腎癌の診断薬および治療薬
【課題】腎癌の診断薬および治療薬の提供。
【解決手段】抗ＴＬＲ３抗体を含有する腎癌診断薬、およびＴＬＲ３アゴニストを有効成分とする腎癌治療薬を提供する。
【解決手段】抗ＴＬＲ３抗体を含有する腎癌診断薬、およびＴＬＲ３アゴニストを有効成分とする腎癌治療薬を提供する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗ＴＬＲ３抗体を利用した腎癌の診断薬およびＴＬＲ３アゴニストを利用した腎癌の治療薬に関する。
【背景技術】
【０００２】
腎細胞癌（ｒｅｎａｌ ｃｅｌｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ；ＲＣＣ）は成人悪性腫瘍の２−３％を占め、日本およびアメリカでは罹患率・死亡率ともに増加傾向にある（非特許文献１，２）。腎細胞癌の主な組織型としては、（１）Ｃｌｅａｒ ｃｅｌｌ ＲＣＣ（約８０％）、（２）Ｐａｐｉｌｌａｒｙ ＲＣＣ（１０−１５％）、（３）Ｃｈｒｏｍｏｐｈｏｂｅ ＲＣＣ（約５％）、（４）Ｃｏｌｌｅｃｔｉｎｇ ｄｕｃｔ ｃａｒｃｉｎｏｍａ（約１％）がある（非特許文献３）。また、分化が悪くなり癌細胞が肉腫様に変化するｓａｒｃｏｍａｔｏｉｄ ｃｈａｎｇｅは全ての組織型に伴いうる。
【０００３】
腎癌に対しては、画像検査技術の進歩により早期発見症例が増えた反面、いまだに遠隔転移を有する症例が減っていないのが現状である。すなわち、腎癌については、発見の遅滞あるいは従来適切な治療法が無かったことを意味する。従って、腎癌の簡便かつ的確な早期発見技術および有効な治療法の開発が望まれている。近年多くの癌種において癌特異的に発現されているタンパク質をターゲットとした、診断方法および治療方法の研究が盛んであるが、多くは遺伝子レベルでの解析に止まり、進展していないのが現状である。
【０００４】
腎細胞癌の現状での治療法としては早期外科的切除が有効とされているが、根治的切除不能例や再発例のような進行性腎細胞癌には、有効な治療法がない。すなわち、これら進行性腎細胞癌に対する治療としては、他の癌腫で通常行われる化学療法や放射線療法はほとんど効果を示さないとされている（非特許文献４，５）。その反面、一部の症例に対してインターフェロンα（ＩＦＮα）やインターロイキン２といった免疫療法が奏効することが腎細胞癌の特徴であり、日本では進行性腎細胞癌の治療には広くＩＦＮαが用いられている。しかし、進行性腎細胞癌症例に対するＩＦＮαの奏功率は１０−２０％程度に過ぎない（非特許文献６，７）。ゆえに、進行性腎細胞癌に対する有効な治療法の開発が望まれている。
【０００５】
ｔｏｌｌ−ｌｉｋｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＴＬＲ）は、病原体からの刺激に対して自然免疫担当細胞を活性化させることで感染防御に働く分子である。ＴＬＲは現在までに１３種類が知られており（ヒトでは１０種類）、その大部分はリガンドが同定されており（非特許文献８）、それらには細菌細胞壁成分であるＬＰＳ、リポタイコ酸、ペプチドグリカン、細菌鞭毛成分フラジェリン、細菌あるいはウイルス由来ＣｐＧ ＤＮＡ、ウイルス由来1本鎖ＲＮＡ、ウイルス由来２本鎖ＲＮＡ、ウイルス由来タンパク質がある。多くのＴＬＲｓはリガンド結合後アダプター分子であるＭｙＤ８８依存的な経路を介して転写因子ＮＦ−κＢを核に移行させることでサイトカインであるＴＮＦＩαやＩＬ−６と同様な炎症性作用を示すことにより、病原体の侵入に対して感染防御に働くことにその主な役割があると従来考えられていた。しかし、ある種のＴＬＲは癌細胞にも発現しており、ＴＬＲが癌細胞の増殖に有利な環境を作り出しているということも最近になって考えられるようになってきている（非特許文献９）。その一方で、ＴＬＲアゴニストが癌の治療に用いられる可能性も考えられる（非特許文献１０）。いわばＴＬＲは癌にとって有利にも不利にも働きうる、「諸刃の剣」的な存在と言える（非特許文献１１）。
【０００６】
ＴＬＲ３は、１９９８年のＲｏｃｋ，Ｆ．Ｌ．による発見後（非特許文献１２）、多くの文献が報告され、自然免疫に関与することが明らかにされた。すなわち、ＴＬＲ３は他のＴＬＲｓとは異なり、ウイルスが産生する二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）がリガンドであり、リガンド結合後ＭｙＤ８８非依存的なＴＲＩＦ経路で、ＩＦＮの産生を誘導することにより抗ウイルス作用を発揮することおよびＮＦκＢの活性化が知られている（非特許文献１３）。
【０００７】
ＴＬＲ３が自然免疫に関与することから、炎症および癌に応用可能との推論のもと、医療に関与する文献が多数報告されている（特許文献１〜４）。それらは、ＴＬＲ３の生理機能としてのＩＦＮ−β、ＩＦＮ誘導性遺伝子群および炎症性サイトカインへの影響を想定したアンタゴニストまたはアゴニスト作用を示す特許文献である。
【０００８】
ＴＬＲ３の発現は、細胞としては樹状細胞、線維芽細胞、腸上皮細胞、グリア細胞、臍帯静脈血管内皮細胞に、正常組織では子宮内膜、腎臓、癌組織では大腸癌（特許文献５）および腎臓癌（非特許文献１４）組織においてＴＬＲ３が高発現していることが示されている。しかしながら、特許文献５および非特許文献１４はマイクロアレイによる遺伝子発現解析のみであり、タンパク質発現については明らかにされていない。
【０００９】
ＴＬＲ３と癌の診断および治療に関する文献として、特許文献５で乳癌、大腸癌、肺癌、胃癌、前立腺癌、子宮癌、子宮頸部癌、子宮内膜癌、皮膚癌、および白血病に対する、抗体による診断と治療が特許請求の範囲に記載されているが、大腸癌における結果を示しているに過ぎず、腎癌に対する実施例はない。さらに、特許文献４においては、腎癌を含む多種類の癌の抗ＴＬＲ３抗体による診断・治療が特許請求の範囲に記載されているが、乳癌について記載されているだけで、腎癌に関する実施例は全くない。
【非特許文献１】Ｉｎｔ Ｊ Ｕｒｏｌ．２００１；８：３５９−６５
【非特許文献２】ＪＡＭＡ．１９９９；２８１：１６２８−３１
【非特許文献３】Ｊ Ｐａｔｈｏｌ．１９９７；１８３：１３１−３
【非特許文献４】Ｊ Ｕｒｏｌ．２０００；１６３：４０８−１７
【非特許文献５】Ｌａｎｃｅｔ．１９９８；３５２：１６９１−６
【非特許文献６】Ｊ Ｕｒｏｌ．１９９９；１６１：３８１−７
【非特許文献７】Ｌａｎｃｅｔ．１９９９；３５３：１４−７
【非特許文献８】Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００４；４：４９９−５１
【非特許文献９】Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２００５；６５：５００９−１４
【非特許文献１０】Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ．２００６；５：４７１−８４
【非特許文献１１】Ｂｒ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ．２００６；９５：２４７−５２
【非特許文献１２】Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．１９９８；９５：５８８−５９３
【非特許文献１３】Ｎａｔｕｒｅ．２００１；４１３：７３２−８
【非特許文献１４】ＢＭＣ Ｃａｎｃｅｒ．２００３；３：１−１９
【特許文献１】国際公開第２００６／０６０５１３号パンフレット
【特許文献２】米国特許出願公開第２００６０１４７４５６号明細書
【特許文献３】米国特許出願公開第２００６０１１５４７５号明細書
【特許文献４】国際公開第２００６／０５４１７７号パンフレット
【特許文献５】国際公開第２００５／０２６７３５号パンフレット
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
腎癌の治療としては早期外科的切除が有効とされているが、手術による治療は、転移巣の治療が困難であるばかりなく、侵襲と合併症の併発を伴うことが多い。根本的切除不能例や再発例のような進行性癌には、有効な治療法がないゆえに、初期の腎癌を早期に診断する必要がある。従って、腎癌に対する早期診断法および治療法の開発が望まれている。
【００１１】
本発明の目的は、精度良く、早期腎癌を診断する方法と、効果的な治療方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
腎癌特異的に高発現している細胞表面分子の探索をマイクロアレイ解析により実施した結果、Ｃｌｅａｒ ｃｅｌｌ ＲＣＣにおいては自然免疫応答に関与する遺伝子群が特徴的に高発現していることが明らかとなり、自然免疫応答がＣｌｅａｒ ｃｅｌｌ ＲＣＣの病因に繋がる可能性が考えられた。また、自然免疫応答に関与することが報告されているＴＬＲ３が遺伝子レベルでＣｌｅａｒ ｃｅｌｌ ＲＣＣ特異的に高発現していることが認められ、併せてＲＴ−ＰＣＲによりＣｌｅａｒ ｃｅｌｌ ＲＣＣ特異的に高発現が確認できた。
次いで、Ｃｌｅａｒ ｃｅｌｌ ＲＣＣ組織に対し抗ＴＬＲ３抗体による組織免疫染色を検討した結果、Ｃｌｅａｒ ｃｅｌｌ ＲＣＣ組織では細胞質に細顆粒状として１８９症例中１８４例においてＴＬＲ３タンパク質が染色された。そのうち１３９例において強く染色されることが確認できたのに対し、Ｃｈｒｏｍｏｐｈｏｂｅ ＲＣＣでは全く染色されなかった。さらに、腎癌の肺転移８症例中６例においてもＴＬＲ３陽性像が確認できた。
一方、複数の腎癌細胞株へのリガンドまたはｓｉＲＮＡの添加により、ＴＬＲ３発現量に比例した増殖抑制効果が認められた。さらに、腎癌細胞株へのリガンドの添加により抗腫瘍効果が期待できるＩＦＮβの発現が誘導された。この結果は、ＴＬＲ３発現腎癌細胞を直接的に治療する方法であり、従来の自然免疫担当細胞である樹上細胞等のリガンドによる活性化を介した癌の治療とは異なることを見出し、本発明を完成させるに至った。
【００１３】
すなわち、本発明は、抗ＴＬＲ３抗体を含有する腎癌の診断薬を提供するものである。
また、本発明は、被験者から採取された試料に抗ＴＬＲ３抗体を反応させ、あるいは被験者に抗ＴＬＲ３抗体を投与して、ＴＬＲ３タンパク質を検出することを特徴とする腎癌の診断方法を提供するものである。
さらに、本発明は、ＴＬＲ３アゴニストを投与することを特徴とする腎癌の治療方法、およびＴＬＲ３アゴニストを含有する腎癌の治療薬を提供するものである。
【発明の効果】
【００１４】
本発明によれば、特異的に検出できる分子イメージング（ＰＥＴ）で行う方法および血液診断ならびにバイオプシーにより採取した組織を用いた腎癌の早期診断（生検）が可能となり、早急に新たな腎癌治療計画の策定が可能となる。また、手術を伴わず、患者に負担をかけない腎癌の非侵襲的な治療の実施が可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
本発明により、診断および治療される疾患は、腎癌である。診断および治療の対象となる動物は、ヒトであることが好ましいが、イヌ、ネコ、ウサギ、マウス、ラット、モルモット等のヒト以外の哺乳類でも良い。
【００１６】
本発明において腎癌の診断を行う場合、被験者の血液中および臓器組織にＴＬＲ３タンパク質が検出された場合に、被験者が腎癌である可能性が高いと判定される。また、腎癌と診断された患者の血液あるいは組織中ＴＬＲ３タンパク質濃度を測定することにより、その患者が治療対象患者か否かを判定すること（治療対象患者の選択）ができる。さらに、腎癌の治療後、ＴＬＲ３タンパク質測定において、タンパク質の量が術前より減少した場合、治療の経過が良好であると判定される。一方、治療後のＴＬＲ３タンパク質の量が低下しないあるいは増加する場合には、再発および転移があると判定される。腎癌診断は、画像診断、生検および血液診断により行うことができる。
【００１７】
画像診断においては、標識した抗ＴＬＲ３抗体を投与後画像診断によりＴＬＲ３タンパク質を検出することにより行うことができる。より具体的には、抗ＴＬＲ３抗体に、標識物質として放射性同位元素で標識したプローブを被験者に投与し、ＰＥＴまたはＳＰＥＣＴで腎癌組織を検出することができる。使用する放射性同位元素は、当業者に公知の物質を用いることができるが、好ましくは陽電子放出放射性同位元素であり、さらに好ましくは11Ｃ、13Ｎ、18Ｆ、15Ｏ、94mＴｃ、124Ｉである。抗ＴＬＲ３抗体への放射性同位元素の標識は、当業者に公知の方法により行うことができる。
【００１８】
生検により腎癌診断を行う方法として、被験者から得られた臓器組織を試料として、免疫学的測定法を行うことができる。例えば、ラジオイムノアッセイ、エンザイムイムノアッセイ、蛍光イムノアッセイ、発光イムノアッセイ、免疫沈降法、免疫比濁法、ウェスタンブロット、免疫染色、免疫拡散法などを挙げることができるが、好ましくは免疫染色である。免疫染色などの上述した免疫学的方法は当業者に公知の方法により行うことが可能である。
【００１９】
生検により腎癌診断を行う他の様態として、抗ＴＬＲ３抗体を一次抗体として使用した免疫組織学的染色法を行うことができる。具体的には、被験者から得られた検体を公知の方法によりパラフィンや凍結等により固定し、切片を作製する。次いで、切片を一次抗体として抗ＴＬＲ３抗体、二次抗体としてＩｇＧを認識するビオチン標識抗体をそれぞれ用いて処理する。二次抗体は、ＩｇＧを認識する公知の抗体を用いることができ、例えばウサギ抗ＩｇＧ抗体などを挙げることができる。二次抗体に標識物質を結合させ、それぞれの標識物質に適した公知の方法により、切片中のタンパク質の有無を検出する。また、二次抗体を使用せず、抗ＴＬＲ３抗体に標識物質を結合させ、免疫組織学的染色法を行うこともできる。標識物質は当業者公知の物質を用いることができるが、例えばペルオキシターゼ、ＦＩＴＣなどを挙げることができる。抗体と標識物質の結合は、当業者に公知の方法で行うことができ、具体的には、ストレプトアビジンとビオチンを利用した結合方法を挙げることができる。
【００２０】
腎癌診断を行う他の様態として、被験者から得られた血液、血清、または血漿を試料として、免疫学的測定法を行うことができる。例えば、ラジオイムノアッセイ、エンザイムイムノアッセイ、蛍光イムノアッセイ、発光イムノアッセイ、免疫沈降法、免疫比濁法、ウェスタンブロット、免疫拡散法などを挙げることができるが、好ましくはエンザイムイムノアッセイであり、特に好ましいのは酵素結合免疫吸着定量法(enzyme-linked immunosorbent assay：ＥＬＩＳＡ)（例えば、sandwich ELISA）である。ＥＬＩＳＡなどの上述した免疫学的方法は当業者に公知の方法により行うことが可能である。
【００２１】
血液、血清、または血漿を検体とした腎癌診断方法としては、例えば、抗ＴＬＲ３抗体を支持体に固定し、ここに被検試料を加え、インキュベートを行い抗ＴＬＲ３抗体とタンパク質を結合させた後に洗浄して、抗ＴＬＲ３抗体を介して支持体に結合したＴＬＲ３タンパク質の検出を行う方法を挙げることができる。
【００２２】
本発明において抗ＴＬＲ３抗体を固定するために用いられる支持体としては、例えば、アガロース、セルロースなどの不溶性の多糖類、シリコン樹脂、ポリスチレン樹脂、ポリアクリルアミド樹脂、ナイロン樹脂、ポリカーボネイト樹脂などの合成樹脂や、ガラス、フェライトなどの不溶性の支持体を挙げることができる。これらの支持体は、ビーズやプレートなどの形状で用いることが可能である。ビーズの場合、これらが充填されたカラムなどを用いることができる。プレートの場合、マルチウェルプレート（９６穴マルチウェルプレート等）、やバイオセンサーチップなどを用いることができる。抗ＴＬＲ３抗体と支持体との結合は、化学結合や物理的な吸着などの通常用いられる方法により結合することができる。これらの支持体はすべて市販のものを用いることができる。
【００２３】
抗ＴＬＲ３抗体と試料中のＴＬＲ３タンパク質との結合は、通常、緩衝液中で行われる。緩衝液としては、例えば、リン酸緩衝液、Ｔｒｉｓ 緩衝液、クエン酸緩衝液、ホウ酸塩緩衝液、炭酸塩緩衝液などが使用され、通常用いるｐＨの範囲であればよい。また、インキュベーションの条件としては、すでによく用いられている条件、例えば、４℃〜３７℃にて１時間〜２４時間のインキュベーションが行われる。インキュベート後の洗浄は、抗ＴＬＲ３抗体とＴＬＲ３タンパク質の結合を妨げないものであれば何でもよく、例えば、Ｔｗｅｅｎ−２０等の界面活性剤を含む緩衝液などが使用される。
【００２４】
本発明によるＴＬＲ３タンパク質の検出方法においては、ＴＬＲ３タンパク質を検出したい被検試料の他に、コントロール試料を設置してもよい。コントロール試料としては、ＴＬＲ３タンパク質を含まない陰性コントロール試料やＴＬＲ３タンパク質を含む陽性コントロール試料などがある。この場合、ＴＬＲ３タンパク質を含まない陰性コントロール試料で得られた結果と、ＴＬＲ３タンパク質を含む陽性コントロール試料で得られた結果と比較することにより、被検試料中のＴＬＲ３タンパク質を検出することが可能である。また、濃度を段階的に変化させた一連のコントロール試料を調製し、各コントロール試料に対する検出結果を数値として得て、標準曲線を作成し、被検試料の数値から標準曲線に基づいて、被検試料に含まれるＴＬＲ３タンパク質を定量的に検出することも可能である。
【００２５】
抗ＴＬＲ３抗体を介して支持体に結合したＴＬＲ３タンパク質の検出の好ましい態様として、標識物質で標識された抗ＴＬＲ３抗体を用いる方法を挙げることができる。例えば、支持体に固定された抗ＴＬＲ３抗体に被検試料を接触させ、洗浄後に、ＴＬＲ３タンパク質を特異的に認識する標識抗体を用いて検出する。
【００２６】
抗ＴＬＲ３抗体の標識は通常知られている方法により行うことが可能である。標識物質としては、蛍光色素、酵素、補酵素、化学発光物質、放射性物質などの当業者に公知の標識物質を用いることが可能であり、具体的な例としては、ラジオアイソトープ(32P、14C、125I、3H、131Iなど)、フルオレセイン、ローダミン、ダンシルクロリド、ウンベリフェロン、ルシフェラーゼ、ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β-ガラクトシダーゼ、β-グルコシダーゼ、ホースラディッシュパーオキシダーゼ、グルコアミラーゼ、リゾチーム、サッカリドオキシダーゼ、マイクロペルオキシダーゼ、ビオチン、ルテニウムなどを挙げることができる。標識物質としてビオチンを用いる場合には、ビオチン標識抗体を添加後に、ペルオキシダーゼなどの酵素を結合させたストレプトアビジンをさらに添加することが好ましい。標識物質と抗ＴＬＲ３抗体との結合には、グルタルアルデヒド法、マレイミド法、ピリジルジスルフィド法、過ヨウ素酸法、などの公知の方法を用いることができる。
【００２７】
具体的には、抗ＴＬＲ３抗体を含む溶液をプレートまたはビーズなどの支持体に加え、抗ＴＬＲ３抗体を支持体に固定する。プレート、またはビーズを洗浄後、タンパク質の非特異的な結合を防ぐため、例えばＢＳＡ、ゼラチン、アルブミンなどでブロッキングする。再び洗浄し、被検試料をプレートまたはビーズに加える。インキュベートの後、洗浄し、標識抗ＴＬＲ３抗体を加える。適度なインキュベーションの後、プレートまたはビーズを洗浄し、支持体に残った標識抗ＴＬＲ３抗体を検出する。検出は当業者に公知の方法により行うことができ、例えば、放射性物質による標識の場合には液体シンチレーションやＲＩＡ法により検出することができる。酵素による標識の場合には基質を加え、基質の酵素的変化、例えば発色を吸光度計により検出することができる。基質の具体的な例としては、２，２−アジノビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸）ジアンモニウム塩（ＡＢＴＳ）、１，２−フェニレンジアミン（オルソ−フェニレンジアミン）、３，３'，５，５'−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）などを挙げることができる。蛍光物質または化学発光物質の場合にはルミノメーターにより検出することができる。
【００２８】
本発明のＴＬＲ３タンパク質検出方法の特に好ましい態様として、ビオチンで標識された抗ＴＬＲ３抗体と、ストレプトアビジンを用いる方法を挙げることができる。
【００２９】
具体的には、抗ＴＬＲ３抗体を含む溶液をプレートなどの支持体に加え、抗ＴＬＲ３抗体を固定する。プレートを洗浄後、タンパク質の非特異的な結合を防ぐため、例えばＢＳＡなどでブロッキングする。再び洗浄し、被検試料をプレートに加える。インキュベートの後、洗浄し、ビオチン標識抗ＴＬＲ３抗体を加える。適度なインキュベーションの後、プレートを洗浄し、アルカリホスファターゼ、ペルオキシダーゼなどの酵素と結合したアビジンを加える。インキュベーション後、プレートを洗浄し、アビジンに結合している酵素に対応した基質を加え、基質の酵素的変化などを指標にＴＬＲ３タンパク質を検出する。
【００３０】
本発明のＴＬＲ３タンパク質検出方法の他の態様として、ＴＬＲ３タンパク質を特異的に認識する一次抗体を一種類以上、および該一次抗体を特異的に認識する二次抗体を一種類以上用いる方法を挙げることができる。
【００３１】
例えば、支持体に固定された一種類以上の抗ＴＬＲ３抗体に被検試料を接触させ、インキュベーションした後、洗浄し、洗浄後に結合しているＴＬＲ３タンパク質を、一次抗ＴＬＲ３抗体、および該一次抗体を特異的に認識する一種類以上の二次抗体により検出する。この場合、二次抗体は好ましくは標識物質により標識されている。
【００３２】
本発明のＴＬＲ３タンパク質の検出方法の他の態様としては、凝集反応を利用した検出方法を挙げることができる。該方法においては、抗ＴＬＲ３抗体を感作した担体を用いてＴＬＲ３タンパク質を検出することができる。抗体を感作する担体としては、不溶性で、非特異的な反応を起こさず、かつ安定である限り、いかなる担体を使用してもよい。例えば、ラテックス粒子、ベントナイト、コロジオン、カオリン、固定羊赤血球等を使用することができるが、ラテックス粒子を使用するのが好ましい。ラテックス粒子としては、例えば、ポリスチレンラテックス粒子、スチレン−ブタジエン共重合体ラテックス粒子、ポリビニルトルエンラテックス粒子等を使用することができるが、ポリスチレンラテックス粒子を使用するのが好ましい。感作した粒子を試料と混合し、一定時間攪拌する。試料中にＴＬＲ３タンパク質が高濃度で含まれるほど粒子の凝集度が大きくなるので、凝集を肉眼でみることによりＴＬＲ３タンパク質を検出することができる。
また、凝集による濁度を分光光度計等により測定することによっても検出することが可能である。
【００３３】
本発明のタンパク質の検出方法の他の態様としては、例えば、表面プラズモン共鳴現象を利用したバイオセンサーを用いた方法を挙げることができる。表面プラズモン共鳴現象を利用したバイオセンサーはタンパク質−タンパク質間の相互作用を微量のタンパク質を用いてかつ標識することなく、表面プラズモン共鳴シグナルとしてリアルタイムに観察することが可能である。例えば、ＢＩＡｃｏｒｅ（Biacore International AB社製）等のバイオセンサーを用いることにより抗ＴＬＲ３抗体とＴＬＲ３タンパク質との結合をそれぞれ検出することが可能である。具体的には抗ＴＬＲ３抗体を固定化したセンサーチップに、被検試料を接触させ抗ＴＬＲ３抗体に結合するＴＬＲ３タンパク質を共鳴シグナルの変化としてそれぞれ検出することができる。
【００３４】
本発明の検出方法は、種々の自動検査装置を用いて自動化することもでき、一度に大量の試料について検査を行うことも可能である。
【００３５】
本発明の腎癌診断薬は、キットの形態であってもよい。本発明の腎癌診断薬は少なくとも抗ＴＬＲ３抗体を含む。該診断薬がＥＬＩＳＡ法等のＥＩＡ法に基づく場合は、抗体を固相化する担体を含んでいてもよく、抗体があらかじめ担体に結合していてもよい。該診断薬がラテックス等の担体を用いた凝集法に基づく場合は抗体が吸着した担体を含んでいてもよい。また、該診断薬は、適宜、ブロッキング溶液、反応溶液、反応停止液、試料を処理するための試薬等を含んでいてもよい。
【００３６】
本発明の生検組織および血液などの試料を用いる診断用抗ＴＬＲ３抗体は、ＴＬＲ３タンパク質にそれぞれ特異的に結合すればよく、その由来、種類（モノクローナル、ポリクローナル）および形状を問わない。具体的には、マウス抗体、ラット抗体、トリ抗体、ヒト抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体などの公知の抗体を用いることができる。抗体はポリクローナル抗体でもよいが、モノクローナル抗体であることが好ましく、高感度で特異的な測定が可能であれば、市販されている抗体を使用してもよい。
【００３７】
また、支持体に固定される抗ＴＬＲ３抗体と標識物質で標識される抗ＴＬＲ３抗体は、ＴＬＲ３タンパク質の同じエピトープを認識してもよいが、異なるエピトープを認識することが好ましく、部位は特に制限されない。
【００３８】
本発明の画像診断に用いられる抗体は、ＴＬＲ３タンパク質と特異的に結合する限り、モノクローナル抗体であればキメラ抗体、ヒト化（ＣＤＲ移植）抗体、ヒト抗体のいずれであっても良い。また、それら抗体は、癌に対する結合が認められれば、市販されている抗体を使用してもよい。
【００３９】
本発明で使用される抗ＴＬＲ３抗体は、公知の手段を用いてポリクローナルまたはモノクローナル抗体として得ることができる。本発明で使用される抗ＴＬＲ３抗体として、哺乳動物由来あるいはトリ由来モノクローナル抗体が好ましい。特に、哺乳動物由来のモノクローナル抗体が好ましい。哺乳動物由来のモノクローナル抗体は、ハイブリドーマにより産生されるもの、および遺伝子工学的手法により抗体遺伝子を含む発現ベクターで形質転換した宿主に産生されるものを含む。
【００４０】
モノクローナル抗体産生ハイブリドーマは、基本的には公知技術を使用し、以下のようにして作製できる。すなわち、ＴＬＲ３タンパク質を感作抗原として使用して、これを通常の免疫方法にしたがって免疫し、得られる免疫細胞を通常の細胞融合法によって公知の親細胞と融合させ、通常のスクリーニング法により、モノクローナルな抗体産生細胞をスクリーニングすることによって作製できる。
具体的には、モノクローナル抗体を作製するには次のようにすればよい。
【００４１】
まず、抗体取得の感作抗原として使用されるＴＬＲ３タンパク質はＧｅｎＢａｎｋ番号（ＮＭ＿００３２６５）に開示された遺伝子／アミノ酸配列を発現することによって得る。すなわち、ＴＬＲ３タンパク質をコードするそれぞれの遺伝子配列を公知の発現ベクター系に挿入して適当な宿主細胞を形質転換させた後、その宿主細胞中または培養上清中から目的のヒトＴＬＲ３タンパク質を公知の方法で精製する。また、天然のＴＬＲ３タンパク質を精製して用いることもできる。
【００４２】
次に、この精製ＴＬＲ３タンパク質を感作抗原として用いる。あるいは、ＴＬＲ３タンパク質の部分ペプチドを感作抗原として使用することもできる。この際、部分ペプチドはヒトＴＬＲ３タンパク質のアミノ酸配列より化学合成により得ることもできるし、ヒトＴＬＲ３遺伝子の一部を発現ベクターに組込んで得ることもでき、さらに天然のヒトＴＬＲ３タンパク質をタンパク質分解酵素により分解することによっても得ることができる。部分ペプチドとして用いるヒトＴＬＲ３タンパク質の部分および大きさは限定されない。
【００４３】
感作抗原で免疫される哺乳動物としては、特に限定されるものではないが、細胞融合に使用する親細胞との適合性を考慮して選択するのが好ましく、一般的にはげっ歯類の動物、例えば、マウス、ラット、ハムスター、あるいはトリ、ウサギ、サル等が使用される。
【００４４】
感作抗原を動物に免疫するには、公知の方法にしたがって行われる。例えば、一般的方法として、感作抗原を哺乳動物の腹腔内または皮下に注射することにより行われる。具体的には、感作抗原をＰＢＳ（Phosphate-Buffered Saline）や生理食塩水等で適当量に希釈、懸濁したものに所望により通常のアジュバント、例えばフロイント完全アジュバントを適量混合し、乳化後、哺乳動物に４〜２１日毎に数回投与する。また、感作抗原免疫時に適当な担体を使用することもできる。特に分子量の小さい部分ペプチドを感作抗原として用いる場合には、アルブミン、キーホールリンペットヘモシアニン等の担体タンパク質と結合させて免疫することが望ましい。
【００４５】
このように哺乳動物を免疫し、血清中に所望の抗体レベルが上昇するのを確認した後に、哺乳動物から免疫細胞を採取し、細胞融合に付されるが、好ましい免疫細胞としては、特に脾細胞が挙げられる。
【００４６】
前記免疫細胞と融合される他方の親細胞として、哺乳動物のミエローマ細胞を用いる。このミエローマ細胞は、公知の種々の細胞株、例えば、Ｐ３（P3x63Ag8.653）（J. Immnol.（1979）123, 1548-1550）、P3x63Ag8U.1（Current Topics in Microbiology and Immunology（1978）81, 1-7）、 NS-1（Kohler. G. and Milstein, C. Eur. J. Immunol.（1976）6, 511-519）、MPC-11（Margulies. D.H. et al., Cell（1976）8, 405-415）、SP2/0 （Shulman, M. et al., Nature（1978）276, 269-270）、FO（de St. Groth, S. F. et al., J. Immunol. Methods（1980）35, 1-21）、S194（Trowbridge, I. S. J. Exp. Med.（1978）148, 313-323）、R210（Galfre, G. et al., Nature（1979）277, 131-133）等が好適に使用される。
【００４７】
前記免疫細胞とミエローマ細胞との細胞融合は、基本的には公知の方法、たとえば、ケーラーとミルステインらの方法（Kohler. G. and Milstein, C.、Methods Enzymol.（1981）73, 3-46）等に準じて行うことができる。
【００４８】
より具体的には、前記細胞融合は、例えば細胞融合促進剤の存在下に通常の栄養培養液中で実施される。融合促進剤としては、例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、センダイウイルス（ＨＶＪ）等が使用され、さらに所望により融合効率を高めるためにジメチルスルホキシド等の補助剤を添加使用することもできる。
【００４９】
免疫細胞とミエローマ細胞との使用割合は任意に設定することができる。例えば、ミエローマ細胞に対して免疫細胞を１〜１０倍とするのが好ましい。前記細胞融合に用いる培養液としては、例えば、前記ミエローマ細胞株の増殖に好適なＲＰＭＩ１６４０培養液、ＭＥＭ培養液、その他、この種の細胞培養に用いられる通常の培養液が使用可能であり、さらに、牛胎児血清（ＦＣＳ）等の血清補液を併用することもできる。
【００５０】
細胞融合は、前記免疫細胞とミエローマ細胞との所定量を前記培養液中でよく混合し、予め３７℃程度に加温したＰＥＧ溶液（例えば平均分子量１０００〜６０００程度）を通常３０〜６０％（ｗ／ｖ）の濃度で添加し、混合することによって目的とする融合細胞（ハイブリドーマ）を形成する。続いて、適当な培養液を逐次添加し、遠心して上清を除去する操作を繰り返すことによりハイブリドーマの生育に好ましくない細胞融合剤等を除去する。
【００５１】
このようにして得られたハイブリドーマは、通常の選択培養液、例えばＨＡＴ培養液（ヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジンを含む培養液）で培養することにより選択される。上記ＨＡＴ培養液での培養は、目的とするハイブリドーマ以外の細胞（非融合細胞）が死滅するのに十分な時間（通常、数日〜数週間）継続する。ついで、通常の限界希釈法を実施し、目的とする抗体を産生するハイブリドーマのスクリーニングおよび単一クローニングを行う。
【００５２】
目的とする抗体のスクリーニングおよび単一クローニングは、公知の抗原抗体反応に基づくスクリーニング方法で行えばよい。例えば、ポリスチレン等でできたビーズや市販の９６ウェルのマイクロタイタープレート等の担体に抗原を結合させ、ハイブリドーマの培養上清と反応させ、担体を洗浄した後に酵素標識二次抗体等を反応させることにより、培養上清中に感作抗原と反応する目的とする抗体が含まれるかどうか決定できる。目的とする抗体を産生するハイブリドーマを限界希釈法等によりクローニングすることができる。この際、抗原としては免疫に用いたものを用いればよい。
【００５３】
また、ヒト以外の動物に抗原を免疫して上記ハイブリドーマを得る他に、ヒトリンパ球をｉｎ ｖｉｔｒｏで、ＴＬＲ３タンパク質に感作し、感作リンパ球をヒト由来の永久分裂能を有するミエローマ細胞と融合させ、ＴＬＲ３タンパク質への結合活性を有する所望のヒト抗体を得ることもできる（特公平１−５９８７８号公報参照）。さらに、ヒト抗体遺伝子の全てのレパートリーを有するトランスジェニック動物に抗原となるＴＬＲ３タンパク質を投与して抗ＴＬＲ３抗体産生細胞を取得し、これを不死化させた細胞からＴＬＲ３タンパク質に対するヒト抗体をそれぞれ取得してもよい（国際特許出願公開番号ＷＯ ９４／２５５８５号公報、ＷＯ ９３／１２２２７号公報、ＷＯ ９２／０３９１８号公報、ＷＯ ９４／０２６０２号公報参照）。
【００５４】
このようにして作製されるモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマは、通常の培養液中で継代培養することが可能であり、また、液体窒素中で長期保存することが可能である。
【００５５】
当該ハイブリドーマからモノクローナル抗体を取得するには、当該ハイブリドーマを通常の方法に従い培養し、その培養上清として得る方法、あるいはハイブリドーマをこれと適合性がある哺乳動物に投与して増殖させ、その腹水として得る方法などが採用される。前者の方法は、高純度の抗体を得るのに適しており、一方、後者の方法は、抗体の大量生産に適している。
【００５６】
本発明では、モノクローナル抗体として、抗体遺伝子をハイブリドーマからクローニングし、適当なベクターに組み込んで、これを宿主に導入し、遺伝子組換え技術を用いて産生させた組換え型のものを用いることができる（例えば、Vandamme, A. M. et al., Eur.J. Biochem.（1990）192, 767-775, 1990参照）。
具体的には、抗ＴＬＲ３抗体を産生するハイブリドーマから、抗ＴＬＲ３抗体の可変（Ｖ）領域をコードするｍＲＮＡを単離する。ｍＲＮＡの単離は、公知の方法、例えば、グアニジン超遠心法（Chirgwin, J. M. et al., Biochemistry（1979）18, 5294-5299）、ＡＰＧＣ法（Chomczynski, P.et al., Anal. Biochem.（1987）162, 156-159）等により行って全ＲＮＡを調製し、mRNA Purification Kit （Pharmacia製）等を使用して目的のｍＲＮＡを調製する。また、ＱｕｉｃｋＰｒｅｐ ｍＲＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Pharmacia製）を用いることによりｍＲＮＡを直接調製することもできる。
【００５７】
得られたｍＲＮＡから逆転写酵素を用いて抗体Ｖ領域のｃＤＮＡを合成する。ｃＤＮＡの合成は、AMV Reverse Transcriptase First-strand cDNA Synthesis Kit（生化学工業社製）等を用いて行う。また、ｃＤＮＡの合成および増幅を行うには、５'−Ａｍｐｌｉ ＦＩＮＤＥＲ ＲＡＣＥ Ｋｉｔ（Clontech製）およびＰＣＲを用いた５'−ＲＡＣＥ法（Frohman, M. A. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA（1988）85, 8998-9002、Belyavsky, A.et al., Nucleic Acids Res.（1989）17, 2919-2932）等を使用することができる。
【００５８】
得られたＰＣＲ産物から目的とするＤＮＡ断片を精製し、ベクターＤＮＡと連結する。さらに、これより組換えベクターを作製し、大腸菌等に導入してコロニーを選択して所望の組換えベクターを調製する。そして、目的とするＤＮＡの塩基配列を公知の方法、例えば、ジデオキシヌクレオチドチェインターミネーション法等により確認する。
【００５９】
目的とする抗ＴＬＲ３抗体のV領域をコードするＤＮＡをそれぞれ得たのち、これを、所望の抗体定常領域（Ｃ領域）をコードするＤＮＡを含有する発現ベクターへ組み込む。
【００６０】
本発明で使用される抗ＴＬＲ３抗体を製造するには、抗体遺伝子を発現制御領域、例えば、エンハンサー、プロモーターの制御のもとで発現するよう発現ベクターに組み込む。次に、この発現ベクターにより、宿主細胞を形質転換し、抗体を発現させる。
【００６１】
抗体遺伝子の発現は、抗体重鎖（Ｈ鎖）または軽鎖（Ｌ鎖）をコードするＤＮＡを別々に発現ベクターに組み込んで宿主細胞を同時形質転換させてもよいし、あるいはＨ鎖およびＬ鎖をコードするＤＮＡを単一の発現ベクターに組み込んで宿主細胞を形質転換させてもよい（WO 94/11523 号公報参照）。
【００６２】
また、組換え型抗体の産生には上記宿主細胞だけではなく、トランスジェニック動物を使用することができる。例えば、抗体遺伝子を、乳汁中に固有に産生されるタンパク質（ヤギβカゼインなど）をコードする遺伝子の途中に挿入して融合遺伝子として調製する。抗体遺伝子が挿入された融合遺伝子を含むＤＮＡ断片をヤギの胚へ注入し、この胚を雌のヤギへ導入する。胚を受容したヤギから生まれるトランスジェニックヤギまたはその子孫が産生する乳汁から所望の抗体を得る。また、トランスジェニックヤギから産生される所望の抗体を含む乳汁量を増加させるために、適宜ホルモンをトランスジェニックヤギに使用してもよい（Ebert, K.M. et al., Bio/Technology（1994）12, 699-702）。
【００６３】
本発明で使用される抗体は、抗体の全体分子に限られず、ＴＬＲ３タンパク質に結合する限り、抗体の断片またはその修飾物であってもよく、二価抗体も一価抗体も含まれる。例えば、抗体の断片としては、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ'）２、Ｆｖ、1個のＦａｂと完全なＦｃを有するＦａｂ／ｃ、またはＨ鎖若しくはＬ鎖のＦｖを適当なリンカーで連結させたシングルチェインＦｖ（ｓｃＦｖ）が挙げられる。具体的には、抗体を酵素、例えばパパイン、ペプシンで処理し抗体断片を生成させるか、または、これら抗体断片をコードする遺伝子を構築し、これを発現ベクターに導入した後、適当な宿主細胞で発現させる（例えば、Co, M.S. et al., J. Immunol.（1994）152, 2968-2976、Better, M. & Horwitz, A.H. Methods in Enzymology（1989）178, 476-496, Academic Press, Inc.、Plueckthun, A. & Skerra, A. Methods in Enzymology（1989）178, 476-496, Academic Press, Inc.、Lamoyi, E., Methods in Enzymology（1989）121, 652-663、Rousseaux, J. et al., Methods in Enzymology（1989）121, 663-669、Bird, R. E. et al., TIBTECH（1991）9, 132-137参照）。
【００６４】
ｓｃＦｖは、抗体のＨ鎖Ｖ領域とＬ鎖Ｖ領域とを連結することにより得られる。このｓｃＦｖにおいて、Ｈ鎖Ｖ領域とＬ鎖Ｖ領域は、リンカー、好ましくはペプチドリンカーを介して連結される（Huston, J. S. et al.、Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.（1988）85, 5879-5883）。ｓｃＦｖにおけるＨ鎖Ｖ領域およびＬ鎖Ｖ領域は、本明細書に抗体として記載されたもののいずれの由来であってもよい。Ｖ領域を連結するペプチドリンカーとしては、例えばアミノ酸１２〜１９残基からなる任意の一本鎖ペプチドが用いられる。
【００６５】
ｓｃＦｖをコードするＤＮＡは、前記抗体のＨ鎖またはＨ鎖Ｖ領域をコードするＤＮＡ、およびＬ鎖またはＬ鎖Ｖ領域をコードするＤＮＡのうち、それらの配列のうちの全部または所望のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ部分を鋳型とし、その両端を規定するプライマー対を用いてＰＣＲ法により増幅し、次いで、さらにペプチドリンカー部分をコードするＤＮＡ、およびその両端が各々Ｈ鎖、Ｌ鎖と連結されるように規定するプライマー対を組み合せて増幅することにより得られる。
【００６６】
また、一旦ｓｃＦｖをコードするＤＮＡが作製されると、それらを含有する発現ベクター、および該発現ベクターにより形質転換された宿主を常法に従って得ることができ、また、その宿主を用いることにより、常法に従ってｓｃＦｖを得ることができる。
【００６７】
これら抗体の断片は、前記と同様にしてその遺伝子を取得し発現させ、宿主により産生させることができる。本発明における「抗体」にはこれらの抗体の断片も包含される。
【００６８】
抗体の修飾物として、標識物質等の各種分子と結合した抗ＴＬＲ３抗体を使用することもできる。本発明における「抗体」にはこれらの抗体修飾物も包含される。このような抗体修飾物は、得られた抗体に化学的な修飾を施すことによって得ることができる。なお、抗体の修飾方法はこの分野においてすでに確立されている。
【００６９】
さらに、本発明で使用される抗体は、二重特異性抗体（bispecific antibody）であってもよい。二重特異性抗体は分子上の異なるエピトープを認識する抗原結合部位を有する二重特異性抗体であってもよいし、一方の抗原結合部位がＴＬＲ３タンパク質を認識し、他方の抗原結合部位が標識物質等を認識してもよい。二重特異性抗体は２種類の抗体のＨＬ対を結合させて作製することもできるし、異なるモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを融合させて二重特異性抗体産生融合細胞を作製し、得ることもできる。さらに、遺伝子工学的手法により二重特異性抗体を作製することも可能である。
【００７０】
前記のように構築した抗体遺伝子は、公知の方法により発現させ、取得することができる。哺乳類細胞の場合、常用される有用なプロモーター、発現させる抗体遺伝子、その３'側下流にポリAシグナルを機能的に結合させて発現させることができる。例えばプロモーター／エンハンサーとしては、ヒトサイトメガロウイルス前期プロモーター／エンハンサー（human cytomegalovirus immediate early promoter/enhancer）を挙げることができる。
【００７１】
また、その他に本発明で使用される抗体発現に使用できるプロモーター／エンハンサーとして、レトロウイルス、ポリオーマウイルス、アデノウイルス、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）等のウイルスプロモーター／エンハンサー、あるいはヒトエロンゲーションファクター１α（ＨＥＦ１α）などの哺乳類細胞由来のプロモーター／エンハンサー等が挙げられる。
【００７２】
ＳＶ４０プロモーター／エンハンサーを使用する場合はMulliganらの方法（Nature（1979）277, 108）により、また、ＨＥＦ１αプロモーター／エンハンサーを使用する場合はMizushimaらの方法（Nucleic Acids Res.（1990）18, 5322）により、容易に遺伝子発現を行うことができる。
【００７３】
大腸菌の場合、常用される有用なプロモーター、抗体分泌のためのシグナル配列および発現させる抗体遺伝子を機能的に結合させて当該遺伝子を発現させることができる。プロモーターとしては、例えばｌａｃＺプロモーター、ａｒａＢプロモーターを挙げることができる。ｌａｃＺプロモーターを使用する場合はWardらの方法（Nature（1098）341, 544-546 ; FASEBJ.（1992）6, 2422-2427）により、あるいはａｒａＢプロモーターを使用する場合はBetterらの方法（Science（1988）240, 1041-1043）により発現することができる。
【００７４】
抗体分泌のためのシグナル配列としては、大腸菌のペリプラズムに産生させる場合、ｐｅｌＢシグナル配列（Lei, S. P. et al J. Bacteriol.（1987）169, 4379）を使用すればよい。そして、ペリプラズムに産生された抗体を分離した後、抗体の構造を適切に組み直して（ｒｅｆｏｌｄ）使用する。
【００７５】
複製起源としては、ＳＶ４０、ポリオーマウイルス、アデノウイルス、ウシパピローマウイルス（ＢＰＶ）等の由来のものを用いることができ、さらに、宿主細胞系で遺伝子コピー数増幅のため、発現ベクターは、選択マーカーとしてアミノグリコシドトランスフェラーゼ（ＡＰＨ）遺伝子、チミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子、大腸菌キサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｅｃｏｇｐｔ）遺伝子、ジヒドロ葉酸還元酵素（ｄｈｆｒ）遺伝子等を含むことができる。
【００７６】
本発明で使用される抗体の製造のために、任意の発現系、例えば真核細胞または原核細胞系を使用することができる。真核細胞としては、例えば樹立された哺乳類細胞系、昆虫細胞系、真糸状菌細胞および酵母細胞などの細胞等が挙げられ、原核細胞としては、例えば大腸菌細胞等の細菌細胞が挙げられる。
【００７７】
好ましくは、本発明で使用される抗体は、哺乳類細胞、例えばＣＨＯ、ＣＯＳ、ミエローマ、ＢＨＫ、Ｖｅｒｏ、ＨｅＬａ細胞中で発現される。
【００７８】
次に、形質転換された宿主細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏで培養して目的とする抗体を産生させる。宿主細胞の培養は公知の方法に従い行う。例えば、培養液として、ＤＭＥＭ、ＭＥＭ、ＲＰＭＩ１６４０、ＩＭＤＭを使用することができ、牛胎児血清（ＦＣＳ）等の血清補液を併用することもできる。
【００７９】
前記のように発現、産生された抗体は、細胞、宿主動物から分離し均一にまで精製することができる。本発明で使用される抗体の分離、精製はアフィニティーカラムを用いて行うことができる。例えば、プロテインＡカラムを用いたカラムとして、ＨｙｐｅｒＤ、ＰＯＲＯＳ、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦ（Pharmacia製）等が挙げられる。その他、通常のタンパク質で使用されている分離、精製方法を使用すればよく、何ら限定されるものではない。例えば、上記アフィニティーカラム以外のクロマトグラフィーカラム、フィルター、限外濾過、塩析、透析等を適宜選択、組み合わせることにより、抗体を分離、精製することができる（Antibodies: A Laboratory Manual. Ed Harlow, David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988）。
【００８０】
また、本発明により、ＴＬＲ３タンパク質はＣｌｅａｒ Ｃｅｌｌ ＲＣＣに特異的に発現していることが明らかになったことから、本発明における診断および治療の対象となる腎細胞癌（ＲＣＣ）としては、Ｃｌｅａｒ Ｃｅｌｌ ＲＣＣおよびＣｌｅａｒ Ｃｅｌｌ ＲＣＣ転移癌が特に好ましい。
【００８１】
本発明の腎癌治療薬に使用されるＴＬＲ３アゴニストとしては、二本鎖ＲＮＡおよびＴＬＲ３に対してアゴニスト作用を示す抗体が挙げられる。
【００８２】
本発明の腎癌治療薬は、ＴＬＲ３アゴニストを当該技術分野においてよく知られる薬学的に許容しうる担体とともに、混合、溶解、顆粒化、錠剤化、乳化、カプセル封入、凍結乾燥等により、製剤化することができる。
【００８３】
経口投与用には、ＴＬＲ３アゴニストを、薬学的に許容しうる溶媒、賦形剤、結合剤、安定化剤、分散剤等とともに、錠剤、丸薬、糖衣剤、軟カプセル、硬カプセル、溶液、懸濁液、乳剤、ゲル、シロップ、スラリー等の剤形に製剤化することができる。
【００８４】
非経口投与用には、ＴＬＲ３アゴニストを、薬学的に許容しうる溶媒、賦形剤、結合剤、安定化剤、分散剤等とともに、注射用溶液、懸濁液、乳剤、クリーム剤、軟膏剤、吸入剤、坐剤等の剤形に製剤化することができる。注射用の処方においては、抗ＴＬＲ３抗体を水性溶液、好ましくはハンクス溶液、リンゲル溶液、または生理的食塩緩衝液等の生理学的に適合性の緩衝液中に溶解することができる。さらに、組成物は、油性または水性のベヒクル中で、懸濁液、溶液、または乳濁液等の形状をとることができる。あるいは、治療剤を粉体の形態で製造し、使用前に滅菌水等を用いて水溶液または懸濁液を調製してもよい。吸入による投与用には、ＴＬＲ３アゴニストを粉末化し、ラクトースまたはデンプン等の適当な基剤とともに粉末混合物とすることができる。坐剤処方は、ＴＬＲ３アゴニストをカカオバター等の慣用の坐剤基剤と混合することにより製造することができる。さらに、本発明の腎癌治療剤は、ポリマーマトリクス等に封入して、持続放出用製剤として処方することができる。
【００８５】
投与量および投与回数は、剤形および投与経路、ならびに患者の症状、年齢、体重によって異なるが、一般に、ＴＬＲ３アゴニストは、１日あたり体重１ｋｇあたり、約０．００１ｍｇから１０００ｍｇの範囲、好ましくは約０．０１ｍｇから１０ｍｇの範囲となるよう、１日に１回から数回投与することができる。
【００８６】
本発明の腎癌治療薬は通常非経口投与経路で、例えば注射剤（皮下注、静注、筋注、腹腔内注など）、経皮、経粘膜、経鼻、経肺などで投与するのが好ましい。
また、本発明の腎癌治療薬はＴＬＲ３アゴニストに加えて、インターフェロン、特にインターフェロンαを併用するのが特に好ましい。ＴＬＲ３アゴニストをインターフェロンと併用する場合、インターフェロンαの投与はＣ型肝炎の治療方法に準ずる。すなわち、インターフェロンαを６００〜１，０００万ＩＵ筋注にて２週間連続、さらに２２週間、週あたり３回投与するのが好ましい。
【実施例】
【００８７】
以下に実施例により本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例により限定されるものではない。
【００８８】
実施例１ 腎細胞癌の網羅的遺伝子発現解析
（１−１）対象症例
２０００年から２００４年にかけて東京大学医学部附属病院にて手術的に切除された腎細胞癌臨床検体３０症例および同一症例の正常腎組織９例を対象として、オリゴヌクレオチドマイクロアレイであるＧｅｎｅＣｈｉｐ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）による網羅的遺伝子発現解析を行った。全ての症例はインフォームドコンセントおよび文書による同意がなされ、また本研究における臨床検体を用いた実験プロトコールの全ては倫理委員会の承認を受けている。手術による切除後、癌部あるいは正常腎組織の一部をメスで切り取り、液体窒素中で急速凍結した。凍結組織はＲＮＡ抽出時まで、液体窒素タンクないし−８０℃のｄｅｅｐ ｆｒｅｅｚｅｒ内で保存された。対象症例群における臨床病理学的因子のまとめを表１に記載する。ＴＮＭ分類に関しては、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｊｏｉｎｔ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ｏｎ Ｃａｎｃｅｒの基準に従った。Nuclear Gradeに関しては、Ｆｕｒｈｍａｎｎによる分類に従った。
【００８９】
【表１】
【００９０】
（１−２）Ｔｏｔａｌ ＲＮＡの抽出
凍結検体を液体窒素で満たした乳鉢の中ですり棒を用いてすり潰し、Ｔｒｉｚｏｌ(Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ)１ｍＬを加えホモジナイズした。Ｔｏｔａｌ ＲＮＡの抽出はＴｒｉｚｏｌのプロトコールに従い行った。
【００９１】
（１−３）オリゴヌクレオチドマイクロアレイ解析
ＧｅｎｅＣｈｉｐの説明書に従い、各サンプルのＴｏｔａｌ ＲＮＡ３μｇより、Ｔ７ｐｒｏｍｏｔｅｒのついたｏｌｉｇｏ−ｄＴ（２４ｍｅｒ）ｐｒｉｍｅｒを使用して、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔTMII ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）による逆転写反応により２本鎖ｃＤＮＡ合成を行った。ついで、Ｔ７ ＲＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＥＮＺＯ）によるｉｎ ｖｉｔｒｏ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ反応によりビオチンラベル化されたｃＤＮＡを合成した。断片化を行い、ＧｅｎｅＣｈｉｐ １枚あたり５μｇのｃＲＮＡを用いて、５４６７５プローブを有するＧｅｎｅＣｈｉｐＨＧ−Ｕ１３３ ｐｌｕｓ２．０に対してハイブリダイゼーションを１６時間行った。洗浄後、Ｓｔｒｅｐｙｏａｖｉｄｉｎｅ Ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ染色、ビオチン化抗体処理、Ｓｔｒｅｐｙｏａｖｉｄｉｎｅ Ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎの再染色によりシグナルを増強後、スキャナーで読み込み、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社のＭｉｃｒｏａｒｒａｙ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｓｕｉｔｅ５．０（ＭＡＳ ５．０）で画像を解析した。その後、各ＧｅｎｅＣｈｉｐ上の各遺伝子に対して、ＭＡＳ ５．０によって表示されたシグナル値を発現量として用い、各ＧｅｎｅＣｈｉｐにおける遺伝子発現量の平均が１００になるようにデータの標準化を行った。
【００９２】
（１−４）遺伝子発現解析
（１−４−１）クラスター解析
ＧｅｎｅＣｈｉｐより得られた５４６７５プローブのシグナル値をもとに、ＧｅｎｅＳｐｒｉｎｇ（Ａｇｉｌｅｎｔ）を用いてプローブと症例による階層的クラスター解析を行い、３９検体 (Ｃｌｅａｒ ｃｅｌｌ ＲＣＣ ２７例、Ｃｈｒｏｍｏｐｈｏｂｅ ＲＣＣ ２例、Ｓａｒｃｏｍａｔｏｉｄ ＲＣＣ１例および非癌部正常腎９例）を分類した。まず、それぞれのプローブについて、３９検体中少なくとも１検体でシグナル値が２００を超えるものを選出し、プローブセットとした。次にこのプローブセットの発現量を用いて、遺伝子間についてピアソン相関係数を求め、クラスター解析を行った。症例間についても同様にピアソン相関係数を求め、クラスター解析を行った。このように、遺伝子間と症例間の二方向についてクラスター解析を行い、症例の類似性の比較を行った。まず、ＧｅｎｅＣｈｉｐの全てのプローブ（５４６７５プローブ）の中から、シグナル値が全ての症例で２００以下のプローブを除外することによって、１７５１２プローブのセットを選出した。このプローブセットで階層的クラスター解析を行ったところ、Ｃｌｅａｒ ｃｅｌｌ ＲＣＣ（Ｓａｒｃｏｍａｔｏｉｄ ＲＣＣを含む）の群と、正常腎およびＣｈｒｏｍｏｐｈｏｂｅ ＲＣＣを含む群の2群に大きく分けられた（図１）。また、正常腎９例およびＣｈｒｏｍｏｐｈｏｂｅ ＲＣＣ２例はそれぞれまとまったクラスターを形成した。
【００９３】
（１−４−２）組織型特異的に高発現している遺伝子の選定
クラスター解析に使用したプローブセットの発現値を用いて、Ｃｌｅａｒ ｃｅｌｌ ＲＣＣあるいはＣｈｒｏｍｏｐｈｏｂｅ ＲＣＣで特異的に高発現している遺伝子の選出を行った。選出の条件は以下の通りである。
【００９４】
ｉ）Ｃｌｅａｒ ｃｅｌｌ ＲＣＣ特異的高発現遺伝子
Ｃｌｅａｒ ｃｅｌｌ ＲＣＣ ２７例の中央値／正常腎９例の中央値＞５かつ、
Ｃｌｅａｒ ｃｅｌｌ ＲＣＣ ２７例の中央値／Ｃｈｒｏｍｏｐｈｏｂｅ ＲＣＣ ２例の最大値＞５
ii）Ｃｈｒｏｍｏｐｈｏｂｅ ＲＣＣ特異的高発現遺伝子
Ｃｈｒｏｍｏｐｈｏｂｅ ＲＣＣ ２例の最小値／正常腎９例の中央値＞５かつ、
Ｃｈｒｏｍｏｐｈｏｂｅ ＲＣＣ ２例の最小値／Ｃｌｅａｒ ｃｅｌｌ ＲＣＣ ２７例の中央値＞５
【００９５】
Ｃｌｅａｒ ｃｅｌｌ ＲＣＣあるいはＣｈｒｏｍｏｐｈｏｂｅ ＲＣＣで特異的に高発現している遺伝子として、それぞれ３１５、１９６プローブが選出された。なお、正常腎に比べてＣｌｅａｒ ｃｅｌｌ ＲＣＣで５倍以上発現亢進している遺伝子と、正常腎に比べてＣｈｒｏｍｏｐｈｏｂｅ ＲＣＣで５倍以上発現亢進している遺伝子で共通しているものは認められなかった。すなわち、この２つの組織型では全く異なる遺伝子群が発現亢進していた。
選出されたプローブセットを用いて、ＮＩＨが提供しているソフトウェアＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ ＡＮＡＬＹＳＩＳ ＳＹＳＴＥＭＡＴＩＣ ＥＸＰＬＯＲＥＲによって解析を行い、各組織型特異的に発現亢進している遺伝子群にどのような機能の遺伝子が多く含まれるかを調べた。表２、表３に示す通り、Ｃｌｅａｒ ｃｅｌｌ ＲＣＣでは免疫応答や生体防御・免疫応答などに関わる遺伝子群が特徴的に高発現していた。また、Ｃｈｒｏｍｏｐｈｏｂｅ ＲＣＣではイオン輸送やホメオスタシスなどに関与する遺伝子群が特徴的に高発現していることが明らかとなった。各組織型で特異的に高発現していた遺伝子、上位５０プローブを次ページ以下、表４および表５に示す。
【００９６】
【表２】
【００９７】
【表３】
【００９８】
【表４】
【００９９】
【表５】
【０１００】
（１−４−３）組織型特異的に高発現している遺伝子のｇｅｎｅ ｏｎｔｏｌｏｇｙ解析
上記（１−４−２）において選出された遺伝子群にどのような機能の遺伝子が多く含まれるかについて、ＮＩＨが提供しているソフトウェアＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ ＡＮＡＬＹＳＩＳ ＳＹＳＴＥＭＡＴＩＣ ＥＸＰＬＯＲＥＲによって解析を行った。
これは、各プローブに付されている各ｇｅｎｅ ｏｎｔｏｌｏｇｙ(遺伝子の機能)が、全プローブ中の頻度に対し、目的の遺伝子群でどの程度濃縮されているかをｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｆｉｓｈｅｒ'ｓ ｅｘａｃｔ ｔｅｓｔにより検定するものである。検定値はＥａｓｅ Ｓｃｏｒｅとして表され、この数値が低いほど、目的の遺伝子群で濃縮されている、すなわち、その機能を持つ遺伝子が目的の遺伝子群に多く含まれていると評価される。
【０１０１】
（１−４−４）腎細胞癌治療標的遺伝子の選定
今回解析した腎細胞癌、正常腎の発現データと、以前東京大学先端研ゲノムサイエンス部門にてＧｅｎｅＣｈｉｐ ＨＧ−Ｕ１３３ ｐｌｕｓ２．０による解析が行われた１５種の正常臓器（Ｂｒａｉｎ，Ｍｕｓｃｌｅ，Ｈｅａｒｔ，Ｓｋｉｎ，Ｌｕｎｇ，Ｌｉｖｅｒ，Ｓｔｏｍａｃｈ，Ｃｏｌｏｎ，Ｐａｎｃｒｅａｓ，Ｋｉｄｎｅｙ，Ｂｌａｄｄｅｒ，Ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ，Ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｂｌｏｏｄ，Ｏｖａｒｙ，Ｔｅｓｔｉｓ）の発現データを用い、正常臓器で発現が低く、Ｃｌｅａｒ ｃｅｌｌ ＲＣＣ特異的に発現が亢進している遺伝子の選出を行った。選出の基準は以下の通りである。
【０１０２】
Ｃｌｅａｒ ｃｅｌｌ ＲＣＣ ２７例の中央値／正常腎９例の中央値＞５かつ、
Ｃｌｅａｒ ｃｅｌｌ ＲＣＣ ２７例の中央値＞５００(シグナル値)かつ、
１５種類の正常臓器の最大値＜500(シグナル値)
【０１０３】
その結果、表６に示すように３６プローブ（既知遺伝子数としては２３個）が選出された。
それら３６プローブのうち、ＴＬＲ３に着目してさらに検討を行った。ＴＬＲ３の遺伝子発現値（ＧｅｎｅＣｈｉｐシグナル値）を図２に示す。
オリゴヌクレオチドマイクロアレイ解析により、ＴＬＲ３遺伝子が正常腎および各種正常組織に比べＣｌｅａｒ ｃｅｌｌ ＲＣＣで発現亢進していることがわかった。
【０１０４】
【表６】
【０１０５】
実施例２ Ｃｌｅａｒ ｃｅｌｌ ＲＣＣにおける定量的ＲＴ−ＰＣＲによるＴＬＲ３遺伝子の発現亢進
Ｃｌｅａｒ ｃｅｌｌ ＲＣＣおよび同一患者の正常腎組織７ペアにおけるＴＬＲ３遺伝子の発現を定量的ＲＴ−ＰＣＲで測定した。ｃＤＮＡの合成は，１μｇのｔｏｔａｌ ＲＮＡにＤＮａｓｅ Ｉ Ａｍｐ ｇｒａｄｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を添加し、室温で１５分間静置することによりゲノムＤＮＡの分解を行った。ついで、Ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）プライマーおよびＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔTMIII 逆転写酵素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて５０℃で６０分間逆転写反応を行った。その後、ＲＮａｓｅ Ｈを加えて鋳型ＲＮＡ鎖の分解を行った。合成されたｃＤＮＡ溶液をｎｕｃｌｅａｓｅ ｆｒｅｅ ｗａｔｅｒで希釈し、ＰＣＲ反応に用いた。合成されたｃＤＮＡを鋳型としてＰＣＲバッファー（５０ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ８．３、２ｍＭ ＭｇＣｌ2、０．０１％ゼラチン）、２００ μＭ ｄＮＴＰｓ（ＴａＫａＲａ）、０．２μＭプライマー、Ｔａｑ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ（ＢＭＡ）を用いて定量的ＲＴ−ＰＣＲを行った。尚、ＴＬＲ３のＦｏｒｗａｒｄ ｐｒｉｍｅｒは配列番号１、Ｒｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒは配列番号２を使用して、ＰＣＲ条件：９４℃３分、（９４℃１５秒、６０℃１５秒、７２℃３０秒）×４５サイクルで実施した。また、内部標準遺伝子としてのＡＣＴＢについては、Ｆｏｒｗａｒｄ ｐｒｉｍｅｒは配列番号３、Ｒｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒは配列番号４を使用して、ＰＣＲ条件：９４℃３分、（９４℃１５秒、６２℃１５秒、７２℃３０秒）×３５サイクルで実施し、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎが発する蛍光量を測定することで初期鋳型ｃＤＮＡ量を求めた。さらに、ＡＣＴＢの初期鋳型ｃＤＮＡ量を求め、その値で目的遺伝子の初期鋳型ｃＤＮＡ量を割って補正を行い、得られた数値を目的遺伝子のｍＲＮＡの相対量とした。それぞれ同じサンプルについて５０μＬの系を３本用意して行い、その平均の値を結果として使用した。図３に示す通り、全ての症例において正常腎に比べてＣｌｅａｒ ｃｅｌｌ ＲＣＣでＴＬＲ３遺伝子の発現亢進を認めた。
【０１０６】
実施例３ ＴＬＲ３ｃＤＮＡのクローニング、全長強制発現細胞抽出物の調製
ＴＬＲ３のコーディング領域に対してプライマーを設計し、上記実施例２で得られたｃＤＮＡを鋳型としてＰＣＲ反応を行った。ＤＮＡポリメラーゼとしては、ＫＯＤ−ｐｌｕｓ−ｖｅｒ．２（ＴＯＹＯＢＯ）を用いた。尚、ＰＣＲ条件は以下のとおりである。Ｆｏｗａｒｄ ｐｒｉｍｅｒ として配列番号５、Ｒｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒ として配列番号６を用い、ＰＣＲ条件：９４℃２分、（９４℃１５秒、５５℃３０秒、６８℃３分）×２５サイクルにておこなった。得られたＰＣＲ産物をアガロースゲルにて電気泳動して切り出し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて回収した。回収したＤＮＡおよびＺｅｒｏ Ｂｌｕｎｔ ＴＯＰＯ ＰＣＲ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｒｅａｇｅｎｔｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてベクターへの組み込みを行った。コンピテント細胞としてＴＯＰＯ１０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用い、クローニングを行った。コロニーＰＣＲおよびシークエンシングにより、正しいＴＬＲ３ ｃＤＮＡの配列が組み込まれていることが確認されたコンストラクトを、ＥｃｏＲＩおよびＳｍａＩ（ＴａＫａＲａ Ｂｉｏ）により制限酵素処理して、ＴＬＲ３のコーディング領域をプラスミドから切り出し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔを用いてＤＮＡフラグメントを回収した。同様に制限酵素処理した動物細胞発現用ベクターであるｐｈＣＭＶ ｖｅｃｔｏｒ（Ｇｅｎｌａｎｔｉｓ）に、得られたＴＬＲ３のコーディング領域を組み込んだ。ライゲーション試薬としてはＴ４ ＤＮＡ Ｌｉｇａｓｅ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いた。得られたコンストラクトを、ＴＯＰ１０へトランスフォーメーションした。ＱＩＡＧＥＮのＭｉｄＰｒｅｐ ｋｉｔを用いてプラスミドＤＮＡを精製回収した。
【０１０７】
次に、精製されたプラスミドＤＮＡをＣＨＯ細胞（大日本住友製薬）に、ＦｕＧＥＮＥ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ ｒｅａｇｅｎｔ（Ｒｏｃｈｅ）を用いて導入した。細胞は、トランスフェクション前日に、１０ｃｍ ｄｉｓｈに８×１０5個播種した。トランスフェクション時には、ＯｐｔｉＭＥＭ培地(Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ)４００μＬ、ＦｕＧＥＮＥ試薬１６μＬ、プラスミドＤＮＡ８μｇを混合し、１５分間室温にて静置した。その後、混合液を１０ｃｍ ｄｉｓｈに添加した。４８時間後に限外希釈を行い、クローニングを開始した。セレクション薬剤にはＧ４１８(Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ)を１ｍｇ／ｍＬの濃度で使用した。クローニング後の細胞を１０ｃｍ ｄｉｓｈで培養し、コンフルエントになった時点で、プロテアーゼ阻害剤を加えたＲＩＰＡバッファーを用いてタンパク質を回収した。
【０１０８】
実施例４ ＴＬＲ３の免疫用抗原の調製
ＴＬＲ３の細胞外領域（１−７００ａａ）に対してC末端側にヒスチジンタグを付加したプライマーを設計し、上記実施例３で得られたＴＬＲ３のコーディング領域のＤＮＡを鋳型としてＰＣＲ反応を行った。ＤＮＡポリメーラーゼとしては、ＫＯＤ−ｐｌｕｓ−ｖｅｒ．２（ＴＯＹＯＢＯ）を用いた。尚、ＰＣＲ条件は以下のとおりである。Ｆｏｗａｒｄ ｐｒｉｍｅｒとして配列番号７、Ｒｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒとして配列番号８を用い、ＰＣＲ条件：９４℃２分、（９４℃１５秒、５５℃３０秒、６８℃３分）×２５サイクルにておこなった。得られたＰＣＲ産物をアガロースゲルにて電気泳動して切り出し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて回収した。回収したＤＮＡおよびＺｅｒｏ Ｂｌｕｎｔ ＴＯＰＯ ＰＣＲ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｒｅａｇｅｎｔｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてベクターへの組み込みを行った。コンピテント細胞としてＴＯＰＯ１０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用い、クローニングを行った。コロニーＰＣＲおよびシークエンシングにより、正しいＴＬＲ３ ｃＤＮＡの配列が組み込まれていることが確認されたコンストラクトを、ＮｏｔＩおよびＸｂａＩ（ＴａＫａＲａ Ｂｉｏ）により制限酵素処理して、ＴＬＲ３の細胞外領域をプラスミドから切り出し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔを用いてＤＮＡフラグメントを回収した。同様に制限酵素処理した動物細胞発現用ベクターであるｐＮＯＷベクター（イムノ・ジャパン）に、得られたＴＬＲ３の細胞外領域を組み込んだ。ライゲーション試薬としてはＴ４ ＤＮＡ Ｌｉｇａｓｅ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いた。得られたコンストラクトを、ＴＯＰ１０へトランスフォーメーションした。ＱＩＡＧＥＮのＭｉｄＰｒｅｐ ｋｉｔを用いてプラスミドＤＮＡを精製回収した。
【０１０９】
続いて精製回収されたプラスミドＤＮＡをＣＨＯ細胞（大日本住友製薬）に、ＦｕＧＥＮＥ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ ｒｅａｇｅｎｔ（Ｒｏｃｈｅ）を用いて導入した。細胞は、トランスフェクション前日に、１０ｃｍ ｄｉｓｈに８×１０5個播種した。トランスフェクション時には、ＯｐｔｉＭＥＭ培地(Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ)４００μＬ、ＦｕＧＥＮＥ試薬１６μＬ、プラスミドＤＮＡ８μｇを混合し、１５分間室温にて静置した。その後、混合液を１０ｃｍ ｄｉｓｈに添加した。４８時間後に限外希釈を行い、クローニングを開始した。セレクション薬剤にはＧ４１８(Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ)を１ｍｇ／ｍＬの濃度で使用した。クローニング後の細胞を無血清培地ＣＨＯ−ＳＦＭ−ＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用しローラーボトル（Ｆａｌｃｏｎ）にて培養を行い、培養上清を回収した。得られた培養上清からＨｉｓ Ｔｒａｐ ＨＰカラム（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）を用いてＴＬＲ３の細胞外領域（１−７００ａａ）−Ｈｉｓ ｔａｇ融合タンパク質の精製を行った。この精製された融合タンパク質をＰＢＳに対し透析し、免疫用抗原として用いた。
【０１１０】
実施例５ 抗ＴＬＲ３モノクローナル抗体の作製
ＰＢＳに溶解した５０μｇのＴＬＲ３の細胞外領域（１−７００ａａ）−Ｈｉｓ ｔａｇ融合タンパク質とＴｉｔｅｒ−ＭＡＸ（ＴｉｔｅｒＭａｘ ＵＳＡ，Ｉｎｃ．）を等量混合してＭＲＬ／Ｉｐｒマウス（三共ラボサービス）に腹腔内注射することにより初回免疫を行った。２回目以降の免疫は同様に調製した２５μｇタンパク質量相当のＴＬＲ３の細胞外領域（１−７００ａａ）−Ｈｉｓ ｔａｇ融合タンパク質とＴｉｔｅｒ−ＭＡＸを混合して腹腔内注射することにより実施した。最終免疫から３日後にマウスから脾臓細胞を無菌的に調製し、ポリエチレングリコール法によってマウスミエローマ細胞ＮＳ１との細胞融合を行った。
ハイブリドーマ培養上清中の抗ＴＬＲ３抗体のスクリーニングは、ＴＬＲ３の細胞外領域（１−７００ａａ）−Ｈｉｓ ｔａｇ融合タンパク質を固相化したＥＬＩＳＡによって実施した。
【０１１１】
実施例６ 腎癌組織抽出液ＴＬＲ３のイムノブロティング
凍結組織およびＴＬＲ３強制発現ＣＨＯ細胞を液体窒素で満たした乳鉢の中ですり棒を用いてすり潰し、プロテアーゼ阻害剤（ＳＩＧＭＡ）を加えたＲＩＰＡバッファー（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．４、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＥＤＴＡ、１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、１％デオキシコール酸ナトリウム、０．１％ ＳＤＳ）を加えた。３０分間氷上に静置し、４℃、１０分、１０，０００ｒｐｍで遠心して上清をチューブに回収し、等量のサンプルバッファー（２×ＳＤＳバッファー、１０％メルカプトエタノール）を加えて、９５℃で１５分加熱した。加熱後遠心上清を１２％アクリルアミドゲル上に電気泳動した。電気泳動は１００Ｖで１０分間、２００Ｖで５０分間行った。２％スキムミルク／ＴＢＳ−Ｔ（Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００）にてブロッキングを６０分間行った後、一次抗体と室温で６０分間反応させた。一次抗体としては抗ＴＬＲ３モノクローナル抗体（２．５μｇ／ｍＬ，ＩＭＧＥＮＥＸ）および抗β−ａｃｔｉｎモノクローナル抗体（０．３μｇ／ｍＬ，Ｓｉｇｍａ）を用いた。ＴＢＳ−Ｔによる洗浄を行った後、二次抗体と室温で４５分間反応させた。二次抗体としてはＨＲＰラベルされた抗マウスＩｇＧ抗体（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を１／１０，０００に希釈したものを用いた。ＴＢＳ−Ｔによる洗浄を行った後に、化学発光検出試薬であるＥＣＬ−ＰＬＵＳ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）によってＨＲＰの発光を行い、ＬＡＳ ３０００イメージアナライザー(富士フィルム)でバンドを検出した。
【０１１２】
図４に示すように、ＴＬＲ３を強制発現させたＣＨＯ細胞から回収したタンパク質においては、ＴＬＲ３タンパク質の予想サイズである１２０ｋＤａ付近に単一のバンドが得られたが、コントロールのＣＨＯ細胞から回収したタンパク質の場合バンドは認められなかった。一方で、定量的ＲＴ−ＰＣＲによって癌部でのＴＬＲ３遺伝子の発現亢進が確認された検体(９Ｔ)でも同じ位置に単一のバンドを認めた。同一患者の正常腎(９Ｎ)でも同じ位置にごく弱いバンドを認めた。
【０１１３】
実施例７ 腎細胞癌におけるＴＬＲ３タンパク質の局在、および各組織型における発現頻度、ならびに臨床病理学的データとの相関性
（７−１）ＴＭＡブロックの作製
１９９３年から２００４年にかけて東京大学医学部附属病院にて手術的に切除された腎腫瘍２１６例のパラフィンブロックからＴｉｓｓｕｅ ｍｉｃｒｏ ａｒｒａｙ（ＴＭＡ）ブロックを作製した。まず、各症例のスライドガラスを鏡検し、組織型の評価を行うとともに、腫瘍の代表的な部分２箇所に印をつけた。次いで、印をつけたスライドガラスと照らし合わせながら、各症例のパラフィンブロックから２箇所を直径２ｍｍの針で打ち抜き、ＴＭＡブロックに移植した。1ブロックにつき２４症例４８箇所の組織を移植したＴＭＡブロックを９個作成した。ＴＭＡブロックを４μｍの厚さに薄切し、シランコートガラスに貼り付け、免疫染色用の標本とした。なお、連続切片の１枚に対してはＨＥ(ヘマトキシリン・エオジン)染色を行い、組織型の評価を行った。
【０１１４】
（７−２）染色方法
まず、４μｍに薄切された切片に対し、キシレン・エタノール系列で脱パラフィン化と親水化を行った。次に、切片をｐＨ６．０クエン酸バッファーに浸した状態で１０分間オートクレーブ処理（１２１℃）することにより抗原賦活化を行った。一次抗体として、抗ＴＬＲ３モノクローナル抗体（ＩＭＧＥＮＥＸ）を抗体希釈液（ＣｈｅｍＭａｔｅ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｄｉｌｕｅｎｔ，ＤａｋｏＣｙｔｏｍａｔｉｏｎ）で１０倍に希釈し（希釈後濃度２．５μｇ／ｍＬ）、室温で６０分間反応させた。ＴＢＳで洗浄した後、二次抗体として、ＥＮＶＩＳＩＯＮ＋／ＨＲＰ（ＤＡＫＯ）を室温で３０分間反応させ、ＴＢＳで洗浄した。Ｄｉａｍｉｎｏｂｅｎｚｉｄｉｎｅ ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ（ＤＡＢ）で発色を行い、最後にヘマトキシリンで核染色を行い、エタノール、キシレン系列で脱水、透徹して封入した。陰性コントロールとして、全ての切片に対して一次抗体のみを省いて同様の染色工程を行った。陰性コントロール切片では、陽性シグナルは認められなかった。
【０１１５】
染色の強度は０（陰性）、１＋（弱陽性）、２＋（中等度陽性）、３＋（強陽性）の４段階で評価した。染色強度の判定は２人の病理医が独立して行った。ＴＭＡに対する免疫染色では、Ｃｌｅａｒ ｃｅｌｌ ＲＣＣ １８９例、Ｐａｐｉｌｌａｒｙ ＲＣＣ １１例、Ｃｈｒｏｍｏｐｈｏｂｅ ＲＣＣ ８例、計２０８例を対象として評価した。
【０１１６】
ＴＭＡに対する染色の結果、正常腎では、大部分の尿細管および集合管の細胞質に弱陽性像(１＋)がみられた（図５（Ａ））。稀に、中等度陽性(２＋)を示す尿細管も散見された（図５（Ｂ））。また、稀にボウマン嚢上皮にも弱陽性像が観察された。
【０１１７】
Ｃｌｅａｒ ｃｅｌｌ ＲＣＣでは１８９例中１８４例（９７．４）に陽性像が得られた。正常尿細管よりも強い発現を示すもの(２＋および３＋)は１８９例中１３９例（７３．５％）であった。癌部では癌細胞の細胞質に細顆粒状の染色像を認めた(図５（Ｄ，Ｅ）)。間質との境界部で特に発現が増強している症例も認められた(図５（Ｆ）)。癌部では癌細胞特異的に染色され、癌細胞以外の血管内皮細胞や炎症細胞には陽性像は観察されなかった。
Ｐａｐｉｌｌａｒｙ ＲＣＣではＣｌｅａｒ ｃｅｌｌ ＲＣＣと同様に高頻度に発現を認めたが（図６（Ａ）、表７）、Ｃｈｒｏｍｏｐｈｏｂｅ ＲＣＣでは、８例中全てが完全に陰性だった(図６（Ｂ）、表７)。
【０１１８】
【表７】
【０１１９】
（７−３）臨床病理学的データとの相関の検討
Ｃｌｅａｒ ｃｅｌｌ ＲＣＣ １８９例についての、ＴＬＲ３染色強度と臨床病理学的因子との相関を表８に示す。ＴＬＲ３高発現群では、低発現群に比べて静脈侵襲が少ない傾向があったものの、ＴＬＲ３の染色強度と、年齢・性別・核異型度・ｐＴ・静脈侵襲との間に有意差は見られなかった。
【０１２０】
【表８】
【０１２１】
実施例８ Ｃｌｅａｒ ｃｅｌｌ ＲＣＣの肺転移巣におけるＴＬＲ３タンパク質の発現
Ｃｌｅａｒ ｃｅｌｌ ＲＣＣの肺転移巣８例のパラフィン包埋検体を用いて実施例７と同様に免疫染色を行った。
Ｃｌｅａｒ ｃｅｌｌ ＲＣＣ の肺転移巣では、８例中６例（７５％）で、５０％以上の癌細胞に中等度（２＋）以上の陽性像を認めた（図６(Ｃ,Ｄ)）。なお、正常肺胞上皮や終末細気管支上皮では殆どＴＬＲ３の発現はみられなかった。
【０１２２】
実施例９ Ｐｏｌｙ Ｉ：Ｃ単剤による細胞増殖抑制
腎癌細胞株８種を東北大学加齢研（Ｃａｋｉ−１、ＡＣＨＮ、ＳＷ８３９、ＶＭＲＣ−ＲＣＷ）、理研セルバンク（ＯＳ−ＲＣ−２、ＴＵＨＲ１０−ＴＫＢ、ＴＵＨＲ１４−ＴＫＢ）およびＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｃａｋｉ−２）より入手した。細胞は１０％ＦＢＳおよび抗生物質(ペニシリン・ストレプトマイシン)を含む培地を培養液として、５％ ＣＯ2通気下、３７℃にて培養した。使用した培地は、ＡＣＨＮ、ＳＷ８３９、ＶＭＲＣ−ＲＣＷ、ＯＳ−ＲＣ−２、ＴＵＨＲ１０−ＴＫＢ、ＴＵＨＲ１４−ＴＫＢについてはＲＰＭＩ１６４０ ｍｅｄｉｕｍ（ＳＩＧＭＡ）、Ｃａｋｉ−１、Ｃａｋｉ−２についてはＭａｃｏｙ ５Ａ ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｍｅｄｉｕｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）である。各細胞をそれぞれ１０ｃｍ ｄｉｓｈで培養し、７０〜８０％のコンフルエントになった時点でＲＮＡを回収した。１μｇのＲＮＡをテンプレートとしてｃＤＮＡ合成を行い、定量的ＲＴ−ＰＣＲで目的遺伝子の発現量を測定した。ＴＬＲ３遺伝子の発現は全ての細胞株で認められた（図７（Ａ））。発現量には細胞株によってばらつきがあり、最も高発現していたＴＵＨＲ１０−ＴＫＢでは、最も発現が低かったＣａｋｉ−２の９．９倍の発現量を示した。それら腎癌細胞株８種に対してＰｏｌｙ Ｉ：Ｃ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を投与し、細胞増殖の程度を測定した。各細胞を９６−ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅに1ウェルあたり２×１０3個あるいは４×１０3個となるように播種した(播種細胞の個数は増殖速度に応じて調整した)。２４時間後、培地を除去し、各種濃度のＰｏｌｙ Ｉ：Ｃを含む培地を添加し、さらに培養を行った。Ｐｏｌｙ Ｉ：Ｃを添加してから一定時間経過後に、ＷＳＴ−８ ａｓｓａｙ Ｋｉｔ(同仁)を用いて生細胞数の比較を行った。プレートリーダーにて４５０ｎｍの吸光度を測定し、その値からバックグラウンドとして６３０ｎｍの吸光度を差し引いた値を結果として用いた。それぞれ同じ条件について４ウェルの測定を行い、その平均の値を結果として使用した。１０μｇ／ｍＬのＰｏｌｙ Ｉ：Ｃを投与し、７２時間後に吸光度を測定した場合、８個中５個の細胞株（ＴＵＨＲ１０−ＴＫＢ、ＯＳ−ＲＣ−２、ＴＵＨＲ１４−ＴＫＢ、ＳＷ８３９、ＶＭＲＣ−ＲＣＷ）で有意（ｐ＜０．０１）な増殖抑制効果が観察された(図７（Ｂ）)。そして、ＴＬＲ３遺伝子の発現が高い細胞株ほどより強い増殖抑制効果を示す傾向があった。すなわち、１０μｇ／ｍＬのＰｏｌｙ Ｉ：Ｃ投与では、ＴＬＲ３遺伝子の発現が最も高いＴＵＨＲ１０−ＴＫＢに対して最大の増殖抑制効果を示した。そして、１０μｇ／ｍＬのＰｏｌｙ Ｉ：Ｃ添加で有意な増殖抑制効果を示さなかった３株(ＡＣＨＮ、Ｃａｋｉ−１、Ｃａｋｉ−２)ではＴＬＲ３遺伝子の発現は低かった（図７（Ａ））。
Ｐｏｌｙ Ｉ：Ｃによる増殖抑制効果は用量依存性であった。すなわち、ＴＬＲ３遺伝子の発現が最も高かったＴＵＨＲ１０−ＴＫＢに各種濃度のＰｏｌｙ Ｉ：Ｃを投与したところ、Ｐｏｌｙ Ｉ：Ｃの濃度が高いほど強い増殖抑制効果を示した(図７（Ｃ）)。
【０１２３】
実施例１０ Ｐｏｌｙ Ｉ：Ｃ添加によるアポトーシス誘導
Ｐｏｌｙ Ｉ：Ｃによる増殖抑制効果にアポトーシスが寄与しているかどうかを、Ａｎｎｅｘｉｎ−Ｖ染色にて検討した。腎癌細胞株ＴＵＨＲ１０−ＴＫＢを、４−ｗｅｌｌ組織培養用カルチャースライド(ＢＤｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ)に１ウェルあたり５×１０4個となるように播種した。２４時間後、培地を除去し、０または５０μｇ／ｍＬのＰｏｌｙ Ｉ：Ｃを含む培地を添加し、５時間培養を行った。その後、Ａｎｎｅｘｉｎ−Ｖ−ＦＬＵＯＳ Ｓｔａｉｎｉｎｇ Ｋｉｔ（Ｒｏｃｈｅ）のプロトコールに従い、アポトーシスに陥った細胞の観察を行った。すなわち、培養終了後、培地を除去し、ＨＥＰＥＳバッファーで２回洗浄した。次に、Ａｎｎｅｘｉｎ−Ｖ−ＦＬＵＯＳ ｌａｂｅｌｉｎｇ ｓｏｌｕｔｉｏｎを１ウェルあたり１００μＬ添加し、室温で１５分間反応させた。カバーガラスで封入し、蛍光顕微鏡にて４８８ｎｍの波長で観察した。Ｐｏｌｙ Ｉ：Ｃ添加群では約１０％の細胞が陽性を示したのに対し、対照のＰｏｌｙ Ｉ：Ｃ非添加群では、陽性細胞は稀（１％程度）であった（図８）。すなわち、Ｐｏｌｙ Ｉ：Ｃ添加によって細胞アポトーシスが誘導されることがわかった。
【０１２４】
実施例１１ 定量的ＲＴ−ＰＣＲによるＰｏｌｙ Ｉ：Ｃ投与時ＴＬＲ３下流遺伝子の発現変化の解析
腎癌細胞株ＴＵＨＲ１０−ＴＫＢおよびＣａｋｉ−１の培養後、５０μｇ／ｍＬのＰｏｌｙ Ｉ：Ｃを投与し、０、２、６、１２、２４時間後に細胞をＰＢＳで２回洗浄した後、Ｔｒｉｚｏｌを加えホモジナイズした。回収した１μｇのＲＮＡをテンプレートとしてｃＤＮＡ合成を行い、定量的ＲＴ−ＰＣＲで目的遺伝子の発現変化を測定した。ｃＤＮＡ合成および定量的ＲＴ−ＰＣＲは前述の通り行った。内部標準遺伝子としてＡＣＴＢの初期鋳型ｃＤＮＡ量を求め、その値で目的遺伝子の初期鋳型ｃＤＮＡ量を割って補正を行い、得られた数値を目的遺伝子のｍＲＮＡの相対量とした。それぞれ同じサンプルについて５０μＬの系を３本用意して行い、その平均の値を結果として使用した。使用した各サイトカインおよびケモカインのForward primer（Ｆ）およびReverse primer（Ｒ）を以下に示す。各ＰＣＲ条件はサイクル数を除きＩＦＮβと同条件である。
【０１２５】
＜ＩＦＮβ＞：Ｆ（配列番号９）、Ｒ（配列番号１０）；９４℃３分、（９４℃１５秒、６０℃１５秒、７２℃３０秒）×３８サイクル
＜ＩＬ６＞：Ｆ（配列番号１１）、Ｒ（配列番号１２）；×４０サイクル
＜ＩＬ８＞：Ｆ（配列番号１３）、Ｒ（配列番号１４）；×４０サイクル
＜ＩＰ１０（ＣＸＣＬ１０）＞：Ｆ（配列番号１５）、Ｒ（配列番号１６）；×３５サイクル
＜ＲＡＮＴＥＳ（ＣＣＬ５）＞：Ｆ（配列番号１７）、Ｒ（配列番号１８）；×３５サイクル
【０１２６】
まず、ＴＬＲ３シグナルにおいて最も重要な役割を果たすＩＦＮβの発現について検討した。ＴＵＨＲ１０−ＴＫＢおよびＣａｋｉ−１はいずれも定常状態ではほとんどＩＦＮβの発現はみられなかったが、ｐｏｌｙ Ｉ：Ｃ添加によって発現が著明に増加した(図７（Ｄ）)。ＩＦＮβの発現増強は、ＴＬＲ３発現の高いＴＵＨＲ１０−ＴＫＢ株でより顕著であった。また、ＴＵＨＲ１０−ＴＫＢ株について、ＴＬＲ３の下流遺伝子として知られているＩＬ６、ＩＬ８、ＩＰ１０（ＣＸＣＬ１０）、ＲＡＮＴＥＳ（ＣＣＬ５）のｐｏｌｙ Ｉ：Ｃ添加による経時的な発現変化を調べた。いずれの遺伝子も定常状態ではほとんど発現はなかったが、ｐｏｌｙ Ｉ：Ｃ添加の2時間後には発現の上昇がみられ、さらに時間の経過とともに発現が上昇していった(図９（Ａ−Ｄ）)。ＴＬＲ３の発現も、ｐｏｌｙ Ｉ：Ｃ添加から６時間後より上昇した(図９（Ｅ））。
【０１２７】
実施例１２ ｓｉＲＮＡによるＴＬＲ３遺伝子の発現抑制
腎癌細胞株ＯＳ−ＲＣ−２について、ＴＬＲ３を標的としたｓｉＲＮＡによるＴＬＲ３の発現抑制解析を行った。ｓｉＲＮＡの導入はＨｉＰｅｒＦｅｃｔ（ＱＩＡＧＥＮ）のプロトコールに従い、リバーストランスフェクション法を用いて行った。ＯｐｔｉＭＥＭ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に、ＨｉＰｅｒＦｅｃｔおよびｓｉＲＮＡを最終濃度２０ｎＭとなるように混合し、抗生物質を含まない細胞懸濁液を添加した。６−ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅで４８時間培養した後ＲＮＡを回収した。１μｇのＲＮＡをテンプレートとしてｃＤＮＡ合成を行い、定量的ＲＴ−ＰＣＲで目的遺伝子の発現変化を測定した。ｓｉＲＮＡの配列は配列番号１９に示した。陰性コントロールとして、Ｓｔｅａｌｔｈ ＲＮＡｉ Ｎｅｇａｔｉｖｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｋｉｔ ｗｉｔｈ Ｍｅｄｉｕｍ ＧＣ（ＧＣ ４８％）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用した。さらに、上記と同様に、腎癌細胞株ＯＳ−ＲＣ−２に対して最終濃度２０ｎＭのｓｉＲＮＡを導入し、９６−ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅで７２時間培養した。その後、０または５０μｇ／ｍＬのｐｏｌｙ Ｉ：Ｃ溶液（抗生物質を含む）を添加し、さらに４８時間培養した後、前述の通り、ＷＳＴ−８ ａｓｓａｙ Ｋｉｔを用いて生細胞数の比較を行った。それぞれ同じ条件について４ウェルの測定を行い、その平均の値を結果として使用した。その結果、ＴＬＲ３を標的としたｓｉＲＮＡによって、陰性コントロールと比較してＴＬＲ３遺伝子の著明な発現抑制がみられた（図１０（Ａ））。次いで、ｓｉＲＮＡによってＴＬＲ３遺伝子の発現を抑制したときの細胞増殖に与える変化およびｐｏｌｙ Ｉ：Ｃによる増殖抑制効果ならびにＩＦＮβ遺伝子発現の変化を検討した。まず、ＴＬＲ３遺伝子の発現を抑制すること自体は細胞増殖に変化を与えなかった（図１０（Ｂ））。しかし、ＴＬＲ３遺伝子の発現を抑制することにより、ｐｏｌｙ Ｉ：Ｃによる増殖抑制効果は有意に減弱した。すなわち、コントロール株ではｐｏｌｙ Ｉ：Ｃ添加によって３７％の増殖抑制効果（ｐｏｌｙ Ｉ：Ｃ非投与群の吸光度に対する投与群の吸光度の減少割合を示す）を示したのに対し、ＴＬＲ３遺伝子の発現を抑制したものでは増殖抑制効果が１７％に半減した（図１０（Ｂ））。すなわち、ｐｏｌｙ Ｉ：Ｃによる増殖抑制効果はＴＬＲ３の発現に依存しているということが示された。また、ＴＬＲ３遺伝子の発現を抑制することにより、ｐｏｌｙ Ｉ：ＣによるＩＦＮβの発現誘導が抑制された(図１０（Ｃ）)。すなわち、ｐｏｌｙ Ｉ：ＣによるＩＦＮβの発現誘導もＴＬＲ３の発現に依存しているということが示された。
【０１２８】
実施例１３ ｐｏｌｙ Ｉ：ＣおよびＩＦＮαの併用による感受性試験
腎癌細胞株Ｃａｋｉ−１に対して、ｐｏｌｙ Ｉ：ＣおよびＩＦＮαを併用することによる増殖の変化を測定した。まず、９６−ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅに1ウェルあたり２×１０3個となるように細胞を播種した。播種後２４時間で培地を除去し、ＩＦＮα（０、１００、１０００、１００００Ｕ／ｍＬ）を含む培地を添加した。ＩＦＮα添加２４時間後、培地を除去し、ｐｏｌｙ Ｉ：Ｃ(０、１０、５０μｇ／ｍＬ)を含む培地を添加した。さらに４８時間培養を行った後、ＷＳＴ−８ ａｓｓａｙ Ｋｉｔを用いて生細胞数の比較を行った。それぞれ同じ条件について４ウェルの測定を行い、その平均の値を結果として使用した。
Ｃａｋｉ−１に対して、ＩＦＮαとｐｏｌｙ Ｉ：Ｃは相乗的な増殖抑制効果を示した（図１１（Ａ））。すなわち、ＩＦＮαを加えなかった場合、ｐｏｌｙ Ｉ：Ｃのみによる増殖抑制効果は乏しかったが（ｐｏｌｙ Ｉ：Ｃ ５０μｇ／ｍＬのものは、ｐｏｌｙ Ｉ：Ｃなしのものに比べて１７％の増殖抑制効果）、ＩＦＮαの投与により、ｐｏｌｙ Ｉ：Ｃによる増殖抑制効果が著明に増強した。具体的には、ＩＦＮαを１００、１０００、１００００Ｕ／ｍＬ加えた場合（それぞれ単独では１１、１９、２３％の増殖抑制効果を示すにすぎない）、さらにｐｏｌｙ Ｉ：Ｃ ５０μｇ／ｍＬを加えたときの増殖抑制効果（ｐｏｌｙ Ｉ：Ｃ、ＩＦＮαのいずれも添加しなかった群の吸光度に対する目的群の吸光度の減少割合を示す。以下同じ。）はそれぞれ５０、７１、７６％に増強した。また、ＩＦＮα単独の場合増殖抑制効果は乏しかったが（ＩＦＮα １００００Ｕ／ｍＬのものは、ＩＦＮαなしのものに比べて２３％の増殖抑制効果）、ＩＦＮα添加培養のｐｏｌｙ Ｉ：Ｃを加えた場合、ＩＦＮαによる増殖抑制効果が著明に増強した。具体的には、ｐｏｌｙ Ｉ：Ｃを１０あるいは５０μｇ／ｍＬ加えた場合（それぞれ単独では９、１７％の増殖抑制効果を示すにすぎない）、ＩＦＮα １００００Ｕ／ｍＬを加えたものの増殖抑制効果はそれぞれ５７、７６％に増強した。
【０１２９】
実施例１４ ＩＦＮα添加によるＴＬＲ３遺伝子の発現変化
実施例１３と同様に腎癌細胞株Ｃａｋｉ−１に、ＩＦＮα（０,１００,１０００,１００００Ｕ／ｍＬ）を添加し、６時間後にＲＮＡを回収した。１μｇのＲＮＡをテンプレートとしてｃＤＮＡ合成を行い、定量的ＲＴ−ＰＣＲでＴＬＲ３遺伝子の発現変化を測定した。ＩＦＮα投与により、ＴＬＲ３遺伝子の発現上昇がみられた。定常状態と比較し、ＴＬＲ３遺伝子の発現量はＩＦＮα １００Ｕ／ｍＬ添加により３．４倍、１００００Ｕ／ｍＬ添加により４．８倍に増加した(図１１（Ｂ）)。
【０１３０】
実施例１５ ＩＦＮαおよびｐｏｌｙ Ｉ：Ｃ添加によるＴＬＲ３下流遺伝子の発現変化
実施例１３と同様に、腎癌細胞株Ｃａｋｉ−１に、０、１００、１０００、１００００Ｕ／ｍＬのＩＦＮαを投与して２４時間培養した後、０あるいは５０μｇ／ｍＬのｐｏｌｙ Ｉ：Ｃを投与し、６時間後にＲＮＡを回収した。１μｇのＲＮＡをテンプレートとしてｃＤＮＡ合成を行い、定量的ＲＴ−ＰＣＲで目的遺伝子の発現変化を測定した。ＩＦＮβ、ＩＬ６、ＩＬ８、ＩＰ１０、ＲＡＮＴＥＳのいずれも、ｐｏｌｙ Ｉ：Ｃを添加しなかった場合は、プレインキュベートしたＩＦＮαの濃度に関わらず、発現はほとんどみられなかった（ＩＦＮβ、ＩＬ６、ＩＬ８、ＲＡＮＴＥＳについて図１０（Ｄ−Ｆ）に示す。ＩＰ１０については省略）。ｐｏｌｙ Ｉ：Ｃ添加により、全ての遺伝子の発現が上昇した。そして、遺伝子発現上昇の程度はＩＦＮαの濃度に依存していた。すなわち、同じ濃度（５０μｇ／ｍＬ）のｐｏｌｙ Ｉ：Ｃを添加した場合、プレインキュベートしたＩＦＮαの濃度が高いほど、ＴＬＲ３下流遺伝子の発現量は高くなった（図１０（Ｃ−Ｆ））。
【図面の簡単な説明】
【０１３１】
【図１】腎癌症例および遺伝子の２方向による階層的クラスター解析の結果を示す。
【図２】腎癌および正常組織のＧｅｎｅＣｈｉｐ解析によるＴＬＲ３の遺伝子発現量を示す。
【図３】腎癌および正常組織における定量的ＲＴ−ＰＣＲによるＴＬＲ３遺伝子の発現量を示す。
【図４】Ｃｌｅａｒ ｃｅｌｌ ＲＣＣ、正常腎組織ペア検体およびにＴＬＲ３強制発現ＣＨＯ細胞おける腎癌組織抽出液ＴＬＲ３のイムノブロティング結果を示す。
【図５】腎癌におけるＴＬＲ３タンパク質の局在を示す。
【図６】腎癌各組織型および転移巣における発現頻度を示す。
【図７】Ｐｏｌｙ Ｉ：Ｃ単剤による細胞増殖抑制効果結果を示す。
【図８】Ｐｏｌｙ Ｉ：Ｃ添加によるアポトーシス誘導結果を示す。
【図９】定量的ＲＴ−ＰＣＲによるＰｏｌｙ Ｉ：Ｃ投与時ＴＬＲ３下流遺伝子の発現変化の解析結果を示す。
【図１０】ｓｉＲＮＡによるＴＬＲ３遺伝子の発現抑制結果を示す。
【図１１】ｐｏｌｙ Ｉ：ＣおよびＩＦＮαの併用による細胞増殖に対する相乗効果結果を示す。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗ＴＬＲ３抗体を利用した腎癌の診断薬およびＴＬＲ３アゴニストを利用した腎癌の治療薬に関する。
【背景技術】
【０００２】
腎細胞癌（ｒｅｎａｌ ｃｅｌｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ；ＲＣＣ）は成人悪性腫瘍の２−３％を占め、日本およびアメリカでは罹患率・死亡率ともに増加傾向にある（非特許文献１，２）。腎細胞癌の主な組織型としては、（１）Ｃｌｅａｒ ｃｅｌｌ ＲＣＣ（約８０％）、（２）Ｐａｐｉｌｌａｒｙ ＲＣＣ（１０−１５％）、（３）Ｃｈｒｏｍｏｐｈｏｂｅ ＲＣＣ（約５％）、（４）Ｃｏｌｌｅｃｔｉｎｇ ｄｕｃｔ ｃａｒｃｉｎｏｍａ（約１％）がある（非特許文献３）。また、分化が悪くなり癌細胞が肉腫様に変化するｓａｒｃｏｍａｔｏｉｄ ｃｈａｎｇｅは全ての組織型に伴いうる。
【０００３】
腎癌に対しては、画像検査技術の進歩により早期発見症例が増えた反面、いまだに遠隔転移を有する症例が減っていないのが現状である。すなわち、腎癌については、発見の遅滞あるいは従来適切な治療法が無かったことを意味する。従って、腎癌の簡便かつ的確な早期発見技術および有効な治療法の開発が望まれている。近年多くの癌種において癌特異的に発現されているタンパク質をターゲットとした、診断方法および治療方法の研究が盛んであるが、多くは遺伝子レベルでの解析に止まり、進展していないのが現状である。
【０００４】
腎細胞癌の現状での治療法としては早期外科的切除が有効とされているが、根治的切除不能例や再発例のような進行性腎細胞癌には、有効な治療法がない。すなわち、これら進行性腎細胞癌に対する治療としては、他の癌腫で通常行われる化学療法や放射線療法はほとんど効果を示さないとされている（非特許文献４，５）。その反面、一部の症例に対してインターフェロンα（ＩＦＮα）やインターロイキン２といった免疫療法が奏効することが腎細胞癌の特徴であり、日本では進行性腎細胞癌の治療には広くＩＦＮαが用いられている。しかし、進行性腎細胞癌症例に対するＩＦＮαの奏功率は１０−２０％程度に過ぎない（非特許文献６，７）。ゆえに、進行性腎細胞癌に対する有効な治療法の開発が望まれている。
【０００５】
ｔｏｌｌ−ｌｉｋｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＴＬＲ）は、病原体からの刺激に対して自然免疫担当細胞を活性化させることで感染防御に働く分子である。ＴＬＲは現在までに１３種類が知られており（ヒトでは１０種類）、その大部分はリガンドが同定されており（非特許文献８）、それらには細菌細胞壁成分であるＬＰＳ、リポタイコ酸、ペプチドグリカン、細菌鞭毛成分フラジェリン、細菌あるいはウイルス由来ＣｐＧ ＤＮＡ、ウイルス由来1本鎖ＲＮＡ、ウイルス由来２本鎖ＲＮＡ、ウイルス由来タンパク質がある。多くのＴＬＲｓはリガンド結合後アダプター分子であるＭｙＤ８８依存的な経路を介して転写因子ＮＦ−κＢを核に移行させることでサイトカインであるＴＮＦＩαやＩＬ−６と同様な炎症性作用を示すことにより、病原体の侵入に対して感染防御に働くことにその主な役割があると従来考えられていた。しかし、ある種のＴＬＲは癌細胞にも発現しており、ＴＬＲが癌細胞の増殖に有利な環境を作り出しているということも最近になって考えられるようになってきている（非特許文献９）。その一方で、ＴＬＲアゴニストが癌の治療に用いられる可能性も考えられる（非特許文献１０）。いわばＴＬＲは癌にとって有利にも不利にも働きうる、「諸刃の剣」的な存在と言える（非特許文献１１）。
【０００６】
ＴＬＲ３は、１９９８年のＲｏｃｋ，Ｆ．Ｌ．による発見後（非特許文献１２）、多くの文献が報告され、自然免疫に関与することが明らかにされた。すなわち、ＴＬＲ３は他のＴＬＲｓとは異なり、ウイルスが産生する二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）がリガンドであり、リガンド結合後ＭｙＤ８８非依存的なＴＲＩＦ経路で、ＩＦＮの産生を誘導することにより抗ウイルス作用を発揮することおよびＮＦκＢの活性化が知られている（非特許文献１３）。
【０００７】
ＴＬＲ３が自然免疫に関与することから、炎症および癌に応用可能との推論のもと、医療に関与する文献が多数報告されている（特許文献１〜４）。それらは、ＴＬＲ３の生理機能としてのＩＦＮ−β、ＩＦＮ誘導性遺伝子群および炎症性サイトカインへの影響を想定したアンタゴニストまたはアゴニスト作用を示す特許文献である。
【０００８】
ＴＬＲ３の発現は、細胞としては樹状細胞、線維芽細胞、腸上皮細胞、グリア細胞、臍帯静脈血管内皮細胞に、正常組織では子宮内膜、腎臓、癌組織では大腸癌（特許文献５）および腎臓癌（非特許文献１４）組織においてＴＬＲ３が高発現していることが示されている。しかしながら、特許文献５および非特許文献１４はマイクロアレイによる遺伝子発現解析のみであり、タンパク質発現については明らかにされていない。
【０００９】
ＴＬＲ３と癌の診断および治療に関する文献として、特許文献５で乳癌、大腸癌、肺癌、胃癌、前立腺癌、子宮癌、子宮頸部癌、子宮内膜癌、皮膚癌、および白血病に対する、抗体による診断と治療が特許請求の範囲に記載されているが、大腸癌における結果を示しているに過ぎず、腎癌に対する実施例はない。さらに、特許文献４においては、腎癌を含む多種類の癌の抗ＴＬＲ３抗体による診断・治療が特許請求の範囲に記載されているが、乳癌について記載されているだけで、腎癌に関する実施例は全くない。
【非特許文献１】Ｉｎｔ Ｊ Ｕｒｏｌ．２００１；８：３５９−６５
【非特許文献２】ＪＡＭＡ．１９９９；２８１：１６２８−３１
【非特許文献３】Ｊ Ｐａｔｈｏｌ．１９９７；１８３：１３１−３
【非特許文献４】Ｊ Ｕｒｏｌ．２０００；１６３：４０８−１７
【非特許文献５】Ｌａｎｃｅｔ．１９９８；３５２：１６９１−６
【非特許文献６】Ｊ Ｕｒｏｌ．１９９９；１６１：３８１−７
【非特許文献７】Ｌａｎｃｅｔ．１９９９；３５３：１４−７
【非特許文献８】Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００４；４：４９９−５１
【非特許文献９】Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２００５；６５：５００９−１４
【非特許文献１０】Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ．２００６；５：４７１−８４
【非特許文献１１】Ｂｒ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ．２００６；９５：２４７−５２
【非特許文献１２】Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．１９９８；９５：５８８−５９３
【非特許文献１３】Ｎａｔｕｒｅ．２００１；４１３：７３２−８
【非特許文献１４】ＢＭＣ Ｃａｎｃｅｒ．２００３；３：１−１９
【特許文献１】国際公開第２００６／０６０５１３号パンフレット
【特許文献２】米国特許出願公開第２００６０１４７４５６号明細書
【特許文献３】米国特許出願公開第２００６０１１５４７５号明細書
【特許文献４】国際公開第２００６／０５４１７７号パンフレット
【特許文献５】国際公開第２００５／０２６７３５号パンフレット
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
腎癌の治療としては早期外科的切除が有効とされているが、手術による治療は、転移巣の治療が困難であるばかりなく、侵襲と合併症の併発を伴うことが多い。根本的切除不能例や再発例のような進行性癌には、有効な治療法がないゆえに、初期の腎癌を早期に診断する必要がある。従って、腎癌に対する早期診断法および治療法の開発が望まれている。
【００１１】
本発明の目的は、精度良く、早期腎癌を診断する方法と、効果的な治療方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
腎癌特異的に高発現している細胞表面分子の探索をマイクロアレイ解析により実施した結果、Ｃｌｅａｒ ｃｅｌｌ ＲＣＣにおいては自然免疫応答に関与する遺伝子群が特徴的に高発現していることが明らかとなり、自然免疫応答がＣｌｅａｒ ｃｅｌｌ ＲＣＣの病因に繋がる可能性が考えられた。また、自然免疫応答に関与することが報告されているＴＬＲ３が遺伝子レベルでＣｌｅａｒ ｃｅｌｌ ＲＣＣ特異的に高発現していることが認められ、併せてＲＴ−ＰＣＲによりＣｌｅａｒ ｃｅｌｌ ＲＣＣ特異的に高発現が確認できた。
次いで、Ｃｌｅａｒ ｃｅｌｌ ＲＣＣ組織に対し抗ＴＬＲ３抗体による組織免疫染色を検討した結果、Ｃｌｅａｒ ｃｅｌｌ ＲＣＣ組織では細胞質に細顆粒状として１８９症例中１８４例においてＴＬＲ３タンパク質が染色された。そのうち１３９例において強く染色されることが確認できたのに対し、Ｃｈｒｏｍｏｐｈｏｂｅ ＲＣＣでは全く染色されなかった。さらに、腎癌の肺転移８症例中６例においてもＴＬＲ３陽性像が確認できた。
一方、複数の腎癌細胞株へのリガンドまたはｓｉＲＮＡの添加により、ＴＬＲ３発現量に比例した増殖抑制効果が認められた。さらに、腎癌細胞株へのリガンドの添加により抗腫瘍効果が期待できるＩＦＮβの発現が誘導された。この結果は、ＴＬＲ３発現腎癌細胞を直接的に治療する方法であり、従来の自然免疫担当細胞である樹上細胞等のリガンドによる活性化を介した癌の治療とは異なることを見出し、本発明を完成させるに至った。
【００１３】
すなわち、本発明は、抗ＴＬＲ３抗体を含有する腎癌の診断薬を提供するものである。
また、本発明は、被験者から採取された試料に抗ＴＬＲ３抗体を反応させ、あるいは被験者に抗ＴＬＲ３抗体を投与して、ＴＬＲ３タンパク質を検出することを特徴とする腎癌の診断方法を提供するものである。
さらに、本発明は、ＴＬＲ３アゴニストを投与することを特徴とする腎癌の治療方法、およびＴＬＲ３アゴニストを含有する腎癌の治療薬を提供するものである。
【発明の効果】
【００１４】
本発明によれば、特異的に検出できる分子イメージング（ＰＥＴ）で行う方法および血液診断ならびにバイオプシーにより採取した組織を用いた腎癌の早期診断（生検）が可能となり、早急に新たな腎癌治療計画の策定が可能となる。また、手術を伴わず、患者に負担をかけない腎癌の非侵襲的な治療の実施が可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
本発明により、診断および治療される疾患は、腎癌である。診断および治療の対象となる動物は、ヒトであることが好ましいが、イヌ、ネコ、ウサギ、マウス、ラット、モルモット等のヒト以外の哺乳類でも良い。
【００１６】
本発明において腎癌の診断を行う場合、被験者の血液中および臓器組織にＴＬＲ３タンパク質が検出された場合に、被験者が腎癌である可能性が高いと判定される。また、腎癌と診断された患者の血液あるいは組織中ＴＬＲ３タンパク質濃度を測定することにより、その患者が治療対象患者か否かを判定すること（治療対象患者の選択）ができる。さらに、腎癌の治療後、ＴＬＲ３タンパク質測定において、タンパク質の量が術前より減少した場合、治療の経過が良好であると判定される。一方、治療後のＴＬＲ３タンパク質の量が低下しないあるいは増加する場合には、再発および転移があると判定される。腎癌診断は、画像診断、生検および血液診断により行うことができる。
【００１７】
画像診断においては、標識した抗ＴＬＲ３抗体を投与後画像診断によりＴＬＲ３タンパク質を検出することにより行うことができる。より具体的には、抗ＴＬＲ３抗体に、標識物質として放射性同位元素で標識したプローブを被験者に投与し、ＰＥＴまたはＳＰＥＣＴで腎癌組織を検出することができる。使用する放射性同位元素は、当業者に公知の物質を用いることができるが、好ましくは陽電子放出放射性同位元素であり、さらに好ましくは11Ｃ、13Ｎ、18Ｆ、15Ｏ、94mＴｃ、124Ｉである。抗ＴＬＲ３抗体への放射性同位元素の標識は、当業者に公知の方法により行うことができる。
【００１８】
生検により腎癌診断を行う方法として、被験者から得られた臓器組織を試料として、免疫学的測定法を行うことができる。例えば、ラジオイムノアッセイ、エンザイムイムノアッセイ、蛍光イムノアッセイ、発光イムノアッセイ、免疫沈降法、免疫比濁法、ウェスタンブロット、免疫染色、免疫拡散法などを挙げることができるが、好ましくは免疫染色である。免疫染色などの上述した免疫学的方法は当業者に公知の方法により行うことが可能である。
【００１９】
生検により腎癌診断を行う他の様態として、抗ＴＬＲ３抗体を一次抗体として使用した免疫組織学的染色法を行うことができる。具体的には、被験者から得られた検体を公知の方法によりパラフィンや凍結等により固定し、切片を作製する。次いで、切片を一次抗体として抗ＴＬＲ３抗体、二次抗体としてＩｇＧを認識するビオチン標識抗体をそれぞれ用いて処理する。二次抗体は、ＩｇＧを認識する公知の抗体を用いることができ、例えばウサギ抗ＩｇＧ抗体などを挙げることができる。二次抗体に標識物質を結合させ、それぞれの標識物質に適した公知の方法により、切片中のタンパク質の有無を検出する。また、二次抗体を使用せず、抗ＴＬＲ３抗体に標識物質を結合させ、免疫組織学的染色法を行うこともできる。標識物質は当業者公知の物質を用いることができるが、例えばペルオキシターゼ、ＦＩＴＣなどを挙げることができる。抗体と標識物質の結合は、当業者に公知の方法で行うことができ、具体的には、ストレプトアビジンとビオチンを利用した結合方法を挙げることができる。
【００２０】
腎癌診断を行う他の様態として、被験者から得られた血液、血清、または血漿を試料として、免疫学的測定法を行うことができる。例えば、ラジオイムノアッセイ、エンザイムイムノアッセイ、蛍光イムノアッセイ、発光イムノアッセイ、免疫沈降法、免疫比濁法、ウェスタンブロット、免疫拡散法などを挙げることができるが、好ましくはエンザイムイムノアッセイであり、特に好ましいのは酵素結合免疫吸着定量法(enzyme-linked immunosorbent assay：ＥＬＩＳＡ)（例えば、sandwich ELISA）である。ＥＬＩＳＡなどの上述した免疫学的方法は当業者に公知の方法により行うことが可能である。
【００２１】
血液、血清、または血漿を検体とした腎癌診断方法としては、例えば、抗ＴＬＲ３抗体を支持体に固定し、ここに被検試料を加え、インキュベートを行い抗ＴＬＲ３抗体とタンパク質を結合させた後に洗浄して、抗ＴＬＲ３抗体を介して支持体に結合したＴＬＲ３タンパク質の検出を行う方法を挙げることができる。
【００２２】
本発明において抗ＴＬＲ３抗体を固定するために用いられる支持体としては、例えば、アガロース、セルロースなどの不溶性の多糖類、シリコン樹脂、ポリスチレン樹脂、ポリアクリルアミド樹脂、ナイロン樹脂、ポリカーボネイト樹脂などの合成樹脂や、ガラス、フェライトなどの不溶性の支持体を挙げることができる。これらの支持体は、ビーズやプレートなどの形状で用いることが可能である。ビーズの場合、これらが充填されたカラムなどを用いることができる。プレートの場合、マルチウェルプレート（９６穴マルチウェルプレート等）、やバイオセンサーチップなどを用いることができる。抗ＴＬＲ３抗体と支持体との結合は、化学結合や物理的な吸着などの通常用いられる方法により結合することができる。これらの支持体はすべて市販のものを用いることができる。
【００２３】
抗ＴＬＲ３抗体と試料中のＴＬＲ３タンパク質との結合は、通常、緩衝液中で行われる。緩衝液としては、例えば、リン酸緩衝液、Ｔｒｉｓ 緩衝液、クエン酸緩衝液、ホウ酸塩緩衝液、炭酸塩緩衝液などが使用され、通常用いるｐＨの範囲であればよい。また、インキュベーションの条件としては、すでによく用いられている条件、例えば、４℃〜３７℃にて１時間〜２４時間のインキュベーションが行われる。インキュベート後の洗浄は、抗ＴＬＲ３抗体とＴＬＲ３タンパク質の結合を妨げないものであれば何でもよく、例えば、Ｔｗｅｅｎ−２０等の界面活性剤を含む緩衝液などが使用される。
【００２４】
本発明によるＴＬＲ３タンパク質の検出方法においては、ＴＬＲ３タンパク質を検出したい被検試料の他に、コントロール試料を設置してもよい。コントロール試料としては、ＴＬＲ３タンパク質を含まない陰性コントロール試料やＴＬＲ３タンパク質を含む陽性コントロール試料などがある。この場合、ＴＬＲ３タンパク質を含まない陰性コントロール試料で得られた結果と、ＴＬＲ３タンパク質を含む陽性コントロール試料で得られた結果と比較することにより、被検試料中のＴＬＲ３タンパク質を検出することが可能である。また、濃度を段階的に変化させた一連のコントロール試料を調製し、各コントロール試料に対する検出結果を数値として得て、標準曲線を作成し、被検試料の数値から標準曲線に基づいて、被検試料に含まれるＴＬＲ３タンパク質を定量的に検出することも可能である。
【００２５】
抗ＴＬＲ３抗体を介して支持体に結合したＴＬＲ３タンパク質の検出の好ましい態様として、標識物質で標識された抗ＴＬＲ３抗体を用いる方法を挙げることができる。例えば、支持体に固定された抗ＴＬＲ３抗体に被検試料を接触させ、洗浄後に、ＴＬＲ３タンパク質を特異的に認識する標識抗体を用いて検出する。
【００２６】
抗ＴＬＲ３抗体の標識は通常知られている方法により行うことが可能である。標識物質としては、蛍光色素、酵素、補酵素、化学発光物質、放射性物質などの当業者に公知の標識物質を用いることが可能であり、具体的な例としては、ラジオアイソトープ(32P、14C、125I、3H、131Iなど)、フルオレセイン、ローダミン、ダンシルクロリド、ウンベリフェロン、ルシフェラーゼ、ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β-ガラクトシダーゼ、β-グルコシダーゼ、ホースラディッシュパーオキシダーゼ、グルコアミラーゼ、リゾチーム、サッカリドオキシダーゼ、マイクロペルオキシダーゼ、ビオチン、ルテニウムなどを挙げることができる。標識物質としてビオチンを用いる場合には、ビオチン標識抗体を添加後に、ペルオキシダーゼなどの酵素を結合させたストレプトアビジンをさらに添加することが好ましい。標識物質と抗ＴＬＲ３抗体との結合には、グルタルアルデヒド法、マレイミド法、ピリジルジスルフィド法、過ヨウ素酸法、などの公知の方法を用いることができる。
【００２７】
具体的には、抗ＴＬＲ３抗体を含む溶液をプレートまたはビーズなどの支持体に加え、抗ＴＬＲ３抗体を支持体に固定する。プレート、またはビーズを洗浄後、タンパク質の非特異的な結合を防ぐため、例えばＢＳＡ、ゼラチン、アルブミンなどでブロッキングする。再び洗浄し、被検試料をプレートまたはビーズに加える。インキュベートの後、洗浄し、標識抗ＴＬＲ３抗体を加える。適度なインキュベーションの後、プレートまたはビーズを洗浄し、支持体に残った標識抗ＴＬＲ３抗体を検出する。検出は当業者に公知の方法により行うことができ、例えば、放射性物質による標識の場合には液体シンチレーションやＲＩＡ法により検出することができる。酵素による標識の場合には基質を加え、基質の酵素的変化、例えば発色を吸光度計により検出することができる。基質の具体的な例としては、２，２−アジノビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸）ジアンモニウム塩（ＡＢＴＳ）、１，２−フェニレンジアミン（オルソ−フェニレンジアミン）、３，３'，５，５'−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）などを挙げることができる。蛍光物質または化学発光物質の場合にはルミノメーターにより検出することができる。
【００２８】
本発明のＴＬＲ３タンパク質検出方法の特に好ましい態様として、ビオチンで標識された抗ＴＬＲ３抗体と、ストレプトアビジンを用いる方法を挙げることができる。
【００２９】
具体的には、抗ＴＬＲ３抗体を含む溶液をプレートなどの支持体に加え、抗ＴＬＲ３抗体を固定する。プレートを洗浄後、タンパク質の非特異的な結合を防ぐため、例えばＢＳＡなどでブロッキングする。再び洗浄し、被検試料をプレートに加える。インキュベートの後、洗浄し、ビオチン標識抗ＴＬＲ３抗体を加える。適度なインキュベーションの後、プレートを洗浄し、アルカリホスファターゼ、ペルオキシダーゼなどの酵素と結合したアビジンを加える。インキュベーション後、プレートを洗浄し、アビジンに結合している酵素に対応した基質を加え、基質の酵素的変化などを指標にＴＬＲ３タンパク質を検出する。
【００３０】
本発明のＴＬＲ３タンパク質検出方法の他の態様として、ＴＬＲ３タンパク質を特異的に認識する一次抗体を一種類以上、および該一次抗体を特異的に認識する二次抗体を一種類以上用いる方法を挙げることができる。
【００３１】
例えば、支持体に固定された一種類以上の抗ＴＬＲ３抗体に被検試料を接触させ、インキュベーションした後、洗浄し、洗浄後に結合しているＴＬＲ３タンパク質を、一次抗ＴＬＲ３抗体、および該一次抗体を特異的に認識する一種類以上の二次抗体により検出する。この場合、二次抗体は好ましくは標識物質により標識されている。
【００３２】
本発明のＴＬＲ３タンパク質の検出方法の他の態様としては、凝集反応を利用した検出方法を挙げることができる。該方法においては、抗ＴＬＲ３抗体を感作した担体を用いてＴＬＲ３タンパク質を検出することができる。抗体を感作する担体としては、不溶性で、非特異的な反応を起こさず、かつ安定である限り、いかなる担体を使用してもよい。例えば、ラテックス粒子、ベントナイト、コロジオン、カオリン、固定羊赤血球等を使用することができるが、ラテックス粒子を使用するのが好ましい。ラテックス粒子としては、例えば、ポリスチレンラテックス粒子、スチレン−ブタジエン共重合体ラテックス粒子、ポリビニルトルエンラテックス粒子等を使用することができるが、ポリスチレンラテックス粒子を使用するのが好ましい。感作した粒子を試料と混合し、一定時間攪拌する。試料中にＴＬＲ３タンパク質が高濃度で含まれるほど粒子の凝集度が大きくなるので、凝集を肉眼でみることによりＴＬＲ３タンパク質を検出することができる。
また、凝集による濁度を分光光度計等により測定することによっても検出することが可能である。
【００３３】
本発明のタンパク質の検出方法の他の態様としては、例えば、表面プラズモン共鳴現象を利用したバイオセンサーを用いた方法を挙げることができる。表面プラズモン共鳴現象を利用したバイオセンサーはタンパク質−タンパク質間の相互作用を微量のタンパク質を用いてかつ標識することなく、表面プラズモン共鳴シグナルとしてリアルタイムに観察することが可能である。例えば、ＢＩＡｃｏｒｅ（Biacore International AB社製）等のバイオセンサーを用いることにより抗ＴＬＲ３抗体とＴＬＲ３タンパク質との結合をそれぞれ検出することが可能である。具体的には抗ＴＬＲ３抗体を固定化したセンサーチップに、被検試料を接触させ抗ＴＬＲ３抗体に結合するＴＬＲ３タンパク質を共鳴シグナルの変化としてそれぞれ検出することができる。
【００３４】
本発明の検出方法は、種々の自動検査装置を用いて自動化することもでき、一度に大量の試料について検査を行うことも可能である。
【００３５】
本発明の腎癌診断薬は、キットの形態であってもよい。本発明の腎癌診断薬は少なくとも抗ＴＬＲ３抗体を含む。該診断薬がＥＬＩＳＡ法等のＥＩＡ法に基づく場合は、抗体を固相化する担体を含んでいてもよく、抗体があらかじめ担体に結合していてもよい。該診断薬がラテックス等の担体を用いた凝集法に基づく場合は抗体が吸着した担体を含んでいてもよい。また、該診断薬は、適宜、ブロッキング溶液、反応溶液、反応停止液、試料を処理するための試薬等を含んでいてもよい。
【００３６】
本発明の生検組織および血液などの試料を用いる診断用抗ＴＬＲ３抗体は、ＴＬＲ３タンパク質にそれぞれ特異的に結合すればよく、その由来、種類（モノクローナル、ポリクローナル）および形状を問わない。具体的には、マウス抗体、ラット抗体、トリ抗体、ヒト抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体などの公知の抗体を用いることができる。抗体はポリクローナル抗体でもよいが、モノクローナル抗体であることが好ましく、高感度で特異的な測定が可能であれば、市販されている抗体を使用してもよい。
【００３７】
また、支持体に固定される抗ＴＬＲ３抗体と標識物質で標識される抗ＴＬＲ３抗体は、ＴＬＲ３タンパク質の同じエピトープを認識してもよいが、異なるエピトープを認識することが好ましく、部位は特に制限されない。
【００３８】
本発明の画像診断に用いられる抗体は、ＴＬＲ３タンパク質と特異的に結合する限り、モノクローナル抗体であればキメラ抗体、ヒト化（ＣＤＲ移植）抗体、ヒト抗体のいずれであっても良い。また、それら抗体は、癌に対する結合が認められれば、市販されている抗体を使用してもよい。
【００３９】
本発明で使用される抗ＴＬＲ３抗体は、公知の手段を用いてポリクローナルまたはモノクローナル抗体として得ることができる。本発明で使用される抗ＴＬＲ３抗体として、哺乳動物由来あるいはトリ由来モノクローナル抗体が好ましい。特に、哺乳動物由来のモノクローナル抗体が好ましい。哺乳動物由来のモノクローナル抗体は、ハイブリドーマにより産生されるもの、および遺伝子工学的手法により抗体遺伝子を含む発現ベクターで形質転換した宿主に産生されるものを含む。
【００４０】
モノクローナル抗体産生ハイブリドーマは、基本的には公知技術を使用し、以下のようにして作製できる。すなわち、ＴＬＲ３タンパク質を感作抗原として使用して、これを通常の免疫方法にしたがって免疫し、得られる免疫細胞を通常の細胞融合法によって公知の親細胞と融合させ、通常のスクリーニング法により、モノクローナルな抗体産生細胞をスクリーニングすることによって作製できる。
具体的には、モノクローナル抗体を作製するには次のようにすればよい。
【００４１】
まず、抗体取得の感作抗原として使用されるＴＬＲ３タンパク質はＧｅｎＢａｎｋ番号（ＮＭ＿００３２６５）に開示された遺伝子／アミノ酸配列を発現することによって得る。すなわち、ＴＬＲ３タンパク質をコードするそれぞれの遺伝子配列を公知の発現ベクター系に挿入して適当な宿主細胞を形質転換させた後、その宿主細胞中または培養上清中から目的のヒトＴＬＲ３タンパク質を公知の方法で精製する。また、天然のＴＬＲ３タンパク質を精製して用いることもできる。
【００４２】
次に、この精製ＴＬＲ３タンパク質を感作抗原として用いる。あるいは、ＴＬＲ３タンパク質の部分ペプチドを感作抗原として使用することもできる。この際、部分ペプチドはヒトＴＬＲ３タンパク質のアミノ酸配列より化学合成により得ることもできるし、ヒトＴＬＲ３遺伝子の一部を発現ベクターに組込んで得ることもでき、さらに天然のヒトＴＬＲ３タンパク質をタンパク質分解酵素により分解することによっても得ることができる。部分ペプチドとして用いるヒトＴＬＲ３タンパク質の部分および大きさは限定されない。
【００４３】
感作抗原で免疫される哺乳動物としては、特に限定されるものではないが、細胞融合に使用する親細胞との適合性を考慮して選択するのが好ましく、一般的にはげっ歯類の動物、例えば、マウス、ラット、ハムスター、あるいはトリ、ウサギ、サル等が使用される。
【００４４】
感作抗原を動物に免疫するには、公知の方法にしたがって行われる。例えば、一般的方法として、感作抗原を哺乳動物の腹腔内または皮下に注射することにより行われる。具体的には、感作抗原をＰＢＳ（Phosphate-Buffered Saline）や生理食塩水等で適当量に希釈、懸濁したものに所望により通常のアジュバント、例えばフロイント完全アジュバントを適量混合し、乳化後、哺乳動物に４〜２１日毎に数回投与する。また、感作抗原免疫時に適当な担体を使用することもできる。特に分子量の小さい部分ペプチドを感作抗原として用いる場合には、アルブミン、キーホールリンペットヘモシアニン等の担体タンパク質と結合させて免疫することが望ましい。
【００４５】
このように哺乳動物を免疫し、血清中に所望の抗体レベルが上昇するのを確認した後に、哺乳動物から免疫細胞を採取し、細胞融合に付されるが、好ましい免疫細胞としては、特に脾細胞が挙げられる。
【００４６】
前記免疫細胞と融合される他方の親細胞として、哺乳動物のミエローマ細胞を用いる。このミエローマ細胞は、公知の種々の細胞株、例えば、Ｐ３（P3x63Ag8.653）（J. Immnol.（1979）123, 1548-1550）、P3x63Ag8U.1（Current Topics in Microbiology and Immunology（1978）81, 1-7）、 NS-1（Kohler. G. and Milstein, C. Eur. J. Immunol.（1976）6, 511-519）、MPC-11（Margulies. D.H. et al., Cell（1976）8, 405-415）、SP2/0 （Shulman, M. et al., Nature（1978）276, 269-270）、FO（de St. Groth, S. F. et al., J. Immunol. Methods（1980）35, 1-21）、S194（Trowbridge, I. S. J. Exp. Med.（1978）148, 313-323）、R210（Galfre, G. et al., Nature（1979）277, 131-133）等が好適に使用される。
【００４７】
前記免疫細胞とミエローマ細胞との細胞融合は、基本的には公知の方法、たとえば、ケーラーとミルステインらの方法（Kohler. G. and Milstein, C.、Methods Enzymol.（1981）73, 3-46）等に準じて行うことができる。
【００４８】
より具体的には、前記細胞融合は、例えば細胞融合促進剤の存在下に通常の栄養培養液中で実施される。融合促進剤としては、例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、センダイウイルス（ＨＶＪ）等が使用され、さらに所望により融合効率を高めるためにジメチルスルホキシド等の補助剤を添加使用することもできる。
【００４９】
免疫細胞とミエローマ細胞との使用割合は任意に設定することができる。例えば、ミエローマ細胞に対して免疫細胞を１〜１０倍とするのが好ましい。前記細胞融合に用いる培養液としては、例えば、前記ミエローマ細胞株の増殖に好適なＲＰＭＩ１６４０培養液、ＭＥＭ培養液、その他、この種の細胞培養に用いられる通常の培養液が使用可能であり、さらに、牛胎児血清（ＦＣＳ）等の血清補液を併用することもできる。
【００５０】
細胞融合は、前記免疫細胞とミエローマ細胞との所定量を前記培養液中でよく混合し、予め３７℃程度に加温したＰＥＧ溶液（例えば平均分子量１０００〜６０００程度）を通常３０〜６０％（ｗ／ｖ）の濃度で添加し、混合することによって目的とする融合細胞（ハイブリドーマ）を形成する。続いて、適当な培養液を逐次添加し、遠心して上清を除去する操作を繰り返すことによりハイブリドーマの生育に好ましくない細胞融合剤等を除去する。
【００５１】
このようにして得られたハイブリドーマは、通常の選択培養液、例えばＨＡＴ培養液（ヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジンを含む培養液）で培養することにより選択される。上記ＨＡＴ培養液での培養は、目的とするハイブリドーマ以外の細胞（非融合細胞）が死滅するのに十分な時間（通常、数日〜数週間）継続する。ついで、通常の限界希釈法を実施し、目的とする抗体を産生するハイブリドーマのスクリーニングおよび単一クローニングを行う。
【００５２】
目的とする抗体のスクリーニングおよび単一クローニングは、公知の抗原抗体反応に基づくスクリーニング方法で行えばよい。例えば、ポリスチレン等でできたビーズや市販の９６ウェルのマイクロタイタープレート等の担体に抗原を結合させ、ハイブリドーマの培養上清と反応させ、担体を洗浄した後に酵素標識二次抗体等を反応させることにより、培養上清中に感作抗原と反応する目的とする抗体が含まれるかどうか決定できる。目的とする抗体を産生するハイブリドーマを限界希釈法等によりクローニングすることができる。この際、抗原としては免疫に用いたものを用いればよい。
【００５３】
また、ヒト以外の動物に抗原を免疫して上記ハイブリドーマを得る他に、ヒトリンパ球をｉｎ ｖｉｔｒｏで、ＴＬＲ３タンパク質に感作し、感作リンパ球をヒト由来の永久分裂能を有するミエローマ細胞と融合させ、ＴＬＲ３タンパク質への結合活性を有する所望のヒト抗体を得ることもできる（特公平１−５９８７８号公報参照）。さらに、ヒト抗体遺伝子の全てのレパートリーを有するトランスジェニック動物に抗原となるＴＬＲ３タンパク質を投与して抗ＴＬＲ３抗体産生細胞を取得し、これを不死化させた細胞からＴＬＲ３タンパク質に対するヒト抗体をそれぞれ取得してもよい（国際特許出願公開番号ＷＯ ９４／２５５８５号公報、ＷＯ ９３／１２２２７号公報、ＷＯ ９２／０３９１８号公報、ＷＯ ９４／０２６０２号公報参照）。
【００５４】
このようにして作製されるモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマは、通常の培養液中で継代培養することが可能であり、また、液体窒素中で長期保存することが可能である。
【００５５】
当該ハイブリドーマからモノクローナル抗体を取得するには、当該ハイブリドーマを通常の方法に従い培養し、その培養上清として得る方法、あるいはハイブリドーマをこれと適合性がある哺乳動物に投与して増殖させ、その腹水として得る方法などが採用される。前者の方法は、高純度の抗体を得るのに適しており、一方、後者の方法は、抗体の大量生産に適している。
【００５６】
本発明では、モノクローナル抗体として、抗体遺伝子をハイブリドーマからクローニングし、適当なベクターに組み込んで、これを宿主に導入し、遺伝子組換え技術を用いて産生させた組換え型のものを用いることができる（例えば、Vandamme, A. M. et al., Eur.J. Biochem.（1990）192, 767-775, 1990参照）。
具体的には、抗ＴＬＲ３抗体を産生するハイブリドーマから、抗ＴＬＲ３抗体の可変（Ｖ）領域をコードするｍＲＮＡを単離する。ｍＲＮＡの単離は、公知の方法、例えば、グアニジン超遠心法（Chirgwin, J. M. et al., Biochemistry（1979）18, 5294-5299）、ＡＰＧＣ法（Chomczynski, P.et al., Anal. Biochem.（1987）162, 156-159）等により行って全ＲＮＡを調製し、mRNA Purification Kit （Pharmacia製）等を使用して目的のｍＲＮＡを調製する。また、ＱｕｉｃｋＰｒｅｐ ｍＲＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Pharmacia製）を用いることによりｍＲＮＡを直接調製することもできる。
【００５７】
得られたｍＲＮＡから逆転写酵素を用いて抗体Ｖ領域のｃＤＮＡを合成する。ｃＤＮＡの合成は、AMV Reverse Transcriptase First-strand cDNA Synthesis Kit（生化学工業社製）等を用いて行う。また、ｃＤＮＡの合成および増幅を行うには、５'−Ａｍｐｌｉ ＦＩＮＤＥＲ ＲＡＣＥ Ｋｉｔ（Clontech製）およびＰＣＲを用いた５'−ＲＡＣＥ法（Frohman, M. A. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA（1988）85, 8998-9002、Belyavsky, A.et al., Nucleic Acids Res.（1989）17, 2919-2932）等を使用することができる。
【００５８】
得られたＰＣＲ産物から目的とするＤＮＡ断片を精製し、ベクターＤＮＡと連結する。さらに、これより組換えベクターを作製し、大腸菌等に導入してコロニーを選択して所望の組換えベクターを調製する。そして、目的とするＤＮＡの塩基配列を公知の方法、例えば、ジデオキシヌクレオチドチェインターミネーション法等により確認する。
【００５９】
目的とする抗ＴＬＲ３抗体のV領域をコードするＤＮＡをそれぞれ得たのち、これを、所望の抗体定常領域（Ｃ領域）をコードするＤＮＡを含有する発現ベクターへ組み込む。
【００６０】
本発明で使用される抗ＴＬＲ３抗体を製造するには、抗体遺伝子を発現制御領域、例えば、エンハンサー、プロモーターの制御のもとで発現するよう発現ベクターに組み込む。次に、この発現ベクターにより、宿主細胞を形質転換し、抗体を発現させる。
【００６１】
抗体遺伝子の発現は、抗体重鎖（Ｈ鎖）または軽鎖（Ｌ鎖）をコードするＤＮＡを別々に発現ベクターに組み込んで宿主細胞を同時形質転換させてもよいし、あるいはＨ鎖およびＬ鎖をコードするＤＮＡを単一の発現ベクターに組み込んで宿主細胞を形質転換させてもよい（WO 94/11523 号公報参照）。
【００６２】
また、組換え型抗体の産生には上記宿主細胞だけではなく、トランスジェニック動物を使用することができる。例えば、抗体遺伝子を、乳汁中に固有に産生されるタンパク質（ヤギβカゼインなど）をコードする遺伝子の途中に挿入して融合遺伝子として調製する。抗体遺伝子が挿入された融合遺伝子を含むＤＮＡ断片をヤギの胚へ注入し、この胚を雌のヤギへ導入する。胚を受容したヤギから生まれるトランスジェニックヤギまたはその子孫が産生する乳汁から所望の抗体を得る。また、トランスジェニックヤギから産生される所望の抗体を含む乳汁量を増加させるために、適宜ホルモンをトランスジェニックヤギに使用してもよい（Ebert, K.M. et al., Bio/Technology（1994）12, 699-702）。
【００６３】
本発明で使用される抗体は、抗体の全体分子に限られず、ＴＬＲ３タンパク質に結合する限り、抗体の断片またはその修飾物であってもよく、二価抗体も一価抗体も含まれる。例えば、抗体の断片としては、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ'）２、Ｆｖ、1個のＦａｂと完全なＦｃを有するＦａｂ／ｃ、またはＨ鎖若しくはＬ鎖のＦｖを適当なリンカーで連結させたシングルチェインＦｖ（ｓｃＦｖ）が挙げられる。具体的には、抗体を酵素、例えばパパイン、ペプシンで処理し抗体断片を生成させるか、または、これら抗体断片をコードする遺伝子を構築し、これを発現ベクターに導入した後、適当な宿主細胞で発現させる（例えば、Co, M.S. et al., J. Immunol.（1994）152, 2968-2976、Better, M. & Horwitz, A.H. Methods in Enzymology（1989）178, 476-496, Academic Press, Inc.、Plueckthun, A. & Skerra, A. Methods in Enzymology（1989）178, 476-496, Academic Press, Inc.、Lamoyi, E., Methods in Enzymology（1989）121, 652-663、Rousseaux, J. et al., Methods in Enzymology（1989）121, 663-669、Bird, R. E. et al., TIBTECH（1991）9, 132-137参照）。
【００６４】
ｓｃＦｖは、抗体のＨ鎖Ｖ領域とＬ鎖Ｖ領域とを連結することにより得られる。このｓｃＦｖにおいて、Ｈ鎖Ｖ領域とＬ鎖Ｖ領域は、リンカー、好ましくはペプチドリンカーを介して連結される（Huston, J. S. et al.、Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.（1988）85, 5879-5883）。ｓｃＦｖにおけるＨ鎖Ｖ領域およびＬ鎖Ｖ領域は、本明細書に抗体として記載されたもののいずれの由来であってもよい。Ｖ領域を連結するペプチドリンカーとしては、例えばアミノ酸１２〜１９残基からなる任意の一本鎖ペプチドが用いられる。
【００６５】
ｓｃＦｖをコードするＤＮＡは、前記抗体のＨ鎖またはＨ鎖Ｖ領域をコードするＤＮＡ、およびＬ鎖またはＬ鎖Ｖ領域をコードするＤＮＡのうち、それらの配列のうちの全部または所望のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ部分を鋳型とし、その両端を規定するプライマー対を用いてＰＣＲ法により増幅し、次いで、さらにペプチドリンカー部分をコードするＤＮＡ、およびその両端が各々Ｈ鎖、Ｌ鎖と連結されるように規定するプライマー対を組み合せて増幅することにより得られる。
【００６６】
また、一旦ｓｃＦｖをコードするＤＮＡが作製されると、それらを含有する発現ベクター、および該発現ベクターにより形質転換された宿主を常法に従って得ることができ、また、その宿主を用いることにより、常法に従ってｓｃＦｖを得ることができる。
【００６７】
これら抗体の断片は、前記と同様にしてその遺伝子を取得し発現させ、宿主により産生させることができる。本発明における「抗体」にはこれらの抗体の断片も包含される。
【００６８】
抗体の修飾物として、標識物質等の各種分子と結合した抗ＴＬＲ３抗体を使用することもできる。本発明における「抗体」にはこれらの抗体修飾物も包含される。このような抗体修飾物は、得られた抗体に化学的な修飾を施すことによって得ることができる。なお、抗体の修飾方法はこの分野においてすでに確立されている。
【００６９】
さらに、本発明で使用される抗体は、二重特異性抗体（bispecific antibody）であってもよい。二重特異性抗体は分子上の異なるエピトープを認識する抗原結合部位を有する二重特異性抗体であってもよいし、一方の抗原結合部位がＴＬＲ３タンパク質を認識し、他方の抗原結合部位が標識物質等を認識してもよい。二重特異性抗体は２種類の抗体のＨＬ対を結合させて作製することもできるし、異なるモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを融合させて二重特異性抗体産生融合細胞を作製し、得ることもできる。さらに、遺伝子工学的手法により二重特異性抗体を作製することも可能である。
【００７０】
前記のように構築した抗体遺伝子は、公知の方法により発現させ、取得することができる。哺乳類細胞の場合、常用される有用なプロモーター、発現させる抗体遺伝子、その３'側下流にポリAシグナルを機能的に結合させて発現させることができる。例えばプロモーター／エンハンサーとしては、ヒトサイトメガロウイルス前期プロモーター／エンハンサー（human cytomegalovirus immediate early promoter/enhancer）を挙げることができる。
【００７１】
また、その他に本発明で使用される抗体発現に使用できるプロモーター／エンハンサーとして、レトロウイルス、ポリオーマウイルス、アデノウイルス、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）等のウイルスプロモーター／エンハンサー、あるいはヒトエロンゲーションファクター１α（ＨＥＦ１α）などの哺乳類細胞由来のプロモーター／エンハンサー等が挙げられる。
【００７２】
ＳＶ４０プロモーター／エンハンサーを使用する場合はMulliganらの方法（Nature（1979）277, 108）により、また、ＨＥＦ１αプロモーター／エンハンサーを使用する場合はMizushimaらの方法（Nucleic Acids Res.（1990）18, 5322）により、容易に遺伝子発現を行うことができる。
【００７３】
大腸菌の場合、常用される有用なプロモーター、抗体分泌のためのシグナル配列および発現させる抗体遺伝子を機能的に結合させて当該遺伝子を発現させることができる。プロモーターとしては、例えばｌａｃＺプロモーター、ａｒａＢプロモーターを挙げることができる。ｌａｃＺプロモーターを使用する場合はWardらの方法（Nature（1098）341, 544-546 ; FASEBJ.（1992）6, 2422-2427）により、あるいはａｒａＢプロモーターを使用する場合はBetterらの方法（Science（1988）240, 1041-1043）により発現することができる。
【００７４】
抗体分泌のためのシグナル配列としては、大腸菌のペリプラズムに産生させる場合、ｐｅｌＢシグナル配列（Lei, S. P. et al J. Bacteriol.（1987）169, 4379）を使用すればよい。そして、ペリプラズムに産生された抗体を分離した後、抗体の構造を適切に組み直して（ｒｅｆｏｌｄ）使用する。
【００７５】
複製起源としては、ＳＶ４０、ポリオーマウイルス、アデノウイルス、ウシパピローマウイルス（ＢＰＶ）等の由来のものを用いることができ、さらに、宿主細胞系で遺伝子コピー数増幅のため、発現ベクターは、選択マーカーとしてアミノグリコシドトランスフェラーゼ（ＡＰＨ）遺伝子、チミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子、大腸菌キサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｅｃｏｇｐｔ）遺伝子、ジヒドロ葉酸還元酵素（ｄｈｆｒ）遺伝子等を含むことができる。
【００７６】
本発明で使用される抗体の製造のために、任意の発現系、例えば真核細胞または原核細胞系を使用することができる。真核細胞としては、例えば樹立された哺乳類細胞系、昆虫細胞系、真糸状菌細胞および酵母細胞などの細胞等が挙げられ、原核細胞としては、例えば大腸菌細胞等の細菌細胞が挙げられる。
【００７７】
好ましくは、本発明で使用される抗体は、哺乳類細胞、例えばＣＨＯ、ＣＯＳ、ミエローマ、ＢＨＫ、Ｖｅｒｏ、ＨｅＬａ細胞中で発現される。
【００７８】
次に、形質転換された宿主細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏで培養して目的とする抗体を産生させる。宿主細胞の培養は公知の方法に従い行う。例えば、培養液として、ＤＭＥＭ、ＭＥＭ、ＲＰＭＩ１６４０、ＩＭＤＭを使用することができ、牛胎児血清（ＦＣＳ）等の血清補液を併用することもできる。
【００７９】
前記のように発現、産生された抗体は、細胞、宿主動物から分離し均一にまで精製することができる。本発明で使用される抗体の分離、精製はアフィニティーカラムを用いて行うことができる。例えば、プロテインＡカラムを用いたカラムとして、ＨｙｐｅｒＤ、ＰＯＲＯＳ、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦ（Pharmacia製）等が挙げられる。その他、通常のタンパク質で使用されている分離、精製方法を使用すればよく、何ら限定されるものではない。例えば、上記アフィニティーカラム以外のクロマトグラフィーカラム、フィルター、限外濾過、塩析、透析等を適宜選択、組み合わせることにより、抗体を分離、精製することができる（Antibodies: A Laboratory Manual. Ed Harlow, David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988）。
【００８０】
また、本発明により、ＴＬＲ３タンパク質はＣｌｅａｒ Ｃｅｌｌ ＲＣＣに特異的に発現していることが明らかになったことから、本発明における診断および治療の対象となる腎細胞癌（ＲＣＣ）としては、Ｃｌｅａｒ Ｃｅｌｌ ＲＣＣおよびＣｌｅａｒ Ｃｅｌｌ ＲＣＣ転移癌が特に好ましい。
【００８１】
本発明の腎癌治療薬に使用されるＴＬＲ３アゴニストとしては、二本鎖ＲＮＡおよびＴＬＲ３に対してアゴニスト作用を示す抗体が挙げられる。
【００８２】
本発明の腎癌治療薬は、ＴＬＲ３アゴニストを当該技術分野においてよく知られる薬学的に許容しうる担体とともに、混合、溶解、顆粒化、錠剤化、乳化、カプセル封入、凍結乾燥等により、製剤化することができる。
【００８３】
経口投与用には、ＴＬＲ３アゴニストを、薬学的に許容しうる溶媒、賦形剤、結合剤、安定化剤、分散剤等とともに、錠剤、丸薬、糖衣剤、軟カプセル、硬カプセル、溶液、懸濁液、乳剤、ゲル、シロップ、スラリー等の剤形に製剤化することができる。
【００８４】
非経口投与用には、ＴＬＲ３アゴニストを、薬学的に許容しうる溶媒、賦形剤、結合剤、安定化剤、分散剤等とともに、注射用溶液、懸濁液、乳剤、クリーム剤、軟膏剤、吸入剤、坐剤等の剤形に製剤化することができる。注射用の処方においては、抗ＴＬＲ３抗体を水性溶液、好ましくはハンクス溶液、リンゲル溶液、または生理的食塩緩衝液等の生理学的に適合性の緩衝液中に溶解することができる。さらに、組成物は、油性または水性のベヒクル中で、懸濁液、溶液、または乳濁液等の形状をとることができる。あるいは、治療剤を粉体の形態で製造し、使用前に滅菌水等を用いて水溶液または懸濁液を調製してもよい。吸入による投与用には、ＴＬＲ３アゴニストを粉末化し、ラクトースまたはデンプン等の適当な基剤とともに粉末混合物とすることができる。坐剤処方は、ＴＬＲ３アゴニストをカカオバター等の慣用の坐剤基剤と混合することにより製造することができる。さらに、本発明の腎癌治療剤は、ポリマーマトリクス等に封入して、持続放出用製剤として処方することができる。
【００８５】
投与量および投与回数は、剤形および投与経路、ならびに患者の症状、年齢、体重によって異なるが、一般に、ＴＬＲ３アゴニストは、１日あたり体重１ｋｇあたり、約０．００１ｍｇから１０００ｍｇの範囲、好ましくは約０．０１ｍｇから１０ｍｇの範囲となるよう、１日に１回から数回投与することができる。
【００８６】
本発明の腎癌治療薬は通常非経口投与経路で、例えば注射剤（皮下注、静注、筋注、腹腔内注など）、経皮、経粘膜、経鼻、経肺などで投与するのが好ましい。
また、本発明の腎癌治療薬はＴＬＲ３アゴニストに加えて、インターフェロン、特にインターフェロンαを併用するのが特に好ましい。ＴＬＲ３アゴニストをインターフェロンと併用する場合、インターフェロンαの投与はＣ型肝炎の治療方法に準ずる。すなわち、インターフェロンαを６００〜１，０００万ＩＵ筋注にて２週間連続、さらに２２週間、週あたり３回投与するのが好ましい。
【実施例】
【００８７】
以下に実施例により本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例により限定されるものではない。
【００８８】
実施例１ 腎細胞癌の網羅的遺伝子発現解析
（１−１）対象症例
２０００年から２００４年にかけて東京大学医学部附属病院にて手術的に切除された腎細胞癌臨床検体３０症例および同一症例の正常腎組織９例を対象として、オリゴヌクレオチドマイクロアレイであるＧｅｎｅＣｈｉｐ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）による網羅的遺伝子発現解析を行った。全ての症例はインフォームドコンセントおよび文書による同意がなされ、また本研究における臨床検体を用いた実験プロトコールの全ては倫理委員会の承認を受けている。手術による切除後、癌部あるいは正常腎組織の一部をメスで切り取り、液体窒素中で急速凍結した。凍結組織はＲＮＡ抽出時まで、液体窒素タンクないし−８０℃のｄｅｅｐ ｆｒｅｅｚｅｒ内で保存された。対象症例群における臨床病理学的因子のまとめを表１に記載する。ＴＮＭ分類に関しては、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｊｏｉｎｔ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ｏｎ Ｃａｎｃｅｒの基準に従った。Nuclear Gradeに関しては、Ｆｕｒｈｍａｎｎによる分類に従った。
【００８９】
【表１】
【００９０】
（１−２）Ｔｏｔａｌ ＲＮＡの抽出
凍結検体を液体窒素で満たした乳鉢の中ですり棒を用いてすり潰し、Ｔｒｉｚｏｌ(Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ)１ｍＬを加えホモジナイズした。Ｔｏｔａｌ ＲＮＡの抽出はＴｒｉｚｏｌのプロトコールに従い行った。
【００９１】
（１−３）オリゴヌクレオチドマイクロアレイ解析
ＧｅｎｅＣｈｉｐの説明書に従い、各サンプルのＴｏｔａｌ ＲＮＡ３μｇより、Ｔ７ｐｒｏｍｏｔｅｒのついたｏｌｉｇｏ−ｄＴ（２４ｍｅｒ）ｐｒｉｍｅｒを使用して、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔTMII ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）による逆転写反応により２本鎖ｃＤＮＡ合成を行った。ついで、Ｔ７ ＲＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＥＮＺＯ）によるｉｎ ｖｉｔｒｏ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ反応によりビオチンラベル化されたｃＤＮＡを合成した。断片化を行い、ＧｅｎｅＣｈｉｐ １枚あたり５μｇのｃＲＮＡを用いて、５４６７５プローブを有するＧｅｎｅＣｈｉｐＨＧ−Ｕ１３３ ｐｌｕｓ２．０に対してハイブリダイゼーションを１６時間行った。洗浄後、Ｓｔｒｅｐｙｏａｖｉｄｉｎｅ Ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ染色、ビオチン化抗体処理、Ｓｔｒｅｐｙｏａｖｉｄｉｎｅ Ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎの再染色によりシグナルを増強後、スキャナーで読み込み、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社のＭｉｃｒｏａｒｒａｙ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｓｕｉｔｅ５．０（ＭＡＳ ５．０）で画像を解析した。その後、各ＧｅｎｅＣｈｉｐ上の各遺伝子に対して、ＭＡＳ ５．０によって表示されたシグナル値を発現量として用い、各ＧｅｎｅＣｈｉｐにおける遺伝子発現量の平均が１００になるようにデータの標準化を行った。
【００９２】
（１−４）遺伝子発現解析
（１−４−１）クラスター解析
ＧｅｎｅＣｈｉｐより得られた５４６７５プローブのシグナル値をもとに、ＧｅｎｅＳｐｒｉｎｇ（Ａｇｉｌｅｎｔ）を用いてプローブと症例による階層的クラスター解析を行い、３９検体 (Ｃｌｅａｒ ｃｅｌｌ ＲＣＣ ２７例、Ｃｈｒｏｍｏｐｈｏｂｅ ＲＣＣ ２例、Ｓａｒｃｏｍａｔｏｉｄ ＲＣＣ１例および非癌部正常腎９例）を分類した。まず、それぞれのプローブについて、３９検体中少なくとも１検体でシグナル値が２００を超えるものを選出し、プローブセットとした。次にこのプローブセットの発現量を用いて、遺伝子間についてピアソン相関係数を求め、クラスター解析を行った。症例間についても同様にピアソン相関係数を求め、クラスター解析を行った。このように、遺伝子間と症例間の二方向についてクラスター解析を行い、症例の類似性の比較を行った。まず、ＧｅｎｅＣｈｉｐの全てのプローブ（５４６７５プローブ）の中から、シグナル値が全ての症例で２００以下のプローブを除外することによって、１７５１２プローブのセットを選出した。このプローブセットで階層的クラスター解析を行ったところ、Ｃｌｅａｒ ｃｅｌｌ ＲＣＣ（Ｓａｒｃｏｍａｔｏｉｄ ＲＣＣを含む）の群と、正常腎およびＣｈｒｏｍｏｐｈｏｂｅ ＲＣＣを含む群の2群に大きく分けられた（図１）。また、正常腎９例およびＣｈｒｏｍｏｐｈｏｂｅ ＲＣＣ２例はそれぞれまとまったクラスターを形成した。
【００９３】
（１−４−２）組織型特異的に高発現している遺伝子の選定
クラスター解析に使用したプローブセットの発現値を用いて、Ｃｌｅａｒ ｃｅｌｌ ＲＣＣあるいはＣｈｒｏｍｏｐｈｏｂｅ ＲＣＣで特異的に高発現している遺伝子の選出を行った。選出の条件は以下の通りである。
【００９４】
ｉ）Ｃｌｅａｒ ｃｅｌｌ ＲＣＣ特異的高発現遺伝子
Ｃｌｅａｒ ｃｅｌｌ ＲＣＣ ２７例の中央値／正常腎９例の中央値＞５かつ、
Ｃｌｅａｒ ｃｅｌｌ ＲＣＣ ２７例の中央値／Ｃｈｒｏｍｏｐｈｏｂｅ ＲＣＣ ２例の最大値＞５
ii）Ｃｈｒｏｍｏｐｈｏｂｅ ＲＣＣ特異的高発現遺伝子
Ｃｈｒｏｍｏｐｈｏｂｅ ＲＣＣ ２例の最小値／正常腎９例の中央値＞５かつ、
Ｃｈｒｏｍｏｐｈｏｂｅ ＲＣＣ ２例の最小値／Ｃｌｅａｒ ｃｅｌｌ ＲＣＣ ２７例の中央値＞５
【００９５】
Ｃｌｅａｒ ｃｅｌｌ ＲＣＣあるいはＣｈｒｏｍｏｐｈｏｂｅ ＲＣＣで特異的に高発現している遺伝子として、それぞれ３１５、１９６プローブが選出された。なお、正常腎に比べてＣｌｅａｒ ｃｅｌｌ ＲＣＣで５倍以上発現亢進している遺伝子と、正常腎に比べてＣｈｒｏｍｏｐｈｏｂｅ ＲＣＣで５倍以上発現亢進している遺伝子で共通しているものは認められなかった。すなわち、この２つの組織型では全く異なる遺伝子群が発現亢進していた。
選出されたプローブセットを用いて、ＮＩＨが提供しているソフトウェアＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ ＡＮＡＬＹＳＩＳ ＳＹＳＴＥＭＡＴＩＣ ＥＸＰＬＯＲＥＲによって解析を行い、各組織型特異的に発現亢進している遺伝子群にどのような機能の遺伝子が多く含まれるかを調べた。表２、表３に示す通り、Ｃｌｅａｒ ｃｅｌｌ ＲＣＣでは免疫応答や生体防御・免疫応答などに関わる遺伝子群が特徴的に高発現していた。また、Ｃｈｒｏｍｏｐｈｏｂｅ ＲＣＣではイオン輸送やホメオスタシスなどに関与する遺伝子群が特徴的に高発現していることが明らかとなった。各組織型で特異的に高発現していた遺伝子、上位５０プローブを次ページ以下、表４および表５に示す。
【００９６】
【表２】
【００９７】
【表３】
【００９８】
【表４】
【００９９】
【表５】
【０１００】
（１−４−３）組織型特異的に高発現している遺伝子のｇｅｎｅ ｏｎｔｏｌｏｇｙ解析
上記（１−４−２）において選出された遺伝子群にどのような機能の遺伝子が多く含まれるかについて、ＮＩＨが提供しているソフトウェアＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ ＡＮＡＬＹＳＩＳ ＳＹＳＴＥＭＡＴＩＣ ＥＸＰＬＯＲＥＲによって解析を行った。
これは、各プローブに付されている各ｇｅｎｅ ｏｎｔｏｌｏｇｙ(遺伝子の機能)が、全プローブ中の頻度に対し、目的の遺伝子群でどの程度濃縮されているかをｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｆｉｓｈｅｒ'ｓ ｅｘａｃｔ ｔｅｓｔにより検定するものである。検定値はＥａｓｅ Ｓｃｏｒｅとして表され、この数値が低いほど、目的の遺伝子群で濃縮されている、すなわち、その機能を持つ遺伝子が目的の遺伝子群に多く含まれていると評価される。
【０１０１】
（１−４−４）腎細胞癌治療標的遺伝子の選定
今回解析した腎細胞癌、正常腎の発現データと、以前東京大学先端研ゲノムサイエンス部門にてＧｅｎｅＣｈｉｐ ＨＧ−Ｕ１３３ ｐｌｕｓ２．０による解析が行われた１５種の正常臓器（Ｂｒａｉｎ，Ｍｕｓｃｌｅ，Ｈｅａｒｔ，Ｓｋｉｎ，Ｌｕｎｇ，Ｌｉｖｅｒ，Ｓｔｏｍａｃｈ，Ｃｏｌｏｎ，Ｐａｎｃｒｅａｓ，Ｋｉｄｎｅｙ，Ｂｌａｄｄｅｒ，Ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ，Ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｂｌｏｏｄ，Ｏｖａｒｙ，Ｔｅｓｔｉｓ）の発現データを用い、正常臓器で発現が低く、Ｃｌｅａｒ ｃｅｌｌ ＲＣＣ特異的に発現が亢進している遺伝子の選出を行った。選出の基準は以下の通りである。
【０１０２】
Ｃｌｅａｒ ｃｅｌｌ ＲＣＣ ２７例の中央値／正常腎９例の中央値＞５かつ、
Ｃｌｅａｒ ｃｅｌｌ ＲＣＣ ２７例の中央値＞５００(シグナル値)かつ、
１５種類の正常臓器の最大値＜500(シグナル値)
【０１０３】
その結果、表６に示すように３６プローブ（既知遺伝子数としては２３個）が選出された。
それら３６プローブのうち、ＴＬＲ３に着目してさらに検討を行った。ＴＬＲ３の遺伝子発現値（ＧｅｎｅＣｈｉｐシグナル値）を図２に示す。
オリゴヌクレオチドマイクロアレイ解析により、ＴＬＲ３遺伝子が正常腎および各種正常組織に比べＣｌｅａｒ ｃｅｌｌ ＲＣＣで発現亢進していることがわかった。
【０１０４】
【表６】
【０１０５】
実施例２ Ｃｌｅａｒ ｃｅｌｌ ＲＣＣにおける定量的ＲＴ−ＰＣＲによるＴＬＲ３遺伝子の発現亢進
Ｃｌｅａｒ ｃｅｌｌ ＲＣＣおよび同一患者の正常腎組織７ペアにおけるＴＬＲ３遺伝子の発現を定量的ＲＴ−ＰＣＲで測定した。ｃＤＮＡの合成は，１μｇのｔｏｔａｌ ＲＮＡにＤＮａｓｅ Ｉ Ａｍｐ ｇｒａｄｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を添加し、室温で１５分間静置することによりゲノムＤＮＡの分解を行った。ついで、Ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）プライマーおよびＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔTMIII 逆転写酵素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて５０℃で６０分間逆転写反応を行った。その後、ＲＮａｓｅ Ｈを加えて鋳型ＲＮＡ鎖の分解を行った。合成されたｃＤＮＡ溶液をｎｕｃｌｅａｓｅ ｆｒｅｅ ｗａｔｅｒで希釈し、ＰＣＲ反応に用いた。合成されたｃＤＮＡを鋳型としてＰＣＲバッファー（５０ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ８．３、２ｍＭ ＭｇＣｌ2、０．０１％ゼラチン）、２００ μＭ ｄＮＴＰｓ（ＴａＫａＲａ）、０．２μＭプライマー、Ｔａｑ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ（ＢＭＡ）を用いて定量的ＲＴ−ＰＣＲを行った。尚、ＴＬＲ３のＦｏｒｗａｒｄ ｐｒｉｍｅｒは配列番号１、Ｒｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒは配列番号２を使用して、ＰＣＲ条件：９４℃３分、（９４℃１５秒、６０℃１５秒、７２℃３０秒）×４５サイクルで実施した。また、内部標準遺伝子としてのＡＣＴＢについては、Ｆｏｒｗａｒｄ ｐｒｉｍｅｒは配列番号３、Ｒｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒは配列番号４を使用して、ＰＣＲ条件：９４℃３分、（９４℃１５秒、６２℃１５秒、７２℃３０秒）×３５サイクルで実施し、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎが発する蛍光量を測定することで初期鋳型ｃＤＮＡ量を求めた。さらに、ＡＣＴＢの初期鋳型ｃＤＮＡ量を求め、その値で目的遺伝子の初期鋳型ｃＤＮＡ量を割って補正を行い、得られた数値を目的遺伝子のｍＲＮＡの相対量とした。それぞれ同じサンプルについて５０μＬの系を３本用意して行い、その平均の値を結果として使用した。図３に示す通り、全ての症例において正常腎に比べてＣｌｅａｒ ｃｅｌｌ ＲＣＣでＴＬＲ３遺伝子の発現亢進を認めた。
【０１０６】
実施例３ ＴＬＲ３ｃＤＮＡのクローニング、全長強制発現細胞抽出物の調製
ＴＬＲ３のコーディング領域に対してプライマーを設計し、上記実施例２で得られたｃＤＮＡを鋳型としてＰＣＲ反応を行った。ＤＮＡポリメラーゼとしては、ＫＯＤ−ｐｌｕｓ−ｖｅｒ．２（ＴＯＹＯＢＯ）を用いた。尚、ＰＣＲ条件は以下のとおりである。Ｆｏｗａｒｄ ｐｒｉｍｅｒ として配列番号５、Ｒｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒ として配列番号６を用い、ＰＣＲ条件：９４℃２分、（９４℃１５秒、５５℃３０秒、６８℃３分）×２５サイクルにておこなった。得られたＰＣＲ産物をアガロースゲルにて電気泳動して切り出し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて回収した。回収したＤＮＡおよびＺｅｒｏ Ｂｌｕｎｔ ＴＯＰＯ ＰＣＲ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｒｅａｇｅｎｔｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてベクターへの組み込みを行った。コンピテント細胞としてＴＯＰＯ１０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用い、クローニングを行った。コロニーＰＣＲおよびシークエンシングにより、正しいＴＬＲ３ ｃＤＮＡの配列が組み込まれていることが確認されたコンストラクトを、ＥｃｏＲＩおよびＳｍａＩ（ＴａＫａＲａ Ｂｉｏ）により制限酵素処理して、ＴＬＲ３のコーディング領域をプラスミドから切り出し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔを用いてＤＮＡフラグメントを回収した。同様に制限酵素処理した動物細胞発現用ベクターであるｐｈＣＭＶ ｖｅｃｔｏｒ（Ｇｅｎｌａｎｔｉｓ）に、得られたＴＬＲ３のコーディング領域を組み込んだ。ライゲーション試薬としてはＴ４ ＤＮＡ Ｌｉｇａｓｅ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いた。得られたコンストラクトを、ＴＯＰ１０へトランスフォーメーションした。ＱＩＡＧＥＮのＭｉｄＰｒｅｐ ｋｉｔを用いてプラスミドＤＮＡを精製回収した。
【０１０７】
次に、精製されたプラスミドＤＮＡをＣＨＯ細胞（大日本住友製薬）に、ＦｕＧＥＮＥ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ ｒｅａｇｅｎｔ（Ｒｏｃｈｅ）を用いて導入した。細胞は、トランスフェクション前日に、１０ｃｍ ｄｉｓｈに８×１０5個播種した。トランスフェクション時には、ＯｐｔｉＭＥＭ培地(Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ)４００μＬ、ＦｕＧＥＮＥ試薬１６μＬ、プラスミドＤＮＡ８μｇを混合し、１５分間室温にて静置した。その後、混合液を１０ｃｍ ｄｉｓｈに添加した。４８時間後に限外希釈を行い、クローニングを開始した。セレクション薬剤にはＧ４１８(Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ)を１ｍｇ／ｍＬの濃度で使用した。クローニング後の細胞を１０ｃｍ ｄｉｓｈで培養し、コンフルエントになった時点で、プロテアーゼ阻害剤を加えたＲＩＰＡバッファーを用いてタンパク質を回収した。
【０１０８】
実施例４ ＴＬＲ３の免疫用抗原の調製
ＴＬＲ３の細胞外領域（１−７００ａａ）に対してC末端側にヒスチジンタグを付加したプライマーを設計し、上記実施例３で得られたＴＬＲ３のコーディング領域のＤＮＡを鋳型としてＰＣＲ反応を行った。ＤＮＡポリメーラーゼとしては、ＫＯＤ−ｐｌｕｓ−ｖｅｒ．２（ＴＯＹＯＢＯ）を用いた。尚、ＰＣＲ条件は以下のとおりである。Ｆｏｗａｒｄ ｐｒｉｍｅｒとして配列番号７、Ｒｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒとして配列番号８を用い、ＰＣＲ条件：９４℃２分、（９４℃１５秒、５５℃３０秒、６８℃３分）×２５サイクルにておこなった。得られたＰＣＲ産物をアガロースゲルにて電気泳動して切り出し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて回収した。回収したＤＮＡおよびＺｅｒｏ Ｂｌｕｎｔ ＴＯＰＯ ＰＣＲ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｒｅａｇｅｎｔｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてベクターへの組み込みを行った。コンピテント細胞としてＴＯＰＯ１０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用い、クローニングを行った。コロニーＰＣＲおよびシークエンシングにより、正しいＴＬＲ３ ｃＤＮＡの配列が組み込まれていることが確認されたコンストラクトを、ＮｏｔＩおよびＸｂａＩ（ＴａＫａＲａ Ｂｉｏ）により制限酵素処理して、ＴＬＲ３の細胞外領域をプラスミドから切り出し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔを用いてＤＮＡフラグメントを回収した。同様に制限酵素処理した動物細胞発現用ベクターであるｐＮＯＷベクター（イムノ・ジャパン）に、得られたＴＬＲ３の細胞外領域を組み込んだ。ライゲーション試薬としてはＴ４ ＤＮＡ Ｌｉｇａｓｅ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いた。得られたコンストラクトを、ＴＯＰ１０へトランスフォーメーションした。ＱＩＡＧＥＮのＭｉｄＰｒｅｐ ｋｉｔを用いてプラスミドＤＮＡを精製回収した。
【０１０９】
続いて精製回収されたプラスミドＤＮＡをＣＨＯ細胞（大日本住友製薬）に、ＦｕＧＥＮＥ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ ｒｅａｇｅｎｔ（Ｒｏｃｈｅ）を用いて導入した。細胞は、トランスフェクション前日に、１０ｃｍ ｄｉｓｈに８×１０5個播種した。トランスフェクション時には、ＯｐｔｉＭＥＭ培地(Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ)４００μＬ、ＦｕＧＥＮＥ試薬１６μＬ、プラスミドＤＮＡ８μｇを混合し、１５分間室温にて静置した。その後、混合液を１０ｃｍ ｄｉｓｈに添加した。４８時間後に限外希釈を行い、クローニングを開始した。セレクション薬剤にはＧ４１８(Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ)を１ｍｇ／ｍＬの濃度で使用した。クローニング後の細胞を無血清培地ＣＨＯ−ＳＦＭ−ＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用しローラーボトル（Ｆａｌｃｏｎ）にて培養を行い、培養上清を回収した。得られた培養上清からＨｉｓ Ｔｒａｐ ＨＰカラム（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）を用いてＴＬＲ３の細胞外領域（１−７００ａａ）−Ｈｉｓ ｔａｇ融合タンパク質の精製を行った。この精製された融合タンパク質をＰＢＳに対し透析し、免疫用抗原として用いた。
【０１１０】
実施例５ 抗ＴＬＲ３モノクローナル抗体の作製
ＰＢＳに溶解した５０μｇのＴＬＲ３の細胞外領域（１−７００ａａ）−Ｈｉｓ ｔａｇ融合タンパク質とＴｉｔｅｒ−ＭＡＸ（ＴｉｔｅｒＭａｘ ＵＳＡ，Ｉｎｃ．）を等量混合してＭＲＬ／Ｉｐｒマウス（三共ラボサービス）に腹腔内注射することにより初回免疫を行った。２回目以降の免疫は同様に調製した２５μｇタンパク質量相当のＴＬＲ３の細胞外領域（１−７００ａａ）−Ｈｉｓ ｔａｇ融合タンパク質とＴｉｔｅｒ−ＭＡＸを混合して腹腔内注射することにより実施した。最終免疫から３日後にマウスから脾臓細胞を無菌的に調製し、ポリエチレングリコール法によってマウスミエローマ細胞ＮＳ１との細胞融合を行った。
ハイブリドーマ培養上清中の抗ＴＬＲ３抗体のスクリーニングは、ＴＬＲ３の細胞外領域（１−７００ａａ）−Ｈｉｓ ｔａｇ融合タンパク質を固相化したＥＬＩＳＡによって実施した。
【０１１１】
実施例６ 腎癌組織抽出液ＴＬＲ３のイムノブロティング
凍結組織およびＴＬＲ３強制発現ＣＨＯ細胞を液体窒素で満たした乳鉢の中ですり棒を用いてすり潰し、プロテアーゼ阻害剤（ＳＩＧＭＡ）を加えたＲＩＰＡバッファー（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．４、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＥＤＴＡ、１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、１％デオキシコール酸ナトリウム、０．１％ ＳＤＳ）を加えた。３０分間氷上に静置し、４℃、１０分、１０，０００ｒｐｍで遠心して上清をチューブに回収し、等量のサンプルバッファー（２×ＳＤＳバッファー、１０％メルカプトエタノール）を加えて、９５℃で１５分加熱した。加熱後遠心上清を１２％アクリルアミドゲル上に電気泳動した。電気泳動は１００Ｖで１０分間、２００Ｖで５０分間行った。２％スキムミルク／ＴＢＳ−Ｔ（Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００）にてブロッキングを６０分間行った後、一次抗体と室温で６０分間反応させた。一次抗体としては抗ＴＬＲ３モノクローナル抗体（２．５μｇ／ｍＬ，ＩＭＧＥＮＥＸ）および抗β−ａｃｔｉｎモノクローナル抗体（０．３μｇ／ｍＬ，Ｓｉｇｍａ）を用いた。ＴＢＳ−Ｔによる洗浄を行った後、二次抗体と室温で４５分間反応させた。二次抗体としてはＨＲＰラベルされた抗マウスＩｇＧ抗体（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を１／１０，０００に希釈したものを用いた。ＴＢＳ−Ｔによる洗浄を行った後に、化学発光検出試薬であるＥＣＬ−ＰＬＵＳ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）によってＨＲＰの発光を行い、ＬＡＳ ３０００イメージアナライザー(富士フィルム)でバンドを検出した。
【０１１２】
図４に示すように、ＴＬＲ３を強制発現させたＣＨＯ細胞から回収したタンパク質においては、ＴＬＲ３タンパク質の予想サイズである１２０ｋＤａ付近に単一のバンドが得られたが、コントロールのＣＨＯ細胞から回収したタンパク質の場合バンドは認められなかった。一方で、定量的ＲＴ−ＰＣＲによって癌部でのＴＬＲ３遺伝子の発現亢進が確認された検体(９Ｔ)でも同じ位置に単一のバンドを認めた。同一患者の正常腎(９Ｎ)でも同じ位置にごく弱いバンドを認めた。
【０１１３】
実施例７ 腎細胞癌におけるＴＬＲ３タンパク質の局在、および各組織型における発現頻度、ならびに臨床病理学的データとの相関性
（７−１）ＴＭＡブロックの作製
１９９３年から２００４年にかけて東京大学医学部附属病院にて手術的に切除された腎腫瘍２１６例のパラフィンブロックからＴｉｓｓｕｅ ｍｉｃｒｏ ａｒｒａｙ（ＴＭＡ）ブロックを作製した。まず、各症例のスライドガラスを鏡検し、組織型の評価を行うとともに、腫瘍の代表的な部分２箇所に印をつけた。次いで、印をつけたスライドガラスと照らし合わせながら、各症例のパラフィンブロックから２箇所を直径２ｍｍの針で打ち抜き、ＴＭＡブロックに移植した。1ブロックにつき２４症例４８箇所の組織を移植したＴＭＡブロックを９個作成した。ＴＭＡブロックを４μｍの厚さに薄切し、シランコートガラスに貼り付け、免疫染色用の標本とした。なお、連続切片の１枚に対してはＨＥ(ヘマトキシリン・エオジン)染色を行い、組織型の評価を行った。
【０１１４】
（７−２）染色方法
まず、４μｍに薄切された切片に対し、キシレン・エタノール系列で脱パラフィン化と親水化を行った。次に、切片をｐＨ６．０クエン酸バッファーに浸した状態で１０分間オートクレーブ処理（１２１℃）することにより抗原賦活化を行った。一次抗体として、抗ＴＬＲ３モノクローナル抗体（ＩＭＧＥＮＥＸ）を抗体希釈液（ＣｈｅｍＭａｔｅ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｄｉｌｕｅｎｔ，ＤａｋｏＣｙｔｏｍａｔｉｏｎ）で１０倍に希釈し（希釈後濃度２．５μｇ／ｍＬ）、室温で６０分間反応させた。ＴＢＳで洗浄した後、二次抗体として、ＥＮＶＩＳＩＯＮ＋／ＨＲＰ（ＤＡＫＯ）を室温で３０分間反応させ、ＴＢＳで洗浄した。Ｄｉａｍｉｎｏｂｅｎｚｉｄｉｎｅ ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ（ＤＡＢ）で発色を行い、最後にヘマトキシリンで核染色を行い、エタノール、キシレン系列で脱水、透徹して封入した。陰性コントロールとして、全ての切片に対して一次抗体のみを省いて同様の染色工程を行った。陰性コントロール切片では、陽性シグナルは認められなかった。
【０１１５】
染色の強度は０（陰性）、１＋（弱陽性）、２＋（中等度陽性）、３＋（強陽性）の４段階で評価した。染色強度の判定は２人の病理医が独立して行った。ＴＭＡに対する免疫染色では、Ｃｌｅａｒ ｃｅｌｌ ＲＣＣ １８９例、Ｐａｐｉｌｌａｒｙ ＲＣＣ １１例、Ｃｈｒｏｍｏｐｈｏｂｅ ＲＣＣ ８例、計２０８例を対象として評価した。
【０１１６】
ＴＭＡに対する染色の結果、正常腎では、大部分の尿細管および集合管の細胞質に弱陽性像(１＋)がみられた（図５（Ａ））。稀に、中等度陽性(２＋)を示す尿細管も散見された（図５（Ｂ））。また、稀にボウマン嚢上皮にも弱陽性像が観察された。
【０１１７】
Ｃｌｅａｒ ｃｅｌｌ ＲＣＣでは１８９例中１８４例（９７．４）に陽性像が得られた。正常尿細管よりも強い発現を示すもの(２＋および３＋)は１８９例中１３９例（７３．５％）であった。癌部では癌細胞の細胞質に細顆粒状の染色像を認めた(図５（Ｄ，Ｅ）)。間質との境界部で特に発現が増強している症例も認められた(図５（Ｆ）)。癌部では癌細胞特異的に染色され、癌細胞以外の血管内皮細胞や炎症細胞には陽性像は観察されなかった。
Ｐａｐｉｌｌａｒｙ ＲＣＣではＣｌｅａｒ ｃｅｌｌ ＲＣＣと同様に高頻度に発現を認めたが（図６（Ａ）、表７）、Ｃｈｒｏｍｏｐｈｏｂｅ ＲＣＣでは、８例中全てが完全に陰性だった(図６（Ｂ）、表７)。
【０１１８】
【表７】
【０１１９】
（７−３）臨床病理学的データとの相関の検討
Ｃｌｅａｒ ｃｅｌｌ ＲＣＣ １８９例についての、ＴＬＲ３染色強度と臨床病理学的因子との相関を表８に示す。ＴＬＲ３高発現群では、低発現群に比べて静脈侵襲が少ない傾向があったものの、ＴＬＲ３の染色強度と、年齢・性別・核異型度・ｐＴ・静脈侵襲との間に有意差は見られなかった。
【０１２０】
【表８】
【０１２１】
実施例８ Ｃｌｅａｒ ｃｅｌｌ ＲＣＣの肺転移巣におけるＴＬＲ３タンパク質の発現
Ｃｌｅａｒ ｃｅｌｌ ＲＣＣの肺転移巣８例のパラフィン包埋検体を用いて実施例７と同様に免疫染色を行った。
Ｃｌｅａｒ ｃｅｌｌ ＲＣＣ の肺転移巣では、８例中６例（７５％）で、５０％以上の癌細胞に中等度（２＋）以上の陽性像を認めた（図６(Ｃ,Ｄ)）。なお、正常肺胞上皮や終末細気管支上皮では殆どＴＬＲ３の発現はみられなかった。
【０１２２】
実施例９ Ｐｏｌｙ Ｉ：Ｃ単剤による細胞増殖抑制
腎癌細胞株８種を東北大学加齢研（Ｃａｋｉ−１、ＡＣＨＮ、ＳＷ８３９、ＶＭＲＣ−ＲＣＷ）、理研セルバンク（ＯＳ−ＲＣ−２、ＴＵＨＲ１０−ＴＫＢ、ＴＵＨＲ１４−ＴＫＢ）およびＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｃａｋｉ−２）より入手した。細胞は１０％ＦＢＳおよび抗生物質(ペニシリン・ストレプトマイシン)を含む培地を培養液として、５％ ＣＯ2通気下、３７℃にて培養した。使用した培地は、ＡＣＨＮ、ＳＷ８３９、ＶＭＲＣ−ＲＣＷ、ＯＳ−ＲＣ−２、ＴＵＨＲ１０−ＴＫＢ、ＴＵＨＲ１４−ＴＫＢについてはＲＰＭＩ１６４０ ｍｅｄｉｕｍ（ＳＩＧＭＡ）、Ｃａｋｉ−１、Ｃａｋｉ−２についてはＭａｃｏｙ ５Ａ ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｍｅｄｉｕｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）である。各細胞をそれぞれ１０ｃｍ ｄｉｓｈで培養し、７０〜８０％のコンフルエントになった時点でＲＮＡを回収した。１μｇのＲＮＡをテンプレートとしてｃＤＮＡ合成を行い、定量的ＲＴ−ＰＣＲで目的遺伝子の発現量を測定した。ＴＬＲ３遺伝子の発現は全ての細胞株で認められた（図７（Ａ））。発現量には細胞株によってばらつきがあり、最も高発現していたＴＵＨＲ１０−ＴＫＢでは、最も発現が低かったＣａｋｉ−２の９．９倍の発現量を示した。それら腎癌細胞株８種に対してＰｏｌｙ Ｉ：Ｃ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を投与し、細胞増殖の程度を測定した。各細胞を９６−ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅに1ウェルあたり２×１０3個あるいは４×１０3個となるように播種した(播種細胞の個数は増殖速度に応じて調整した)。２４時間後、培地を除去し、各種濃度のＰｏｌｙ Ｉ：Ｃを含む培地を添加し、さらに培養を行った。Ｐｏｌｙ Ｉ：Ｃを添加してから一定時間経過後に、ＷＳＴ−８ ａｓｓａｙ Ｋｉｔ(同仁)を用いて生細胞数の比較を行った。プレートリーダーにて４５０ｎｍの吸光度を測定し、その値からバックグラウンドとして６３０ｎｍの吸光度を差し引いた値を結果として用いた。それぞれ同じ条件について４ウェルの測定を行い、その平均の値を結果として使用した。１０μｇ／ｍＬのＰｏｌｙ Ｉ：Ｃを投与し、７２時間後に吸光度を測定した場合、８個中５個の細胞株（ＴＵＨＲ１０−ＴＫＢ、ＯＳ−ＲＣ−２、ＴＵＨＲ１４−ＴＫＢ、ＳＷ８３９、ＶＭＲＣ−ＲＣＷ）で有意（ｐ＜０．０１）な増殖抑制効果が観察された(図７（Ｂ）)。そして、ＴＬＲ３遺伝子の発現が高い細胞株ほどより強い増殖抑制効果を示す傾向があった。すなわち、１０μｇ／ｍＬのＰｏｌｙ Ｉ：Ｃ投与では、ＴＬＲ３遺伝子の発現が最も高いＴＵＨＲ１０−ＴＫＢに対して最大の増殖抑制効果を示した。そして、１０μｇ／ｍＬのＰｏｌｙ Ｉ：Ｃ添加で有意な増殖抑制効果を示さなかった３株(ＡＣＨＮ、Ｃａｋｉ−１、Ｃａｋｉ−２)ではＴＬＲ３遺伝子の発現は低かった（図７（Ａ））。
Ｐｏｌｙ Ｉ：Ｃによる増殖抑制効果は用量依存性であった。すなわち、ＴＬＲ３遺伝子の発現が最も高かったＴＵＨＲ１０−ＴＫＢに各種濃度のＰｏｌｙ Ｉ：Ｃを投与したところ、Ｐｏｌｙ Ｉ：Ｃの濃度が高いほど強い増殖抑制効果を示した(図７（Ｃ）)。
【０１２３】
実施例１０ Ｐｏｌｙ Ｉ：Ｃ添加によるアポトーシス誘導
Ｐｏｌｙ Ｉ：Ｃによる増殖抑制効果にアポトーシスが寄与しているかどうかを、Ａｎｎｅｘｉｎ−Ｖ染色にて検討した。腎癌細胞株ＴＵＨＲ１０−ＴＫＢを、４−ｗｅｌｌ組織培養用カルチャースライド(ＢＤｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ)に１ウェルあたり５×１０4個となるように播種した。２４時間後、培地を除去し、０または５０μｇ／ｍＬのＰｏｌｙ Ｉ：Ｃを含む培地を添加し、５時間培養を行った。その後、Ａｎｎｅｘｉｎ−Ｖ−ＦＬＵＯＳ Ｓｔａｉｎｉｎｇ Ｋｉｔ（Ｒｏｃｈｅ）のプロトコールに従い、アポトーシスに陥った細胞の観察を行った。すなわち、培養終了後、培地を除去し、ＨＥＰＥＳバッファーで２回洗浄した。次に、Ａｎｎｅｘｉｎ−Ｖ−ＦＬＵＯＳ ｌａｂｅｌｉｎｇ ｓｏｌｕｔｉｏｎを１ウェルあたり１００μＬ添加し、室温で１５分間反応させた。カバーガラスで封入し、蛍光顕微鏡にて４８８ｎｍの波長で観察した。Ｐｏｌｙ Ｉ：Ｃ添加群では約１０％の細胞が陽性を示したのに対し、対照のＰｏｌｙ Ｉ：Ｃ非添加群では、陽性細胞は稀（１％程度）であった（図８）。すなわち、Ｐｏｌｙ Ｉ：Ｃ添加によって細胞アポトーシスが誘導されることがわかった。
【０１２４】
実施例１１ 定量的ＲＴ−ＰＣＲによるＰｏｌｙ Ｉ：Ｃ投与時ＴＬＲ３下流遺伝子の発現変化の解析
腎癌細胞株ＴＵＨＲ１０−ＴＫＢおよびＣａｋｉ−１の培養後、５０μｇ／ｍＬのＰｏｌｙ Ｉ：Ｃを投与し、０、２、６、１２、２４時間後に細胞をＰＢＳで２回洗浄した後、Ｔｒｉｚｏｌを加えホモジナイズした。回収した１μｇのＲＮＡをテンプレートとしてｃＤＮＡ合成を行い、定量的ＲＴ−ＰＣＲで目的遺伝子の発現変化を測定した。ｃＤＮＡ合成および定量的ＲＴ−ＰＣＲは前述の通り行った。内部標準遺伝子としてＡＣＴＢの初期鋳型ｃＤＮＡ量を求め、その値で目的遺伝子の初期鋳型ｃＤＮＡ量を割って補正を行い、得られた数値を目的遺伝子のｍＲＮＡの相対量とした。それぞれ同じサンプルについて５０μＬの系を３本用意して行い、その平均の値を結果として使用した。使用した各サイトカインおよびケモカインのForward primer（Ｆ）およびReverse primer（Ｒ）を以下に示す。各ＰＣＲ条件はサイクル数を除きＩＦＮβと同条件である。
【０１２５】
＜ＩＦＮβ＞：Ｆ（配列番号９）、Ｒ（配列番号１０）；９４℃３分、（９４℃１５秒、６０℃１５秒、７２℃３０秒）×３８サイクル
＜ＩＬ６＞：Ｆ（配列番号１１）、Ｒ（配列番号１２）；×４０サイクル
＜ＩＬ８＞：Ｆ（配列番号１３）、Ｒ（配列番号１４）；×４０サイクル
＜ＩＰ１０（ＣＸＣＬ１０）＞：Ｆ（配列番号１５）、Ｒ（配列番号１６）；×３５サイクル
＜ＲＡＮＴＥＳ（ＣＣＬ５）＞：Ｆ（配列番号１７）、Ｒ（配列番号１８）；×３５サイクル
【０１２６】
まず、ＴＬＲ３シグナルにおいて最も重要な役割を果たすＩＦＮβの発現について検討した。ＴＵＨＲ１０−ＴＫＢおよびＣａｋｉ−１はいずれも定常状態ではほとんどＩＦＮβの発現はみられなかったが、ｐｏｌｙ Ｉ：Ｃ添加によって発現が著明に増加した(図７（Ｄ）)。ＩＦＮβの発現増強は、ＴＬＲ３発現の高いＴＵＨＲ１０−ＴＫＢ株でより顕著であった。また、ＴＵＨＲ１０−ＴＫＢ株について、ＴＬＲ３の下流遺伝子として知られているＩＬ６、ＩＬ８、ＩＰ１０（ＣＸＣＬ１０）、ＲＡＮＴＥＳ（ＣＣＬ５）のｐｏｌｙ Ｉ：Ｃ添加による経時的な発現変化を調べた。いずれの遺伝子も定常状態ではほとんど発現はなかったが、ｐｏｌｙ Ｉ：Ｃ添加の2時間後には発現の上昇がみられ、さらに時間の経過とともに発現が上昇していった(図９（Ａ−Ｄ）)。ＴＬＲ３の発現も、ｐｏｌｙ Ｉ：Ｃ添加から６時間後より上昇した(図９（Ｅ））。
【０１２７】
実施例１２ ｓｉＲＮＡによるＴＬＲ３遺伝子の発現抑制
腎癌細胞株ＯＳ−ＲＣ−２について、ＴＬＲ３を標的としたｓｉＲＮＡによるＴＬＲ３の発現抑制解析を行った。ｓｉＲＮＡの導入はＨｉＰｅｒＦｅｃｔ（ＱＩＡＧＥＮ）のプロトコールに従い、リバーストランスフェクション法を用いて行った。ＯｐｔｉＭＥＭ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に、ＨｉＰｅｒＦｅｃｔおよびｓｉＲＮＡを最終濃度２０ｎＭとなるように混合し、抗生物質を含まない細胞懸濁液を添加した。６−ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅで４８時間培養した後ＲＮＡを回収した。１μｇのＲＮＡをテンプレートとしてｃＤＮＡ合成を行い、定量的ＲＴ−ＰＣＲで目的遺伝子の発現変化を測定した。ｓｉＲＮＡの配列は配列番号１９に示した。陰性コントロールとして、Ｓｔｅａｌｔｈ ＲＮＡｉ Ｎｅｇａｔｉｖｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｋｉｔ ｗｉｔｈ Ｍｅｄｉｕｍ ＧＣ（ＧＣ ４８％）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用した。さらに、上記と同様に、腎癌細胞株ＯＳ−ＲＣ−２に対して最終濃度２０ｎＭのｓｉＲＮＡを導入し、９６−ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅで７２時間培養した。その後、０または５０μｇ／ｍＬのｐｏｌｙ Ｉ：Ｃ溶液（抗生物質を含む）を添加し、さらに４８時間培養した後、前述の通り、ＷＳＴ−８ ａｓｓａｙ Ｋｉｔを用いて生細胞数の比較を行った。それぞれ同じ条件について４ウェルの測定を行い、その平均の値を結果として使用した。その結果、ＴＬＲ３を標的としたｓｉＲＮＡによって、陰性コントロールと比較してＴＬＲ３遺伝子の著明な発現抑制がみられた（図１０（Ａ））。次いで、ｓｉＲＮＡによってＴＬＲ３遺伝子の発現を抑制したときの細胞増殖に与える変化およびｐｏｌｙ Ｉ：Ｃによる増殖抑制効果ならびにＩＦＮβ遺伝子発現の変化を検討した。まず、ＴＬＲ３遺伝子の発現を抑制すること自体は細胞増殖に変化を与えなかった（図１０（Ｂ））。しかし、ＴＬＲ３遺伝子の発現を抑制することにより、ｐｏｌｙ Ｉ：Ｃによる増殖抑制効果は有意に減弱した。すなわち、コントロール株ではｐｏｌｙ Ｉ：Ｃ添加によって３７％の増殖抑制効果（ｐｏｌｙ Ｉ：Ｃ非投与群の吸光度に対する投与群の吸光度の減少割合を示す）を示したのに対し、ＴＬＲ３遺伝子の発現を抑制したものでは増殖抑制効果が１７％に半減した（図１０（Ｂ））。すなわち、ｐｏｌｙ Ｉ：Ｃによる増殖抑制効果はＴＬＲ３の発現に依存しているということが示された。また、ＴＬＲ３遺伝子の発現を抑制することにより、ｐｏｌｙ Ｉ：ＣによるＩＦＮβの発現誘導が抑制された(図１０（Ｃ）)。すなわち、ｐｏｌｙ Ｉ：ＣによるＩＦＮβの発現誘導もＴＬＲ３の発現に依存しているということが示された。
【０１２８】
実施例１３ ｐｏｌｙ Ｉ：ＣおよびＩＦＮαの併用による感受性試験
腎癌細胞株Ｃａｋｉ−１に対して、ｐｏｌｙ Ｉ：ＣおよびＩＦＮαを併用することによる増殖の変化を測定した。まず、９６−ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅに1ウェルあたり２×１０3個となるように細胞を播種した。播種後２４時間で培地を除去し、ＩＦＮα（０、１００、１０００、１００００Ｕ／ｍＬ）を含む培地を添加した。ＩＦＮα添加２４時間後、培地を除去し、ｐｏｌｙ Ｉ：Ｃ(０、１０、５０μｇ／ｍＬ)を含む培地を添加した。さらに４８時間培養を行った後、ＷＳＴ−８ ａｓｓａｙ Ｋｉｔを用いて生細胞数の比較を行った。それぞれ同じ条件について４ウェルの測定を行い、その平均の値を結果として使用した。
Ｃａｋｉ−１に対して、ＩＦＮαとｐｏｌｙ Ｉ：Ｃは相乗的な増殖抑制効果を示した（図１１（Ａ））。すなわち、ＩＦＮαを加えなかった場合、ｐｏｌｙ Ｉ：Ｃのみによる増殖抑制効果は乏しかったが（ｐｏｌｙ Ｉ：Ｃ ５０μｇ／ｍＬのものは、ｐｏｌｙ Ｉ：Ｃなしのものに比べて１７％の増殖抑制効果）、ＩＦＮαの投与により、ｐｏｌｙ Ｉ：Ｃによる増殖抑制効果が著明に増強した。具体的には、ＩＦＮαを１００、１０００、１００００Ｕ／ｍＬ加えた場合（それぞれ単独では１１、１９、２３％の増殖抑制効果を示すにすぎない）、さらにｐｏｌｙ Ｉ：Ｃ ５０μｇ／ｍＬを加えたときの増殖抑制効果（ｐｏｌｙ Ｉ：Ｃ、ＩＦＮαのいずれも添加しなかった群の吸光度に対する目的群の吸光度の減少割合を示す。以下同じ。）はそれぞれ５０、７１、７６％に増強した。また、ＩＦＮα単独の場合増殖抑制効果は乏しかったが（ＩＦＮα １００００Ｕ／ｍＬのものは、ＩＦＮαなしのものに比べて２３％の増殖抑制効果）、ＩＦＮα添加培養のｐｏｌｙ Ｉ：Ｃを加えた場合、ＩＦＮαによる増殖抑制効果が著明に増強した。具体的には、ｐｏｌｙ Ｉ：Ｃを１０あるいは５０μｇ／ｍＬ加えた場合（それぞれ単独では９、１７％の増殖抑制効果を示すにすぎない）、ＩＦＮα １００００Ｕ／ｍＬを加えたものの増殖抑制効果はそれぞれ５７、７６％に増強した。
【０１２９】
実施例１４ ＩＦＮα添加によるＴＬＲ３遺伝子の発現変化
実施例１３と同様に腎癌細胞株Ｃａｋｉ−１に、ＩＦＮα（０,１００,１０００,１００００Ｕ／ｍＬ）を添加し、６時間後にＲＮＡを回収した。１μｇのＲＮＡをテンプレートとしてｃＤＮＡ合成を行い、定量的ＲＴ−ＰＣＲでＴＬＲ３遺伝子の発現変化を測定した。ＩＦＮα投与により、ＴＬＲ３遺伝子の発現上昇がみられた。定常状態と比較し、ＴＬＲ３遺伝子の発現量はＩＦＮα １００Ｕ／ｍＬ添加により３．４倍、１００００Ｕ／ｍＬ添加により４．８倍に増加した(図１１（Ｂ）)。
【０１３０】
実施例１５ ＩＦＮαおよびｐｏｌｙ Ｉ：Ｃ添加によるＴＬＲ３下流遺伝子の発現変化
実施例１３と同様に、腎癌細胞株Ｃａｋｉ−１に、０、１００、１０００、１００００Ｕ／ｍＬのＩＦＮαを投与して２４時間培養した後、０あるいは５０μｇ／ｍＬのｐｏｌｙ Ｉ：Ｃを投与し、６時間後にＲＮＡを回収した。１μｇのＲＮＡをテンプレートとしてｃＤＮＡ合成を行い、定量的ＲＴ−ＰＣＲで目的遺伝子の発現変化を測定した。ＩＦＮβ、ＩＬ６、ＩＬ８、ＩＰ１０、ＲＡＮＴＥＳのいずれも、ｐｏｌｙ Ｉ：Ｃを添加しなかった場合は、プレインキュベートしたＩＦＮαの濃度に関わらず、発現はほとんどみられなかった（ＩＦＮβ、ＩＬ６、ＩＬ８、ＲＡＮＴＥＳについて図１０（Ｄ−Ｆ）に示す。ＩＰ１０については省略）。ｐｏｌｙ Ｉ：Ｃ添加により、全ての遺伝子の発現が上昇した。そして、遺伝子発現上昇の程度はＩＦＮαの濃度に依存していた。すなわち、同じ濃度（５０μｇ／ｍＬ）のｐｏｌｙ Ｉ：Ｃを添加した場合、プレインキュベートしたＩＦＮαの濃度が高いほど、ＴＬＲ３下流遺伝子の発現量は高くなった（図１０（Ｃ−Ｆ））。
【図面の簡単な説明】
【０１３１】
【図１】腎癌症例および遺伝子の２方向による階層的クラスター解析の結果を示す。
【図２】腎癌および正常組織のＧｅｎｅＣｈｉｐ解析によるＴＬＲ３の遺伝子発現量を示す。
【図３】腎癌および正常組織における定量的ＲＴ−ＰＣＲによるＴＬＲ３遺伝子の発現量を示す。
【図４】Ｃｌｅａｒ ｃｅｌｌ ＲＣＣ、正常腎組織ペア検体およびにＴＬＲ３強制発現ＣＨＯ細胞おける腎癌組織抽出液ＴＬＲ３のイムノブロティング結果を示す。
【図５】腎癌におけるＴＬＲ３タンパク質の局在を示す。
【図６】腎癌各組織型および転移巣における発現頻度を示す。
【図７】Ｐｏｌｙ Ｉ：Ｃ単剤による細胞増殖抑制効果結果を示す。
【図８】Ｐｏｌｙ Ｉ：Ｃ添加によるアポトーシス誘導結果を示す。
【図９】定量的ＲＴ−ＰＣＲによるＰｏｌｙ Ｉ：Ｃ投与時ＴＬＲ３下流遺伝子の発現変化の解析結果を示す。
【図１０】ｓｉＲＮＡによるＴＬＲ３遺伝子の発現抑制結果を示す。
【図１１】ｐｏｌｙ Ｉ：ＣおよびＩＦＮαの併用による細胞増殖に対する相乗効果結果を示す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗ＴＬＲ３抗体を含有する腎癌診断薬。
【請求項２】
腎癌がＣｌｅａｒ ｃｅｌｌ ＲＣＣである請求項１記載の腎癌診断薬。
【請求項３】
腎癌がＣｌｅａｒ ｃｅｌｌ ＲＣＣ転移癌である請求項１または２記載の腎癌診断薬。
【請求項４】
抗ＴＬＲ３抗体がＴＬＲ３タンパク質と結合する抗体である請求項１〜３のいずれか１項記載の腎癌診断薬。
【請求項５】
血液中、血清中、血漿中または臓器組織に抗ＴＬＲ３抗体を反応させてＴＬＲ３タンパク質を検出することにより使用されるものである請求項１〜４のいずれか１項記載の腎癌診断薬。
【請求項６】
腎癌患者のうち、治療対象患者を選択するための診断薬である請求項１〜５のいずれか１項記載の腎癌診断薬。
【請求項７】
被験者から採取された試料に抗ＴＬＲ３抗体を反応させ、当該試料中のＴＬＲ３タンパク質を検出することを特徴とする腎癌の診断方法。
【請求項８】
被験者から採取された試料が血液、血清、血漿または臓器組織である請求項６記載の腎癌の診断方法。
【請求項９】
ＴＬＲ３アゴニストを有効成分とする腎癌治療薬。
【請求項１０】
腎癌がＣｌｅａｒ ｃｅｌｌ ＲＣＣである請求項９記載の腎癌治療薬。
【請求項１１】
腎癌がＣｌｅａｒ ｃｅｌｌ ＲＣＣ転移癌である請求項９または１０記載の腎癌治療薬。
【請求項１２】
ＴＬＲ３アゴニストが、二本鎖ＲＮＡまたは抗ＴＬＲ３抗体である請求項９〜１１のいずれか１項記載の腎癌治療薬。
【請求項１３】
ＴＬＲ３アゴニストを投与することを特徴とする腎癌治療方法。
【請求項１４】
腎癌がＣｌｅａｒ ｃｅｌｌ ＲＣＣである請求項１３記載の腎癌治療方法。
【請求項１５】
ＴＬＲ３アゴニストが、二本鎖ＲＮＡまたは抗ＴＬＲ３抗体である請求項１３または１４記載の腎癌治療方法。
【請求項１６】
ＴＬＲ３アゴニストとインターフェロン併用投与による腎癌治療方法。
【請求項１】
抗ＴＬＲ３抗体を含有する腎癌診断薬。
【請求項２】
腎癌がＣｌｅａｒ ｃｅｌｌ ＲＣＣである請求項１記載の腎癌診断薬。
【請求項３】
腎癌がＣｌｅａｒ ｃｅｌｌ ＲＣＣ転移癌である請求項１または２記載の腎癌診断薬。
【請求項４】
抗ＴＬＲ３抗体がＴＬＲ３タンパク質と結合する抗体である請求項１〜３のいずれか１項記載の腎癌診断薬。
【請求項５】
血液中、血清中、血漿中または臓器組織に抗ＴＬＲ３抗体を反応させてＴＬＲ３タンパク質を検出することにより使用されるものである請求項１〜４のいずれか１項記載の腎癌診断薬。
【請求項６】
腎癌患者のうち、治療対象患者を選択するための診断薬である請求項１〜５のいずれか１項記載の腎癌診断薬。
【請求項７】
被験者から採取された試料に抗ＴＬＲ３抗体を反応させ、当該試料中のＴＬＲ３タンパク質を検出することを特徴とする腎癌の診断方法。
【請求項８】
被験者から採取された試料が血液、血清、血漿または臓器組織である請求項６記載の腎癌の診断方法。
【請求項９】
ＴＬＲ３アゴニストを有効成分とする腎癌治療薬。
【請求項１０】
腎癌がＣｌｅａｒ ｃｅｌｌ ＲＣＣである請求項９記載の腎癌治療薬。
【請求項１１】
腎癌がＣｌｅａｒ ｃｅｌｌ ＲＣＣ転移癌である請求項９または１０記載の腎癌治療薬。
【請求項１２】
ＴＬＲ３アゴニストが、二本鎖ＲＮＡまたは抗ＴＬＲ３抗体である請求項９〜１１のいずれか１項記載の腎癌治療薬。
【請求項１３】
ＴＬＲ３アゴニストを投与することを特徴とする腎癌治療方法。
【請求項１４】
腎癌がＣｌｅａｒ ｃｅｌｌ ＲＣＣである請求項１３記載の腎癌治療方法。
【請求項１５】
ＴＬＲ３アゴニストが、二本鎖ＲＮＡまたは抗ＴＬＲ３抗体である請求項１３または１４記載の腎癌治療方法。
【請求項１６】
ＴＬＲ３アゴニストとインターフェロン併用投与による腎癌治療方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【公開番号】特開２００８−２０９３６９（Ｐ２００８−２０９３６９Ａ）
【公開日】平成２０年９月１１日（２００８．９．１１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−４８９６４（Ｐ２００７−４８９６４）
【出願日】平成１９年２月２８日（２００７．２．２８）
【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）平成１７年度および平成１８年度科学研究費補助金「がん特定領域研究−発現情報に基づく癌個性診断法の開発」
【出願人】（５０３１９６７７６）株式会社ペルセウスプロテオミクス (25)
【出願人】（５０４１３７９１２）国立大学法人 東京大学 (1,942)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２０年９月１１日（２００８．９．１１）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年２月２８日（２００７．２．２８）
【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）平成１７年度および平成１８年度科学研究費補助金「がん特定領域研究−発現情報に基づく癌個性診断法の開発」
【出願人】（５０３１９６７７６）株式会社ペルセウスプロテオミクス (25)
【出願人】（５０４１３７９１２）国立大学法人 東京大学 (1,942)
【Ｆターム（参考）】
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