腎臓疾患の治療方法
ヒトまたはヒト以外の動物の腎障害を予防および治療する方法が開示される。本方法は２０−ＨＥＴＥまたは２０−ＨＥＴＥアゴニストをヒトまたはヒト以外の動物に腎障害を予防または治療するのに十分な量投与することを含む。さらには虚血性急性腎不全を予防または治療するための方法も開示され、特に該方法は２０−ＨＥＴＥまたは２０−ＨＥＴＥアゴニストをヒトまたはヒト以外の動物に虚血性急性腎不全を予防または治療するのに十分な量投与することを含む。再灌流の際の生体外保存腎臓への損傷の深刻さを予防または軽減する方法も開示される。本方法は再灌流の際の腎臓への損傷の深刻さを予防または軽減するのに十分な量の２０−ＨＥＴＥまたは２０−ＨＥＴＥアゴニストを含んだ保存溶液で生体外で腎臓を保存することを含む。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、２００４年９月１６日に出願された米国仮出願第６０／６１０，４６５号の利益を主張する、２００５年９月１６日に出願された米国特許出願第１１／２２９，２４１号に基づく一部継続出願である。両先行出願はその全体が参照により本明細書に組み込まれるものとする。
【０００２】
連邦政府による資金提供を受けた研究開発の記載
本発明は次の機関により授与された米国政府補助金により行われた：ＮＩＨ ＨＬ−３６２７９。米国は本発明において一定の権利を有する。
【背景技術】
【０００３】
糖尿病および高血圧は末期腎疾患（ＥＳＲＤ）の主要な原因である。薬物療法が有効であるにも関わらず、コンプライアンスおよび薬剤費は深刻な問題であり、わずかな割合の患者だけが適切な生涯にわたる血圧または糖尿病のコントロールを達成する。結果としてＥＳＲＤの発生率は、母集団が加齢し、また肥満になるにつれて増加する。ＥＳＲＤ治療のための米国連邦政府の負担は１年あたり１５０億ドルを超える。
【０００４】
ＥＳＲＤのための現在の治療の選択肢としては腎臓透析および移植等が挙げられる。これら２種の治療には高額費用がかかることに加え、透析は濾過作用のみの提供で腎臓の他の機能は提供せず、また腎臓移植は臓器の不足および拒絶反応の問題を有する。
【０００５】
最近、糖尿病性（diabetes-induced）および高血圧性（hypertension-induced）腎症の治療のためのターゲットとしてＴＧＦ−βが同定された。これは、これらの疾患の患者および動物モデルの腎臓においてＴＧＦ−βの発現がアップレギュレートされていることが見出されたためである（Noble NA & Border WA, Sem Nephrol 17:455-466, 1997; Reeves WB & Anderoli TE, Proc Natl Acad Sci 97:7667-7669, 2000; Sharma K & McGowan T. Cytokine Growth Factor Rev 11:115-123, 2000; Sharma K et. al., Diabetes 46:854-859, 1997; Yamamoto T et. al., Proc Nat’l Acad Sci 90:1814-1818, 1993; Yamamoto T et. al., Kidney Int 49:461-469, 1996）。糖尿病性および高血圧性腎症は初期にタンパク尿を発症し、これが例えば糸球体病変（糸球体硬化症等）の発症を促すことによって腎疾患の進行を速めることを特徴とし、ＴＧＦ−βの過剰発現がこの過程において重要なファクターであると信じられている（Dahly AJ et. al., Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol 283:R757-767, 2002; Border WA et. al., N Engl J Med 331:1286-1292, 1994; Sanders PW Hypertension 43:142-146, 2004; McCarthy ET et. al., J Am Soc Nephrol 14:84A, 2003; Bottinger EP et. al., J Am Soc Nephrol 10:2600-2610, 2002; August P et. al., Kidney Int Suppl 87:S99-104, 2003; Ziyadeh FN et. al., Proc Nat'l Acad Sci USA 97:8015-8020, 2000; 175, 202, 218, 265, 266）。例えば、ＴＧＦ−βは単離糸球体のアルブミンに対する透過性を直接増加させることが見出されており（Sharma R et. al., Kidney Int 58:131-136, 2000）、タンパク尿の誘発においてＴＧＦ−βが直接的な役割を担っていることが示されている。また、ＴＧＦ−βは細胞外マトリクスの産生を増加させ、糸球体硬化症および腎間質線維化の発症を促すことも見出されている（Pavenstadt H et. al., Physiol Rev 83:253-307, 2003; Border WA et. al., N Engl J Med 331 : 1286-1292, 1994; および Sanders PW Hypertension 43:142-146, 2004）。重要なことには、ＴＧＦ−β抗体またはアンチセンスオリゴヌクレオチドのいずれかによりＴＧＦ−βの活性を阻害すると、タンパク尿および糸球体の損傷の度合いが減少することが示されている（Dahly AJ et. al., Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol 283:R757-767, 2002; Ziyadeh FN et. al., Proc Nat’l Acad Sci USA 97:8015-8020, 2000; Chen s et. al., Biochem Biophys Res Commun 300:16-22, 2003; および Han DC et. al., Am J Physiol 278F628-F634, 2000）。
【０００６】
腎臓におけるＴＧＦ−β発現の増加は、腎移植拒絶反応（Shihab FS et. al., Kidney Int 50:1904-1913, 1996; Shihab FS et. al., J Am Soc Nephrol 6:286-294, 1995）；各種形態の糸球体硬化症（Yamamoto T et. al., Kidney Int 49:461-469, 1996; Yoshioka K et. al., Lab Invest 68:154-163, 1993）；ヘイマン腎炎（Shankland SJ et. al., Kidney Int 50:116-124, 1996）；残存腎臓（remnant kidney）（Lee L et. al., J Clin Invest 96:953-964, 1995; Wu LL et. al., Kidney Int 51:1553-1567, 1997）；尿管閉塞（Kaneto H et. al., Kidney Int 44:313-321, 1993）；放射線並びにシクロスポリン、ピューロマイシン、シスプラチン、および重金属等の免疫抑制性および腎毒性薬剤によって引き起こされた腎疾患（Oikawa T et. al., Kidney Int 51:164-172, 1997; Sharma VK et. al., Kidney Int 49:1297-1303, 1996; Shihab FS et. al., Kidney Int 49:1141-1151, 1996; Jones CL et. al., Am J Path 141:1381-1396, 1992; Ma LJ et. al., Kidney Int 65:106-115, 2004）；さらには試験された腎損傷の動物モデル全て（Noble NA & Border WA, Sem Nephrol 17:455-466, 1997）とも関連している。シクロスポリンおよびピューロマイシンにより誘導された腎症においてはＴＧＦ−β活性のその抗体による阻害が有益な効果をもたらした（Ling H et. al., J Am Soc Nephrol 14:377-388, 2003; Ma LJ et. al., Kidney Int 65:106-115, 2004）。
【０００７】
ＴＧＦ−βがタンパク尿および腎損傷の進行を開始するメカニズムは明らかではない。これと関連しては、ＴＧＦ−βの下流側応答因子（respondent）の同定が、腎臓におけるＴＧＦ−βの発現量の上昇と関連した腎疾患を治療するための更なる、および新規の標的をもたらすであろう。
【発明の概要】
【０００８】
本発明は、２０−ヒドロキシエイコサテトラエン酸（２０−ＨＥＴＥ）またはそのアゴニストをヒトまたはヒト以外の動物に腎疾患を予防または治療するのに十分な量投与することにより、該ヒトまたはヒト以外の動物における腎疾患を予防または治療する方法を提供する。
【０００９】
本発明はさらに、２０−ＨＥＴＥまたはそのアゴニストをヒトまたはヒト以外の動物に虚血性急性腎不全を予防または治療するのに十分な量投与することにより、該ヒトまたはヒト以外の動物における虚血性急性腎不全を予防または治療する方法も提供する。
【００１０】
本発明はさらに、再灌流の際の腎臓への損傷の深刻さを予防または軽減させるのに十分な量の２０−ＨＥＴＥまたはそのアゴニストを含んだ保存溶液中で生体外で腎臓を保存することにより、再灌流の際の生体外保存腎臓への損傷の深刻さ予防または軽減させる方法も提供する。
【発明の詳細な説明】
【００１１】
腎臓のＴＧＦ−βのアップレギュレーションが、２０−ＨＥＴＥの糸球体における産生を阻害することを通じて、糸球体濾過障壁のアルブミンおよび他の高分子に対する透過性を増加させることが本明細書に開示される。このようなアルブミンに対する糸球体の透過性の増加はタンパク尿およびさらに他の糸球体損傷（例えば糸球体硬化症および腎間質線維化）を引き起こすことから、本発明はＴＧＦ−βと関連した腎疾患並びにその物理的および病理学的症状を予防および治療するための新たな手段を提供する。
【００１２】
一局面において、本発明は、ヒトおよびヒト以外の動物にけるＴＧＦ−βと関連した腎疾患を予防または治療する方法に関する。本方法は該腎疾患を予防または治療するのに十分な量の２０−ＨＥＴＥまたは２０−ＨＥＴＥアゴニストを該ヒトまたはヒト以外の動物に投与することを含む。ＴＧＦ−βと関連した腎疾患とは、ここではＴＧＦ−β発現がアップレギュレートされている腎疾患並びにその物理的および病理学的症状を意味する。このような疾患の例としては、タンパク尿；糖尿病および高血圧（食塩感受性高血圧等）によって誘起された腎症；腎移植拒絶反応；ヘイマン腎炎；残存腎臓腎症（remnant kidney nephropathy）；尿管閉塞性腎症（ureteral obstruction nephropathy）；また放射線並びにシクロスポリン、ピューロマイシン、シスプラチン、および重金属等の免疫抑制性および腎毒性薬剤によって引き起こされた腎疾患が挙げられるがこれらに限定されない。一態様においては、本発明の方法はタンパク尿またはタンパク尿と関連した腎疾患を予防または治療するために用いられる。タンパク尿と関連した腎疾患とは、ここではタンパク尿が検出される腎疾患を意味する。他の態様においては、本発明の方法は糖尿病性または高血圧性腎症を予防または治療するために用いられる。
【００１３】
本発明で用いることが出来る２０−ＨＥＴＥの例としては、米国特許第６，３９５，７８１号； Yu M et. al., Eur J Pharmacol. 486:297-306, 2004; Yu M et. al., Bioorg Med Chem. 11:2803-2821, 2003;およびAlonso-Galicia M et. al., Am J Physiol. 277:F790-796, 1999（これらは全てその全体が本明細書に組み入れられたものとする）に開示されているものが挙げられるがこれらに限定されない。例えば、米国特許第６，３９５，７８１号において提供されている下記式により定義される２０−ＨＥＴＥアゴニストを本発明において用いることが出来る：
【化１】
［式中、
Ｒ１はカルボン酸、フェノール、アミド、イミド、スルホンアミド、スルホンアミド、活性メチレン、１，３−ジカルボニル、アルコール、チオール；アミン、テトラゾールおよび他のヘテロアリール基からなる群より選択され；
Ｒ２はカルボン酸、フェノール、アミド、イミド、スルホンアミド、スルホンアミド、活性メチレン、１，３−ジカルボニル、アルコール、チオール；アミン、テトラゾールおよび他のヘテロアリールからなる群より選択され；
Ｗは炭素鎖（Ｃ１〜Ｃ２５）であり、直鎖状、環状または分岐状であってもよく、かつヘテロ原子を含んでいてもよく；
Ｙは炭素鎖（Ｃ１〜Ｃ２５）であり、直鎖状、環状または分岐状であってもよく、かつヘテロ原子を含んでいてもよく；
ｓｐ＜３ Ｃｅｎｔｅｒはビニル、アリール、ヘテロアリール、シクロプロピル、およびアセチレン部分からなる群より選択され；
Ｘは直鎖状、分岐状、環状または多環式であってもよいアルキル鎖であり、かつヘテロ原子を含んでいてもよく；
ｍは０、１、２、３、４または５であり；そして
ｎは０、１、２、３、４または５である］。
【００１４】
好ましくは、上記式により定義された２０−ＨＥＴＥアゴニストはＲ１またはＲ２のいずれかにカルボキシル基または他のイオン性基を有し、該イオン性基から１４〜１５炭素に等しい距離で二重結合または他の官能基を有する（米国特許第６，３９５，７８１号）。より好ましくは、該２０−ＨＥＴＥアゴニストは２０〜２１炭素の長さを有し、カルボキシル基または他のイオン性基をＲ１またはＲ２のいずれかに有し、二重結合または他の官能基を該イオン性基から１４〜１５炭素に等しい距離で有し、水酸基をＲ１またはＲ２のいずれかの２０または２１炭素上に有する（米国特許第６，３９５，７８１号）。
【００１５】
一形態においては、本発明は次の２０−ＨＥＴＥアゴニストのうちの１または複数種の使用を意図している：２０−ヒドロキシエイコサン酸、２０−ヒドロキシエイコサ−５（Ｚ），１４（Ｚ）−ジエン酸（ＷＩＴ００３）、およびＮ−メチルスルホニル−２０−ヒドロキシエイコサ−５（Ｚ），１４（Ｚ）−ジエンアミド。
【００１６】
タンパク尿、糖尿病性腎症、および高血圧性腎症等の腎臓ＴＧＦ−β発現量の上昇と関連した慢性腎疾患に対する有益な効果に加え、本願発明者らは動物を２０−ＨＥＴＥまたは２０−ＨＥＴＥアゴニストで治療すると虚血によって引き起こされた急性腎損傷を軽減することが出来ることも見出した（下記実施例２を参照）。
【００１７】
虚血は臓器に対する血液および酸素の供給不足と定義される。腎臓への血液の供給が中断または減少した場合、尿細管細胞が壊死またはアポトーシスを起こし、急性腎不全が発症することがある。虚血には、心臓手術、失血、重症の下痢または熱傷による体液の喪失、ショック、および移植前のドナー腎の保存と関連した虚血等の多くの原因がある。これらの状況においては、腎臓への血流が危険なほど低い水準にまで低下し、その時間の長さが、尿細管上皮細胞に虚血性傷害を引き起こし、該上皮細胞が尿細管内腔へと剥がれ落ち、尿細管の流れの障害となって糸球体濾過の喪失および急性腎不全を引き起こすのに十分なまでになる場合がある。
【００１８】
急性腎不全とは、尿がほとんどまたは全く生成されず、通常は腎臓が除去するはずの物質が体内に残留してしまうほどの低い水準まで糸球体濾過速度が突然低下することを言う。虚血は腎臓への血流の減少により急性腎不全を引き起こし、排泄が不十分となる。血流の減少はまた高度に代謝的に活発な尿細管細胞への不十分な酸素供給をもたらし、該細胞は高エネルギーリン酸塩を使い果たして不可逆性の虚血性傷害を被り、壊死および／またはアポトーシスが起こる。そして該細胞は破裂するかまたは基底膜から剥がれ落ち、尿細管内腔を詰まらせて、詰まった尿細管内の圧力をせき止め、腎灌流が回復した際、あるいはときにおいても濾過を妨げる。
【００１９】
２０−ＨＥＴＥは強力な腎血管収縮剤であることから、２０−ＨＥＴＥまたはそのアゴニストが虚血により損傷を被った腎臓に対して有益な効果を有するであろうことは驚くべきことである。理論により限定されることなく、本願発明者らは、腎虚血性傷害の予防における２０−ＨＥＴＥの有益な効果は、２０−ＨＥＴＥが尿細管上皮細胞中のナトリウム輸送を阻害する直接的な効果を有し、また細胞の増殖および生存に関与する多くの細胞内経路を活性化するために、虚血性傷害を被った尿細管上皮細胞の生存に対して効果を有することによるものであろうと信じる。これと関連して、本発明は、ヒトまたはヒト以外の動物に対し虚血性急性腎不全を予防または治療するのに十分な量の２０−ＨＥＴＥおよび／または２０−ＨＥＴＥアゴニストを投与することにより、該ヒトまたはヒト以外の動物における虚血性急性腎不全を予防または治療する方法を提供する。任意に、本方法は２０−ＨＥＴＥおよび／またはそのアゴニストを用いた治療により改善されると期待される尿生成能等の腎臓の機能を監視する工程も伴っていてもよい。例えば、２０−ＨＥＴＥまたはそのアゴニストは心臓手術または腎移植手術の前、最中、および／または直後に急性腎不全を予防または治療するために患者に投与されてもよい。好ましいものを含む２０−ＨＥＴＥアゴニストの例は上記の通りである。
【００２０】
本発明は特定の経路の投与により限定されるものではない。２０−ＨＥＴＥまたは２０−ＨＥＴＥアゴニストの適した投与経路としては、経口投与、静脈内投与、皮下投与、筋肉内投与、および腎臓への直接送達等が挙げられるがこれらに限定されるものではない。特定の投与経路を介した特定の腎疾患を予防または治療するための２０−ＨＥＴＥまたは特定の２０−ＨＥＴＥアゴニストの最適な投与量は当業者により容易に決定され得る。
【００２１】
２０−ＨＥＴＥおよび／またはそのアゴニストは生体外で腎臓を保存するためにも用いることが出来る。移植に用いられる臓器には、該臓器が取り出された瞬間から移植の時点まで、効果的な生体外での保存が必要である。低温保存溶液は、冷阻血時間中に代謝活性および毒性物質の蓄積を減少させることにより組織の生存能力を維持するために開発された。移植のために用いられる臓器は血液供給から外された後、長期にわたり冷阻血保存される場合があり、この場合再灌流時に障害を受けやすくなる。臨床腎移植において低温保存の時間が長いことが移植片機能の遅延と強く関わっていることが多くの研究により示されており、これがその後の短期および長期の移植片の生存に影響しうる。本発明は、再灌流の際の腎臓への損傷の深刻さを予防または軽減するのに十分な量の２０−ＨＥＴＥおよび／または２０−ＨＥＴＥアゴニストを含んだ保存溶液中で腎臓を生体外保存することにより、再灌流の際の該生体外保存腎臓への損傷の深刻さを予防または軽減する方法を提供する。一態様においては、このような量は約０．１μＭないし約１０μＭである。任意に、２０−ＨＥＴＥおよび／またはそのアゴニストは、回収の時点から移植の時点までに腎臓が接触する１または複数種の他の溶液中にも含まれている。この移植手術を行う医師および／または前記腎臓を受け入れる患者は、再灌流の際の腎臓の損傷の深刻さを予防または軽減するための条件下で該腎臓が保存されたものであることを知らされてもよい。
【実施例】
【００２２】
本発明は次の限定されない実施例を考慮することにより、より完全に理解されるであろう。
【００２３】
実施例１：２０−ＨＥＴＥアゴニストはＴＧＦ−βにより誘起された糸球体傷害と拮抗する
この実施例では、トランスフォーミング増殖因子ベータ（ＴＧＦ−β）が、２０−ヒドロキシエイコサテトラエン酸（２０−ＨＥＴＥ）の糸球体における産生を阻害することにより糸球体透過性を変えることを示す。ＴＧＦ−βの腎臓発現は高塩食を７日間与えたＤａｈｌ食塩感受性（Ｄａｈｌ Ｓ）ラットにおいて倍加し、これはアルブミンに対する透過性（Ｐａｌｂ）の０．１９±０．０４から０．７５±０．０１への顕著な上昇と関連しており、糸球体濾過障壁の超微細構造における変化を伴っていた。ＴＧＦ−βを中和する抗体でＤａｈｌ Ｓラットを長期間処理すると、Ｐａｌｂの増加が阻止され、また糸球体毛細血管の構造が保存されたことから、高血圧性腎疾患がＴＧＦ−βの生成および活性の増加に依存していることが示された。高塩食により生じた血圧の上昇に対しては効果が無かった。Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙ（ＳＤ）ラットより単離された糸球体をＴＧＦ−β１（１０ｎｇ／ｍｌ）とともに１５分間プレインキュベートすると、Ｐａｌｂが０．０１±０．０１から０．６０±０．０２へと上昇した。これは２０−ＨＥＴＥの糸球体における産生が２２１±１１から３．４＋０．５μｇ／３０分間／ｍｇタンパク質へと抑制されたことと関連していた。２０−ＨＥＴＥの安定なアナログである２０−ヒドロキシエイコサ−５（Ｚ），１４（Ｚ）−ジエン酸でＳＤの糸球体を前処理したところ、ベースラインのＰａｌｂが減少し、Ｐａｌｂを上昇させるＴＧＦ−βの効果と拮抗した。
【００２４】
材料および方法
Ｄａｈｌ食塩感受性ラットモデル：Ｄａｈｌ食塩感受性（Ｓ）ラットはヒトにおける食塩感受性高血圧と関連した数多くの特徴を示す（Campese VM. Hypertension 78:531-550, 1994; および Grimm CE et. al., Hypertension 15:803-809, 1990）。これらは食塩感受性（Iwai, J. Hypertension 9:I18-I20, 1987; および Rapp J.P. Hypertension 4:753-763, 1982）、インシュリン抵抗性（Reft, GM et. al., Hypertension 18:630-635, 1991）および脂質異常症（Raji, L et. al., Kidney Int. 41:801-806, 1984; および O’Donnell, MP et. al., Hypertension 20:651-658, 1992）であり、高塩（ＨＳ）食による負荷を与えると速やかにタンパク尿および糸球体硬化症を発症する（O’Donnell, MP et. al., Hypertension 20:651-658, 1992; Roman RJ et. al., Hypertension 12:177-183, 1988; Roman RJ et. al., Hypertension 21:985-988, 1988; Roman RJ et. al., Am J Hypertens 10:63S-67S, 1997; および Tolins JP et. al., Hypertension 16:452-461, 1990）。発症する糸球体病変は高血圧性および糖尿病性腎症を有する患者に見られるものと類似している（McClellan W et. al., Am J Kidney Dis 12:285-290, 1987; Ronstand GS et. al., N Engl J Med 306:1276-1279, 1982; および Tierney WM et. al., Am J Kidney Dis 13:485-493, 1989）。トランスフォーミング増殖因子β（ＴＧＦ−β）の腎臓発現は高塩（ＨＳ）食を与えたＤａｈｌ Ｓラットにおいて上昇し、ＴＧＦ−β中和抗
体（Ａｂ）によりＤａｈｌ Ｓラットを３週間長期処理すると、タンパク尿並びに糸球体硬化症および線維症の度合いが軽減する（Dahly AJ et. al., Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol 283:R757-767, 2002）。
【００２５】
概要：１％ＮａＣｌを含んだ正常食塩食（＃５０１０， Ｐｕｒｉｎａ）を与えた７週齢のＳｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙ（Ｔａｃｏｎｉｃ Ｌａｂｓ）ラット、およびＭｅｄｉｃａｌ Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎにおいて維持される本願発明者らのコロニーから得たＤａｈｌ食塩感受性／Ｊｏｈｎ Ｒａｐｐラットに対して実験を行った。ラットに０．４％（低塩、ＬＳ）または８．０％ ＮａＣｌ（高塩、ＨＳ）のいずれかを含んだ、Ｄｙｔｅｓ， Ｉｎｃより購入した精製飼料（ＡＩＮ７６）を与えた。高血圧発症中にタンパク尿およびＰａｌｂを変化させるＴＧＦ−βの役割を評価するため、ＨＳ食を与えたＤａｈｌ Ｓラットの群をマウス抗ＴＧＦ−βモノクローナルＡｂ（０．５ｍｇ／ｋｇ；１Ｄ１１；Ｇｅｎｚｙｍｅ Ｃｏｒｐ）または対照マウスモノクローナルＡｂ（１３Ｃ４；抗ベロ毒素）の隔日での腹腔内投与により処理した（Dasch JR et. al., J Immunol 10:2109-2119, 1989）。処理期間の最後にラットを代謝ケージ中に一晩置いてタンパク質およびアルブミンの排泄を測定した（Dahly AJ et. al., Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol 283:R757-767, 2002）。次にこれらをハロセンにより麻酔し、腎臓を回収して、ウェスタンブロット法によりＴＧＦ−βタンパク質の発現量を測定し（Hoagland KM et. al., Hypertension 43:860-865, 2004）、また糸球体を単離してＰａｌｂおよび２０−ＨＥＴＥの産生量を測定した。無線テレメトリー送信機（Ｄａｔａ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｉｎｃ．）に接続したカテーテルを１０個体のさらなる対照および１０個体の１Ｄ１１処理Ｄａｈｌ Ｓラットの大腿動脈に挿入し、高血圧発症時の抗ＴＧＦ−β療法の効果を測定した。平均動脈圧（ＭＡＰ）を、ラットにＬＳ食を与えた対照期間の間、およびＨＳ食を７日間与えた後に、午前９時と正午（１２ＰＭ）との間の毎日３時間測定した。
【００２６】
アルブミン透過性（Ｐａｌｂ）の測定：糸球体を、Sharma R et. al.(Kidney Int 58:131-136, 2000)およびSavin VJ et. al.(J Am Soc Nephrol 3:1260-1269, 1992)に記載のふるい分け法（ｓｉｅｖｉｎｇ ｍｅｔｈｏｄ）を用いて、５ｇ／ｄｌのウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含む培地中で単離した。各実験条件下で、槽を１ｇ／ｄＬアルブミンを含んだ培地と交換した後の糸球体容積の変化（ΔＶ）からＰａｌｂを測定した。Ｐａｌｂは１−（ΔＶｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ／ΔＶｃｏｎｔｒｏｌ）として計算され、ここで正常食塩食を与えたＳｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙラットからの糸球体を各実験の対照値を提供するために用いた。Ｄａｈｌ ＳラットにおけるΔＶの欠如が糸球体の機械的な性質の変化ではなくＰａｌｂの変化と関連するものであったことを確認するため、糸球体を高分子量デキストランの５％溶液に暴露する追加実験を行った。これらの条件下におけるＤａｈｌ Ｓ糸球体のサイズの変化は、１％アルブミンに対する反応の欠如がＰａｌｂの増加に起因するものであったことを示唆する（Savin VJ et. al., J Am Soc Nephrol 3:1260-1269, 1992）。
【００２７】
他の実験においては、Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙラットと、ＬＳ食またはＨＳ食のいずれかを４日間与えたＤａｈｌ Ｓラットとから単離された糸球体における、ＴＧＦ−βおよび２０−ＨＥＴＥのＰａｌｂに対する相互作用を試験した。糸球体を溶媒またはＴＧＦ−β１（１０ｎｇ／ｍｌ）とともに１５分間３７℃でプレインキュベートし、Ｐａｌｂの変化を測定した。また、糸球体を安定な２０−ＨＥＴＥアゴニスト、２０−ヒドロキシエイコサ−５（Ｚ），１４（Ｚ）−ジエン酸（ＷＩＴ００３；１μｍｏｌ／Ｌ；Ｔａｉｓｈｏ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ）（Alonso-Galicia, M et al, Am. J. Physiol. 277:F790-F796, 1999; および Yu, M et. al., Bioorg. Med. Chem. 11:2803-2821, 2003）とともに１５分間３７℃で前処理し、ＴＧＦ−β１（１０ｎｇ／ｍｌ）に対するＰａｌｂの応答を再測定した。各ラットで最低５個の糸球体を分析し、これらの実験を各処理群で５個体以上のラットを用いて行った。
【００２８】
電子顕微鏡法：ＬＳ食を与えたＤａｈｌ ＳラットおよびＨＳ食を１週間与えて１Ｄ１１または溶媒で処理したＤａｈｌ Ｓラットからの腎臓を回収し、４％グルタルアルデヒド溶液中で固定した。薄いエポン切片を調製し、酢酸ウラニルおよびクエン酸鉛により染色し、透過型電子顕微鏡（Ｈｉｔａｃｈｉ Ｈ６００）を用いて１６，０００Ｘで観察した。
【００２９】
ウェスタンブロット法：対照のＳｐｒａｇｕｅ ＤａｗｌｅｙラットおよびＬＳまたはＨＳ食を７日間与えたＤａｈｌ Ｓラットの腎臓からホモジネートを調製した。ホモジネートの一部（３０μｇタンパク質）を１２．５％ドデシル硫酸ナトリウムゲル上で分離し、ニトロセルロース膜に転写し、１次ＴＧＦ−β１ Ａｂ（ＳＣ：１４６；Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、続いて２次Ａｂ（ＳＣ：２００４； Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）とともにインキュベートし、Hoagland KM et. al., Hypertension 43:860-865, 2004に記載の通り増感化学発光を用いて現像した。メンブレンをクマシーブルーで後染色し、試料のローディング量の潜在的な違いに対して結果を標準化した。
【００３０】
糸球体における２０−ＨＥＴＥ産生量の液体クロマトグラフィー／質量分析測定：糸球体（約２０μｇタンパク質）を、１ｍｍｏｌ／Ｌ ＮＡＤＰＨを含んだ０．１ｍｏｌ／Ｌ ＫＰＯ４緩衝液中で３７℃の下、ＴＧＦ−β１（１０ｎｇ／ｍｌ）の存在および不在下で３０分間インキュベートした。インキュベーションをギ酸による酸性化で停止し、ホモジナイズし、１０ｎｇの内部標準、１４，１５−エポキシエイコサ−５（Ｚ）−エン酸−メチルスルホニルイミド（ＥＥＺＥ）の添加後にホモジネートをクロロホルム：メタノール（２：１）で抽出した。試料を５０％アセトニトリル中で再構成（reconstitute）し、オンライン逆相高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）トラッピングカラムを用いて精製し、続いて１８Ｃ−ＲＰ ２Ｘ２５０ｍｍマイクロボアＨＰＬＣ（BetaBasic18 150x21 3μm, Thermo.Hypersil-Keystone）上の定組成ステップグラジエント（isocratic step gradient）を用い、ＨＥＴＥを分離するためのアセトニトリル：水：酢酸（５７：４３：０．１）からなる移動相を２０分間、続いてＥＥＴを分離するためのアセトニトリル：水：酢酸（６３：３７：０．１）からなる移動相を１５分間用い、試料中のＨＥＴＥおよびエポキシエイコサトリエン酸（ＥＥＴ）を分離した。陰イオンエレクトロスプレーを用いて試料をイオン化し、質量電荷比（ｍ／ｚ）３１９（ＨＥＴＥおよびＥＥＴ）または３２３（内部標準）で溶出されるピークを、Ａｇｉｌｅｎｔ ＬＳＤイオントラップ質量分析計（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ １１００）を用いて選択的イオン質量分析（ＭＳ）モードにて分離およびモニタした。目的とするピーク（ＨＥＴＥおよびＥＥＴ、ｍ／ｚ ３１９）の、近傍で溶出する内部標準に該当するピーク（ＥＥＺＥ、ｍ／ｚ ３２３）に対するイオン存在比を決定し、各バッチの試料で０．１ないし２ｎｇの２０−ＨＥＴＥおよびＥＥＴの範囲にわたって生成された標準曲線と比較した。
【００３１】
統計：平均値±１標準誤差を示す。平均値間の差の有意性をＡＮＯＶＡとそれに続くＳｔｕｄｅｎｔ−Ｎｅｗｍａｎ−Ｋｅｕｌｓ事後検定を用いて決定した。Ｐ＜０．０５を有意とみなした。
【００３２】
結果
高塩食のＴＧＦ−β１腎臓発現に対する影響：これらの実験の結果を図１に示す。腎臓におけるＴＧＦ−β１の発現量は、ＨＳ食を１週間与えたＤａｈｌ Ｓラットにおいて、ＬＳ食を与えたＤａｈｌ Ｓラットで見られた量と比べて２倍超となった。
【００３３】
高塩食のＰａｌｂに対する影響：Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙラット並びにＬＳおよびＨＳ食を１週間までの様々な期間与えたＤａｈｌ ＳラットにおけるＰａｌｂの比較を図２に示す。ベースラインＰａｌｂはＬＳ食で維持されたＤａｈｌ Ｓラットにおいて対照のＳｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙラットにおけるよりも有意に高かった。ＰａｌｂはＨＳ食を与えたＤａｈｌ Ｓラットにおいてわずか４日間後に増加し、７日間後にピークに達した。ＨＳを１週間与えたＤａｈｌ ＳラットにおけるこのＰａｌｂの増加は、１２１±２から１３６±３ｍｍ Ｈｇへと血圧が有意に増加したこと（ｎ＝１０）、およびタンパク質の排泄が４７±８ｍｇ／日から２１７±３１ｍｇ／日へと顕著に増加したこと（ｎ＝１４）と関連していた。同様に、Ｄａｈｌ ＳラットにＨＳ食を７日間与えた後、アルブミンの排泄が２７±９ｍｇ／日から１２９±２６ｍｇ／日へと増加した。
【００３４】
Ｄａｈｌ ＳラットのＰａｌｂの変化に対するＴＧＦ−βの役割：Ｓｐｒａｇｕｅ ＤａｗｌｅｙおよびＤａｈｌ Ｓラットから単離された糸球体のＰａｌｂに対するＴＧＦ−β１（１０ｎｇ／ｍＬ）の外因性投与の影響の比較も図２にまとめる。ＴＧＦ−β１はＰａｌｂを、Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙラットから単離された糸球体において０．０１±０．０１から０．５６±０．０２に増加させ、ＬＳ食を与えたＤａｈｌ Ｓラットから単離された糸球体において０．１９±０．０１から０．７５±０．０１に増加させた。ＴＧＦ−β１は４日間ＨＳ食を与えたＤａｈｌ ＳラットのＰａｌｂも増加させたが、７日間ＨＳ食を与えたＤａｈｌ ＳラットのＰａｌｂには影響を与えなかった。後者のラットのベースラインＰａｌｂはすでに最大に近かったためである。
【００３５】
ＨＳ食を与えたＤａｈｌ ＳラットをＴＧＦ−β中和Ａｂで長期間処理すると、ベースラインＰａｌｂの増加が抑制された。ＴＧＦ−β１をこれらの糸球体へ投与するとまだＰａｌｂが増加し、これは対照Ｓｐｒａｇｕｅ ＤａｗｌｅｙラットおよびＬＳ食を与えたＤａｈｌ Ｓラットから単離された糸球体に見られた場合と同様であった。ＴＧＦ−β１ Ａｂ療法は血圧の上昇には効果を示さなかった。血圧は、ＨＳ食を与えて１Ｄ１１で７日間処理したＤａｈｌ Ｓラットにおいて１２３±４から１３６±３ｍｍ Ｈｇ（ｎ＝１０）へと上昇した。
【００３６】
電子顕微鏡法：ＬＳまたはＨＳ食を与えたＤａｈｌ Ｓラット、およびＴＧＦ−β Ａｂで１週間処理したこれらラットにおける糸球体毛細血管の超微細構造の電子顕微鏡写真を得た。ＬＳ食を与えたＤａｈｌ Ｓラットは正常な外観の糸球体限外濾過障壁を示した。ＨＳ食を７日間与えたＤａｈｌ Ｓラットにおいては、足細胞の足突起の退縮および融合並びに基底膜部分の暴露が認められた。また、糸球体毛細血管を裏打ちする内皮細胞の腫脹も認められ、それらの形状が扁平なものからより立方内皮（cubodial endothelium）状へと変化していた。ＨＳ食を与えたＤａｈｌ Ｓラットにおける糸球体濾過障壁の超微細構造のこれらの変化はＴＧＦ−β Ａｂの投与により抑制された。
【００３７】
２０−ＨＥＴＥの糸球体における産生に対するＴＧＦ−βの影響：単離された糸球体によるアラキドン酸（ＡＡ）の産生および代謝に対するＴＧＦ−βの影響を図３に示す。ＡＡとともにインキュベートした糸球体は、２０−ＨＥＴＥ、１５−ＨＥＴＥ、１２−ＨＥＴＥ、５−ＨＥＴＥ並びに１４，１５−ＥＥＴ、１１，１２−ＥＥＴ、８，９−ＥＥＴ、および５，６−ＥＥＴ標準と共溶出する３１９のｍ／ｚを示すいくつかの大きなピークを生じた（図３Ａ）。さらに、フラグメンテーションの１６分後に溶出する最大のピークが、２０−ＨＥＴＥ標準に見られるものと同一の３０１、２７３、２５７、および２４５のｍ／ｚにおいて顕著な二次イオンのＭＳ／ＭＳスペクトルを生成することが確認された。糸球体をＴＧＦ−β１で前処理したところ、１５−、１２−若しくは５−ＨＥＴＥまたはＥＥＴの生成に影響を与えることなく（図３Ａ）、２０−ＨＥＴＥの生成が選択的に９７％減少した（図３Ｂ）
【００３８】
Ｐａｌｂに対する２０−ＨＥＴＥアゴニストの影響：ＴＧＦ−β１により生じたＰａｌｂの変化に対する２０−ＨＥＴＥアゴニストの添加の影響を図４にまとめる。糸球体を２０−ＨＥＴＥアゴニストで前処理したところ、ベースラインＰａｌｂが減少し、ＴＧＦ−β１により生じたＰａｌｂの増加が著しく弱まった。同様な結果が、ＬＳ食で維持したまたはＨＳ食を４日間与えたＤａｈｌ Ｓラットで得られた。例えば、ＴＧＦ−β１はＨＳ食を４日間与えたＤａｈｌ Ｓラットから単離された糸球体においてＰａｌｂを０．５８±０．０４（ｎ＝２５糸球体；ラット５個体）から０．８７±０．０２（ｎ＝２５；ラット５個体）へと増加させた。糸球体を２０−ＨＥＴＥアゴニストで前処理した後、ＴＧＦ−β１ Ｐａｌｂは０．２５±０．０１（ｎ＝２５；ラット５個体）から０．４０±０．０１（ｎ＝２５；ラット５個体）へと増加しただけであった。
【００３９】
実施例２：２０−ＨＥＴＥおよび２０−ＨＥＴＥアゴニストによる、虚血性傷害からの腎臓の保護
材料および方法
ペントバルビタール（５０ｍｇ／Ｋｇ）を用いて麻酔したオスのＳｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙラットで実験を行った。正中切開により腎臓を露出させ、腎動脈を分離した。右および左腎動脈の両方に調節式血管オクルーダー（adjustable vascular occluder）を設置し、腎臓への血流を３０分間完全に閉塞した。完全な腎虚血の時間の後、鉗子を除き、腎臓を再灌流させた。外科的切開を２−０絹縫合で閉じ、ラットを麻酔から完全に回復させた。２４時間後、このラットをペントバルビタールで再麻酔し、大動脈から血液試料を採取し、血漿クレアチニン濃度を自動分析器を用いて測定した。腎臓を回収し、１０％ホルマリン溶液中で固定し、パラフィン切片を調製してヘマトキシリン・エオジン染色を行い、尿細管の壊死および傷害の度合いを評価した。３群のラットを分析した。第１群のラットは溶媒で処理し、対照個体とした。第２群のラットは２０−ＨＥＴＥの合成の阻害剤であるＨＥＴ００１６（５ｍｇ／Ｋｇ、皮下注射）で腎虚血の３０分前に処理した。第３群のラットは２０−ＨＥＴＥアゴニストであるＷＩＴ００３（１０ｍｇ／Ｋｇ、皮下注射）を腎虚血の３０分前に静脈注射により投与した。
【００４０】
結果
図５に示すのは、腎臓の虚血および再灌流後の腎損傷の度合いに対するＨＥＴ００１６（２０−ＨＥＴＥの合成の阻害剤）およびＷＩＴ００３（２０−ＨＥＴＥアゴニスト）の効果を試験したｉｎ ｖｉｖｏ実験の結果である。Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙラットの腎臓を３０分間の完全な虚血にし、続いて２４時間の再灌流を行ってから２４時間後に、血漿クレアチニン濃度は０．５から約３．０ｍｇ／ｄｌに上昇した。血漿クレアチニン濃度に反映される傷害の程度は、虚血の３０分前にＨＥＴ０１６（５ｍｇ／Ｋｇ、皮下注射）投与で処理したラットにおいて有意に大きかった。再灌流の３０分前にＷＩＴ００３（１０ｍｇ／Ｋｇ、皮下注射）を投与すると、血漿クレアチニン濃度に反映される腎障害の程度は有意に減少した。対照個体における虚血再灌流後の血漿クレアチニン濃度は近位尿細管のＳ３セグメントの深刻な壊死と関連している。尿細管のこのセグメントの組織学的障害の度合いは２０−ＨＥＴＥアゴニストで処理したラットにおいて減少している（データ示さず）。
【００４１】
他の実験において、２０分間の虚血再灌流を行ったＤａｈｌ Ｓラット（２０−ＨＥＴＥ欠損系統）に見られる腎傷害の程度を、腎臓において２０−ＨＥＴＥを産生する酵素をコードするＬｅｗｉｓラットからのＣＹＰ４Ａ遺伝子を導入した、２Ｘ４と呼ばれるＤａｈｌ Ｓラットのコンジェニック系統に見られる腎傷害の程度と比較した。この遺伝子を移入すると腎臓におけるＣＹＰ４Ａタンパク質の発現および腎臓における２０−ＨＥＴＥの産生がアップレギュレートされる。図６に見られるように、ＬｅｗｉｓラットからのＣＹＰ４Ａ遺伝子のＤａｈｌ Ｓ遺伝的背景への移入により、虚血および再灌流の２４時間後の血漿クレアチニン濃度のより少ない上昇に反映される腎損傷の程度の有意な軽減が認められた。従ってこのデータは、２０−ＨＥＴＥの内生的形成のアップレギュレーションまたは２０−ＨＥＴＥアゴニストの投与が腎臓を虚血性腎傷害から保護し、一方で２０−ＨＥＴＥの腎臓における生成の阻害が傷害の程度を悪化させるという、Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙラットにおいて得られた結果と矛盾が無い。
【００４２】
本発明は前述の実施例に限定されることを意図するものではなく、添付の特許請求の範囲内に入る全てのこのような改変および変形を含むものである。
【図面の簡単な説明】
【００４３】
【図１】図１は、Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙ（ＳＤ）並びにＬＳおよび７日間のＨＳを与えたＤａｈｌ Ｓラット（食塩感受性高血圧および高血圧性腎疾患の遺伝モデル）の腎臓におけるＴＧＦ−β１の発現量を示した図である。ＳＤ（レーン１−３）、ＬＳ食を与えたＤａｈｌ Ｓラット（レーン４−７）、およびＨＳ食（８％ ＮａＣｌ）を７日間与えたＤａｈｌ Ｓラット（レーン８−１１）から単離された腎臓ホモジネート。各レーンには異なる個体（各群でｎ＝３ないし４）から単離されたホモジネート（３０μｇタンパク質／レーン）をロードした。＊はＬＳ食を与えたＤａｈｌ Ｓラットに見られた値に対する有意差を表す。ＨＳ−７、７日間のＨＳ食。
【図２】図２は、ＳＤラット並びにＬＳおよび７日間のＨＳ食を与えたＤａｈｌ Ｓラットから単離された糸球体における、またはＨＳ食を与えてＴＧＦ−β Ａｂ（１Ｄ１１−７）で処理したＤａｈｌ Ｓラットにおける、アルブミンに対する透過性（Ｐａｌｂ）へのＨＳ食の影響およびＴＧＦ−βの役割を示した図である。用いたＴＧＦ−β ＡｂはＴＧＦ−βの３種のアイソフォーム全てを効果的に中和する。糸球体を溶媒または１０ｎｇ／ｍｌのＴＧＦ−β１とともに１５分間３７℃でプレインキュベートし、Ｐａｌｂを測定した。括弧内の数字は群あたりの分析された糸球体の数およびラットの数を表す。＊はＬＳ食を与えたＤａｈｌ Ｓラットに見られた値に対する有意差を表す。†は対応するコントロール値からの有意差を表す。ＨＳ−４、４日間のＨＳ。ＨＳ−７、７日間のＨＳ。
【図３】図３は、単離糸球体による２０−ＨＥＴＥの産生に対するＴＧＦ−β１（１０ｎｇ／ｍｌ）の影響を示した図である。典型的なＬＣ／ＭＳクロマトグラムをパネル４Ａに示す。ＴＧＦ−β１は、１６分間の保持時間で溶出する３１９のｍ／ｚを示す２０−ＨＥＴＥのピークの形成を阻害した。パネルＢに、６つの実験から得られた結果の要約を示す。†は対応するコントロール値からの有意差を表す。
【図４】図４は、ＴＧＦ−β１により生じたＰａｌｂの変化に対する２０−ＨＥＴＥアゴニストの影響を示した図である。糸球体を溶媒またはＴＧＦ−β１（１０ｎｇ／ｍｌ）とともに１５分間３７℃でプレインキュベートし、Ｐａｌｂの変化を測定した。糸球体を安定な２０−ＨＥＴＥアゴニスト、２０−ヒドロキシエイコサ−５（Ｚ），１４（Ｚ）−ジエン酸（ＷＩＴ００３）とともに１５分間３７℃で前処理し、ＴＧＦ−β１（１０ｎｇ／ｍｌ）に対するＰａｌｂの応答を再測定した。括弧内の数字は群あたりの分析された糸球体の数およびラットの数を表す。†は対応するコントロール値からの有意差を表す。
【図５】図５は、腎臓の３０分間の虚血および２４時間の再灌流の後におけるＳｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙラットの血漿クレアチニン濃度の比較を示した図である。ラットを、溶媒、２０−ＨＥＴＥ形成阻害剤Ｎ−ヒドロキシ−Ｎ’−（４−ブチル−２−メチルフェノール）−ホルムアミジン（ＨＥＴ００１６、５ｍｇ／Ｋｇ）、またはＷＩＴ００３（１０ｍｇ／Ｋｇ）とともに、虚血開始３０分前に処理した。
【図６】図６は、Ｄａｈｌ Ｓラット（２０−ＨＥＴＥ欠損系統）と、２０−ＨＥＴＥを腎臓において産生するＣＹＰ４Ａ遺伝子を過剰発現するＤａｈｌ Ｓラットの２Ｘ４コンジェニック系統とにおける、腎臓の２０分間の虚血および２４時間の再灌流後の血漿クレアチニン濃度の比較を示した図である。
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、２００４年９月１６日に出願された米国仮出願第６０／６１０，４６５号の利益を主張する、２００５年９月１６日に出願された米国特許出願第１１／２２９，２４１号に基づく一部継続出願である。両先行出願はその全体が参照により本明細書に組み込まれるものとする。
【０００２】
連邦政府による資金提供を受けた研究開発の記載
本発明は次の機関により授与された米国政府補助金により行われた：ＮＩＨ ＨＬ−３６２７９。米国は本発明において一定の権利を有する。
【背景技術】
【０００３】
糖尿病および高血圧は末期腎疾患（ＥＳＲＤ）の主要な原因である。薬物療法が有効であるにも関わらず、コンプライアンスおよび薬剤費は深刻な問題であり、わずかな割合の患者だけが適切な生涯にわたる血圧または糖尿病のコントロールを達成する。結果としてＥＳＲＤの発生率は、母集団が加齢し、また肥満になるにつれて増加する。ＥＳＲＤ治療のための米国連邦政府の負担は１年あたり１５０億ドルを超える。
【０００４】
ＥＳＲＤのための現在の治療の選択肢としては腎臓透析および移植等が挙げられる。これら２種の治療には高額費用がかかることに加え、透析は濾過作用のみの提供で腎臓の他の機能は提供せず、また腎臓移植は臓器の不足および拒絶反応の問題を有する。
【０００５】
最近、糖尿病性（diabetes-induced）および高血圧性（hypertension-induced）腎症の治療のためのターゲットとしてＴＧＦ−βが同定された。これは、これらの疾患の患者および動物モデルの腎臓においてＴＧＦ−βの発現がアップレギュレートされていることが見出されたためである（Noble NA & Border WA, Sem Nephrol 17:455-466, 1997; Reeves WB & Anderoli TE, Proc Natl Acad Sci 97:7667-7669, 2000; Sharma K & McGowan T. Cytokine Growth Factor Rev 11:115-123, 2000; Sharma K et. al., Diabetes 46:854-859, 1997; Yamamoto T et. al., Proc Nat’l Acad Sci 90:1814-1818, 1993; Yamamoto T et. al., Kidney Int 49:461-469, 1996）。糖尿病性および高血圧性腎症は初期にタンパク尿を発症し、これが例えば糸球体病変（糸球体硬化症等）の発症を促すことによって腎疾患の進行を速めることを特徴とし、ＴＧＦ−βの過剰発現がこの過程において重要なファクターであると信じられている（Dahly AJ et. al., Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol 283:R757-767, 2002; Border WA et. al., N Engl J Med 331:1286-1292, 1994; Sanders PW Hypertension 43:142-146, 2004; McCarthy ET et. al., J Am Soc Nephrol 14:84A, 2003; Bottinger EP et. al., J Am Soc Nephrol 10:2600-2610, 2002; August P et. al., Kidney Int Suppl 87:S99-104, 2003; Ziyadeh FN et. al., Proc Nat'l Acad Sci USA 97:8015-8020, 2000; 175, 202, 218, 265, 266）。例えば、ＴＧＦ−βは単離糸球体のアルブミンに対する透過性を直接増加させることが見出されており（Sharma R et. al., Kidney Int 58:131-136, 2000）、タンパク尿の誘発においてＴＧＦ−βが直接的な役割を担っていることが示されている。また、ＴＧＦ−βは細胞外マトリクスの産生を増加させ、糸球体硬化症および腎間質線維化の発症を促すことも見出されている（Pavenstadt H et. al., Physiol Rev 83:253-307, 2003; Border WA et. al., N Engl J Med 331 : 1286-1292, 1994; および Sanders PW Hypertension 43:142-146, 2004）。重要なことには、ＴＧＦ−β抗体またはアンチセンスオリゴヌクレオチドのいずれかによりＴＧＦ−βの活性を阻害すると、タンパク尿および糸球体の損傷の度合いが減少することが示されている（Dahly AJ et. al., Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol 283:R757-767, 2002; Ziyadeh FN et. al., Proc Nat’l Acad Sci USA 97:8015-8020, 2000; Chen s et. al., Biochem Biophys Res Commun 300:16-22, 2003; および Han DC et. al., Am J Physiol 278F628-F634, 2000）。
【０００６】
腎臓におけるＴＧＦ−β発現の増加は、腎移植拒絶反応（Shihab FS et. al., Kidney Int 50:1904-1913, 1996; Shihab FS et. al., J Am Soc Nephrol 6:286-294, 1995）；各種形態の糸球体硬化症（Yamamoto T et. al., Kidney Int 49:461-469, 1996; Yoshioka K et. al., Lab Invest 68:154-163, 1993）；ヘイマン腎炎（Shankland SJ et. al., Kidney Int 50:116-124, 1996）；残存腎臓（remnant kidney）（Lee L et. al., J Clin Invest 96:953-964, 1995; Wu LL et. al., Kidney Int 51:1553-1567, 1997）；尿管閉塞（Kaneto H et. al., Kidney Int 44:313-321, 1993）；放射線並びにシクロスポリン、ピューロマイシン、シスプラチン、および重金属等の免疫抑制性および腎毒性薬剤によって引き起こされた腎疾患（Oikawa T et. al., Kidney Int 51:164-172, 1997; Sharma VK et. al., Kidney Int 49:1297-1303, 1996; Shihab FS et. al., Kidney Int 49:1141-1151, 1996; Jones CL et. al., Am J Path 141:1381-1396, 1992; Ma LJ et. al., Kidney Int 65:106-115, 2004）；さらには試験された腎損傷の動物モデル全て（Noble NA & Border WA, Sem Nephrol 17:455-466, 1997）とも関連している。シクロスポリンおよびピューロマイシンにより誘導された腎症においてはＴＧＦ−β活性のその抗体による阻害が有益な効果をもたらした（Ling H et. al., J Am Soc Nephrol 14:377-388, 2003; Ma LJ et. al., Kidney Int 65:106-115, 2004）。
【０００７】
ＴＧＦ−βがタンパク尿および腎損傷の進行を開始するメカニズムは明らかではない。これと関連しては、ＴＧＦ−βの下流側応答因子（respondent）の同定が、腎臓におけるＴＧＦ−βの発現量の上昇と関連した腎疾患を治療するための更なる、および新規の標的をもたらすであろう。
【発明の概要】
【０００８】
本発明は、２０−ヒドロキシエイコサテトラエン酸（２０−ＨＥＴＥ）またはそのアゴニストをヒトまたはヒト以外の動物に腎疾患を予防または治療するのに十分な量投与することにより、該ヒトまたはヒト以外の動物における腎疾患を予防または治療する方法を提供する。
【０００９】
本発明はさらに、２０−ＨＥＴＥまたはそのアゴニストをヒトまたはヒト以外の動物に虚血性急性腎不全を予防または治療するのに十分な量投与することにより、該ヒトまたはヒト以外の動物における虚血性急性腎不全を予防または治療する方法も提供する。
【００１０】
本発明はさらに、再灌流の際の腎臓への損傷の深刻さを予防または軽減させるのに十分な量の２０−ＨＥＴＥまたはそのアゴニストを含んだ保存溶液中で生体外で腎臓を保存することにより、再灌流の際の生体外保存腎臓への損傷の深刻さ予防または軽減させる方法も提供する。
【発明の詳細な説明】
【００１１】
腎臓のＴＧＦ−βのアップレギュレーションが、２０−ＨＥＴＥの糸球体における産生を阻害することを通じて、糸球体濾過障壁のアルブミンおよび他の高分子に対する透過性を増加させることが本明細書に開示される。このようなアルブミンに対する糸球体の透過性の増加はタンパク尿およびさらに他の糸球体損傷（例えば糸球体硬化症および腎間質線維化）を引き起こすことから、本発明はＴＧＦ−βと関連した腎疾患並びにその物理的および病理学的症状を予防および治療するための新たな手段を提供する。
【００１２】
一局面において、本発明は、ヒトおよびヒト以外の動物にけるＴＧＦ−βと関連した腎疾患を予防または治療する方法に関する。本方法は該腎疾患を予防または治療するのに十分な量の２０−ＨＥＴＥまたは２０−ＨＥＴＥアゴニストを該ヒトまたはヒト以外の動物に投与することを含む。ＴＧＦ−βと関連した腎疾患とは、ここではＴＧＦ−β発現がアップレギュレートされている腎疾患並びにその物理的および病理学的症状を意味する。このような疾患の例としては、タンパク尿；糖尿病および高血圧（食塩感受性高血圧等）によって誘起された腎症；腎移植拒絶反応；ヘイマン腎炎；残存腎臓腎症（remnant kidney nephropathy）；尿管閉塞性腎症（ureteral obstruction nephropathy）；また放射線並びにシクロスポリン、ピューロマイシン、シスプラチン、および重金属等の免疫抑制性および腎毒性薬剤によって引き起こされた腎疾患が挙げられるがこれらに限定されない。一態様においては、本発明の方法はタンパク尿またはタンパク尿と関連した腎疾患を予防または治療するために用いられる。タンパク尿と関連した腎疾患とは、ここではタンパク尿が検出される腎疾患を意味する。他の態様においては、本発明の方法は糖尿病性または高血圧性腎症を予防または治療するために用いられる。
【００１３】
本発明で用いることが出来る２０−ＨＥＴＥの例としては、米国特許第６，３９５，７８１号； Yu M et. al., Eur J Pharmacol. 486:297-306, 2004; Yu M et. al., Bioorg Med Chem. 11:2803-2821, 2003;およびAlonso-Galicia M et. al., Am J Physiol. 277:F790-796, 1999（これらは全てその全体が本明細書に組み入れられたものとする）に開示されているものが挙げられるがこれらに限定されない。例えば、米国特許第６，３９５，７８１号において提供されている下記式により定義される２０−ＨＥＴＥアゴニストを本発明において用いることが出来る：
【化１】
［式中、
Ｒ１はカルボン酸、フェノール、アミド、イミド、スルホンアミド、スルホンアミド、活性メチレン、１，３−ジカルボニル、アルコール、チオール；アミン、テトラゾールおよび他のヘテロアリール基からなる群より選択され；
Ｒ２はカルボン酸、フェノール、アミド、イミド、スルホンアミド、スルホンアミド、活性メチレン、１，３−ジカルボニル、アルコール、チオール；アミン、テトラゾールおよび他のヘテロアリールからなる群より選択され；
Ｗは炭素鎖（Ｃ１〜Ｃ２５）であり、直鎖状、環状または分岐状であってもよく、かつヘテロ原子を含んでいてもよく；
Ｙは炭素鎖（Ｃ１〜Ｃ２５）であり、直鎖状、環状または分岐状であってもよく、かつヘテロ原子を含んでいてもよく；
ｓｐ＜３ Ｃｅｎｔｅｒはビニル、アリール、ヘテロアリール、シクロプロピル、およびアセチレン部分からなる群より選択され；
Ｘは直鎖状、分岐状、環状または多環式であってもよいアルキル鎖であり、かつヘテロ原子を含んでいてもよく；
ｍは０、１、２、３、４または５であり；そして
ｎは０、１、２、３、４または５である］。
【００１４】
好ましくは、上記式により定義された２０−ＨＥＴＥアゴニストはＲ１またはＲ２のいずれかにカルボキシル基または他のイオン性基を有し、該イオン性基から１４〜１５炭素に等しい距離で二重結合または他の官能基を有する（米国特許第６，３９５，７８１号）。より好ましくは、該２０−ＨＥＴＥアゴニストは２０〜２１炭素の長さを有し、カルボキシル基または他のイオン性基をＲ１またはＲ２のいずれかに有し、二重結合または他の官能基を該イオン性基から１４〜１５炭素に等しい距離で有し、水酸基をＲ１またはＲ２のいずれかの２０または２１炭素上に有する（米国特許第６，３９５，７８１号）。
【００１５】
一形態においては、本発明は次の２０−ＨＥＴＥアゴニストのうちの１または複数種の使用を意図している：２０−ヒドロキシエイコサン酸、２０−ヒドロキシエイコサ−５（Ｚ），１４（Ｚ）−ジエン酸（ＷＩＴ００３）、およびＮ−メチルスルホニル−２０−ヒドロキシエイコサ−５（Ｚ），１４（Ｚ）−ジエンアミド。
【００１６】
タンパク尿、糖尿病性腎症、および高血圧性腎症等の腎臓ＴＧＦ−β発現量の上昇と関連した慢性腎疾患に対する有益な効果に加え、本願発明者らは動物を２０−ＨＥＴＥまたは２０−ＨＥＴＥアゴニストで治療すると虚血によって引き起こされた急性腎損傷を軽減することが出来ることも見出した（下記実施例２を参照）。
【００１７】
虚血は臓器に対する血液および酸素の供給不足と定義される。腎臓への血液の供給が中断または減少した場合、尿細管細胞が壊死またはアポトーシスを起こし、急性腎不全が発症することがある。虚血には、心臓手術、失血、重症の下痢または熱傷による体液の喪失、ショック、および移植前のドナー腎の保存と関連した虚血等の多くの原因がある。これらの状況においては、腎臓への血流が危険なほど低い水準にまで低下し、その時間の長さが、尿細管上皮細胞に虚血性傷害を引き起こし、該上皮細胞が尿細管内腔へと剥がれ落ち、尿細管の流れの障害となって糸球体濾過の喪失および急性腎不全を引き起こすのに十分なまでになる場合がある。
【００１８】
急性腎不全とは、尿がほとんどまたは全く生成されず、通常は腎臓が除去するはずの物質が体内に残留してしまうほどの低い水準まで糸球体濾過速度が突然低下することを言う。虚血は腎臓への血流の減少により急性腎不全を引き起こし、排泄が不十分となる。血流の減少はまた高度に代謝的に活発な尿細管細胞への不十分な酸素供給をもたらし、該細胞は高エネルギーリン酸塩を使い果たして不可逆性の虚血性傷害を被り、壊死および／またはアポトーシスが起こる。そして該細胞は破裂するかまたは基底膜から剥がれ落ち、尿細管内腔を詰まらせて、詰まった尿細管内の圧力をせき止め、腎灌流が回復した際、あるいはときにおいても濾過を妨げる。
【００１９】
２０−ＨＥＴＥは強力な腎血管収縮剤であることから、２０−ＨＥＴＥまたはそのアゴニストが虚血により損傷を被った腎臓に対して有益な効果を有するであろうことは驚くべきことである。理論により限定されることなく、本願発明者らは、腎虚血性傷害の予防における２０−ＨＥＴＥの有益な効果は、２０−ＨＥＴＥが尿細管上皮細胞中のナトリウム輸送を阻害する直接的な効果を有し、また細胞の増殖および生存に関与する多くの細胞内経路を活性化するために、虚血性傷害を被った尿細管上皮細胞の生存に対して効果を有することによるものであろうと信じる。これと関連して、本発明は、ヒトまたはヒト以外の動物に対し虚血性急性腎不全を予防または治療するのに十分な量の２０−ＨＥＴＥおよび／または２０−ＨＥＴＥアゴニストを投与することにより、該ヒトまたはヒト以外の動物における虚血性急性腎不全を予防または治療する方法を提供する。任意に、本方法は２０−ＨＥＴＥおよび／またはそのアゴニストを用いた治療により改善されると期待される尿生成能等の腎臓の機能を監視する工程も伴っていてもよい。例えば、２０−ＨＥＴＥまたはそのアゴニストは心臓手術または腎移植手術の前、最中、および／または直後に急性腎不全を予防または治療するために患者に投与されてもよい。好ましいものを含む２０−ＨＥＴＥアゴニストの例は上記の通りである。
【００２０】
本発明は特定の経路の投与により限定されるものではない。２０−ＨＥＴＥまたは２０−ＨＥＴＥアゴニストの適した投与経路としては、経口投与、静脈内投与、皮下投与、筋肉内投与、および腎臓への直接送達等が挙げられるがこれらに限定されるものではない。特定の投与経路を介した特定の腎疾患を予防または治療するための２０−ＨＥＴＥまたは特定の２０−ＨＥＴＥアゴニストの最適な投与量は当業者により容易に決定され得る。
【００２１】
２０−ＨＥＴＥおよび／またはそのアゴニストは生体外で腎臓を保存するためにも用いることが出来る。移植に用いられる臓器には、該臓器が取り出された瞬間から移植の時点まで、効果的な生体外での保存が必要である。低温保存溶液は、冷阻血時間中に代謝活性および毒性物質の蓄積を減少させることにより組織の生存能力を維持するために開発された。移植のために用いられる臓器は血液供給から外された後、長期にわたり冷阻血保存される場合があり、この場合再灌流時に障害を受けやすくなる。臨床腎移植において低温保存の時間が長いことが移植片機能の遅延と強く関わっていることが多くの研究により示されており、これがその後の短期および長期の移植片の生存に影響しうる。本発明は、再灌流の際の腎臓への損傷の深刻さを予防または軽減するのに十分な量の２０−ＨＥＴＥおよび／または２０−ＨＥＴＥアゴニストを含んだ保存溶液中で腎臓を生体外保存することにより、再灌流の際の該生体外保存腎臓への損傷の深刻さを予防または軽減する方法を提供する。一態様においては、このような量は約０．１μＭないし約１０μＭである。任意に、２０−ＨＥＴＥおよび／またはそのアゴニストは、回収の時点から移植の時点までに腎臓が接触する１または複数種の他の溶液中にも含まれている。この移植手術を行う医師および／または前記腎臓を受け入れる患者は、再灌流の際の腎臓の損傷の深刻さを予防または軽減するための条件下で該腎臓が保存されたものであることを知らされてもよい。
【実施例】
【００２２】
本発明は次の限定されない実施例を考慮することにより、より完全に理解されるであろう。
【００２３】
実施例１：２０−ＨＥＴＥアゴニストはＴＧＦ−βにより誘起された糸球体傷害と拮抗する
この実施例では、トランスフォーミング増殖因子ベータ（ＴＧＦ−β）が、２０−ヒドロキシエイコサテトラエン酸（２０−ＨＥＴＥ）の糸球体における産生を阻害することにより糸球体透過性を変えることを示す。ＴＧＦ−βの腎臓発現は高塩食を７日間与えたＤａｈｌ食塩感受性（Ｄａｈｌ Ｓ）ラットにおいて倍加し、これはアルブミンに対する透過性（Ｐａｌｂ）の０．１９±０．０４から０．７５±０．０１への顕著な上昇と関連しており、糸球体濾過障壁の超微細構造における変化を伴っていた。ＴＧＦ−βを中和する抗体でＤａｈｌ Ｓラットを長期間処理すると、Ｐａｌｂの増加が阻止され、また糸球体毛細血管の構造が保存されたことから、高血圧性腎疾患がＴＧＦ−βの生成および活性の増加に依存していることが示された。高塩食により生じた血圧の上昇に対しては効果が無かった。Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙ（ＳＤ）ラットより単離された糸球体をＴＧＦ−β１（１０ｎｇ／ｍｌ）とともに１５分間プレインキュベートすると、Ｐａｌｂが０．０１±０．０１から０．６０±０．０２へと上昇した。これは２０−ＨＥＴＥの糸球体における産生が２２１±１１から３．４＋０．５μｇ／３０分間／ｍｇタンパク質へと抑制されたことと関連していた。２０−ＨＥＴＥの安定なアナログである２０−ヒドロキシエイコサ−５（Ｚ），１４（Ｚ）−ジエン酸でＳＤの糸球体を前処理したところ、ベースラインのＰａｌｂが減少し、Ｐａｌｂを上昇させるＴＧＦ−βの効果と拮抗した。
【００２４】
材料および方法
Ｄａｈｌ食塩感受性ラットモデル：Ｄａｈｌ食塩感受性（Ｓ）ラットはヒトにおける食塩感受性高血圧と関連した数多くの特徴を示す（Campese VM. Hypertension 78:531-550, 1994; および Grimm CE et. al., Hypertension 15:803-809, 1990）。これらは食塩感受性（Iwai, J. Hypertension 9:I18-I20, 1987; および Rapp J.P. Hypertension 4:753-763, 1982）、インシュリン抵抗性（Reft, GM et. al., Hypertension 18:630-635, 1991）および脂質異常症（Raji, L et. al., Kidney Int. 41:801-806, 1984; および O’Donnell, MP et. al., Hypertension 20:651-658, 1992）であり、高塩（ＨＳ）食による負荷を与えると速やかにタンパク尿および糸球体硬化症を発症する（O’Donnell, MP et. al., Hypertension 20:651-658, 1992; Roman RJ et. al., Hypertension 12:177-183, 1988; Roman RJ et. al., Hypertension 21:985-988, 1988; Roman RJ et. al., Am J Hypertens 10:63S-67S, 1997; および Tolins JP et. al., Hypertension 16:452-461, 1990）。発症する糸球体病変は高血圧性および糖尿病性腎症を有する患者に見られるものと類似している（McClellan W et. al., Am J Kidney Dis 12:285-290, 1987; Ronstand GS et. al., N Engl J Med 306:1276-1279, 1982; および Tierney WM et. al., Am J Kidney Dis 13:485-493, 1989）。トランスフォーミング増殖因子β（ＴＧＦ−β）の腎臓発現は高塩（ＨＳ）食を与えたＤａｈｌ Ｓラットにおいて上昇し、ＴＧＦ−β中和抗
体（Ａｂ）によりＤａｈｌ Ｓラットを３週間長期処理すると、タンパク尿並びに糸球体硬化症および線維症の度合いが軽減する（Dahly AJ et. al., Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol 283:R757-767, 2002）。
【００２５】
概要：１％ＮａＣｌを含んだ正常食塩食（＃５０１０， Ｐｕｒｉｎａ）を与えた７週齢のＳｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙ（Ｔａｃｏｎｉｃ Ｌａｂｓ）ラット、およびＭｅｄｉｃａｌ Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎにおいて維持される本願発明者らのコロニーから得たＤａｈｌ食塩感受性／Ｊｏｈｎ Ｒａｐｐラットに対して実験を行った。ラットに０．４％（低塩、ＬＳ）または８．０％ ＮａＣｌ（高塩、ＨＳ）のいずれかを含んだ、Ｄｙｔｅｓ， Ｉｎｃより購入した精製飼料（ＡＩＮ７６）を与えた。高血圧発症中にタンパク尿およびＰａｌｂを変化させるＴＧＦ−βの役割を評価するため、ＨＳ食を与えたＤａｈｌ Ｓラットの群をマウス抗ＴＧＦ−βモノクローナルＡｂ（０．５ｍｇ／ｋｇ；１Ｄ１１；Ｇｅｎｚｙｍｅ Ｃｏｒｐ）または対照マウスモノクローナルＡｂ（１３Ｃ４；抗ベロ毒素）の隔日での腹腔内投与により処理した（Dasch JR et. al., J Immunol 10:2109-2119, 1989）。処理期間の最後にラットを代謝ケージ中に一晩置いてタンパク質およびアルブミンの排泄を測定した（Dahly AJ et. al., Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol 283:R757-767, 2002）。次にこれらをハロセンにより麻酔し、腎臓を回収して、ウェスタンブロット法によりＴＧＦ−βタンパク質の発現量を測定し（Hoagland KM et. al., Hypertension 43:860-865, 2004）、また糸球体を単離してＰａｌｂおよび２０−ＨＥＴＥの産生量を測定した。無線テレメトリー送信機（Ｄａｔａ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｉｎｃ．）に接続したカテーテルを１０個体のさらなる対照および１０個体の１Ｄ１１処理Ｄａｈｌ Ｓラットの大腿動脈に挿入し、高血圧発症時の抗ＴＧＦ−β療法の効果を測定した。平均動脈圧（ＭＡＰ）を、ラットにＬＳ食を与えた対照期間の間、およびＨＳ食を７日間与えた後に、午前９時と正午（１２ＰＭ）との間の毎日３時間測定した。
【００２６】
アルブミン透過性（Ｐａｌｂ）の測定：糸球体を、Sharma R et. al.(Kidney Int 58:131-136, 2000)およびSavin VJ et. al.(J Am Soc Nephrol 3:1260-1269, 1992)に記載のふるい分け法（ｓｉｅｖｉｎｇ ｍｅｔｈｏｄ）を用いて、５ｇ／ｄｌのウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含む培地中で単離した。各実験条件下で、槽を１ｇ／ｄＬアルブミンを含んだ培地と交換した後の糸球体容積の変化（ΔＶ）からＰａｌｂを測定した。Ｐａｌｂは１−（ΔＶｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ／ΔＶｃｏｎｔｒｏｌ）として計算され、ここで正常食塩食を与えたＳｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙラットからの糸球体を各実験の対照値を提供するために用いた。Ｄａｈｌ ＳラットにおけるΔＶの欠如が糸球体の機械的な性質の変化ではなくＰａｌｂの変化と関連するものであったことを確認するため、糸球体を高分子量デキストランの５％溶液に暴露する追加実験を行った。これらの条件下におけるＤａｈｌ Ｓ糸球体のサイズの変化は、１％アルブミンに対する反応の欠如がＰａｌｂの増加に起因するものであったことを示唆する（Savin VJ et. al., J Am Soc Nephrol 3:1260-1269, 1992）。
【００２７】
他の実験においては、Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙラットと、ＬＳ食またはＨＳ食のいずれかを４日間与えたＤａｈｌ Ｓラットとから単離された糸球体における、ＴＧＦ−βおよび２０−ＨＥＴＥのＰａｌｂに対する相互作用を試験した。糸球体を溶媒またはＴＧＦ−β１（１０ｎｇ／ｍｌ）とともに１５分間３７℃でプレインキュベートし、Ｐａｌｂの変化を測定した。また、糸球体を安定な２０−ＨＥＴＥアゴニスト、２０−ヒドロキシエイコサ−５（Ｚ），１４（Ｚ）−ジエン酸（ＷＩＴ００３；１μｍｏｌ／Ｌ；Ｔａｉｓｈｏ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ）（Alonso-Galicia, M et al, Am. J. Physiol. 277:F790-F796, 1999; および Yu, M et. al., Bioorg. Med. Chem. 11:2803-2821, 2003）とともに１５分間３７℃で前処理し、ＴＧＦ−β１（１０ｎｇ／ｍｌ）に対するＰａｌｂの応答を再測定した。各ラットで最低５個の糸球体を分析し、これらの実験を各処理群で５個体以上のラットを用いて行った。
【００２８】
電子顕微鏡法：ＬＳ食を与えたＤａｈｌ ＳラットおよびＨＳ食を１週間与えて１Ｄ１１または溶媒で処理したＤａｈｌ Ｓラットからの腎臓を回収し、４％グルタルアルデヒド溶液中で固定した。薄いエポン切片を調製し、酢酸ウラニルおよびクエン酸鉛により染色し、透過型電子顕微鏡（Ｈｉｔａｃｈｉ Ｈ６００）を用いて１６，０００Ｘで観察した。
【００２９】
ウェスタンブロット法：対照のＳｐｒａｇｕｅ ＤａｗｌｅｙラットおよびＬＳまたはＨＳ食を７日間与えたＤａｈｌ Ｓラットの腎臓からホモジネートを調製した。ホモジネートの一部（３０μｇタンパク質）を１２．５％ドデシル硫酸ナトリウムゲル上で分離し、ニトロセルロース膜に転写し、１次ＴＧＦ−β１ Ａｂ（ＳＣ：１４６；Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、続いて２次Ａｂ（ＳＣ：２００４； Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）とともにインキュベートし、Hoagland KM et. al., Hypertension 43:860-865, 2004に記載の通り増感化学発光を用いて現像した。メンブレンをクマシーブルーで後染色し、試料のローディング量の潜在的な違いに対して結果を標準化した。
【００３０】
糸球体における２０−ＨＥＴＥ産生量の液体クロマトグラフィー／質量分析測定：糸球体（約２０μｇタンパク質）を、１ｍｍｏｌ／Ｌ ＮＡＤＰＨを含んだ０．１ｍｏｌ／Ｌ ＫＰＯ４緩衝液中で３７℃の下、ＴＧＦ−β１（１０ｎｇ／ｍｌ）の存在および不在下で３０分間インキュベートした。インキュベーションをギ酸による酸性化で停止し、ホモジナイズし、１０ｎｇの内部標準、１４，１５−エポキシエイコサ−５（Ｚ）−エン酸−メチルスルホニルイミド（ＥＥＺＥ）の添加後にホモジネートをクロロホルム：メタノール（２：１）で抽出した。試料を５０％アセトニトリル中で再構成（reconstitute）し、オンライン逆相高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）トラッピングカラムを用いて精製し、続いて１８Ｃ−ＲＰ ２Ｘ２５０ｍｍマイクロボアＨＰＬＣ（BetaBasic18 150x21 3μm, Thermo.Hypersil-Keystone）上の定組成ステップグラジエント（isocratic step gradient）を用い、ＨＥＴＥを分離するためのアセトニトリル：水：酢酸（５７：４３：０．１）からなる移動相を２０分間、続いてＥＥＴを分離するためのアセトニトリル：水：酢酸（６３：３７：０．１）からなる移動相を１５分間用い、試料中のＨＥＴＥおよびエポキシエイコサトリエン酸（ＥＥＴ）を分離した。陰イオンエレクトロスプレーを用いて試料をイオン化し、質量電荷比（ｍ／ｚ）３１９（ＨＥＴＥおよびＥＥＴ）または３２３（内部標準）で溶出されるピークを、Ａｇｉｌｅｎｔ ＬＳＤイオントラップ質量分析計（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ １１００）を用いて選択的イオン質量分析（ＭＳ）モードにて分離およびモニタした。目的とするピーク（ＨＥＴＥおよびＥＥＴ、ｍ／ｚ ３１９）の、近傍で溶出する内部標準に該当するピーク（ＥＥＺＥ、ｍ／ｚ ３２３）に対するイオン存在比を決定し、各バッチの試料で０．１ないし２ｎｇの２０−ＨＥＴＥおよびＥＥＴの範囲にわたって生成された標準曲線と比較した。
【００３１】
統計：平均値±１標準誤差を示す。平均値間の差の有意性をＡＮＯＶＡとそれに続くＳｔｕｄｅｎｔ−Ｎｅｗｍａｎ−Ｋｅｕｌｓ事後検定を用いて決定した。Ｐ＜０．０５を有意とみなした。
【００３２】
結果
高塩食のＴＧＦ−β１腎臓発現に対する影響：これらの実験の結果を図１に示す。腎臓におけるＴＧＦ−β１の発現量は、ＨＳ食を１週間与えたＤａｈｌ Ｓラットにおいて、ＬＳ食を与えたＤａｈｌ Ｓラットで見られた量と比べて２倍超となった。
【００３３】
高塩食のＰａｌｂに対する影響：Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙラット並びにＬＳおよびＨＳ食を１週間までの様々な期間与えたＤａｈｌ ＳラットにおけるＰａｌｂの比較を図２に示す。ベースラインＰａｌｂはＬＳ食で維持されたＤａｈｌ Ｓラットにおいて対照のＳｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙラットにおけるよりも有意に高かった。ＰａｌｂはＨＳ食を与えたＤａｈｌ Ｓラットにおいてわずか４日間後に増加し、７日間後にピークに達した。ＨＳを１週間与えたＤａｈｌ ＳラットにおけるこのＰａｌｂの増加は、１２１±２から１３６±３ｍｍ Ｈｇへと血圧が有意に増加したこと（ｎ＝１０）、およびタンパク質の排泄が４７±８ｍｇ／日から２１７±３１ｍｇ／日へと顕著に増加したこと（ｎ＝１４）と関連していた。同様に、Ｄａｈｌ ＳラットにＨＳ食を７日間与えた後、アルブミンの排泄が２７±９ｍｇ／日から１２９±２６ｍｇ／日へと増加した。
【００３４】
Ｄａｈｌ ＳラットのＰａｌｂの変化に対するＴＧＦ−βの役割：Ｓｐｒａｇｕｅ ＤａｗｌｅｙおよびＤａｈｌ Ｓラットから単離された糸球体のＰａｌｂに対するＴＧＦ−β１（１０ｎｇ／ｍＬ）の外因性投与の影響の比較も図２にまとめる。ＴＧＦ−β１はＰａｌｂを、Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙラットから単離された糸球体において０．０１±０．０１から０．５６±０．０２に増加させ、ＬＳ食を与えたＤａｈｌ Ｓラットから単離された糸球体において０．１９±０．０１から０．７５±０．０１に増加させた。ＴＧＦ−β１は４日間ＨＳ食を与えたＤａｈｌ ＳラットのＰａｌｂも増加させたが、７日間ＨＳ食を与えたＤａｈｌ ＳラットのＰａｌｂには影響を与えなかった。後者のラットのベースラインＰａｌｂはすでに最大に近かったためである。
【００３５】
ＨＳ食を与えたＤａｈｌ ＳラットをＴＧＦ−β中和Ａｂで長期間処理すると、ベースラインＰａｌｂの増加が抑制された。ＴＧＦ−β１をこれらの糸球体へ投与するとまだＰａｌｂが増加し、これは対照Ｓｐｒａｇｕｅ ＤａｗｌｅｙラットおよびＬＳ食を与えたＤａｈｌ Ｓラットから単離された糸球体に見られた場合と同様であった。ＴＧＦ−β１ Ａｂ療法は血圧の上昇には効果を示さなかった。血圧は、ＨＳ食を与えて１Ｄ１１で７日間処理したＤａｈｌ Ｓラットにおいて１２３±４から１３６±３ｍｍ Ｈｇ（ｎ＝１０）へと上昇した。
【００３６】
電子顕微鏡法：ＬＳまたはＨＳ食を与えたＤａｈｌ Ｓラット、およびＴＧＦ−β Ａｂで１週間処理したこれらラットにおける糸球体毛細血管の超微細構造の電子顕微鏡写真を得た。ＬＳ食を与えたＤａｈｌ Ｓラットは正常な外観の糸球体限外濾過障壁を示した。ＨＳ食を７日間与えたＤａｈｌ Ｓラットにおいては、足細胞の足突起の退縮および融合並びに基底膜部分の暴露が認められた。また、糸球体毛細血管を裏打ちする内皮細胞の腫脹も認められ、それらの形状が扁平なものからより立方内皮（cubodial endothelium）状へと変化していた。ＨＳ食を与えたＤａｈｌ Ｓラットにおける糸球体濾過障壁の超微細構造のこれらの変化はＴＧＦ−β Ａｂの投与により抑制された。
【００３７】
２０−ＨＥＴＥの糸球体における産生に対するＴＧＦ−βの影響：単離された糸球体によるアラキドン酸（ＡＡ）の産生および代謝に対するＴＧＦ−βの影響を図３に示す。ＡＡとともにインキュベートした糸球体は、２０−ＨＥＴＥ、１５−ＨＥＴＥ、１２−ＨＥＴＥ、５−ＨＥＴＥ並びに１４，１５−ＥＥＴ、１１，１２−ＥＥＴ、８，９−ＥＥＴ、および５，６−ＥＥＴ標準と共溶出する３１９のｍ／ｚを示すいくつかの大きなピークを生じた（図３Ａ）。さらに、フラグメンテーションの１６分後に溶出する最大のピークが、２０−ＨＥＴＥ標準に見られるものと同一の３０１、２７３、２５７、および２４５のｍ／ｚにおいて顕著な二次イオンのＭＳ／ＭＳスペクトルを生成することが確認された。糸球体をＴＧＦ−β１で前処理したところ、１５−、１２−若しくは５−ＨＥＴＥまたはＥＥＴの生成に影響を与えることなく（図３Ａ）、２０−ＨＥＴＥの生成が選択的に９７％減少した（図３Ｂ）
【００３８】
Ｐａｌｂに対する２０−ＨＥＴＥアゴニストの影響：ＴＧＦ−β１により生じたＰａｌｂの変化に対する２０−ＨＥＴＥアゴニストの添加の影響を図４にまとめる。糸球体を２０−ＨＥＴＥアゴニストで前処理したところ、ベースラインＰａｌｂが減少し、ＴＧＦ−β１により生じたＰａｌｂの増加が著しく弱まった。同様な結果が、ＬＳ食で維持したまたはＨＳ食を４日間与えたＤａｈｌ Ｓラットで得られた。例えば、ＴＧＦ−β１はＨＳ食を４日間与えたＤａｈｌ Ｓラットから単離された糸球体においてＰａｌｂを０．５８±０．０４（ｎ＝２５糸球体；ラット５個体）から０．８７±０．０２（ｎ＝２５；ラット５個体）へと増加させた。糸球体を２０−ＨＥＴＥアゴニストで前処理した後、ＴＧＦ−β１ Ｐａｌｂは０．２５±０．０１（ｎ＝２５；ラット５個体）から０．４０±０．０１（ｎ＝２５；ラット５個体）へと増加しただけであった。
【００３９】
実施例２：２０−ＨＥＴＥおよび２０−ＨＥＴＥアゴニストによる、虚血性傷害からの腎臓の保護
材料および方法
ペントバルビタール（５０ｍｇ／Ｋｇ）を用いて麻酔したオスのＳｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙラットで実験を行った。正中切開により腎臓を露出させ、腎動脈を分離した。右および左腎動脈の両方に調節式血管オクルーダー（adjustable vascular occluder）を設置し、腎臓への血流を３０分間完全に閉塞した。完全な腎虚血の時間の後、鉗子を除き、腎臓を再灌流させた。外科的切開を２−０絹縫合で閉じ、ラットを麻酔から完全に回復させた。２４時間後、このラットをペントバルビタールで再麻酔し、大動脈から血液試料を採取し、血漿クレアチニン濃度を自動分析器を用いて測定した。腎臓を回収し、１０％ホルマリン溶液中で固定し、パラフィン切片を調製してヘマトキシリン・エオジン染色を行い、尿細管の壊死および傷害の度合いを評価した。３群のラットを分析した。第１群のラットは溶媒で処理し、対照個体とした。第２群のラットは２０−ＨＥＴＥの合成の阻害剤であるＨＥＴ００１６（５ｍｇ／Ｋｇ、皮下注射）で腎虚血の３０分前に処理した。第３群のラットは２０−ＨＥＴＥアゴニストであるＷＩＴ００３（１０ｍｇ／Ｋｇ、皮下注射）を腎虚血の３０分前に静脈注射により投与した。
【００４０】
結果
図５に示すのは、腎臓の虚血および再灌流後の腎損傷の度合いに対するＨＥＴ００１６（２０−ＨＥＴＥの合成の阻害剤）およびＷＩＴ００３（２０−ＨＥＴＥアゴニスト）の効果を試験したｉｎ ｖｉｖｏ実験の結果である。Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙラットの腎臓を３０分間の完全な虚血にし、続いて２４時間の再灌流を行ってから２４時間後に、血漿クレアチニン濃度は０．５から約３．０ｍｇ／ｄｌに上昇した。血漿クレアチニン濃度に反映される傷害の程度は、虚血の３０分前にＨＥＴ０１６（５ｍｇ／Ｋｇ、皮下注射）投与で処理したラットにおいて有意に大きかった。再灌流の３０分前にＷＩＴ００３（１０ｍｇ／Ｋｇ、皮下注射）を投与すると、血漿クレアチニン濃度に反映される腎障害の程度は有意に減少した。対照個体における虚血再灌流後の血漿クレアチニン濃度は近位尿細管のＳ３セグメントの深刻な壊死と関連している。尿細管のこのセグメントの組織学的障害の度合いは２０−ＨＥＴＥアゴニストで処理したラットにおいて減少している（データ示さず）。
【００４１】
他の実験において、２０分間の虚血再灌流を行ったＤａｈｌ Ｓラット（２０−ＨＥＴＥ欠損系統）に見られる腎傷害の程度を、腎臓において２０−ＨＥＴＥを産生する酵素をコードするＬｅｗｉｓラットからのＣＹＰ４Ａ遺伝子を導入した、２Ｘ４と呼ばれるＤａｈｌ Ｓラットのコンジェニック系統に見られる腎傷害の程度と比較した。この遺伝子を移入すると腎臓におけるＣＹＰ４Ａタンパク質の発現および腎臓における２０−ＨＥＴＥの産生がアップレギュレートされる。図６に見られるように、ＬｅｗｉｓラットからのＣＹＰ４Ａ遺伝子のＤａｈｌ Ｓ遺伝的背景への移入により、虚血および再灌流の２４時間後の血漿クレアチニン濃度のより少ない上昇に反映される腎損傷の程度の有意な軽減が認められた。従ってこのデータは、２０−ＨＥＴＥの内生的形成のアップレギュレーションまたは２０−ＨＥＴＥアゴニストの投与が腎臓を虚血性腎傷害から保護し、一方で２０−ＨＥＴＥの腎臓における生成の阻害が傷害の程度を悪化させるという、Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙラットにおいて得られた結果と矛盾が無い。
【００４２】
本発明は前述の実施例に限定されることを意図するものではなく、添付の特許請求の範囲内に入る全てのこのような改変および変形を含むものである。
【図面の簡単な説明】
【００４３】
【図１】図１は、Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙ（ＳＤ）並びにＬＳおよび７日間のＨＳを与えたＤａｈｌ Ｓラット（食塩感受性高血圧および高血圧性腎疾患の遺伝モデル）の腎臓におけるＴＧＦ−β１の発現量を示した図である。ＳＤ（レーン１−３）、ＬＳ食を与えたＤａｈｌ Ｓラット（レーン４−７）、およびＨＳ食（８％ ＮａＣｌ）を７日間与えたＤａｈｌ Ｓラット（レーン８−１１）から単離された腎臓ホモジネート。各レーンには異なる個体（各群でｎ＝３ないし４）から単離されたホモジネート（３０μｇタンパク質／レーン）をロードした。＊はＬＳ食を与えたＤａｈｌ Ｓラットに見られた値に対する有意差を表す。ＨＳ−７、７日間のＨＳ食。
【図２】図２は、ＳＤラット並びにＬＳおよび７日間のＨＳ食を与えたＤａｈｌ Ｓラットから単離された糸球体における、またはＨＳ食を与えてＴＧＦ−β Ａｂ（１Ｄ１１−７）で処理したＤａｈｌ Ｓラットにおける、アルブミンに対する透過性（Ｐａｌｂ）へのＨＳ食の影響およびＴＧＦ−βの役割を示した図である。用いたＴＧＦ−β ＡｂはＴＧＦ−βの３種のアイソフォーム全てを効果的に中和する。糸球体を溶媒または１０ｎｇ／ｍｌのＴＧＦ−β１とともに１５分間３７℃でプレインキュベートし、Ｐａｌｂを測定した。括弧内の数字は群あたりの分析された糸球体の数およびラットの数を表す。＊はＬＳ食を与えたＤａｈｌ Ｓラットに見られた値に対する有意差を表す。†は対応するコントロール値からの有意差を表す。ＨＳ−４、４日間のＨＳ。ＨＳ−７、７日間のＨＳ。
【図３】図３は、単離糸球体による２０−ＨＥＴＥの産生に対するＴＧＦ−β１（１０ｎｇ／ｍｌ）の影響を示した図である。典型的なＬＣ／ＭＳクロマトグラムをパネル４Ａに示す。ＴＧＦ−β１は、１６分間の保持時間で溶出する３１９のｍ／ｚを示す２０−ＨＥＴＥのピークの形成を阻害した。パネルＢに、６つの実験から得られた結果の要約を示す。†は対応するコントロール値からの有意差を表す。
【図４】図４は、ＴＧＦ−β１により生じたＰａｌｂの変化に対する２０−ＨＥＴＥアゴニストの影響を示した図である。糸球体を溶媒またはＴＧＦ−β１（１０ｎｇ／ｍｌ）とともに１５分間３７℃でプレインキュベートし、Ｐａｌｂの変化を測定した。糸球体を安定な２０−ＨＥＴＥアゴニスト、２０−ヒドロキシエイコサ−５（Ｚ），１４（Ｚ）−ジエン酸（ＷＩＴ００３）とともに１５分間３７℃で前処理し、ＴＧＦ−β１（１０ｎｇ／ｍｌ）に対するＰａｌｂの応答を再測定した。括弧内の数字は群あたりの分析された糸球体の数およびラットの数を表す。†は対応するコントロール値からの有意差を表す。
【図５】図５は、腎臓の３０分間の虚血および２４時間の再灌流の後におけるＳｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙラットの血漿クレアチニン濃度の比較を示した図である。ラットを、溶媒、２０−ＨＥＴＥ形成阻害剤Ｎ−ヒドロキシ−Ｎ’−（４−ブチル−２−メチルフェノール）−ホルムアミジン（ＨＥＴ００１６、５ｍｇ／Ｋｇ）、またはＷＩＴ００３（１０ｍｇ／Ｋｇ）とともに、虚血開始３０分前に処理した。
【図６】図６は、Ｄａｈｌ Ｓラット（２０−ＨＥＴＥ欠損系統）と、２０−ＨＥＴＥを腎臓において産生するＣＹＰ４Ａ遺伝子を過剰発現するＤａｈｌ Ｓラットの２Ｘ４コンジェニック系統とにおける、腎臓の２０分間の虚血および２４時間の再灌流後の血漿クレアチニン濃度の比較を示した図である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトまたはヒト以外の動物における虚血性急性腎不全を予防または治療する方法であって、２０−ＨＥＴＥおよび２０−ＨＥＴＥアゴニストからなる群より選択される薬剤を、ヒトまたはヒト以外の動物に虚血性急性腎不全を予防または治療するのに十分な量投与する工程を含んでなる、方法。
【請求項２】
ヒトにおける虚血性急性腎不全を予防または治療する方法である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
薬剤が２０−ＨＥＴＥアゴニストである、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
２０−ＨＥＴＥアゴニストが下記式により定義される、請求項３に記載の方法：
【化１】
［式中、
Ｒ１はカルボン酸、フェノール、アミド、イミド、スルホンアミド、スルホンアミド、活性メチレン、１，３−ジカルボニル、アルコール、チオール、アミン、テトラゾール、および他のヘテロアリール基からなる群より選択され；
Ｒ２はカルボン酸、フェノール、アミド、イミド、スルホンアミド、スルホンアミド、活性メチレン、１，３−ジカルボニル、アルコール、チオール、アミン、テトラゾール、および他のヘテロアリールからなる群より選択され；
Ｗは炭素鎖（Ｃ１〜Ｃ２５）であり、直鎖状、環状または分岐状であってもよく、かつヘテロ原子を含んでいてもよく；
Ｙは炭素鎖（Ｃ１〜Ｃ２５）であり、直鎖状、環状または分岐状であってもよく、かつヘテロ原子を含んでいてもよく；
ｓｐ＜３ Ｃｅｎｔｅｒはビニル、アリール、ヘテロアリール、シクロプロピル、およびアセチレン部分からなる群より選択され；
Ｘは直鎖状、分岐状、環状または多環式であってもよいアルキル鎖であり、かつヘテロ原子を含んでいてもよく；
ｍは０、１、２、３、４または５であり；そして
ｎは０、１、２、３、４または５である］。
【請求項５】
化合物がＲ１またはＲ２のいずれかにカルボキシル基または他のイオン性基を有し、かつ前記化合物が前記イオン性基から１４〜１５炭素に等しい距離で二重結合または他の官能基を有する、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
化合物が２０〜２１炭素の長さを有し、カルボキシル基または他のイオン性基をＲ１またはＲ２のいずれかに有し、二重結合または他の官能基を前記イオン性基から１４〜１５炭素に等しい距離で有し、かつ水酸基をＲ１またはＲ２のいずれかの２０または２１炭素上に有する、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
２０−ＨＥＴＥアゴニストが２０−ヒドロキシエイコサン酸、２０−ヒドロキシエイコサ−５（Ｚ），１４（Ｚ）−ジエン酸（ＷＩＴ００３）、およびＮ−メチルスルホニル−２０−ヒドロキシエイコサ−５（Ｚ），１４（Ｚ）−ジエンアミドからなる群より選択される、請求項３に記載の方法。
【請求項８】
２０−ＨＥＴＥアゴニストが２０−ヒドロキシエイコサ−５（Ｚ），１４（Ｚ）−ジエン酸（ＷＩＴ００３）である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
腎臓の尿生成能を監視する工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
再灌流の際の生体外保存腎臓への損傷の深刻さを予防または軽減させる方法であって、再灌流の際の腎臓への損傷の深刻さを予防または軽減させるのに十分な量の薬剤を含んでなる保存溶液中で生体外で腎臓を保存する工程を含んでなり、薬剤が２０−ＨＥＴＥおよび２０−ＨＥＴＥアゴニストからなる群より選択される方法。
【請求項１１】
腎臓がヒト腎臓である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
薬剤が２０−ＨＥＴＥアゴニストである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
２０−ＨＥＴＥアゴニストが下記式により定義される、請求項１２に記載の方法：
【化２】
［式中、
Ｒ１はカルボン酸、フェノール、アミド、イミド、スルホンアミド、スルホンアミド、活性メチレン、１，３−ジカルボニル、アルコール、チオール、アミン、テトラゾール、および他のヘテロアリール基からなる群より選択され；
Ｒ２はカルボン酸、フェノール、アミド、イミド、スルホンアミド、スルホンアミド、活性メチレン、１，３−ジカルボニル、アルコール、チオール、アミン、テトラゾール、および他のヘテロアリールからなる群より選択され；
Ｗは炭素鎖（Ｃ１〜Ｃ２５）であり、直鎖状、環状または分岐状であってもよく、かつヘテロ原子を含んでいてもよく；
Ｙは炭素鎖（Ｃ１〜Ｃ２５）であり、直鎖状、環状または分岐状であってもよく、かつヘテロ原子を含んでいてもよく；
ｓｐ＜３ Ｃｅｎｔｅｒはビニル、アリール、ヘテロアリール、シクロプロピル、およびアセチレン部分からなる群より選択され；
Ｘは直鎖状、分岐状、環状または多環式であってもよいアルキル鎖であり、かつヘテロ原子を含んでいてもよく；
ｍは０、１、２、３、４または５であり；そして
ｎは０、１、２、３、４または５である］。
【請求項１４】
化合物がＲ１またはＲ２のいずれかにカルボキシル基または他のイオン性基を有し、かつ化合物が前記イオン性基から１４〜１５炭素に等しい距離で二重結合または他の官能基を有する、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
化合物が２０〜２１炭素の長さを有し、カルボキシル基または他のイオン性基をＲ１またはＲ２のいずれかに有し、二重結合または他の官能基を前記イオン性基から１４〜１５炭素に等しい距離で有し、水酸基をＲ１またはＲ２のいずれかの２０または２１炭素上に有する、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
２０−ＨＥＴＥアゴニストが２０−ヒドロキシエイコサン酸、２０−ヒドロキシエイコサ−５（Ｚ），１４（Ｚ）−ジエン酸（ＷＩＴ００３）、およびＮ−メチルスルホニル−２０−ヒドロキシエイコサ−５（Ｚ），１４（Ｚ）−ジエンアミドからなる群より選択される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１７】
２０−ＨＥＴＥアゴニストが２０−ヒドロキシエイコサ−５（Ｚ），１４（Ｚ）−ジエン酸（ＷＩＴ００３）である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
医師または患者に、再灌流の際の障害の深刻さを予防または軽減するための条件下で腎臓が保存されたことを知らせる工程をさらに含んでなる、請求項１０に記載の方法。
【請求項１】
ヒトまたはヒト以外の動物における虚血性急性腎不全を予防または治療する方法であって、２０−ＨＥＴＥおよび２０−ＨＥＴＥアゴニストからなる群より選択される薬剤を、ヒトまたはヒト以外の動物に虚血性急性腎不全を予防または治療するのに十分な量投与する工程を含んでなる、方法。
【請求項２】
ヒトにおける虚血性急性腎不全を予防または治療する方法である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
薬剤が２０−ＨＥＴＥアゴニストである、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
２０−ＨＥＴＥアゴニストが下記式により定義される、請求項３に記載の方法：
【化１】
［式中、
Ｒ１はカルボン酸、フェノール、アミド、イミド、スルホンアミド、スルホンアミド、活性メチレン、１，３−ジカルボニル、アルコール、チオール、アミン、テトラゾール、および他のヘテロアリール基からなる群より選択され；
Ｒ２はカルボン酸、フェノール、アミド、イミド、スルホンアミド、スルホンアミド、活性メチレン、１，３−ジカルボニル、アルコール、チオール、アミン、テトラゾール、および他のヘテロアリールからなる群より選択され；
Ｗは炭素鎖（Ｃ１〜Ｃ２５）であり、直鎖状、環状または分岐状であってもよく、かつヘテロ原子を含んでいてもよく；
Ｙは炭素鎖（Ｃ１〜Ｃ２５）であり、直鎖状、環状または分岐状であってもよく、かつヘテロ原子を含んでいてもよく；
ｓｐ＜３ Ｃｅｎｔｅｒはビニル、アリール、ヘテロアリール、シクロプロピル、およびアセチレン部分からなる群より選択され；
Ｘは直鎖状、分岐状、環状または多環式であってもよいアルキル鎖であり、かつヘテロ原子を含んでいてもよく；
ｍは０、１、２、３、４または５であり；そして
ｎは０、１、２、３、４または５である］。
【請求項５】
化合物がＲ１またはＲ２のいずれかにカルボキシル基または他のイオン性基を有し、かつ前記化合物が前記イオン性基から１４〜１５炭素に等しい距離で二重結合または他の官能基を有する、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
化合物が２０〜２１炭素の長さを有し、カルボキシル基または他のイオン性基をＲ１またはＲ２のいずれかに有し、二重結合または他の官能基を前記イオン性基から１４〜１５炭素に等しい距離で有し、かつ水酸基をＲ１またはＲ２のいずれかの２０または２１炭素上に有する、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
２０−ＨＥＴＥアゴニストが２０−ヒドロキシエイコサン酸、２０−ヒドロキシエイコサ−５（Ｚ），１４（Ｚ）−ジエン酸（ＷＩＴ００３）、およびＮ−メチルスルホニル−２０−ヒドロキシエイコサ−５（Ｚ），１４（Ｚ）−ジエンアミドからなる群より選択される、請求項３に記載の方法。
【請求項８】
２０−ＨＥＴＥアゴニストが２０−ヒドロキシエイコサ−５（Ｚ），１４（Ｚ）−ジエン酸（ＷＩＴ００３）である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
腎臓の尿生成能を監視する工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
再灌流の際の生体外保存腎臓への損傷の深刻さを予防または軽減させる方法であって、再灌流の際の腎臓への損傷の深刻さを予防または軽減させるのに十分な量の薬剤を含んでなる保存溶液中で生体外で腎臓を保存する工程を含んでなり、薬剤が２０−ＨＥＴＥおよび２０−ＨＥＴＥアゴニストからなる群より選択される方法。
【請求項１１】
腎臓がヒト腎臓である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
薬剤が２０−ＨＥＴＥアゴニストである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
２０−ＨＥＴＥアゴニストが下記式により定義される、請求項１２に記載の方法：
【化２】
［式中、
Ｒ１はカルボン酸、フェノール、アミド、イミド、スルホンアミド、スルホンアミド、活性メチレン、１，３−ジカルボニル、アルコール、チオール、アミン、テトラゾール、および他のヘテロアリール基からなる群より選択され；
Ｒ２はカルボン酸、フェノール、アミド、イミド、スルホンアミド、スルホンアミド、活性メチレン、１，３−ジカルボニル、アルコール、チオール、アミン、テトラゾール、および他のヘテロアリールからなる群より選択され；
Ｗは炭素鎖（Ｃ１〜Ｃ２５）であり、直鎖状、環状または分岐状であってもよく、かつヘテロ原子を含んでいてもよく；
Ｙは炭素鎖（Ｃ１〜Ｃ２５）であり、直鎖状、環状または分岐状であってもよく、かつヘテロ原子を含んでいてもよく；
ｓｐ＜３ Ｃｅｎｔｅｒはビニル、アリール、ヘテロアリール、シクロプロピル、およびアセチレン部分からなる群より選択され；
Ｘは直鎖状、分岐状、環状または多環式であってもよいアルキル鎖であり、かつヘテロ原子を含んでいてもよく；
ｍは０、１、２、３、４または５であり；そして
ｎは０、１、２、３、４または５である］。
【請求項１４】
化合物がＲ１またはＲ２のいずれかにカルボキシル基または他のイオン性基を有し、かつ化合物が前記イオン性基から１４〜１５炭素に等しい距離で二重結合または他の官能基を有する、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
化合物が２０〜２１炭素の長さを有し、カルボキシル基または他のイオン性基をＲ１またはＲ２のいずれかに有し、二重結合または他の官能基を前記イオン性基から１４〜１５炭素に等しい距離で有し、水酸基をＲ１またはＲ２のいずれかの２０または２１炭素上に有する、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
２０−ＨＥＴＥアゴニストが２０−ヒドロキシエイコサン酸、２０−ヒドロキシエイコサ−５（Ｚ），１４（Ｚ）−ジエン酸（ＷＩＴ００３）、およびＮ−メチルスルホニル−２０−ヒドロキシエイコサ−５（Ｚ），１４（Ｚ）−ジエンアミドからなる群より選択される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１７】
２０−ＨＥＴＥアゴニストが２０−ヒドロキシエイコサ−５（Ｚ），１４（Ｚ）−ジエン酸（ＷＩＴ００３）である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
医師または患者に、再灌流の際の障害の深刻さを予防または軽減するための条件下で腎臓が保存されたことを知らせる工程をさらに含んでなる、請求項１０に記載の方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【公表番号】特表２００９−５３９９８５（Ｐ２００９−５３９９８５Ａ）
【公表日】平成２１年１１月１９日（２００９．１１．１９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−５１５４４５（Ｐ２００９−５１５４４５）
【出願日】平成１９年６月１２日（２００７．６．１２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００７／０１３７４０
【国際公開番号】ＷＯ２００７／１４６２６２
【国際公開日】平成１９年１２月２１日（２００７．１２．２１）
【出願人】（５０８２２０２８３）エムシーダブリュ、リサーチ、ファウンデーション、インコーポレーテッド (2)
【氏名又は名称原語表記】ＭＣＷ ＲＥＳＥＡＲＣＨ ＦＯＵＮＤＡＴＩＯＮ， ＩＮＣ．
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２１年１１月１９日（２００９．１１．１９）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年６月１２日（２００７．６．１２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００７／０１３７４０
【国際公開番号】ＷＯ２００７／１４６２６２
【国際公開日】平成１９年１２月２１日（２００７．１２．２１）
【出願人】（５０８２２０２８３）エムシーダブリュ、リサーチ、ファウンデーション、インコーポレーテッド (2)
【氏名又は名称原語表記】ＭＣＷ ＲＥＳＥＡＲＣＨ ＦＯＵＮＤＡＴＩＯＮ， ＩＮＣ．
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]