腫瘍分類のためのＩＲ−Ａ及びＩＲ−Ｂの定量
制限なく、本開示は、組織試料中のインスリン受容体アイソフォームＡ（ＩＲ−Ａ）及び／又はインスリン受容体アイソフォームＢ（ＩＲ−Ｂ）の発現を検出及び定量するための組成物及び方法に関する。本開示はまた、組織試料中のインスリン受容体アイソフォームＡ（ＩＲ−Ａ）及び／又はインスリン受容体アイソフォームＢ（ＩＲ−Ｂ）の発現を検出及び定量することに少なくとも部分的に基づく診断及び分類の方法にも関する。このような分類に基づいて対象を治療する方法は、本明細書中で提供される開示のさらなる態様の中に含まれる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、その全体において参照により組み込まれる２００９年１０月１２日出願の米国仮出願第６１／２５０，７８０号に対する優先権を主張する。
【０００２】
配列表
本願は、ＡＳＣＩＩ形式でＥＦＳウェブを介して提出され、その全体において参照により組み込まれる配列表を含む。２０１０年９月８日作成のこのＡＳＣＩＩコピーの名称はＭＥＤ５４０．ＰＣＴ．ｔｘｔであり、サイズは４８，９４８バイトである。
【０００３】
発明の分野
制限なく、本開示は、組織試料などの試料中のインスリン受容体アイソフォームＡ（ＩＲ−Ａ）及び／又はインスリン受容体アイソフォームＢ（ＩＲ−Ｂ）の発現を検出及び定量するための組成物及び方法に関する。本開示はまた、組織試料などの試料中のインスリン受容体アイソフォームＡ（ＩＲ−Ａ）及び／又はインスリン受容体アイソフォームＢ（ＩＲ−Ｂ）の発現を検出及び定量することに少なくとも一部基づく診断及び分類の方法にも関する。このような分類に基づき対象を治療する方法は、本明細書中で提供される開示のさらなる態様に含まれる。
【背景技術】
【０００４】
関連技術に関する記述
インスリン受容体（ＩＮＳＲ）は、エネルギー代謝の制御に関与する膜貫通チロシンキナーゼ受容体である。ＩＮＳＲは、単一のＩＮＳＲ遺伝子から発現されるサブユニット、α及びβを含む。ＩＲ−Ａ及びＩＲ−Ｂと呼ばれる２種類のアイソフォームは、ｍＲＮＡの選択的スプライシングによるものである。ＩＲ−Ａは、ＩＮＳＲ遺伝子から転写されるｍＲＮＡの選択的スプライシングにより生じ、エクソン１１が省かれているが、このエクソン１１はＩＲ−ＢのｍＲＮＡには含まれる（図１Ａ−１Ｂ）。このように、ＩＲ−Ａは、ＩＮＳＲα−サブユニットのカルボキシ末端のアミノ酸残基のストレッチ部が欠如しているため、ＩＲ−Ｂとは異なっている。ＩＲ−Ａ及びＩＲ−Ｂの同一性は９９％を超える（図２）。この２種類のアイソフォームの発現プロファイルは異なるが、これらのアイソフォームは細胞において同時発現される。ＩＲ−Ａ及びＩＲ−Ｂの相対的存在量は発生段階及び組織に特異的な因子により制御される。
【０００５】
例えば、ＩＲ−Ａは胎児及び癌細胞で主に発現され、一方ＩＲ−Ｂは、分化したインスリン標的細胞で主に発現される。ＩＲ−Ａは、インスリンに対して高い親和性を示し、ＩＧＦ−ＩＩに対する親和性は中程度であり、ＩＧＦ−Ｉに対する親和性は低い。ＩＧＦ−ＩＩは、同程度の親和性でＩＧＦのＩ型受容体（ＩＧＦ−ＩＲ）及びＩＲ−Ａに結合する。ＩＲ−Ｂはインスリンに対する特異性の高い受容体である。
【０００６】
現在、患者試料中のＩＲ−Ａ及びＩＲ−Ｂレベルを調べる方法については、有効かつ正確な検出手段がないことが障壁になっている。現在のところ、特定的にＩＲ−Ａ発現を測定するために利用可能な唯一の方法は、Ｓｃｉａｃｃａら（Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ２１（５４）：８２４０−５０；２００２ Ｎｏｖ ２８）に記載されている。この方法は、ＰＣＲ及びゲル分離を行い、それに続いて、得られたバンドを定量測定することに基づく。この方法は、大きな労力を要し、定量的に正確ではなく、ハイスループット又は臨床の場においてその使用は限定的なものとなっている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
患者の組織がその薬物の分子標的を発現するか否かの判定に基づき、薬物に対する患者の反応を予測することができる改善された診断試験が必要とされている。ＩＲ−Ａ及びＩＲ−Ｂの発現を正確に検出及び／又は定量するための方法が必要とされている。患者試料中の各アイソフォームの発現の検出及び定量を可能とする能力は、個人対応の治療計画を患者に提供するのに有用である。このような個人対応の治療計画によって、患者に対する治療的有用性を最大限にできる可能性が生まれ、同時に、例えば代替的な有効性がより低い治療計画に伴い得る副作用を最小限に抑えることができるようになる。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
生体材料の試料が、ヒトＩＲ−Ａ及び／又はＩＲ−Ｂを含むＩＲ−Ａ及び／又はＩＲ−Ｂを発現する細胞を含有するか否かを検出及び／又は定量するための有用な組成物及び方法ならびにこのような方法での使用のためのキットが、本明細書中で開示される。これらの方法は、組織試料中のＩＲ−Ａ及び／又はＩＲ−Ｂの発現を測定するために特定のオリゴヌクレオチドが使用できるという知見に一部基づく。これらのオリゴヌクレオチドは、ハイスループット及び臨床の場で本方法が使用できるように、試料中のＩＲ−Ａ及び／又はＩＲ−Ｂ発現のレベルを迅速かつ定量的に区別するために使用することができる。これらの組成物及び方法は、組織試料、例えば腫瘍組織試料を分類するための方法において有用であり得る。このような方法の結果は、患者がＩＮＳＲ、ＩＧＦ１Ｒ又はＩＧＦのアンタゴニストもしくはアゴニストなどの薬物にどのように応答するかということの指標として、腫瘍又は癌患者を分類する際の要因として使用することができる。治療に対する候補を選択する方法及び癌患者を治療する方法において、これらの方法及び得られた分類を使用することができる。
【０００９】
有用なオリゴヌクレオチドは、ＩＲ−Ａ及び／又はＩＲ−Ｂを選択的に増幅するために使用することができる合成核酸を含み得る。このような有用なオリゴヌクレオチドは１０から３０個の連続ヌクレオチドを含む合成核酸配列を含み得、この場合この合成核酸配列は、以下の配列の何れか１つの少なくとも１０から２０個の連続ヌクレオチドを含むものが開示される：（ｉ）配列番号３、それに相補的な配列又はストリンジェントな条件下で配列番号３もしくはその相補体とハイブリッド形成可能である配列；（ｉｉ）配列番号４、それに相補的な配列（配列番号２１）又はストリンジェントな条件下で配列番号４もしくはその相補体とハイブリッド形成可能である配列又はそれらの変異形；（ｉｉｉ）配列番号５、それに相補的な配列又はストリンジェントな条件下で配列番号５もしくはその相補体とハイブリッド形成可能である配列；又は（ｉｖ）配列番号６、それに相補的な配列（配列番号２２）又はストリンジェントな条件下で配列番号６もしくはその相補体とハイブリッド形成可能である配列。この合成核酸配列は、以下の核酸配列の何れか１つから基本的に構成され得る：（ｉ）配列番号３（ＴＧＡＧＧＡＴＴＡＣＣＴＧＣＡＣＡＡＣＧ）、それに相補的な配列又はストリンジェントな条件下で配列番号３もしくはその相補体とハイブリッド形成可能である配列又はその変異形；（ｉｉ）配列番号４（ＧＡＴＧＴＴＧＧＧＡ ＡＴＧＴＧＡＣＧＧＴ）、それに相補的な配列（配列番号２１）又はストリンジェントな条件下で配列番号４もしくはその相補体とハイブリッド形成可能である配列；（ｉｉｉ）配列番号５（ＴＴＧＡＧＧＡＴＴＡＣＣＴＧＣＡＣＡＡＣＧＴ）、それに相補的な配列又はストリンジェントな条件下で配列番号５もしくはその相補体とハイブリッド形成可能である配列又はそれらの変異形；又は（ｉｖ）配列番号６（ＡＡＡＣＧＣＡＧＧＴＣＣＣＴＴＧＧＣ）、それに相補的な配列（配列番号２２）又はストリンジェントな条件下で配列番号６もしくはその相補体とハイブリッド形成可能である配列又はそれらの変異形。
【００１０】
有用な合成核酸配列は、配列番号７、それに相補的な配列又はストリンジェントな条件下で配列番号７もしくはその相補体とハイブリッド形成可能である配列又はそれらの変異形又は、配列番号８、それに相補的な配列又はストリンジェントな条件下で配列番号８もしくはその相補体とハイブリッド形成可能である配列又はそれらの変異形であり得る。別の有用な合成核酸配列は、配列番号７、それに相補的な配列又はストリンジェントな条件下で配列番号７もしくはその相補体とハイブリッド形成可能である配列又はそれらの変異形又は、配列番号８、それに相補的な配列又はストリンジェントな条件下で配列番号８もしくはその相補体とハイブリッド形成可能である配列又はそれらの変異形から基本的に構成され得る。上述の合成核酸配列の何れかを含む組成物も有用であり得る。
【００１１】
生体試料中の標的ヒトＩＲ−Ａ核酸の有無を判定するために有用であるプライマーセットも本明細書中で開示され、このプライマーセットは、以下の少なくとも１つの、１０から３０個の連続ヌクレオチドを含む合成核酸配列の中から選択され得る少なくとも１つの合成核酸配列を含む:（ａ）ＩＮＳＲ遺伝子のエクソン１０の最後の５０塩基（配列番号１）又はその相補的な核酸配列；及び（ｂ）ＩＮＳＲ遺伝子のエクソン１２の最初の６０塩基（配列番号２）、それに相補的な配列又はストリンジェントな条件下で配列番号８もしくはその相補体とハイブリッド形成可能である配列。この合成核酸配列は、配列番号３、それに相補的な配列又はストリンジェントな条件下で配列番号３もしくはその相補体とハイブリッド形成可能である配列；配列番号４、それに相補的な配列（配列番号２１）又はストリンジェントな条件下で配列番号４もしくはその相補体とハイブリッド形成可能である配列；配列番号５、それに相補的な配列又はストリンジェントな条件下で配列番号５もしくはその相補体とハイブリッド形成可能である配列；及び配列番号６、それに相補的な配列（配列番号２２）又はストリンジェントな条件下で配列番号６もしくはその相補体とハイブリッド形成可能である配列の中から選択され得るヌクレオチド配列を有し得る。
【００１２】
（ａ）ポリメラーゼによる増幅に適切な条件下で上述のものなどのプライマーセットと生体試料を接触させる工程；（ｂ）増幅された標的ＩＲ−Ａ核酸配列を検出及び／又は定量する工程を含む、生体試料中の標的ＩＲ−Ａ核酸配列の有無を判定するための方法も本明細書中で開示される。例として、生体試料は、腫瘍試料などの組織試料又は組織もしくは細胞試料由来の核酸を含む試料であり得る。
【００１３】
プライマーセットは、配列番号３、それに相補的な配列又はストリンジェントな条件下で配列番号３もしくはその相補体とハイブリッド形成可能である配列と、配列番号４、それに相補的な配列（配列番号２１）又はストリンジェントな条件下で配列番号４もしくはその相補体とハイブリッド形成可能である配列と、を含み得る。別の例において、本プライマーセットは、配列番号５、それに相補的な配列又はストリンジェントな条件下で配列番号５もしくはその相補体とハイブリッド形成可能である配列と、配列番号６、それに相補的な配列（配列番号２２）又はストリンジェントな条件下で配列番号６もしくはその相補体とハイブリッド形成可能である配列と、を含み得る。ある例において、ポリメラーゼによる増幅は定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ｑ−ＰＣＲ）である。
【００１４】
プライマー及びプローブセットは、配列番号３、それに相補的な配列又はストリンジェントな条件下で配列番号３もしくはその相補体とハイブリッド形成可能である配列又はそれらの変異形と；配列番号４（配列番号２１）、それに相補的な配列又はストリンジェントな条件下で配列番号４もしくはその相補体とハイブリッド形成可能である配列又はそれらの変異形と；検出可能な標識も含み得、クエンチャーをさらに含み得る、配列番号７、それに相補的な配列又はストリンジェントな条件下で配列番号７もしくはその相補体とハイブリッド形成可能である配列又はそれらの変異形と、を含み得る。別の例において、プライマー及びプローブセットは、配列番号５、それに相補的な配列又はストリンジェントな条件下で配列番号５もしくはその相補体とハイブリッド形成可能である配列又はそれらの変異形と；配列番号６、それに相補的な配列（配列番号２２）又はストリンジェントな条件下で配列番号６もしくはその相補体とハイブリッド形成可能である配列又はそれらの変異形と；検出可能な標識も含み得、クエンチャーをさらに含み得る、配列番号８、それに相補的な配列又はストリンジェントな条件下で配列番号８もしくはその相補体とハイブリッド形成可能である配列又はそれらの変異形と、を含み得る。一般に増幅産物は１００塩基未満である。
【００１５】
有用な合成核酸配列は１０から３０個の連続ヌクレオチドを含み得、この合成核酸配列は、以下の配列の何れか１つの少なくとも１０から２０個の連続ヌクレオチドを含む：配列番号１１、それに相補的な配列又はストリンジェントな条件下で配列番号１１もしくはその相補体とハイブリッド形成可能である配列又はそれらの変異形；又は配列番号１２、それに相補的な配列又はストリンジェントな条件下で配列番号１２もしくはその相補体とハイブリッド形成可能である配列又はそれらの変異形。ある例において、本核酸配列は、配列番号１１、それに相補的な配列又はストリンジェントな条件下で配列番号１１もしくはその相補体とハイブリッド形成可能である配列又はそれらの変異形；又は配列番号１２、それに相補的な配列又はストリンジェントな条件下で配列番号１２もしくはその相補体とハイブリッド形成可能である配列又はそれらの変異形；配列番号１３、それに相補的な配列又はストリンジェントな条件下で配列番号１３もしくはその相補体とハイブリッド形成可能である配列又はそれらの変異形；配列番号１４、それに相補的な配列又はストリンジェントな条件下で配列番号１４もしくはその相補体とハイブリッド形成可能である配列又はそれらの変異形；又は、配列番号１５、それに相補的な配列又はストリンジェントな条件下で配列番号１５もしくはその相補体とハイブリッド形成可能である配列又はそれらの変異形から基本的に構成される。上記の合成核酸配列の何れか１以上を含む組成物も有用であり得る。
【００１６】
生体試料中のＩＲ−Ｂの有無を判定するためのプライマーセットは、以下の少なくとも１つの１０から３０個の連続ヌクレオチドを含む合成核酸配列を含み得る：（ａ）ＩＮＳＲ遺伝子のエクソン１０の最後の５０塩基（配列番号１）、それに相補的な配列又はストリンジェントな条件下で配列番号１もしくはその相補体とハイブリッド形成可能である配列及び、ＩＮＳＲ遺伝子のエクソン１１の塩基（配列番号９）、それに相補的な配列又はストリンジェントな条件下で配列番号９もしくはその相補体とハイブリッド形成可能である配列又はそれに相補的な配列又は、ＩＮＳＲ遺伝子のエクソン１０及びエクソン１１を架橋する配列、それに相補的な配列又はストリンジェントな条件下でそれともしくはその相補体とハイブリッド形成可能である配列；及び（ｂ）ＩＮＳＲ遺伝子のエクソン１２の最初の５０塩基（配列番号１０）、それに相補的な配列又はストリンジェントな条件下で配列番号１０もしくはその相補体とハイブリッド形成可能である配列又はそれに相補的な配列。プライマーセットは、配列番号１１、それに相補的な配列又はストリンジェントな条件下で配列番号１１もしくはその相補体とハイブリッド形成可能である配列；及び配列番号１２、その相補的な配列又はストリンジェントな条件下で配列番号１２もしくはその相補体とハイブリッド形成可能である配列の中から選択され得るヌクレオチド配列を有する少なくとも１つの合成核酸配列を含み得る。
【００１７】
生体試料中の標的ＩＲ−Ｂ核酸配列の有無を判定するための方法は、（ｃ）ポリメラーゼによる増幅に適切な条件下で上記のプライマーセットと生体試料を接触させる工程、（ｄ）増幅された標的ＩＲ−Ｂ核酸配列を検出及び／又は定量する工程を含み得る。例として、生体試料は、腫瘍試料などの組織試料からの核酸を含む試料であり得る。別の例において、ポリメラーゼによる増幅は、定量的ポリメラーゼ連鎖反応によるものであり得る。プライマー及びプローブセットは、配列番号１１、それに相補的な配列又はストリンジェントな条件下で配列番号１１もしくはその相補体とハイブリッド形成可能である配列；配列番号１２、それに相補的な配列又はストリンジェントな条件下で配列番号１２もしくはその相補体とハイブリッド形成可能である配列；及び、検出可能な標識も含み得、さらにクエンチャーを含み得る、配列番号１３、それに相補的な配列又はストリンジェントな条件下で配列番号１３もしくはその相補体とハイブリッド形成可能である配列を含み得る。別の例において、プライマー及びプローブセットは、配列番号１１、それに相補的な配列又はストリンジェントな条件下で配列番号１１もしくはその相補体とハイブリッド形成可能である配列と；配列番号１２、それに相補的な配列又はストリンジェントな条件下で配列番号１２もしくはその相補体とハイブリッド形成可能である配列と；配列番号１４、それに相補的な配列又はストリンジェントな条件下で配列番号１４もしくはその相補体とハイブリッド形成可能である配列と、を含み得る。
【００１８】
別の例において、プライマーセットは、配列番号１１、それに相補的な配列又はストリンジェントな条件下で配列番号１１もしくはその相補体とハイブリッド形成可能である配列と；配列番号１２、それに相補的な配列又はストリンジェントな条件下で配列番号１２もしくはその相補体とハイブリッド形成可能である配列と、を含み得；さらに、検出可能な標識も含み得、クエンチャーをさらに含み得る、配列番号１５、それに相補的な配列又はストリンジェントな条件下で配列番号１５もしくはその相補体とハイブリッド形成可能である配列を含み得る。一般に増幅産物は１００塩基未満である。
【００１９】
生体試料中の標的ＩＲ−Ａ及びＩＲ−Ｂ核酸の有無を判定するための方法は、ポリメラーゼによる増幅に適切な条件下で上述のようなＩＲ−Ａプライマーセットと生体試料を接触させ；ポリメラーゼ反応による増幅に適切な条件下で上述のようなＩＲ−Ｂプライマーセットと生体試料を接触させる工程；増幅された標的ＩＲ−Ａ及びＩＲ−Ｂ核酸配列を検出及び／又は定量する工程を含み得る。この方法は、ＩＲ−Ａ及びＩＲ−Ｂの相対発現レベルを計算することをさらに含み得る。
【００２０】
生体試料中のＩＲ−Ａの有無を判定するためのキットは、上述の少なくとも１つの合成核酸配列と、本明細書中に記載の１以上の方法を行うための説明書と、を含み得る。このようなキットにおいて、少なくとも１つの合成核酸配列は、本明細書中で開示されるＩＲ−Ａプライマー及びプローブの中から選択されるヌクレオチド配列又はそれらの何らかのセットを有し得る。キットはまた、適切なＰＣＲ試薬；及び場合によってはＩＲ−Ａの有無を判定するための陽性及び／又は陰性対照も含み得る。
【００２１】
生体試料中のＩＲ−Ｂの有無を判定するためのキットは、上述のような少なくとも１つの合成核酸配列と、本明細書中に記載の１以上の方法を行うための説明書と、を含み得る。このようなキット中の合成核酸は、ＩＲ−Ｂ核酸の中から選択されるヌクレオチド配列を有し得る。このキットはまた、適切なＰＣＲ試薬；及び場合によってはＩＲ−Ｂの有無を判定するための陽性及び／又は陰性対照も含み得る。
【００２２】
ＩＧＦＩ／ＩＩリガンド、ＩＮＳＲ又はＩＧＦＲ１受容体アンタゴニストもしくはアゴニストに反応性がある患者を選択するための方法は、癌に罹患しているか又はその疑いのある対象から生体試料を入手することと；その試料中のＩＲ−Ａの存在を検出及び／又は定量することと、を含み得る。ＩＲ−Ａの有無は、ＩＧＦＩ／ＩＩリガンド、ＩＮＳＲ又はＩＧＦＲ１受容体アンタゴニストもしくはアゴニストを対象に投与すべきか否かに関する指標である。このように、患者を治療する方法は、患者から得られた患者におけるＩＲ−Ａの存在を検出及び／又は定量することと、ＩＧＦＩ／ＩＩリガンド、ＩＮＳＲ又はＩＧＦＲ１受容体アンタゴニスト又はアンタゴニストをその患者に投与することと、を含み得る。例として、ＩＧＦＩ及びＩＩリガンド、ＩＮＳＲ又はＩＧＦＲ１受容体アンタゴニストは抗体であり得る。
【００２３】
ＩＲ−Ａ及び又はＩＲ−Ｂの発現に従うか又はＩＲ−Ａ及びＩＲ−Ｂの相対量により腫瘍を分類することができる。このようにして腫瘍を分類することにより、ＩＲ−Ａ及び／又はＩＲ−Ｂを過剰発現している腫瘍又はＩＲ−Ｂに対するＩＲ−Ａの変動もしくはその逆を有する腫瘍を同定することができるようになる。腫瘍を分類する方法は、腫瘍組織試料中のＩＲ−Ａ及び／又はＩＲ−Ｂの発現又はＩＲ−Ｂに対するＩＲ−Ａの量もしくはその逆を定量することと、その定量に基づいて分類を行うことと、を含み得る。腫瘍がある患者を治療する方法は、腫瘍組織試料中のＩＲ−Ａ及び／又はＩＲ−Ｂの発現又はＩＲ−Ｂに対するＩＲ−Ａの量又はその逆を定量することにより腫瘍を分類することと、ＩＲ−Ａ及び／又はＩＲ−Ｂの発現又はＩＲ−Ｂに対するＩＲ−Ａの量もしくはその逆の定量に基づき分類を割り当てることと、その分類に従い、ＩＧＦＩ／ＩＩリガンド又はＩＧＦＲ１受容体アンタゴニスト又はアゴニストを患者に投与することと、を含み得る。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】図１Ａ−１ＢはＩＲ−Ａ及びＩＲ−Ｂを示す。図１Ａは、ＩＲ−Ａ及びＩＲ−Ｂのゲノム構造を示す。図１Ｂは、左にエクソン位置を示し、右に機能ドメイン位置を示す、ＩＮＳＲホモ二量体のα及びβサブユニットの概略図である。
【図２】ヒトＩＲ−Ａ（配列番号１６）及びＩＲ−Ｂ（配列番号１７）の配列アラインメントであり、このアラインメントは、エクソン１１がＩＲ−Ａから欠落していることを除き、同一であることを示す。
【図３】強い及び弱いリガンド相互作用を説明するＩＧＦ−１Ｒ／ＩＲ受容体の概略図である。
【図４】例えばＩＲ−Ａアッセイのためのプライマー及びプローブ位置の概略を示す。
【図５】図５は、例えばＩＲ−Ａアッセイのためのプライマー及びプローブ位置の概略を示す。
【図６】例えばＩＲ−Ｂアッセイのためのプライマー及びプローブ位置の概略を示す。
【図７】ＩＲ−Ａ、ＩＲ−Ｂ又は空のベクター対照の何れかのプラスミドＤＮＡのおよそ１０７から１０コピーの連続希釈液を用いた、ＩＲ−Ａ又はＩＲ−Ｂ ｑＲＴ−ＰＣＲアッセイの結果を示す。Ｙ軸はサイクル閾値（ｃｙｃｌｅ−ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ（Ｃｔ）値）を表し、Ｘ軸はｌｏｇＤＮＡ複製数を表す。ＩＲ−Ａアッセイに対する標準希釈曲線の傾斜及び相関係数（ｒ２値）はそれぞれ−３．２５９及び０．９９９２である。ＩＲ−Ｂアッセイに対する標準希釈曲線の傾斜及び相関係数（ｒ２値）はそれぞれ−３．１５５及び０．９９８９である。
【図８】正常乳房組織に対する、原発乳癌におけるインスリン受容体及びそのアイソフォームのｍＲＮＡ相対発現レベルを示す。ＴａｑＭａｎ遺伝子発現アッセイによって、正常（ｎ＝１９）と腫瘍（ｎ＝４２）乳房組織試料との間のＩＮＳＲ（トータル）、ＩＲ−Ａ及びＩＲ−Ｂの相対量（ＲＱ）の差を決定した（ｌｏｇ２ベースのスケール）。各試料に対する倍単位の変化の差を計算するために、平均正常ΔＣｔ値を使用した。ウェルチの両側ｔ−検定分析によって、ＩＮＳＲ及びＩＲ−Ｂの両方に対して正常試料と腫瘍試料との間の有意差が確認されたが（Ｐ＜０．００１）、その一方でＩＲ−Ａについては差が見られなかった（Ｐ＝０．４５）。バーは特定の遺伝子標的及び組織型の組み合わせ内のｌｏｇ２ＲＱの中央値を表す。
【図９】対応する正常乳房及び乳癌検体におけるＩＲ−Ａ発現の割合を示す。２（−ΔＣｔ）の計算により算出した、試料内の総インスリン受容体組成物（即ちＩＲ−Ａ＋ＩＲ−Ｂ）に対するインスリン受容体アイソフォーム−Ａ（ＩＲ−Ａ）の割合。対応のある試料ｔ−検定分析から、対応する正常試料と腫瘍試料との間のＩＲ−Ａの割合の計算値について有意差があることが示された（Ｐ＜０．００１）。黒いバーは、正常（４６．６０±４．７４、平均％±９５％ＣＩ）及び腫瘍（７５．２４±５．０３、平均％±９５％ＣＩ）組織内のＩＲ−Ａの割合の中央値（％）に相当する。
【図１０】原発性乳癌におけるＩＲ−Ａ：ＩＲ−Ｂ比の上昇を示す。正常（ｎ＝１９）及び腫瘍（ｎ＝４２）乳房試料におけるインスリン受容体アイソフォームＩＲ−Ａ及びＩＲ−ＢのΔＣｔの差の計算値。正規化のために試料内参照遺伝子パネル（平均Ｃｔ）を利用して、全試料に対してΔＣｔ差（ＩＲ−ＡΔＣｔ−ＩＲ−ＢΔＣｔ）の値を計算した。ウェルチの両側ｔ−検定分析によって、実際のＩＲ−Ａ：ＩＲ−ＢのΔＣｔ差に関して、正常試料と腫瘍試料との間で有意差が認められた（Ｐ＜０．００１）。黒いバーは特定組織型内のＩＲ−Ａ：ＩＲ−ＢΔＣｔ差の中央値を示す。
【図１１】ｑＰＣＲ ｃＤＮＡアレイからの乳癌試料中のＩＲ−Ａ：ＩＲ−Ｂ比の上昇を示す。正常（ｎ＝１５；１０名の個別ドナー由来の試料）、乳癌ｃＤＮＡパネル（ｎ＝１６５）及び２倍超のエストロゲン受容体（ＥＲ）過剰発現がある、これらのｃＤＮＡパネル由来の乳房腫瘍（ｎ＝８３）におけるインスリン受容体アイソフォームＩＲ−Ａ及びＩＲ−Ｂ（Ｙ軸）のΔＣｔ差の計算値。正規化のために試料内参照遺伝子パネル（平均Ｃｔ）を用いて、全試料に対して、ΔＣｔ差（ＩＲ−ＡΔＣｔ−ＩＲ−ＢΔＣｔ）値を計算した。ウェルチの両側ｔ−検定分析によって、実際のＩＲ−Ａ：ＩＲ−ＢΔＣｔ差に関して、正常試料と腫瘍試料との間で有意差が認められた（Ｐ＜０．０００１）。バーは、特定の組織型内の平均ＩＲ−Ａ：ＩＲ−ＢΔＣｔ差の平均値を表す。
【図１２】増殖遺伝子の発現とＩＲ−Ａ：ＩＲ−ＢΔＣｔ差の相関を示す。ＩＲ−Ａ：ＩＲ−ＢΔＣｔ差の計算値（Ｙ軸）とプールした増殖マーカーパネル（ＡＵＲＫＡ、ＢＩＲＣ５、ＣＣＮＢ１、ＫＩ６７及びＭＹＢＬ２）（Ｘ軸）との間の関係の線形回帰分析。特定試料に対する全マーカーにわたるΔＣｔ平均値をとることによって、増殖パネルサマリー値を計算した。正常及び腫瘍試料の両方に対する結果の概要を示す。この線形回帰分析の結果から、２つのサマリー値の間の正相関が示唆される（補正Ｒ２＝０．５９５）。
【図１３】図１３（Ａ及びＢ）はＥＲ＋乳癌のサブタイプにおけるＩＲ−Ａ：ＩＲ−ＢΔＣｔ差を示す。収縮重心分類手段（ｓｈｒｕｎｋｅｎ ｃｅｎｔｒｏｉｄ ｃｌａｓｓｉｆｉｅｒ）に基づく方法（Ａ）及び２試料間のウェルチ検定分析（Ｂ）により判定された試料サブタイプ（正常、ｌｕｍｉｎａｌ− Ａ又はｌｕｍｉｎａｌ−Ｂ）分類に関する、ＩＲ−Ａ：ＩＲ−ＢΔＣｔ差の計算値の散布図。全サブタイプのペアワイズ比較から、有意差（２試料ｔ検定、ｐ＜０．００１）が示される。バーは、特定の試料サブタイプ内のＩＲ−Ａ：ＩＲ−ＢΔＣｔ差の中央値を表す。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
以下のプライマー及びプローブ配列に本明細書中で言及する。
【００２６】
配列番号１（ＴＴＴＡＧＧＡＡＧＡ ＣＧＴＴＴＧＡＧＧＡ ＴＴＡＣＣＴＧＣＡＣ
ＡＡＣＧＴＧＧＴＴＴ ＴＣＧＴＣＣＣＣＡＧ）ＩＮＳＲエクソン１０ Ｃ末端
【００２７】
配列番号２（ＧＣＣＡＴＣＴＣＧＧ ＡＡＡＣＧＣＡＧＧＴ ＣＣＣＴＴＧＧＣＧＡ
ＴＧＴＴＧＧＧＡＡＴ ＧＴＧＡＣＧＧＴＧＧ ＣＣＧＴＧＣＣＣＡＣ）
ＩＮＳＲエクソン１２ Ｎ末端
【００２８】
配列番号３（ＴＧＡＧＧＡＴＴＡＣＣＴＧＣＡＣＡＡＣＧ）ＩＲ−Ａプライマー
【００２９】
配列番号４（ＧＡＴＧＴＴＧＧＧＡ ＡＴＧＴＧＡＣＧＧＴ）ＩＲ−Ａプライマー（逆相補的 配列番号２１）
【００３０】
配列番号５（ＴＴＧＡＧＧＡＴＴＡ ＣＣＴＧＣＡＣＡＡＣＧＴ）ＩＲ−Ａプライマー
【００３１】
配列番号６（ＡＡＡＣＧＣＡＧＧＴＣＣＣＴＴＧＧＣ）ＩＲ−Ａプライマー（逆相補的 配列番号２２）
【００３２】
配列番号７（ＴＣＣＣＣＡＧＧＣＣＡＴＣＴ）ＩＲ−Ａプローブ
【００３３】
配列番号８（ＴＴＴＴＣＧＴＣＣＣＣＡＧＧＣＣＡ）ＩＲ−Ａプローブ
【００３４】
配列番号９（ＡＡＡＡＡＣＣＴＣＴ ＴＣＡＧＧＣＡＣＴＧ ＧＴＧＣＣＣＡＧＧＡ
ＣＣＣＴＡＧ）ＩＮＳＲエクソン１１
【００３５】
配列番号１０（ＧＣＣＡＴＣＴＣＧＧ ＡＡＡＣＧＣＡＧＧＴ ＣＣＣＴＴＧＧＣＧＡ
ＴＧＴＴＧＧＧＡＡＴ ＧＴＧＡＣＧＧＴＧＧ）ＩＮＳＲエクソン１２ Ｎ末端
【００３６】
配列番号１１（ＣＧＴＣＣＣＣＡＧＡＡＡＡＡＣＣＴＣＴＴＣ）ＩＲ−Ｂプライマー
【００３７】
配列番号１２（ＧＧＡＣＣＴＧＣＧＴＴＴＣＣＧＡＧＡＴ）ＩＲ−Ｂプライマー
【００３８】
配列番号１３（ＡＣＴＧＧＴＧＣＣＧＡＧＧＡＣ）ＩＲ−Ｂ特異的プローブ
【００３９】
配列番号１４（ＣＣＧＡＧＧＡＣＣＣＴＡＧＧＣ）ＩＲ−Ｂ特異的プローブ
【００４０】
配列番号１５（ＴＧＣＣＧＡＧＧＡＣＣＣＴＡＧ）ＩＲ−Ｂ特異的プローブ
【００４１】
さらなるプライマー及びプローブ配列には、表３及び４にあるものが含まれる。熟練者は、本明細書中で開示されるプライマーから、ＰＣＲ反応で核酸配列を増幅できるプライマー対を選択することができる（例えば、逆鎖にアニーリングし、正しい方向にＤＮＡ合成を開始させる。）。熟練者はこのようなプライマーの相補体を例えば陰性対照として使用することができることを理解するであろう。
【００４２】
ＩＲ−ＡとＩＲ−Ｂとの間に高い配列同一性があるにもかかわらず、試料中のヒトＩＲ−Ａ及びヒトＩＲ−Ｂの発現を検出及び定量するためのアッセイにおいて、これらの核酸配列及び本明細書中に記載の関連配列を使用することができる。このようにして、初めて、迅速かつ高感度の、試料中のＩＲ−Ａ及び／又はＩＲ−Ｂの発現を調べるための方法が発見された。これらの配列を用いて記載される方法は定量的に正確であり、ハイスループット及び臨床の場で使用することができる。
【００４３】
試験試料においてＩＲ−Ａ及び／又はＩＲ−Ｂの発現を特定するために使用することができる合成核酸配列又はオリゴヌクレオチドは、それらが所望の反応において依然として機能可能である限り、塩基部分、糖部分又は骨格が修飾され得、その他の付属基、標識又はクエンチャーを含み得る、ＤＮＡ、ＲＮＡ、それらのキメラ混合物もしくは誘導体もしくは修飾体であり得る。合成核酸配列は、少なくとも１つの修飾リン酸骨格、例えばホスホロチオアート、ホスホロジチオアート、ホスホルアミドチオアート、ホスホルアミダート、ホスホルジアミダート、メチルホスホネート、アルキルホスホトリエステル及びホルムアセタール又はそれらの類似体などを含み得る。
【００４４】
Ａ．ＩＲ−Ａ核酸配列
適切なＩＲ−Ａ合成核酸配列には、表３及び４で出現するものが含まれる。
【００４５】
ＩＮＳＲ遺伝子のエクソン１０の最後の５０、４５、４０、３５、３０、２５もしくは２０個の塩基（配列番号１）又はストリンジェントな条件下で配列番号１もしくはその相補体とハイブリッド形成可能である配列及び、ＩＮＳＲ遺伝子のエクソン１２の最初の６０、５５、５０、４５、４０、３５、３０、２５もしくは２０個の塩基（配列番号２）又はストリンジェントな条件下で配列番号２もしくはその相補体とハイブリッド形成可能である配列で出現するＩＲ−Ａ核酸配列を含む合成核酸は、試料中のＩＲ−Ａの発現レベルを調べるための定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）（リアルタイムＰＣＲ又は動力学的ＰＣＲとしても知られる。）などのポリメラーゼによる増幅及び検出において使用することができる。
【００４６】
ＩＲ−Ａ配列を含む合成核酸は、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９又は３０個の連続ヌクレオチドを含み得、同時にこの合成核酸配列は、以下の配列の何れか１つの少なくとも１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０個の連続ヌクレオチドを含む：
（ｉ）配列番号３（ＴＧＡＧＧＡＴＴＡＣ ＣＴＧＣＡＣＡＡＣＧ）、それに相補的な配列又はストリンジェントな条件下で配列番号３もしくはその相補体とハイブリッド形成可能である配列；
（ｉｉ）配列番号４（ＧＡＴＧＴＴＧＧＧＡ ＡＴＧＴＧＡＣＧＧＴ）、それに相補的な配列（配列番号２１）又はストリンジェントな条件下で配列番号４もしくはその相補体とハイブリッド形成可能である配列；
（ｉｉｉ）配列番号５（ＴＴＧＡＧＧＡＴＴＡ ＣＣＴＧＣＡＣＡＡＣ ＧＴ）、それに相補的な配列又はストリンジェントな条件下で配列番号５もしくはその相補体とハイブリッド形成可能である配列；又は
（ｉｖ）配列番号６（ＡＡＡＣＧＣＡＧＧＴ ＣＣＣＴＴＧＧＣ）、それに相補的な配列（配列番号２２）又はストリンジェントな条件下で配列番号６もしくはその相補体とハイブリッド形成可能である配列。
【００４７】
ある例において、生体試料中の標的ＩＲ−Ａ核酸配列の有無を判定するためのプライマーセットは、以下うち少なくとも１つの１０から３０個の連続ヌクレオチドを含む合成核酸配列の中から選択され得る少なくとも１つの合成核酸配列を含み得る：（ａ）ＩＮＳＲ遺伝子のエクソン１０の最後の５０、４５、４０、３５、３０、２５もしくは２０個の塩基（配列番号１）、それに相補的な配列又はストリンジェントな条件下で配列番号１もしくはその相補体とハイブリッド形成可能である配列；及び（ｂ）ＩＮＳＲ遺伝子のエクソン１２の最初の６０、５５、５０、４５、４０、３５、３０、２５もしくは２０個の塩基（配列番号２）、それに相補的な配列又はストリンジェントな条件下で配列番号２もしくはその相補体とハイブリッド形成可能である配列。このプライマーセットは、（ｉ）配列番号３、それに相補的な配列又はストリンジェントな条件下で配列番号３もしくはその相補体とハイブリッド形成可能である配列及び、配列番号４、それに相補的な配列（配列番号２１）又はストリンジェントな条件下で配列番号４もしくはその相補体とハイブリッド形成可能である配列又は、（ｉｉ）配列番号５又はその相補的配列；及び配列番号６、それに相補的な配列（配列番号２２）又はストリンジェントな条件下で配列番号６もしくはその相補体とハイブリッド形成可能である配列を含み得る。通常、プライマーセットは、約５０から１５０ｂｐの生成物を生成させるためにＰＣＲで使用される。プローブは、配列番号７もしくは８又はストリンジェントな条件下で配列番号７もしくは８又はその相補体の何れかとハイブリッド形成可能である配列を含み得、適切な標識及びクエンチャーの組み合わせも含み得る。
【００４８】
例として、定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）に有用なプライマーセットは：
配列番号３又はそれに相補的な核酸配列；
配列番号４又はそれに相補的な核酸配列（配列番号２１）；及びクエンチャーも含み得る検出可能な標識を有する、さらなる合成核酸又はプローブを含む。ある例において、さらなる核酸は、１０から５０ヌクレオチドの間の１本鎖核酸配列であり、配列番号３及び４の２つのＰＣＲプライマー間でＩＲ−Ａ ｃＤＮＡ又はその相補体のＤＮＡ配列に特異的に結合するように設計されている。さらなる核酸は、通常、その５’及び３’末端で共有結合する、６−カルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ）又はテトラクロロフルオレシン（ｆｌｕｏｒｅｓｃｉｎ）（ＴＥＴ）などの蛍光レポーター又はフルオロフォア及び、テトラメチルローダミン（ＴＡＭＲＡ）などのクエンチャーを有する。この例において、特異的ＰＣＲ生成物のみが蛍光シグナルを発する。この例において、さらなる核酸は、１０から５０塩基であり得、配列番号７又はストリンジェントな条件下で配列番号７もしくはその相補体とハイブリッド形成可能である配列の少なくとも５〜１４塩基を含む。
【００４９】
別の例において、プライマーセットは、
配列番号５又はそれに相補的な核酸配列；
配列番号６又はそれに相補的な核酸配列（配列番号２２）；及びクエンチャーも含み得る検出可能な標識を有するさらなる核酸を含む。さらなる核酸は、１０から３２ヌクレオチドの間の１本鎖核酸配列であり得、配列番号５及び６の２つのＰＣＲプライマー間でＩＲ−Ａ ｃＤＮＡ又はその相補体のＤＮＡ配列にのみ結合するように設計される。この例において、さらなる核酸は１０から３２塩基であり得、配列番号８又はストリンジェントな条件下で配列番号８もしくはその相補体とハイブリッド形成可能である配列の少なくとも５〜１４塩基を含む。
【００５０】
Ｂ．ＩＲ−Ｂ核酸配列
適切なＩＲ−Ｂ合成核酸配列には、表３及び４で出現するものが含まれる。
【００５１】
ＩＲ−Ｂの発現レベルを調べるための本明細書中で開示される方法、特にＰＣＲに基づく方法において、（ａ）エクソン１０の最後の５０、４５、４０、３５、３０、２５もしくは２０個の塩基（配列番号１）もしくはその相補体又はストリンジェントな条件下で配列番号１もしくはその相補体とハイブリッド形成可能である配列及び、ＩＮＳＲ遺伝子のエクソン１１（配列番号９）もしくはそれに相補的な配列又はストリンジェントな条件下で配列番号９もしくはその相補体とハイブリッド形成可能である配列又は、エクソン１０及び１１を架橋する配列又はストリンジェントな条件下でエクソン１０及び１１を架橋する領域もしくはその相補体とハイブリッド形成可能である配列；及び（ｂ）ＩＮＳＲ遺伝子のエクソン１２の最初の５０、４５、４０、３５、３０、２５もしくは２０個の塩基（配列番号２）、それに相補的な配列又はストリンジェントな条件下で配列番号３もしくはその相補体とハイブリッド形成可能である配列で出現するＩＲ−Ｂ核酸配列を使用することができる。
【００５２】
ある例において、ＩＲ−Ｂ配列を含む合成核酸は、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９又は３０個の連続ヌクレオチドを含み得、この場合、この合成核酸配列は、以下の配列の何れか１つの少なくとも１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０個の連続ヌクレオチドを含む：
（ｉ）配列番号１１又はそれに相補的な配列又はストリンジェントな条件下で配列番号１１もしくはその相補体とハイブリッド形成可能である配列；又は
（ｉｉ）配列番号１２又はそれに相補的な配列又はストリンジェントな条件下で配列番号１２もしくはその相補体とハイブリッド形成可能である配列。
【００５３】
別の例において、生体試料中の標的ＩＲ−Ｂ核酸配列の有無を決定するためのプライマーセットは、以下のうち少なくとも１つの１０から２７個の連続ヌクレオチドを含む合成核酸配列の中から選択され得る少なくとも１つの合成核酸配列を含み得る：（ａ）ＩＮＳＲ遺伝子のエクソン１０の最後の５０塩基（配列番号１）中の５０、４５、４０、３５、３０、２５もしくは２０個の塩基及びエクソン１１（配列番号９）又はそれに相補的な配列；及び（ｂ）ＩＮＳＲ遺伝子のエクソン１２の最初の５０、４５、４０、３５、３０、２５もしくは２０個の塩基（配列番号１０）又はそれに相補的な配列。プライマーセットは、配列番号１１又はそれに相補的な合成核酸配列；及び配列番号１２又はそれに相補的な合成核酸配列の中から選択され得るヌクレオチド配列を含み得る。
【００５４】
プライマーセットがｑＰＣＲなどのＰＣＲで使用される場合、プライマーセットは、配列番号１１又はそれに相補的な合成核酸配列又はストリンジェントな条件下で配列番号１１もしくはその相補体とハイブリッド形成可能である配列と；配列番号１２又はそれに相補的な合成核酸配列又はストリンジェントな条件下で配列番号１２もしくはその相補体とハイブリッド形成可能である配列と；クエンチャーも含み得る検出可能な標識を含むさらなる核酸と、を含み得る。さらなる核酸は、１０から２７ヌクレオチドの間の１本鎖核酸配列であり得、配列番号１１及び１２の２つのＰＣＲプライマーの間でＩＲ−Ｂ ｃＤＮＡの配列もしくはその相補体又はストリンジェントな条件下でその領域もしくはその相補体とハイブリッド形成可能である配列と特異的に結合するように設計されている。例として、さらなる核酸は、１０から２７個の塩基であり得、配列番号１３もしくはその相補体又はストリンジェントな条件下で配列番号１３もしくはその相補体とハイブリッド形成可能である配列の少なくとも５から１４個の塩基を含み得る。さらなる核酸は、１０から３０個の塩基であり得、配列番号１４もしくはその相補体又はストリンジェントな条件下で配列番号１４もしくはその相補体とハイブリッド形成可能である配列の少なくとも５〜１４塩基を含み得る。さらに別の例において、さらなる核酸は１０から３０個の塩基であり得、配列番号１５もしくはその相補体又はストリンジェントな条件下で配列番号１５もしくはその相補体とハイブリッド形成可能である配列の少なくとも５〜１４塩基を含み得る。さらなる核酸は、通常、その５’及び３’末端で共有結合する、６−カルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ）及びテトラクロロフルオレシン（ｆｌｕｏｒｅｓｃｉｎ）（ＴＥＴ）などの蛍光レポーター又はフルオロフォア及びテトラメチルローダミン（ＴＡＭＲＡ）などのクエンチャーを有する。
【００５５】
有用な合成核酸配列はまた、上記で開示される配列の変異形又は本明細書中で開示される核酸と実質的に同様である配列も含む。変異形は、１以上の塩基、例えば２、３、４、５、６、７、８、９又は１０個の塩基により改変されるが、対象のＩＲ−Ａ標的配列の特異的位置になおアニーリング可能である配列を含む。「実質的に同様」という用語は、アニーリング又はハイブリッド形成に関して使用される場合、プライマーなどの合成核酸配列が、ストリンジェントな条件下でその個々の核酸とハイブリッド形成するか又はアニーリングするのに十分に相補的であるはずであることを意味する。この合成核酸配列は、その個々の核酸の正確な配列を反映する必要はなく、実際には「変性物」であってもよい。その合成核酸配列がハイブリッド形成を可能とするようにその配列と十分な相補性を有するならば、非相補的な塩基又は他の配列が合成核酸配列中に散在し得る。従って、例として、ＰＣＲ増幅に使用されるプライマーは、増幅しようとする特異的配列に「実質的に」相補的となるように選択され得る。
【００５６】
本明細書中で使用される場合、「ハイブリッド形成」という用語は、塩基対形成を通じて核酸鎖が相補鎖と連結する過程ならびに例えばＰＣＲ技術において行われる場合の増幅の過程を指す。ある種のヌクレオチド配列の相補体とハイブリッド形成可能なヌクレオチド配列は一般に機能的に同等であり、本明細書中に記載の方法の目的のためにそのヌクレオチド配列と置き換えることができる。
【００５７】
このようにして、この開示により特に高感度で特異的であることが分かった特異的プライマー及びプローブを特定するが、当業者は、有用なプライマーには、本明細書中で開示される例示するプライマーとほぼ同じ位置でポリメラーゼ反応を開始させることができるいかなるプライマーも含まれることを理解するであろう。即ち、ＩＮＳＲ遺伝子のエクソン１０及びエクソン１２において重合反応を開始させるプライマーを使用して、診断用の配列を増幅させることができる。ＩＲ−Ｂ配列のエクソン１０−エクソン１１連結部に及ぶプライマーを使用して、ＩＲ−Ｂ配列を特異的に増幅させることができる。同様に、増幅させたＩＲ−Ａ又はＩＲ−Ｂ標的配列に特異的に結合する、ＩＲ−ＡとＩＲ−Ｂとを区別するさらなるプローブを合成し得る。一般に、より相補的な残基を含むより長い配列ほど、より多くの変化を含有し得る。
【００５８】
「ストリンジェントなハイブリッド形成条件」とは、ストリンジェンシーの低い条件、ストリンジェンシーが中程度の条件及びストリンジェンシーが高い条件の何れかであり得る。一般に、「ストリンジェンシーの低い条件」は、例えば、３２℃での、５ｘＳＳＣ；５ｘデンハルト液；０．５％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ；及び５０％（ｗ／ｖ）ホルムアミドを含む溶液中でのハイブリッド形成である。「ストリンジェンシーが中程度の条件」は、例えば、４２℃での、５ｘＳＳＣ；５ｘデンハルト液；０．５％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ；及び５０％（ｗ／ｖ）ホルムアミドを含む溶液中でのハイブリッド形成である。「ストリンジェンシーが高い条件」とは、例えば、５０℃での、５ｘＳＳＣ；５ｘデンハルト液；０．５％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ；及び５０％（ｗ／ｖ）ホルムアミドを含む溶液中でのハイブリッド形成である。ハイブリッド形成のストリンジェンシーは、温度、核酸濃度、核酸の長さ、イオン強度、時間及び塩濃度などの複数の因子により影響を受ける。これらは、様々なレベルのストリンジェンシーを産み出す例となる条件にすぎない。当業者は、ＰＣＲ反応での所望のストリンジェンシーに対してこのような条件を調整することを含め、ハイブリッド形成条件を適切に調整することによって同様のストリンジェンシーを実現することが可能であろう。
【００５９】
合成核酸配列は、非特異的に核酸を切断する化学物質もしくは酵素又は部位特異的制限エンドヌクレアーゼを用いたより大きい核酸断片の切断により、又は例えば市販の自動ＤＮＡ合成装置及び標準的なホスホラミダイト化学の使用によるものなどの当技術分野で公知の標準的な方法による合成によって得ることができる。修飾された固体支持体上でオリゴヌクレオチドを合成するためのある方法は米国特許第４，４５８，０６６号に記載されている。
【００６０】
所望の合成核酸が合成されたら、核酸を合成した固体支持体から切り離し、存在する保護基を全て除去するために、当技術分野で公知の方法によって、処理すことができる。次に、抽出及びゲル精製を含む当技術分野で公知の何らかの方法によってこの合成核酸を精製することができる。オリゴヌクレオチドの濃度及び純度は、例えばアクリルアミドゲル上でオリゴヌクレオチドを調べることによって、ＨＰＬＣによって又は分光光度計において２６０ｎｍでの光学密度を測定することによって、試験することができる。
【００６１】
本発明の合成核酸配列は、ＩＲ−Ａ及びＩＲ−Ｂの発現の存在について調べるために使用されるあらゆるアッセイにおいて使用することができる。ある例において、本明細書中で開示されるような単離核酸を増幅プロセスで使用することができる。増幅とは、インビトロで核酸鎖を増加させるためのプロセスを指す。代表的技術はＰＣＲであり、これは核酸分子を指数関数的に増幅させる。ＰＣＲは、米国特許第４，６８３，１９５号及び同第４，６８３，２０２号に記載されている。ＰＣＲは標的核酸配列ポリヌクレオチドの特異的検出及び定量に広く使用されており、分子生物学においては標準的な方法である。ＰＣＲは、試験試料中のＩＲ−Ａ及び／又はＩＲ−Ｂの発現を調べるために使用することができる。この方法は単離核酸配列対、「プライマー」を使用し、これはＩＲ−Ａ又はＩＲ−Ｂ ＤＮＡ分子における特異的位置に特異的にアニーリングする。ＩＲ−Ａ又はＩＲ−Ｂ ＤＮＡを熱変性し、増幅しようとするＤＮＡの逆鎖における標的配列を取り囲む２つのオリゴヌクレオチドをハイブリッド形成させる。これらのオリゴヌクレオチドは、ＤＮＡポリメラーゼとともに使用するためのプライマーとなる。このＤＮＡは、プライマー伸長によりコピーされ、両鎖の第二のコピーが作製される。熱変性、プライマーハイブリッド形成及び伸長のサイクルを繰り返すことによって、標的ＩＲ−Ａ又はＩＲ−Ｂ ＤＮＡを約２〜４時間で百万倍以上に増幅することができる。ＰＣＲは、増幅の結果を判定するための検出技術と組み合わせて使用されるべき分子生物学ツールである。ＰＣＲの長所は、およそ４時間で百万から十億倍、標的ＤＮＡの量を増幅することによって感度を向上させることである。
【００６２】
下記で考察し、実施例で説明するように、ＩＲ−Ａプライマー及びプローブを使用する有用な方法は定量的ＰＣＲである。定量的ＰＣＲは、蛍光の光シグナルの検出を用いて増幅反応をリアルタイムで監視できるようにするために蛍光化学とＰＣＲ反応を組み合わせる方法を指す。ある例において、この方法は、ＳＹＢＲ ｇｒｅｅｎなどの配列非特異的蛍光レポーター色素を使用する（Ｗｉｔｔｗｅｒ Ｃ．Ｔ．ら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ．１９９７年１月；２２（１）：１７６−８１）。別の例において、この方法は、ＴＡＱＭＡＮプローブなどの配列特異的蛍光レポーターを使用する（Ｈｅｉｄ Ｃ．Ａ．ら、Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．１９９６，Ｏｃｔｏｂｅｒ；６（１０）：９８６−９４）。ＰＣＲサイクリングプログラムの実行中、光源を用いて試料を励起させる。生成されるＰＣＲ増幅産物の量の指標となる蛍光シグナルは、光検出器又はＣＣＤ／ＣＭＯＳカメラを用いて各反応ウェル中で監視する。反応中の試料中の蛍光を監視することによって、正確な定量的測定を行うことができる。プローブを利用したＰＣＲ法は、ＳＹＢＲ ｇｒｅｅｎ法よりも正確であると考えられる。ＰＣＲ又はｑＰＣＲは通常、プラスチック製の９６又は３８４ウェルマイクロタイタープレート中で行われ、各反応物の体積は５〜５０μＬの規模である。しかし、ＰＣＲは、非常に小さい（ナノリットル）体積で行うことができる。
【００６３】
「プライマー」又は「プライマー対」という用語は、本明細書中で使用される場合、重合反応を開始させるためにＰＣＲで使用される短いオリゴヌクレオチド（通常は１０から３０ｂｐ）を指す。特異的プライマーを、標的配列の特異的位置において重合を開始させることによって増幅しようとするＩＲ−Ａ又はＩＲ−Ｂ ＤＮＡ配列を選択するために使用することができる。
【００６４】
本明細書中に記載の方法は、ＩＲ−Ａ及び／又はＩＲ−Ｂを含有する少量のＤＮＡの、再現性がありロバストな増幅のための方法を提供する。本明細書中に記載の核酸プライマーを用いてｑＰＣＲを行うことによって、０．１ピコグラムのＤＮＡ（１０００複製）から又は３５複製のＤＮＡから、ＩＲ−Ａ又はＩＲ−Ｂを特異的に検出することができる。
【００６５】
生体試料は、この方法の一部の実施においてｃＤＮＡに最初に転写されるＲＮＡを含み得る。細胞総ＲＮＡ、細胞質ＲＮＡ又はポリ（Ａ）＋ＲＮＡを使用し得る。総ＲＮＡ及びポリ（Ａ）＋ＲＮＡを調製するための方法は周知であり、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ−−Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（第２版）、ｖｏｌ．１−３，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．）及びＡｕｓｕｂｅｌら編（１９９４，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．２，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）に全般的に記載されている。好ましくは、Ｃｈｉｒｇｗｉｎら（１９８７）、Ｃｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉ＆Ｓａｃｃｈｉ（１９８７）、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）又はＦａｒｒｅｌｌ Ｊｒ．（１９９３）により記載される技術によって総ＲＮＡを調製し、多くの高品質の市販キットも利用可能である。より好ましくは、Ｃｈｉｒｇｗｉｎら（１９８７）のグアニジンチオシアナート法を用いて、使用する総ＲＮＡを調製する。総ＲＮＡの完全性は当技術分野で公知の様々な方法を用いて確認することができる。例として、ＲＮＡゲル電気泳動法（例えばホルムアルデヒド／アガロースゲル）又はＡｇｉｌｅｎｔ ＬａｂＣｈｉｐを用いてＲＮＡを分析し得る。哺乳動物総ＲＮＡの場合、およそ４．５及び１．９ｋｂの２本のバンドが見えるはずであり；これらのバンドは２８Ｓ及び１８ＳリボソームＲＮＡにそれぞれ相当し、これらのバンドの強度比は通常は１．５〜２．５：１となるはずである。
【００６６】
マイクロスケールのＲＮＡ調製のためのＲＮＡ精製キットは、多くの市販業者から入手可能である（例えばＡｂｓｏｌｕｔｅｌｙ ＲＮＡ（商標）Ｎａｎｏｐｒｅｐ、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ；ＰｉｃｏＰｕｒｅＴＭ、Ａｒｃｔｕｒｕｓ；ＲＮｅａｓｙ（登録商標）、Ｑｉａｇｅｎ；ＲＮＡｑｕｅｏｕｓＴＭ Ｍｉｃｒｏｋｉｔ、Ａｍｂｉｏｎ）。
【００６７】
第一鎖ｃＤＮＡ合成のためのｃＤＮＡ合成オリゴヌクレオチドは、約６０℃から９０℃の温度で、好ましくは約７０℃で、約５分間、適切な緩衝液中でＲＮＡとハイブリッド形成させることができ、次いで、約４℃に冷却し、その後、逆転写酵素を添加する。ｃＤＮＡ合成オリゴヌクレオチドのＲＮＡとのハイブリッド形成後、第一のｃＤＮＡ鎖が合成される。このｃＤＮＡの第一鎖は、好ましくは逆転写のプロセスを通じて生成され、ＤＮＡは、当業者に良く知られる方法に従い、逆転写酵素を用いてＲＮＡから生成される。
【００６８】
伸長後に酵素がデオキシリボヌクレオチドを３’末端に付加する限り（Ｖａｒｍｕｓ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４０：１４２７−１４３５（１９８８））及び酵素がＲＮａｓｅＨ活性を欠く限り、ＲＮＡをＤＮＡに転写するために何らかの逆転写酵素を使用することができる。好ましくは、逆転写酵素はＲＮａｓｅＨ活性を欠くが、より長いｃＤＮＡが合成され得るように野生型ポリメラーゼ活性を保持している。逆転写酵素は、モロニーマウス白血病ウイルス（ＭＭＬＶ）逆転写酵素又はその突然変異形であり得る。逆転写酵素はＰｏｗｅｒＳｃｒｉｐｔ（商標）逆転写酵素（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）であり得る。逆転写酵素はＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＩＩ（商標）であり得る。
【００６９】
当業者に理解されるように、使用される逆転写酵素の量は変動し得る。例えば、およそ１時間、逆転写酵素とともに適切な温度で温置することによって、逆転写が行われるが、この温度は、逆転写酵素が酵素活性を保持する温度範囲でなければならない。この反応は、３７℃と５５℃の間、好ましくは３７℃から４２℃の間で行われ得る。最も好ましくは、この反応は、約４２℃など、至適酵素活性で行われる。逆転写反応は、反応混合物を９５℃に約５分間加熱して酵素を不活性化し、場合によっては続いて氷上で冷却することによって、停止させることができる。
【００７０】
Ｃ．ＩＧＦアンタゴニスト／アゴニスト
本明細書中で使用される場合、ＩＧＦ剤は、ＩＧＦ−１Ｒ／ＩＲシグナル伝達経路の何れかの成員の発現又は活性に影響を与える薬剤を指し、これにはＩＧＦ−１Ｒ、ＩＲ、ＩＮＳＲ又はＩＧＦＩ／ＩＩアンタゴニストもしくはアゴニストが含まれる。ＩＧＦ−１Ｒ、ＩＲ、ＩＮＳＲ又はＩＧＦＩ／ＩＩアンタゴニストもしくはアゴニストは、ペプチド模倣体、タンパク質、ペプチド、核酸、低分子、抗体又はその他の薬物候補であり得る。ＩＧＦ−Ｒ１アンタゴニストの例は当技術分野で周知であり、これには、ＩＧＦ−１Ｒに拮抗するアンチセンス及び核酸が含まれ、例えば、Ｗｒａｉｇｈｔら、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．，１８：５２１−５２６（２０００）；米国特許第５，６４３，７８８号；米国特許第６，３４０，６７４号；ＵＳ２００３／００３１６５８号；米国特許第６，３４０，６７４号；米国特許第５，４５６，６１２号；米国特許第５，６４３，７８８号；米国特許第６，０７１，８９１号；国際公開第２００２／１０１００２号；国際公開第１９９９／２３２５９号；国際公開第２００３／１０００５９号；ＵＳ２００４／１２７４４６号；ＵＳ２００４／１４２８９５号；ＵＳ２００４／１１０２９６号；ＵＳ２００４／００６０３５号；ＵＳ２００３／２０６８８７号；ＵＳ２００３／１９０６３５号；ＵＳ２００３／１７０８９１号；ＵＳ２００３／０９６７６９号；米国特許第５，９２９，０４０号；米国特許第６，２８４，７４１号；ＵＳ２００６／０２３４２３９号；及び米国特許第５，８７２，２４１号に記載されている。
【００７１】
さらに、ＵＳ２００５／０２５５４９３は、低分子２本鎖ＲＮＡを用いたＲＮＡ干渉によるＩＧＦ−１Ｒ発現低下を開示する。さらに、ＩＧＦ−１Ｒを標的とする阻害ペプチドが、インビトロ及びインビボで抗増殖活性を保持するように作製されている（Ｐｉｅｔｒｚｋｏｗｓｋｉら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，５２：６４４７−６４５１（１９９２）；Ｈａｙｌｏｒら、Ｊ．Ａｍ．Ｓｏｃ．Ｎｅｐｈｒｏｌ、１１：２０２７−２０３５（２０００））。ＩＧＦ−１ＲのＣ末端ペプチドは、アポトーシスを誘導し、腫瘍成長を顕著に抑制することが示されている（Ｒｅｉｓｓら、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｐｈｙｓ．，１８１：１２４−１３５（１９９９））。また、可溶性形態のＩＧＦ−１Ｒは、インビボで腫瘍成長を抑制する（Ｄ’Ａｍｂｒｏｓｉｏら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，５６：４０１３−４０２０（１９９６））。ＩＧＦ−ＩＲに対する低分子阻害剤は、例えばＧａｒｃｉａ−Ｅｃｈｅｖｅｒｒｉａら、Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ，５：２３１−２３９（２００４）；Ｍｉｔｓｉａｄｅｓら、Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ，５：２２１−２３０（２００４）；及びＣａｒｂｏｎｉら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ，６５：３７８１−３７８７（２００５）に記載されている。
【００７２】
このような低分子阻害剤に関する開示のさらなる例としては、国際公開第２００２／１０２８０４号；国際公開第２００２／１０２８０５号；国際公開第２００４／５５０２２号；米国特許第６，０３７，３３２号；国際公開第２００３／４８１３３号；ＵＳ２００４／０５３９３１号；ＵＳ２００３／１２５３７０号；米国特許第６，５９９，９０２号；米国特許第６，１１７，８８０号；国際公開第２００３／３５６１９号；国際公開第２００３／３５６１４号；国際公開第２００３／３５６１６号；国際公開第２００３／３５６１５号；国際公開第１９９８／４８８３１号；米国特許第６，３３７，３３８号；ＵＳ２００３／００６４４８２号；米国特許第６，４７５，４８６号；米国特許第６，６１０，２９９号；米国特許第５，５６１，１１９号；国際公開第２００６／０８０４５０号；国際公開第２００６／０９４６００号；及び国際公開第２００４／０９３７８１号が挙げられる。国際公開第２００７／０９９１７１号（ビシクロ−ピラゾール阻害剤）及び国際公開第２００７／０９９１６６号（ピラゾロ−ピリジン誘導体阻害剤）も参照のこと。Ａｂｂｏｔｔ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎの分子Ａ−９２８６０５に対する、（Ｈｕｂｂａｒｄら、ＡＡＣＲ−ＮＣＩ−ＥＯＲＴＣ Ｉｎｔ Ｃｏｎｆ Ｍｏｌ Ｔａｒｇｅｔｓ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒ（１０月２２−２６日、Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ）２００７年、Ａｂｓｔ Ａ２２７）も参照のこと。
【００７３】
ＩＧＦ剤の例としては、ＩＧＦ−Ｉ／ＩＩアゴニスト又はアンタゴニストが挙げられる。特異的ＩＧＦ−ＩＩアンタゴニストも当技術分野で公知であり、これには、ＩＧＦ−Ｉ及び／又はＩＧＦ−ＩＩに結合する抗体が含まれる。このようなアンタゴニストは、国際公開第２００７０２２１７２号及び欧州特許第４９２５５２号で開示されている。ＩＧＦ−Ｉ及びＩＧＦ−ＩＩの両方に結合する抗体の例としては、国際公開第２００７０７０４３２号、国際公開第０５／１８６７１号、国際公開第０３／０９３３１７号、国際公開第０５／０２７９７０号及び国際公開第０５／０２８５１５号に記載のものが挙げられる。
【００７４】
ＩＧＦアンタゴニストとして有用な抗体の具体例には、表１及び２で列挙される重鎖及び軽鎖成分が含まれる。これらの抗体は、その全体において本明細書中に参照により組み込まれるＷＯ２００７０７０４３２に開示されている。特定の抗体としては、７．１５９．１、７．１５８．１及び７．３４．１と呼ばれるものが挙げられる。上記で開示される薬剤及び抗体は、それらの全体において本願に組み込まれる。
【表１】
＊ハッチ表記（＃）は生殖細胞系列におけるスペースを指し、この表で示される抗体配列との適正なアラインメントを示すために使用される。
＊＊上記の表で示される生殖細胞系列配列は、アラインメントを目的とするものであり、各個別の抗体領域が、インビボで免疫グロブリン生殖細胞系列ＤＮＡセグメントの可変領域内でそれ自身の位置に存在することを理解されたい。
【表２】
＊ハッチ表記（＃）は生殖細胞系列におけるスペースを指し、この表で示される抗体配列との適正なアラインメントを示すために使用される。
＊＊上記の表で示される生殖細胞系列配列は、アラインメントを目的とするものであり、各個別の抗体領域が、インビボで免疫グロブリン生殖細胞系列ＤＮＡセグメントの可変領域内でそれ自身の位置に存在することを理解されたい。
【００７５】
Ｄ．ＩＲ−Ａ及びＩＲ−Ｂ発現を検出及び／又は定量する方法
試料中のＩＲ−Ａ又はＩＲ−Ｂレベルを調べるために、上で開示されるＩＲ−Ａ及びＩＲ−Ｂ合成核酸配列、プライマー及びプローブセットを使用することができる。このアッセイの感度を考慮すると、本発明の分子は多くの用途を有し得る。
【００７６】
好ましいアプローチは、定量的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（Ｑ−ＰＣＲ、ｑＰＣＲ、ｑｒｔ−ＰＣＲ又はＲＴＱ−ＰＣＲなど様々に略称される）又は動力学的ポリメラーゼ連鎖反応（ＫＰＣＲ）とも呼ばれるリアルタイムポリメラーゼ連鎖反応を使用することである。細胞又は組織中のメッセンジャーＲＮＡ及び非コードＲＮＡを定量するために、逆転写とリアルタイムＰＣＲが組み合わせられることが多い。逆転写ＰＣＲによって、予めｃＤＮＡを調製することなくＲＮＡ含有試料から開始することができるようになる。リアルタイム逆転写ＰＣＲは、しばしばｑＲＴ−ＰＣＲ、ＲＲＴ−ＰＣＲ又はＲＴ−ｒｔＰＣＲと表記される。これによって、ＤＮＡ試料中の１以上の特異的配列の検出及び定量の両方が可能になる（ＤＮＡ投入量又はさらなる正規化遺伝子に対して正規化する場合の、絶対的コピー数又は相対量として）。
【００７７】
この手順は、ポリメラーゼ連鎖反応の一般過程に従う。しかし、増幅されたＤＮＡは、リアルタイムに反応進行とともに検出される。リアルタイムＰＣＲにおける生成物の検出のための２つの一般的な方法は、（１）何らかの２本鎖ＤＮＡに挿入される非特異的蛍光色素及び（２）プローブとその相補的ＤＮＡ標的とのハイブリッド形成後にのみ検出が可能となる蛍光レポーターで標識されるオリゴヌクレオチドからなる配列−特異的ＤＮＡプローブである。
【００７８】
蛍光レポータープローブは、プローブ配列を含有するＤＮＡのみを検出し；従って、レポータープローブを使用すると特異性が顕著に向上し、非特異的ＤＮＡ増幅が存在しても定量が可能となる。蛍光プローブは、標的とされる遺伝子が全て同様の効率で増幅されるならば、様々な色の標識を有する特異的プローブに基づき、同じ反応中のいくつかの遺伝子の検出のために、多重アッセイにおいて使用することができる。
【００７９】
本方法は、一般に、プローブの片方の末端に蛍光レポーターが付加されており、プローブの他方の末端に蛍光のクエンチャーが付加されているＤＮＡに基づくプローブを使用する。クエンチャーへのレポーターの近接近によりその蛍光の検出が妨げられ；ポリメラーゼの５’から３’方向のエクソヌクレアーゼ活性によるプローブの切断によってレポーターがクエンチャーから離され、それ故に蛍光発光が抑制されなくなる。従って、各ＰＣＲサイクルでのレポータープローブが標的とする生成物が増加すると、プローブの切断及びレポーターの放出によって蛍光の比例した増加が起こる。
【００８０】
ＰＣＲ試料は通常と同様に調製し、レポータープローブを付加する。反応が開始されると、ＰＣＲのアニーリング段階中にプローブ及びプライマーの両方がＤＮＡ標的にアニーリングする。
【００８１】
新しいＤＮＡ鎖の重合はプライマーから開始され、ポリメラーゼがプローブに到達すると、その５’−３’−エクソヌクレアーゼがプローブを分解し、蛍光レポーターをクエンチャーから物理的に引き離し、その結果蛍光が増強する。蛍光は、リアルタイムＰＣＲサーモサイクラーにおいて検出され、測定され、生成物の指数関数的増加に対応するその幾何級数的増加は、各反応における閾値サイクル（ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ ｃｙｃｌｅ（ＣＴ））を決定するために使用される。
【００８２】
反応の指数期中に存在するＤＮＡの相対濃度は、対数スケールでサイクル数に対して蛍光をプロットすることにより調べることができる（指数関数的に量が増加すると直線になる）。バックグラウンドを上回る蛍光の検出に対する閾値が決定される。試料からの蛍光が閾値を越えるサイクルをサイクル閾値、Ｃｔと呼ぶ。指数期中、ＤＮＡの量は、理論的にはサイクルごとに２倍になり、ＤＮＡの相対量を計算することができ、例えばＣｔが別の試料よりも３サイクル小さい試料は、２３＝８倍多い鋳型を有する。全てのプライマーセットが同じように良好に機能するわけではないので、最初に反応効率を計算しなければならない。このようにして、基数としてこれを使用し、指数としてサイクルの差（ｃｙｃｌｅ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ）Ｃ（ｔ）を用いることによって、開始時の鋳型の差を（２ｘ効率％）Ｃｔとして計算することができる。
【００８３】
次いで、結果を公知の量のＲＮＡ又はＤＮＡの連続希釈物（例えば未希釈、１：４、１：１６、１：６４）のリアルタイムＰＣＲにより作成した標準曲線と比較することによって、ＲＮＡ又はＤＮＡの量を決定することができる。遺伝子発現を正確に定量するために、対象となる遺伝子からのＲＮＡの測定量を同じ試料において測定したハウスキーピング遺伝子からのＲＮＡ量で除して、様々な試料間のＲＮＡの量及び質の起こり得る変動に対して正規化する。正規化で使用される参照遺伝子の発現が全試料にわたり非常に類似しているならば、この正規化によって、様々な試料間の対象となる遺伝子の発現の正確な比較が可能となる。
【００８４】
ＭＡＫ２など、機序に基づくｑＰＣＲ（ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｂａｓｅｄ ｑＰＣＲ）定量法も記載されている。これらは、定量のための標準曲線を必要としない。これらの機序に基づく方法は、元の試料濃度の推定を行うためのポリメラーゼ増幅プロセスに関する知識を利用している。
【００８５】
相対量及び絶対量を調べるためにリアルタイムＰＣＲを使用することができる。相対定量は、標的量における倍単位での差（２ｘ、３ｘなど）の尺度である。絶対量は、公知の標準物質と比較することによって、存在する正確な標的分子数を与える。
【００８６】
Ｅ．腫瘍の診断分類
腫瘍を分類する方法は、腫瘍試料を提供することと；その試料を合成ＩＲ−Ａ特異的オリゴヌクレオチドと接触させることと；腫瘍中のＩＲ−Ａ量を検出又は定量することと、を含み得る。腫瘍におけるＩＲ−Ａ量を対照組織試料と又は正常組織に対する母集団平均と比較し得る。例えば、乳癌腫瘍試料を、同じ患者の疾患のない乳房由来の試料と又は非罹患乳房組織に対する母集団平均と比較し得る。ＩＲ−Ａの発現の上昇は、その腫瘍がＩＲ−Ａ発現腫瘍であることを示す。
【００８７】
あるいは、腫瘍を分類する方法は、対照試料又は母集団平均と比較して、腫瘍におけるＩＲ−Ｂ量を検出及び／又は定量することを含み得る。このようにして、腫瘍を分類する方法は、腫瘍試料を提供することと；その試料を合成ＩＲ−Ｂ特異的オリゴヌクレオチドと接触させることと；腫瘍中のＩＲ−Ｂ量を検出又は定量することと、を含み得る。腫瘍におけるＩＲ−Ｂ量を対照組織試料と又は正常組織に対する母集団平均と比較し得る。例えば、乳癌腫瘍試料を、同じ患者の疾患のない乳房由来の試料と又は非罹患乳房組織に対する母集団平均と比較し得る。ＩＲ−Ｂの発現の上昇は、その腫瘍がＩＲ−Ｂ発現腫瘍であることを示す。
【００８８】
腫瘍を分類する方法は、ＩＲ−Ａ及びＩＲ−Ｂの相対発現レベルを決定することを含み得る。相対発現は、ＩＲ−Ａ：ＩＲ−Ｂ ｍＲＮＡの比として又は総ＩＲ ｍＲＮＡの割合としての何れかの％として、例えばＩＲ−Ａの％として記述することができる。ＩＲ−Ａ及びＩＲ−Ｂの相対発現はまた、ｑＰＣＲにおける閾値サイクルの差、例えば（ＩＲ−ＡΔＣｔ）−（ＩＲ−ＢΔＣｔ）＝ΔΔＣｔにより示すこともでき、試料中のＩＲ−Ｂ ｍＲＮＡに対するＩＲ−Ａ ｍＲＮＡの比は２−ΔΔＣｔとほぼ等しい。ΔＣｔの計算の場合、実験によるＣｔ値は、内部標準に対して正規化することができる。例えば、１以上のハウスキーピング遺伝子の平均Ｃｔなど、遺伝子発現パネルの試料内の平均（即ちＩＲ−Ａ及び／又はＩＲ−Ｂ発現と同じ試料から得られる。）Ｃｔ値をＩＲ−Ａ及びＩＲ−Ｂに対するＣｔ値の正規化のために使用して、ΔＣｔ値を計算することができる。
【００８９】
腫瘍組織試料など、組織試料を分類するために、総ＩＮＳＲ発現に対するＩＲ−Ａの％に基づき、組織型におけるＩＲ−Ａの％の平均及び標準偏差を最初に計算する。別のアプローチにおいて、平均の信頼範囲が、予め選択された信頼区間、例えば９５％、９７．５％、９９％又は９９．９％の信頼に対して統計的に決定される。次に、組織試料中の総ＩＮＳＲ発現に対するＩＲ−Ａの％を組織試料において決定する。総ＩＮＳＲ発現からのＩＲ−Ａの％が平均よりも大きい場合、この組織は、ＩＲ−Ａ発現の割合が上昇していると言うことができる。総ＩＮＳＲ発現中のＩＲ−Ａの割合が１〜３標準偏差を超えて、より大きい場合、例えば２標準偏差を超えて大きい場合、その試料は、ＩＲ−Ａの割合が実質的に上昇していると言うことができる。同様に、総ＩＮＳＲ発現中のＩＲ−Ａの割合が予め選択された信頼レベルに対する平均値の信頼区間の上限よりも大きい場合、その組織はＩＲ−Ａの割合が異常に高いと言うことができる。組織のタイプに対して、平均値の９５％、９７．５％、９９％又は９９．９％信頼区間の１、２又は３倍を超える組織試料に分類が割り当てられ得る。
【００９０】
あるいは、腫瘍の既知の分類に対して、総ＩＮＳＲ ｍＲＮＡに対するＩＲ−Ａ ｍＲＮＡの割合の平均及び予め選択した信頼レベルに対する信頼区間を決定し得る。組織試料のＩＲ−Ａの％測定値が信頼区間内に収まる場合、その測定は腫瘍分類と合致すると言うことができる。
【００９１】
例として、正常乳房組織は、９５％信頼で、総ＩＮＳＲ ｍＲＮＡに対する割合として４６．６±４．７％のＩＲ−Ａ ｍＲＮＡを含有すると決定されている。乳房腫瘍組織は、±５％の９５％信頼区間で、総ＩＮＳＲ ｍＲＮＡに対して７５．２４％のＩＲ−Ａを含有することが見出されてた。これらの測定は、有意差があるとされている（ｐ＜０．０００１）。４６．６％よりも大きい組織試料ＩＲ−Ａ％は、ＩＲ−Ａの平均％よりも高いことを示すと言うことができ得る。しかし、正常組織の平均値と腫瘍組織の平均値との間のほぼ中間点であり、個々の９５％信頼範囲を優に超える約６０％に閾値を設定すると、不正確に分類される試料の数が最小限に抑えられる。熟練者は、４７〜７５％の範囲で閾値を調整し得、例えば、比較的包括的な分類を容易にするために、５５％から６５％の範囲で閾値を選択する。
【００９２】
別の例として、ＩＲ−Ａ及びＩＲ−ＢのΔＣｔ値を任意の型の正常組織に対して決定し得る。平均値より、１、２、３標準偏差またはそれ以上低い（ＩＲ−ＡΔＣｔ）−（ＩＲ−ＢΔＣｔ）の差を有すると決定された組織試料は、ＩＲ−Ｂ発現に対してＩＲ−Ａ発現のレベルが不均衡であるものとして分類され得る。一方、正のΔＣｔ差は、ＩＲ−Ｂ発現レベルが不均衡であることを示す。例証するために、正常及び原発腫瘍乳房試料においてＩＲ−Ａ：ＩＲ−ＢΔＣｔ差を決定した。平均ＩＲ−Ａ：ＩＲ−ＢΔΔＣｔ±９５％ＣＩは正常の場合０．２０±０．２３（ｎ＝１９）であり、原発腫瘍では、平均ＩＲ−Ａ：ＩＲ−ＢΔΔＣｔ差±９５％ＣＩは−１．８１±０．２７（ｎ＝４２）であった。従って、ＩＲ−Ａ：ＩＲ−ＢΔΔＣｔ＜約０．２である組織試料は、平均ＩＲ−Ａ：ＩＲ−ＢΔΔＣｔよりも高い値を有すると言うことができ、ＩＲ−Ａ発現の割合の平均値よりも高いことが示される。しかし、閾値を約−０．４、−０．６、−０．８、−１．０又は−１．２に設定することによって、信頼レベルが向上する。中間点（この例において約−０．７から−０．９のＩＲ−Ａ：ＩＲ−ＢΔΔＣｔ）付近に閾値を設定することにより、正しくない分類の数が最小限に抑えられる。言うまでもなく、熟練者は、より包括的に、またはより包括的でないように、分類のための必要性のバランスを取るために、平均値の間の範囲の何れかに閾値を調整し得る。従って、ＩＲ−Ａ：ＩＲ−ＢΔΔＣｔ差が、ＩＲ−Ｂに対するＩＲ−Ａの量が変化している乳房腫瘍組織と合致するものとして試料を分類するための閾値は、０．２から−１．８の範囲に設定され得、例えば９５％信頼区間に基づき、約０．４から約−１．５４の間に設定される。
【００９３】
別の例として、ＩＲ−Ａ及びＩＲ−Ｂの相対発現は、腫瘍サブタイプ、例えばｌｕｍｉｎａｌ Ａ及びｌｕｍｉｎａｌ Ｂ乳癌を分類するために使用され得る。例えば、正常、ｌｕｍｉｎａｌ Ａ及びｌｕｍｉｎａｌ ＢにおけるＩＲ−Ａ：ＩＲ−ＢΔＣｔ差を比較した。平均ＩＲ−Ａ：ＩＲ−ＢΔΔＣｔ±９５％ＣＩは、正常の場合０．２７±０．３０（ｎ＝１５）であった。ｌｕｍｉｎａｌ Ａに分類される乳癌では、平均ＩＲ−Ａ：ＩＲ−ＢΔΔＣｔ±９５％ＣＩは−１．０９±０．３４（ｎ＝１３）であった。ｌｕｍｉｎａｌ Ｂに分類される乳癌では平均ＩＲ−Ａ：ＩＲ−ＢΔΔＣｔ±９５％ＣＩは−２．１２±０．３４（ｎ＝２７）であった。全サブタイプのペアワイズ比較から、有意差が示される（２−試料ｔ検定、ｐ＜０．００１）。従って、正常とｌｕｍｉｎａｌ Ａ腫瘍組織との間のＩＲ−Ａ：ＩＲ−ＢΔΔＣｔ分類に対する閾値は、約０．３から−１．４の間の範囲、例えば約−０．２、約−０．４又は約−０．６に設定され得る。ｌｕｍｉｎａｌ Ａとｌｕｍｉｎａｌ Ｂ腫瘍組織との間のＩＲ−Ａ：ＩＲ−ＢΔΔＣｔ分類のための閾値は、約−１．１から約−２．１の範囲、例えば約−１．５から−１．７５の範囲又は約−１．５５、約−１．６、約−１．６５又は約−１．７に設定され得る。
【００９４】
ＧｅｎｅＣｈｉｐ発現プロファイルに基づき、正常、ｌｕｍｉｎａｌ−Ａ及びｌｕｍｉｎａｌ−Ｂに対する分類スキームを用いて、正常、ｌｕｍｉｎａｌ−Ａ及びｌｕｍｉｎａｌ−Ｂに分類された腫瘍試料におけるＩＲ−Ａ：ＩＲ−ＢΔＣｔ差を比較した。正常において、平均ＩＲ−Ａ：ＩＲ−ＢΔΔＣｔ±９５％ＣＩは０．３２±０．２５（ｎ＝１５）であった。ｌｕｍｉｎａｌ−Ａと予測される乳癌においては、平均ＩＲ−Ａ：ＩＲ−ＢΔΔＣｔ±９５％ＣＩは−１．０５±０．１９（ｎ＝１８）であった。ｌｕｍｉｎａｌ−Ｂと予測される乳癌において、平均ＩＲ−Ａ：ＩＲ−ＢΔΔＣｔ±９５％ＣＩは−２．４２±０．３２（ｎ＝２２）であった。このスキームによると、ｌｕｍｉｎａｌ Ａとｌｕｍｉｎａｌ Ｂ腫瘍組織との間のＩＲ−Ａ：ＩＲ−ＢΔΔＣｔ分類に対する閾値は、約−１．１から約−２．４の範囲、例えば約−１．４から−２．１の範囲又は約−１．４、約−１．６、約−１．７、約−１．８又は約−１．９に設定され得る。サブタイプ分類をさらに改良するために、ＩＲ−Ａ：ＩＲ−ＢΔΔＣｔを他の発現プロファイルと組み合わせることができる。
【００９５】
例えば増殖スコアを決定するために、特に他の癌増殖の予測因子と組み合わせて、癌増殖の予測因子として、組織中のＩＲ−Ａ及びＩＲ−Ｂの相対発現レベルを使用することができる。予測される増殖比率から、個々の癌の予後及び悪性度に対する有用な情報が提供され得る。上記データから、ＩＲ−ＡＴＲ−ＢΔＣｔ差と増殖スコアとの間の正相関が示される。このようにして、腫瘍組織をスコア化するための方法は、ＩＲ−Ａ及びＩＲ−Ｂ発現の相対的比率を調べることと、ＩＲ−Ａ及びＩＲ−Ｂの相対発現に少なくとも一部基づき、増殖スコアを割り当てることと、を含み得る。
【００９６】
これらの方法を用いた分類のための腫瘍試料は、肺、乳房、前立腺、結腸、卵巣、膵臓、脳、食道、子宮内膜、子宮頸部、消化管又は皮膚由来の試料を含むいずれの適切な腫瘍試料でもあり得る。腫瘍試料は、ＩＧＦ−Ｒ１／ＩＲ−Ａなどの細胞表面受容体を通じてのみ、又は一部それを通じて腫瘍活性が媒介される何れかの患者から採取することができる。例えば、腫瘍は、白血病、多発性骨髄腫又はリンパ腫などの非固形腫瘍であってもよいし、固形腫瘍、例えば胆管、骨、膀胱、脳／ＣＮＳ、乳房、結腸直腸、子宮頸部、子宮内膜、胃、頭頸部、肝臓、肺、筋肉、神経、食道、卵巣、膵臓、胸膜／腹膜、前立腺、腎臓、皮膚、精巣、甲状腺、子宮及び外陰部の腫瘍であってもよい。ある例において、腫瘍は、乳房の腫瘍である。別の例において、腫瘍は膀胱の腫瘍である。別の例において、腫瘍は肝臓の腫瘍である。
【００９７】
適切な腫瘍試料は当技術分野で公知のように調製することができる。例えば、針生検を介して生きている腫瘍細胞を得て、次いで標準的手順に従いインビトロで培養する。あるいは、吸引後に腫瘍細胞をすぐに固定するか又は腫瘍を（全体又は一部）を摘出し、免疫組織学的染色用に切片を調製し得る。
【００９８】
腫瘍細胞をインビトロで培養することにより、刺激後の内在化動態の測定が可能となり、一方で試料をすぐに固定すると、腫瘍内の受容体の静的な局在性をアッセイできる。
【００９９】
Ｆ．治療方法
ＩＧＦ−１受容体（ＩＧＦ−ＩＲ）経路は複雑であり、複数の因子が含まれる（図３参照）。ＩＧＦ−１Ｒは、インスリン受容体（ＩＮＳＲ）とハイブリッド受容体を形成することができ、実際に形成する。ＩＧＦリガンドであるＩＧＦ−Ｉ及びＩＧＦ−ＩＩは、最初にＩＧＦ−１Ｒと相互作用し、様々な細胞内シグナル伝達カスケードを活性化することによって、それらの様々な効果を発揮する。具体的には、ＩＧＦ−Ｉは、ＩＧＦ−ＩＲを活性化することによって主に機能し、一方でＩＧＦ−ＩＩはＩＧＦ−ＩＲを通じて又はＩＲ−Ａアイソフォームを通じての何れかで作用し得る。ＩＧＦ−１Ｒ、そのＩＧＦリガンド及びＩＲ−Ａは、乳癌及び前立腺癌の両方を含む多くの癌に関与しており、癌治療における使用のための多くのアンタゴニストが、ＩＧＦ−ＩＲ及びＩＧＦリガンドを標的とするために開発されている。
【０１００】
ＩＧＦ経路を標的とする現在利用可能な多数のアンタゴニストがあることを考えると、患者が反応する可能性があるか又は反応性が高いアンタゴニストの選択が所望される。例えば、ＩＧＦ−１Ｒアンタゴニストには、これらのアンタゴニストがＩＲ−Ａ経路を阻害しないという欠点がある。文献において、ＩＲ−Ａは、癌において過剰発現される場合、ＩＧＦ−１Ｒアンタゴニストに対する耐性に関与し得ることが示唆されていることを考えると、ＩＧＦ−１ＲだけではなくＩＲ−Ａも標的とするアンタゴニストを投与することが望ましい。このようなアンタゴニストの例は、特異的にＩＧＦ−ＩＩを標的とし、ＩＧＦ−Ｉと交差反応し得る抗体である。
【０１０１】
これらのＩＧＦ−Ｉ及びＩＩアンタゴニストは、ＩＧＦ−ＩＲ及びＩＲ−Ａシグナル伝達の両方に対する阻害能を有し、その結果、ＩＧＦ−１Ｒよりも臨床における活性が幅広く、低分子ＩＧＦ−１Ｒ／ＩＲ−Ａ／ＩＲ−Ｂ阻害剤と比較して毒性が低くなる。例としては、ＩＧＦ−Ｉ及び／又はＩＧＦ−ＩＩに対する抗体が挙げられるが、これには国際公開第２００７０７０４３２号で開示されるものが含まれる。特に関心が高いものは、ハイブリドーマ７．１５９．１、７．１５８．１及び７．３４．１により産生される抗体のアミノ酸配列を有する抗体である。
【０１０２】
特定のＩＧＦアンタゴニスト又はアゴニストに反応する可能性が高いことを予測するために、ＩＧＦアンタゴニスト又はアゴニストを用いた治療に対する候補となる患者を選択する方法は、上記方法の何れかを用いてＩＲ−Ａ及び／又はＩＲ−Ｂ発現を定量することと、正常対象に対して又は癌患者集団に対してＩＲ−Ａ及び／又はＩＲ−Ｂの発現量が上昇もしくは低下している患者を選択することと、を含み得る。患者は、ＩＲ−Ｂ発現に対するＩＲ−Ａの相対量の変化によっても選択され得る。
【０１０３】
具体例において、実施者は、腫瘍がＩＲ−Ａ及び／又はＩＲ−Ｂを発現するか否かの決定に基づいて、特定のＩＧＦアンタゴニストを予め選択し得る。ＩＲ−Ａを過剰発現すると決定されている腫瘍の特定によって、ＩＧＦＩ／ＩＩアンタゴニストに対する反応性が高い可能性が最も高い患者を選択する機会が与えられる。
【０１０４】
ある例において、アンタゴニストは、配列番号４５及び５３のアミノ酸配列を含むアミノ酸配列を含む抗体である。別の例において、アンタゴニストは、表１及び２で示されるように、配列番号４５及び５３のＣＤＲ配列を含む抗体である。別の例において、アンタゴニストは、配列番号４５からの３個のＣＤＲ及び軽鎖を含む抗体を含む。別の例において、アンタゴニストは、配列番号５３からの３個のＣＤＲ及び重鎖を含む抗体を含む。
【０１０５】
本方法はまた、ＩＧＦ−１Ｒ又はＩＧＦの特定の阻害剤がインスリン受容体を活性化させているか又は阻害しているかを判定するためにも使用することができる。例えば、ＩＧＦ−１Ｒキナーゼの低分子阻害剤はインスリン受容体を交差阻害することが多いことが知られている。これは代謝性合併症をもたらし得る。ある例において、腫瘍などの試料中のＩＲ−Ａ及び／又はＩＲ−Ｂの発現を決定し、それらの発現を対照と比較する方法である。対照と比較してＩＲ−Ｂの発現が低下しており、ＩＲ−Ａの発現が対照と比較して上昇している場合、ＩＧＦ−Ｉ／ＩＩアンタゴニストなどの代替となるＩＧＦアンタゴニストを選択することが必要となり得る。このように、患者を治療する方法は、例えば患者からの組織試料に対してＩＲ−Ａ：ＩＲ−ＢΔＣｔ差を調べることによってＩＲ−Ａ及びＩＲ−Ｂの相対発現をけっていすることと、ＩＲ−Ｂに対するＩＲ−Ａの割合が閾値よりも低い場合にＩＧＦ−Ｉ／ＩＩアンタゴニストを投与することと、を含み得る。
【０１０６】
別の例において、ある方法により癌患者のサブセットの分類が可能になる。現在、ＩＲ−Ａが乳癌において過剰発現され得ることが知られている。治療のために患者のサブセットを選択する方法は、ＩＲ−Ａを過剰発現するか又はＩＲ−Ｂに対してＩＲ−Ａを不均衡に発現し、従ってＩＧＦＩ／ＩＩアンタゴニストに対する応答が高くなっている可能性がある乳癌患者のサブセットを特定することを含み得る。ＩＧＦＩ／ＩＩアンタゴニストに対する応答が高い可能性がある癌患者を治療する方法は、腫瘍組織試料に対してＩＲ−Ａ：ＩＲ−ＢΔＣｔ差を測定することと、腫瘍組織試料のＩＲ−Ａ：ＩＲ−ＢΔＣｔ差が閾値よりも低く、正常よりも高いＩＲ−ＡのＩＲ−Ｂに対する割合を示す場合に、有効量のＩＧＦＩ／ＩＩアンタゴニストを投与することと、を含み得る。アンタゴニストの例には、ＩＧＦ−Ｉ及び／又はＩＧＦ−ＩＩに結合する抗体が含まれる。ある例において、アンタゴニストは、配列番号４５及び５３のアミノ酸配列を含むアミノ酸配列を含む抗体である。別の例において、アンタゴニストは、表１及び２で示されるように、配列番号４５及び５３のＣＤＲ配列を含む抗体である。別の例において、アンタゴニストは、配列番号４５からの３個のＣＤＲ及び軽鎖を含む抗体を含む。別の例において、アンタゴニストは、配列番号５３からの３個のＣＤＲ及び重鎖を含む抗体を含む。
【０１０７】
応答性が高い又は応答者とは、特定のＩＧＦ剤の投与後に反応するか又はより正の方向に反応する患者を意味する。応答者及び無応答者は、Ｕｎｉｏｎ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｎｔｒｅ ｌｅ Ｃａｎｃｅｒ／Ｗｏｒｌｄ Ｈｅａｌｔｈ Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ（Ｕ ＩＣＣ／ＷＨＯ）基準に従い、客観的腫瘍反応を測定することによって決定することができる。基準は以下のようにカテゴリー分けされる：完全寛解（ＣＲ）：評価可能な全病変部で遺残腫瘍なし；部分寛解（ＰＲ）：測定可能な全病変部の合計のベースラインのもと、遺残腫瘍が化学療法により５０％以上縮小し、新たな病変なし；安定疾患（ＳＤ）：ＣＲとして判定されない遺残腫瘍；及び進行性疾患（ＰＤ）：測定可能な全病変部の合計のベースラインのもと、遺残腫瘍が２５％以上増大しているか又は新たな病変が出現。本明細書中で定義されるように、無応答者はＰＤである。本方法は、ＣＲ又はＰＲである患者を判定するために特に有効である。このようにして、本方法により、個々の患者に治療を適合させ、利用可能なＩＧＦアンタゴニストのタイプの使用をより有効にすることによって、癌患者の予後及びクオリティーオブライフが改善される。
【０１０８】
Ｇ．糖尿病
インスリン受容体を介してシグナル伝達を破壊及び／又は低下させる物質／化合物に対するスクリーニングのための方法。試料中のＩＲ−Ａ又はＩＲ−Ｂの相対的発現を決定することをスクリーニングツールとして使用して、例えばβ細胞において及び末梢組織において、ＩＲ−Ａ又はＩＲ−Ｂ−特異的シグナル伝達カスケードの何れかを選択的に活性化する、低分子化合物及び／又はインスリン模倣体などの薬剤を同定することができる。古典的なインスリン標的組織における顕著なＩＲ−Ｂの発現は、これらの組織におけるＩＲ−Ｂシグナル伝達カスケードの重要性を示す。その結果、ＩＲ−Ｂシグナル伝達カスケードを選択的に刺激する化合物は、β細胞の機能（グルコース応答性及び、従ってインスリン分泌）ならびに末梢インスリン標的組織の機能（グルコース取り込み及び利用、タンパク質合成、脂質合成）を向上させ、従ってインスリン非依存性糖尿病（ＮＩＤＤＭ、２型糖尿病）の２つの主要な原因、即ち末梢インスリン抵抗性及びβ細胞機能不全を対象にする治療を提供する可能性がある。
【０１０９】
このように、インスリンシグナル伝達を調節する薬剤を同定する方法は、試験薬剤と細胞を接触させることと、その試験薬剤によってＩＲ−Ｂ発現が上昇するか又は低下するか否かを決定することと、が含まれる。ＩＲ−Ｂ発現を上昇させる薬剤の同定は、２型糖尿病を治療することにおいてその薬剤が有用であり得ることの指標となる。
【０１１０】
Ｈ．キット
生体試料中のＩＲ−Ａ又はＩＲ−Ｂの存在を検出するためのキットは、ＩＲ−Ａ及び／又はＩＲ−Ｂプローブ又はプライマーを含み得る。本明細書中に記載の方法における使用のための材料は、キットの調製のために理想的に適している。例えば、キットは、腫瘍試料中のＩＲ−Ａ又はＩＲ−Ｂを検出することが可能な、本明細書中で開示されるような核酸配列と；対照試料と；細胞表面受容体の検出方法に関する説明書と、を含み得る。このようなキットは、例えば緩衝液、適切なヌクレオチド三リン酸（例えば、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰ；又はｒＡＴＰ、ｒＣＴＰ、ｒＧＴＰ及びＵＴＰ）、逆転写酵素、ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼ及び１以上のオリゴヌクレオチドを含む、本方法で使用される、それぞれ１以上の様々な試薬（通常は濃縮形態）入りの容器を含み得る。
【０１１１】
容器中のオリゴヌクレオチドはいかなる形態、例えば、凍結乾燥形態又は溶液形態（例えば、蒸留水又は緩衝溶液）などでもあり得る。同じ増幅反応で即時使用できるオリゴヌクレオチドを１つの容器中で組み合わせてもよいし、個別の容器中に入れてもよい。本キットは、場合によっては、別個の容器中で、ＲＮＡポリメラーゼプロモーターに特異的なＲＮＡポリメラーゼ及び／又はＰＣＲ用の緩衝液及び／又はＤＮＡポリメラーゼをさらに含む。本キットは、場合によっては対照核酸をさらに含む。通常は一連の説明書も含まれる。
【０１１２】
本明細書中で開示される方法は、別段の指示がない限り、当業者の能力の範囲内である、化学、分子生物学、微生物学、組み換えＤＮＡ及び免疫学の従来技術を使用する。このような技術は、文献で説明されている。例えば、Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｔｓｃｈ及びＴ．Ｍａｎｉａｔｉｓ，１９８９，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，第２版，１−３巻，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ら（１９９５及びｐｅｒｉｏｄｉｃ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｓ；Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，第９，１３及び１６章，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．）；Ｂ．Ｒｏｅ、Ｊ．Ｃｒａｂｔｒｅｅ及びＡ．Ｋａｈｎ、１９９６、ＤＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ：Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ；Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ（Ｅｄｉｔｏｒ），１９８４，Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ、Ｉｒｌ Ｐｒｅｓｓ；及びＤ．Ｍ．Ｊ．Ｌｉｌｌｅｙ及びＪ．Ｅ．Ｄａｈｌｂｅｒｇ，１９９２，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ：ＤＮＡ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ Ｐａｒｔ Ａ：Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ及びＰｈｙｓｉｃａｌ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ＤＮＡ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓを参照のこと。これらの各一般的教科書はそれらの全体において参照により本明細書中に組み込まれる。
【実施例】
【０１１３】
以下の実施例は、本明細書中に記載の方法を実施するにあたり当業者の一助となるものであり、本開示の範囲を何ら限定するものではない。
【０１１４】
Ｉ．代表的な具体例
以下の実施態様のリストは代表的なものであり、本開示の範囲を何ら限定するものではない。
【０１１５】
１．合成核酸配列が以下の配列の何れか１つの少なくとも１０から２０個の連続ヌクレオチドを含む、１０から３０個の連続ヌクレオチドを含む合成核酸：
（ｉ）配列番号３、それに相補的な配列又はストリンジェントな条件下で配列番号３もしくはその相補体とハイブリッド形成可能である配列；
（ｉｉ）配列番号４、それに相補的な配列（配列番号２１）又はストリンジェントな条件下で配列番号４もしくはその相補体とハイブリッド形成可能である配列；
（ｉｉｉ）配列番号５、それに相補的な配列又はストリンジェントな条件下で配列番号５もしくはその相補体とハイブリッド形成可能である配列；又は
（ｉｖ）配列番号６、それに相補的な配列（配列番号２２）又はストリンジェントな条件下で配列番号６もしくはその相補体とハイブリッド形成可能である配列。
【０１１６】
２．以下の核酸配列の何れか１つから基本的に構成される合成核酸配列：
（ｉ）配列番号３、それに相補的な配列又はストリンジェントな条件下で配列番号３もしくはその相補体とハイブリッド形成可能である配列；
（ｉｉ）配列番号４、それに相補的な配列（配列番号２１）又はストリンジェントな条件下で配列番号４もしくはその相補体とハイブリッド形成可能である配列；
（ｉｉｉ）配列番号５、それに相補的な配列又はストリンジェントな条件下で配列番号５もしくはその相補体とハイブリッド形成可能である配列；又は
（ｉｖ）配列番号６、それに相補的な配列（配列番号２２）又はストリンジェントな条件下で配列番号６もしくはその相補体とハイブリッド形成可能である配列。
【０１１７】
３．配列番号７、それに相補的な配列又はストリンジェントな条件下で配列番号７もしくはその相補体とハイブリッド形成可能である配列から基本的に構成される合成核酸配列。
【０１１８】
４．配列番号８、それに相補的な配列又はストリンジェントな条件下で配列番号８もしくはその相補体とハイブリッド形成可能である配列から基本的に構成される合成核酸配列。
【０１１９】
５．実施態様１−４の何れか１つに記載の合成核酸配列を含む組成物。
【０１２０】
６．（ａ）ＩＮＳＲ遺伝子のエクソン１０の最後の５０塩基（配列番号１）、それに相補的な配列又はストリンジェントな条件下で配列番号１もしくはその相補体とハイブリッド形成可能である配列の、１０から３０個の連続ヌクレオチドを含む合成核酸配列と；
（ｂ）ＩＮＳＲ遺伝子のエクソン１２の最初の６０塩基（配列番号２）、それに相補的な配列又はストリンジェントな条件下で配列番号２もしくはその相補体とハイブリッド形成可能である配列の、１０から３０個の連続ヌクレオチドを含む合成核酸配列と、
を含む、生体試料中のＩＲ−Ａ核酸配列を検出及び／又は定量するためのプライマーセット。
【０１２１】
７．少なくとも１つの合成核酸配列が、
配列番号３、それに相補的な配列又はストリンジェントな条件下で配列番号３もしくはその相補体とハイブリッド形成可能である配列；
配列番号２１、それに相補的な配列又はストリンジェントな条件下で配列番号２１もしくはその相補体とハイブリッド形成可能である配列；
配列番号５、それに相補的な配列又はストリンジェントな条件下で配列番号５もしくはその相補体とハイブリッド形成可能である配列；及び
配列番号２２、それに相補的な配列又はストリンジェントな条件下で配列番号２２もしくはその相補体とハイブリッド形成可能である配列
の中から選択されるヌクレオチド配列を有する、実施態様６に記載のプライマーセット。
【０１２２】
８．（ａ）ポリメラーゼによる増幅に適切な条件下で実施態様６に記載のプライマーセットと生体試料又は生体試料から調製された核酸を接触させる工程；
（ｂ）増幅された対象とするＩＲ−Ａ核酸配列を検出及び／又は定量する工程
を含む、生体試料中のＩＲ−Ａ核酸配列を検出及び／又は定量するための方法。
【０１２３】
９．生体試料が腫瘍試料から調製される、実施態様８に記載の方法。
【０１２４】
１０．プライマーセットが、配列番号３、それに相補的な配列又はストリンジェントな条件下で配列番号３もしくはその相補体とハイブリッド形成可能である配列と、配列番号２１、それに相補的な配列又はストリンジェントな条件下で配列番号２１もしくはその相補体とハイブリッド形成可能である配列と、を含む、実施態様８から９の何れか１つに記載の方法。
【０１２５】
１１．プライマーセットが、配列番号５、それに相補的な配列又はストリンジェントな条件下で配列番号５もしくはその相補体とハイブリッド形成可能である配列と、配列番号２２、それに相補的な配列又はストリンジェントな条件下で配列番号２２もしくはその相補体とハイブリッド形成可能である配列と、を含む、実施態様８に記載の方法。
【０１２６】
１２．前記ポリメラーゼによる増幅が定量的ポリメラーゼ連鎖反応である、実施態様８から１１の何れかに記載の方法。
【０１２７】
１３．プライマーセットが、
配列番号３、それに相補的な配列又はストリンジェントな条件下で配列番号３もしくはその相補体とハイブリッド形成可能である配列と；
配列番号２１、それに相補的な配列又はストリンジェントな条件下で配列番号２１もしくはその相補体とハイブリッド形成可能である配列と；
検出可能な標識も有する、配列番号７、それに相補的な配列又はストリンジェントな条件下で配列番号７もしくはその相補体とハイブリッド形成可能である配列と、
を含む、実施態様１２に記載の方法。
【０１２８】
１４．プライマーセットが、
配列番号５、それに相補的な配列又はストリンジェントな条件下で配列番号５もしくはその相補体とハイブリッド形成可能である配列と；
配列番号２２、それに相補的な配列又はストリンジェントな条件下で配列番号２２もしくはその相補体とハイブリッド形成可能である配列と；
検出可能な標識も有する、配列番号８、それに相補的な配列又はストリンジェントな条件下で配列番号８もしくはその相補体とハイブリッド形成可能である配列と、
を含む、実施態様１２に記載の方法。
【０１２９】
１５．増幅産物が１００塩基未満である、実施態様８から１４の何れかに記載の方法。
【０１３０】
１６．合成核酸配列が、以下の配列の何れか１つの少なくとも１０から２０個の連続ヌクレオチドを含む、１０から３０個の連続ヌクレオチドを含む合成核酸：
（ｉ）配列番号１１、それに相補的な配列又はストリンジェントな条件下で配列番号１１もしくはその相補体とハイブリッド形成可能である配列；又は
（ｉｉ）配列番号１２、それに相補的な配列又はストリンジェントな条件下で配列番号１２もしくはその相補体とハイブリッド形成可能である配列。
【０１３１】
１７．以下の核酸配列の何れか１つから基本的に構成される合成核酸：
（ｉ）配列番号１１、それに相補的な配列又はストリンジェントな条件下で配列番号１１もしくはその相補体とハイブリッド形成可能である配列；又は
（ｉｉ）配列番号１２、それに相補的な配列又はストリンジェントな条件下で配列番号１２もしくはその相補体とハイブリッド形成可能である配列。
【０１３２】
１８．配列番号１３、それに相補的な配列又はストリンジェントな条件下で配列番号１３もしくはその相補体とハイブリッド形成可能である配列から基本的に構成される合成核酸配列。
【０１３３】
１９．配列番号１４、それに相補的な配列又はストリンジェントな条件下で配列番号１４もしくはその相補体とハイブリッド形成可能である配列から基本的に構成される合成核酸配列。
【０１３４】
２０．配列番号１５、それに相補的な配列又はストリンジェントな条件下で配列番号１５もしくはその相補体とハイブリッド形成可能である配列から基本的に構成される合成核酸配列。
【０１３５】
２１．実施態様１−４及び１６−２０の何れか１つに記載の合成核酸配列を含む組成物。
【０１３６】
２２．（ａ）（ｉ）ＩＮＳＲ遺伝子のエクソン１０の最後の５０塩基（配列番号１）、それに相補的な配列又はストリンジェントな条件下で配列番号１もしくはその相補体とハイブリッド形成可能である配列の、１０から３０個の連続ヌクレオチドを含む合成核酸配列、
（ａ）（ｉｉ）ＩＮＳＲ遺伝子のエクソン１１（配列番号９）、それに相補的な配列又はストリンジェントな条件下で配列番号９もしくはその相補体とハイブリッド形成可能である配列の、１０から３０個の連続ヌクレオチドを含む合成核酸配列；又は
（ａ）（ｉｉｉ）エクソン１０及び１１を架橋する塩基、それに相補的な配列又はストリンジェントな条件下でそれともしくはその相補体とハイブリッド形成可能である配列の、１０から３０個の連続ヌクレオチドを含む合成核酸配列；と、
（ｂ）ＩＮＳＲ遺伝子のエクソン１２の最初の５０塩基（配列番号１０）、それに相補的な配列又はストリンジェントな条件下で配列番号１０もしくはその相補体とハイブリッド形成可能である配列又はそれに相補的な配列の、１０から３０個の連続ヌクレオチドを含む合成核酸配列と、
を含む、生体試料中のＩＲ−Ｂ核酸配列を検出及び／又は定量するためのプライマーセット。
【０１３７】
２３．少なくとも１つの合成核酸配列が、
配列番号１１、それに相補的な配列又はストリンジェントな条件下で配列番号１１もしくはその相補体とハイブリッド形成可能である配列；及び
配列番号１２、それに相補的な配列又はストリンジェントな条件下で配列番号１２もしくはその相補体とハイブリッド形成可能である配列
の中から選択されるヌクレオチド配列を有する、実施態様２２に記載のプライマーセット。
【０１３８】
２４．（ａ）ポリメラーゼによる増幅に適切な条件下で実施態様２２又は２３に記載のプライマーセットと生体試料又は生体試料から調製された核酸を接触させる工程；
（ｂ）増幅された標的ＩＲ−Ｂ核酸配列を検出及び／又は定量する工程
を含む、生体試料中のＩＲ−Ｂ核酸を検出及び／又は定量するための方法。
【０１３９】
２５．生体試料が腫瘍試料である、実施態様２４に記載の方法。
【０１４０】
２４．プライマーセットが：
配列番号１１、それに相補的な配列又はストリンジェントな条件下で配列番号１１もしくはその相補体とハイブリッド形成可能である配列と；
配列番号１２、それに相補的な配列又はストリンジェントな条件下で配列番号１２もしくはその相補体とハイブリッド形成可能である配列と、
を含む、実施態様２４に記載の方法。
【０１４１】
２５．前記ポリメラーゼによる増幅が定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ｑ−ＰＣＲ）である、実施態様２４に記載の方法。
【０１４２】
２６．プライマーセットが：
配列番号１１、それに相補的な配列又はストリンジェントな条件下で配列番号１１もしくはその相補体とハイブリッド形成可能である配列と；
配列番号１２、それに相補的な配列又はストリンジェントな条件下で配列番号１２もしくはその相補体とハイブリッド形成可能である配列と；
検出可能な標識も有する、配列番号１３、それに相補的な配列又はストリンジェントな条件下で配列番号１３もしくはその相補体とハイブリッド形成可能である配列と、
を含む、実施態様２５に記載の方法。
【０１４３】
２７．プライマーセットが：
配列番号１１、それに相補的な配列又はストリンジェントな条件下で配列番号１１もしくはその相補体とハイブリッド形成可能である配列と；
配列番号１２、それに相補的な配列又はストリンジェントな条件下で配列番号１２もしくはその相補体とハイブリッド形成可能である配列と；
検出可能な標識も有する、配列番号１４、それに相補的な配列又はストリンジェントな条件下で配列番号１４もしくはその相補体とハイブリッド形成可能である配列と、
を含む、実施態様２５に記載の方法。
【０１４４】
２８．プライマーセットが；
配列番号１１、それに相補的な配列又はストリンジェントな条件下で配列番号１１もしくはその相補体とハイブリッド形成可能である配列；
配列番号１２、それに相補的な配列又はストリンジェントな条件下で配列番号１２もしくはその相補体とハイブリッド形成可能である配列を含み、さらに、
検出可能な標識も有する、配列番号１５、それに相補的な配列又はストリンジェントな条件下で配列番号１５もしくはその相補体とハイブリッド形成可能である配列を含む、実施態様２５に記載の方法。
【０１４５】
２９．増幅産物が１００塩基未満である、実施態様２４から２８の何れかに記載の方法。
【０１４６】
３０．ポリメラーゼによる増幅に適切な条件下で生体試料中のＩＲ−Ａ核酸配列を検出及び／又は定量するためのプライマーセットと生体試料又は生体試料から調製された核酸の試料を接触させること（この場合、プライマーセットは実施態様６に記載のプライマーセットを含む）及び／又はポリメラーゼによる増幅に適切な条件下で生体試料中のＩＲ−Ｂ核酸配列を検出及び／又は定量するためのプライマーセットと生体試料又は生体試料から調製された核酸の試料を接触させることと（この場合、プライマーセットは実施態様２２に記載のプライマーセットを含む）、
増幅された標的ＩＲ−Ａ又はＩＲ−Ｂ核酸配列を検出及び／又は定量することと、
を含む、生体試料中の標的ＩＲ−Ａ核酸配列及び／又は標的ＩＲ−Ｂ核酸配列の有無を決定するための方法。
【０１４７】
３１．実施態様１から１５の何れかに記載の少なくとも１つの合成核酸配列と使用説明書とを含む、生体試料中のＩＲ−Ａの有無を決定するためのキット。
【０１４８】
３２．少なくとも１つの合成核酸配列が、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、該配列の１つに相補的な配列又はストリンジェントな条件下で該配列の１つもしくはその相補体とハイブリッド形成可能な配列の中から選択されるヌクレオチド配列を有する、実施態様３１に記載のキット。
【０１４９】
３３．合成核酸配列が以下のプライマーセットの中から選択される、実施態様３１に記載のキット：
（１）配列番号３、それに相補的な配列又はストリンジェントな条件下で配列番号３もしくはその相補体とハイブリッド形成可能である配列；
配列番号２１、それに相補的な配列又はストリンジェントな条件下で配列番号２１もしくはその相補体とハイブリッド形成可能である配列；及び
検出可能な標識も有する、配列番号７、それに相補的な配列又はストリンジェントな条件下で配列番号７もしくはその相補体とハイブリッド形成可能である配列；又は
（２）配列番号５、それに相補的な配列又はストリンジェントな条件下で配列番号５もしくはその相補体とハイブリッド形成可能である配列；
配列番号２２、それに相補的な配列又はストリンジェントな条件下で配列番号２２もしくはその相補体とハイブリッド形成可能である配列；及び
検出可能な標識も有する、配列番号８、それに相補的な配列又はストリンジェントな条件下で配列番号８もしくはその相補体とハイブリッド形成可能である配列。
【０１５０】
３４．適切なＰＣＲ試薬と；場合によっては、ＩＲ−Ａの有無を決定するための陽性及び／又は陰性対照と、をさらに含む、実施態様３１に記載のキット。
【０１５１】
３５．実施態様１６−２３の何れかに記載の少なくとも１つの合成核酸配列と使用説明書とを含む、生体試料中のＩＲ−Ｂの有無を決定するためのキット。
【０１５２】
３６．合成核酸配列が、配列番号１１、配列番号１２、該配列の何れかと相補的な配列又はストリンジェントな条件下で該配列の何れかもしくはその相補体とハイブリッド形成可能である配列の中から選択されるヌクレオチド配列を有する、実施態様３５に記載のキット。
【０１５３】
３７．合成核酸配列が以下のプライマーセットから選択される、実施態様３５に記載のキット：
（１）配列番号１１、それに相補的な配列又はストリンジェントな条件下で配列番号１１もしくはその相補体とハイブリッド形成可能である配列と；
配列番号１２、それに相補的な配列又はストリンジェントな条件下で配列番号１２もしくはその相補体とハイブリッド形成可能である配列と；
検出可能な標識を有する、配列番号１３、それに相補的な配列又はストリンジェントな条件下で配列番号１３もしくはその相補体とハイブリッド形成可能である配列；または
（２）配列番号１１、それに相補的な配列又はストリンジェントな条件下で配列番号１１もしくはその相補体とハイブリッド形成可能である配列と；
配列番号１２、それに相補的な配列又はストリンジェントな条件下で配列番号１２もしくはその相補体とハイブリッド形成可能である配列と；
検出可能な標識を有する配列番号１４；又は
（３）配列番号１１、それに相補的な配列又はストリンジェントな条件下で配列番号１１もしくはその相補体とハイブリッド形成可能である配列と；
配列番号１２、それに相補的な配列又はストリンジェントな条件下で配列番号１２もしくはその相補体とハイブリッド形成可能である配列と；
検出可能な標識も有する、配列番号１５、それに相補的な配列又はストリンジェントな条件下で配列番号１５もしくはその相補体とハイブリッド形成可能である配列。
【０１５４】
３８．適切なＰＣＲ試薬と；場合によっては、ＩＲ−Ｂの有無を決定するための陽性及び／又は陰性対照と、をさらに含む、実施態様３５に記載のキット。
【０１５５】
３９．実施態様８に従い、試料中のＩＲ−Ａ発現を検出及び／又は定量することと、
実施態様２４に従い、試料中のＩＲ−Ｂ発現を検出及び／又は定量することと、を含み、
ＩＲ−Ａ及びＩＲ−Ｂの発現が、ＩＧＦＩ／ＩＩリガンド又はＩＧＦＩＲ受容体アンタゴニストを対象に投与するべきか否かの指標である、ＩＧＦＩ／ＩＩリガンド又はＩＧＦＲ１受容体アンタゴニストに応答性のある患者を選択するための方法。
【０１５６】
４０．ＩＧＦＩ／ＩＩリガンド又はＩＧＦＲ１受容体アンタゴニストが抗体である、実施態様３９に記載の方法。
【０１５７】
４１．抗体が、表１及び表２に列挙される配列成分を含む、実施態様４０に記載の方法。
【０１５８】
４２．ポリメラーゼによる増幅に適切な条件下で、実施態様６に記載のプライマーセットと生体試料又は生体試料から調製された核酸を接触させることと、
ポリメラーゼによる増幅に適切な条件下で、実施態様２２に記載のプライマーセットと生体試料又は生体試料から調製された核酸を接触させることと；
増幅されたＩＲ−Ａ及びＩＲ−Ｂ核酸配列を定量することと；
それによって生体試料中のＩＲ−Ｂに対するＩＲ−Ａの相対発現を判定することと、
を含む、生体試料中の標的ＩＲ−Ａ核酸配列及びＩＲ−Ｂ核酸配列の相対的な有無を決定するための方法。
【０１５９】
４３．実施態様４２に記載の方法によって腫瘍試料中のＩＲ−Ｂに対するＩＲ−Ａの相対発現を決定することと、
ＩＲ−Ａ及びＩＲ−Ｂの相対発現を含む基準により腫瘍を分類することと、
を含む、腫瘍を分類する方法。
【０１６０】
４４．実施態様４２に記載の方法によって患者の組織中のＩＲ−Ｂに対するＩＲ−Ａの相対発現を決定することと、
ＩＲ−Ａ及びＩＲ−Ｂの相対発現を含む基準により患者を分類し、それによりＩＧＦアンタゴニストに対する患者の相対的な応答性を予測することと、
を含む、ＩＧＦアンタゴニストで治療するための患者を選択する方法。
【０１６１】
４５．ＩＲ−Ａの発現がＩＲ−Ｂに対して上昇している、実施態様３９、４３及び４４の何れかに記載の方法。
【０１６２】
４６．実施態様４２に記載の方法によって組織試料中のＩＲ−Ｂに対するＩＲ−Ａの相対発現を決定することと、
ＩＲ−Ａ及びＩＲ−Ｂの相対発現を含む基準によって患者を分類することと；
該分類に従いＩＧＦアンタゴニストを投与することと、
を含む、ＩＧＦアンタゴニストを用いて患者を治療する方法。
【０１６３】
４７．ＩＲ−Ａの発現がＩＲ−Ｂと比較して上昇している、実施態様４６に記載の方法。
【０１６４】
４８．ＩＧＦアンタゴニストが抗体である、実施態様４４又は４７に記載の方法。
【０１６５】
４９．抗体が、配列番号４５及び５３のアミノ酸配列を含むアミノ酸配列を含む、実施態様４０、４１及び４８に記載の方法。
【０１６６】
５０．抗体が、表１及び２で示されるような配列番号４５及び５３のＣＤＲ配列を含む、実施態様４０、４１及び４８の何れかに記載の方法。
【０１６７】
５１．抗体が、配列番号４５からの３個のＣＤＲ及び軽鎖を含む、実施態様４０、４１及び４８に記載の方法。
【０１６８】
５２．抗体が配列番号５３からの３個のＣＤＲ及び重鎖を含む、実施態様４０、４１及び４８の何れかに記載の方法。
【０１６９】
５３．総インスリン受容体に対するＩＲ−Ａの％が４６．６％より大きい、実施態様４５及び４７の何れかに記載の方法。
【０１７０】
５４．ＩＲＡ：ＩＲ−ＢΔΔＣｔが約０．２未満である、実施態様４５及び４７の何れかに記載の方法。
【０１７１】
５５．ＩＲ−Ａに対するｌｏｇ２ベースのスケールでの相対量の差の平均が、約−０．０７±０．２９であり、ＩＲ−Ｂに対して約−２．０８±０．２５である、実施態様４５及び４７の何れかに記載の方法。
【０１７２】
５６．実施態様４２に記載の方法によって乳癌腫瘍試料中のＩＲ−Ｂに対するＩＲ−Ａの相対的発現を判定することと；ＩＲ−Ａ：ＩＲ−Ｂ比が閾値よりも低い場合にｌｕｍｉｎａｌ Ｂとして乳癌サブタイプを分類することと、を含む、乳癌腫瘍サブタイプを分類する方法。
【０１７３】
５７．ＩＲ−Ａ：ＩＲ−ＢΔΔＣｔを計算することをさらに含み、閾値が、約−１．１から約−２．４の範囲に設定されるＩＲ−Ａ：ＩＲ−ＢΔΔＣｔ値である、実施態様５６に記載の方法。
【０１７４】
５８．閾値が約−１．４から−２．１の範囲である、実施態様５４に記載の方法。
【０１７５】
５９．ＩＲ−Ａ：ＩＲ−ＢΔΔＣｔの決定が、サブタイプ分類を決定することにおいて他の発現プロファイルと組み合わせられ得る、実施態様５７に記載の方法。
【０１７６】
６０．実施態様４２に記載の方法により、腫瘍試料中のＩＲ−Ｂに対するＩＲ−Ａの相対発現を決定することと、より高いＩＲ−Ａ：ＩＲ−Ｂ比がより高い増殖スコアを示す因子であるとみなすことと、を含む、腫瘍に対する増殖スコアを決定する方法。
【０１７７】
６１．ＩＲ−Ａ：ＩＲ−ＢΔΔＣｔを計算することと、より低いＩＲ−Ａ：ＩＲ−ＢΔΔＣｔ値が、より高い増殖スコアを示す因子であるとみなすことと、をさらに含む、実施態様６０に記載の方法。
【０１７８】
６２．試料中のＩＲ−Ａ及びＩＲ−Ｂの相対レベルを決定することを含み、ＩＲ−Ｂに対するＩＲ−Ａの量の上昇が、ｌｕｍｉｎａｌ−Ｂである腫瘍の指標となる、ｌｕｍｉｎａｌ−Ａ又はｌｕｍｉｎａｌ−Ｂとして乳癌試料を分類する方法。
【０１７９】
ＩＩ．実施例
実施例１：ＩＲ−Ａ及びＩＲ−Ｂプライマー及びプローブ設計
市販のアッセイは、ＩＲ−Ａ及びＩＲ−Ｂ発現を区別し、定量することができなかった。そこで、新規プローブが必要であった。インスリン受容体（ＩＮＳＲ）短（ＮＭ＿００１０７９８１７）及び長（ＮＭ＿０００２０８）アイソフォームに対する成熟ｍＲＮＡ転写配列をＮａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）Ｅｎｔｒｅｚ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅデータベースから入手した。ＩＮＳＲ短アイソフォームをＩＲ−Ａと呼び、ＩＮＳＲ長アイソフォームをＩＲ−Ｂと呼ぶ。この２つのアイソフォーム間の違いは、成熟転写物におけるエクソン１１、３６ヌクレオチド領域が存在するか（ＩＲ−Ｂ）又は存在しないか（ＩＲ−Ａ）である。エクソン１１はＩＲ−Ａ型には存在しないが、ＩＲ−Ｂ型は成熟ｍＲＮＡ転写物においてエクソン１１配列を含有する。ＩＲ−Ａ ｍＲＮＡの検出に特異的であるプライマー及びプローブの設計のために、エクソン１０／１２連結領域を遺伝子特異的プローブに対する標的とした。エクソン１０又はエクソン１２コード領域内にそれぞれ位置するいくつかのプライマー対（フォワード及びリバース）を設計した。ＩＲ−Ｂ設計の場合、エクソン１１／１２連結部を標的とし、遺伝子特異的プローブに対してはエクソン１１内部領域を標的とした。エクソン１０内又はエクソン１０／１１連結部及びエクソン１２コード領域にそれぞれ位置するいくつかのプライマー対（フォワード及びリバース）を設計した。プライマー／プローブ設計は全てＰｒｉｍｅｒ Ｅｘｐｒｅｓｓ（ＡＢＩ）ソフトウェアツールにインポートし、確実にＴａｑＭａｎ遺伝子発現アッセイ法における利用に最適な設計となるようにした。プローブは全て、小溝結合（ＭＧＢ）部分を取り込むように設計し、検出用の蛍光色素（ＦＡＭ）及び非蛍光クエンチャーで標識した。設計した全プライマー／プローブの組み合わせの配列を表３及び４に示す。
【表３】
【表４】
【０１８０】
実施例２：プライマー及びプローブの特異性
ＩＮＳＲ長（クローンＳＣ３１１３２８）及び短（クローンＳＣ３１５８８０）転写物に対する全長ｃＤＮＡクローンを含有する市販のプラスミドをＯｒｉＧｅｎｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｉｎｃ．から購入した。各ＩＮＳＲクローンの配列確認を行った。様々な複製数（１０２〜１０７複製）の投入量のＩＮＳＲ長又は短アイソフォームクローンの何れかの存在下で、全ＴａｑＭａｎ遺伝子発現アッセイ設計の特異性及び感度を試験した。全プライマー／プローブ及び鋳型の組み合わせに対して３８４ウェル形式で標準的なＴａｑＭａｎ遺伝子発現アッセイを行った。反応液は、３８４ウェルプレートの最終体積１５μＬ／ウェルに対して、７．５μＬのＴａｑＭａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ、１．５μＬの１０ｘ遺伝子発現アッセイ混合液及び６μＬの様々な複製数のＩＮＳＲ長又は短型ｃＤＮＡクローンの何れかから構成されていた。各プライマー／プローブ及び鋳型の組み合わせを少なくとも３回繰り返した。標準設定（９５℃で１０分間温置し、続いて９５℃で１５秒間及び６０℃で１分間を４０サイクルという構成のサイクリングプログラム）を用いて、全アッセイプレートをＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ７９００ＨＴ検出システムで試験した。ＳＤＳｖ２．０ソフトウェアツール（ＡＢＩ）を用いてデータ値（Ｃｔ値）を各回のアッセイの実行から抽出した。データ抽出及び分析後、以下のプライマー及びプローブアッセイ設計によって発明者らの目的に対して十分な感度及び特異性が得られると決定した：ＩＲ−Ａ１、ＩＲ−Ａ３、ＩＲ−Ｂ３、ＩＲ−Ｂ４及びＩＲ−Ｂ５。
【０１８１】
ＩＲ−Ａ１及びＩＲ−Ａ３アッセイは、約３５コピーの複製数閾値でＩＲ−Ａアイソフォーム配列を検出することができた。これらのアッセイはまた、これらが利用された何れの複製数投入量でもＩＲ−Ｂアイソフォームの存在を検出できなかったことから、ＩＲ−Ａアイソフォームに非常に特異的であることも分かった。あるいは、ＩＲ−Ｂ３、ＩＲ−Ｂ４及びＩＲ−Ｂ５設計は、約３５コピーの複製数閾値でＩＲ−Ｂアイソフォーム配列を検出することができた。これらの設計物はまた、約３５複製の閾値以下でＩＲ−Ａアイソフォームの存在を検出できず、これらが利用された何れのコピー数投入量でもＩＲ−Ａアイソフォームの存在を検出できなかったことから、ＩＲ−Ｂアイソフォームに非常に特異的であることも分かった。
【０１８２】
リアルタイムＰＣＲのためのＢｉｏＭａｒｋ（商標）Ｄｙｎａｍｉｃ Ａｒｒａｙ（Ｆｌｕｉｄｉｇｍ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）マイクロフルイディクスシステムを用いて、これらの特異性実験を繰り返した。このシステムにより、変動性が低く、従来のＲＴ−ＰＣＲとよく相関する高品質データをもたらすハイスループットのリアルタイムＰＣＲ（プレートあたり２３０４の個別の反応が可能）が可能となる。この技術を用いるために、製造者の説明書に従い、ＴａｑＭａｎ Ｐｒｅ−Ａｍｐ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘを用いてｃＤＮＡ試料を予め増幅した。反応液には、２０μＬの最終体積に対して、５μＬのｃＤＮＡ、１０μＬのＰｒｅ−Ａｍｐ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ及び５μＬの０．２ｘ遺伝子発現アッセイミックス（アッセイしようとする全プライマー／プローブから構成）が含有された。推奨されるプログラムを用いて１４サイクルにわたり反応サイクルを繰り返し、次いでＴＥ緩衝液で１：５に希釈した。予め増幅したｃＤＮＡをすぐに使用するか又は必要になるまで−２０℃で保存した。
【０１８３】
４８ｘ４８ダイナミックアレイチップ（Ｆｌｕｉｄｉｇｍ）に投入するための試料を調製するために、反応混合液は、２．５μＬの２ｘＵｎｉｖｅｒｓａｌ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、０．２５μＬのＳａｍｐｌｅ Ｌｏａｄｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ（試料ローディング用緩衝液）（Ｆｌｕｉｄｉｇｍ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）及び２．２５μＬの予め増幅したｃＤＮＡを含有した。プライマー／プローブを調製するために、反応混合液は、２．５μＬの２０ｘＴａｑｍａｎ遺伝子発現アッセイ及び２．５μＬのＡｓｓａｙ Ｌｏａｄｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ（アッセイローディング緩衝液）（Ｆｌｕｉｄｉｇｍ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を含有した。試料及びアッセイ試薬を注入口に投入する前に、ＩＦＣ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｒにおいてチップの準備を行った。記載のように調製した５μＬの試料をダイナミックアレイチップの各試料注入口に投入し、５μＬの１０ｘ遺伝子発現アッセイミックスを各検出器の注入口に投入した。投入及び混合のために、チップをＩＦＣ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｒ上に置いた。およそ１時間後、温度サイクリングのためにチップをＢｉｏＭａｒｋ（商標）リアルタイムＰＣＲシステムに投入した（９５℃で１０分間、続いて９５℃で１５秒間及び６０℃で１分間を４０サイクル）。試料の反復数及び組成は、特定の実験によって変動したが、三重未満にはならなかった。設計されるプローブ感度及び特異性を決定するために平均Ｃｔ値を使用した。
【０１８４】
Ｆｌｕｉｄｉｇｍ ｓｙｓｔｅｍを用いて、従来のリアルタイムＰＣＲを用いて得られた結果を検証した。ＩＲ−Ａ１、ＩＲ−Ａ３、ＩＲ−Ｂ３、ＩＲ−Ｂ４及びＩＲ−Ｂ５はＩＲ−Ａ又はＩＲ−Ｂの何れかに対して特異的であり、約３５コピーの複製数閾値で適切な受容体アイソフォームを検出することができた。
【０１８５】
さらなる分析においても、ＩＲ−ＡもしくはＩＲ−Ｂの何れかを過剰発現することが知られているか又はＩＲ−Ａを過剰発現するように改変されている細胞株からのｃＤＮＡ鋳型を利用した。２つの内因対照遺伝子（ＧＡＰＤＨ及びＡＣＴＩＮ）の平均ＣＴを標的遺伝子の平均Ｃｔから差し引くことによって、各試料に対するΔ比較閾値（ΔＣｔ）を計算した。結果から、これらのプライマー／プローブ設計が、ｃＤＮＡクローンを用いて観察されるのと同じように、細胞株においてＩＲ−Ａ又はＩＲ−Ｂの何れかを再現性よく特異的に検出したことが示された。まとめると、これらの結果から、ｃＤＮＡ又は組織試料のさらなるハイスループット分析に対するＦｌｕｉｄｉｇｍ技術の使用が有効であることが確認され、ＩＲ−Ａ及びＩＲ−Ｂプライマー／プローブ設計の特異性が検証された。複数のプライマー／プローブ設計の品質確認後、発明者らは、多数の一連の乳癌におけるＩＲ−Ａ及びＩＲ−Ｂの発現状態を測定するためにＩＲ−Ａ１及びＩＲ−Ｂ４を選択した。
【０１８６】
１００ｐｇのＩＲ−Ａ又はＩＲ−Ｂの鋳型保存溶液（ＤＮＡ鋳型およそ１０７複製）で開始してＩＲ−Ａ又はＩＲ−Ｂ ｑＲＴ−ＰＣＲアッセイを行うことによって、プローブの感度を検証した。ｌ０−４ｐｇ（およそ１０コピーのＤＮＡ鋳型）までＤＮＡを連続希釈した。２つ組で各試料を試験した。標準鋳型希釈曲線の傾斜は、ｌｏｇＤＮＡ複製数の関数としてサイクル−閾値（Ｃｔ）値をプロットすることによって計算した。この結果を図７で示す。ｌｏｇ［濃度］と、その個々の対応する標準鋳型を用いて試験した各アッセイに対して得られたＣｔ値と、の間で強い相関が認められた。相関係数（ｒ２値）は全て０．９９９以上（ｐ≦０．０００１）であった。両アッセイにおいて上述のＤＮＡ濃度範囲において直線性が維持され、このことから、幅広いダイナミックレンジが示され、正確なＣｔ値が得られる。この結果から、約３５コピーのＤＮＡに対してＩＲ−Ａ及びＩＲ−Ｂアッセイの両方が高い感度で適切なアイソフォームを検出していることが示された。
【０１８７】
ＩＲ−Ｂ ＤＮＡ鋳型の存在下でＩＲ−Ａアッセイを、ＩＲ−Ａ ＤＮＡ鋳型の存在下でＩＲ−Ｂアッセイを、それぞれ試験することによってもアッセイの特異性を評価した。ＩＲ−Ａアッセイは、１０から１０７複製のＩＲ−Ｂ ＤＮＡという試験範囲でＩＲ−Ｂ ＤＮＡ鋳型を増幅しない。同様に、ＩＲ−Ｂアッセイは、試験範囲でＩＲ−Ａ ＤＮＡ鋳型を増幅しない。
【０１８８】
両アッセイに対する標準希釈曲線の傾斜によってアッセイ効率を評価した（図７）。その傾斜は、ＩＲ−Ａに対して−３．２５９であり、ＩＲ−Ｂに対して−３．１５５であった。この２つの傾斜は非常に類似しており、これにより、プローブ効率の差はあまりないことが示唆される。
【０１８９】
実施例３：乳癌患者における発現プロファイリング
Ａ．一般手法
４２例のグレードＩからＩＩＩの浸潤性乳管癌をＩＬＳｂｉｏ（Ｃｈｅｓｔｅｒｔｏｗｎ、ＭＤ）から購入した。１９例の対応する正常な隣接乳房組織試料も入手した。患者の年齢は３１歳から８８歳の範囲であった。乳癌試料は全て、ＩＨＣによれば、ＥＲ及びＰＲ陽性であり、ＨＥＲ２陰性である。いずれの処理を開始する前にも、全試料を新鮮凍結し、回収した。腫瘍試料に対してマクロダイセクションを行い正常組織を除去し、正常試料に対してマクロダイセクションを行って非腺組織を除去した。マクロダイセクション後、全試料における腫瘍純度は８５％超である。
【０１９０】
４種類の乳癌組織ｑＰＣＲ ｃＤＮＡアレイ（ＢＣＲＴ１０１、ＢＣＲＴ１０２、ＢＣＲＴ１０３、ＢＣＲＴ１０４）をＯｒｉＧｅｎｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ）から購入した。ｑＰＣＲアレイは、１５検体の正常乳房組織（１０名の独自のドナー由来）及び１６５検体の乳腺癌組織由来のｃＤＮＡを含有する。腫瘍ステージはＩからＩＶまで様々であり、これらの組織は５０から９０％の腫瘍から構成された。
【０１９１】
ＺＲ ＲＮＡ ＭｉｃｒｏＰｒｅｐキット（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｏｒａｎｇｅ、ＣＡ）を用いて総ＲＮＡを急速凍結組織標本から抽出した。分光光度法でＲＮＡ純度及び濃度を測定した（２６０／２８０＞１．９）。ＲＮＡ６０００ Ｎａｎｏ ＬａｂＣｈｉｐ（登録商標）を用い、Ａｇｉｌｅｎｔ ２１００ ＢｉｏａｎａｌｙｚｅｒにおいてＲＮＡの品質を評価した。
【０１９２】
以下のの実施例のために、ＩＲ−Ａアッセイに対するフォワードプライマーの配列は５’−ＴＧＡＧＧＡＴＴＡＣＣＴＧＣＡＣＡＡＣＧ−３’（配列番号３）であり、リバースプライマーの配列は５’−ＡＣＣＧＴＣＡＣＡＴＴＣＣＣＡＡＣＡＴＣ−３’（配列番号４の相補体）であり、プローブは５’−ＴＣＣＣＣＡＧＧＣＣＡＴＣＴ−３’（配列番号７）である。ＩＲ−Ｂアッセイのためのフォワードプライマーの配列は５’−ＣＧＴＣＣＣＣＡＧＡＡＡＡＡＣＣＴＣＴＴＣ−３’（配列番号１１）であり、リバースプライマーの配列は５’−ＧＧＡＣＣＴＧＣＧＴＴＴＣＣＧＡＧＡＴ−３’（配列番号１２）であり、プローブの配列は５’ＣＣＧＡＧＧＡＣＣＣＴＡＧＧＣ−３’（配列番号１４）である。
【０１９３】
陽性及び陰性対照には、ＩＲ−Ａの全長ｃＤＮＡクローン（ｐＣＭＶ６−ＸＬ４中でクローニング）及びＩＲ−Ｂの全長ｃＤＮＡクローン（ｐＣＭＶ６−ＸＬ５中でクローニング）を含有する市販のｃＤＮＡクローンをＯｒｉＧｅｎｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｉｎｃから購入した（ＩＲ−Ａ：ＳＫＵ＃．ＳＣ３１１３２８；ＩＲ−Ｂ：ＳＫＵ＃ＳＣ３１５８８０）。ＩＲ−Ａ及びＩＲ−Ｂアッセイに対する陰性対照ＤＮＡとしてそれぞれ空のｐＣＭＶ６−ＸＬ４及びｐＣＭＶ６−ＸＬ５のプラスミドを使用した。
【０１９４】
プライマー／プローブ及び鋳型の組み合わせ全てに対して、３８４ウェル方式で標準的ＴａｑＭａｎ遺伝子発現アッセイを行った。反応液は、３８４ウェルプレートのウェルあたり１０μＬの最終体積に対して、５μＬのＴａｑＭａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ、０．５μＬの１０ｘ遺伝子発現アッセイＭｉｘ及び４．５μＬの様々な複製数のＩＲ−Ｂ又はＩＲ−Ａ ｃＤＮＡクローンの何れかから構成された。各プライマー／プローブ及び鋳型の組み合わせを少なくとも３回繰り返した。標準設定（９５℃で１０分間温置し、続いて９５℃で１５秒間及び６０℃で１分間を４０サイクルから構成されるサイクリングプログラム）を用いて、全アッセイプレートをＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ７９００ＨＴ検出システムで試験した。ＳＤＳｖ２．０ソフトウェアツール（ＡＢＩ）を用いてデータ値（サイクル閾値（Ｃｔ）値）を各回のアッセイ実行から抽出した。
【０１９５】
他の遺伝子の発現レベルの評価のために、ＴａｑＭａｎ遺伝子発現アッセイをＡＢＩ（Ｆｏｒｅｓｔ ｃｉｔｙ、ＣＡ）から購入した。このアッセイには、ＩＮＳＲ（アッセイＩＤ：Ｈｓ００９６１５５４＿ｍ１）、ＥＲ（アッセイＩＤ：Ｈｓ００１７４８６０＿ｍ１）、ＰＲ（アッセイＩＤ：Ｈｓ０１５５６７０７＿ｍ１）、ＥＲＢＢ２（ＨＥＲ２、アッセイＩＤ：Ｈｓ０１００１５８０＿ｍ１）、腫瘍増殖遺伝子（Ｐｉｋｅ Ｓら、２００４）：ＢＩＲＣ５（アッセイＩＤ：Ｈｓ００１５３３５３＿ｍ１）、ＡＵＲＫＡ（ＳＴＫ１５、アッセイＩＤ：Ｈｓ０１５８２０７３＿ｍ１）、ＣＣＮＢ１（アッセイＩＤ：Ｈｓ００２５９１２６＿ｍ１）、Ｋｉ６７（アッセイＩＤ：Ｈｓ０１０３２４４３＿ｍ１）、ＭＹＢＬ２（アッセイＩＤ：Ｈｓ００９４２５４３＿ｍ１）及び参照又は「ハウスキーピング」遺伝子：ＡＣＴＢ（Ｈｓ９９９９９９０３＿ｍ１）、ＧＵＳＢ（アッセイＩＤ：Ｈｓ９９９９９９０８＿ｍｌ）、ＧＡＰＤＨ（アッセイＩＤ：Ｈｓ９９９９９９０５＿ｍ１）、ＲＰＬＰ０（アッセイＩＤ：Ｈｓ９９９９９９０２＿ｍ１）、ＴＦＲＣ（アッセイＩＤ：Ｈｓ９９９９９９１１＿ｍ１）が含まれる。
【０１９６】
ＢｉｏＭａｒｋ（商標）Ｄｙｎａｍｉｃ Ａｒｒａｙ（Ｆｌｕｉｄｉｇｍ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）マイクロフルイディクスシステムにより、変動性が低く従来のＲＴ−ＰＣＲと強く相関する高品質のデータを生成させる、ハイスループットリアルタイムＰＣＲ（プレートあたり２３０４の個々の反応が可能）が可能になる。Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ（登録商標）ＩＩＩ Ｆｉｒｓｔ Ｓｔｒａｎｄ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ＳｕｐｅｒＭｉｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を用いて総ＲＮＡから１本鎖ｃＤＮＡを生成させた。製造者の説明書に従い、ＴａｑＭａｎ Ｐｒｅ−Ａｍｐ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘを用いてｃＤＮＡ試料を予め増幅した。反応液は、２０μＬの最終体積に対して、５μＬのｃＤＮＡ、１０μＬのＰｒｅ−Ａｍｐ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ及び５μＬの０．２ｘ遺伝子発現アッセイミックス（アッセイしようとする全プライマー／プローブから構成）を含有した。推奨されるプログラムを用いて１４サイクルにわたり反応を繰り返し、次いでＴＥ緩衝液で１：５に希釈した。予め増幅したｃＤＮＡをすぐに使用するか又は必要になるまで−２０℃で保存した。
【０１９７】
４８ｘ４８ダイナミックアレイチップ（Ｆｌｕｉｄｉｇｍ）に投入するための試料を調製するために、反応混合液は、２．５μＬの２ｘＵｎｉｖｅｒｓａｌ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、０．２５μＬのＳａｍｐｌｅ Ｌｏａｄｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ（試料ローディング緩衝液）（Ｆｌｕｉｄｉｇｍ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）及び２．２５μＬの予め増幅したｃＤＮＡを含有した。プライマー／プローブを調製するために、反応混合液は、２．５μＬの２０ｘＴａｑｍａｎ遺伝子発現アッセイ及び２．５μＬのＡｓｓａｙ Ｌｏａｄｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ（アッセイローディング緩衝液）（Ｆｌｕｉｄｉｇｍ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を含有した。試料及びアッセイ試薬を注入口に投入する前に、ＩＦＣ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｒにおいてチップの準備を行った。記載のように調製した５μＬの試料をダイナミックアレイチップの各試料注入口に投入し、５μＬの１０ｘ遺伝子発現アッセイミックスを各検出器注入口に投入した。投入及び混合のために、チップをＩＦＣ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｒに置いた。およそ１時間後、温度サイクリングのためにチップをＢｉｏＭａｒｋ（商標）リアルタイムＰＣＲシステムに投入した（９５℃で１０分間、続いて９５℃で１５秒間及び６０℃で１分間を４０サイクル）。試料の反復数及び組成は、特定の実験によって変動したが、三重未満となることはなかった。設計されたプローブの感度及び特異性を決定するために平均Ｃｔ値を使用した。試料内の全ての利用可能な参照遺伝子アッセイの平均Ｃｔ値をΔＣｔの計算のために使用した。
【０１９８】
ＭｅｓｓａｇｅＡｍｐ（商標）Ｐｒｅｍｉｅｒ ＲＮＡ増幅キット（Ａｍｂｉｏｎ、Ａｕｓｔｉｎ、ＴＸ）を用いて、７５ｎｇの総ＲＮＡからビオチン標識された増幅ｃＲＮＡを生成させた。分光光度法でｃＲＮＡ生成物の純度及び濃度を決定した。Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｏｍｅ Ｕ１３３ Ｐｌｕｓ ２．０ ＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）アレイにおいてハイブリッド形成のために１５μｇの各ビオチン標識ｃＲＮＡを断片化した。全ＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）洗浄、染色及びスキャン手順をＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘの標準装置により行った。データ捕捉及び最初のアレイ品質評価は、ＧｅｎｅＣｈｉｐ Ｏｐｅｒａｔｉｎｇ Ｓｏｆｔｗａｒｅ（ＧＣＯＳ）ツールを用いて行った。全試料にわたりシグナル強度が２５未満であるプローブは全て分析から排除した。
【０１９９】
Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｏｍｅ Ｕ１３３ Ｐｌｕｓ ２．０ ＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）アレイにおいて、ＥＲ＋、ＰＲ＋及びＨｅｒ２−原発乳房腫瘍のサブセット（ｎ＝４０）及び対応する正常な隣接乳房組織試料（ｎ＝１５）のプロファイルを調べた。Ｆｌｕｉｄｉｇｍプラットフォームで分析した２検体の原発乳房試料及び４検体の対応する正常な隣接乳房組織試料は、ＲＮＡ量が不十分であったためＧｅｎｅＣｈｉｐによる処理を行わなかった。発明者らのゲノムアレイデータ全体を使用して、ｌｕｍｉｎａｌ−Ａ及びｌｕｍｉｎａｌ−Ｂサブタイプに関する乳癌分子サブタイプ分類を行った。
【０２００】
推定試料分類を判定するための２種類の方法を実施した。第一の分類方法では、試料サブタイプ分類（正常、基底膜細胞型（ｂａｓａｌ−ｌｉｋｅ）、ＨＥＲ２、ｌｕｍｉｎａｌ−Ａ又はｌｕｍｉｎａｌ−Ｂ）の目的で、公開されているＰＡＭ５０−遺伝子収縮重心分類手段（Ｗｅｉｇｅｌｔら、２０１０）を用いた。この分析に対してＭＡＳ５で正規化したＧｅｎｅＣｈｉｐデータを使用した（公開されている分類法がこのタイプの規模のデータを用いて確立されてることを考慮して）。スピアマンの順位相関係数（５０遺伝子強度ベクター対サブタイプ重心分類法）に従い、試料を分類し、最大相関値を有するサブタイプを特定の試料に割り当てた。第二の方法では、２試料のウェルチｔ−検定分析によって発現が異なる転写物のパネルを特定するために、ＧＣ−ＲＭＡで正規化したＧｅｎｅＣｈｉｐデータを使用した。統計学的分析を行う前に、病理学的評価に基づき試料を２群（正常又は腫瘍）に分けた。教師なし階層型クラスター分析のために、倍単位での変化の差が３超であり、ｐ値が１．０ｘ１０−１２未満であるプローブ（ｎ＝４５９プローブ）を使用した。転写パネル組成物の関数として、特定されたサブ集団を正常、ｌｕｍｉｎａｌ−Ａ又はｌｕｍｉｎａｌ−Ｂとして分類した。
【０２０１】
Ｂ．結果
乳癌におけるＩＲ−Ａ及びＩＲ−Ｂ
乳癌、４２ＥＲ及びＰＲ陽性及びＨｅｒ２陰性原発乳房組織試料及び１９検体の対応する正常隣接乳房組織におけるＩＲ−Ａ及びＩＲ−ＢのｍＲＮＡ発現状態を試験した。ランダムヘキサマープライマーによってｃＤＮＡを予め増幅し、ＴａｑＭａｎ ｑＰＣＲ（Ｆｌｕｉｄｉｇｍ）によってＩＲ−Ａ、ＩＲ−Ｂ及び総インスリン受容体（ＩＮＳＲ）転写物の発現レベルについてアッセイした。上述のように５種類のハウスキーピング遺伝子の平均に対して試料を正規化した。結果を図８で示す。正常におけるＩＮＳＲ、ＩＲ−Ａ及びＩＲ−Ｂの平均相対量（ＲＱ）の差（ｌｏｇ２ベースのスケール）±９５％ＣＩはそれぞれ１．０３ｘｌ０−８±０．１７、−７．３７ｘｌ０−９±０．２４及び３．３７ｘｌ０−８±０．１８（ｎ＝１９）であった。腫瘍におけるＩＮＳＲ、ＩＲ−Ａ及びＩＲ−Ｂの平均相対量（ＲＱ）の差（ｌｏｇ２ベースのスケール）±９５％ＣＩは、それぞれ−０．８８±０．２５、−０．０７±０．２９及び−２．０８±０．２５（ｎ＝４２）であった。ウェルチの両側ｔ−検定分析から、正常乳房組織と比較した場合に、試験した乳房腫瘍セットにおいてＩＮＳＲ及びＩＲ−ＢのｍＲＮＡレベルが有意に低いことが示される（ｐ＜０．０００１）。あるいは、正常と比較した場合、乳癌におけるＩＲ−ＡのｍＲＮＡレベルで有意差は観察されなかった（ｐ＝０．４５０１）。
【０２０２】
２（−ΔＣｔ）によって、対応する腫瘍及び正常の対において、総インスリン受容体組成物（即ちＩＲ−Ａ＋ＩＲ−Ｂ）に対するＩＲ−Ａの割合を計算した。結果を図９で示す。正常パネルに対する平均ＩＲ−Ａ転写物の割合（％）±９５％ＣＩは４６．６０％±４．７４％（ｎ＝１９）であり、一方、対応する腫瘍試料に対する平均ＩＲ−Ａ転写物の割合（％）±９５％ＣＩは７５．２４％±５．０２であった。対応のある試料ｔ−検定分析から、対応する正常試料と比較した場合、腫瘍試料中のＩＲ−Ａの割合の計算値が有意に上昇していることが示された（ｐ＜０．０００１）。結果から、腫瘍におけるＩＲ−Ｂレベルの有意な低下が、正常と比較した場合の腫瘍試料におけるＩＲ−Ａの割合の全体的な上昇に関与することが示唆される。
【０２０３】
ＩＲ−Ａ及びＩＲ−ＢのｍＲＮＡ転写物の比率を評価するために、発明者らは、正常及び原発腫瘍乳房試料におけるＩＲ−Ａ及びＩＲ−ＢのΔＣｔ差を計算した。正規化のために試料内参照遺伝子（ハウスキーピング）パネル（平均Ｃｔ）を使用して、全試料に対してΔＣｔ差（ＩＲ−ＡΔＣｔ−ＩＲ−ＢΔＣｔ）値を計算した。平均ＩＲ−Ａ：ＩＲ−ＢΔＣｔ±９５％ＣＩは正常の場合０．２０±０．２３（ｎ＝１９）であり、原発腫瘍では、平均ＩＲ−Ａ：ＩＲ−ＢΔＣｔ±９５％ＣＩは−１．８１±０．２７（ｎ＝４２）であった。ウェルチの両側ｔ−検定分析により、観察されたＩＲ−Ａ：ＩＲ−ＢΔＣｔに関して、正常と腫瘍試料との間で有意差が認められた（ｐ＜０．０００１）（図１０）。この結果から、乳房腫瘍においてＩＲ−ＡのＩＲ−Ｂに対する比率の有意な上昇が示された。
【０２０４】
上記の結果をさらに確認するために、発明者らは、さらなる乳癌組織試料におけるＩＲ−Ａ及びＩＲ−ＢのｍＲＮＡ発現比率を評価した。１５検体の正常乳房組織及び１６５検体の乳腺癌組織由来のｃＤＮＡを含有するＰＣＲアレイを使用した。等量のｃＤＮＡを予め増幅し、Ｔａｑｍａｎ ｑＰＣＲ（Ｆｌｕｉｄｉｇｍ）によりＩＲ−Ａ、ＩＲ−Ｂ及びＥＲの発現レベルについてアッセイした。正規化のために試料内参照遺伝子パネル（ＡＣＴＢ、ＧＵＳＢ、ＧＡＰＤＨ）を用いて全試料に対してΔＣｔ差（ＩＲ−ＡΔＣｔ−ＩＲ−ＢΔＣｔ）値を計算した。結果を図１１で示す。正常組織では平均ＩＲ−Ａ：ＩＲ−ＢΔＣｔ±９５％ＣＩは０．５１±０．３７（ｎ＝１５）であった。平均ＩＲ−Ａ：ＩＲ−ＢΔＣｔ±９５％ＣＩは、試験した全乳癌にわたり−１．１９±０．１７（ｎ＝１６５）であった。
【０２０５】
次に、発明者らは、乳癌試料から、正常乳房組織に対して２倍のエストロゲン受容体過剰発現を示した乳癌試料を分け、それらのＩＲ−Ａ：ＩＲ−ＢΔＣｔ差を正常組織及び全乳癌試料と比較した。結果を図１１で示す。ＥＲ＋乳癌では平均ＩＲ−Ａ：ＩＲ−ＢΔＣｔ±９５％ＣＩは−１．４８±０．３９（ｎ＝８３）であり、これは乳癌データセット全体にわたり観察されたものと非常に近い。ウェルチの両側ｔ−検定分析により、観察されたＩＲ−Ａ：ＩＲ−ＢΔＣｔ差に関して正常と腫瘍試料との間の有意差が認められた（ｐ＜０．０００１）。
【０２０６】
乳癌増殖に関与する遺伝子とＩＲ−Ａ：ＩＲ−Ｂ比の相関
Ｋｉ６７、ＳＴＫ１５、サバイビン、ＣＣＮＢ１、ＭＹＢＬ２は、乳癌増殖に関与する、特徴がよく分かっている遺伝子である。これらの遺伝子の複合発現スコアはＯｎｃｏｔｙｐｅ ＤＸで使用されており、多くの患者において乳癌再発に関与する重要な因子となっている。発明者らは、回帰分析及び相関分析を用いて、原発乳癌試料のセットにおいてＩＲ−Ａ：ＩＲ−Ｂ比と増殖スコアとの関係を調べた。ＩＲ−Ａ：ＩＲ−ＢΔＣｔ差の計算値とプールされた増殖マーカーのパネル（ＡＵＲＫＡ、ＢＩＲＣ５、ＣＣＮＢ１、ＫＩ６７及びＭＹＢＬ２）との間の関係を定量するために、線形回帰分析を行った。特定の試料に対して全マーカーにわたる平均ΔＣｔをとることによって、増殖パネルのサマリー値を計算した。正常及び腫瘍試料の両方に対するサマリーの結果を与える。線形回帰分析の結果から、２つのサマリー値の間の正相関が示唆される（補正ｒ２＝０．５９５）（図１２）。ＩＲ−ＡＴＲ−ＢΔＣｔ差は、増殖スコアとの正相関を示す（図１２）。この結果から、腫瘍でのＩＲ−Ｂ発現の低下及びＩＲ−Ａ比率発現の上昇がＥＲ＋ＰＲ＋及びＨｅｒ−乳癌において腫瘍増殖に寄与し得ることが示唆される。
【０２０７】
乳癌サブタイプにおけるＩＲ−Ａ：ＩＲ−ＢΔＣｔ差
乳癌は、分子的変化、細胞組成及び臨床的な転帰に関して不均一な疾患である。固有の遺伝子リストを用いて、階層的クラスター分析によってＥＲ陽性乳癌をｌｕｍｉｎａｌ−Ａ及びｌｕｍｉｎａｌ−Ｂサブタイプにさらに分類することができる（Ｐｅｒｏｕ ＣＭ、２０００）。Ｌｕｍｉｎａｌ−Ａ癌は、組織学的に低悪性度であり、ネオアジュバント内分泌療法に感受性がある（Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ Ｃら、２００８）。一方、ｌｕｍｉｎａｌ−Ｂ癌は、組織学的に悪性度が高いことが多く、ネオアジュバント内分泌療法に対する感受性が低く、より短期間で不良転帰となる（Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ Ｃら、２００８）。Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎの報告によると、ＩＧＦ−Ｉという特徴はｌｕｍｉｎａｌ−Ｂ乳癌で明白であり、この特徴は多くの不良予後因子と高い相関があり、尚且つ疾患転帰の最強の指標の１つである。ＩＲ−ＡアイソフォームはＩＧＦシグナル伝達に関与する重要な成分の１つであるので、発明者らはＩＲ−Ａ：ＩＲ−Ｂの比率の変化がｌｕｍｉｎａｌ−Ａ及びｌｕｍｉｎａｌ−Ｂ乳癌を比較した際に明白となり得るという仮説を検証した。
【０２０８】
この疑問に取り組むために、発明者らは、４０検体のＥＲ＋ＰＲ＋及びＨｅｒ２−陰性乳癌及び１５検体の正常乳房試料に対して全ゲノムアレイ分析を行った。発明者らは最初に、公開されているＰＡＭ５０−遺伝子収縮重心分類手段（Ｗｅｉｇｅｌｔら、２０１０）を利用した。スピアマンの順位相関係数に従い、ｌｕｍｉｎａｌ Ａ又はｌｕｍｉｎａｌ Ｂとして試料を分類し、最大相関値を有するサブタイプを特定の試料に割り当てた。次に、正常、ｌｕｍｉｎａｌ−Ａ及びｌｕｍｉｎａｌ−ＢにおけるＩＲ−Ａ：ＩＲ−ＢΔＣｔ差を比較した。試料サブタイプ（正常、ｌｕｍｉｎａｌ−Ａ又はｌｕｍｉｎａｌ−Ｂ）に関するＩＲ−Ａ：ＩＲ−ＢΔＣｔ差の計算値の散布図を図１３Ａで示す。正常において平均ＩＲ−Ａ：ＩＲ−ＢΔＣｔ±９５％ＣＩは０．２７±０．３０（ｎ＝１５）であった。ｌｕｍｉｎａｌ−Ａに分類された乳癌において平均ＩＲ−Ａ：ＩＲ−ＢΔＣｔ±９５％ＣＩは−１．０９±０．３４（ｎ＝１３）であった。ｌｕｍｉｎａｌ−Ｂに分類された乳癌において平均ＩＲ−Ａ：Ｒ−ＢΔＣｔ±９５％ＣＩは−２．１２±０．３４（ｎ＝２７）であった。全サブタイプのペアワイズ比較から、有意差が示される（２−試料ｔ検定、ｐ＜０．００１）。この結果から、ｌｕｍｉｎａｌ−Ｂ患者におけるＩＲ−Ａ：ＩＲ−Ｂ比が、ｌｕｍｉｎａｌ−Ａ患者よりも大幅に変化したことが示された。
【０２０９】
収縮重心分類手段に加えて、発明者らは、２−試料ウェルチｔ−検定分析によって発現が異なる転写物のパネルを特定するためにＧＣ−ＲＭＡで正規化したＧｅｎｅＣｈｉｐデータを使用した。統計学的分析を行う前に、病理学的評価に基づき、試料を２群（正常又は腫瘍）に分けた。転写物パネル組成の関数として、教師なし階層的クラスター分析によって同定されたサブ集団を、正常、ｌｕｍｉｎａｌ−Ａ又はｌｕｍｉｎａｌ−Ｂに分類した。正常、ｌｕｍｉｎａｌ−Ａ及びｌｕｍｉｎａｌ−ＢにおけるＩＲ−Ａ：ＩＲ−ＢΔＣｔ差も比較した。この結果を図１３Ｂで示す。正常において平均ＩＲ−Ａ：ＩＲ−ＢΔＣｔ±９５％ＣＩは０．３２±０．２５（ｎ＝１５）であった。ｌｕｍｉｎａｌ−Ａと予測された乳癌において平均ＩＲ−Ａ：ＩＲ−ＢΔＣｔ±９５％ＣＩは−１．０５±０．１９（ｎ＝１８）であった。ｌｕｍｉｎａｌ−Ｂと予測された乳癌における平均ＩＲ−Ａ：ＩＲ−ＢΔＣｔ±９５％ＣＩは−２．４２±０．３２（ｎ＝２２）であった。全サブタイプのペアワイズ比較から、有意差が示される（２−試料ｔ−検定、ｐ＜０．００１）。
参考文献
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【０２１９】
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【０２２３】
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【０２２４】
Ｓｃｉａｃｃａら，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ．Ｎｏｖ ２８；２１（５４）：８２４０−５０．９，２００２。
【０２２５】
本発明の好ましい態様を参照しながら詳細に上記の開示を提供してきたが、当業者にとって、本開示及び特許請求の範囲から逸脱することなく、様々な変更がなされ得、同等物が使用され得ることは明白であろう。引用される文献は全て、それらの全体が参照により組み込まれる。
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、その全体において参照により組み込まれる２００９年１０月１２日出願の米国仮出願第６１／２５０，７８０号に対する優先権を主張する。
【０００２】
配列表
本願は、ＡＳＣＩＩ形式でＥＦＳウェブを介して提出され、その全体において参照により組み込まれる配列表を含む。２０１０年９月８日作成のこのＡＳＣＩＩコピーの名称はＭＥＤ５４０．ＰＣＴ．ｔｘｔであり、サイズは４８，９４８バイトである。
【０００３】
発明の分野
制限なく、本開示は、組織試料などの試料中のインスリン受容体アイソフォームＡ（ＩＲ−Ａ）及び／又はインスリン受容体アイソフォームＢ（ＩＲ−Ｂ）の発現を検出及び定量するための組成物及び方法に関する。本開示はまた、組織試料などの試料中のインスリン受容体アイソフォームＡ（ＩＲ−Ａ）及び／又はインスリン受容体アイソフォームＢ（ＩＲ−Ｂ）の発現を検出及び定量することに少なくとも一部基づく診断及び分類の方法にも関する。このような分類に基づき対象を治療する方法は、本明細書中で提供される開示のさらなる態様に含まれる。
【背景技術】
【０００４】
関連技術に関する記述
インスリン受容体（ＩＮＳＲ）は、エネルギー代謝の制御に関与する膜貫通チロシンキナーゼ受容体である。ＩＮＳＲは、単一のＩＮＳＲ遺伝子から発現されるサブユニット、α及びβを含む。ＩＲ−Ａ及びＩＲ−Ｂと呼ばれる２種類のアイソフォームは、ｍＲＮＡの選択的スプライシングによるものである。ＩＲ−Ａは、ＩＮＳＲ遺伝子から転写されるｍＲＮＡの選択的スプライシングにより生じ、エクソン１１が省かれているが、このエクソン１１はＩＲ−ＢのｍＲＮＡには含まれる（図１Ａ−１Ｂ）。このように、ＩＲ−Ａは、ＩＮＳＲα−サブユニットのカルボキシ末端のアミノ酸残基のストレッチ部が欠如しているため、ＩＲ−Ｂとは異なっている。ＩＲ−Ａ及びＩＲ−Ｂの同一性は９９％を超える（図２）。この２種類のアイソフォームの発現プロファイルは異なるが、これらのアイソフォームは細胞において同時発現される。ＩＲ−Ａ及びＩＲ−Ｂの相対的存在量は発生段階及び組織に特異的な因子により制御される。
【０００５】
例えば、ＩＲ−Ａは胎児及び癌細胞で主に発現され、一方ＩＲ−Ｂは、分化したインスリン標的細胞で主に発現される。ＩＲ−Ａは、インスリンに対して高い親和性を示し、ＩＧＦ−ＩＩに対する親和性は中程度であり、ＩＧＦ−Ｉに対する親和性は低い。ＩＧＦ−ＩＩは、同程度の親和性でＩＧＦのＩ型受容体（ＩＧＦ−ＩＲ）及びＩＲ−Ａに結合する。ＩＲ−Ｂはインスリンに対する特異性の高い受容体である。
【０００６】
現在、患者試料中のＩＲ−Ａ及びＩＲ−Ｂレベルを調べる方法については、有効かつ正確な検出手段がないことが障壁になっている。現在のところ、特定的にＩＲ−Ａ発現を測定するために利用可能な唯一の方法は、Ｓｃｉａｃｃａら（Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ２１（５４）：８２４０−５０；２００２ Ｎｏｖ ２８）に記載されている。この方法は、ＰＣＲ及びゲル分離を行い、それに続いて、得られたバンドを定量測定することに基づく。この方法は、大きな労力を要し、定量的に正確ではなく、ハイスループット又は臨床の場においてその使用は限定的なものとなっている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
患者の組織がその薬物の分子標的を発現するか否かの判定に基づき、薬物に対する患者の反応を予測することができる改善された診断試験が必要とされている。ＩＲ−Ａ及びＩＲ−Ｂの発現を正確に検出及び／又は定量するための方法が必要とされている。患者試料中の各アイソフォームの発現の検出及び定量を可能とする能力は、個人対応の治療計画を患者に提供するのに有用である。このような個人対応の治療計画によって、患者に対する治療的有用性を最大限にできる可能性が生まれ、同時に、例えば代替的な有効性がより低い治療計画に伴い得る副作用を最小限に抑えることができるようになる。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
生体材料の試料が、ヒトＩＲ−Ａ及び／又はＩＲ−Ｂを含むＩＲ−Ａ及び／又はＩＲ−Ｂを発現する細胞を含有するか否かを検出及び／又は定量するための有用な組成物及び方法ならびにこのような方法での使用のためのキットが、本明細書中で開示される。これらの方法は、組織試料中のＩＲ−Ａ及び／又はＩＲ−Ｂの発現を測定するために特定のオリゴヌクレオチドが使用できるという知見に一部基づく。これらのオリゴヌクレオチドは、ハイスループット及び臨床の場で本方法が使用できるように、試料中のＩＲ−Ａ及び／又はＩＲ−Ｂ発現のレベルを迅速かつ定量的に区別するために使用することができる。これらの組成物及び方法は、組織試料、例えば腫瘍組織試料を分類するための方法において有用であり得る。このような方法の結果は、患者がＩＮＳＲ、ＩＧＦ１Ｒ又はＩＧＦのアンタゴニストもしくはアゴニストなどの薬物にどのように応答するかということの指標として、腫瘍又は癌患者を分類する際の要因として使用することができる。治療に対する候補を選択する方法及び癌患者を治療する方法において、これらの方法及び得られた分類を使用することができる。
【０００９】
有用なオリゴヌクレオチドは、ＩＲ−Ａ及び／又はＩＲ−Ｂを選択的に増幅するために使用することができる合成核酸を含み得る。このような有用なオリゴヌクレオチドは１０から３０個の連続ヌクレオチドを含む合成核酸配列を含み得、この場合この合成核酸配列は、以下の配列の何れか１つの少なくとも１０から２０個の連続ヌクレオチドを含むものが開示される：（ｉ）配列番号３、それに相補的な配列又はストリンジェントな条件下で配列番号３もしくはその相補体とハイブリッド形成可能である配列；（ｉｉ）配列番号４、それに相補的な配列（配列番号２１）又はストリンジェントな条件下で配列番号４もしくはその相補体とハイブリッド形成可能である配列又はそれらの変異形；（ｉｉｉ）配列番号５、それに相補的な配列又はストリンジェントな条件下で配列番号５もしくはその相補体とハイブリッド形成可能である配列；又は（ｉｖ）配列番号６、それに相補的な配列（配列番号２２）又はストリンジェントな条件下で配列番号６もしくはその相補体とハイブリッド形成可能である配列。この合成核酸配列は、以下の核酸配列の何れか１つから基本的に構成され得る：（ｉ）配列番号３（ＴＧＡＧＧＡＴＴＡＣＣＴＧＣＡＣＡＡＣＧ）、それに相補的な配列又はストリンジェントな条件下で配列番号３もしくはその相補体とハイブリッド形成可能である配列又はその変異形；（ｉｉ）配列番号４（ＧＡＴＧＴＴＧＧＧＡ ＡＴＧＴＧＡＣＧＧＴ）、それに相補的な配列（配列番号２１）又はストリンジェントな条件下で配列番号４もしくはその相補体とハイブリッド形成可能である配列；（ｉｉｉ）配列番号５（ＴＴＧＡＧＧＡＴＴＡＣＣＴＧＣＡＣＡＡＣＧＴ）、それに相補的な配列又はストリンジェントな条件下で配列番号５もしくはその相補体とハイブリッド形成可能である配列又はそれらの変異形；又は（ｉｖ）配列番号６（ＡＡＡＣＧＣＡＧＧＴＣＣＣＴＴＧＧＣ）、それに相補的な配列（配列番号２２）又はストリンジェントな条件下で配列番号６もしくはその相補体とハイブリッド形成可能である配列又はそれらの変異形。
【００１０】
有用な合成核酸配列は、配列番号７、それに相補的な配列又はストリンジェントな条件下で配列番号７もしくはその相補体とハイブリッド形成可能である配列又はそれらの変異形又は、配列番号８、それに相補的な配列又はストリンジェントな条件下で配列番号８もしくはその相補体とハイブリッド形成可能である配列又はそれらの変異形であり得る。別の有用な合成核酸配列は、配列番号７、それに相補的な配列又はストリンジェントな条件下で配列番号７もしくはその相補体とハイブリッド形成可能である配列又はそれらの変異形又は、配列番号８、それに相補的な配列又はストリンジェントな条件下で配列番号８もしくはその相補体とハイブリッド形成可能である配列又はそれらの変異形から基本的に構成され得る。上述の合成核酸配列の何れかを含む組成物も有用であり得る。
【００１１】
生体試料中の標的ヒトＩＲ−Ａ核酸の有無を判定するために有用であるプライマーセットも本明細書中で開示され、このプライマーセットは、以下の少なくとも１つの、１０から３０個の連続ヌクレオチドを含む合成核酸配列の中から選択され得る少なくとも１つの合成核酸配列を含む:（ａ）ＩＮＳＲ遺伝子のエクソン１０の最後の５０塩基（配列番号１）又はその相補的な核酸配列；及び（ｂ）ＩＮＳＲ遺伝子のエクソン１２の最初の６０塩基（配列番号２）、それに相補的な配列又はストリンジェントな条件下で配列番号８もしくはその相補体とハイブリッド形成可能である配列。この合成核酸配列は、配列番号３、それに相補的な配列又はストリンジェントな条件下で配列番号３もしくはその相補体とハイブリッド形成可能である配列；配列番号４、それに相補的な配列（配列番号２１）又はストリンジェントな条件下で配列番号４もしくはその相補体とハイブリッド形成可能である配列；配列番号５、それに相補的な配列又はストリンジェントな条件下で配列番号５もしくはその相補体とハイブリッド形成可能である配列；及び配列番号６、それに相補的な配列（配列番号２２）又はストリンジェントな条件下で配列番号６もしくはその相補体とハイブリッド形成可能である配列の中から選択され得るヌクレオチド配列を有し得る。
【００１２】
（ａ）ポリメラーゼによる増幅に適切な条件下で上述のものなどのプライマーセットと生体試料を接触させる工程；（ｂ）増幅された標的ＩＲ−Ａ核酸配列を検出及び／又は定量する工程を含む、生体試料中の標的ＩＲ−Ａ核酸配列の有無を判定するための方法も本明細書中で開示される。例として、生体試料は、腫瘍試料などの組織試料又は組織もしくは細胞試料由来の核酸を含む試料であり得る。
【００１３】
プライマーセットは、配列番号３、それに相補的な配列又はストリンジェントな条件下で配列番号３もしくはその相補体とハイブリッド形成可能である配列と、配列番号４、それに相補的な配列（配列番号２１）又はストリンジェントな条件下で配列番号４もしくはその相補体とハイブリッド形成可能である配列と、を含み得る。別の例において、本プライマーセットは、配列番号５、それに相補的な配列又はストリンジェントな条件下で配列番号５もしくはその相補体とハイブリッド形成可能である配列と、配列番号６、それに相補的な配列（配列番号２２）又はストリンジェントな条件下で配列番号６もしくはその相補体とハイブリッド形成可能である配列と、を含み得る。ある例において、ポリメラーゼによる増幅は定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ｑ−ＰＣＲ）である。
【００１４】
プライマー及びプローブセットは、配列番号３、それに相補的な配列又はストリンジェントな条件下で配列番号３もしくはその相補体とハイブリッド形成可能である配列又はそれらの変異形と；配列番号４（配列番号２１）、それに相補的な配列又はストリンジェントな条件下で配列番号４もしくはその相補体とハイブリッド形成可能である配列又はそれらの変異形と；検出可能な標識も含み得、クエンチャーをさらに含み得る、配列番号７、それに相補的な配列又はストリンジェントな条件下で配列番号７もしくはその相補体とハイブリッド形成可能である配列又はそれらの変異形と、を含み得る。別の例において、プライマー及びプローブセットは、配列番号５、それに相補的な配列又はストリンジェントな条件下で配列番号５もしくはその相補体とハイブリッド形成可能である配列又はそれらの変異形と；配列番号６、それに相補的な配列（配列番号２２）又はストリンジェントな条件下で配列番号６もしくはその相補体とハイブリッド形成可能である配列又はそれらの変異形と；検出可能な標識も含み得、クエンチャーをさらに含み得る、配列番号８、それに相補的な配列又はストリンジェントな条件下で配列番号８もしくはその相補体とハイブリッド形成可能である配列又はそれらの変異形と、を含み得る。一般に増幅産物は１００塩基未満である。
【００１５】
有用な合成核酸配列は１０から３０個の連続ヌクレオチドを含み得、この合成核酸配列は、以下の配列の何れか１つの少なくとも１０から２０個の連続ヌクレオチドを含む：配列番号１１、それに相補的な配列又はストリンジェントな条件下で配列番号１１もしくはその相補体とハイブリッド形成可能である配列又はそれらの変異形；又は配列番号１２、それに相補的な配列又はストリンジェントな条件下で配列番号１２もしくはその相補体とハイブリッド形成可能である配列又はそれらの変異形。ある例において、本核酸配列は、配列番号１１、それに相補的な配列又はストリンジェントな条件下で配列番号１１もしくはその相補体とハイブリッド形成可能である配列又はそれらの変異形；又は配列番号１２、それに相補的な配列又はストリンジェントな条件下で配列番号１２もしくはその相補体とハイブリッド形成可能である配列又はそれらの変異形；配列番号１３、それに相補的な配列又はストリンジェントな条件下で配列番号１３もしくはその相補体とハイブリッド形成可能である配列又はそれらの変異形；配列番号１４、それに相補的な配列又はストリンジェントな条件下で配列番号１４もしくはその相補体とハイブリッド形成可能である配列又はそれらの変異形；又は、配列番号１５、それに相補的な配列又はストリンジェントな条件下で配列番号１５もしくはその相補体とハイブリッド形成可能である配列又はそれらの変異形から基本的に構成される。上記の合成核酸配列の何れか１以上を含む組成物も有用であり得る。
【００１６】
生体試料中のＩＲ−Ｂの有無を判定するためのプライマーセットは、以下の少なくとも１つの１０から３０個の連続ヌクレオチドを含む合成核酸配列を含み得る：（ａ）ＩＮＳＲ遺伝子のエクソン１０の最後の５０塩基（配列番号１）、それに相補的な配列又はストリンジェントな条件下で配列番号１もしくはその相補体とハイブリッド形成可能である配列及び、ＩＮＳＲ遺伝子のエクソン１１の塩基（配列番号９）、それに相補的な配列又はストリンジェントな条件下で配列番号９もしくはその相補体とハイブリッド形成可能である配列又はそれに相補的な配列又は、ＩＮＳＲ遺伝子のエクソン１０及びエクソン１１を架橋する配列、それに相補的な配列又はストリンジェントな条件下でそれともしくはその相補体とハイブリッド形成可能である配列；及び（ｂ）ＩＮＳＲ遺伝子のエクソン１２の最初の５０塩基（配列番号１０）、それに相補的な配列又はストリンジェントな条件下で配列番号１０もしくはその相補体とハイブリッド形成可能である配列又はそれに相補的な配列。プライマーセットは、配列番号１１、それに相補的な配列又はストリンジェントな条件下で配列番号１１もしくはその相補体とハイブリッド形成可能である配列；及び配列番号１２、その相補的な配列又はストリンジェントな条件下で配列番号１２もしくはその相補体とハイブリッド形成可能である配列の中から選択され得るヌクレオチド配列を有する少なくとも１つの合成核酸配列を含み得る。
【００１７】
生体試料中の標的ＩＲ−Ｂ核酸配列の有無を判定するための方法は、（ｃ）ポリメラーゼによる増幅に適切な条件下で上記のプライマーセットと生体試料を接触させる工程、（ｄ）増幅された標的ＩＲ−Ｂ核酸配列を検出及び／又は定量する工程を含み得る。例として、生体試料は、腫瘍試料などの組織試料からの核酸を含む試料であり得る。別の例において、ポリメラーゼによる増幅は、定量的ポリメラーゼ連鎖反応によるものであり得る。プライマー及びプローブセットは、配列番号１１、それに相補的な配列又はストリンジェントな条件下で配列番号１１もしくはその相補体とハイブリッド形成可能である配列；配列番号１２、それに相補的な配列又はストリンジェントな条件下で配列番号１２もしくはその相補体とハイブリッド形成可能である配列；及び、検出可能な標識も含み得、さらにクエンチャーを含み得る、配列番号１３、それに相補的な配列又はストリンジェントな条件下で配列番号１３もしくはその相補体とハイブリッド形成可能である配列を含み得る。別の例において、プライマー及びプローブセットは、配列番号１１、それに相補的な配列又はストリンジェントな条件下で配列番号１１もしくはその相補体とハイブリッド形成可能である配列と；配列番号１２、それに相補的な配列又はストリンジェントな条件下で配列番号１２もしくはその相補体とハイブリッド形成可能である配列と；配列番号１４、それに相補的な配列又はストリンジェントな条件下で配列番号１４もしくはその相補体とハイブリッド形成可能である配列と、を含み得る。
【００１８】
別の例において、プライマーセットは、配列番号１１、それに相補的な配列又はストリンジェントな条件下で配列番号１１もしくはその相補体とハイブリッド形成可能である配列と；配列番号１２、それに相補的な配列又はストリンジェントな条件下で配列番号１２もしくはその相補体とハイブリッド形成可能である配列と、を含み得；さらに、検出可能な標識も含み得、クエンチャーをさらに含み得る、配列番号１５、それに相補的な配列又はストリンジェントな条件下で配列番号１５もしくはその相補体とハイブリッド形成可能である配列を含み得る。一般に増幅産物は１００塩基未満である。
【００１９】
生体試料中の標的ＩＲ−Ａ及びＩＲ−Ｂ核酸の有無を判定するための方法は、ポリメラーゼによる増幅に適切な条件下で上述のようなＩＲ−Ａプライマーセットと生体試料を接触させ；ポリメラーゼ反応による増幅に適切な条件下で上述のようなＩＲ−Ｂプライマーセットと生体試料を接触させる工程；増幅された標的ＩＲ−Ａ及びＩＲ−Ｂ核酸配列を検出及び／又は定量する工程を含み得る。この方法は、ＩＲ−Ａ及びＩＲ−Ｂの相対発現レベルを計算することをさらに含み得る。
【００２０】
生体試料中のＩＲ−Ａの有無を判定するためのキットは、上述の少なくとも１つの合成核酸配列と、本明細書中に記載の１以上の方法を行うための説明書と、を含み得る。このようなキットにおいて、少なくとも１つの合成核酸配列は、本明細書中で開示されるＩＲ−Ａプライマー及びプローブの中から選択されるヌクレオチド配列又はそれらの何らかのセットを有し得る。キットはまた、適切なＰＣＲ試薬；及び場合によってはＩＲ−Ａの有無を判定するための陽性及び／又は陰性対照も含み得る。
【００２１】
生体試料中のＩＲ−Ｂの有無を判定するためのキットは、上述のような少なくとも１つの合成核酸配列と、本明細書中に記載の１以上の方法を行うための説明書と、を含み得る。このようなキット中の合成核酸は、ＩＲ−Ｂ核酸の中から選択されるヌクレオチド配列を有し得る。このキットはまた、適切なＰＣＲ試薬；及び場合によってはＩＲ−Ｂの有無を判定するための陽性及び／又は陰性対照も含み得る。
【００２２】
ＩＧＦＩ／ＩＩリガンド、ＩＮＳＲ又はＩＧＦＲ１受容体アンタゴニストもしくはアゴニストに反応性がある患者を選択するための方法は、癌に罹患しているか又はその疑いのある対象から生体試料を入手することと；その試料中のＩＲ−Ａの存在を検出及び／又は定量することと、を含み得る。ＩＲ−Ａの有無は、ＩＧＦＩ／ＩＩリガンド、ＩＮＳＲ又はＩＧＦＲ１受容体アンタゴニストもしくはアゴニストを対象に投与すべきか否かに関する指標である。このように、患者を治療する方法は、患者から得られた患者におけるＩＲ−Ａの存在を検出及び／又は定量することと、ＩＧＦＩ／ＩＩリガンド、ＩＮＳＲ又はＩＧＦＲ１受容体アンタゴニスト又はアンタゴニストをその患者に投与することと、を含み得る。例として、ＩＧＦＩ及びＩＩリガンド、ＩＮＳＲ又はＩＧＦＲ１受容体アンタゴニストは抗体であり得る。
【００２３】
ＩＲ−Ａ及び又はＩＲ−Ｂの発現に従うか又はＩＲ−Ａ及びＩＲ−Ｂの相対量により腫瘍を分類することができる。このようにして腫瘍を分類することにより、ＩＲ−Ａ及び／又はＩＲ−Ｂを過剰発現している腫瘍又はＩＲ−Ｂに対するＩＲ−Ａの変動もしくはその逆を有する腫瘍を同定することができるようになる。腫瘍を分類する方法は、腫瘍組織試料中のＩＲ−Ａ及び／又はＩＲ−Ｂの発現又はＩＲ−Ｂに対するＩＲ−Ａの量もしくはその逆を定量することと、その定量に基づいて分類を行うことと、を含み得る。腫瘍がある患者を治療する方法は、腫瘍組織試料中のＩＲ−Ａ及び／又はＩＲ−Ｂの発現又はＩＲ−Ｂに対するＩＲ−Ａの量又はその逆を定量することにより腫瘍を分類することと、ＩＲ−Ａ及び／又はＩＲ−Ｂの発現又はＩＲ−Ｂに対するＩＲ−Ａの量もしくはその逆の定量に基づき分類を割り当てることと、その分類に従い、ＩＧＦＩ／ＩＩリガンド又はＩＧＦＲ１受容体アンタゴニスト又はアゴニストを患者に投与することと、を含み得る。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】図１Ａ−１ＢはＩＲ−Ａ及びＩＲ−Ｂを示す。図１Ａは、ＩＲ−Ａ及びＩＲ−Ｂのゲノム構造を示す。図１Ｂは、左にエクソン位置を示し、右に機能ドメイン位置を示す、ＩＮＳＲホモ二量体のα及びβサブユニットの概略図である。
【図２】ヒトＩＲ−Ａ（配列番号１６）及びＩＲ−Ｂ（配列番号１７）の配列アラインメントであり、このアラインメントは、エクソン１１がＩＲ−Ａから欠落していることを除き、同一であることを示す。
【図３】強い及び弱いリガンド相互作用を説明するＩＧＦ−１Ｒ／ＩＲ受容体の概略図である。
【図４】例えばＩＲ−Ａアッセイのためのプライマー及びプローブ位置の概略を示す。
【図５】図５は、例えばＩＲ−Ａアッセイのためのプライマー及びプローブ位置の概略を示す。
【図６】例えばＩＲ−Ｂアッセイのためのプライマー及びプローブ位置の概略を示す。
【図７】ＩＲ−Ａ、ＩＲ−Ｂ又は空のベクター対照の何れかのプラスミドＤＮＡのおよそ１０７から１０コピーの連続希釈液を用いた、ＩＲ−Ａ又はＩＲ−Ｂ ｑＲＴ−ＰＣＲアッセイの結果を示す。Ｙ軸はサイクル閾値（ｃｙｃｌｅ−ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ（Ｃｔ）値）を表し、Ｘ軸はｌｏｇＤＮＡ複製数を表す。ＩＲ−Ａアッセイに対する標準希釈曲線の傾斜及び相関係数（ｒ２値）はそれぞれ−３．２５９及び０．９９９２である。ＩＲ−Ｂアッセイに対する標準希釈曲線の傾斜及び相関係数（ｒ２値）はそれぞれ−３．１５５及び０．９９８９である。
【図８】正常乳房組織に対する、原発乳癌におけるインスリン受容体及びそのアイソフォームのｍＲＮＡ相対発現レベルを示す。ＴａｑＭａｎ遺伝子発現アッセイによって、正常（ｎ＝１９）と腫瘍（ｎ＝４２）乳房組織試料との間のＩＮＳＲ（トータル）、ＩＲ−Ａ及びＩＲ−Ｂの相対量（ＲＱ）の差を決定した（ｌｏｇ２ベースのスケール）。各試料に対する倍単位の変化の差を計算するために、平均正常ΔＣｔ値を使用した。ウェルチの両側ｔ−検定分析によって、ＩＮＳＲ及びＩＲ−Ｂの両方に対して正常試料と腫瘍試料との間の有意差が確認されたが（Ｐ＜０．００１）、その一方でＩＲ−Ａについては差が見られなかった（Ｐ＝０．４５）。バーは特定の遺伝子標的及び組織型の組み合わせ内のｌｏｇ２ＲＱの中央値を表す。
【図９】対応する正常乳房及び乳癌検体におけるＩＲ−Ａ発現の割合を示す。２（−ΔＣｔ）の計算により算出した、試料内の総インスリン受容体組成物（即ちＩＲ−Ａ＋ＩＲ−Ｂ）に対するインスリン受容体アイソフォーム−Ａ（ＩＲ−Ａ）の割合。対応のある試料ｔ−検定分析から、対応する正常試料と腫瘍試料との間のＩＲ−Ａの割合の計算値について有意差があることが示された（Ｐ＜０．００１）。黒いバーは、正常（４６．６０±４．７４、平均％±９５％ＣＩ）及び腫瘍（７５．２４±５．０３、平均％±９５％ＣＩ）組織内のＩＲ−Ａの割合の中央値（％）に相当する。
【図１０】原発性乳癌におけるＩＲ−Ａ：ＩＲ−Ｂ比の上昇を示す。正常（ｎ＝１９）及び腫瘍（ｎ＝４２）乳房試料におけるインスリン受容体アイソフォームＩＲ−Ａ及びＩＲ−ＢのΔＣｔの差の計算値。正規化のために試料内参照遺伝子パネル（平均Ｃｔ）を利用して、全試料に対してΔＣｔ差（ＩＲ−ＡΔＣｔ−ＩＲ−ＢΔＣｔ）の値を計算した。ウェルチの両側ｔ−検定分析によって、実際のＩＲ−Ａ：ＩＲ−ＢのΔＣｔ差に関して、正常試料と腫瘍試料との間で有意差が認められた（Ｐ＜０．００１）。黒いバーは特定組織型内のＩＲ−Ａ：ＩＲ−ＢΔＣｔ差の中央値を示す。
【図１１】ｑＰＣＲ ｃＤＮＡアレイからの乳癌試料中のＩＲ−Ａ：ＩＲ−Ｂ比の上昇を示す。正常（ｎ＝１５；１０名の個別ドナー由来の試料）、乳癌ｃＤＮＡパネル（ｎ＝１６５）及び２倍超のエストロゲン受容体（ＥＲ）過剰発現がある、これらのｃＤＮＡパネル由来の乳房腫瘍（ｎ＝８３）におけるインスリン受容体アイソフォームＩＲ−Ａ及びＩＲ−Ｂ（Ｙ軸）のΔＣｔ差の計算値。正規化のために試料内参照遺伝子パネル（平均Ｃｔ）を用いて、全試料に対して、ΔＣｔ差（ＩＲ−ＡΔＣｔ−ＩＲ−ＢΔＣｔ）値を計算した。ウェルチの両側ｔ−検定分析によって、実際のＩＲ−Ａ：ＩＲ−ＢΔＣｔ差に関して、正常試料と腫瘍試料との間で有意差が認められた（Ｐ＜０．０００１）。バーは、特定の組織型内の平均ＩＲ−Ａ：ＩＲ−ＢΔＣｔ差の平均値を表す。
【図１２】増殖遺伝子の発現とＩＲ−Ａ：ＩＲ−ＢΔＣｔ差の相関を示す。ＩＲ−Ａ：ＩＲ−ＢΔＣｔ差の計算値（Ｙ軸）とプールした増殖マーカーパネル（ＡＵＲＫＡ、ＢＩＲＣ５、ＣＣＮＢ１、ＫＩ６７及びＭＹＢＬ２）（Ｘ軸）との間の関係の線形回帰分析。特定試料に対する全マーカーにわたるΔＣｔ平均値をとることによって、増殖パネルサマリー値を計算した。正常及び腫瘍試料の両方に対する結果の概要を示す。この線形回帰分析の結果から、２つのサマリー値の間の正相関が示唆される（補正Ｒ２＝０．５９５）。
【図１３】図１３（Ａ及びＢ）はＥＲ＋乳癌のサブタイプにおけるＩＲ−Ａ：ＩＲ−ＢΔＣｔ差を示す。収縮重心分類手段（ｓｈｒｕｎｋｅｎ ｃｅｎｔｒｏｉｄ ｃｌａｓｓｉｆｉｅｒ）に基づく方法（Ａ）及び２試料間のウェルチ検定分析（Ｂ）により判定された試料サブタイプ（正常、ｌｕｍｉｎａｌ− Ａ又はｌｕｍｉｎａｌ−Ｂ）分類に関する、ＩＲ−Ａ：ＩＲ−ＢΔＣｔ差の計算値の散布図。全サブタイプのペアワイズ比較から、有意差（２試料ｔ検定、ｐ＜０．００１）が示される。バーは、特定の試料サブタイプ内のＩＲ−Ａ：ＩＲ−ＢΔＣｔ差の中央値を表す。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
以下のプライマー及びプローブ配列に本明細書中で言及する。
【００２６】
配列番号１（ＴＴＴＡＧＧＡＡＧＡ ＣＧＴＴＴＧＡＧＧＡ ＴＴＡＣＣＴＧＣＡＣ
ＡＡＣＧＴＧＧＴＴＴ ＴＣＧＴＣＣＣＣＡＧ）ＩＮＳＲエクソン１０ Ｃ末端
【００２７】
配列番号２（ＧＣＣＡＴＣＴＣＧＧ ＡＡＡＣＧＣＡＧＧＴ ＣＣＣＴＴＧＧＣＧＡ
ＴＧＴＴＧＧＧＡＡＴ ＧＴＧＡＣＧＧＴＧＧ ＣＣＧＴＧＣＣＣＡＣ）
ＩＮＳＲエクソン１２ Ｎ末端
【００２８】
配列番号３（ＴＧＡＧＧＡＴＴＡＣＣＴＧＣＡＣＡＡＣＧ）ＩＲ−Ａプライマー
【００２９】
配列番号４（ＧＡＴＧＴＴＧＧＧＡ ＡＴＧＴＧＡＣＧＧＴ）ＩＲ−Ａプライマー（逆相補的 配列番号２１）
【００３０】
配列番号５（ＴＴＧＡＧＧＡＴＴＡ ＣＣＴＧＣＡＣＡＡＣＧＴ）ＩＲ−Ａプライマー
【００３１】
配列番号６（ＡＡＡＣＧＣＡＧＧＴＣＣＣＴＴＧＧＣ）ＩＲ−Ａプライマー（逆相補的 配列番号２２）
【００３２】
配列番号７（ＴＣＣＣＣＡＧＧＣＣＡＴＣＴ）ＩＲ−Ａプローブ
【００３３】
配列番号８（ＴＴＴＴＣＧＴＣＣＣＣＡＧＧＣＣＡ）ＩＲ−Ａプローブ
【００３４】
配列番号９（ＡＡＡＡＡＣＣＴＣＴ ＴＣＡＧＧＣＡＣＴＧ ＧＴＧＣＣＣＡＧＧＡ
ＣＣＣＴＡＧ）ＩＮＳＲエクソン１１
【００３５】
配列番号１０（ＧＣＣＡＴＣＴＣＧＧ ＡＡＡＣＧＣＡＧＧＴ ＣＣＣＴＴＧＧＣＧＡ
ＴＧＴＴＧＧＧＡＡＴ ＧＴＧＡＣＧＧＴＧＧ）ＩＮＳＲエクソン１２ Ｎ末端
【００３６】
配列番号１１（ＣＧＴＣＣＣＣＡＧＡＡＡＡＡＣＣＴＣＴＴＣ）ＩＲ−Ｂプライマー
【００３７】
配列番号１２（ＧＧＡＣＣＴＧＣＧＴＴＴＣＣＧＡＧＡＴ）ＩＲ−Ｂプライマー
【００３８】
配列番号１３（ＡＣＴＧＧＴＧＣＣＧＡＧＧＡＣ）ＩＲ−Ｂ特異的プローブ
【００３９】
配列番号１４（ＣＣＧＡＧＧＡＣＣＣＴＡＧＧＣ）ＩＲ−Ｂ特異的プローブ
【００４０】
配列番号１５（ＴＧＣＣＧＡＧＧＡＣＣＣＴＡＧ）ＩＲ−Ｂ特異的プローブ
【００４１】
さらなるプライマー及びプローブ配列には、表３及び４にあるものが含まれる。熟練者は、本明細書中で開示されるプライマーから、ＰＣＲ反応で核酸配列を増幅できるプライマー対を選択することができる（例えば、逆鎖にアニーリングし、正しい方向にＤＮＡ合成を開始させる。）。熟練者はこのようなプライマーの相補体を例えば陰性対照として使用することができることを理解するであろう。
【００４２】
ＩＲ−ＡとＩＲ−Ｂとの間に高い配列同一性があるにもかかわらず、試料中のヒトＩＲ−Ａ及びヒトＩＲ−Ｂの発現を検出及び定量するためのアッセイにおいて、これらの核酸配列及び本明細書中に記載の関連配列を使用することができる。このようにして、初めて、迅速かつ高感度の、試料中のＩＲ−Ａ及び／又はＩＲ−Ｂの発現を調べるための方法が発見された。これらの配列を用いて記載される方法は定量的に正確であり、ハイスループット及び臨床の場で使用することができる。
【００４３】
試験試料においてＩＲ−Ａ及び／又はＩＲ−Ｂの発現を特定するために使用することができる合成核酸配列又はオリゴヌクレオチドは、それらが所望の反応において依然として機能可能である限り、塩基部分、糖部分又は骨格が修飾され得、その他の付属基、標識又はクエンチャーを含み得る、ＤＮＡ、ＲＮＡ、それらのキメラ混合物もしくは誘導体もしくは修飾体であり得る。合成核酸配列は、少なくとも１つの修飾リン酸骨格、例えばホスホロチオアート、ホスホロジチオアート、ホスホルアミドチオアート、ホスホルアミダート、ホスホルジアミダート、メチルホスホネート、アルキルホスホトリエステル及びホルムアセタール又はそれらの類似体などを含み得る。
【００４４】
Ａ．ＩＲ−Ａ核酸配列
適切なＩＲ−Ａ合成核酸配列には、表３及び４で出現するものが含まれる。
【００４５】
ＩＮＳＲ遺伝子のエクソン１０の最後の５０、４５、４０、３５、３０、２５もしくは２０個の塩基（配列番号１）又はストリンジェントな条件下で配列番号１もしくはその相補体とハイブリッド形成可能である配列及び、ＩＮＳＲ遺伝子のエクソン１２の最初の６０、５５、５０、４５、４０、３５、３０、２５もしくは２０個の塩基（配列番号２）又はストリンジェントな条件下で配列番号２もしくはその相補体とハイブリッド形成可能である配列で出現するＩＲ−Ａ核酸配列を含む合成核酸は、試料中のＩＲ−Ａの発現レベルを調べるための定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）（リアルタイムＰＣＲ又は動力学的ＰＣＲとしても知られる。）などのポリメラーゼによる増幅及び検出において使用することができる。
【００４６】
ＩＲ−Ａ配列を含む合成核酸は、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９又は３０個の連続ヌクレオチドを含み得、同時にこの合成核酸配列は、以下の配列の何れか１つの少なくとも１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０個の連続ヌクレオチドを含む：
（ｉ）配列番号３（ＴＧＡＧＧＡＴＴＡＣ ＣＴＧＣＡＣＡＡＣＧ）、それに相補的な配列又はストリンジェントな条件下で配列番号３もしくはその相補体とハイブリッド形成可能である配列；
（ｉｉ）配列番号４（ＧＡＴＧＴＴＧＧＧＡ ＡＴＧＴＧＡＣＧＧＴ）、それに相補的な配列（配列番号２１）又はストリンジェントな条件下で配列番号４もしくはその相補体とハイブリッド形成可能である配列；
（ｉｉｉ）配列番号５（ＴＴＧＡＧＧＡＴＴＡ ＣＣＴＧＣＡＣＡＡＣ ＧＴ）、それに相補的な配列又はストリンジェントな条件下で配列番号５もしくはその相補体とハイブリッド形成可能である配列；又は
（ｉｖ）配列番号６（ＡＡＡＣＧＣＡＧＧＴ ＣＣＣＴＴＧＧＣ）、それに相補的な配列（配列番号２２）又はストリンジェントな条件下で配列番号６もしくはその相補体とハイブリッド形成可能である配列。
【００４７】
ある例において、生体試料中の標的ＩＲ−Ａ核酸配列の有無を判定するためのプライマーセットは、以下うち少なくとも１つの１０から３０個の連続ヌクレオチドを含む合成核酸配列の中から選択され得る少なくとも１つの合成核酸配列を含み得る：（ａ）ＩＮＳＲ遺伝子のエクソン１０の最後の５０、４５、４０、３５、３０、２５もしくは２０個の塩基（配列番号１）、それに相補的な配列又はストリンジェントな条件下で配列番号１もしくはその相補体とハイブリッド形成可能である配列；及び（ｂ）ＩＮＳＲ遺伝子のエクソン１２の最初の６０、５５、５０、４５、４０、３５、３０、２５もしくは２０個の塩基（配列番号２）、それに相補的な配列又はストリンジェントな条件下で配列番号２もしくはその相補体とハイブリッド形成可能である配列。このプライマーセットは、（ｉ）配列番号３、それに相補的な配列又はストリンジェントな条件下で配列番号３もしくはその相補体とハイブリッド形成可能である配列及び、配列番号４、それに相補的な配列（配列番号２１）又はストリンジェントな条件下で配列番号４もしくはその相補体とハイブリッド形成可能である配列又は、（ｉｉ）配列番号５又はその相補的配列；及び配列番号６、それに相補的な配列（配列番号２２）又はストリンジェントな条件下で配列番号６もしくはその相補体とハイブリッド形成可能である配列を含み得る。通常、プライマーセットは、約５０から１５０ｂｐの生成物を生成させるためにＰＣＲで使用される。プローブは、配列番号７もしくは８又はストリンジェントな条件下で配列番号７もしくは８又はその相補体の何れかとハイブリッド形成可能である配列を含み得、適切な標識及びクエンチャーの組み合わせも含み得る。
【００４８】
例として、定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）に有用なプライマーセットは：
配列番号３又はそれに相補的な核酸配列；
配列番号４又はそれに相補的な核酸配列（配列番号２１）；及びクエンチャーも含み得る検出可能な標識を有する、さらなる合成核酸又はプローブを含む。ある例において、さらなる核酸は、１０から５０ヌクレオチドの間の１本鎖核酸配列であり、配列番号３及び４の２つのＰＣＲプライマー間でＩＲ−Ａ ｃＤＮＡ又はその相補体のＤＮＡ配列に特異的に結合するように設計されている。さらなる核酸は、通常、その５’及び３’末端で共有結合する、６−カルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ）又はテトラクロロフルオレシン（ｆｌｕｏｒｅｓｃｉｎ）（ＴＥＴ）などの蛍光レポーター又はフルオロフォア及び、テトラメチルローダミン（ＴＡＭＲＡ）などのクエンチャーを有する。この例において、特異的ＰＣＲ生成物のみが蛍光シグナルを発する。この例において、さらなる核酸は、１０から５０塩基であり得、配列番号７又はストリンジェントな条件下で配列番号７もしくはその相補体とハイブリッド形成可能である配列の少なくとも５〜１４塩基を含む。
【００４９】
別の例において、プライマーセットは、
配列番号５又はそれに相補的な核酸配列；
配列番号６又はそれに相補的な核酸配列（配列番号２２）；及びクエンチャーも含み得る検出可能な標識を有するさらなる核酸を含む。さらなる核酸は、１０から３２ヌクレオチドの間の１本鎖核酸配列であり得、配列番号５及び６の２つのＰＣＲプライマー間でＩＲ−Ａ ｃＤＮＡ又はその相補体のＤＮＡ配列にのみ結合するように設計される。この例において、さらなる核酸は１０から３２塩基であり得、配列番号８又はストリンジェントな条件下で配列番号８もしくはその相補体とハイブリッド形成可能である配列の少なくとも５〜１４塩基を含む。
【００５０】
Ｂ．ＩＲ−Ｂ核酸配列
適切なＩＲ−Ｂ合成核酸配列には、表３及び４で出現するものが含まれる。
【００５１】
ＩＲ−Ｂの発現レベルを調べるための本明細書中で開示される方法、特にＰＣＲに基づく方法において、（ａ）エクソン１０の最後の５０、４５、４０、３５、３０、２５もしくは２０個の塩基（配列番号１）もしくはその相補体又はストリンジェントな条件下で配列番号１もしくはその相補体とハイブリッド形成可能である配列及び、ＩＮＳＲ遺伝子のエクソン１１（配列番号９）もしくはそれに相補的な配列又はストリンジェントな条件下で配列番号９もしくはその相補体とハイブリッド形成可能である配列又は、エクソン１０及び１１を架橋する配列又はストリンジェントな条件下でエクソン１０及び１１を架橋する領域もしくはその相補体とハイブリッド形成可能である配列；及び（ｂ）ＩＮＳＲ遺伝子のエクソン１２の最初の５０、４５、４０、３５、３０、２５もしくは２０個の塩基（配列番号２）、それに相補的な配列又はストリンジェントな条件下で配列番号３もしくはその相補体とハイブリッド形成可能である配列で出現するＩＲ−Ｂ核酸配列を使用することができる。
【００５２】
ある例において、ＩＲ−Ｂ配列を含む合成核酸は、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９又は３０個の連続ヌクレオチドを含み得、この場合、この合成核酸配列は、以下の配列の何れか１つの少なくとも１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０個の連続ヌクレオチドを含む：
（ｉ）配列番号１１又はそれに相補的な配列又はストリンジェントな条件下で配列番号１１もしくはその相補体とハイブリッド形成可能である配列；又は
（ｉｉ）配列番号１２又はそれに相補的な配列又はストリンジェントな条件下で配列番号１２もしくはその相補体とハイブリッド形成可能である配列。
【００５３】
別の例において、生体試料中の標的ＩＲ−Ｂ核酸配列の有無を決定するためのプライマーセットは、以下のうち少なくとも１つの１０から２７個の連続ヌクレオチドを含む合成核酸配列の中から選択され得る少なくとも１つの合成核酸配列を含み得る：（ａ）ＩＮＳＲ遺伝子のエクソン１０の最後の５０塩基（配列番号１）中の５０、４５、４０、３５、３０、２５もしくは２０個の塩基及びエクソン１１（配列番号９）又はそれに相補的な配列；及び（ｂ）ＩＮＳＲ遺伝子のエクソン１２の最初の５０、４５、４０、３５、３０、２５もしくは２０個の塩基（配列番号１０）又はそれに相補的な配列。プライマーセットは、配列番号１１又はそれに相補的な合成核酸配列；及び配列番号１２又はそれに相補的な合成核酸配列の中から選択され得るヌクレオチド配列を含み得る。
【００５４】
プライマーセットがｑＰＣＲなどのＰＣＲで使用される場合、プライマーセットは、配列番号１１又はそれに相補的な合成核酸配列又はストリンジェントな条件下で配列番号１１もしくはその相補体とハイブリッド形成可能である配列と；配列番号１２又はそれに相補的な合成核酸配列又はストリンジェントな条件下で配列番号１２もしくはその相補体とハイブリッド形成可能である配列と；クエンチャーも含み得る検出可能な標識を含むさらなる核酸と、を含み得る。さらなる核酸は、１０から２７ヌクレオチドの間の１本鎖核酸配列であり得、配列番号１１及び１２の２つのＰＣＲプライマーの間でＩＲ−Ｂ ｃＤＮＡの配列もしくはその相補体又はストリンジェントな条件下でその領域もしくはその相補体とハイブリッド形成可能である配列と特異的に結合するように設計されている。例として、さらなる核酸は、１０から２７個の塩基であり得、配列番号１３もしくはその相補体又はストリンジェントな条件下で配列番号１３もしくはその相補体とハイブリッド形成可能である配列の少なくとも５から１４個の塩基を含み得る。さらなる核酸は、１０から３０個の塩基であり得、配列番号１４もしくはその相補体又はストリンジェントな条件下で配列番号１４もしくはその相補体とハイブリッド形成可能である配列の少なくとも５〜１４塩基を含み得る。さらに別の例において、さらなる核酸は１０から３０個の塩基であり得、配列番号１５もしくはその相補体又はストリンジェントな条件下で配列番号１５もしくはその相補体とハイブリッド形成可能である配列の少なくとも５〜１４塩基を含み得る。さらなる核酸は、通常、その５’及び３’末端で共有結合する、６−カルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ）及びテトラクロロフルオレシン（ｆｌｕｏｒｅｓｃｉｎ）（ＴＥＴ）などの蛍光レポーター又はフルオロフォア及びテトラメチルローダミン（ＴＡＭＲＡ）などのクエンチャーを有する。
【００５５】
有用な合成核酸配列はまた、上記で開示される配列の変異形又は本明細書中で開示される核酸と実質的に同様である配列も含む。変異形は、１以上の塩基、例えば２、３、４、５、６、７、８、９又は１０個の塩基により改変されるが、対象のＩＲ−Ａ標的配列の特異的位置になおアニーリング可能である配列を含む。「実質的に同様」という用語は、アニーリング又はハイブリッド形成に関して使用される場合、プライマーなどの合成核酸配列が、ストリンジェントな条件下でその個々の核酸とハイブリッド形成するか又はアニーリングするのに十分に相補的であるはずであることを意味する。この合成核酸配列は、その個々の核酸の正確な配列を反映する必要はなく、実際には「変性物」であってもよい。その合成核酸配列がハイブリッド形成を可能とするようにその配列と十分な相補性を有するならば、非相補的な塩基又は他の配列が合成核酸配列中に散在し得る。従って、例として、ＰＣＲ増幅に使用されるプライマーは、増幅しようとする特異的配列に「実質的に」相補的となるように選択され得る。
【００５６】
本明細書中で使用される場合、「ハイブリッド形成」という用語は、塩基対形成を通じて核酸鎖が相補鎖と連結する過程ならびに例えばＰＣＲ技術において行われる場合の増幅の過程を指す。ある種のヌクレオチド配列の相補体とハイブリッド形成可能なヌクレオチド配列は一般に機能的に同等であり、本明細書中に記載の方法の目的のためにそのヌクレオチド配列と置き換えることができる。
【００５７】
このようにして、この開示により特に高感度で特異的であることが分かった特異的プライマー及びプローブを特定するが、当業者は、有用なプライマーには、本明細書中で開示される例示するプライマーとほぼ同じ位置でポリメラーゼ反応を開始させることができるいかなるプライマーも含まれることを理解するであろう。即ち、ＩＮＳＲ遺伝子のエクソン１０及びエクソン１２において重合反応を開始させるプライマーを使用して、診断用の配列を増幅させることができる。ＩＲ−Ｂ配列のエクソン１０−エクソン１１連結部に及ぶプライマーを使用して、ＩＲ−Ｂ配列を特異的に増幅させることができる。同様に、増幅させたＩＲ−Ａ又はＩＲ−Ｂ標的配列に特異的に結合する、ＩＲ−ＡとＩＲ−Ｂとを区別するさらなるプローブを合成し得る。一般に、より相補的な残基を含むより長い配列ほど、より多くの変化を含有し得る。
【００５８】
「ストリンジェントなハイブリッド形成条件」とは、ストリンジェンシーの低い条件、ストリンジェンシーが中程度の条件及びストリンジェンシーが高い条件の何れかであり得る。一般に、「ストリンジェンシーの低い条件」は、例えば、３２℃での、５ｘＳＳＣ；５ｘデンハルト液；０．５％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ；及び５０％（ｗ／ｖ）ホルムアミドを含む溶液中でのハイブリッド形成である。「ストリンジェンシーが中程度の条件」は、例えば、４２℃での、５ｘＳＳＣ；５ｘデンハルト液；０．５％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ；及び５０％（ｗ／ｖ）ホルムアミドを含む溶液中でのハイブリッド形成である。「ストリンジェンシーが高い条件」とは、例えば、５０℃での、５ｘＳＳＣ；５ｘデンハルト液；０．５％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ；及び５０％（ｗ／ｖ）ホルムアミドを含む溶液中でのハイブリッド形成である。ハイブリッド形成のストリンジェンシーは、温度、核酸濃度、核酸の長さ、イオン強度、時間及び塩濃度などの複数の因子により影響を受ける。これらは、様々なレベルのストリンジェンシーを産み出す例となる条件にすぎない。当業者は、ＰＣＲ反応での所望のストリンジェンシーに対してこのような条件を調整することを含め、ハイブリッド形成条件を適切に調整することによって同様のストリンジェンシーを実現することが可能であろう。
【００５９】
合成核酸配列は、非特異的に核酸を切断する化学物質もしくは酵素又は部位特異的制限エンドヌクレアーゼを用いたより大きい核酸断片の切断により、又は例えば市販の自動ＤＮＡ合成装置及び標準的なホスホラミダイト化学の使用によるものなどの当技術分野で公知の標準的な方法による合成によって得ることができる。修飾された固体支持体上でオリゴヌクレオチドを合成するためのある方法は米国特許第４，４５８，０６６号に記載されている。
【００６０】
所望の合成核酸が合成されたら、核酸を合成した固体支持体から切り離し、存在する保護基を全て除去するために、当技術分野で公知の方法によって、処理すことができる。次に、抽出及びゲル精製を含む当技術分野で公知の何らかの方法によってこの合成核酸を精製することができる。オリゴヌクレオチドの濃度及び純度は、例えばアクリルアミドゲル上でオリゴヌクレオチドを調べることによって、ＨＰＬＣによって又は分光光度計において２６０ｎｍでの光学密度を測定することによって、試験することができる。
【００６１】
本発明の合成核酸配列は、ＩＲ−Ａ及びＩＲ−Ｂの発現の存在について調べるために使用されるあらゆるアッセイにおいて使用することができる。ある例において、本明細書中で開示されるような単離核酸を増幅プロセスで使用することができる。増幅とは、インビトロで核酸鎖を増加させるためのプロセスを指す。代表的技術はＰＣＲであり、これは核酸分子を指数関数的に増幅させる。ＰＣＲは、米国特許第４，６８３，１９５号及び同第４，６８３，２０２号に記載されている。ＰＣＲは標的核酸配列ポリヌクレオチドの特異的検出及び定量に広く使用されており、分子生物学においては標準的な方法である。ＰＣＲは、試験試料中のＩＲ−Ａ及び／又はＩＲ−Ｂの発現を調べるために使用することができる。この方法は単離核酸配列対、「プライマー」を使用し、これはＩＲ−Ａ又はＩＲ−Ｂ ＤＮＡ分子における特異的位置に特異的にアニーリングする。ＩＲ−Ａ又はＩＲ−Ｂ ＤＮＡを熱変性し、増幅しようとするＤＮＡの逆鎖における標的配列を取り囲む２つのオリゴヌクレオチドをハイブリッド形成させる。これらのオリゴヌクレオチドは、ＤＮＡポリメラーゼとともに使用するためのプライマーとなる。このＤＮＡは、プライマー伸長によりコピーされ、両鎖の第二のコピーが作製される。熱変性、プライマーハイブリッド形成及び伸長のサイクルを繰り返すことによって、標的ＩＲ−Ａ又はＩＲ−Ｂ ＤＮＡを約２〜４時間で百万倍以上に増幅することができる。ＰＣＲは、増幅の結果を判定するための検出技術と組み合わせて使用されるべき分子生物学ツールである。ＰＣＲの長所は、およそ４時間で百万から十億倍、標的ＤＮＡの量を増幅することによって感度を向上させることである。
【００６２】
下記で考察し、実施例で説明するように、ＩＲ−Ａプライマー及びプローブを使用する有用な方法は定量的ＰＣＲである。定量的ＰＣＲは、蛍光の光シグナルの検出を用いて増幅反応をリアルタイムで監視できるようにするために蛍光化学とＰＣＲ反応を組み合わせる方法を指す。ある例において、この方法は、ＳＹＢＲ ｇｒｅｅｎなどの配列非特異的蛍光レポーター色素を使用する（Ｗｉｔｔｗｅｒ Ｃ．Ｔ．ら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ．１９９７年１月；２２（１）：１７６−８１）。別の例において、この方法は、ＴＡＱＭＡＮプローブなどの配列特異的蛍光レポーターを使用する（Ｈｅｉｄ Ｃ．Ａ．ら、Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．１９９６，Ｏｃｔｏｂｅｒ；６（１０）：９８６−９４）。ＰＣＲサイクリングプログラムの実行中、光源を用いて試料を励起させる。生成されるＰＣＲ増幅産物の量の指標となる蛍光シグナルは、光検出器又はＣＣＤ／ＣＭＯＳカメラを用いて各反応ウェル中で監視する。反応中の試料中の蛍光を監視することによって、正確な定量的測定を行うことができる。プローブを利用したＰＣＲ法は、ＳＹＢＲ ｇｒｅｅｎ法よりも正確であると考えられる。ＰＣＲ又はｑＰＣＲは通常、プラスチック製の９６又は３８４ウェルマイクロタイタープレート中で行われ、各反応物の体積は５〜５０μＬの規模である。しかし、ＰＣＲは、非常に小さい（ナノリットル）体積で行うことができる。
【００６３】
「プライマー」又は「プライマー対」という用語は、本明細書中で使用される場合、重合反応を開始させるためにＰＣＲで使用される短いオリゴヌクレオチド（通常は１０から３０ｂｐ）を指す。特異的プライマーを、標的配列の特異的位置において重合を開始させることによって増幅しようとするＩＲ−Ａ又はＩＲ−Ｂ ＤＮＡ配列を選択するために使用することができる。
【００６４】
本明細書中に記載の方法は、ＩＲ−Ａ及び／又はＩＲ−Ｂを含有する少量のＤＮＡの、再現性がありロバストな増幅のための方法を提供する。本明細書中に記載の核酸プライマーを用いてｑＰＣＲを行うことによって、０．１ピコグラムのＤＮＡ（１０００複製）から又は３５複製のＤＮＡから、ＩＲ−Ａ又はＩＲ−Ｂを特異的に検出することができる。
【００６５】
生体試料は、この方法の一部の実施においてｃＤＮＡに最初に転写されるＲＮＡを含み得る。細胞総ＲＮＡ、細胞質ＲＮＡ又はポリ（Ａ）＋ＲＮＡを使用し得る。総ＲＮＡ及びポリ（Ａ）＋ＲＮＡを調製するための方法は周知であり、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ−−Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（第２版）、ｖｏｌ．１−３，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．）及びＡｕｓｕｂｅｌら編（１９９４，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．２，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）に全般的に記載されている。好ましくは、Ｃｈｉｒｇｗｉｎら（１９８７）、Ｃｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉ＆Ｓａｃｃｈｉ（１９８７）、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）又はＦａｒｒｅｌｌ Ｊｒ．（１９９３）により記載される技術によって総ＲＮＡを調製し、多くの高品質の市販キットも利用可能である。より好ましくは、Ｃｈｉｒｇｗｉｎら（１９８７）のグアニジンチオシアナート法を用いて、使用する総ＲＮＡを調製する。総ＲＮＡの完全性は当技術分野で公知の様々な方法を用いて確認することができる。例として、ＲＮＡゲル電気泳動法（例えばホルムアルデヒド／アガロースゲル）又はＡｇｉｌｅｎｔ ＬａｂＣｈｉｐを用いてＲＮＡを分析し得る。哺乳動物総ＲＮＡの場合、およそ４．５及び１．９ｋｂの２本のバンドが見えるはずであり；これらのバンドは２８Ｓ及び１８ＳリボソームＲＮＡにそれぞれ相当し、これらのバンドの強度比は通常は１．５〜２．５：１となるはずである。
【００６６】
マイクロスケールのＲＮＡ調製のためのＲＮＡ精製キットは、多くの市販業者から入手可能である（例えばＡｂｓｏｌｕｔｅｌｙ ＲＮＡ（商標）Ｎａｎｏｐｒｅｐ、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ；ＰｉｃｏＰｕｒｅＴＭ、Ａｒｃｔｕｒｕｓ；ＲＮｅａｓｙ（登録商標）、Ｑｉａｇｅｎ；ＲＮＡｑｕｅｏｕｓＴＭ Ｍｉｃｒｏｋｉｔ、Ａｍｂｉｏｎ）。
【００６７】
第一鎖ｃＤＮＡ合成のためのｃＤＮＡ合成オリゴヌクレオチドは、約６０℃から９０℃の温度で、好ましくは約７０℃で、約５分間、適切な緩衝液中でＲＮＡとハイブリッド形成させることができ、次いで、約４℃に冷却し、その後、逆転写酵素を添加する。ｃＤＮＡ合成オリゴヌクレオチドのＲＮＡとのハイブリッド形成後、第一のｃＤＮＡ鎖が合成される。このｃＤＮＡの第一鎖は、好ましくは逆転写のプロセスを通じて生成され、ＤＮＡは、当業者に良く知られる方法に従い、逆転写酵素を用いてＲＮＡから生成される。
【００６８】
伸長後に酵素がデオキシリボヌクレオチドを３’末端に付加する限り（Ｖａｒｍｕｓ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４０：１４２７−１４３５（１９８８））及び酵素がＲＮａｓｅＨ活性を欠く限り、ＲＮＡをＤＮＡに転写するために何らかの逆転写酵素を使用することができる。好ましくは、逆転写酵素はＲＮａｓｅＨ活性を欠くが、より長いｃＤＮＡが合成され得るように野生型ポリメラーゼ活性を保持している。逆転写酵素は、モロニーマウス白血病ウイルス（ＭＭＬＶ）逆転写酵素又はその突然変異形であり得る。逆転写酵素はＰｏｗｅｒＳｃｒｉｐｔ（商標）逆転写酵素（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）であり得る。逆転写酵素はＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＩＩ（商標）であり得る。
【００６９】
当業者に理解されるように、使用される逆転写酵素の量は変動し得る。例えば、およそ１時間、逆転写酵素とともに適切な温度で温置することによって、逆転写が行われるが、この温度は、逆転写酵素が酵素活性を保持する温度範囲でなければならない。この反応は、３７℃と５５℃の間、好ましくは３７℃から４２℃の間で行われ得る。最も好ましくは、この反応は、約４２℃など、至適酵素活性で行われる。逆転写反応は、反応混合物を９５℃に約５分間加熱して酵素を不活性化し、場合によっては続いて氷上で冷却することによって、停止させることができる。
【００７０】
Ｃ．ＩＧＦアンタゴニスト／アゴニスト
本明細書中で使用される場合、ＩＧＦ剤は、ＩＧＦ−１Ｒ／ＩＲシグナル伝達経路の何れかの成員の発現又は活性に影響を与える薬剤を指し、これにはＩＧＦ−１Ｒ、ＩＲ、ＩＮＳＲ又はＩＧＦＩ／ＩＩアンタゴニストもしくはアゴニストが含まれる。ＩＧＦ−１Ｒ、ＩＲ、ＩＮＳＲ又はＩＧＦＩ／ＩＩアンタゴニストもしくはアゴニストは、ペプチド模倣体、タンパク質、ペプチド、核酸、低分子、抗体又はその他の薬物候補であり得る。ＩＧＦ−Ｒ１アンタゴニストの例は当技術分野で周知であり、これには、ＩＧＦ−１Ｒに拮抗するアンチセンス及び核酸が含まれ、例えば、Ｗｒａｉｇｈｔら、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．，１８：５２１−５２６（２０００）；米国特許第５，６４３，７８８号；米国特許第６，３４０，６７４号；ＵＳ２００３／００３１６５８号；米国特許第６，３４０，６７４号；米国特許第５，４５６，６１２号；米国特許第５，６４３，７８８号；米国特許第６，０７１，８９１号；国際公開第２００２／１０１００２号；国際公開第１９９９／２３２５９号；国際公開第２００３／１０００５９号；ＵＳ２００４／１２７４４６号；ＵＳ２００４／１４２８９５号；ＵＳ２００４／１１０２９６号；ＵＳ２００４／００６０３５号；ＵＳ２００３／２０６８８７号；ＵＳ２００３／１９０６３５号；ＵＳ２００３／１７０８９１号；ＵＳ２００３／０９６７６９号；米国特許第５，９２９，０４０号；米国特許第６，２８４，７４１号；ＵＳ２００６／０２３４２３９号；及び米国特許第５，８７２，２４１号に記載されている。
【００７１】
さらに、ＵＳ２００５／０２５５４９３は、低分子２本鎖ＲＮＡを用いたＲＮＡ干渉によるＩＧＦ−１Ｒ発現低下を開示する。さらに、ＩＧＦ−１Ｒを標的とする阻害ペプチドが、インビトロ及びインビボで抗増殖活性を保持するように作製されている（Ｐｉｅｔｒｚｋｏｗｓｋｉら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，５２：６４４７−６４５１（１９９２）；Ｈａｙｌｏｒら、Ｊ．Ａｍ．Ｓｏｃ．Ｎｅｐｈｒｏｌ、１１：２０２７−２０３５（２０００））。ＩＧＦ−１ＲのＣ末端ペプチドは、アポトーシスを誘導し、腫瘍成長を顕著に抑制することが示されている（Ｒｅｉｓｓら、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｐｈｙｓ．，１８１：１２４−１３５（１９９９））。また、可溶性形態のＩＧＦ−１Ｒは、インビボで腫瘍成長を抑制する（Ｄ’Ａｍｂｒｏｓｉｏら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，５６：４０１３−４０２０（１９９６））。ＩＧＦ−ＩＲに対する低分子阻害剤は、例えばＧａｒｃｉａ−Ｅｃｈｅｖｅｒｒｉａら、Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ，５：２３１−２３９（２００４）；Ｍｉｔｓｉａｄｅｓら、Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ，５：２２１−２３０（２００４）；及びＣａｒｂｏｎｉら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ，６５：３７８１−３７８７（２００５）に記載されている。
【００７２】
このような低分子阻害剤に関する開示のさらなる例としては、国際公開第２００２／１０２８０４号；国際公開第２００２／１０２８０５号；国際公開第２００４／５５０２２号；米国特許第６，０３７，３３２号；国際公開第２００３／４８１３３号；ＵＳ２００４／０５３９３１号；ＵＳ２００３／１２５３７０号；米国特許第６，５９９，９０２号；米国特許第６，１１７，８８０号；国際公開第２００３／３５６１９号；国際公開第２００３／３５６１４号；国際公開第２００３／３５６１６号；国際公開第２００３／３５６１５号；国際公開第１９９８／４８８３１号；米国特許第６，３３７，３３８号；ＵＳ２００３／００６４４８２号；米国特許第６，４７５，４８６号；米国特許第６，６１０，２９９号；米国特許第５，５６１，１１９号；国際公開第２００６／０８０４５０号；国際公開第２００６／０９４６００号；及び国際公開第２００４／０９３７８１号が挙げられる。国際公開第２００７／０９９１７１号（ビシクロ−ピラゾール阻害剤）及び国際公開第２００７／０９９１６６号（ピラゾロ−ピリジン誘導体阻害剤）も参照のこと。Ａｂｂｏｔｔ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎの分子Ａ−９２８６０５に対する、（Ｈｕｂｂａｒｄら、ＡＡＣＲ−ＮＣＩ−ＥＯＲＴＣ Ｉｎｔ Ｃｏｎｆ Ｍｏｌ Ｔａｒｇｅｔｓ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒ（１０月２２−２６日、Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ）２００７年、Ａｂｓｔ Ａ２２７）も参照のこと。
【００７３】
ＩＧＦ剤の例としては、ＩＧＦ−Ｉ／ＩＩアゴニスト又はアンタゴニストが挙げられる。特異的ＩＧＦ−ＩＩアンタゴニストも当技術分野で公知であり、これには、ＩＧＦ−Ｉ及び／又はＩＧＦ−ＩＩに結合する抗体が含まれる。このようなアンタゴニストは、国際公開第２００７０２２１７２号及び欧州特許第４９２５５２号で開示されている。ＩＧＦ−Ｉ及びＩＧＦ−ＩＩの両方に結合する抗体の例としては、国際公開第２００７０７０４３２号、国際公開第０５／１８６７１号、国際公開第０３／０９３３１７号、国際公開第０５／０２７９７０号及び国際公開第０５／０２８５１５号に記載のものが挙げられる。
【００７４】
ＩＧＦアンタゴニストとして有用な抗体の具体例には、表１及び２で列挙される重鎖及び軽鎖成分が含まれる。これらの抗体は、その全体において本明細書中に参照により組み込まれるＷＯ２００７０７０４３２に開示されている。特定の抗体としては、７．１５９．１、７．１５８．１及び７．３４．１と呼ばれるものが挙げられる。上記で開示される薬剤及び抗体は、それらの全体において本願に組み込まれる。
【表１】
＊ハッチ表記（＃）は生殖細胞系列におけるスペースを指し、この表で示される抗体配列との適正なアラインメントを示すために使用される。
＊＊上記の表で示される生殖細胞系列配列は、アラインメントを目的とするものであり、各個別の抗体領域が、インビボで免疫グロブリン生殖細胞系列ＤＮＡセグメントの可変領域内でそれ自身の位置に存在することを理解されたい。
【表２】
＊ハッチ表記（＃）は生殖細胞系列におけるスペースを指し、この表で示される抗体配列との適正なアラインメントを示すために使用される。
＊＊上記の表で示される生殖細胞系列配列は、アラインメントを目的とするものであり、各個別の抗体領域が、インビボで免疫グロブリン生殖細胞系列ＤＮＡセグメントの可変領域内でそれ自身の位置に存在することを理解されたい。
【００７５】
Ｄ．ＩＲ−Ａ及びＩＲ−Ｂ発現を検出及び／又は定量する方法
試料中のＩＲ−Ａ又はＩＲ−Ｂレベルを調べるために、上で開示されるＩＲ−Ａ及びＩＲ−Ｂ合成核酸配列、プライマー及びプローブセットを使用することができる。このアッセイの感度を考慮すると、本発明の分子は多くの用途を有し得る。
【００７６】
好ましいアプローチは、定量的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（Ｑ−ＰＣＲ、ｑＰＣＲ、ｑｒｔ−ＰＣＲ又はＲＴＱ−ＰＣＲなど様々に略称される）又は動力学的ポリメラーゼ連鎖反応（ＫＰＣＲ）とも呼ばれるリアルタイムポリメラーゼ連鎖反応を使用することである。細胞又は組織中のメッセンジャーＲＮＡ及び非コードＲＮＡを定量するために、逆転写とリアルタイムＰＣＲが組み合わせられることが多い。逆転写ＰＣＲによって、予めｃＤＮＡを調製することなくＲＮＡ含有試料から開始することができるようになる。リアルタイム逆転写ＰＣＲは、しばしばｑＲＴ−ＰＣＲ、ＲＲＴ−ＰＣＲ又はＲＴ−ｒｔＰＣＲと表記される。これによって、ＤＮＡ試料中の１以上の特異的配列の検出及び定量の両方が可能になる（ＤＮＡ投入量又はさらなる正規化遺伝子に対して正規化する場合の、絶対的コピー数又は相対量として）。
【００７７】
この手順は、ポリメラーゼ連鎖反応の一般過程に従う。しかし、増幅されたＤＮＡは、リアルタイムに反応進行とともに検出される。リアルタイムＰＣＲにおける生成物の検出のための２つの一般的な方法は、（１）何らかの２本鎖ＤＮＡに挿入される非特異的蛍光色素及び（２）プローブとその相補的ＤＮＡ標的とのハイブリッド形成後にのみ検出が可能となる蛍光レポーターで標識されるオリゴヌクレオチドからなる配列−特異的ＤＮＡプローブである。
【００７８】
蛍光レポータープローブは、プローブ配列を含有するＤＮＡのみを検出し；従って、レポータープローブを使用すると特異性が顕著に向上し、非特異的ＤＮＡ増幅が存在しても定量が可能となる。蛍光プローブは、標的とされる遺伝子が全て同様の効率で増幅されるならば、様々な色の標識を有する特異的プローブに基づき、同じ反応中のいくつかの遺伝子の検出のために、多重アッセイにおいて使用することができる。
【００７９】
本方法は、一般に、プローブの片方の末端に蛍光レポーターが付加されており、プローブの他方の末端に蛍光のクエンチャーが付加されているＤＮＡに基づくプローブを使用する。クエンチャーへのレポーターの近接近によりその蛍光の検出が妨げられ；ポリメラーゼの５’から３’方向のエクソヌクレアーゼ活性によるプローブの切断によってレポーターがクエンチャーから離され、それ故に蛍光発光が抑制されなくなる。従って、各ＰＣＲサイクルでのレポータープローブが標的とする生成物が増加すると、プローブの切断及びレポーターの放出によって蛍光の比例した増加が起こる。
【００８０】
ＰＣＲ試料は通常と同様に調製し、レポータープローブを付加する。反応が開始されると、ＰＣＲのアニーリング段階中にプローブ及びプライマーの両方がＤＮＡ標的にアニーリングする。
【００８１】
新しいＤＮＡ鎖の重合はプライマーから開始され、ポリメラーゼがプローブに到達すると、その５’−３’−エクソヌクレアーゼがプローブを分解し、蛍光レポーターをクエンチャーから物理的に引き離し、その結果蛍光が増強する。蛍光は、リアルタイムＰＣＲサーモサイクラーにおいて検出され、測定され、生成物の指数関数的増加に対応するその幾何級数的増加は、各反応における閾値サイクル（ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ ｃｙｃｌｅ（ＣＴ））を決定するために使用される。
【００８２】
反応の指数期中に存在するＤＮＡの相対濃度は、対数スケールでサイクル数に対して蛍光をプロットすることにより調べることができる（指数関数的に量が増加すると直線になる）。バックグラウンドを上回る蛍光の検出に対する閾値が決定される。試料からの蛍光が閾値を越えるサイクルをサイクル閾値、Ｃｔと呼ぶ。指数期中、ＤＮＡの量は、理論的にはサイクルごとに２倍になり、ＤＮＡの相対量を計算することができ、例えばＣｔが別の試料よりも３サイクル小さい試料は、２３＝８倍多い鋳型を有する。全てのプライマーセットが同じように良好に機能するわけではないので、最初に反応効率を計算しなければならない。このようにして、基数としてこれを使用し、指数としてサイクルの差（ｃｙｃｌｅ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ）Ｃ（ｔ）を用いることによって、開始時の鋳型の差を（２ｘ効率％）Ｃｔとして計算することができる。
【００８３】
次いで、結果を公知の量のＲＮＡ又はＤＮＡの連続希釈物（例えば未希釈、１：４、１：１６、１：６４）のリアルタイムＰＣＲにより作成した標準曲線と比較することによって、ＲＮＡ又はＤＮＡの量を決定することができる。遺伝子発現を正確に定量するために、対象となる遺伝子からのＲＮＡの測定量を同じ試料において測定したハウスキーピング遺伝子からのＲＮＡ量で除して、様々な試料間のＲＮＡの量及び質の起こり得る変動に対して正規化する。正規化で使用される参照遺伝子の発現が全試料にわたり非常に類似しているならば、この正規化によって、様々な試料間の対象となる遺伝子の発現の正確な比較が可能となる。
【００８４】
ＭＡＫ２など、機序に基づくｑＰＣＲ（ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｂａｓｅｄ ｑＰＣＲ）定量法も記載されている。これらは、定量のための標準曲線を必要としない。これらの機序に基づく方法は、元の試料濃度の推定を行うためのポリメラーゼ増幅プロセスに関する知識を利用している。
【００８５】
相対量及び絶対量を調べるためにリアルタイムＰＣＲを使用することができる。相対定量は、標的量における倍単位での差（２ｘ、３ｘなど）の尺度である。絶対量は、公知の標準物質と比較することによって、存在する正確な標的分子数を与える。
【００８６】
Ｅ．腫瘍の診断分類
腫瘍を分類する方法は、腫瘍試料を提供することと；その試料を合成ＩＲ−Ａ特異的オリゴヌクレオチドと接触させることと；腫瘍中のＩＲ−Ａ量を検出又は定量することと、を含み得る。腫瘍におけるＩＲ−Ａ量を対照組織試料と又は正常組織に対する母集団平均と比較し得る。例えば、乳癌腫瘍試料を、同じ患者の疾患のない乳房由来の試料と又は非罹患乳房組織に対する母集団平均と比較し得る。ＩＲ−Ａの発現の上昇は、その腫瘍がＩＲ−Ａ発現腫瘍であることを示す。
【００８７】
あるいは、腫瘍を分類する方法は、対照試料又は母集団平均と比較して、腫瘍におけるＩＲ−Ｂ量を検出及び／又は定量することを含み得る。このようにして、腫瘍を分類する方法は、腫瘍試料を提供することと；その試料を合成ＩＲ−Ｂ特異的オリゴヌクレオチドと接触させることと；腫瘍中のＩＲ−Ｂ量を検出又は定量することと、を含み得る。腫瘍におけるＩＲ−Ｂ量を対照組織試料と又は正常組織に対する母集団平均と比較し得る。例えば、乳癌腫瘍試料を、同じ患者の疾患のない乳房由来の試料と又は非罹患乳房組織に対する母集団平均と比較し得る。ＩＲ−Ｂの発現の上昇は、その腫瘍がＩＲ−Ｂ発現腫瘍であることを示す。
【００８８】
腫瘍を分類する方法は、ＩＲ−Ａ及びＩＲ−Ｂの相対発現レベルを決定することを含み得る。相対発現は、ＩＲ−Ａ：ＩＲ−Ｂ ｍＲＮＡの比として又は総ＩＲ ｍＲＮＡの割合としての何れかの％として、例えばＩＲ−Ａの％として記述することができる。ＩＲ−Ａ及びＩＲ−Ｂの相対発現はまた、ｑＰＣＲにおける閾値サイクルの差、例えば（ＩＲ−ＡΔＣｔ）−（ＩＲ−ＢΔＣｔ）＝ΔΔＣｔにより示すこともでき、試料中のＩＲ−Ｂ ｍＲＮＡに対するＩＲ−Ａ ｍＲＮＡの比は２−ΔΔＣｔとほぼ等しい。ΔＣｔの計算の場合、実験によるＣｔ値は、内部標準に対して正規化することができる。例えば、１以上のハウスキーピング遺伝子の平均Ｃｔなど、遺伝子発現パネルの試料内の平均（即ちＩＲ−Ａ及び／又はＩＲ−Ｂ発現と同じ試料から得られる。）Ｃｔ値をＩＲ−Ａ及びＩＲ−Ｂに対するＣｔ値の正規化のために使用して、ΔＣｔ値を計算することができる。
【００８９】
腫瘍組織試料など、組織試料を分類するために、総ＩＮＳＲ発現に対するＩＲ−Ａの％に基づき、組織型におけるＩＲ−Ａの％の平均及び標準偏差を最初に計算する。別のアプローチにおいて、平均の信頼範囲が、予め選択された信頼区間、例えば９５％、９７．５％、９９％又は９９．９％の信頼に対して統計的に決定される。次に、組織試料中の総ＩＮＳＲ発現に対するＩＲ−Ａの％を組織試料において決定する。総ＩＮＳＲ発現からのＩＲ−Ａの％が平均よりも大きい場合、この組織は、ＩＲ−Ａ発現の割合が上昇していると言うことができる。総ＩＮＳＲ発現中のＩＲ−Ａの割合が１〜３標準偏差を超えて、より大きい場合、例えば２標準偏差を超えて大きい場合、その試料は、ＩＲ−Ａの割合が実質的に上昇していると言うことができる。同様に、総ＩＮＳＲ発現中のＩＲ−Ａの割合が予め選択された信頼レベルに対する平均値の信頼区間の上限よりも大きい場合、その組織はＩＲ−Ａの割合が異常に高いと言うことができる。組織のタイプに対して、平均値の９５％、９７．５％、９９％又は９９．９％信頼区間の１、２又は３倍を超える組織試料に分類が割り当てられ得る。
【００９０】
あるいは、腫瘍の既知の分類に対して、総ＩＮＳＲ ｍＲＮＡに対するＩＲ−Ａ ｍＲＮＡの割合の平均及び予め選択した信頼レベルに対する信頼区間を決定し得る。組織試料のＩＲ−Ａの％測定値が信頼区間内に収まる場合、その測定は腫瘍分類と合致すると言うことができる。
【００９１】
例として、正常乳房組織は、９５％信頼で、総ＩＮＳＲ ｍＲＮＡに対する割合として４６．６±４．７％のＩＲ−Ａ ｍＲＮＡを含有すると決定されている。乳房腫瘍組織は、±５％の９５％信頼区間で、総ＩＮＳＲ ｍＲＮＡに対して７５．２４％のＩＲ−Ａを含有することが見出されてた。これらの測定は、有意差があるとされている（ｐ＜０．０００１）。４６．６％よりも大きい組織試料ＩＲ−Ａ％は、ＩＲ−Ａの平均％よりも高いことを示すと言うことができ得る。しかし、正常組織の平均値と腫瘍組織の平均値との間のほぼ中間点であり、個々の９５％信頼範囲を優に超える約６０％に閾値を設定すると、不正確に分類される試料の数が最小限に抑えられる。熟練者は、４７〜７５％の範囲で閾値を調整し得、例えば、比較的包括的な分類を容易にするために、５５％から６５％の範囲で閾値を選択する。
【００９２】
別の例として、ＩＲ−Ａ及びＩＲ−ＢのΔＣｔ値を任意の型の正常組織に対して決定し得る。平均値より、１、２、３標準偏差またはそれ以上低い（ＩＲ−ＡΔＣｔ）−（ＩＲ−ＢΔＣｔ）の差を有すると決定された組織試料は、ＩＲ−Ｂ発現に対してＩＲ−Ａ発現のレベルが不均衡であるものとして分類され得る。一方、正のΔＣｔ差は、ＩＲ−Ｂ発現レベルが不均衡であることを示す。例証するために、正常及び原発腫瘍乳房試料においてＩＲ−Ａ：ＩＲ−ＢΔＣｔ差を決定した。平均ＩＲ−Ａ：ＩＲ−ＢΔΔＣｔ±９５％ＣＩは正常の場合０．２０±０．２３（ｎ＝１９）であり、原発腫瘍では、平均ＩＲ−Ａ：ＩＲ−ＢΔΔＣｔ差±９５％ＣＩは−１．８１±０．２７（ｎ＝４２）であった。従って、ＩＲ−Ａ：ＩＲ−ＢΔΔＣｔ＜約０．２である組織試料は、平均ＩＲ−Ａ：ＩＲ−ＢΔΔＣｔよりも高い値を有すると言うことができ、ＩＲ−Ａ発現の割合の平均値よりも高いことが示される。しかし、閾値を約−０．４、−０．６、−０．８、−１．０又は−１．２に設定することによって、信頼レベルが向上する。中間点（この例において約−０．７から−０．９のＩＲ−Ａ：ＩＲ−ＢΔΔＣｔ）付近に閾値を設定することにより、正しくない分類の数が最小限に抑えられる。言うまでもなく、熟練者は、より包括的に、またはより包括的でないように、分類のための必要性のバランスを取るために、平均値の間の範囲の何れかに閾値を調整し得る。従って、ＩＲ−Ａ：ＩＲ−ＢΔΔＣｔ差が、ＩＲ−Ｂに対するＩＲ−Ａの量が変化している乳房腫瘍組織と合致するものとして試料を分類するための閾値は、０．２から−１．８の範囲に設定され得、例えば９５％信頼区間に基づき、約０．４から約−１．５４の間に設定される。
【００９３】
別の例として、ＩＲ−Ａ及びＩＲ−Ｂの相対発現は、腫瘍サブタイプ、例えばｌｕｍｉｎａｌ Ａ及びｌｕｍｉｎａｌ Ｂ乳癌を分類するために使用され得る。例えば、正常、ｌｕｍｉｎａｌ Ａ及びｌｕｍｉｎａｌ ＢにおけるＩＲ−Ａ：ＩＲ−ＢΔＣｔ差を比較した。平均ＩＲ−Ａ：ＩＲ−ＢΔΔＣｔ±９５％ＣＩは、正常の場合０．２７±０．３０（ｎ＝１５）であった。ｌｕｍｉｎａｌ Ａに分類される乳癌では、平均ＩＲ−Ａ：ＩＲ−ＢΔΔＣｔ±９５％ＣＩは−１．０９±０．３４（ｎ＝１３）であった。ｌｕｍｉｎａｌ Ｂに分類される乳癌では平均ＩＲ−Ａ：ＩＲ−ＢΔΔＣｔ±９５％ＣＩは−２．１２±０．３４（ｎ＝２７）であった。全サブタイプのペアワイズ比較から、有意差が示される（２−試料ｔ検定、ｐ＜０．００１）。従って、正常とｌｕｍｉｎａｌ Ａ腫瘍組織との間のＩＲ−Ａ：ＩＲ−ＢΔΔＣｔ分類に対する閾値は、約０．３から−１．４の間の範囲、例えば約−０．２、約−０．４又は約−０．６に設定され得る。ｌｕｍｉｎａｌ Ａとｌｕｍｉｎａｌ Ｂ腫瘍組織との間のＩＲ−Ａ：ＩＲ−ＢΔΔＣｔ分類のための閾値は、約−１．１から約−２．１の範囲、例えば約−１．５から−１．７５の範囲又は約−１．５５、約−１．６、約−１．６５又は約−１．７に設定され得る。
【００９４】
ＧｅｎｅＣｈｉｐ発現プロファイルに基づき、正常、ｌｕｍｉｎａｌ−Ａ及びｌｕｍｉｎａｌ−Ｂに対する分類スキームを用いて、正常、ｌｕｍｉｎａｌ−Ａ及びｌｕｍｉｎａｌ−Ｂに分類された腫瘍試料におけるＩＲ−Ａ：ＩＲ−ＢΔＣｔ差を比較した。正常において、平均ＩＲ−Ａ：ＩＲ−ＢΔΔＣｔ±９５％ＣＩは０．３２±０．２５（ｎ＝１５）であった。ｌｕｍｉｎａｌ−Ａと予測される乳癌においては、平均ＩＲ−Ａ：ＩＲ−ＢΔΔＣｔ±９５％ＣＩは−１．０５±０．１９（ｎ＝１８）であった。ｌｕｍｉｎａｌ−Ｂと予測される乳癌において、平均ＩＲ−Ａ：ＩＲ−ＢΔΔＣｔ±９５％ＣＩは−２．４２±０．３２（ｎ＝２２）であった。このスキームによると、ｌｕｍｉｎａｌ Ａとｌｕｍｉｎａｌ Ｂ腫瘍組織との間のＩＲ−Ａ：ＩＲ−ＢΔΔＣｔ分類に対する閾値は、約−１．１から約−２．４の範囲、例えば約−１．４から−２．１の範囲又は約−１．４、約−１．６、約−１．７、約−１．８又は約−１．９に設定され得る。サブタイプ分類をさらに改良するために、ＩＲ−Ａ：ＩＲ−ＢΔΔＣｔを他の発現プロファイルと組み合わせることができる。
【００９５】
例えば増殖スコアを決定するために、特に他の癌増殖の予測因子と組み合わせて、癌増殖の予測因子として、組織中のＩＲ−Ａ及びＩＲ−Ｂの相対発現レベルを使用することができる。予測される増殖比率から、個々の癌の予後及び悪性度に対する有用な情報が提供され得る。上記データから、ＩＲ−ＡＴＲ−ＢΔＣｔ差と増殖スコアとの間の正相関が示される。このようにして、腫瘍組織をスコア化するための方法は、ＩＲ−Ａ及びＩＲ−Ｂ発現の相対的比率を調べることと、ＩＲ−Ａ及びＩＲ−Ｂの相対発現に少なくとも一部基づき、増殖スコアを割り当てることと、を含み得る。
【００９６】
これらの方法を用いた分類のための腫瘍試料は、肺、乳房、前立腺、結腸、卵巣、膵臓、脳、食道、子宮内膜、子宮頸部、消化管又は皮膚由来の試料を含むいずれの適切な腫瘍試料でもあり得る。腫瘍試料は、ＩＧＦ−Ｒ１／ＩＲ−Ａなどの細胞表面受容体を通じてのみ、又は一部それを通じて腫瘍活性が媒介される何れかの患者から採取することができる。例えば、腫瘍は、白血病、多発性骨髄腫又はリンパ腫などの非固形腫瘍であってもよいし、固形腫瘍、例えば胆管、骨、膀胱、脳／ＣＮＳ、乳房、結腸直腸、子宮頸部、子宮内膜、胃、頭頸部、肝臓、肺、筋肉、神経、食道、卵巣、膵臓、胸膜／腹膜、前立腺、腎臓、皮膚、精巣、甲状腺、子宮及び外陰部の腫瘍であってもよい。ある例において、腫瘍は、乳房の腫瘍である。別の例において、腫瘍は膀胱の腫瘍である。別の例において、腫瘍は肝臓の腫瘍である。
【００９７】
適切な腫瘍試料は当技術分野で公知のように調製することができる。例えば、針生検を介して生きている腫瘍細胞を得て、次いで標準的手順に従いインビトロで培養する。あるいは、吸引後に腫瘍細胞をすぐに固定するか又は腫瘍を（全体又は一部）を摘出し、免疫組織学的染色用に切片を調製し得る。
【００９８】
腫瘍細胞をインビトロで培養することにより、刺激後の内在化動態の測定が可能となり、一方で試料をすぐに固定すると、腫瘍内の受容体の静的な局在性をアッセイできる。
【００９９】
Ｆ．治療方法
ＩＧＦ−１受容体（ＩＧＦ−ＩＲ）経路は複雑であり、複数の因子が含まれる（図３参照）。ＩＧＦ−１Ｒは、インスリン受容体（ＩＮＳＲ）とハイブリッド受容体を形成することができ、実際に形成する。ＩＧＦリガンドであるＩＧＦ−Ｉ及びＩＧＦ−ＩＩは、最初にＩＧＦ−１Ｒと相互作用し、様々な細胞内シグナル伝達カスケードを活性化することによって、それらの様々な効果を発揮する。具体的には、ＩＧＦ−Ｉは、ＩＧＦ−ＩＲを活性化することによって主に機能し、一方でＩＧＦ−ＩＩはＩＧＦ−ＩＲを通じて又はＩＲ−Ａアイソフォームを通じての何れかで作用し得る。ＩＧＦ−１Ｒ、そのＩＧＦリガンド及びＩＲ−Ａは、乳癌及び前立腺癌の両方を含む多くの癌に関与しており、癌治療における使用のための多くのアンタゴニストが、ＩＧＦ−ＩＲ及びＩＧＦリガンドを標的とするために開発されている。
【０１００】
ＩＧＦ経路を標的とする現在利用可能な多数のアンタゴニストがあることを考えると、患者が反応する可能性があるか又は反応性が高いアンタゴニストの選択が所望される。例えば、ＩＧＦ−１Ｒアンタゴニストには、これらのアンタゴニストがＩＲ−Ａ経路を阻害しないという欠点がある。文献において、ＩＲ−Ａは、癌において過剰発現される場合、ＩＧＦ−１Ｒアンタゴニストに対する耐性に関与し得ることが示唆されていることを考えると、ＩＧＦ−１ＲだけではなくＩＲ−Ａも標的とするアンタゴニストを投与することが望ましい。このようなアンタゴニストの例は、特異的にＩＧＦ−ＩＩを標的とし、ＩＧＦ−Ｉと交差反応し得る抗体である。
【０１０１】
これらのＩＧＦ−Ｉ及びＩＩアンタゴニストは、ＩＧＦ−ＩＲ及びＩＲ−Ａシグナル伝達の両方に対する阻害能を有し、その結果、ＩＧＦ−１Ｒよりも臨床における活性が幅広く、低分子ＩＧＦ−１Ｒ／ＩＲ−Ａ／ＩＲ−Ｂ阻害剤と比較して毒性が低くなる。例としては、ＩＧＦ−Ｉ及び／又はＩＧＦ−ＩＩに対する抗体が挙げられるが、これには国際公開第２００７０７０４３２号で開示されるものが含まれる。特に関心が高いものは、ハイブリドーマ７．１５９．１、７．１５８．１及び７．３４．１により産生される抗体のアミノ酸配列を有する抗体である。
【０１０２】
特定のＩＧＦアンタゴニスト又はアゴニストに反応する可能性が高いことを予測するために、ＩＧＦアンタゴニスト又はアゴニストを用いた治療に対する候補となる患者を選択する方法は、上記方法の何れかを用いてＩＲ−Ａ及び／又はＩＲ−Ｂ発現を定量することと、正常対象に対して又は癌患者集団に対してＩＲ−Ａ及び／又はＩＲ−Ｂの発現量が上昇もしくは低下している患者を選択することと、を含み得る。患者は、ＩＲ−Ｂ発現に対するＩＲ−Ａの相対量の変化によっても選択され得る。
【０１０３】
具体例において、実施者は、腫瘍がＩＲ−Ａ及び／又はＩＲ−Ｂを発現するか否かの決定に基づいて、特定のＩＧＦアンタゴニストを予め選択し得る。ＩＲ−Ａを過剰発現すると決定されている腫瘍の特定によって、ＩＧＦＩ／ＩＩアンタゴニストに対する反応性が高い可能性が最も高い患者を選択する機会が与えられる。
【０１０４】
ある例において、アンタゴニストは、配列番号４５及び５３のアミノ酸配列を含むアミノ酸配列を含む抗体である。別の例において、アンタゴニストは、表１及び２で示されるように、配列番号４５及び５３のＣＤＲ配列を含む抗体である。別の例において、アンタゴニストは、配列番号４５からの３個のＣＤＲ及び軽鎖を含む抗体を含む。別の例において、アンタゴニストは、配列番号５３からの３個のＣＤＲ及び重鎖を含む抗体を含む。
【０１０５】
本方法はまた、ＩＧＦ−１Ｒ又はＩＧＦの特定の阻害剤がインスリン受容体を活性化させているか又は阻害しているかを判定するためにも使用することができる。例えば、ＩＧＦ−１Ｒキナーゼの低分子阻害剤はインスリン受容体を交差阻害することが多いことが知られている。これは代謝性合併症をもたらし得る。ある例において、腫瘍などの試料中のＩＲ−Ａ及び／又はＩＲ−Ｂの発現を決定し、それらの発現を対照と比較する方法である。対照と比較してＩＲ−Ｂの発現が低下しており、ＩＲ−Ａの発現が対照と比較して上昇している場合、ＩＧＦ−Ｉ／ＩＩアンタゴニストなどの代替となるＩＧＦアンタゴニストを選択することが必要となり得る。このように、患者を治療する方法は、例えば患者からの組織試料に対してＩＲ−Ａ：ＩＲ−ＢΔＣｔ差を調べることによってＩＲ−Ａ及びＩＲ−Ｂの相対発現をけっていすることと、ＩＲ−Ｂに対するＩＲ−Ａの割合が閾値よりも低い場合にＩＧＦ−Ｉ／ＩＩアンタゴニストを投与することと、を含み得る。
【０１０６】
別の例において、ある方法により癌患者のサブセットの分類が可能になる。現在、ＩＲ−Ａが乳癌において過剰発現され得ることが知られている。治療のために患者のサブセットを選択する方法は、ＩＲ−Ａを過剰発現するか又はＩＲ−Ｂに対してＩＲ−Ａを不均衡に発現し、従ってＩＧＦＩ／ＩＩアンタゴニストに対する応答が高くなっている可能性がある乳癌患者のサブセットを特定することを含み得る。ＩＧＦＩ／ＩＩアンタゴニストに対する応答が高い可能性がある癌患者を治療する方法は、腫瘍組織試料に対してＩＲ−Ａ：ＩＲ−ＢΔＣｔ差を測定することと、腫瘍組織試料のＩＲ−Ａ：ＩＲ−ＢΔＣｔ差が閾値よりも低く、正常よりも高いＩＲ−ＡのＩＲ−Ｂに対する割合を示す場合に、有効量のＩＧＦＩ／ＩＩアンタゴニストを投与することと、を含み得る。アンタゴニストの例には、ＩＧＦ−Ｉ及び／又はＩＧＦ−ＩＩに結合する抗体が含まれる。ある例において、アンタゴニストは、配列番号４５及び５３のアミノ酸配列を含むアミノ酸配列を含む抗体である。別の例において、アンタゴニストは、表１及び２で示されるように、配列番号４５及び５３のＣＤＲ配列を含む抗体である。別の例において、アンタゴニストは、配列番号４５からの３個のＣＤＲ及び軽鎖を含む抗体を含む。別の例において、アンタゴニストは、配列番号５３からの３個のＣＤＲ及び重鎖を含む抗体を含む。
【０１０７】
応答性が高い又は応答者とは、特定のＩＧＦ剤の投与後に反応するか又はより正の方向に反応する患者を意味する。応答者及び無応答者は、Ｕｎｉｏｎ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｎｔｒｅ ｌｅ Ｃａｎｃｅｒ／Ｗｏｒｌｄ Ｈｅａｌｔｈ Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ（Ｕ ＩＣＣ／ＷＨＯ）基準に従い、客観的腫瘍反応を測定することによって決定することができる。基準は以下のようにカテゴリー分けされる：完全寛解（ＣＲ）：評価可能な全病変部で遺残腫瘍なし；部分寛解（ＰＲ）：測定可能な全病変部の合計のベースラインのもと、遺残腫瘍が化学療法により５０％以上縮小し、新たな病変なし；安定疾患（ＳＤ）：ＣＲとして判定されない遺残腫瘍；及び進行性疾患（ＰＤ）：測定可能な全病変部の合計のベースラインのもと、遺残腫瘍が２５％以上増大しているか又は新たな病変が出現。本明細書中で定義されるように、無応答者はＰＤである。本方法は、ＣＲ又はＰＲである患者を判定するために特に有効である。このようにして、本方法により、個々の患者に治療を適合させ、利用可能なＩＧＦアンタゴニストのタイプの使用をより有効にすることによって、癌患者の予後及びクオリティーオブライフが改善される。
【０１０８】
Ｇ．糖尿病
インスリン受容体を介してシグナル伝達を破壊及び／又は低下させる物質／化合物に対するスクリーニングのための方法。試料中のＩＲ−Ａ又はＩＲ−Ｂの相対的発現を決定することをスクリーニングツールとして使用して、例えばβ細胞において及び末梢組織において、ＩＲ−Ａ又はＩＲ−Ｂ−特異的シグナル伝達カスケードの何れかを選択的に活性化する、低分子化合物及び／又はインスリン模倣体などの薬剤を同定することができる。古典的なインスリン標的組織における顕著なＩＲ−Ｂの発現は、これらの組織におけるＩＲ−Ｂシグナル伝達カスケードの重要性を示す。その結果、ＩＲ−Ｂシグナル伝達カスケードを選択的に刺激する化合物は、β細胞の機能（グルコース応答性及び、従ってインスリン分泌）ならびに末梢インスリン標的組織の機能（グルコース取り込み及び利用、タンパク質合成、脂質合成）を向上させ、従ってインスリン非依存性糖尿病（ＮＩＤＤＭ、２型糖尿病）の２つの主要な原因、即ち末梢インスリン抵抗性及びβ細胞機能不全を対象にする治療を提供する可能性がある。
【０１０９】
このように、インスリンシグナル伝達を調節する薬剤を同定する方法は、試験薬剤と細胞を接触させることと、その試験薬剤によってＩＲ−Ｂ発現が上昇するか又は低下するか否かを決定することと、が含まれる。ＩＲ−Ｂ発現を上昇させる薬剤の同定は、２型糖尿病を治療することにおいてその薬剤が有用であり得ることの指標となる。
【０１１０】
Ｈ．キット
生体試料中のＩＲ−Ａ又はＩＲ−Ｂの存在を検出するためのキットは、ＩＲ−Ａ及び／又はＩＲ−Ｂプローブ又はプライマーを含み得る。本明細書中に記載の方法における使用のための材料は、キットの調製のために理想的に適している。例えば、キットは、腫瘍試料中のＩＲ−Ａ又はＩＲ−Ｂを検出することが可能な、本明細書中で開示されるような核酸配列と；対照試料と；細胞表面受容体の検出方法に関する説明書と、を含み得る。このようなキットは、例えば緩衝液、適切なヌクレオチド三リン酸（例えば、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰ；又はｒＡＴＰ、ｒＣＴＰ、ｒＧＴＰ及びＵＴＰ）、逆転写酵素、ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼ及び１以上のオリゴヌクレオチドを含む、本方法で使用される、それぞれ１以上の様々な試薬（通常は濃縮形態）入りの容器を含み得る。
【０１１１】
容器中のオリゴヌクレオチドはいかなる形態、例えば、凍結乾燥形態又は溶液形態（例えば、蒸留水又は緩衝溶液）などでもあり得る。同じ増幅反応で即時使用できるオリゴヌクレオチドを１つの容器中で組み合わせてもよいし、個別の容器中に入れてもよい。本キットは、場合によっては、別個の容器中で、ＲＮＡポリメラーゼプロモーターに特異的なＲＮＡポリメラーゼ及び／又はＰＣＲ用の緩衝液及び／又はＤＮＡポリメラーゼをさらに含む。本キットは、場合によっては対照核酸をさらに含む。通常は一連の説明書も含まれる。
【０１１２】
本明細書中で開示される方法は、別段の指示がない限り、当業者の能力の範囲内である、化学、分子生物学、微生物学、組み換えＤＮＡ及び免疫学の従来技術を使用する。このような技術は、文献で説明されている。例えば、Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｔｓｃｈ及びＴ．Ｍａｎｉａｔｉｓ，１９８９，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，第２版，１−３巻，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ら（１９９５及びｐｅｒｉｏｄｉｃ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｓ；Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，第９，１３及び１６章，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．）；Ｂ．Ｒｏｅ、Ｊ．Ｃｒａｂｔｒｅｅ及びＡ．Ｋａｈｎ、１９９６、ＤＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ：Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ；Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ（Ｅｄｉｔｏｒ），１９８４，Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ、Ｉｒｌ Ｐｒｅｓｓ；及びＤ．Ｍ．Ｊ．Ｌｉｌｌｅｙ及びＪ．Ｅ．Ｄａｈｌｂｅｒｇ，１９９２，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ：ＤＮＡ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ Ｐａｒｔ Ａ：Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ及びＰｈｙｓｉｃａｌ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ＤＮＡ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓを参照のこと。これらの各一般的教科書はそれらの全体において参照により本明細書中に組み込まれる。
【実施例】
【０１１３】
以下の実施例は、本明細書中に記載の方法を実施するにあたり当業者の一助となるものであり、本開示の範囲を何ら限定するものではない。
【０１１４】
Ｉ．代表的な具体例
以下の実施態様のリストは代表的なものであり、本開示の範囲を何ら限定するものではない。
【０１１５】
１．合成核酸配列が以下の配列の何れか１つの少なくとも１０から２０個の連続ヌクレオチドを含む、１０から３０個の連続ヌクレオチドを含む合成核酸：
（ｉ）配列番号３、それに相補的な配列又はストリンジェントな条件下で配列番号３もしくはその相補体とハイブリッド形成可能である配列；
（ｉｉ）配列番号４、それに相補的な配列（配列番号２１）又はストリンジェントな条件下で配列番号４もしくはその相補体とハイブリッド形成可能である配列；
（ｉｉｉ）配列番号５、それに相補的な配列又はストリンジェントな条件下で配列番号５もしくはその相補体とハイブリッド形成可能である配列；又は
（ｉｖ）配列番号６、それに相補的な配列（配列番号２２）又はストリンジェントな条件下で配列番号６もしくはその相補体とハイブリッド形成可能である配列。
【０１１６】
２．以下の核酸配列の何れか１つから基本的に構成される合成核酸配列：
（ｉ）配列番号３、それに相補的な配列又はストリンジェントな条件下で配列番号３もしくはその相補体とハイブリッド形成可能である配列；
（ｉｉ）配列番号４、それに相補的な配列（配列番号２１）又はストリンジェントな条件下で配列番号４もしくはその相補体とハイブリッド形成可能である配列；
（ｉｉｉ）配列番号５、それに相補的な配列又はストリンジェントな条件下で配列番号５もしくはその相補体とハイブリッド形成可能である配列；又は
（ｉｖ）配列番号６、それに相補的な配列（配列番号２２）又はストリンジェントな条件下で配列番号６もしくはその相補体とハイブリッド形成可能である配列。
【０１１７】
３．配列番号７、それに相補的な配列又はストリンジェントな条件下で配列番号７もしくはその相補体とハイブリッド形成可能である配列から基本的に構成される合成核酸配列。
【０１１８】
４．配列番号８、それに相補的な配列又はストリンジェントな条件下で配列番号８もしくはその相補体とハイブリッド形成可能である配列から基本的に構成される合成核酸配列。
【０１１９】
５．実施態様１−４の何れか１つに記載の合成核酸配列を含む組成物。
【０１２０】
６．（ａ）ＩＮＳＲ遺伝子のエクソン１０の最後の５０塩基（配列番号１）、それに相補的な配列又はストリンジェントな条件下で配列番号１もしくはその相補体とハイブリッド形成可能である配列の、１０から３０個の連続ヌクレオチドを含む合成核酸配列と；
（ｂ）ＩＮＳＲ遺伝子のエクソン１２の最初の６０塩基（配列番号２）、それに相補的な配列又はストリンジェントな条件下で配列番号２もしくはその相補体とハイブリッド形成可能である配列の、１０から３０個の連続ヌクレオチドを含む合成核酸配列と、
を含む、生体試料中のＩＲ−Ａ核酸配列を検出及び／又は定量するためのプライマーセット。
【０１２１】
７．少なくとも１つの合成核酸配列が、
配列番号３、それに相補的な配列又はストリンジェントな条件下で配列番号３もしくはその相補体とハイブリッド形成可能である配列；
配列番号２１、それに相補的な配列又はストリンジェントな条件下で配列番号２１もしくはその相補体とハイブリッド形成可能である配列；
配列番号５、それに相補的な配列又はストリンジェントな条件下で配列番号５もしくはその相補体とハイブリッド形成可能である配列；及び
配列番号２２、それに相補的な配列又はストリンジェントな条件下で配列番号２２もしくはその相補体とハイブリッド形成可能である配列
の中から選択されるヌクレオチド配列を有する、実施態様６に記載のプライマーセット。
【０１２２】
８．（ａ）ポリメラーゼによる増幅に適切な条件下で実施態様６に記載のプライマーセットと生体試料又は生体試料から調製された核酸を接触させる工程；
（ｂ）増幅された対象とするＩＲ−Ａ核酸配列を検出及び／又は定量する工程
を含む、生体試料中のＩＲ−Ａ核酸配列を検出及び／又は定量するための方法。
【０１２３】
９．生体試料が腫瘍試料から調製される、実施態様８に記載の方法。
【０１２４】
１０．プライマーセットが、配列番号３、それに相補的な配列又はストリンジェントな条件下で配列番号３もしくはその相補体とハイブリッド形成可能である配列と、配列番号２１、それに相補的な配列又はストリンジェントな条件下で配列番号２１もしくはその相補体とハイブリッド形成可能である配列と、を含む、実施態様８から９の何れか１つに記載の方法。
【０１２５】
１１．プライマーセットが、配列番号５、それに相補的な配列又はストリンジェントな条件下で配列番号５もしくはその相補体とハイブリッド形成可能である配列と、配列番号２２、それに相補的な配列又はストリンジェントな条件下で配列番号２２もしくはその相補体とハイブリッド形成可能である配列と、を含む、実施態様８に記載の方法。
【０１２６】
１２．前記ポリメラーゼによる増幅が定量的ポリメラーゼ連鎖反応である、実施態様８から１１の何れかに記載の方法。
【０１２７】
１３．プライマーセットが、
配列番号３、それに相補的な配列又はストリンジェントな条件下で配列番号３もしくはその相補体とハイブリッド形成可能である配列と；
配列番号２１、それに相補的な配列又はストリンジェントな条件下で配列番号２１もしくはその相補体とハイブリッド形成可能である配列と；
検出可能な標識も有する、配列番号７、それに相補的な配列又はストリンジェントな条件下で配列番号７もしくはその相補体とハイブリッド形成可能である配列と、
を含む、実施態様１２に記載の方法。
【０１２８】
１４．プライマーセットが、
配列番号５、それに相補的な配列又はストリンジェントな条件下で配列番号５もしくはその相補体とハイブリッド形成可能である配列と；
配列番号２２、それに相補的な配列又はストリンジェントな条件下で配列番号２２もしくはその相補体とハイブリッド形成可能である配列と；
検出可能な標識も有する、配列番号８、それに相補的な配列又はストリンジェントな条件下で配列番号８もしくはその相補体とハイブリッド形成可能である配列と、
を含む、実施態様１２に記載の方法。
【０１２９】
１５．増幅産物が１００塩基未満である、実施態様８から１４の何れかに記載の方法。
【０１３０】
１６．合成核酸配列が、以下の配列の何れか１つの少なくとも１０から２０個の連続ヌクレオチドを含む、１０から３０個の連続ヌクレオチドを含む合成核酸：
（ｉ）配列番号１１、それに相補的な配列又はストリンジェントな条件下で配列番号１１もしくはその相補体とハイブリッド形成可能である配列；又は
（ｉｉ）配列番号１２、それに相補的な配列又はストリンジェントな条件下で配列番号１２もしくはその相補体とハイブリッド形成可能である配列。
【０１３１】
１７．以下の核酸配列の何れか１つから基本的に構成される合成核酸：
（ｉ）配列番号１１、それに相補的な配列又はストリンジェントな条件下で配列番号１１もしくはその相補体とハイブリッド形成可能である配列；又は
（ｉｉ）配列番号１２、それに相補的な配列又はストリンジェントな条件下で配列番号１２もしくはその相補体とハイブリッド形成可能である配列。
【０１３２】
１８．配列番号１３、それに相補的な配列又はストリンジェントな条件下で配列番号１３もしくはその相補体とハイブリッド形成可能である配列から基本的に構成される合成核酸配列。
【０１３３】
１９．配列番号１４、それに相補的な配列又はストリンジェントな条件下で配列番号１４もしくはその相補体とハイブリッド形成可能である配列から基本的に構成される合成核酸配列。
【０１３４】
２０．配列番号１５、それに相補的な配列又はストリンジェントな条件下で配列番号１５もしくはその相補体とハイブリッド形成可能である配列から基本的に構成される合成核酸配列。
【０１３５】
２１．実施態様１−４及び１６−２０の何れか１つに記載の合成核酸配列を含む組成物。
【０１３６】
２２．（ａ）（ｉ）ＩＮＳＲ遺伝子のエクソン１０の最後の５０塩基（配列番号１）、それに相補的な配列又はストリンジェントな条件下で配列番号１もしくはその相補体とハイブリッド形成可能である配列の、１０から３０個の連続ヌクレオチドを含む合成核酸配列、
（ａ）（ｉｉ）ＩＮＳＲ遺伝子のエクソン１１（配列番号９）、それに相補的な配列又はストリンジェントな条件下で配列番号９もしくはその相補体とハイブリッド形成可能である配列の、１０から３０個の連続ヌクレオチドを含む合成核酸配列；又は
（ａ）（ｉｉｉ）エクソン１０及び１１を架橋する塩基、それに相補的な配列又はストリンジェントな条件下でそれともしくはその相補体とハイブリッド形成可能である配列の、１０から３０個の連続ヌクレオチドを含む合成核酸配列；と、
（ｂ）ＩＮＳＲ遺伝子のエクソン１２の最初の５０塩基（配列番号１０）、それに相補的な配列又はストリンジェントな条件下で配列番号１０もしくはその相補体とハイブリッド形成可能である配列又はそれに相補的な配列の、１０から３０個の連続ヌクレオチドを含む合成核酸配列と、
を含む、生体試料中のＩＲ−Ｂ核酸配列を検出及び／又は定量するためのプライマーセット。
【０１３７】
２３．少なくとも１つの合成核酸配列が、
配列番号１１、それに相補的な配列又はストリンジェントな条件下で配列番号１１もしくはその相補体とハイブリッド形成可能である配列；及び
配列番号１２、それに相補的な配列又はストリンジェントな条件下で配列番号１２もしくはその相補体とハイブリッド形成可能である配列
の中から選択されるヌクレオチド配列を有する、実施態様２２に記載のプライマーセット。
【０１３８】
２４．（ａ）ポリメラーゼによる増幅に適切な条件下で実施態様２２又は２３に記載のプライマーセットと生体試料又は生体試料から調製された核酸を接触させる工程；
（ｂ）増幅された標的ＩＲ−Ｂ核酸配列を検出及び／又は定量する工程
を含む、生体試料中のＩＲ−Ｂ核酸を検出及び／又は定量するための方法。
【０１３９】
２５．生体試料が腫瘍試料である、実施態様２４に記載の方法。
【０１４０】
２４．プライマーセットが：
配列番号１１、それに相補的な配列又はストリンジェントな条件下で配列番号１１もしくはその相補体とハイブリッド形成可能である配列と；
配列番号１２、それに相補的な配列又はストリンジェントな条件下で配列番号１２もしくはその相補体とハイブリッド形成可能である配列と、
を含む、実施態様２４に記載の方法。
【０１４１】
２５．前記ポリメラーゼによる増幅が定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ｑ−ＰＣＲ）である、実施態様２４に記載の方法。
【０１４２】
２６．プライマーセットが：
配列番号１１、それに相補的な配列又はストリンジェントな条件下で配列番号１１もしくはその相補体とハイブリッド形成可能である配列と；
配列番号１２、それに相補的な配列又はストリンジェントな条件下で配列番号１２もしくはその相補体とハイブリッド形成可能である配列と；
検出可能な標識も有する、配列番号１３、それに相補的な配列又はストリンジェントな条件下で配列番号１３もしくはその相補体とハイブリッド形成可能である配列と、
を含む、実施態様２５に記載の方法。
【０１４３】
２７．プライマーセットが：
配列番号１１、それに相補的な配列又はストリンジェントな条件下で配列番号１１もしくはその相補体とハイブリッド形成可能である配列と；
配列番号１２、それに相補的な配列又はストリンジェントな条件下で配列番号１２もしくはその相補体とハイブリッド形成可能である配列と；
検出可能な標識も有する、配列番号１４、それに相補的な配列又はストリンジェントな条件下で配列番号１４もしくはその相補体とハイブリッド形成可能である配列と、
を含む、実施態様２５に記載の方法。
【０１４４】
２８．プライマーセットが；
配列番号１１、それに相補的な配列又はストリンジェントな条件下で配列番号１１もしくはその相補体とハイブリッド形成可能である配列；
配列番号１２、それに相補的な配列又はストリンジェントな条件下で配列番号１２もしくはその相補体とハイブリッド形成可能である配列を含み、さらに、
検出可能な標識も有する、配列番号１５、それに相補的な配列又はストリンジェントな条件下で配列番号１５もしくはその相補体とハイブリッド形成可能である配列を含む、実施態様２５に記載の方法。
【０１４５】
２９．増幅産物が１００塩基未満である、実施態様２４から２８の何れかに記載の方法。
【０１４６】
３０．ポリメラーゼによる増幅に適切な条件下で生体試料中のＩＲ−Ａ核酸配列を検出及び／又は定量するためのプライマーセットと生体試料又は生体試料から調製された核酸の試料を接触させること（この場合、プライマーセットは実施態様６に記載のプライマーセットを含む）及び／又はポリメラーゼによる増幅に適切な条件下で生体試料中のＩＲ−Ｂ核酸配列を検出及び／又は定量するためのプライマーセットと生体試料又は生体試料から調製された核酸の試料を接触させることと（この場合、プライマーセットは実施態様２２に記載のプライマーセットを含む）、
増幅された標的ＩＲ−Ａ又はＩＲ−Ｂ核酸配列を検出及び／又は定量することと、
を含む、生体試料中の標的ＩＲ−Ａ核酸配列及び／又は標的ＩＲ−Ｂ核酸配列の有無を決定するための方法。
【０１４７】
３１．実施態様１から１５の何れかに記載の少なくとも１つの合成核酸配列と使用説明書とを含む、生体試料中のＩＲ−Ａの有無を決定するためのキット。
【０１４８】
３２．少なくとも１つの合成核酸配列が、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、該配列の１つに相補的な配列又はストリンジェントな条件下で該配列の１つもしくはその相補体とハイブリッド形成可能な配列の中から選択されるヌクレオチド配列を有する、実施態様３１に記載のキット。
【０１４９】
３３．合成核酸配列が以下のプライマーセットの中から選択される、実施態様３１に記載のキット：
（１）配列番号３、それに相補的な配列又はストリンジェントな条件下で配列番号３もしくはその相補体とハイブリッド形成可能である配列；
配列番号２１、それに相補的な配列又はストリンジェントな条件下で配列番号２１もしくはその相補体とハイブリッド形成可能である配列；及び
検出可能な標識も有する、配列番号７、それに相補的な配列又はストリンジェントな条件下で配列番号７もしくはその相補体とハイブリッド形成可能である配列；又は
（２）配列番号５、それに相補的な配列又はストリンジェントな条件下で配列番号５もしくはその相補体とハイブリッド形成可能である配列；
配列番号２２、それに相補的な配列又はストリンジェントな条件下で配列番号２２もしくはその相補体とハイブリッド形成可能である配列；及び
検出可能な標識も有する、配列番号８、それに相補的な配列又はストリンジェントな条件下で配列番号８もしくはその相補体とハイブリッド形成可能である配列。
【０１５０】
３４．適切なＰＣＲ試薬と；場合によっては、ＩＲ−Ａの有無を決定するための陽性及び／又は陰性対照と、をさらに含む、実施態様３１に記載のキット。
【０１５１】
３５．実施態様１６−２３の何れかに記載の少なくとも１つの合成核酸配列と使用説明書とを含む、生体試料中のＩＲ−Ｂの有無を決定するためのキット。
【０１５２】
３６．合成核酸配列が、配列番号１１、配列番号１２、該配列の何れかと相補的な配列又はストリンジェントな条件下で該配列の何れかもしくはその相補体とハイブリッド形成可能である配列の中から選択されるヌクレオチド配列を有する、実施態様３５に記載のキット。
【０１５３】
３７．合成核酸配列が以下のプライマーセットから選択される、実施態様３５に記載のキット：
（１）配列番号１１、それに相補的な配列又はストリンジェントな条件下で配列番号１１もしくはその相補体とハイブリッド形成可能である配列と；
配列番号１２、それに相補的な配列又はストリンジェントな条件下で配列番号１２もしくはその相補体とハイブリッド形成可能である配列と；
検出可能な標識を有する、配列番号１３、それに相補的な配列又はストリンジェントな条件下で配列番号１３もしくはその相補体とハイブリッド形成可能である配列；または
（２）配列番号１１、それに相補的な配列又はストリンジェントな条件下で配列番号１１もしくはその相補体とハイブリッド形成可能である配列と；
配列番号１２、それに相補的な配列又はストリンジェントな条件下で配列番号１２もしくはその相補体とハイブリッド形成可能である配列と；
検出可能な標識を有する配列番号１４；又は
（３）配列番号１１、それに相補的な配列又はストリンジェントな条件下で配列番号１１もしくはその相補体とハイブリッド形成可能である配列と；
配列番号１２、それに相補的な配列又はストリンジェントな条件下で配列番号１２もしくはその相補体とハイブリッド形成可能である配列と；
検出可能な標識も有する、配列番号１５、それに相補的な配列又はストリンジェントな条件下で配列番号１５もしくはその相補体とハイブリッド形成可能である配列。
【０１５４】
３８．適切なＰＣＲ試薬と；場合によっては、ＩＲ−Ｂの有無を決定するための陽性及び／又は陰性対照と、をさらに含む、実施態様３５に記載のキット。
【０１５５】
３９．実施態様８に従い、試料中のＩＲ−Ａ発現を検出及び／又は定量することと、
実施態様２４に従い、試料中のＩＲ−Ｂ発現を検出及び／又は定量することと、を含み、
ＩＲ−Ａ及びＩＲ−Ｂの発現が、ＩＧＦＩ／ＩＩリガンド又はＩＧＦＩＲ受容体アンタゴニストを対象に投与するべきか否かの指標である、ＩＧＦＩ／ＩＩリガンド又はＩＧＦＲ１受容体アンタゴニストに応答性のある患者を選択するための方法。
【０１５６】
４０．ＩＧＦＩ／ＩＩリガンド又はＩＧＦＲ１受容体アンタゴニストが抗体である、実施態様３９に記載の方法。
【０１５７】
４１．抗体が、表１及び表２に列挙される配列成分を含む、実施態様４０に記載の方法。
【０１５８】
４２．ポリメラーゼによる増幅に適切な条件下で、実施態様６に記載のプライマーセットと生体試料又は生体試料から調製された核酸を接触させることと、
ポリメラーゼによる増幅に適切な条件下で、実施態様２２に記載のプライマーセットと生体試料又は生体試料から調製された核酸を接触させることと；
増幅されたＩＲ−Ａ及びＩＲ−Ｂ核酸配列を定量することと；
それによって生体試料中のＩＲ−Ｂに対するＩＲ−Ａの相対発現を判定することと、
を含む、生体試料中の標的ＩＲ−Ａ核酸配列及びＩＲ−Ｂ核酸配列の相対的な有無を決定するための方法。
【０１５９】
４３．実施態様４２に記載の方法によって腫瘍試料中のＩＲ−Ｂに対するＩＲ−Ａの相対発現を決定することと、
ＩＲ−Ａ及びＩＲ−Ｂの相対発現を含む基準により腫瘍を分類することと、
を含む、腫瘍を分類する方法。
【０１６０】
４４．実施態様４２に記載の方法によって患者の組織中のＩＲ−Ｂに対するＩＲ−Ａの相対発現を決定することと、
ＩＲ−Ａ及びＩＲ−Ｂの相対発現を含む基準により患者を分類し、それによりＩＧＦアンタゴニストに対する患者の相対的な応答性を予測することと、
を含む、ＩＧＦアンタゴニストで治療するための患者を選択する方法。
【０１６１】
４５．ＩＲ−Ａの発現がＩＲ−Ｂに対して上昇している、実施態様３９、４３及び４４の何れかに記載の方法。
【０１６２】
４６．実施態様４２に記載の方法によって組織試料中のＩＲ−Ｂに対するＩＲ−Ａの相対発現を決定することと、
ＩＲ−Ａ及びＩＲ−Ｂの相対発現を含む基準によって患者を分類することと；
該分類に従いＩＧＦアンタゴニストを投与することと、
を含む、ＩＧＦアンタゴニストを用いて患者を治療する方法。
【０１６３】
４７．ＩＲ−Ａの発現がＩＲ−Ｂと比較して上昇している、実施態様４６に記載の方法。
【０１６４】
４８．ＩＧＦアンタゴニストが抗体である、実施態様４４又は４７に記載の方法。
【０１６５】
４９．抗体が、配列番号４５及び５３のアミノ酸配列を含むアミノ酸配列を含む、実施態様４０、４１及び４８に記載の方法。
【０１６６】
５０．抗体が、表１及び２で示されるような配列番号４５及び５３のＣＤＲ配列を含む、実施態様４０、４１及び４８の何れかに記載の方法。
【０１６７】
５１．抗体が、配列番号４５からの３個のＣＤＲ及び軽鎖を含む、実施態様４０、４１及び４８に記載の方法。
【０１６８】
５２．抗体が配列番号５３からの３個のＣＤＲ及び重鎖を含む、実施態様４０、４１及び４８の何れかに記載の方法。
【０１６９】
５３．総インスリン受容体に対するＩＲ−Ａの％が４６．６％より大きい、実施態様４５及び４７の何れかに記載の方法。
【０１７０】
５４．ＩＲＡ：ＩＲ−ＢΔΔＣｔが約０．２未満である、実施態様４５及び４７の何れかに記載の方法。
【０１７１】
５５．ＩＲ−Ａに対するｌｏｇ２ベースのスケールでの相対量の差の平均が、約−０．０７±０．２９であり、ＩＲ−Ｂに対して約−２．０８±０．２５である、実施態様４５及び４７の何れかに記載の方法。
【０１７２】
５６．実施態様４２に記載の方法によって乳癌腫瘍試料中のＩＲ−Ｂに対するＩＲ−Ａの相対的発現を判定することと；ＩＲ−Ａ：ＩＲ−Ｂ比が閾値よりも低い場合にｌｕｍｉｎａｌ Ｂとして乳癌サブタイプを分類することと、を含む、乳癌腫瘍サブタイプを分類する方法。
【０１７３】
５７．ＩＲ−Ａ：ＩＲ−ＢΔΔＣｔを計算することをさらに含み、閾値が、約−１．１から約−２．４の範囲に設定されるＩＲ−Ａ：ＩＲ−ＢΔΔＣｔ値である、実施態様５６に記載の方法。
【０１７４】
５８．閾値が約−１．４から−２．１の範囲である、実施態様５４に記載の方法。
【０１７５】
５９．ＩＲ−Ａ：ＩＲ−ＢΔΔＣｔの決定が、サブタイプ分類を決定することにおいて他の発現プロファイルと組み合わせられ得る、実施態様５７に記載の方法。
【０１７６】
６０．実施態様４２に記載の方法により、腫瘍試料中のＩＲ−Ｂに対するＩＲ−Ａの相対発現を決定することと、より高いＩＲ−Ａ：ＩＲ−Ｂ比がより高い増殖スコアを示す因子であるとみなすことと、を含む、腫瘍に対する増殖スコアを決定する方法。
【０１７７】
６１．ＩＲ−Ａ：ＩＲ−ＢΔΔＣｔを計算することと、より低いＩＲ−Ａ：ＩＲ−ＢΔΔＣｔ値が、より高い増殖スコアを示す因子であるとみなすことと、をさらに含む、実施態様６０に記載の方法。
【０１７８】
６２．試料中のＩＲ−Ａ及びＩＲ−Ｂの相対レベルを決定することを含み、ＩＲ−Ｂに対するＩＲ−Ａの量の上昇が、ｌｕｍｉｎａｌ−Ｂである腫瘍の指標となる、ｌｕｍｉｎａｌ−Ａ又はｌｕｍｉｎａｌ−Ｂとして乳癌試料を分類する方法。
【０１７９】
ＩＩ．実施例
実施例１：ＩＲ−Ａ及びＩＲ−Ｂプライマー及びプローブ設計
市販のアッセイは、ＩＲ−Ａ及びＩＲ−Ｂ発現を区別し、定量することができなかった。そこで、新規プローブが必要であった。インスリン受容体（ＩＮＳＲ）短（ＮＭ＿００１０７９８１７）及び長（ＮＭ＿０００２０８）アイソフォームに対する成熟ｍＲＮＡ転写配列をＮａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）Ｅｎｔｒｅｚ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅデータベースから入手した。ＩＮＳＲ短アイソフォームをＩＲ−Ａと呼び、ＩＮＳＲ長アイソフォームをＩＲ−Ｂと呼ぶ。この２つのアイソフォーム間の違いは、成熟転写物におけるエクソン１１、３６ヌクレオチド領域が存在するか（ＩＲ−Ｂ）又は存在しないか（ＩＲ−Ａ）である。エクソン１１はＩＲ−Ａ型には存在しないが、ＩＲ−Ｂ型は成熟ｍＲＮＡ転写物においてエクソン１１配列を含有する。ＩＲ−Ａ ｍＲＮＡの検出に特異的であるプライマー及びプローブの設計のために、エクソン１０／１２連結領域を遺伝子特異的プローブに対する標的とした。エクソン１０又はエクソン１２コード領域内にそれぞれ位置するいくつかのプライマー対（フォワード及びリバース）を設計した。ＩＲ−Ｂ設計の場合、エクソン１１／１２連結部を標的とし、遺伝子特異的プローブに対してはエクソン１１内部領域を標的とした。エクソン１０内又はエクソン１０／１１連結部及びエクソン１２コード領域にそれぞれ位置するいくつかのプライマー対（フォワード及びリバース）を設計した。プライマー／プローブ設計は全てＰｒｉｍｅｒ Ｅｘｐｒｅｓｓ（ＡＢＩ）ソフトウェアツールにインポートし、確実にＴａｑＭａｎ遺伝子発現アッセイ法における利用に最適な設計となるようにした。プローブは全て、小溝結合（ＭＧＢ）部分を取り込むように設計し、検出用の蛍光色素（ＦＡＭ）及び非蛍光クエンチャーで標識した。設計した全プライマー／プローブの組み合わせの配列を表３及び４に示す。
【表３】
【表４】
【０１８０】
実施例２：プライマー及びプローブの特異性
ＩＮＳＲ長（クローンＳＣ３１１３２８）及び短（クローンＳＣ３１５８８０）転写物に対する全長ｃＤＮＡクローンを含有する市販のプラスミドをＯｒｉＧｅｎｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｉｎｃ．から購入した。各ＩＮＳＲクローンの配列確認を行った。様々な複製数（１０２〜１０７複製）の投入量のＩＮＳＲ長又は短アイソフォームクローンの何れかの存在下で、全ＴａｑＭａｎ遺伝子発現アッセイ設計の特異性及び感度を試験した。全プライマー／プローブ及び鋳型の組み合わせに対して３８４ウェル形式で標準的なＴａｑＭａｎ遺伝子発現アッセイを行った。反応液は、３８４ウェルプレートの最終体積１５μＬ／ウェルに対して、７．５μＬのＴａｑＭａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ、１．５μＬの１０ｘ遺伝子発現アッセイ混合液及び６μＬの様々な複製数のＩＮＳＲ長又は短型ｃＤＮＡクローンの何れかから構成されていた。各プライマー／プローブ及び鋳型の組み合わせを少なくとも３回繰り返した。標準設定（９５℃で１０分間温置し、続いて９５℃で１５秒間及び６０℃で１分間を４０サイクルという構成のサイクリングプログラム）を用いて、全アッセイプレートをＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ７９００ＨＴ検出システムで試験した。ＳＤＳｖ２．０ソフトウェアツール（ＡＢＩ）を用いてデータ値（Ｃｔ値）を各回のアッセイの実行から抽出した。データ抽出及び分析後、以下のプライマー及びプローブアッセイ設計によって発明者らの目的に対して十分な感度及び特異性が得られると決定した：ＩＲ−Ａ１、ＩＲ−Ａ３、ＩＲ−Ｂ３、ＩＲ−Ｂ４及びＩＲ−Ｂ５。
【０１８１】
ＩＲ−Ａ１及びＩＲ−Ａ３アッセイは、約３５コピーの複製数閾値でＩＲ−Ａアイソフォーム配列を検出することができた。これらのアッセイはまた、これらが利用された何れの複製数投入量でもＩＲ−Ｂアイソフォームの存在を検出できなかったことから、ＩＲ−Ａアイソフォームに非常に特異的であることも分かった。あるいは、ＩＲ−Ｂ３、ＩＲ−Ｂ４及びＩＲ−Ｂ５設計は、約３５コピーの複製数閾値でＩＲ−Ｂアイソフォーム配列を検出することができた。これらの設計物はまた、約３５複製の閾値以下でＩＲ−Ａアイソフォームの存在を検出できず、これらが利用された何れのコピー数投入量でもＩＲ−Ａアイソフォームの存在を検出できなかったことから、ＩＲ−Ｂアイソフォームに非常に特異的であることも分かった。
【０１８２】
リアルタイムＰＣＲのためのＢｉｏＭａｒｋ（商標）Ｄｙｎａｍｉｃ Ａｒｒａｙ（Ｆｌｕｉｄｉｇｍ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）マイクロフルイディクスシステムを用いて、これらの特異性実験を繰り返した。このシステムにより、変動性が低く、従来のＲＴ−ＰＣＲとよく相関する高品質データをもたらすハイスループットのリアルタイムＰＣＲ（プレートあたり２３０４の個別の反応が可能）が可能となる。この技術を用いるために、製造者の説明書に従い、ＴａｑＭａｎ Ｐｒｅ−Ａｍｐ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘを用いてｃＤＮＡ試料を予め増幅した。反応液には、２０μＬの最終体積に対して、５μＬのｃＤＮＡ、１０μＬのＰｒｅ−Ａｍｐ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ及び５μＬの０．２ｘ遺伝子発現アッセイミックス（アッセイしようとする全プライマー／プローブから構成）が含有された。推奨されるプログラムを用いて１４サイクルにわたり反応サイクルを繰り返し、次いでＴＥ緩衝液で１：５に希釈した。予め増幅したｃＤＮＡをすぐに使用するか又は必要になるまで−２０℃で保存した。
【０１８３】
４８ｘ４８ダイナミックアレイチップ（Ｆｌｕｉｄｉｇｍ）に投入するための試料を調製するために、反応混合液は、２．５μＬの２ｘＵｎｉｖｅｒｓａｌ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、０．２５μＬのＳａｍｐｌｅ Ｌｏａｄｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ（試料ローディング用緩衝液）（Ｆｌｕｉｄｉｇｍ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）及び２．２５μＬの予め増幅したｃＤＮＡを含有した。プライマー／プローブを調製するために、反応混合液は、２．５μＬの２０ｘＴａｑｍａｎ遺伝子発現アッセイ及び２．５μＬのＡｓｓａｙ Ｌｏａｄｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ（アッセイローディング緩衝液）（Ｆｌｕｉｄｉｇｍ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を含有した。試料及びアッセイ試薬を注入口に投入する前に、ＩＦＣ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｒにおいてチップの準備を行った。記載のように調製した５μＬの試料をダイナミックアレイチップの各試料注入口に投入し、５μＬの１０ｘ遺伝子発現アッセイミックスを各検出器の注入口に投入した。投入及び混合のために、チップをＩＦＣ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｒ上に置いた。およそ１時間後、温度サイクリングのためにチップをＢｉｏＭａｒｋ（商標）リアルタイムＰＣＲシステムに投入した（９５℃で１０分間、続いて９５℃で１５秒間及び６０℃で１分間を４０サイクル）。試料の反復数及び組成は、特定の実験によって変動したが、三重未満にはならなかった。設計されるプローブ感度及び特異性を決定するために平均Ｃｔ値を使用した。
【０１８４】
Ｆｌｕｉｄｉｇｍ ｓｙｓｔｅｍを用いて、従来のリアルタイムＰＣＲを用いて得られた結果を検証した。ＩＲ−Ａ１、ＩＲ−Ａ３、ＩＲ−Ｂ３、ＩＲ−Ｂ４及びＩＲ−Ｂ５はＩＲ−Ａ又はＩＲ−Ｂの何れかに対して特異的であり、約３５コピーの複製数閾値で適切な受容体アイソフォームを検出することができた。
【０１８５】
さらなる分析においても、ＩＲ−ＡもしくはＩＲ−Ｂの何れかを過剰発現することが知られているか又はＩＲ−Ａを過剰発現するように改変されている細胞株からのｃＤＮＡ鋳型を利用した。２つの内因対照遺伝子（ＧＡＰＤＨ及びＡＣＴＩＮ）の平均ＣＴを標的遺伝子の平均Ｃｔから差し引くことによって、各試料に対するΔ比較閾値（ΔＣｔ）を計算した。結果から、これらのプライマー／プローブ設計が、ｃＤＮＡクローンを用いて観察されるのと同じように、細胞株においてＩＲ−Ａ又はＩＲ−Ｂの何れかを再現性よく特異的に検出したことが示された。まとめると、これらの結果から、ｃＤＮＡ又は組織試料のさらなるハイスループット分析に対するＦｌｕｉｄｉｇｍ技術の使用が有効であることが確認され、ＩＲ−Ａ及びＩＲ−Ｂプライマー／プローブ設計の特異性が検証された。複数のプライマー／プローブ設計の品質確認後、発明者らは、多数の一連の乳癌におけるＩＲ−Ａ及びＩＲ−Ｂの発現状態を測定するためにＩＲ−Ａ１及びＩＲ−Ｂ４を選択した。
【０１８６】
１００ｐｇのＩＲ−Ａ又はＩＲ−Ｂの鋳型保存溶液（ＤＮＡ鋳型およそ１０７複製）で開始してＩＲ−Ａ又はＩＲ−Ｂ ｑＲＴ−ＰＣＲアッセイを行うことによって、プローブの感度を検証した。ｌ０−４ｐｇ（およそ１０コピーのＤＮＡ鋳型）までＤＮＡを連続希釈した。２つ組で各試料を試験した。標準鋳型希釈曲線の傾斜は、ｌｏｇＤＮＡ複製数の関数としてサイクル−閾値（Ｃｔ）値をプロットすることによって計算した。この結果を図７で示す。ｌｏｇ［濃度］と、その個々の対応する標準鋳型を用いて試験した各アッセイに対して得られたＣｔ値と、の間で強い相関が認められた。相関係数（ｒ２値）は全て０．９９９以上（ｐ≦０．０００１）であった。両アッセイにおいて上述のＤＮＡ濃度範囲において直線性が維持され、このことから、幅広いダイナミックレンジが示され、正確なＣｔ値が得られる。この結果から、約３５コピーのＤＮＡに対してＩＲ−Ａ及びＩＲ−Ｂアッセイの両方が高い感度で適切なアイソフォームを検出していることが示された。
【０１８７】
ＩＲ−Ｂ ＤＮＡ鋳型の存在下でＩＲ−Ａアッセイを、ＩＲ−Ａ ＤＮＡ鋳型の存在下でＩＲ−Ｂアッセイを、それぞれ試験することによってもアッセイの特異性を評価した。ＩＲ−Ａアッセイは、１０から１０７複製のＩＲ−Ｂ ＤＮＡという試験範囲でＩＲ−Ｂ ＤＮＡ鋳型を増幅しない。同様に、ＩＲ−Ｂアッセイは、試験範囲でＩＲ−Ａ ＤＮＡ鋳型を増幅しない。
【０１８８】
両アッセイに対する標準希釈曲線の傾斜によってアッセイ効率を評価した（図７）。その傾斜は、ＩＲ−Ａに対して−３．２５９であり、ＩＲ−Ｂに対して−３．１５５であった。この２つの傾斜は非常に類似しており、これにより、プローブ効率の差はあまりないことが示唆される。
【０１８９】
実施例３：乳癌患者における発現プロファイリング
Ａ．一般手法
４２例のグレードＩからＩＩＩの浸潤性乳管癌をＩＬＳｂｉｏ（Ｃｈｅｓｔｅｒｔｏｗｎ、ＭＤ）から購入した。１９例の対応する正常な隣接乳房組織試料も入手した。患者の年齢は３１歳から８８歳の範囲であった。乳癌試料は全て、ＩＨＣによれば、ＥＲ及びＰＲ陽性であり、ＨＥＲ２陰性である。いずれの処理を開始する前にも、全試料を新鮮凍結し、回収した。腫瘍試料に対してマクロダイセクションを行い正常組織を除去し、正常試料に対してマクロダイセクションを行って非腺組織を除去した。マクロダイセクション後、全試料における腫瘍純度は８５％超である。
【０１９０】
４種類の乳癌組織ｑＰＣＲ ｃＤＮＡアレイ（ＢＣＲＴ１０１、ＢＣＲＴ１０２、ＢＣＲＴ１０３、ＢＣＲＴ１０４）をＯｒｉＧｅｎｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ）から購入した。ｑＰＣＲアレイは、１５検体の正常乳房組織（１０名の独自のドナー由来）及び１６５検体の乳腺癌組織由来のｃＤＮＡを含有する。腫瘍ステージはＩからＩＶまで様々であり、これらの組織は５０から９０％の腫瘍から構成された。
【０１９１】
ＺＲ ＲＮＡ ＭｉｃｒｏＰｒｅｐキット（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｏｒａｎｇｅ、ＣＡ）を用いて総ＲＮＡを急速凍結組織標本から抽出した。分光光度法でＲＮＡ純度及び濃度を測定した（２６０／２８０＞１．９）。ＲＮＡ６０００ Ｎａｎｏ ＬａｂＣｈｉｐ（登録商標）を用い、Ａｇｉｌｅｎｔ ２１００ ＢｉｏａｎａｌｙｚｅｒにおいてＲＮＡの品質を評価した。
【０１９２】
以下のの実施例のために、ＩＲ−Ａアッセイに対するフォワードプライマーの配列は５’−ＴＧＡＧＧＡＴＴＡＣＣＴＧＣＡＣＡＡＣＧ−３’（配列番号３）であり、リバースプライマーの配列は５’−ＡＣＣＧＴＣＡＣＡＴＴＣＣＣＡＡＣＡＴＣ−３’（配列番号４の相補体）であり、プローブは５’−ＴＣＣＣＣＡＧＧＣＣＡＴＣＴ−３’（配列番号７）である。ＩＲ−Ｂアッセイのためのフォワードプライマーの配列は５’−ＣＧＴＣＣＣＣＡＧＡＡＡＡＡＣＣＴＣＴＴＣ−３’（配列番号１１）であり、リバースプライマーの配列は５’−ＧＧＡＣＣＴＧＣＧＴＴＴＣＣＧＡＧＡＴ−３’（配列番号１２）であり、プローブの配列は５’ＣＣＧＡＧＧＡＣＣＣＴＡＧＧＣ−３’（配列番号１４）である。
【０１９３】
陽性及び陰性対照には、ＩＲ−Ａの全長ｃＤＮＡクローン（ｐＣＭＶ６−ＸＬ４中でクローニング）及びＩＲ−Ｂの全長ｃＤＮＡクローン（ｐＣＭＶ６−ＸＬ５中でクローニング）を含有する市販のｃＤＮＡクローンをＯｒｉＧｅｎｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｉｎｃから購入した（ＩＲ−Ａ：ＳＫＵ＃．ＳＣ３１１３２８；ＩＲ−Ｂ：ＳＫＵ＃ＳＣ３１５８８０）。ＩＲ−Ａ及びＩＲ−Ｂアッセイに対する陰性対照ＤＮＡとしてそれぞれ空のｐＣＭＶ６−ＸＬ４及びｐＣＭＶ６−ＸＬ５のプラスミドを使用した。
【０１９４】
プライマー／プローブ及び鋳型の組み合わせ全てに対して、３８４ウェル方式で標準的ＴａｑＭａｎ遺伝子発現アッセイを行った。反応液は、３８４ウェルプレートのウェルあたり１０μＬの最終体積に対して、５μＬのＴａｑＭａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ、０．５μＬの１０ｘ遺伝子発現アッセイＭｉｘ及び４．５μＬの様々な複製数のＩＲ−Ｂ又はＩＲ−Ａ ｃＤＮＡクローンの何れかから構成された。各プライマー／プローブ及び鋳型の組み合わせを少なくとも３回繰り返した。標準設定（９５℃で１０分間温置し、続いて９５℃で１５秒間及び６０℃で１分間を４０サイクルから構成されるサイクリングプログラム）を用いて、全アッセイプレートをＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ７９００ＨＴ検出システムで試験した。ＳＤＳｖ２．０ソフトウェアツール（ＡＢＩ）を用いてデータ値（サイクル閾値（Ｃｔ）値）を各回のアッセイ実行から抽出した。
【０１９５】
他の遺伝子の発現レベルの評価のために、ＴａｑＭａｎ遺伝子発現アッセイをＡＢＩ（Ｆｏｒｅｓｔ ｃｉｔｙ、ＣＡ）から購入した。このアッセイには、ＩＮＳＲ（アッセイＩＤ：Ｈｓ００９６１５５４＿ｍ１）、ＥＲ（アッセイＩＤ：Ｈｓ００１７４８６０＿ｍ１）、ＰＲ（アッセイＩＤ：Ｈｓ０１５５６７０７＿ｍ１）、ＥＲＢＢ２（ＨＥＲ２、アッセイＩＤ：Ｈｓ０１００１５８０＿ｍ１）、腫瘍増殖遺伝子（Ｐｉｋｅ Ｓら、２００４）：ＢＩＲＣ５（アッセイＩＤ：Ｈｓ００１５３３５３＿ｍ１）、ＡＵＲＫＡ（ＳＴＫ１５、アッセイＩＤ：Ｈｓ０１５８２０７３＿ｍ１）、ＣＣＮＢ１（アッセイＩＤ：Ｈｓ００２５９１２６＿ｍ１）、Ｋｉ６７（アッセイＩＤ：Ｈｓ０１０３２４４３＿ｍ１）、ＭＹＢＬ２（アッセイＩＤ：Ｈｓ００９４２５４３＿ｍ１）及び参照又は「ハウスキーピング」遺伝子：ＡＣＴＢ（Ｈｓ９９９９９９０３＿ｍ１）、ＧＵＳＢ（アッセイＩＤ：Ｈｓ９９９９９９０８＿ｍｌ）、ＧＡＰＤＨ（アッセイＩＤ：Ｈｓ９９９９９９０５＿ｍ１）、ＲＰＬＰ０（アッセイＩＤ：Ｈｓ９９９９９９０２＿ｍ１）、ＴＦＲＣ（アッセイＩＤ：Ｈｓ９９９９９９１１＿ｍ１）が含まれる。
【０１９６】
ＢｉｏＭａｒｋ（商標）Ｄｙｎａｍｉｃ Ａｒｒａｙ（Ｆｌｕｉｄｉｇｍ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）マイクロフルイディクスシステムにより、変動性が低く従来のＲＴ−ＰＣＲと強く相関する高品質のデータを生成させる、ハイスループットリアルタイムＰＣＲ（プレートあたり２３０４の個々の反応が可能）が可能になる。Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ（登録商標）ＩＩＩ Ｆｉｒｓｔ Ｓｔｒａｎｄ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ＳｕｐｅｒＭｉｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を用いて総ＲＮＡから１本鎖ｃＤＮＡを生成させた。製造者の説明書に従い、ＴａｑＭａｎ Ｐｒｅ−Ａｍｐ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘを用いてｃＤＮＡ試料を予め増幅した。反応液は、２０μＬの最終体積に対して、５μＬのｃＤＮＡ、１０μＬのＰｒｅ−Ａｍｐ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ及び５μＬの０．２ｘ遺伝子発現アッセイミックス（アッセイしようとする全プライマー／プローブから構成）を含有した。推奨されるプログラムを用いて１４サイクルにわたり反応を繰り返し、次いでＴＥ緩衝液で１：５に希釈した。予め増幅したｃＤＮＡをすぐに使用するか又は必要になるまで−２０℃で保存した。
【０１９７】
４８ｘ４８ダイナミックアレイチップ（Ｆｌｕｉｄｉｇｍ）に投入するための試料を調製するために、反応混合液は、２．５μＬの２ｘＵｎｉｖｅｒｓａｌ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、０．２５μＬのＳａｍｐｌｅ Ｌｏａｄｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ（試料ローディング緩衝液）（Ｆｌｕｉｄｉｇｍ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）及び２．２５μＬの予め増幅したｃＤＮＡを含有した。プライマー／プローブを調製するために、反応混合液は、２．５μＬの２０ｘＴａｑｍａｎ遺伝子発現アッセイ及び２．５μＬのＡｓｓａｙ Ｌｏａｄｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ（アッセイローディング緩衝液）（Ｆｌｕｉｄｉｇｍ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を含有した。試料及びアッセイ試薬を注入口に投入する前に、ＩＦＣ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｒにおいてチップの準備を行った。記載のように調製した５μＬの試料をダイナミックアレイチップの各試料注入口に投入し、５μＬの１０ｘ遺伝子発現アッセイミックスを各検出器注入口に投入した。投入及び混合のために、チップをＩＦＣ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｒに置いた。およそ１時間後、温度サイクリングのためにチップをＢｉｏＭａｒｋ（商標）リアルタイムＰＣＲシステムに投入した（９５℃で１０分間、続いて９５℃で１５秒間及び６０℃で１分間を４０サイクル）。試料の反復数及び組成は、特定の実験によって変動したが、三重未満となることはなかった。設計されたプローブの感度及び特異性を決定するために平均Ｃｔ値を使用した。試料内の全ての利用可能な参照遺伝子アッセイの平均Ｃｔ値をΔＣｔの計算のために使用した。
【０１９８】
ＭｅｓｓａｇｅＡｍｐ（商標）Ｐｒｅｍｉｅｒ ＲＮＡ増幅キット（Ａｍｂｉｏｎ、Ａｕｓｔｉｎ、ＴＸ）を用いて、７５ｎｇの総ＲＮＡからビオチン標識された増幅ｃＲＮＡを生成させた。分光光度法でｃＲＮＡ生成物の純度及び濃度を決定した。Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｏｍｅ Ｕ１３３ Ｐｌｕｓ ２．０ ＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）アレイにおいてハイブリッド形成のために１５μｇの各ビオチン標識ｃＲＮＡを断片化した。全ＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）洗浄、染色及びスキャン手順をＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘの標準装置により行った。データ捕捉及び最初のアレイ品質評価は、ＧｅｎｅＣｈｉｐ Ｏｐｅｒａｔｉｎｇ Ｓｏｆｔｗａｒｅ（ＧＣＯＳ）ツールを用いて行った。全試料にわたりシグナル強度が２５未満であるプローブは全て分析から排除した。
【０１９９】
Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｏｍｅ Ｕ１３３ Ｐｌｕｓ ２．０ ＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）アレイにおいて、ＥＲ＋、ＰＲ＋及びＨｅｒ２−原発乳房腫瘍のサブセット（ｎ＝４０）及び対応する正常な隣接乳房組織試料（ｎ＝１５）のプロファイルを調べた。Ｆｌｕｉｄｉｇｍプラットフォームで分析した２検体の原発乳房試料及び４検体の対応する正常な隣接乳房組織試料は、ＲＮＡ量が不十分であったためＧｅｎｅＣｈｉｐによる処理を行わなかった。発明者らのゲノムアレイデータ全体を使用して、ｌｕｍｉｎａｌ−Ａ及びｌｕｍｉｎａｌ−Ｂサブタイプに関する乳癌分子サブタイプ分類を行った。
【０２００】
推定試料分類を判定するための２種類の方法を実施した。第一の分類方法では、試料サブタイプ分類（正常、基底膜細胞型（ｂａｓａｌ−ｌｉｋｅ）、ＨＥＲ２、ｌｕｍｉｎａｌ−Ａ又はｌｕｍｉｎａｌ−Ｂ）の目的で、公開されているＰＡＭ５０−遺伝子収縮重心分類手段（Ｗｅｉｇｅｌｔら、２０１０）を用いた。この分析に対してＭＡＳ５で正規化したＧｅｎｅＣｈｉｐデータを使用した（公開されている分類法がこのタイプの規模のデータを用いて確立されてることを考慮して）。スピアマンの順位相関係数（５０遺伝子強度ベクター対サブタイプ重心分類法）に従い、試料を分類し、最大相関値を有するサブタイプを特定の試料に割り当てた。第二の方法では、２試料のウェルチｔ−検定分析によって発現が異なる転写物のパネルを特定するために、ＧＣ−ＲＭＡで正規化したＧｅｎｅＣｈｉｐデータを使用した。統計学的分析を行う前に、病理学的評価に基づき試料を２群（正常又は腫瘍）に分けた。教師なし階層型クラスター分析のために、倍単位での変化の差が３超であり、ｐ値が１．０ｘ１０−１２未満であるプローブ（ｎ＝４５９プローブ）を使用した。転写パネル組成物の関数として、特定されたサブ集団を正常、ｌｕｍｉｎａｌ−Ａ又はｌｕｍｉｎａｌ−Ｂとして分類した。
【０２０１】
Ｂ．結果
乳癌におけるＩＲ−Ａ及びＩＲ−Ｂ
乳癌、４２ＥＲ及びＰＲ陽性及びＨｅｒ２陰性原発乳房組織試料及び１９検体の対応する正常隣接乳房組織におけるＩＲ−Ａ及びＩＲ−ＢのｍＲＮＡ発現状態を試験した。ランダムヘキサマープライマーによってｃＤＮＡを予め増幅し、ＴａｑＭａｎ ｑＰＣＲ（Ｆｌｕｉｄｉｇｍ）によってＩＲ−Ａ、ＩＲ−Ｂ及び総インスリン受容体（ＩＮＳＲ）転写物の発現レベルについてアッセイした。上述のように５種類のハウスキーピング遺伝子の平均に対して試料を正規化した。結果を図８で示す。正常におけるＩＮＳＲ、ＩＲ−Ａ及びＩＲ−Ｂの平均相対量（ＲＱ）の差（ｌｏｇ２ベースのスケール）±９５％ＣＩはそれぞれ１．０３ｘｌ０−８±０．１７、−７．３７ｘｌ０−９±０．２４及び３．３７ｘｌ０−８±０．１８（ｎ＝１９）であった。腫瘍におけるＩＮＳＲ、ＩＲ−Ａ及びＩＲ−Ｂの平均相対量（ＲＱ）の差（ｌｏｇ２ベースのスケール）±９５％ＣＩは、それぞれ−０．８８±０．２５、−０．０７±０．２９及び−２．０８±０．２５（ｎ＝４２）であった。ウェルチの両側ｔ−検定分析から、正常乳房組織と比較した場合に、試験した乳房腫瘍セットにおいてＩＮＳＲ及びＩＲ−ＢのｍＲＮＡレベルが有意に低いことが示される（ｐ＜０．０００１）。あるいは、正常と比較した場合、乳癌におけるＩＲ−ＡのｍＲＮＡレベルで有意差は観察されなかった（ｐ＝０．４５０１）。
【０２０２】
２（−ΔＣｔ）によって、対応する腫瘍及び正常の対において、総インスリン受容体組成物（即ちＩＲ−Ａ＋ＩＲ−Ｂ）に対するＩＲ−Ａの割合を計算した。結果を図９で示す。正常パネルに対する平均ＩＲ−Ａ転写物の割合（％）±９５％ＣＩは４６．６０％±４．７４％（ｎ＝１９）であり、一方、対応する腫瘍試料に対する平均ＩＲ−Ａ転写物の割合（％）±９５％ＣＩは７５．２４％±５．０２であった。対応のある試料ｔ−検定分析から、対応する正常試料と比較した場合、腫瘍試料中のＩＲ−Ａの割合の計算値が有意に上昇していることが示された（ｐ＜０．０００１）。結果から、腫瘍におけるＩＲ−Ｂレベルの有意な低下が、正常と比較した場合の腫瘍試料におけるＩＲ−Ａの割合の全体的な上昇に関与することが示唆される。
【０２０３】
ＩＲ−Ａ及びＩＲ−ＢのｍＲＮＡ転写物の比率を評価するために、発明者らは、正常及び原発腫瘍乳房試料におけるＩＲ−Ａ及びＩＲ−ＢのΔＣｔ差を計算した。正規化のために試料内参照遺伝子（ハウスキーピング）パネル（平均Ｃｔ）を使用して、全試料に対してΔＣｔ差（ＩＲ−ＡΔＣｔ−ＩＲ−ＢΔＣｔ）値を計算した。平均ＩＲ−Ａ：ＩＲ−ＢΔＣｔ±９５％ＣＩは正常の場合０．２０±０．２３（ｎ＝１９）であり、原発腫瘍では、平均ＩＲ−Ａ：ＩＲ−ＢΔＣｔ±９５％ＣＩは−１．８１±０．２７（ｎ＝４２）であった。ウェルチの両側ｔ−検定分析により、観察されたＩＲ−Ａ：ＩＲ−ＢΔＣｔに関して、正常と腫瘍試料との間で有意差が認められた（ｐ＜０．０００１）（図１０）。この結果から、乳房腫瘍においてＩＲ−ＡのＩＲ−Ｂに対する比率の有意な上昇が示された。
【０２０４】
上記の結果をさらに確認するために、発明者らは、さらなる乳癌組織試料におけるＩＲ−Ａ及びＩＲ−ＢのｍＲＮＡ発現比率を評価した。１５検体の正常乳房組織及び１６５検体の乳腺癌組織由来のｃＤＮＡを含有するＰＣＲアレイを使用した。等量のｃＤＮＡを予め増幅し、Ｔａｑｍａｎ ｑＰＣＲ（Ｆｌｕｉｄｉｇｍ）によりＩＲ−Ａ、ＩＲ−Ｂ及びＥＲの発現レベルについてアッセイした。正規化のために試料内参照遺伝子パネル（ＡＣＴＢ、ＧＵＳＢ、ＧＡＰＤＨ）を用いて全試料に対してΔＣｔ差（ＩＲ−ＡΔＣｔ−ＩＲ−ＢΔＣｔ）値を計算した。結果を図１１で示す。正常組織では平均ＩＲ−Ａ：ＩＲ−ＢΔＣｔ±９５％ＣＩは０．５１±０．３７（ｎ＝１５）であった。平均ＩＲ−Ａ：ＩＲ−ＢΔＣｔ±９５％ＣＩは、試験した全乳癌にわたり−１．１９±０．１７（ｎ＝１６５）であった。
【０２０５】
次に、発明者らは、乳癌試料から、正常乳房組織に対して２倍のエストロゲン受容体過剰発現を示した乳癌試料を分け、それらのＩＲ−Ａ：ＩＲ−ＢΔＣｔ差を正常組織及び全乳癌試料と比較した。結果を図１１で示す。ＥＲ＋乳癌では平均ＩＲ−Ａ：ＩＲ−ＢΔＣｔ±９５％ＣＩは−１．４８±０．３９（ｎ＝８３）であり、これは乳癌データセット全体にわたり観察されたものと非常に近い。ウェルチの両側ｔ−検定分析により、観察されたＩＲ−Ａ：ＩＲ−ＢΔＣｔ差に関して正常と腫瘍試料との間の有意差が認められた（ｐ＜０．０００１）。
【０２０６】
乳癌増殖に関与する遺伝子とＩＲ−Ａ：ＩＲ−Ｂ比の相関
Ｋｉ６７、ＳＴＫ１５、サバイビン、ＣＣＮＢ１、ＭＹＢＬ２は、乳癌増殖に関与する、特徴がよく分かっている遺伝子である。これらの遺伝子の複合発現スコアはＯｎｃｏｔｙｐｅ ＤＸで使用されており、多くの患者において乳癌再発に関与する重要な因子となっている。発明者らは、回帰分析及び相関分析を用いて、原発乳癌試料のセットにおいてＩＲ−Ａ：ＩＲ−Ｂ比と増殖スコアとの関係を調べた。ＩＲ−Ａ：ＩＲ−ＢΔＣｔ差の計算値とプールされた増殖マーカーのパネル（ＡＵＲＫＡ、ＢＩＲＣ５、ＣＣＮＢ１、ＫＩ６７及びＭＹＢＬ２）との間の関係を定量するために、線形回帰分析を行った。特定の試料に対して全マーカーにわたる平均ΔＣｔをとることによって、増殖パネルのサマリー値を計算した。正常及び腫瘍試料の両方に対するサマリーの結果を与える。線形回帰分析の結果から、２つのサマリー値の間の正相関が示唆される（補正ｒ２＝０．５９５）（図１２）。ＩＲ−ＡＴＲ−ＢΔＣｔ差は、増殖スコアとの正相関を示す（図１２）。この結果から、腫瘍でのＩＲ−Ｂ発現の低下及びＩＲ−Ａ比率発現の上昇がＥＲ＋ＰＲ＋及びＨｅｒ−乳癌において腫瘍増殖に寄与し得ることが示唆される。
【０２０７】
乳癌サブタイプにおけるＩＲ−Ａ：ＩＲ−ＢΔＣｔ差
乳癌は、分子的変化、細胞組成及び臨床的な転帰に関して不均一な疾患である。固有の遺伝子リストを用いて、階層的クラスター分析によってＥＲ陽性乳癌をｌｕｍｉｎａｌ−Ａ及びｌｕｍｉｎａｌ−Ｂサブタイプにさらに分類することができる（Ｐｅｒｏｕ ＣＭ、２０００）。Ｌｕｍｉｎａｌ−Ａ癌は、組織学的に低悪性度であり、ネオアジュバント内分泌療法に感受性がある（Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ Ｃら、２００８）。一方、ｌｕｍｉｎａｌ−Ｂ癌は、組織学的に悪性度が高いことが多く、ネオアジュバント内分泌療法に対する感受性が低く、より短期間で不良転帰となる（Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ Ｃら、２００８）。Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎの報告によると、ＩＧＦ−Ｉという特徴はｌｕｍｉｎａｌ−Ｂ乳癌で明白であり、この特徴は多くの不良予後因子と高い相関があり、尚且つ疾患転帰の最強の指標の１つである。ＩＲ−ＡアイソフォームはＩＧＦシグナル伝達に関与する重要な成分の１つであるので、発明者らはＩＲ−Ａ：ＩＲ−Ｂの比率の変化がｌｕｍｉｎａｌ−Ａ及びｌｕｍｉｎａｌ−Ｂ乳癌を比較した際に明白となり得るという仮説を検証した。
【０２０８】
この疑問に取り組むために、発明者らは、４０検体のＥＲ＋ＰＲ＋及びＨｅｒ２−陰性乳癌及び１５検体の正常乳房試料に対して全ゲノムアレイ分析を行った。発明者らは最初に、公開されているＰＡＭ５０−遺伝子収縮重心分類手段（Ｗｅｉｇｅｌｔら、２０１０）を利用した。スピアマンの順位相関係数に従い、ｌｕｍｉｎａｌ Ａ又はｌｕｍｉｎａｌ Ｂとして試料を分類し、最大相関値を有するサブタイプを特定の試料に割り当てた。次に、正常、ｌｕｍｉｎａｌ−Ａ及びｌｕｍｉｎａｌ−ＢにおけるＩＲ−Ａ：ＩＲ−ＢΔＣｔ差を比較した。試料サブタイプ（正常、ｌｕｍｉｎａｌ−Ａ又はｌｕｍｉｎａｌ−Ｂ）に関するＩＲ−Ａ：ＩＲ−ＢΔＣｔ差の計算値の散布図を図１３Ａで示す。正常において平均ＩＲ−Ａ：ＩＲ−ＢΔＣｔ±９５％ＣＩは０．２７±０．３０（ｎ＝１５）であった。ｌｕｍｉｎａｌ−Ａに分類された乳癌において平均ＩＲ−Ａ：ＩＲ−ＢΔＣｔ±９５％ＣＩは−１．０９±０．３４（ｎ＝１３）であった。ｌｕｍｉｎａｌ−Ｂに分類された乳癌において平均ＩＲ−Ａ：Ｒ−ＢΔＣｔ±９５％ＣＩは−２．１２±０．３４（ｎ＝２７）であった。全サブタイプのペアワイズ比較から、有意差が示される（２−試料ｔ検定、ｐ＜０．００１）。この結果から、ｌｕｍｉｎａｌ−Ｂ患者におけるＩＲ−Ａ：ＩＲ−Ｂ比が、ｌｕｍｉｎａｌ−Ａ患者よりも大幅に変化したことが示された。
【０２０９】
収縮重心分類手段に加えて、発明者らは、２−試料ウェルチｔ−検定分析によって発現が異なる転写物のパネルを特定するためにＧＣ−ＲＭＡで正規化したＧｅｎｅＣｈｉｐデータを使用した。統計学的分析を行う前に、病理学的評価に基づき、試料を２群（正常又は腫瘍）に分けた。転写物パネル組成の関数として、教師なし階層的クラスター分析によって同定されたサブ集団を、正常、ｌｕｍｉｎａｌ−Ａ又はｌｕｍｉｎａｌ−Ｂに分類した。正常、ｌｕｍｉｎａｌ−Ａ及びｌｕｍｉｎａｌ−ＢにおけるＩＲ−Ａ：ＩＲ−ＢΔＣｔ差も比較した。この結果を図１３Ｂで示す。正常において平均ＩＲ−Ａ：ＩＲ−ＢΔＣｔ±９５％ＣＩは０．３２±０．２５（ｎ＝１５）であった。ｌｕｍｉｎａｌ−Ａと予測された乳癌において平均ＩＲ−Ａ：ＩＲ−ＢΔＣｔ±９５％ＣＩは−１．０５±０．１９（ｎ＝１８）であった。ｌｕｍｉｎａｌ−Ｂと予測された乳癌における平均ＩＲ−Ａ：ＩＲ−ＢΔＣｔ±９５％ＣＩは−２．４２±０．３２（ｎ＝２２）であった。全サブタイプのペアワイズ比較から、有意差が示される（２−試料ｔ−検定、ｐ＜０．００１）。
参考文献
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【０２１９】
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【０２２０】
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【０２２２】
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【０２２３】
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【０２２４】
Ｓｃｉａｃｃａら，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ．Ｎｏｖ ２８；２１（５４）：８２４０−５０．９，２００２。
【０２２５】
本発明の好ましい態様を参照しながら詳細に上記の開示を提供してきたが、当業者にとって、本開示及び特許請求の範囲から逸脱することなく、様々な変更がなされ得、同等物が使用され得ることは明白であろう。引用される文献は全て、それらの全体が参照により組み込まれる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
合成核酸配列が以下の配列の何れか１つの少なくとも１０から２０個の連続ヌクレオチドを含む、１０から３０個の連続ヌクレオチドを含む合成核酸：
（ｉ）配列番号３、それに相補的な配列又はストリンジェントな条件下で配列番号３もしくはその相補体とハイブリッド形成可能である配列；
（ｉｉ）配列番号４、それに相補的な配列又はストリンジェントな条件下で配列番号４もしくはその相補体とハイブリッド形成可能である配列；
（ｉｉｉ）配列番号５、それに相補的な配列又はストリンジェントな条件下で配列番号５もしくはその相補体とハイブリッド形成可能である配列；又は
（ｉｖ）配列番号６、それに相補的な配列又はストリンジェントな条件下で配列番号６もしくはその相補体とハイブリッド形成可能である配列。
【請求項２】
以下の核酸配列の何れか１つから基本的に構成される合成核酸配列：
（ｉ）配列番号３、それに相補的な配列又はストリンジェントな条件下で配列番号３もしくはその相補体とハイブリッド形成可能である配列；
（ｉｉ）配列番号４、それに相補的な配列又はストリンジェントな条件下で配列番号４もしくはその相補体とハイブリッド形成可能である配列；
（ｉｉｉ）配列番号５、それに相補的な配列又はストリンジェントな条件下で配列番号５もしくはその相補体とハイブリッド形成可能である配列；又は
（ｉｖ）配列番号６、それに相補的な配列又はストリンジェントな条件下で配列番号６もしくはその相補体とハイブリッド形成可能である配列。
【請求項３】
配列番号７、それに相補的な配列又はストリンジェントな条件下で配列番号７もしくはその相補体とハイブリッド形成可能である配列から基本的に構成される、合成核酸配列。
【請求項４】
配列番号８、それに相補的な配列又はストリンジェントな条件下で配列番号８もしくはその相補体とハイブリッド形成可能である配列から基本的に構成される、合成核酸配列。
【請求項５】
請求項１から請求項４の何れか１項に記載の合成核酸配列を含む組成物。
【請求項６】
（ａ）ＩＮＳＲ遺伝子のエクソン１０の最後の５０塩基（配列番号１）、それに相補的な配列又はストリンジェントな条件下で配列番号１もしくはその相補体とハイブリッド形成可能である配列の、１０から３０個の連続ヌクレオチドを含む、合成核酸配列と；
（ｂ）ＩＮＳＲ遺伝子のエクソン１２の最初の６０塩基（配列番号２）、それに相補的な配列又はストリンジェントな条件下で配列番号２もしくはその相補体とハイブリッド形成可能である配列の、１０から３０個の連続ヌクレオチドを含む、合成核酸配列と、
を含む、生体試料中のＩＲ−Ａ核酸を検出及び／又は定量するためのプライマーセット。
【請求項７】
少なくとも１つの合成核酸配列が、
配列番号３、それに相補的な配列又はストリンジェントな条件下で配列番号３もしくはその相補体とハイブリッド形成可能である配列；
配列番号２１、それに相補的な配列又はストリンジェントな条件下で配列番号２１もしくはその相補体とハイブリッド形成可能である配列；
配列番号５、それに相補的な配列又はストリンジェントな条件下で配列番号５もしくはその相補体とハイブリッド形成可能である配列；及び
配列番号２２、それに相補的な配列又はストリンジェントな条件下で配列番号２２もしくはその相補体とハイブリッド形成可能である配列
の中から選択されるヌクレオチド配列を有する、請求項６に記載のプライマーセット。
【請求項８】
（ａ）ポリメラーゼによる増幅に適切な条件下で請求項６に記載のプライマーセットと生体試料又は生体試料から調製された核酸を接触させる工程；
（ｂ）増幅された標的ＩＲ−Ａ核酸配列を検出及び／又は定量する工程を含む、生体試料中のＩＲ−Ａ核酸を検出及び／又は定量するための方法。
【請求項９】
前記生体試料が腫瘍試料から調製される、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記プライマーセットが、配列番号３、それに相補的な配列又はストリンジェントな条件下で配列番号３もしくはその相補体とハイブリッド形成可能である配列と、配列番号２１、それに相補的な配列又はストリンジェントな条件下で配列番号２１もしくはその相補体とハイブリッド形成可能である配列と、を含む、請求項８から請求項９の何れか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記プライマーセットが、配列番号５、それに相補的な配列又はストリンジェントな条件下で配列番号５もしくはその相補体とハイブリッド形成可能である配列と、配列番号２２、それに相補的な配列又はストリンジェントな条件下で配列番号２２もしくはその相補体とハイブリッド形成可能である配列と、を含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１２】
前記ポリメラーゼによる増幅が定量的ポリメラーゼ連鎖反応である、請求項８に記載の方法。
【請求項１３】
前記プライマーセットが、
配列番号３、それに相補的な配列又はストリンジェントな条件下で配列番号３もしくはその相補体とハイブリッド形成可能である配列と；
配列番号２１、それに相補的な配列又はストリンジェントな条件下で配列番号２１もしくはその相補体とハイブリッド形成可能である配列と；
配列番号７、それに相補的な配列又はストリンジェントな条件下で配列番号７もしくはその相補体とハイブリッド形成可能である配列（これは検出可能な標識も有する）と、
を含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記プライマーセットが、
配列番号５、それに相補的な配列又はストリンジェントな条件下で配列番号５もしくはその相補体とハイブリッド形成可能である配列と；
配列番号２２、それに相補的な配列又はストリンジェントな条件下で配列番号２２もしくはその相補体とハイブリッド形成可能である配列と；
配列番号８、それに相補的な配列又はストリンジェントな条件下で配列番号８もしくはその相補体とハイブリッド形成可能である配列（これは検出可能な標識も有する）と、
を含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
増幅産物が１００塩基未満である、請求項８に記載の方法。
【請求項１６】
合成核酸配列が、以下の配列の何れか１つの少なくとも１０から２０個の連続ヌクレオチドを含む、１０から３０個の連続ヌクレオチドを含む合成核酸：
（ｉ）配列番号１１、それに相補的な配列又はストリンジェントな条件下で配列番号１１もしくはその相補体とハイブリッド形成可能である配列；又は
（ｉｉ）配列番号１２、それに相補的な配列又はストリンジェントな条件下で配列番号１２もしくはその相補体とハイブリッド形成可能である配列。
【請求項１７】
以下の核酸配列の何れか１つから基本的に構成される合成核酸：
（ｉ）配列番号１１、それに相補的な配列又はストリンジェントな条件下で配列番号１１もしくはその相補体とハイブリッド形成可能である配列；又は
（ｉｉ）配列番号１２、それに相補的な配列又はストリンジェントな条件下で配列番号１２もしくはその相補体とハイブリッド形成可能である配列。
【請求項１８】
配列番号１３、それに相補的な配列又はストリンジェントな条件下で配列番号１３もしくはその相補体とハイブリッド形成可能である配列から基本的に構成される、合成核酸配列。
【請求項１９】
配列番号１４、それに相補的な配列又はストリンジェントな条件下で配列番号１４もしくはその相補体とハイブリッド形成可能である配列から基本的に構成される、合成核酸配列。
【請求項２０】
配列番号１５、それに相補的な配列又はストリンジェントな条件下で配列番号１５もしくはその相補体とハイブリッド形成可能である配列から基本的に構成される、合成核酸配列。
【請求項２１】
請求項１６から請求項２０の何れか１項に記載の合成核酸配列を含む、組成物。
【請求項２２】
（ａ）（ｉ）ＩＮＳＲ遺伝子のエクソン１０の最後の５０塩基（配列番号１）、それに相補的な配列又はストリンジェントな条件下で配列番号１もしくはその相補体とハイブリッド形成可能である配列の、１０から３０個の連続ヌクレオチドを含む、合成核酸配列、
（ａ）（ｉｉ）ＩＮＳＲ遺伝子のエクソン１１（配列番号９）、それに相補的な配列又はストリンジェントな条件下で配列番号９もしくはその相補体とハイブリッド形成可能である配列、の１０から３０個の連続ヌクレオチドを含む、合成核酸配列；
（ａ）（ｉｉｉ）エクソン１０及び１１を架橋する塩基、それに相補的な配列又はストリンジェントな条件下でそれともしくはその相補体とハイブリッド形成可能である配列の、１０から３０個の連続ヌクレオチドを含む、合成核酸配列と、
（ｂ）ＩＮＳＲ遺伝子のエクソン１２の最初の５０塩基（配列番号１０）、それに相補的な配列又はストリンジェントな条件下で配列番号１０もしくはその相補体とハイブリッド形成可能である配列又はそれに相補的な配列の、１０から３０個の連続ヌクレオチドを含む合成核酸配列と、
を含む、生体試料中のＩＲ−Ｂ核酸配列を検出及び／又は定量するためのプライマーセット。
【請求項２３】
少なくとも１つの前記合成核酸配列が、
配列番号１１、それに相補的な配列又はストリンジェントな条件下で配列番号１１もしくはその相補体とハイブリッド形成可能である配列；及び
配列番号１２、それに相補的な配列又はストリンジェントな条件下で配列番号１２もしくはその相補体とハイブリッド形成可能である配列
の中から選択されるヌクレオチド配列を有する、請求項２２に記載のプライマーセット。
【請求項２４】
（ａ）ポリメラーゼによる増幅に適切な条件下で請求項２２に記載のプライマーセットと生体試料又は生体試料から調製される核酸を接触させる工程；
（ｂ）増幅された標的ＩＲ−Ｂ核酸配列を検出及び／又は定量する工程
を含む、生体試料中のＩＲ−Ｂ核酸を検出及び／又は定量するための方法。
【請求項２５】
前記生体試料が腫瘍試料である、請求項２４に記載の方法。
［請求項２４］
前記プライマーセットが、
配列番号１１、それに相補的な配列又はストリンジェントな条件下で配列番号１１もしくはその相補体とハイブリッド形成可能である配列と；
配列番号１２、それに相補的な配列又はストリンジェントな条件下で配列番号１２もしくはその相補体とハイブリッド形成可能である配列と、
を含む、請求項２４に記載の方法。
［請求項２５］
前記ポリメラーゼによる増幅が定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ｑ−ＰＣＲ）である、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記プライマーセットが、
配列番号１１、それに相補的な配列又はストリンジェントな条件下で配列番号１１もしくはその相補体とハイブリッド形成可能である配列と；
配列番号１２、それに相補的な配列又はストリンジェントな条件下で配列番号１２もしくはその相補体とハイブリッド形成可能である配列と；
検出可能な標識も有する、配列番号１３、それに相補的な配列又はストリンジェントな条件下で配列番号１３もしくはその相補体とハイブリッド形成可能である配列と、
を含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項２７】
前記プライマーセットが、
配列番号１１、それに相補的な配列又はストリンジェントな条件下で配列番号１１もしくはその相補体とハイブリッド形成可能である配列と；
配列番号１２、それに相補的な配列又はストリンジェントな条件下で配列番号１２もしくはその相補体とハイブリッド形成可能である配列と；
検出可能な標識も有する、配列番号１４、それに相補的な配列又はストリンジェントな条件下で配列番号１４もしくはその相補体とハイブリッド形成可能である配列と、
を含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項２８】
前記プライマーセットが、
配列番号１１、それに相補的な配列又はストリンジェントな条件下で配列番号１１もしくはその相補体とハイブリッド形成可能である配列と；
配列番号１２、それに相補的な配列又はストリンジェントな条件下で配列番号１２もしくはその相補体とハイブリッド形成可能である配列と；を含み、さらに、
検出可能な標識も有する、配列番号１５、それに相補的な配列又はストリンジェントな条件下で配列番号１５もしくはその相補体とハイブリッド形成可能である配列を含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項２９】
増幅産物が１００塩基未満である、請求項２４に記載の方法。
【請求項３０】
ポリメラーゼによる増幅に適切な条件下で生体試料中のＩＲ−Ａ核酸配列を検出及び／又は定量するためのプライマーセットと生体試料又は生体試料から調製された核酸の試料を接触させること（該プライマーセットは、請求項６に記載のプライマーセットを含む）及び／又は、ポリメラーゼによる増幅に適切な条件下で生体試料中のＩＲ−Ｂ核酸配列を検出及び／又は定量するためのプライマーセットと生体試料又は生体試料から調製された核酸の試料を接触させること（該プライマーセットは、請求項２２に記載のプライマーセットを含む）と、
増幅された標的ＩＲ−Ａ又はＩＲ−Ｂ核酸配列を検出及び／又は定量することと、
を含む、生体試料中の標的ＩＲ−Ａ核酸配列及び／又は標的ＩＲ−Ｂ核酸配列の有無を判定するための方法。
【請求項３１】
請求項１に記載の少なくとも１つの合成核酸配列と、使用説明書と、を含む、生体試料中のＩＲ−Ａの有無を決定するためのキット。
【請求項３２】
前記少なくとも１つの合成核酸配列が、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、該配列の１つに相補的な配列又はストリンジェントな条件下で該配列の１つもしくはその相補体とハイブリッド形成可能である配列の中から選択されるヌクレオチド配列を有する、請求項３１に記載のキット。
【請求項３３】
前記合成核酸配列が、以下のプライマーセットの中から選択される、請求項３１に記載のキット：
（１）配列番号３、それに相補的な配列又はストリンジェントな条件下で配列番号３もしくはその相補体とハイブリッド形成可能である配列；
配列番号２１、それに相補的な配列又はストリンジェントな条件下で配列番号２１もしくはその相補体とハイブリッド形成可能である配列；及び
検出可能な標識も有する、配列番号７、それに相補的な配列又はストリンジェントな条件下で配列番号７もしくはその相補体とハイブリッド形成可能である配列；又は
（２）配列番号５、それに相補的な配列又はストリンジェントな条件下で配列番号５もしくはその相補体とハイブリッド形成可能である配列；
配列番号２２、それに相補的な配列又はストリンジェントな条件下で配列番号２２もしくはその相補体とハイブリッド形成可能である配列；及び
検出可能な標識も有する、配列番号８、それに相補的な配列又はストリンジェントな条件下で配列番号８もしくはその相補体とハイブリッド形成可能である配列。
【請求項３４】
適切なＰＣＲ試薬と；場合によってはＩＲ−Ａの有無を決定するための陽性及び／又は陰性対照と、をさらに含む、請求項３１に記載のキット。
【請求項３５】
請求項１６に記載の少なくとも１つの合成核酸配列と、使用説明書と、を含む、生体試料中のＩＲ−Ｂの有無を決定するためのキット。
【請求項３６】
前記合成核酸配列が、配列番号１１、配列番号１２、該配列の何れかに相補的な配列又はストリンジェントな条件下で該配列の何れかもしくはその相補体とハイブリッド形成可能である配列の中から選択されるヌクレオチド配列を有する、請求項３５に記載のキット。
【請求項３７】
前記合成核酸配列が、以下のプライマーセットから選択される、請求項３５に記載のキット：
（１）配列番号１１、それに相補的な配列又はストリンジェントな条件下で配列番号１１もしくはその相補体とハイブリッド形成可能である配列と；
配列番号１２、それに相補的な配列又はストリンジェントな条件下で配列番号１２もしくはその相補体とハイブリッド形成可能である配列と；
検出可能な標識を有する、配列番号１３、それに相補的な配列又はストリンジェントな条件下で配列番号１３もしくはその相補体とハイブリッド形成可能である配列；又は
（２）配列番号１１、それに相補的な配列又はストリンジェントな条件下で配列番号１１もしくはその相補体とハイブリッド形成可能である配列と；
配列番号１２、それに相補的な配列又はストリンジェントな条件下で配列番号１２もしくはその相補体とハイブリッド形成可能である配列と；
検出可能な標識を有する配列番号１４；又は
（３）配列番号１１、それに相補的な配列又はストリンジェントな条件下で配列番号１１もしくはその相補体とハイブリッド形成可能である配列と；
配列番号１２、それに相補的な配列又はストリンジェントな条件下で配列番号１２もしくはその相補体とハイブリッド形成可能である配列と；
検出可能な標識も有する、配列番号１５、それに相補的な配列又はストリンジェントな条件下で配列番号１５もしくはその相補体とハイブリッド形成可能である配列。
【請求項３８】
適切なＰＣＲ試薬と；場合によってはＩＲ−Ｂの有無を決定するための陽性及び／又は陰性対照と、をさらに含む、請求項３５に記載のキット。
【請求項３９】
請求項８に従い、試料中のＩＲ−Ａ発現を検出及び／又は定量し；
請求項２４に従い、試料中のＩＲ−Ｂ発現を検出及び／又は定量することを含み、
ＩＲ−Ａ及びＩＲ−Ｂの発現が、ＩＧＦＩ／ＩＩリガンド又はＩＧＦ１Ｒ受容体アンタゴニストを対象に投与するべきか否かの指標である、ＩＧＦＩ／ＩＩリガンド又はＩＧＦＲ１受容体アンタゴニストに応答する患者を選択するための方法。
【請求項４０】
ＩＧＦＩ／ＩＩリガンド又はＩＧＦＲ１受容体アンタゴニストが抗体である、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記抗体が表１及び表２で挙げられる配列成分を含む、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
ポリメラーゼによる増幅に適切な条件下で、生体試料又は生体試料から調製された核酸を請求項６に記載のプライマーセットと接触させることと、
ポリメラーゼによる増幅に適切な条件下で、生体試料又は生体試料から調製された核酸を請求項２２に記載のプライマーセットと接触させることと；
増幅されたＩＲ−Ａ及びＩＲ−Ｂ核酸配列を定量することと；
それによって生体試料中のＩＲ−Ｂに対するＩＲ−Ａの相対発現を決定することと、
を含む、生体試料中の標的ＩＲ−Ａ核酸配列及び標的ＩＲ−Ｂ核酸配列の相対的な有無を決定するための方法。
【請求項４３】
請求項４２に記載の方法によって腫瘍試料中のＩＲ−Ｂに対するＩＲ−Ａの相対発現を決定することと、
ＩＲ−Ａ及びＩＲ−Ｂの相対発現を含む基準によって腫瘍を分類することと、
を含む、腫瘍を分類する方法。
【請求項４４】
請求項４２に記載の方法によって患者組織中のＩＲ−Ｂに対するＩＲ−Ａの相対発現を判定することと、
ＩＲ−Ａ及びＩＲ−Ｂの相対発現を含む基準によって該患者を分類することと、
それによってＩＧＦアンタゴニストに対する患者の相対応答性を予測することと、
を含む、ＩＧＦアンタゴニストによる治療に対して患者を選択する方法。
【請求項４５】
ＩＲ−Ａの発現がＩＲ−Ｂと比較して上昇している、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
請求項４２に記載の方法によって組織試料中のＩＲ−Ｂに対するＩＲ−Ａの相対発現を判定することと、
ＩＲ−Ａ及びＩＲ−Ｂの相対発現を含む基準によって患者を分類することと；
該分類に従いＩＧＦアンタゴニストを投与することと、
を含む、ＩＧＦアンタゴニストを用いて患者を治療する方法。
【請求項４７】
ＩＲ−Ａの発現がＩＲ−Ｂと比較して上昇している、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
前記ＩＧＦアンタゴニストが抗体である、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
前記抗体が、配列番号４５及び５３のアミノ酸配列を含むアミノ酸配列を含む、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
前記抗体が、表１及び２で示されるような配列番号４５及び５３のＣＤＲ配列を含む、請求項４８に記載の方法。
【請求項５１】
前記抗体が、配列番号４５からの３個のＣＤＲ及び軽鎖を含む、請求項４８に記載の方法。
【請求項５２】
前記抗体が配列番号５３からの３個のＣＤＲ及び重鎖を含む、請求項４８に記載の方法。
【請求項５３】
総インスリン受容体に対するＩＲ−Ａの％が４６．６％より大きい、請求項４５及び請求項４７の何れかに記載の方法。
【請求項５４】
ＩＲＡ：ＩＲ−ＢΔΔＣｔが約０．２未満である、請求項４５及び請求項４７の何れかに記載の方法。
【請求項５５】
ＩＲ−Ａに対するｌｏｇ２ベースのスケールでの相対量の差の平均が、約−０．０７±０．２９であり、ＩＲ−Ｂに対して約−２．０８±０．２５である、請求項４５及び請求項４７の何れかに記載の方法。
【請求項５６】
請求項４２に記載の方法によって乳癌腫瘍試料中のＩＲ−Ｂに対するＩＲ−Ａの相対発現を決定することと、ＩＲ−Ａ：ＩＲ−Ｂ比が閾値よりも低い場合にｌｕｍｉｎａｌ Ｂとして乳癌サブタイプを分類することと、を含む、乳癌腫瘍サブタイプを分類する方法。
【請求項５７】
ＩＲ−Ａ：ＩＲ−ＢΔΔＣｔを計算することをさらに含み、閾値が、約−１．１から約−２．４の範囲に設定されるＩＲ−Ａ：ＩＲ−ＢΔΔＣｔ値である、請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
閾値が約−１．４から−２．１の範囲である、請求項５４に記載の方法。
【請求項５９】
ＩＲ−Ａ：ＩＲ−ＢΔΔＣｔの決定が、サブタイプ分類を決定することにおいて、他の発現プロファイルと組み合わせられ得る、請求項５７に記載の方法。
【請求項６０】
請求項４２に記載の方法により腫瘍試料中のＩＲ−Ｂに対するＩＲ−Ａの相対発現を決定することと、より高いＩＲ−Ａ：ＩＲ−Ｂ比が、より高い増殖スコアを示す因子であるとみなすことと、を含む、腫瘍に対する増殖スコアを決定する方法。
【請求項６１】
ＩＲ−Ａ：ＩＲ−ＢΔΔＣｔを計算することと、より低いＩＲ−Ａ：ＩＲ−ＢΔΔＣｔ値が、より高い増殖スコアを示す因子であるとみなすことと、を含む、請求項６０に記載の方法。
【請求項１】
合成核酸配列が以下の配列の何れか１つの少なくとも１０から２０個の連続ヌクレオチドを含む、１０から３０個の連続ヌクレオチドを含む合成核酸：
（ｉ）配列番号３、それに相補的な配列又はストリンジェントな条件下で配列番号３もしくはその相補体とハイブリッド形成可能である配列；
（ｉｉ）配列番号４、それに相補的な配列又はストリンジェントな条件下で配列番号４もしくはその相補体とハイブリッド形成可能である配列；
（ｉｉｉ）配列番号５、それに相補的な配列又はストリンジェントな条件下で配列番号５もしくはその相補体とハイブリッド形成可能である配列；又は
（ｉｖ）配列番号６、それに相補的な配列又はストリンジェントな条件下で配列番号６もしくはその相補体とハイブリッド形成可能である配列。
【請求項２】
以下の核酸配列の何れか１つから基本的に構成される合成核酸配列：
（ｉ）配列番号３、それに相補的な配列又はストリンジェントな条件下で配列番号３もしくはその相補体とハイブリッド形成可能である配列；
（ｉｉ）配列番号４、それに相補的な配列又はストリンジェントな条件下で配列番号４もしくはその相補体とハイブリッド形成可能である配列；
（ｉｉｉ）配列番号５、それに相補的な配列又はストリンジェントな条件下で配列番号５もしくはその相補体とハイブリッド形成可能である配列；又は
（ｉｖ）配列番号６、それに相補的な配列又はストリンジェントな条件下で配列番号６もしくはその相補体とハイブリッド形成可能である配列。
【請求項３】
配列番号７、それに相補的な配列又はストリンジェントな条件下で配列番号７もしくはその相補体とハイブリッド形成可能である配列から基本的に構成される、合成核酸配列。
【請求項４】
配列番号８、それに相補的な配列又はストリンジェントな条件下で配列番号８もしくはその相補体とハイブリッド形成可能である配列から基本的に構成される、合成核酸配列。
【請求項５】
請求項１から請求項４の何れか１項に記載の合成核酸配列を含む組成物。
【請求項６】
（ａ）ＩＮＳＲ遺伝子のエクソン１０の最後の５０塩基（配列番号１）、それに相補的な配列又はストリンジェントな条件下で配列番号１もしくはその相補体とハイブリッド形成可能である配列の、１０から３０個の連続ヌクレオチドを含む、合成核酸配列と；
（ｂ）ＩＮＳＲ遺伝子のエクソン１２の最初の６０塩基（配列番号２）、それに相補的な配列又はストリンジェントな条件下で配列番号２もしくはその相補体とハイブリッド形成可能である配列の、１０から３０個の連続ヌクレオチドを含む、合成核酸配列と、
を含む、生体試料中のＩＲ−Ａ核酸を検出及び／又は定量するためのプライマーセット。
【請求項７】
少なくとも１つの合成核酸配列が、
配列番号３、それに相補的な配列又はストリンジェントな条件下で配列番号３もしくはその相補体とハイブリッド形成可能である配列；
配列番号２１、それに相補的な配列又はストリンジェントな条件下で配列番号２１もしくはその相補体とハイブリッド形成可能である配列；
配列番号５、それに相補的な配列又はストリンジェントな条件下で配列番号５もしくはその相補体とハイブリッド形成可能である配列；及び
配列番号２２、それに相補的な配列又はストリンジェントな条件下で配列番号２２もしくはその相補体とハイブリッド形成可能である配列
の中から選択されるヌクレオチド配列を有する、請求項６に記載のプライマーセット。
【請求項８】
（ａ）ポリメラーゼによる増幅に適切な条件下で請求項６に記載のプライマーセットと生体試料又は生体試料から調製された核酸を接触させる工程；
（ｂ）増幅された標的ＩＲ−Ａ核酸配列を検出及び／又は定量する工程を含む、生体試料中のＩＲ−Ａ核酸を検出及び／又は定量するための方法。
【請求項９】
前記生体試料が腫瘍試料から調製される、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記プライマーセットが、配列番号３、それに相補的な配列又はストリンジェントな条件下で配列番号３もしくはその相補体とハイブリッド形成可能である配列と、配列番号２１、それに相補的な配列又はストリンジェントな条件下で配列番号２１もしくはその相補体とハイブリッド形成可能である配列と、を含む、請求項８から請求項９の何れか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記プライマーセットが、配列番号５、それに相補的な配列又はストリンジェントな条件下で配列番号５もしくはその相補体とハイブリッド形成可能である配列と、配列番号２２、それに相補的な配列又はストリンジェントな条件下で配列番号２２もしくはその相補体とハイブリッド形成可能である配列と、を含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１２】
前記ポリメラーゼによる増幅が定量的ポリメラーゼ連鎖反応である、請求項８に記載の方法。
【請求項１３】
前記プライマーセットが、
配列番号３、それに相補的な配列又はストリンジェントな条件下で配列番号３もしくはその相補体とハイブリッド形成可能である配列と；
配列番号２１、それに相補的な配列又はストリンジェントな条件下で配列番号２１もしくはその相補体とハイブリッド形成可能である配列と；
配列番号７、それに相補的な配列又はストリンジェントな条件下で配列番号７もしくはその相補体とハイブリッド形成可能である配列（これは検出可能な標識も有する）と、
を含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記プライマーセットが、
配列番号５、それに相補的な配列又はストリンジェントな条件下で配列番号５もしくはその相補体とハイブリッド形成可能である配列と；
配列番号２２、それに相補的な配列又はストリンジェントな条件下で配列番号２２もしくはその相補体とハイブリッド形成可能である配列と；
配列番号８、それに相補的な配列又はストリンジェントな条件下で配列番号８もしくはその相補体とハイブリッド形成可能である配列（これは検出可能な標識も有する）と、
を含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
増幅産物が１００塩基未満である、請求項８に記載の方法。
【請求項１６】
合成核酸配列が、以下の配列の何れか１つの少なくとも１０から２０個の連続ヌクレオチドを含む、１０から３０個の連続ヌクレオチドを含む合成核酸：
（ｉ）配列番号１１、それに相補的な配列又はストリンジェントな条件下で配列番号１１もしくはその相補体とハイブリッド形成可能である配列；又は
（ｉｉ）配列番号１２、それに相補的な配列又はストリンジェントな条件下で配列番号１２もしくはその相補体とハイブリッド形成可能である配列。
【請求項１７】
以下の核酸配列の何れか１つから基本的に構成される合成核酸：
（ｉ）配列番号１１、それに相補的な配列又はストリンジェントな条件下で配列番号１１もしくはその相補体とハイブリッド形成可能である配列；又は
（ｉｉ）配列番号１２、それに相補的な配列又はストリンジェントな条件下で配列番号１２もしくはその相補体とハイブリッド形成可能である配列。
【請求項１８】
配列番号１３、それに相補的な配列又はストリンジェントな条件下で配列番号１３もしくはその相補体とハイブリッド形成可能である配列から基本的に構成される、合成核酸配列。
【請求項１９】
配列番号１４、それに相補的な配列又はストリンジェントな条件下で配列番号１４もしくはその相補体とハイブリッド形成可能である配列から基本的に構成される、合成核酸配列。
【請求項２０】
配列番号１５、それに相補的な配列又はストリンジェントな条件下で配列番号１５もしくはその相補体とハイブリッド形成可能である配列から基本的に構成される、合成核酸配列。
【請求項２１】
請求項１６から請求項２０の何れか１項に記載の合成核酸配列を含む、組成物。
【請求項２２】
（ａ）（ｉ）ＩＮＳＲ遺伝子のエクソン１０の最後の５０塩基（配列番号１）、それに相補的な配列又はストリンジェントな条件下で配列番号１もしくはその相補体とハイブリッド形成可能である配列の、１０から３０個の連続ヌクレオチドを含む、合成核酸配列、
（ａ）（ｉｉ）ＩＮＳＲ遺伝子のエクソン１１（配列番号９）、それに相補的な配列又はストリンジェントな条件下で配列番号９もしくはその相補体とハイブリッド形成可能である配列、の１０から３０個の連続ヌクレオチドを含む、合成核酸配列；
（ａ）（ｉｉｉ）エクソン１０及び１１を架橋する塩基、それに相補的な配列又はストリンジェントな条件下でそれともしくはその相補体とハイブリッド形成可能である配列の、１０から３０個の連続ヌクレオチドを含む、合成核酸配列と、
（ｂ）ＩＮＳＲ遺伝子のエクソン１２の最初の５０塩基（配列番号１０）、それに相補的な配列又はストリンジェントな条件下で配列番号１０もしくはその相補体とハイブリッド形成可能である配列又はそれに相補的な配列の、１０から３０個の連続ヌクレオチドを含む合成核酸配列と、
を含む、生体試料中のＩＲ−Ｂ核酸配列を検出及び／又は定量するためのプライマーセット。
【請求項２３】
少なくとも１つの前記合成核酸配列が、
配列番号１１、それに相補的な配列又はストリンジェントな条件下で配列番号１１もしくはその相補体とハイブリッド形成可能である配列；及び
配列番号１２、それに相補的な配列又はストリンジェントな条件下で配列番号１２もしくはその相補体とハイブリッド形成可能である配列
の中から選択されるヌクレオチド配列を有する、請求項２２に記載のプライマーセット。
【請求項２４】
（ａ）ポリメラーゼによる増幅に適切な条件下で請求項２２に記載のプライマーセットと生体試料又は生体試料から調製される核酸を接触させる工程；
（ｂ）増幅された標的ＩＲ−Ｂ核酸配列を検出及び／又は定量する工程
を含む、生体試料中のＩＲ−Ｂ核酸を検出及び／又は定量するための方法。
【請求項２５】
前記生体試料が腫瘍試料である、請求項２４に記載の方法。
［請求項２４］
前記プライマーセットが、
配列番号１１、それに相補的な配列又はストリンジェントな条件下で配列番号１１もしくはその相補体とハイブリッド形成可能である配列と；
配列番号１２、それに相補的な配列又はストリンジェントな条件下で配列番号１２もしくはその相補体とハイブリッド形成可能である配列と、
を含む、請求項２４に記載の方法。
［請求項２５］
前記ポリメラーゼによる増幅が定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ｑ−ＰＣＲ）である、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記プライマーセットが、
配列番号１１、それに相補的な配列又はストリンジェントな条件下で配列番号１１もしくはその相補体とハイブリッド形成可能である配列と；
配列番号１２、それに相補的な配列又はストリンジェントな条件下で配列番号１２もしくはその相補体とハイブリッド形成可能である配列と；
検出可能な標識も有する、配列番号１３、それに相補的な配列又はストリンジェントな条件下で配列番号１３もしくはその相補体とハイブリッド形成可能である配列と、
を含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項２７】
前記プライマーセットが、
配列番号１１、それに相補的な配列又はストリンジェントな条件下で配列番号１１もしくはその相補体とハイブリッド形成可能である配列と；
配列番号１２、それに相補的な配列又はストリンジェントな条件下で配列番号１２もしくはその相補体とハイブリッド形成可能である配列と；
検出可能な標識も有する、配列番号１４、それに相補的な配列又はストリンジェントな条件下で配列番号１４もしくはその相補体とハイブリッド形成可能である配列と、
を含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項２８】
前記プライマーセットが、
配列番号１１、それに相補的な配列又はストリンジェントな条件下で配列番号１１もしくはその相補体とハイブリッド形成可能である配列と；
配列番号１２、それに相補的な配列又はストリンジェントな条件下で配列番号１２もしくはその相補体とハイブリッド形成可能である配列と；を含み、さらに、
検出可能な標識も有する、配列番号１５、それに相補的な配列又はストリンジェントな条件下で配列番号１５もしくはその相補体とハイブリッド形成可能である配列を含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項２９】
増幅産物が１００塩基未満である、請求項２４に記載の方法。
【請求項３０】
ポリメラーゼによる増幅に適切な条件下で生体試料中のＩＲ−Ａ核酸配列を検出及び／又は定量するためのプライマーセットと生体試料又は生体試料から調製された核酸の試料を接触させること（該プライマーセットは、請求項６に記載のプライマーセットを含む）及び／又は、ポリメラーゼによる増幅に適切な条件下で生体試料中のＩＲ−Ｂ核酸配列を検出及び／又は定量するためのプライマーセットと生体試料又は生体試料から調製された核酸の試料を接触させること（該プライマーセットは、請求項２２に記載のプライマーセットを含む）と、
増幅された標的ＩＲ−Ａ又はＩＲ−Ｂ核酸配列を検出及び／又は定量することと、
を含む、生体試料中の標的ＩＲ−Ａ核酸配列及び／又は標的ＩＲ−Ｂ核酸配列の有無を判定するための方法。
【請求項３１】
請求項１に記載の少なくとも１つの合成核酸配列と、使用説明書と、を含む、生体試料中のＩＲ−Ａの有無を決定するためのキット。
【請求項３２】
前記少なくとも１つの合成核酸配列が、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、該配列の１つに相補的な配列又はストリンジェントな条件下で該配列の１つもしくはその相補体とハイブリッド形成可能である配列の中から選択されるヌクレオチド配列を有する、請求項３１に記載のキット。
【請求項３３】
前記合成核酸配列が、以下のプライマーセットの中から選択される、請求項３１に記載のキット：
（１）配列番号３、それに相補的な配列又はストリンジェントな条件下で配列番号３もしくはその相補体とハイブリッド形成可能である配列；
配列番号２１、それに相補的な配列又はストリンジェントな条件下で配列番号２１もしくはその相補体とハイブリッド形成可能である配列；及び
検出可能な標識も有する、配列番号７、それに相補的な配列又はストリンジェントな条件下で配列番号７もしくはその相補体とハイブリッド形成可能である配列；又は
（２）配列番号５、それに相補的な配列又はストリンジェントな条件下で配列番号５もしくはその相補体とハイブリッド形成可能である配列；
配列番号２２、それに相補的な配列又はストリンジェントな条件下で配列番号２２もしくはその相補体とハイブリッド形成可能である配列；及び
検出可能な標識も有する、配列番号８、それに相補的な配列又はストリンジェントな条件下で配列番号８もしくはその相補体とハイブリッド形成可能である配列。
【請求項３４】
適切なＰＣＲ試薬と；場合によってはＩＲ−Ａの有無を決定するための陽性及び／又は陰性対照と、をさらに含む、請求項３１に記載のキット。
【請求項３５】
請求項１６に記載の少なくとも１つの合成核酸配列と、使用説明書と、を含む、生体試料中のＩＲ−Ｂの有無を決定するためのキット。
【請求項３６】
前記合成核酸配列が、配列番号１１、配列番号１２、該配列の何れかに相補的な配列又はストリンジェントな条件下で該配列の何れかもしくはその相補体とハイブリッド形成可能である配列の中から選択されるヌクレオチド配列を有する、請求項３５に記載のキット。
【請求項３７】
前記合成核酸配列が、以下のプライマーセットから選択される、請求項３５に記載のキット：
（１）配列番号１１、それに相補的な配列又はストリンジェントな条件下で配列番号１１もしくはその相補体とハイブリッド形成可能である配列と；
配列番号１２、それに相補的な配列又はストリンジェントな条件下で配列番号１２もしくはその相補体とハイブリッド形成可能である配列と；
検出可能な標識を有する、配列番号１３、それに相補的な配列又はストリンジェントな条件下で配列番号１３もしくはその相補体とハイブリッド形成可能である配列；又は
（２）配列番号１１、それに相補的な配列又はストリンジェントな条件下で配列番号１１もしくはその相補体とハイブリッド形成可能である配列と；
配列番号１２、それに相補的な配列又はストリンジェントな条件下で配列番号１２もしくはその相補体とハイブリッド形成可能である配列と；
検出可能な標識を有する配列番号１４；又は
（３）配列番号１１、それに相補的な配列又はストリンジェントな条件下で配列番号１１もしくはその相補体とハイブリッド形成可能である配列と；
配列番号１２、それに相補的な配列又はストリンジェントな条件下で配列番号１２もしくはその相補体とハイブリッド形成可能である配列と；
検出可能な標識も有する、配列番号１５、それに相補的な配列又はストリンジェントな条件下で配列番号１５もしくはその相補体とハイブリッド形成可能である配列。
【請求項３８】
適切なＰＣＲ試薬と；場合によってはＩＲ−Ｂの有無を決定するための陽性及び／又は陰性対照と、をさらに含む、請求項３５に記載のキット。
【請求項３９】
請求項８に従い、試料中のＩＲ−Ａ発現を検出及び／又は定量し；
請求項２４に従い、試料中のＩＲ−Ｂ発現を検出及び／又は定量することを含み、
ＩＲ−Ａ及びＩＲ−Ｂの発現が、ＩＧＦＩ／ＩＩリガンド又はＩＧＦ１Ｒ受容体アンタゴニストを対象に投与するべきか否かの指標である、ＩＧＦＩ／ＩＩリガンド又はＩＧＦＲ１受容体アンタゴニストに応答する患者を選択するための方法。
【請求項４０】
ＩＧＦＩ／ＩＩリガンド又はＩＧＦＲ１受容体アンタゴニストが抗体である、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記抗体が表１及び表２で挙げられる配列成分を含む、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
ポリメラーゼによる増幅に適切な条件下で、生体試料又は生体試料から調製された核酸を請求項６に記載のプライマーセットと接触させることと、
ポリメラーゼによる増幅に適切な条件下で、生体試料又は生体試料から調製された核酸を請求項２２に記載のプライマーセットと接触させることと；
増幅されたＩＲ−Ａ及びＩＲ−Ｂ核酸配列を定量することと；
それによって生体試料中のＩＲ−Ｂに対するＩＲ−Ａの相対発現を決定することと、
を含む、生体試料中の標的ＩＲ−Ａ核酸配列及び標的ＩＲ−Ｂ核酸配列の相対的な有無を決定するための方法。
【請求項４３】
請求項４２に記載の方法によって腫瘍試料中のＩＲ−Ｂに対するＩＲ−Ａの相対発現を決定することと、
ＩＲ−Ａ及びＩＲ−Ｂの相対発現を含む基準によって腫瘍を分類することと、
を含む、腫瘍を分類する方法。
【請求項４４】
請求項４２に記載の方法によって患者組織中のＩＲ−Ｂに対するＩＲ−Ａの相対発現を判定することと、
ＩＲ−Ａ及びＩＲ−Ｂの相対発現を含む基準によって該患者を分類することと、
それによってＩＧＦアンタゴニストに対する患者の相対応答性を予測することと、
を含む、ＩＧＦアンタゴニストによる治療に対して患者を選択する方法。
【請求項４５】
ＩＲ−Ａの発現がＩＲ−Ｂと比較して上昇している、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
請求項４２に記載の方法によって組織試料中のＩＲ−Ｂに対するＩＲ−Ａの相対発現を判定することと、
ＩＲ−Ａ及びＩＲ−Ｂの相対発現を含む基準によって患者を分類することと；
該分類に従いＩＧＦアンタゴニストを投与することと、
を含む、ＩＧＦアンタゴニストを用いて患者を治療する方法。
【請求項４７】
ＩＲ−Ａの発現がＩＲ−Ｂと比較して上昇している、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
前記ＩＧＦアンタゴニストが抗体である、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
前記抗体が、配列番号４５及び５３のアミノ酸配列を含むアミノ酸配列を含む、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
前記抗体が、表１及び２で示されるような配列番号４５及び５３のＣＤＲ配列を含む、請求項４８に記載の方法。
【請求項５１】
前記抗体が、配列番号４５からの３個のＣＤＲ及び軽鎖を含む、請求項４８に記載の方法。
【請求項５２】
前記抗体が配列番号５３からの３個のＣＤＲ及び重鎖を含む、請求項４８に記載の方法。
【請求項５３】
総インスリン受容体に対するＩＲ−Ａの％が４６．６％より大きい、請求項４５及び請求項４７の何れかに記載の方法。
【請求項５４】
ＩＲＡ：ＩＲ−ＢΔΔＣｔが約０．２未満である、請求項４５及び請求項４７の何れかに記載の方法。
【請求項５５】
ＩＲ−Ａに対するｌｏｇ２ベースのスケールでの相対量の差の平均が、約−０．０７±０．２９であり、ＩＲ−Ｂに対して約−２．０８±０．２５である、請求項４５及び請求項４７の何れかに記載の方法。
【請求項５６】
請求項４２に記載の方法によって乳癌腫瘍試料中のＩＲ−Ｂに対するＩＲ−Ａの相対発現を決定することと、ＩＲ−Ａ：ＩＲ−Ｂ比が閾値よりも低い場合にｌｕｍｉｎａｌ Ｂとして乳癌サブタイプを分類することと、を含む、乳癌腫瘍サブタイプを分類する方法。
【請求項５７】
ＩＲ−Ａ：ＩＲ−ＢΔΔＣｔを計算することをさらに含み、閾値が、約−１．１から約−２．４の範囲に設定されるＩＲ−Ａ：ＩＲ−ＢΔΔＣｔ値である、請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
閾値が約−１．４から−２．１の範囲である、請求項５４に記載の方法。
【請求項５９】
ＩＲ−Ａ：ＩＲ−ＢΔΔＣｔの決定が、サブタイプ分類を決定することにおいて、他の発現プロファイルと組み合わせられ得る、請求項５７に記載の方法。
【請求項６０】
請求項４２に記載の方法により腫瘍試料中のＩＲ−Ｂに対するＩＲ−Ａの相対発現を決定することと、より高いＩＲ−Ａ：ＩＲ−Ｂ比が、より高い増殖スコアを示す因子であるとみなすことと、を含む、腫瘍に対する増殖スコアを決定する方法。
【請求項６１】
ＩＲ−Ａ：ＩＲ−ＢΔΔＣｔを計算することと、より低いＩＲ−Ａ：ＩＲ−ＢΔΔＣｔ値が、より高い増殖スコアを示す因子であるとみなすことと、を含む、請求項６０に記載の方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【公表番号】特表２０１３−５０７１４４（Ｐ２０１３−５０７１４４Ａ）
【公表日】平成２５年３月４日（２０１３．３．４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−５３４２６５（Ｐ２０１２−５３４２６５）
【出願日】平成２２年１０月１１日（２０１０．１０．１１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０５２１７３
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／０４６８７１
【国際公開日】平成２３年４月２１日（２０１１．４．２１）
【出願人】（５０４３３３９７２）メディミューン，エルエルシー (108)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２５年３月４日（２０１３．３．４）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年１０月１１日（２０１０．１０．１１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０５２１７３
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／０４６８７１
【国際公開日】平成２３年４月２１日（２０１１．４．２１）
【出願人】（５０４３３３９７２）メディミューン，エルエルシー (108)
【Ｆターム（参考）】
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