腫瘍関連抗原としての拡張Ｉ型スフィンゴ糖脂質鎖
【課題】癌の診断に対する現在のアプローチにおける困難性のために、当該分野におい
て改善された組成物および方法を提供すること。
【解決手段】新規のヒト腫瘍関連抗原であって、より詳細には、例えばその１つの実施形態において、拡張１型スフィンゴ糖脂質鎖およびその使用（例えば、免疫原および腫瘍マーカーとしての使用）に関する腫瘍関連抗原としての拡張Ｉ型スフィンゴ糖脂質鎖であり、概して癌の検出に関する化合物および方法を提供するもの。
て改善された組成物および方法を提供すること。
【解決手段】新規のヒト腫瘍関連抗原であって、より詳細には、例えばその１つの実施形態において、拡張１型スフィンゴ糖脂質鎖およびその使用（例えば、免疫原および腫瘍マーカーとしての使用）に関する腫瘍関連抗原としての拡張Ｉ型スフィンゴ糖脂質鎖であり、概して癌の検出に関する化合物および方法を提供するもの。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（技術分野）
本発明は、概して新規のヒト腫瘍関連抗原に関する。本発明は、より詳細には
、拡張１型スフィンゴ糖脂質鎖およびその使用（例えば、免疫原および腫瘍マー
カーとしての使用）に関する。
【０００２】
（発明の背景）
財源および人材の莫大な投資にも関わらず、癌は、依然として死亡の主要な原
因の１つのままである。最新の癌治療は、悪性腫瘍を発症する患者の約５０％の
みを治療する。大部分のヒト悪性疾患において、転移は死亡の主要な原因である
。
【０００３】
転移は、遠隔部位における第２の腫瘍コロニーの形成である。大部分のヒト悪
性疾患において、遠隔転移は、しばしばあまりにも小さすぎて、原発腫瘍が処置
される時点では検出されない。さらに、転移性コロニーの広範囲な開始は、通常
、転移性疾患の臨床的症状が明らかである前に起こる。転移におけるサイズおよ
び年齢の変化、それらの分散した解剖学的位置、およびそれらの不均質な組成は
、外科的除去を妨げ、転移性コロニーに送達され得る抗ガン剤の濃度を抑える全
ての因子である。それ故に、原発部位からの腫瘍細胞の播種前の悪性疾患の検出
が、現在の癌治療の効果を向上させるのに必要とされる。
【０００４】
異常なグリコシル化は、大部分の癌の型について一般的な特徴であることが観
察されてきた。ヒト癌の診断のために使用される糖質抗原の大部分は、ポリラク
トサミン構造を有し、すなわち、それらはＧａｌβ１→３／４ＧｌｃＮＡｃを含
む。ポリラクトサミンは、通常、それらのポリラクトサミン単位構造に従って、
２つのカテゴリーに分類される。Ｇａｌβ１→３ＧｌｃＮＡｃ構造を有するポリ
ラクトサミンは、１型鎖と呼ばれ、Ｇａｌβ１→４ＧｌｃＮＡｃ構造を有するポ
リラクトサミンは、２型鎖と呼ばれる。主なヒト癌に見出される最も一般的な腫
瘍関連抗原は、ラクト系列２型鎖構造を有し、これは通常、シアリル化および／
またはフコシル化されている。１型鎖抗原は、正常の細胞および組織において豊
富であり、また癌と関連する。例えば、２→３シアリル化Ｌｅａ抗原（Ｎ１９−
９抗体によって規定されるＣＡ１９−９抗原）は、癌関連１型鎖−抗原である。
しかし、これらの公知の抗原の検出に基づく癌診断方法は、高い偽陽性発生数お
よび／または高い偽陰性発生数によって妨害されている。
【０００５】
癌の診断に対する現在のアプローチにおける困難性のために、当該分野におい
て改善された組成物および方法が必要とされる。本発明は、この要求を満たし、
さらに他の関連した利点を提供する。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明によって以下が提供されます。
（１） フコシル残基および／またはシアリル残基を含むかまたは含
まない、単離された化合物であって、該化合物は、以下の式：
Ｇａｌβ１→３ＧｌｃＮＡｃβ１→３Ｇａｌβ１→３ＧｌｃＮＡｃβ１→（
３Ｇａｌβ１→３ＧｌｃＮＡｃβ１→）ｎ３Ｇａｌβ１→４Ｇｌｃβ１→１Ｃｅ
ｒ
を有し、ここで、ｎは０または１以上の整数であり、そしてｎ＝１である場合、
少なくとも２つのフコシル残基および／または１つ以上のシアリル残基が存在し
、Ｇａｌは、ガラクトースを表し、ＧｌｃＮＡｃは、Ｎ−アセチルグルコサミン
を表し、Ｇｌｃは、グルコースを表し、そしてＣｅｒは、セラミドを表し、そし
てここで、該少なくとも２つのフコシル残基は、α１→４連結を介して該Ｇｌｃ
ＮＡｃ残基に連結され、かつ／またはα１→２連結を介して該末端Ｇａｌ残基に
連結され、そして該１以上のシアリル残基は、α２→３連結を介して末端Ｇａｌ
残基に連結され、かつ／またはα２→６連結を介して１つ以上の末端近傍Ｇｌｃ
ＮＡｃ残基に連結される、単離された化合物。
（２） 少なくとも２つのシアリル残基が存在する、項目１に記載
の単離された化合物。
（３） 以下の式：
【化１】
３Ｇａｌβ１→４Ｇｌｃβ１→１Ｃｅｒ
を有する、項目１に記載の単離された化合物であって、
ここでＦｕｃは、フコースを表し、そしてＮｅｕＡｃは、Ｎ−アセチルノイラミ
ン酸を表す、単離された化合物。
（４） 以下の式：
【化２】
を有する、項目１に記載の単離された化合物であって、
ここでＦｕｃは、フコースを表し、そしてＮｅｕＡｃは、Ｎ−アセチルノイラミ
ン酸を表す、単離された化合物。
（５） 以下の式：
【化３】
を有する、項目１に記載の単離された化合物であって、
ここでＦｕｃは、フコースを表し、そしてＮｅｕＡｃは、Ｎ−アセチルノイラミ
ン酸を表す、単離された化合物。
（６） 以下の式：
【化４】
を有する項目１に記載の単離された化合物であって、
ここでＦｕｃがフコースを表す、単離された化合物。
（７） 以下の式：
【化５】
を有する、項目１に記載の単離された化合物であって、
ここでＦｕｃがフコースを表す、単離された化合物。
（８） 以下の式：
【化６】
を有する、項目１に記載の単離された化合物であって、
ここでＮｅｕＡｃが、Ｎ−アセチルノイラミン酸を表し、そしてＦｕｃがフコー
スを表す、単離された化合物。
(発明の要旨）
簡単に述べると、本発明は、単離された化合物およびこのような化合物を検出
することによって癌をスクリーニングする方法を提供する。１局面において、本
発明は、フコシル残基および／またはシアリル残基を有しても有さなくてもよい
、以下：
【０００７】
【化７】
【０００８】
の式を有する単離された化合物を提供し、
ここで、ｎは０または１以上の整数であり、少なくとも２個のフコシル残基お
よび／または１個以上のシアリル残基が存在し、Ｇａｌはガラクトースを表し、
Ｇｌｃはグルコースを表し、ＧｌｃＡｃはＮ−アセチルグルコサミンを表し、Ｃ
ｅｒはセラミドを表し、ここで、上記少なくとも２個のフコシル残基は、α１→
４結合を介してＧｌｃＮＡｃに連結し、および／またはα１→２結合を介して末
端Ｇａｌ残基に連結し、そして上記１個以上のシアリル残基は、α２→３結合を
介して末端Ｇａｌ残基に連結し、および／またはα２→６結合を介して末端付近
の１個以上のＧｌｃＮＡｃ残基に連結する。
【０００９】
さらなる局面において、本発明は、以下：
【００１０】
【化８】
【００１１】
の式を有する上記の単離された化合物を提供し、
ここで、Ｆｕｃはフコースを表し、ＮｅｕＡｃはＮ−アセチルノイラミン酸を
表す。
【００１２】
別の局面において、本発明は、以下：
【００１３】
【化９】
【００１４】
の式を有する最初に記載された化合物を提供し、
ここで、Ｆｕｃはフコースを表し、ＮｅｕＡｃはＮ−アセチルノイラミン酸を
表す。
【００１５】
別の局面において、本発明は、以下：
【００１６】
【化１０】
【００１７】
の式を有する最初に記載された化合物を提供し、
ここで、Ｆｕｃはフコースを表し、ＮｅｕＡｃはＮ−アセチルノイラミン酸を
表す。
【００１８】
なおさらなる実施形態において、本発明は、以下：
【００１９】
【化１１】
【００２０】
の式を有する単離された化合物を提供する。
【００２１】
なおさらなる局面において、本発明は、以下：
【００２２】
【化１２】
【００２３】
の式を有するエピトープを含む単離された化合物を提供する。
【００２４】
なお他の局面において、本発明の化合物のいずれかは、ポリクローナル抗体ま
たはモノクローナル抗体の産生のための免疫原として使用され得る。
【００２５】
本発明の別の局面において、癌をスクリーニングするための方法が提供される
。本方法は、（ａ）温血動物から生物学的サンプルを単離する工程；および（ｂ
）化合物の存在または量についてサンプルを試験する工程を包含する。
【００２６】
（発明の詳細な説明）
本発明は、概して癌の検出に関する化合物および方法に関する。より具体的に
は、本発明の開示は、ラクト系列の１型鎖が癌組織における拡張された形態で生
じることを示す。
【００２７】
上で示されるように、１型ラクトサミン鎖（Ｇａｌβ１→３ＧｌｃＮＡｃ）は
、正常な細胞および組織において豊富であることが公知である。拡張２型鎖（す
なわち、Ｇａｌβ１→４ＧｌｃＮＡｃコア構造が繰り返される）を有するポリラ
クトサミン抗原が検出されたが、拡張１型鎖を有するポリラクトサミン抗原は検
出されなかった。従って、ラクト系列１型鎖は、伝統的に拡張形態で生じないと
考えられてきた。
【００２８】
本発明において開示されるように、ラクト系列Ｉ型鎖の拡張形態（すなわち、
Ｇａｌβ１→３ＧｌｃＮＡβ１→［３Ｇａｌβ１→３ＧｌｃＮＡｃβ→］ｎ３Ｇ
ａｌβ１→Ｒ、シアリル残基および／またはフコシル残基を有しても有しなくて
もよい）は癌組織内に存在する。２つの代表的な拡張形態のラクト系列１型鎖は
、（腫瘍細胞から抽出された）糖脂質画分を分取カラムおよび薄層クロマトグラ
フィーに供することによって単離された。
【００２９】
ゆっくりと移動するシアル酸−Ｌｅｗｉｓａ（ｓＬｅａ）活性スフィンゴ糖脂
質（ＧＳＬ）を、結腸腺癌細胞系統Ｃｏｌｏ２０５のモノシアリルガングリオシ
ド画分から精製して均質にした。この化合物を、２種の異なる溶媒系でＨＰＬＣ
および分取ＨＰＴＬＣによって精製し、α−ｓＬｅαモノクローナル抗体（ＭＡ
ｂ）ＮＫＨ−１を使用するＴＬＣ免疫染色によって強く染色した。穏やかな酸加
水分解（１％酢酸、１００℃で１時間）により、二量体−Ｌｅα標準ＧＳＬと共
に移動し、α−二量体ＬｅαＭＡｂ ＳＴ−４２１によって強く染色された、よ
り早く移動する成分を得た。この構造は、１Ｈ−ＮＭＲ分光法によって、シアリ
ル−二量体Ｌｅα（以下の構造を参照のこと）であると確認された。
【００３０】
【化１３】
【００３１】
。
【００３２】
上述した特定の糖脂質に加え、Ｌｅａ−ＬｅａエピトープおよびＬｅｂ−Ｌｅ
ａエピトープは、追加の［３Ｇａｌβ１→３ＧｌｃＮＡｃβｌ→］ｎ単位を有す
る拡張１型として提供され得る。さらに、Ｌｅａ−ＬｅａエピトープおよびＬｅ
ｂ−Ｌｅａエピトープは、糖タンパク質（例えば、高分子量ムチン様血清糖タン
パク質）によって運搬され得る。
【００３３】
本明細書中に提供される教示によれば、他の拡張形態のラクト系列１鎖化合物
が生物学的出発物質（例えば、癌組織）から単離され得るか、または構造的同定
を伴って化学的に（および／または酵素的に）合成され得ることが当業者に明ら
かである。簡単に述べれば、脂質またはタンパク質のいずれかに結合した炭水化
物の構造は、分解、質量分析法（電子直接試料導入（ＥＩ））および高速原子衝
撃（ＦＡＢ）を含む）、およびメチル化分析（以下に記載される技術、例えば、
Ｎｕｄｅｌｍａｎら．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６１：５４８７−５４９５
，１９８６）に基づいて、決定され得る。分解分析は、化学的に、および／また
は酵素的に（例えば、グリコシダーゼによって）達成され得る。分解分析によっ
て示唆される糖質配列は、メチル化分析（例えば、Ｈａｋｏｍｏｒｉ，Ｊ．Ｂｉ
ｏｃｈｅｍ．５５：２０５−２０８，１９６４）、続いて、過メチル化糖の化学
イオン化質量分析（例えば、Ｓｔｅｌｌｎｅｒら、Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．
Ｂｉｏｐｈｙｓ．１５５：４６４−４７２，１９７４；Ｌｅｖｅｒｙら，Ｍｅｔ
ｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１３８：１３−２５，１９８７）によって決定され得る。
代替的に、またはこれらの技術と組み合わせて、ＥＩ質量分析法は、過メチル化
グリカン上で、またはインタクトなグリカンの適切な分解後に実施され得る（例
えば、Ｋａｎｎａｇｉら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５９：８４４４−８４５
１，１９８４；Ｎｕｄｅｌｍａｎら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６３：１３９
４２−１３９５１，１９８８）。糖質配列の均質性は、種々の化学的および物理
的基準（インタクトなグリカン、またはメチル化したグリカンのプロトンＮＭＲ
分光法、およびＦＡＢ質量分析法）を含む）に基づいて実証され得る。一旦、糖
質構造が実証されれば、この糖質またはその誘導体あるいはその非糖質官能性等
価物は、当業者に周知の技術を使用して合成され得る。
【００３４】
本発明の化合物は、ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体（ＭＡｂ）
の産生のための免疫原として使用され得る。ポリクローナル抗体は、標準方法に
よって産生され得る。例えば、簡単に述べれば、ポリクローナル抗体は、本発明
の化合物による動物の免疫化およびその血清の後の回収によって産生され得る。
一般に、血清回収前に、初期免疫化後に１回以上の追加免疫を行うことが好まし
い。ＭＡＢは、一般に、ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ（Ｎａｔｕｒｅ２
５６：４９５−４９７，１９７５；Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６：５１１−
５１９，１９７６）の方法によって産生され得る。簡単に述べれば、本発明の化
合物で免疫化した動物のリンパ節および／または脾臓は、骨髄腫細胞と融合され
て、ハイブリッド細胞系統（「ハイブリドーマ」または「クローン」）を形成す
る。各ハイブリドーマは、単一の型の免疫グロブリンを分泌し、骨髄腫細胞と同
様に、無限な細胞分裂のための能力を有する。ハイブリドーマを介するＭＡｂの
産生の代替は、バクテリオファージおよびバクテリアを使用するＭＡｂ発現ライ
ブラリーの形成である（例えば、Ｓａｓｔｒｙら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａ
ｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８６：５７２８，１９８９；Ｈｕｓｅら．，Ｓｃｉｅｎｃｅ
２４６：１２７５，１９８９）。所望された特異性を示す抗体の選択は、当業者
に周知の種々の方法で実施され得る。
【００３５】
本発明の化合物の免疫原性を増加させるために、その化合物をキャリアと合わ
せることが所望され得る。適切なキャリアとして、不活化した細菌、カサガイヘ
モシアニン（ｋｅｙｈｏｌｅ ｌｉｍｐｅｔ ｈｅｍｏｃｙａｎｉｎ）、サイロ
グロブリン、ウシ血清アルブミンおよびそれらの誘導体が挙げられる。例えば、
ＧＳＬｓＬｅａ−ＬｅａまたはＬｅｂ−Ｌｅａの糖質残基の全てまたは一部は、
キャリアと合わせられ得る。本発明の化合物は、種々の手段（吸着および共有結
合を含む）によってキャリアと合わせられ得る。
【００３６】
免疫原としての本発明の化合物の使用の代表例は、Ｌｅｂ／Ｌｅａ抗原による
マウスの免疫化である。簡単に述べれば、Ｃｏｌｏ２０５細胞から単離したＬｅ
ｂ／Ｌｅａを、酸処理したＳａｌｍｏｎｅｌｌａ ｍｉｎｎｅｓｏｔａｅの懸濁
液と合わせ、尾静脈を介してＢＡＬＢ／ｃマウスに注射し、そしてこの注射を１
０日間の間隔で３回繰り返した。最終注射後、免疫化したマウスの脾細胞を採取
し、骨髄腫細胞と融合した。免疫原と優先的な反応性を示したハイブリドーマ、
ＩＭＨ２を樹立し、ＡＴＣＣ（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ
Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，１０８０１ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｂｏｕｌｅｖａｒ
ｄ， Ｍａｎａｓｓａｓ， Ｖｉｒｇｉｎｉａ ２０１１０ ＵＳＡ）にＡＴＣ
Ｃ番号ＨＢ１１０２６として寄託した。このハイブリドーマは、ＩｇＧ３アイソ
タイプを有するＭＡｂ １ＭＨ２を産生する。
【００３７】
Ｌｅａ−Ｌｅａ抗原および／またはＬｅｂ−Ｌｅｂ抗原のような拡張形態のＩ
型鎖抗原を検出するための方法は、癌についてスクリーンするために使用され得
る。例えば、ＧＳＬ Ｌｅｂ−ＬｅａおよびＧＳＬ Ｌｅａ−Ｌｅａを、種々の
腫瘍サンプルから調製した中性糖脂質画分のそれぞれＭＡｂ １ＭＨ２およびＭ
Ａｂ ＮＣＣ−ＳＴ−４２１で免疫染色するＴＬＣ（Ｗａｔａｎａｂｅら，Ｊｐ
ｎ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ（Ｇａｎｎ）７６：４３−５２，１９８５に従っ
て確立された）によって検出した。このようなサンプルとして、結腸癌、乳癌、
ホジキン病、胆嚢癌および胎児性横紋筋肉腫由来の組織が挙げられる。例えば、
ＧＳＬ Ｌｅａ−Ｌｅａは、脾臓、肝臓、腎臓、胎盤および肺由来の正常の組織
から、糖脂質画分内で検出されなかった。本明細書中に提供される教示によれば
、腫瘍関連拡張１型抗原を検出するための種々の手段（ＧＳＬ Ｌｅａ−Ｌｅａ
およびＬｅｂ−Ｌｅａのような腫瘍関連拡張Ｉ型抗原に対して特異的な結合パー
トナーの使用を含む）が本発明の方法内で使用され得ることは、当業者にとって
明らかである。例えば、Ｌｅａ−ＬｅａまたはＬｅｂ−Ｌｅａエピトープについ
て特異的な抗体は、上記のように産生され得、免疫複合体の存在は、免疫複合体
の形成を可能にするのに十分な条件下および時間で、このような抗体の生物学的
サンプルとの接触（例えば、インキュベーション）後、試験され得る。
【００３８】
上記の抗原とこの抗原に対して特異的な抗体との間で形成された免疫複合体の
存在の検出は、種々の公知の技術（例えば、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）お
よび酵素結合イムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ））によって達成され得る
。適切なイムノアッセイとして、Ｄａｖｉｄら（米国特許第４，３７６，１１０
号）の二重モノクローナル抗体サンドウィッチイムノアッセイ技術；モノクロー
ナル−ポリクローナル抗体サンドウィッチアッセイ（Ｗｉｄｅら、Ｋｉｒｋｈａ
ｍ ａｎｄ Ｈｕｎｔｅｒ編，Ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ Ｍｅｔｈｏ
ｄｓ Ｅ．ａｎｄ Ｓ．Ｌｉｖｉｎｇｓｔｏｎｅ，Ｅｄｉｎｂｕｒｇｈ，１９７
０）；Ｇｏｒｄｏｎら（米国特許第４，４５２，９０１号）の「ウエスタンブロ
ット」法；標識されたリガンドの免疫沈降法（Ｂｒｏｗｎら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃ
ｈｅｍ．２５５：４９８０−４９８３，１９８０）；例えば、Ｒａｉｎｅｓ ａ
ｎｄ Ｒｏｓｓ（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５７：５１５４−５１６０，１９
８２）によって記載されるような酵素結合イムノソルベントアッセイ；免疫細胞
学技術（蛍光色素の使用（Ｂｒｏｏｋｓら，Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ
．３９：４７７，１９８０）を含む）；および活性の中性化（Ｂｏｗｅｎ−Ｐｏ
ｐｅら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８１：２３９６−２
４００，１９８４）が挙げられる。上記のイムノアッセイに加えて、多数の他の
イムノアッセイ（米国特許第３，８１７，８２７号；同第３，８５０，７５２号
；同第３，９０１，６５４号；同第３，９３５，０７４号；同第３，９８４，５
３３号；同第３，９９６，３４５号；同第４，０３４，０７４号；および同第４
，０９８，８７６号に記載されるイムノアッセイを含む）が利用可能である。
【００３９】
検出の目的のために、抗体は標識されてもよいし、標識されなくてもよい。標
識されていない場合、抗体は凝集アッセイにおける使用を見出す。さらに、非標
識抗体は、免疫複合体と反応性である標識された分子と組み合わせて、あるいは
、免疫グロブリンに対して特異的な抗体のような、この化合物に対して指向され
た抗体と反応性である標識された抗体（二次抗体）と組み合わせて、使用され得
る。あるいは、この抗体は直接標識され得る。それらが標識される場合、レポー
ター基は、ラジオアイソトープ、蛍光色素、酵素、発光体（ｌｕｍｉｎｅｓｃｅ
ｒ）、または色素粒子を含み得る。これらの標識および他の標識は、当該分野に
おいて周知であり、例えば、以下の米国特許第３，７６６，１６２号；同第３，
７９１，９３２号；同第３，８１７，８３７号；同第３，９９６，３４５号；お
よび同第４，２３３，４０２号に記載される。
【００４０】
免疫複合体を検出するための１つの好ましい実施形態において、レポーター基
は、抗体に結合される。免疫複合体を検出する工程は、実質的に全ての非結合抗
体を除去する工程、および次いでこのレポーター基の存在を検出する工程を包含
する。非結合抗体は、この抗原に結合しなかった抗体である。
【００４１】
別の好ましい実施形態において、レポーター基は、この抗原に対して特異的な
抗体に結合し得る二次抗体に結合する。免疫複合体を検出する工程は、（ａ）実
質的に全ての非結合抗体（すなわち、この抗原に結合しなかった抗体）を除去す
る工程、（ｂ）二次抗体を加える工程、（ｃ）実質的に全ての結合していない二
次抗体を除去する工程、および、次いで（ｄ）このレポーター基の存在を検出す
る工程を包含する。例えば、抗原に対して特異的な抗体がマウス由来である場合
、二次抗体は抗マウス抗体である。
【００４２】
免疫複合体を検出するための第３の好ましい実施形態において、レポーター基
は、この免疫複合体に結合し得る分子に結合する。この検出する工程は、（ａ）
この分子を添加する工程、（ｂ）実質的に全ての非結合分子を除去する工程、お
よび、次いで、（ｃ）このレポーター基の存在を検出する工程を包含する。免疫
複合体に結合し得る分子の例は、プロテインＡである。
【００４３】
免疫複合体と反応性である標識された抗体、標識された第２の抗体または標識
された分子の使用の代替は、一般的には標識された抗原を使用するイムノアッセ
イである。このようなアッセイ（「間接的」または「競合的」）において、サン
プル中に存在する抗原は、この抗体について標識された抗原と競合する。
【００４４】
免疫複合体を検出するための種々の方法が本発明において使用され得ることは
、当業者にとって明らかである。この方法のいずれかにおける使用に適切なレポ
ーター基として、ラジオアイソトープ、蛍光色素、酵素、発光体、および色素粒
子が挙げられる。さらに、本発明の腫瘍関連拡張１型抗原に対して特異的な結合
パートナー（抗体を除く）は、このような抗原について試験するために使用され
得、このような結合パートナーと抗原との間で形成された複合体は、免疫複合体
について上に記載された技術に類似の技術によって検出され得る。
【００４５】
以下の実施例は、例示のために提供され、限定するためではない。
【００４６】
（実施例）
（実施例１）
（腫瘍組織および正常組織から調製された中性糖脂質のＭＡＢ ＮＣＣ−ＳＴ
−４２１を用いるＨＰＴＬＣ免疫染色およびイムノアッセイ）
（Ａ．モノクローナル抗体およびイムノアッセイ）
ＭＡｂ ＳＴ−４２１を、以前に記載されたとおりに樹立した（Ｗａｔａｎａ
ｂｅら，Ｊｐｎ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．（Ｇａｎｎ）７６：４３−５２，
１９８５）。ＭＡｂ ＭＮＨ−１（１型Ｎ−アセチルラクトサミン鎖（Ｇａｌβ
１→３ＧｌｃＮＡｃβ１→Ｒ）を規定する）を、本発明者らの研究室で調製した
；ＭＡｂ １Ｂ２（２型Ｎ−アセチルラクトサミン鎖（Ｇａｌβ１→４ＧｌｃＮ
Ａｃβ１→Ｒ）を規定する）を、以前に記載されるとおりに樹立した（Ｙｏｕｎ
ｇら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５６：１０９６７−１０９７２，１９８１）
。抗ＬｅａＭＡｂを、Ｃｈｅｍｂｉｏｍｅｄ Ｌｔｄ．（Ｅｄｍｏｎｔｏｎ，Ａ
ｌｂｅｒｔａ，Ｃａｎａｄａ）から得た。抗ＬｅｙＭＡｂ ＡＨ６を、以前に記
載されるように樹立し（Ａｂｅら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５８：１１７９
３−１１７９７，１９８３）、そしてこれは、Ｌｅｂとの交差反応性を示さなか
った。抗ＬｅｂＭＡｂを、Ｃｈｅｍｂｉｏｍｅｄ Ｌｔｄ．（Ｅｄｍｏｎｔｏｎ
，Ａｌｂｅｒｔａ，Ｃａｎａｄａ）から購入し、そしてこれは、１型Ｈ鎖との交
差反応性を示した。別の抗ＬｅｂＭＡｂを、Ｍｏｎｏｃａｒｂ（Ｌｕｎｄ，Ｓｗ
ｅｄｅｎ）から購入し、そしてこれは、Ｌｅｂ、１型Ｈ鎖、およびＬｅｙとの反
応性を示した。ＨＰＴＬＣ免疫染色を、Ｗｈａｔｍａｎ ＨＰＴＬＣプレート（
ＨＰ−ＫＦ）を使用して、元々Ｍａｇｎａｎｉら（Ｍａｇｎａｎｉら，Ａｎａｌ
．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１０９：３９９−４０２，１９８０）により記載された方法
の改変版（Ｋａｎｎａｇｉら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５７：４４３８−４
４４２，１９８２；Ｋａｎｎａｇｉら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５７：１４
８６５−１４８７４，１９８２）により実施した。
【００４７】
（Ｂ．糖脂質調製）
使用された全ての糖脂質サンプルを、単離するかまたは酵素的に合成した。Ｖ
Ｉ３ＮｅｕＡｃｎＬｃ６、ＩＶ３ＮｅｕＡｃＩＩＩ４ＦｕｃＬｃ４、ＶＩ２Ｆｕ
ｃｎＬｃ６、およびＩＶ２ＦｕｃＬｃ４を、それぞれヒト胎盤、肝臓腺癌、ヒト
Ｏ型赤血球、およびブタ腸から、ＩＨＷ（５５：２５：２０）での抽出、次いで
Ｆｏｌｃｈ分配、ＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｄｅｘクロマトグラフィー、およびＩａ
ｔｒｏｂｅａｄｓ ６ＲＳ−８０１０カラムでのＨＰＴＬＣの後、単離した（Ｍ
ａｇｎａｎｉら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５７：１４３６５−１４３６９，
１９８２；Ｗａｔａｎａｂｅら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５４：８２２３−
８２２９，１９７９；Ｈａｋｏｍｏｒｉら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．９８：３１−
３８，１９６７；Ｓｔｅｌｌｎｅｒら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １２：６５
６−６６１，１９７３）。ｎＬｃ６およびＩＩＩ４ＦｕｃＬｃ４を、１００℃で
１時間１％酢酸中でサンプルを加熱することによる、それぞれＶＩ３ＮｅｕＡｃ
ｎＬｃ６およびＩＶ３ＮｅｕＡｃＩＩＩ４ＦｕｃＬｃ４の脱シアリルにより調製
した。ＩＶ３ＧｌｃＮＡｃｎＬｃ４、ＩＶ３Ｇａｌβ１→３−ＧｌｃＮＡｃｎＬ
ｃ４、ＩＶ３Ｇａｌβ１→３［Ｆｕｃ１→４］ＧｌｃＮＡｃｎＬｃ４およびＩＶ
３Ｇａｌβ１→３［Ｆｕｃ１→４］ＧｌｃＮＡｃＩＩＩ３ＦｕｃｎＬｃ４（Ｌｅ
ａ−Ｌｅｘ）を、酵素的合成により調製した。ＩＶ３Ｇａｌβ１→３ＧｌｃＮＡ
ｃＩＩＩ３ＦｕｃｎＬｃ４を、ＩＶ３Ｇａｌβ１→３［Ｆｕｃ１→４］ＧｌｃＮ
ＡｃＩＩＩ３ＦｕｃｎＬｃ４のα−フコシダーゼ処理により調製した；すなわち
、１００μｇの糖脂質を、０．０５単位のウシ腎臓α−Ｌ−フコシダーゼ（Ｓｉ
ｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏ．）を含む０．２
Ｍのクエン酸緩衝液（ｐＨ４．５）と共に２時間３７℃でインキュベートした。
ＩＶ２ＩＩＩ４Ｆｕｃ２Ｌｃ４、Ｖ３ＩＩＩ３Ｆｕｃ２ｎＬｃ６、およびＶＩ２
Ｖ３Ｆｕｃ２ｎＬｃ６を、Ｃｏｌｏ２Ｏ５由来のα１→３／４フコシルトランス
フェラーゼを使用して、基質としてＩＶ２ＦｕｃＬｃ４、ｎＬｃ６、およびＶＩ
２ＦｕｃｎＬｃ６（それぞれ）のα１→３フコシル化により生合成的に調製した
。α１→３／４フコシルトランスフェラーゼを、４℃にて２容量の５０ｍＭ Ｈ
ｅｐｅｓ緩衝液（ｐＨ ７．０）、０．５Ｍスクロース、１ｍＭ ＥＤＴＡ、お
よび１％Ｔｒｉｔｏｎ ＣＦ−５４中、Ｐｏｔｔｅｒ−Ｅｌｖｅｈｊｅｍホモジ
ナイザーでＣｏｌｏ２Ｏ５細胞から可溶化した。このホモジネートを、１００，
０００×ｇで１時間遠心分離し、そしてその上清を透析により細胞の元の容積ま
で濃縮した。この酵素調製物を−８０℃で必要になるまで保存した。
【００４８】
酵素的α１→３／４フコシル化を、１ｍｌの全容積中に１ｍｇのスフィンゴ糖
脂質（ＧＳＬ）基質、１ｍｇのデオキシタウロコール酸塩、１０μｍｏｌのＭｎ
Ｃｌ２、２５μｍｏｌのＨｅｐｅｓ緩衝液（ｐＨ７．０）、５μｍｏｌのＣＤＰ
−コリン、６μｍｏｌのＧＤＰ−フコース、および５００μｌの酵素調製物を含
む反応混合物中で行った。この反応混合物を、３７℃で１６時間インキュベート
し、次いで凍結乾燥し、イソプロパノール−ヘキサン−水（ＩＨＷ）（５５：２
５：２０）で超音波処理により抽出し、そして遠心分離した。その上清を、Ｉａ
ｔｒｏｂｅａｄｓ６ＲＳ−８０１０カラムで５５：４０：５〜５５：２５：２０
のＩＨＷ勾配溶出を使用して２００分間にわたってＨＰＬＣにかけた。２ｍｌず
つのフラクションを収集し、そして最終生成物を含むチューブを、クロロホルム
−メタノール−水５０：４０：１０中のＨＰＴＬＣ移動度に従ってプールした。
ＧＳＬバンドを、オルシノールスプレー試薬により可視化した。
【００４９】
規定された構造を有する各ＧＳＬを、特定のＭＡｂ（単数または複数）との反
応性により特徴付けた（すなわち、抗ＬｅｂＭＡｂと反応するが抗ＬｅｙＭＡｂ
ＡＨ６とは反応しないＬｅｂ／Ｌｅａ抗原；ＡＨ６とは反応するが抗ＬｅｂＭ
Ａｂとも抗ＬｅｘＭＡｂとも反応しないＬｅｙ／Ｌｅｘ；抗ＬｅａＭＡｂおよび
ＭＡｂ ＳＴ−４２１と反応するＬｅａ／ＬｅａおよびＬｅａ／Ｌｅｘ）。
【００５０】
（Ｃ．ＴＬＣ免疫染色）
種々の腫瘍サンプルから調製された中性糖脂質フラクションのＴＬＣ免疫染色
は、−Ｌｅａ−活性セラミドペンタサッカリドよりも遅く移動するポジティブな
バンドの存在、および抗ＬｅａＭＡｂとの交差反応を示した。このバンドは、Ｍ
Ａｂ ＮＣＣ−ＳＴ−４２１により強く染色され、そして以前に試験された腫瘍
の大部分に見られた。結腸癌、乳癌、ホジキン病、胆嚢癌、および胎児性横紋筋
肉腫由来の例。
【００５１】
（実施例２）
（ダイマーＬｅａ抗原およびＬｅｂ−Ｌｅａ抗原の単離）
（Ａ．腫瘍組織の調製）
Ｃｏｌｏ２０５細胞（ＡＴＣＣ）（Ｓｅｍｐｌｅら，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．
３８：１３４５−１３５５，１９７８）を、１０％ウシ胎児血清を含有するＲＰ
ＭＩ１６４０培地中で増殖した。細胞を採取し、そしておよそ７日間毎に継代し
た。採取された細胞をトリプシン処理し、遠心分離し、リン酸緩衝化生理食塩水
（ｐＨ７．４）で２回洗浄し、そして血球計を使用して計数した。４×１０６個
の細胞を、６匹の無胸腺症（ヌード）マウスの各々に皮下注射した。腫瘍（それ
ぞれ約２ｍｌ）を、２週間後に切除し、そして必要になるまで−８０℃で凍結保
存した。
【００５２】
（Ｂ．Ｃｏｌｏ２０５腫瘍由来の移動遅延性Ｌｅａ活性成分（ダイマーＬｅａ
）の単離）
約２００ｇの腫瘍を、イソプロパノール−ヘキサン−水（ＩＨＷ）（５５：２
５：２０）で抽出し、次いでＦｏｌｃｈ分配、ＤＥＡＥ−ｓｅｐｈａｄｅｘクロ
マトグラフィー、そしてＩａｔｒｏｂｅａｄｓ ６ＲＳ−８０１０カラムのＨＰ
ＬＣにかけた。上相中性フラクションの勾配溶出を、５５：４０：５〜５５：２
５：２０のＩＨＷで２００分間にわたって行った。２ｍｌずつのフラクションを
収集し、そしてクロロホルム−メタノール−水（５０：４０：１０）中のＨＰＴ
ＬＣ移動度に従ってプールした。遅延移動性Ｌｅａ活性フラクション（ＴＬＣ免
疫染色により示される）を、Ｍｅｒｃｋ ＨＰＴＬＣプレート（Ｓｉｌｉｃａ
Ｇｅｌ ６０，Ｍｅｒｃｋ，Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）の分取ＴＬ
Ｃによりさらに精製し、そして構造特徴付けに使用した。
【００５３】
（Ｃ．Ｌｅｂ−Ｌｅａ抗原の単離）
ダイマーＬｅａ抗原の直ぐ下に移動するポジティブなバンド（実施例１に従う
ＭＡｂ ＮＣＣ−ＳＴ−４２１を用いた免疫染色による）を、上記のＢ節に記載
される方法を使用して精製する。
【００５４】
（実施例３）
（ダイマーＬｅａ抗原およびＬｅｂ−Ｌｅａ抗原の特徴付け）
（Ａ．酵素分解）
１ｍｇのダイマーＬｅａの酵素分解を、０．５単位のα−フコシダーゼ（ウシ
腎臓）、０．５単位のβ−ガラクトシダーゼ（ナタマメ）、および０．５単位の
β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ（ウシ精巣）（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃ
ａｌ Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏ．）を用いて逐次的に加水分解により行
った。全ての反応を０．２Ｍクエン酸ナトリウム（ｐＨ４．５）中４時間３７℃
で振盪しながら水浴中で行った。各分解産物の精製を、分取ＨＰＴＬＣにより行
った。
【００５５】
（Ｂ．ＩＭＨ２のインビトロ細胞傷害性）
（１．細胞株）
Ｃｏｌｏ２Ｏ５を、最初にＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃ
ｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）から入手し、そして１０％のウシ胎児血清、ｍ
ＭのＬ−グルタミン、１００ＩＵ／ｍｌのペニシリン、および１０μｇ／ｍｌの
ストレプトマイシンを補充したＲＰＭＩ−１６４０培地で培養した。ヒト類表皮
癌Ａ４３１細胞株（ＭａｃＬｅｏｄら，Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．１２７
：１７５−１８２，１９８６）は、元々Ｃａｒｏｌ ＭａｃＬｅｏｄ博士（Ｇｉ
ｌｄｒｅｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｆａｃｉｌｉｔｙ，ＵＣＳＤ Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ
Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）から提供された。この細胞株
は、ＥＧＦレセプター上でＬｅａ、Ｌｅｂ、Ｌｅｘ、ＬｅｙおよびＡＬｅｂを発
現する（Ｇｏｏｉら，Ｂｉｏｓｃｉ．Ｒｅｐｏｒｔｓ ５：８３−９４，１９８
５）。Ａ４３１細胞を、５％ウシ胎児血清、１ｍＭのグルタミン、１１０ｍｇ／
ｌのピルビン酸ナトリウム、１００ＩＵ／ｍｌのペニシリン、および１０μｇ／
ｍｌのストレプトマイシンを補充したＤｕｌｂｅｃｃｏ改変Ｅａｇｌｅ培地（Ｉ
ｒｖｉｎｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｓａｎｔａ Ａｎａ，ＣＡ）中で培養した
。細胞（約５×１０５／ｍｌ）を、接種し、そしてＥＤＴＡ処理次いでＣａ２＋
およびＭｇ２＋を含有するＰＢＳでの洗浄による集密度で採取した。これらをイ
ンビトロ細胞傷害性アッセイにおける標的細胞として使用するか、または５×１
０６個の細胞の皮下接種によるムードマウスにおける腫瘍形成を試験するために
使用した。ヒト赤白血病Ｋ５６２細胞（Ｌｏｚｚｉｏら；Ｂｌｏｏｄ ４５：３
２１−３３４，１９７５）を、アッセイ系で使用されるリンパ球のナチュラルキ
ラー（ＮＫ）活性についてのコントロールとして使用した。
【００５６】
（２．抗体依存性細胞の細胞傷害性（ＡＤＣＣ）および補体依存性細胞傷害性
（ＣＤＣ））
ＡＤＣＣアッセイのために、ヒト末梢血リンパ球（ＨＰＢＬ）（エフェクター
細胞として使用される）を、健康な志願ドナー由来の血液のバフィーコートフラ
クションから得た。簡単には、単核細胞を、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ勾配
溶液による２０００ｒｐｍで２０分間の遠心分離により分離した（Ｍｉｓｈｅｌ
ｌら，Ｍｉｓｈｅｌｌ，Ｂ．ＢおよびＳｈｉｉｇｉ，Ｓ．Ｍ．（編），Ｓｅｌｅ
ｃｔｅｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，
ｐｐ．３−２７，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ＆Ｃｏ．，Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃ
ｏ，ＣＡ，１９８０）。マウス脾臓細胞およびマウス腹膜マクロファージ（エフ
ェクター細胞）を、以下のようないくつかの改変をしてＭｉｓｈｅｌｌらにより
以前に記載されたように調製した。標的細胞（５×１０６個）を、１００μｌの
５１Ｃｒと共に９０分間３７℃でインキュベートすることにより標識した。洗浄
（３回）およびインキュベーション（３７℃で１時間）の後、細胞（１×１０６
／ｍｌ）を、２５ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液および３％のウシ血清アルブミンを補
充したＲＰＭＩ−１６４０中に懸濁した。２０μｌの標識した細胞、１００μｌ
のＩＭＨ２またはＳＴ−４２１、および１００μｌのエフェクター細胞懸濁液を
ミクロタイターＵ底プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ，ＮＹ）中に混合した。非特異的
マウスＩｇ（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）をネガティブコントロール
として使用した。４時間のインキュベーションの後、これらのプレートを、遠心
分離機に組み立てられた懸垂プレートホルダーを用いて遠心分離し（５００×ｇ
、２分間）、そして各ウェル中の１００μｌの上清における放射能をγ線計数器
で測定した。各実験群を３回試験した。特異的溶解％を、式（［Ａ−Ｂ］×１０
０）／Ｃ（ここで、Ａ＝溶解した実験細胞中のｃｐｍ；Ｂ＝未溶解の標的細胞中
のｃｐｍ；Ｃ＝全標的細胞中のｃｐｍ）に従って計算した。自発性放出は、放出
可能な最大の標識放射能の１５％を超えなかった。
【００５７】
ＣＤＣに関して、５１Ｃｒ放出アッセイを、エフェクター細胞の代わりに補体
源として１００μｌの希釈ヒト血清を加えたことを除いて、ＡＤＣＣと同様な手
順を使用して行った。この血清を５６℃で３０分間不活化し、そしてコントロー
ルとして使用した。特異的溶解％を、上記のように計算した。
【００５８】
Ｃｏｌｏ２Ｏ５細胞は、拡張１型Ｌｅａ／Ｌｅａ鎖抗原およびＬｅｂ／Ｌｅａ
抗原を発現すると特徴付けられていたので（これらは、それぞれＭＡｂ ＳＴ−
４２１およびＩＭＨ２と強く反応する）、ＩＭＨ２のＣｏｌｏ２Ｏ５に対する細
胞傷害性効果を評価し、ＳＴ−４２１の細胞傷害性効果と比較した。両方のＭＡ
ｂは、Ｃｏｌｏ２０Ｓ細胞の顕著なＡＤＣＣ殺傷を示した。この殺傷は、エフェ
クター細胞：標的細胞（Ｅ：Ｔ）比およびＭＡｂ濃度と相関があった。この細胞
傷害性効果は、１００：１〜２００：１のＥ：Ｔ比、および３５〜７０μｇ／ｍ
ｌのＭＡｂ濃度で最大であった。コントロールマウスＩｇＧおよび他の非特異的
ＭＡｂは、Ｅ：Ｔ比またはＭＡｂ濃度にかかわらず細胞傷害性効果を示さなかっ
た。同じ細胞傷害性試験をマウス脾臓細胞で行った場合、対応する値は、わずか
７％溶解および１７％溶解（Ｅ：Ｔ比２００：１、Ｍａｂ濃度３０μｇ／ｍｌ）
であった。ＭＡｂは、Ａ４３１細胞に対して弱い細胞傷害性効果を示した（表）
。Ｃｏｌｏ２０５細胞、Ａ４３１細胞、およびＫ５６２細胞の最大ＩＭＨ２依存
性溶解の比較を表に示す。高い溶解値（例えば、それぞれＩＭＨ２およびＳＴ−
４２１を用いたＣｏｌｏ２０５細胞の６５％溶解および９４％溶解）は、ＨＰＢ
Ｌの存在下でのみ顕著であり；ＳＴ−４２１で以前に観察されたように、値は、
マウス脾臓細胞では非常に低かった（Ｗａｔａｎａｂｅら，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅ
ｓ．５１：２１９９−２２０４，１９９１）。ＩＭＨ２およびＳＴ−４２１によ
り媒介されるＣＤＣは、同様に補体濃度およびＭＡｂ濃度と相関した。
（表 ＭＡｂ ＳＴ−４２１およびＩＭＨ２による、Ｃｏｌｏ２０５細胞、Ａ４
３１細胞、およびＫ５６２細胞に対するＭＡｂ依存性細胞傷害性効果）
【００５９】
【表１】
【００６０】
ａ．ＩＭＨ２（３５μｇ／ｍｌ）およびＳＴ−４２１（×１００希釈腹水）を用
いて、１００：１のＥ：Ｔ（エフェクター細胞：標的細胞）比における溶解パー
セント。
ｂ．フローサイトメトリーにより決定。＋、ポジティブ；±、弱いポジティブ；
−、ネガティブ。
ｃ．Ｋ５６２細胞の高い細胞傷害性効果はまた、ＭＡｂの非存在下で観察され、
そしてこれは、ナチュラルキラー細胞活性を反映すると考えられる。
【００６１】
（Ｃ．インビボ腫瘍抑制）
インビボ実験に使用されるＣｏｌｏ２０５細胞およびＡ４３１細胞を、インビ
トロで増殖し、培地で２回洗浄し、そしてＰＢＳ中で所望の細胞密度で再形成し
た。細胞（５×１０６／１００μｌ）を、５〜７週齢の無胸腺症ＢＡＬＢ／ｃマ
ウスの背部に皮下注射し、そしてＭＡｂの腹腔内投与を注射の直後に開始した。
ＩｇＧの対応する濃度（１．１〜１．２ｎｇ／ｍｌ）を有する、腹水液中の精製
されたＩＭＨ２（１．１ｍｇ／ｍｌ）またはＳＴ−４２１を、０．２ｍｌ／動物
の投薬量で、２週間にわたって１回／日で腹腔内注入した。腫瘍の幅および長さ
を、同一の観察者により３回／週で測定した。腫瘍重量を、（幅２×長さ）／２
として見積もった。コントロール動物に、ＢＡＬＢ／ｃマウスにおけるマウス骨
髄腫細胞株ＮＳ１により作製された腹水タンパク質を投与した。１群あたり７匹
のマウスを、各実験に使用し、そして実験を２回行った。２回の実験に基づく平
均腫瘍重量値をプロットした。
【００６２】
ＭＡｂ ＩＭＨ２およびＳＴ−４２１の両方は、ヌードマウスにおけるＣｏｌ
ｏ２０５腫瘍増殖の顕著な阻害を示した。対照的に、両方のＭＡｂは、Ａ４３１
腫瘍増殖に対して最小の阻害効果を示した。従って、規定された抗原の高い発現
は、インビボでの腫瘍増殖の抗体依存性阻害に対する感受性に必須であると思わ
れる。
【００６３】
（Ｄ．種々の腫瘍組織および正常組織とのＩＭＨ２の反応性）
種々の腫瘍組織および隣接正常組織を、ホルマリンで固定しそしてパラフィン
に包埋した外科標本から得た。さらに、脳、胸腺、肺、肝臓、胃、結腸、腎臓、
副腎、腺、脾臓、膵臓、子宮（子宮内膜を含む）、および皮膚由来の正常組織お
よびいくつかの腫瘍組織を、事故犠牲者からの新しい剖検から得た。外科標本お
よび剖検標本の両方は、Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ，Ｓ
ｗｅｄｉｓｈ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｅｎｔｅｒ，Ｓｅａｔｔｌｅ，ＷＡおよびＴ
ｈｅ Ｂｉｏｍｅｍｂｒａｎｅ ＩｎｓｔｉｔｕｔｅのＭｓ．Ｄｅｂｂｉｅ Ｂ
ｅｎｎｅｔｔからの無料提供であった。サンプルを薄片に切り（厚さ３μＭ）、
キシレン（ｚｙｌｅｎｅ）でパラフィンを除去し、エタノールで脱水し、一次Ｍ
Ａｂで処理して、ビオチン化二次ＭＡｂおよびペルオキシダーゼ結合体化アビジ
ンで続けて処理し、そして３’，３’−ジアミノベンジジンで染色した。内因性
ペルオキシダーゼ活性を、切片を０．３％Ｈ２Ｏ２で２０分間処理することによ
りブロックした。いくつかの切片をネガティブコントロールとしてマウスＩｇＧ
と共にインキュベートした。ビオチン化ヤギ抗マウスＩｇＭ、アビジン、および
ビオチンは、Ｖｅｃｔａｓｔａｉｎ（Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ）由来であっ
た。
【００６４】
Ｍａｂ ＩＭＨ２は、結腸、直腸、肝臓、膵臓、および子宮内膜由来の腫瘍と
、強くかつ高い発生率で反応した（表Ｉ）。対照的に、遠位結腸および直腸の正
常粘膜（陰窩領域および杯細胞を含む）とは反応性を示さなかった。肺腺癌とは
反応したが、大細胞癌または小細胞癌とは反応しなかった。５件の扁平上皮癌の
うち１つは、強いポジティブの反応性を示した。ＭＡｂ ＩＭＨ２は、正常な脳
、肺、脾臓、皮膚の組織、または顆粒球を含む種々の血球と反応しなかった。
【００６５】
強い染色が観察された正常組織の場所は、以下の通りである：胸腺のハッサル
体および上皮細網細胞（胸腺細胞はネガティブである）；胃粘膜の粘膜上皮およ
び分泌腺（固有層、漿膜、および筋層はネガティブであった）；副腎の髄質およ
び皮質の両方。中程度から弱いポジティブ染色を有する正常組織の場所は、以下
である：腎臓の近位回および遠位回の上皮細胞（その他の部分はネガティブであ
った）；膵臓のランゲルハンス島の細胞（膵臓のその他の部分はネガティブであ
った）；盲管粘膜；尿路上皮。非常に弱い染色が肝細胞に関して観察された（肝
臓のその他の部分、小葉間結合組織、中心静脈、胆管、およびクップファー細胞
は、ネガティブであた）。これらの結果を表Ｉに要約する。
表Ｉ．ＭＡｂ ＩＭＨ２による正常組織および癌の免疫組織学的染色
【００６６】
【表２】
【００６７】
（Ｅ．既知のルイス状態および分泌状態を有する患者由来の結腸および膀胱の
正常組織および悪性組織とのＩＭＨ２の反応性）
ＬｅｂおよびＬｅｙ決定基の発現は、個体の分泌状態と相関し（Ｓａｋａｍｏ
ｔｏら，Ｍｏｌｅｃ．Ｉｍｍｕｎ．２１：１０９３−１０９８，１９８４；Ｏｅ
ｒｎｔｏｆｔら，Ｊ．Ｕｒｏｌ．１３８：１７１−１７６，１９８７）、他方、
いくつかの腫瘍におけるルイス抗原の発現は、宿主のルイス状態と関連しない（
Ｏｅｒｎｔｏｆｔら、Ｌａｂ．Ｉｎｖｅｓｔ．５８：５７６−５８３，１９８８
；Ｏｅｒｎｔｏｆｔら，Ｂｌｏｏｄ ７７：１３８９−１３９６，１９９１）。
従って、既知のルイス状態および分泌状態を有する患者由来の結腸および膀胱の
正常組織および悪性組織とのＭａｂ ＩＭＨ２の反応性を調べた。結果を表ＩＩ
および表ＩＩＩに要約する。ＩＭＨ２は、直腸腫瘍と反応性であるが、正常直腸
組織とは反応性ではなく、そしてこの反応性は、分泌状態とは関係がない。逆に
、ＩＭＨ２は、正常盲端とは反応性であったが、調べられた単一の盲端腫瘍サン
プルとはそれほど反応性ではなかった。これらの結果は、結腸正常組織および悪
性組織におけるＩＭＨ２エピトープ発現の傾向は、ＡＢＨ抗原の十分に確立され
ている発現パターンと類似していることを示唆する。真性ルイスネガティブ（Ｌ
ｅａ−ｂ−）の個体（Ｏｅｒｎｔｏｆｔら，Ｌａｂ．Ｉｎｖｅｓｔ．５８：５７
６−５８３，１９８８）は、結腸正常組織および悪性組織の両方においてＩＭＨ
２エピトープを発現した（表ＩＩおよびＩＩＩ）。
【００６８】
ＩＭＨ２エピトープは、正常尿路上皮において発現されるが、その発現は、膀
胱腫瘍の程度の変化に対して減少する。これらは、腹水の段階との相関と思われ
る。すなわち、ＩＭＨ２エピトープ発現は、高度に侵襲性の腫瘍において最も低
い。また、この傾向は、膀胱正常組織および悪性組織におけるＡＢＨ抗原の発現
の傾向と類似する。しかし、結腸組織と対照的に、血液型群Ａの個体由来の膀胱
組織におけるＩＭＨ２エピトープ発現は、分泌状態と相関する。真性ルイスネガ
ティブ（Ｌｅａ−ｂ−）の個体は、膀胱正常組織および悪性組織の両方において
ＩＭＨ２エピトープを発現した。
表ＩＩ．結腸正常組織および悪性組織のＭＡｂ ＩＭＨ２による免疫組織学的染
色：宿主ルイス状態との関係。
【００６９】
【表３】
【００７０】
数字は、試験された合計標本で割ったポジティブ標本を示す。ＮＤ＝決定されな
い。Ｌｅａ−ｂ−個体（真性および非真性）について、表現型状態を、唾液にお
けるα１→４フコシルトランスフェラーゼ活性、ならびに抗ＬｅａＭＡｂおよび
抗ＬｅｂＭＡｂとの赤血球反応性により決定した。表現型の定義は、Ｈｏｌｍｅ
ｓら，Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．２７４：１４−２５，１９
８９、およびＯｅｒｎｔｏｆｔら，Ｌａｂ．Ｉｎｖｅｓｔ．５８：５７６−５８
３，１９８８に見出され得る。
ａ非分泌者
表ＩＩＩ．膀胱正常組織および悪性組織のＭＡｂ ＩＭＨ２による免疫組織学的
染色：宿主ルイス状態との関係
【００７１】
【表４】
【００７２】
主な脚注は表ＩＩのとおり。
【００７３】
（Ｆ．拡張シアリル−Ｌｅａ（すなわちＳＬｅａ−Ｌｅａ）の単離）
Ｃｏｌｏ２０５細胞のモノシアロ−ガングリオシドフラクションの試験は、高
性能薄層クロマトグラフィー技術による１つの主要なガングリオシドの単離をも
たらすかまたは単離を生じた。この主要なバンドを抽出して特徴付けした。構造
を以下：
【００７４】
【化１４】
【００７５】
と同定した。
【００７６】
この構造は、１Ｈ−ＮＭＲ分光法により確認した。
【００７７】
ＳＬｅａ−Ｌｅａ構造上の拡張シアリル−Ｌｅａを、シアリダーゼを用いる酵
素分解により確認して、薄層クロマトグラフィーおよびモノクローナル抗体ＳＴ
−４２１での免疫染色により確認された場合のＬｅａ−Ｌｅａと同じ化合物を得
た。元々のシアリルＬｅａ−Ｌｅａまたは拡張Ｌｅａは、ＭＡｂ ＳＴ−４２１
との反応性を示さない。しかし、この化合物は、Ｎ−１９−９、ＮＫＨ−１およ
びＮＫＨ−２のようなシアリル−Ｌｅａに特異的なＭＡｂとの反応性を示した。
【図面の簡単な説明】
【００７８】
【図１】図１は、糖Ｉ（Ｇｌｃ）、ＩＩ（Ｇａｌ）、ＩＩＩ（ＧｌｃＮＡｃ）、ＩＶ（Ｇａｌ）、Ｖ（ＧｌｃＮＡｃ）およびＶＩ（ＧａｌおよびＦＩＩＩとして同定されるＩＩＩ ＧｌｃＮＡｃに結合したフコース、およびＦＩＶによって示されるようなＶＧｌｃＮＡｃに結合したフコース）をカバーする４．２０ｐｐｍ〜５．６０ｐｐｍにおける化学シフトからの、拡張シアリルＬｅａの１Ｈ−ＮＭＲスペクトルである。このスペクトルにおいて、ＦＶおよびＦＩＩＩの全てのアノマープロトンスペクトルは、ＦＶ−１およびＦＩＩＩ−１として示される。さらに、フコースのスペクトルＣ５プロトンは、ＦＩＩＩ−５およびＦＶ−５によって示されるように、多重カップリングによって示される。Ｃｉｓとして示されるスペクトルは、スフィンゴシンのＣｉｓ二重結合であり、Ｒ−５およびＲ−４は、スフィンゴシンのスペクトルを示す。
【技術分野】
【０００１】
（技術分野）
本発明は、概して新規のヒト腫瘍関連抗原に関する。本発明は、より詳細には
、拡張１型スフィンゴ糖脂質鎖およびその使用（例えば、免疫原および腫瘍マー
カーとしての使用）に関する。
【０００２】
（発明の背景）
財源および人材の莫大な投資にも関わらず、癌は、依然として死亡の主要な原
因の１つのままである。最新の癌治療は、悪性腫瘍を発症する患者の約５０％の
みを治療する。大部分のヒト悪性疾患において、転移は死亡の主要な原因である
。
【０００３】
転移は、遠隔部位における第２の腫瘍コロニーの形成である。大部分のヒト悪
性疾患において、遠隔転移は、しばしばあまりにも小さすぎて、原発腫瘍が処置
される時点では検出されない。さらに、転移性コロニーの広範囲な開始は、通常
、転移性疾患の臨床的症状が明らかである前に起こる。転移におけるサイズおよ
び年齢の変化、それらの分散した解剖学的位置、およびそれらの不均質な組成は
、外科的除去を妨げ、転移性コロニーに送達され得る抗ガン剤の濃度を抑える全
ての因子である。それ故に、原発部位からの腫瘍細胞の播種前の悪性疾患の検出
が、現在の癌治療の効果を向上させるのに必要とされる。
【０００４】
異常なグリコシル化は、大部分の癌の型について一般的な特徴であることが観
察されてきた。ヒト癌の診断のために使用される糖質抗原の大部分は、ポリラク
トサミン構造を有し、すなわち、それらはＧａｌβ１→３／４ＧｌｃＮＡｃを含
む。ポリラクトサミンは、通常、それらのポリラクトサミン単位構造に従って、
２つのカテゴリーに分類される。Ｇａｌβ１→３ＧｌｃＮＡｃ構造を有するポリ
ラクトサミンは、１型鎖と呼ばれ、Ｇａｌβ１→４ＧｌｃＮＡｃ構造を有するポ
リラクトサミンは、２型鎖と呼ばれる。主なヒト癌に見出される最も一般的な腫
瘍関連抗原は、ラクト系列２型鎖構造を有し、これは通常、シアリル化および／
またはフコシル化されている。１型鎖抗原は、正常の細胞および組織において豊
富であり、また癌と関連する。例えば、２→３シアリル化Ｌｅａ抗原（Ｎ１９−
９抗体によって規定されるＣＡ１９−９抗原）は、癌関連１型鎖−抗原である。
しかし、これらの公知の抗原の検出に基づく癌診断方法は、高い偽陽性発生数お
よび／または高い偽陰性発生数によって妨害されている。
【０００５】
癌の診断に対する現在のアプローチにおける困難性のために、当該分野におい
て改善された組成物および方法が必要とされる。本発明は、この要求を満たし、
さらに他の関連した利点を提供する。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明によって以下が提供されます。
（１） フコシル残基および／またはシアリル残基を含むかまたは含
まない、単離された化合物であって、該化合物は、以下の式：
Ｇａｌβ１→３ＧｌｃＮＡｃβ１→３Ｇａｌβ１→３ＧｌｃＮＡｃβ１→（
３Ｇａｌβ１→３ＧｌｃＮＡｃβ１→）ｎ３Ｇａｌβ１→４Ｇｌｃβ１→１Ｃｅ
ｒ
を有し、ここで、ｎは０または１以上の整数であり、そしてｎ＝１である場合、
少なくとも２つのフコシル残基および／または１つ以上のシアリル残基が存在し
、Ｇａｌは、ガラクトースを表し、ＧｌｃＮＡｃは、Ｎ−アセチルグルコサミン
を表し、Ｇｌｃは、グルコースを表し、そしてＣｅｒは、セラミドを表し、そし
てここで、該少なくとも２つのフコシル残基は、α１→４連結を介して該Ｇｌｃ
ＮＡｃ残基に連結され、かつ／またはα１→２連結を介して該末端Ｇａｌ残基に
連結され、そして該１以上のシアリル残基は、α２→３連結を介して末端Ｇａｌ
残基に連結され、かつ／またはα２→６連結を介して１つ以上の末端近傍Ｇｌｃ
ＮＡｃ残基に連結される、単離された化合物。
（２） 少なくとも２つのシアリル残基が存在する、項目１に記載
の単離された化合物。
（３） 以下の式：
【化１】
３Ｇａｌβ１→４Ｇｌｃβ１→１Ｃｅｒ
を有する、項目１に記載の単離された化合物であって、
ここでＦｕｃは、フコースを表し、そしてＮｅｕＡｃは、Ｎ−アセチルノイラミ
ン酸を表す、単離された化合物。
（４） 以下の式：
【化２】
を有する、項目１に記載の単離された化合物であって、
ここでＦｕｃは、フコースを表し、そしてＮｅｕＡｃは、Ｎ−アセチルノイラミ
ン酸を表す、単離された化合物。
（５） 以下の式：
【化３】
を有する、項目１に記載の単離された化合物であって、
ここでＦｕｃは、フコースを表し、そしてＮｅｕＡｃは、Ｎ−アセチルノイラミ
ン酸を表す、単離された化合物。
（６） 以下の式：
【化４】
を有する項目１に記載の単離された化合物であって、
ここでＦｕｃがフコースを表す、単離された化合物。
（７） 以下の式：
【化５】
を有する、項目１に記載の単離された化合物であって、
ここでＦｕｃがフコースを表す、単離された化合物。
（８） 以下の式：
【化６】
を有する、項目１に記載の単離された化合物であって、
ここでＮｅｕＡｃが、Ｎ−アセチルノイラミン酸を表し、そしてＦｕｃがフコー
スを表す、単離された化合物。
(発明の要旨）
簡単に述べると、本発明は、単離された化合物およびこのような化合物を検出
することによって癌をスクリーニングする方法を提供する。１局面において、本
発明は、フコシル残基および／またはシアリル残基を有しても有さなくてもよい
、以下：
【０００７】
【化７】
【０００８】
の式を有する単離された化合物を提供し、
ここで、ｎは０または１以上の整数であり、少なくとも２個のフコシル残基お
よび／または１個以上のシアリル残基が存在し、Ｇａｌはガラクトースを表し、
Ｇｌｃはグルコースを表し、ＧｌｃＡｃはＮ−アセチルグルコサミンを表し、Ｃ
ｅｒはセラミドを表し、ここで、上記少なくとも２個のフコシル残基は、α１→
４結合を介してＧｌｃＮＡｃに連結し、および／またはα１→２結合を介して末
端Ｇａｌ残基に連結し、そして上記１個以上のシアリル残基は、α２→３結合を
介して末端Ｇａｌ残基に連結し、および／またはα２→６結合を介して末端付近
の１個以上のＧｌｃＮＡｃ残基に連結する。
【０００９】
さらなる局面において、本発明は、以下：
【００１０】
【化８】
【００１１】
の式を有する上記の単離された化合物を提供し、
ここで、Ｆｕｃはフコースを表し、ＮｅｕＡｃはＮ−アセチルノイラミン酸を
表す。
【００１２】
別の局面において、本発明は、以下：
【００１３】
【化９】
【００１４】
の式を有する最初に記載された化合物を提供し、
ここで、Ｆｕｃはフコースを表し、ＮｅｕＡｃはＮ−アセチルノイラミン酸を
表す。
【００１５】
別の局面において、本発明は、以下：
【００１６】
【化１０】
【００１７】
の式を有する最初に記載された化合物を提供し、
ここで、Ｆｕｃはフコースを表し、ＮｅｕＡｃはＮ−アセチルノイラミン酸を
表す。
【００１８】
なおさらなる実施形態において、本発明は、以下：
【００１９】
【化１１】
【００２０】
の式を有する単離された化合物を提供する。
【００２１】
なおさらなる局面において、本発明は、以下：
【００２２】
【化１２】
【００２３】
の式を有するエピトープを含む単離された化合物を提供する。
【００２４】
なお他の局面において、本発明の化合物のいずれかは、ポリクローナル抗体ま
たはモノクローナル抗体の産生のための免疫原として使用され得る。
【００２５】
本発明の別の局面において、癌をスクリーニングするための方法が提供される
。本方法は、（ａ）温血動物から生物学的サンプルを単離する工程；および（ｂ
）化合物の存在または量についてサンプルを試験する工程を包含する。
【００２６】
（発明の詳細な説明）
本発明は、概して癌の検出に関する化合物および方法に関する。より具体的に
は、本発明の開示は、ラクト系列の１型鎖が癌組織における拡張された形態で生
じることを示す。
【００２７】
上で示されるように、１型ラクトサミン鎖（Ｇａｌβ１→３ＧｌｃＮＡｃ）は
、正常な細胞および組織において豊富であることが公知である。拡張２型鎖（す
なわち、Ｇａｌβ１→４ＧｌｃＮＡｃコア構造が繰り返される）を有するポリラ
クトサミン抗原が検出されたが、拡張１型鎖を有するポリラクトサミン抗原は検
出されなかった。従って、ラクト系列１型鎖は、伝統的に拡張形態で生じないと
考えられてきた。
【００２８】
本発明において開示されるように、ラクト系列Ｉ型鎖の拡張形態（すなわち、
Ｇａｌβ１→３ＧｌｃＮＡβ１→［３Ｇａｌβ１→３ＧｌｃＮＡｃβ→］ｎ３Ｇ
ａｌβ１→Ｒ、シアリル残基および／またはフコシル残基を有しても有しなくて
もよい）は癌組織内に存在する。２つの代表的な拡張形態のラクト系列１型鎖は
、（腫瘍細胞から抽出された）糖脂質画分を分取カラムおよび薄層クロマトグラ
フィーに供することによって単離された。
【００２９】
ゆっくりと移動するシアル酸−Ｌｅｗｉｓａ（ｓＬｅａ）活性スフィンゴ糖脂
質（ＧＳＬ）を、結腸腺癌細胞系統Ｃｏｌｏ２０５のモノシアリルガングリオシ
ド画分から精製して均質にした。この化合物を、２種の異なる溶媒系でＨＰＬＣ
および分取ＨＰＴＬＣによって精製し、α−ｓＬｅαモノクローナル抗体（ＭＡ
ｂ）ＮＫＨ−１を使用するＴＬＣ免疫染色によって強く染色した。穏やかな酸加
水分解（１％酢酸、１００℃で１時間）により、二量体−Ｌｅα標準ＧＳＬと共
に移動し、α−二量体ＬｅαＭＡｂ ＳＴ−４２１によって強く染色された、よ
り早く移動する成分を得た。この構造は、１Ｈ−ＮＭＲ分光法によって、シアリ
ル−二量体Ｌｅα（以下の構造を参照のこと）であると確認された。
【００３０】
【化１３】
【００３１】
。
【００３２】
上述した特定の糖脂質に加え、Ｌｅａ−ＬｅａエピトープおよびＬｅｂ−Ｌｅ
ａエピトープは、追加の［３Ｇａｌβ１→３ＧｌｃＮＡｃβｌ→］ｎ単位を有す
る拡張１型として提供され得る。さらに、Ｌｅａ−ＬｅａエピトープおよびＬｅ
ｂ−Ｌｅａエピトープは、糖タンパク質（例えば、高分子量ムチン様血清糖タン
パク質）によって運搬され得る。
【００３３】
本明細書中に提供される教示によれば、他の拡張形態のラクト系列１鎖化合物
が生物学的出発物質（例えば、癌組織）から単離され得るか、または構造的同定
を伴って化学的に（および／または酵素的に）合成され得ることが当業者に明ら
かである。簡単に述べれば、脂質またはタンパク質のいずれかに結合した炭水化
物の構造は、分解、質量分析法（電子直接試料導入（ＥＩ））および高速原子衝
撃（ＦＡＢ）を含む）、およびメチル化分析（以下に記載される技術、例えば、
Ｎｕｄｅｌｍａｎら．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６１：５４８７−５４９５
，１９８６）に基づいて、決定され得る。分解分析は、化学的に、および／また
は酵素的に（例えば、グリコシダーゼによって）達成され得る。分解分析によっ
て示唆される糖質配列は、メチル化分析（例えば、Ｈａｋｏｍｏｒｉ，Ｊ．Ｂｉ
ｏｃｈｅｍ．５５：２０５−２０８，１９６４）、続いて、過メチル化糖の化学
イオン化質量分析（例えば、Ｓｔｅｌｌｎｅｒら、Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．
Ｂｉｏｐｈｙｓ．１５５：４６４−４７２，１９７４；Ｌｅｖｅｒｙら，Ｍｅｔ
ｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１３８：１３−２５，１９８７）によって決定され得る。
代替的に、またはこれらの技術と組み合わせて、ＥＩ質量分析法は、過メチル化
グリカン上で、またはインタクトなグリカンの適切な分解後に実施され得る（例
えば、Ｋａｎｎａｇｉら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５９：８４４４−８４５
１，１９８４；Ｎｕｄｅｌｍａｎら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６３：１３９
４２−１３９５１，１９８８）。糖質配列の均質性は、種々の化学的および物理
的基準（インタクトなグリカン、またはメチル化したグリカンのプロトンＮＭＲ
分光法、およびＦＡＢ質量分析法）を含む）に基づいて実証され得る。一旦、糖
質構造が実証されれば、この糖質またはその誘導体あるいはその非糖質官能性等
価物は、当業者に周知の技術を使用して合成され得る。
【００３４】
本発明の化合物は、ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体（ＭＡｂ）
の産生のための免疫原として使用され得る。ポリクローナル抗体は、標準方法に
よって産生され得る。例えば、簡単に述べれば、ポリクローナル抗体は、本発明
の化合物による動物の免疫化およびその血清の後の回収によって産生され得る。
一般に、血清回収前に、初期免疫化後に１回以上の追加免疫を行うことが好まし
い。ＭＡＢは、一般に、ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ（Ｎａｔｕｒｅ２
５６：４９５−４９７，１９７５；Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６：５１１−
５１９，１９７６）の方法によって産生され得る。簡単に述べれば、本発明の化
合物で免疫化した動物のリンパ節および／または脾臓は、骨髄腫細胞と融合され
て、ハイブリッド細胞系統（「ハイブリドーマ」または「クローン」）を形成す
る。各ハイブリドーマは、単一の型の免疫グロブリンを分泌し、骨髄腫細胞と同
様に、無限な細胞分裂のための能力を有する。ハイブリドーマを介するＭＡｂの
産生の代替は、バクテリオファージおよびバクテリアを使用するＭＡｂ発現ライ
ブラリーの形成である（例えば、Ｓａｓｔｒｙら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａ
ｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８６：５７２８，１９８９；Ｈｕｓｅら．，Ｓｃｉｅｎｃｅ
２４６：１２７５，１９８９）。所望された特異性を示す抗体の選択は、当業者
に周知の種々の方法で実施され得る。
【００３５】
本発明の化合物の免疫原性を増加させるために、その化合物をキャリアと合わ
せることが所望され得る。適切なキャリアとして、不活化した細菌、カサガイヘ
モシアニン（ｋｅｙｈｏｌｅ ｌｉｍｐｅｔ ｈｅｍｏｃｙａｎｉｎ）、サイロ
グロブリン、ウシ血清アルブミンおよびそれらの誘導体が挙げられる。例えば、
ＧＳＬｓＬｅａ−ＬｅａまたはＬｅｂ−Ｌｅａの糖質残基の全てまたは一部は、
キャリアと合わせられ得る。本発明の化合物は、種々の手段（吸着および共有結
合を含む）によってキャリアと合わせられ得る。
【００３６】
免疫原としての本発明の化合物の使用の代表例は、Ｌｅｂ／Ｌｅａ抗原による
マウスの免疫化である。簡単に述べれば、Ｃｏｌｏ２０５細胞から単離したＬｅ
ｂ／Ｌｅａを、酸処理したＳａｌｍｏｎｅｌｌａ ｍｉｎｎｅｓｏｔａｅの懸濁
液と合わせ、尾静脈を介してＢＡＬＢ／ｃマウスに注射し、そしてこの注射を１
０日間の間隔で３回繰り返した。最終注射後、免疫化したマウスの脾細胞を採取
し、骨髄腫細胞と融合した。免疫原と優先的な反応性を示したハイブリドーマ、
ＩＭＨ２を樹立し、ＡＴＣＣ（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ
Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，１０８０１ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｂｏｕｌｅｖａｒ
ｄ， Ｍａｎａｓｓａｓ， Ｖｉｒｇｉｎｉａ ２０１１０ ＵＳＡ）にＡＴＣ
Ｃ番号ＨＢ１１０２６として寄託した。このハイブリドーマは、ＩｇＧ３アイソ
タイプを有するＭＡｂ １ＭＨ２を産生する。
【００３７】
Ｌｅａ−Ｌｅａ抗原および／またはＬｅｂ−Ｌｅｂ抗原のような拡張形態のＩ
型鎖抗原を検出するための方法は、癌についてスクリーンするために使用され得
る。例えば、ＧＳＬ Ｌｅｂ−ＬｅａおよびＧＳＬ Ｌｅａ−Ｌｅａを、種々の
腫瘍サンプルから調製した中性糖脂質画分のそれぞれＭＡｂ １ＭＨ２およびＭ
Ａｂ ＮＣＣ−ＳＴ−４２１で免疫染色するＴＬＣ（Ｗａｔａｎａｂｅら，Ｊｐ
ｎ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ（Ｇａｎｎ）７６：４３−５２，１９８５に従っ
て確立された）によって検出した。このようなサンプルとして、結腸癌、乳癌、
ホジキン病、胆嚢癌および胎児性横紋筋肉腫由来の組織が挙げられる。例えば、
ＧＳＬ Ｌｅａ−Ｌｅａは、脾臓、肝臓、腎臓、胎盤および肺由来の正常の組織
から、糖脂質画分内で検出されなかった。本明細書中に提供される教示によれば
、腫瘍関連拡張１型抗原を検出するための種々の手段（ＧＳＬ Ｌｅａ−Ｌｅａ
およびＬｅｂ−Ｌｅａのような腫瘍関連拡張Ｉ型抗原に対して特異的な結合パー
トナーの使用を含む）が本発明の方法内で使用され得ることは、当業者にとって
明らかである。例えば、Ｌｅａ−ＬｅａまたはＬｅｂ−Ｌｅａエピトープについ
て特異的な抗体は、上記のように産生され得、免疫複合体の存在は、免疫複合体
の形成を可能にするのに十分な条件下および時間で、このような抗体の生物学的
サンプルとの接触（例えば、インキュベーション）後、試験され得る。
【００３８】
上記の抗原とこの抗原に対して特異的な抗体との間で形成された免疫複合体の
存在の検出は、種々の公知の技術（例えば、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）お
よび酵素結合イムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ））によって達成され得る
。適切なイムノアッセイとして、Ｄａｖｉｄら（米国特許第４，３７６，１１０
号）の二重モノクローナル抗体サンドウィッチイムノアッセイ技術；モノクロー
ナル−ポリクローナル抗体サンドウィッチアッセイ（Ｗｉｄｅら、Ｋｉｒｋｈａ
ｍ ａｎｄ Ｈｕｎｔｅｒ編，Ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ Ｍｅｔｈｏ
ｄｓ Ｅ．ａｎｄ Ｓ．Ｌｉｖｉｎｇｓｔｏｎｅ，Ｅｄｉｎｂｕｒｇｈ，１９７
０）；Ｇｏｒｄｏｎら（米国特許第４，４５２，９０１号）の「ウエスタンブロ
ット」法；標識されたリガンドの免疫沈降法（Ｂｒｏｗｎら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃ
ｈｅｍ．２５５：４９８０−４９８３，１９８０）；例えば、Ｒａｉｎｅｓ ａ
ｎｄ Ｒｏｓｓ（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５７：５１５４−５１６０，１９
８２）によって記載されるような酵素結合イムノソルベントアッセイ；免疫細胞
学技術（蛍光色素の使用（Ｂｒｏｏｋｓら，Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ
．３９：４７７，１９８０）を含む）；および活性の中性化（Ｂｏｗｅｎ−Ｐｏ
ｐｅら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８１：２３９６−２
４００，１９８４）が挙げられる。上記のイムノアッセイに加えて、多数の他の
イムノアッセイ（米国特許第３，８１７，８２７号；同第３，８５０，７５２号
；同第３，９０１，６５４号；同第３，９３５，０７４号；同第３，９８４，５
３３号；同第３，９９６，３４５号；同第４，０３４，０７４号；および同第４
，０９８，８７６号に記載されるイムノアッセイを含む）が利用可能である。
【００３９】
検出の目的のために、抗体は標識されてもよいし、標識されなくてもよい。標
識されていない場合、抗体は凝集アッセイにおける使用を見出す。さらに、非標
識抗体は、免疫複合体と反応性である標識された分子と組み合わせて、あるいは
、免疫グロブリンに対して特異的な抗体のような、この化合物に対して指向され
た抗体と反応性である標識された抗体（二次抗体）と組み合わせて、使用され得
る。あるいは、この抗体は直接標識され得る。それらが標識される場合、レポー
ター基は、ラジオアイソトープ、蛍光色素、酵素、発光体（ｌｕｍｉｎｅｓｃｅ
ｒ）、または色素粒子を含み得る。これらの標識および他の標識は、当該分野に
おいて周知であり、例えば、以下の米国特許第３，７６６，１６２号；同第３，
７９１，９３２号；同第３，８１７，８３７号；同第３，９９６，３４５号；お
よび同第４，２３３，４０２号に記載される。
【００４０】
免疫複合体を検出するための１つの好ましい実施形態において、レポーター基
は、抗体に結合される。免疫複合体を検出する工程は、実質的に全ての非結合抗
体を除去する工程、および次いでこのレポーター基の存在を検出する工程を包含
する。非結合抗体は、この抗原に結合しなかった抗体である。
【００４１】
別の好ましい実施形態において、レポーター基は、この抗原に対して特異的な
抗体に結合し得る二次抗体に結合する。免疫複合体を検出する工程は、（ａ）実
質的に全ての非結合抗体（すなわち、この抗原に結合しなかった抗体）を除去す
る工程、（ｂ）二次抗体を加える工程、（ｃ）実質的に全ての結合していない二
次抗体を除去する工程、および、次いで（ｄ）このレポーター基の存在を検出す
る工程を包含する。例えば、抗原に対して特異的な抗体がマウス由来である場合
、二次抗体は抗マウス抗体である。
【００４２】
免疫複合体を検出するための第３の好ましい実施形態において、レポーター基
は、この免疫複合体に結合し得る分子に結合する。この検出する工程は、（ａ）
この分子を添加する工程、（ｂ）実質的に全ての非結合分子を除去する工程、お
よび、次いで、（ｃ）このレポーター基の存在を検出する工程を包含する。免疫
複合体に結合し得る分子の例は、プロテインＡである。
【００４３】
免疫複合体と反応性である標識された抗体、標識された第２の抗体または標識
された分子の使用の代替は、一般的には標識された抗原を使用するイムノアッセ
イである。このようなアッセイ（「間接的」または「競合的」）において、サン
プル中に存在する抗原は、この抗体について標識された抗原と競合する。
【００４４】
免疫複合体を検出するための種々の方法が本発明において使用され得ることは
、当業者にとって明らかである。この方法のいずれかにおける使用に適切なレポ
ーター基として、ラジオアイソトープ、蛍光色素、酵素、発光体、および色素粒
子が挙げられる。さらに、本発明の腫瘍関連拡張１型抗原に対して特異的な結合
パートナー（抗体を除く）は、このような抗原について試験するために使用され
得、このような結合パートナーと抗原との間で形成された複合体は、免疫複合体
について上に記載された技術に類似の技術によって検出され得る。
【００４５】
以下の実施例は、例示のために提供され、限定するためではない。
【００４６】
（実施例）
（実施例１）
（腫瘍組織および正常組織から調製された中性糖脂質のＭＡＢ ＮＣＣ−ＳＴ
−４２１を用いるＨＰＴＬＣ免疫染色およびイムノアッセイ）
（Ａ．モノクローナル抗体およびイムノアッセイ）
ＭＡｂ ＳＴ−４２１を、以前に記載されたとおりに樹立した（Ｗａｔａｎａ
ｂｅら，Ｊｐｎ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．（Ｇａｎｎ）７６：４３−５２，
１９８５）。ＭＡｂ ＭＮＨ−１（１型Ｎ−アセチルラクトサミン鎖（Ｇａｌβ
１→３ＧｌｃＮＡｃβ１→Ｒ）を規定する）を、本発明者らの研究室で調製した
；ＭＡｂ １Ｂ２（２型Ｎ−アセチルラクトサミン鎖（Ｇａｌβ１→４ＧｌｃＮ
Ａｃβ１→Ｒ）を規定する）を、以前に記載されるとおりに樹立した（Ｙｏｕｎ
ｇら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５６：１０９６７−１０９７２，１９８１）
。抗ＬｅａＭＡｂを、Ｃｈｅｍｂｉｏｍｅｄ Ｌｔｄ．（Ｅｄｍｏｎｔｏｎ，Ａ
ｌｂｅｒｔａ，Ｃａｎａｄａ）から得た。抗ＬｅｙＭＡｂ ＡＨ６を、以前に記
載されるように樹立し（Ａｂｅら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５８：１１７９
３−１１７９７，１９８３）、そしてこれは、Ｌｅｂとの交差反応性を示さなか
った。抗ＬｅｂＭＡｂを、Ｃｈｅｍｂｉｏｍｅｄ Ｌｔｄ．（Ｅｄｍｏｎｔｏｎ
，Ａｌｂｅｒｔａ，Ｃａｎａｄａ）から購入し、そしてこれは、１型Ｈ鎖との交
差反応性を示した。別の抗ＬｅｂＭＡｂを、Ｍｏｎｏｃａｒｂ（Ｌｕｎｄ，Ｓｗ
ｅｄｅｎ）から購入し、そしてこれは、Ｌｅｂ、１型Ｈ鎖、およびＬｅｙとの反
応性を示した。ＨＰＴＬＣ免疫染色を、Ｗｈａｔｍａｎ ＨＰＴＬＣプレート（
ＨＰ−ＫＦ）を使用して、元々Ｍａｇｎａｎｉら（Ｍａｇｎａｎｉら，Ａｎａｌ
．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１０９：３９９−４０２，１９８０）により記載された方法
の改変版（Ｋａｎｎａｇｉら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５７：４４３８−４
４４２，１９８２；Ｋａｎｎａｇｉら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５７：１４
８６５−１４８７４，１９８２）により実施した。
【００４７】
（Ｂ．糖脂質調製）
使用された全ての糖脂質サンプルを、単離するかまたは酵素的に合成した。Ｖ
Ｉ３ＮｅｕＡｃｎＬｃ６、ＩＶ３ＮｅｕＡｃＩＩＩ４ＦｕｃＬｃ４、ＶＩ２Ｆｕ
ｃｎＬｃ６、およびＩＶ２ＦｕｃＬｃ４を、それぞれヒト胎盤、肝臓腺癌、ヒト
Ｏ型赤血球、およびブタ腸から、ＩＨＷ（５５：２５：２０）での抽出、次いで
Ｆｏｌｃｈ分配、ＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｄｅｘクロマトグラフィー、およびＩａ
ｔｒｏｂｅａｄｓ ６ＲＳ−８０１０カラムでのＨＰＴＬＣの後、単離した（Ｍ
ａｇｎａｎｉら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５７：１４３６５−１４３６９，
１９８２；Ｗａｔａｎａｂｅら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５４：８２２３−
８２２９，１９７９；Ｈａｋｏｍｏｒｉら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．９８：３１−
３８，１９６７；Ｓｔｅｌｌｎｅｒら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １２：６５
６−６６１，１９７３）。ｎＬｃ６およびＩＩＩ４ＦｕｃＬｃ４を、１００℃で
１時間１％酢酸中でサンプルを加熱することによる、それぞれＶＩ３ＮｅｕＡｃ
ｎＬｃ６およびＩＶ３ＮｅｕＡｃＩＩＩ４ＦｕｃＬｃ４の脱シアリルにより調製
した。ＩＶ３ＧｌｃＮＡｃｎＬｃ４、ＩＶ３Ｇａｌβ１→３−ＧｌｃＮＡｃｎＬ
ｃ４、ＩＶ３Ｇａｌβ１→３［Ｆｕｃ１→４］ＧｌｃＮＡｃｎＬｃ４およびＩＶ
３Ｇａｌβ１→３［Ｆｕｃ１→４］ＧｌｃＮＡｃＩＩＩ３ＦｕｃｎＬｃ４（Ｌｅ
ａ−Ｌｅｘ）を、酵素的合成により調製した。ＩＶ３Ｇａｌβ１→３ＧｌｃＮＡ
ｃＩＩＩ３ＦｕｃｎＬｃ４を、ＩＶ３Ｇａｌβ１→３［Ｆｕｃ１→４］ＧｌｃＮ
ＡｃＩＩＩ３ＦｕｃｎＬｃ４のα−フコシダーゼ処理により調製した；すなわち
、１００μｇの糖脂質を、０．０５単位のウシ腎臓α−Ｌ−フコシダーゼ（Ｓｉ
ｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏ．）を含む０．２
Ｍのクエン酸緩衝液（ｐＨ４．５）と共に２時間３７℃でインキュベートした。
ＩＶ２ＩＩＩ４Ｆｕｃ２Ｌｃ４、Ｖ３ＩＩＩ３Ｆｕｃ２ｎＬｃ６、およびＶＩ２
Ｖ３Ｆｕｃ２ｎＬｃ６を、Ｃｏｌｏ２Ｏ５由来のα１→３／４フコシルトランス
フェラーゼを使用して、基質としてＩＶ２ＦｕｃＬｃ４、ｎＬｃ６、およびＶＩ
２ＦｕｃｎＬｃ６（それぞれ）のα１→３フコシル化により生合成的に調製した
。α１→３／４フコシルトランスフェラーゼを、４℃にて２容量の５０ｍＭ Ｈ
ｅｐｅｓ緩衝液（ｐＨ ７．０）、０．５Ｍスクロース、１ｍＭ ＥＤＴＡ、お
よび１％Ｔｒｉｔｏｎ ＣＦ−５４中、Ｐｏｔｔｅｒ−Ｅｌｖｅｈｊｅｍホモジ
ナイザーでＣｏｌｏ２Ｏ５細胞から可溶化した。このホモジネートを、１００，
０００×ｇで１時間遠心分離し、そしてその上清を透析により細胞の元の容積ま
で濃縮した。この酵素調製物を−８０℃で必要になるまで保存した。
【００４８】
酵素的α１→３／４フコシル化を、１ｍｌの全容積中に１ｍｇのスフィンゴ糖
脂質（ＧＳＬ）基質、１ｍｇのデオキシタウロコール酸塩、１０μｍｏｌのＭｎ
Ｃｌ２、２５μｍｏｌのＨｅｐｅｓ緩衝液（ｐＨ７．０）、５μｍｏｌのＣＤＰ
−コリン、６μｍｏｌのＧＤＰ−フコース、および５００μｌの酵素調製物を含
む反応混合物中で行った。この反応混合物を、３７℃で１６時間インキュベート
し、次いで凍結乾燥し、イソプロパノール−ヘキサン−水（ＩＨＷ）（５５：２
５：２０）で超音波処理により抽出し、そして遠心分離した。その上清を、Ｉａ
ｔｒｏｂｅａｄｓ６ＲＳ−８０１０カラムで５５：４０：５〜５５：２５：２０
のＩＨＷ勾配溶出を使用して２００分間にわたってＨＰＬＣにかけた。２ｍｌず
つのフラクションを収集し、そして最終生成物を含むチューブを、クロロホルム
−メタノール−水５０：４０：１０中のＨＰＴＬＣ移動度に従ってプールした。
ＧＳＬバンドを、オルシノールスプレー試薬により可視化した。
【００４９】
規定された構造を有する各ＧＳＬを、特定のＭＡｂ（単数または複数）との反
応性により特徴付けた（すなわち、抗ＬｅｂＭＡｂと反応するが抗ＬｅｙＭＡｂ
ＡＨ６とは反応しないＬｅｂ／Ｌｅａ抗原；ＡＨ６とは反応するが抗ＬｅｂＭ
Ａｂとも抗ＬｅｘＭＡｂとも反応しないＬｅｙ／Ｌｅｘ；抗ＬｅａＭＡｂおよび
ＭＡｂ ＳＴ−４２１と反応するＬｅａ／ＬｅａおよびＬｅａ／Ｌｅｘ）。
【００５０】
（Ｃ．ＴＬＣ免疫染色）
種々の腫瘍サンプルから調製された中性糖脂質フラクションのＴＬＣ免疫染色
は、−Ｌｅａ−活性セラミドペンタサッカリドよりも遅く移動するポジティブな
バンドの存在、および抗ＬｅａＭＡｂとの交差反応を示した。このバンドは、Ｍ
Ａｂ ＮＣＣ−ＳＴ−４２１により強く染色され、そして以前に試験された腫瘍
の大部分に見られた。結腸癌、乳癌、ホジキン病、胆嚢癌、および胎児性横紋筋
肉腫由来の例。
【００５１】
（実施例２）
（ダイマーＬｅａ抗原およびＬｅｂ−Ｌｅａ抗原の単離）
（Ａ．腫瘍組織の調製）
Ｃｏｌｏ２０５細胞（ＡＴＣＣ）（Ｓｅｍｐｌｅら，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．
３８：１３４５−１３５５，１９７８）を、１０％ウシ胎児血清を含有するＲＰ
ＭＩ１６４０培地中で増殖した。細胞を採取し、そしておよそ７日間毎に継代し
た。採取された細胞をトリプシン処理し、遠心分離し、リン酸緩衝化生理食塩水
（ｐＨ７．４）で２回洗浄し、そして血球計を使用して計数した。４×１０６個
の細胞を、６匹の無胸腺症（ヌード）マウスの各々に皮下注射した。腫瘍（それ
ぞれ約２ｍｌ）を、２週間後に切除し、そして必要になるまで−８０℃で凍結保
存した。
【００５２】
（Ｂ．Ｃｏｌｏ２０５腫瘍由来の移動遅延性Ｌｅａ活性成分（ダイマーＬｅａ
）の単離）
約２００ｇの腫瘍を、イソプロパノール−ヘキサン−水（ＩＨＷ）（５５：２
５：２０）で抽出し、次いでＦｏｌｃｈ分配、ＤＥＡＥ−ｓｅｐｈａｄｅｘクロ
マトグラフィー、そしてＩａｔｒｏｂｅａｄｓ ６ＲＳ−８０１０カラムのＨＰ
ＬＣにかけた。上相中性フラクションの勾配溶出を、５５：４０：５〜５５：２
５：２０のＩＨＷで２００分間にわたって行った。２ｍｌずつのフラクションを
収集し、そしてクロロホルム−メタノール−水（５０：４０：１０）中のＨＰＴ
ＬＣ移動度に従ってプールした。遅延移動性Ｌｅａ活性フラクション（ＴＬＣ免
疫染色により示される）を、Ｍｅｒｃｋ ＨＰＴＬＣプレート（Ｓｉｌｉｃａ
Ｇｅｌ ６０，Ｍｅｒｃｋ，Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）の分取ＴＬ
Ｃによりさらに精製し、そして構造特徴付けに使用した。
【００５３】
（Ｃ．Ｌｅｂ−Ｌｅａ抗原の単離）
ダイマーＬｅａ抗原の直ぐ下に移動するポジティブなバンド（実施例１に従う
ＭＡｂ ＮＣＣ−ＳＴ−４２１を用いた免疫染色による）を、上記のＢ節に記載
される方法を使用して精製する。
【００５４】
（実施例３）
（ダイマーＬｅａ抗原およびＬｅｂ−Ｌｅａ抗原の特徴付け）
（Ａ．酵素分解）
１ｍｇのダイマーＬｅａの酵素分解を、０．５単位のα−フコシダーゼ（ウシ
腎臓）、０．５単位のβ−ガラクトシダーゼ（ナタマメ）、および０．５単位の
β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ（ウシ精巣）（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃ
ａｌ Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏ．）を用いて逐次的に加水分解により行
った。全ての反応を０．２Ｍクエン酸ナトリウム（ｐＨ４．５）中４時間３７℃
で振盪しながら水浴中で行った。各分解産物の精製を、分取ＨＰＴＬＣにより行
った。
【００５５】
（Ｂ．ＩＭＨ２のインビトロ細胞傷害性）
（１．細胞株）
Ｃｏｌｏ２Ｏ５を、最初にＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃ
ｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）から入手し、そして１０％のウシ胎児血清、ｍ
ＭのＬ−グルタミン、１００ＩＵ／ｍｌのペニシリン、および１０μｇ／ｍｌの
ストレプトマイシンを補充したＲＰＭＩ−１６４０培地で培養した。ヒト類表皮
癌Ａ４３１細胞株（ＭａｃＬｅｏｄら，Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．１２７
：１７５−１８２，１９８６）は、元々Ｃａｒｏｌ ＭａｃＬｅｏｄ博士（Ｇｉ
ｌｄｒｅｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｆａｃｉｌｉｔｙ，ＵＣＳＤ Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ
Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）から提供された。この細胞株
は、ＥＧＦレセプター上でＬｅａ、Ｌｅｂ、Ｌｅｘ、ＬｅｙおよびＡＬｅｂを発
現する（Ｇｏｏｉら，Ｂｉｏｓｃｉ．Ｒｅｐｏｒｔｓ ５：８３−９４，１９８
５）。Ａ４３１細胞を、５％ウシ胎児血清、１ｍＭのグルタミン、１１０ｍｇ／
ｌのピルビン酸ナトリウム、１００ＩＵ／ｍｌのペニシリン、および１０μｇ／
ｍｌのストレプトマイシンを補充したＤｕｌｂｅｃｃｏ改変Ｅａｇｌｅ培地（Ｉ
ｒｖｉｎｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｓａｎｔａ Ａｎａ，ＣＡ）中で培養した
。細胞（約５×１０５／ｍｌ）を、接種し、そしてＥＤＴＡ処理次いでＣａ２＋
およびＭｇ２＋を含有するＰＢＳでの洗浄による集密度で採取した。これらをイ
ンビトロ細胞傷害性アッセイにおける標的細胞として使用するか、または５×１
０６個の細胞の皮下接種によるムードマウスにおける腫瘍形成を試験するために
使用した。ヒト赤白血病Ｋ５６２細胞（Ｌｏｚｚｉｏら；Ｂｌｏｏｄ ４５：３
２１−３３４，１９７５）を、アッセイ系で使用されるリンパ球のナチュラルキ
ラー（ＮＫ）活性についてのコントロールとして使用した。
【００５６】
（２．抗体依存性細胞の細胞傷害性（ＡＤＣＣ）および補体依存性細胞傷害性
（ＣＤＣ））
ＡＤＣＣアッセイのために、ヒト末梢血リンパ球（ＨＰＢＬ）（エフェクター
細胞として使用される）を、健康な志願ドナー由来の血液のバフィーコートフラ
クションから得た。簡単には、単核細胞を、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ勾配
溶液による２０００ｒｐｍで２０分間の遠心分離により分離した（Ｍｉｓｈｅｌ
ｌら，Ｍｉｓｈｅｌｌ，Ｂ．ＢおよびＳｈｉｉｇｉ，Ｓ．Ｍ．（編），Ｓｅｌｅ
ｃｔｅｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，
ｐｐ．３−２７，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ＆Ｃｏ．，Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃ
ｏ，ＣＡ，１９８０）。マウス脾臓細胞およびマウス腹膜マクロファージ（エフ
ェクター細胞）を、以下のようないくつかの改変をしてＭｉｓｈｅｌｌらにより
以前に記載されたように調製した。標的細胞（５×１０６個）を、１００μｌの
５１Ｃｒと共に９０分間３７℃でインキュベートすることにより標識した。洗浄
（３回）およびインキュベーション（３７℃で１時間）の後、細胞（１×１０６
／ｍｌ）を、２５ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液および３％のウシ血清アルブミンを補
充したＲＰＭＩ−１６４０中に懸濁した。２０μｌの標識した細胞、１００μｌ
のＩＭＨ２またはＳＴ−４２１、および１００μｌのエフェクター細胞懸濁液を
ミクロタイターＵ底プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ，ＮＹ）中に混合した。非特異的
マウスＩｇ（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）をネガティブコントロール
として使用した。４時間のインキュベーションの後、これらのプレートを、遠心
分離機に組み立てられた懸垂プレートホルダーを用いて遠心分離し（５００×ｇ
、２分間）、そして各ウェル中の１００μｌの上清における放射能をγ線計数器
で測定した。各実験群を３回試験した。特異的溶解％を、式（［Ａ−Ｂ］×１０
０）／Ｃ（ここで、Ａ＝溶解した実験細胞中のｃｐｍ；Ｂ＝未溶解の標的細胞中
のｃｐｍ；Ｃ＝全標的細胞中のｃｐｍ）に従って計算した。自発性放出は、放出
可能な最大の標識放射能の１５％を超えなかった。
【００５７】
ＣＤＣに関して、５１Ｃｒ放出アッセイを、エフェクター細胞の代わりに補体
源として１００μｌの希釈ヒト血清を加えたことを除いて、ＡＤＣＣと同様な手
順を使用して行った。この血清を５６℃で３０分間不活化し、そしてコントロー
ルとして使用した。特異的溶解％を、上記のように計算した。
【００５８】
Ｃｏｌｏ２Ｏ５細胞は、拡張１型Ｌｅａ／Ｌｅａ鎖抗原およびＬｅｂ／Ｌｅａ
抗原を発現すると特徴付けられていたので（これらは、それぞれＭＡｂ ＳＴ−
４２１およびＩＭＨ２と強く反応する）、ＩＭＨ２のＣｏｌｏ２Ｏ５に対する細
胞傷害性効果を評価し、ＳＴ−４２１の細胞傷害性効果と比較した。両方のＭＡ
ｂは、Ｃｏｌｏ２０Ｓ細胞の顕著なＡＤＣＣ殺傷を示した。この殺傷は、エフェ
クター細胞：標的細胞（Ｅ：Ｔ）比およびＭＡｂ濃度と相関があった。この細胞
傷害性効果は、１００：１〜２００：１のＥ：Ｔ比、および３５〜７０μｇ／ｍ
ｌのＭＡｂ濃度で最大であった。コントロールマウスＩｇＧおよび他の非特異的
ＭＡｂは、Ｅ：Ｔ比またはＭＡｂ濃度にかかわらず細胞傷害性効果を示さなかっ
た。同じ細胞傷害性試験をマウス脾臓細胞で行った場合、対応する値は、わずか
７％溶解および１７％溶解（Ｅ：Ｔ比２００：１、Ｍａｂ濃度３０μｇ／ｍｌ）
であった。ＭＡｂは、Ａ４３１細胞に対して弱い細胞傷害性効果を示した（表）
。Ｃｏｌｏ２０５細胞、Ａ４３１細胞、およびＫ５６２細胞の最大ＩＭＨ２依存
性溶解の比較を表に示す。高い溶解値（例えば、それぞれＩＭＨ２およびＳＴ−
４２１を用いたＣｏｌｏ２０５細胞の６５％溶解および９４％溶解）は、ＨＰＢ
Ｌの存在下でのみ顕著であり；ＳＴ−４２１で以前に観察されたように、値は、
マウス脾臓細胞では非常に低かった（Ｗａｔａｎａｂｅら，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅ
ｓ．５１：２１９９−２２０４，１９９１）。ＩＭＨ２およびＳＴ−４２１によ
り媒介されるＣＤＣは、同様に補体濃度およびＭＡｂ濃度と相関した。
（表 ＭＡｂ ＳＴ−４２１およびＩＭＨ２による、Ｃｏｌｏ２０５細胞、Ａ４
３１細胞、およびＫ５６２細胞に対するＭＡｂ依存性細胞傷害性効果）
【００５９】
【表１】
【００６０】
ａ．ＩＭＨ２（３５μｇ／ｍｌ）およびＳＴ−４２１（×１００希釈腹水）を用
いて、１００：１のＥ：Ｔ（エフェクター細胞：標的細胞）比における溶解パー
セント。
ｂ．フローサイトメトリーにより決定。＋、ポジティブ；±、弱いポジティブ；
−、ネガティブ。
ｃ．Ｋ５６２細胞の高い細胞傷害性効果はまた、ＭＡｂの非存在下で観察され、
そしてこれは、ナチュラルキラー細胞活性を反映すると考えられる。
【００６１】
（Ｃ．インビボ腫瘍抑制）
インビボ実験に使用されるＣｏｌｏ２０５細胞およびＡ４３１細胞を、インビ
トロで増殖し、培地で２回洗浄し、そしてＰＢＳ中で所望の細胞密度で再形成し
た。細胞（５×１０６／１００μｌ）を、５〜７週齢の無胸腺症ＢＡＬＢ／ｃマ
ウスの背部に皮下注射し、そしてＭＡｂの腹腔内投与を注射の直後に開始した。
ＩｇＧの対応する濃度（１．１〜１．２ｎｇ／ｍｌ）を有する、腹水液中の精製
されたＩＭＨ２（１．１ｍｇ／ｍｌ）またはＳＴ−４２１を、０．２ｍｌ／動物
の投薬量で、２週間にわたって１回／日で腹腔内注入した。腫瘍の幅および長さ
を、同一の観察者により３回／週で測定した。腫瘍重量を、（幅２×長さ）／２
として見積もった。コントロール動物に、ＢＡＬＢ／ｃマウスにおけるマウス骨
髄腫細胞株ＮＳ１により作製された腹水タンパク質を投与した。１群あたり７匹
のマウスを、各実験に使用し、そして実験を２回行った。２回の実験に基づく平
均腫瘍重量値をプロットした。
【００６２】
ＭＡｂ ＩＭＨ２およびＳＴ−４２１の両方は、ヌードマウスにおけるＣｏｌ
ｏ２０５腫瘍増殖の顕著な阻害を示した。対照的に、両方のＭＡｂは、Ａ４３１
腫瘍増殖に対して最小の阻害効果を示した。従って、規定された抗原の高い発現
は、インビボでの腫瘍増殖の抗体依存性阻害に対する感受性に必須であると思わ
れる。
【００６３】
（Ｄ．種々の腫瘍組織および正常組織とのＩＭＨ２の反応性）
種々の腫瘍組織および隣接正常組織を、ホルマリンで固定しそしてパラフィン
に包埋した外科標本から得た。さらに、脳、胸腺、肺、肝臓、胃、結腸、腎臓、
副腎、腺、脾臓、膵臓、子宮（子宮内膜を含む）、および皮膚由来の正常組織お
よびいくつかの腫瘍組織を、事故犠牲者からの新しい剖検から得た。外科標本お
よび剖検標本の両方は、Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ，Ｓ
ｗｅｄｉｓｈ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｅｎｔｅｒ，Ｓｅａｔｔｌｅ，ＷＡおよびＴ
ｈｅ Ｂｉｏｍｅｍｂｒａｎｅ ＩｎｓｔｉｔｕｔｅのＭｓ．Ｄｅｂｂｉｅ Ｂ
ｅｎｎｅｔｔからの無料提供であった。サンプルを薄片に切り（厚さ３μＭ）、
キシレン（ｚｙｌｅｎｅ）でパラフィンを除去し、エタノールで脱水し、一次Ｍ
Ａｂで処理して、ビオチン化二次ＭＡｂおよびペルオキシダーゼ結合体化アビジ
ンで続けて処理し、そして３’，３’−ジアミノベンジジンで染色した。内因性
ペルオキシダーゼ活性を、切片を０．３％Ｈ２Ｏ２で２０分間処理することによ
りブロックした。いくつかの切片をネガティブコントロールとしてマウスＩｇＧ
と共にインキュベートした。ビオチン化ヤギ抗マウスＩｇＭ、アビジン、および
ビオチンは、Ｖｅｃｔａｓｔａｉｎ（Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ）由来であっ
た。
【００６４】
Ｍａｂ ＩＭＨ２は、結腸、直腸、肝臓、膵臓、および子宮内膜由来の腫瘍と
、強くかつ高い発生率で反応した（表Ｉ）。対照的に、遠位結腸および直腸の正
常粘膜（陰窩領域および杯細胞を含む）とは反応性を示さなかった。肺腺癌とは
反応したが、大細胞癌または小細胞癌とは反応しなかった。５件の扁平上皮癌の
うち１つは、強いポジティブの反応性を示した。ＭＡｂ ＩＭＨ２は、正常な脳
、肺、脾臓、皮膚の組織、または顆粒球を含む種々の血球と反応しなかった。
【００６５】
強い染色が観察された正常組織の場所は、以下の通りである：胸腺のハッサル
体および上皮細網細胞（胸腺細胞はネガティブである）；胃粘膜の粘膜上皮およ
び分泌腺（固有層、漿膜、および筋層はネガティブであった）；副腎の髄質およ
び皮質の両方。中程度から弱いポジティブ染色を有する正常組織の場所は、以下
である：腎臓の近位回および遠位回の上皮細胞（その他の部分はネガティブであ
った）；膵臓のランゲルハンス島の細胞（膵臓のその他の部分はネガティブであ
った）；盲管粘膜；尿路上皮。非常に弱い染色が肝細胞に関して観察された（肝
臓のその他の部分、小葉間結合組織、中心静脈、胆管、およびクップファー細胞
は、ネガティブであた）。これらの結果を表Ｉに要約する。
表Ｉ．ＭＡｂ ＩＭＨ２による正常組織および癌の免疫組織学的染色
【００６６】
【表２】
【００６７】
（Ｅ．既知のルイス状態および分泌状態を有する患者由来の結腸および膀胱の
正常組織および悪性組織とのＩＭＨ２の反応性）
ＬｅｂおよびＬｅｙ決定基の発現は、個体の分泌状態と相関し（Ｓａｋａｍｏ
ｔｏら，Ｍｏｌｅｃ．Ｉｍｍｕｎ．２１：１０９３−１０９８，１９８４；Ｏｅ
ｒｎｔｏｆｔら，Ｊ．Ｕｒｏｌ．１３８：１７１−１７６，１９８７）、他方、
いくつかの腫瘍におけるルイス抗原の発現は、宿主のルイス状態と関連しない（
Ｏｅｒｎｔｏｆｔら、Ｌａｂ．Ｉｎｖｅｓｔ．５８：５７６−５８３，１９８８
；Ｏｅｒｎｔｏｆｔら，Ｂｌｏｏｄ ７７：１３８９−１３９６，１９９１）。
従って、既知のルイス状態および分泌状態を有する患者由来の結腸および膀胱の
正常組織および悪性組織とのＭａｂ ＩＭＨ２の反応性を調べた。結果を表ＩＩ
および表ＩＩＩに要約する。ＩＭＨ２は、直腸腫瘍と反応性であるが、正常直腸
組織とは反応性ではなく、そしてこの反応性は、分泌状態とは関係がない。逆に
、ＩＭＨ２は、正常盲端とは反応性であったが、調べられた単一の盲端腫瘍サン
プルとはそれほど反応性ではなかった。これらの結果は、結腸正常組織および悪
性組織におけるＩＭＨ２エピトープ発現の傾向は、ＡＢＨ抗原の十分に確立され
ている発現パターンと類似していることを示唆する。真性ルイスネガティブ（Ｌ
ｅａ−ｂ−）の個体（Ｏｅｒｎｔｏｆｔら，Ｌａｂ．Ｉｎｖｅｓｔ．５８：５７
６−５８３，１９８８）は、結腸正常組織および悪性組織の両方においてＩＭＨ
２エピトープを発現した（表ＩＩおよびＩＩＩ）。
【００６８】
ＩＭＨ２エピトープは、正常尿路上皮において発現されるが、その発現は、膀
胱腫瘍の程度の変化に対して減少する。これらは、腹水の段階との相関と思われ
る。すなわち、ＩＭＨ２エピトープ発現は、高度に侵襲性の腫瘍において最も低
い。また、この傾向は、膀胱正常組織および悪性組織におけるＡＢＨ抗原の発現
の傾向と類似する。しかし、結腸組織と対照的に、血液型群Ａの個体由来の膀胱
組織におけるＩＭＨ２エピトープ発現は、分泌状態と相関する。真性ルイスネガ
ティブ（Ｌｅａ−ｂ−）の個体は、膀胱正常組織および悪性組織の両方において
ＩＭＨ２エピトープを発現した。
表ＩＩ．結腸正常組織および悪性組織のＭＡｂ ＩＭＨ２による免疫組織学的染
色：宿主ルイス状態との関係。
【００６９】
【表３】
【００７０】
数字は、試験された合計標本で割ったポジティブ標本を示す。ＮＤ＝決定されな
い。Ｌｅａ−ｂ−個体（真性および非真性）について、表現型状態を、唾液にお
けるα１→４フコシルトランスフェラーゼ活性、ならびに抗ＬｅａＭＡｂおよび
抗ＬｅｂＭＡｂとの赤血球反応性により決定した。表現型の定義は、Ｈｏｌｍｅ
ｓら，Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．２７４：１４−２５，１９
８９、およびＯｅｒｎｔｏｆｔら，Ｌａｂ．Ｉｎｖｅｓｔ．５８：５７６−５８
３，１９８８に見出され得る。
ａ非分泌者
表ＩＩＩ．膀胱正常組織および悪性組織のＭＡｂ ＩＭＨ２による免疫組織学的
染色：宿主ルイス状態との関係
【００７１】
【表４】
【００７２】
主な脚注は表ＩＩのとおり。
【００７３】
（Ｆ．拡張シアリル−Ｌｅａ（すなわちＳＬｅａ−Ｌｅａ）の単離）
Ｃｏｌｏ２０５細胞のモノシアロ−ガングリオシドフラクションの試験は、高
性能薄層クロマトグラフィー技術による１つの主要なガングリオシドの単離をも
たらすかまたは単離を生じた。この主要なバンドを抽出して特徴付けした。構造
を以下：
【００７４】
【化１４】
【００７５】
と同定した。
【００７６】
この構造は、１Ｈ−ＮＭＲ分光法により確認した。
【００７７】
ＳＬｅａ−Ｌｅａ構造上の拡張シアリル−Ｌｅａを、シアリダーゼを用いる酵
素分解により確認して、薄層クロマトグラフィーおよびモノクローナル抗体ＳＴ
−４２１での免疫染色により確認された場合のＬｅａ−Ｌｅａと同じ化合物を得
た。元々のシアリルＬｅａ−Ｌｅａまたは拡張Ｌｅａは、ＭＡｂ ＳＴ−４２１
との反応性を示さない。しかし、この化合物は、Ｎ−１９−９、ＮＫＨ−１およ
びＮＫＨ−２のようなシアリル−Ｌｅａに特異的なＭＡｂとの反応性を示した。
【図面の簡単な説明】
【００７８】
【図１】図１は、糖Ｉ（Ｇｌｃ）、ＩＩ（Ｇａｌ）、ＩＩＩ（ＧｌｃＮＡｃ）、ＩＶ（Ｇａｌ）、Ｖ（ＧｌｃＮＡｃ）およびＶＩ（ＧａｌおよびＦＩＩＩとして同定されるＩＩＩ ＧｌｃＮＡｃに結合したフコース、およびＦＩＶによって示されるようなＶＧｌｃＮＡｃに結合したフコース）をカバーする４．２０ｐｐｍ〜５．６０ｐｐｍにおける化学シフトからの、拡張シアリルＬｅａの１Ｈ−ＮＭＲスペクトルである。このスペクトルにおいて、ＦＶおよびＦＩＩＩの全てのアノマープロトンスペクトルは、ＦＶ−１およびＦＩＩＩ−１として示される。さらに、フコースのスペクトルＣ５プロトンは、ＦＩＩＩ−５およびＦＶ−５によって示されるように、多重カップリングによって示される。Ｃｉｓとして示されるスペクトルは、スフィンゴシンのＣｉｓ二重結合であり、Ｒ−５およびＲ−４は、スフィンゴシンのスペクトルを示す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
本願発明に記載されるような、腫瘍関連抗原としての拡張Ｉ型スフィンゴ糖脂質鎖。
【請求項１】
本願発明に記載されるような、腫瘍関連抗原としての拡張Ｉ型スフィンゴ糖脂質鎖。
【図１】
【公開番号】特開２００７−１９１４９０（Ｐ２００７−１９１４９０Ａ）
【公開日】平成１９年８月２日（２００７．８．２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−９６９５４（Ｐ２００７−９６９５４）
【出願日】平成１９年４月２日（２００７．４．２）
【分割の表示】特願２００２−５０６７４８（Ｐ２００２−５０６７４８）の分割
【原出願日】平成１２年７月３日（２０００．７．３）
【出願人】（５０３００９１７７）ザ バイオメンブレイン インスティチュート (1)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１９年８月２日（２００７．８．２）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年４月２日（２００７．４．２）
【分割の表示】特願２００２−５０６７４８（Ｐ２００２−５０６７４８）の分割
【原出願日】平成１２年７月３日（２０００．７．３）
【出願人】（５０３００９１７７）ザ バイオメンブレイン インスティチュート (1)
【Ｆターム（参考）】
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