脳障害関連疾患の診断方法
対象体から採取した体液中のＡ−ＦＡＢＰ、Ｅ−ＦＡＢＰ、Ｈ−ＦＡＢＰ、ＰＧＰ９．５、ＧＦＡＰ、プロスタグランジンＤシンターゼ、ニューロモジュリン、ニューロフィラメントＬ、カルシフォシン、ＲＮＡ結合調節サブユニット(RNA binding regulatory subunit)、ユビキチン融合分解蛋白質１同族体(Ubiquitin fusion degradation protein 1 homolog)、核酸系ヌクレオシドジホスファートキナーゼＡ、グルタチオンＳトランフェラーゼＰ、カテプシンＤ、ＤＪ−１蛋白質、ペルオキシレドキシン５、およびペプチジル−プロリル・シス−トランス・イソメラーゼＡ（シクロフィリンＡ）から選択された少なくとも一つのポリペプチド、またはその変異体もしくは同族体を検出することによって、対象体における脳障害関連疾患を診断する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、脳障害疾患の診断方法に関する。脳血管疾患、痴呆、神経組織変性症などの脳障関連疾患のルーチン検査のための生物学的マーカーは現在のところ無い。本発明は脳障害疾患の雛形として死亡患者から得た脳脊髄液を用いて、脳障害関連疾患のマーカーを発見し、診断に用いることに関わる。
【背景技術】
【０００２】
ここ２０年ほどの間に、脳障害関連疾患の患者の脳脊髄液（ＣＳＦ）や血清で多くの生物学的マーカー（バイオマーカー）が研究されてきた。クレアチンキナーゼ−ＢＢ［１］、乳酸デヒドロゲナーゼ［２］、ミエリン塩基性蛋白［３］、Ｓ１００蛋白質［４］、脳神経特異性エノラーゼ（ＮＳＥ）［５］、神経膠原線維酸性蛋白［６］、そしてタウ（tau）［７］などである。それらの殆どが脳障害疾患の程度や、臨床状態や機能面での結果の正確な予測のための有益な指標であることを証明出来ていない。実際、それらの顕現が遅いこと、障害のあとの遅れる反応ピーク、感度や特異性の低さ、また、これらの分子のＣＦＳ、最終的には血清の中への放出を統制するメカニズムへの理解の不足などが脳障害関連疾患のバイオマーカーの価値の妨げになってきた。これらの限界のおかげで、脳障害疾患関連のバイオマーカーの使用は現在のところ研究段階に限定され、どれもがルーチン評価のために推奨されていない。
【０００３】
ＷＯ01/42793は、体液サンプル中の心臓や脳の脂肪酸結合蛋白（H-FABP またはB-FABP）の濃度を決めるという、卒中の診断分析法に関連している。
【発明の開示】
【０００４】
理想的には、脳障害関連疾患の診断、監視、予後のためのマーカーとしては少なくとも次のような特性を有しなければならない。（１）脳特異性であること。（２）患者からＣＳＦサンプルを得ることが困難であることは明白なので、血清の検出が非常に望ましい。（３）早く顕現すること。（４）そのピークレベル、代替的には連続的な濃度カーブ下の領域が、脳障害の程度を反映すること。（５）機能上の結果を指し示すもの。我々はここで新たな脳障害関連疾患用バイオマーカーを論証し、この目的のために最も詳細に評価されている二つの分子、Ｓ１００とＮＳＥとの比較を行う。
【０００５】
我々は、重い脳障害のモデルとしての死亡患者からのＣＳＦをプロテオミクスベース（proteomics-based）の分析を用いて、いかに脳障害疾患用バイオマーカーを識別するかを述べる。また、１例として、急性脳卒中の患者に関して血清ＦＡＢＰレベルがＥＬＩＳＡ分析を用いて順序立てて決定されたあと得られた結果について、Ｓ１００やＮＳＥと比較してレポートする。
【０００６】
本発明の第１の目的は、健康なドナーの脳脊髄液に比べ死亡患者の脳脊髄液のレベルが高まるポリペプチドを構成する成分を提供することである。同じ目的のために、上記ポリペプチドから誘引される抗体の組成を提供する。
【０００７】
本発明の第２の目的は、脳血管疾患、痴呆、脳神経変性疾患を含む脳障害関連疾患の診断や予後において、創意に富む組成物を用いる方法を提供することである。
本発明は以下のものを提供する。
【０００８】
・ 脳障害関連疾患もしくはその可能性を、罹病していると疑われる対象物において診断する方法であって、対象から取った体液サンプル中の、Ａ−ＦＡＢＰ、Ｅ−ＦＡＢＰ
、Ｈ−ＦＡＢＰ、Ｂ−ＦＡＢＰ、ＰＧＰ９．５、ＧＦＡＰ、プロスタグランジンＤシンターゼ、ニューロモジュリン、ニューロフィラメントＬ、カルシフォシン、ＲＮＡ結合調節サブユニット(RNA binding regulatory subunit)、ユビキチン融合分解蛋白質１同族体(Ubiquitin fusion degradation protein 1 homolog)、ヌクレオシドジホスファートキナーゼＡ、グルタチオンＳトランフェラーゼＰ、カテプシンＤ、ＤＪ−１蛋白質、ペルオキシレドキシン５、およびペプチジル−プロリル・シス−トランス・イソメラーゼＡ（シクロフィリンＡ）の中から選択される少なくとも一つのポリペプチドまたはその変異体または同族体を検出することを含む方法。
【０００９】
（２）ポリペプチドが、脳障害関連疾患に冒されている対象の体液中と脳障害関連疾患に冒されていない対象の体液中で差異的に含まれ、また、サンプル中のポリペプチドの濃度が脳障害関連疾患の診断と一致性を持っているかを決定することを含む１の方法。
【００１０】
（３）濃度の検出または決定にポリペプチドの抗体を用いる１または２の方法。
（４）体液が、脳脊髄液、血漿、血清、血液、涙、尿、または唾液である１から３の内いずれかの方法。
【００１１】
（５）ポリペプチドが、脳障害関連疾患に冒されている対象の体液中に存在して、脳障害関連疾患に冒されていない対象の体液中には存在しない、そのため体液サンプル中のポリペプチドの存在が脳障害関連疾患の表示となる、１から４の内いずれかの方法。
【００１２】
（６）ポリペプチドが、脳障害関連疾患に冒されている対象の体液中に存在しないで、脳障害関連疾患に冒されていない対象の体液中には存在する、そのため体液サンプル中のポリペプチドの非存在が脳障害関連疾患の表示となる、１から４の内いずれかの方法。
【００１３】
（７）サンプルの中に複数のペプチドが検出される１から６の内いずれかの方法。
（８）脳障害関連疾患に冒された対象と脳障害関連疾患に冒されていない対象の体液中で、ポリペプチドの遷移後の変性し易さ(subject to post-translational modification)が差異的であって、サンプル中のポリペプチドの遷移後変性(post-translational modification)を検出し、それが脳障害関連疾患の診断と一致するかどうかを決定する１から７の内いずれかの方法。
【００１４】
（９）遷移後変性(post-translational modification)がＮ−グリコシラチオンを含む８の方法。
（１０）脳障害関連疾患が卒中であって、ポリペプチドがユビキチン融合分解蛋白質１同族体(Ubiquitin fusion degradation protein 1 homolog)である１から９の内いずれかの方法。
【００１５】
（１１）脳障害関連疾患が卒中であって、ポリペプチドがＲＮＡ結合調節サブユニット(RNA binding regulatory subunit)である１から９の内いずれかの方法。
（１２）脳障害関連疾患が卒中であって、ポリペプチドがヌクレオシドジホスファートキナーゼＡである１から９の内いずれかの方法。
【００１６】
（１３）ユビキチン融合分解蛋白質１同族体、ＲＮＡ結合調節サブユニット、ヌクレオシドジホスファートキナーゼＡ、Ｈ−ＦＡＢＰに対する抗体のうち２個以上のマーカーを選択し、ＥＬＩＳＡマイクロタイタープレート(microtiter plate)の一つのウェルに用いる１０から１２の内いずれかの方法。
【００１７】
（１４）一つのウェルに上記４つのマーカーをすべて用いる１３の方法。
（１５）ユビキチン融合分解蛋白質１同族体(Ubiquitin fusion degradation protein
1 homolog)、ＲＮＡ結合調節サブユニット(RNA binding regulatory subunit)、ヌクレオシドジホスファートキナーゼＡ、Ｈ−ＦＡＢＰから選択された２個以上のポリペプチドが個別に分析され、診断のために予測アルゴリズムを用いる１０から１２の内いずれかの方法。
【００１８】
（１６）Ａ−ＦＡＢＰ、Ｅ−ＦＡＢＰ、Ｈ−ＦＡＢＰ、Ｂ−ＦＡＢＰ、ＰＧＰ９．５、ＧＦＡＰ、プロスタグランジンＤシンターゼ、ニューロモジュリン、ニューロフィラメントＬ、カルシフォシン、ＲＮＡ結合調節サブユニット(RNA binding regulatory subunit)、ユビキチン融合分解蛋白質１同族体(Ubiquitin fusion degradation protein 1 homolog)、ヌクレオシドジホスファートキナーゼＡ、グルタチオンＳトランフェラーゼＰ、カテプシンＤ、ＤＪ−１蛋白質、ペルオキシレドキシン５、およびペプチジル−プロリル・シス−トランス・イソメラーゼＡ（シクロフィリンＡ）から選択されたポリペプチドまたはその変異体もしくは同族体、または上記ポリペプチドの組み合わせの、脳障害関連疾患に関連する診断、予後、および治療の応用への使用方法。
【００１９】
（１７）上記ポリペプチドが、脳障害関連疾患に冒されている対象と脳障害関連疾患に冒されていない対象とで差異的に含まれている１６記載の使用方法。
（１８）Ａ−ＦＡＢＰ、Ｅ−ＦＡＢＰ、Ｈ−ＦＡＢＰ、Ｂ−ＦＡＢＰ、ＰＧＰ９．５、ＧＦＡＰ、プロスタグランジンＤシンターゼ、ニューロモジュリン、ニューロフィラメントＬ、カルシフォシン、ＲＮＡ結合調節サブユニット(RNA binding regulatory subunit)、ユビキチン融合分解蛋白質１同族体(Ubiquitin fusion degradation protein 1 homolog)、ヌクレオシドジホスファートキナーゼＡ、グルタチオンＳトランフェラーゼＰ、カテプシンＤ、ＤＪ−１蛋白質、ペルオキシレドキシン５、およびペプチジル−プロリル・シス−トランス・イソメラーゼＡ（シクロフィリンＡ）から選択されたポリペプチドまたはその変異体もしくは同族体を認識する、またはそれに結合する、またはそれと親和性のある物質の、脳障害関連疾患に関する診断、予後、治療の応用への使用方法。
【００２０】
（１９）Ａ−ＦＡＢＰ、Ｅ−ＦＡＢＰ、Ｈ−ＦＡＢＰ、Ｂ−ＦＡＢＰ、ＰＧＰ９．５、ＧＦＡＰ、プロスタグランジンＤシンターゼ、ニューロモジュリン、ニューロフィラメントＬ、カルシフォシン、ＲＮＡ結合調節サブユニット(RNA binding regulatory subunit)、ユビキチン融合分解蛋白質１同族体(Ubiquitin fusion degradation protein 1 homolog)、ヌクレオシドジホスファートキナーゼＡ、グルタチオンＳトランフェラーゼＰ、カテプシンＤ、ＤＪ−１蛋白質、ペルオキシレドキシン５、およびペプチジル−プロリル・シス−トランス・イソメラーゼＡ（シクロフィリンＡ）から選択されたポリペプチドまたはその変異体もしくは同族体を認識する、またはそれに結合する、またはそれと親和性のある物質の組み合わせを用いる１８記載の使用方法。
【００２１】
（２０）上記物質が、抗体または抗体片である１８または１９記載の使用方法。
（２１）上記物質が、Ａ−ＦＡＢＰに対する抗体である２０記載の使用方法。
（２２）上記物質が、Ｅ−ＦＡＢＰに対する抗体である２０記載の使用方法。
【００２２】
（２３）上記物質が、ＰＧＰ９．５に対する抗体である２０記載の使用方法。
（２４）上記物質が、ＧＦＡＰに対する抗体である２０記載の使用方法。
（２５）上記物質が、プロスタグランジンＤシンターゼに対する抗体である２０記載の使用方法。
【００２３】
（２６）上記物質が、ニューロモジュリンに対する抗体である２０記載の使用方法。
（２７）上記物質が、ニューロフィラメントＬに対する抗体である２０記載の使用方法。
【００２４】
（２８）上記物質が、カルシフォシンに対する抗体である２０記載の使用方法。
（２９）上記物質が、ＲＮＡ結合調節サブユニット(RNA binding regulatory subunit)に対する抗体である２０記載の使用方法。
【００２５】
（３０）上記物質が、ユビキチン融合分解蛋白質１同族体(Ubiquitin fusion degradation protein 1 homolog)に対する抗体である２０記載の使用方法。
（３１）上記物質が、ヌクレオシドジホスファートキナーゼＡに対する抗体である２０記載の使用方法。
【００２６】
（３２）上記物質が、グルタチオンＳトランフェラーゼＰに対する抗体である２０記載の使用方法。
（３３）上記物質が、カテプシンＤに対する抗体である２０記載の使用方法。
【００２７】
（３４）上記物質が、ＤＪ−１蛋白質に対する抗体である２０記載の使用方法。
（３５）上記物質が、ペルオキシレドキシン５に対する抗体である２０記載の使用方法。
【００２８】
（３６）上記物質が、ペプチジル−プロリル・シス−トランス・イソメラーゼＡ（シクロフィリンＡ）に対する抗体である２０記載の使用方法。
（３７）脳障害関連疾患に関する診断のために用いられる分析装置であって、Ａ−ＦＡＢＰ、Ｅ−ＦＡＢＰ、Ｈ−ＦＡＢＰ、Ｂ−ＦＡＢＰ、ＰＧＰ９．５、ＧＦＡＰ、プロスタグランジンＤシンターゼ、ニューロモジュリン、ニューロフィラメントＬ、カルシフォシン、ＲＮＡ結合調節サブユニット(RNA binding regulatory subunit)、ユビキチン融合分解蛋白質１同族体(Ubiquitin fusion degradation protein 1 homolog)、ヌクレオシドジホスファートキナーゼＡ、グルタチオンＳトランフェラーゼＰ、カテプシンＤ、ＤＪ−１蛋白質、ペルオキシレドキシン５、およびペプチジル−プロリル・シス−トランス・イソメラーゼＡ（シクロフィリンＡ）から選択されたポリペプチドまたはその変異体もしくは同族体を認識する、またはそれに結合する、またはそれと親和性のある物質を含んだ場所を有する固形基板を含む分析装置。
【００２９】
（３８）上記固形基板が、Ａ−ＦＡＢＰ、Ｅ−ＦＡＢＰ、Ｈ−ＦＡＢＰ、Ｂ−ＦＡＢＰ、ＰＧＰ９．５、ＧＦＡＰ、プロスタグランジンＤシンターゼ、ニューロモジュリン、ニューロフィラメントＬ、カルシフォシン、ＲＮＡ結合調節サブユニット(RNA binding regulatory subunit)、ユビキチン融合分解蛋白質１同族体(Ubiquitin fusion degradation protein 1 homolog)、ヌクレオシドジホスファートキナーゼＡ、グルタチオンＳトランフェラーゼＰ、カテプシンＤ、ＤＪ−１蛋白質、ペルオキシレドキシン５、およびペプチジル−プロリル・シス−トランス・イソメラーゼＡ（シクロフィリンＡ）から選択されたポリペプチドまたはその変異体もしくは同族体を認識する、またはそれに結合する、またはそれと親和性のある物質を各々含む複数の場所を有する３７記載の分析装置。
【００３０】
（３９）上記物質が抗体または抗体片である３７または３８記載の分析装置。
（４０）上記各抗体が特徴的に配置され、各ポリペプチド、または、どんなポリペプチドの組み合わせでも読み取りができる上記３９記載の分析装置。
【００３１】
（４１）Ａ−ＦＡＢＰに対する抗体を含む、上記３７から４０の内いずれかの分析装置。
（４２）Ｅ−ＦＡＢＰに対する抗体を含む、上記３７から４０の内いずれかの分析装置。
【００３２】
（４３）ＰＧＰ９．５に対する抗体を含む、上記３７から４０の内いずれかの分析装置
。
（４４）ＧＦＡＰに対する抗体を含む、上記３７から４０の内いずれかの分析装置。
【００３３】
（４５）プロスタグランジンＤシンターゼに対する抗体を含む、上記３７から４０の内いずれかの分析装置。
（４６）ニューロモジュリンに対する抗体を含む、上記３７から４０の内いずれかの分析装置。
【００３４】
（４７）ニューロフィラメントＬに対する抗体を含む、上記３７から４０の内いずれかの分析装置。
（４８）カルシフォシンに対する抗体を含む、上記３７から４０の内いずれかの分析装置。
【００３５】
（４９）ＲＮＡ結合調節サブユニット(RNA binding regulatory subunit)に対する抗体を含む、上記３７から４０の内いずれかの分析装置。
（５０）ユビキチン融合分解蛋白質１同族体(Ubiquitin fusion degradation protein 1 homolog)に対する抗体を含む、上記３７から４０の内いずれかの分析装置。
【００３６】
（５１）ヌクレオシドジホスファートキナーゼＡに対する抗体を含む、上記３７から４０の内いずれかの分析装置。
（５２）グルタチオンＳトランフェラーゼＰに対する抗体を含む、上記３７から４０の内いずれかの分析装置。
【００３７】
（５３）カテプシンＤに対する抗体を含む、上記３７から４０の内いずれかの分析装置。
（５４）ＤＪ−１蛋白質に対する抗体を含む、上記３７から４０の内いずれかの分析装置。
【００３８】
（５５）ペルオキシレドキシン５に対する抗体を含む、上記３７から４０の内いずれかの分析装置。
（５６）ペプチジル−プロリル・シス−トランス・イソメラーゼＡ（シクロフィリンＡ）に対する抗体を含む、上記３７から４０の内いずれかの分析装置。
【００３９】
（５７）３７から５６記載のいずれかの分析装置と、対象から採取した体液サンプル中の一つ以上のポリペプチドの量を検出する手段とを含む、脳障害関連疾患診断に用いるキット。
【００４０】
本発明に用いる新しいマーカーは以下のものである。
A-FABP(P15090)。これは以下のシーケンス(SEQ ID NO.1)を有する:
1 CDAFVGTWKLVSSENFDDYMKEVGVGFATRKVAGMAKPNMIISVNGDVITIKSESTFKNTEISFILGQEFDEVTADDRKVKSTITLDGGVLVHVQKWDGKSTTIKRKREDDKLVVECVMKGVTSTRVYERA 131
E-FABP(Q01469)。これは以下のシーケンス (SEQ ID NO.2)を有する:
1 MATVQQLEGRWRLVDSKGFDEYMKELGVGIALRKMGAMAKPDCIITCDGKNLTIKTESTLKTTQFSCTLGEKFEETTADGRKTQTVCNFTDGALVQHQEWDGKESTITRKLKDGKLVVECVMNNVTCTRIYEKVE 135
PGP 9.5 (P09936)。これは以下のシーケンス (SEQ ID NO.3)を有する:
1 MQLKPMEINP EMLNKVLSRL GVAGQWRFVD VLGLEEESLG SVPAPACALL LLFPLTAQHE 60
NFRKKQIEEL KGQEVSPKVY FMKQTIGNSC GTIGLIHAVA NNQDKLGFED GSVLKQFLSE 120
TEKMSPEDRA KCFEKNEAIQ AAHDAVAQEG QCRVDDKVNF HFILFNNVDG HLYELDGRMP 180
FPVNHGASSE DTLLKDAAKV CREFTEREQG EVRFSAVALCKAA 223
GFAP (14136)。これは以下のシーケンス (SEQ ID NO.4)を有する:
1MERRRITSAA RRSYVSSGEM MVGGLAPGRR LGPGTRLSLA RMPPPLPTRV DFSLAGALNA 60
GFKETRASER AEMMELNDRF ASYIEKVRFL EQQNKALAAE LNQLRAKEPT KLADVYQAEL 120
RELRLRLDQL TANSARLEVE RDNLAQDLAT VRQKLQDETN LRLEAENNLA AYRQEADEAT180
LARLDLERKI ESLEEEIRFL RKIHEEEVRE LQEQLARQQV HVELDVAKPD LTAALKEIRT240 QYEAMASSNM HEAEEWYRSK FADLTDAAAR NAELLRQAKH EANDYRRQLQ SLTCDLESLR 300
GTNESLERQM REQEERHVRE AASYQEALAR LEEEGQSLKD EMARHLQEYQ DLLNVKLALD 360
IEIATYRKLL EGEENRITIP VQTFSNLQIR ETSLDTKSVS EGHLKRNIVV KTVEMRDGEV 420
IKESKQEHKD VM 432
プロスタグランジンＤシンターゼ (P41222)。これは以下のシーケンス (SEQ ID N0.5)を有する:
23 APEAQVSV QPNFQQDKFL GRWFSAGLAS NSSWLREKKA 60
ALSMCKSVVA PATDGGLNLT STFLRKNQCE TRTMLLQPAG SLGSYSYRSP HWGSTYSVSV 120
VETDYDQYAL LYSQGSKGPG EDFRMATLYS RTQTPRAELK EKFTAFCKAQ GFTEDTIVFL 180
PQTDKCMTEQ
ニューロモジュリン(P17677)。これは以下のシーケンス (SEQ ID N0.6)を有する:
1 MLCCMRRTKQ VEKNDDDQKI EQDGIKPEDK AHKAATKIQA SFRGHITRKK LKGEKKDDVQ 60
AAEAEANKKD EAPVADGVEK KGEGTTTAEA APATGSKPDE PGKAGETPSE EKKGEGDAAT 120
EQAAPQAPAS SEEKAGSAET ESATKASTDN SPSSKAEDAP AKEEPKQADV PAAVTAAAAT 180
TPAAEDAAAK ATAQPPTETG ESSQAEENIE AVDETKPKES ARQDEGKEEE PEADQEHA 238
ニューロフィラメントＬ(P07196)。これは以下のシーケンス (SEQ ID NO.7)を有する:
1 SSFSYEPYYS TSYKRRYVET PRVHISVRSG YSTARSAYSS YSAPVSSSLS VRRSYSSSSG 60
SLMPSLENLD LSQVAAISND LKSIRTQEKA QLQDLNDRFA SFIERVHELE QQNKVLEAEL 120
LVLRQKHSEP SRFRALYEQE IRDLRLAAED ATTNEKQALR GEREEGLEET LRNLQARYEE 180
EVLSREDAEG RLMERRKGAD EAALARAELE KRIDSLMDEI SFLKKVHEEE IAELQAQIQY 240
AQISVEMDVT KPDLSAALKD IRAQYEKLAA KNMQNAEEWF KSRFTVLTES AAKNTDAVRA 300
AKDEVSESRR LLKAKTLEIE ACRGMNEALE KQLQELEDKQ NADISAMQDT INKLENELRT 360
TKSEMARYLK EYQDLLNVKM ALDIEIAAYR KLLEGEETRL SFTSVGSITS GYSQSSQVFG 420
RSAYGGLQTS SYLMSTRSFP SYYTSHVQEE QTEVEETIEA SKAEEAKDEP PSEGEAEEEE 480
KDKEEAEEEE AAEEEEAAKE ESEEAKEEEE GGEGEEGEET KEAEEEEKKV EGAGEEQAAK 540
KKD 543
カルシフォシン(Q13938)。これは以下のシーケンス (SEQ ID NO.8)を有する:
1 MDAVDATMEK LRAQCLSRGA SGIQGLARFF RQLDRDGSRS LDADEFRQGL AKLGLVLDQA 60
EAEGVCRKWD RNGSGTLDLE EFLRALRPPM SQAREAVIAA AFAKLDRSGD GVVTVDDLRG 120
VYSGRAHPKV RSGEWTEDEV LRRFLDNFDS SEKDGQVTLA EFQDYYSGVS ASMNTDEEFV 180
AMMTSAWQL 189
ＲＮＡ結合調節サブユニット(RNA binding regulatory subunit)(014805)。これはRNA-BPとも称し、以下のシーケンス (SEQ ID NO.9)を有する:
1MASKRALVIL AKGAEEMETV IPVDMRRAG IKVTVAGLAG KDPVQCSRDV VICPDASLED 60
AKKEGPYDVV VLPGGNLGAQ NLSESAAVKE ILKEQENRKG LIAAICAGPT ALLAHEIGFG 120
SKVTTHPLAK DKMMNGGHYT YSENRVEKDG LILTSRGPGT SFEFALAIVE ALNGKEVAAQ 180
VKAPLVLKD 189
ユビキチン融合分解蛋白質１同族体(Ubiquitin fusion degradation protein 1 homolog)(Q92890)。これはUFD1または UFDP1とも称し、以下のシーケンス (SEQ ID NO.10)を有する:
1 MFSFNMFDHP IPRVFQNRFS TQYRCFSVSM LAGPNDRSDV EKGGKIIMPP SALDQLSRLN 60
ITYPMLFKLT NKNSDRMTHC GVLEFVADEG ICYLPHWMMQ NLLLEEDGLV QLETVNLQVA 120
TYSKSKFCYL PHWMMQNLLL EEGGLVQVES VNLQVATYSK FQPQSPDFLD ITNPKAVLEN 180
ALRNFACLTT GDVIAINYNE KIYELRVMET KPDKAVSIIE CDMNVDFDAP LGYKEPERQV 240
QHEESTEGEA DHSGYAGELG FRAFSGSGNR LDGKKKGVEP SPSPIKPGDI KRGIPNYEFK 300
LGKITFIRNS RPLVKKVEED EAGGRFVAFS GEGQSLRKKG RKP 343
ヌクレオシドジホスファートキナーゼＡ(P15531)。これはNDK Aとも称し、以下のシーケンス (SEQ ID NO11)を有する:
1 MANCERTFIA IKPDGVQRGL VGEIIKRFEQ KGFRLVGLKF MQASEDLLKE HYVDLKDRPF 60
FAGLVKYMHS GPVVAMVWEG LNVVKTGRVM LGETNPADSK PGTIRGDFCI QVGRNIIHGS 120
DSVESAEKEI GLWFHPEELV DYTSCAQNWI YE 152
グルタチオンＳトランフェラーゼＰ(P09211)。これは以下のシーケンス (SEQ ID NO.12)を有する:
1 PPYTVVYFPV RGRCAALRML LADQGQSWKE EVVTVETWQE GSLKASCLYG QLPKFQDGDL 60
TLYQSNTILR HLGRTLGLYG KDQQEAALVD MVNDGVEDLR CKYISLIYTN YEAGKDDYVK 120
ALPGQLKPFE TLLSQNQGGK TFIVGDQISF ADYNLLDLLL IHEVLAPGCL DAFPLLSAYV 180
GRLSARPKLK AFLASPEYVN LPINGNGKQ 209
カテプシンＤ(P07339)。これは以下のシーケンス (SEQ ID NO. 13)を有する:
65 GPIPEV LKNYMDAQYY GEIGIGTPPQ CFTVVFDTGS SNLWVPSIHC KLLDIACWIH 120
HKYNSDKSST YVKNGTSFDI HYGSGSLSGY LSQDTVSVPC QSASSASALG GVKVERQVFG 180
EATKQPGITF IAAKFDGILG MAYPRISVNN VLPVFDNLMQ QKLVDQNIFS FYLSRDPDAQ 240
PGGELMLGGT DSKYYKGSLS YLNVTRKAYW QVHLDQVEVA SGLTLCKEGC EAIVDTGTSL 300
MVGPVDEVRE LQKAIGAVPL IQGEYMIPCE KVSTLPAITL KLGGKGYKLS PEDYTLKVSQ 360
AGKTLCLSGF MGMDIPPPSG PLWILGDVFI GRYYTVFDRD NNRVGFAEAA RL 412
ＤＪ−１蛋白質(Q99497)。これは以下のシーケンス (SEQ ID NO.14)を有する:
1 MASKRALVIL AKGAEEMETV IPVDVMRRAG IKVTVAGLAG KDPVQCSRDV VICPDASLED 60
AKKEGPYDVV VLPGGNLGAQ NLSESAAVKE ILKEQENRKG LIAAICAGPT ALLAHEIGCG 120
SKVTTHPLAK DKMMNGGHYT YSENRVEKDG LILTSRGPGT SFEFALAIVE ALNGKEVAAQ 180
VKAPLVLKD 189
ペルオキシレドキシン５(P30044)。これは以下のシーケンス (SEQ ID N0.15)を有する:1 MGLAGVCALR RSAGYILVGG AGGQSAAAAA RRCSEGEWAS GGVRSFSRAA AAMAPIKVGD 60
AIPAVEVFEG EPGNKVNLAE LFKGKKGVLF GVPGAFTPGC SKTHLPGFVE QAEALKAKGV 120
QVVACLSVND AFVTGEWGRA HKAEGKVRLL ADPTGAFGKE TDLLLDDSLV SIFGNRRLKR 180
FSMVVQDGIV KALNVEPDGT GLTCSLAPNI ISQL 214
ペプチジル−プロリル・シス−トランス・イソメラーゼＡ(P05092)。これは以下のシーケンス(SEQ ID NO.16)を有する;
1 VNPTVFFDIA VDGEPLGRVS FELFADKVPK TAENFRALST GEKGFGYKGS CFHRIIPGFM 60
CQGGDFTRHN GTGGKSIYGE KFEDENFILK HTGPGILSMA NAGPNTNGSQ FFICTAKTEW 120
LDGKHVVFGK VKEGMNIVEA MERFGSRNGK TSKKITIADC GQLE 164
本発明に有用なポリペプチドは上記のシーケンスに限定されないで、その同族体、変異体も含まれる。同族体とは、ポリペプチドのシーケンスに自然に起こる変種で、与えられたシーケンスと高度の相同性を有し、かつ、実質的に同一の機能的、免疫学的な性状を持つものと定義する。変異体とは、人工的に創造された変種と定義する。高度の相同性とは、少なくとも９０％、好適には９５％、もっとも好適には９９％の相同性を指す。変種は単一種内または異種間で起こる。上記シーケンスはヒト由来のものであるが、本発明は例えばウシ属など他の哺乳類の、対応するポリペプチドを含む。
【００４１】
本発明で云う脳障害関連疾患は、以下を含む：
脳損傷（head trauma）、虚血性卒中、出血性卒中、くも膜下出血、頭蓋内出血、一過性虚血性発作、血管性痴呆、大脳皮質基底核神経節変成症、脳炎、てんかん、ランド-クレフナー症候群、水頭症、偽性脳腫瘍、視床疾患、脳膜炎、脊膜炎、運動障害、真性振戦、脊髄疾患、脊髄空洞症、アルツハイマー（早期発症）、アルツハイマー（遅発症）、多重梗塞性痴呆症、ピック症、ハンチントン病、パーキンソン病、パーキンソンシンドローム、前頭側頭型痴呆、大脳皮質基底核変性症、多系統萎縮症、進行性核上性麻痺、ルーイ体（Lewy body）疾患、筋萎縮性側索硬化症、クロイツフェルト-ヤコブ病、ダンディーウォーカーシンドローム、フリードライヒ（Friedreich）運動失調症、マカドヨセフ（Mach
ado-Joseph）病、偏頭症、統合失調症、情緒不安定（mood disorder）、およびうつ病。ヒト以外の哺乳類における対応する疾患、たとえばウシスポンジ状脳症（BSE）などの流行性スポンジ状脳症（TSE）やヒツジのスクレイピーなども含まれる。
【００４２】
本発明において、H-FABP（P０５４１３）とB-FABP（O１５５４０）も、特に卒中やCJD以外の脳障害関連疾患とその可能性の診断に有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４３】
本発明は、脳血管疾患、痴呆、神経変性疾患を含む脳障害関連疾患に冒された患者の、血液成分（例えば血漿や血清）や脳脊髄液などの体液中で増大または減少するポリペプチドを検出する物質成分とその方法に関する。
【００４４】
脳障害の蛋白マーカーに対するポリペプチド、特にその蛋白結合領域が検出ツールとして適している。前に述べたような分子に対する抗体の性状を変えたり最適化するために、分子生物学的、また、バイオテクノロジーの方法が、ある特別の方法で利用される。加えて、抗体の安定性を増すために、アセチル化、カルバモイル化、ホルミル化、ビオチン化、アシル化、ポリエチレングリコールや親水性ポリマーによる誘導体化、など化学的に抗体に変更を加える。
【００４５】
Ａ−ＦＡＢＰ、Ｅ−ＦＡＢＰや他のFABP、例えばＨ−ＦＡＢＰ、Ｂ−ＦＡＢＰ、およびＰＧＰ９．５、ＧＦＡＰ、プロスタグランジンＤシンターゼ、ニューロモジュリン、ニューロフィラメントＬ、カルシフォシン、ＲＮＡ結合調節サブユニット(RNA binding regulatory subunit)、ユビキチン融合分解蛋白質１同族体(Ubiquitin fusion degradation protein 1 homolog)、ヌクレオシドジホスファートキナーゼＡ、グルタチオンＳトランフェラーゼＰ、カテプシンＤ、ＤＪ−１蛋白質、ペルオキシレドキシン５、およびペプチジル−プロリル・シス−トランス・イソメラーゼＡ（シクロフィリンＡ）から選択される特異的なポリペプチドマーカーが、例えばそれらの抗体を用いて体液サンプル中に検出される。マーカーは、好適にはポリペプチドに対する抗体を用いて、抗原（ポリペプチド）/抗体反応の程度を測る免疫分析法で測定される。抗体はモノクロナール抗体でも、製造された（キメラ体の）ものでも良い。上記ポリペプチドに対する抗体は商業的に入手可能である。また、抗体を増殖するためにケーラーミルスタイン法が有効である。ポリクロナール抗体はあまり望ましくない。本発明における抗体とは、単鎖やFab片など抗体の結合片を含む。
【００４６】
知られているどの免疫分析法でも利用可能である。サンドイッチ法では、ポリペプチドに対する抗体（例えばポリクロナール）が、プラスチック製のマイクロタイタープレートのウェルのような固層に結合され、サンプルおよび、検出すべきポリペプチドに特異的な、標識された第2の抗体と共にインキュベートされる。その代わりに、抗体補足法（間接免疫分析法）を用いても良い。この方法では、サンプルが固層に結合され、抗ポリペプチド抗体（ポリクロナールまたはモノクロナール）が加えられ、結合される。もしポリクロナール抗体の場合は、他の品種のポリペプチドとの間で交差反応が低いものが望ましい。非結合物質が洗い流されたあとに、固層に着いている抗体の量が第二の標識された抗体、すなわち抗−第一のもの、を用いて判定される。
【００４７】
標識された抗−ポリペプチド抗体を用いて直接分析法が行われる。テストサンプルが固層に結合され、抗−ポリペプチド抗体が加えられる。非結合物質が洗い流されたあとに、固層に着いている抗体の量が判定される。標識は第2の抗体でなく、直接なされる。
【００４８】
他の実施例では、サンプルと標識されたポリペプチドまたはそこから誘引されたペプチドとの間で競合法が行われる。この2つの抗原は固層に結合した少量の抗−ポリペプチド
抗体と量的に競合する。標識されたポリペプチドまたはペプチドは固層上で抗体と事前にインキュベートすることも出来、それによってサンプル中のポリペプチドは抗体に結合したポリペプチドまたはペプチドと部分的に置換する（displaces part）。
【００４９】
さらに他の実施例では、二つの抗原が抗体とともに競合的にインキュベートされる。洗浄によって非結合の抗原が除かれ、支持体に結合した標識の量を検出し、サンプル中の蛋白量が事前に確立されている標準滴定曲線と比較して測定される。
【００５０】
通して、標識は酵素が望ましい。酵素の基体は、発色性、蛍光発光、化学蛍光発光、電気化学的なものでありうる。また、可溶性でも凝結性のものでも良い。また、標識はラジオアイソトープや、例えば共役フルオレセインを用いた蛍光物質でも良い。
【００５１】
酵素は、例えば、アルカリホスファタ−ゼやホースラディッシュペルオキシターゼや、色測定に便利な、例えば、アルカリホスファターゼと共に黄色発色基材としてP-ニトロフェニルリン酸塩を用いることも出来る。
【００５２】
化学蛍光法では、抗体の標識にアクリジニウムエステルやホースラディッシュペルオキシターゼを用いることが出来る。後者は強調(enhanced)化学蛍光分析法（ＥＣＬ）に用いられる。ホースラディッシュペルオキシターゼで標識された抗体は、ルミノールやペルオキシターゼおよびその化合物との化学蛍光反応に関与し、それは発光強度やその寿命を強化する。典型的には、４−ヨードフェノールや４−ヒドロキシ桂皮酸がそれである。
【００５３】
免疫PCRのような増殖免疫分析法(amplified immunoassay)が利用される。この技術では、抗体はPCRプライマーを含む任意のDNA分子に共有結合され、抗体が組みこまれたDNAがポリメラーゼ連鎖反応によって増殖される。Hendrickson et al., Nucleic Acids Research 1995; 23, 522-529 (1995) または、T.Sano et al., in “Molecular Biology and Biotechnology” Robert A Meyers編集, VCH出版社(1995),458-460ページ参照。信号は前記のように読み取られる。
【００５４】
ポリペプチド検出の一つの方法として、酵素結合免疫吸着法(enzyme-linked immunosorbent assay)（ＥＬＩＳＡ）が用いられる。
AMIのH-FABP検出のために開発されたrapid micro particle-enhanced turbidimetric免疫分析法は分析時間を特段に短縮した。M.Roberts et al., “Development of a rapid microparticle-enhanced turbidimetric immuassay for plasma fatty acid-binding protein, an early marker of acute microcardial infarction”, Clin.Chem. 1998;44:1564-1567参照。
【００５５】
これによって、上記M.Roberts等 によって述べられているホフマンラロッシュのCOBAS
MIRA（登録商標）Plus system やアボットラボラトリー社のAxSYM（登録商標）で行われている全自動化が、脳障害関連疾患の日常的臨床検査でも可能になり、また適用されるに違いない。
【００５６】
ポリペプチドの濃度は、免疫分析法以外でも測定できる。たとえば、サンプルを２次元ゲル電気泳動にかけ、ポリペプチド濃度をゲルの濃度測定走査やシミの濃度走査によってポリペプチドの量を評価する。しかし、分析は患者が迅速に処置されるよう、すばやく行われることが望ましい。
【００５７】
原理的には、診断用サンプルとしてどんな体液でも可能であるが、望ましくは、脳脊髄液（ＣＳＦ）、血清、血液、尿、涙、または唾液である。
本発明では、単一のポリペプチドまたは２つ以上のポリペプチドの組み合わせによって
脳障害関連疾患の診断を行う。
【００５８】
本発明は、また、脳障害によって影響を受ける物質と、脳以外の障害によって影響を受ける物質に差異的に含まれるポリペプチドを、診断、予後、治療に供することに関する。これには、上記ポリペプチドに結合する、あるいはそれに対する親和性を有する物質を認識する物質を調製すること、また/もしくは、使用することを含む。そのような物質の例は、抗体や抗体片である。ここでいう「抗体」には、ポリクロナール抗血清、モノクロナール抗体、Fabのような抗体片、遺伝子操作で作られた抗体を含む。抗体は、非現実的なものでも良いし、単独種のものでも良い。上記「予後」応用は、例えば体液中の上記ポリペプチドの量を測定し、脳障害関連疾患のあり得そうな進行を検知することを含む。上記「治療追跡」応用には、例えば体液中の上記ポリペプチドの量を測定し（治療の働きとしてのレベル、能力障害が回復したかどうか、障害領域の大きさ等を評価し）脳障害関連疾患のあり得そうな進行を検知することを含む。上記「治療」応用とは、上記ポリペプチドに結合する、あるいはそれに対する親和性を有する物質を認識する物質を調製すること、使用することを含む。この場合、物質を変形して例えば、抗体と治療薬とを化合し、その薬を患者の特異的な場所に向かわせる。
【００５９】
上記ポリペプチドの「存在、非存在」は、単に疾患サンプルと非疾患サンプルの間でポリペプチドの量に非常なる差があることを意味する。したがって、テストサンプル中のポリペプチドの「非存在」とは、ポリペプチドが実際には存在する可能性があるが、比較テストサンプルと比べて量が非常に少ないということを含む。本発明は、診断をポリペプチドの存在、非存在をベースに行っても良い。これには、ポリペプチドの量が比較テストサンプルに比べて非常に少ないか、非常に多いということを含む。
【００６０】
上記ポリペプチドの「検出」には、量的変化の他に、成分の比較表やポリペプチドの遷移後変性体(post-translational modifications)を検出する方法が含まれる。例として、死後のものとコントロールのＣＳＦに関し、プロスタグランジンＤシンターゼの遷移後変性パターンに差があることが認められた。同様の差は、クロイツフェルトヤコブ病患者とコントロール患者のＣＳＦでも観測される。このことは実施例５で述べる。したがって、本発明は、一般的に遷移後変性体を検出し、そのようなポリペプチドの変性が脳障害関連疾患の診断と合致しているかを決定することまで包含する。
【００６１】
本発明では、脳障害関連疾患の診断に用いられる分析キットや装置を含む。これには、Ａ−ＦＡＢＰ、Ｅ−ＦＡＢＰや他のＦＡＢＰ、例えばＨ−ＦＡＢＰ、Ｂ−ＦＡＢＰおよびＰＧＰ９．５、ＧＦＡＰ、プロスタグランジンＤシンターゼ、ニューロモジュリン、ニューロフィラメントＬ、カルシフォシン、ＲＮＡ結合調節サブユニット(RNA binding regulatory subunit)、ユビキチン融合分解蛋白質１同族体(Ubiquitin fusion degradation protein 1 homolog)、ヌクレオシドジホスファートキナーゼＡ、グルタチオンＳトランフェラーゼＰ、カテプシンＤ、ＤＪ−１蛋白質、ペルオキシレドキシン５、およびペプチジル−プロリル・シス−トランス・イソメラーゼＡ（シクロフィリンＡ）の内から選択されるポリペプチドに対する抗体を含ませることが出来る。抗体は患者から採取された液体サンプル中で適合するポリペプチドと結合する。抗体は固体支持体の上に固定される。望ましくは、抗体の配置は特別なアクセスが可能な配置になっており、それによって、別々の分析法でサンプル中の各ポリペプチドおよび選択されたポリペプチドのどんな組み合わせでも読み出されようになっている。
【００６２】
以下の実施例で発明を例示する。
[実施例１]
脳脊髄液（ＣＳＦ）蛋白の２次元ゲル電気泳動による分離と、質量分析法によって、テーブル１に示す１５のポリペプチドが、脳障害の大きな患者のＣＳＦ中で増大または減少
していることが判った。
【００６３】
−対象員数とサンプルの取り扱い−
脳障害関連疾患用のマーカーを発見すべく、８つのＣＳＦサンプルがプロテオミクスベース(proteomics-based)のアプローチにかけられた。このうち４つは、死体解剖で中枢神経に異常の無い、死後６時間の死体から得た。他の４つのサンプルは、存命中の、脳障害と関係の無い患者で、精密検査で良好な状態である患者（非定型的頭痛、突発性顔面周囲神経麻痺）から腰椎穿刺で集められた。ＣＳＦサンプルは採取後直ちに遠心分離にかけられ、分割され、分析まで−８０℃で冷凍された。
【００６４】
- ＣＳＦ ２−ＤＥ-
すべての試薬、装置は他所に述べられている[９]。２５０μlのＣＳＦと５００μlの冷やされたアセトン（−２０℃）を混合し、４℃下で１０分間、１０００ｇで遠心分離する。ペレットは１０％ＳＤＳ（w/v）、２．３％ＤＴＥ（w/v）を含む溶剤と混合した。サンプルは９５℃で５分間温められたのち、８Ｍの尿素、４％のＣＨＡＰS(w/v)、４０ｍＭのTris、６５ｍＭのＤＴＥおよび僅かなブロモフェノールブルーを含む溶剤で、６０μlに希釈された。この最終的に希釈されたサンプルの４５μg対応分がＩＰＧストリップの陰極端のカップに入れられた。２−ＤＥ分析が前述したように実施された［１０］。簡単に述べれば、第1次方向の蛋白分離が、Amersham Bioscience(Uppsala, Sweden)製で、市販されている、ｐＨ３．５から１０の非線形ＩＰＧを使用して行われた。第２次元方向の分離は、手製の縦階調のスラブゲル(vertical gradient slab gel)（9-16% T,2.6%C）の上で行われた。ゲルはアンモニア銀で染色され［１１］、レーザー濃度計（Amersham Bioscience, Uppsala, Sweden）で走査され、ＭＥＬＡＮＩＥ ３ソフトウェアパッケージ［１２］で２−ＤＥ像のコンピュータ像解析がなされた。
【００６５】
-質量分析による同定-
死体と健康体のＣＳＦ（ｎ＝４）の分析ゲルの比較から、スポットの現れ方が異なるということが見出された。その興味あるスポットは、matrix-assisted laser desorption/ionization 飛行時間計測式の質量分析器（Perspective Biosystems Voyger STR MALDI-TOF-MS, Framingham, MA, USA）を使用したペプチド質量フィンガープリント法で分析され［１０］、PeptIdent (http://www.expasy.ch/sprot/peptident.html)で鑑定された。
【００６６】
【表１】
［実施例２］
脳脊髄液（ＣＳＦ）の２次元ゲル電気泳動（２−ＤＥ）分離と質量分析法によって、大きな脳損傷のモデルとして用いた死後のＣＳＦ中で、ＦＡＢＰが上昇しているのが観測された。Ｈ−ＦＡＢＰは、多くの機関の中に存在する一つのＦＡＢＰであるが、脳の中にも集中しているので、卒中患者とコントロールの血清サンプルの中でＨ−ＦＡＢＰを検出するためのＥＬＩＳＡ法が行われた。しかし、Ｈ−ＦＡＢＰはまた、急性心筋梗塞（ＡＭＩ）のマーカーでもあるので、並存する心臓障害を除くため、同時にトロポニン−Ｉとクレアチンキナーゼ−ＭＢ（ＣＫ−ＭＢ）のレベルが分析された。
【００６７】
−対象員数とサンプルの取り扱い−
員数は、後に述べる色々なマーカーの血清を使用した評価のために、あらかじめ検討された患者６４人（第２表）であり、等しく３つのグループに分けられた、すなわち、（１）抹消および中枢神経系に既知の症状が無い６５才（範囲：３４−８６才）の、男性１４人、女性８人のコントロールグループ。（２）６５才（範囲：２９−９０才）の急性心筋梗塞患者、男性１４、女性6人のグループ（ＡＭＩグループ）；ＡＭＩの診断は、すべて典型的な心電計上の変化とＣＫ−ＭＢの上昇（カットオフ値９．３ng/ml以上）および、トロポニン−Ｉ（カットオフ値２ng/ｍl以上）の上昇によって行われた。（３）６５才（範囲：３０−８７才）の急性卒中患者、男性１４、女性８人のグループ（卒中グループ）；卒中の診断は、訓練された医師によるものと、急性局所神経障害の発症と、およびそのあとの脳ＣＴやＭＲＩで症状に対応した損傷像によってなされた。ただし、眼に見える傷害が診断に必要の無い一過性虚血性脳卒中（ＴＩＡ）は例外である。卒中グループは次のように分けられる、すなわち、卒中のタイプ（虚血性か出血性か）、傷害の場所（脳幹か脳半球か）および臨床的進行時間（ＴＩＡの場合、２４時間以内のいつ完全に回復したか、または２４以上にわたり神経学的欠損が存在しているか）。
【００６８】
【表２】
３グループの各患者のサンプルは、入院時にヘパリン入りの乾燥した試験管に採取された。4℃下で１５分間１５００gで遠心分離されたあと、血清サンプルが分割され、分析時まで−２０℃で貯蔵された。卒中グループに対しては、神経学的事件のあと２４時間以内、４８時間以内、４８時間以後の３つのサンプルがさらに採取された。このグループでは、神経学的事件から最初の血液採取までの間隔は１８５分（範囲；４０分から３日）であった。この因子はデータ分析時に考慮された。各患者またはその親族は登録に当たり事前に告知同意している。
【００６９】
−ＦＡＢＰの測定−
Ｈ−ＦＡＢＰのレベルは、血清のサンドイッチＥＬＩＳＡ法で測定される。９６ウェルのポリスチレンマイクロタイタープレート（NUNC, Polylabo, CH）の各ウェルに、0.1ＭｐＨ９．６のカルボナートバッファー中に２０．４μｇ／ｍｌで混合した１００μlのポリクロナールヒツジ抗ヒト筋ＦＡＢＰ（Spectral Diagnosis HC, Ontario, USA）を、４℃で一晩かけて固着した。プレートはBioRad NOVAPATH（登録商標） WASHER（Hercules, CA）を用いて、ＰＢＳ（１５ｍＭ Ｎａ２ＰＯ４−１２０ｍＭ ＮａＣｌ−２．７ｍＭ ＫＣＬ ｐＨ７．４、Sigma）で自動洗浄する。洗浄毎に新しいＰＢＳで洗浄した。非特異結合部位はカルボネートバッファーに入れた２％カゼイン（w/v）で３７℃下で２時間かけてブロックした。洗浄ステップ後、サンプルをウェル当り１００μl注入した。プレートを３７℃下で２時間インキュベートした。洗浄後、１％(w/v)のＢＳＡを加えたＢＰＳを０．３μｇ/ml比で混合した100μl/ウェルのマウス抗ヒト心臓ＦＡＢＰ（clone 66E2、HyCult biotechnology b.v, Uden, Netherland）を、室温で1時間シェイクしつつインキュベートした。洗浄後、５０μl/ウェルのホスファターゼ基材と、ジエタノールアミン中に１．５mg/μl比で混合したパラニトロフェニルフォスヘートを３０分間インキュベートした。反応は100μl/ウェルの１Ｍ ＮａＯＨで停止した。発色を、MileniaTM kinetic
analyzer(DPC,LA,USA)で波長４０５nmを使って評価した。
【００７０】
−ＣＫ−ＭＢおよびトロポニン-I の測定−
血清サンプルは１５００ｇ下で１５分間遠心分離され、分割されて−２０℃で貯蔵された。血清ＣＫ−ＭＢとトロポニン−Ｉのレベルは自動化学分析機AxSYS（登録商標） SyStem(ABBOT Laboratories, Abbot Park, IL)を用いて、蛍光マイクロプレート酵素免疫分析法（ＭＥＩＡ）によって行われた。蛍光物質の生成はサンプル中のトロポニン−Ｉと直に比例している。トロポニン−Ｉの検出限界は０．３μg/lである。ＣＫ−ＭＢは蛍光プローブの量と比例しており、検出限界は０．７μg/lである。
【００７１】
−ＮＳＥおよびＳ１００の測定−
Ｈ−ＦＡＢＰの測定と同様、ＮＳＥとＳ１００は卒中グループの４つの連続する血清サンプルで分析された。ＳＭＡＲＴ−Ｓ１００およびＳＭＡＲＴ−ＮＳＥ用ＥＬＩＳＡキットが使用された。両者はSkye Pharma Tech Inc.(Ontario, CA)から市販されている。ＮＳＥとＳ１００の検出限界は各々１μg/lおよび0.01μg/lである。
【００７２】
−統計分析−
Ｈ−ＦＡＢＰのレベルは光学濃度値で平均±標準偏差で表示される。組み換えＨ−ＦＡＢＰは入手できなかったので、別途の補正によって濃度単位で表示することは出来なかった。Ｈ−ＦＡＢＰ、トロポニン−Ｉ、ＣＫ−ＭＢの濃度は正常、卒中およびＡＭＩのいずれのグループも、コルモロゴフ-スミルノフテストによるガウス分布の条件を満たさなかったので、３者の比較は、事後のダンの手法(post hoc Dann’s procedure)によるノンパラメトリック（non-parametric）クラスカル−ウォリステストによって行われた。卒中のサブグループ間の比較は、マン−ホイットニーＵテストで行われ、Ｈ−ＦＡＢＰの濃縮時間の縦軸評価(longitudinal assessment)は繰り返し測定の分散分析（ＡＮＯＶＡ）で行われた。卒中と正常患者を区別するためのＨ−ＦＡＢＰの比較限界は、受信者動作特性(receiver operating characteristic)（ＲＯＣ）カーブ（マイクロソフトExcel（登録商標）用Analyser-It（登録商標）ソフト）を使用して詳細に描写された。引き続き、各時点での感度、特異性、陽性、陰性の予測値が計算された。統計上の有意性は０．０５以下に設定された。
【００７３】
−結果−
３グループのＨ−ＦＡＢＰ分析の結果を第1図に示し、その詳細を第３表に示す。血清Ｈ−ＦＡＢＰ濃度の平均は、コントロールグループで０．２２１±０．１３４ＯＤ、卒中グループで１．０７９±０．８３８、ＡＭＩグループで２．３４０±０．７６３ＯＤであった。本ＥＬＩＳＡ法における変動係数は５．８％±３．８であった。クラスカル−ウォリステストによって、この3つのグループの濃度は互いに有意に異なる（ｐ＜０．００１）ことが見出された。コントロールと卒中グループを識別する最良のカットオフ値は、Ｈ−ＦＡＢＰレベルのＲＯＣカーブ（データ不記載）から、ＯＤ＞０．５３１とされた。このカットオフ値を使った卒中の診断におけるＨ−ＦＡＢＰの正当性測定の結果は次のようである：感度は卒中患者２２人中１５人がカットオフ値以上で６８．２％、特異性は正常者２２人すべてがカットオフ値以下で１００％、陽性予測値は１００％、陰性予測値は７５．９％であった。
【００７４】
【表３】
ＡＭＩグループと卒中患者グループを生物学的レベルで識別するために、トロポニン−ＩとＣＫ−ＭＫの分析がさらに行われた。トロポニン−Ｉ分析はAxSYMトロポニン−Ｉ分析において２ng/mlのカットオフ値で行われ、AxSYM ＣＫ−ＢＭ分析で３．８ng/mlのカットオフ値で行われた（表３）。期待されたように、これらＡＭＩグループにおけるＡＭＩマーカーはコントロール、卒中グループに比べて非常に高い（ｐ＜０．０１）。あとの２グループ間では差が無い、このことは脳障害の結果によってトロポニン−ＩとＣＫ−ＭＢが増加することはないこと、また、卒中患者は卒中時に随伴性のＡＭＩを維持しないことを証明している。これらのことから、Ｈ−ＦＡＢＰ、トロポニン−Ｉ、及びＣＫ−ＭＢ濃度は２０人のＡＭＩ患者と１５人の卒中患者を正しく識別する。一つの例外は、一人の卒中患者において、心電計の異常を伴わないでＨ−ＦＡＢＰレベルが上昇し、トロポニン−ＩとＣＫ−ＭＢレベルが徐々に上昇するという随伴性非ＡＭＩの心臓障害と一致するデータを示している。
【００７５】
卒中グループにおいて、神経学的出来事のあといずれの時点においてもＨ−ＦＡＢＰレベルがＯＤ０．５３１というカットオフ値を下回っている７つの偽陰性の結果が観測された。７人のうち、2人は神経欠損後２４時間以内に完全回復し、これは一過性虚血性脳卒中（ＴＩＡ）のケースと一致する。また、他の二人はラクナ型(lacunar) 卒中を起こしていたことがＭＲＩ像にあり、一人は脳幹の中であった。ＴＩＡやラクナ型卒中であることが、その患者の多くで見られるような偽陰性の結果を説明しているが、Ｈ−ＦＡＢＰの低レベルを示す残りの３人については一貫して説明できなかった。
【００７６】
卒中後の連続的なＨ−ＦＡＢＰ検出において、１５人中１０人（６７％）の陽性患者は早期から（１２時間以内）Ｈ−ＦＡＢＰの増大が認められた。さらに、第2図に示すように、すべての卒中患者を見たとき、傷害後平均Ｈ−ＦＡＢＰ濃度は着実に下がって行き、そのピーク値は１２時間以内に観測された。最初の測定と４８時間以内、その後の３つの差は大きい（分散分析、ｐ＜０．０５）。卒中グループのサブグループ間ではＨ−ＦＡＢＰレベルに統計的な有意差は認められなかった。虚血性（０．９５５±０．６８８、Ｎ＝１５）と出血性卒中（１．３４６±１．１３９、Ｎ＝７）間、および、脳半球体（０．９８７±０．７８３、Ｎ＝１８）と脳幹卒中（１．４９３±１．０８０）ではＨ−ＦＡＢＰレベルは似ている。しかし、サンプル数が少ないため分析の統計としての重みは少ない。しかしながら、定着した卒中とＴＩＡ患者の場合の比較では、両者の差は有意ではない（マンホイットニーＵテスト、ｐ＝０．２４）が、前者（１．２００２±０．８９２）は後者（０．６５２±０．４９９）のほぼ倍の値を示している。
【００７７】
最後に、ＮＳＥとＳ１００Ｂがコントロールと卒中グループで分析され、その結果がＨ−ＦＡＢＰ分析と比較された。ＳＭＡＲＴ−ＮＳＥとＳＭＡＲＴ−Ｓ１００Ｂ蛋白ＥＬＩＳＡテストの卒中診断用のカットオフ値は、それぞれＮＳＥに対し１０ng/ml、Ｓ１００に対し０．０２ng/mlである。ＮＳＥとＳ１００のレベルは、卒中患者中グループ（各々１４．１２ng/mlと０．０１０ng/ml）の方がコントロールグループ（各々１５．８８ng/mlと０．００４ng/ml）に比べてわずかに増加していた。表４に示すように、卒中診断においては、ＮＳＥ，Ｓ１００Ｂに対する特異性、感度、ＰＰＶ（予測陽性値）、ＮＰＶ（予測陰性値）はＨ−ＦＡＢＰに対するそれらに比べて大変低い。これらの差は、テストが同じサンプル上で行われているため関連がある。
【００７８】
【表４】
［実施例３］
死亡患者から得たＣＳＦサンプルで調製された２次元電気泳動で３つの蛋白質が同定された。これらの蛋白質は以前示したように、健康なコントロールに比べ死亡した患者からのＣＳＦ中で増大している。しかし、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦを使った質量分析では同定の試みは失敗している。今回の実験はＥＳＩ−Ｉｏｎ Ｔｒａｐ装置（DecalCQ XP, ThermoFinnigan）を使ったμＬＣ−ＮＳ−ＭＳによって行った。さらに、データベース中にデータ量を増やしたことで、以前特定できなかったスポットが成功裏に同定出来た。
【００７９】
（１）ＲＮＡ結合蛋白質調製サブユニット(RNA binding regulatory subunit)（Ｏ１４８０５）／ＤＪ−１蛋白質（Ｑ９９４９７）
ＲＮＡ結合蛋白質調製サブユニット(RNA binding regulatory subunit)は以前死後のＣＳＦサンプルのところで述べた（例１参照）。同様の同定結果が近傍のスポットで得られた（図３）。以前の同定結果を追認した。図１は、健康体のＣＳＦと死んだＣＳＦの２次元電気泳動マップの拡大図である。２７０μｇの蛋白質がＩＰＧゲル上（ｐＨ３．５−１０ＮＬ，１８ｃｍ）にセットされる。２次元目は縦階調のスラブゲル(vertical gradient
slab gel)（１２％Ｔ）である。ゲルは蛍光染色体で染色される。上向きの矢印が、ＲＮＡ結合調節サブユニットまたはＤＪ−１蛋白質に対応するスポットを示している。
【００８０】
さらに、この結果はこれらのスポットが他の同族の蛋白質ＤＪ−１に対応することを示している。ＲＮＡ結合調節サブユニットとＤＪ−１蛋白質のシーケンスの違いはたった一つのアミノ酸である。本実験中に検出された一個のペプチドはこの特異的な残基を含まなかった。
【００８１】
ＤＩ−１遺伝子の突然変異は常染色体退行性早期発症パーキンソン症候群と関係してい
る（Bonifati et al., Science, 2003）。ＤＪ−１が細胞の酸性ストレス反応や神経変性症にかかわりがあるということを示唆する別の結果もある。（Bonigati et al., Science, 2003; Wilson et al., PNAS,2003)。
【００８２】
（２）ペルオキシレドキシン５（Ｐ３００４４）
ぺルオキシレドキシン５の２―ＤＥのスポットを図４に示す。これは、図３と同様に作られた健康体のＣＳＦと死後のＣＳＦの２−ＤＥスポットマップの拡大図である。ぺルオキシレドキシン５に対応したスポットを右側矢印で示す。ぺルオキシレドキシン５は抗酸酵素であり、神経保護効果を持つ可能性がある（Plaisant et al., Free Radic. Biol. Med., 2003）。また、異なる神経変性疾患の患者の脳内で、ぺルオキシレドキシンファミリーに属する蛋白質が異常な現れ方をすることが述べられている（Krapfenbauer et al.,
Electrophoresis, 2002; Krapfenbauer et al., Brain Res., 2003）。
【００８３】
（３）ペプチジル−プロリル・シス−トランス・イソメラーゼＡ、即ちシクロフィリンＡ（Ｐ０５０９２）
２個のスポットがペプチジル−プロリル・シス−トランス・イソメラーゼＡであることを同定している（図５）。これも図４同様、健康体のＣＳＦと死後のＣＳＦの２−ＤＥスポットマップの拡大図である。シクロフィリンＡに対応する基本的なスポットがぺルオキシレドキシン５のスポットの極近傍にある。
【００８４】
シクロフィリンＡは、抗酸酵素に対する神経保護因子として述べられている（Doyle et
al., Bichem J., 1999）。それはぺルオキシレドキシン酵素に結合し、ペルオキシダーゼの働きに加わることはない（Lee et al., J. Biol. Chem.,2001）。さらに、文献によれば、シクロフィリンＡは酸性ストレスに反応して心臓平滑筋（ＶＳＭＣ）内に秘匿され、ＶＳＭＣの成長を刺激する（Jin et al., Circ. Res., 2000）。これらのことは、シクロフィリンＡが心臓疾患のプロセスに関わっていることを示唆する。抗酸酵素Cu/Zｕスーパーオキサイドジスムターゼ−１に関連する筋萎縮性側索硬化症（神経変性病状）の家族型との関連も述べられている（Lee et al., PNAS, 1999）。シクロフィリンＡは、ＳＯＤ変異体誘引の細胞消滅に対する防護効果を有するように見える。
【００８５】
［実施例４］
−序−
図６から図１５に卒中患者の調査を行った結果を示す。ユビキチン融合分解蛋白質１同族体（ＵＦＤ１）、ＲＮＡ結合調節サブユニット（ＲＮＡ−ＢＰ）、ヌクレオチドジホスファートキナーゼＡ（ＮＤＫ Ａ）のＥＬＩＳＡ強度信号を、患者と陰性のコントロール患者の血清サンプルを使って得た。患者からの血清サンプルは、救急病院に到着してから２４時間以内、または／および７２時間以上経過後に採取し、コントロール患者サンプルと年齢、性別を一致させた。
【００８６】
−プロトコル−
ＥＬＩＳＡは 96-well Recti-BindTMとNeutrAvidinTMとを塗布したBlack Plates(Pierce, Rockford, IL)を使用して行った。プレートは、まず、NOVAPATHTM洗浄機（BIO-Rad, Hercules, CA）上で、ホウ酸バッファー食塩水（ＢＢＳ）（100ｍＭ H3BO3,25ｍＭ Na2B4O7(Sigma, St Luis, MO, USA), ７５ｍＭ ＮａＣｌ(Merck, Darmastadt, Germany)）で洗浄した。次に、ｐＨ７の溶解バッファＡで調製された抗体ビオチン結合体(２μg/mL）が５０μl加えられ、３７℃で１時間インキュベートされた。バッファＡの組成は、80％加水分解されたポリビニルアルコール、モル質量9,000-10,000(Aldrich, Milwaukee, WI,USA), MOPS(3-[N-モルホリノ]プロパンスルホン酸(Sigma), NaCl, MgC12(Sigma), ZnC12(Aldrich)，pH6.90,BSA30％Solution, Manufacturing Grade(Serologjcal Proteins Inc., Kankakee, IL)である。
【００８７】
プレートはＢＢＳのプレートウォッシャーで洗浄した。５０μlの抗体が加えられ、３７℃で１時間インキュベートされた。キャリブレーションカーブを取るため、組み換え型蛋白質抗原が希釈バッファＡで各々１００，５０，２５，１２．５，６．２５ng/mlに希釈された。血清サンプルがバッファＡで適切な濃度に希釈される。洗浄ステップ後、５０μlのアルカリホスハターゼ結合抗体が適切濃度でバッファＡに希釈され、３７℃で１時間インキュベートされた。９６ウェルのプレートはＢＢＳのプレートウォッシャーで３回洗浄され、５０μlの蛍光 Attophos（登録商標）AP Fluorescent Substrate (Promega, Madison, WI)が加えられた。プレートは直ちにSpectraMax GEMINI-XS(Molecuar Devices Corporation, Sunnyvale，CA,U.S.A.)蛍光マイクロタイタープレートリーダー関連蛍光ユニット(RFU)(λexcitation=444 nm, λemission=555 nm)で読み取られた。
【００８８】
プレートはSpectraMax GEMINI-XS(Molecuar Devices)蛍光マイクロタイタープレートリーダー(λexcitation=444 nm, λemission=555 nm)で読み取った。結果はＲＦＵユニットに表示され、エンドポイントモード（一回だけの読み取り）か１０分の運動モードで読み取った。運動モードは、各ウェル６回のフラッシュを用い、それを平均する、それを各ウェル６回、最小の間隔で読んだ。その結果、読み取り間隔は２分であった。評価するためのスロープを決定した。GraphPad Prism ４ ソフトで、コントロールと卒中グループ間（虚血性プラス出血性、虚血性対出血性）のベストなカットオフ値が求められた。
【００８９】
−結論−
図７、１０、１３に、卒中患者のＵＦＤ１、ＲＮＡ−ＢＰ、ＮＤＫ Ａ各々がコントロール患者と比較して十分に説明されている。各バイオマーカーに対し統計分析がなされ、テストの感度が１特異性の機能を有することを示すＲＯＣカーブ（GraphPad Prism 4 ソフト）が得られた（図８、１１、１４、各々ＵＦＤ１、ＲＮＡ−ＢＰ、ＮＤＫ Ａに対するもの）。卒中とコントロールとを区別するベストなカットオフ値がこれらのＲＯＣカーブから得られた。ＵＦＤ１、ＲＮＡ−ＢＰ、ＮＤＫ Ａ各々の感度として９４．４％、９４．４％、１００％、各々の特異性として７７．８％、７２．２％、８３．３％を得た。卒中とコントロールを比較するため、各マーカーに対しノンパラメトリックな(non parametric)マン-ホイットニーテストが行われた。３つのマーカーに対し、非常に低いｐ値を得た（ＵＦＤ１とＮＤＫ Ａはｐ＜0.0001、ＲＮＡ−ＢＰはｐ＝0.0003）、これは、卒中とコントロールの差が非常に大きいことを意味する。
【００９０】
図６で、ＲＮＡ−ＢＰとＮＤＫ Ａが発症後たった３０分で卒中を検出出来ることに気がつく。これはこれらが非常に早期のマーカーであることを意味する。このことは、病院到着時と７２時間後のあいだに信号の減少があることで確認された。患者２０２と２３９は到着時（０〜２４時間）と７２時間後で検査され、全マーカーの信号の大きな減少が見られる。このテスト結果は、ユビキチン融合分解蛋白質１同族体(Ubiquitin fusion degradation protein 1 homolog)（ＵＦＤ１）、ＲＮＡ結合調節サブユニット(RNA binding regulatory subunit)（ＲＮＡ−ＢＰ）、ヌクレオシドジホスファートキナーゼＡ（ＮＤＫ
Ａ）は、単独か組み合わせ、または他のバイオマーカーとの組み合わせの形で卒中の早期診断に有用であることを示している。
【００９１】
［実施例５］
この実施例は、神経変性疾患に含まれる可能性のある遷移後変性症に関わる。対象員数、サンプルの取り扱い、ＣＳＦの２−ＤＥは第1実施例と同じである。
【００９２】
−２−ＤＥイムノブロッティング分析−
２−ＤＥで分離された蛋白質は、基本的にはTowen等が述べた［２２］ように、ＰＶＤＦ膜の上にエレクトロブロッティング(electrobrotted)され、Amido Black で染色され、
水で脱染されるか乾燥される。対象の蛋白質が、特異的な抗体とＥＣＬ（登録商標）ウェスタンブロット検出試薬（AmerSham BioScienceS, Uppsala, Sweden）を用いて前述［２９］したように検出される。次のような抗体が使用された：抗ヒト−プロスタグランデンＤシンセターゼ（リポカリンタイプ）ラビットポリクロナール抗体（Cayman chemical, Ann Arbor, MI）、１／２５０希釈。
【００９３】
図１６（Ａ）は、死体およびコントロールの２−ＤＥゲル上のスポット強度の比較を示す。４５μlの蛋白質がＩＰＧストリップ（ｐＨ３．５−１０ＮＬ、１８ｃｍ）上にセットされた。２次元目はアンモニア銀で染色された縦階調スラブゲル(vertical gradient slab gel)（９−１６％Ｔ）上で行われた。Apolipoprotein AIとイタリック体で表示されたものも２つのサンプルで同様のレベルを示した。ＰＧＨＤのスポットの場所は以前の識別（テスト）［３１］から導き出された。死体からのほうのゲルでは、一般的に考えられているＰＧＨＤのスポット場所が与えられている。図１６（Ｂ）は、死体およびコントロールからのＣＳＦで調製された２−ＤＥの免疫検出を示す。２−ＤＥはＡと同様に行われた。前述［２９］したと同じ免疫検出が、抗ヒト−プロスタグランデンＤシンセターゼ（リポカリンタイプ）ラビットポリクロナール抗体とＥＣＬＴＭウェスタンブロット検出試薬を用いて行われた。
【００９４】
−結果−
プロスタグランジンＤシンセターゼ（ＰＧＨＤ）は、Ｎ−グリコシル化による遷移後変性体(post-translationaly modified)として知られる（Hoffman A, et al., J.Neurochem.1994,63,2185-2196）塩基性蛋白（ｐＩ＝８．３７）である。健康な生きている患者からのＣＳＦの２−ＤＥゲル上には、５つのスポットが見られる。死後のＣＳＦで調製された２−ＤＥゲル上では、３つの酸性スポットが強く退行し、付随的に２つの基本スポットが強調されている（図１６Ａ）。
【００９５】
この異なったスポットがＰＧＨＤに対応しているかどうかを確認するため、特異的な抗体を用いてウェスタンブロットを行った（図１６Ｂ）。得られた結果は、死後のＣＳＦには酸性のＰＧＨＤスポットは無く、基本スポットはまだ存在するということが確認された。さらに、Melanie 3 ソフトを用いた２つのゲルのスポット全容積測定では、２つのサンプルでＰＧＨＤレベルは同等である。これは、したがって、死後のＣＳＦ中でＰＧＨＤの脱グリコシル化が起こっているが、トータルのＰＧＨＤは一定であることを示している。
【００９６】
−文献からのデータ−
ＡＤに罹った患者のＣＳＦ中で、ＰＧＨＤが減少することが見つかっている（Puchades
et al., Brain Res. Mol. Brain Res. 2003,118,140-146）。しかし、研究は２−ＤＥで行われ、かつ酸性スポットのみが分析された。死体からのＣＳＦに関する我々の結果では、分析したサンプル中で脱グリコシル化が起こっている可能性があり、結果、酸性スポットは消滅するがトータルの蛋白質量は変わらない。
【００９７】
毛管等電合焦法(capillary isoelectric focusing)を用いて、Hiraokaらがさまざまな神経疾患に関連してＣＳＦのＰＧＨＤが荷電微小不均一性(charge microheterogeneity)に変化が起こることを確認した（Hiraoka A et al.,Electrophoresis 2001,22,3433-3437）。ＡＤや病理的脳萎縮を伴うＰＤ、あるいは多硬化症で、塩基形／酸性形の比が増大することが見出された。このことから、これら遷移後変性(post tlanslational modification)がＮ−グリコシル化における変化とリンクしていることを示唆された。
【００９８】
−クロイツフェルト−ヤコブ病（ＣＪＤ）患者のＣＳＦにおけるＰＧＨＤ遷移後変性（ＰＴＭ）パターン−
ＣＪＤ患者と健康なコントロールから集めたＣＳＦサンプル内のＰＧＨＤのＰＴＭパタ
ーンを比較した。前述したように、蛋白質は２−ＤＥで分離され、ＰＶＤＦ膜状に電気ブロッティングされ、ＰＧＨＤが特異的抗体で検出された。ＣＳＦサンプルはランダムに集められた。コントロール患者は脳障害と関係の無いように、精密検査された。ＣＳＦサンプルは採取後直ちに遠心分離され、小分けされて分析するまで−２０℃で保存された。
【００９９】
図１７はその結果で、ミニ２−ＤＥのプロスタグランジンＤ２のスポット強度を、ヤコブ病患者のＣＳＦで調製したゲルと健康な患者のＣＳＦで調製したゲルとで比較したものである。４５μlの蛋白質がＩＰＧゲル上（ｐＨ３−１０、７ｃｍ）にセットされた。２次元目は、縦階調スラブゲル(vertical gradient slab gel)（１２％Ｔ）である。抗ヒトＰＧＨＤ（リポカリンタイプ）ウサギポリクロナール抗体（Cayman chemical, Ann Arbor, MI）とＥＣＬＴＭウェスタンブロット検出試薬（Amersham Biosciences, Uppsala, Sweden）を用いて免疫検出が行われた。
【０１００】
結果は、ＣＪＤ患者のＣＳＦ中のＰＧＨＤのＰＴＭパターンは、コントロールのものと明らかに異なっており、４つの殆どの酸性スポットが強い退行を示している（図１７）。ＣＪＴ患者のパターンは死んだＣＳＦのものと良く似ている。これらのデータは、ＰＧＨＤのＰＴＭパターンの変化の、神経疾患マーカーとしての関心を支持する。
【０１０１】
［実施例６］
この実施例は、卒中とコントロール患者における、ＵＦＤＰ１の血清レベルを示す追加のデータを示す。図１９は、コントロールと死んだ患者のＣＳＦにおけるＵＦＤＰ１のレベルを示す。追加データは、２つの患者とコントロールの群から得た、すなわち、ジュネーブのより小さい群とアメリカからはより広範囲からの群である。本例と、次の例７，８における分析手法は同じである、ただし、用いられる抗体の特異性は、問題とする蛋白質毎で異なっている。各検討の方法は例４で示したのと同様である。
【０１０２】
Black Plates(Pierce, Rockford, IL)をコートした９６ウェルのRiacti-Bind（登録商標） NeutrAvidin（登録商標）を用いてＥＬＩＳＡを行った。プレートは、まずNOVAPATH（登録商標） ウォッシャー（Bio-Rad, Hercules, CA）を使って、ホウ酸バッファ食塩水ｐＨ８．４（ＢＢS）（100ｍＭ H3BO3,25ｍＭ Na2B4O7(Sigma, St Louis, MO, USA)、75ｍＭ NaCl(Merk, Darmastadt, Germany)）中で洗浄された。次に、ｐＨ７希釈バッファＡで調製された、関連バイオマーカーに特異性のある抗体−ビオチン結合体（２μg/ｍＬ）５０μlを加え、３７℃下で１時間インキュベーションした。バッファＡの組成は；80％加水分解されたポリビニルアルコール、モル質量9,000-10,000(Aldrich, Milwaukee, WI,USA),MOPS(3-[N-モルホリノ]プロパンスルホン酸(Sigma),NaCl,MgCl2(Sigma),ZnCl2(Aldrich)，pH6.90,BSA30％Solution, Manufacturing Grade(Serological Proteins Inc.，Kankakee, IL)である。 次に、プレートをプレートウォッシャーでＢＢS中で３回洗浄した。抗原または血清を５０μl加え37℃下で１時間インキュベーションした。キャリブレーションカーブを取るため、組み換え型蛋白質抗原が希釈バッファＡで各々１００，５０，２５，１２．５，６．２５，３．１２５，１．５６ng/mlに希釈された。血清サンプルがバッファＡで適切な濃度に希釈される。更なる洗浄ステップ後、５０μlの関連バイオマーカーに特異性のあるアルカリホスハターゼ結合抗体が適切濃度でバッファＡに希釈され、３７℃で１時間インキュベートされた。９６ウェルのプレートはＢＢＳのプレートウォッシャーで３回洗浄され、５０μlの蛍光 Attophos（登録商標）AP Fluorescent Substrate
(Promega, Madison, WI)が加えられた。プレートは直ちにSpectraMax GEMINI-XS (Molecuar Devices Corporation, Sunnyvale，CA,U.S.A.)蛍光マイクロタイター(microtiter)プレートリーダーで読み取られた。
【０１０３】
プレートは、蛍光をSpectraMax GEMINI-XS(Molecuar Devices)蛍光マイクロタイタープレートリーダー(λexcitation=444 nm, λemission=555 nm)で読み取った。結果はＲＦＵ
ユニットに表示され、エンドポイントモード（一回だけの読み取り）か１０分の運動モードで読み取った。運動モードは、各ウェル６回のフラッシュを用い、それは平均され、それを各ウェル６回、最小の間隔で読んだ。その結果、読み取り間隔は２分であった。評価するためのスロープを決定した。GraphPad Prism 4 ソフトで、コントロールと卒中グループ間（虚血性プラス出血性、虚血性対出血性）のベストなカットオフ値をＲＯＣカーブによって決定した。
【０１０４】
結果を図２０に示す。
［実施例７］
本実施例は、ポリペプチドがＲＮＡ−ＢＰであることを除けば、例６に符合する。図２１は、コントロールと死体患者のＣＳＦ中のＲＮＡ−ＢＰレベルを示す。図２２は、それぞれ卒中患者とコントロールを含む３回の検討における、ＥＬＩＳＡによるＲＮＡ−ＢＰ血清中濃度を示す。
【０１０５】
［実施例８］
本例は、ポリペプチドがＮＤＫＡであることを除けば、例６に符合する。図２３は、コントロールと死体患者のＣＳＦ中のＮＤＫＡレベルを示す。図２４は、ジュネーブとアメリカの卒中患者およびコントロール群の、ＥＬＩＳＡによるＮＤＫＡ血清中濃度を示す。
【０１０６】
［実施例９］
各実施例６，７，８のデータからは、単なる卒中とコントロール間の識別に加えて、脳血管事故からサンプル採取までの時間の関係を分析することが出来る、または代替的に、虚血性、出血性、または一過性虚血性脳卒中（ＴＬＡ）という卒中のタイプに関連付けて分析することが出来る。それぞれの分析を図２５ａと図２５ｂに示す、また、卒中の診断において死んだＣＳＦのマーカーが有用であることが示されている。このことは、特に事故後３時間以内に卒中の診断を行いＴＰＡのような血栓除去薬を投与することが大切である臨床処置と関係する。また、テストは出血性と虚血性の卒中を識別出来ることが大切で、ＴＰＡは虚血性の処置に適しているが、出血性の卒中患者には破滅的な効果を与えてしまう可能性がある。
【０１０７】
［実施例１０］
各死んだＣＳＦマーカーが各々卒中診断に良い結果を示しているが、商品としては数種の蛋白質レベルの測定を要求される可能性がある。この「パネル」手法は２つの方法で行うことが出来る。より単純な方法としては、個別のマーカーに対する抗体が用意され、マイクロタイタープレートのウェルにコートされる。信号強度は各独立した強度の総和とすることが出来る。しかしこの場合、各マーカーの個別のレベルを決めることは出来ない。この方法で意味のあるカットオフ値を設定することは難題である。しかし、この方法はもっともユーザーフレンドリーな商品を提供する。
【０１０８】
図２６に本例で使用されたマーカーを要約した。実験結果を図２７に示す。死んだＣＳＦ蛋白質ＵＤＦ１，ＲＮＡ−ＢＰ，ＮＤＫＡ，Ｈ−ＦＡＢＰに対する各抗体は、例４のように同じ濃度で希釈された。しかし、これら抗体液は等量で混合され、上述した一つの検体標本中では最初の４分の１の濃度に希釈された。プロトコルは以下のようである。
【０１０９】
パネルアルゴリズムの問題を解決するために、直接混合した４つの抗体を各ウェル内で検査した。最初の抗体コートのステップで、各バイオマーカー特異性 ビオチン−抗体結合体を１ウェル当り１２．５μＬとした以外、プロトコルは各抗体に対して前述した（上記）のとまったく同じである。希釈バッファＡで初期濃度が１００、５０，２５．１２．５、６．２５、３．１２５ng/mlに調製された４つの組み換え型蛋白質抗原、ＵＤＦ１，ＲＮＡ−ＢＰ，ＮＤＫＡ，Ｈ−ＦＡＢＰを、キャリブレーションカーブを得るため同じプ
レート上のウェルに各々１２．５μl入れ、スタンダードカーブが同様に構築された。血清サンプルは各バイオマーカーに対すると同じように、同じ希釈、同じ容量（ウェル当り５０μl）用いられた。個別分析と同じ、バイオマーカー特異性 抗体−アルカリホスハターゼ結合体を用いて捕捉抗原の検出を行った、すなわち、スタンダード用および血清サンプル用の各ウェルに４つのバイオマーカー特異性抗体−アルカリホスハターゼ結合体が等量（１２．５μl）ずつ加えられた。蛍光の測定は、上記の例で示した単一のバイオマーカー分析で述べたように行われた。
【０１１０】
卒中１０とコントロール１０（年齢性別非合致）の２倍希釈血清サンプルがテストされた（図２７）。この試験では、感度１００％特異性８０％が得られた。２つの偽陽性サンプルは、患者のコントロール３６８，４５０に対応し、前立腺がんと脳障害候補を示す。
【０１１１】
この特異な例において、蛍光信号はアルカリホスハターゼ結合体を分析の検出サイドに使った各バイオマーカー特異性抗体によって発生した信号の総和に対応し、アルカリホスハターゼ結合体を分析の検出側に使った場合は全体の中で単一のバイオマーカーの相対的貢献を決めることは不可能である。本発明の一つの実施例としては、各バイオマーカー特異性抗体を励起放射波長が十分に異なる異なった蛍光団でラベリングすることが可能で、各抗体のレベルを干渉なしに検出できるということがある。この場合、一回のテストの一つのサンプルで４つまでの異なったバイオマーカーのレベルを正確に定量出来、サンプルの必要量の削減やスループットの向上をもたらす。
【０１１２】
［実施例１１］
ある環境下では、単一のウェルの中で多数検体のレベルを測定することが望ましくないかもしれない。例えば、ある特殊な診断をする場合に必要な個別蛋白質の絶対レベルとか、複数蛋白質間のレベル比などである。この状況では、各検体レベルを別々の分析で測定することが望ましいかもしれない。各患者ごとの特殊な診断に供するために、この多因子のデータセットを解釈するための予測アルゴリズムが用いられる。この例では、異なった多検体バイオマーカーパネルの理論的な性能を予測するため統計アルゴリズムを使用した。
【０１１３】
卒中の診断のため、上記さまざまな例で得られた個別のバイオマーカーレベルのデータセットを用いて、死んだＣＳＦ蛋白質ＵＤＦ１、ＲＮＡ−ＢＰ、ＮＤＫＡ、Ｈ−ＦＡＢＰの各組み合わせにおける真陽性および真陰性の比率を専用アルゴリズムを使用して求めた。分析のため、サンプルの群（ＵＤＦ１、ＲＮＡ−ＢＰ、ＮＤＫＡ、Ｈ−ＦＡＢＰに対し、１８コントロール、１８卒中）を員数ランダムの２つのグループに分けた。８０％のサンプルは、閾値トレーニング用として慎重に(by the technique of naive bayes)分析され、残りの２０％は１０００倍に希釈され、各マーカーおよびマーカーの組み合わせに対する閾値（感度と特異性）を評価するため用いられた。
【０１１４】
アルゴリズムが単一のマーカーに適用されたときは、感度および特異性は観察値と比較可能である。このデータセットの感度、特異性（カッコ内の数値）は、前述のＲＯＣカーブから決定された最適カットオフ値に基づいて計算されている。以下のデータの中で、カッコ内の最初の数値は標準偏差に該当する（例、０．９３±０．１５）。「１蛋白質」データの第２番目のカッコ内数値は、アルゴリズムを用いないで単純ＲＯＣカーブ（GraphPad Prism）を用いて得た感度（ＳＥ）および特異性（ＳＰ）に対応する。ＳＥ、ＳＰ値は、アルゴリズムありとなしの結果を比較するために示してある。
【０１１５】
アルゴリズム分析の結果は以下のようであった。
１蛋白質
トレーニングセットにおけるＵＦＤ１の真陽性比：0.93（0.15） （ＳＥ94％）
トレーニングセットにおけるＵＦＤ１の真陰性比：0.74（0.24） （ＳＰ78％）
トレーニングセットにおけるＲＮＡ−ＢＰの真陽性比：0.85（0.21）（ＳＥ94％）
トレーニングセットにおけるＲＮＡ−ＢＰの真陰性比：0.73（0.23）（ＳＰ72％）
トレーニングセットにおけるＨ−ＦＡＢＰの真陽性比：0.47（0.29）（ＳＥ39％）
トレーニングセットにおけるＲＮＡ−ＢＰの真陰性比：0.80（0.23）（ＳＰ100％）
トレーニングセットにおけるＮＤＫ Ａの真陽性比：0.79（0.16） （ＳＥ100％）
トレーニングセットにおけるＮＤＫ Ａの真陰性比：0.89（0.16） （ＳＰ83％）
２蛋白質
トレーニングセットにおけるＵＦＤ１/ＲＮＡ−ＢＰの真陽性比：0.90（0.17）
トレーニングセットにおけるＵＦＤ１/ＲＮＡ−ＢＰの真陰性比：0.69（0.25）
トレーニングセットにおけるＵＦＤ１/Ｈ−ＦＡＢＰの真陽性比：0.82（0.22）
トレーニングセットにおけるＵＦＤ１/Ｈ−ＦＡＢＰの真陰性比：0.83（0.20）
トレーニングセットにおけるＵＦＤ１/ＮＤＫ Ａの真陽性比：0.92（0.16）
トレーニングセットにおけるＵＦＤ１/ＮＤＫ Ａの真陰性比：0.79（0.21）
トレーニングセットにおけるＲＮＡ−ＢＰ/Ｈ−ＦＡＢＰの真陽性比：0.81（0.24）
トレーニングセットにおけるＲＮＡ−ＢＰ/Ｈ−ＦＡＢＰの真陰性比：0.73（0.24）
トレーニングセットにおけるＲＮＡ−ＢＰ/ＮＤＫ Ａの真陽性比：0.91（0.16）
トレーニングセットにおけるＲＮＡ−ＢＰ/ＮＤＫ Ａの真陰性比：0.83（0.21）
トレーニングセットにおけるＨ−ＦＡＢＰ/ＮＤＫ Ａの真陽性比：0.77（0.27）
トレーニングセットにおけるＨ−ＦＡＢＰ/ＮＤＫ Ａの真陰性比：0.84（0.20）
３蛋白質
トレーニングセットにおけるＲＮＡ−ＢＰ/ＮＤＫ Ａ/Ｈ−ＦＡＢＰの真陽性比：0.96（0.11）
トレーニングセットにおけるＲＮＡ−ＢＰ/ＮＤＫ Ａ/Ｈ−ＦＡＢＰの真陰性比：0.83（0.20）
トレーニングセットにおけるＵＦＤ１/ＮＤＫ Ａ/Ｈ−ＦＡＢＰの真陽性比：0.92（0.17）
トレーニングセットにおけるＵＦＤ１/ＮＤＫ Ａ/Ｈ−ＦＡＢＰの真陰性比：0.83（0.21）
トレーニングセットにおけるＵＦＤ１/ＲＮＡ−ＢＰ/ＮＤＫ Ａの真陽性比：0.95（0.14）
トレーニングセットにおけるＵＦＤ１/ＲＮＡ−ＢＰ/ＮＤＫ Ａの真陰性比：0.82（0.20）
トレーニングセットにおけるＵＦＤ１/ＲＮＡ−ＢＰ/Ｈ−ＦＡＢＰの真陽性比：0.93（0.15）
トレーニングセットにおけるＵＦＤ１/ＲＮＡ−ＢＰ/Ｈ−ＦＡＢＰの真陰性比：0.75（0.23）
４蛋白質
トレーニングセットにおけるＵＦＤ１/ＲＮＡ−ＢＰ/Ｈ−ＦＡＢＰ/ＮＤＫ Ａの真陽性比：0.93（0.13）
トレーニングセットにおけるＵＦＤ１/ＲＮＡ−ＢＰ/Ｈ−ＦＡＢＰ/ＮＤＫ Ａの真陰性比：0.73（0.23）
図２８は、本例で４つのバイオマーカーの内２つの組み合わせの場合を図示したものである。図には診断のために決定したカットオフポイント（縦、横の線）を示す。
【０１１６】
［実施例１２］
死後ＣＳＦマーカーであるＵＦＤ１，ＲＮＡ−ＢＰおよびＮＤＫ Ａに関して、ジュネーブおよびＵSＡでさらに大規模な研究を行った。サンプルは、上記の例で前述したようなＥＬＩＳＡを実施した（ジュネーブおよびＵSＡ双方の検査で）。結果を図２９〜３８に示す。
【０１１７】
参考文献
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【図面の簡単な説明】
【０１１８】
【図１】図１は、対照（コントロール）グループ、急性心筋梗塞（AMI）のグループ、急性卒中の３グループH-FABPの分析結果（縦軸はOD単位）である。
【図２】図２は、急性心筋梗塞患者のグループのH-FABPレベルを、卒中後異なった時間間隔で連続検知した結果である。
【図３】図３は、健全なＣＳＦと死後のＣＳＦに対する２−ＤＥマップの部分を示し、調製サブユニット結合ＲＮＡまたはDJ-1蛋白質に対応するスポットが上向きの矢印で示されている。健全なＣＳＦと死後のＣＳＦの２−ＤＥマップの拡大図が示されている。４５μｇの蛋白がIPGゲル（ｐｈ 3.5-10 NL, 18cm）上に載せられた。第２のディメンジョン（dimension）は、縦階調のスラブゲル(vertical gradient slab gel)（9-16% T）である。ゲルは銀染色されている。ＲＮＡ結合調節サブユニット(RNA binding regulatory subunit)またはDJ-1蛋白質に対応するスポットが上向きの矢印（赤）で示されている。
【図４】図４は、健全なＣＳＦと死後のＣＳＦに対する２−ＤＥマップの部分を示し、ペルオキシレドキシン５に対応するスポットが右側の矢印で示されている。健全なＣＳＦ死後のＣＳＦの２−ＤＥマップの拡大図が示されている。４５μｇの蛋白がIPGゲル（ｐｈ 3.5-10 NL, 18cm）上に載せられた。第2のディメンジョン（dimension）は、縦階調のスラブゲル(vertical gradient slab gel)（9-16% T）である。ゲルは銀染色されている。ペルオキシレドキシン５に対応するスポットが右側の矢印（赤）で示されている。
【図５】図５は、健全なＣＳＦと死後のＣＳＦに対する２−ＤＥマップの場所を示し、ペプチジル−プロリル・シス−トランス・イソメラーゼＡ（シクロフィリンＡ）に対応するスポットが右側2個の矢印で示されている。健全なＣＳＦと死後のＣＳＦの２−ＤＥマップの拡大図が示されている。４５μｇの蛋白がIPGゲル（ｐＨ 3.5-10 NL, 18cm）上に載せられた。第2のディメンジョン（dimension）は、縦階調のスラブゲル(vertical gradient slab gel)（9-16% T）である。ゲルは銀染色されている。ペプチジル−プロリル・シス−トランス・イソメラーゼＡ（シクロフィリンＡ）に対応するスポットが右側2個の矢印（赤）で示されている。
【図６】図６は、卒中患者の調査で得られたマーカーポリペプチドのＥＬＩＳＡ法の強度値を示す。
【図７】図７は、上記検査からの血清サンプル中のUFD1の検出を示す。
【図８】図８は、図７のデータからのUDF1のROCカーブを示す。
【図９】図９は、図７に対応するUDF1の検出を示す。
【図１０】図１０は、上記調査の血清サンプル中のRNA-BPの検出を示す。
【図１１】図１１は、図１０のデータからのRNA-BPのROCカーブを示す。
【図１２】図１２は、図１０に対応するRNA-BPの検出を示す。
【図１３】図１３は、上記調査からの血清サンプル中のNDK Aの検出を示す。
【図１４】図１４は、図１３のデータからのNDK AのROCカーブを示す。
【図１５】図１５は、図１３に対応するNDK Aの検出を示す。
【図１６】図１６は、プロスタグランジンＤシンターゼのレベルを表す、健全なＣＳＦと死後のＣＳＦに対する２−DEマップの場所を示す。
【図１７】図１７は、CJD患者からと、コントロールとして健康人から取ったＣＳＦで調製されたミニ２−DEゲル上でのプロスタグランジンＤシンターゼのスポット強度を示す。
【図１８】図１８は、卒中患者とコントロールグループのH-FABPに対するＥＬＩＳＡ法の強度値を示す。
【図１９】図１９は、コントロールおよび患者グループからのＣＳＦで調製されたミニ２−ＤＥゲル上でのUFDP-1のスポット強度を示す。
【図２０】図２０は、ジュネーブおよび米国の２集団の卒中患者のUFDP-1血清濃度をＥＬＩＳＡ法で測定したものを示す。
【図２１】図２１は、コントロールおよび疾患患者から得たＣＳＦで調製したミニ２−ＤＥゲル上のRNA-BPスポット強度を示す。
【図２２】図２２は、コントロールおよび卒中患者の３回の調査におけるRNA-BP血清濃度をＥＬＩＳＡ法で測定したものを示す。
【図２３】図２３は、コントロールおよび疾患患者から得たＣＳＦで調製したミニ２−ＤＥゲル上のNDK Aスポット強度を示す。
【図２４】図２４は、ジュネーブおよび米国の２集団の卒中患者のNDK A血清濃度をＥＬＩＳＡ法で測定したものを示す。
【図２５ａ】図２５ａは、発症時間と、UFDP1,RNA-BPおよびNDK Aの卒中マーカー（ＳＭ）濃度を示す。各々コントロール患者、脳血管事故から３時間以内の卒中患者、脳血管事故から３時間以降の卒中患者に対するものである。
【図２５ｂ】図２５ｂは、UFDP1,RNA-BPおよびNDK Aの卒中マーカー(ＳＭ)濃度を卒中タイプ別に示す。各々コントロール患者、出血性脳卒中患者、一過性虚血性脳卒中（TLA）患者、虚血性脳卒中患者に対するものである。
【図２６】図２６は、卒中用の血清用初期マーカーの集約情報を一覧にしたものである。
【図２７】図２７は、UFDP1,RNA-BP、NDK AおよびH-FABPを一つのウェルに混合した場合のＥＬＩＳＡ法の強度を示す。
【図２８】図２８は、図２７における４つのバイオマーカーのうち２つの組み合わせと、診断時のカットオフ値を示す。
【図２９Ａ】図２９Ａは、３７人の卒中患者と、年齢性別が一致するコントロール患者３７人の血清サンプルに関する追加検査の情報を示す。診断（Diag）は次のように表されている、すなわち、I（虚血性脳卒中）、H（出血性脳卒中）、TLA（一過性虚血性脳卒中）、ctl（コントロール）。UFDP1,RNA-BPおよびNDK AのＥＬＩＳＡ法による濃度が示されている。ＥＬＩＳＡ法は前述したように行われた。
【図２９Ｂ】図２９Ｂは、３７人の卒中患者と、年齢性別が一致するコントロール患者３７人の血清サンプルに関する追加検査の情報を示す。診断（Diag）は次のように表されている、すなわち、I（虚血性脳卒中）、H（出血性脳卒中）、TLA（一過性虚血性脳卒中）、ctl（コントロール）。UFDP1,RNA-BPおよびNDK AのＥＬＩＳＡ法による濃度が示されている。ＥＬＩＳＡ法は前述したように行われた。
【図３０】図３０は、ジュネーブでテストした中から３７人の卒中患者と３７人のコントロール患者の血清サンプルを使ったUDFA1に対する上記追加テストの結果を示す。また、米国―１（コントロール患者は年齢性別が一致していない）のUDFA1に対するデータである。
【図３１】図３１は、ジュネーブでテストした中から３７人の卒中患者と３７人のコントロール患者の血清サンプルを使ったRNA-BPに対する上記追加テストの結果を示す。また、米国―１（コントロール患者は年齢性別が一致していない）および米国―２（コントロール患者は年齢性別が一致している）のRNA-BPに対するデータである。
【図３２】図３２は、米国―３の６３３人の患者に関するPNA-BPの大規模検査の結果を示す。
【図３３】図３３は、米国―３のRNA-BPに関する統計分析（クラスカル-ウォリス法）を示す。
【図３４】図３４は、ジュネーブでテストした中から３３人の卒中患者と３３人のコントロール患者の血清サンプルを使ったNDKAに対する上記追加テストの結果を示す。また、米国―１（コントロール患者は年齢性別が一致していない）のNDKAに対するデータである。
【図３５】図３５は、米国―３の６２２人の患者に関するNDKAの大規模検査の結果を示す。
【図３６】図３６は、米国―3のNDKAに関する統計分析（クラスカル-ウォリス法）を示す。
【図３７】図３７は、発症時間に関する働きとしての卒中マーカー濃度を示す（ジュネーブデータ、新たな３７人の卒中患者と３７人のコントロール患者の血清サンプル）。
【図３８】図３８は、米国―１のデータを用いた、卒中タイプに関する働きとしての卒中マーカー濃度を示す。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、脳障害疾患の診断方法に関する。脳血管疾患、痴呆、神経組織変性症などの脳障関連疾患のルーチン検査のための生物学的マーカーは現在のところ無い。本発明は脳障害疾患の雛形として死亡患者から得た脳脊髄液を用いて、脳障害関連疾患のマーカーを発見し、診断に用いることに関わる。
【背景技術】
【０００２】
ここ２０年ほどの間に、脳障害関連疾患の患者の脳脊髄液（ＣＳＦ）や血清で多くの生物学的マーカー（バイオマーカー）が研究されてきた。クレアチンキナーゼ−ＢＢ［１］、乳酸デヒドロゲナーゼ［２］、ミエリン塩基性蛋白［３］、Ｓ１００蛋白質［４］、脳神経特異性エノラーゼ（ＮＳＥ）［５］、神経膠原線維酸性蛋白［６］、そしてタウ（tau）［７］などである。それらの殆どが脳障害疾患の程度や、臨床状態や機能面での結果の正確な予測のための有益な指標であることを証明出来ていない。実際、それらの顕現が遅いこと、障害のあとの遅れる反応ピーク、感度や特異性の低さ、また、これらの分子のＣＦＳ、最終的には血清の中への放出を統制するメカニズムへの理解の不足などが脳障害関連疾患のバイオマーカーの価値の妨げになってきた。これらの限界のおかげで、脳障害疾患関連のバイオマーカーの使用は現在のところ研究段階に限定され、どれもがルーチン評価のために推奨されていない。
【０００３】
ＷＯ01/42793は、体液サンプル中の心臓や脳の脂肪酸結合蛋白（H-FABP またはB-FABP）の濃度を決めるという、卒中の診断分析法に関連している。
【発明の開示】
【０００４】
理想的には、脳障害関連疾患の診断、監視、予後のためのマーカーとしては少なくとも次のような特性を有しなければならない。（１）脳特異性であること。（２）患者からＣＳＦサンプルを得ることが困難であることは明白なので、血清の検出が非常に望ましい。（３）早く顕現すること。（４）そのピークレベル、代替的には連続的な濃度カーブ下の領域が、脳障害の程度を反映すること。（５）機能上の結果を指し示すもの。我々はここで新たな脳障害関連疾患用バイオマーカーを論証し、この目的のために最も詳細に評価されている二つの分子、Ｓ１００とＮＳＥとの比較を行う。
【０００５】
我々は、重い脳障害のモデルとしての死亡患者からのＣＳＦをプロテオミクスベース（proteomics-based）の分析を用いて、いかに脳障害疾患用バイオマーカーを識別するかを述べる。また、１例として、急性脳卒中の患者に関して血清ＦＡＢＰレベルがＥＬＩＳＡ分析を用いて順序立てて決定されたあと得られた結果について、Ｓ１００やＮＳＥと比較してレポートする。
【０００６】
本発明の第１の目的は、健康なドナーの脳脊髄液に比べ死亡患者の脳脊髄液のレベルが高まるポリペプチドを構成する成分を提供することである。同じ目的のために、上記ポリペプチドから誘引される抗体の組成を提供する。
【０００７】
本発明の第２の目的は、脳血管疾患、痴呆、脳神経変性疾患を含む脳障害関連疾患の診断や予後において、創意に富む組成物を用いる方法を提供することである。
本発明は以下のものを提供する。
【０００８】
・ 脳障害関連疾患もしくはその可能性を、罹病していると疑われる対象物において診断する方法であって、対象から取った体液サンプル中の、Ａ−ＦＡＢＰ、Ｅ−ＦＡＢＰ
、Ｈ−ＦＡＢＰ、Ｂ−ＦＡＢＰ、ＰＧＰ９．５、ＧＦＡＰ、プロスタグランジンＤシンターゼ、ニューロモジュリン、ニューロフィラメントＬ、カルシフォシン、ＲＮＡ結合調節サブユニット(RNA binding regulatory subunit)、ユビキチン融合分解蛋白質１同族体(Ubiquitin fusion degradation protein 1 homolog)、ヌクレオシドジホスファートキナーゼＡ、グルタチオンＳトランフェラーゼＰ、カテプシンＤ、ＤＪ−１蛋白質、ペルオキシレドキシン５、およびペプチジル−プロリル・シス−トランス・イソメラーゼＡ（シクロフィリンＡ）の中から選択される少なくとも一つのポリペプチドまたはその変異体または同族体を検出することを含む方法。
【０００９】
（２）ポリペプチドが、脳障害関連疾患に冒されている対象の体液中と脳障害関連疾患に冒されていない対象の体液中で差異的に含まれ、また、サンプル中のポリペプチドの濃度が脳障害関連疾患の診断と一致性を持っているかを決定することを含む１の方法。
【００１０】
（３）濃度の検出または決定にポリペプチドの抗体を用いる１または２の方法。
（４）体液が、脳脊髄液、血漿、血清、血液、涙、尿、または唾液である１から３の内いずれかの方法。
【００１１】
（５）ポリペプチドが、脳障害関連疾患に冒されている対象の体液中に存在して、脳障害関連疾患に冒されていない対象の体液中には存在しない、そのため体液サンプル中のポリペプチドの存在が脳障害関連疾患の表示となる、１から４の内いずれかの方法。
【００１２】
（６）ポリペプチドが、脳障害関連疾患に冒されている対象の体液中に存在しないで、脳障害関連疾患に冒されていない対象の体液中には存在する、そのため体液サンプル中のポリペプチドの非存在が脳障害関連疾患の表示となる、１から４の内いずれかの方法。
【００１３】
（７）サンプルの中に複数のペプチドが検出される１から６の内いずれかの方法。
（８）脳障害関連疾患に冒された対象と脳障害関連疾患に冒されていない対象の体液中で、ポリペプチドの遷移後の変性し易さ(subject to post-translational modification)が差異的であって、サンプル中のポリペプチドの遷移後変性(post-translational modification)を検出し、それが脳障害関連疾患の診断と一致するかどうかを決定する１から７の内いずれかの方法。
【００１４】
（９）遷移後変性(post-translational modification)がＮ−グリコシラチオンを含む８の方法。
（１０）脳障害関連疾患が卒中であって、ポリペプチドがユビキチン融合分解蛋白質１同族体(Ubiquitin fusion degradation protein 1 homolog)である１から９の内いずれかの方法。
【００１５】
（１１）脳障害関連疾患が卒中であって、ポリペプチドがＲＮＡ結合調節サブユニット(RNA binding regulatory subunit)である１から９の内いずれかの方法。
（１２）脳障害関連疾患が卒中であって、ポリペプチドがヌクレオシドジホスファートキナーゼＡである１から９の内いずれかの方法。
【００１６】
（１３）ユビキチン融合分解蛋白質１同族体、ＲＮＡ結合調節サブユニット、ヌクレオシドジホスファートキナーゼＡ、Ｈ−ＦＡＢＰに対する抗体のうち２個以上のマーカーを選択し、ＥＬＩＳＡマイクロタイタープレート(microtiter plate)の一つのウェルに用いる１０から１２の内いずれかの方法。
【００１７】
（１４）一つのウェルに上記４つのマーカーをすべて用いる１３の方法。
（１５）ユビキチン融合分解蛋白質１同族体(Ubiquitin fusion degradation protein
1 homolog)、ＲＮＡ結合調節サブユニット(RNA binding regulatory subunit)、ヌクレオシドジホスファートキナーゼＡ、Ｈ−ＦＡＢＰから選択された２個以上のポリペプチドが個別に分析され、診断のために予測アルゴリズムを用いる１０から１２の内いずれかの方法。
【００１８】
（１６）Ａ−ＦＡＢＰ、Ｅ−ＦＡＢＰ、Ｈ−ＦＡＢＰ、Ｂ−ＦＡＢＰ、ＰＧＰ９．５、ＧＦＡＰ、プロスタグランジンＤシンターゼ、ニューロモジュリン、ニューロフィラメントＬ、カルシフォシン、ＲＮＡ結合調節サブユニット(RNA binding regulatory subunit)、ユビキチン融合分解蛋白質１同族体(Ubiquitin fusion degradation protein 1 homolog)、ヌクレオシドジホスファートキナーゼＡ、グルタチオンＳトランフェラーゼＰ、カテプシンＤ、ＤＪ−１蛋白質、ペルオキシレドキシン５、およびペプチジル−プロリル・シス−トランス・イソメラーゼＡ（シクロフィリンＡ）から選択されたポリペプチドまたはその変異体もしくは同族体、または上記ポリペプチドの組み合わせの、脳障害関連疾患に関連する診断、予後、および治療の応用への使用方法。
【００１９】
（１７）上記ポリペプチドが、脳障害関連疾患に冒されている対象と脳障害関連疾患に冒されていない対象とで差異的に含まれている１６記載の使用方法。
（１８）Ａ−ＦＡＢＰ、Ｅ−ＦＡＢＰ、Ｈ−ＦＡＢＰ、Ｂ−ＦＡＢＰ、ＰＧＰ９．５、ＧＦＡＰ、プロスタグランジンＤシンターゼ、ニューロモジュリン、ニューロフィラメントＬ、カルシフォシン、ＲＮＡ結合調節サブユニット(RNA binding regulatory subunit)、ユビキチン融合分解蛋白質１同族体(Ubiquitin fusion degradation protein 1 homolog)、ヌクレオシドジホスファートキナーゼＡ、グルタチオンＳトランフェラーゼＰ、カテプシンＤ、ＤＪ−１蛋白質、ペルオキシレドキシン５、およびペプチジル−プロリル・シス−トランス・イソメラーゼＡ（シクロフィリンＡ）から選択されたポリペプチドまたはその変異体もしくは同族体を認識する、またはそれに結合する、またはそれと親和性のある物質の、脳障害関連疾患に関する診断、予後、治療の応用への使用方法。
【００２０】
（１９）Ａ−ＦＡＢＰ、Ｅ−ＦＡＢＰ、Ｈ−ＦＡＢＰ、Ｂ−ＦＡＢＰ、ＰＧＰ９．５、ＧＦＡＰ、プロスタグランジンＤシンターゼ、ニューロモジュリン、ニューロフィラメントＬ、カルシフォシン、ＲＮＡ結合調節サブユニット(RNA binding regulatory subunit)、ユビキチン融合分解蛋白質１同族体(Ubiquitin fusion degradation protein 1 homolog)、ヌクレオシドジホスファートキナーゼＡ、グルタチオンＳトランフェラーゼＰ、カテプシンＤ、ＤＪ−１蛋白質、ペルオキシレドキシン５、およびペプチジル−プロリル・シス−トランス・イソメラーゼＡ（シクロフィリンＡ）から選択されたポリペプチドまたはその変異体もしくは同族体を認識する、またはそれに結合する、またはそれと親和性のある物質の組み合わせを用いる１８記載の使用方法。
【００２１】
（２０）上記物質が、抗体または抗体片である１８または１９記載の使用方法。
（２１）上記物質が、Ａ−ＦＡＢＰに対する抗体である２０記載の使用方法。
（２２）上記物質が、Ｅ−ＦＡＢＰに対する抗体である２０記載の使用方法。
【００２２】
（２３）上記物質が、ＰＧＰ９．５に対する抗体である２０記載の使用方法。
（２４）上記物質が、ＧＦＡＰに対する抗体である２０記載の使用方法。
（２５）上記物質が、プロスタグランジンＤシンターゼに対する抗体である２０記載の使用方法。
【００２３】
（２６）上記物質が、ニューロモジュリンに対する抗体である２０記載の使用方法。
（２７）上記物質が、ニューロフィラメントＬに対する抗体である２０記載の使用方法。
【００２４】
（２８）上記物質が、カルシフォシンに対する抗体である２０記載の使用方法。
（２９）上記物質が、ＲＮＡ結合調節サブユニット(RNA binding regulatory subunit)に対する抗体である２０記載の使用方法。
【００２５】
（３０）上記物質が、ユビキチン融合分解蛋白質１同族体(Ubiquitin fusion degradation protein 1 homolog)に対する抗体である２０記載の使用方法。
（３１）上記物質が、ヌクレオシドジホスファートキナーゼＡに対する抗体である２０記載の使用方法。
【００２６】
（３２）上記物質が、グルタチオンＳトランフェラーゼＰに対する抗体である２０記載の使用方法。
（３３）上記物質が、カテプシンＤに対する抗体である２０記載の使用方法。
【００２７】
（３４）上記物質が、ＤＪ−１蛋白質に対する抗体である２０記載の使用方法。
（３５）上記物質が、ペルオキシレドキシン５に対する抗体である２０記載の使用方法。
【００２８】
（３６）上記物質が、ペプチジル−プロリル・シス−トランス・イソメラーゼＡ（シクロフィリンＡ）に対する抗体である２０記載の使用方法。
（３７）脳障害関連疾患に関する診断のために用いられる分析装置であって、Ａ−ＦＡＢＰ、Ｅ−ＦＡＢＰ、Ｈ−ＦＡＢＰ、Ｂ−ＦＡＢＰ、ＰＧＰ９．５、ＧＦＡＰ、プロスタグランジンＤシンターゼ、ニューロモジュリン、ニューロフィラメントＬ、カルシフォシン、ＲＮＡ結合調節サブユニット(RNA binding regulatory subunit)、ユビキチン融合分解蛋白質１同族体(Ubiquitin fusion degradation protein 1 homolog)、ヌクレオシドジホスファートキナーゼＡ、グルタチオンＳトランフェラーゼＰ、カテプシンＤ、ＤＪ−１蛋白質、ペルオキシレドキシン５、およびペプチジル−プロリル・シス−トランス・イソメラーゼＡ（シクロフィリンＡ）から選択されたポリペプチドまたはその変異体もしくは同族体を認識する、またはそれに結合する、またはそれと親和性のある物質を含んだ場所を有する固形基板を含む分析装置。
【００２９】
（３８）上記固形基板が、Ａ−ＦＡＢＰ、Ｅ−ＦＡＢＰ、Ｈ−ＦＡＢＰ、Ｂ−ＦＡＢＰ、ＰＧＰ９．５、ＧＦＡＰ、プロスタグランジンＤシンターゼ、ニューロモジュリン、ニューロフィラメントＬ、カルシフォシン、ＲＮＡ結合調節サブユニット(RNA binding regulatory subunit)、ユビキチン融合分解蛋白質１同族体(Ubiquitin fusion degradation protein 1 homolog)、ヌクレオシドジホスファートキナーゼＡ、グルタチオンＳトランフェラーゼＰ、カテプシンＤ、ＤＪ−１蛋白質、ペルオキシレドキシン５、およびペプチジル−プロリル・シス−トランス・イソメラーゼＡ（シクロフィリンＡ）から選択されたポリペプチドまたはその変異体もしくは同族体を認識する、またはそれに結合する、またはそれと親和性のある物質を各々含む複数の場所を有する３７記載の分析装置。
【００３０】
（３９）上記物質が抗体または抗体片である３７または３８記載の分析装置。
（４０）上記各抗体が特徴的に配置され、各ポリペプチド、または、どんなポリペプチドの組み合わせでも読み取りができる上記３９記載の分析装置。
【００３１】
（４１）Ａ−ＦＡＢＰに対する抗体を含む、上記３７から４０の内いずれかの分析装置。
（４２）Ｅ−ＦＡＢＰに対する抗体を含む、上記３７から４０の内いずれかの分析装置。
【００３２】
（４３）ＰＧＰ９．５に対する抗体を含む、上記３７から４０の内いずれかの分析装置
。
（４４）ＧＦＡＰに対する抗体を含む、上記３７から４０の内いずれかの分析装置。
【００３３】
（４５）プロスタグランジンＤシンターゼに対する抗体を含む、上記３７から４０の内いずれかの分析装置。
（４６）ニューロモジュリンに対する抗体を含む、上記３７から４０の内いずれかの分析装置。
【００３４】
（４７）ニューロフィラメントＬに対する抗体を含む、上記３７から４０の内いずれかの分析装置。
（４８）カルシフォシンに対する抗体を含む、上記３７から４０の内いずれかの分析装置。
【００３５】
（４９）ＲＮＡ結合調節サブユニット(RNA binding regulatory subunit)に対する抗体を含む、上記３７から４０の内いずれかの分析装置。
（５０）ユビキチン融合分解蛋白質１同族体(Ubiquitin fusion degradation protein 1 homolog)に対する抗体を含む、上記３７から４０の内いずれかの分析装置。
【００３６】
（５１）ヌクレオシドジホスファートキナーゼＡに対する抗体を含む、上記３７から４０の内いずれかの分析装置。
（５２）グルタチオンＳトランフェラーゼＰに対する抗体を含む、上記３７から４０の内いずれかの分析装置。
【００３７】
（５３）カテプシンＤに対する抗体を含む、上記３７から４０の内いずれかの分析装置。
（５４）ＤＪ−１蛋白質に対する抗体を含む、上記３７から４０の内いずれかの分析装置。
【００３８】
（５５）ペルオキシレドキシン５に対する抗体を含む、上記３７から４０の内いずれかの分析装置。
（５６）ペプチジル−プロリル・シス−トランス・イソメラーゼＡ（シクロフィリンＡ）に対する抗体を含む、上記３７から４０の内いずれかの分析装置。
【００３９】
（５７）３７から５６記載のいずれかの分析装置と、対象から採取した体液サンプル中の一つ以上のポリペプチドの量を検出する手段とを含む、脳障害関連疾患診断に用いるキット。
【００４０】
本発明に用いる新しいマーカーは以下のものである。
A-FABP(P15090)。これは以下のシーケンス(SEQ ID NO.1)を有する:
1 CDAFVGTWKLVSSENFDDYMKEVGVGFATRKVAGMAKPNMIISVNGDVITIKSESTFKNTEISFILGQEFDEVTADDRKVKSTITLDGGVLVHVQKWDGKSTTIKRKREDDKLVVECVMKGVTSTRVYERA 131
E-FABP(Q01469)。これは以下のシーケンス (SEQ ID NO.2)を有する:
1 MATVQQLEGRWRLVDSKGFDEYMKELGVGIALRKMGAMAKPDCIITCDGKNLTIKTESTLKTTQFSCTLGEKFEETTADGRKTQTVCNFTDGALVQHQEWDGKESTITRKLKDGKLVVECVMNNVTCTRIYEKVE 135
PGP 9.5 (P09936)。これは以下のシーケンス (SEQ ID NO.3)を有する:
1 MQLKPMEINP EMLNKVLSRL GVAGQWRFVD VLGLEEESLG SVPAPACALL LLFPLTAQHE 60
NFRKKQIEEL KGQEVSPKVY FMKQTIGNSC GTIGLIHAVA NNQDKLGFED GSVLKQFLSE 120
TEKMSPEDRA KCFEKNEAIQ AAHDAVAQEG QCRVDDKVNF HFILFNNVDG HLYELDGRMP 180
FPVNHGASSE DTLLKDAAKV CREFTEREQG EVRFSAVALCKAA 223
GFAP (14136)。これは以下のシーケンス (SEQ ID NO.4)を有する:
1MERRRITSAA RRSYVSSGEM MVGGLAPGRR LGPGTRLSLA RMPPPLPTRV DFSLAGALNA 60
GFKETRASER AEMMELNDRF ASYIEKVRFL EQQNKALAAE LNQLRAKEPT KLADVYQAEL 120
RELRLRLDQL TANSARLEVE RDNLAQDLAT VRQKLQDETN LRLEAENNLA AYRQEADEAT180
LARLDLERKI ESLEEEIRFL RKIHEEEVRE LQEQLARQQV HVELDVAKPD LTAALKEIRT240 QYEAMASSNM HEAEEWYRSK FADLTDAAAR NAELLRQAKH EANDYRRQLQ SLTCDLESLR 300
GTNESLERQM REQEERHVRE AASYQEALAR LEEEGQSLKD EMARHLQEYQ DLLNVKLALD 360
IEIATYRKLL EGEENRITIP VQTFSNLQIR ETSLDTKSVS EGHLKRNIVV KTVEMRDGEV 420
IKESKQEHKD VM 432
プロスタグランジンＤシンターゼ (P41222)。これは以下のシーケンス (SEQ ID N0.5)を有する:
23 APEAQVSV QPNFQQDKFL GRWFSAGLAS NSSWLREKKA 60
ALSMCKSVVA PATDGGLNLT STFLRKNQCE TRTMLLQPAG SLGSYSYRSP HWGSTYSVSV 120
VETDYDQYAL LYSQGSKGPG EDFRMATLYS RTQTPRAELK EKFTAFCKAQ GFTEDTIVFL 180
PQTDKCMTEQ
ニューロモジュリン(P17677)。これは以下のシーケンス (SEQ ID N0.6)を有する:
1 MLCCMRRTKQ VEKNDDDQKI EQDGIKPEDK AHKAATKIQA SFRGHITRKK LKGEKKDDVQ 60
AAEAEANKKD EAPVADGVEK KGEGTTTAEA APATGSKPDE PGKAGETPSE EKKGEGDAAT 120
EQAAPQAPAS SEEKAGSAET ESATKASTDN SPSSKAEDAP AKEEPKQADV PAAVTAAAAT 180
TPAAEDAAAK ATAQPPTETG ESSQAEENIE AVDETKPKES ARQDEGKEEE PEADQEHA 238
ニューロフィラメントＬ(P07196)。これは以下のシーケンス (SEQ ID NO.7)を有する:
1 SSFSYEPYYS TSYKRRYVET PRVHISVRSG YSTARSAYSS YSAPVSSSLS VRRSYSSSSG 60
SLMPSLENLD LSQVAAISND LKSIRTQEKA QLQDLNDRFA SFIERVHELE QQNKVLEAEL 120
LVLRQKHSEP SRFRALYEQE IRDLRLAAED ATTNEKQALR GEREEGLEET LRNLQARYEE 180
EVLSREDAEG RLMERRKGAD EAALARAELE KRIDSLMDEI SFLKKVHEEE IAELQAQIQY 240
AQISVEMDVT KPDLSAALKD IRAQYEKLAA KNMQNAEEWF KSRFTVLTES AAKNTDAVRA 300
AKDEVSESRR LLKAKTLEIE ACRGMNEALE KQLQELEDKQ NADISAMQDT INKLENELRT 360
TKSEMARYLK EYQDLLNVKM ALDIEIAAYR KLLEGEETRL SFTSVGSITS GYSQSSQVFG 420
RSAYGGLQTS SYLMSTRSFP SYYTSHVQEE QTEVEETIEA SKAEEAKDEP PSEGEAEEEE 480
KDKEEAEEEE AAEEEEAAKE ESEEAKEEEE GGEGEEGEET KEAEEEEKKV EGAGEEQAAK 540
KKD 543
カルシフォシン(Q13938)。これは以下のシーケンス (SEQ ID NO.8)を有する:
1 MDAVDATMEK LRAQCLSRGA SGIQGLARFF RQLDRDGSRS LDADEFRQGL AKLGLVLDQA 60
EAEGVCRKWD RNGSGTLDLE EFLRALRPPM SQAREAVIAA AFAKLDRSGD GVVTVDDLRG 120
VYSGRAHPKV RSGEWTEDEV LRRFLDNFDS SEKDGQVTLA EFQDYYSGVS ASMNTDEEFV 180
AMMTSAWQL 189
ＲＮＡ結合調節サブユニット(RNA binding regulatory subunit)(014805)。これはRNA-BPとも称し、以下のシーケンス (SEQ ID NO.9)を有する:
1MASKRALVIL AKGAEEMETV IPVDMRRAG IKVTVAGLAG KDPVQCSRDV VICPDASLED 60
AKKEGPYDVV VLPGGNLGAQ NLSESAAVKE ILKEQENRKG LIAAICAGPT ALLAHEIGFG 120
SKVTTHPLAK DKMMNGGHYT YSENRVEKDG LILTSRGPGT SFEFALAIVE ALNGKEVAAQ 180
VKAPLVLKD 189
ユビキチン融合分解蛋白質１同族体(Ubiquitin fusion degradation protein 1 homolog)(Q92890)。これはUFD1または UFDP1とも称し、以下のシーケンス (SEQ ID NO.10)を有する:
1 MFSFNMFDHP IPRVFQNRFS TQYRCFSVSM LAGPNDRSDV EKGGKIIMPP SALDQLSRLN 60
ITYPMLFKLT NKNSDRMTHC GVLEFVADEG ICYLPHWMMQ NLLLEEDGLV QLETVNLQVA 120
TYSKSKFCYL PHWMMQNLLL EEGGLVQVES VNLQVATYSK FQPQSPDFLD ITNPKAVLEN 180
ALRNFACLTT GDVIAINYNE KIYELRVMET KPDKAVSIIE CDMNVDFDAP LGYKEPERQV 240
QHEESTEGEA DHSGYAGELG FRAFSGSGNR LDGKKKGVEP SPSPIKPGDI KRGIPNYEFK 300
LGKITFIRNS RPLVKKVEED EAGGRFVAFS GEGQSLRKKG RKP 343
ヌクレオシドジホスファートキナーゼＡ(P15531)。これはNDK Aとも称し、以下のシーケンス (SEQ ID NO11)を有する:
1 MANCERTFIA IKPDGVQRGL VGEIIKRFEQ KGFRLVGLKF MQASEDLLKE HYVDLKDRPF 60
FAGLVKYMHS GPVVAMVWEG LNVVKTGRVM LGETNPADSK PGTIRGDFCI QVGRNIIHGS 120
DSVESAEKEI GLWFHPEELV DYTSCAQNWI YE 152
グルタチオンＳトランフェラーゼＰ(P09211)。これは以下のシーケンス (SEQ ID NO.12)を有する:
1 PPYTVVYFPV RGRCAALRML LADQGQSWKE EVVTVETWQE GSLKASCLYG QLPKFQDGDL 60
TLYQSNTILR HLGRTLGLYG KDQQEAALVD MVNDGVEDLR CKYISLIYTN YEAGKDDYVK 120
ALPGQLKPFE TLLSQNQGGK TFIVGDQISF ADYNLLDLLL IHEVLAPGCL DAFPLLSAYV 180
GRLSARPKLK AFLASPEYVN LPINGNGKQ 209
カテプシンＤ(P07339)。これは以下のシーケンス (SEQ ID NO. 13)を有する:
65 GPIPEV LKNYMDAQYY GEIGIGTPPQ CFTVVFDTGS SNLWVPSIHC KLLDIACWIH 120
HKYNSDKSST YVKNGTSFDI HYGSGSLSGY LSQDTVSVPC QSASSASALG GVKVERQVFG 180
EATKQPGITF IAAKFDGILG MAYPRISVNN VLPVFDNLMQ QKLVDQNIFS FYLSRDPDAQ 240
PGGELMLGGT DSKYYKGSLS YLNVTRKAYW QVHLDQVEVA SGLTLCKEGC EAIVDTGTSL 300
MVGPVDEVRE LQKAIGAVPL IQGEYMIPCE KVSTLPAITL KLGGKGYKLS PEDYTLKVSQ 360
AGKTLCLSGF MGMDIPPPSG PLWILGDVFI GRYYTVFDRD NNRVGFAEAA RL 412
ＤＪ−１蛋白質(Q99497)。これは以下のシーケンス (SEQ ID NO.14)を有する:
1 MASKRALVIL AKGAEEMETV IPVDVMRRAG IKVTVAGLAG KDPVQCSRDV VICPDASLED 60
AKKEGPYDVV VLPGGNLGAQ NLSESAAVKE ILKEQENRKG LIAAICAGPT ALLAHEIGCG 120
SKVTTHPLAK DKMMNGGHYT YSENRVEKDG LILTSRGPGT SFEFALAIVE ALNGKEVAAQ 180
VKAPLVLKD 189
ペルオキシレドキシン５(P30044)。これは以下のシーケンス (SEQ ID N0.15)を有する:1 MGLAGVCALR RSAGYILVGG AGGQSAAAAA RRCSEGEWAS GGVRSFSRAA AAMAPIKVGD 60
AIPAVEVFEG EPGNKVNLAE LFKGKKGVLF GVPGAFTPGC SKTHLPGFVE QAEALKAKGV 120
QVVACLSVND AFVTGEWGRA HKAEGKVRLL ADPTGAFGKE TDLLLDDSLV SIFGNRRLKR 180
FSMVVQDGIV KALNVEPDGT GLTCSLAPNI ISQL 214
ペプチジル−プロリル・シス−トランス・イソメラーゼＡ(P05092)。これは以下のシーケンス(SEQ ID NO.16)を有する;
1 VNPTVFFDIA VDGEPLGRVS FELFADKVPK TAENFRALST GEKGFGYKGS CFHRIIPGFM 60
CQGGDFTRHN GTGGKSIYGE KFEDENFILK HTGPGILSMA NAGPNTNGSQ FFICTAKTEW 120
LDGKHVVFGK VKEGMNIVEA MERFGSRNGK TSKKITIADC GQLE 164
本発明に有用なポリペプチドは上記のシーケンスに限定されないで、その同族体、変異体も含まれる。同族体とは、ポリペプチドのシーケンスに自然に起こる変種で、与えられたシーケンスと高度の相同性を有し、かつ、実質的に同一の機能的、免疫学的な性状を持つものと定義する。変異体とは、人工的に創造された変種と定義する。高度の相同性とは、少なくとも９０％、好適には９５％、もっとも好適には９９％の相同性を指す。変種は単一種内または異種間で起こる。上記シーケンスはヒト由来のものであるが、本発明は例えばウシ属など他の哺乳類の、対応するポリペプチドを含む。
【００４１】
本発明で云う脳障害関連疾患は、以下を含む：
脳損傷（head trauma）、虚血性卒中、出血性卒中、くも膜下出血、頭蓋内出血、一過性虚血性発作、血管性痴呆、大脳皮質基底核神経節変成症、脳炎、てんかん、ランド-クレフナー症候群、水頭症、偽性脳腫瘍、視床疾患、脳膜炎、脊膜炎、運動障害、真性振戦、脊髄疾患、脊髄空洞症、アルツハイマー（早期発症）、アルツハイマー（遅発症）、多重梗塞性痴呆症、ピック症、ハンチントン病、パーキンソン病、パーキンソンシンドローム、前頭側頭型痴呆、大脳皮質基底核変性症、多系統萎縮症、進行性核上性麻痺、ルーイ体（Lewy body）疾患、筋萎縮性側索硬化症、クロイツフェルト-ヤコブ病、ダンディーウォーカーシンドローム、フリードライヒ（Friedreich）運動失調症、マカドヨセフ（Mach
ado-Joseph）病、偏頭症、統合失調症、情緒不安定（mood disorder）、およびうつ病。ヒト以外の哺乳類における対応する疾患、たとえばウシスポンジ状脳症（BSE）などの流行性スポンジ状脳症（TSE）やヒツジのスクレイピーなども含まれる。
【００４２】
本発明において、H-FABP（P０５４１３）とB-FABP（O１５５４０）も、特に卒中やCJD以外の脳障害関連疾患とその可能性の診断に有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４３】
本発明は、脳血管疾患、痴呆、神経変性疾患を含む脳障害関連疾患に冒された患者の、血液成分（例えば血漿や血清）や脳脊髄液などの体液中で増大または減少するポリペプチドを検出する物質成分とその方法に関する。
【００４４】
脳障害の蛋白マーカーに対するポリペプチド、特にその蛋白結合領域が検出ツールとして適している。前に述べたような分子に対する抗体の性状を変えたり最適化するために、分子生物学的、また、バイオテクノロジーの方法が、ある特別の方法で利用される。加えて、抗体の安定性を増すために、アセチル化、カルバモイル化、ホルミル化、ビオチン化、アシル化、ポリエチレングリコールや親水性ポリマーによる誘導体化、など化学的に抗体に変更を加える。
【００４５】
Ａ−ＦＡＢＰ、Ｅ−ＦＡＢＰや他のFABP、例えばＨ−ＦＡＢＰ、Ｂ−ＦＡＢＰ、およびＰＧＰ９．５、ＧＦＡＰ、プロスタグランジンＤシンターゼ、ニューロモジュリン、ニューロフィラメントＬ、カルシフォシン、ＲＮＡ結合調節サブユニット(RNA binding regulatory subunit)、ユビキチン融合分解蛋白質１同族体(Ubiquitin fusion degradation protein 1 homolog)、ヌクレオシドジホスファートキナーゼＡ、グルタチオンＳトランフェラーゼＰ、カテプシンＤ、ＤＪ−１蛋白質、ペルオキシレドキシン５、およびペプチジル−プロリル・シス−トランス・イソメラーゼＡ（シクロフィリンＡ）から選択される特異的なポリペプチドマーカーが、例えばそれらの抗体を用いて体液サンプル中に検出される。マーカーは、好適にはポリペプチドに対する抗体を用いて、抗原（ポリペプチド）/抗体反応の程度を測る免疫分析法で測定される。抗体はモノクロナール抗体でも、製造された（キメラ体の）ものでも良い。上記ポリペプチドに対する抗体は商業的に入手可能である。また、抗体を増殖するためにケーラーミルスタイン法が有効である。ポリクロナール抗体はあまり望ましくない。本発明における抗体とは、単鎖やFab片など抗体の結合片を含む。
【００４６】
知られているどの免疫分析法でも利用可能である。サンドイッチ法では、ポリペプチドに対する抗体（例えばポリクロナール）が、プラスチック製のマイクロタイタープレートのウェルのような固層に結合され、サンプルおよび、検出すべきポリペプチドに特異的な、標識された第2の抗体と共にインキュベートされる。その代わりに、抗体補足法（間接免疫分析法）を用いても良い。この方法では、サンプルが固層に結合され、抗ポリペプチド抗体（ポリクロナールまたはモノクロナール）が加えられ、結合される。もしポリクロナール抗体の場合は、他の品種のポリペプチドとの間で交差反応が低いものが望ましい。非結合物質が洗い流されたあとに、固層に着いている抗体の量が第二の標識された抗体、すなわち抗−第一のもの、を用いて判定される。
【００４７】
標識された抗−ポリペプチド抗体を用いて直接分析法が行われる。テストサンプルが固層に結合され、抗−ポリペプチド抗体が加えられる。非結合物質が洗い流されたあとに、固層に着いている抗体の量が判定される。標識は第2の抗体でなく、直接なされる。
【００４８】
他の実施例では、サンプルと標識されたポリペプチドまたはそこから誘引されたペプチドとの間で競合法が行われる。この2つの抗原は固層に結合した少量の抗−ポリペプチド
抗体と量的に競合する。標識されたポリペプチドまたはペプチドは固層上で抗体と事前にインキュベートすることも出来、それによってサンプル中のポリペプチドは抗体に結合したポリペプチドまたはペプチドと部分的に置換する（displaces part）。
【００４９】
さらに他の実施例では、二つの抗原が抗体とともに競合的にインキュベートされる。洗浄によって非結合の抗原が除かれ、支持体に結合した標識の量を検出し、サンプル中の蛋白量が事前に確立されている標準滴定曲線と比較して測定される。
【００５０】
通して、標識は酵素が望ましい。酵素の基体は、発色性、蛍光発光、化学蛍光発光、電気化学的なものでありうる。また、可溶性でも凝結性のものでも良い。また、標識はラジオアイソトープや、例えば共役フルオレセインを用いた蛍光物質でも良い。
【００５１】
酵素は、例えば、アルカリホスファタ−ゼやホースラディッシュペルオキシターゼや、色測定に便利な、例えば、アルカリホスファターゼと共に黄色発色基材としてP-ニトロフェニルリン酸塩を用いることも出来る。
【００５２】
化学蛍光法では、抗体の標識にアクリジニウムエステルやホースラディッシュペルオキシターゼを用いることが出来る。後者は強調(enhanced)化学蛍光分析法（ＥＣＬ）に用いられる。ホースラディッシュペルオキシターゼで標識された抗体は、ルミノールやペルオキシターゼおよびその化合物との化学蛍光反応に関与し、それは発光強度やその寿命を強化する。典型的には、４−ヨードフェノールや４−ヒドロキシ桂皮酸がそれである。
【００５３】
免疫PCRのような増殖免疫分析法(amplified immunoassay)が利用される。この技術では、抗体はPCRプライマーを含む任意のDNA分子に共有結合され、抗体が組みこまれたDNAがポリメラーゼ連鎖反応によって増殖される。Hendrickson et al., Nucleic Acids Research 1995; 23, 522-529 (1995) または、T.Sano et al., in “Molecular Biology and Biotechnology” Robert A Meyers編集, VCH出版社(1995),458-460ページ参照。信号は前記のように読み取られる。
【００５４】
ポリペプチド検出の一つの方法として、酵素結合免疫吸着法(enzyme-linked immunosorbent assay)（ＥＬＩＳＡ）が用いられる。
AMIのH-FABP検出のために開発されたrapid micro particle-enhanced turbidimetric免疫分析法は分析時間を特段に短縮した。M.Roberts et al., “Development of a rapid microparticle-enhanced turbidimetric immuassay for plasma fatty acid-binding protein, an early marker of acute microcardial infarction”, Clin.Chem. 1998;44:1564-1567参照。
【００５５】
これによって、上記M.Roberts等 によって述べられているホフマンラロッシュのCOBAS
MIRA（登録商標）Plus system やアボットラボラトリー社のAxSYM（登録商標）で行われている全自動化が、脳障害関連疾患の日常的臨床検査でも可能になり、また適用されるに違いない。
【００５６】
ポリペプチドの濃度は、免疫分析法以外でも測定できる。たとえば、サンプルを２次元ゲル電気泳動にかけ、ポリペプチド濃度をゲルの濃度測定走査やシミの濃度走査によってポリペプチドの量を評価する。しかし、分析は患者が迅速に処置されるよう、すばやく行われることが望ましい。
【００５７】
原理的には、診断用サンプルとしてどんな体液でも可能であるが、望ましくは、脳脊髄液（ＣＳＦ）、血清、血液、尿、涙、または唾液である。
本発明では、単一のポリペプチドまたは２つ以上のポリペプチドの組み合わせによって
脳障害関連疾患の診断を行う。
【００５８】
本発明は、また、脳障害によって影響を受ける物質と、脳以外の障害によって影響を受ける物質に差異的に含まれるポリペプチドを、診断、予後、治療に供することに関する。これには、上記ポリペプチドに結合する、あるいはそれに対する親和性を有する物質を認識する物質を調製すること、また/もしくは、使用することを含む。そのような物質の例は、抗体や抗体片である。ここでいう「抗体」には、ポリクロナール抗血清、モノクロナール抗体、Fabのような抗体片、遺伝子操作で作られた抗体を含む。抗体は、非現実的なものでも良いし、単独種のものでも良い。上記「予後」応用は、例えば体液中の上記ポリペプチドの量を測定し、脳障害関連疾患のあり得そうな進行を検知することを含む。上記「治療追跡」応用には、例えば体液中の上記ポリペプチドの量を測定し（治療の働きとしてのレベル、能力障害が回復したかどうか、障害領域の大きさ等を評価し）脳障害関連疾患のあり得そうな進行を検知することを含む。上記「治療」応用とは、上記ポリペプチドに結合する、あるいはそれに対する親和性を有する物質を認識する物質を調製すること、使用することを含む。この場合、物質を変形して例えば、抗体と治療薬とを化合し、その薬を患者の特異的な場所に向かわせる。
【００５９】
上記ポリペプチドの「存在、非存在」は、単に疾患サンプルと非疾患サンプルの間でポリペプチドの量に非常なる差があることを意味する。したがって、テストサンプル中のポリペプチドの「非存在」とは、ポリペプチドが実際には存在する可能性があるが、比較テストサンプルと比べて量が非常に少ないということを含む。本発明は、診断をポリペプチドの存在、非存在をベースに行っても良い。これには、ポリペプチドの量が比較テストサンプルに比べて非常に少ないか、非常に多いということを含む。
【００６０】
上記ポリペプチドの「検出」には、量的変化の他に、成分の比較表やポリペプチドの遷移後変性体(post-translational modifications)を検出する方法が含まれる。例として、死後のものとコントロールのＣＳＦに関し、プロスタグランジンＤシンターゼの遷移後変性パターンに差があることが認められた。同様の差は、クロイツフェルトヤコブ病患者とコントロール患者のＣＳＦでも観測される。このことは実施例５で述べる。したがって、本発明は、一般的に遷移後変性体を検出し、そのようなポリペプチドの変性が脳障害関連疾患の診断と合致しているかを決定することまで包含する。
【００６１】
本発明では、脳障害関連疾患の診断に用いられる分析キットや装置を含む。これには、Ａ−ＦＡＢＰ、Ｅ−ＦＡＢＰや他のＦＡＢＰ、例えばＨ−ＦＡＢＰ、Ｂ−ＦＡＢＰおよびＰＧＰ９．５、ＧＦＡＰ、プロスタグランジンＤシンターゼ、ニューロモジュリン、ニューロフィラメントＬ、カルシフォシン、ＲＮＡ結合調節サブユニット(RNA binding regulatory subunit)、ユビキチン融合分解蛋白質１同族体(Ubiquitin fusion degradation protein 1 homolog)、ヌクレオシドジホスファートキナーゼＡ、グルタチオンＳトランフェラーゼＰ、カテプシンＤ、ＤＪ−１蛋白質、ペルオキシレドキシン５、およびペプチジル−プロリル・シス−トランス・イソメラーゼＡ（シクロフィリンＡ）の内から選択されるポリペプチドに対する抗体を含ませることが出来る。抗体は患者から採取された液体サンプル中で適合するポリペプチドと結合する。抗体は固体支持体の上に固定される。望ましくは、抗体の配置は特別なアクセスが可能な配置になっており、それによって、別々の分析法でサンプル中の各ポリペプチドおよび選択されたポリペプチドのどんな組み合わせでも読み出されようになっている。
【００６２】
以下の実施例で発明を例示する。
[実施例１]
脳脊髄液（ＣＳＦ）蛋白の２次元ゲル電気泳動による分離と、質量分析法によって、テーブル１に示す１５のポリペプチドが、脳障害の大きな患者のＣＳＦ中で増大または減少
していることが判った。
【００６３】
−対象員数とサンプルの取り扱い−
脳障害関連疾患用のマーカーを発見すべく、８つのＣＳＦサンプルがプロテオミクスベース(proteomics-based)のアプローチにかけられた。このうち４つは、死体解剖で中枢神経に異常の無い、死後６時間の死体から得た。他の４つのサンプルは、存命中の、脳障害と関係の無い患者で、精密検査で良好な状態である患者（非定型的頭痛、突発性顔面周囲神経麻痺）から腰椎穿刺で集められた。ＣＳＦサンプルは採取後直ちに遠心分離にかけられ、分割され、分析まで−８０℃で冷凍された。
【００６４】
- ＣＳＦ ２−ＤＥ-
すべての試薬、装置は他所に述べられている[９]。２５０μlのＣＳＦと５００μlの冷やされたアセトン（−２０℃）を混合し、４℃下で１０分間、１０００ｇで遠心分離する。ペレットは１０％ＳＤＳ（w/v）、２．３％ＤＴＥ（w/v）を含む溶剤と混合した。サンプルは９５℃で５分間温められたのち、８Ｍの尿素、４％のＣＨＡＰS(w/v)、４０ｍＭのTris、６５ｍＭのＤＴＥおよび僅かなブロモフェノールブルーを含む溶剤で、６０μlに希釈された。この最終的に希釈されたサンプルの４５μg対応分がＩＰＧストリップの陰極端のカップに入れられた。２−ＤＥ分析が前述したように実施された［１０］。簡単に述べれば、第1次方向の蛋白分離が、Amersham Bioscience(Uppsala, Sweden)製で、市販されている、ｐＨ３．５から１０の非線形ＩＰＧを使用して行われた。第２次元方向の分離は、手製の縦階調のスラブゲル(vertical gradient slab gel)（9-16% T,2.6%C）の上で行われた。ゲルはアンモニア銀で染色され［１１］、レーザー濃度計（Amersham Bioscience, Uppsala, Sweden）で走査され、ＭＥＬＡＮＩＥ ３ソフトウェアパッケージ［１２］で２−ＤＥ像のコンピュータ像解析がなされた。
【００６５】
-質量分析による同定-
死体と健康体のＣＳＦ（ｎ＝４）の分析ゲルの比較から、スポットの現れ方が異なるということが見出された。その興味あるスポットは、matrix-assisted laser desorption/ionization 飛行時間計測式の質量分析器（Perspective Biosystems Voyger STR MALDI-TOF-MS, Framingham, MA, USA）を使用したペプチド質量フィンガープリント法で分析され［１０］、PeptIdent (http://www.expasy.ch/sprot/peptident.html)で鑑定された。
【００６６】
【表１】
［実施例２］
脳脊髄液（ＣＳＦ）の２次元ゲル電気泳動（２−ＤＥ）分離と質量分析法によって、大きな脳損傷のモデルとして用いた死後のＣＳＦ中で、ＦＡＢＰが上昇しているのが観測された。Ｈ−ＦＡＢＰは、多くの機関の中に存在する一つのＦＡＢＰであるが、脳の中にも集中しているので、卒中患者とコントロールの血清サンプルの中でＨ−ＦＡＢＰを検出するためのＥＬＩＳＡ法が行われた。しかし、Ｈ−ＦＡＢＰはまた、急性心筋梗塞（ＡＭＩ）のマーカーでもあるので、並存する心臓障害を除くため、同時にトロポニン−Ｉとクレアチンキナーゼ−ＭＢ（ＣＫ−ＭＢ）のレベルが分析された。
【００６７】
−対象員数とサンプルの取り扱い−
員数は、後に述べる色々なマーカーの血清を使用した評価のために、あらかじめ検討された患者６４人（第２表）であり、等しく３つのグループに分けられた、すなわち、（１）抹消および中枢神経系に既知の症状が無い６５才（範囲：３４−８６才）の、男性１４人、女性８人のコントロールグループ。（２）６５才（範囲：２９−９０才）の急性心筋梗塞患者、男性１４、女性6人のグループ（ＡＭＩグループ）；ＡＭＩの診断は、すべて典型的な心電計上の変化とＣＫ−ＭＢの上昇（カットオフ値９．３ng/ml以上）および、トロポニン−Ｉ（カットオフ値２ng/ｍl以上）の上昇によって行われた。（３）６５才（範囲：３０−８７才）の急性卒中患者、男性１４、女性８人のグループ（卒中グループ）；卒中の診断は、訓練された医師によるものと、急性局所神経障害の発症と、およびそのあとの脳ＣＴやＭＲＩで症状に対応した損傷像によってなされた。ただし、眼に見える傷害が診断に必要の無い一過性虚血性脳卒中（ＴＩＡ）は例外である。卒中グループは次のように分けられる、すなわち、卒中のタイプ（虚血性か出血性か）、傷害の場所（脳幹か脳半球か）および臨床的進行時間（ＴＩＡの場合、２４時間以内のいつ完全に回復したか、または２４以上にわたり神経学的欠損が存在しているか）。
【００６８】
【表２】
３グループの各患者のサンプルは、入院時にヘパリン入りの乾燥した試験管に採取された。4℃下で１５分間１５００gで遠心分離されたあと、血清サンプルが分割され、分析時まで−２０℃で貯蔵された。卒中グループに対しては、神経学的事件のあと２４時間以内、４８時間以内、４８時間以後の３つのサンプルがさらに採取された。このグループでは、神経学的事件から最初の血液採取までの間隔は１８５分（範囲；４０分から３日）であった。この因子はデータ分析時に考慮された。各患者またはその親族は登録に当たり事前に告知同意している。
【００６９】
−ＦＡＢＰの測定−
Ｈ−ＦＡＢＰのレベルは、血清のサンドイッチＥＬＩＳＡ法で測定される。９６ウェルのポリスチレンマイクロタイタープレート（NUNC, Polylabo, CH）の各ウェルに、0.1ＭｐＨ９．６のカルボナートバッファー中に２０．４μｇ／ｍｌで混合した１００μlのポリクロナールヒツジ抗ヒト筋ＦＡＢＰ（Spectral Diagnosis HC, Ontario, USA）を、４℃で一晩かけて固着した。プレートはBioRad NOVAPATH（登録商標） WASHER（Hercules, CA）を用いて、ＰＢＳ（１５ｍＭ Ｎａ２ＰＯ４−１２０ｍＭ ＮａＣｌ−２．７ｍＭ ＫＣＬ ｐＨ７．４、Sigma）で自動洗浄する。洗浄毎に新しいＰＢＳで洗浄した。非特異結合部位はカルボネートバッファーに入れた２％カゼイン（w/v）で３７℃下で２時間かけてブロックした。洗浄ステップ後、サンプルをウェル当り１００μl注入した。プレートを３７℃下で２時間インキュベートした。洗浄後、１％(w/v)のＢＳＡを加えたＢＰＳを０．３μｇ/ml比で混合した100μl/ウェルのマウス抗ヒト心臓ＦＡＢＰ（clone 66E2、HyCult biotechnology b.v, Uden, Netherland）を、室温で1時間シェイクしつつインキュベートした。洗浄後、５０μl/ウェルのホスファターゼ基材と、ジエタノールアミン中に１．５mg/μl比で混合したパラニトロフェニルフォスヘートを３０分間インキュベートした。反応は100μl/ウェルの１Ｍ ＮａＯＨで停止した。発色を、MileniaTM kinetic
analyzer(DPC,LA,USA)で波長４０５nmを使って評価した。
【００７０】
−ＣＫ−ＭＢおよびトロポニン-I の測定−
血清サンプルは１５００ｇ下で１５分間遠心分離され、分割されて−２０℃で貯蔵された。血清ＣＫ−ＭＢとトロポニン−Ｉのレベルは自動化学分析機AxSYS（登録商標） SyStem(ABBOT Laboratories, Abbot Park, IL)を用いて、蛍光マイクロプレート酵素免疫分析法（ＭＥＩＡ）によって行われた。蛍光物質の生成はサンプル中のトロポニン−Ｉと直に比例している。トロポニン−Ｉの検出限界は０．３μg/lである。ＣＫ−ＭＢは蛍光プローブの量と比例しており、検出限界は０．７μg/lである。
【００７１】
−ＮＳＥおよびＳ１００の測定−
Ｈ−ＦＡＢＰの測定と同様、ＮＳＥとＳ１００は卒中グループの４つの連続する血清サンプルで分析された。ＳＭＡＲＴ−Ｓ１００およびＳＭＡＲＴ−ＮＳＥ用ＥＬＩＳＡキットが使用された。両者はSkye Pharma Tech Inc.(Ontario, CA)から市販されている。ＮＳＥとＳ１００の検出限界は各々１μg/lおよび0.01μg/lである。
【００７２】
−統計分析−
Ｈ−ＦＡＢＰのレベルは光学濃度値で平均±標準偏差で表示される。組み換えＨ−ＦＡＢＰは入手できなかったので、別途の補正によって濃度単位で表示することは出来なかった。Ｈ−ＦＡＢＰ、トロポニン−Ｉ、ＣＫ−ＭＢの濃度は正常、卒中およびＡＭＩのいずれのグループも、コルモロゴフ-スミルノフテストによるガウス分布の条件を満たさなかったので、３者の比較は、事後のダンの手法(post hoc Dann’s procedure)によるノンパラメトリック（non-parametric）クラスカル−ウォリステストによって行われた。卒中のサブグループ間の比較は、マン−ホイットニーＵテストで行われ、Ｈ−ＦＡＢＰの濃縮時間の縦軸評価(longitudinal assessment)は繰り返し測定の分散分析（ＡＮＯＶＡ）で行われた。卒中と正常患者を区別するためのＨ−ＦＡＢＰの比較限界は、受信者動作特性(receiver operating characteristic)（ＲＯＣ）カーブ（マイクロソフトExcel（登録商標）用Analyser-It（登録商標）ソフト）を使用して詳細に描写された。引き続き、各時点での感度、特異性、陽性、陰性の予測値が計算された。統計上の有意性は０．０５以下に設定された。
【００７３】
−結果−
３グループのＨ−ＦＡＢＰ分析の結果を第1図に示し、その詳細を第３表に示す。血清Ｈ−ＦＡＢＰ濃度の平均は、コントロールグループで０．２２１±０．１３４ＯＤ、卒中グループで１．０７９±０．８３８、ＡＭＩグループで２．３４０±０．７６３ＯＤであった。本ＥＬＩＳＡ法における変動係数は５．８％±３．８であった。クラスカル−ウォリステストによって、この3つのグループの濃度は互いに有意に異なる（ｐ＜０．００１）ことが見出された。コントロールと卒中グループを識別する最良のカットオフ値は、Ｈ−ＦＡＢＰレベルのＲＯＣカーブ（データ不記載）から、ＯＤ＞０．５３１とされた。このカットオフ値を使った卒中の診断におけるＨ−ＦＡＢＰの正当性測定の結果は次のようである：感度は卒中患者２２人中１５人がカットオフ値以上で６８．２％、特異性は正常者２２人すべてがカットオフ値以下で１００％、陽性予測値は１００％、陰性予測値は７５．９％であった。
【００７４】
【表３】
ＡＭＩグループと卒中患者グループを生物学的レベルで識別するために、トロポニン−ＩとＣＫ−ＭＫの分析がさらに行われた。トロポニン−Ｉ分析はAxSYMトロポニン−Ｉ分析において２ng/mlのカットオフ値で行われ、AxSYM ＣＫ−ＢＭ分析で３．８ng/mlのカットオフ値で行われた（表３）。期待されたように、これらＡＭＩグループにおけるＡＭＩマーカーはコントロール、卒中グループに比べて非常に高い（ｐ＜０．０１）。あとの２グループ間では差が無い、このことは脳障害の結果によってトロポニン−ＩとＣＫ−ＭＢが増加することはないこと、また、卒中患者は卒中時に随伴性のＡＭＩを維持しないことを証明している。これらのことから、Ｈ−ＦＡＢＰ、トロポニン−Ｉ、及びＣＫ−ＭＢ濃度は２０人のＡＭＩ患者と１５人の卒中患者を正しく識別する。一つの例外は、一人の卒中患者において、心電計の異常を伴わないでＨ−ＦＡＢＰレベルが上昇し、トロポニン−ＩとＣＫ−ＭＢレベルが徐々に上昇するという随伴性非ＡＭＩの心臓障害と一致するデータを示している。
【００７５】
卒中グループにおいて、神経学的出来事のあといずれの時点においてもＨ−ＦＡＢＰレベルがＯＤ０．５３１というカットオフ値を下回っている７つの偽陰性の結果が観測された。７人のうち、2人は神経欠損後２４時間以内に完全回復し、これは一過性虚血性脳卒中（ＴＩＡ）のケースと一致する。また、他の二人はラクナ型(lacunar) 卒中を起こしていたことがＭＲＩ像にあり、一人は脳幹の中であった。ＴＩＡやラクナ型卒中であることが、その患者の多くで見られるような偽陰性の結果を説明しているが、Ｈ−ＦＡＢＰの低レベルを示す残りの３人については一貫して説明できなかった。
【００７６】
卒中後の連続的なＨ−ＦＡＢＰ検出において、１５人中１０人（６７％）の陽性患者は早期から（１２時間以内）Ｈ−ＦＡＢＰの増大が認められた。さらに、第2図に示すように、すべての卒中患者を見たとき、傷害後平均Ｈ−ＦＡＢＰ濃度は着実に下がって行き、そのピーク値は１２時間以内に観測された。最初の測定と４８時間以内、その後の３つの差は大きい（分散分析、ｐ＜０．０５）。卒中グループのサブグループ間ではＨ−ＦＡＢＰレベルに統計的な有意差は認められなかった。虚血性（０．９５５±０．６８８、Ｎ＝１５）と出血性卒中（１．３４６±１．１３９、Ｎ＝７）間、および、脳半球体（０．９８７±０．７８３、Ｎ＝１８）と脳幹卒中（１．４９３±１．０８０）ではＨ−ＦＡＢＰレベルは似ている。しかし、サンプル数が少ないため分析の統計としての重みは少ない。しかしながら、定着した卒中とＴＩＡ患者の場合の比較では、両者の差は有意ではない（マンホイットニーＵテスト、ｐ＝０．２４）が、前者（１．２００２±０．８９２）は後者（０．６５２±０．４９９）のほぼ倍の値を示している。
【００７７】
最後に、ＮＳＥとＳ１００Ｂがコントロールと卒中グループで分析され、その結果がＨ−ＦＡＢＰ分析と比較された。ＳＭＡＲＴ−ＮＳＥとＳＭＡＲＴ−Ｓ１００Ｂ蛋白ＥＬＩＳＡテストの卒中診断用のカットオフ値は、それぞれＮＳＥに対し１０ng/ml、Ｓ１００に対し０．０２ng/mlである。ＮＳＥとＳ１００のレベルは、卒中患者中グループ（各々１４．１２ng/mlと０．０１０ng/ml）の方がコントロールグループ（各々１５．８８ng/mlと０．００４ng/ml）に比べてわずかに増加していた。表４に示すように、卒中診断においては、ＮＳＥ，Ｓ１００Ｂに対する特異性、感度、ＰＰＶ（予測陽性値）、ＮＰＶ（予測陰性値）はＨ−ＦＡＢＰに対するそれらに比べて大変低い。これらの差は、テストが同じサンプル上で行われているため関連がある。
【００７８】
【表４】
［実施例３］
死亡患者から得たＣＳＦサンプルで調製された２次元電気泳動で３つの蛋白質が同定された。これらの蛋白質は以前示したように、健康なコントロールに比べ死亡した患者からのＣＳＦ中で増大している。しかし、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦを使った質量分析では同定の試みは失敗している。今回の実験はＥＳＩ−Ｉｏｎ Ｔｒａｐ装置（DecalCQ XP, ThermoFinnigan）を使ったμＬＣ−ＮＳ−ＭＳによって行った。さらに、データベース中にデータ量を増やしたことで、以前特定できなかったスポットが成功裏に同定出来た。
【００７９】
（１）ＲＮＡ結合蛋白質調製サブユニット(RNA binding regulatory subunit)（Ｏ１４８０５）／ＤＪ−１蛋白質（Ｑ９９４９７）
ＲＮＡ結合蛋白質調製サブユニット(RNA binding regulatory subunit)は以前死後のＣＳＦサンプルのところで述べた（例１参照）。同様の同定結果が近傍のスポットで得られた（図３）。以前の同定結果を追認した。図１は、健康体のＣＳＦと死んだＣＳＦの２次元電気泳動マップの拡大図である。２７０μｇの蛋白質がＩＰＧゲル上（ｐＨ３．５−１０ＮＬ，１８ｃｍ）にセットされる。２次元目は縦階調のスラブゲル(vertical gradient
slab gel)（１２％Ｔ）である。ゲルは蛍光染色体で染色される。上向きの矢印が、ＲＮＡ結合調節サブユニットまたはＤＪ−１蛋白質に対応するスポットを示している。
【００８０】
さらに、この結果はこれらのスポットが他の同族の蛋白質ＤＪ−１に対応することを示している。ＲＮＡ結合調節サブユニットとＤＪ−１蛋白質のシーケンスの違いはたった一つのアミノ酸である。本実験中に検出された一個のペプチドはこの特異的な残基を含まなかった。
【００８１】
ＤＩ−１遺伝子の突然変異は常染色体退行性早期発症パーキンソン症候群と関係してい
る（Bonifati et al., Science, 2003）。ＤＪ−１が細胞の酸性ストレス反応や神経変性症にかかわりがあるということを示唆する別の結果もある。（Bonigati et al., Science, 2003; Wilson et al., PNAS,2003)。
【００８２】
（２）ペルオキシレドキシン５（Ｐ３００４４）
ぺルオキシレドキシン５の２―ＤＥのスポットを図４に示す。これは、図３と同様に作られた健康体のＣＳＦと死後のＣＳＦの２−ＤＥスポットマップの拡大図である。ぺルオキシレドキシン５に対応したスポットを右側矢印で示す。ぺルオキシレドキシン５は抗酸酵素であり、神経保護効果を持つ可能性がある（Plaisant et al., Free Radic. Biol. Med., 2003）。また、異なる神経変性疾患の患者の脳内で、ぺルオキシレドキシンファミリーに属する蛋白質が異常な現れ方をすることが述べられている（Krapfenbauer et al.,
Electrophoresis, 2002; Krapfenbauer et al., Brain Res., 2003）。
【００８３】
（３）ペプチジル−プロリル・シス−トランス・イソメラーゼＡ、即ちシクロフィリンＡ（Ｐ０５０９２）
２個のスポットがペプチジル−プロリル・シス−トランス・イソメラーゼＡであることを同定している（図５）。これも図４同様、健康体のＣＳＦと死後のＣＳＦの２−ＤＥスポットマップの拡大図である。シクロフィリンＡに対応する基本的なスポットがぺルオキシレドキシン５のスポットの極近傍にある。
【００８４】
シクロフィリンＡは、抗酸酵素に対する神経保護因子として述べられている（Doyle et
al., Bichem J., 1999）。それはぺルオキシレドキシン酵素に結合し、ペルオキシダーゼの働きに加わることはない（Lee et al., J. Biol. Chem.,2001）。さらに、文献によれば、シクロフィリンＡは酸性ストレスに反応して心臓平滑筋（ＶＳＭＣ）内に秘匿され、ＶＳＭＣの成長を刺激する（Jin et al., Circ. Res., 2000）。これらのことは、シクロフィリンＡが心臓疾患のプロセスに関わっていることを示唆する。抗酸酵素Cu/Zｕスーパーオキサイドジスムターゼ−１に関連する筋萎縮性側索硬化症（神経変性病状）の家族型との関連も述べられている（Lee et al., PNAS, 1999）。シクロフィリンＡは、ＳＯＤ変異体誘引の細胞消滅に対する防護効果を有するように見える。
【００８５】
［実施例４］
−序−
図６から図１５に卒中患者の調査を行った結果を示す。ユビキチン融合分解蛋白質１同族体（ＵＦＤ１）、ＲＮＡ結合調節サブユニット（ＲＮＡ−ＢＰ）、ヌクレオチドジホスファートキナーゼＡ（ＮＤＫ Ａ）のＥＬＩＳＡ強度信号を、患者と陰性のコントロール患者の血清サンプルを使って得た。患者からの血清サンプルは、救急病院に到着してから２４時間以内、または／および７２時間以上経過後に採取し、コントロール患者サンプルと年齢、性別を一致させた。
【００８６】
−プロトコル−
ＥＬＩＳＡは 96-well Recti-BindTMとNeutrAvidinTMとを塗布したBlack Plates(Pierce, Rockford, IL)を使用して行った。プレートは、まず、NOVAPATHTM洗浄機（BIO-Rad, Hercules, CA）上で、ホウ酸バッファー食塩水（ＢＢＳ）（100ｍＭ H3BO3,25ｍＭ Na2B4O7(Sigma, St Luis, MO, USA), ７５ｍＭ ＮａＣｌ(Merck, Darmastadt, Germany)）で洗浄した。次に、ｐＨ７の溶解バッファＡで調製された抗体ビオチン結合体(２μg/mL）が５０μl加えられ、３７℃で１時間インキュベートされた。バッファＡの組成は、80％加水分解されたポリビニルアルコール、モル質量9,000-10,000(Aldrich, Milwaukee, WI,USA), MOPS(3-[N-モルホリノ]プロパンスルホン酸(Sigma), NaCl, MgC12(Sigma), ZnC12(Aldrich)，pH6.90,BSA30％Solution, Manufacturing Grade(Serologjcal Proteins Inc., Kankakee, IL)である。
【００８７】
プレートはＢＢＳのプレートウォッシャーで洗浄した。５０μlの抗体が加えられ、３７℃で１時間インキュベートされた。キャリブレーションカーブを取るため、組み換え型蛋白質抗原が希釈バッファＡで各々１００，５０，２５，１２．５，６．２５ng/mlに希釈された。血清サンプルがバッファＡで適切な濃度に希釈される。洗浄ステップ後、５０μlのアルカリホスハターゼ結合抗体が適切濃度でバッファＡに希釈され、３７℃で１時間インキュベートされた。９６ウェルのプレートはＢＢＳのプレートウォッシャーで３回洗浄され、５０μlの蛍光 Attophos（登録商標）AP Fluorescent Substrate (Promega, Madison, WI)が加えられた。プレートは直ちにSpectraMax GEMINI-XS(Molecuar Devices Corporation, Sunnyvale，CA,U.S.A.)蛍光マイクロタイタープレートリーダー関連蛍光ユニット(RFU)(λexcitation=444 nm, λemission=555 nm)で読み取られた。
【００８８】
プレートはSpectraMax GEMINI-XS(Molecuar Devices)蛍光マイクロタイタープレートリーダー(λexcitation=444 nm, λemission=555 nm)で読み取った。結果はＲＦＵユニットに表示され、エンドポイントモード（一回だけの読み取り）か１０分の運動モードで読み取った。運動モードは、各ウェル６回のフラッシュを用い、それを平均する、それを各ウェル６回、最小の間隔で読んだ。その結果、読み取り間隔は２分であった。評価するためのスロープを決定した。GraphPad Prism ４ ソフトで、コントロールと卒中グループ間（虚血性プラス出血性、虚血性対出血性）のベストなカットオフ値が求められた。
【００８９】
−結論−
図７、１０、１３に、卒中患者のＵＦＤ１、ＲＮＡ−ＢＰ、ＮＤＫ Ａ各々がコントロール患者と比較して十分に説明されている。各バイオマーカーに対し統計分析がなされ、テストの感度が１特異性の機能を有することを示すＲＯＣカーブ（GraphPad Prism 4 ソフト）が得られた（図８、１１、１４、各々ＵＦＤ１、ＲＮＡ−ＢＰ、ＮＤＫ Ａに対するもの）。卒中とコントロールとを区別するベストなカットオフ値がこれらのＲＯＣカーブから得られた。ＵＦＤ１、ＲＮＡ−ＢＰ、ＮＤＫ Ａ各々の感度として９４．４％、９４．４％、１００％、各々の特異性として７７．８％、７２．２％、８３．３％を得た。卒中とコントロールを比較するため、各マーカーに対しノンパラメトリックな(non parametric)マン-ホイットニーテストが行われた。３つのマーカーに対し、非常に低いｐ値を得た（ＵＦＤ１とＮＤＫ Ａはｐ＜0.0001、ＲＮＡ−ＢＰはｐ＝0.0003）、これは、卒中とコントロールの差が非常に大きいことを意味する。
【００９０】
図６で、ＲＮＡ−ＢＰとＮＤＫ Ａが発症後たった３０分で卒中を検出出来ることに気がつく。これはこれらが非常に早期のマーカーであることを意味する。このことは、病院到着時と７２時間後のあいだに信号の減少があることで確認された。患者２０２と２３９は到着時（０〜２４時間）と７２時間後で検査され、全マーカーの信号の大きな減少が見られる。このテスト結果は、ユビキチン融合分解蛋白質１同族体(Ubiquitin fusion degradation protein 1 homolog)（ＵＦＤ１）、ＲＮＡ結合調節サブユニット(RNA binding regulatory subunit)（ＲＮＡ−ＢＰ）、ヌクレオシドジホスファートキナーゼＡ（ＮＤＫ
Ａ）は、単独か組み合わせ、または他のバイオマーカーとの組み合わせの形で卒中の早期診断に有用であることを示している。
【００９１】
［実施例５］
この実施例は、神経変性疾患に含まれる可能性のある遷移後変性症に関わる。対象員数、サンプルの取り扱い、ＣＳＦの２−ＤＥは第1実施例と同じである。
【００９２】
−２−ＤＥイムノブロッティング分析−
２−ＤＥで分離された蛋白質は、基本的にはTowen等が述べた［２２］ように、ＰＶＤＦ膜の上にエレクトロブロッティング(electrobrotted)され、Amido Black で染色され、
水で脱染されるか乾燥される。対象の蛋白質が、特異的な抗体とＥＣＬ（登録商標）ウェスタンブロット検出試薬（AmerSham BioScienceS, Uppsala, Sweden）を用いて前述［２９］したように検出される。次のような抗体が使用された：抗ヒト−プロスタグランデンＤシンセターゼ（リポカリンタイプ）ラビットポリクロナール抗体（Cayman chemical, Ann Arbor, MI）、１／２５０希釈。
【００９３】
図１６（Ａ）は、死体およびコントロールの２−ＤＥゲル上のスポット強度の比較を示す。４５μlの蛋白質がＩＰＧストリップ（ｐＨ３．５−１０ＮＬ、１８ｃｍ）上にセットされた。２次元目はアンモニア銀で染色された縦階調スラブゲル(vertical gradient slab gel)（９−１６％Ｔ）上で行われた。Apolipoprotein AIとイタリック体で表示されたものも２つのサンプルで同様のレベルを示した。ＰＧＨＤのスポットの場所は以前の識別（テスト）［３１］から導き出された。死体からのほうのゲルでは、一般的に考えられているＰＧＨＤのスポット場所が与えられている。図１６（Ｂ）は、死体およびコントロールからのＣＳＦで調製された２−ＤＥの免疫検出を示す。２−ＤＥはＡと同様に行われた。前述［２９］したと同じ免疫検出が、抗ヒト−プロスタグランデンＤシンセターゼ（リポカリンタイプ）ラビットポリクロナール抗体とＥＣＬＴＭウェスタンブロット検出試薬を用いて行われた。
【００９４】
−結果−
プロスタグランジンＤシンセターゼ（ＰＧＨＤ）は、Ｎ−グリコシル化による遷移後変性体(post-translationaly modified)として知られる（Hoffman A, et al., J.Neurochem.1994,63,2185-2196）塩基性蛋白（ｐＩ＝８．３７）である。健康な生きている患者からのＣＳＦの２−ＤＥゲル上には、５つのスポットが見られる。死後のＣＳＦで調製された２−ＤＥゲル上では、３つの酸性スポットが強く退行し、付随的に２つの基本スポットが強調されている（図１６Ａ）。
【００９５】
この異なったスポットがＰＧＨＤに対応しているかどうかを確認するため、特異的な抗体を用いてウェスタンブロットを行った（図１６Ｂ）。得られた結果は、死後のＣＳＦには酸性のＰＧＨＤスポットは無く、基本スポットはまだ存在するということが確認された。さらに、Melanie 3 ソフトを用いた２つのゲルのスポット全容積測定では、２つのサンプルでＰＧＨＤレベルは同等である。これは、したがって、死後のＣＳＦ中でＰＧＨＤの脱グリコシル化が起こっているが、トータルのＰＧＨＤは一定であることを示している。
【００９６】
−文献からのデータ−
ＡＤに罹った患者のＣＳＦ中で、ＰＧＨＤが減少することが見つかっている（Puchades
et al., Brain Res. Mol. Brain Res. 2003,118,140-146）。しかし、研究は２−ＤＥで行われ、かつ酸性スポットのみが分析された。死体からのＣＳＦに関する我々の結果では、分析したサンプル中で脱グリコシル化が起こっている可能性があり、結果、酸性スポットは消滅するがトータルの蛋白質量は変わらない。
【００９７】
毛管等電合焦法(capillary isoelectric focusing)を用いて、Hiraokaらがさまざまな神経疾患に関連してＣＳＦのＰＧＨＤが荷電微小不均一性(charge microheterogeneity)に変化が起こることを確認した（Hiraoka A et al.,Electrophoresis 2001,22,3433-3437）。ＡＤや病理的脳萎縮を伴うＰＤ、あるいは多硬化症で、塩基形／酸性形の比が増大することが見出された。このことから、これら遷移後変性(post tlanslational modification)がＮ−グリコシル化における変化とリンクしていることを示唆された。
【００９８】
−クロイツフェルト−ヤコブ病（ＣＪＤ）患者のＣＳＦにおけるＰＧＨＤ遷移後変性（ＰＴＭ）パターン−
ＣＪＤ患者と健康なコントロールから集めたＣＳＦサンプル内のＰＧＨＤのＰＴＭパタ
ーンを比較した。前述したように、蛋白質は２−ＤＥで分離され、ＰＶＤＦ膜状に電気ブロッティングされ、ＰＧＨＤが特異的抗体で検出された。ＣＳＦサンプルはランダムに集められた。コントロール患者は脳障害と関係の無いように、精密検査された。ＣＳＦサンプルは採取後直ちに遠心分離され、小分けされて分析するまで−２０℃で保存された。
【００９９】
図１７はその結果で、ミニ２−ＤＥのプロスタグランジンＤ２のスポット強度を、ヤコブ病患者のＣＳＦで調製したゲルと健康な患者のＣＳＦで調製したゲルとで比較したものである。４５μlの蛋白質がＩＰＧゲル上（ｐＨ３−１０、７ｃｍ）にセットされた。２次元目は、縦階調スラブゲル(vertical gradient slab gel)（１２％Ｔ）である。抗ヒトＰＧＨＤ（リポカリンタイプ）ウサギポリクロナール抗体（Cayman chemical, Ann Arbor, MI）とＥＣＬＴＭウェスタンブロット検出試薬（Amersham Biosciences, Uppsala, Sweden）を用いて免疫検出が行われた。
【０１００】
結果は、ＣＪＤ患者のＣＳＦ中のＰＧＨＤのＰＴＭパターンは、コントロールのものと明らかに異なっており、４つの殆どの酸性スポットが強い退行を示している（図１７）。ＣＪＴ患者のパターンは死んだＣＳＦのものと良く似ている。これらのデータは、ＰＧＨＤのＰＴＭパターンの変化の、神経疾患マーカーとしての関心を支持する。
【０１０１】
［実施例６］
この実施例は、卒中とコントロール患者における、ＵＦＤＰ１の血清レベルを示す追加のデータを示す。図１９は、コントロールと死んだ患者のＣＳＦにおけるＵＦＤＰ１のレベルを示す。追加データは、２つの患者とコントロールの群から得た、すなわち、ジュネーブのより小さい群とアメリカからはより広範囲からの群である。本例と、次の例７，８における分析手法は同じである、ただし、用いられる抗体の特異性は、問題とする蛋白質毎で異なっている。各検討の方法は例４で示したのと同様である。
【０１０２】
Black Plates(Pierce, Rockford, IL)をコートした９６ウェルのRiacti-Bind（登録商標） NeutrAvidin（登録商標）を用いてＥＬＩＳＡを行った。プレートは、まずNOVAPATH（登録商標） ウォッシャー（Bio-Rad, Hercules, CA）を使って、ホウ酸バッファ食塩水ｐＨ８．４（ＢＢS）（100ｍＭ H3BO3,25ｍＭ Na2B4O7(Sigma, St Louis, MO, USA)、75ｍＭ NaCl(Merk, Darmastadt, Germany)）中で洗浄された。次に、ｐＨ７希釈バッファＡで調製された、関連バイオマーカーに特異性のある抗体−ビオチン結合体（２μg/ｍＬ）５０μlを加え、３７℃下で１時間インキュベーションした。バッファＡの組成は；80％加水分解されたポリビニルアルコール、モル質量9,000-10,000(Aldrich, Milwaukee, WI,USA),MOPS(3-[N-モルホリノ]プロパンスルホン酸(Sigma),NaCl,MgCl2(Sigma),ZnCl2(Aldrich)，pH6.90,BSA30％Solution, Manufacturing Grade(Serological Proteins Inc.，Kankakee, IL)である。 次に、プレートをプレートウォッシャーでＢＢS中で３回洗浄した。抗原または血清を５０μl加え37℃下で１時間インキュベーションした。キャリブレーションカーブを取るため、組み換え型蛋白質抗原が希釈バッファＡで各々１００，５０，２５，１２．５，６．２５，３．１２５，１．５６ng/mlに希釈された。血清サンプルがバッファＡで適切な濃度に希釈される。更なる洗浄ステップ後、５０μlの関連バイオマーカーに特異性のあるアルカリホスハターゼ結合抗体が適切濃度でバッファＡに希釈され、３７℃で１時間インキュベートされた。９６ウェルのプレートはＢＢＳのプレートウォッシャーで３回洗浄され、５０μlの蛍光 Attophos（登録商標）AP Fluorescent Substrate
(Promega, Madison, WI)が加えられた。プレートは直ちにSpectraMax GEMINI-XS (Molecuar Devices Corporation, Sunnyvale，CA,U.S.A.)蛍光マイクロタイター(microtiter)プレートリーダーで読み取られた。
【０１０３】
プレートは、蛍光をSpectraMax GEMINI-XS(Molecuar Devices)蛍光マイクロタイタープレートリーダー(λexcitation=444 nm, λemission=555 nm)で読み取った。結果はＲＦＵ
ユニットに表示され、エンドポイントモード（一回だけの読み取り）か１０分の運動モードで読み取った。運動モードは、各ウェル６回のフラッシュを用い、それは平均され、それを各ウェル６回、最小の間隔で読んだ。その結果、読み取り間隔は２分であった。評価するためのスロープを決定した。GraphPad Prism 4 ソフトで、コントロールと卒中グループ間（虚血性プラス出血性、虚血性対出血性）のベストなカットオフ値をＲＯＣカーブによって決定した。
【０１０４】
結果を図２０に示す。
［実施例７］
本実施例は、ポリペプチドがＲＮＡ−ＢＰであることを除けば、例６に符合する。図２１は、コントロールと死体患者のＣＳＦ中のＲＮＡ−ＢＰレベルを示す。図２２は、それぞれ卒中患者とコントロールを含む３回の検討における、ＥＬＩＳＡによるＲＮＡ−ＢＰ血清中濃度を示す。
【０１０５】
［実施例８］
本例は、ポリペプチドがＮＤＫＡであることを除けば、例６に符合する。図２３は、コントロールと死体患者のＣＳＦ中のＮＤＫＡレベルを示す。図２４は、ジュネーブとアメリカの卒中患者およびコントロール群の、ＥＬＩＳＡによるＮＤＫＡ血清中濃度を示す。
【０１０６】
［実施例９］
各実施例６，７，８のデータからは、単なる卒中とコントロール間の識別に加えて、脳血管事故からサンプル採取までの時間の関係を分析することが出来る、または代替的に、虚血性、出血性、または一過性虚血性脳卒中（ＴＬＡ）という卒中のタイプに関連付けて分析することが出来る。それぞれの分析を図２５ａと図２５ｂに示す、また、卒中の診断において死んだＣＳＦのマーカーが有用であることが示されている。このことは、特に事故後３時間以内に卒中の診断を行いＴＰＡのような血栓除去薬を投与することが大切である臨床処置と関係する。また、テストは出血性と虚血性の卒中を識別出来ることが大切で、ＴＰＡは虚血性の処置に適しているが、出血性の卒中患者には破滅的な効果を与えてしまう可能性がある。
【０１０７】
［実施例１０］
各死んだＣＳＦマーカーが各々卒中診断に良い結果を示しているが、商品としては数種の蛋白質レベルの測定を要求される可能性がある。この「パネル」手法は２つの方法で行うことが出来る。より単純な方法としては、個別のマーカーに対する抗体が用意され、マイクロタイタープレートのウェルにコートされる。信号強度は各独立した強度の総和とすることが出来る。しかしこの場合、各マーカーの個別のレベルを決めることは出来ない。この方法で意味のあるカットオフ値を設定することは難題である。しかし、この方法はもっともユーザーフレンドリーな商品を提供する。
【０１０８】
図２６に本例で使用されたマーカーを要約した。実験結果を図２７に示す。死んだＣＳＦ蛋白質ＵＤＦ１，ＲＮＡ−ＢＰ，ＮＤＫＡ，Ｈ−ＦＡＢＰに対する各抗体は、例４のように同じ濃度で希釈された。しかし、これら抗体液は等量で混合され、上述した一つの検体標本中では最初の４分の１の濃度に希釈された。プロトコルは以下のようである。
【０１０９】
パネルアルゴリズムの問題を解決するために、直接混合した４つの抗体を各ウェル内で検査した。最初の抗体コートのステップで、各バイオマーカー特異性 ビオチン−抗体結合体を１ウェル当り１２．５μＬとした以外、プロトコルは各抗体に対して前述した（上記）のとまったく同じである。希釈バッファＡで初期濃度が１００、５０，２５．１２．５、６．２５、３．１２５ng/mlに調製された４つの組み換え型蛋白質抗原、ＵＤＦ１，ＲＮＡ−ＢＰ，ＮＤＫＡ，Ｈ−ＦＡＢＰを、キャリブレーションカーブを得るため同じプ
レート上のウェルに各々１２．５μl入れ、スタンダードカーブが同様に構築された。血清サンプルは各バイオマーカーに対すると同じように、同じ希釈、同じ容量（ウェル当り５０μl）用いられた。個別分析と同じ、バイオマーカー特異性 抗体−アルカリホスハターゼ結合体を用いて捕捉抗原の検出を行った、すなわち、スタンダード用および血清サンプル用の各ウェルに４つのバイオマーカー特異性抗体−アルカリホスハターゼ結合体が等量（１２．５μl）ずつ加えられた。蛍光の測定は、上記の例で示した単一のバイオマーカー分析で述べたように行われた。
【０１１０】
卒中１０とコントロール１０（年齢性別非合致）の２倍希釈血清サンプルがテストされた（図２７）。この試験では、感度１００％特異性８０％が得られた。２つの偽陽性サンプルは、患者のコントロール３６８，４５０に対応し、前立腺がんと脳障害候補を示す。
【０１１１】
この特異な例において、蛍光信号はアルカリホスハターゼ結合体を分析の検出サイドに使った各バイオマーカー特異性抗体によって発生した信号の総和に対応し、アルカリホスハターゼ結合体を分析の検出側に使った場合は全体の中で単一のバイオマーカーの相対的貢献を決めることは不可能である。本発明の一つの実施例としては、各バイオマーカー特異性抗体を励起放射波長が十分に異なる異なった蛍光団でラベリングすることが可能で、各抗体のレベルを干渉なしに検出できるということがある。この場合、一回のテストの一つのサンプルで４つまでの異なったバイオマーカーのレベルを正確に定量出来、サンプルの必要量の削減やスループットの向上をもたらす。
【０１１２】
［実施例１１］
ある環境下では、単一のウェルの中で多数検体のレベルを測定することが望ましくないかもしれない。例えば、ある特殊な診断をする場合に必要な個別蛋白質の絶対レベルとか、複数蛋白質間のレベル比などである。この状況では、各検体レベルを別々の分析で測定することが望ましいかもしれない。各患者ごとの特殊な診断に供するために、この多因子のデータセットを解釈するための予測アルゴリズムが用いられる。この例では、異なった多検体バイオマーカーパネルの理論的な性能を予測するため統計アルゴリズムを使用した。
【０１１３】
卒中の診断のため、上記さまざまな例で得られた個別のバイオマーカーレベルのデータセットを用いて、死んだＣＳＦ蛋白質ＵＤＦ１、ＲＮＡ−ＢＰ、ＮＤＫＡ、Ｈ−ＦＡＢＰの各組み合わせにおける真陽性および真陰性の比率を専用アルゴリズムを使用して求めた。分析のため、サンプルの群（ＵＤＦ１、ＲＮＡ−ＢＰ、ＮＤＫＡ、Ｈ−ＦＡＢＰに対し、１８コントロール、１８卒中）を員数ランダムの２つのグループに分けた。８０％のサンプルは、閾値トレーニング用として慎重に(by the technique of naive bayes)分析され、残りの２０％は１０００倍に希釈され、各マーカーおよびマーカーの組み合わせに対する閾値（感度と特異性）を評価するため用いられた。
【０１１４】
アルゴリズムが単一のマーカーに適用されたときは、感度および特異性は観察値と比較可能である。このデータセットの感度、特異性（カッコ内の数値）は、前述のＲＯＣカーブから決定された最適カットオフ値に基づいて計算されている。以下のデータの中で、カッコ内の最初の数値は標準偏差に該当する（例、０．９３±０．１５）。「１蛋白質」データの第２番目のカッコ内数値は、アルゴリズムを用いないで単純ＲＯＣカーブ（GraphPad Prism）を用いて得た感度（ＳＥ）および特異性（ＳＰ）に対応する。ＳＥ、ＳＰ値は、アルゴリズムありとなしの結果を比較するために示してある。
【０１１５】
アルゴリズム分析の結果は以下のようであった。
１蛋白質
トレーニングセットにおけるＵＦＤ１の真陽性比：0.93（0.15） （ＳＥ94％）
トレーニングセットにおけるＵＦＤ１の真陰性比：0.74（0.24） （ＳＰ78％）
トレーニングセットにおけるＲＮＡ−ＢＰの真陽性比：0.85（0.21）（ＳＥ94％）
トレーニングセットにおけるＲＮＡ−ＢＰの真陰性比：0.73（0.23）（ＳＰ72％）
トレーニングセットにおけるＨ−ＦＡＢＰの真陽性比：0.47（0.29）（ＳＥ39％）
トレーニングセットにおけるＲＮＡ−ＢＰの真陰性比：0.80（0.23）（ＳＰ100％）
トレーニングセットにおけるＮＤＫ Ａの真陽性比：0.79（0.16） （ＳＥ100％）
トレーニングセットにおけるＮＤＫ Ａの真陰性比：0.89（0.16） （ＳＰ83％）
２蛋白質
トレーニングセットにおけるＵＦＤ１/ＲＮＡ−ＢＰの真陽性比：0.90（0.17）
トレーニングセットにおけるＵＦＤ１/ＲＮＡ−ＢＰの真陰性比：0.69（0.25）
トレーニングセットにおけるＵＦＤ１/Ｈ−ＦＡＢＰの真陽性比：0.82（0.22）
トレーニングセットにおけるＵＦＤ１/Ｈ−ＦＡＢＰの真陰性比：0.83（0.20）
トレーニングセットにおけるＵＦＤ１/ＮＤＫ Ａの真陽性比：0.92（0.16）
トレーニングセットにおけるＵＦＤ１/ＮＤＫ Ａの真陰性比：0.79（0.21）
トレーニングセットにおけるＲＮＡ−ＢＰ/Ｈ−ＦＡＢＰの真陽性比：0.81（0.24）
トレーニングセットにおけるＲＮＡ−ＢＰ/Ｈ−ＦＡＢＰの真陰性比：0.73（0.24）
トレーニングセットにおけるＲＮＡ−ＢＰ/ＮＤＫ Ａの真陽性比：0.91（0.16）
トレーニングセットにおけるＲＮＡ−ＢＰ/ＮＤＫ Ａの真陰性比：0.83（0.21）
トレーニングセットにおけるＨ−ＦＡＢＰ/ＮＤＫ Ａの真陽性比：0.77（0.27）
トレーニングセットにおけるＨ−ＦＡＢＰ/ＮＤＫ Ａの真陰性比：0.84（0.20）
３蛋白質
トレーニングセットにおけるＲＮＡ−ＢＰ/ＮＤＫ Ａ/Ｈ−ＦＡＢＰの真陽性比：0.96（0.11）
トレーニングセットにおけるＲＮＡ−ＢＰ/ＮＤＫ Ａ/Ｈ−ＦＡＢＰの真陰性比：0.83（0.20）
トレーニングセットにおけるＵＦＤ１/ＮＤＫ Ａ/Ｈ−ＦＡＢＰの真陽性比：0.92（0.17）
トレーニングセットにおけるＵＦＤ１/ＮＤＫ Ａ/Ｈ−ＦＡＢＰの真陰性比：0.83（0.21）
トレーニングセットにおけるＵＦＤ１/ＲＮＡ−ＢＰ/ＮＤＫ Ａの真陽性比：0.95（0.14）
トレーニングセットにおけるＵＦＤ１/ＲＮＡ−ＢＰ/ＮＤＫ Ａの真陰性比：0.82（0.20）
トレーニングセットにおけるＵＦＤ１/ＲＮＡ−ＢＰ/Ｈ−ＦＡＢＰの真陽性比：0.93（0.15）
トレーニングセットにおけるＵＦＤ１/ＲＮＡ−ＢＰ/Ｈ−ＦＡＢＰの真陰性比：0.75（0.23）
４蛋白質
トレーニングセットにおけるＵＦＤ１/ＲＮＡ−ＢＰ/Ｈ−ＦＡＢＰ/ＮＤＫ Ａの真陽性比：0.93（0.13）
トレーニングセットにおけるＵＦＤ１/ＲＮＡ−ＢＰ/Ｈ−ＦＡＢＰ/ＮＤＫ Ａの真陰性比：0.73（0.23）
図２８は、本例で４つのバイオマーカーの内２つの組み合わせの場合を図示したものである。図には診断のために決定したカットオフポイント（縦、横の線）を示す。
【０１１６】
［実施例１２］
死後ＣＳＦマーカーであるＵＦＤ１，ＲＮＡ−ＢＰおよびＮＤＫ Ａに関して、ジュネーブおよびＵSＡでさらに大規模な研究を行った。サンプルは、上記の例で前述したようなＥＬＩＳＡを実施した（ジュネーブおよびＵSＡ双方の検査で）。結果を図２９〜３８に示す。
【０１１７】
参考文献
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【図面の簡単な説明】
【０１１８】
【図１】図１は、対照（コントロール）グループ、急性心筋梗塞（AMI）のグループ、急性卒中の３グループH-FABPの分析結果（縦軸はOD単位）である。
【図２】図２は、急性心筋梗塞患者のグループのH-FABPレベルを、卒中後異なった時間間隔で連続検知した結果である。
【図３】図３は、健全なＣＳＦと死後のＣＳＦに対する２−ＤＥマップの部分を示し、調製サブユニット結合ＲＮＡまたはDJ-1蛋白質に対応するスポットが上向きの矢印で示されている。健全なＣＳＦと死後のＣＳＦの２−ＤＥマップの拡大図が示されている。４５μｇの蛋白がIPGゲル（ｐｈ 3.5-10 NL, 18cm）上に載せられた。第２のディメンジョン（dimension）は、縦階調のスラブゲル(vertical gradient slab gel)（9-16% T）である。ゲルは銀染色されている。ＲＮＡ結合調節サブユニット(RNA binding regulatory subunit)またはDJ-1蛋白質に対応するスポットが上向きの矢印（赤）で示されている。
【図４】図４は、健全なＣＳＦと死後のＣＳＦに対する２−ＤＥマップの部分を示し、ペルオキシレドキシン５に対応するスポットが右側の矢印で示されている。健全なＣＳＦ死後のＣＳＦの２−ＤＥマップの拡大図が示されている。４５μｇの蛋白がIPGゲル（ｐｈ 3.5-10 NL, 18cm）上に載せられた。第2のディメンジョン（dimension）は、縦階調のスラブゲル(vertical gradient slab gel)（9-16% T）である。ゲルは銀染色されている。ペルオキシレドキシン５に対応するスポットが右側の矢印（赤）で示されている。
【図５】図５は、健全なＣＳＦと死後のＣＳＦに対する２−ＤＥマップの場所を示し、ペプチジル−プロリル・シス−トランス・イソメラーゼＡ（シクロフィリンＡ）に対応するスポットが右側2個の矢印で示されている。健全なＣＳＦと死後のＣＳＦの２−ＤＥマップの拡大図が示されている。４５μｇの蛋白がIPGゲル（ｐＨ 3.5-10 NL, 18cm）上に載せられた。第2のディメンジョン（dimension）は、縦階調のスラブゲル(vertical gradient slab gel)（9-16% T）である。ゲルは銀染色されている。ペプチジル−プロリル・シス−トランス・イソメラーゼＡ（シクロフィリンＡ）に対応するスポットが右側2個の矢印（赤）で示されている。
【図６】図６は、卒中患者の調査で得られたマーカーポリペプチドのＥＬＩＳＡ法の強度値を示す。
【図７】図７は、上記検査からの血清サンプル中のUFD1の検出を示す。
【図８】図８は、図７のデータからのUDF1のROCカーブを示す。
【図９】図９は、図７に対応するUDF1の検出を示す。
【図１０】図１０は、上記調査の血清サンプル中のRNA-BPの検出を示す。
【図１１】図１１は、図１０のデータからのRNA-BPのROCカーブを示す。
【図１２】図１２は、図１０に対応するRNA-BPの検出を示す。
【図１３】図１３は、上記調査からの血清サンプル中のNDK Aの検出を示す。
【図１４】図１４は、図１３のデータからのNDK AのROCカーブを示す。
【図１５】図１５は、図１３に対応するNDK Aの検出を示す。
【図１６】図１６は、プロスタグランジンＤシンターゼのレベルを表す、健全なＣＳＦと死後のＣＳＦに対する２−DEマップの場所を示す。
【図１７】図１７は、CJD患者からと、コントロールとして健康人から取ったＣＳＦで調製されたミニ２−DEゲル上でのプロスタグランジンＤシンターゼのスポット強度を示す。
【図１８】図１８は、卒中患者とコントロールグループのH-FABPに対するＥＬＩＳＡ法の強度値を示す。
【図１９】図１９は、コントロールおよび患者グループからのＣＳＦで調製されたミニ２−ＤＥゲル上でのUFDP-1のスポット強度を示す。
【図２０】図２０は、ジュネーブおよび米国の２集団の卒中患者のUFDP-1血清濃度をＥＬＩＳＡ法で測定したものを示す。
【図２１】図２１は、コントロールおよび疾患患者から得たＣＳＦで調製したミニ２−ＤＥゲル上のRNA-BPスポット強度を示す。
【図２２】図２２は、コントロールおよび卒中患者の３回の調査におけるRNA-BP血清濃度をＥＬＩＳＡ法で測定したものを示す。
【図２３】図２３は、コントロールおよび疾患患者から得たＣＳＦで調製したミニ２−ＤＥゲル上のNDK Aスポット強度を示す。
【図２４】図２４は、ジュネーブおよび米国の２集団の卒中患者のNDK A血清濃度をＥＬＩＳＡ法で測定したものを示す。
【図２５ａ】図２５ａは、発症時間と、UFDP1,RNA-BPおよびNDK Aの卒中マーカー（ＳＭ）濃度を示す。各々コントロール患者、脳血管事故から３時間以内の卒中患者、脳血管事故から３時間以降の卒中患者に対するものである。
【図２５ｂ】図２５ｂは、UFDP1,RNA-BPおよびNDK Aの卒中マーカー(ＳＭ)濃度を卒中タイプ別に示す。各々コントロール患者、出血性脳卒中患者、一過性虚血性脳卒中（TLA）患者、虚血性脳卒中患者に対するものである。
【図２６】図２６は、卒中用の血清用初期マーカーの集約情報を一覧にしたものである。
【図２７】図２７は、UFDP1,RNA-BP、NDK AおよびH-FABPを一つのウェルに混合した場合のＥＬＩＳＡ法の強度を示す。
【図２８】図２８は、図２７における４つのバイオマーカーのうち２つの組み合わせと、診断時のカットオフ値を示す。
【図２９Ａ】図２９Ａは、３７人の卒中患者と、年齢性別が一致するコントロール患者３７人の血清サンプルに関する追加検査の情報を示す。診断（Diag）は次のように表されている、すなわち、I（虚血性脳卒中）、H（出血性脳卒中）、TLA（一過性虚血性脳卒中）、ctl（コントロール）。UFDP1,RNA-BPおよびNDK AのＥＬＩＳＡ法による濃度が示されている。ＥＬＩＳＡ法は前述したように行われた。
【図２９Ｂ】図２９Ｂは、３７人の卒中患者と、年齢性別が一致するコントロール患者３７人の血清サンプルに関する追加検査の情報を示す。診断（Diag）は次のように表されている、すなわち、I（虚血性脳卒中）、H（出血性脳卒中）、TLA（一過性虚血性脳卒中）、ctl（コントロール）。UFDP1,RNA-BPおよびNDK AのＥＬＩＳＡ法による濃度が示されている。ＥＬＩＳＡ法は前述したように行われた。
【図３０】図３０は、ジュネーブでテストした中から３７人の卒中患者と３７人のコントロール患者の血清サンプルを使ったUDFA1に対する上記追加テストの結果を示す。また、米国―１（コントロール患者は年齢性別が一致していない）のUDFA1に対するデータである。
【図３１】図３１は、ジュネーブでテストした中から３７人の卒中患者と３７人のコントロール患者の血清サンプルを使ったRNA-BPに対する上記追加テストの結果を示す。また、米国―１（コントロール患者は年齢性別が一致していない）および米国―２（コントロール患者は年齢性別が一致している）のRNA-BPに対するデータである。
【図３２】図３２は、米国―３の６３３人の患者に関するPNA-BPの大規模検査の結果を示す。
【図３３】図３３は、米国―３のRNA-BPに関する統計分析（クラスカル-ウォリス法）を示す。
【図３４】図３４は、ジュネーブでテストした中から３３人の卒中患者と３３人のコントロール患者の血清サンプルを使ったNDKAに対する上記追加テストの結果を示す。また、米国―１（コントロール患者は年齢性別が一致していない）のNDKAに対するデータである。
【図３５】図３５は、米国―３の６２２人の患者に関するNDKAの大規模検査の結果を示す。
【図３６】図３６は、米国―3のNDKAに関する統計分析（クラスカル-ウォリス法）を示す。
【図３７】図３７は、発症時間に関する働きとしての卒中マーカー濃度を示す（ジュネーブデータ、新たな３７人の卒中患者と３７人のコントロール患者の血清サンプル）。
【図３８】図３８は、米国―１のデータを用いた、卒中タイプに関する働きとしての卒中マーカー濃度を示す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
脳障害関連疾患もしくはその可能性を、罹病していると疑われる対象において診断する方法であって、前記対象から取った体液サンプル中の、Ａ−ＦＡＢＰ、Ｅ−ＦＡＢＰ、Ｈ−ＦＡＢＰ、Ｂ−ＦＡＢＰ、ＰＧＰ９．５、ＧＦＡＰ、プロスタグランジンＤシンターゼ、ニューロモジュリン、ニューロフィラメントＬ、カルシフォシン、ＲＮＡ結合調節サブユニット、ユビキチン融合分解蛋白質１同族体、ヌクレオシドジホスファートキナーゼＡ、グルタチオンＳトランフェラーゼＰ、カテプシンＤ、ＤＪ−１蛋白質、ペルオキシレドキシン５、およびペプチジル−プロリル・シス−トランス・イソメラーゼＡ（シクロフィリンＡ）の中から選択される、少なくとも１つのポリペプチドまたはその変異体もしくは同族体を検出することを含む方法。
【請求項２】
前記ポリペプチドが脳障害関連疾患である対象の体液中と脳障害関連疾患でない対象の体液中に差異的に含まれ、また、前記サンプル中のポリペプチドの濃度が脳障害関連疾患と一貫性を持っているかを決定することを含む請求項１の方法。
【請求項３】
前記濃度の検出または決定にポリペプチドの抗体を用いる請求項１または２の方法。
【請求項４】
前記体液が、脳脊髄液、血漿、血清、血液、涙、尿、または唾液である請求項１から３の内いずれかの方法。
【請求項５】
前記ポリペプチドが脳障害関連疾患である対象の体液中に存在して、脳障害関連疾患でない対象の体液中には存在しない、そのため体液サンプル中のポリペプチドの存在が脳障害関連疾患の指標となる請求項１から４の内いずれかの方法。
【請求項６】
前記ポリペプチドが脳障害関連疾患である対象の体液中に存在しないで、脳障害関連疾患でない対象の体液中には存在する、そのため体液サンプル中のポリペプチドの非存在が脳障害関連疾患の指標となる請求項１から４の内いずれかの方法。
【請求項７】
前記サンプルの中に複数のペプチドが検出される請求項１から６の内いずれかの方法。
【請求項８】
脳障害関連疾患に冒された対象と脳障害関連疾患に冒されていない対象の体液中で、ポリペプチドの転移後の変性し易さが差異的であって、サンプル中のポリペプチドの転移後変性を検出し、それが脳障害関連疾患の診断と一致するかどうかを決定することを含む請求項１から７の内いずれかの方法。
【請求項９】
前記転移後変性が、Ｎ−グリコシル化を含む請求項８の方法。
【請求項１０】
前記脳障害関連疾患が卒中であって、前記ポリペプチドがユビキチン融合分解蛋白質１同族体である請求項１から９の内いずれかの方法。
【請求項１１】
前記脳障害関連疾患が卒中であって、前記ポリペプチドがＲＮＡ結合調節サブユニットである請求項１から９の内いずれかの方法。
【請求項１２】
前記脳障害関連疾患が卒中であって、前記ポリペプチドがヌクレオシドジホスファートキナーゼＡである請求項１から９の内いずれかの方法。
【請求項１３】
ユビキチン融合分解蛋白質１同族体、ＲＮＡ結合調節サブユニット、ヌクレオシドジホスファートキナーゼＡ、Ｈ−ＦＡＢＰに対する抗体のうち２個以上のマーカーを選択し、ＥＬＩＳＡマイクロプレートの一つのウェルに用いる請求項１０から１２の内いずれかの
方法。
【請求項１４】
一つのウェルに上記４つのマーカーをすべて用いる請求項１３の方法。
【請求項１５】
ユビキチン融合分解蛋白質１同族体、ＲＮＡ結合調節サブユニット、ヌクレオシドジホスファートキナーゼＡ、Ｈ−ＦＡＢＰから選択された２個以上のポリペプチドが個別に分析され、診断のために予測アルゴリズムを用いる請求項１０から１２の内いずれかの方法。
【請求項１６】
Ａ−ＦＡＢＰ、Ｅ−ＦＡＢＰ、Ｈ−ＦＡＢＰ、Ｂ−ＦＡＢＰ、ＰＧＰ９．５、ＧＦＡＰ、プロスタグランジンＤシンターゼ、ニューロモジュリン、ニューロフィラメントＬ、カルシフォシン、ＲＮＡ結合調節サブユニット、ユビキチン融合分解蛋白質１同族体、ヌクレオシドジホスファートキナーゼＡ、グルタチオンＳトランフェラーゼＰ、カテプシンＤ、ＤＪ−１蛋白質、ペルオキシレドキシン５、およびペプチジル−プロリル・シス−トランス・イソメラーゼＡ（シクロフィリンＡ）から選択されたポリペプチドまたはその変異体もしくは同族体、または上記ポリペプチドの組み合わせの、脳障害関連疾患に関連する診断、予後、および治療の応用への使用方法。
【請求項１７】
前記ポリペプチドが、脳障害関連疾患に冒されている対象の体液と脳障害関連疾患に冒されていない対象の体液とで差異的に含まれている請求項１６記載の使用方法。
【請求項１８】
Ａ−ＦＡＢＰ、Ｅ−ＦＡＢＰ、Ｈ−ＦＡＢＰ、Ｂ−ＦＡＢＰ、ＰＧＰ９．５、ＧＦＡＰ、プロスタグランジンＤシンターゼ、ニューロモジュリン、ニューロフィラメントＬ、カルシフォシン、ＲＮＡ結合調節サブユニット、ユビキチン融合分解蛋白質１同族体、ヌクレオシドジホスファートキナーゼＡ、グルタチオンＳトランフェラーゼＰ、カテプシンＤ、ＤＪ−１蛋白質、ペルオキシレドキシン５、およびペプチジル−プロリル・シス−トランス・イソメラーゼＡ（シクロフィリンＡ）から選択されたポリペプチドまたはその変異体もしくは同族体を認識する、またはそれに結合する、またはそれと親和性のある物質の、脳障害関連疾患に関する診断、予後、および治療の応用への使用方法。
【請求項１９】
Ａ−ＦＡＢＰ、Ｅ−ＦＡＢＰ、Ｈ−ＦＡＢＰ、Ｂ−ＦＡＢＰ、ＰＧＰ９．５、ＧＦＡＰ、プロスタグランジンＤシンターゼ、ニューロモジュリン、ニューロフィラメントＬ、カルシフォシン、ＲＮＡ結合調節サブユニット、ユビキチン融合分解蛋白質１同族体、ヌクレオシドジホスファートキナーゼＡ、グルタチオンＳトランフェラーゼＰ、カテプシンＤ、ＤＪ−１蛋白質、ペルオキシレドキシン５、およびペプチジル−プロリル・シス−トランス・イソメラーゼＡ（シクロフィリンＡ）から選択されたポリペプチドまたはその変異体もしくは同族体を認識する、またはそれに結合する、またはそれと親和性のある物質の組み合わせを用いる請求項１８記載の使用方法。
【請求項２０】
前記物質が、抗体または抗体片である請求項１８または１９記載の使用方法。
【請求項２１】
前記物質が、Ａ−ＦＡＢＰに対する抗体である請求項２０記載の使用方法。
【請求項２２】
前記物質が、Ｅ−ＦＡＢＰに対する抗体である請求項２０記載の使用方法。
【請求項２３】
前記物質が、ＰＧＰ９．５に対する抗体である請求項２０記載の使用方法。
【請求項２４】
前記物質が、ＧＦＡＰに対する抗体である請求項２０記載の使用方法。
【請求項２５】
前記物質が、プロスタグランジンＤシンターゼに対する抗体である請求項２０記載の使
用方法。
【請求項２６】
前記物質が、ニューロモジュリンに対する抗体である請求項２０記載の使用方法。
【請求項２７】
前記物質が、ニューロフィラメントＬに対する抗体である請求項２０記載の使用方法。
【請求項２８】
前記物質が、カルシフォシンに対する抗体である請求項２０記載の使用方法。
【請求項２９】
前記物質が、ＲＮＡ結合調節サブユニットに対する抗体である請求項２０記載の使用方法。
【請求項３０】
前記物質が、ユビキチン融合分解蛋白質１同族体に対する抗体である請求項２０記載の使用方法。
【請求項３１】
前記物質が、ヌクレオシドジホスファートキナーゼＡに対する抗体である請求項２０記載の使用方法。
【請求項３２】
前記物質が、グルタチオンＳトランフェラーゼＰに対する抗体である請求項２０記載の使用方法。
【請求項３３】
前記物質が、カテプシンＤに対する抗体である請求項２０記載の使用方法。
【請求項３４】
前記物質が、ＤＪ−１蛋白質に対する抗体である請求項２０記載の使用方法。
【請求項３５】
前記物質が、ペルオキシレドキシン５に対する抗体である請求項２０記載の使用方法。
【請求項３６】
前記物質が、ペプチジル−プロリル・シス−トランス・イソメラーゼＡ（シクロフィリンＡ）に対する抗体である請求項２０記載の使用方法。
【請求項３７】
脳障害関連疾患の診断に用いられる分析装置であって、Ａ−ＦＡＢＰ、Ｅ−ＦＡＢＰ、Ｈ−ＦＡＢＰ、Ｂ−ＦＡＢＰ、ＰＧＰ９．５、ＧＦＡＰ、プロスタグランジンＤシンターゼ、ニューロモジュリン、ニューロフィラメントＬ、カルシフォシン、ＲＮＡ結合調節サブユニット、ユビキチン融合分解蛋白質１同族体、ヌクレオシドジホスファートキナーゼＡ、グルタチオンＳトランフェラーゼＰ、カテプシンＤ、ＤＪ−１蛋白質、ペルオキシレドキシン５、およびペプチジル−プロリル・シス−トランス・イソメラーゼＡ（シクロフィリンＡ）から選択されたポリペプチドまたはその変異体もしくは同族体を認識する、またはそれに結合する、またはそれと親和性のある物質を含んだ場所を持つ固形基板を含む分析装置。
【請求項３８】
前記固形基板が、Ａ−ＦＡＢＰ、Ｅ−ＦＡＢＰ、Ｈ−ＦＡＢＰ、Ｂ−ＦＡＢＰ，ＰＧＰ９．５、ＧＦＡＰ、プロスタグランジンＤシンターゼ、ニューロモジュリン、ニューロフィラメントＬ、カルシフォシン、ＲＮＡ結合調節サブユニット、ユビキチン融合分解蛋白質１同族体、ヌクレオシドジホスファートキナーゼＡ、グルタチオンＳトランフェラーゼＰ、カテプシンＤ、ＤＪ−１蛋白質、ペルオキシレドキシン５、およびペプチジル−プロリル・シス−トランス・イソメラーゼＡ（シクロフィリンＡ）から選択されたポリペプチドまたはその変異体もしくは同族体を認識する、またはそれに結合する、またはそれと親和性のある物質を各々含む複数の場所を有する請求項３７記載の分析装置。
【請求項３９】
前記物質が抗体または抗体片である請求項３７または３８記載の分析装置。
【請求項４０】
前記各抗体が特徴的に配置され、各ポリペプチド、または、どんなポリペプチドの組み合わせでも読み取りができる請求項３９記載の分析装置。
【請求項４１】
Ａ−ＦＡＢＰに対する抗体を含む請求項３７から４０の内いずれか記載の分析装置。
【請求項４２】
Ｅ−ＦＡＢＰに対する抗体を含む請求項３７から４０の内いずれか記載の分析装置。
【請求項４３】
ＰＧＰ９．５に対する抗体を含む請求項３７から４０の内いずれか記載の分析装置。
【請求項４４】
ＧＦＡＰに対する抗体を含む請求項３７から４０の内いずれか記載の分析装置。
【請求項４５】
プロスタグランジンＤシンターゼに対する抗体を含む請求項３７から４０の内いずれか記載の分析装置。
【請求項４６】
ニューロモジュリンに対する抗体を含む請求項３７から４０の内いずれか記載の分析装置。
【請求項４７】
ニューロフィラメントＬに対する抗体を含む請求項３７から４０の内いずれか記載の分析装置。
【請求項４８】
カルシフォシンに対する抗体を含む請求項３７から４０の内いずれか記載の分析装置。
【請求項４９】
ＲＮＡ結合調節サブユニットに対する抗体を含む請求項３７から４０の内いずれか記載の分析装置。
【請求項５０】
ユビキチン融合分解蛋白質１同族体に対する抗体を含む請求項３７から４０の内いずれか記載の分析装置。
【請求項５１】
ヌクレオシドジホスファートキナーゼＡに対する抗体を含む請求項３７から４０の内いずれか記載の分析装置。
【請求項５２】
グルタチオンＳトランフェラーゼＰに対する抗体を含む請求項３７から４０の内いずれか記載の分析装置。
【請求項５３】
カテプシンＤに対する抗体を含む請求項３７から４０の内いずれか記載の分析装置。
【請求項５４】
ＤＪ−１蛋白質に対する抗体を含む請求項３７から４０の内いずれか記載の分析装置。
【請求項５５】
ペルオキシレドキシン５に対する抗体を含む請求項３７から４０の内いずれか記載の分析装置。
【請求項５６】
ペプチジル−プロリル・シス−トランス・イソメラーゼＡ（シクロフィリンＡ）に対する抗体を含む請求項３７から４０の内いずれか記載の分析装置。
【請求項５７】
請求項３７から５６記載のいずれかの分析装置と、対象から採取した体液サンプル中の一つ以上のポリペプチドの量を検出する手段とを含む、脳障害関連疾患診断に用いるキット。
【請求項１】
脳障害関連疾患もしくはその可能性を、罹病していると疑われる対象において診断する方法であって、前記対象から取った体液サンプル中の、Ａ−ＦＡＢＰ、Ｅ−ＦＡＢＰ、Ｈ−ＦＡＢＰ、Ｂ−ＦＡＢＰ、ＰＧＰ９．５、ＧＦＡＰ、プロスタグランジンＤシンターゼ、ニューロモジュリン、ニューロフィラメントＬ、カルシフォシン、ＲＮＡ結合調節サブユニット、ユビキチン融合分解蛋白質１同族体、ヌクレオシドジホスファートキナーゼＡ、グルタチオンＳトランフェラーゼＰ、カテプシンＤ、ＤＪ−１蛋白質、ペルオキシレドキシン５、およびペプチジル−プロリル・シス−トランス・イソメラーゼＡ（シクロフィリンＡ）の中から選択される、少なくとも１つのポリペプチドまたはその変異体もしくは同族体を検出することを含む方法。
【請求項２】
前記ポリペプチドが脳障害関連疾患である対象の体液中と脳障害関連疾患でない対象の体液中に差異的に含まれ、また、前記サンプル中のポリペプチドの濃度が脳障害関連疾患と一貫性を持っているかを決定することを含む請求項１の方法。
【請求項３】
前記濃度の検出または決定にポリペプチドの抗体を用いる請求項１または２の方法。
【請求項４】
前記体液が、脳脊髄液、血漿、血清、血液、涙、尿、または唾液である請求項１から３の内いずれかの方法。
【請求項５】
前記ポリペプチドが脳障害関連疾患である対象の体液中に存在して、脳障害関連疾患でない対象の体液中には存在しない、そのため体液サンプル中のポリペプチドの存在が脳障害関連疾患の指標となる請求項１から４の内いずれかの方法。
【請求項６】
前記ポリペプチドが脳障害関連疾患である対象の体液中に存在しないで、脳障害関連疾患でない対象の体液中には存在する、そのため体液サンプル中のポリペプチドの非存在が脳障害関連疾患の指標となる請求項１から４の内いずれかの方法。
【請求項７】
前記サンプルの中に複数のペプチドが検出される請求項１から６の内いずれかの方法。
【請求項８】
脳障害関連疾患に冒された対象と脳障害関連疾患に冒されていない対象の体液中で、ポリペプチドの転移後の変性し易さが差異的であって、サンプル中のポリペプチドの転移後変性を検出し、それが脳障害関連疾患の診断と一致するかどうかを決定することを含む請求項１から７の内いずれかの方法。
【請求項９】
前記転移後変性が、Ｎ−グリコシル化を含む請求項８の方法。
【請求項１０】
前記脳障害関連疾患が卒中であって、前記ポリペプチドがユビキチン融合分解蛋白質１同族体である請求項１から９の内いずれかの方法。
【請求項１１】
前記脳障害関連疾患が卒中であって、前記ポリペプチドがＲＮＡ結合調節サブユニットである請求項１から９の内いずれかの方法。
【請求項１２】
前記脳障害関連疾患が卒中であって、前記ポリペプチドがヌクレオシドジホスファートキナーゼＡである請求項１から９の内いずれかの方法。
【請求項１３】
ユビキチン融合分解蛋白質１同族体、ＲＮＡ結合調節サブユニット、ヌクレオシドジホスファートキナーゼＡ、Ｈ−ＦＡＢＰに対する抗体のうち２個以上のマーカーを選択し、ＥＬＩＳＡマイクロプレートの一つのウェルに用いる請求項１０から１２の内いずれかの
方法。
【請求項１４】
一つのウェルに上記４つのマーカーをすべて用いる請求項１３の方法。
【請求項１５】
ユビキチン融合分解蛋白質１同族体、ＲＮＡ結合調節サブユニット、ヌクレオシドジホスファートキナーゼＡ、Ｈ−ＦＡＢＰから選択された２個以上のポリペプチドが個別に分析され、診断のために予測アルゴリズムを用いる請求項１０から１２の内いずれかの方法。
【請求項１６】
Ａ−ＦＡＢＰ、Ｅ−ＦＡＢＰ、Ｈ−ＦＡＢＰ、Ｂ−ＦＡＢＰ、ＰＧＰ９．５、ＧＦＡＰ、プロスタグランジンＤシンターゼ、ニューロモジュリン、ニューロフィラメントＬ、カルシフォシン、ＲＮＡ結合調節サブユニット、ユビキチン融合分解蛋白質１同族体、ヌクレオシドジホスファートキナーゼＡ、グルタチオンＳトランフェラーゼＰ、カテプシンＤ、ＤＪ−１蛋白質、ペルオキシレドキシン５、およびペプチジル−プロリル・シス−トランス・イソメラーゼＡ（シクロフィリンＡ）から選択されたポリペプチドまたはその変異体もしくは同族体、または上記ポリペプチドの組み合わせの、脳障害関連疾患に関連する診断、予後、および治療の応用への使用方法。
【請求項１７】
前記ポリペプチドが、脳障害関連疾患に冒されている対象の体液と脳障害関連疾患に冒されていない対象の体液とで差異的に含まれている請求項１６記載の使用方法。
【請求項１８】
Ａ−ＦＡＢＰ、Ｅ−ＦＡＢＰ、Ｈ−ＦＡＢＰ、Ｂ−ＦＡＢＰ、ＰＧＰ９．５、ＧＦＡＰ、プロスタグランジンＤシンターゼ、ニューロモジュリン、ニューロフィラメントＬ、カルシフォシン、ＲＮＡ結合調節サブユニット、ユビキチン融合分解蛋白質１同族体、ヌクレオシドジホスファートキナーゼＡ、グルタチオンＳトランフェラーゼＰ、カテプシンＤ、ＤＪ−１蛋白質、ペルオキシレドキシン５、およびペプチジル−プロリル・シス−トランス・イソメラーゼＡ（シクロフィリンＡ）から選択されたポリペプチドまたはその変異体もしくは同族体を認識する、またはそれに結合する、またはそれと親和性のある物質の、脳障害関連疾患に関する診断、予後、および治療の応用への使用方法。
【請求項１９】
Ａ−ＦＡＢＰ、Ｅ−ＦＡＢＰ、Ｈ−ＦＡＢＰ、Ｂ−ＦＡＢＰ、ＰＧＰ９．５、ＧＦＡＰ、プロスタグランジンＤシンターゼ、ニューロモジュリン、ニューロフィラメントＬ、カルシフォシン、ＲＮＡ結合調節サブユニット、ユビキチン融合分解蛋白質１同族体、ヌクレオシドジホスファートキナーゼＡ、グルタチオンＳトランフェラーゼＰ、カテプシンＤ、ＤＪ−１蛋白質、ペルオキシレドキシン５、およびペプチジル−プロリル・シス−トランス・イソメラーゼＡ（シクロフィリンＡ）から選択されたポリペプチドまたはその変異体もしくは同族体を認識する、またはそれに結合する、またはそれと親和性のある物質の組み合わせを用いる請求項１８記載の使用方法。
【請求項２０】
前記物質が、抗体または抗体片である請求項１８または１９記載の使用方法。
【請求項２１】
前記物質が、Ａ−ＦＡＢＰに対する抗体である請求項２０記載の使用方法。
【請求項２２】
前記物質が、Ｅ−ＦＡＢＰに対する抗体である請求項２０記載の使用方法。
【請求項２３】
前記物質が、ＰＧＰ９．５に対する抗体である請求項２０記載の使用方法。
【請求項２４】
前記物質が、ＧＦＡＰに対する抗体である請求項２０記載の使用方法。
【請求項２５】
前記物質が、プロスタグランジンＤシンターゼに対する抗体である請求項２０記載の使
用方法。
【請求項２６】
前記物質が、ニューロモジュリンに対する抗体である請求項２０記載の使用方法。
【請求項２７】
前記物質が、ニューロフィラメントＬに対する抗体である請求項２０記載の使用方法。
【請求項２８】
前記物質が、カルシフォシンに対する抗体である請求項２０記載の使用方法。
【請求項２９】
前記物質が、ＲＮＡ結合調節サブユニットに対する抗体である請求項２０記載の使用方法。
【請求項３０】
前記物質が、ユビキチン融合分解蛋白質１同族体に対する抗体である請求項２０記載の使用方法。
【請求項３１】
前記物質が、ヌクレオシドジホスファートキナーゼＡに対する抗体である請求項２０記載の使用方法。
【請求項３２】
前記物質が、グルタチオンＳトランフェラーゼＰに対する抗体である請求項２０記載の使用方法。
【請求項３３】
前記物質が、カテプシンＤに対する抗体である請求項２０記載の使用方法。
【請求項３４】
前記物質が、ＤＪ−１蛋白質に対する抗体である請求項２０記載の使用方法。
【請求項３５】
前記物質が、ペルオキシレドキシン５に対する抗体である請求項２０記載の使用方法。
【請求項３６】
前記物質が、ペプチジル−プロリル・シス−トランス・イソメラーゼＡ（シクロフィリンＡ）に対する抗体である請求項２０記載の使用方法。
【請求項３７】
脳障害関連疾患の診断に用いられる分析装置であって、Ａ−ＦＡＢＰ、Ｅ−ＦＡＢＰ、Ｈ−ＦＡＢＰ、Ｂ−ＦＡＢＰ、ＰＧＰ９．５、ＧＦＡＰ、プロスタグランジンＤシンターゼ、ニューロモジュリン、ニューロフィラメントＬ、カルシフォシン、ＲＮＡ結合調節サブユニット、ユビキチン融合分解蛋白質１同族体、ヌクレオシドジホスファートキナーゼＡ、グルタチオンＳトランフェラーゼＰ、カテプシンＤ、ＤＪ−１蛋白質、ペルオキシレドキシン５、およびペプチジル−プロリル・シス−トランス・イソメラーゼＡ（シクロフィリンＡ）から選択されたポリペプチドまたはその変異体もしくは同族体を認識する、またはそれに結合する、またはそれと親和性のある物質を含んだ場所を持つ固形基板を含む分析装置。
【請求項３８】
前記固形基板が、Ａ−ＦＡＢＰ、Ｅ−ＦＡＢＰ、Ｈ−ＦＡＢＰ、Ｂ−ＦＡＢＰ，ＰＧＰ９．５、ＧＦＡＰ、プロスタグランジンＤシンターゼ、ニューロモジュリン、ニューロフィラメントＬ、カルシフォシン、ＲＮＡ結合調節サブユニット、ユビキチン融合分解蛋白質１同族体、ヌクレオシドジホスファートキナーゼＡ、グルタチオンＳトランフェラーゼＰ、カテプシンＤ、ＤＪ−１蛋白質、ペルオキシレドキシン５、およびペプチジル−プロリル・シス−トランス・イソメラーゼＡ（シクロフィリンＡ）から選択されたポリペプチドまたはその変異体もしくは同族体を認識する、またはそれに結合する、またはそれと親和性のある物質を各々含む複数の場所を有する請求項３７記載の分析装置。
【請求項３９】
前記物質が抗体または抗体片である請求項３７または３８記載の分析装置。
【請求項４０】
前記各抗体が特徴的に配置され、各ポリペプチド、または、どんなポリペプチドの組み合わせでも読み取りができる請求項３９記載の分析装置。
【請求項４１】
Ａ−ＦＡＢＰに対する抗体を含む請求項３７から４０の内いずれか記載の分析装置。
【請求項４２】
Ｅ−ＦＡＢＰに対する抗体を含む請求項３７から４０の内いずれか記載の分析装置。
【請求項４３】
ＰＧＰ９．５に対する抗体を含む請求項３７から４０の内いずれか記載の分析装置。
【請求項４４】
ＧＦＡＰに対する抗体を含む請求項３７から４０の内いずれか記載の分析装置。
【請求項４５】
プロスタグランジンＤシンターゼに対する抗体を含む請求項３７から４０の内いずれか記載の分析装置。
【請求項４６】
ニューロモジュリンに対する抗体を含む請求項３７から４０の内いずれか記載の分析装置。
【請求項４７】
ニューロフィラメントＬに対する抗体を含む請求項３７から４０の内いずれか記載の分析装置。
【請求項４８】
カルシフォシンに対する抗体を含む請求項３７から４０の内いずれか記載の分析装置。
【請求項４９】
ＲＮＡ結合調節サブユニットに対する抗体を含む請求項３７から４０の内いずれか記載の分析装置。
【請求項５０】
ユビキチン融合分解蛋白質１同族体に対する抗体を含む請求項３７から４０の内いずれか記載の分析装置。
【請求項５１】
ヌクレオシドジホスファートキナーゼＡに対する抗体を含む請求項３７から４０の内いずれか記載の分析装置。
【請求項５２】
グルタチオンＳトランフェラーゼＰに対する抗体を含む請求項３７から４０の内いずれか記載の分析装置。
【請求項５３】
カテプシンＤに対する抗体を含む請求項３７から４０の内いずれか記載の分析装置。
【請求項５４】
ＤＪ−１蛋白質に対する抗体を含む請求項３７から４０の内いずれか記載の分析装置。
【請求項５５】
ペルオキシレドキシン５に対する抗体を含む請求項３７から４０の内いずれか記載の分析装置。
【請求項５６】
ペプチジル−プロリル・シス−トランス・イソメラーゼＡ（シクロフィリンＡ）に対する抗体を含む請求項３７から４０の内いずれか記載の分析装置。
【請求項５７】
請求項３７から５６記載のいずれかの分析装置と、対象から採取した体液サンプル中の一つ以上のポリペプチドの量を検出する手段とを含む、脳障害関連疾患診断に用いるキット。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図２３】
【図２４】
【図２５ａ】
【図２５ｂ】
【図２６】
【図２７】
【図２８】
【図２９Ａ】
【図２９Ｂ】
【図３０】
【図３１】
【図３２】
【図３３】
【図３４】
【図３５】
【図３６】
【図３７】
【図３８】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図２３】
【図２４】
【図２５ａ】
【図２５ｂ】
【図２６】
【図２７】
【図２８】
【図２９Ａ】
【図２９Ｂ】
【図３０】
【図３１】
【図３２】
【図３３】
【図３４】
【図３５】
【図３６】
【図３７】
【図３８】
【公表番号】特表２００７−５０６０８６（Ｐ２００７−５０６０８６Ａ）
【公表日】平成１９年３月１５日（２００７．３．１５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−５２６７０４（Ｐ２００６−５２６７０４）
【出願日】平成１６年９月２０日（２００４．９．２０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＧＢ２００４／０５００１２
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０２９０８８
【国際公開日】平成１７年３月３１日（２００５．３．３１）
【出願人】（５０６０４９６５５）エレクトロフォレティックス リミテッド (4)
【氏名又は名称原語表記】ＥＬＥＣＴＲＯＰＨＯＲＥＴＩＣＳ ＬＩＭＩＴＥＤ
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１９年３月１５日（２００７．３．１５）
【国際特許分類】
【出願日】平成１６年９月２０日（２００４．９．２０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＧＢ２００４／０５００１２
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０２９０８８
【国際公開日】平成１７年３月３１日（２００５．３．３１）
【出願人】（５０６０４９６５５）エレクトロフォレティックス リミテッド (4)
【氏名又は名称原語表記】ＥＬＥＣＴＲＯＰＨＯＲＥＴＩＣＳ ＬＩＭＩＴＥＤ
【Ｆターム（参考）】
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