膵島移植補助薬剤
【課題】治療効果の高い治療及び／又は改善剤、又はその治療及び／又は改善方法を提供すること。
【解決手段】トロンボモジュリンを有効成分とする薬剤であって、膵島移植を受ける糖尿病患者に投与され、膵島移植後の血糖値を正常化するための薬剤。
【解決手段】トロンボモジュリンを有効成分とする薬剤であって、膵島移植を受ける糖尿病患者に投与され、膵島移植後の血糖値を正常化するための薬剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、糖尿病患者における膵島移植の際に使用される薬剤であって、トロンボモジュリンを主たる有効成分とし、糖尿病を治療及び／又は改善するための薬剤、又は膵島移植による糖尿病の治療及び／又は改善効果を補助するための薬剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
糖尿病は、身体が炭水化物、脂肪、及びタンパク質を適正に維持および使用することができなくなる慢性の複雑な代謝疾患である。種々の遺伝及び環境因子により、インスリン産生の欠損またはその作用低下により引き起こされる血中グルコースの高レベルを特徴とする。１９９７年に旧厚生省が行った糖尿病実態調査によると、糖尿病が強く疑われる人は６９０万人、糖尿病の可能性を否定できない人６８０万人を加えると、約１，３７０万人がリスク群と推定されている。ＷＨＯの推定する全世界の糖尿病人口は、２０００年で約１億５千万人であり、２０２５年では約３億人に達すると予測されている。
【０００３】
糖尿病は、進行すると網膜症、腎症、及び神経障害などの合併症を引き起こし、また、脳卒中、虚血性心疾患の発症・進展を促進し、患者のＱＯＬを著しく低下させる。１９９８年に行われた日本透析医学会の調査によると、１９９８年の１年間で新たに透析導入となった患者の内、３５．７％は糖尿病性腎症が原因であり、１９８３年の２倍以上に増加していた。また、１９８８年に行われた旧厚生省の視覚障害の疾病調査研究によれば、糖尿病性網膜症により年間３千人が視覚障害となっている。このように、糖尿病は社会的な大きな問題となっており、糖尿病撲滅は欧米と同様に本邦においても重要な課題となっている。
【０００４】
糖尿病の多くの症例は、若年者に多く発症するＩ型、及び成人に多く発症するＩＩ型に分類され、約５〜１０％の糖尿病患者がＩ型である。Ｉ型糖尿病は、自己免疫の異常によってインスリンを産生する膵β細胞が特異的に破壊されることで発症する（非特許文献１）。そのため、糖尿病患者は、生死に関わる高血糖（高血糖症）合併症を予防するために、外部からのインシュリン注射に依存している。血糖測定とインスリン投与（インスリン集中治療）という非常に厳格な治療法を忠実に守らない限り、高血糖症に起因する慢性的で長期間にわたる器官損傷合併症を防ぐことはできない。インスリン集中治療は、インスリンの過剰投与によって、致命的ともなり得る急性かつ重篤な意識変容状態を伴う急性低血糖症のリスクを増加させる。インスリン療法はＩ型糖尿病において速やかな死という緊急の問題を解決し、現在どの患者に対しても提供され得るものであるという点においてその果たしている役割は非常に大きい。しかし、一方でＩ型糖尿病に対する根本的治療法とはなりえず、低血糖の危険性、長期合併症といった非常に困難な問題が残っている。
【０００５】
Ｉ型糖尿病の根本的治療法として、膵臓又は膵臓と腎臓を同時に移植して、膵島β細胞の再生置換療法が行われている。移植によって非常に厳格な血糖調節を可能とし、低血糖さらには長期合併症の発症を回避することである。単にインスリン集中療法による日常の煩わしさから患者を開放させるだけでなく、Ｉ型糖尿病の治癒が期待される治療法である。しかしながら、膵臓移植では手術侵襲が大きいこと、また付随して移植される外分泌腺による合併症が重度となりうるなどの問題がある。
【０００６】
後腹膜に存在する膵臓は、外分泌腺と内分泌腺から構成されている。膵臓全容積の９８％以上を外分泌腺が占め、内分泌腺は２％以下である。１８６９年ランゲルハンスによって見いだされた内分泌腺組織は、膵島と呼ばれる。膵島は内分泌細胞の集団であり、α細胞、β細胞、ＰＰ細胞、δ細胞などからなっている。体内のホルモンで唯一血糖を下げる作用をもつインスリンは膵島のβ細胞から分泌される。この膵島を膵臓から単離し、Ｉ型糖尿病の患者に移植することにより、一旦廃絶した血糖降下システムの置換再生を目指すのが膵島移植である。
【０００７】
膵島移植は、ドナーから摘出した膵臓を酵素処理して膵島細胞を分離した後、患者の門脈に膵島細胞を注入する。手術による開腹及び血管の吻合は不要で侵襲が極めて小さいため、糖尿病患者にとってより安全であり、血管病変の進行により膵臓移植の適応外になった患者でも実施可能である。また、門脈循環にインスリンが放出されるため、生理学的にも有利である。さらに、分離膵島の凍結保存によるいわゆるバンキングも可能であるなど、膵臓移植と比較して多くの利点を有している。
【０００８】
Ｉ型糖尿病では、インスリン療法による血糖調節が非常に困難であるため、膵島移植が最も有効な治療法と考えられている。また、ＩＩ型糖尿病の治療においても、積極的にインスリン療法が用いられている。これは、インスリンを投与することにより、患者自身の膵島β細胞を休息させ、それによりβ細胞の機能が回復してくるのを待つという考え方からであり、近年積極的に導入され好結果が報告されている。このことは、ＩＩ型糖尿病においても病期が進むと糖毒性やβ細胞の疲弊によってインスリンの不足を来すので、ＩＩ型糖尿病は現在のところ膵島移植の適応とはなっていないが、将来、移植膵島を多量に供給し得る状況となった場合には、インスリン抵抗性を契機としたインスリン依存型糖尿病もその適応となる可能性は充分にある。
【０００９】
このように、膵島移植の臨床研究までに発展した理由としては、主として大動物を用いて膵臓から大量に膵島を分離する方法が開発されたことが大きい。１９８４年、Ｒｉｃｏｒｄｉらによって独自の自動膵島分離装置が考案され、ブタ又はヒトの膵臓から膵島を大量に分離することが可能となった（非特許文献２）。膵島移植に利用される膵島の分離、調製法としては、特許文献１に記載されている。
【００１０】
実験的医療の段階から始まった膵島移植は、当初成績が芳しくなかったが、１９９９年３月からカナダのエドモントンにあるアルバータ大学において、エドモントンプロトコール（Ｅｄｍｏｎｔｏｎ Ｐｒｏｔｏｃｏｌ）と呼ばれる免疫抑制剤の斬新な使用法を用いた膵島移植が実施され、膵島移植施行７例全例が Ｉ型糖尿病症例で日常的なインスリン投与から離脱することが報告され（非特許文献３）、このプロトコールを用いた他施設共同治験が行われるようになった。
【００１１】
Ｉ型糖尿病の治療法として膵島移植の有用性は高まってきているが、移植を成功させる上で大量の膵島細胞の輸注が必要なこと、また質の高い膵島細胞を得るため状態の良い膵臓を用意することが課題となっている。２００６年にＳｈａｐｉｒｏ ＡＭらによってエドモントンプロトコールを用いて膵島移植を受けた患者の転帰について報告され（非特許文献４）、膵島移植によってインスリン治療が不要となった患者の内、移植後２年の時点でインスリンの治療を再開した患者が７６％になっていた。これらのことから、Ｉ型糖尿病患者の根治療法としての膵島移植において、更なる改善が望まれている。
【００１２】
一方、トロンボモジュリンは、トロンビンと特異的に結合しトロンビンの血液凝固活性を阻害すると同時にトロンビンのプロテインＣ活性化能を著しく促進する作用を有する物質として知られ、強力な血液凝固阻害作用を有することが知られている。トロンビンによる凝固時間を延長することや、トロンビンによる血小板凝集を抑制することが知られている。プロテインＣは、血液凝固線溶系において重要な役割を演じているビタミンＫ依存性の蛋白質であり、トロンビンの作用により活性化され、活性化プロテインＣとなる。この活性化プロテインＣは、生体内で血液凝固系因子の活性型第Ｖ因子、及び活性型第ＶＩＩＩ因子を失活させ、また血栓溶解作用を有するプラスミノゲンアクチベーターの産生に関与していることが知られている（非特許文献５）。したがって、トロンボモジュリンは、このトロンビンによるプロテインＣの活性化を促進して抗血液凝固剤又は血栓溶解剤として有用であるとされており、凝固亢進を伴う疾患の治療、予防に有効であるという動物実験についての報告もある（非特許文献６）。
【００１３】
従来、トロンボモジュリンは、ヒトをはじめとする種々の動物種の血管内皮細胞上に発現している糖蛋白質として発見取得され、その後、クローニングに成功した。即ち、遺伝子工学的手法を用いてヒト肺ｃＤＮＡライブラリーからシグナルペプチドを含むヒトトロンボモジュリン前駆体の遺伝子をクローニングし、そしてトロンボモジュリンの全遺伝子配列を解析し、シグナルペプチド（通常は、１８アミノ酸残基が例示される）を含む５７５残基のアミノ酸配列が明らかにされている（特許文献２）。シグナルペプチドが切断されたマチュアなトロンボモジュリンは、そのマチュアなペプチドのＮ末端側よりＮ末端領域（１−２２６番目：シグナルペプチドが１８アミノ酸残基であると考えた場合の位置表示、以下同じ）、６つのＥＧＦ様構造をもつ領域（２２７−４６２番目）、Ｏ型糖鎖付加領域（４６３−４９８番目）、膜貫通領域（４９９−５２１番目）、そして細胞質内領域（５２２−５５７番目）の５つの領域から構成されている。全長のトロンボモジュリンと同じ活性を有する部分（すなわち、最小活性単位）は、６つのＥＧＦ様構造を持つ領域のうち、主としてＮ末端側から４，５，６番目のＥＧＦ様構造からなる部分であることが知られている（非特許文献７）。
【００１４】
全長のトロンボモジュリンは界面活性剤の存在下でないと溶解し難く、製剤としては界面活性剤の添加が必須であるのに対して、界面活性剤の非存在下でもきれいに溶解することができる可溶性トロンボモジュリンが存在する。可溶性トロンボモジュリンは、少なくとも、膜貫通領域の一部又は全部を含有せしめないように調製すればよく、例えば、Ｎ末端領域と６つのＥＧＦ様構造をもつ領域とＯ型糖鎖付加領域の３つの領域のみからなる（即ち、配列番号９の第１９〜５１６位のアミノ酸配列からなる）可溶性トロンボモジュリンは、組換え技術の応用により取得できること、そしてその組換え体可溶性トロンボモジュリンは、天然のトロンボモジュリンの活性を有していることが確認されている（特許文献２）。他に可溶性トロンボモジュリンの例としていくつかの報告がある（特許文献３〜１０）。あるいは天然型としてヒト尿由来の可溶性トロンボモジュリン等も例示される（特許文献１１、１２）。
【００１５】
因みに、遺伝子においては、自然の変異又は取得時の変異により、多くのケースで認められる通り、ヒトにおいても多形性の変異が見つけられており、上述の５７５残基のアミノ酸配列からなるヒトトロンボモジュリン前駆体の第４７３位のアミノ酸においてＶａｌであるものと、Ａｌａであるものが現在確認されている。このアミノ酸をコードする塩基配列においては、第１４１８位において、それぞれＴとＣとの変異に相当する（非特許文献８）。しかし、活性及び物性においては、全く相違なく、両者は実質的に同一と考えることができる。
【００１６】
従来トロンボモジュリンの用途として、例えば、心筋梗塞、血栓症（例えば、急性期又は慢性期の脳血栓症、動脈又は静脈の急性又は慢性の末梢血栓症など）、塞栓症（例えば、急性期又は慢性期の脳塞栓症、動脈又は静脈の急性又は慢性の末梢塞栓症など）、末梢血管閉塞症（例えば、バージャー病、レイノー病など）、閉塞性動脈硬化症、心臓手術に続発する機能性障害、移植臓器の合併症、血管内血液凝固症候群（ＤＩＣ）、狭心症、一過性脳虚血発作、妊娠中毒症、肝ＶＯＤ（Ｌｉｖｅｒ ｖｅｎｏ−ｏｃｃｌｕｓｉｖｅ ｄｉｓｅａｓｅ；劇症肝炎や骨髄移植後の肝静脈閉塞症）、深部静脈血栓症（ＤＶＴ；Ｄｅｅｐ ｖｅｎｏｕｓ ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ）等の疾患の治療及び予防に用いられることが期待されている。また、血栓症やＤＩＣなどの凝固亢進を伴う疾患以外の疾患に対する適用として、肝臓障害（特許文献１３）、吸収性骨疾患（特許文献１４）、創傷治癒（特許文献１５）などが挙げられる。さらにトロンボモジュリンを他の有効成分と併用する用途として、創傷治癒（特許文献１６）及び脳組織の保護（特許文献１７）などが開示されている。
【００１７】
【特許文献１】特表平２−５０４２２２２号公報
【特許文献２】特開昭６４−６２１９号公報
【特許文献３】特開平２−２５５６９９号公報
【特許文献４】特開平３−１３３３８０号公報
【特許文献５】特開平３−２５９０８４号公報
【特許文献６】特開平４−２１０７００号公報
【特許文献７】特開平５−２１３９９８号公報
【特許文献８】ＷＯ９２／００３２５号公報
【特許文献９】ＷＯ９２／０３１４９号公報
【特許文献１０】ＷＯ９３／１５７５５号公報
【特許文献１１】特開平３−８６９００号公報
【特許文献１２】特開平３−２１８３９９号公報
【特許文献１３】特開平８−３０６５号公報
【特許文献１４】特開平８−３０１７８３号公報
【特許文献１５】特開平９−２０６７７号公報
【特許文献１６】米国特許第５，９７６，５２３号明細書
【特許文献１７】米国特許第５，８２７，８３２号明細書
【非特許文献１】Ａｔｋｉｎｓｏｎ ＭＡ ｅｔ ａｌ、Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ １９９４；３３１：１４２８−１４３６
【非特許文献２】Ｒｉｃｏｒｄｉ Ｃ ｅｔ ａｌ、Ｄｉａｂｅｔｅｓ １９８８；３７：４１３−４２０
【非特許文献３】Ｓｈａｐｉｒｏ ＡＭ ｅｔ ａｌ、Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ２０００；３４３：２３０−２３８
【非特許文献４】Ｓｈａｐｉｒｏ ＡＭ ｅｔ ａｌ、Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ２００６；３５５： １３７２−４
【非特許文献５】鈴木宏治、医学のあゆみ １９８３；１２５：９０１
【非特許文献６】Ｇｏｍｉ Ｋ ｅｔ ａｌ、 Ｂｌｏｏｄ １９９０；７５：１３９６−１３９９
【非特許文献７】Ｚｕｓｈｉ Ｍ ｅｔ ａｌ、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ １９８９；２４６：１０３５１−１０３５３
【非特許文献８】Ｗｅｎ ＤＺ ｅｔ ａｌ、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １９８７；２６：４３５０−４３５７
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１８】
本発明の課題は、糖尿病患者の膵島移植後の血糖値を正常化するためのより治療効果の高い薬剤、又は糖尿病患者の膵島移植後の血糖値を正常化する方法を提供することにある。本発明の別の課題は、糖尿病患者の膵島移植において移植膵島細胞の生着率をより効果的に改善する薬剤、糖尿病患者の膵島移植において移植した膵島細胞の生存期間を延長する薬剤、又はそれらの方法を提供することにある。さらには本発明の別の課題は、膵島移植を受けた糖尿病患者の糖尿病の病状をより治療及び／又は改善するためのより治療効果の高い薬剤、又はその治療及び／又は改善方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１９】
近年、Ｉ型糖尿病の根本治療としての膵島移植は、技術的な進歩によって治療成績が向上しているが、大量の膵島細胞を必要とすること、また移植後インスリン治療からの離脱が長期間にわたって維持しないため、複数回の膵島移植が必要であり、膵島移植方法の改善による治療成績の更なる向上が求められている。本発明者らは、移植した膵島細胞の生着率の改善に着眼し、これを満足させる薬剤を見出すべく鋭意研究した結果、驚くべきことに、従来試みられることのなかったトロンボモジュリンを投与することにより、移植膵島細胞の生着率を著しく改善する効果があることを見出した。また、トロンボモジュリンを投与することにより膵島移植後の膵島移植細胞の生存期間を延長させることができることを見出した。さらには、トロンボモジュリンを投与することにより膵島移植後の血糖値を正常化することができることを見出し、これら個々の知見に基づいて本発明を完成するに至った。すなわち、本発明はトロンボモジュリンを主たる有効成分として含有し、膵島移植を受ける糖尿病患者及び／又は膵島移植を受けた糖尿病患者に投与され、膵島移植後の血糖値を正常化するための薬剤に関する。本発明の薬剤は、糖尿病の根治療法として期待される膵島移植に際して投与することにより移植された膵島細胞の生着率を著しく高めることができると共に、インスリン分泌を正常化し、膵島移植後の膵島移植細胞の生存期間を延長することが可能となる。また、膵島移植後の糖尿病患者の血糖値を正常化し、糖尿病をより効果的に治療及び／又は改善することが可能となる。
【００２０】
すなわち、本発明として具体的には以下のものが挙げられる。
〔１〕トロンボモジュリンを有効成分とする薬剤であって、該薬剤が、膵島移植を受ける糖尿病患者及び／又は膵島移植を受けた糖尿病患者に投与され、膵島移植後の血糖値を正常化するための該薬剤；
〔１−２〕トロンボモジュリンを有効成分とする薬剤であって、該薬剤が膵島移植を受ける糖尿病患者及び／又は膵島移植を受けた糖尿病患者に投与されることにより糖尿病を治療及び／又は改善するための該薬剤；
〔１−３〕トロンボモジュリンを有効成分とする薬剤であって、該薬剤が膵島移植を受ける糖尿病患者及び／又は膵島移植を受けた糖尿病患者に投与され、膵島移植による糖尿病の治療及び／又は改善効果を補助するための該薬剤；
〔１−４〕トロンボモジュリンを有効成分とする薬剤であって、該薬剤が膵島移植を受ける糖尿病患者及び／又は膵島移植を受けた糖尿病患者に投与され、移植膵島細胞の生着率を改善するための該薬剤；
〔１−５〕トロンボモジュリンを有効成分とする薬剤であって、該薬剤が膵島移植を受ける糖尿病患者及び／又は膵島移植を受けた糖尿病患者に投与され、移植膵島細胞の生存期間を延長するための該薬剤；
〔１−６〕トロンボモジュリンを有効成分とする薬剤であって、該薬剤が膵島移植を受ける糖尿病患者及び／又は膵島移植を受けた糖尿病患者に投与され、膵島移植後の血漿中インスリン濃度を正常化するための該薬剤；
【００２１】
〔２〕該トロンボモジュリンが、可溶性トロンボモジュリンである前記〔１〕〜〔１−６〕のいずれかに記載の薬剤；
【００２２】
〔３〕該トロンボモジュリンが、配列番号１、３、５、７、９又は配列番号１１に記載のアミノ酸配列をコードするＤＮＡを宿主細胞にトランスフェクトして調製された形質転換細胞より取得されるペプチドである、前記〔１〕〜〔２〕のいずれかに記載の薬剤；
なお、前記〔１〕〜〔２〕のように引用する項番号が範囲で示され、その範囲内に〔１−２〕等の枝番号を有する項が配置されている場合には、〔１−２〕等の枝番号を有する項も引用されることを意味する。以下においても同様である。
〔３−２〕該トロンボモジュリンが、配列番号１又は配列番号３に記載のアミノ酸配列をコードするＤＮＡを宿主細胞にトランスフェクトして調製された形質転換細胞により取得されるペプチドである、前記〔１〕〜〔２〕のいずれかに記載の薬剤；
〔３−３〕該トロンボモジュリンが、配列番号５又は配列番号７に記載のアミノ酸配列をコードするＤＮＡを宿主細胞にトランスフェクトして調製された形質転換細胞により取得されるペプチドである、前記〔１〕〜〔２〕のいずれかに記載の薬剤；
〔３−４〕該トロンボモジュリンが、配列番号９又は配列番号１１に記載のアミノ酸配列をコードするＤＮＡを宿主細胞にトランスフェクトして調製された形質転換細胞により取得されるペプチドである、前記〔１〕〜〔２〕のいずれかに記載の薬剤；
【００２３】
〔４〕該トロンボモジュリンが、配列番号１もしくは配列番号３のそれぞれにおける第１９〜１３２位の配列を有するペプチド、上記配列の相同変異配列を有しトロンボモジュリン活性を有するペプチド、又はそれらの混合物のいずれかである前記〔１〕〜〔２〕、又は〔３−２〕のいずれかに記載の薬剤；
〔４−２〕該トロンボモジュリンが、配列番号１もしくは配列番号３のそれぞれにおける第１９〜１３２位の配列を有するペプチド、又は上記配列の相同変異配列を有しトロンボモジュリン活性を有するペプチドである前記〔１〕〜〔２〕、又は〔３−２〕のいずれかに記載の薬剤；
〔４−３〕該トロンボモジュリンが、配列番号１もしくは配列番号３のそれぞれにおける第１９〜１３２位の配列を有するペプチドである前記〔１〕〜〔２〕、又は〔３−２〕のいずれかに記載の薬剤；
〔４−４〕該トロンボモジュリンが、配列番号１もしくは配列番号３のそれぞれにおける第１９〜１３２位もしくは第１７〜１３２位の配列を有するペプチド、上記配列の相同変異配列を有しトロンボモジュリン活性を有するペプチド、又はそれらの混合物のいずれかである前記〔１〕〜〔２〕、又は〔３−２〕のいずれかに記載の薬剤；
〔４−５〕該トロンボモジュリンが、配列番号１もしくは配列番号３のそれぞれにおける第１９〜１３２位もしくは第１７〜１３２位の配列を有するペプチド又はそれらの混合物である前記〔１〕〜〔２〕、又は〔３−２〕のいずれかに記載の薬剤；
〔４−６〕該トロンボモジュリンが、配列番号１における第１９〜１３２位もしくは第１７〜１３２位の配列を有するペプチド又はそれらの混合物である前記〔１〕〜〔２〕、又は〔３−２〕のいずれかに記載の薬剤；
〔４−７〕該トロンボモジュリンが、配列番号３における第１９〜１３２位もしくは第１７〜１３２位の配列を有するペプチド又はそれらの混合物である前記〔１〕〜〔２〕、又は〔３−２〕のいずれかに記載の薬剤；
〔４−８〕該トロンボモジュリンが、配列番号１における第１９〜１３２位もしくは第１７〜１３２位の配列からなるペプチド又はそれらの混合物である前記〔１〕〜〔２〕、又は〔３−２〕のいずれかに記載の薬剤；
〔４−９〕該トロンボモジュリンが、配列番号３における第１９〜１３２位もしくは第１７〜１３２位の配列からなるペプチド又はそれらの混合物である前記〔１〕〜〔２〕、又は〔３−２〕のいずれかに記載の薬剤；
【００２４】
〔５〕該トロンボモジュリンが、配列番号５もしくは配列番号７のそれぞれにおける第１９〜４８０位の配列を有するペプチド、上記配列の相同変異配列を有しトロンボモジュリン活性を有するペプチド、又はそれらの混合物のいずれかである前記〔１〕〜〔２〕、又は〔３−３〕のいずれかに記載の薬剤；
〔５−２〕該トロンボモジュリンが、配列番号５もしくは配列番号７のそれぞれにおける第１９〜４８０位の配列を有するペプチド、又は上記配列の相同変異配列を有しトロンボモジュリン活性を有するペプチドである前記〔１〕〜〔２〕、又は〔３−３〕のいずれかに記載の薬剤；
〔５−３〕該トロンボモジュリンが、配列番号５もしくは配列番号７のそれぞれにおける第１９〜４８０位の配列を有するペプチドである前記〔１〕〜〔２〕、又は〔３−３〕のいずれかに記載の薬剤；
〔５−４〕該トロンボモジュリンが、配列番号５もしくは配列番号７のそれぞれにおける第１９〜４８０位もしくは第１７〜４８０位の配列を有するペプチド、上記配列の相同変異配列を有しトロンボモジュリン活性を有するペプチド、又はそれらの混合物のいずれかである前記〔１〕〜〔２〕、又は〔３−３〕のいずれかに記載の薬剤；
〔５−５〕該トロンボモジュリンが、配列番号５もしくは配列番号７のそれぞれにおける第１９〜４８０位もしくは第１７〜４８０位の配列を有するペプチド又はそれらの混合物である前記〔１〕〜〔２〕、又は〔３−３〕のいずれかに記載の薬剤；
〔５−６〕該トロンボモジュリンが、配列番号５における第１９〜４８０位もしくは第１７〜４８０位の配列を有するペプチド又はそれらの混合物である前記〔１〕〜〔２〕、又は〔３−３〕のいずれかに記載の薬剤；
〔５−７〕該トロンボモジュリンが、配列番号７における第１９〜４８０位もしくは第１７〜４８０位の配列を有するペプチド又はそれらの混合物である前記〔１〕〜〔２〕、又は〔３−３〕のいずれかに記載の薬剤；
〔５−８〕該トロンボモジュリンが、配列番号５における第１９〜４８０位もしくは第１７〜４８０位の配列からなるペプチド又はそれらの混合物である前記〔１〕〜〔２〕、又は〔３−３〕のいずれかに記載の薬剤；
〔５−９〕該トロンボモジュリンが、配列番号７における第１９〜４８０位もしくは第１７〜４８０位の配列からなるペプチド又はそれらの混合物である前記〔１〕〜〔２〕、又は〔３−３〕のいずれかに記載の薬剤；
【００２５】
〔６〕該トロンボモジュリンが、配列番号９もしくは配列番号１１のそれぞれにおける第１９〜５１６位の配列を有するペプチド、前記ペプチドのアミノ酸配列の１つ又は複数のアミノ酸が置換、欠失、又は付加されたアミノ酸配列を有しトロンボモジュリン活性を有するペプチド、又はそれらの混合物のいずれかである前記〔１〕〜〔２〕、又は〔３−４〕のいずれかに記載の薬剤；
〔６−２〕該トロンボモジュリンが、配列番号９もしくは配列番号１１のそれぞれにおける第１９〜５１６位の配列を有するペプチド、又は前記ペプチドのアミノ酸配列の１つ又は複数のアミノ酸が置換、欠失、又は付加されたアミノ酸配列を有しトロンボモジュリン活性を有するペプチドである前記〔１〕〜〔２〕、又は〔３−４〕のいずれかに記載の薬剤；
〔６−３〕該トロンボモジュリンが、配列番号９もしくは配列番号１１のそれぞれにおける第１９〜５１６位の配列を有するペプチドである前記〔１〕〜〔２〕又は〔３−４〕のいずれかに記載の薬剤；
〔６−４〕該トロンボモジュリンが、配列番号９もしくは配列番号１１のそれぞれにおける第１９〜５１６位、第１９〜５１５位、第１７〜５１６位、もしくは第１７〜５１５位の配列を有するペプチド、上記配列の相同変異配列を有しトロンボモジュリン活性を有するペプチド、又はそれらの混合物である前記〔１〕〜〔２〕、又は〔３−４〕のいずれかに記載の薬剤；
〔６−５〕該トロンボモジュリンが、配列番号９もしくは配列番号１１のそれぞれにおける第１９〜５１６位、第１９〜５１５位、第１７〜５１６位、もしくは第１７〜５１５位の配列を有するペプチド、又はそれらの混合物である前記〔１〕〜〔２〕、又は〔３−４〕のいずれかに記載の薬剤；
〔６−６〕該トロンボモジュリンが、配列番号９における第１９〜５１６位、第１９〜５１５位、第１７〜５１６位、もしくは第１７〜５１５位の配列を有するペプチド、又はそれらの混合物である前記〔１〕〜〔２〕、又は〔３−４〕のいずれかに記載の薬剤；
〔６−７〕該トロンボモジュリンが、配列番号１１における第１９〜５１６位、第１９〜５１５位、第１７〜５１６位、もしくは第１７〜５１５位の配列を有するペプチド、又はそれらの混合物である前記〔１〕〜〔２〕、又は〔３−４〕のいずれかに記載の薬剤；
〔６−８〕該トロンボモジュリンが、配列番号９における第１９〜５１６位、第１９〜５１５位、第１７〜５１６位、もしくは第１７〜５１５位の配列からなるペプチド、又はそれらの混合物である前記〔１〕〜〔２〕、又は〔３−４〕のいずれかに記載の薬剤；
〔６−９〕該トロンボモジュリンが、配列番号９における第１９〜５１６位、第１９〜５１５位、第１７〜５１６位、もしくは第１７〜５１５位の配列からなるペプチドである前記〔１〕〜〔２〕、又は〔３−４〕のいずれかに記載の薬剤；
〔６−１０〕該トロンボモジュリンが、配列番号１１における第１９〜５１６位、第１９〜５１５位、第１７〜５１６位、もしくは第１７〜５１５位の配列からなるペプチド、又はそれらの混合物である前記〔１〕〜〔２〕、又は〔３−４〕のいずれかに記載の薬剤；
〔６−１１〕該トロンボモジュリンが、配列番号１１における第１９〜５１６位、第１９〜５１５位、第１７〜５１６位、もしくは第１７〜５１５位の配列からなるペプチドである前記〔１〕〜〔２〕、又は〔３−４〕のいずれかに記載の薬剤；
【００２６】
〔７〕前記〔１〕、又は〔２〕〜〔６−１１〕のいずれかに記載の薬剤と免疫抑制剤とを組み合わせてなる薬剤であって、該薬剤が膵島移植を受ける糖尿病患者及び／又は膵島移植を受けた糖尿病患者に投与され、膵島移植後の血糖値を正常化するための該薬剤；
〔７−２〕前記〔１〕、又は〔２〕〜〔６−１１〕のいずれかに記載の薬剤、免疫抑制剤、及び糖尿病治療薬とを組み合わせてなる薬剤であって、該薬剤が膵島移植を受ける糖尿病患者及び／又は膵島移植を受けた糖尿病患者に投与され、膵島移植後の血糖値を正常化するための該薬剤；
〔７−３〕前記〔１−２〕、又は〔２〕〜〔６−１１〕のいずれかに記載の薬剤と免疫抑制剤とを組み合わせてなる薬剤であって、該薬剤が膵島移植を受ける糖尿病患者及び／又は膵島移植を受けた糖尿病患者に投与されることにより糖尿病を治療及び／又は改善するための該薬剤；
〔７−４〕前記〔１−２〕、又は〔２〕〜〔６−１１〕のいずれかに記載の薬剤、免疫抑制剤、及び糖尿病治療薬とを組み合わせてなる薬剤であって、該薬剤が膵島移植を受ける糖尿病患者及び／又は膵島移植を受けた糖尿病患者に投与されることにより糖尿病を治療及び／又は改善するための該薬剤；
〔７−５〕前記〔１−３〕、又は〔２〕〜〔６−１１〕のいずれかに記載の薬剤と免疫抑制剤とを組み合わせてなる薬剤であって、該薬剤が膵島移植を受ける糖尿病患者及び／又は膵島移植を受けた糖尿病患者に投与され、膵島移植による糖尿病の治療及び／又は改善効果を補助するための該薬剤；
〔７−６〕前記〔１−３〕、又は〔２〕〜〔６−１１〕のいずれかに記載の薬剤と免疫抑制剤とを組み合わせてなる薬剤であって、該薬剤が膵島移植を受ける糖尿病患者及び／又は膵島移植を受けた糖尿病患者に投与され、膵島移植による糖尿病の治療及び／又は改善効果を補助するための該薬剤；
〔７−７〕前記〔１−４〕、又は〔２〕〜〔６−１１〕のいずれかに記載の薬剤と免疫抑制剤とを組み合わせてなる薬剤であって、該薬剤が膵島移植を受ける糖尿病患者及び／又は膵島移植を受けた糖尿病患者に投与され、移植膵島細胞の生着率を改善するための該薬剤；
〔７−８〕前記〔１−４〕、又は〔２〕〜〔６−１１〕のいずれかに記載の薬剤、免疫抑制剤、及び糖尿病治療薬とを組み合わせてなる薬剤であって、該薬剤が膵島移植を受ける糖尿病患者及び／又は膵島移植を受けた糖尿病患者に投与され、移植膵島細胞の生着率を改善するための該薬剤；
〔７−９〕前記〔１−５〕、又は〔２〕〜〔６−１１〕のいずれかに記載の薬剤と免疫抑制剤とを組み合わせてなる薬剤であって、該薬剤が膵島移植を受ける糖尿病患者及び／又は膵島移植を受けた糖尿病患者に投与され、移植膵島細胞の生存期間を延長するための該薬剤；
〔７−１０〕前記〔１−５〕、又は〔２〕〜〔６−１１〕のいずれかに記載の薬剤、免疫抑制剤、及び糖尿病治療薬とを組み合わせてなる薬剤であって、該薬剤が膵島移植を受ける糖尿病患者及び／又は膵島移植を受けた糖尿病患者に投与され、移植膵島細胞の生存期間を延長するための該薬剤；
〔７−１１〕前記〔１−６〕、又は〔２〕〜〔６−１１〕のいずれかに記載の薬剤と免疫抑制剤とを組み合わせてなる薬剤であって、該薬剤が膵島移植を受ける糖尿病患者及び／又は膵島移植を受けた糖尿病患者に投与され、膵島移植後の血漿中インスリン濃度を正常化するための該薬剤；
〔７−１２〕前記〔１−６〕、又は〔２〕〜〔６−１１〕のいずれかに記載の薬剤、免疫抑制剤、及び糖尿病治療薬とを組み合わせてなる薬剤であって、該薬剤が膵島移植を受ける糖尿病患者及び／又は膵島移植を受けた糖尿病患者に投与され、膵島移植後の血漿中インスリン濃度を正常化するための該薬剤；
【００２７】
〔８〕膵島移植を受ける糖尿病患者が、Ｉ型糖尿病患者である前記〔１〕〜〔７−１２〕のいずれかに記載の薬剤；
【００２８】
〔１’〕膵島移植を受ける糖尿病患者及び／又は膵島移植を受けた糖尿病患者にトロンボモジュリンを投与することを含む、膵島移植後の血糖値を正常化する方法；
〔２’〕該トンボモジュリンが、可溶性トロンボモジュリンである前記〔１’〕に記載の方法；
〔３’〕該トロンボモジュリンが、配列番号９又は１１に記載のアミノ酸配列をコードするＤＮＡを宿主細胞にトランスフェクトして調製された形質転換細胞より取得されたペプチドである、前記〔１’〕又は〔２’〕に記載の方法；
〔４’〕該トロンボモジュリンが、配列番号９もしくは配列番号１１のそれぞれにおける第１９〜５１６位の配列を有するペプチド、又は上記配列の相同変異配列を有しトロンボモジュリン活性を有するペプチドのいずれかである前記〔１’〕又は〔２’〕に記載の方法；
【００２９】
〔５’〕膵島移植を受ける糖尿病患者及び／又は膵島移植を受けた糖尿病患者にトロンボモジュリン及び免疫抑制剤を投与することを含む、膵島移植後の血糖値を正常化する方法；
〔５’−２〕膵島移植を受ける糖尿病患者及び／又は膵島移植を受けた糖尿病患者にトロンボモジュリン、免疫抑制剤、及び糖尿病治療薬を投与することを含む、膵島移植後の血糖値を正常化する方法；
【００３０】
〔６’〕膵島移植を受ける糖尿病患者が、Ｉ型糖尿病患者である前記〔１’〕〜〔５’−２〕のいずれかに記載の方法；
〔７’〕前記〔１’〕に記載の方法であって、前記〔１〕〜〔８〕のいずれかに記載の特徴を有する該方法；
〔８’〕膵島移植を受ける糖尿病患者及び／又は膵島移植を受けた糖尿病患者にトロンボモジュリンを投与することを含む、糖尿病を治療及び／又は改善する方法；
〔８’−２〕前記〔８’〕に記載の方法であって、前記〔１〕〜〔８〕のいずれかに記載の特徴を有する方法；
【００３１】
〔９’〕膵島移植を受ける糖尿病患者及び／又は膵島移植を受けた糖尿病患者にトロンボモジュリンを投与することを含む、膵島移植による糖尿病の治療及び／又は改善効果を補助する方法；
〔９’−２〕前記〔９’〕に記載の方法であって、前記〔１〕〜〔８〕のいずれかに記載の特徴を有する該方法；
〔１０’〕膵島移植を受ける糖尿病患者及び／又は膵島移植を受けた糖尿病患者にトロンボモジュリンを投与することを含む、移植膵島細胞の生着率を改善する方法；
〔１０’−２〕前記〔１０’〕に記載の方法であって、前記〔１〕〜〔８〕のいずれかに記載の特徴を有する該方法；
【００３２】
〔１１’〕膵島移植を受ける糖尿病患者及び／又は膵島移植を受けた糖尿病患者にトロンボモジュリンを投与することを含む、移植膵島細胞の生存期間を延長する方法；
〔１１’−２〕前記〔１１’〕に記載の方法であって、前記〔１〕〜〔８〕のいずれかに記載の特徴を有する該方法；
〔１２’〕膵島移植を受ける糖尿病患者及び／又は膵島移植を受けた糖尿病患者にトロンボモジュリンを投与することを含む、膵島移植後の血漿中インスリン濃度を正常化する方法；
〔１２’−２〕前記〔１２’〕に記載の方法であって、前記〔１〕〜〔８〕のいずれかに記載の特徴を有する該方法；
【００３３】
〔１３’〕膵島移植を受ける糖尿病患者及び／又は膵島移植を受けた糖尿病患者にトロンボモジュリンを投与することを含む、膵島移植による糖尿病の治療及び／又は改善効果を補助する方法；
〔１３’−２〕前記〔１３’〕に記載の方法であって、前記〔１〕〜〔８〕のいずれかに記載の特徴を有する方法。
【発明の効果】
【００３４】
本発明のトロンボモジュリンを含有する薬剤を膵島移植を受ける糖尿病患者及び／又は膵島移植を受けた糖尿病患者に用いることにより、糖尿病患者の膵島移植後の血糖値を正常化することができ、本発明の方法によれば糖尿病患者の膵島移植後の血糖値を効果的に正常化することができる。また、本発明のトロンボモジュリンを含有する薬剤により、膵島移植後の移植膵島細胞の生着率を改善することができ、移植膵島細胞の生存期間を延長することができる。さらには血漿中のインスリン濃度を正常化することができ、糖尿病をより効果的に治療及び／又は改善することが可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３５】
以下、本発明を具体的に説明する。
本発明において、膵島移植としては、上述した通り内因性インスリンが枯渇した患者や腎不全を合併した患者等に行われる膵臓単独移植又は膵腎同時移植が具体的な例として挙げられる。本発明の薬剤も、上述した膵島移植に用いることができる。
【００３６】
本発明における膵島移植方法としては、１）ドナーから摘出した膵臓を酵素処理し、２）細胞分離機で膵島細胞だけを取り出し、３）患者の門脈に膵島細胞を注入、移植するという方法が好ましい例として挙げられる。
【００３７】
本発明における血糖値としては、血漿中における血糖値が挙げられる。また、血糖値を正常化することとしては、糖尿病の病状が改善されていると判断できる状態に血糖値を低下させることであれば特に限定されないが、例えば、血糖値を低下させてインスリンの投与量が減じられた状態を維持させること、又は血糖値を低下させてインスリン投与が不要である状態を維持させることが具体的な例として挙げられ、血糖値を低下させてインスリン投与が不要である状態を維持させることが好ましい。また、通常インスリンは、体重１ｋｇあたり０．２５単位以下で投与されることが好ましく、０．１単位以下で投与されることが好ましいが、血糖値が正常化された状態ではインスリンの投与量が上記の好ましい投与量よりも少ない量で済むか、又はインスリンの投与が不要となる場合がある。
【００３８】
正常化された血糖値は、通常１０〜１４時間絶食した後に採血して得られた血漿中の血糖値（空腹時血糖値）、又は７５ｇのブドウ糖を服用した後の血糖値（以下、ブドウ糖負荷試験血糖値と呼ぶことがある）によって例示される。ブドウ糖負荷試験血糖値は、ブドウ糖を服用して１時間ないしは２時間後に採血して得られた血漿中の血糖値が好ましい例として用いられ、より好ましくは２時間後の血糖値が用いられる。具体的には、空腹時血糖値の上限としては、１６０ｍｇ／ｄＬ以下が好ましく、１４０ｍｇ／ｄＬ以下がより好ましく、１３０ｍｇ／ｄＬ以下がさらに好ましく、１１０ｍｇ／ｄＬ以下が特に好ましく、下限として は６０ｍｇ／ｄＬ以上が好ましく、７０ｍｇ／ｄＬ以上がより好ましく、８０ｍｇ／ｄＬ以上が最も好ましい。また、ブドウ糖負荷試験血糖値としては、例えばブドウ糖負荷後２時間における血糖値の上限として、２２０ｍｇ／ｄＬ以下が好ましく、２００ｍｇ／ｄＬ以下がより好ましく、１８０ｍｇ／ｄＬ以下がさらに好ましく、１４０ｍｇ／ｄＬ以下が特に好ましく、下限としては、６０ｍｇ／ｄＬ以上が好ましく、７０ｍｇ／ｄＬ以上がより好ましく、８０ｍｇ／ｄＬ以上がさらに好ましい。血糖値を上記の範囲にすることも、血糖値を正常化することの好ましい態様として挙げられる。
【００３９】
本発明における、膵島移植による糖尿病の治療及び／又は改善効果を補助することとしては、膵島移植により糖尿病の治療を行うにあたり本発明の薬剤を用いることにより、糖尿病の治療及び／又は改善効果を高めること、又は糖尿病の治療及び／又は改善の確率を高めることが挙げられる。また、糖尿病それ自体を治療及び／又は改善することを意味する場合もある。
【００４０】
本発明における移植膵島細胞の生着としては、膵島移植において導入された細胞が導入臓器において生存することが挙げられ、生着率は、導入した細胞がある時点でどの程度生存しているかを示す１つの指標として挙げられる。
【００４１】
移植膵島細胞の生着率の改善を示す指標としては、移植された膵島細胞のインスリン産生能とインスリン産生に基づく血糖値の低下を組み合わせて評価するＨｏｍｅｏｓｔａｔｉｃ ｍｏｄｅｌ ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ ｏｆ β−ｃｅｌｌ ｆｕｎｃｔｉｏｎ（以下、ＨＯＭＡ−β値と呼ぶことがある）が例示され、以下の式で算出することができる。すなわち、ＨＯＭＡ−β値（％）＝２０×ＦＰＩ÷（ＦＰＧ−３．５）である。ここでＦＰＩは空腹時の血漿インスリン濃度（μＵ／ｍＬ）、ＦＰＧは空腹時血糖値（ｍｍｏｌ／Ｌ）を示す。
【００４２】
移植膵島細胞の改善された生着率の値としては、具体的には、ＨＯＭＡ−β値として下限としては４０％以上が好ましく、６０％以上がより好ましく、８０％以上がさらに好ましく、上限としては限定されることはないが、１００％以下が好ましい。移植膵島細胞の生存率を上記の範囲にすることも、移植膵島細胞の生存率を改善することの好ましい態様として挙げられる。
【００４３】
また、移植膵島細胞の生着率の改善を示す指標として、膵島細胞のインスリンの産生において、インスリンの前駆体であるプロインスリンからインスリンが生成する際に生じるＣペプチドの血漿中濃度を用いることも好ましい。移植膵島細胞の改善された生着率の値としては、具体的には、Ｃペプチドの血漿中濃度として下限としては０．５ｎｇ／ｍＬ以上が好ましく、０．７ｎｇ／ｍＬ以上がより好ましく、０．９ｎｇ／ｍＬがさらに好ましく、上限としては３．５ｎｇ／ｍＬ以下が好ましく、２．８ｎｇ／ｍＬ以下がより好ましく、２．２ｎｇ／ｍＬ以下がさらに好ましい。移植膵島細胞の生着率を上記の範囲にすることも、移植膵島細胞の生着率を改善することの好ましい態様として挙げられる。
【００４４】
本発明における移植膵島細胞の生存期間としては、具体的には、下限としては１ヶ月以上が好ましく、３ヶ月以上がより好ましく、６ヶ月以上がさらに好ましく、１年以上が特に好ましく、３年以上が最も好ましく、上限としては限定されることはないが、５年以下が好ましい。移植膵島細胞の生存期間を上記の範囲にすることも、移植膵島細胞の生存期間を延長することの好ましい態様として挙げられる。
【００４５】
本発明における移植の回数としては、具体的には上限として、３回以下が好ましく、２回以下がより好ましく、１回が最も好ましい。また、下限としては、限定されることはないが、１回以上が好ましい。また、再移植がないのが最も好ましい。
【００４６】
移植膵島細胞の生存期間としては、移植された膵島細胞がインスリンを産生しなくなるまでの期間として定義することが例示され、例えば、膵島移植後の血漿中Ｃペプチド濃度又は空腹時血糖値が異常値を示すまでの期間として評価することができる。血漿中Ｃペプチド濃度又は空腹時血糖値が異常値となった状態としては、血漿中Ｃペプチド濃度が０．３ｎｇ／ｍＬ以下、又は空腹時血糖値が２７０ｍｇ／ｄｌ以上である状態が例示される。
【００４７】
本発明における糖尿病患者としては、膵島移植を受ける糖尿病患者であっても膵島移植を受けた糖尿病患者であってもよい。前者の場合、膵島移植を受ける前に本発明の薬剤を糖尿病患者に投与すればよく、後者の場合、膵島移植を受けた後に本発明の薬剤を糖尿病患者に投与すればよい。また、「膵島移植を受ける糖尿病患者及び／又は膵島移植を受けた糖尿病患者」としては「膵島移植中の糖尿病患者」も含まれ、この場合膵島移植を行うのと同時に糖尿病患者に投与すればよい。
【００４８】
また、本発明における糖尿病患者としては、インスリン産生が高度に障害された糖尿病患者であれば特に限定されないが、Ｉ型糖尿病患者又はII型糖尿病患者が具体的な例として挙げられ、Ｉ型糖尿病患者が好ましい例として挙げられる。また、II型糖尿病患者が好ましい場合もある。インスリン産生の指標として、血漿中のインスリン濃度やＣペプチド濃度の異常が例示される。インスリン産生が高度に障害された状態としては、血漿中インスリン濃度が２μＵ／ｍＬ以下である状態が例示され、又は血漿中Ｃペプチド濃度が０．３ｎｇ／ｍＬ以下である状態が例示される。
【００４９】
本発明におけるトロンボモジュリンは、（１）トロンビンと選択的に結合して（２）トロンビンによるプロテインＣの活性化を促進する作用を有することが知られている。また、（３）トロンビンによる凝固時間を延長する作用、及び／又は（４）トロンビンによる血小板凝集を抑制する作用が通常認められることが好ましい。これらトロンボモジュリンの持つ作用をトロンボモジュリン活性と呼ぶことがある。トロンボモジュリン活性としては、上記（１）及び（２）の作用を有し、さらに上記（１）〜（４）の作用を全て備えていることが好ましい。
【００５０】
トロンビンによるプロテインＣの活性化を促進する作用は、例えば、特開昭６４−６２１９号公報を初めとする各種の公知文献に明確に記載された試験方法によりプロテインＣの活性化を促進する作用の活性量やその有無を容易に確認できるものである。また、トロンビンによる凝固時間を延長する作用、及び／又はトロンビンによる血小板凝集を抑制する作用についても同様に容易に確認できる。
【００５１】
本発明におけるトロンボモジュリンとしては、トロンボモジュリン活性を有していれば特に限定されないが、可溶性トロンボモジュリンであることが好ましい。可溶性トロンボモジュリンの溶解性の好ましい例示としては、水、例えば注射用蒸留水に対して（トリトンＸ−１００やポリドカノール等の界面活性剤の非存在下、通常は中性付近にて）、１ｍｇ／ｍＬ以上、又は１０ｍｇ／ｍＬ以上が挙げられ、好ましくは１５ｍｇ／ｍＬ以上、又は１７ｍｇ／ｍＬ以上が挙げられ、さらに好ましくは２０ｍｇ／ｍＬ以上、２５ｍｇ／ｍＬ以上、又は３０ｍｇ／ｍＬ以上が例示され、特に好ましくは６０ｍｇ／ｍＬ以上が挙げられ、場合によっては、８０ｍｇ／ｍＬ以上、又は１００ｍｇ／ｍＬ以上がそれぞれ挙げられる。可溶性トロンボモジュリンが溶解し得たか否かを判断するに当たっては、溶解した後に、例えば白色光源の直下、約１０００ルクスの明るさの位置で、肉眼で観察した場合に、澄明であって、明らかに認められるような程度の不溶性物質を含まないことが端的な指標となるものと理解される。また、濾過して残渣の有無を確認することもできる。
【００５２】
本発明におけるトロンボモジュリンとしては、ヒト型のトロンボモジュリンにおいてトロンボモジュリン活性の中心部位として知られている配列番号１の第１９〜１３２位のアミノ酸配列を包含していることが好ましく、配列番号１の第１９〜１３２位のアミノ酸配列を包含していれば特に限定されない。該配列番号１の第１９〜１３２位のアミノ酸配列は、トロンビンによるプロテインＣの活性化を促進する作用、すなわちトロンボモジュリン活性を有する限り自然又は人工的に変異していてもよく、すなわち配列番号１の第１９〜１３２位のアミノ酸配列において１つ又は複数のアミノ酸が置換、欠失、付加していても良い。許容される変異の程度は、トロンボモジュリン活性を有すれば特に限定されないが、例えばアミノ酸配列として５０％以上の相同性が例示され、７０％以上の相同性が好ましく、８０％以上の相同性がより好ましく、９０％以上の相同性がさらに好ましく、９５％以上の相同性が特に好ましく、９８％以上の相同性が最も好ましい。これらのようなアミノ酸配列を相同変異配列という。これらの変異については後述の通り、通常の遺伝子操作技術を用いれば容易に取得可能である。
【００５３】
配列番号３の配列は、配列番号１の第１２５位のアミノ酸であるＶａｌがＡｌａに変異したものであるが、本発明におけるトロンボモジュリンとして、配列番号３の第１９〜１３２位のアミノ酸配列を包含していることも好ましい。
【００５４】
このように本発明におけるトロンボモジュリンとしては、配列番号１もしくは配列番号３の第１９〜１３２位の配列、又はそれらの相同変異配列を少なくとも有し、少なくともトロンボモジュリン活性を有するペプチド配列を包含していれば特に限定されないが、配列番号１もしくは配列番号３のそれぞれにおける第１９〜１３２位もしくは第１７〜１３２位の配列からなるペプチド、又は上記配列の相同変異配列からなり少なくともトロンボモジュリン活性を有するペプチドが好ましい例として挙げられ、配列番号１もしくは配列番号３の第１９〜１３２位の配列からなるペプチドがより好ましい。また、配列番号１もしくは配列番号３のそれぞれにおける第１９〜１３２位もしくは第１７〜１３２位の相同変異配列からなり少なくともトロンボモジュリン活性を有するペプチドがより好ましい別の態様もある。
【００５５】
また本発明におけるトロンボモジュリンの別の態様として、配列番号５の第１９〜４８０位のアミノ酸配列を包含していることが好ましく、配列番号５の第１９〜４８０位のアミノ酸配列を包含していれば特に限定されない。該配列番号５の第１９〜４８０位のアミノ酸配列は、トロンビンによるプロテインＣの活性化を促進する作用、すなわちトロンボモジュリン活性を有する限りその相同変異配列であってもよい。
【００５６】
配列番号７の配列は、配列番号５の第４７３位のアミノ酸であるＶａｌがＡｌａに変異したものであるが、本発明におけるトロンボモジュリンとして、配列番号７の第１９〜４８０位のアミノ酸配列を包含していることも好ましい。
【００５７】
このように本発明におけるトロンボモジュリンとしては、配列番号５もしくは配列番号７の第１９〜４８０位の配列、又はそれらの相同変異配列を少なくとも有し、少なくともトロンボモジュリン活性を有するペプチド配列を包含していれば特に限定されないが、配列番号５もしくは配列番号７のそれぞれにおける第１９〜４８０位もしくは第１７〜４８０位の配列からなるペプチド、又は上記配列の相同変異配列からなり少なくともトロンボモジュリン活性を有するペプチドが好ましい例として挙げられ、配列番号５もしくは配列番号７の第１９〜４８０位の配列からなるペプチドがより好ましい。また、配列番号５もしくは配列番号７のそれぞれにおける第１９〜４８０位もしくは第１７〜４８０位の相同変異配列からなり少なくともトロンボモジュリン活性を有するペプチドがより好ましい別の態様もある。
【００５８】
また本発明におけるトロンボモジュリンの別の態様として、配列番号９の第１９〜５１５位のアミノ酸配列を包含していることが好ましく、配列番号９の第１９〜５１５位のアミノ酸配列を包含していれば特に限定されない。該配列番号９の第１９〜５１５位のアミノ酸配列は、トロンビンによるプロテインＣの活性化を促進する作用、すなわちトロンボモジュリン活性を有する限りその相同変異配列であってもよい。
【００５９】
配列番号１１の配列は、配列番号９の第４７３位のアミノ酸であるＶａｌがＡｌａに変異したものであるが、本発明におけるトロンボモジュリンとして、配列番号１１の第１９〜５１５位のアミノ酸配列を包含していることも好ましい。
【００６０】
このように本発明におけるトロンボモジュリンとしては、配列番号９もしくは配列番号１１の第１９〜５１５位の配列、又はそれらの相同変異配列を少なくとも有し、少なくともトロンボモジュリン活性を有するペプチド配列を包含していれば特に限定されないが、配列番号９もしくは配列番号１１のそれぞれにおける第１９〜５１６位、第１９〜５１５位、第１７〜５１６位、もしくは第１７〜５１５位の配列からなるペプチド、又は上記配列の相同変異配列からなり少なくともトロンボモジュリン活性を有するペプチドがより好ましい例として挙げられ、配列番号９における第１９〜５１６位、第１９〜５１５位、第１７〜５１６位、もしくは第１７〜５１５位の配列からなるペプチドが特に好ましい。これらの混合物も好ましい例として挙げられる。また、配列番号１１のそれぞれにおける第１９〜５１６位、第１９〜５１５位、第１７〜５１６位、もしくは第１７〜５１５位の配列からなるペプチドが特に好ましい別の態様もある。これらの混合物も好ましい例として挙げられる。さらにそれらの相同変異配列からなり、少なくともトロンボモジュリン活性を有するぺプチドも好ましい例として挙げられる。
【００６１】
相同変異配列を有するペプチドとは、上述した通りであるが、対象とするペプチドのアミノ酸配列中１つ以上、すなわち１つ又は複数のアミノ酸、さらに好ましくは数個（例えば１から２０個、好ましくは１から１０個、より好ましくは１から５個、特に好ましくは１から３個）のアミノ酸が置換、欠失、付加していてもよいペプチドをも意味する。許容される変異の程度は、トロンボモジュリン活性を有すれば特に限定されないが、例えばアミノ酸配列として５０％以上の相同性が例示され、７０％以上の相同性が好ましく、８０％以上の相同性がより好ましく、９０％以上の相同性がさらに好ましく、９５％以上の相同性が特に好ましく、９８％以上の相同性が最も好ましい。
【００６２】
さらに、本発明におけるトロンボモジュリンとしては、特開昭６４−６２１９における配列番号１４（４６２アミノ酸残基）からなるペプチド、配列番号８（２７２アミノ酸残基）からなるペプチド、又は配列番号６（２３６アミノ酸残基）からなるペプチドも好ましい例として挙げられる。
【００６３】
本発明におけるトロンボモジュリンとしては配列番号１又は配列番号３の第１９〜１３２位のアミノ酸配列を少なくとも有しているペプチドであれば特に限定されないが、その中でも配列番号５又は配列番号７の第１９〜４８０位のアミノ酸配列を少なくとも有しているペプチドであることが好ましく、配列番号９もしくは配列番号１１の第１９〜５１５位のアミノ酸配列を少なくとも有しているペプチドであることがより好ましい。配列番号９もしくは配列番号１１の第１９〜５１５位のアミノ酸配列を少なくとも有しているペプチドとしては、配列番号９もしくは配列番号１１のそれぞれにおける第１９〜５１６位、第１９〜５１５位、第１７〜５１６位、もしくは第１７〜５１５位の配列からなるペプチドがより好ましい例として挙げられる。また、配列番号９もしくは配列番号１１のそれぞれにおける第１９〜５１６位、第１９〜５１５位、第１７〜５１６位、もしくは第１７〜５１５位の配列からなるペプチドの、配列番号９もしくは配列番号１１それぞれについての混合物もより好ましい例として挙げられる。
【００６４】
上記混合物の場合、配列番号９もしくは配列番号１１のそれぞれにおける第１７位から始まるペプチドと第１９位から始まるペプチドの混合割合としては、（３０：７０）〜（５０：５０）が例示され、（３５：６５）〜（４５：５５）が好ましい例として挙げられる。
また、配列番号９もしくは配列番号１１のそれぞれにおける第５１５位で終わるペプチドと第５１６位で終わるペプチドの混合割合としては、（７０：３０）〜（９０：１０）が例示され、（７５：２５）〜（８５：１５）が好ましい例として挙げられる。
これらペプチドの混合割合は、通常の方法により求めることができる。
【００６５】
なお、配列番号１の第１９〜１３２位の配列は、配列番号９の第３６７〜４８０位の配列に相当し、配列番号５の第１９〜４８０位の配列は、配列番号９の第１９〜４８０位の配列に相当する。また、配列番号３の第１９〜１３２位の配列は、配列番号１１の第３６７〜４８０位の配列に相当し、配列番号７の第１９〜４８０位の配列は、配列番号１１の第１９〜４８０位の配列に相当する。さらに、配列番号１、３、５、７、９、及び１１のそれぞれにおける第１〜１８位の配列は、全て同一の配列である。
【００６６】
これら本発明におけるトロンボモジュリンは後述の通り、これらのペプチドをコードするＤＮＡ（具体的には、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、又は配列番号１２等の塩基配列）をベクターにより宿主細胞にトランスフェクトして調製された形質転換細胞より取得することができる。
【００６７】
さらに、これらのペプチドは、前記のアミノ酸配列を有すればよいのであって、糖鎖が付いていても、又付いていなくともよく、この点は特に限定されるものではない。また遺伝子操作においては、使用する宿主細胞の種類により、糖鎖の種類や、付加位置や付加の程度は相違するものであり、いずれも用いることができる。糖鎖の結合位置及び種類については、特開平１１−３４１９９０に記載の事実が知られており、本発明におけるトロンボモジュリンについても同様の位置に同様の糖鎖が付加する場合がある。後述の通り、遺伝子操作により取得することに特定されるものではないが、遺伝子操作により取得する場合には、発現に際して用いることができるシグナル配列としては、配列番号９の第１〜１８位のアミノ酸配列をコードする塩基配列、配列番号９の第１〜１６位のアミノ酸配列をコードする塩基配列、その他公知のシグナル配列、例えば、ヒト組織型プラスミノゲンアクチベーターのシグナル配列を利用することができる（国際公開８８／９８１１号公報）。
【００６８】
トロンボモジュリンをコードするＤＮＡ配列を宿主細胞へ導入する場合には、好ましくはトロンボモジュリンをコードするＤＮＡ配列を、ベクター、特に好ましくは、動物細胞において発現可能な発現ベクターに組み込んで導入する方法が挙げられる。発現ベクターとは、プロモーター配列、ｍＲＮＡにリボソーム結合部位を付与する配列、発現したい蛋白をコードするＤＮＡ配列、スプライシングシグナル、転写終結のターミネーター配列、複製起源配列などで構成されるＤＮＡ分子であり、好ましい動物細胞発現ベクターの例としては、Ｍｕｌｌｉｇａｎ ＲＣら［Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １９８１；７８：２０７２−２０７６］が報告しているｐＳＶ２−Ｘや、Ｈｏｗｌｅｙ ＰＭら［Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｍｚｙｍｏｌｏｇｙ １９８３；１０１：３８７−４０２、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ］が報告しているｐＢＰ６９Ｔ（６９−６）などが挙げられる。
【００６９】
これらのペプチドを製造するに際して用いることのできる宿主細胞としては、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＣＯＳ−１細胞、ＣＯＳ−７細胞、ＶＥＲＯ（ＡＴＣＣ ＣＣＬ−８１）細胞、ＢＨＫ細胞、イヌ腎由来ＭＤＣＫ細胞、ハムスターＡＶ−１２−６６４細胞等が、またヒト由来細胞としてＨｅＬａ細胞、ＷＩ３８細胞、ヒト２９３細胞が挙げられる。ＣＨＯ細胞が極めて一般的であり好ましく、ＣＨＯ細胞においては、ＤＨＦＲ−ＣＨＯ細胞がさらに好ましい。
【００７０】
また、遺伝子操作の過程やペプチドの製造過程において、大腸菌等の微生物も多く使われ、それぞれに適した宿主−ベクター系を使用することが好ましく、上述の宿主細胞においても、適宜のベクター系を選択することができる。遺伝子組換え技術に用いるトロンボモジュリンの遺伝子は、クローニングされており、そしてトロンボモジュリンの遺伝子組換え技術を用いた製造例が開示されており、さらにはその精製品を得るための精製方法も知られている［特開昭６４−６２１９号公報、特開平２−２５５６９９号公報、特開平５−２１３９９８号公報、特開平５−３１０７８７号公報、特開平７−１５５１７６号公報、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ １９８９；２６４：１０３５１−１０３５３］。したがって本発明で用いるトロンボモジュリンは、上記の報告に記載されている方法を用いることにより、あるいはそれらに記載の方法に準じることにより製造することができる。例えば特開昭６４−６２１９号公報では、全長のトロンボモジュリンをコードするＤＮＡを含むプラスミドｐＳＶ２ＴＭＪ２を含む、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ−１２ ｓｔｒａｉｎ ＤＨ５（ＡＴＣＣ寄託番号６７２８３号）が開示されている。また、この菌株を生命研（現独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センター）に再寄託した菌株（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＤＨ５／ｐＳＶ２ＴＭ Ｊ２）（ＦＥＲＭ ＢＰ−５５７０）を用いることもできる。この全長のトロンボモジュリンをコードするＤＮＡを原料として、公知の遺伝子操作技術によって、本発明のトロンボモジュリンを調製することができる。
【００７１】
本発明に用いられるトロンボモジュリンは、従来公知の方法又はそれに準じて調製すればよいが、例えば、前記山本らの方法［特開昭６４−６２１９号公報］、又は特開平５−２１３９９８号公報を参考にすることができる。すなわちヒト由来のトロンボモジュリン遺伝子を遺伝子操作技術により、例えば、配列番号９のアミノ酸配列をコードするＤＮＡとなし、さらに必要に応じた改変を行うことも可能である。この改変としては、例えば、配列番号１１のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ（具体的には、配列番号１２の塩基配列よりなる）となすために、配列番号９の第４７３位のアミノ酸をコードするコドン（特に、配列番号１０の第１４１８位の塩基）に、Ｚｏｌｌｅｒ ＭＪら［Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １９８３；１００：４６８−５００、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ］の方法に従って、部位特異的変異を行う。例えば、配列番号１０の第１４１８位の塩基Ｔは、配列番号１３に示された塩基配列を有する変異用合成ＤＮＡを用いて塩基Ｃに変換したＤＮＡとなすことができる。
【００７２】
このようにして調製したＤＮＡを、例えばチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞に組み込んで、形質転換細胞とし、適宜選択し、この細胞を培養して得た培養液から、公知の方法により精製されたトロンボモジュリンが製造できる。前述の通り配列番号９のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ（配列番号１０）を前記宿主細胞にトランスフェクトすることが好ましい。本発明に用いられるトロンボモジュリンの生産方法は、上記の方法に限定されるものではなく、例えば、尿や血液、その他体液等から抽出精製することでも可能であるし、またトロンボモジュリンを生産する組織又はこれら組織培養液等から抽出精製することも、また必要によりさらに蛋白分解酵素により切断処理することも可能である。
【００７３】
上記細胞培養方法により本発明におけるトロンボモジュリンを製造する場合、タンパク質の翻訳後修飾により、Ｎ末端アミノ酸に多様性が認められる場合がある。例えば、配列番号９における第１７位、１８位、１９位、もしくは２２位のアミノ酸がＮ末端となる場合がある。また、例えば第２２位のグルタミン酸がピログルタミン酸に変換されるように、Ｎ末端アミノ酸が修飾される場合もある。第１７位又は１９位のアミノ酸がＮ末端となることが好ましく、第１９位のアミノ酸がＮ末端となることがより好ましい。また、第１７位のアミノ酸がＮ末端となることが好ましい別の態様もある。以上の修飾や多様性等については配列番号１１についても同様な例が挙げられる。
【００７４】
さらに、配列番号１０の塩基配列を有するＤＮＡを用いてトロンボモジュリンを製造する場合、Ｃ末端アミノ酸の多様性が認められることがあり、１アミノ酸残基短いペプチドが製造される場合がある。すなわち、第５１５位のアミノ酸がＣ末端となり、さらに該第５１５位がアミド化されるといったように、Ｃ末端アミノ酸が修飾される場合がある。したがって、Ｎ末端アミノ酸とＣ末端アミノ酸が多様性に富んだペプチド、又はそれらの混合物が製造されることがある。第５１５位のアミノ酸がＣ末端となることが好ましい。また、第５１６位のアミノ酸がＣ末端になることが好ましい別の態様もある。以上の修飾や多様性等については配列番号１２の塩基配列を有するＤＮＡについても同様である。
【００７５】
上記方法で得られるトロンボモジュリンは、Ｎ末端及びＣ末端に多様性が認められるペプチドの混合物である場合がある。具体的は、配列番号９における第１９〜５１６位、第１９〜５１５位、第１７〜５１６位、もしくは第１７〜５１５位の配列からなるペプチドの混合物が挙げられる。
【００７６】
次いで上記により取得された培養上清、又は培養物からのトロンボモジュリンの単離精製方法は、公知の手法［堀尾武一編集、蛋白質・酵素の基礎実験法、１９８１］に準じて行うことができる。例えば、トロンボモジュリンと逆の電荷を持つ官能基を固定化したクロマトグラフィー担体と、トロンボモジュリンの間の相互作用を利用したイオン交換クロマトグラフィーや吸着クロマトグラフィーの使用も好ましい。また、トロンボモジュリンとの特異的親和性を利用したアフィニティークロマトグラフィーも好ましい例として挙げられる。吸着体の好ましい例として、トロンボモジュリンのリガンドであるトロンビンやトロンボモジュリンの抗体を利用する例が挙げられる。この抗体としては、適宜の性質、あるいは適宜のエピトープを認識するトロンボモジュリンの抗体を利用することができ、例えば、特公平５−４２９２０号公報、特開昭６４−４５３９８号公報、特開平６−２０５６９２号公報などに記載された例が挙げられる。また、トロンボモジュリンの分子量サイズを利用した、ゲル濾過クロマトグラフィーや限外濾過が挙げられる。そしてまた、疎水性基を固定化したクロマトグラフィー担体と、トロンボモジュリンのもつ疎水性部位との間の疎水結合を利用した疎水性クロマトグラフィーが挙げられる。また、吸着クロマトグラフィーとしてハイドロキシアパタイトを担体として用いることも可能であり、例えば、特開平９−１１０９００号公報に記載した例が挙げられる。これらの手法は適宜組み合わせることができる。精製の程度は、使用目的等により選択できるが、例えば電気泳動、好ましくはＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果が単一バンドとして得られるか、もしくは単離精製品のゲル濾過ＨＰＬＣ又は逆相ＨＰＬＣの結果が単一のピークになるまで純粋化することが望ましい。もちろん、複数種のトロンボモジュリンを用いる場合には、実質的にトロンボモジュリンのみのバンドになることが好ましいのであり、単一のバンドになることを求めるものではない。
【００７７】
本発明における精製法を具体的に例示すれば、トロンボモジュリン活性を指標に精製する法が挙げられ、例えばイオン交換カラムのＱ−セファロースＦａｓｔ Ｆｌｏｗで培養上清又は培養物を粗精製しトロンボモジュリン活性を有する画分を回収し、ついでアフィニティーカラムのＤＩＰ−トロンビン−アガロース（ｄｉｉｓｏｐｒｏｐｙｌｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌｔｈｒｏｍｂｉｎ ａｇａｒｏｓｅ）カラムで主精製しトロンボモジュリン活性が強い画分を回収し、回収画分を濃縮し、ゲル濾過にかけトロンボモジュリン活性画分を純品として取得する精製方法［Ｇｏｍｉ Ｋ ｅｔ ａｌ、Ｂｌｏｏｄ １９９０；７５：１３９６−１３９９］が挙げられる。指標とするトロンボモジュリン活性としては、例えばトロンビンによるプロテインＣ活性化の促進活性が挙げられる。その他に、好ましい精製法を例示すると以下の通りである。
【００７８】
トロンボモジュリンと良好な吸着条件を有する適当なイオン交換樹脂を選定し、イオン交換クロマト精製を行う。特に好ましい例としては、０．１８ｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌを含む０．０２ｍｏｌ／Ｌトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）で平衡化したＱ−セファロースＦａｓｔ Ｆｌｏｗを用いる方法である。適宜洗浄後、例えば０．３ｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ含む０．０２ｍｏｌ／Ｌトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）で溶出し粗精製品のトロンボモジュリンを得ることができる。
【００７９】
次に、例えばトロンボモジュリンと特異的親和性を持つ物質を樹脂に固定化しアフィニティークロマト精製を行うことができる。好ましい例としてＤＩＰ−トロンビン−アガロースカラムの例と、抗トロンボモジュリンモノクローナル抗体カラムの例が挙げられる。ＤＩＰ−トロンビン−アガロースカラムは、予め、例えば、１００ｍｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ及び０．５ｍｍｏｌ／Ｌ塩化カルシウムを含む２０ｍｍｏｌ／Ｌトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）で平衡化せしめ、上記の粗精製品をチャージして、適宜の洗浄を行い、例えば、１．０ｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ及び０．５ｍｍｏｌ／Ｌ塩化カルシウムを含む２０ｍｍｏｌ／Ｌトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）で溶出し精製品のトロンボモジュリンを取得することができる。また抗トロンボモジュリンモノクローナル抗体カラムにおいては、予めＣＮＢｒにより活性化したセファロース４ＦＦ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社）に、抗トロンボモジュリンモノクローナル抗体を溶解した０．５ｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ含有０．１ｍｏｌ／Ｌ ＮａＨＣＯ３緩衝液（ｐＨ８．３）に接触させ、セファロース４ＦＦに抗トロンボモジュリンモノクローナル抗体をカップリングさせた樹脂を充填したカラムを、予め例えば０．３ｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ含む２０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸塩緩衝液（ｐＨ７．３）で平衡化し、適宜の洗浄の後、例えば、０．３ｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ含む１００ｍｍｏｌ／Ｌグリシン塩酸緩衝液（ｐＨ３．０）にて溶出せしめる方法が例示される。溶出液は適当な緩衝液で中和し、精製品として取得することもできる。
【００８０】
次に得られた精製品をｐＨ３．５に調整した後に、０．３ｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌを含む１００ｍｍｏｌ／Ｌグリシン塩酸緩衝液（ｐＨ３．５）で平衡化した陽イオン交換体、好ましくは強陽イオン交換体であるＳＰ−セファロースＦＦ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社）にチャージし、同緩衝液で洗浄して得られた非吸着画分を得る。得られた画分は適当な緩衝液で中和し、高純度精製品として取得することができる。これらは、限外濾過により濃縮することが好ましい。
【００８１】
さらに、ゲル濾過による緩衝液交換を行うことも好ましい。例えば、５０ｍｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌを含む２０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸塩緩衝液（ｐＨ７．３）で平衡化せしめたＳｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ−３００カラムもしくはＳ−２００カラムに、限外濾過により濃縮した高純度精製品をチャージし、５０ｍｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌを含む２０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸塩緩衝液（ｐＨ７．３）で展開分画し、トロンビンによるプロテインＣ活性化の促進活性の確認を行って活性画分を回収し、緩衝液交換した高純度精製品を取得することができる。このようにして得られた高純度精製品は安全性を高めるために適当なウイルス除去膜、例えばプラノバ１５Ｎ（旭化成メディカル株式会社）を用いて濾過することが好ましく、その後限外濾過により目的の濃度まで濃縮することができる。最後に無菌濾過膜により濾過することが好ましい。
【００８２】
本発明の薬剤は、有効成分としてトロンボモジュリンを含有していれば特に限定されることはなく、必要に応じて膵島移植患者に使用される薬剤を単一又は複数の製剤として製造して使用することもできる。すなわち、本発明により、トロンボモジュリンと免疫抑制剤とを組み合わせてなる薬剤であって、該薬剤が膵島移植を受ける糖尿病患者及び／又は膵島移植を受けた糖尿病患者に投与され、膵島移植後の血糖値を正常化するための該薬剤、糖尿病を治療及び／又は改善するための該薬剤、膵島移植による糖尿病の治療及び／又は改善効果を補助するための該薬剤、膵島移植細胞の生着率を改善するための該薬剤、又は膵島移植細胞の生存期間を延長するための該薬剤が提供される。
【００８３】
免疫抑制剤としては、副腎皮質ステロイド、アルキル化剤、代謝拮抗剤、アルカロイド系薬剤、カルシニューリン阻害剤、サイクリン依存性カイネース阻害剤、抗胸腺細胞グロブリン、ＣＤ抗原に対するモノクローナル抗体であるプレドニゾロン、メチルプレドニゾロン、ハイドロコルチゾン、トリアムシノロン、ベタメサゾン、デキサメサゾン、シクロフォスファミド、メトトレキサート、アザチオプリン、ミコフェノレート、ミゾリビン、ビンクリスチン、ビンブラスチン、エトポシド、マイトマイシンＣ、シクロスポリン、タクロリムス、シロリムス、ラパマイシン、アトガム、チモグロブリン、Ｍｕｒｏｍｏｎａｂ−ＣＤ３、リツキシマブ、バシリキシマブ、ダクリツマブが例示され、ミコフェノレート、アザチオプリン、タクロリムス、シロリムス、ラパマイシン、バシキキシマブ、又はダクリツマブが好ましいがこれらに限定されるものではない。また、その他の免疫抑制剤として、インフリキシマブ、グスペリムス、又は抗リンパ球グロブリンも好ましい例として挙げられる。
【００８４】
本発明の、トロンボモジュリンと免疫抑制剤とを組み合わせてなる薬剤は、それぞれの成分が一つにまとめられて混合された配合剤の状態であってもよく、また、それぞれの成分が混合されておらず、複数の容器から別々に投与できる非混合的な組み合わせの状態であってもよい。
【００８５】
本発明のトロンボモジュリンと免疫抑制剤とを組み合わせてなる薬剤は、トロンボモジュリン及び免疫抑制剤の各活性成分の完全な混合物として同時に患者に投与することができる。また、本発明の該薬剤におけるトロンボモジュリン及び免疫抑制剤は、別々の成分として同時あるいは逐次に患者に投与することができる。逐次に投与する際、トロンボモジュリン及び免疫抑制剤の投与順序は問わないが、トロンボモジュリンの次に免疫抑制剤を投与することが好ましい。また、免疫抑制剤の次にトロンボモジュリンを投与するという好ましい別の態様もある。トロンボモジュリンは、膵島移植前又は膵島移植後、あるいは膵島移植中に投与することもできるが、膵島移植前又は膵島移植後に投与することが好ましく、膵島移植後に投与することがより好ましい。また、膵島移植前に投与することがより好ましい別の態様もある。さらに、膵島移植中に投与することがより好ましい場合もある。免疫抑制剤は、膵島移植中又は膵島移植後に投与することが好ましい。投与順序又は投与部位は、対象となる患者の状態に応じて適宜変化させることが可能である。
【００８６】
また、本発明により、トロンボモジュリン、免疫抑制剤、及び糖尿病治療薬とを組み合わせてなる薬剤であって、該薬剤が膵島移植を受ける糖尿病患者及び／又は膵島移植を受けた糖尿病患者に投与され、膵島移植後の血糖値を正常化するための該薬剤、糖尿病を治療及び／又は改善するための該薬剤、膵島移植による糖尿病の治療及び／又は改善効果を補助するための該薬剤、膵島移植細胞の生着率を改善するための該薬剤、又は膵島移植細胞の生存期間を延長するための該薬剤が提供される。
【００８７】
本発明の一成分として用いられる糖尿病治療薬としては、インスリン感受性増加剤（ＰＰＡＲγ作動薬）、インスリン分泌促進剤（ＳＵ剤、グリニド）、肝糖放出抑制剤、糖吸収遅延剤（α−グルコシダーゼ阻害剤）、ＤＰＰ−ＩＶ阻害剤、グルカゴン関連ペプチドであるピオグリタゾン、ロシグリタゾン、トログリタゾン、グリベンクラミド、グリクラジド、グリピザイド、グリメピリド、レパグリニド、ナテグリニド、ミチグリニド、メトフォルミン、ボグリボース、アカルボース、ビルダグリプチン、エクセナチド、又はリラグルチドが例示され、ビルダグリプチン、エクセナチド、又はリラグルチドが好ましい糖尿病治療薬として例示されるが、これらに限定されるものではない。
【００８８】
また、本発明の別の態様として、糖尿病治療薬としてインスリン又はインスリン誘導体を用いることも好ましい。インスリン及びインスリン誘導体としては、超速効型、速効型、混合型（二相性）、中間型、持効型として、インスリンリスプロ、インスリンアスパルト、インスリングルリシン、ヒトインスリン、ヒト中性インスリン、ヒトイソフェンインスリン、インスリングラルギン、又はインスリンデテミルが例示されるがこれらに限定されるものではない。これらの種類の薬剤を単独あるいは適宜組み合わせて使用することができる。
【００８９】
本発明の、トロンボモジュリン、免疫抑制剤、及び糖尿病治療薬とを組み合わせてなる薬剤は、それぞれの成分が一つにまとめられて混合された配合剤の状態であってもよく、また、それぞれの成分が混合されておらず、複数の容器から別々に投与できる非混合的な組み合わせの状態であってもよい。
【００９０】
本発明のトロンボモジュリン、免疫抑制剤、及び糖尿病治療薬とを組み合わせてなる薬剤は、トロンボモジュリン、免疫抑制剤、及び糖尿病治療薬の各活性成分の完全な混合物として同時に患者に投与することができる。また、本発明の該薬剤におけるトロンボモジュリン、免疫抑制剤、及び糖尿病治療薬は、別々の成分として同時あるいは逐次に患者に投与することができる。逐次に投与する際、糖尿病治療薬の投与順序は、糖尿病治療薬が膵島移植前又は膵島移植後に投与されれば特に限定されないが、トロンボモジュリン及び免疫抑制剤の投与後に糖尿病治療薬を投与することが好ましい。また、糖尿病治療薬の投与後にトロンボモジュリン及び免疫抑制剤を投与するのが好ましい別の態様もある。糖尿病治療薬は、膵島移植前又は膵島移植後、あるいは膵島移植中に投与することもできるが、膵島移植前又は膵島移植後に投与することが好ましい。投与順序又は投与部位は、対象となる患者の状態に応じて適宜変化させることが可能である。
【００９１】
本発明の薬剤は、担体を含有することができる。本発明で用いることのできる担体としては、水溶性の担体が好ましく、例えば、ショ糖、グリセリン等や、その他の無機塩のｐＨ調整剤等を添加剤として加えて調製することができる。さらに必要に応じて、特開平１−６２１９号公報及び特開平６−３２１８０５号公報に開示される通り、アミノ酸、塩類、糖質、界面活性剤、アルブミン、ゼラチン等を添加しても良いし、また、防腐剤を添加することも好ましく、例えば、パラ安息香酸エステル類が好ましい例として挙げられ、パラ安息香酸メチルが特に好ましい例として挙げられる。防腐剤の添加量は、通常０．０１〜１．０％（重量％を示す、以下同じ）が例示され、好ましくは０．１〜０．３％が挙げられる。これらの添加方法は特に限定されないが、凍結乾燥とする場合には、通常行われるように、例えば、免疫抑制剤、糖尿病治療薬から選ばれる少なくとも１つを含有する溶液とトロンボモジュリン含有溶液を混合した後、添加物を添加混合する方法や、又はあらかじめ添加物を水、注射用蒸留水あるいは適当な緩衝液に溶解した免疫抑制剤、糖尿病治療薬から選ばれる少なくとも１つに混合した後、トロンボモジュリン含有溶液を添加混合にする方法にて溶液を調製し、凍結乾燥する方法が挙げられる。本発明の薬剤が各薬剤成分を組み合わせてなる薬剤である場合には、各薬剤は、適宜の製造方法により担体を添加して製造することが好ましい。本発明の薬剤としては、注射液の形態で提供されても、また凍結乾燥製剤を使用時に溶解して使用する形態で提供されてもよい。
【００９２】
製剤化工程においては、アンプル又はバイアルに、水、注射用蒸留水あるいは適当な緩衝液１ｍＬあたり０．０５〜１５ｍｇ、好適には０．１〜５ｍｇのトロンボモジュリンと、抗血小板剤、抗血液凝固剤、又は血栓溶解剤の何れか１つと上記添加物を含有する溶液を、例えば０．５〜１０ｍＬ充填した後に凍結し、減圧下のもとで乾燥する方法が例示される。又はそのままに水溶液注射用製剤として調製できる。
【００９３】
本発明の薬剤は、非経口投与法、例えば静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与などによって投与することが望ましい。また経口投与、直腸内投与、鼻内投与、舌下投与なども可能である。本発明の薬剤が各薬剤成分を組み合わせてなる薬剤である場合には、それぞれの薬剤成分はは、適宜の投与方法により投与することが好ましい。
【００９４】
静脈内投与の場合、一度に所望の量を投与する方法又は点滴静脈内投与が挙げられる。
一度に所望の量を投与する方法は投与時間が短い点で好ましい。一度に投与する場合には、注射器での投与に要する時間に通常幅があるが、投与に要する時間としては、投与する液量にもよるが、通常は２分以下が好ましく、１分以下がより好ましく、３０秒以下がさらに好ましい。また下限としては特に限定されないが、１秒以上が好ましく、５秒以上がより好ましく、１０秒以上がさらに好ましい。投与量は上記の好ましい投与量であれば特に限定されない。また、点滴静脈内投与はトロンボモジュリンの血中濃度を一定に保つことが容易な点で好ましい。
【００９５】
本発明における薬剤の１日の投与量は、患者の年齢、体重、疾患の程度、投与経路などによっても異なるが、一般的にトロンボモジュリンの量として、上限としては２０ｍｇ／ｋｇ以下が好ましく、１０ｍｇ／ｋｇ以下がより好ましく、５ｍｇ／ｋｇ以下がさらに好ましく、２ｍｇ／ｋｇ以下が特に好ましく、１ｍｇ／ｋｇ以下が最も好ましく、下限としては０．００１ｍｇ／ｋｇ以上が好ましく、０．００５ｍｇ／ｋｇ以上がより好ましく、０．０１ｍｇ／ｋｇ以上がさらに好ましく、０．０２ｍｇ／ｋｇ以上が特に好ましく、０．０５ｍｇ／ｋｇ以上が最も好ましい。
【００９６】
点滴静脈内投与の場合、上記の好ましい投与量であれば特に限定されないが、１日の投与量の上限としては１ｍｇ／ｋｇ以下が好ましく、０．５ｍｇ／ｋｇ以下がより好ましく、０．１ｍｇ／ｋｇ以下がさらに好ましく、０．０８ｍｇ／ｋｇ以下が特に好ましく、０．０６ｍｇ／ｋｇ以下が最も好ましく、下限としては０．００５ｍｇ／ｋｇ以上が好ましく、０．０１ｍｇ／ｋｇ以上がより好ましく、０．０２ｍｇ／ｋｇ以上がさらに好ましく、０．０４ｍｇ／ｋｇ以上が特に好ましい。
【００９７】
１日あたり１回又は必要に応じて数回投与する。投与間隔は、２日から１４日に１回、好ましくは２日から７日に１回、さらに好ましくは３日から５日に１回にとすることも可能である。
【００９８】
かくして取得されたトロンボモジュリンを含有する本発明の薬剤を、Ｉ型糖尿病マウスに対する膵島細胞の同種同系移植の際に投与したところ、ランゲルハンス島β細胞の機能障害に起因する血糖値の上昇に対して優れた予防及び治療効果が認められた。すなわち、これらのモデル動物に対する効果から、本発明の薬剤は、Ｉ型糖尿病患者に対する膵島移植において、移植時の細胞生着率の向上、及びこれに伴う移植細胞数の軽減可能となる移植補助剤として有用であることが確認された。上述のように本発明の薬剤を製造するに際しては、有効量のトロンボモジュリンを医薬上許容される担体と混合する公知の方法により調製すればよい。
【００９９】
本発明の薬剤は、出血しやすい糖尿病患者が膵島移植を受ける際にも出血のリスクを高めることなく安全かつ高い効果を示すことができる点で非常に有用である。該有用性は、本発明の薬剤の有効成分であるトロンボモジュリンが出血を助長することなく、逆に出血症状を改善することが報告されている（Ｓａｉｔｏ Ｈら、Ｊ Ｔｈｒｏｍｂ Ｈａｅｍｏｓｔ ２００７；５：３１−４１）ことからも裏付けることができる。出血のリスクの評価方法として、血漿に本発明の薬剤を加えた検体を用いて凝固時間（例えば、Ｍｏｈｒｉ Ｍら（Ｍｏｈｒｉ Ｍ ｅｔ ａｌ、Ｔｈｒｏｍｂ Ｈａｅｍｏｓｔ １９９９； ８２： １６８７−９３）に記載の活性化部分トロンボプラスチン時間（ＡＰＴＴ））の測定が例示される。また、膵島移植における出血状態の評価方法として、血液（輸血）や血漿製剤の使用量を指標とすることが例示される。
【０１００】
本発明の薬剤は、膵島移植の特長である手術侵襲が少なくかつ短時間に行われるという利便性を損なうことなく使用することができる点においても有用である。また、上述のように本発明の薬剤は出血のリスクを高めることがないため、投与量が適正であることを評価するための検査が不要である。投与量が適正であることを評価する方法としては、上述の凝固時間法を指標とした出血リスクの評価方法が例示される。
【０１０１】
［配列表の説明］
配列番号１：ＴＭＥ４５６の生産に用いた遺伝子がコードするアミノ酸配列
配列番号２：配列番号１のアミノ酸配列をコードする塩基配列
配列番号３：ＴＭＥ４５６Ｍの生産に用いた遺伝子がコードするアミノ酸配列
配列番号４：配列番号３のアミノ酸配列をコードする塩基配列
配列番号５：ＴＭＤ１２の生産に用いた遺伝子がコードするアミノ酸配列
配列番号６：配列番号５のアミノ酸配列をコードする塩基配列
配列番号７：ＴＭＤ１２Ｍの生産に用いた遺伝子がコードするアミノ酸配列
配列番号８：配列番号７のアミノ酸配列をコードする塩基配列
配列番号９：ＴＭＤ１２３の生産に用いた遺伝子がコードするアミノ酸配列
配列番号１０：配列番号９のアミノ酸配列をコードする塩基配列
配列番号１１：ＴＭＤ１２３Ｍの生産に用いた遺伝子がコードするアミノ酸配列
配列番号１２：配列番号１１のアミノ酸配列をコードする塩基配列
配列番号１３：部位特異的変異を行う際に使用する変異用合成ＤＮＡ
【実施例】
【０１０２】
以下、実施例及び試験例により本発明を具体的に説明するが、本発明は何らこれらによって限定されるものではない。
試験例に用いる本発明におけるトロンボモジュリンは、前記山本らの方法（特開昭６４−６２１９号に記載の方法）に従って製造した。以下にその製造例を示す。なお、今回の製造例で得られたトロンボモジュリンは、ラット及びサルを用いた単回及び反復静脈内投与試験、マウス生殖試験、局所刺激性試験、安全性薬理試験、ウイルス不活化試験などによりその安全性が確認されている。
【０１０３】
［製造例１］
＜トロンボモジュリンの取得＞
上記の方法、すなわち、配列番号９のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ（具体的には、配列番号１０の塩基配列よりなる）を、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞にトランスフェクションして、この形質転換細胞の培養液より前述した定法の精製法にて、５０ｍｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌを含む２０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸塩緩衝液（ｐＨ７．３）で活性画分を回収した高純度精製品を取得した。さらに限外濾過を行って濃度が１１．２ｍｇ／ｍＬのトロンボモジュリン（以下、ＴＭＤ１２３と略すことがある）溶液を取得した。
＜添加剤溶液調製＞
１０Ｌのステンレス製容器に、塩酸アルギニン（味の素社製）４８０ｇを量り入れ、注射用水を５Ｌ加えて溶解した。１ｍｏｌ／Ｌ水酸化ナトリウム溶液を添加して、ｐＨを７．３に調整した。
【０１０４】
＜薬液調製・充填 ＞
上記添加剤溶液全量を２０Ｌのステンレス製容器に入れ、上記得られたＴＭＤ１２３溶液２３９８ｍＬ（可溶性トロンボモジュリンのたん白質量として２６.８８ｇに相当。ただし１２％過量仕込み。）加え混合攪拌した。さらに注射用水を加えて全量を１２Ｌとして均一に混合撹拌した。この薬液を、孔径が０．２２μｍのフィルター（ミリポア製ＭＣＧＬ１０Ｓ）で濾過滅菌した。濾過液を１ｍＬずつバイアルに充填し、ゴム栓を半打栓した。
【０１０５】
＜凍結乾燥＞
凍結乾燥→窒素充填→ゴム栓全打栓→キャップ巻締めの順で以下の条件にて凍結乾燥工程を行い、１容器中に可溶性トロンボモジュリン２ｍｇ、塩酸アルギニン４０ｍｇを含むＴＭＤ１２３含有製剤を得た。
＜凍結乾燥条件＞
予備冷却（１５分かけて室温から１５℃）→ 本冷却（２時間かけて１５℃から−４５℃）→ 保持（２時間 −４５℃）→ 真空開始（１８時間 −４５℃）→ 昇温（２０時間かけて−４５℃から２５℃）→ 保持（１５時間２５℃）→ 昇温（１時間かけて２５℃から４５℃）→ 保持（５時間４５℃）→ 室温（２時間かけて４５℃から２５℃）→ 復圧窒素充填（−１００ｍｍＨｇまで）→ 全打栓 → キャップ巻締め
【０１０６】
［製造例２］
配列番号１１のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ（具体的には、配列番号１２の塩基配列よりなる）を、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞にトランスフェクションして、この形質転換細胞の培養液より前述した定法の精製法にて精製されたトロンボモジュリン（以下、ＴＭＤ１２３Ｍと略すことがある）溶液を取得し、上記と同様の方法によりＴＭＤ１２３Ｍの凍結乾燥製剤を取得する。
【０１０７】
［製造例３］
配列番号１のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ（具体的には、配列番号２の塩基配列よりなる）を、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞にトランスフェクションして、この形質転換細胞の培養液より前述した定法の精製法にて精製されたトロンボモジュリン（以下、ＴＭＥ４５６と略すことがある）を取得し、上記と同様の方法によりＴＭＥ４５６の凍結乾燥製剤を取得する。
【０１０８】
［製造例４］
配列番号３のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ（具体的には、配列番号４の塩基配列よりなる）を、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞にトランスフェクションして、この形質転換細胞の培養液より前述した定法の精製法にて精製されたトロンボモジュリン（以下、ＴＭＥ４５６Ｍと略すことがある）を取得し、上記と同様の方法によりＴＭＥ４５６Ｍの凍結乾燥製剤を取得する。
【０１０９】
［製造例５］
配列番号５のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ（具体的には、配列番号６の塩基配列よりなる）を、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞にトランスフェクションして、この形質転換細胞の培養液より前述した定法の精製法にて精製されたトロンボモジュリン（以下、ＴＭＤ１２と略すことがある）を取得し、上記と同様の方法によりＴＭＤ１２の凍結乾燥製剤を取得する。
【０１１０】
［製造例６］
配列番号７のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ（具体的には、配列番号８の塩基配列よりなる）を、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞にトランスフェクションして、この形質転換細胞の培養液より前述した定法の精製法にて精製されたトロンボモジュリン（以下、ＴＭＤ１２Ｍと略すことがある）を取得し、上記と同様の方法によりＴＭＤ１２Ｍの凍結乾燥製剤を取得する。
【０１１１】
［試験例１］
＜I型糖尿病マウスに対する膵島細胞の同種同系移植＞
雄性Ｃ５７ＢＬ／６マウス（チャールスリバー、７〜１０週齢）にストレプトゾシン（シグマ）を１８０ｍｇ／ｋｇ投与し、ランゲルハンス島β細胞の機能を特異的に低下させたＩ型糖尿病マウスモデルを作成した。ストレプトゾトシン投与３日後に、Ｓｕｔｔｏｎ Ｒらの方法（Ｓｕｔｔｏｎ Ｒ ｅｔ ａｌ、Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ １９８６；４２：６８９−６９１）を参考にコラゲナーゼ処理後、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｃｏｎｒａｙを用いた密度勾配遠心法（Ｏｋｅｄａ Ｔ ｅｔ ａｌ、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ Ｊｐｎ １９７９；２６：４９５−４９９）を用いてＣ５７ＢＬ／６マウスから分離した膵島細胞２００個を経門脈的に肝内に同種同系移植した。移植したマウスを群分し、一方の試験群には、生理食塩液を急速投与した。もう一方の試験群には、トロンボモジュリン（ＴＭＤ１２３、１０ｍｇ／ｋｇ）を膵島移植の直前、移植後１２時間並びに２４時間にそれぞれ１回ずつ静脈内に急速投与した。膵島移植前及び移植後（週２ないし３回）に、尾静脈からヘパリン加採血し、得られた血漿中の血糖値をオートアナライザー（ベックマン）を用いて測定した。その結果、生理食塩液投与群（図１）では、膵島細胞２００個では血糖値は正常化しなかったが、トロンボモジュリンの投与により血糖値は正常化した（図２）。トロンボモジュリンが移植後膵島グラフトの障害を防ぎ、血糖値をコントロールすることが示された。
【図面の簡単な説明】
【０１１２】
【図１】ストレプトゾトシン誘発I型糖尿病マウスに対する同種同系膵島移植における生理食塩液投与群（Ｎ＝５）の術後血糖値の推移を示す図である。ストレプトゾトシン誘発I型糖尿病マウスに、同種同系マウス（Ｃ５７ＢＬ／６）から単離した膵島２００個を、経門脈的肝内移植したもの。同系移植（Ｓｙｎｇｅｎｉｃ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔｓ）であり、この系では同種移植拒絶反応は発現しない。縦軸は非空腹時血糖値、横軸は移植後日数を示す。生理食塩液投与群の空腹時血糖値は上昇したままであることを示している。
【図２】ストレプトゾトシン誘発I型糖尿病マウスに対する同種同系膵島移植におけるトロンボモジュリン（ＴＭＤ１２３）投与群（Ｎ＝５）の術後血糖値の推移を示す図である。ストレプトゾトシン誘発I型糖尿病マウスに、同種同系マウス（Ｃ５７ＢＬ／６）から単離した膵島２００個を、経門脈的肝内移植したもの。同系移植（Ｓｙｎｇｅｎｉｃ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔｓ）であり、この系では同種移植拒絶反応は発現しない。縦軸は非空腹時血糖値、横軸は移植後日数を示す。ＴＭＤ１２３（１０ｍｇ／ｋｇ）、移植直前、１２時間、２４時間後の３回投与によって、移植後の血糖値が正常化することを示している。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、糖尿病患者における膵島移植の際に使用される薬剤であって、トロンボモジュリンを主たる有効成分とし、糖尿病を治療及び／又は改善するための薬剤、又は膵島移植による糖尿病の治療及び／又は改善効果を補助するための薬剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
糖尿病は、身体が炭水化物、脂肪、及びタンパク質を適正に維持および使用することができなくなる慢性の複雑な代謝疾患である。種々の遺伝及び環境因子により、インスリン産生の欠損またはその作用低下により引き起こされる血中グルコースの高レベルを特徴とする。１９９７年に旧厚生省が行った糖尿病実態調査によると、糖尿病が強く疑われる人は６９０万人、糖尿病の可能性を否定できない人６８０万人を加えると、約１，３７０万人がリスク群と推定されている。ＷＨＯの推定する全世界の糖尿病人口は、２０００年で約１億５千万人であり、２０２５年では約３億人に達すると予測されている。
【０００３】
糖尿病は、進行すると網膜症、腎症、及び神経障害などの合併症を引き起こし、また、脳卒中、虚血性心疾患の発症・進展を促進し、患者のＱＯＬを著しく低下させる。１９９８年に行われた日本透析医学会の調査によると、１９９８年の１年間で新たに透析導入となった患者の内、３５．７％は糖尿病性腎症が原因であり、１９８３年の２倍以上に増加していた。また、１９８８年に行われた旧厚生省の視覚障害の疾病調査研究によれば、糖尿病性網膜症により年間３千人が視覚障害となっている。このように、糖尿病は社会的な大きな問題となっており、糖尿病撲滅は欧米と同様に本邦においても重要な課題となっている。
【０００４】
糖尿病の多くの症例は、若年者に多く発症するＩ型、及び成人に多く発症するＩＩ型に分類され、約５〜１０％の糖尿病患者がＩ型である。Ｉ型糖尿病は、自己免疫の異常によってインスリンを産生する膵β細胞が特異的に破壊されることで発症する（非特許文献１）。そのため、糖尿病患者は、生死に関わる高血糖（高血糖症）合併症を予防するために、外部からのインシュリン注射に依存している。血糖測定とインスリン投与（インスリン集中治療）という非常に厳格な治療法を忠実に守らない限り、高血糖症に起因する慢性的で長期間にわたる器官損傷合併症を防ぐことはできない。インスリン集中治療は、インスリンの過剰投与によって、致命的ともなり得る急性かつ重篤な意識変容状態を伴う急性低血糖症のリスクを増加させる。インスリン療法はＩ型糖尿病において速やかな死という緊急の問題を解決し、現在どの患者に対しても提供され得るものであるという点においてその果たしている役割は非常に大きい。しかし、一方でＩ型糖尿病に対する根本的治療法とはなりえず、低血糖の危険性、長期合併症といった非常に困難な問題が残っている。
【０００５】
Ｉ型糖尿病の根本的治療法として、膵臓又は膵臓と腎臓を同時に移植して、膵島β細胞の再生置換療法が行われている。移植によって非常に厳格な血糖調節を可能とし、低血糖さらには長期合併症の発症を回避することである。単にインスリン集中療法による日常の煩わしさから患者を開放させるだけでなく、Ｉ型糖尿病の治癒が期待される治療法である。しかしながら、膵臓移植では手術侵襲が大きいこと、また付随して移植される外分泌腺による合併症が重度となりうるなどの問題がある。
【０００６】
後腹膜に存在する膵臓は、外分泌腺と内分泌腺から構成されている。膵臓全容積の９８％以上を外分泌腺が占め、内分泌腺は２％以下である。１８６９年ランゲルハンスによって見いだされた内分泌腺組織は、膵島と呼ばれる。膵島は内分泌細胞の集団であり、α細胞、β細胞、ＰＰ細胞、δ細胞などからなっている。体内のホルモンで唯一血糖を下げる作用をもつインスリンは膵島のβ細胞から分泌される。この膵島を膵臓から単離し、Ｉ型糖尿病の患者に移植することにより、一旦廃絶した血糖降下システムの置換再生を目指すのが膵島移植である。
【０００７】
膵島移植は、ドナーから摘出した膵臓を酵素処理して膵島細胞を分離した後、患者の門脈に膵島細胞を注入する。手術による開腹及び血管の吻合は不要で侵襲が極めて小さいため、糖尿病患者にとってより安全であり、血管病変の進行により膵臓移植の適応外になった患者でも実施可能である。また、門脈循環にインスリンが放出されるため、生理学的にも有利である。さらに、分離膵島の凍結保存によるいわゆるバンキングも可能であるなど、膵臓移植と比較して多くの利点を有している。
【０００８】
Ｉ型糖尿病では、インスリン療法による血糖調節が非常に困難であるため、膵島移植が最も有効な治療法と考えられている。また、ＩＩ型糖尿病の治療においても、積極的にインスリン療法が用いられている。これは、インスリンを投与することにより、患者自身の膵島β細胞を休息させ、それによりβ細胞の機能が回復してくるのを待つという考え方からであり、近年積極的に導入され好結果が報告されている。このことは、ＩＩ型糖尿病においても病期が進むと糖毒性やβ細胞の疲弊によってインスリンの不足を来すので、ＩＩ型糖尿病は現在のところ膵島移植の適応とはなっていないが、将来、移植膵島を多量に供給し得る状況となった場合には、インスリン抵抗性を契機としたインスリン依存型糖尿病もその適応となる可能性は充分にある。
【０００９】
このように、膵島移植の臨床研究までに発展した理由としては、主として大動物を用いて膵臓から大量に膵島を分離する方法が開発されたことが大きい。１９８４年、Ｒｉｃｏｒｄｉらによって独自の自動膵島分離装置が考案され、ブタ又はヒトの膵臓から膵島を大量に分離することが可能となった（非特許文献２）。膵島移植に利用される膵島の分離、調製法としては、特許文献１に記載されている。
【００１０】
実験的医療の段階から始まった膵島移植は、当初成績が芳しくなかったが、１９９９年３月からカナダのエドモントンにあるアルバータ大学において、エドモントンプロトコール（Ｅｄｍｏｎｔｏｎ Ｐｒｏｔｏｃｏｌ）と呼ばれる免疫抑制剤の斬新な使用法を用いた膵島移植が実施され、膵島移植施行７例全例が Ｉ型糖尿病症例で日常的なインスリン投与から離脱することが報告され（非特許文献３）、このプロトコールを用いた他施設共同治験が行われるようになった。
【００１１】
Ｉ型糖尿病の治療法として膵島移植の有用性は高まってきているが、移植を成功させる上で大量の膵島細胞の輸注が必要なこと、また質の高い膵島細胞を得るため状態の良い膵臓を用意することが課題となっている。２００６年にＳｈａｐｉｒｏ ＡＭらによってエドモントンプロトコールを用いて膵島移植を受けた患者の転帰について報告され（非特許文献４）、膵島移植によってインスリン治療が不要となった患者の内、移植後２年の時点でインスリンの治療を再開した患者が７６％になっていた。これらのことから、Ｉ型糖尿病患者の根治療法としての膵島移植において、更なる改善が望まれている。
【００１２】
一方、トロンボモジュリンは、トロンビンと特異的に結合しトロンビンの血液凝固活性を阻害すると同時にトロンビンのプロテインＣ活性化能を著しく促進する作用を有する物質として知られ、強力な血液凝固阻害作用を有することが知られている。トロンビンによる凝固時間を延長することや、トロンビンによる血小板凝集を抑制することが知られている。プロテインＣは、血液凝固線溶系において重要な役割を演じているビタミンＫ依存性の蛋白質であり、トロンビンの作用により活性化され、活性化プロテインＣとなる。この活性化プロテインＣは、生体内で血液凝固系因子の活性型第Ｖ因子、及び活性型第ＶＩＩＩ因子を失活させ、また血栓溶解作用を有するプラスミノゲンアクチベーターの産生に関与していることが知られている（非特許文献５）。したがって、トロンボモジュリンは、このトロンビンによるプロテインＣの活性化を促進して抗血液凝固剤又は血栓溶解剤として有用であるとされており、凝固亢進を伴う疾患の治療、予防に有効であるという動物実験についての報告もある（非特許文献６）。
【００１３】
従来、トロンボモジュリンは、ヒトをはじめとする種々の動物種の血管内皮細胞上に発現している糖蛋白質として発見取得され、その後、クローニングに成功した。即ち、遺伝子工学的手法を用いてヒト肺ｃＤＮＡライブラリーからシグナルペプチドを含むヒトトロンボモジュリン前駆体の遺伝子をクローニングし、そしてトロンボモジュリンの全遺伝子配列を解析し、シグナルペプチド（通常は、１８アミノ酸残基が例示される）を含む５７５残基のアミノ酸配列が明らかにされている（特許文献２）。シグナルペプチドが切断されたマチュアなトロンボモジュリンは、そのマチュアなペプチドのＮ末端側よりＮ末端領域（１−２２６番目：シグナルペプチドが１８アミノ酸残基であると考えた場合の位置表示、以下同じ）、６つのＥＧＦ様構造をもつ領域（２２７−４６２番目）、Ｏ型糖鎖付加領域（４６３−４９８番目）、膜貫通領域（４９９−５２１番目）、そして細胞質内領域（５２２−５５７番目）の５つの領域から構成されている。全長のトロンボモジュリンと同じ活性を有する部分（すなわち、最小活性単位）は、６つのＥＧＦ様構造を持つ領域のうち、主としてＮ末端側から４，５，６番目のＥＧＦ様構造からなる部分であることが知られている（非特許文献７）。
【００１４】
全長のトロンボモジュリンは界面活性剤の存在下でないと溶解し難く、製剤としては界面活性剤の添加が必須であるのに対して、界面活性剤の非存在下でもきれいに溶解することができる可溶性トロンボモジュリンが存在する。可溶性トロンボモジュリンは、少なくとも、膜貫通領域の一部又は全部を含有せしめないように調製すればよく、例えば、Ｎ末端領域と６つのＥＧＦ様構造をもつ領域とＯ型糖鎖付加領域の３つの領域のみからなる（即ち、配列番号９の第１９〜５１６位のアミノ酸配列からなる）可溶性トロンボモジュリンは、組換え技術の応用により取得できること、そしてその組換え体可溶性トロンボモジュリンは、天然のトロンボモジュリンの活性を有していることが確認されている（特許文献２）。他に可溶性トロンボモジュリンの例としていくつかの報告がある（特許文献３〜１０）。あるいは天然型としてヒト尿由来の可溶性トロンボモジュリン等も例示される（特許文献１１、１２）。
【００１５】
因みに、遺伝子においては、自然の変異又は取得時の変異により、多くのケースで認められる通り、ヒトにおいても多形性の変異が見つけられており、上述の５７５残基のアミノ酸配列からなるヒトトロンボモジュリン前駆体の第４７３位のアミノ酸においてＶａｌであるものと、Ａｌａであるものが現在確認されている。このアミノ酸をコードする塩基配列においては、第１４１８位において、それぞれＴとＣとの変異に相当する（非特許文献８）。しかし、活性及び物性においては、全く相違なく、両者は実質的に同一と考えることができる。
【００１６】
従来トロンボモジュリンの用途として、例えば、心筋梗塞、血栓症（例えば、急性期又は慢性期の脳血栓症、動脈又は静脈の急性又は慢性の末梢血栓症など）、塞栓症（例えば、急性期又は慢性期の脳塞栓症、動脈又は静脈の急性又は慢性の末梢塞栓症など）、末梢血管閉塞症（例えば、バージャー病、レイノー病など）、閉塞性動脈硬化症、心臓手術に続発する機能性障害、移植臓器の合併症、血管内血液凝固症候群（ＤＩＣ）、狭心症、一過性脳虚血発作、妊娠中毒症、肝ＶＯＤ（Ｌｉｖｅｒ ｖｅｎｏ−ｏｃｃｌｕｓｉｖｅ ｄｉｓｅａｓｅ；劇症肝炎や骨髄移植後の肝静脈閉塞症）、深部静脈血栓症（ＤＶＴ；Ｄｅｅｐ ｖｅｎｏｕｓ ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ）等の疾患の治療及び予防に用いられることが期待されている。また、血栓症やＤＩＣなどの凝固亢進を伴う疾患以外の疾患に対する適用として、肝臓障害（特許文献１３）、吸収性骨疾患（特許文献１４）、創傷治癒（特許文献１５）などが挙げられる。さらにトロンボモジュリンを他の有効成分と併用する用途として、創傷治癒（特許文献１６）及び脳組織の保護（特許文献１７）などが開示されている。
【００１７】
【特許文献１】特表平２−５０４２２２２号公報
【特許文献２】特開昭６４−６２１９号公報
【特許文献３】特開平２−２５５６９９号公報
【特許文献４】特開平３−１３３３８０号公報
【特許文献５】特開平３−２５９０８４号公報
【特許文献６】特開平４−２１０７００号公報
【特許文献７】特開平５−２１３９９８号公報
【特許文献８】ＷＯ９２／００３２５号公報
【特許文献９】ＷＯ９２／０３１４９号公報
【特許文献１０】ＷＯ９３／１５７５５号公報
【特許文献１１】特開平３−８６９００号公報
【特許文献１２】特開平３−２１８３９９号公報
【特許文献１３】特開平８−３０６５号公報
【特許文献１４】特開平８−３０１７８３号公報
【特許文献１５】特開平９−２０６７７号公報
【特許文献１６】米国特許第５，９７６，５２３号明細書
【特許文献１７】米国特許第５，８２７，８３２号明細書
【非特許文献１】Ａｔｋｉｎｓｏｎ ＭＡ ｅｔ ａｌ、Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ １９９４；３３１：１４２８−１４３６
【非特許文献２】Ｒｉｃｏｒｄｉ Ｃ ｅｔ ａｌ、Ｄｉａｂｅｔｅｓ １９８８；３７：４１３−４２０
【非特許文献３】Ｓｈａｐｉｒｏ ＡＭ ｅｔ ａｌ、Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ２０００；３４３：２３０−２３８
【非特許文献４】Ｓｈａｐｉｒｏ ＡＭ ｅｔ ａｌ、Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ２００６；３５５： １３７２−４
【非特許文献５】鈴木宏治、医学のあゆみ １９８３；１２５：９０１
【非特許文献６】Ｇｏｍｉ Ｋ ｅｔ ａｌ、 Ｂｌｏｏｄ １９９０；７５：１３９６−１３９９
【非特許文献７】Ｚｕｓｈｉ Ｍ ｅｔ ａｌ、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ １９８９；２４６：１０３５１−１０３５３
【非特許文献８】Ｗｅｎ ＤＺ ｅｔ ａｌ、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １９８７；２６：４３５０−４３５７
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１８】
本発明の課題は、糖尿病患者の膵島移植後の血糖値を正常化するためのより治療効果の高い薬剤、又は糖尿病患者の膵島移植後の血糖値を正常化する方法を提供することにある。本発明の別の課題は、糖尿病患者の膵島移植において移植膵島細胞の生着率をより効果的に改善する薬剤、糖尿病患者の膵島移植において移植した膵島細胞の生存期間を延長する薬剤、又はそれらの方法を提供することにある。さらには本発明の別の課題は、膵島移植を受けた糖尿病患者の糖尿病の病状をより治療及び／又は改善するためのより治療効果の高い薬剤、又はその治療及び／又は改善方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１９】
近年、Ｉ型糖尿病の根本治療としての膵島移植は、技術的な進歩によって治療成績が向上しているが、大量の膵島細胞を必要とすること、また移植後インスリン治療からの離脱が長期間にわたって維持しないため、複数回の膵島移植が必要であり、膵島移植方法の改善による治療成績の更なる向上が求められている。本発明者らは、移植した膵島細胞の生着率の改善に着眼し、これを満足させる薬剤を見出すべく鋭意研究した結果、驚くべきことに、従来試みられることのなかったトロンボモジュリンを投与することにより、移植膵島細胞の生着率を著しく改善する効果があることを見出した。また、トロンボモジュリンを投与することにより膵島移植後の膵島移植細胞の生存期間を延長させることができることを見出した。さらには、トロンボモジュリンを投与することにより膵島移植後の血糖値を正常化することができることを見出し、これら個々の知見に基づいて本発明を完成するに至った。すなわち、本発明はトロンボモジュリンを主たる有効成分として含有し、膵島移植を受ける糖尿病患者及び／又は膵島移植を受けた糖尿病患者に投与され、膵島移植後の血糖値を正常化するための薬剤に関する。本発明の薬剤は、糖尿病の根治療法として期待される膵島移植に際して投与することにより移植された膵島細胞の生着率を著しく高めることができると共に、インスリン分泌を正常化し、膵島移植後の膵島移植細胞の生存期間を延長することが可能となる。また、膵島移植後の糖尿病患者の血糖値を正常化し、糖尿病をより効果的に治療及び／又は改善することが可能となる。
【００２０】
すなわち、本発明として具体的には以下のものが挙げられる。
〔１〕トロンボモジュリンを有効成分とする薬剤であって、該薬剤が、膵島移植を受ける糖尿病患者及び／又は膵島移植を受けた糖尿病患者に投与され、膵島移植後の血糖値を正常化するための該薬剤；
〔１−２〕トロンボモジュリンを有効成分とする薬剤であって、該薬剤が膵島移植を受ける糖尿病患者及び／又は膵島移植を受けた糖尿病患者に投与されることにより糖尿病を治療及び／又は改善するための該薬剤；
〔１−３〕トロンボモジュリンを有効成分とする薬剤であって、該薬剤が膵島移植を受ける糖尿病患者及び／又は膵島移植を受けた糖尿病患者に投与され、膵島移植による糖尿病の治療及び／又は改善効果を補助するための該薬剤；
〔１−４〕トロンボモジュリンを有効成分とする薬剤であって、該薬剤が膵島移植を受ける糖尿病患者及び／又は膵島移植を受けた糖尿病患者に投与され、移植膵島細胞の生着率を改善するための該薬剤；
〔１−５〕トロンボモジュリンを有効成分とする薬剤であって、該薬剤が膵島移植を受ける糖尿病患者及び／又は膵島移植を受けた糖尿病患者に投与され、移植膵島細胞の生存期間を延長するための該薬剤；
〔１−６〕トロンボモジュリンを有効成分とする薬剤であって、該薬剤が膵島移植を受ける糖尿病患者及び／又は膵島移植を受けた糖尿病患者に投与され、膵島移植後の血漿中インスリン濃度を正常化するための該薬剤；
【００２１】
〔２〕該トロンボモジュリンが、可溶性トロンボモジュリンである前記〔１〕〜〔１−６〕のいずれかに記載の薬剤；
【００２２】
〔３〕該トロンボモジュリンが、配列番号１、３、５、７、９又は配列番号１１に記載のアミノ酸配列をコードするＤＮＡを宿主細胞にトランスフェクトして調製された形質転換細胞より取得されるペプチドである、前記〔１〕〜〔２〕のいずれかに記載の薬剤；
なお、前記〔１〕〜〔２〕のように引用する項番号が範囲で示され、その範囲内に〔１−２〕等の枝番号を有する項が配置されている場合には、〔１−２〕等の枝番号を有する項も引用されることを意味する。以下においても同様である。
〔３−２〕該トロンボモジュリンが、配列番号１又は配列番号３に記載のアミノ酸配列をコードするＤＮＡを宿主細胞にトランスフェクトして調製された形質転換細胞により取得されるペプチドである、前記〔１〕〜〔２〕のいずれかに記載の薬剤；
〔３−３〕該トロンボモジュリンが、配列番号５又は配列番号７に記載のアミノ酸配列をコードするＤＮＡを宿主細胞にトランスフェクトして調製された形質転換細胞により取得されるペプチドである、前記〔１〕〜〔２〕のいずれかに記載の薬剤；
〔３−４〕該トロンボモジュリンが、配列番号９又は配列番号１１に記載のアミノ酸配列をコードするＤＮＡを宿主細胞にトランスフェクトして調製された形質転換細胞により取得されるペプチドである、前記〔１〕〜〔２〕のいずれかに記載の薬剤；
【００２３】
〔４〕該トロンボモジュリンが、配列番号１もしくは配列番号３のそれぞれにおける第１９〜１３２位の配列を有するペプチド、上記配列の相同変異配列を有しトロンボモジュリン活性を有するペプチド、又はそれらの混合物のいずれかである前記〔１〕〜〔２〕、又は〔３−２〕のいずれかに記載の薬剤；
〔４−２〕該トロンボモジュリンが、配列番号１もしくは配列番号３のそれぞれにおける第１９〜１３２位の配列を有するペプチド、又は上記配列の相同変異配列を有しトロンボモジュリン活性を有するペプチドである前記〔１〕〜〔２〕、又は〔３−２〕のいずれかに記載の薬剤；
〔４−３〕該トロンボモジュリンが、配列番号１もしくは配列番号３のそれぞれにおける第１９〜１３２位の配列を有するペプチドである前記〔１〕〜〔２〕、又は〔３−２〕のいずれかに記載の薬剤；
〔４−４〕該トロンボモジュリンが、配列番号１もしくは配列番号３のそれぞれにおける第１９〜１３２位もしくは第１７〜１３２位の配列を有するペプチド、上記配列の相同変異配列を有しトロンボモジュリン活性を有するペプチド、又はそれらの混合物のいずれかである前記〔１〕〜〔２〕、又は〔３−２〕のいずれかに記載の薬剤；
〔４−５〕該トロンボモジュリンが、配列番号１もしくは配列番号３のそれぞれにおける第１９〜１３２位もしくは第１７〜１３２位の配列を有するペプチド又はそれらの混合物である前記〔１〕〜〔２〕、又は〔３−２〕のいずれかに記載の薬剤；
〔４−６〕該トロンボモジュリンが、配列番号１における第１９〜１３２位もしくは第１７〜１３２位の配列を有するペプチド又はそれらの混合物である前記〔１〕〜〔２〕、又は〔３−２〕のいずれかに記載の薬剤；
〔４−７〕該トロンボモジュリンが、配列番号３における第１９〜１３２位もしくは第１７〜１３２位の配列を有するペプチド又はそれらの混合物である前記〔１〕〜〔２〕、又は〔３−２〕のいずれかに記載の薬剤；
〔４−８〕該トロンボモジュリンが、配列番号１における第１９〜１３２位もしくは第１７〜１３２位の配列からなるペプチド又はそれらの混合物である前記〔１〕〜〔２〕、又は〔３−２〕のいずれかに記載の薬剤；
〔４−９〕該トロンボモジュリンが、配列番号３における第１９〜１３２位もしくは第１７〜１３２位の配列からなるペプチド又はそれらの混合物である前記〔１〕〜〔２〕、又は〔３−２〕のいずれかに記載の薬剤；
【００２４】
〔５〕該トロンボモジュリンが、配列番号５もしくは配列番号７のそれぞれにおける第１９〜４８０位の配列を有するペプチド、上記配列の相同変異配列を有しトロンボモジュリン活性を有するペプチド、又はそれらの混合物のいずれかである前記〔１〕〜〔２〕、又は〔３−３〕のいずれかに記載の薬剤；
〔５−２〕該トロンボモジュリンが、配列番号５もしくは配列番号７のそれぞれにおける第１９〜４８０位の配列を有するペプチド、又は上記配列の相同変異配列を有しトロンボモジュリン活性を有するペプチドである前記〔１〕〜〔２〕、又は〔３−３〕のいずれかに記載の薬剤；
〔５−３〕該トロンボモジュリンが、配列番号５もしくは配列番号７のそれぞれにおける第１９〜４８０位の配列を有するペプチドである前記〔１〕〜〔２〕、又は〔３−３〕のいずれかに記載の薬剤；
〔５−４〕該トロンボモジュリンが、配列番号５もしくは配列番号７のそれぞれにおける第１９〜４８０位もしくは第１７〜４８０位の配列を有するペプチド、上記配列の相同変異配列を有しトロンボモジュリン活性を有するペプチド、又はそれらの混合物のいずれかである前記〔１〕〜〔２〕、又は〔３−３〕のいずれかに記載の薬剤；
〔５−５〕該トロンボモジュリンが、配列番号５もしくは配列番号７のそれぞれにおける第１９〜４８０位もしくは第１７〜４８０位の配列を有するペプチド又はそれらの混合物である前記〔１〕〜〔２〕、又は〔３−３〕のいずれかに記載の薬剤；
〔５−６〕該トロンボモジュリンが、配列番号５における第１９〜４８０位もしくは第１７〜４８０位の配列を有するペプチド又はそれらの混合物である前記〔１〕〜〔２〕、又は〔３−３〕のいずれかに記載の薬剤；
〔５−７〕該トロンボモジュリンが、配列番号７における第１９〜４８０位もしくは第１７〜４８０位の配列を有するペプチド又はそれらの混合物である前記〔１〕〜〔２〕、又は〔３−３〕のいずれかに記載の薬剤；
〔５−８〕該トロンボモジュリンが、配列番号５における第１９〜４８０位もしくは第１７〜４８０位の配列からなるペプチド又はそれらの混合物である前記〔１〕〜〔２〕、又は〔３−３〕のいずれかに記載の薬剤；
〔５−９〕該トロンボモジュリンが、配列番号７における第１９〜４８０位もしくは第１７〜４８０位の配列からなるペプチド又はそれらの混合物である前記〔１〕〜〔２〕、又は〔３−３〕のいずれかに記載の薬剤；
【００２５】
〔６〕該トロンボモジュリンが、配列番号９もしくは配列番号１１のそれぞれにおける第１９〜５１６位の配列を有するペプチド、前記ペプチドのアミノ酸配列の１つ又は複数のアミノ酸が置換、欠失、又は付加されたアミノ酸配列を有しトロンボモジュリン活性を有するペプチド、又はそれらの混合物のいずれかである前記〔１〕〜〔２〕、又は〔３−４〕のいずれかに記載の薬剤；
〔６−２〕該トロンボモジュリンが、配列番号９もしくは配列番号１１のそれぞれにおける第１９〜５１６位の配列を有するペプチド、又は前記ペプチドのアミノ酸配列の１つ又は複数のアミノ酸が置換、欠失、又は付加されたアミノ酸配列を有しトロンボモジュリン活性を有するペプチドである前記〔１〕〜〔２〕、又は〔３−４〕のいずれかに記載の薬剤；
〔６−３〕該トロンボモジュリンが、配列番号９もしくは配列番号１１のそれぞれにおける第１９〜５１６位の配列を有するペプチドである前記〔１〕〜〔２〕又は〔３−４〕のいずれかに記載の薬剤；
〔６−４〕該トロンボモジュリンが、配列番号９もしくは配列番号１１のそれぞれにおける第１９〜５１６位、第１９〜５１５位、第１７〜５１６位、もしくは第１７〜５１５位の配列を有するペプチド、上記配列の相同変異配列を有しトロンボモジュリン活性を有するペプチド、又はそれらの混合物である前記〔１〕〜〔２〕、又は〔３−４〕のいずれかに記載の薬剤；
〔６−５〕該トロンボモジュリンが、配列番号９もしくは配列番号１１のそれぞれにおける第１９〜５１６位、第１９〜５１５位、第１７〜５１６位、もしくは第１７〜５１５位の配列を有するペプチド、又はそれらの混合物である前記〔１〕〜〔２〕、又は〔３−４〕のいずれかに記載の薬剤；
〔６−６〕該トロンボモジュリンが、配列番号９における第１９〜５１６位、第１９〜５１５位、第１７〜５１６位、もしくは第１７〜５１５位の配列を有するペプチド、又はそれらの混合物である前記〔１〕〜〔２〕、又は〔３−４〕のいずれかに記載の薬剤；
〔６−７〕該トロンボモジュリンが、配列番号１１における第１９〜５１６位、第１９〜５１５位、第１７〜５１６位、もしくは第１７〜５１５位の配列を有するペプチド、又はそれらの混合物である前記〔１〕〜〔２〕、又は〔３−４〕のいずれかに記載の薬剤；
〔６−８〕該トロンボモジュリンが、配列番号９における第１９〜５１６位、第１９〜５１５位、第１７〜５１６位、もしくは第１７〜５１５位の配列からなるペプチド、又はそれらの混合物である前記〔１〕〜〔２〕、又は〔３−４〕のいずれかに記載の薬剤；
〔６−９〕該トロンボモジュリンが、配列番号９における第１９〜５１６位、第１９〜５１５位、第１７〜５１６位、もしくは第１７〜５１５位の配列からなるペプチドである前記〔１〕〜〔２〕、又は〔３−４〕のいずれかに記載の薬剤；
〔６−１０〕該トロンボモジュリンが、配列番号１１における第１９〜５１６位、第１９〜５１５位、第１７〜５１６位、もしくは第１７〜５１５位の配列からなるペプチド、又はそれらの混合物である前記〔１〕〜〔２〕、又は〔３−４〕のいずれかに記載の薬剤；
〔６−１１〕該トロンボモジュリンが、配列番号１１における第１９〜５１６位、第１９〜５１５位、第１７〜５１６位、もしくは第１７〜５１５位の配列からなるペプチドである前記〔１〕〜〔２〕、又は〔３−４〕のいずれかに記載の薬剤；
【００２６】
〔７〕前記〔１〕、又は〔２〕〜〔６−１１〕のいずれかに記載の薬剤と免疫抑制剤とを組み合わせてなる薬剤であって、該薬剤が膵島移植を受ける糖尿病患者及び／又は膵島移植を受けた糖尿病患者に投与され、膵島移植後の血糖値を正常化するための該薬剤；
〔７−２〕前記〔１〕、又は〔２〕〜〔６−１１〕のいずれかに記載の薬剤、免疫抑制剤、及び糖尿病治療薬とを組み合わせてなる薬剤であって、該薬剤が膵島移植を受ける糖尿病患者及び／又は膵島移植を受けた糖尿病患者に投与され、膵島移植後の血糖値を正常化するための該薬剤；
〔７−３〕前記〔１−２〕、又は〔２〕〜〔６−１１〕のいずれかに記載の薬剤と免疫抑制剤とを組み合わせてなる薬剤であって、該薬剤が膵島移植を受ける糖尿病患者及び／又は膵島移植を受けた糖尿病患者に投与されることにより糖尿病を治療及び／又は改善するための該薬剤；
〔７−４〕前記〔１−２〕、又は〔２〕〜〔６−１１〕のいずれかに記載の薬剤、免疫抑制剤、及び糖尿病治療薬とを組み合わせてなる薬剤であって、該薬剤が膵島移植を受ける糖尿病患者及び／又は膵島移植を受けた糖尿病患者に投与されることにより糖尿病を治療及び／又は改善するための該薬剤；
〔７−５〕前記〔１−３〕、又は〔２〕〜〔６−１１〕のいずれかに記載の薬剤と免疫抑制剤とを組み合わせてなる薬剤であって、該薬剤が膵島移植を受ける糖尿病患者及び／又は膵島移植を受けた糖尿病患者に投与され、膵島移植による糖尿病の治療及び／又は改善効果を補助するための該薬剤；
〔７−６〕前記〔１−３〕、又は〔２〕〜〔６−１１〕のいずれかに記載の薬剤と免疫抑制剤とを組み合わせてなる薬剤であって、該薬剤が膵島移植を受ける糖尿病患者及び／又は膵島移植を受けた糖尿病患者に投与され、膵島移植による糖尿病の治療及び／又は改善効果を補助するための該薬剤；
〔７−７〕前記〔１−４〕、又は〔２〕〜〔６−１１〕のいずれかに記載の薬剤と免疫抑制剤とを組み合わせてなる薬剤であって、該薬剤が膵島移植を受ける糖尿病患者及び／又は膵島移植を受けた糖尿病患者に投与され、移植膵島細胞の生着率を改善するための該薬剤；
〔７−８〕前記〔１−４〕、又は〔２〕〜〔６−１１〕のいずれかに記載の薬剤、免疫抑制剤、及び糖尿病治療薬とを組み合わせてなる薬剤であって、該薬剤が膵島移植を受ける糖尿病患者及び／又は膵島移植を受けた糖尿病患者に投与され、移植膵島細胞の生着率を改善するための該薬剤；
〔７−９〕前記〔１−５〕、又は〔２〕〜〔６−１１〕のいずれかに記載の薬剤と免疫抑制剤とを組み合わせてなる薬剤であって、該薬剤が膵島移植を受ける糖尿病患者及び／又は膵島移植を受けた糖尿病患者に投与され、移植膵島細胞の生存期間を延長するための該薬剤；
〔７−１０〕前記〔１−５〕、又は〔２〕〜〔６−１１〕のいずれかに記載の薬剤、免疫抑制剤、及び糖尿病治療薬とを組み合わせてなる薬剤であって、該薬剤が膵島移植を受ける糖尿病患者及び／又は膵島移植を受けた糖尿病患者に投与され、移植膵島細胞の生存期間を延長するための該薬剤；
〔７−１１〕前記〔１−６〕、又は〔２〕〜〔６−１１〕のいずれかに記載の薬剤と免疫抑制剤とを組み合わせてなる薬剤であって、該薬剤が膵島移植を受ける糖尿病患者及び／又は膵島移植を受けた糖尿病患者に投与され、膵島移植後の血漿中インスリン濃度を正常化するための該薬剤；
〔７−１２〕前記〔１−６〕、又は〔２〕〜〔６−１１〕のいずれかに記載の薬剤、免疫抑制剤、及び糖尿病治療薬とを組み合わせてなる薬剤であって、該薬剤が膵島移植を受ける糖尿病患者及び／又は膵島移植を受けた糖尿病患者に投与され、膵島移植後の血漿中インスリン濃度を正常化するための該薬剤；
【００２７】
〔８〕膵島移植を受ける糖尿病患者が、Ｉ型糖尿病患者である前記〔１〕〜〔７−１２〕のいずれかに記載の薬剤；
【００２８】
〔１’〕膵島移植を受ける糖尿病患者及び／又は膵島移植を受けた糖尿病患者にトロンボモジュリンを投与することを含む、膵島移植後の血糖値を正常化する方法；
〔２’〕該トンボモジュリンが、可溶性トロンボモジュリンである前記〔１’〕に記載の方法；
〔３’〕該トロンボモジュリンが、配列番号９又は１１に記載のアミノ酸配列をコードするＤＮＡを宿主細胞にトランスフェクトして調製された形質転換細胞より取得されたペプチドである、前記〔１’〕又は〔２’〕に記載の方法；
〔４’〕該トロンボモジュリンが、配列番号９もしくは配列番号１１のそれぞれにおける第１９〜５１６位の配列を有するペプチド、又は上記配列の相同変異配列を有しトロンボモジュリン活性を有するペプチドのいずれかである前記〔１’〕又は〔２’〕に記載の方法；
【００２９】
〔５’〕膵島移植を受ける糖尿病患者及び／又は膵島移植を受けた糖尿病患者にトロンボモジュリン及び免疫抑制剤を投与することを含む、膵島移植後の血糖値を正常化する方法；
〔５’−２〕膵島移植を受ける糖尿病患者及び／又は膵島移植を受けた糖尿病患者にトロンボモジュリン、免疫抑制剤、及び糖尿病治療薬を投与することを含む、膵島移植後の血糖値を正常化する方法；
【００３０】
〔６’〕膵島移植を受ける糖尿病患者が、Ｉ型糖尿病患者である前記〔１’〕〜〔５’−２〕のいずれかに記載の方法；
〔７’〕前記〔１’〕に記載の方法であって、前記〔１〕〜〔８〕のいずれかに記載の特徴を有する該方法；
〔８’〕膵島移植を受ける糖尿病患者及び／又は膵島移植を受けた糖尿病患者にトロンボモジュリンを投与することを含む、糖尿病を治療及び／又は改善する方法；
〔８’−２〕前記〔８’〕に記載の方法であって、前記〔１〕〜〔８〕のいずれかに記載の特徴を有する方法；
【００３１】
〔９’〕膵島移植を受ける糖尿病患者及び／又は膵島移植を受けた糖尿病患者にトロンボモジュリンを投与することを含む、膵島移植による糖尿病の治療及び／又は改善効果を補助する方法；
〔９’−２〕前記〔９’〕に記載の方法であって、前記〔１〕〜〔８〕のいずれかに記載の特徴を有する該方法；
〔１０’〕膵島移植を受ける糖尿病患者及び／又は膵島移植を受けた糖尿病患者にトロンボモジュリンを投与することを含む、移植膵島細胞の生着率を改善する方法；
〔１０’−２〕前記〔１０’〕に記載の方法であって、前記〔１〕〜〔８〕のいずれかに記載の特徴を有する該方法；
【００３２】
〔１１’〕膵島移植を受ける糖尿病患者及び／又は膵島移植を受けた糖尿病患者にトロンボモジュリンを投与することを含む、移植膵島細胞の生存期間を延長する方法；
〔１１’−２〕前記〔１１’〕に記載の方法であって、前記〔１〕〜〔８〕のいずれかに記載の特徴を有する該方法；
〔１２’〕膵島移植を受ける糖尿病患者及び／又は膵島移植を受けた糖尿病患者にトロンボモジュリンを投与することを含む、膵島移植後の血漿中インスリン濃度を正常化する方法；
〔１２’−２〕前記〔１２’〕に記載の方法であって、前記〔１〕〜〔８〕のいずれかに記載の特徴を有する該方法；
【００３３】
〔１３’〕膵島移植を受ける糖尿病患者及び／又は膵島移植を受けた糖尿病患者にトロンボモジュリンを投与することを含む、膵島移植による糖尿病の治療及び／又は改善効果を補助する方法；
〔１３’−２〕前記〔１３’〕に記載の方法であって、前記〔１〕〜〔８〕のいずれかに記載の特徴を有する方法。
【発明の効果】
【００３４】
本発明のトロンボモジュリンを含有する薬剤を膵島移植を受ける糖尿病患者及び／又は膵島移植を受けた糖尿病患者に用いることにより、糖尿病患者の膵島移植後の血糖値を正常化することができ、本発明の方法によれば糖尿病患者の膵島移植後の血糖値を効果的に正常化することができる。また、本発明のトロンボモジュリンを含有する薬剤により、膵島移植後の移植膵島細胞の生着率を改善することができ、移植膵島細胞の生存期間を延長することができる。さらには血漿中のインスリン濃度を正常化することができ、糖尿病をより効果的に治療及び／又は改善することが可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３５】
以下、本発明を具体的に説明する。
本発明において、膵島移植としては、上述した通り内因性インスリンが枯渇した患者や腎不全を合併した患者等に行われる膵臓単独移植又は膵腎同時移植が具体的な例として挙げられる。本発明の薬剤も、上述した膵島移植に用いることができる。
【００３６】
本発明における膵島移植方法としては、１）ドナーから摘出した膵臓を酵素処理し、２）細胞分離機で膵島細胞だけを取り出し、３）患者の門脈に膵島細胞を注入、移植するという方法が好ましい例として挙げられる。
【００３７】
本発明における血糖値としては、血漿中における血糖値が挙げられる。また、血糖値を正常化することとしては、糖尿病の病状が改善されていると判断できる状態に血糖値を低下させることであれば特に限定されないが、例えば、血糖値を低下させてインスリンの投与量が減じられた状態を維持させること、又は血糖値を低下させてインスリン投与が不要である状態を維持させることが具体的な例として挙げられ、血糖値を低下させてインスリン投与が不要である状態を維持させることが好ましい。また、通常インスリンは、体重１ｋｇあたり０．２５単位以下で投与されることが好ましく、０．１単位以下で投与されることが好ましいが、血糖値が正常化された状態ではインスリンの投与量が上記の好ましい投与量よりも少ない量で済むか、又はインスリンの投与が不要となる場合がある。
【００３８】
正常化された血糖値は、通常１０〜１４時間絶食した後に採血して得られた血漿中の血糖値（空腹時血糖値）、又は７５ｇのブドウ糖を服用した後の血糖値（以下、ブドウ糖負荷試験血糖値と呼ぶことがある）によって例示される。ブドウ糖負荷試験血糖値は、ブドウ糖を服用して１時間ないしは２時間後に採血して得られた血漿中の血糖値が好ましい例として用いられ、より好ましくは２時間後の血糖値が用いられる。具体的には、空腹時血糖値の上限としては、１６０ｍｇ／ｄＬ以下が好ましく、１４０ｍｇ／ｄＬ以下がより好ましく、１３０ｍｇ／ｄＬ以下がさらに好ましく、１１０ｍｇ／ｄＬ以下が特に好ましく、下限として は６０ｍｇ／ｄＬ以上が好ましく、７０ｍｇ／ｄＬ以上がより好ましく、８０ｍｇ／ｄＬ以上が最も好ましい。また、ブドウ糖負荷試験血糖値としては、例えばブドウ糖負荷後２時間における血糖値の上限として、２２０ｍｇ／ｄＬ以下が好ましく、２００ｍｇ／ｄＬ以下がより好ましく、１８０ｍｇ／ｄＬ以下がさらに好ましく、１４０ｍｇ／ｄＬ以下が特に好ましく、下限としては、６０ｍｇ／ｄＬ以上が好ましく、７０ｍｇ／ｄＬ以上がより好ましく、８０ｍｇ／ｄＬ以上がさらに好ましい。血糖値を上記の範囲にすることも、血糖値を正常化することの好ましい態様として挙げられる。
【００３９】
本発明における、膵島移植による糖尿病の治療及び／又は改善効果を補助することとしては、膵島移植により糖尿病の治療を行うにあたり本発明の薬剤を用いることにより、糖尿病の治療及び／又は改善効果を高めること、又は糖尿病の治療及び／又は改善の確率を高めることが挙げられる。また、糖尿病それ自体を治療及び／又は改善することを意味する場合もある。
【００４０】
本発明における移植膵島細胞の生着としては、膵島移植において導入された細胞が導入臓器において生存することが挙げられ、生着率は、導入した細胞がある時点でどの程度生存しているかを示す１つの指標として挙げられる。
【００４１】
移植膵島細胞の生着率の改善を示す指標としては、移植された膵島細胞のインスリン産生能とインスリン産生に基づく血糖値の低下を組み合わせて評価するＨｏｍｅｏｓｔａｔｉｃ ｍｏｄｅｌ ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ ｏｆ β−ｃｅｌｌ ｆｕｎｃｔｉｏｎ（以下、ＨＯＭＡ−β値と呼ぶことがある）が例示され、以下の式で算出することができる。すなわち、ＨＯＭＡ−β値（％）＝２０×ＦＰＩ÷（ＦＰＧ−３．５）である。ここでＦＰＩは空腹時の血漿インスリン濃度（μＵ／ｍＬ）、ＦＰＧは空腹時血糖値（ｍｍｏｌ／Ｌ）を示す。
【００４２】
移植膵島細胞の改善された生着率の値としては、具体的には、ＨＯＭＡ−β値として下限としては４０％以上が好ましく、６０％以上がより好ましく、８０％以上がさらに好ましく、上限としては限定されることはないが、１００％以下が好ましい。移植膵島細胞の生存率を上記の範囲にすることも、移植膵島細胞の生存率を改善することの好ましい態様として挙げられる。
【００４３】
また、移植膵島細胞の生着率の改善を示す指標として、膵島細胞のインスリンの産生において、インスリンの前駆体であるプロインスリンからインスリンが生成する際に生じるＣペプチドの血漿中濃度を用いることも好ましい。移植膵島細胞の改善された生着率の値としては、具体的には、Ｃペプチドの血漿中濃度として下限としては０．５ｎｇ／ｍＬ以上が好ましく、０．７ｎｇ／ｍＬ以上がより好ましく、０．９ｎｇ／ｍＬがさらに好ましく、上限としては３．５ｎｇ／ｍＬ以下が好ましく、２．８ｎｇ／ｍＬ以下がより好ましく、２．２ｎｇ／ｍＬ以下がさらに好ましい。移植膵島細胞の生着率を上記の範囲にすることも、移植膵島細胞の生着率を改善することの好ましい態様として挙げられる。
【００４４】
本発明における移植膵島細胞の生存期間としては、具体的には、下限としては１ヶ月以上が好ましく、３ヶ月以上がより好ましく、６ヶ月以上がさらに好ましく、１年以上が特に好ましく、３年以上が最も好ましく、上限としては限定されることはないが、５年以下が好ましい。移植膵島細胞の生存期間を上記の範囲にすることも、移植膵島細胞の生存期間を延長することの好ましい態様として挙げられる。
【００４５】
本発明における移植の回数としては、具体的には上限として、３回以下が好ましく、２回以下がより好ましく、１回が最も好ましい。また、下限としては、限定されることはないが、１回以上が好ましい。また、再移植がないのが最も好ましい。
【００４６】
移植膵島細胞の生存期間としては、移植された膵島細胞がインスリンを産生しなくなるまでの期間として定義することが例示され、例えば、膵島移植後の血漿中Ｃペプチド濃度又は空腹時血糖値が異常値を示すまでの期間として評価することができる。血漿中Ｃペプチド濃度又は空腹時血糖値が異常値となった状態としては、血漿中Ｃペプチド濃度が０．３ｎｇ／ｍＬ以下、又は空腹時血糖値が２７０ｍｇ／ｄｌ以上である状態が例示される。
【００４７】
本発明における糖尿病患者としては、膵島移植を受ける糖尿病患者であっても膵島移植を受けた糖尿病患者であってもよい。前者の場合、膵島移植を受ける前に本発明の薬剤を糖尿病患者に投与すればよく、後者の場合、膵島移植を受けた後に本発明の薬剤を糖尿病患者に投与すればよい。また、「膵島移植を受ける糖尿病患者及び／又は膵島移植を受けた糖尿病患者」としては「膵島移植中の糖尿病患者」も含まれ、この場合膵島移植を行うのと同時に糖尿病患者に投与すればよい。
【００４８】
また、本発明における糖尿病患者としては、インスリン産生が高度に障害された糖尿病患者であれば特に限定されないが、Ｉ型糖尿病患者又はII型糖尿病患者が具体的な例として挙げられ、Ｉ型糖尿病患者が好ましい例として挙げられる。また、II型糖尿病患者が好ましい場合もある。インスリン産生の指標として、血漿中のインスリン濃度やＣペプチド濃度の異常が例示される。インスリン産生が高度に障害された状態としては、血漿中インスリン濃度が２μＵ／ｍＬ以下である状態が例示され、又は血漿中Ｃペプチド濃度が０．３ｎｇ／ｍＬ以下である状態が例示される。
【００４９】
本発明におけるトロンボモジュリンは、（１）トロンビンと選択的に結合して（２）トロンビンによるプロテインＣの活性化を促進する作用を有することが知られている。また、（３）トロンビンによる凝固時間を延長する作用、及び／又は（４）トロンビンによる血小板凝集を抑制する作用が通常認められることが好ましい。これらトロンボモジュリンの持つ作用をトロンボモジュリン活性と呼ぶことがある。トロンボモジュリン活性としては、上記（１）及び（２）の作用を有し、さらに上記（１）〜（４）の作用を全て備えていることが好ましい。
【００５０】
トロンビンによるプロテインＣの活性化を促進する作用は、例えば、特開昭６４−６２１９号公報を初めとする各種の公知文献に明確に記載された試験方法によりプロテインＣの活性化を促進する作用の活性量やその有無を容易に確認できるものである。また、トロンビンによる凝固時間を延長する作用、及び／又はトロンビンによる血小板凝集を抑制する作用についても同様に容易に確認できる。
【００５１】
本発明におけるトロンボモジュリンとしては、トロンボモジュリン活性を有していれば特に限定されないが、可溶性トロンボモジュリンであることが好ましい。可溶性トロンボモジュリンの溶解性の好ましい例示としては、水、例えば注射用蒸留水に対して（トリトンＸ−１００やポリドカノール等の界面活性剤の非存在下、通常は中性付近にて）、１ｍｇ／ｍＬ以上、又は１０ｍｇ／ｍＬ以上が挙げられ、好ましくは１５ｍｇ／ｍＬ以上、又は１７ｍｇ／ｍＬ以上が挙げられ、さらに好ましくは２０ｍｇ／ｍＬ以上、２５ｍｇ／ｍＬ以上、又は３０ｍｇ／ｍＬ以上が例示され、特に好ましくは６０ｍｇ／ｍＬ以上が挙げられ、場合によっては、８０ｍｇ／ｍＬ以上、又は１００ｍｇ／ｍＬ以上がそれぞれ挙げられる。可溶性トロンボモジュリンが溶解し得たか否かを判断するに当たっては、溶解した後に、例えば白色光源の直下、約１０００ルクスの明るさの位置で、肉眼で観察した場合に、澄明であって、明らかに認められるような程度の不溶性物質を含まないことが端的な指標となるものと理解される。また、濾過して残渣の有無を確認することもできる。
【００５２】
本発明におけるトロンボモジュリンとしては、ヒト型のトロンボモジュリンにおいてトロンボモジュリン活性の中心部位として知られている配列番号１の第１９〜１３２位のアミノ酸配列を包含していることが好ましく、配列番号１の第１９〜１３２位のアミノ酸配列を包含していれば特に限定されない。該配列番号１の第１９〜１３２位のアミノ酸配列は、トロンビンによるプロテインＣの活性化を促進する作用、すなわちトロンボモジュリン活性を有する限り自然又は人工的に変異していてもよく、すなわち配列番号１の第１９〜１３２位のアミノ酸配列において１つ又は複数のアミノ酸が置換、欠失、付加していても良い。許容される変異の程度は、トロンボモジュリン活性を有すれば特に限定されないが、例えばアミノ酸配列として５０％以上の相同性が例示され、７０％以上の相同性が好ましく、８０％以上の相同性がより好ましく、９０％以上の相同性がさらに好ましく、９５％以上の相同性が特に好ましく、９８％以上の相同性が最も好ましい。これらのようなアミノ酸配列を相同変異配列という。これらの変異については後述の通り、通常の遺伝子操作技術を用いれば容易に取得可能である。
【００５３】
配列番号３の配列は、配列番号１の第１２５位のアミノ酸であるＶａｌがＡｌａに変異したものであるが、本発明におけるトロンボモジュリンとして、配列番号３の第１９〜１３２位のアミノ酸配列を包含していることも好ましい。
【００５４】
このように本発明におけるトロンボモジュリンとしては、配列番号１もしくは配列番号３の第１９〜１３２位の配列、又はそれらの相同変異配列を少なくとも有し、少なくともトロンボモジュリン活性を有するペプチド配列を包含していれば特に限定されないが、配列番号１もしくは配列番号３のそれぞれにおける第１９〜１３２位もしくは第１７〜１３２位の配列からなるペプチド、又は上記配列の相同変異配列からなり少なくともトロンボモジュリン活性を有するペプチドが好ましい例として挙げられ、配列番号１もしくは配列番号３の第１９〜１３２位の配列からなるペプチドがより好ましい。また、配列番号１もしくは配列番号３のそれぞれにおける第１９〜１３２位もしくは第１７〜１３２位の相同変異配列からなり少なくともトロンボモジュリン活性を有するペプチドがより好ましい別の態様もある。
【００５５】
また本発明におけるトロンボモジュリンの別の態様として、配列番号５の第１９〜４８０位のアミノ酸配列を包含していることが好ましく、配列番号５の第１９〜４８０位のアミノ酸配列を包含していれば特に限定されない。該配列番号５の第１９〜４８０位のアミノ酸配列は、トロンビンによるプロテインＣの活性化を促進する作用、すなわちトロンボモジュリン活性を有する限りその相同変異配列であってもよい。
【００５６】
配列番号７の配列は、配列番号５の第４７３位のアミノ酸であるＶａｌがＡｌａに変異したものであるが、本発明におけるトロンボモジュリンとして、配列番号７の第１９〜４８０位のアミノ酸配列を包含していることも好ましい。
【００５７】
このように本発明におけるトロンボモジュリンとしては、配列番号５もしくは配列番号７の第１９〜４８０位の配列、又はそれらの相同変異配列を少なくとも有し、少なくともトロンボモジュリン活性を有するペプチド配列を包含していれば特に限定されないが、配列番号５もしくは配列番号７のそれぞれにおける第１９〜４８０位もしくは第１７〜４８０位の配列からなるペプチド、又は上記配列の相同変異配列からなり少なくともトロンボモジュリン活性を有するペプチドが好ましい例として挙げられ、配列番号５もしくは配列番号７の第１９〜４８０位の配列からなるペプチドがより好ましい。また、配列番号５もしくは配列番号７のそれぞれにおける第１９〜４８０位もしくは第１７〜４８０位の相同変異配列からなり少なくともトロンボモジュリン活性を有するペプチドがより好ましい別の態様もある。
【００５８】
また本発明におけるトロンボモジュリンの別の態様として、配列番号９の第１９〜５１５位のアミノ酸配列を包含していることが好ましく、配列番号９の第１９〜５１５位のアミノ酸配列を包含していれば特に限定されない。該配列番号９の第１９〜５１５位のアミノ酸配列は、トロンビンによるプロテインＣの活性化を促進する作用、すなわちトロンボモジュリン活性を有する限りその相同変異配列であってもよい。
【００５９】
配列番号１１の配列は、配列番号９の第４７３位のアミノ酸であるＶａｌがＡｌａに変異したものであるが、本発明におけるトロンボモジュリンとして、配列番号１１の第１９〜５１５位のアミノ酸配列を包含していることも好ましい。
【００６０】
このように本発明におけるトロンボモジュリンとしては、配列番号９もしくは配列番号１１の第１９〜５１５位の配列、又はそれらの相同変異配列を少なくとも有し、少なくともトロンボモジュリン活性を有するペプチド配列を包含していれば特に限定されないが、配列番号９もしくは配列番号１１のそれぞれにおける第１９〜５１６位、第１９〜５１５位、第１７〜５１６位、もしくは第１７〜５１５位の配列からなるペプチド、又は上記配列の相同変異配列からなり少なくともトロンボモジュリン活性を有するペプチドがより好ましい例として挙げられ、配列番号９における第１９〜５１６位、第１９〜５１５位、第１７〜５１６位、もしくは第１７〜５１５位の配列からなるペプチドが特に好ましい。これらの混合物も好ましい例として挙げられる。また、配列番号１１のそれぞれにおける第１９〜５１６位、第１９〜５１５位、第１７〜５１６位、もしくは第１７〜５１５位の配列からなるペプチドが特に好ましい別の態様もある。これらの混合物も好ましい例として挙げられる。さらにそれらの相同変異配列からなり、少なくともトロンボモジュリン活性を有するぺプチドも好ましい例として挙げられる。
【００６１】
相同変異配列を有するペプチドとは、上述した通りであるが、対象とするペプチドのアミノ酸配列中１つ以上、すなわち１つ又は複数のアミノ酸、さらに好ましくは数個（例えば１から２０個、好ましくは１から１０個、より好ましくは１から５個、特に好ましくは１から３個）のアミノ酸が置換、欠失、付加していてもよいペプチドをも意味する。許容される変異の程度は、トロンボモジュリン活性を有すれば特に限定されないが、例えばアミノ酸配列として５０％以上の相同性が例示され、７０％以上の相同性が好ましく、８０％以上の相同性がより好ましく、９０％以上の相同性がさらに好ましく、９５％以上の相同性が特に好ましく、９８％以上の相同性が最も好ましい。
【００６２】
さらに、本発明におけるトロンボモジュリンとしては、特開昭６４−６２１９における配列番号１４（４６２アミノ酸残基）からなるペプチド、配列番号８（２７２アミノ酸残基）からなるペプチド、又は配列番号６（２３６アミノ酸残基）からなるペプチドも好ましい例として挙げられる。
【００６３】
本発明におけるトロンボモジュリンとしては配列番号１又は配列番号３の第１９〜１３２位のアミノ酸配列を少なくとも有しているペプチドであれば特に限定されないが、その中でも配列番号５又は配列番号７の第１９〜４８０位のアミノ酸配列を少なくとも有しているペプチドであることが好ましく、配列番号９もしくは配列番号１１の第１９〜５１５位のアミノ酸配列を少なくとも有しているペプチドであることがより好ましい。配列番号９もしくは配列番号１１の第１９〜５１５位のアミノ酸配列を少なくとも有しているペプチドとしては、配列番号９もしくは配列番号１１のそれぞれにおける第１９〜５１６位、第１９〜５１５位、第１７〜５１６位、もしくは第１７〜５１５位の配列からなるペプチドがより好ましい例として挙げられる。また、配列番号９もしくは配列番号１１のそれぞれにおける第１９〜５１６位、第１９〜５１５位、第１７〜５１６位、もしくは第１７〜５１５位の配列からなるペプチドの、配列番号９もしくは配列番号１１それぞれについての混合物もより好ましい例として挙げられる。
【００６４】
上記混合物の場合、配列番号９もしくは配列番号１１のそれぞれにおける第１７位から始まるペプチドと第１９位から始まるペプチドの混合割合としては、（３０：７０）〜（５０：５０）が例示され、（３５：６５）〜（４５：５５）が好ましい例として挙げられる。
また、配列番号９もしくは配列番号１１のそれぞれにおける第５１５位で終わるペプチドと第５１６位で終わるペプチドの混合割合としては、（７０：３０）〜（９０：１０）が例示され、（７５：２５）〜（８５：１５）が好ましい例として挙げられる。
これらペプチドの混合割合は、通常の方法により求めることができる。
【００６５】
なお、配列番号１の第１９〜１３２位の配列は、配列番号９の第３６７〜４８０位の配列に相当し、配列番号５の第１９〜４８０位の配列は、配列番号９の第１９〜４８０位の配列に相当する。また、配列番号３の第１９〜１３２位の配列は、配列番号１１の第３６７〜４８０位の配列に相当し、配列番号７の第１９〜４８０位の配列は、配列番号１１の第１９〜４８０位の配列に相当する。さらに、配列番号１、３、５、７、９、及び１１のそれぞれにおける第１〜１８位の配列は、全て同一の配列である。
【００６６】
これら本発明におけるトロンボモジュリンは後述の通り、これらのペプチドをコードするＤＮＡ（具体的には、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、又は配列番号１２等の塩基配列）をベクターにより宿主細胞にトランスフェクトして調製された形質転換細胞より取得することができる。
【００６７】
さらに、これらのペプチドは、前記のアミノ酸配列を有すればよいのであって、糖鎖が付いていても、又付いていなくともよく、この点は特に限定されるものではない。また遺伝子操作においては、使用する宿主細胞の種類により、糖鎖の種類や、付加位置や付加の程度は相違するものであり、いずれも用いることができる。糖鎖の結合位置及び種類については、特開平１１−３４１９９０に記載の事実が知られており、本発明におけるトロンボモジュリンについても同様の位置に同様の糖鎖が付加する場合がある。後述の通り、遺伝子操作により取得することに特定されるものではないが、遺伝子操作により取得する場合には、発現に際して用いることができるシグナル配列としては、配列番号９の第１〜１８位のアミノ酸配列をコードする塩基配列、配列番号９の第１〜１６位のアミノ酸配列をコードする塩基配列、その他公知のシグナル配列、例えば、ヒト組織型プラスミノゲンアクチベーターのシグナル配列を利用することができる（国際公開８８／９８１１号公報）。
【００６８】
トロンボモジュリンをコードするＤＮＡ配列を宿主細胞へ導入する場合には、好ましくはトロンボモジュリンをコードするＤＮＡ配列を、ベクター、特に好ましくは、動物細胞において発現可能な発現ベクターに組み込んで導入する方法が挙げられる。発現ベクターとは、プロモーター配列、ｍＲＮＡにリボソーム結合部位を付与する配列、発現したい蛋白をコードするＤＮＡ配列、スプライシングシグナル、転写終結のターミネーター配列、複製起源配列などで構成されるＤＮＡ分子であり、好ましい動物細胞発現ベクターの例としては、Ｍｕｌｌｉｇａｎ ＲＣら［Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １９８１；７８：２０７２−２０７６］が報告しているｐＳＶ２−Ｘや、Ｈｏｗｌｅｙ ＰＭら［Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｍｚｙｍｏｌｏｇｙ １９８３；１０１：３８７−４０２、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ］が報告しているｐＢＰ６９Ｔ（６９−６）などが挙げられる。
【００６９】
これらのペプチドを製造するに際して用いることのできる宿主細胞としては、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＣＯＳ−１細胞、ＣＯＳ−７細胞、ＶＥＲＯ（ＡＴＣＣ ＣＣＬ−８１）細胞、ＢＨＫ細胞、イヌ腎由来ＭＤＣＫ細胞、ハムスターＡＶ−１２−６６４細胞等が、またヒト由来細胞としてＨｅＬａ細胞、ＷＩ３８細胞、ヒト２９３細胞が挙げられる。ＣＨＯ細胞が極めて一般的であり好ましく、ＣＨＯ細胞においては、ＤＨＦＲ−ＣＨＯ細胞がさらに好ましい。
【００７０】
また、遺伝子操作の過程やペプチドの製造過程において、大腸菌等の微生物も多く使われ、それぞれに適した宿主−ベクター系を使用することが好ましく、上述の宿主細胞においても、適宜のベクター系を選択することができる。遺伝子組換え技術に用いるトロンボモジュリンの遺伝子は、クローニングされており、そしてトロンボモジュリンの遺伝子組換え技術を用いた製造例が開示されており、さらにはその精製品を得るための精製方法も知られている［特開昭６４−６２１９号公報、特開平２−２５５６９９号公報、特開平５−２１３９９８号公報、特開平５−３１０７８７号公報、特開平７−１５５１７６号公報、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ １９８９；２６４：１０３５１−１０３５３］。したがって本発明で用いるトロンボモジュリンは、上記の報告に記載されている方法を用いることにより、あるいはそれらに記載の方法に準じることにより製造することができる。例えば特開昭６４−６２１９号公報では、全長のトロンボモジュリンをコードするＤＮＡを含むプラスミドｐＳＶ２ＴＭＪ２を含む、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ−１２ ｓｔｒａｉｎ ＤＨ５（ＡＴＣＣ寄託番号６７２８３号）が開示されている。また、この菌株を生命研（現独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センター）に再寄託した菌株（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＤＨ５／ｐＳＶ２ＴＭ Ｊ２）（ＦＥＲＭ ＢＰ−５５７０）を用いることもできる。この全長のトロンボモジュリンをコードするＤＮＡを原料として、公知の遺伝子操作技術によって、本発明のトロンボモジュリンを調製することができる。
【００７１】
本発明に用いられるトロンボモジュリンは、従来公知の方法又はそれに準じて調製すればよいが、例えば、前記山本らの方法［特開昭６４−６２１９号公報］、又は特開平５−２１３９９８号公報を参考にすることができる。すなわちヒト由来のトロンボモジュリン遺伝子を遺伝子操作技術により、例えば、配列番号９のアミノ酸配列をコードするＤＮＡとなし、さらに必要に応じた改変を行うことも可能である。この改変としては、例えば、配列番号１１のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ（具体的には、配列番号１２の塩基配列よりなる）となすために、配列番号９の第４７３位のアミノ酸をコードするコドン（特に、配列番号１０の第１４１８位の塩基）に、Ｚｏｌｌｅｒ ＭＪら［Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １９８３；１００：４６８−５００、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ］の方法に従って、部位特異的変異を行う。例えば、配列番号１０の第１４１８位の塩基Ｔは、配列番号１３に示された塩基配列を有する変異用合成ＤＮＡを用いて塩基Ｃに変換したＤＮＡとなすことができる。
【００７２】
このようにして調製したＤＮＡを、例えばチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞に組み込んで、形質転換細胞とし、適宜選択し、この細胞を培養して得た培養液から、公知の方法により精製されたトロンボモジュリンが製造できる。前述の通り配列番号９のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ（配列番号１０）を前記宿主細胞にトランスフェクトすることが好ましい。本発明に用いられるトロンボモジュリンの生産方法は、上記の方法に限定されるものではなく、例えば、尿や血液、その他体液等から抽出精製することでも可能であるし、またトロンボモジュリンを生産する組織又はこれら組織培養液等から抽出精製することも、また必要によりさらに蛋白分解酵素により切断処理することも可能である。
【００７３】
上記細胞培養方法により本発明におけるトロンボモジュリンを製造する場合、タンパク質の翻訳後修飾により、Ｎ末端アミノ酸に多様性が認められる場合がある。例えば、配列番号９における第１７位、１８位、１９位、もしくは２２位のアミノ酸がＮ末端となる場合がある。また、例えば第２２位のグルタミン酸がピログルタミン酸に変換されるように、Ｎ末端アミノ酸が修飾される場合もある。第１７位又は１９位のアミノ酸がＮ末端となることが好ましく、第１９位のアミノ酸がＮ末端となることがより好ましい。また、第１７位のアミノ酸がＮ末端となることが好ましい別の態様もある。以上の修飾や多様性等については配列番号１１についても同様な例が挙げられる。
【００７４】
さらに、配列番号１０の塩基配列を有するＤＮＡを用いてトロンボモジュリンを製造する場合、Ｃ末端アミノ酸の多様性が認められることがあり、１アミノ酸残基短いペプチドが製造される場合がある。すなわち、第５１５位のアミノ酸がＣ末端となり、さらに該第５１５位がアミド化されるといったように、Ｃ末端アミノ酸が修飾される場合がある。したがって、Ｎ末端アミノ酸とＣ末端アミノ酸が多様性に富んだペプチド、又はそれらの混合物が製造されることがある。第５１５位のアミノ酸がＣ末端となることが好ましい。また、第５１６位のアミノ酸がＣ末端になることが好ましい別の態様もある。以上の修飾や多様性等については配列番号１２の塩基配列を有するＤＮＡについても同様である。
【００７５】
上記方法で得られるトロンボモジュリンは、Ｎ末端及びＣ末端に多様性が認められるペプチドの混合物である場合がある。具体的は、配列番号９における第１９〜５１６位、第１９〜５１５位、第１７〜５１６位、もしくは第１７〜５１５位の配列からなるペプチドの混合物が挙げられる。
【００７６】
次いで上記により取得された培養上清、又は培養物からのトロンボモジュリンの単離精製方法は、公知の手法［堀尾武一編集、蛋白質・酵素の基礎実験法、１９８１］に準じて行うことができる。例えば、トロンボモジュリンと逆の電荷を持つ官能基を固定化したクロマトグラフィー担体と、トロンボモジュリンの間の相互作用を利用したイオン交換クロマトグラフィーや吸着クロマトグラフィーの使用も好ましい。また、トロンボモジュリンとの特異的親和性を利用したアフィニティークロマトグラフィーも好ましい例として挙げられる。吸着体の好ましい例として、トロンボモジュリンのリガンドであるトロンビンやトロンボモジュリンの抗体を利用する例が挙げられる。この抗体としては、適宜の性質、あるいは適宜のエピトープを認識するトロンボモジュリンの抗体を利用することができ、例えば、特公平５−４２９２０号公報、特開昭６４−４５３９８号公報、特開平６−２０５６９２号公報などに記載された例が挙げられる。また、トロンボモジュリンの分子量サイズを利用した、ゲル濾過クロマトグラフィーや限外濾過が挙げられる。そしてまた、疎水性基を固定化したクロマトグラフィー担体と、トロンボモジュリンのもつ疎水性部位との間の疎水結合を利用した疎水性クロマトグラフィーが挙げられる。また、吸着クロマトグラフィーとしてハイドロキシアパタイトを担体として用いることも可能であり、例えば、特開平９−１１０９００号公報に記載した例が挙げられる。これらの手法は適宜組み合わせることができる。精製の程度は、使用目的等により選択できるが、例えば電気泳動、好ましくはＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果が単一バンドとして得られるか、もしくは単離精製品のゲル濾過ＨＰＬＣ又は逆相ＨＰＬＣの結果が単一のピークになるまで純粋化することが望ましい。もちろん、複数種のトロンボモジュリンを用いる場合には、実質的にトロンボモジュリンのみのバンドになることが好ましいのであり、単一のバンドになることを求めるものではない。
【００７７】
本発明における精製法を具体的に例示すれば、トロンボモジュリン活性を指標に精製する法が挙げられ、例えばイオン交換カラムのＱ−セファロースＦａｓｔ Ｆｌｏｗで培養上清又は培養物を粗精製しトロンボモジュリン活性を有する画分を回収し、ついでアフィニティーカラムのＤＩＰ−トロンビン−アガロース（ｄｉｉｓｏｐｒｏｐｙｌｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌｔｈｒｏｍｂｉｎ ａｇａｒｏｓｅ）カラムで主精製しトロンボモジュリン活性が強い画分を回収し、回収画分を濃縮し、ゲル濾過にかけトロンボモジュリン活性画分を純品として取得する精製方法［Ｇｏｍｉ Ｋ ｅｔ ａｌ、Ｂｌｏｏｄ １９９０；７５：１３９６−１３９９］が挙げられる。指標とするトロンボモジュリン活性としては、例えばトロンビンによるプロテインＣ活性化の促進活性が挙げられる。その他に、好ましい精製法を例示すると以下の通りである。
【００７８】
トロンボモジュリンと良好な吸着条件を有する適当なイオン交換樹脂を選定し、イオン交換クロマト精製を行う。特に好ましい例としては、０．１８ｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌを含む０．０２ｍｏｌ／Ｌトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）で平衡化したＱ−セファロースＦａｓｔ Ｆｌｏｗを用いる方法である。適宜洗浄後、例えば０．３ｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ含む０．０２ｍｏｌ／Ｌトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）で溶出し粗精製品のトロンボモジュリンを得ることができる。
【００７９】
次に、例えばトロンボモジュリンと特異的親和性を持つ物質を樹脂に固定化しアフィニティークロマト精製を行うことができる。好ましい例としてＤＩＰ−トロンビン−アガロースカラムの例と、抗トロンボモジュリンモノクローナル抗体カラムの例が挙げられる。ＤＩＰ−トロンビン−アガロースカラムは、予め、例えば、１００ｍｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ及び０．５ｍｍｏｌ／Ｌ塩化カルシウムを含む２０ｍｍｏｌ／Ｌトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）で平衡化せしめ、上記の粗精製品をチャージして、適宜の洗浄を行い、例えば、１．０ｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ及び０．５ｍｍｏｌ／Ｌ塩化カルシウムを含む２０ｍｍｏｌ／Ｌトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）で溶出し精製品のトロンボモジュリンを取得することができる。また抗トロンボモジュリンモノクローナル抗体カラムにおいては、予めＣＮＢｒにより活性化したセファロース４ＦＦ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社）に、抗トロンボモジュリンモノクローナル抗体を溶解した０．５ｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ含有０．１ｍｏｌ／Ｌ ＮａＨＣＯ３緩衝液（ｐＨ８．３）に接触させ、セファロース４ＦＦに抗トロンボモジュリンモノクローナル抗体をカップリングさせた樹脂を充填したカラムを、予め例えば０．３ｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ含む２０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸塩緩衝液（ｐＨ７．３）で平衡化し、適宜の洗浄の後、例えば、０．３ｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ含む１００ｍｍｏｌ／Ｌグリシン塩酸緩衝液（ｐＨ３．０）にて溶出せしめる方法が例示される。溶出液は適当な緩衝液で中和し、精製品として取得することもできる。
【００８０】
次に得られた精製品をｐＨ３．５に調整した後に、０．３ｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌを含む１００ｍｍｏｌ／Ｌグリシン塩酸緩衝液（ｐＨ３．５）で平衡化した陽イオン交換体、好ましくは強陽イオン交換体であるＳＰ−セファロースＦＦ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社）にチャージし、同緩衝液で洗浄して得られた非吸着画分を得る。得られた画分は適当な緩衝液で中和し、高純度精製品として取得することができる。これらは、限外濾過により濃縮することが好ましい。
【００８１】
さらに、ゲル濾過による緩衝液交換を行うことも好ましい。例えば、５０ｍｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌを含む２０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸塩緩衝液（ｐＨ７．３）で平衡化せしめたＳｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ−３００カラムもしくはＳ−２００カラムに、限外濾過により濃縮した高純度精製品をチャージし、５０ｍｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌを含む２０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸塩緩衝液（ｐＨ７．３）で展開分画し、トロンビンによるプロテインＣ活性化の促進活性の確認を行って活性画分を回収し、緩衝液交換した高純度精製品を取得することができる。このようにして得られた高純度精製品は安全性を高めるために適当なウイルス除去膜、例えばプラノバ１５Ｎ（旭化成メディカル株式会社）を用いて濾過することが好ましく、その後限外濾過により目的の濃度まで濃縮することができる。最後に無菌濾過膜により濾過することが好ましい。
【００８２】
本発明の薬剤は、有効成分としてトロンボモジュリンを含有していれば特に限定されることはなく、必要に応じて膵島移植患者に使用される薬剤を単一又は複数の製剤として製造して使用することもできる。すなわち、本発明により、トロンボモジュリンと免疫抑制剤とを組み合わせてなる薬剤であって、該薬剤が膵島移植を受ける糖尿病患者及び／又は膵島移植を受けた糖尿病患者に投与され、膵島移植後の血糖値を正常化するための該薬剤、糖尿病を治療及び／又は改善するための該薬剤、膵島移植による糖尿病の治療及び／又は改善効果を補助するための該薬剤、膵島移植細胞の生着率を改善するための該薬剤、又は膵島移植細胞の生存期間を延長するための該薬剤が提供される。
【００８３】
免疫抑制剤としては、副腎皮質ステロイド、アルキル化剤、代謝拮抗剤、アルカロイド系薬剤、カルシニューリン阻害剤、サイクリン依存性カイネース阻害剤、抗胸腺細胞グロブリン、ＣＤ抗原に対するモノクローナル抗体であるプレドニゾロン、メチルプレドニゾロン、ハイドロコルチゾン、トリアムシノロン、ベタメサゾン、デキサメサゾン、シクロフォスファミド、メトトレキサート、アザチオプリン、ミコフェノレート、ミゾリビン、ビンクリスチン、ビンブラスチン、エトポシド、マイトマイシンＣ、シクロスポリン、タクロリムス、シロリムス、ラパマイシン、アトガム、チモグロブリン、Ｍｕｒｏｍｏｎａｂ−ＣＤ３、リツキシマブ、バシリキシマブ、ダクリツマブが例示され、ミコフェノレート、アザチオプリン、タクロリムス、シロリムス、ラパマイシン、バシキキシマブ、又はダクリツマブが好ましいがこれらに限定されるものではない。また、その他の免疫抑制剤として、インフリキシマブ、グスペリムス、又は抗リンパ球グロブリンも好ましい例として挙げられる。
【００８４】
本発明の、トロンボモジュリンと免疫抑制剤とを組み合わせてなる薬剤は、それぞれの成分が一つにまとめられて混合された配合剤の状態であってもよく、また、それぞれの成分が混合されておらず、複数の容器から別々に投与できる非混合的な組み合わせの状態であってもよい。
【００８５】
本発明のトロンボモジュリンと免疫抑制剤とを組み合わせてなる薬剤は、トロンボモジュリン及び免疫抑制剤の各活性成分の完全な混合物として同時に患者に投与することができる。また、本発明の該薬剤におけるトロンボモジュリン及び免疫抑制剤は、別々の成分として同時あるいは逐次に患者に投与することができる。逐次に投与する際、トロンボモジュリン及び免疫抑制剤の投与順序は問わないが、トロンボモジュリンの次に免疫抑制剤を投与することが好ましい。また、免疫抑制剤の次にトロンボモジュリンを投与するという好ましい別の態様もある。トロンボモジュリンは、膵島移植前又は膵島移植後、あるいは膵島移植中に投与することもできるが、膵島移植前又は膵島移植後に投与することが好ましく、膵島移植後に投与することがより好ましい。また、膵島移植前に投与することがより好ましい別の態様もある。さらに、膵島移植中に投与することがより好ましい場合もある。免疫抑制剤は、膵島移植中又は膵島移植後に投与することが好ましい。投与順序又は投与部位は、対象となる患者の状態に応じて適宜変化させることが可能である。
【００８６】
また、本発明により、トロンボモジュリン、免疫抑制剤、及び糖尿病治療薬とを組み合わせてなる薬剤であって、該薬剤が膵島移植を受ける糖尿病患者及び／又は膵島移植を受けた糖尿病患者に投与され、膵島移植後の血糖値を正常化するための該薬剤、糖尿病を治療及び／又は改善するための該薬剤、膵島移植による糖尿病の治療及び／又は改善効果を補助するための該薬剤、膵島移植細胞の生着率を改善するための該薬剤、又は膵島移植細胞の生存期間を延長するための該薬剤が提供される。
【００８７】
本発明の一成分として用いられる糖尿病治療薬としては、インスリン感受性増加剤（ＰＰＡＲγ作動薬）、インスリン分泌促進剤（ＳＵ剤、グリニド）、肝糖放出抑制剤、糖吸収遅延剤（α−グルコシダーゼ阻害剤）、ＤＰＰ−ＩＶ阻害剤、グルカゴン関連ペプチドであるピオグリタゾン、ロシグリタゾン、トログリタゾン、グリベンクラミド、グリクラジド、グリピザイド、グリメピリド、レパグリニド、ナテグリニド、ミチグリニド、メトフォルミン、ボグリボース、アカルボース、ビルダグリプチン、エクセナチド、又はリラグルチドが例示され、ビルダグリプチン、エクセナチド、又はリラグルチドが好ましい糖尿病治療薬として例示されるが、これらに限定されるものではない。
【００８８】
また、本発明の別の態様として、糖尿病治療薬としてインスリン又はインスリン誘導体を用いることも好ましい。インスリン及びインスリン誘導体としては、超速効型、速効型、混合型（二相性）、中間型、持効型として、インスリンリスプロ、インスリンアスパルト、インスリングルリシン、ヒトインスリン、ヒト中性インスリン、ヒトイソフェンインスリン、インスリングラルギン、又はインスリンデテミルが例示されるがこれらに限定されるものではない。これらの種類の薬剤を単独あるいは適宜組み合わせて使用することができる。
【００８９】
本発明の、トロンボモジュリン、免疫抑制剤、及び糖尿病治療薬とを組み合わせてなる薬剤は、それぞれの成分が一つにまとめられて混合された配合剤の状態であってもよく、また、それぞれの成分が混合されておらず、複数の容器から別々に投与できる非混合的な組み合わせの状態であってもよい。
【００９０】
本発明のトロンボモジュリン、免疫抑制剤、及び糖尿病治療薬とを組み合わせてなる薬剤は、トロンボモジュリン、免疫抑制剤、及び糖尿病治療薬の各活性成分の完全な混合物として同時に患者に投与することができる。また、本発明の該薬剤におけるトロンボモジュリン、免疫抑制剤、及び糖尿病治療薬は、別々の成分として同時あるいは逐次に患者に投与することができる。逐次に投与する際、糖尿病治療薬の投与順序は、糖尿病治療薬が膵島移植前又は膵島移植後に投与されれば特に限定されないが、トロンボモジュリン及び免疫抑制剤の投与後に糖尿病治療薬を投与することが好ましい。また、糖尿病治療薬の投与後にトロンボモジュリン及び免疫抑制剤を投与するのが好ましい別の態様もある。糖尿病治療薬は、膵島移植前又は膵島移植後、あるいは膵島移植中に投与することもできるが、膵島移植前又は膵島移植後に投与することが好ましい。投与順序又は投与部位は、対象となる患者の状態に応じて適宜変化させることが可能である。
【００９１】
本発明の薬剤は、担体を含有することができる。本発明で用いることのできる担体としては、水溶性の担体が好ましく、例えば、ショ糖、グリセリン等や、その他の無機塩のｐＨ調整剤等を添加剤として加えて調製することができる。さらに必要に応じて、特開平１−６２１９号公報及び特開平６−３２１８０５号公報に開示される通り、アミノ酸、塩類、糖質、界面活性剤、アルブミン、ゼラチン等を添加しても良いし、また、防腐剤を添加することも好ましく、例えば、パラ安息香酸エステル類が好ましい例として挙げられ、パラ安息香酸メチルが特に好ましい例として挙げられる。防腐剤の添加量は、通常０．０１〜１．０％（重量％を示す、以下同じ）が例示され、好ましくは０．１〜０．３％が挙げられる。これらの添加方法は特に限定されないが、凍結乾燥とする場合には、通常行われるように、例えば、免疫抑制剤、糖尿病治療薬から選ばれる少なくとも１つを含有する溶液とトロンボモジュリン含有溶液を混合した後、添加物を添加混合する方法や、又はあらかじめ添加物を水、注射用蒸留水あるいは適当な緩衝液に溶解した免疫抑制剤、糖尿病治療薬から選ばれる少なくとも１つに混合した後、トロンボモジュリン含有溶液を添加混合にする方法にて溶液を調製し、凍結乾燥する方法が挙げられる。本発明の薬剤が各薬剤成分を組み合わせてなる薬剤である場合には、各薬剤は、適宜の製造方法により担体を添加して製造することが好ましい。本発明の薬剤としては、注射液の形態で提供されても、また凍結乾燥製剤を使用時に溶解して使用する形態で提供されてもよい。
【００９２】
製剤化工程においては、アンプル又はバイアルに、水、注射用蒸留水あるいは適当な緩衝液１ｍＬあたり０．０５〜１５ｍｇ、好適には０．１〜５ｍｇのトロンボモジュリンと、抗血小板剤、抗血液凝固剤、又は血栓溶解剤の何れか１つと上記添加物を含有する溶液を、例えば０．５〜１０ｍＬ充填した後に凍結し、減圧下のもとで乾燥する方法が例示される。又はそのままに水溶液注射用製剤として調製できる。
【００９３】
本発明の薬剤は、非経口投与法、例えば静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与などによって投与することが望ましい。また経口投与、直腸内投与、鼻内投与、舌下投与なども可能である。本発明の薬剤が各薬剤成分を組み合わせてなる薬剤である場合には、それぞれの薬剤成分はは、適宜の投与方法により投与することが好ましい。
【００９４】
静脈内投与の場合、一度に所望の量を投与する方法又は点滴静脈内投与が挙げられる。
一度に所望の量を投与する方法は投与時間が短い点で好ましい。一度に投与する場合には、注射器での投与に要する時間に通常幅があるが、投与に要する時間としては、投与する液量にもよるが、通常は２分以下が好ましく、１分以下がより好ましく、３０秒以下がさらに好ましい。また下限としては特に限定されないが、１秒以上が好ましく、５秒以上がより好ましく、１０秒以上がさらに好ましい。投与量は上記の好ましい投与量であれば特に限定されない。また、点滴静脈内投与はトロンボモジュリンの血中濃度を一定に保つことが容易な点で好ましい。
【００９５】
本発明における薬剤の１日の投与量は、患者の年齢、体重、疾患の程度、投与経路などによっても異なるが、一般的にトロンボモジュリンの量として、上限としては２０ｍｇ／ｋｇ以下が好ましく、１０ｍｇ／ｋｇ以下がより好ましく、５ｍｇ／ｋｇ以下がさらに好ましく、２ｍｇ／ｋｇ以下が特に好ましく、１ｍｇ／ｋｇ以下が最も好ましく、下限としては０．００１ｍｇ／ｋｇ以上が好ましく、０．００５ｍｇ／ｋｇ以上がより好ましく、０．０１ｍｇ／ｋｇ以上がさらに好ましく、０．０２ｍｇ／ｋｇ以上が特に好ましく、０．０５ｍｇ／ｋｇ以上が最も好ましい。
【００９６】
点滴静脈内投与の場合、上記の好ましい投与量であれば特に限定されないが、１日の投与量の上限としては１ｍｇ／ｋｇ以下が好ましく、０．５ｍｇ／ｋｇ以下がより好ましく、０．１ｍｇ／ｋｇ以下がさらに好ましく、０．０８ｍｇ／ｋｇ以下が特に好ましく、０．０６ｍｇ／ｋｇ以下が最も好ましく、下限としては０．００５ｍｇ／ｋｇ以上が好ましく、０．０１ｍｇ／ｋｇ以上がより好ましく、０．０２ｍｇ／ｋｇ以上がさらに好ましく、０．０４ｍｇ／ｋｇ以上が特に好ましい。
【００９７】
１日あたり１回又は必要に応じて数回投与する。投与間隔は、２日から１４日に１回、好ましくは２日から７日に１回、さらに好ましくは３日から５日に１回にとすることも可能である。
【００９８】
かくして取得されたトロンボモジュリンを含有する本発明の薬剤を、Ｉ型糖尿病マウスに対する膵島細胞の同種同系移植の際に投与したところ、ランゲルハンス島β細胞の機能障害に起因する血糖値の上昇に対して優れた予防及び治療効果が認められた。すなわち、これらのモデル動物に対する効果から、本発明の薬剤は、Ｉ型糖尿病患者に対する膵島移植において、移植時の細胞生着率の向上、及びこれに伴う移植細胞数の軽減可能となる移植補助剤として有用であることが確認された。上述のように本発明の薬剤を製造するに際しては、有効量のトロンボモジュリンを医薬上許容される担体と混合する公知の方法により調製すればよい。
【００９９】
本発明の薬剤は、出血しやすい糖尿病患者が膵島移植を受ける際にも出血のリスクを高めることなく安全かつ高い効果を示すことができる点で非常に有用である。該有用性は、本発明の薬剤の有効成分であるトロンボモジュリンが出血を助長することなく、逆に出血症状を改善することが報告されている（Ｓａｉｔｏ Ｈら、Ｊ Ｔｈｒｏｍｂ Ｈａｅｍｏｓｔ ２００７；５：３１−４１）ことからも裏付けることができる。出血のリスクの評価方法として、血漿に本発明の薬剤を加えた検体を用いて凝固時間（例えば、Ｍｏｈｒｉ Ｍら（Ｍｏｈｒｉ Ｍ ｅｔ ａｌ、Ｔｈｒｏｍｂ Ｈａｅｍｏｓｔ １９９９； ８２： １６８７−９３）に記載の活性化部分トロンボプラスチン時間（ＡＰＴＴ））の測定が例示される。また、膵島移植における出血状態の評価方法として、血液（輸血）や血漿製剤の使用量を指標とすることが例示される。
【０１００】
本発明の薬剤は、膵島移植の特長である手術侵襲が少なくかつ短時間に行われるという利便性を損なうことなく使用することができる点においても有用である。また、上述のように本発明の薬剤は出血のリスクを高めることがないため、投与量が適正であることを評価するための検査が不要である。投与量が適正であることを評価する方法としては、上述の凝固時間法を指標とした出血リスクの評価方法が例示される。
【０１０１】
［配列表の説明］
配列番号１：ＴＭＥ４５６の生産に用いた遺伝子がコードするアミノ酸配列
配列番号２：配列番号１のアミノ酸配列をコードする塩基配列
配列番号３：ＴＭＥ４５６Ｍの生産に用いた遺伝子がコードするアミノ酸配列
配列番号４：配列番号３のアミノ酸配列をコードする塩基配列
配列番号５：ＴＭＤ１２の生産に用いた遺伝子がコードするアミノ酸配列
配列番号６：配列番号５のアミノ酸配列をコードする塩基配列
配列番号７：ＴＭＤ１２Ｍの生産に用いた遺伝子がコードするアミノ酸配列
配列番号８：配列番号７のアミノ酸配列をコードする塩基配列
配列番号９：ＴＭＤ１２３の生産に用いた遺伝子がコードするアミノ酸配列
配列番号１０：配列番号９のアミノ酸配列をコードする塩基配列
配列番号１１：ＴＭＤ１２３Ｍの生産に用いた遺伝子がコードするアミノ酸配列
配列番号１２：配列番号１１のアミノ酸配列をコードする塩基配列
配列番号１３：部位特異的変異を行う際に使用する変異用合成ＤＮＡ
【実施例】
【０１０２】
以下、実施例及び試験例により本発明を具体的に説明するが、本発明は何らこれらによって限定されるものではない。
試験例に用いる本発明におけるトロンボモジュリンは、前記山本らの方法（特開昭６４−６２１９号に記載の方法）に従って製造した。以下にその製造例を示す。なお、今回の製造例で得られたトロンボモジュリンは、ラット及びサルを用いた単回及び反復静脈内投与試験、マウス生殖試験、局所刺激性試験、安全性薬理試験、ウイルス不活化試験などによりその安全性が確認されている。
【０１０３】
［製造例１］
＜トロンボモジュリンの取得＞
上記の方法、すなわち、配列番号９のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ（具体的には、配列番号１０の塩基配列よりなる）を、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞にトランスフェクションして、この形質転換細胞の培養液より前述した定法の精製法にて、５０ｍｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌを含む２０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸塩緩衝液（ｐＨ７．３）で活性画分を回収した高純度精製品を取得した。さらに限外濾過を行って濃度が１１．２ｍｇ／ｍＬのトロンボモジュリン（以下、ＴＭＤ１２３と略すことがある）溶液を取得した。
＜添加剤溶液調製＞
１０Ｌのステンレス製容器に、塩酸アルギニン（味の素社製）４８０ｇを量り入れ、注射用水を５Ｌ加えて溶解した。１ｍｏｌ／Ｌ水酸化ナトリウム溶液を添加して、ｐＨを７．３に調整した。
【０１０４】
＜薬液調製・充填 ＞
上記添加剤溶液全量を２０Ｌのステンレス製容器に入れ、上記得られたＴＭＤ１２３溶液２３９８ｍＬ（可溶性トロンボモジュリンのたん白質量として２６.８８ｇに相当。ただし１２％過量仕込み。）加え混合攪拌した。さらに注射用水を加えて全量を１２Ｌとして均一に混合撹拌した。この薬液を、孔径が０．２２μｍのフィルター（ミリポア製ＭＣＧＬ１０Ｓ）で濾過滅菌した。濾過液を１ｍＬずつバイアルに充填し、ゴム栓を半打栓した。
【０１０５】
＜凍結乾燥＞
凍結乾燥→窒素充填→ゴム栓全打栓→キャップ巻締めの順で以下の条件にて凍結乾燥工程を行い、１容器中に可溶性トロンボモジュリン２ｍｇ、塩酸アルギニン４０ｍｇを含むＴＭＤ１２３含有製剤を得た。
＜凍結乾燥条件＞
予備冷却（１５分かけて室温から１５℃）→ 本冷却（２時間かけて１５℃から−４５℃）→ 保持（２時間 −４５℃）→ 真空開始（１８時間 −４５℃）→ 昇温（２０時間かけて−４５℃から２５℃）→ 保持（１５時間２５℃）→ 昇温（１時間かけて２５℃から４５℃）→ 保持（５時間４５℃）→ 室温（２時間かけて４５℃から２５℃）→ 復圧窒素充填（−１００ｍｍＨｇまで）→ 全打栓 → キャップ巻締め
【０１０６】
［製造例２］
配列番号１１のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ（具体的には、配列番号１２の塩基配列よりなる）を、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞にトランスフェクションして、この形質転換細胞の培養液より前述した定法の精製法にて精製されたトロンボモジュリン（以下、ＴＭＤ１２３Ｍと略すことがある）溶液を取得し、上記と同様の方法によりＴＭＤ１２３Ｍの凍結乾燥製剤を取得する。
【０１０７】
［製造例３］
配列番号１のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ（具体的には、配列番号２の塩基配列よりなる）を、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞にトランスフェクションして、この形質転換細胞の培養液より前述した定法の精製法にて精製されたトロンボモジュリン（以下、ＴＭＥ４５６と略すことがある）を取得し、上記と同様の方法によりＴＭＥ４５６の凍結乾燥製剤を取得する。
【０１０８】
［製造例４］
配列番号３のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ（具体的には、配列番号４の塩基配列よりなる）を、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞にトランスフェクションして、この形質転換細胞の培養液より前述した定法の精製法にて精製されたトロンボモジュリン（以下、ＴＭＥ４５６Ｍと略すことがある）を取得し、上記と同様の方法によりＴＭＥ４５６Ｍの凍結乾燥製剤を取得する。
【０１０９】
［製造例５］
配列番号５のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ（具体的には、配列番号６の塩基配列よりなる）を、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞にトランスフェクションして、この形質転換細胞の培養液より前述した定法の精製法にて精製されたトロンボモジュリン（以下、ＴＭＤ１２と略すことがある）を取得し、上記と同様の方法によりＴＭＤ１２の凍結乾燥製剤を取得する。
【０１１０】
［製造例６］
配列番号７のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ（具体的には、配列番号８の塩基配列よりなる）を、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞にトランスフェクションして、この形質転換細胞の培養液より前述した定法の精製法にて精製されたトロンボモジュリン（以下、ＴＭＤ１２Ｍと略すことがある）を取得し、上記と同様の方法によりＴＭＤ１２Ｍの凍結乾燥製剤を取得する。
【０１１１】
［試験例１］
＜I型糖尿病マウスに対する膵島細胞の同種同系移植＞
雄性Ｃ５７ＢＬ／６マウス（チャールスリバー、７〜１０週齢）にストレプトゾシン（シグマ）を１８０ｍｇ／ｋｇ投与し、ランゲルハンス島β細胞の機能を特異的に低下させたＩ型糖尿病マウスモデルを作成した。ストレプトゾトシン投与３日後に、Ｓｕｔｔｏｎ Ｒらの方法（Ｓｕｔｔｏｎ Ｒ ｅｔ ａｌ、Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ １９８６；４２：６８９−６９１）を参考にコラゲナーゼ処理後、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｃｏｎｒａｙを用いた密度勾配遠心法（Ｏｋｅｄａ Ｔ ｅｔ ａｌ、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ Ｊｐｎ １９７９；２６：４９５−４９９）を用いてＣ５７ＢＬ／６マウスから分離した膵島細胞２００個を経門脈的に肝内に同種同系移植した。移植したマウスを群分し、一方の試験群には、生理食塩液を急速投与した。もう一方の試験群には、トロンボモジュリン（ＴＭＤ１２３、１０ｍｇ／ｋｇ）を膵島移植の直前、移植後１２時間並びに２４時間にそれぞれ１回ずつ静脈内に急速投与した。膵島移植前及び移植後（週２ないし３回）に、尾静脈からヘパリン加採血し、得られた血漿中の血糖値をオートアナライザー（ベックマン）を用いて測定した。その結果、生理食塩液投与群（図１）では、膵島細胞２００個では血糖値は正常化しなかったが、トロンボモジュリンの投与により血糖値は正常化した（図２）。トロンボモジュリンが移植後膵島グラフトの障害を防ぎ、血糖値をコントロールすることが示された。
【図面の簡単な説明】
【０１１２】
【図１】ストレプトゾトシン誘発I型糖尿病マウスに対する同種同系膵島移植における生理食塩液投与群（Ｎ＝５）の術後血糖値の推移を示す図である。ストレプトゾトシン誘発I型糖尿病マウスに、同種同系マウス（Ｃ５７ＢＬ／６）から単離した膵島２００個を、経門脈的肝内移植したもの。同系移植（Ｓｙｎｇｅｎｉｃ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔｓ）であり、この系では同種移植拒絶反応は発現しない。縦軸は非空腹時血糖値、横軸は移植後日数を示す。生理食塩液投与群の空腹時血糖値は上昇したままであることを示している。
【図２】ストレプトゾトシン誘発I型糖尿病マウスに対する同種同系膵島移植におけるトロンボモジュリン（ＴＭＤ１２３）投与群（Ｎ＝５）の術後血糖値の推移を示す図である。ストレプトゾトシン誘発I型糖尿病マウスに、同種同系マウス（Ｃ５７ＢＬ／６）から単離した膵島２００個を、経門脈的肝内移植したもの。同系移植（Ｓｙｎｇｅｎｉｃ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔｓ）であり、この系では同種移植拒絶反応は発現しない。縦軸は非空腹時血糖値、横軸は移植後日数を示す。ＴＭＤ１２３（１０ｍｇ／ｋｇ）、移植直前、１２時間、２４時間後の３回投与によって、移植後の血糖値が正常化することを示している。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
トロンボモジュリンを有効成分とする薬剤であって、該薬剤が膵島移植を受ける糖尿病患者及び／又は膵島移植を受けた糖尿病患者に投与され、膵島移植後の血糖値を正常化するための該薬剤。
【請求項２】
該トロンボモジュリンが可溶性トロンボモジュリンである請求項１に記載の薬剤。
【請求項３】
該トロンボモジュリンが、配列番号９又は配列番号１１に記載のアミノ酸配列をコードするＤＮＡを宿主細胞にトランスフェクトして調製された形質転換細胞より取得されるペプチドである、請求項１又は２に記載の薬剤。
【請求項４】
該トロンボモジュリンが、配列番号９もしくは配列番号１１のそれぞれにおける第１９〜５１６位の配列を有するペプチド、又は前記ペプチドのアミノ酸配列の１つ又は複数のアミノ酸が置換、欠失、又は付加されたアミノ酸配列を有しトロンボモジュリン活性を有するペプチドのいずれかである請求項１〜３のいずれかに記載の薬剤。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれかに記載の薬剤と免疫抑制剤とを組み合わせてなる薬剤であって、該薬剤が膵島移植を受ける糖尿病患者及び／又は膵島移植を受けた糖尿病患者に投与され、膵島移植後の血糖値を正常化するための該薬剤。
【請求項６】
請求項１〜４のいずれかに記載の薬剤、免疫抑制剤、及び糖尿病治療薬とを組み合わせてなる薬剤であって、該薬剤が膵島移植を受ける糖尿病患者及び／又は膵島移植を受けた糖尿病患者に投与され、膵島移植後の血糖値を正常化するための該薬剤。
【請求項７】
膵島移植を受ける糖尿病患者が、Ｉ型糖尿病患者である、請求項１〜６のいずれかに記載の薬剤。
【請求項８】
トロンボモジュリンを有効成分とする薬剤であって、該薬剤が膵島移植を受ける糖尿病患者及び／又は膵島移植を受けた糖尿病患者に投与されることにより糖尿病を治療及び／又は改善するための該薬剤。
【請求項１】
トロンボモジュリンを有効成分とする薬剤であって、該薬剤が膵島移植を受ける糖尿病患者及び／又は膵島移植を受けた糖尿病患者に投与され、膵島移植後の血糖値を正常化するための該薬剤。
【請求項２】
該トロンボモジュリンが可溶性トロンボモジュリンである請求項１に記載の薬剤。
【請求項３】
該トロンボモジュリンが、配列番号９又は配列番号１１に記載のアミノ酸配列をコードするＤＮＡを宿主細胞にトランスフェクトして調製された形質転換細胞より取得されるペプチドである、請求項１又は２に記載の薬剤。
【請求項４】
該トロンボモジュリンが、配列番号９もしくは配列番号１１のそれぞれにおける第１９〜５１６位の配列を有するペプチド、又は前記ペプチドのアミノ酸配列の１つ又は複数のアミノ酸が置換、欠失、又は付加されたアミノ酸配列を有しトロンボモジュリン活性を有するペプチドのいずれかである請求項１〜３のいずれかに記載の薬剤。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれかに記載の薬剤と免疫抑制剤とを組み合わせてなる薬剤であって、該薬剤が膵島移植を受ける糖尿病患者及び／又は膵島移植を受けた糖尿病患者に投与され、膵島移植後の血糖値を正常化するための該薬剤。
【請求項６】
請求項１〜４のいずれかに記載の薬剤、免疫抑制剤、及び糖尿病治療薬とを組み合わせてなる薬剤であって、該薬剤が膵島移植を受ける糖尿病患者及び／又は膵島移植を受けた糖尿病患者に投与され、膵島移植後の血糖値を正常化するための該薬剤。
【請求項７】
膵島移植を受ける糖尿病患者が、Ｉ型糖尿病患者である、請求項１〜６のいずれかに記載の薬剤。
【請求項８】
トロンボモジュリンを有効成分とする薬剤であって、該薬剤が膵島移植を受ける糖尿病患者及び／又は膵島移植を受けた糖尿病患者に投与されることにより糖尿病を治療及び／又は改善するための該薬剤。
【図１】
【図２】
【図２】
【公開番号】特開２００８−１８９５７４（Ｐ２００８−１８９５７４Ａ）
【公開日】平成２０年８月２１日（２００８．８．２１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−２４３３２（Ｐ２００７−２４３３２）
【出願日】平成１９年２月２日（２００７．２．２）
【出願人】（３０３０４６２９９）旭化成ファーマ株式会社 (105)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２０年８月２１日（２００８．８．２１）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年２月２日（２００７．２．２）
【出願人】（３０３０４６２９９）旭化成ファーマ株式会社 (105)
【Ｆターム（参考）】
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