et al., 1995)。上記したファージコートタンパク質ｐＩＩＩおよびｐＶＩＩＩは、ファージディスプレイのためにしばしば使用されてきたタンパク質である。
【００１０】
その線状構造により、繊維状ファージは、異なる種類の膜に対する高い透過性を有し(Scott et al., 1990)そして、嗅索に続いて、大脳辺縁系を介して海馬区域に到達して疾患のある部位をターゲティングする。クロロホルムによる繊維状ファージの処理は、線状構造を環状構造に変え、環状構造は脳へのファージの送達を阻止する。
【００１１】
抗体エンジニアリング
抗体エンジニアリング法は、ｍＡｂｓの生物学的活性を維持しながらｍＡｂｓのサイズ（１３５〜９００kDa）を最小化するために適用された(Winter et al., 1994)。これらの技術およびＰＣＲ技術を適用して大きな抗体遺伝子レパートリーを作り出すことは、抗体ファージディスプレイを一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）抗体の単離および特徴付けのための多様なツールとする(Hoogenboom et al., 1998)。ｓｃＦｖは更なる操作のためにファージの表面にディスプレイすることができ、または可溶性ｓｃＦｖ（〜２５kd）フラグメントとして放出されうる。本発明者の研究所は、親ＩｇＭ分子に類似した抗凝集性を示すｓｃＦｖを工学的に作成した(Frenkel et al., 2000a)。ｓｃＦｖ構築のために、抗ＡβＰ ＩｇＭ ５０８ハイブリドーマからの抗体遺伝子をクローニングした。分泌された抗体は、ＡβＰ分子に対して、培養されたＰＣ１２細胞に対するその毒性効果を阻止することにおいて、特異的活性を示した。部位特異的一本鎖Ｆｖ抗体は、細胞内または細胞外アプローチを介して脳に治療抗体をターゲティングための第１段階である。
【００１２】
プロテインＡ：
Staphylococcus aureusのプロテインＡは、免疫グロブリン、特にＩｇＧクラスのＦｃ部分へのそのアフィニティーにより特徴付けられた細胞壁構成成分である(Goding, 1978)。それはヒト、マウス、ブタ、モルモットおよびウサギのＩｇＧ抗体に結合する。マウスにおいては、プロテインＡは高いアフィニティーでＩｇＧ２ａおよびＩｇＧ２ｂ抗体に結合するが、ＩｇＧ１およびＩｇＧ３抗体にはあまりよく結合しない(Goudswaard et al., 1978)。プロテインＡは、アスパラギン酸およびグルタミン酸に富むかシステインを欠いた４つの反復ドメインを有する４２kDaタンパク質である。ＩｇＧ結合ドメイン（ドメインＢ）は、３つの逆平行αヘリックスからなり、その第３はこのタンパク質がＦｃと複合体化されるとき分裂する(disrupted)(Graille et al., 2000)。
【００１３】
プラーク形成疾患
プラーク形成疾患は、脳におけるアミロイドプラーク沈着の存在およびニューロン変性により特徴付けられる。アミロイド沈着物は、不溶性塊に凝集したペプチドにより形成される。ペプチドの性質は異なる疾患において変わるが、多くの場合に、凝集物はβひだ状シート構造(beta-pleated sheet structure)を有しそしてコンゴーレッド染料で染まる。早期発症アルツハイマー病、後記発症アルツハイマー病および前兆アルツハイマー病を含むアルツハイマー病（ＡＤ）の他に、アミロイド沈着により特徴付けられる他の疾患は、例えば、ＳＡＡアミロイドーシス、遺伝性アイスランド症候群、多発性ミエローマおよびプリオン病である。動物において最もよくあるプリオン病は、ヒツジおよびヤギのスクラピーおよびウシ海綿状脳症（ＢＳＥ）である(Wilesmith and Wells, 1991)。４つのプリオン病：（ｉ）クールー病、（ｉｉ）クロイツフェルト−ヤコブ症候群、（ｉｉｉ）ゲルストマン−ストロイスラー−シヤインカー病(Gerstmann-Streussler-Sheinker Disease(GSS)および（ｉｖ）致死的家族性不眠症(fatal familial insomnia(FEI)(Gajdusek, 1977; and Tritschler et al. 1992)が同定された。
【００１４】
プリオン病は、正常細胞プリオンタンパク質（ＰｒＰＣ）の対応するスクラピーアイソフォーム(scrapie isogorm)（ＰｒＰＳｃ）への転換を含む。顕微鏡的測定は、ＰｒＰＣのスクラピーアイソフォーム（ＰｒＰＳｃ）への転換が主要コンフォメーション転移(major conformation transition)を伴うことを示しており、これは、他のアミロイドゲニック病(amyloidogenic diseases)と同様に、プリオン病がタンパク質コンフォメーションの障害であることを示唆している。ＰｒＰＣからＰｒＰＳｃへの転移は、α−ヘリカル二次構造の減少（４２％から３０％）およびβシート含有率の顕著な増加（３％から４３％）により伴われる(Caughey et al, 1991; and Pan et al, 1993)。この再構成(rearrangement)は、非変性性洗剤中への不溶性およびプロテオリシスに対する部分的抵抗を含む異常な物理化学的性質と関連している。これまでの研究は、ヒトＰｒＰの残基１０６〜１２６（Ｐｒｐ１０６〜１２６）と相同性の合成ペプチドは、ＰｒＰＳｃの病原性および物理化学的性質のいくらかを示すことを示した(Selvaggini et al, 1993; Tagliavini et al, 1993; and Forloni et al, 1993)。このペプチドは、種々の環境において異なる二次構造を獲得する、顕著なコンフォメーション多型を示す(De Gioia et al, 1994)。それは、緩衝化溶液中でβシートコンフォメーションを採る傾向がありそしてプロテアーゼによる消化に対して部分的に抵抗性であるアミロイドフィブリルに凝集する傾向がある。抗体３Ｆ４とそのペプチドエピトープ（ＰｒＰ１０４〜１１３）の複合体のＸ線結晶学的研究は、プリオン病の進展に必須のコンフォメーション再構成(conformational rearrangement)の成分であると考えられるこの柔軟性領域の構造的な見解を示した。(Kanyo et al, 1999)。
【００１５】
アルツハイマー病（ＡＤ）は、老人性痴呆をもたらす進行性疾患である。広く言えば、この疾患は２つの種類：老齢（典型的には６５歳以上）で起こる後期発症および老年期の前、例えば３５〜６０歳でよく発生する早期発症に属する。両タイプの疾患において、病態は同様であるが、異常は、より早齢で始まる場合により重篤でありそして広がる傾向がある。疾患は、脳における２つのタイプの損傷、老人斑および神経原繊維変化(neurofibrillary tangles)により特徴付けられる。老人班は、脳組織の切片の顕微鏡解析により見ることができる、中心での細胞外アミロイド沈着物の直径で１５０mmまでの解体した好中球の区域である。神経原繊維変化はペアにおいてお互いのまわりに撚り合わされた２つのフィラメントからなるタウタンパク質の細胞内沈着物である。
【００１６】
老人斑の主成分は、アミロイドベータ（Ａβ）またはベータアミロイドペプチド（βＡＰまたはβＡ）と呼ばれるペプチドである。アミロイドベータペプチドは、アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）と呼ばれる前駆体タンパク質の３９〜４３アミノ酸の内部フラグメントである。ＡＰＰタンパク質内のいくつかの突然変異は、アルツハイマー病の存在と相関していた(Goate et al,(1991)、バリン717 がイソロイシンに; Chartier Harlan et al, (1991),バリン 717 がグリシンに; Murrell et al, (1991), バリン 717 がフェニルアラニンに; Mullan et al, (1992), リシン５９５−メチオニン５９６をアスパラギン５９５−ロイシン５９６に変える二重突然変異)。
【００１７】
このような突然変異は、ＡＰＰのベータアミロイドへの増加したもしくは変化したプロセシング、特にＡＰＰの増加した量の長い形態のベータアミロイドへのプロセシング（即ち、Ａβ１−４２およびＡβ１−４３）によりアルツハイマー病を引き起こすと考えられる。プレセニリン遺伝子、ＰＳ１およびＰＳ２などの他の遺伝子における突然変異は、ＡＰＰのプロセシングに間接に影響を与えて増加した量の長い形態のベータアミロイドを発生させると考えられる(Hardy, TINS 20, 154,1997参照)。これらの観察は、ベータアミロイドおよび特にその長い形態がアルツハイマー病における原因的エレメントであることを示す。
【００１８】
アミロイド繊維に関する刊行物は、円筒形ベータシートがＸ線および電子顕微鏡データのいくらかと合致した唯一の構造でありそしてアルツハイマーＡβフラグメントおよび変異体の繊維は、多分、２つまたは３つの同心円筒形βシートからなることを示す(Perutz et al., 2002)。完全なＡβペプチドは、４２残基、丁度円筒形シェルの核を形成する(nucleate)ための正しい数、を含有し；この発見および、プロリンの不存在下にＡβペプチドからなるβシートにおける多くの可能な強い静電気的相互作用は、Ａβペプチドのアルツハイマー患者において見出された細胞外アミロイドプラークを形成する傾向の原因となる。もしこの解釈が正しいとすれば、アミロイドは、中心が水で充填されたキャビティーを有する細いチユ−ブ（ナノチューブ）からなる。ｉｎ−ｖｉｔｒｏアミロイドプラーク成長の可逆性は、プラーク中のβＡと溶液中のβＡとの定常状態平衡を示唆する(Maggio and Mantyh, 1996)。βひだ状シートフィブリルを形成するためのペプチド−ペプチド相互作用に対するβＡ重合の依存性、および反応に対する他のタンパク質の刺激的影響は、アミロイド形成がモデュレーションを受けることができることを示唆する。アミロイド形成を妨害することができる物質を発見するための多くの試みがなされた。中でも最も研究された化合物は、抗体、プロリンのようなベータブレーカーアミノ酸からなるペプチド、認識モチーフへの帯電した基の付加および構築ブロックとしてのＮ−メチル化アミノ酸の使用である(Gazit, 2002により概説された)。
【００１９】
患者におけるアミロイド凝集により特徴付けられた疾患の予防または処置のための方法が提唱され、これは、アミロイド沈着物のペプチド成分に対する抗体が凝集したアミロイドまたは可溶性アミロイドと接触することを引き起こすことを含む。SchenkのＷＯ99/27944およびSolomonのU. S. Patent5,688,651参照。各々の全内容は参照により本明細書に組み込まれる。抗体を、能動的ワクチン接種または受動的ワクチン接種により可溶性アミロイドもしくは凝集されたアミロイドと接触させることができる。能動的ワクチン接種においては、可溶性アミロイドおよび／または凝集したアミロイドに結合する抗体をｉｎ ｖｉｖｏで高めるために、全体アミロイドペプチドまたはその一部であることができるペプチドが投与される。受動的ワクチン接種は、アミロイドペプチドに特異的な抗体を直接投与することを含む。これらの方法は、アミロイドプラークを減少させるかまたはこのようなプラークの沈着速度を遅くすることによりアルツハイマー病の処置のために好ましくは使用される。
【００２０】
このような方法を試験するためのワクチンの臨床試験がElan CorporationおよびWyeth-Ayerst Laboratoriesにより着手されたことが報告された。試験されている化合物は、ＡＮ−１７９２であった。この製品は、βアミロイド４２の形態であることが報告されている。
【００２１】
本明細書における任意の文献の引用は、このような文献が適切な先行技術であるという承認または本願の特許請求の範囲の特許性に重要であると考えられることの承認であることを意図しない。任意の文献の内容または日付に関する任意の陳述は、出願時点で本出願人に入手可能な情報に基づいておりそしてこのような陳述の正しさに関する承認を構成しない。
【００２２】
発明の要約
本発明は、プロテインＡまたは抗体のＦｃ部分に結合することができるそのフラグメントもしくは変異体を非ネイティブな繊維状バクテリオファージ分子としてその表面にディスプレイする繊維状バクテリオファージ、ならびにプロテインＡまたはそのフラグメントもしくは変異体に抗体のＦｃ部分により結合した抗体または抗原−抗体免疫複合体、を含有するファージディスプレイビヒクルを提供する。
【００２３】
本発明は、治療剤または診断剤として使用するための本発明のファージディスプレイビヒクルを含有する医薬組成物も提供する。
【００２４】
脳の疾患、障害または状態を処置／抑制することまたは診断することを必要としている被検体に本発明のファージディスプレイビヒクルを鼻腔内に投与することにより、脳の疾患、障害または状態を処置／抑制するためまたは診断するための方法が本発明により更に提供される。
【００２５】
発明の詳細な説明
繊維状バクテリオファージは、鼻腔内に投与されるとき脳を透過することを可能とする線形構造を有する。それらはそれらのコートタンパク質上に選別されたタンパク質またはペプチドを提示するように工学的に作成されうるので、それらを使用して抗体または分子（それらの特異的抗体との免疫複合体の形態にある）を哺乳動物被検体の脳に送達することができる。Ｐ３は、ファージがバクテリアEscherichia coliにそれを通って侵入するファージコートの先端の１つをアセンブリする構造タンパク質である。
【００２６】
本発明の１つの局面は、プロテインＡまたは抗体のＦｃ部分に結合することができるそのフラグメントもしくは変異体を非ネイテイブな繊維状バクテリオファージ分子として その表面にディスプレイする繊維状バクテリオファージを含み、そして更にプロテインＡまたはそのフラグメントもしくは変異体にそのＦｃ部分により結合した抗体または抗原−抗体免疫複合体を含む、ファージディスプレイビヒクルに関する。好ましい態様では、繊維状バクテリオファージは、薬物にリンカーを介してまたは直接にコンジュゲーションされておらず、そして抗体または抗原−抗体免疫複合体も固体担体上に固定化されていない。他の好ましい態様では、繊維状バクテリオファージ上にディスプレイされたプロテインＡまたはそのフラグメントもしくは変異体に結合した抗体は、細胞表面上にターゲツトとして提示されていない分子に対して特異的でありそして抗体は固体担体上に固定化されていない。
【００２７】
本発明者の研究所では、構造的レベルおよび遺伝子レベルでよく理解されている繊維状ファージＭ１３、ｆ１およびｆｄ(Greenwood et al., 1991)が使用された。この研究所は、繊維状バクテリオファージが、ベクターの不活性および外来分子を担持する能力を保存しながら、中枢神経系への透過性を示すことを最初に示した(Frenkel and Solomon, 2002)。
【００２８】
繊維状バクテリオファージは、環状一本鎖ＤＮＡゲノムを含有する構造的に関連したウイルスのグループである。それらは、生産的感染期間中それらのホストを殺さない。Ｆプラスミドを含有するEscherichia coliに感染するファージは、まとめてＦｆバクテリオファージと呼ばれる。それらは哺乳動物細胞を殺さない。
【００２９】
繊維状バクテリオファージは、ＤＮＡコアを取り囲んでいるタンパク質サブユニットのヘリカルシェルを有する、約１〜２ミクロン長さおよび直径６nmの柔軟性ロッドである。２つの主コートタンパク質、タンパク質ｐＩＩＩおよび主要コートタンパク質ｐＶＩＩＩは、ディスプレイされたタンパク質のコピーの数において異なる。ｐＩＩＩは４〜５コピーにおいて提示されるが、ｐＶＩＩＩは〜３０００コピーにおいて見出される。約５０残基の主要コートタンパク質ｐＶＩＩＩサブユニットは、主としてαヘリカルでありそしてαヘリックスの軸は、ビリオンの軸と小さな角をなす。タンパク質シェルは、３つの区域：取り囲んでいる溶媒と相互作用しそして低等電点をビリオンに与える酸性残基に富んだサブユニットのＮ末端領域により占められた外側表面；タンパク質サブユニットが主としてお互いに相互作用する極性側鎖の１９残基ストレッチを含むシェルの内側；およびＤＮＡコアと相互作用する塩基性残基に富んだサブユニットのＣ末端領域により占められた内側表面；とみなされる。実質的にすべてのタンパク質側鎖相互作用は、サブユニット内よりはむしろコートタンパク質アレイにおける異なるサブユニット間にあるという事実は、これを高分子アセンブリにおけるαヘリカルサブユニット間の相互作用の研究のための有用なモデルシステムとする。繊維状バクテリオファージは約１６．３MDの質量を有しているが、その独特の構造は、脳へのその透過を可能とし、そして、ファージ構造はアミロイドフィブリルそれ自体に似ているので、βＡフィブリル化を妨害するその能力に寄与することができる。
【００３０】
繊維状バクテリオファージは、Ｍ１３、ｆ１またはｆｄなどの任意の繊維状バクテリオファージであることができる。Ｍ１３は下記の実施例で使用されたけれども、任意の他の繊維状バクテリオファージが、同様な方式で機能しそして挙動することが予想される。何故ならば、それらは同様な構造を有しておりそしてそれらのゲノムは９５％より高いゲノム同一性を有するからである。
【００３１】
本発明に従うファージディスプレイビヒクルにおいて、プロテインＡまたはそのフラグメントもしくは変異体は、繊維状バクテリオファージの表面にディスプレイされる。このファージディスプレイは、ファージコートタンパク質との融合タンパク質としてプロテインＡまたはそのフラグメントもしくは変異体のｃＤＮＡクローンの発現を伴う。従って、繊維状バクテリオファージゲノムは、その表面に非ネイティブポリペプチドをディスプレイするように遺伝子的に改変される。ファージコートタンパク質との融合としての外来タンパク質またはペプチドをディスプレイする繊維状バクテリオファージは当技術分野で周知である。Ｍ１３タンパク質ＩＩＩ、Ｍ１３タンパク質ＶＩＩＩ、Ｍ１３タンパク質ＶＩ、Ｍ１３タンパク質ＶＩ、Ｍ１３タンパク質ＩＸ、およびｆｄ少量コートタンパク質ｐＩＩＩを含むがそれらに限定されない種々のファージおよびコートタンパク質を使用することができる(Saggio et al., 1995; Uppala and Koivunen, 2000)。ベクターの大きなアレイが入手可能である(Kay et al., 1996; Berdichevsky et al., 1999; and Benhar, 2001)。好ましい態様では、プロテインＡまたはそのフラグメントもしくは変異体は、繊維状ファージの少ないコートタンパク質（タンパク質ＩＩＩ）へのその融合によりディスプレイされる。ファージ遺伝子に外来コード配列を挿入するための方法は周知である(例えば、Sambrook et al., 1989; and Brent et al., 2003)。
【００３２】
Staphylococcus aureusのプロテインＡは周知であり、そして抗体のＦｃ部分に結合するために当技術分野でよく使用される。結合ドメイン（１つまたは複数）を含有するタンパク質のフラグメントも当技術分野でよく認識されている。抗体（免疫グロブリン）のＦｃ部分への改良された結合（または異なるＩｇクラスおよびサブクラスからのＦｃへのディファレンシャルな結合）を有するプロテインＡの変異体に関する多数の知見もある。好ましくはプロテインＡまたはそのフラグメントもしくは変異体に結合される抗体はＩｇＧクラスである。プロテインＡ変異体の最も好ましい態様は、配列番号４のアミノ酸配列を有する変異体である。
【００３３】
抗体のＦｃ部分に結合することができるプロテインＡまたはそのフラグメントもしくは変異体は、繊維状バクテリオファージの表面にディスプレイされて脳への送達のために抗体または抗原−抗体免疫複合体に結合する。
【００３４】
本発明は、脳にファージ送達ビヒクルを導入することにより脳の疾患、障害または状態(condition)を抑制または処理するための方法を提供する。更に本方法は、検出されうる、即ち標識されうるファージディスプレイビヒクルを脳に導入することにより脳の疾患、障害または状態を診断するための方法を提供する。本方法は、有効量の本発明のファージディスプレイヒビクルを、導入／投与することを必要としている被検体に導入／投与することを含む。
【００３５】
本明細書および特許請求の範囲の目的で、用語「患者」、「被検体」および「レシピエント」は相互交換可能に使用される。それらは、予防処置もしくは治療処置または診断の目的であるヒトおよび他の哺乳動物を含む。
【００３６】
本明細書および特許請求の範囲の目的で、用語「ベータアミロイドペプチド」は、「βアミロイドペプチド」、「アミロイドβペプチド」、「βＡＰ」、「βＡ」および「Ａβ」と同義である。これらの用語のすべては、アミロイド前駆体タンパク質に由来するプラーク形成ペプチドを指す。好ましい態様では、ファージ表面にディスプレイされたプロテインＡ（またはそのフラグメントもしくは変異体）に結合した抗体は、アミロイドβペプチドに対して特異的である（特異的に結合する）。アミロイドβペプチドは、好ましくはＡβ１−４２またはＡβ１−４０である。
【００３７】
本明細書で使用された、「ＰｒＰタンパク質」、「Ｐｒｐ」、「プリオン」は、適当な条件下に、プラーク形成疾患の原因となる凝集物の形成を誘導することができるポリペプチドを指す。例えば、正常な細胞プリオンタンパク質（ＰｒＰＣ）は、このような条件下で、ウシ海綿状脳症（ＢＳＥ）、または狂犬病、ネコのネコ海綿状脳症、クールー病、クロイツフェルト−ヤコブ病（ＣＪＤ）、ゲルストマン−ストロイスラー−シャインカー病（ＧＳＳ）および致死的家族性不眠症（ＦＦＩ）などの（それらに限定されない）プラーク形成疾患の原因となる対応するスクラピーアイソフォーム（ＰｒＰＳｃ）に転換される。他の好ましい態様では、抗体は病原性ＰｒＰＳｃアイソフォームに対して特異的である。
【００３８】
用語「処置する」は、疾患、障害または状態の進行を実質的に抑制すること、遅くすることまたは逆転させること、疾患、障害または状態の臨床的症候を実質的に改善することまたは、疾患、障害または状態の臨床的症候の出現を実質的に予防することを意味することを意図する。
【００３９】
本発明のファージ送達ビヒクルおよび方法は、脳の疾患、障害または状態を指向する。好ましくは、脳の疾患、障害または状態は「プラーク形成疾患」である。
【００４０】
用語「プラーク形成疾患」は、早期発症アルツハイマー病（ＡＤ）、後期発症アルツハイマー病、前兆アルツハイマー病、ＳＡＡアミロイドーシス、遺伝性アイスランド症候群、老衰、多発性ミエローマならびに例えば、クールー病、クロイツフェルト−ヤコブ病（ＣＪＤ）、ゲルストマン−ストロイスラー−シャインカー病（ＧＳＳ）および致死的家族性不眠症（ＦＦＩ）などの（それらに限定されない）ヒトを冒すことが知られているプリオン病および例えば、スクラピーおよびウシ海綿状脳症（ＢＳＥ）などの動物を冒すことが知られているプリオン病などの（それらに限定されない）疾患における、βアミロイド、血清アミロイドＡ、シスタチンＣ、ＩｇＧκ軽鎖またはプリオンタンパク質などの（それらに限定されない）凝集性タンパク質（プラーク形成ペプチド）によるプラークの形成により特徴付けられた疾患を指す。
【００４１】
前記したプラーク形成疾患と関連したアミロイドプラーク（アミロイド沈着物としても知られている）の大部分は、脳内に位置しているので、任意の提唱された処置様式は、血液脳関門（ＢＢＢ）を横切る能力およびアミロイドプラークを溶解する能力を示さなければならない。普通は、ＢＢＢを通過することができる分子の平均サイズは約２ｋＤａである。
【００４２】
増加する数の証拠は、中枢嗅覚経路における嗅覚欠失および変性的変化は、ＡＤの臨床的経過において早期に影響されることを示す。更に、ＡＤに関与した解剖学的パターンは、嗅覚経路がＡＤの進展における初期の段階でありうることを示唆する。
【００４３】
嗅覚レセプターニューロンは、鼻腔の上皮ライニングにある二極性細胞である。それらの軸索は、篩状プレート(cribriform plate)を横断しそして脳の嗅球における嗅覚経路の第１シナプスに突き出す。鼻上皮からの嗅覚ニューロンの軸索は１０００のミエリンのない繊維の束を形成する。この構成は、それらを、ウイルスまたは他の輸送された物質が血液脳関門（ＢＢＢ）を横切ってＣＮＳにアクセスすることができるハイウエイとする。
【００４４】
前に示されたとおり、鼻腔内投与(Mathison et al, 1998; Chou et al, 1997; Draghia et al, 1995)は、脳脊髄液（ＣＳＦ）またはＣＮＳへのウイルスおよび高分子の直接侵入を可能とする。
【００４５】
脳へのアデノウイルスベクターのための送達点として嗅覚レセプターニューロンの使用は、文献に報告されている。この方法は、報告によれば、見かけの毒性なしに１２日間脳におけるレポーター遺伝子の発現を引き起こす(Draghia et al, 1995)。
【００４６】
抗体または免疫複合体の直接脳送達は、脳への輸送体として嗅覚ニューロンを使用することによりＢＢＢを横切ることを克服する。嗅覚上皮において、一次嗅覚ニューロンの樹状細胞は、鼻内腔と接触しており、そしてこれらのニューロンは、軸索を介して脳の嗅球にも接続されている。嗅覚上皮と接触しているファージは、一次嗅覚ニューロンに取り込まれることができ、嗅球に輸送されることができ、そして脳の他の区域にすら輸送されうる。
【００４７】
脳腫瘍および脳炎症性疾患、障害または状態も、本発明に従う処置され／抑制されまたは診断される脳の疾患、障害または状態に含まれる。脳炎症は、インタクトな海馬形成における新しいニューロンの基礎的な連続的形成および脳発作に応答して増加した神経組織発生(neurogenesis)の両方において神経組織発生の抑制を引き起こす。神経組織発生の悪化(impairment)は、取り囲んでいる組織に損傷があるかないかにかかわらず、ミクログリア活性化の程度に依存する。脳炎症は、多分、パーキンソン病、リューイ小体痴呆(Lewy Body Dementia)、ＡＩＤＳ痴呆コンプレツクス、外傷性脳損傷、緑内障等のようなＡβＰ病理学的効果を含む、ＡＤのほかの他の慢性神経変性障害の病原において多分重要な役割を演じる。
【００４８】
外傷性脳損傷（ＴＢＩ）は、βアミロイド沈着および痴呆の早期発症を含む。このような記述にもかかわらず、これらの変化が起こる機構に関しては殆ど知られていない。ＴＢＩにおけるβアミロイドペプチドの発生について提唱された１つのソースは、外傷により損傷された軸索内の悪化した軸索原形質輸送の部位に蓄積することが示されたβアミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）の異常なタンパク分解開裂である。事実、βＡ免疫反応性は、ＴＢＩのブタモデルにおける膨潤した軸索と共に最近見出され(Smith et al., 1999)、これは、外傷的に損傷された軸索におけるＡＰＰの蓄積がＴＢＩにおけるβアミロイドペプチド形成のためのソースでありうることを示唆する。
【００４９】
神経変性疾患および障害の非限定的例は、アルツハイマー病（ＡＤ）、パーキンソン病、リューイ小体痴呆、ＡＩＤＳ痴呆コンプレツクス、発作、並びに閉鎖性頭部損傷および外傷性脳損傷、例えば、弾丸傷、出血発作(hemorrhagic stroke)、虚血性発作、脳虚血、毒素、毒物、化学（細菌戦）剤、などの神経損傷剤により引き起こされる損傷または腫瘍切除などの外科手術により引き起こされる損傷を含む。
【００５０】
好ましい態様では、ファージディスプレイされたプロテインＡ（またはそのフラグメントもしくは変異体）に結合した抗体は、アミロイドβペプチドおよびＰｒＰＳｃなどの、脳の疾患、障害または状態と関連したターゲット分子に対して特異的なモノクローナル抗体である。抗体は、発作、脳損傷または他の神経変性疾患もしくは障害の結果としての脳炎症を抑制／処置するための、ＴＮＦα、ＩＬ６等などの脳における炎症性サイトカインに対する抗体であることもできる。脳の疾患、障害または状態として脳腫瘍を診断するための方法の場合に、抗体は、脳腫瘍に特徴的なターゲット分子に対して特異的でありそしてその存在は特定の脳腫瘍の診断となる。
【００５１】
あるいは、抗体のＦｃ部分により抗原−抗体免疫複合体に結合したプロテインＡ（またはそのフラグメントもしくは変異体）をディスプレイするファージ送達ビヒクルは、脳に免疫複合体を送達するために使用されうる。免疫複合体における抗体により結合された抗原は、脳の疾患、障害または状態を処置することができる分子である。抗体により結合された抗原の非限定的例は、インスリン、ニューロン損傷および細胞死を減少させることができるエリスロポエチン（ＥＰＯ）、インターフェロンおよび他の抗炎症性サイトカイン、例えばＩＬ１０、および血液脳関門を通過しないニューロン保護分子を含む。
【００５２】
本発明に従う脳の疾患、障害または状態を診断するための方法は、本発明のファージディスプレイビヒクルを鼻腔内に投与することを必要としている被検体に、本発明のファージディスプレイビヒクルを鼻腔内に投与することを含む。その抗体成分を有するファージディスプレイビヒクルが、脳の疾患、障害または状態と関連したターゲットに結合されると、脳の疾患、障害または状態の存在が検出される。繊維状バクテリオファージの表面にディスプレイされたプロテインＡ（または抗体のＦｃ部分に結合することができるそのフラグメントもしくは変異体）に結合した抗体は、検出可能に標識されうる。
【００５３】
標識される抗体は、好ましくは脳腫瘍に対する治療または診断放射線像形成において使用するために放射能標識される。標識のための放射性核種の非限定的例は、１１１Ｉｎ、１２５Ｉ、１３１Ｉおよび９９ｍＴｃを含む。好ましくは放射性ヨウ素化抗体である放射能標識された抗体は、ペプチドおよびタンパク質を放射能標識するための標準方法により調製され、次いで繊維状バクテリオファージの表面にディスプレイされたプロテインＡ（またはそのフラグメントもしくは変異体）に結合させられる。
【００５４】
他の適当な検出可能な標識は、エンハンスドダイナミックＭＲＩ(enhanced dynamic MRI)のための好ましい試薬であるガドリニウム（Ｇｄ）などの造影剤および重元素（例えば、Ｐｔ、ＡｕおよびＴｌ）の有機または無機化合物を含む。
【００５５】
本発明に従う医薬製剤は、有効成分として、本発明のファージディスプレイビヒクルを含む。医薬製剤は、異なる繊維状バクテリオファージからのファージディスプレイビヒクルの混合物であることもできる。
【００５６】
本発明に従う製剤は、生物それ自体に投与されうるかまたはそれが適当な担体もしくは賦形剤と混合されている医薬組成物において投与されうる。
【００５７】
本明細書で使用された「医薬組成物」は、生理学的に適当な担体および賦形剤などの他の化学成分と本明細書に記載の１つ以上の有効成分の製剤を指す。医薬組成物の目的は、生物への化合物の投与を容易にすることである。
【００５８】
用語「有効成分」は、生物学的効果の原因となる製剤を指す。診断用途に使用するための医薬組成物の状況において、用語「有効成分」は、脳の疾患、障害または状態と関連した分子をターゲティングする抗体であることを意図する。
【００５９】
以後、相互交換可能に使用されうる語句「生理学的に許容されうる担体」および「薬学的に許容されうる担体」は、生物に対する有意な刺激を引き起こさずそして投与された化合物の生物学的活性および性質を妨げない担体または希釈剤を指す。
【００６０】
用語「賦形剤」は、有効成分の投与を更に容易にするために医薬組成物に加えられた不活性物質を指す。賦形剤の非限定的例は、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、種々の糖および種々のタイプのデンプン、セルロース誘導体、ゼラチン、植物油およびポリエチレングリコールを含む。
【００６１】
薬物の処方および投与のための技術は、"Remington's Pharmaceutical Sciences," Mack Publishing Co., Easton, PA, latest editionにおいて見出され得、これは参照により本明細書に組み込まれる。
【００６２】
本発明の医薬組成物は、当技術分野で周知の方法、例えば、慣用の混合、溶解、顆粒化、糖剤製造(dragee-making)、研和、乳化、カプセル化、エントラッピングまたは凍結乾燥によって製造されうる。
【００６３】
従って、本発明に従って使用するための医薬組成物は、薬学的に使用されうる製剤への有効成分の加工を容易にする、賦形剤または佐剤を含む１つ以上の生理学的に
許容されうる担体を使用して慣用の方式で処方されうる。
【００６４】
鼻吸入による投与のために、本発明に従って使用するための有効成分を、適当な推進剤、例えば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロ−テトラフルオロエタンまたは二酸化炭素、の使用により加圧されたパックまたはネブライザーからのエアゾル噴霧組成物の形態で便利に送達される。吸入スプレーにおけるように加圧されたパックまたはネブライザーを必要としない鼻中スプレーが替わりに鼻腔内投与のために使用されうる。加圧されたエアゾルの場合に、投薬単位は、弁を設けて計量された量を送達することにより決定されうる。化合物と適当な粉末基剤、例えばラクトースまたはデンプンの粉末混合物を含有する、ディスペンサーにおいて使用するための例えばゼラチンのカプセル剤およびカートリッジ剤が処方されうる。
【００６５】
本発明の状況において使用するために適当な医薬組成物は、有効成分が意図した目的を達成するのに有効な量において含有される組成物を含む。更に詳しくは、治療的有効量は、疾患、障害または状態の症状を予防、軽減または改善するのにまたは処置さされるべき被検体の生存を延長するのに有効な有効成分の量を意味する。
【００６６】
治療的もしくは診断的有効量の決定は、特に、本明細書に与えられた詳細な開示に照らして、当業者の能力の十分に範囲内にある。
【００６７】
投薬量および間隔は、特定の脳疾患、障害または状態を処置または診断するのに十分なファージディスプレイビヒクルの脳レベル（最少有効濃度、ＭＥＣ）を与えるように個々に調節されうる。ＭＥＣは、各製剤について変わるであろうが、ｉｎ−ｖｉｔｒｏデータから評価されうる。ＭＥＣを達成するのに必要な投薬量は個々の特徴に依存するであろう。
【００６８】
投薬間隔は、ＭＥＣ値を使用して決定することもできる。製剤は、間隔時間の１０〜９０％、好ましくは３０〜９０％、最も好ましくは５０〜９０％の間ＭＥＣより高い脳レベルを維持する方式を使用して投与されるべきである。
【００６９】
処置されるべき状態の重篤さおよび応答性に依存して、投薬は、数日もしくは数週間続くまたは治癒が達成されるまでもしくは疾患状態の減退が達成されるまで続く処置のクール(cource)で、１回または複数回の投与であることができる。
【００７０】
投与されるべき組成物の量は、もちろん、処置もしくは診断されるべき被検体、苦痛の重篤さ、処方する医師の判断等に依存するであろう。
【００７１】
本発明の組成物は、所望により、有効成分を含有する1つ以上の単位剤形を含有することができるパックまたはディスペンサー装置、例えばＦＤＡで認可されたキットにおいて提供されうる。パックは、例えば、金属もしくはプラスチックフォイル、例えばブリスターパックを含むことができる。パックまたはディスペンサー装置は、投与のためのインストラクションを伴うことができる。パックまたはディスペンサーは、医薬の製造、使用または販売を規制する政府機関により規制された形態にある容器と関連した通達により適応させることができ、該通達は、組成物またはヒトもしくは獣医学的投与の形態について政府機関による認可の反映である。このような通達は、例えば、処方箋薬物についてU.S,Food and Drug Administrationにより認可されたラベリングまたは認可された製品インサート(product insert)であることができる。適合性薬学的担体において処方された本発明の製剤を含む組成物を調製し、適当な容器中に入れ、そしてさらに上記したとおり、指示された状態の処置についてラベリングすることができる。
【００７２】
今や本発明を一般的に説明してきたが、本発明は、説明として与えられそして本発明の限定であることを意図しない下記の実施例を参照することにより容易に理解されるであろう。
【００７３】
実施例
Ｐ３上にプロテインＡの変異体をディスプレイする繊維状ファージをこの研究において構築した。以前の研究はこの基本的なアイデアを使用したが、異なる方法で使用した：即ち、Li et al. (1998)は、ｓｃＦｖ分子に融合したプロテインＡのＢドメインをディスプレイするファージを使用した。Djojonegoro et al. (1994)は、Ｍ１３ファージ上にディスプレイされたプロテインＡのＢドメインのみを使用し、そしてSampath et al.(1997)は、Ｂドメインを使用して、繊維状ファージをクローニングツールとして使用することができることを示した。すべてのこれらの以前の研究は、プロテインＡＩｇＧ結合ドメインをヒトＩｇＧｓに結合させることにより、ファージディスプレイ技術を使用してファージ上にディスプレイされたプロテインＡの改良された形体の容易な選択を可能とした。この研究において下記に示した実験は、プロテインＡ変異体をディスプレイするファージが主としてＩｇＧ１型のマウス抗体およびそれらのリガンドに結合することを示す。これらの複合体は、鼻腔内適用によりｈＡＰＰｔｇマウスに投与された。それらは、マウス脳に入りそして下記で講じる効果を奏した。
【００７４】
物質および方法
プロテインＡ変異体の合成
使用されたプロテインＡの一部は、ドメインＢを含む４つの反復ドメインを含有する。２つのプライマー：ＡＴＧコドンおよびＮｃｏＩ制限部位を有するフォワードプライマーおよび停止コドンを持たずそしてＮｏｔＩ制限部位を有するリバースプライマーを合成した（図１Ａ）。下記のプロトコールを使用してＰＣＲを行った：Staphylococcus aureusのゲノムＤＮＡ２μgを、Ｑｉａｇｅｎ Ｔａｑポリメラーゼの１×バッファー中の各プライマー２０μMと一緒にした。ｄＮＴＰｓ（０．２mM）およびポリメラーゼ２．５単位を１００μl反応容積に加えた ＰＣＲ条件は：９４℃での３分間の初期変性、次いで９４℃での３0秒間の変性３０サイクル、５５℃で１分間のアニーリングおよび７２℃で１分間の重合であった。ＰＣＲ産物をＮｃｏＩおよびＮｏｔＩで消化し、ゲル精製しそして、ＮｃｏＩおよびＮｏｔＩで前もって線状化されたベクターｐＣＡＮＴＡＢ ５Ｅにクローニングした。このベクターにおけるプロテインＡ遺伝子のこの部分のクローニングは、繊維状ファージ（Ｍ１３）の遺伝子３とのプロテインＡの翻訳融合を発生させた。ヘルパーファージを使用して、ファージＰｒｏｔＡと命名されたプロテインＡ−Ｐ３融合物をディスプレイするファージを産生した。
【００７５】
ＥＬＩＳＡ
異なるＩｇＧ抗体へのファージプロテインＡの結合を、ＥＬＩＳＡにより測定した：プロテインＡをディスプレイする１０１１ファージを、０．１Mリン酸ナトリウム、ｐＨ８．５中の抗体１０μg（１５ナノモル）と混合した。混合物を３７℃で３０分間穏やかに振とうさせ、次いで５０μlアリクォートを、ウサギ抗ファージ抗体で前もってコーティングされそして３％ミルクでブロックされたＥＬＩＳＡウェルに四重で(in tetraplicates)加えた。ヤギ抗マウス−ＨＲＰコンジュゲーションされた抗体を二次抗体として使用した。ＨＲＰ反応をＯＰＤおよびペルオキシドで行った。結果を４９２nmでのＯＤとして示す。
【００７６】
抗原結合後のファージ−プロテインＡ−抗体複合体の安定性を下記の方法によりチェックした：プロテインＡをディスプレイする１０１１ファージを、０．１Mリン酸ナトリウム、ｐＨ８．５中の抗体１０μg（１５ナノモル）と混合した。混合物を３７℃で３０分間穏やかに振とうさせ、そしてついで抗原（０．３２ナノモルのビオチニル化Ａβ１−１６）を、抗体に有利に５０：１のモル比で、ファージ−プロテインＡと抗体の混合物に更に３０分間加えた。アリクォート（５０μｌ）をウサギ抗ファージ抗体で前もってコーティングされそして３％ミルクでブロックされたＥＬＩＳＡウェルに四重で加えた。アビジン−ＨＲＰコンジュゲートを使用してＥＬＩＳＡプレートに結合した複合体を検出した。まだ抗原に結合しているファージ−抗体複合体のみがアビジン−ＨＲＰコンジュゲートと反応するであろう。１：１０００の希釈率でこれらの実験で使用された血清は、ＥＲＦＨエピトープに対する力価を有するマウスから抜き取られた。
【００７７】
異なる量の抗体に結合するのに必要なファージの数を力価測定するために、プロテインＡへの最善の結合能力を示した抗体１９６を使用して、３つの異なる濃度で（５０、１００および２５０ng/ウェル）ＥＬＩＳＡプレートをコーティングし、次いで３％ミルクでウェルをブロックした。異なる濃度（109／ml~1012/ml）におけるファージ−プロテインAを加えそして結合したファージをウサギ抗ファージ抗体およびヤギ抗ウサギ−ＨＲＰ抗体により検出した。
【００７８】
ファージ−プロテインＡへの抗体−抗原複合体の結合を下記のとおりに力価測定した： 109／ml〜1012/mlのファージを、２つの別々の濃度の抗体２Ｈ３、１０ngまたは50ngおよび１：２モル比の抗体：抗原（抗体分子に対して２つの抗原分子）と一緒にした。混合物を、３７℃で３０分間穏やかに振とうさせ、そしてウサギ抗ファージ抗体で前もってコーティングされそしてＰＢＳ中の３％ミルクでコーティングされたＥＬＩＳＡウェルに加えた。結合したファージの検出は、ビオチニル化抗原にのみ結合することができるアビジン−ＨＲＰコンジュゲートでなされた。
【００７９】
ファージ−プロテイン抗体複合体のＰＥＧ沈殿がそれらの解離を引き起こすか起こさないかもチェックした：ＥＬＩＳＡウェルを２０μｇ／mlアビジンで４０℃で一夜コーティングし、次いで１μｇ／ｍｌビオチニル化Ａβ１−１６ペプチドで室温にて３０分間コーティングした。ウェルをＰＢＳ中の３％ミルクでブロックした。1012ファージを、０．１M Ｎａ２ＨＰＯ４１ml中の１μgまたは５μgの抗体１９６と一緒にし、そして３７℃で１時間穏やかに振とうさせた。混合物の半分をＰＥＧ−ＮａＣｌを使用して沈澱させ、次いで前と同じく０．１M Ｎａ２ＨＰＯ４ ５００μl中に再懸濁させ、そして他の半分を沈殿させないで使用した。両混合物を前に述べたＥＬＩＳＡプレートに３７℃で１時間適用した（５０μl混合物／ウェル）。結合したファージの検出をマウス抗ファージおよびヤギ抗マウス−ＨＲＰコンジュゲートにより行った。
【００８０】
ファージプロテインＡは、抗インスリンＩｇＧとの複合体を発生することについてもチェックされた。ファージプロテインＡ（1012／ml）を異なる濃度の抗インスリン抗体と一緒にしそして３７℃で３０分間穏やかに振とうさせた。複合体をＰＥＧ沈澱させ、次いで０．２５mg/mlインスリンで４℃で一夜コーティングされたＥＬＩＳＡプレートに適用した。結合したファージを、マウス抗ファージおよびヤギ抗マウス抗体によりまたはヤギ抗マウスのみで検出した。この第２の検出法は、抗インスリン抗体がファージプロテインＡとともに複合体において実際に存在することを証明するために使用された。
【００８１】
ｉｎ ｖｉｖｏ研究
９か月齢ＰＤＡＰＰマウスに、ファージ−プロテインＡ複合体（Ａｂ１９６とのまたは抗インスリンＡｂ＋インスリンとの）を２週間毎に（４回の処置）、次いで次の６回の処置について１か月毎に、合計１０回の処置のために与えた。複合体を、２つの鼻孔により分けて２０マイクリットルを鼻腔内適用により与えた。処置の終りに、マウスを安楽死させそして殺した。各マウスからの左脳半球を液体窒素中で凍結させた。各半球をホモジナイズしそして可溶性画分と不溶性画分に分けた。不溶性画分を後でグアニジン−ＨＣｌで可溶化した。両画分を分析されるまで凍結して保った。βアミロイド１−４２は、捕捉抗体およびＡβ１−４２に対して特異的な検出抗体を使用して、サンドイッチＥＬＩＳＡにより行った。サイトカインレベルの決定は、ＩＬ１βまたはＩＬ１０（Ｒ＆Ｄシステム）のための特異的キットにより行った。
【００８２】
結果および討論
プロテインＡ変異体を図１Ａに示されたプライマーを使用して合成した。ＰＣＲ産物を配列決定してその完全性(integrity)を証明し、次いでｐＣＡＮＴＡＢ５Ｅにクローニングした。ファージのｐＩＩＩに融合したプロテインＡ変異体を発現するファージを産生しそしてＥＬＩＳＡにおいて使用した。
【００８３】
プロテインＡ変異体をディスプレイするするファージは主としてＩｇＧ１抗体に結合する。
ｐｒｏｔＡファージを、ＩｇＧタイプ抗体へのそれらの結合についてＥＬＩＳＡによりチェックした。
図２において１５ナノモルの異なる抗体への1011ファージ粒子の結合が示される。
【００８４】
ファージ−ｐｒｏｔＡ結合抗体はそれらがその抗原に結合した後ファージから離脱しない。
抗体は、それらがその抗原への結合の後ファージから解離するかしないかについてチェックされた。抗原として、βアミロイドペプチドのＮ末端からのアミノ酸残基１−１６のビオチニル化ペプチドを使用した。この実験の結果は、図２に要約される。この実験について、プロテインＡをディスプレイする1011ファージを、０．１M リン酸ナトリウム、ｐＨ８．５中の１０μg（１５ナノモル）の抗体と混合した。混合物を、３７℃で３０分間振とうし、次いで抗体に有利に５０：１のモル比の抗原（０．３２モルのビオチニル化Ａβ１−１６）を、追加の３０分間ファージ−プロテインＡと抗体の混合物に加えた。複合体を、ウサギ抗ファージ抗体で前もってコーティングされそして３％ミルクでブロツクされたＥＬＩＳＡウェルに加えた。コンジュゲーションされたアビジン−ＨＲＰを使用して、ＥＬＩＳＡプレートに結合した複合体を検出した。抗原の結合後まだ結合しているファージ−抗体複合体のみがアビジン−ＨＲＰコンジュゲートと反応するであろう。これらの実験で使用された血清はＥＲＦＨエピトープに対する力価を有するマウスから抜き取られた。
【００８５】
図３は、プロテインＡが結合した抗体が、それらが認識する抗原に結合するとき、それらはプロテインＡから離脱しないことを示す。プレートに結合したファージ−プロテインＡから離脱する抗体−抗原複合体は、洗浄除去されそしてアビジン−ＨＰＲと反応しないであろう。図２に示されたとおり、１２Ｂ４はファージ−プロテインＡに弱く結合した。それはペプチド１−１６に結合しないので、ここでは反応せず、そして他のネガティブコントロールとして使用された。結合結果は、ＥＬＩＳＡプレートがｐＨ６．０のＰＢＳバッファーで洗浄されるとき、変化しなかった。より低いｐＨは、ファージ−ＰｒｏｔＡからの抗体−抗原複合体の解離を引き起こさなかった。
【００８６】
ｍＡｂ196へのプロテインＡの結合の力価測定
異なる量の抗体に結合するのに必要なファージの数は、結合が特異的であることを証明するために力価測定された。この実験において、プロテインＡへの最善の結合能力を示した抗体196を使用して3つの異なる濃度でＥＬＩＳＡプレートをコーティングし、次いで3％ミルクでウェルをブロックした。異なる濃度のファージ−プロテインＡを加えそして結合したファージをウサギ抗ファージ抗体により検出した（図4）。図4から、抗体196へのファージ−プロテインＡの結合は特異的であることは明らかであり；それはファージ数および抗体濃度の関数として高められる。この実験セッティングにおいて、飽和した結合は観察されなかた。プロテインＡをディスプレイするファージの数を評価するために、ＥＬＩＳＡウェルを高められたファージ濃度でコーティングしそして抗ファージ抗体と反応させた（示されていない）。この分析と図４に示された以前の分析を４９２におけるＯＤを比較することにより、ファージの約３０％〜３６％がプロテインＡをディスプレイすることが決定され得た。
【００８７】
ある量のファージ（結合される抗原の量も示すであろう）に結合するのに必要な抗体の量を決定するために、高められた数のファージを２つの別々の濃度の抗体（２Ｈ３）と一緒にしそして抗体：抗原のモル比を１：２とした（各抗体分子について２つの抗原分子）他の実験を行った（図５Ａ）。混合物を、前もってウサギ抗ファージ抗体でコーティングさされそしてＰＢＳ中の３％ミルクでコーティングされたＥＬＩＳＡウェルに加えた。結合したファージの検出を、ビオチニル化抗原にのみ結合することができるアビジン−ＨＲＰコンジュゲートにより行った。
【００８８】
各抗体濃度に対する結合について観察された値は異なるファージ濃度間であまり異ならないので、結果は「平均の平均」として要約することもできそして図５Ｂに示されたとおりプロットすることもできる。
【００８９】
これらの結果は、抗体濃度がこの実験セッティングにおける限定因子であり、ファージ濃度ではないことを証明する：109／mlファージ−プロテインＡ（ＥＬＩＳＡウェル当たり使用された５０μｌ当たり5×107ファージ）で、約７０ピコモルである５０ngに結合するのに十分なプロテインＡ分子があり、そしてそれらは５×ファージ−プロテインＡ分子を飽和させるのに十分ではない。
【００９０】
ＰＥＧ−ＮａＣｌ沈澱は、甚だしいファージ−抗体解離を引き起こさなかった
ファージ−タンパク質Ａ−抗体複合体のＰＥＧ沈殿がそれらの解離を引き起こすか引き起こさないかもチェックした。ＥＬＩＳＡウェルをアビジンおよび１μｇ／ｍｌビオチニル化１−１６ペプチドでコーティングした。ウェルをＰＢＳ中の３％ミルクでブロックした。1012ファージを０．１M Na2HPO4中の１μgまたは５μg抗体１９６と一緒にしそして３７℃で１時間穏やかに振とうした。混合物の半分をＰＥＧ−ＮａＣｌを使用して沈澱させ、次いで同じバッファーおよび前と同じ容積において再懸濁させ、そして他の半分を沈殿させないで使用した。両混合物を前に記載されたＥＬＩＳＡプレート（５０μl混合物／ウェル）に３７℃で１時間適用した。結合したファージの検出をマウス抗ファージおよびやぎ抗マウス−ＨＲＰコンジュゲートで行った。図６は、ＰＥＧ沈澱が、ファージプロテインＡ−抗体複合体の約２０％を解離させたことを示す。
【００９１】
ファージプロテインＡは、抗インスリン抗体とインスリンの免疫複合体に結合する
ファージ−プロテインＡを抗インスリンＩｇＧと一緒にしそして複合体を、０．２５ｍｇ／ｍｌインスリンでコーティングされたＥＬＩＳＡプレート上で使用した。複合体をＥＬＩＳＡプレートに適用される前にＰＥＧ沈澱させた。結合したファージをマウス抗ファージおよびヤギ抗マウス抗体で検出するか（図７Ａ）またはヤギ抗マウスのみで検出した（図７Ｂ）。この第２の検出法を使用して抗インスリン抗体が実際にファージプロテインＡとの複合体中に存在することを証明した。
【００９２】
ファージ−プロテインＡ（1012／ml）を異なる濃度の抗インスリン抗体と一緒にしそして３７℃で３０分間穏やかに振とうした。複合体を、ＥＬＩＳＡプレートに適用される前にＰＥＧ沈澱させた。結合したファージをマウス抗ファージで検出し次いでやぎ抗マウス抗体で検出した。
【００９３】
図７Ａに示されたのと同様な、しかしヤギ抗マウス抗体のみで検出されたアッセイの結果は、図７Ｂに示される。
【００９４】
要約すると、ＩｇＧタイプの抗体に結合することができるプロテインＡの変異体をディスプレイする繊維状ファージを発生させた。マウスＩｇＧ２ａおよびＩｇＧ２ｂに強く結合するStaphylococcus aureusのネイティブなプロテインＡとは反対に、このリコンビナントプロテインＡは、最も豊富なタイプであるマウスＩｇＧ１分子によりよく結合する。これらのファージは、抗体を精製するためにｉｎ−ｖｉｔｒｏで使用することができるか、または例えばある種の抗体を脳に送達するのにｉｎ ｖｉｖｏで使用することができる。
【００９５】
ｉｎ ｖｉｖｏ研究
ファージ−ｐｒｏｔＡ−１９６
ファージ−ｐｒｏｔＡ−１９６複合体を、物質および方法の節で説明したとおり、ＰＤＡＰＰトランスジェニックマウスに適用した。可溶性画分および不溶性画分（凝集したペプチドおよびグアニジン−ＨＣｌで可溶化された膜）中のβアミロイドペプチド１−４２のレベル、ならびに不溶性画分中のＡβ１−４０のレベルをチェックした。トランスジェニック非処理コントロールと比較して、可溶性画分中のおよび不溶性画分中のＡβ１−４２の量の約２０％減少が処理されたマウスにおいて観察された。しかしながら、結果は有意ではなかった（図８）。Ａβ１−４０において、コントロール非処理サマウスに比較してファージ複合体で処理されたマウス間で差は観察されなかった。
【００９６】
ファージ−ｐｒｏｔＡ−抗インスリン−インスリン
ＰＤＡＰＰマウスをファージ−抗体−インスリン複合体で処理した。図９Ａにおいて、不溶性Ａβ１−４２のレベルのより劇的な差、Ｔｇ非処理マウスまたはファージ−１９６複合体で処理されたマウスと比較して、複合体で処理されたマウスにおける約６３％の減少が観察された。ファージのみで処理されたマウスは、Ａβ１−４２レベルの平均２３％減少を伴うにすぎなかった。処理されたマウスにおける可溶性Ａβ１−４２のレベルの減少は、より劇的ですらありそしてコントロールと比較して８０％に達した（図９Ｂ）。
【００９７】
ＩＬ１β、プロ炎症性サイトカインおよびＩＬ１０、抗炎症性サイトカインのレベルをチェックした。トランスジェニック非処理マウスにおけるＩＬ１βのレベルは、非トランスジェニックマウスにおけるＩＬ１βのレベルより約３６％高かったが（図１０Ａ）、これは、この疾患がより高いＩＬ１β濃度で現れる炎症を引き起こすことを意味している。しかしながら、複合体処理されたマウスは、非トランスジェニックマウスにおけるＩＬ１βのレベルと同様なレベルを含有していたが、これは処理されたマウスが脳の炎症を発生しなかったことを示唆する。抗炎症性サイトカイン、ＩＬ１０の濃度において同じ現象が観察された（図１０Ｂ）。ここで再び、平均して１８％未満のＩＬ１０を含有していたトランスジェニックコントロールマウスに比較して、非トランスジェニックマウスおよびトランスジェニック処理マウスにおいてＩＬ１０のレベルは同様であった。ファージ−ｐｒｏｔＡ−１９６を受け取ったＰＤＡＰＰマウスにおけるサイトカインレベルは、処理されたマウスとトランスジェニックコントロール間で差はなことを示した（データは示されていない）。
【００９８】
以前の研究は、脳脊髄液区画への物質の直接のアクセスを与えることが知られているインスリン投与の鼻腔内経路により記憶機能に対するインスリンの効果を急激に改善する効果を示唆した(Strachan, 2005)。先の結果は、辺縁および海馬領域におけるインスリンレセプターの普及、ならびに全身系インスリンによる記憶の改善を示す。インスリンをファージと組み合わせて、増加した数のファージが脳に導入されてアミロイドの過酷な負荷(amyloid burden)の有効な減少をもたらすことを証明した。この効果は、脳におけるサイトカインプロフィルの改善を伴う。この蓄積効果は、ファージの抗凝集性＋ＡＤの保護的処理としてインスリンを介するより良好な透過を得るのに有効な方法であることができる。
【００９９】
今や本発明を完全に記述してきたが、本発明は、本発明の精神および範囲から逸脱することなくかつ過度の実験なしに、広い範囲の同等なパラメーター、濃度および状態の範囲内で同じことが行われうることは、当業者により認められるであろう。
【０１００】
本発明は、その特定の態様に関して述べられたが、それは更に改変されうることは理解されるであろう。本願は、一般に、本発明の原理に従う、そして本発明が属する技術分野内の既知の実施または慣用の実施内に入るような、そして特許請求の範囲に示された本質的な特徴に適用されうるような、本発明の開示からの逸脱を含む、本発明の任意の変更、使用または適応を包含することを意図する。
【０１０１】
引用された文献中に提示されたすべてのデータ、表、図面およびテキストを含む、雑誌論文またはアブストラクト、公開されたもしくは対応するＵ．Ｓ．もしくは外国特許出願、発行されたＵ．Ｓ．特許もしくは外国特許、または任意の他の文献を含む本明細書で引用されたすべての参考文献は、参照により本明細書に完全に組み込まれる。更に、本明細書に引用された参考文献内に引用された参考文献の全体の内容も、参照により完全に組み込まれる。
【０１０２】
既知の方法の工程、慣用の方法の工程、既知の方法もしくは慣用の方法の参照は、本発明のいかなる局面、説明または態様も、当該技術において開示され、教示されまたは示唆されていることを承認するものでは決してない。
【０１０３】
特定の態様の前記説明は、本発明の一般的性質を、他の人々が、当技術分野の熟練内の知識（本明細書に引用された参考文献の内容を含む）を適用することにより、過度の実験なしに、本発明の一般的概念から逸脱することなく、このような特定の態様を、種々の用途のために容易に改変および／または適合させることができるように、完全に本発明の一般的性質を明らかにするであろう。したがって、このような適合および改変は、本明細書に提示された教示および手引きに基づいて開示された態様の均等物の意味および範囲内にあることを意図する。本明細書における語句および用語は、説明の目的であって限定の目的ではなく、したがって、本明細書の用語または語句は、当業者の知見と組み合わせて、本明細書に提示された教示および手引きに照らして当業者により解釈されるべきであることは理解されるべきである。
【０１０４】
【表１】
【図面の簡単な説明】
【０１０５】
【図１Ａ】プロテインＡ変異体のＰＣＲ合成のために使用された、プライマーＰｒｏｔＡ−ｆｗｄ（配列番号１）およびＰｒｏｔＡ−ｒｅｖ（配列番号２）を示す。図１Ｂは、プロテインＡ変異体のヌクレオチド配列（配列番号３）を示す。図１Ｃは、プロテインＡ変異体のアミノ酸オープンリーディングフレームを示す（配列番号４）。
【図１Ｂ】プロテインＡ変異体のＰＣＲ合成のために使用された、プライマーＰｒｏｔＡ−ｆｗｄ（配列番号１）およびＰｒｏｔＡ−ｒｅｖ（配列番号２）を示す。図１Ｂは、プロテインＡ変異体のヌクレオチド配列（配列番号３）を示す。図１Ｃは、プロテインＡ変異体のアミノ酸オープンリーディングフレームを示す（配列番号４）。
【図１Ｃ】プロテインＡ変異体のＰＣＲ合成のために使用された、プライマーＰｒｏｔＡ−ｆｗｄ（配列番号１）およびＰｒｏｔＡ−ｒｅｖ（配列番号２）を示す。図１Ｂは、プロテインＡ変異体のヌクレオチド配列（配列番号３）を示す。図１Ｃは、プロテインＡ変異体のアミノ酸オープンリーディングフレームを示す（配列番号４）。
【図２】ファージ−プロテインＡがＩｇＧ１タイプの抗体（196、10Ｄ5、６Ｃ6および２Ｈ３）に結合することを示すグラフである。それはＩｇＧ２ａ（３Ｄ６）にも結合しそしてＩｇＧ２ｂ（１２Ｂ４）にも弱く結合する。
【図３】Ａβ１−１６に対するファージ−ＰｒｏｔＡ結合抗体は、一旦それらがＡβ１−１６に結合するとプロテインＡから離脱しないことを示すグラフである。
【図４】ｍＡｂ１９６に結合しているファージ−ＰｒｏｔＡ１の力価測定を示すグラフである。
【図５Ａ】図５Ａおよび５Ｂは２つの別々の濃度の抗体２Ｈ３によるファージの力価測定を示すグラフである。
【図５Ｂ】図５Ａおよび５Ｂは２つの別々の濃度の抗体２Ｈ３によるファージの力価測定を示すグラフである。
【図６】ＰＥＧ沈殿の後の抗体１９６からのファージプロテインＡ解離をチェックするためのＥＬＩＳＡの結果を示すグラフである。処理は、１、５μg196と組み合わせたファージ−プロテインＡおよびＰＥＧ沈殿；２、ＰＥＧ沈澱なしで１と同じ；３、抗体１９６のみ−ＰＥＧ沈澱；４、３における同じであるが、ＰＥＧ沈殿なし；４、抗体なしかつＰＥＧ沈澱なしのファージ−プロテインＡのみ。
【図７Ａ】図７Ａおよび７Ｂは、インスリンに対するファージ−ＰｒｔＡ−抗インスリンの結合（図７Ａ）およびヤギ抗マウス抗体で検出されたファージ−ＰｒｔＡ−インスリン−抗インスリン免疫複合体の結合（図７Ｂ）を示すグラフである。
【図７Ｂ】図７Ａおよび７Ｂは、インスリンに対するファージ−ＰｒｔＡ−抗インスリンの結合（図７Ａ）およびヤギ抗マウス抗体で検出されたファージ−ＰｒｔＡ−インスリン−抗インスリン免疫複合体の結合（図７Ｂ）を示すグラフである。
【図８】ファージ複合体で処理されたマウスおよびコントロール非処理マウスにおける可溶性および不溶性Ａβ１−４２および不溶性Ａβ１−４０のレベルを比較するグラフである。
【図９Ａ】図９Ａおよび９Ｂは、非処理コントロールマウスと比較したファージ−１９６複合体で処理されたＰＤＡＰＰマウスにおける不溶性および可溶性Ａβ１−４２のレベルを示すグラフである。
【図９Ｂ】図９Ａおよび９Ｂは、非処理コントロールマウスと比較したファージ−１９６複合体で処理されたＰＤＡＰＰマウスにおける不溶性および可溶性Ａβ１−４２のレベルを示すグラフである。
【図１０Ａ】図１０Ａおよび１０Ｂは、複合体で処理されたマウスおよび非トランスジェニックマウスおよびトランスジェニックコントロールマウスにおけるＩＬ１βおよびＩＬ１０のサイトカインレベルを示すグラフである。
【図１０Ｂ】図１０Ａおよび１０Ｂは、複合体で処理されたマウスおよび非トランスジェニックマウスおよびトランスジェニックコントロールマウスにおけるＩＬ１βおよびＩＬ１０のサイトカインレベルを示すグラフである。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、脳への抗体および免疫複合体の送達のための繊維状バクテリオファージディスプレイビヒクルならびに診断および治療におけるその使用に関する。
【０００２】
関連技術の説明
ファージディスプレイ
コンビナトリアルファージディスプレイペプチドライブラリーは、タンパク質：タンパク質相互作用を研究するための効率的な手段を提供する。この技術は、対応する遺伝子的青写真と関連したランダムペプチドの非常に大きいコレクションの産生に頼る(Scott et al, 1990; Dower, 1992; Lane et al, 1993; Cortese et al, 1994; Cortese et al, 1995; Cortese et al, 19956)。ランダムペプチドの提示は、Ｍ１３、ｆｄおよびｆ１などの繊維状バクテリオファージの外側表面に発現されたキメラタンパク質を構築することによりしばしば達成される。この提示は、所望の結合性を有するペプチドのアフィニティー単離および同定をもたらす結合アッセイを受けやすいレパートリーおよび特異化されたスクリーニングスキーム（バイオパニングと呼ばれる(Parmley et al, 1988)）を作る。この方法において、レセプターに結合するペプチド(Koivunen et al, 1995; Wrighton et al, 1996; Sparks et al, 1994; Rasqualini et al,1996)、酵素に結合するペプチド（Matthews et al, 1993; Schmitz et al, 1996）または抗体に結合するペプチド(Scott et al, 1990; Cwirla et al, 1990; Felici et al, 1991; Juzzago et al, 1993; Hoess et al, 1993; Bonnycastle et al, 1966)は効果的に選ばれた。
【０００３】
繊維状バクテリオファージは、Ｆエピソームを担持するEscherichia coli細胞に感染する非溶菌性雄特異的バクテリオファージである(概説として、Model et al, 1988参照)。繊維状ファージ粒子は、環状一本鎖ＤＮＡゲノム（＋鎖）を含有する９００nm長および１０nmの細い管状構造のように見える。ファージのライフサイクルは、バクテリアのＦ線毛へのファージの結合、次いでホストへの一本鎖ＤＮＡゲノムの侵入を含む。環状一本鎖ＤＮＡは、ホスト複製装置により認識されそして相補性第２ＤＮＡ鎖の合成はファージｏｒｉ（−）構造において開始される。二本鎖ＤＮＡ複製形体は、ｏｒｉ（＋）構造で開始する一本鎖ＤＮＡ環状ファージゲノムの合成のためのテンプレートである。これらは、最終的にビリオンにパッケージされそしてファージ粒子は溶菌またはホストへの見かけの損傷を引き起こさないでバクテリアから押し出される。
【０００４】
ペプチドディスプレイシステムは、ファージの２つの構造タンパク質：ｐＩＩＩ（Ｐ３）タンパク質およびｐＶＩＩＩタンパク質を利用した。ｐＩＩＩタンパク質は、ファージ当たり５コピーで存在しそしてビリオンの１つの先端に排他的に見出される(Goldsmith et al, 1977)。ｐＩＩＩタンパク質のＮ末端ドメインは、感染プロセスのために必要なノブ様構造を形成する。(Gray et al, 1981)。それは、Ｆ線毛の先端へのファージの吸着および次いでバクテリアホスト細胞への一本鎖ＤＮＡの透過およびトランスロケーションを可能とする(Holliger et al, 1997)。ｐＩＩＩタンパク質は、広範な改変を許容することができ、したがってそのＮ末端にペプチドを発現するのに使用された。外来ペプチドは、６５までのアミノ酸残基の長さであったが(Bluthner et al, 1996; Kay et al, 1993)、ある場合には、ｐＩＩＩ機能に顕著に影響を与えることなく完全長タンパク質と同じ大きさですらあった(McCafferty et al, 1990; McCafferty et al, 1992)。
【０００５】
一本鎖ファージＤＮＡを取り囲んでいる円筒形タンパク質エンベロープは、２７００コピーの主要コートタンパク質、ｐＶＩＩＩ、５０アミノ酸残基からなるα−ヘリカルサブユニットからなる。ｐＶＩＩＩタンパク質それ自体は、タンパク質のαヘリックスがビリオンの長軸に対して浅い角度で位置して、ヘリカルパターンで配置されている(Marvin et al, 1994)。このタンパク質の一次構造は、３つの別々のドメイン：（１）酸性アミノ酸に富みそして外側環境に暴露されたＮ末端部分；（２）（ｉ）ファージ粒子におけるサブユニット：サブユニット相互作用および（ｉｉ）ホスト細胞における膜貫通機能の責任を担う中心疎水性ドメイン；および（３）ファージの内部に埋め込まれておりそしてファージＤＮＡと関連しているＣ末端でクラスター化された塩基性アミノ酸を含有する第３ドメインを含有する。ｐＶＩＩＩは、２３アミノ酸リーダーペプチドを含有するプレコートタンパク質として合成され、該リーダーペプチドはバクテリアの内側膜を横切ってトランスロケーションされると開裂されて成熟５０残基膜貫通タンパク質を生じさせる(Sugimoto et al, 1977)。ディスプレイスカフォールドとしてのｐＶＩＩＩの使用は、それがそのＮ末端に６より長くない残基のペプチドの付加を許容するという事実により妨害される。より大きいインサートはファージアセンブリーを妨害する。しかしながら、より大きいペプチドの導入は、リコンビナントペプチド含有ｐＶＩＩＩタンパク質を野生型ｐＶＩＩＩとｉｎ ｖｉｖｏ混合することにより、混合モザイクファージが産生されるシステムにおいて可能である(Felicit et al, 1991; Greenwood et al, 1991; Willis et al, 1993) 。これは、ファージ粒子のアセンブリー期間中野生型コートタンパク質を点在させたファージ表面で低密度（粒子につき１０〜数１００コピー）でキメラｐＶＩＩＩタンパク質の組み込みを可能とする。モザイクファージ゛の発生を可能とする２つのシステムが使用された：Smith(Smith, 1993)により命名された「タイプ８＋８」および「タイプ８８」システム。
【０００６】
「タイプ８＋８」はシステムは、２つの異なる遺伝子単位において別々に位置した２つのｐＶＩＩＩ遺伝子を有することに基づいている(Felicit et al, 1991; Greenwood et al, 1991; Willis et al, 1993)。リコンビナントｐＶＩＩＩ遺伝子は、ファージミド、即ち、その自身の複製起点に加えて、ファージの複製起点およびパッケージングシグナルを含有するプラスミド上に位置している。野生型ｐＶＩＩＩタンパク質は、ファージミドを抱えるバクテリアにヘルパーファージを重複感染させることにより供給される。更に、ヘルパーファージは、ファージミドおよびヘルパーゲノムの両方をビリオンにパッケージするファージ複製およびアセンブリー装置を与える。したがって、２つのタイプの粒子は、このようなバクテリア、ヘルパーおよびファージミドにより分泌され、その両方がリコンビナントｐＶＩＩＩタンパク質および野生型ｐＶＩＩＩタンパク質の混合物を組み込んでいる。
【０００７】
「タイプ８８」システムは、１つのおよび同じ感染性ファージゲノムにおいて２つのｐＶＩＩＩ遺伝子を含有することにより恩恵を受ける。したがって、これはヘルパーファージおよび重複感染を不要にする。更にたった１つのタイプのモザイクファージが産生される。
【０００８】
ファージゲノムは、１０のタンパク質をコードし（ＰＩ〜ＰＸ）、そのすべては感染性子孫の産生のために必須である(Felicit et al, 1991)。タンパク質のための遺伝子は、２つの非コード領域により分離された２つの堅く詰め込まれた転写単位において構成される(Van Wezenbeek et al, 1980)。「遺伝子間領域」（ｐＩＶとｐＩＩ遺伝子間に位置しているものとして定義された）と呼ばれる1つの非コード領域は、ＤＮＡ複製の（＋）および（−）起点およびカプシド形成の開始を可能とするファージのパッケージングシグナルを含有する。この遺伝子間領域の一部は必須ではない(Kim et al, 1981; Dotto et al, 1984)。更に、この領域は、いくつかの部位で外来ＤＮＡの挿入を許容することができことが見出された(Messing, 1983; Moses et al, 1980; Zacher et al, 1980)。ファージの第２非コード領域は、ｐＶＩＩＩとｐＩＩＩ遺伝子間に位置し、そしてPluckthun(Krebber et al, 1995)により例示されたとおり外来リコンビナント遺伝子を組み込むためにも使用された。
【０００９】
ファージディスプレイによる免疫化
エピトープからなる低分子合成ペプチドは、ペプチドの化学合成を必要とする一般に不十分な抗原でありそして大きな担体にカップリングされる必要があるが、その場合ですら、それらは低アフィニティー免疫応答を誘導する可能性がある。抗原としてＥＦＲＨペプチドのみをディスプレイする繊維状ファージを使用して抗ＡβＰ抗体を生じさせるための免疫感作の方法が本発明者の研究所で開発された(Frenkel et al., 2000 and 2001)。繊維状バクテリオファージは、ファージコートタンパク質をコードする遺伝子の５’端部にランダムなオリゴヌクレオチドをクローニングすることにより発生したペプチドの大きなレパートリーのそれらの表面での「ディスプレイ」のために近年広範に使用されている(Scott and Smith, 1990; Scott, 1992)。最近報告されたとおり、繊維状バクテリオファージは、種々の生物学的製剤における外来ペプチドの発現および提示のための優れたビヒクルである(Greenwood et al., 1993; Medynski, 1994)。繊維状ファージの投与は、ファージ効果システムに対する強い免疫学的応答を誘導する(Willis et al., 1993; Meola et al., 1995)。上記したファージコートタンパク質ｐＩＩＩおよびｐＶＩＩＩは、ファージディスプレイのためにしばしば使用されてきたタンパク質である。
【００１０】
その線状構造により、繊維状ファージは、異なる種類の膜に対する高い透過性を有し(Scott et al., 1990)そして、嗅索に続いて、大脳辺縁系を介して海馬区域に到達して疾患のある部位をターゲティングする。クロロホルムによる繊維状ファージの処理は、線状構造を環状構造に変え、環状構造は脳へのファージの送達を阻止する。
【００１１】
抗体エンジニアリング
抗体エンジニアリング法は、ｍＡｂｓの生物学的活性を維持しながらｍＡｂｓのサイズ（１３５〜９００kDa）を最小化するために適用された(Winter et al., 1994)。これらの技術およびＰＣＲ技術を適用して大きな抗体遺伝子レパートリーを作り出すことは、抗体ファージディスプレイを一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）抗体の単離および特徴付けのための多様なツールとする(Hoogenboom et al., 1998)。ｓｃＦｖは更なる操作のためにファージの表面にディスプレイすることができ、または可溶性ｓｃＦｖ（〜２５kd）フラグメントとして放出されうる。本発明者の研究所は、親ＩｇＭ分子に類似した抗凝集性を示すｓｃＦｖを工学的に作成した(Frenkel et al., 2000a)。ｓｃＦｖ構築のために、抗ＡβＰ ＩｇＭ ５０８ハイブリドーマからの抗体遺伝子をクローニングした。分泌された抗体は、ＡβＰ分子に対して、培養されたＰＣ１２細胞に対するその毒性効果を阻止することにおいて、特異的活性を示した。部位特異的一本鎖Ｆｖ抗体は、細胞内または細胞外アプローチを介して脳に治療抗体をターゲティングための第１段階である。
【００１２】
プロテインＡ：
Staphylococcus aureusのプロテインＡは、免疫グロブリン、特にＩｇＧクラスのＦｃ部分へのそのアフィニティーにより特徴付けられた細胞壁構成成分である(Goding, 1978)。それはヒト、マウス、ブタ、モルモットおよびウサギのＩｇＧ抗体に結合する。マウスにおいては、プロテインＡは高いアフィニティーでＩｇＧ２ａおよびＩｇＧ２ｂ抗体に結合するが、ＩｇＧ１およびＩｇＧ３抗体にはあまりよく結合しない(Goudswaard et al., 1978)。プロテインＡは、アスパラギン酸およびグルタミン酸に富むかシステインを欠いた４つの反復ドメインを有する４２kDaタンパク質である。ＩｇＧ結合ドメイン（ドメインＢ）は、３つの逆平行αヘリックスからなり、その第３はこのタンパク質がＦｃと複合体化されるとき分裂する(disrupted)(Graille et al., 2000)。
【００１３】
プラーク形成疾患
プラーク形成疾患は、脳におけるアミロイドプラーク沈着の存在およびニューロン変性により特徴付けられる。アミロイド沈着物は、不溶性塊に凝集したペプチドにより形成される。ペプチドの性質は異なる疾患において変わるが、多くの場合に、凝集物はβひだ状シート構造(beta-pleated sheet structure)を有しそしてコンゴーレッド染料で染まる。早期発症アルツハイマー病、後記発症アルツハイマー病および前兆アルツハイマー病を含むアルツハイマー病（ＡＤ）の他に、アミロイド沈着により特徴付けられる他の疾患は、例えば、ＳＡＡアミロイドーシス、遺伝性アイスランド症候群、多発性ミエローマおよびプリオン病である。動物において最もよくあるプリオン病は、ヒツジおよびヤギのスクラピーおよびウシ海綿状脳症（ＢＳＥ）である(Wilesmith and Wells, 1991)。４つのプリオン病：（ｉ）クールー病、（ｉｉ）クロイツフェルト−ヤコブ症候群、（ｉｉｉ）ゲルストマン−ストロイスラー−シヤインカー病(Gerstmann-Streussler-Sheinker Disease(GSS)および（ｉｖ）致死的家族性不眠症(fatal familial insomnia(FEI)(Gajdusek, 1977; and Tritschler et al. 1992)が同定された。
【００１４】
プリオン病は、正常細胞プリオンタンパク質（ＰｒＰＣ）の対応するスクラピーアイソフォーム(scrapie isogorm)（ＰｒＰＳｃ）への転換を含む。顕微鏡的測定は、ＰｒＰＣのスクラピーアイソフォーム（ＰｒＰＳｃ）への転換が主要コンフォメーション転移(major conformation transition)を伴うことを示しており、これは、他のアミロイドゲニック病(amyloidogenic diseases)と同様に、プリオン病がタンパク質コンフォメーションの障害であることを示唆している。ＰｒＰＣからＰｒＰＳｃへの転移は、α−ヘリカル二次構造の減少（４２％から３０％）およびβシート含有率の顕著な増加（３％から４３％）により伴われる(Caughey et al, 1991; and Pan et al, 1993)。この再構成(rearrangement)は、非変性性洗剤中への不溶性およびプロテオリシスに対する部分的抵抗を含む異常な物理化学的性質と関連している。これまでの研究は、ヒトＰｒＰの残基１０６〜１２６（Ｐｒｐ１０６〜１２６）と相同性の合成ペプチドは、ＰｒＰＳｃの病原性および物理化学的性質のいくらかを示すことを示した(Selvaggini et al, 1993; Tagliavini et al, 1993; and Forloni et al, 1993)。このペプチドは、種々の環境において異なる二次構造を獲得する、顕著なコンフォメーション多型を示す(De Gioia et al, 1994)。それは、緩衝化溶液中でβシートコンフォメーションを採る傾向がありそしてプロテアーゼによる消化に対して部分的に抵抗性であるアミロイドフィブリルに凝集する傾向がある。抗体３Ｆ４とそのペプチドエピトープ（ＰｒＰ１０４〜１１３）の複合体のＸ線結晶学的研究は、プリオン病の進展に必須のコンフォメーション再構成(conformational rearrangement)の成分であると考えられるこの柔軟性領域の構造的な見解を示した。(Kanyo et al, 1999)。
【００１５】
アルツハイマー病（ＡＤ）は、老人性痴呆をもたらす進行性疾患である。広く言えば、この疾患は２つの種類：老齢（典型的には６５歳以上）で起こる後期発症および老年期の前、例えば３５〜６０歳でよく発生する早期発症に属する。両タイプの疾患において、病態は同様であるが、異常は、より早齢で始まる場合により重篤でありそして広がる傾向がある。疾患は、脳における２つのタイプの損傷、老人斑および神経原繊維変化(neurofibrillary tangles)により特徴付けられる。老人班は、脳組織の切片の顕微鏡解析により見ることができる、中心での細胞外アミロイド沈着物の直径で１５０mmまでの解体した好中球の区域である。神経原繊維変化はペアにおいてお互いのまわりに撚り合わされた２つのフィラメントからなるタウタンパク質の細胞内沈着物である。
【００１６】
老人斑の主成分は、アミロイドベータ（Ａβ）またはベータアミロイドペプチド（βＡＰまたはβＡ）と呼ばれるペプチドである。アミロイドベータペプチドは、アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）と呼ばれる前駆体タンパク質の３９〜４３アミノ酸の内部フラグメントである。ＡＰＰタンパク質内のいくつかの突然変異は、アルツハイマー病の存在と相関していた(Goate et al,(1991)、バリン717 がイソロイシンに; Chartier Harlan et al, (1991),バリン 717 がグリシンに; Murrell et al, (1991), バリン 717 がフェニルアラニンに; Mullan et al, (1992), リシン５９５−メチオニン５９６をアスパラギン５９５−ロイシン５９６に変える二重突然変異)。
【００１７】
このような突然変異は、ＡＰＰのベータアミロイドへの増加したもしくは変化したプロセシング、特にＡＰＰの増加した量の長い形態のベータアミロイドへのプロセシング（即ち、Ａβ１−４２およびＡβ１−４３）によりアルツハイマー病を引き起こすと考えられる。プレセニリン遺伝子、ＰＳ１およびＰＳ２などの他の遺伝子における突然変異は、ＡＰＰのプロセシングに間接に影響を与えて増加した量の長い形態のベータアミロイドを発生させると考えられる(Hardy, TINS 20, 154,1997参照)。これらの観察は、ベータアミロイドおよび特にその長い形態がアルツハイマー病における原因的エレメントであることを示す。
【００１８】
アミロイド繊維に関する刊行物は、円筒形ベータシートがＸ線および電子顕微鏡データのいくらかと合致した唯一の構造でありそしてアルツハイマーＡβフラグメントおよび変異体の繊維は、多分、２つまたは３つの同心円筒形βシートからなることを示す(Perutz et al., 2002)。完全なＡβペプチドは、４２残基、丁度円筒形シェルの核を形成する(nucleate)ための正しい数、を含有し；この発見および、プロリンの不存在下にＡβペプチドからなるβシートにおける多くの可能な強い静電気的相互作用は、Ａβペプチドのアルツハイマー患者において見出された細胞外アミロイドプラークを形成する傾向の原因となる。もしこの解釈が正しいとすれば、アミロイドは、中心が水で充填されたキャビティーを有する細いチユ−ブ（ナノチューブ）からなる。ｉｎ−ｖｉｔｒｏアミロイドプラーク成長の可逆性は、プラーク中のβＡと溶液中のβＡとの定常状態平衡を示唆する(Maggio and Mantyh, 1996)。βひだ状シートフィブリルを形成するためのペプチド−ペプチド相互作用に対するβＡ重合の依存性、および反応に対する他のタンパク質の刺激的影響は、アミロイド形成がモデュレーションを受けることができることを示唆する。アミロイド形成を妨害することができる物質を発見するための多くの試みがなされた。中でも最も研究された化合物は、抗体、プロリンのようなベータブレーカーアミノ酸からなるペプチド、認識モチーフへの帯電した基の付加および構築ブロックとしてのＮ−メチル化アミノ酸の使用である(Gazit, 2002により概説された)。
【００１９】
患者におけるアミロイド凝集により特徴付けられた疾患の予防または処置のための方法が提唱され、これは、アミロイド沈着物のペプチド成分に対する抗体が凝集したアミロイドまたは可溶性アミロイドと接触することを引き起こすことを含む。SchenkのＷＯ99/27944およびSolomonのU. S. Patent5,688,651参照。各々の全内容は参照により本明細書に組み込まれる。抗体を、能動的ワクチン接種または受動的ワクチン接種により可溶性アミロイドもしくは凝集されたアミロイドと接触させることができる。能動的ワクチン接種においては、可溶性アミロイドおよび／または凝集したアミロイドに結合する抗体をｉｎ ｖｉｖｏで高めるために、全体アミロイドペプチドまたはその一部であることができるペプチドが投与される。受動的ワクチン接種は、アミロイドペプチドに特異的な抗体を直接投与することを含む。これらの方法は、アミロイドプラークを減少させるかまたはこのようなプラークの沈着速度を遅くすることによりアルツハイマー病の処置のために好ましくは使用される。
【００２０】
このような方法を試験するためのワクチンの臨床試験がElan CorporationおよびWyeth-Ayerst Laboratoriesにより着手されたことが報告された。試験されている化合物は、ＡＮ−１７９２であった。この製品は、βアミロイド４２の形態であることが報告されている。
【００２１】
本明細書における任意の文献の引用は、このような文献が適切な先行技術であるという承認または本願の特許請求の範囲の特許性に重要であると考えられることの承認であることを意図しない。任意の文献の内容または日付に関する任意の陳述は、出願時点で本出願人に入手可能な情報に基づいておりそしてこのような陳述の正しさに関する承認を構成しない。
【００２２】
発明の要約
本発明は、プロテインＡまたは抗体のＦｃ部分に結合することができるそのフラグメントもしくは変異体を非ネイティブな繊維状バクテリオファージ分子としてその表面にディスプレイする繊維状バクテリオファージ、ならびにプロテインＡまたはそのフラグメントもしくは変異体に抗体のＦｃ部分により結合した抗体または抗原−抗体免疫複合体、を含有するファージディスプレイビヒクルを提供する。
【００２３】
本発明は、治療剤または診断剤として使用するための本発明のファージディスプレイビヒクルを含有する医薬組成物も提供する。
【００２４】
脳の疾患、障害または状態を処置／抑制することまたは診断することを必要としている被検体に本発明のファージディスプレイビヒクルを鼻腔内に投与することにより、脳の疾患、障害または状態を処置／抑制するためまたは診断するための方法が本発明により更に提供される。
【００２５】
発明の詳細な説明
繊維状バクテリオファージは、鼻腔内に投与されるとき脳を透過することを可能とする線形構造を有する。それらはそれらのコートタンパク質上に選別されたタンパク質またはペプチドを提示するように工学的に作成されうるので、それらを使用して抗体または分子（それらの特異的抗体との免疫複合体の形態にある）を哺乳動物被検体の脳に送達することができる。Ｐ３は、ファージがバクテリアEscherichia coliにそれを通って侵入するファージコートの先端の１つをアセンブリする構造タンパク質である。
【００２６】
本発明の１つの局面は、プロテインＡまたは抗体のＦｃ部分に結合することができるそのフラグメントもしくは変異体を非ネイテイブな繊維状バクテリオファージ分子として その表面にディスプレイする繊維状バクテリオファージを含み、そして更にプロテインＡまたはそのフラグメントもしくは変異体にそのＦｃ部分により結合した抗体または抗原−抗体免疫複合体を含む、ファージディスプレイビヒクルに関する。好ましい態様では、繊維状バクテリオファージは、薬物にリンカーを介してまたは直接にコンジュゲーションされておらず、そして抗体または抗原−抗体免疫複合体も固体担体上に固定化されていない。他の好ましい態様では、繊維状バクテリオファージ上にディスプレイされたプロテインＡまたはそのフラグメントもしくは変異体に結合した抗体は、細胞表面上にターゲツトとして提示されていない分子に対して特異的でありそして抗体は固体担体上に固定化されていない。
【００２７】
本発明者の研究所では、構造的レベルおよび遺伝子レベルでよく理解されている繊維状ファージＭ１３、ｆ１およびｆｄ(Greenwood et al., 1991)が使用された。この研究所は、繊維状バクテリオファージが、ベクターの不活性および外来分子を担持する能力を保存しながら、中枢神経系への透過性を示すことを最初に示した(Frenkel and Solomon, 2002)。
【００２８】
繊維状バクテリオファージは、環状一本鎖ＤＮＡゲノムを含有する構造的に関連したウイルスのグループである。それらは、生産的感染期間中それらのホストを殺さない。Ｆプラスミドを含有するEscherichia coliに感染するファージは、まとめてＦｆバクテリオファージと呼ばれる。それらは哺乳動物細胞を殺さない。
【００２９】
繊維状バクテリオファージは、ＤＮＡコアを取り囲んでいるタンパク質サブユニットのヘリカルシェルを有する、約１〜２ミクロン長さおよび直径６nmの柔軟性ロッドである。２つの主コートタンパク質、タンパク質ｐＩＩＩおよび主要コートタンパク質ｐＶＩＩＩは、ディスプレイされたタンパク質のコピーの数において異なる。ｐＩＩＩは４〜５コピーにおいて提示されるが、ｐＶＩＩＩは〜３０００コピーにおいて見出される。約５０残基の主要コートタンパク質ｐＶＩＩＩサブユニットは、主としてαヘリカルでありそしてαヘリックスの軸は、ビリオンの軸と小さな角をなす。タンパク質シェルは、３つの区域：取り囲んでいる溶媒と相互作用しそして低等電点をビリオンに与える酸性残基に富んだサブユニットのＮ末端領域により占められた外側表面；タンパク質サブユニットが主としてお互いに相互作用する極性側鎖の１９残基ストレッチを含むシェルの内側；およびＤＮＡコアと相互作用する塩基性残基に富んだサブユニットのＣ末端領域により占められた内側表面；とみなされる。実質的にすべてのタンパク質側鎖相互作用は、サブユニット内よりはむしろコートタンパク質アレイにおける異なるサブユニット間にあるという事実は、これを高分子アセンブリにおけるαヘリカルサブユニット間の相互作用の研究のための有用なモデルシステムとする。繊維状バクテリオファージは約１６．３MDの質量を有しているが、その独特の構造は、脳へのその透過を可能とし、そして、ファージ構造はアミロイドフィブリルそれ自体に似ているので、βＡフィブリル化を妨害するその能力に寄与することができる。
【００３０】
繊維状バクテリオファージは、Ｍ１３、ｆ１またはｆｄなどの任意の繊維状バクテリオファージであることができる。Ｍ１３は下記の実施例で使用されたけれども、任意の他の繊維状バクテリオファージが、同様な方式で機能しそして挙動することが予想される。何故ならば、それらは同様な構造を有しておりそしてそれらのゲノムは９５％より高いゲノム同一性を有するからである。
【００３１】
本発明に従うファージディスプレイビヒクルにおいて、プロテインＡまたはそのフラグメントもしくは変異体は、繊維状バクテリオファージの表面にディスプレイされる。このファージディスプレイは、ファージコートタンパク質との融合タンパク質としてプロテインＡまたはそのフラグメントもしくは変異体のｃＤＮＡクローンの発現を伴う。従って、繊維状バクテリオファージゲノムは、その表面に非ネイティブポリペプチドをディスプレイするように遺伝子的に改変される。ファージコートタンパク質との融合としての外来タンパク質またはペプチドをディスプレイする繊維状バクテリオファージは当技術分野で周知である。Ｍ１３タンパク質ＩＩＩ、Ｍ１３タンパク質ＶＩＩＩ、Ｍ１３タンパク質ＶＩ、Ｍ１３タンパク質ＶＩ、Ｍ１３タンパク質ＩＸ、およびｆｄ少量コートタンパク質ｐＩＩＩを含むがそれらに限定されない種々のファージおよびコートタンパク質を使用することができる(Saggio et al., 1995; Uppala and Koivunen, 2000)。ベクターの大きなアレイが入手可能である(Kay et al., 1996; Berdichevsky et al., 1999; and Benhar, 2001)。好ましい態様では、プロテインＡまたはそのフラグメントもしくは変異体は、繊維状ファージの少ないコートタンパク質（タンパク質ＩＩＩ）へのその融合によりディスプレイされる。ファージ遺伝子に外来コード配列を挿入するための方法は周知である(例えば、Sambrook et al., 1989; and Brent et al., 2003)。
【００３２】
Staphylococcus aureusのプロテインＡは周知であり、そして抗体のＦｃ部分に結合するために当技術分野でよく使用される。結合ドメイン（１つまたは複数）を含有するタンパク質のフラグメントも当技術分野でよく認識されている。抗体（免疫グロブリン）のＦｃ部分への改良された結合（または異なるＩｇクラスおよびサブクラスからのＦｃへのディファレンシャルな結合）を有するプロテインＡの変異体に関する多数の知見もある。好ましくはプロテインＡまたはそのフラグメントもしくは変異体に結合される抗体はＩｇＧクラスである。プロテインＡ変異体の最も好ましい態様は、配列番号４のアミノ酸配列を有する変異体である。
【００３３】
抗体のＦｃ部分に結合することができるプロテインＡまたはそのフラグメントもしくは変異体は、繊維状バクテリオファージの表面にディスプレイされて脳への送達のために抗体または抗原−抗体免疫複合体に結合する。
【００３４】
本発明は、脳にファージ送達ビヒクルを導入することにより脳の疾患、障害または状態(condition)を抑制または処理するための方法を提供する。更に本方法は、検出されうる、即ち標識されうるファージディスプレイビヒクルを脳に導入することにより脳の疾患、障害または状態を診断するための方法を提供する。本方法は、有効量の本発明のファージディスプレイヒビクルを、導入／投与することを必要としている被検体に導入／投与することを含む。
【００３５】
本明細書および特許請求の範囲の目的で、用語「患者」、「被検体」および「レシピエント」は相互交換可能に使用される。それらは、予防処置もしくは治療処置または診断の目的であるヒトおよび他の哺乳動物を含む。
【００３６】
本明細書および特許請求の範囲の目的で、用語「ベータアミロイドペプチド」は、「βアミロイドペプチド」、「アミロイドβペプチド」、「βＡＰ」、「βＡ」および「Ａβ」と同義である。これらの用語のすべては、アミロイド前駆体タンパク質に由来するプラーク形成ペプチドを指す。好ましい態様では、ファージ表面にディスプレイされたプロテインＡ（またはそのフラグメントもしくは変異体）に結合した抗体は、アミロイドβペプチドに対して特異的である（特異的に結合する）。アミロイドβペプチドは、好ましくはＡβ１−４２またはＡβ１−４０である。
【００３７】
本明細書で使用された、「ＰｒＰタンパク質」、「Ｐｒｐ」、「プリオン」は、適当な条件下に、プラーク形成疾患の原因となる凝集物の形成を誘導することができるポリペプチドを指す。例えば、正常な細胞プリオンタンパク質（ＰｒＰＣ）は、このような条件下で、ウシ海綿状脳症（ＢＳＥ）、または狂犬病、ネコのネコ海綿状脳症、クールー病、クロイツフェルト−ヤコブ病（ＣＪＤ）、ゲルストマン−ストロイスラー−シャインカー病（ＧＳＳ）および致死的家族性不眠症（ＦＦＩ）などの（それらに限定されない）プラーク形成疾患の原因となる対応するスクラピーアイソフォーム（ＰｒＰＳｃ）に転換される。他の好ましい態様では、抗体は病原性ＰｒＰＳｃアイソフォームに対して特異的である。
【００３８】
用語「処置する」は、疾患、障害または状態の進行を実質的に抑制すること、遅くすることまたは逆転させること、疾患、障害または状態の臨床的症候を実質的に改善することまたは、疾患、障害または状態の臨床的症候の出現を実質的に予防することを意味することを意図する。
【００３９】
本発明のファージ送達ビヒクルおよび方法は、脳の疾患、障害または状態を指向する。好ましくは、脳の疾患、障害または状態は「プラーク形成疾患」である。
【００４０】
用語「プラーク形成疾患」は、早期発症アルツハイマー病（ＡＤ）、後期発症アルツハイマー病、前兆アルツハイマー病、ＳＡＡアミロイドーシス、遺伝性アイスランド症候群、老衰、多発性ミエローマならびに例えば、クールー病、クロイツフェルト−ヤコブ病（ＣＪＤ）、ゲルストマン−ストロイスラー−シャインカー病（ＧＳＳ）および致死的家族性不眠症（ＦＦＩ）などの（それらに限定されない）ヒトを冒すことが知られているプリオン病および例えば、スクラピーおよびウシ海綿状脳症（ＢＳＥ）などの動物を冒すことが知られているプリオン病などの（それらに限定されない）疾患における、βアミロイド、血清アミロイドＡ、シスタチンＣ、ＩｇＧκ軽鎖またはプリオンタンパク質などの（それらに限定されない）凝集性タンパク質（プラーク形成ペプチド）によるプラークの形成により特徴付けられた疾患を指す。
【００４１】
前記したプラーク形成疾患と関連したアミロイドプラーク（アミロイド沈着物としても知られている）の大部分は、脳内に位置しているので、任意の提唱された処置様式は、血液脳関門（ＢＢＢ）を横切る能力およびアミロイドプラークを溶解する能力を示さなければならない。普通は、ＢＢＢを通過することができる分子の平均サイズは約２ｋＤａである。
【００４２】
増加する数の証拠は、中枢嗅覚経路における嗅覚欠失および変性的変化は、ＡＤの臨床的経過において早期に影響されることを示す。更に、ＡＤに関与した解剖学的パターンは、嗅覚経路がＡＤの進展における初期の段階でありうることを示唆する。
【００４３】
嗅覚レセプターニューロンは、鼻腔の上皮ライニングにある二極性細胞である。それらの軸索は、篩状プレート(cribriform plate)を横断しそして脳の嗅球における嗅覚経路の第１シナプスに突き出す。鼻上皮からの嗅覚ニューロンの軸索は１０００のミエリンのない繊維の束を形成する。この構成は、それらを、ウイルスまたは他の輸送された物質が血液脳関門（ＢＢＢ）を横切ってＣＮＳにアクセスすることができるハイウエイとする。
【００４４】
前に示されたとおり、鼻腔内投与(Mathison et al, 1998; Chou et al, 1997; Draghia et al, 1995)は、脳脊髄液（ＣＳＦ）またはＣＮＳへのウイルスおよび高分子の直接侵入を可能とする。
【００４５】
脳へのアデノウイルスベクターのための送達点として嗅覚レセプターニューロンの使用は、文献に報告されている。この方法は、報告によれば、見かけの毒性なしに１２日間脳におけるレポーター遺伝子の発現を引き起こす(Draghia et al, 1995)。
【００４６】
抗体または免疫複合体の直接脳送達は、脳への輸送体として嗅覚ニューロンを使用することによりＢＢＢを横切ることを克服する。嗅覚上皮において、一次嗅覚ニューロンの樹状細胞は、鼻内腔と接触しており、そしてこれらのニューロンは、軸索を介して脳の嗅球にも接続されている。嗅覚上皮と接触しているファージは、一次嗅覚ニューロンに取り込まれることができ、嗅球に輸送されることができ、そして脳の他の区域にすら輸送されうる。
【００４７】
脳腫瘍および脳炎症性疾患、障害または状態も、本発明に従う処置され／抑制されまたは診断される脳の疾患、障害または状態に含まれる。脳炎症は、インタクトな海馬形成における新しいニューロンの基礎的な連続的形成および脳発作に応答して増加した神経組織発生(neurogenesis)の両方において神経組織発生の抑制を引き起こす。神経組織発生の悪化(impairment)は、取り囲んでいる組織に損傷があるかないかにかかわらず、ミクログリア活性化の程度に依存する。脳炎症は、多分、パーキンソン病、リューイ小体痴呆(Lewy Body Dementia)、ＡＩＤＳ痴呆コンプレツクス、外傷性脳損傷、緑内障等のようなＡβＰ病理学的効果を含む、ＡＤのほかの他の慢性神経変性障害の病原において多分重要な役割を演じる。
【００４８】
外傷性脳損傷（ＴＢＩ）は、βアミロイド沈着および痴呆の早期発症を含む。このような記述にもかかわらず、これらの変化が起こる機構に関しては殆ど知られていない。ＴＢＩにおけるβアミロイドペプチドの発生について提唱された１つのソースは、外傷により損傷された軸索内の悪化した軸索原形質輸送の部位に蓄積することが示されたβアミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）の異常なタンパク分解開裂である。事実、βＡ免疫反応性は、ＴＢＩのブタモデルにおける膨潤した軸索と共に最近見出され(Smith et al., 1999)、これは、外傷的に損傷された軸索におけるＡＰＰの蓄積がＴＢＩにおけるβアミロイドペプチド形成のためのソースでありうることを示唆する。
【００４９】
神経変性疾患および障害の非限定的例は、アルツハイマー病（ＡＤ）、パーキンソン病、リューイ小体痴呆、ＡＩＤＳ痴呆コンプレツクス、発作、並びに閉鎖性頭部損傷および外傷性脳損傷、例えば、弾丸傷、出血発作(hemorrhagic stroke)、虚血性発作、脳虚血、毒素、毒物、化学（細菌戦）剤、などの神経損傷剤により引き起こされる損傷または腫瘍切除などの外科手術により引き起こされる損傷を含む。
【００５０】
好ましい態様では、ファージディスプレイされたプロテインＡ（またはそのフラグメントもしくは変異体）に結合した抗体は、アミロイドβペプチドおよびＰｒＰＳｃなどの、脳の疾患、障害または状態と関連したターゲット分子に対して特異的なモノクローナル抗体である。抗体は、発作、脳損傷または他の神経変性疾患もしくは障害の結果としての脳炎症を抑制／処置するための、ＴＮＦα、ＩＬ６等などの脳における炎症性サイトカインに対する抗体であることもできる。脳の疾患、障害または状態として脳腫瘍を診断するための方法の場合に、抗体は、脳腫瘍に特徴的なターゲット分子に対して特異的でありそしてその存在は特定の脳腫瘍の診断となる。
【００５１】
あるいは、抗体のＦｃ部分により抗原−抗体免疫複合体に結合したプロテインＡ（またはそのフラグメントもしくは変異体）をディスプレイするファージ送達ビヒクルは、脳に免疫複合体を送達するために使用されうる。免疫複合体における抗体により結合された抗原は、脳の疾患、障害または状態を処置することができる分子である。抗体により結合された抗原の非限定的例は、インスリン、ニューロン損傷および細胞死を減少させることができるエリスロポエチン（ＥＰＯ）、インターフェロンおよび他の抗炎症性サイトカイン、例えばＩＬ１０、および血液脳関門を通過しないニューロン保護分子を含む。
【００５２】
本発明に従う脳の疾患、障害または状態を診断するための方法は、本発明のファージディスプレイビヒクルを鼻腔内に投与することを必要としている被検体に、本発明のファージディスプレイビヒクルを鼻腔内に投与することを含む。その抗体成分を有するファージディスプレイビヒクルが、脳の疾患、障害または状態と関連したターゲットに結合されると、脳の疾患、障害または状態の存在が検出される。繊維状バクテリオファージの表面にディスプレイされたプロテインＡ（または抗体のＦｃ部分に結合することができるそのフラグメントもしくは変異体）に結合した抗体は、検出可能に標識されうる。
【００５３】
標識される抗体は、好ましくは脳腫瘍に対する治療または診断放射線像形成において使用するために放射能標識される。標識のための放射性核種の非限定的例は、１１１Ｉｎ、１２５Ｉ、１３１Ｉおよび９９ｍＴｃを含む。好ましくは放射性ヨウ素化抗体である放射能標識された抗体は、ペプチドおよびタンパク質を放射能標識するための標準方法により調製され、次いで繊維状バクテリオファージの表面にディスプレイされたプロテインＡ（またはそのフラグメントもしくは変異体）に結合させられる。
【００５４】
他の適当な検出可能な標識は、エンハンスドダイナミックＭＲＩ(enhanced dynamic MRI)のための好ましい試薬であるガドリニウム（Ｇｄ）などの造影剤および重元素（例えば、Ｐｔ、ＡｕおよびＴｌ）の有機または無機化合物を含む。
【００５５】
本発明に従う医薬製剤は、有効成分として、本発明のファージディスプレイビヒクルを含む。医薬製剤は、異なる繊維状バクテリオファージからのファージディスプレイビヒクルの混合物であることもできる。
【００５６】
本発明に従う製剤は、生物それ自体に投与されうるかまたはそれが適当な担体もしくは賦形剤と混合されている医薬組成物において投与されうる。
【００５７】
本明細書で使用された「医薬組成物」は、生理学的に適当な担体および賦形剤などの他の化学成分と本明細書に記載の１つ以上の有効成分の製剤を指す。医薬組成物の目的は、生物への化合物の投与を容易にすることである。
【００５８】
用語「有効成分」は、生物学的効果の原因となる製剤を指す。診断用途に使用するための医薬組成物の状況において、用語「有効成分」は、脳の疾患、障害または状態と関連した分子をターゲティングする抗体であることを意図する。
【００５９】
以後、相互交換可能に使用されうる語句「生理学的に許容されうる担体」および「薬学的に許容されうる担体」は、生物に対する有意な刺激を引き起こさずそして投与された化合物の生物学的活性および性質を妨げない担体または希釈剤を指す。
【００６０】
用語「賦形剤」は、有効成分の投与を更に容易にするために医薬組成物に加えられた不活性物質を指す。賦形剤の非限定的例は、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、種々の糖および種々のタイプのデンプン、セルロース誘導体、ゼラチン、植物油およびポリエチレングリコールを含む。
【００６１】
薬物の処方および投与のための技術は、"Remington's Pharmaceutical Sciences," Mack Publishing Co., Easton, PA, latest editionにおいて見出され得、これは参照により本明細書に組み込まれる。
【００６２】
本発明の医薬組成物は、当技術分野で周知の方法、例えば、慣用の混合、溶解、顆粒化、糖剤製造(dragee-making)、研和、乳化、カプセル化、エントラッピングまたは凍結乾燥によって製造されうる。
【００６３】
従って、本発明に従って使用するための医薬組成物は、薬学的に使用されうる製剤への有効成分の加工を容易にする、賦形剤または佐剤を含む１つ以上の生理学的に
許容されうる担体を使用して慣用の方式で処方されうる。
【００６４】
鼻吸入による投与のために、本発明に従って使用するための有効成分を、適当な推進剤、例えば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロ−テトラフルオロエタンまたは二酸化炭素、の使用により加圧されたパックまたはネブライザーからのエアゾル噴霧組成物の形態で便利に送達される。吸入スプレーにおけるように加圧されたパックまたはネブライザーを必要としない鼻中スプレーが替わりに鼻腔内投与のために使用されうる。加圧されたエアゾルの場合に、投薬単位は、弁を設けて計量された量を送達することにより決定されうる。化合物と適当な粉末基剤、例えばラクトースまたはデンプンの粉末混合物を含有する、ディスペンサーにおいて使用するための例えばゼラチンのカプセル剤およびカートリッジ剤が処方されうる。
【００６５】
本発明の状況において使用するために適当な医薬組成物は、有効成分が意図した目的を達成するのに有効な量において含有される組成物を含む。更に詳しくは、治療的有効量は、疾患、障害または状態の症状を予防、軽減または改善するのにまたは処置さされるべき被検体の生存を延長するのに有効な有効成分の量を意味する。
【００６６】
治療的もしくは診断的有効量の決定は、特に、本明細書に与えられた詳細な開示に照らして、当業者の能力の十分に範囲内にある。
【００６７】
投薬量および間隔は、特定の脳疾患、障害または状態を処置または診断するのに十分なファージディスプレイビヒクルの脳レベル（最少有効濃度、ＭＥＣ）を与えるように個々に調節されうる。ＭＥＣは、各製剤について変わるであろうが、ｉｎ−ｖｉｔｒｏデータから評価されうる。ＭＥＣを達成するのに必要な投薬量は個々の特徴に依存するであろう。
【００６８】
投薬間隔は、ＭＥＣ値を使用して決定することもできる。製剤は、間隔時間の１０〜９０％、好ましくは３０〜９０％、最も好ましくは５０〜９０％の間ＭＥＣより高い脳レベルを維持する方式を使用して投与されるべきである。
【００６９】
処置されるべき状態の重篤さおよび応答性に依存して、投薬は、数日もしくは数週間続くまたは治癒が達成されるまでもしくは疾患状態の減退が達成されるまで続く処置のクール(cource)で、１回または複数回の投与であることができる。
【００７０】
投与されるべき組成物の量は、もちろん、処置もしくは診断されるべき被検体、苦痛の重篤さ、処方する医師の判断等に依存するであろう。
【００７１】
本発明の組成物は、所望により、有効成分を含有する1つ以上の単位剤形を含有することができるパックまたはディスペンサー装置、例えばＦＤＡで認可されたキットにおいて提供されうる。パックは、例えば、金属もしくはプラスチックフォイル、例えばブリスターパックを含むことができる。パックまたはディスペンサー装置は、投与のためのインストラクションを伴うことができる。パックまたはディスペンサーは、医薬の製造、使用または販売を規制する政府機関により規制された形態にある容器と関連した通達により適応させることができ、該通達は、組成物またはヒトもしくは獣医学的投与の形態について政府機関による認可の反映である。このような通達は、例えば、処方箋薬物についてU.S,Food and Drug Administrationにより認可されたラベリングまたは認可された製品インサート(product insert)であることができる。適合性薬学的担体において処方された本発明の製剤を含む組成物を調製し、適当な容器中に入れ、そしてさらに上記したとおり、指示された状態の処置についてラベリングすることができる。
【００７２】
今や本発明を一般的に説明してきたが、本発明は、説明として与えられそして本発明の限定であることを意図しない下記の実施例を参照することにより容易に理解されるであろう。
【００７３】
実施例
Ｐ３上にプロテインＡの変異体をディスプレイする繊維状ファージをこの研究において構築した。以前の研究はこの基本的なアイデアを使用したが、異なる方法で使用した：即ち、Li et al. (1998)は、ｓｃＦｖ分子に融合したプロテインＡのＢドメインをディスプレイするファージを使用した。Djojonegoro et al. (1994)は、Ｍ１３ファージ上にディスプレイされたプロテインＡのＢドメインのみを使用し、そしてSampath et al.(1997)は、Ｂドメインを使用して、繊維状ファージをクローニングツールとして使用することができることを示した。すべてのこれらの以前の研究は、プロテインＡＩｇＧ結合ドメインをヒトＩｇＧｓに結合させることにより、ファージディスプレイ技術を使用してファージ上にディスプレイされたプロテインＡの改良された形体の容易な選択を可能とした。この研究において下記に示した実験は、プロテインＡ変異体をディスプレイするファージが主としてＩｇＧ１型のマウス抗体およびそれらのリガンドに結合することを示す。これらの複合体は、鼻腔内適用によりｈＡＰＰｔｇマウスに投与された。それらは、マウス脳に入りそして下記で講じる効果を奏した。
【００７４】
物質および方法
プロテインＡ変異体の合成
使用されたプロテインＡの一部は、ドメインＢを含む４つの反復ドメインを含有する。２つのプライマー：ＡＴＧコドンおよびＮｃｏＩ制限部位を有するフォワードプライマーおよび停止コドンを持たずそしてＮｏｔＩ制限部位を有するリバースプライマーを合成した（図１Ａ）。下記のプロトコールを使用してＰＣＲを行った：Staphylococcus aureusのゲノムＤＮＡ２μgを、Ｑｉａｇｅｎ Ｔａｑポリメラーゼの１×バッファー中の各プライマー２０μMと一緒にした。ｄＮＴＰｓ（０．２mM）およびポリメラーゼ２．５単位を１００μl反応容積に加えた ＰＣＲ条件は：９４℃での３分間の初期変性、次いで９４℃での３0秒間の変性３０サイクル、５５℃で１分間のアニーリングおよび７２℃で１分間の重合であった。ＰＣＲ産物をＮｃｏＩおよびＮｏｔＩで消化し、ゲル精製しそして、ＮｃｏＩおよびＮｏｔＩで前もって線状化されたベクターｐＣＡＮＴＡＢ ５Ｅにクローニングした。このベクターにおけるプロテインＡ遺伝子のこの部分のクローニングは、繊維状ファージ（Ｍ１３）の遺伝子３とのプロテインＡの翻訳融合を発生させた。ヘルパーファージを使用して、ファージＰｒｏｔＡと命名されたプロテインＡ−Ｐ３融合物をディスプレイするファージを産生した。
【００７５】
ＥＬＩＳＡ
異なるＩｇＧ抗体へのファージプロテインＡの結合を、ＥＬＩＳＡにより測定した：プロテインＡをディスプレイする１０１１ファージを、０．１Mリン酸ナトリウム、ｐＨ８．５中の抗体１０μg（１５ナノモル）と混合した。混合物を３７℃で３０分間穏やかに振とうさせ、次いで５０μlアリクォートを、ウサギ抗ファージ抗体で前もってコーティングされそして３％ミルクでブロックされたＥＬＩＳＡウェルに四重で(in tetraplicates)加えた。ヤギ抗マウス−ＨＲＰコンジュゲーションされた抗体を二次抗体として使用した。ＨＲＰ反応をＯＰＤおよびペルオキシドで行った。結果を４９２nmでのＯＤとして示す。
【００７６】
抗原結合後のファージ−プロテインＡ−抗体複合体の安定性を下記の方法によりチェックした：プロテインＡをディスプレイする１０１１ファージを、０．１Mリン酸ナトリウム、ｐＨ８．５中の抗体１０μg（１５ナノモル）と混合した。混合物を３７℃で３０分間穏やかに振とうさせ、そしてついで抗原（０．３２ナノモルのビオチニル化Ａβ１−１６）を、抗体に有利に５０：１のモル比で、ファージ−プロテインＡと抗体の混合物に更に３０分間加えた。アリクォート（５０μｌ）をウサギ抗ファージ抗体で前もってコーティングされそして３％ミルクでブロックされたＥＬＩＳＡウェルに四重で加えた。アビジン−ＨＲＰコンジュゲートを使用してＥＬＩＳＡプレートに結合した複合体を検出した。まだ抗原に結合しているファージ−抗体複合体のみがアビジン−ＨＲＰコンジュゲートと反応するであろう。１：１０００の希釈率でこれらの実験で使用された血清は、ＥＲＦＨエピトープに対する力価を有するマウスから抜き取られた。
【００７７】
異なる量の抗体に結合するのに必要なファージの数を力価測定するために、プロテインＡへの最善の結合能力を示した抗体１９６を使用して、３つの異なる濃度で（５０、１００および２５０ng/ウェル）ＥＬＩＳＡプレートをコーティングし、次いで３％ミルクでウェルをブロックした。異なる濃度（109／ml~1012/ml）におけるファージ−プロテインAを加えそして結合したファージをウサギ抗ファージ抗体およびヤギ抗ウサギ−ＨＲＰ抗体により検出した。
【００７８】
ファージ−プロテインＡへの抗体−抗原複合体の結合を下記のとおりに力価測定した： 109／ml〜1012/mlのファージを、２つの別々の濃度の抗体２Ｈ３、１０ngまたは50ngおよび１：２モル比の抗体：抗原（抗体分子に対して２つの抗原分子）と一緒にした。混合物を、３７℃で３０分間穏やかに振とうさせ、そしてウサギ抗ファージ抗体で前もってコーティングされそしてＰＢＳ中の３％ミルクでコーティングされたＥＬＩＳＡウェルに加えた。結合したファージの検出は、ビオチニル化抗原にのみ結合することができるアビジン−ＨＲＰコンジュゲートでなされた。
【００７９】
ファージ−プロテイン抗体複合体のＰＥＧ沈殿がそれらの解離を引き起こすか起こさないかもチェックした：ＥＬＩＳＡウェルを２０μｇ／mlアビジンで４０℃で一夜コーティングし、次いで１μｇ／ｍｌビオチニル化Ａβ１−１６ペプチドで室温にて３０分間コーティングした。ウェルをＰＢＳ中の３％ミルクでブロックした。1012ファージを、０．１M Ｎａ２ＨＰＯ４１ml中の１μgまたは５μgの抗体１９６と一緒にし、そして３７℃で１時間穏やかに振とうさせた。混合物の半分をＰＥＧ−ＮａＣｌを使用して沈澱させ、次いで前と同じく０．１M Ｎａ２ＨＰＯ４ ５００μl中に再懸濁させ、そして他の半分を沈殿させないで使用した。両混合物を前に述べたＥＬＩＳＡプレートに３７℃で１時間適用した（５０μl混合物／ウェル）。結合したファージの検出をマウス抗ファージおよびヤギ抗マウス−ＨＲＰコンジュゲートにより行った。
【００８０】
ファージプロテインＡは、抗インスリンＩｇＧとの複合体を発生することについてもチェックされた。ファージプロテインＡ（1012／ml）を異なる濃度の抗インスリン抗体と一緒にしそして３７℃で３０分間穏やかに振とうさせた。複合体をＰＥＧ沈澱させ、次いで０．２５mg/mlインスリンで４℃で一夜コーティングされたＥＬＩＳＡプレートに適用した。結合したファージを、マウス抗ファージおよびヤギ抗マウス抗体によりまたはヤギ抗マウスのみで検出した。この第２の検出法は、抗インスリン抗体がファージプロテインＡとともに複合体において実際に存在することを証明するために使用された。
【００８１】
ｉｎ ｖｉｖｏ研究
９か月齢ＰＤＡＰＰマウスに、ファージ−プロテインＡ複合体（Ａｂ１９６とのまたは抗インスリンＡｂ＋インスリンとの）を２週間毎に（４回の処置）、次いで次の６回の処置について１か月毎に、合計１０回の処置のために与えた。複合体を、２つの鼻孔により分けて２０マイクリットルを鼻腔内適用により与えた。処置の終りに、マウスを安楽死させそして殺した。各マウスからの左脳半球を液体窒素中で凍結させた。各半球をホモジナイズしそして可溶性画分と不溶性画分に分けた。不溶性画分を後でグアニジン−ＨＣｌで可溶化した。両画分を分析されるまで凍結して保った。βアミロイド１−４２は、捕捉抗体およびＡβ１−４２に対して特異的な検出抗体を使用して、サンドイッチＥＬＩＳＡにより行った。サイトカインレベルの決定は、ＩＬ１βまたはＩＬ１０（Ｒ＆Ｄシステム）のための特異的キットにより行った。
【００８２】
結果および討論
プロテインＡ変異体を図１Ａに示されたプライマーを使用して合成した。ＰＣＲ産物を配列決定してその完全性(integrity)を証明し、次いでｐＣＡＮＴＡＢ５Ｅにクローニングした。ファージのｐＩＩＩに融合したプロテインＡ変異体を発現するファージを産生しそしてＥＬＩＳＡにおいて使用した。
【００８３】
プロテインＡ変異体をディスプレイするするファージは主としてＩｇＧ１抗体に結合する。
ｐｒｏｔＡファージを、ＩｇＧタイプ抗体へのそれらの結合についてＥＬＩＳＡによりチェックした。
図２において１５ナノモルの異なる抗体への1011ファージ粒子の結合が示される。
【００８４】
ファージ−ｐｒｏｔＡ結合抗体はそれらがその抗原に結合した後ファージから離脱しない。
抗体は、それらがその抗原への結合の後ファージから解離するかしないかについてチェックされた。抗原として、βアミロイドペプチドのＮ末端からのアミノ酸残基１−１６のビオチニル化ペプチドを使用した。この実験の結果は、図２に要約される。この実験について、プロテインＡをディスプレイする1011ファージを、０．１M リン酸ナトリウム、ｐＨ８．５中の１０μg（１５ナノモル）の抗体と混合した。混合物を、３７℃で３０分間振とうし、次いで抗体に有利に５０：１のモル比の抗原（０．３２モルのビオチニル化Ａβ１−１６）を、追加の３０分間ファージ−プロテインＡと抗体の混合物に加えた。複合体を、ウサギ抗ファージ抗体で前もってコーティングされそして３％ミルクでブロツクされたＥＬＩＳＡウェルに加えた。コンジュゲーションされたアビジン−ＨＲＰを使用して、ＥＬＩＳＡプレートに結合した複合体を検出した。抗原の結合後まだ結合しているファージ−抗体複合体のみがアビジン−ＨＲＰコンジュゲートと反応するであろう。これらの実験で使用された血清はＥＲＦＨエピトープに対する力価を有するマウスから抜き取られた。
【００８５】
図３は、プロテインＡが結合した抗体が、それらが認識する抗原に結合するとき、それらはプロテインＡから離脱しないことを示す。プレートに結合したファージ−プロテインＡから離脱する抗体−抗原複合体は、洗浄除去されそしてアビジン−ＨＰＲと反応しないであろう。図２に示されたとおり、１２Ｂ４はファージ−プロテインＡに弱く結合した。それはペプチド１−１６に結合しないので、ここでは反応せず、そして他のネガティブコントロールとして使用された。結合結果は、ＥＬＩＳＡプレートがｐＨ６．０のＰＢＳバッファーで洗浄されるとき、変化しなかった。より低いｐＨは、ファージ−ＰｒｏｔＡからの抗体−抗原複合体の解離を引き起こさなかった。
【００８６】
ｍＡｂ196へのプロテインＡの結合の力価測定
異なる量の抗体に結合するのに必要なファージの数は、結合が特異的であることを証明するために力価測定された。この実験において、プロテインＡへの最善の結合能力を示した抗体196を使用して3つの異なる濃度でＥＬＩＳＡプレートをコーティングし、次いで3％ミルクでウェルをブロックした。異なる濃度のファージ−プロテインＡを加えそして結合したファージをウサギ抗ファージ抗体により検出した（図4）。図4から、抗体196へのファージ−プロテインＡの結合は特異的であることは明らかであり；それはファージ数および抗体濃度の関数として高められる。この実験セッティングにおいて、飽和した結合は観察されなかた。プロテインＡをディスプレイするファージの数を評価するために、ＥＬＩＳＡウェルを高められたファージ濃度でコーティングしそして抗ファージ抗体と反応させた（示されていない）。この分析と図４に示された以前の分析を４９２におけるＯＤを比較することにより、ファージの約３０％〜３６％がプロテインＡをディスプレイすることが決定され得た。
【００８７】
ある量のファージ（結合される抗原の量も示すであろう）に結合するのに必要な抗体の量を決定するために、高められた数のファージを２つの別々の濃度の抗体（２Ｈ３）と一緒にしそして抗体：抗原のモル比を１：２とした（各抗体分子について２つの抗原分子）他の実験を行った（図５Ａ）。混合物を、前もってウサギ抗ファージ抗体でコーティングさされそしてＰＢＳ中の３％ミルクでコーティングされたＥＬＩＳＡウェルに加えた。結合したファージの検出を、ビオチニル化抗原にのみ結合することができるアビジン−ＨＲＰコンジュゲートにより行った。
【００８８】
各抗体濃度に対する結合について観察された値は異なるファージ濃度間であまり異ならないので、結果は「平均の平均」として要約することもできそして図５Ｂに示されたとおりプロットすることもできる。
【００８９】
これらの結果は、抗体濃度がこの実験セッティングにおける限定因子であり、ファージ濃度ではないことを証明する：109／mlファージ−プロテインＡ（ＥＬＩＳＡウェル当たり使用された５０μｌ当たり5×107ファージ）で、約７０ピコモルである５０ngに結合するのに十分なプロテインＡ分子があり、そしてそれらは５×ファージ−プロテインＡ分子を飽和させるのに十分ではない。
【００９０】
ＰＥＧ−ＮａＣｌ沈澱は、甚だしいファージ−抗体解離を引き起こさなかった
ファージ−タンパク質Ａ−抗体複合体のＰＥＧ沈殿がそれらの解離を引き起こすか引き起こさないかもチェックした。ＥＬＩＳＡウェルをアビジンおよび１μｇ／ｍｌビオチニル化１−１６ペプチドでコーティングした。ウェルをＰＢＳ中の３％ミルクでブロックした。1012ファージを０．１M Na2HPO4中の１μgまたは５μg抗体１９６と一緒にしそして３７℃で１時間穏やかに振とうした。混合物の半分をＰＥＧ−ＮａＣｌを使用して沈澱させ、次いで同じバッファーおよび前と同じ容積において再懸濁させ、そして他の半分を沈殿させないで使用した。両混合物を前に記載されたＥＬＩＳＡプレート（５０μl混合物／ウェル）に３７℃で１時間適用した。結合したファージの検出をマウス抗ファージおよびやぎ抗マウス−ＨＲＰコンジュゲートで行った。図６は、ＰＥＧ沈澱が、ファージプロテインＡ−抗体複合体の約２０％を解離させたことを示す。
【００９１】
ファージプロテインＡは、抗インスリン抗体とインスリンの免疫複合体に結合する
ファージ−プロテインＡを抗インスリンＩｇＧと一緒にしそして複合体を、０．２５ｍｇ／ｍｌインスリンでコーティングされたＥＬＩＳＡプレート上で使用した。複合体をＥＬＩＳＡプレートに適用される前にＰＥＧ沈澱させた。結合したファージをマウス抗ファージおよびヤギ抗マウス抗体で検出するか（図７Ａ）またはヤギ抗マウスのみで検出した（図７Ｂ）。この第２の検出法を使用して抗インスリン抗体が実際にファージプロテインＡとの複合体中に存在することを証明した。
【００９２】
ファージ−プロテインＡ（1012／ml）を異なる濃度の抗インスリン抗体と一緒にしそして３７℃で３０分間穏やかに振とうした。複合体を、ＥＬＩＳＡプレートに適用される前にＰＥＧ沈澱させた。結合したファージをマウス抗ファージで検出し次いでやぎ抗マウス抗体で検出した。
【００９３】
図７Ａに示されたのと同様な、しかしヤギ抗マウス抗体のみで検出されたアッセイの結果は、図７Ｂに示される。
【００９４】
要約すると、ＩｇＧタイプの抗体に結合することができるプロテインＡの変異体をディスプレイする繊維状ファージを発生させた。マウスＩｇＧ２ａおよびＩｇＧ２ｂに強く結合するStaphylococcus aureusのネイティブなプロテインＡとは反対に、このリコンビナントプロテインＡは、最も豊富なタイプであるマウスＩｇＧ１分子によりよく結合する。これらのファージは、抗体を精製するためにｉｎ−ｖｉｔｒｏで使用することができるか、または例えばある種の抗体を脳に送達するのにｉｎ ｖｉｖｏで使用することができる。
【００９５】
ｉｎ ｖｉｖｏ研究
ファージ−ｐｒｏｔＡ−１９６
ファージ−ｐｒｏｔＡ−１９６複合体を、物質および方法の節で説明したとおり、ＰＤＡＰＰトランスジェニックマウスに適用した。可溶性画分および不溶性画分（凝集したペプチドおよびグアニジン−ＨＣｌで可溶化された膜）中のβアミロイドペプチド１−４２のレベル、ならびに不溶性画分中のＡβ１−４０のレベルをチェックした。トランスジェニック非処理コントロールと比較して、可溶性画分中のおよび不溶性画分中のＡβ１−４２の量の約２０％減少が処理されたマウスにおいて観察された。しかしながら、結果は有意ではなかった（図８）。Ａβ１−４０において、コントロール非処理サマウスに比較してファージ複合体で処理されたマウス間で差は観察されなかった。
【００９６】
ファージ−ｐｒｏｔＡ−抗インスリン−インスリン
ＰＤＡＰＰマウスをファージ−抗体−インスリン複合体で処理した。図９Ａにおいて、不溶性Ａβ１−４２のレベルのより劇的な差、Ｔｇ非処理マウスまたはファージ−１９６複合体で処理されたマウスと比較して、複合体で処理されたマウスにおける約６３％の減少が観察された。ファージのみで処理されたマウスは、Ａβ１−４２レベルの平均２３％減少を伴うにすぎなかった。処理されたマウスにおける可溶性Ａβ１−４２のレベルの減少は、より劇的ですらありそしてコントロールと比較して８０％に達した（図９Ｂ）。
【００９７】
ＩＬ１β、プロ炎症性サイトカインおよびＩＬ１０、抗炎症性サイトカインのレベルをチェックした。トランスジェニック非処理マウスにおけるＩＬ１βのレベルは、非トランスジェニックマウスにおけるＩＬ１βのレベルより約３６％高かったが（図１０Ａ）、これは、この疾患がより高いＩＬ１β濃度で現れる炎症を引き起こすことを意味している。しかしながら、複合体処理されたマウスは、非トランスジェニックマウスにおけるＩＬ１βのレベルと同様なレベルを含有していたが、これは処理されたマウスが脳の炎症を発生しなかったことを示唆する。抗炎症性サイトカイン、ＩＬ１０の濃度において同じ現象が観察された（図１０Ｂ）。ここで再び、平均して１８％未満のＩＬ１０を含有していたトランスジェニックコントロールマウスに比較して、非トランスジェニックマウスおよびトランスジェニック処理マウスにおいてＩＬ１０のレベルは同様であった。ファージ−ｐｒｏｔＡ−１９６を受け取ったＰＤＡＰＰマウスにおけるサイトカインレベルは、処理されたマウスとトランスジェニックコントロール間で差はなことを示した（データは示されていない）。
【００９８】
以前の研究は、脳脊髄液区画への物質の直接のアクセスを与えることが知られているインスリン投与の鼻腔内経路により記憶機能に対するインスリンの効果を急激に改善する効果を示唆した(Strachan, 2005)。先の結果は、辺縁および海馬領域におけるインスリンレセプターの普及、ならびに全身系インスリンによる記憶の改善を示す。インスリンをファージと組み合わせて、増加した数のファージが脳に導入されてアミロイドの過酷な負荷(amyloid burden)の有効な減少をもたらすことを証明した。この効果は、脳におけるサイトカインプロフィルの改善を伴う。この蓄積効果は、ファージの抗凝集性＋ＡＤの保護的処理としてインスリンを介するより良好な透過を得るのに有効な方法であることができる。
【００９９】
今や本発明を完全に記述してきたが、本発明は、本発明の精神および範囲から逸脱することなくかつ過度の実験なしに、広い範囲の同等なパラメーター、濃度および状態の範囲内で同じことが行われうることは、当業者により認められるであろう。
【０１００】
本発明は、その特定の態様に関して述べられたが、それは更に改変されうることは理解されるであろう。本願は、一般に、本発明の原理に従う、そして本発明が属する技術分野内の既知の実施または慣用の実施内に入るような、そして特許請求の範囲に示された本質的な特徴に適用されうるような、本発明の開示からの逸脱を含む、本発明の任意の変更、使用または適応を包含することを意図する。
【０１０１】
引用された文献中に提示されたすべてのデータ、表、図面およびテキストを含む、雑誌論文またはアブストラクト、公開されたもしくは対応するＵ．Ｓ．もしくは外国特許出願、発行されたＵ．Ｓ．特許もしくは外国特許、または任意の他の文献を含む本明細書で引用されたすべての参考文献は、参照により本明細書に完全に組み込まれる。更に、本明細書に引用された参考文献内に引用された参考文献の全体の内容も、参照により完全に組み込まれる。
【０１０２】
既知の方法の工程、慣用の方法の工程、既知の方法もしくは慣用の方法の参照は、本発明のいかなる局面、説明または態様も、当該技術において開示され、教示されまたは示唆されていることを承認するものでは決してない。
【０１０３】
特定の態様の前記説明は、本発明の一般的性質を、他の人々が、当技術分野の熟練内の知識（本明細書に引用された参考文献の内容を含む）を適用することにより、過度の実験なしに、本発明の一般的概念から逸脱することなく、このような特定の態様を、種々の用途のために容易に改変および／または適合させることができるように、完全に本発明の一般的性質を明らかにするであろう。したがって、このような適合および改変は、本明細書に提示された教示および手引きに基づいて開示された態様の均等物の意味および範囲内にあることを意図する。本明細書における語句および用語は、説明の目的であって限定の目的ではなく、したがって、本明細書の用語または語句は、当業者の知見と組み合わせて、本明細書に提示された教示および手引きに照らして当業者により解釈されるべきであることは理解されるべきである。
【０１０４】
【表１】
【図面の簡単な説明】
【０１０５】
【図１Ａ】プロテインＡ変異体のＰＣＲ合成のために使用された、プライマーＰｒｏｔＡ−ｆｗｄ（配列番号１）およびＰｒｏｔＡ−ｒｅｖ（配列番号２）を示す。図１Ｂは、プロテインＡ変異体のヌクレオチド配列（配列番号３）を示す。図１Ｃは、プロテインＡ変異体のアミノ酸オープンリーディングフレームを示す（配列番号４）。
【図１Ｂ】プロテインＡ変異体のＰＣＲ合成のために使用された、プライマーＰｒｏｔＡ−ｆｗｄ（配列番号１）およびＰｒｏｔＡ−ｒｅｖ（配列番号２）を示す。図１Ｂは、プロテインＡ変異体のヌクレオチド配列（配列番号３）を示す。図１Ｃは、プロテインＡ変異体のアミノ酸オープンリーディングフレームを示す（配列番号４）。
【図１Ｃ】プロテインＡ変異体のＰＣＲ合成のために使用された、プライマーＰｒｏｔＡ−ｆｗｄ（配列番号１）およびＰｒｏｔＡ−ｒｅｖ（配列番号２）を示す。図１Ｂは、プロテインＡ変異体のヌクレオチド配列（配列番号３）を示す。図１Ｃは、プロテインＡ変異体のアミノ酸オープンリーディングフレームを示す（配列番号４）。
【図２】ファージ−プロテインＡがＩｇＧ１タイプの抗体（196、10Ｄ5、６Ｃ6および２Ｈ３）に結合することを示すグラフである。それはＩｇＧ２ａ（３Ｄ６）にも結合しそしてＩｇＧ２ｂ（１２Ｂ４）にも弱く結合する。
【図３】Ａβ１−１６に対するファージ−ＰｒｏｔＡ結合抗体は、一旦それらがＡβ１−１６に結合するとプロテインＡから離脱しないことを示すグラフである。
【図４】ｍＡｂ１９６に結合しているファージ−ＰｒｏｔＡ１の力価測定を示すグラフである。
【図５Ａ】図５Ａおよび５Ｂは２つの別々の濃度の抗体２Ｈ３によるファージの力価測定を示すグラフである。
【図５Ｂ】図５Ａおよび５Ｂは２つの別々の濃度の抗体２Ｈ３によるファージの力価測定を示すグラフである。
【図６】ＰＥＧ沈殿の後の抗体１９６からのファージプロテインＡ解離をチェックするためのＥＬＩＳＡの結果を示すグラフである。処理は、１、５μg196と組み合わせたファージ−プロテインＡおよびＰＥＧ沈殿；２、ＰＥＧ沈澱なしで１と同じ；３、抗体１９６のみ−ＰＥＧ沈澱；４、３における同じであるが、ＰＥＧ沈殿なし；４、抗体なしかつＰＥＧ沈澱なしのファージ−プロテインＡのみ。
【図７Ａ】図７Ａおよび７Ｂは、インスリンに対するファージ−ＰｒｔＡ−抗インスリンの結合（図７Ａ）およびヤギ抗マウス抗体で検出されたファージ−ＰｒｔＡ−インスリン−抗インスリン免疫複合体の結合（図７Ｂ）を示すグラフである。
【図７Ｂ】図７Ａおよび７Ｂは、インスリンに対するファージ−ＰｒｔＡ−抗インスリンの結合（図７Ａ）およびヤギ抗マウス抗体で検出されたファージ−ＰｒｔＡ−インスリン−抗インスリン免疫複合体の結合（図７Ｂ）を示すグラフである。
【図８】ファージ複合体で処理されたマウスおよびコントロール非処理マウスにおける可溶性および不溶性Ａβ１−４２および不溶性Ａβ１−４０のレベルを比較するグラフである。
【図９Ａ】図９Ａおよび９Ｂは、非処理コントロールマウスと比較したファージ−１９６複合体で処理されたＰＤＡＰＰマウスにおける不溶性および可溶性Ａβ１−４２のレベルを示すグラフである。
【図９Ｂ】図９Ａおよび９Ｂは、非処理コントロールマウスと比較したファージ−１９６複合体で処理されたＰＤＡＰＰマウスにおける不溶性および可溶性Ａβ１−４２のレベルを示すグラフである。
【図１０Ａ】図１０Ａおよび１０Ｂは、複合体で処理されたマウスおよび非トランスジェニックマウスおよびトランスジェニックコントロールマウスにおけるＩＬ１βおよびＩＬ１０のサイトカインレベルを示すグラフである。
【図１０Ｂ】図１０Ａおよび１０Ｂは、複合体で処理されたマウスおよび非トランスジェニックマウスおよびトランスジェニックコントロールマウスにおけるＩＬ１βおよびＩＬ１０のサイトカインレベルを示すグラフである。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
プロテインＡまたは抗体のＦｃ部分に結合することができるそのフラグメントもしくは変異体を非ネイティブな繊維状バクテリオファージ分子としてその表面にディスプレイする繊維状バクテリオファージ、ならびに該プロテインＡまたはそのフラグメントもしくは変異体にそのＦｃ部分により結合した抗体または抗原−抗体免疫複合体、を含むファージディスプレイビヒクルであって、但し、該繊維状バクテリオファージは薬物にリンカーを介してまたは直接コンジュゲーションされておらず、そして該抗体または免疫複合体も固体担体上に固定化されていない、ファージディスプレイビヒクル。
【請求項２】
繊維状バクテリオファージがＭ１３、ｆ１およびｆｄバクテリオファージおよびそれらの任意の混合物からなる群より選ばれる、請求項１に記載のファージディスプレイビヒクル。
【請求項３】
繊維状バクテリオファージがＭ１３である、請求項１に記載のファージディスプレイビヒクル。
【請求項４】
抗体がＩｇＧクラスである、請求項１に記載のファージディスプレイビヒクル。
【請求項５】
前記プロテインＡまたはそのフラグメントもしくは変異体に結合した抗体がモノクローナル抗体である、請求項１に記載のファージディスプレイビヒクル。
【請求項６】
前記モノクローナル抗体が、Ａβ１−４２またはＡβ１−４０のアミロイドβペプチドに対して生じたモノクローナル抗体または該アミロイドβペプチドに対して特異的なモノクローナル抗体である、請求項５に記載のファージディスプレイビヒクル。
【請求項７】
前記モノクローナル抗体が、脳の疾患、障害または状態と関連したターゲット分子に対して特異的である、請求項５に記載のファージディスプレイビヒクル。
【請求項８】
前記脳の疾患、障害または状態がプラーク形成疾患または障害である、請求項７に記載のファージディスプレイビヒクル。
【請求項９】
前記モノクローナル抗体が標識されている、請求項７に記載のファージディスプレイビヒクル。
【請求項１０】
前記プロテインＡまたはそのフラグメントもしくは変異体に結合した前記免疫複合体が、インスリンと抗インスリン抗体の免疫複合体である、請求項１に記載のファージディスプレイビヒクル。
【請求項１１】
前記繊維状バクテリオファージの表面にディスプレイされた前記非ネイティブな繊維状バクテリオファージ分子が、抗体または抗原−抗体免疫複合体に結合した、プロテインＡまたは抗体のＦｃ部分に結合することができるそのフラグメントもしくはその変異体からなる、請求項１に記載のファージディスプレイビヒクル。
【請求項１２】
プロテインＡまたは抗体のＦｃ部分に結合することができるそのフラグメントもしくは変異体を非ネイティブな繊維状バクテリオファージ分子としてその表面にディスプレイする繊維状バクテリオファージ、ならびに該プロテインＡまたはそのフラグメントもしくは変異体にそのＦｃ部分により結合した抗体、を含むファージディスプレイビヒクルであって、該抗体が細胞表面にターゲットとして提示されていない分子に対して特異的であり、但し、該抗体は固体担体上に固定化されてもいない、ファージディスプレイビヒクル。
【請求項１３】
繊維状バクテリオファージがＭ１３、ｆ１およびｆｄバクテリオファージおよびそれらの任意の混合物からなる群より選ばれる、請求項１２に記載のファージディスプレイビヒクル。
【請求項１４】
繊維状バクテリオファージがＭ１３である、請求項１２に記載のファージディスプレイビヒクル。
【請求項１５】
抗体がＩｇＧクラスである、請求項１２に記載のファージディスプレイビヒクル。
【請求項１６】
前記プロテインＡまたはそのフラグメントもしくは変異体に結合した抗体がモノクローナル抗体である、請求項１２に記載のファージディスプレイビヒクル。
【請求項１７】
前記モノクローナル抗体が、Ａβ１−４２またはＡβ１−４０のアミロイドβペプチドに対して生じたモノクローナル抗体または該アミロイドβペプチドに対して特異的なモノクローナル抗体である、請求項１６に記載のファージディスプレイビヒクル。
【請求項１８】
前記モノクローナル抗体が、脳の疾患、障害または状態と関連したターゲット分子に対して特異的である、請求項１６に記載のファージディスプレイビヒクル。
【請求項１９】
前記脳の疾患、障害または状態がプラーク形成疾患または障害である、請求項１８に記載のファージディスプレイビヒクル。
【請求項２０】
請求項１または請求項１２に記載のファージディスプレイビヒクルと、薬学的に許容される担体、賦形剤、希釈剤または佐剤を含む医薬組成物。
【請求項２１】
脳の疾患、障害または状態を処置または抑制することを必要としている被検体に有効量の請求項１または請求項１２のファージディスプレイビヒクルを鼻腔内に投与して、脳の疾患、障害または状態を抑制または処置することを含む、脳の疾患、障害または状態を処置または抑制するための方法。
【請求項２２】
前記脳の疾患、障害または状態がプラーク形成疾患または障害である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
プラーク形成疾患または障害がアルツハイマー病である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
ファージディスプレイビヒクル上にディスプレイされた前記プロテインＡまたはそのフラグメントもしくは変異体に結合した抗体が、アミロイドβペプチドに対して特異的な抗体である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記抗体がアミロイドβペプチド１−４２または１−４０に対して特異的である、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
プラーク形成疾患がプリオン病である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２７】
前記脳の疾患、障害または状態が脳腫瘍である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２８】
前記脳の疾患、障害または状態が、脳炎症性疾患、障害または状態である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２９】
被検体が哺乳動物である、請求項２１に記載の方法。
【請求項３０】
被検体がヒトである、請求項２１に記載の方法。
【請求項３１】
前記プロテインＡまたはそのフラグメントもしくは変異体に結合した前記免疫複合体が、インスリンと抗インスリン抗体の免疫複合体である、請求項２１に記載の方法。
【請求項３２】
脳の疾患、障害または状態を診断することを必要としている被検体に請求項１または請求項１２に記載のファージディスプレイビヒクルを鼻腔内に投与し；そして
ファージディスプレイビヒクルを、脳の疾患、障害または状態と関連したターゲット分子に結合したその抗体成分により検出して、脳の疾患、障害または状態の存在を診断する、
ことを含む、脳の疾患、障害または状態を診断するための方法。
【請求項３３】
抗体が検出可能に標識される、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
抗体が、放射性核種により検出可能に標識されている、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
抗体が造影剤で検出可能に標識されている、請求項３３に記載の方法。
【請求項１】
プロテインＡまたは抗体のＦｃ部分に結合することができるそのフラグメントもしくは変異体を非ネイティブな繊維状バクテリオファージ分子としてその表面にディスプレイする繊維状バクテリオファージ、ならびに該プロテインＡまたはそのフラグメントもしくは変異体にそのＦｃ部分により結合した抗体または抗原−抗体免疫複合体、を含むファージディスプレイビヒクルであって、但し、該繊維状バクテリオファージは薬物にリンカーを介してまたは直接コンジュゲーションされておらず、そして該抗体または免疫複合体も固体担体上に固定化されていない、ファージディスプレイビヒクル。
【請求項２】
繊維状バクテリオファージがＭ１３、ｆ１およびｆｄバクテリオファージおよびそれらの任意の混合物からなる群より選ばれる、請求項１に記載のファージディスプレイビヒクル。
【請求項３】
繊維状バクテリオファージがＭ１３である、請求項１に記載のファージディスプレイビヒクル。
【請求項４】
抗体がＩｇＧクラスである、請求項１に記載のファージディスプレイビヒクル。
【請求項５】
前記プロテインＡまたはそのフラグメントもしくは変異体に結合した抗体がモノクローナル抗体である、請求項１に記載のファージディスプレイビヒクル。
【請求項６】
前記モノクローナル抗体が、Ａβ１−４２またはＡβ１−４０のアミロイドβペプチドに対して生じたモノクローナル抗体または該アミロイドβペプチドに対して特異的なモノクローナル抗体である、請求項５に記載のファージディスプレイビヒクル。
【請求項７】
前記モノクローナル抗体が、脳の疾患、障害または状態と関連したターゲット分子に対して特異的である、請求項５に記載のファージディスプレイビヒクル。
【請求項８】
前記脳の疾患、障害または状態がプラーク形成疾患または障害である、請求項７に記載のファージディスプレイビヒクル。
【請求項９】
前記モノクローナル抗体が標識されている、請求項７に記載のファージディスプレイビヒクル。
【請求項１０】
前記プロテインＡまたはそのフラグメントもしくは変異体に結合した前記免疫複合体が、インスリンと抗インスリン抗体の免疫複合体である、請求項１に記載のファージディスプレイビヒクル。
【請求項１１】
前記繊維状バクテリオファージの表面にディスプレイされた前記非ネイティブな繊維状バクテリオファージ分子が、抗体または抗原−抗体免疫複合体に結合した、プロテインＡまたは抗体のＦｃ部分に結合することができるそのフラグメントもしくはその変異体からなる、請求項１に記載のファージディスプレイビヒクル。
【請求項１２】
プロテインＡまたは抗体のＦｃ部分に結合することができるそのフラグメントもしくは変異体を非ネイティブな繊維状バクテリオファージ分子としてその表面にディスプレイする繊維状バクテリオファージ、ならびに該プロテインＡまたはそのフラグメントもしくは変異体にそのＦｃ部分により結合した抗体、を含むファージディスプレイビヒクルであって、該抗体が細胞表面にターゲットとして提示されていない分子に対して特異的であり、但し、該抗体は固体担体上に固定化されてもいない、ファージディスプレイビヒクル。
【請求項１３】
繊維状バクテリオファージがＭ１３、ｆ１およびｆｄバクテリオファージおよびそれらの任意の混合物からなる群より選ばれる、請求項１２に記載のファージディスプレイビヒクル。
【請求項１４】
繊維状バクテリオファージがＭ１３である、請求項１２に記載のファージディスプレイビヒクル。
【請求項１５】
抗体がＩｇＧクラスである、請求項１２に記載のファージディスプレイビヒクル。
【請求項１６】
前記プロテインＡまたはそのフラグメントもしくは変異体に結合した抗体がモノクローナル抗体である、請求項１２に記載のファージディスプレイビヒクル。
【請求項１７】
前記モノクローナル抗体が、Ａβ１−４２またはＡβ１−４０のアミロイドβペプチドに対して生じたモノクローナル抗体または該アミロイドβペプチドに対して特異的なモノクローナル抗体である、請求項１６に記載のファージディスプレイビヒクル。
【請求項１８】
前記モノクローナル抗体が、脳の疾患、障害または状態と関連したターゲット分子に対して特異的である、請求項１６に記載のファージディスプレイビヒクル。
【請求項１９】
前記脳の疾患、障害または状態がプラーク形成疾患または障害である、請求項１８に記載のファージディスプレイビヒクル。
【請求項２０】
請求項１または請求項１２に記載のファージディスプレイビヒクルと、薬学的に許容される担体、賦形剤、希釈剤または佐剤を含む医薬組成物。
【請求項２１】
脳の疾患、障害または状態を処置または抑制することを必要としている被検体に有効量の請求項１または請求項１２のファージディスプレイビヒクルを鼻腔内に投与して、脳の疾患、障害または状態を抑制または処置することを含む、脳の疾患、障害または状態を処置または抑制するための方法。
【請求項２２】
前記脳の疾患、障害または状態がプラーク形成疾患または障害である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
プラーク形成疾患または障害がアルツハイマー病である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
ファージディスプレイビヒクル上にディスプレイされた前記プロテインＡまたはそのフラグメントもしくは変異体に結合した抗体が、アミロイドβペプチドに対して特異的な抗体である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記抗体がアミロイドβペプチド１−４２または１−４０に対して特異的である、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
プラーク形成疾患がプリオン病である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２７】
前記脳の疾患、障害または状態が脳腫瘍である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２８】
前記脳の疾患、障害または状態が、脳炎症性疾患、障害または状態である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２９】
被検体が哺乳動物である、請求項２１に記載の方法。
【請求項３０】
被検体がヒトである、請求項２１に記載の方法。
【請求項３１】
前記プロテインＡまたはそのフラグメントもしくは変異体に結合した前記免疫複合体が、インスリンと抗インスリン抗体の免疫複合体である、請求項２１に記載の方法。
【請求項３２】
脳の疾患、障害または状態を診断することを必要としている被検体に請求項１または請求項１２に記載のファージディスプレイビヒクルを鼻腔内に投与し；そして
ファージディスプレイビヒクルを、脳の疾患、障害または状態と関連したターゲット分子に結合したその抗体成分により検出して、脳の疾患、障害または状態の存在を診断する、
ことを含む、脳の疾患、障害または状態を診断するための方法。
【請求項３３】
抗体が検出可能に標識される、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
抗体が、放射性核種により検出可能に標識されている、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
抗体が造影剤で検出可能に標識されている、請求項３３に記載の方法。
【図１Ａ】
【図１Ｂ】
【図１Ｃ】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５Ａ】
【図５Ｂ】
【図６】
【図７Ａ】
【図７Ｂ】
【図８】
【図９Ａ】
【図９Ｂ】
【図１０Ａ】
【図１０Ｂ】
【図１Ｂ】
【図１Ｃ】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５Ａ】
【図５Ｂ】
【図６】
【図７Ａ】
【図７Ｂ】
【図８】
【図９Ａ】
【図９Ｂ】
【図１０Ａ】
【図１０Ｂ】
【公表番号】特表２００９−５２９３２０（Ｐ２００９−５２９３２０Ａ）
【公表日】平成２１年８月２０日（２００９．８．２０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−５５５４８９（Ｐ２００８−５５５４８９）
【出願日】平成１９年２月１５日（２００７．２．１５）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００７／０６２２３８
【国際公開番号】ＷＯ２００７／０９５６１６
【国際公開日】平成１９年８月２３日（２００７．８．２３）
【出願人】（５０２４３５７７５）ラモット・アット・テルアビブ・ユニバーシティ (3)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２１年８月２０日（２００９．８．２０）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年２月１５日（２００７．２．１５）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００７／０６２２３８
【国際公開番号】ＷＯ２００７／０９５６１６
【国際公開日】平成１９年８月２３日（２００７．８．２３）
【出願人】（５０２４３５７７５）ラモット・アット・テルアビブ・ユニバーシティ (3)
【Ｆターム（参考）】
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