膵管腺癌に関連する新規の抗原及び抗体
本発明は、ヒト膵管腺癌（ＰＤＡ）に関連して特異的に発現されるものとして同定された新規のヒトタンパク質抗原及びそれに関係する抗体を提供する。特に、新規のリン酸化されたα−エノラーゼアイソフォームが、膵臓由来の形質転換された細胞系の中で同定されており、かかるアイソフォームと結合する抗体が、ＰＤＡ患者の血清中に特異的に存在する。これらのタンパク質及び抗体はＰＤＡ及び共通の分子的機能を有するその他の癌の診断及び治療にとって有用であり得る。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒトの癌、特に膵臓由来の癌を診断し治療するための新規の手段に関する。
【背景技術】
【０００２】
膵管腺癌（ＰＤＡ）は、米国及び欧州において最も頻度の高い膵臓癌であり、癌による死亡の第４番目の原因である。大部分の患者は１２ヵ月以内で死亡し、診断後の５年生存率はわずか２％にすぎない。膵切除術が今なおＰＤＡの管理及び化学療法の要であり続けているが、生存率に関してはわずかな利点しか提供しない（Laheru D及びJaffee M、２００５年；Kleef Jら、２００６年）。
【０００３】
（モノクローナル抗体、ワクチン及び化学療法の使用を含めた）外科的及び医学的管理の改善にも関わらず、早期ＰＤＡ診断のためのマーカーは未だに数少なくまた信頼性の低いものである。膵臓癌の診断のために最も広く使用されている血清学的マーカーは、シアリル化ルイス血液型抗原ＣＡ１９−９であるが、その使用はほとんどが、ＰＤＡ診断ではなくむしろ療法に対する応答を監視することに向けられている。実際、この抗原は、（慢性膵炎又は胆道閉塞といったような）良性膵臓疾患に罹患した患者由来の血清中にも高濃度で存在して偽陽性を提供する可能性があり、母集団の５〜１０％においては全く発現されないことを理由として、全てのケースに使用することはできない（Okusaka Tら、２００６年）。
【０００４】
これらの理由から、生検及び組織病理学的評価といったような侵襲的手技を制限することを目的としてＰＤＡ診断において使用するため（Bouvet M, ２００４年；Brand R, ２００１年；Goggins M、２００５年；Leung Tら、２００５年）及び薬物候補を評価するため（Cohen S及びMeropol N、２００２年；Jimento A及びHidalgo M、２００６）の代替的バイオマーカーが承認審査段階にある。
【０００５】
（ＲＮＡ又はタンパク質レベルのいずれかに基づく）タンパク質発現の大規模分析を用いて候補のＰＤＡバイオマーカーを同定するために、様々な技術が近年利用されてきている。特に、二次元ゲル電気泳動法（２−ＤＥ）により分離され、癌患者からの血清抗体により認識され、そして質量分析法を用いて同定されるタンパク質を比較することにより、ＰＤＡ患者の血清中で液性応答を惹起する抗原を検出するために、プロテオーム技術が使用されてきた。タンパク質の分離、選択及び特徴付けのためのこのアプローチの変形形態は、ＳＥＲＰＡ（Klade Cら、２００１年）、ＰＲＯＴＥＯＭＥＸ（Lichtenfels Rら、２００３年）又はＳＰＥＡＲ（Unwin Rら、２００３年）といったように、文献中に異なる名称で記述されている。
【０００６】
これらの方法論に共通の研究作業前提は、癌によって特異的に発現される抗原（いわゆるヒト癌イムノーム）に対するＢ細胞レパートリーを特徴付けることによって、癌の免疫監視及び免疫編集に関与する特異的標的を定義付けし、無制御の細胞増殖及び転移を導く機序を理解することが可能であるはずである、というものである（Drake Cら、２００６年；Dunn Gら、２００４年）。
【０００７】
免疫療法は、膵臓癌の治療にとって貴重なアプローチであり得るということが示唆されてきた（Laheru D及びJaffee M、２００５年）。実際、ＰＤＡ特異的タンパク質候補のリストが、ＲＮＡレベルにおけるそれらの高い発現に基づいて（国際公開第０４／５５５１９号（WO04/55519））、あるいは血清試料及び／又は膵臓試料の大規模プロテオーム解析（Bhattacharyya Sら、２００４年；Cao Dら、２００５年；Cecconi Dら、２００３年；Chen Rら、２００５年；Gronborg Mら、２００６年；Honda Kら、２００５年；Koomen Jら、２００５年；Rodriguez Jら、２００５年；Shen Jら、２００４年、Rosty C及びGoggins M、２００５年；Sinha Pら、１９９９年；Yu Yら、２００５年）に基づいて作成されてきた。血清中のＰＤＡ診断のためのタンパク質候補は、フィブリノーゲンガンマ（Bloomston Mら、２００６年）、ＤＥＡＤ−Ｂｏｘタンパク質４８（Xia Qら、２００５年）、ＭＩＣ−１（Koopmann Jら、２００４年）、ＰＴＨ関連タンパク質（Bouvet Mら、２００１年）及びカルレティキュリン（Hong Sら、２００４年）である。
【０００８】
しかしながら、ＰＤＡの早期検出及びその他の膵臓病変又は癌との弁別のための信頼性の高いバイオマーカーがなおも必要とされている。
【発明の概要】
【０００９】
本発明は、ＰＤＡ患者由来の血清が、健康な個体から又はその他の病変に罹患した個体からの血清と比較した場合に、膵臓癌由来の細胞系の中で発現される特異的タンパク質に対する抗体を含有しているという観察事実に基づくものである。これらのタンパク質の存在は、正常な膵臓組織及びＰＤＡの膵臓組織から得た抽出物中でかかるタンパク質に特異的な精製済み抗体を使用することによって確認された。
【００１０】
本発明の主たる目的は、新規のα−エノラーゼアイソフォームの１つの中でも同様に判定済みである少なくとも３つの位置でリン酸化されているヒトα−エノラーゼ（ＥＮＯＡ）の新規のＰＤＡ関連アイソフォームにある。
【００１１】
本発明のさらなる目的は、これらのＥＮＯＡのリン酸化されたアイソフォームを結合させかつその他のＥＮＯＡアイソフォームからそれらを区別する抗体にある。これらの抗体は、モノクローナル抗体（特にヒトモノクローナル抗体）及び抗体フラグメントといったような任意の適切なフォーマットのものであり得る。
【００１２】
本発明においてＰＤＡ関連として定義付けされたタンパク質及びそれらを結合させる抗体（ならびにそれらを検出するためのその他のあらゆる特異的手段）を、ＰＤＡ診断方法において、ならびにＰＤＡを治療するための作用物質を識別するために使用することができる。特に、患者から得られた生体試料（例えば血清又は生検材料）中のＰＤＡ関連ＥＮＯＡリン酸化アイソフォームの抗体ベースの検出は、ＰＤＡの診断のため、疾病の進行を評価するため又はＰＤＡを治療するための薬物の効果を評価するための方法において使用可能である。
【００１３】
本発明のさらなる目的は、ＰＤＡの診断のため、疾病の進行を評価するため、又はＰＤＡを治療するための薬物の効果を評価するためのキットにおいて、本発明のＰＤＡ関連タンパク質及び／又はそれらを結合させる抗体のうちの少なくとも１つを含むキットにある。
【００１４】
膵臓癌の診断及び治療における特異的抗α−エノラーゼ抗体の定義付け及び使用に関するものを含めた本発明のその他の目的が、以下の記述の中で提供されている。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】ＰＤＡ（腫瘍）患者又は対照（健常）ドナーからのＣＦ−ＰＡＣ−１細胞（腫瘍細胞）及び血清を用いたＰＤＡ関連タンパク質抗原及び抗体を特徴付けするために適用されるＳＥＲＰＡ方法の概略的表示である。
【図２】（Ａ）ＰＤＡ関連タンパク質の発現を検出するための検定としてＣＦ−ＰＡＣ−１細胞系からタンパク質抽出物を使用して調製された２−ＤＥゲル。細胞抽出物中のタンパク質は、その分子量及びＰＩに応じてゲル中で分離され、銀染色を用いて顕示された。ＰＤＡ血清でのウエスタンブロット法において存在するものの対照血清では存在しないスポットの位置は、標示されている（各番号に対応する特異的タンパク質の名称は、表１に列挙されている）。（Ｂ）標示されたＰＤＡ関連タンパク質を認識する抗体を含有する、異なる病期（ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ）における慢性膵炎（ＣＰ）又はＰＤＡに罹患した患者（各グループ内の患者の数はｎとして標示されている）からの血清の百分率を表わすヒストグラム。頭文字に対応するタンパク質のフルネームは表Ｉに標示されている。
【図３】ヒトα−エノラーゼ（ＥＮＯＡ；SWISSPROT Acc. No. P06733；配列番号１）及びヒトガンマエノラーゼ（ENOG SWISSPROT Acc. No. P09104；配列番号２）タンパク質配列のアライメント（２つのタンパク質の中で同一であるアミノ酸は「：」で標示され、一方保存されているだけのタンパク質は「・」で標示されている）。２−ＤＥゲルスポットにおいて質量分析法によって同定されＥＮＯＡアイソフォームをかかるスポットに割当てるために使用されてきたペプチドの配列には下線が付されている。
【図４】異なるアルゴリズムによって予測されかつ／又は実験により同定されるヒトα−エノラーゼ（ＥＮＯＡ）のタンパク質配列内のリン酸化部位（太字、下線）の位置（タンパク質配列の下の小文字；参考文献については凡例を参照のこと）。ＥＮＯＡアイソフォーム３中でリン酸化されているものとしてＥＮＯＡ中で同定されたペプチドは、普通線（normal line）でとり囲まれている。ＥＮＯＡアイソフォーム３中でリン酸化されていないものとして同定されたペプチドは、破線でとり囲まれている。
【図５】（Ａ）異なる手段による６個のα−エノラーゼアイソフォーム（ＥＮＯＡ１，２，３，４，５，６）の検出。ＥＮＯＡ１／２及び３の位置は、白色矢印で標示されている。（Ｂ）膜上に移されその後一次抗体として抗ＥＮＯＡを用いてウエスタンブロット法でテストした正常な膵臓組織由来又はＰＤＡ患者の膵臓組織由来のタンパク質抽出物の中の６個のα−エノラーゼアイソフォーム（１、２、３、４、５、６）の検出。ＥＮＯＡ１／２アイソフォームの位置は、白色矢印で標示されている。ゲル上に投入されたタンパク質量の対照として、膜をウサギポリクローナル抗ヒトアクチン抗体（希釈度１：１００００；Sigma Chemical Co.）でプローブした。
【図６】組換え型ヒトα−エノラーゼ（＋ｒＥＮＯＡ又はｒＥＮＯＡ）での予備吸着を伴う又は伴わないＰＤＡ患者の血清のプールを（一次抗体として）用いた、２−ＤＥゲル及びウエスタンブロット法によるＣＦ−ＰＡＣ−１細胞抽出物中の６個のα−エノラーゼアイソフォーム（スポット１、２、３、４、５、６）の検出。代替的には、ＰＤＡ患者血清のプールを（一次抗体として）用いて、ウエスタンブロット法を実施する前にホスファターゼ（＋λＰＲＡＳＥ）で膜を前処理した。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
生化学的及びプロテオーム技術を組合せた形で使用することにより、疾患関連生体試料中に存在する個々のタンパク質の同定及び評価を可能にする。当該ケースにおいては、このタイプの分析は当初癌（ＰＤＡ）に向けられ、潜在的にＰＤＡの腫瘍形成及び／又は進行に関連付けされる抗体を含有する、膵管腺癌（ＰＤＡ）患者の大規模パネルから得た血清及びヒトＰＤＡから導出された細胞系（ＣＦ−ＰＡＣ−１）という２つの疾患関連分子が使用された。
【００１７】
これらの血清のウエスタンブロット分析によりＣＦ−ＰＡＣ−１抽出物中で検出された免疫反応性タンパク質のプロファイルを、ＣＦ−ＰＡＣ−１プロテオーム中のＰＤＡ関連抗体及びそれに関係する抗原の候補を立証する目的で、異なる対照集団（健康な対象、非ＰＤＡ腫瘍患者、慢性膵炎患者）からの血清を使用して得られたものと比較した（図１）。
【００１８】
全く異なる公知の生物活性を有する限定された数のタンパク質（代謝酵素及び細胞骨格タンパク質を含む）に対する抗体は、ＰＤＡ患者由来の血清中に選択的に存在することが発見されており、このことは、これらのタンパク質がＰＤＡ関連性を有し、ＰＤＡ患者においてはインビボ抗体応答を誘発し、健康な対象又は非ＰＤＡ癌患者においてはこれを誘発しない、ということを示唆していた。
【００１９】
本発明においてＰＤＡ関連として定義付けされたタンパク質及び抗体（及びこれらを検出するためのその他のあらゆる特異的手段）は、ＰＤＡ診断のための方法において、ならびにＰＤＡを治療するための作用物質を同定するために使用可能である。
【００２０】
ＰＤＡ関連ヒトタンパク質パネル（α−エノラーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、レチナール・デヒドロゲナーゼ−１、グルコース−６−リン酸−１−デヒドロゲナーゼ、伸長因子Ｔｕ及びイソクエン酸デヒドロゲナーゼ、ケラチンＩ型細胞骨格（cytoskeletal）１０、コフィリン１を含む；図２Ｂ及び表Ｉ）は、タンパク質の分離及び分析のための２−ＤＥ及び質量分析法技術を用いて、ＰＤＡ血清中に特異的に存在する抗体についての抗原として定義付けされた。その上、これらの抗原に対する精製済み抗体が、その差次的発現ひいては、ＰＤＡの早期診断のために（血清、完全又は部分的に精製された抗体、ポリクローナル抗体調製物及びペプチドを含めて）これらを検出するためそして患者の体内におけるこの癌の進行を評価するためのあらゆるタンパク質ベースの手段の有用性、を確認した。
【００２１】
これらのタンパク質は、各々個別に又は組合せた形で、ＰＤＡの早期診断のためのバイオマーカーとして、及び患者の体内でのこの癌の進行を評価するために使用することができる。これらのバイオマーカーのうち、２−ＤＥ及びウエスタンブロット法を用いて同定されるＥＮＯＡ１／２（α−エノラーゼアイソフォーム１及びアイソフォーム２）及びＣＯＦ１（コンフィリン１）が、最も信頼性の高いＰＤＡ関連タンパク質抗原であるように思われる。
【００２２】
実施例中に示されているように、かかるＰＤＡ関連抗原を結合させる抗体を、以上で列挙した範囲について使用することができる。かくして、生体試料（例えば血清、生検材料又は細胞／組織タンパク質抽出物）中のこのような抗原及び／又は抗体の検出を含む方法によって、ＰＤＡの早期診断及び患者の体内でのＰＤＡ進行の評価が可能である。
【００２３】
ＰＤＡ関連抗原の特徴付けは、以下で記述されている１つのケースを除いて、ＰＤＡ関連タンパク質内の何らかの翻訳語修飾の定義付けにまで拡張されなかった。データは、（表Ｉ右欄について使用されている精製済み抗体のような）所与の抗原の全てのアイソフォームに共通のエピトープ、又は（ＰＤＡ患者の血清中に存在しＰＤＡの進行中に測定されたもののような（図２参照））ＰＤＡ関連翻訳後修飾を含有するアイソフォーム（単複）のみに共通のエピトープを特異的に結合させるあらゆる抗体又はペプチドが、ＰＤＡの診断及び進行のために使用可能であるということを示唆している。
【００２４】
ＰＤＡを治療するための新規の治療用化合物を提供することに関心が寄せられていることから、生体試料中のＰＤＡ関連抗原及び抗体（ならびにその結合特性）の検出を含む方法は、ＰＤＡを治療するための薬物候補を評価するためにも使用することができる。このアプローチは、ＥＮＯＡアイソフォーム（ＥＮＯＡ１／２）での実施例において示されているように、ＰＤＡ関連タンパク質及び／又は抗体の存在を比較することのできる検定において応用することができる。
【００２５】
実施例及び文献中に記述されている生化学的及びプロテオーム技術を用いて立証できかつ候補化合物に対する曝露の後に見られるこれらの特性の変化は、ＰＤＡ腫瘍形成及び転移を導く生物学的経路を標示する可能性がある。例えば、患者又は動物モデルの血清中のＰＤＡ関連抗原に対する一次抗体の消滅、ならびに、抗原特異的抗体を用いた細胞抽出物中のウエスタンブロット法によるスポット数の減少を検出することによって、１つの化合物のＰＤＡ特異的活性を確認することができる。
【００２６】
候補化合物は、ＰＤＡ関連タンパク質（例えばＣＯＦ１又はＥＮＯＡ１／２など）として本発明で定義付けされているものを含め、あらゆる潜在的ＰＤＡ治療標的に指向させることができる。例えば、化合物は、それらを結合させる抗体（全般又は特異的アイソフォームのみ）の形、あるいは、修飾をもたらす酵素の活性を変調させることによりその発現又は翻訳後修飾を改変させる小分子の形をとることができる。その上、マウスモノクローナル抗体といったようなヒトα−エノラーゼを結合させる抗体が、６個のα−エノラーゼアイソフォーム（すなわちウエスタンブロット法においてＰＤＡ患者の血清を用いて検出されるようなＥＮＯＡ１／２を含む）を提示する膵臓由来の形質転換された細胞系のインビトロ成長及び増殖を阻害する、ということが発見された。インビトロ成長及び増殖に対するこの阻害効果は、このような６個のα−エノラーゼアイソフォームを提示する非膵臓由来の形質転換された細胞系についても観察されたが、わずか３個のリン酸化されていないこれらのアイソフォームしか提示しない細胞系では観察されておらず（実施例３；図５Ｂ；表ＩＶ）、ＰＤＡの治療のために抗ＥＮＯＡ抗体を使用する可能性が示唆されている。
【００２７】
このとき、シグナル変換に影響を及ぼすペプチド、ペプチド類似体及び小分子といったような異なる化合物の効果を確認するためにすでにテストされた、細胞系又は動物モデルを使用する膵臓細胞用増殖検定のいずれかにおいてかかる潜在的な治療的特性を評価することができる（Beker Cら、２００２年；Bauer Tら、２００５年；Bruns Cら、２０００年；Lee Lら、２００２年；Levitzki A及びMishani E、２００６年；Qin Yら、１９９５年；Yezhelyev Mら、２００４年；Rubio-Viqueira Bら、２００６年）。その上、膵臓癌をさらに効果的に治療するため異なる分子標的をターゲティングする化合物の組合せを使用する可能性が実証されてきた。例えば、細胞膜レセプタに特異的なキナーゼの阻害物質と共に化学療法試薬を投与することで、動物モデルにおいて実験的ヒト膵臓癌の成長が阻害され、生存期間が有意に延長された（Yokoi Nら、２００５年）。代替的には、ウイルス又はヒトの標的に向けられた２つ以上の抗体が１つの医薬組成物に組合わされた場合、結果として得られる組成物は、相加効果のみならず相乗効果に起因して、改善された治療的及び／又は診断的効能を示し得るということが記述されてきた（Logtenberg T、２００７年）。
【００２８】
ＰＤＡ関連タンパク質（例えば、ＥＮＯＡ１／２）に対する抗体を含む医薬組成物を、ヒトにおける治療及び診断を目的として投与することができる。かくして、ＰＤＡの治療又は診断のための方法は、ＰＤＡ関連タンパク質（例えばＥＮＯＡ１／２）に対する抗体を含む医薬組成物の投与を含み得る。
【００２９】
組成物は、共通の医薬賊形剤を含んでいてよく、単回又は複数回投薬量で、及び／又は適切なデバイスを用いて、筋内、静脈内、皮下、局所、粘膜経由といった様々な経路を通して、非生分解性／生分解性マトリクス材料中で、又は微粒子薬物送達系を用いて、投与可能である。特に、該組成物は、膵臓又はＰＤＡ関連タンパク質が存在し得るその他のあらゆる組織に対する有効な投与を可能にするはずである。
【００３０】
医薬組成物は、化合物が充分な時間にわたりその活性を及ぼすことができるようにする治療上又は予防上有効な量の化合物を提供すべきである。所望の効果は、ＰＤＡの成長及び増殖を制御すること及びＰＤＡの臨床症状の少なくとも一部分を減少させることによって、ＰＤＡ患者の状態を改善することである。例えば、組成物は、投与経路及び個体の状態に応じて、体重１ｋｇあたり約０．００５〜約５０ｍｇの有効量で投与されるべきである。
【００３１】
診断的な用途を有する組成物の場合には、化合物は、生体試料中のウイルスを検出するため臨床及び研究用実験室で一般的に公証済みの技術（例えばＥＬＩＳＡ又はその他の血清学的検定）を用いて、またインビボで対象に対し投与される場合には投与から少なくとも１、２、５、１０、２４時間以上後で検出されるはずである。ＰＤＡ関連タンパク質及び／又は抗体の検出は、ＰＤＡを診断するために立証された公知の手段及び手順にしたがって又はこれらと組合せた形で、本発明のＰＤＡ関連タンパク質及び／又は抗体を用いて実施可能である。
【００３２】
ＰＤＡの療法及び／又は診断のための臨床的な開発及び使用は、抗体の薬物動態及び薬物力学の特徴付け（Lobo Eら、２００４年）、データ前臨床及び臨床安全性（Tabrizi M及びRiskos L、２００７年）、そしてヒトにおける治療及びインビボ診断用の使用のためのモノクローナル抗体の生産及び品質管理に関する国際規定要件の遵守（Harris Rら、２００４年）に基づくべきである。
【００３３】
患者の体内でのＰＤＡ診断用のキットは本発明において定義されている通り以上で定義したＰＤＡ関連タンパク質及び／又は抗体を１つ以上とそれらの検出を可能にするその他のあらゆる化合物を含み得る。これらのキットは、標識された／されない抗原、抗体、又は（例えば酵素活性をもつものとして同定されたものの場合のように）かかる抗原との相互作用の後に修飾される基質を含むことができる。
【００３４】
ＰＤＡに対する液性応答の標的となるもののうち、最も有利であるのは、新規のα−エノラーゼのリン酸化されたアイソフォームがＰＤＡ血清により認識されるという事実である。ヒトα−エノラーゼの新規のアイソフォーム（ＥＮＯＡ）は少なくとも３つの位置でリン酸化されており、合計７つのリン酸化部位が同定されている（図４）。この事実の重要性は、ＰＤＡ患者から得られた血清を用いた又はＰＤＡ患者から得た膵臓組織内での２つのリン酸化度の高いＥＮＯＡアイソフォーム（ＥＮＯＡ１／２）の特異的検出によって裏付けられる（図２Ｂ、５及び６、表Ｉ及びＩＩ）。ＰＤＡ患者は、本発明のリン酸化度の高いＥＮＯＡアイソフォームを特異的に結合する抗体を提示する。
【００３５】
実施例は、ＥＮＯＡ配列内の複数の位置がリン酸化され得るにせよ、トレオニン、セリン及びチロシン残基の精密な組合せが、細胞系及びＰＤＡ組織の両方において実際にリン酸化され、ＰＤＡ患者により産生されたヒト抗体によって検出される、ということを示している。特に、トレオニン５５、チロシン５７、チロシン２００、チロシン２３６、トレオニン２３７、チロシン２５７及びセリン４１９におけるリン酸化が、ＥＮＯＡアイソフォーム３内に存在し、このアイソフォームは、ＥＮＯＡ１／２と同様、ホスファターゼによる処置により改変されるタンパク質リン酸化プロファイルを示す。患者から得た生体試料を用いてＰＤＡを診断し、疾病の進行を評価するために、タンパク質リン酸化の類似の変化を使用することができる。
【００３６】
完全ＥＮＯＡ１／２アイソフォームの代替として、図４（囲みのある配列を参照のこと）で同定されたもののようなＥＮＯＡ１／２と同じリン酸化された残基を提示するＥＮＯＡ由来の単一ペプチド、それらを含むタンパク質配列又はそのライブラリ及び組合せを生成することが有用であり得る。かかるリン酸化されたタンパク質及びペプチドを生成し使用するための方法が、文献中で開示されている（Conrads Tら、２００２年；米国特許第７６３１６４号（US763164）；国際公開第９７／３００９７号（WO97/30097））。
【００３７】
α−エノラーゼ（特にＥＮＯＡ１／２）中の翻訳後の修飾の数及び効果は、ＰＤＡ関連及び対照の試料において、公知の技術によってさらに確認することができる（Kalume Dら、２００３年；Machida Kら、２００３年；Mann Mら、２００２年；Rush Jら、２００５年；Molina Hら、２００７年；Schmeizle K及びWhite F、２００６年；Wu Jら、２００５年）。ＥＮＯＡについて公知の付加的なリン酸化及び／又は修飾（表ＩＩＩ）は、ＥＮＯＡ１／２内に存在し、これらのアイソフォームの抗原性及び生物活性ならびにアイソフォーム特異的抗体によるそれらの検出に適切であり得る。特定の病期／疾病タイプに付随する翻訳後修飾は、その他のタンパク質について示されているように、特異的修飾を有するアイソフォームを区別する抗体又は直接的タンパク質分析を含めた複数の手段によって検出可能である（Edberg Dら、２００５年；Mandell J、２００３年）。
【００３８】
２−ＤＥ及びウエスタンブロット法により非ＰＤＡ／ＰＤＡタンパク質抽出物内で差次的に発現されたタンパク質アイソフォームに対するその結合を通して定義付けされる抗体、特にモノクローナル抗体を、２−ＤＥ及びウエスタンブロット法で類似のプロファイルを有する癌の治療において使用することが可能である。かくして、ＰＤＡ治療用の医薬組成物の調製において及び、ＰＤＡ患者又はα−エノラーゼについて類似の発現プロファイルを提示する（すなわち少なくとも３つの位置でリン酸化されている本発明のヒトα−エノラーゼの新規のアイソフォームを発現する）癌患者の治療的処置のための方法において、α−エノラーゼ（全般又は特に特異的リン酸化アイソフォーム）を結合させる抗体を使用することができる。
【００３９】
リン酸化されたα−エノラーゼのアイソフォームが患者の血清中に存在することによって特徴付けされる（ＰＤＡといったような）癌の検出又は治療のために、抗体を使用することが可能である。これらの抗体は、診断上又は治療上の利点をもつ抗体を同定し、特徴付けしかつ生産するための公知の技術のうちの任意のものを応用して生成することができる（Jain Mら、２００７年；Laffly E及びSodoyer R、２００５年）。抗体は、Ｓｃｆｖ（一本鎖可変フラグメント）、Ｆａｂ（可変重／軽鎖ヘテロ２量体）、ダイアボディ、単離重鎖又は軽鎖、ペンタボディ又は二重特異性抗体といったような異なる名称で文献中に記述されている、完全抗体（例えばモノクローナル抗体、特にヒト又はヒト化モノクローナル抗体）、抗体フラグメント、抗原結合タンパク質、及びその他の工学処理された抗体ベースの融合タンパク質及びペプチドのように、機能的抗体についてのあらゆるタンパク質フォーマットで生成され得る。
【００４０】
本発明の抗体は、治療用、安定化用、標識用又は診断用の作用物質に対する融合又は（化学的リンカー又は重合体を用いた）接合によって改良することができる。これらの作用物質の例としては、結合させることのできる検出可能な標識分子（例えば放射性同位元素、螢光化合物、毒素、金属原子、化学発光性化合物、生物発光性化合物、ビオチン、酵素基質又は酵素）がある。ＥＮＯＡ特異的活性は、同様に、診断又は治療の利用分野において代謝及び／又は安定性を改変させるタンパク質又は重合体といったようなもう１つの治療用タンパク質との融合によっても改良され得る。
【００４１】
タンパク質部分、リガンド及び適切なリンカーを選択し設計するための手段ならびに融合タンパク質の構築、精製、検出及び使用のための方法及び戦略が、文献中で提供されており（Nilssonら、１９９７年、「キメラ遺伝子及びハイブリッドタンパク質の応用」Methods Enzymol. 第３２６〜３２８巻、Academic Press、２０００年；国際公開第０１／７７１３７号（WO01/77137））、臨床及び研究実験室において一般的に利用可能である。例えば、融合タンパク質は、融合タンパク質のインビボ及び／又はインビトロ同定を容易にし得る（ポリヒスチジン、ＦＬＡＧ、ｃ−Ｍｙｃ又はＨＡタグといったタグを含む）市販の抗体によって認識される配列を含有していてよい。その他のタンパク質配列は、（緑色螢光タンパク質の場合のように）直接螢光分析によって、又は（タンパク質分解部位などを用いる）特異的基質又は酵素によって、容易に同定可能である。
【００４２】
（ＥＮＯＡ１／２といったような）ＰＤＡ特異的タンパク質配列を認識する抗体又はこのような抗体から誘導されたその他のあらゆるタンパク質配列は、原核又は真核宿主細胞であり得る適切な宿主細胞を形質転換するためにかかるベクターを用いて組換え型タンパク質として発現され得、所望の組換え型タンパク質の分泌を可能にするはずである。かかるタンパク質を生産するための方法としては、タンパク質の発現に適した条件下でそのコーティング配列を含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞を培養すること、及び宿主細胞培養からタンパク質を回収することが含まれる。
【００４３】
原核又は真核宿主細胞内への発現のためのベクターは、Oxford Univ. Pressにより刊行された「実践アプローチ」シリーズ内の出版物を含め、組換え型タンパク質のクローニング及び生産方法についての書籍及び雑誌の中で記述されている（「ＤＮＡクローニング２：発現系」、１９９５年；「ＤＮＡクローニング４：哺乳動物系」、１９９６年；「タンパク質の発現」、１９９９年；「タンパク質精製技術」、２００１年）。所望の抗体フォーマット（Ｓｃｆｖ、ＦＡｂ、抗体フラグメント、完全ヒト抗体、など）、又は１つ以上の内部アミノ酸の挿入、置換又は除去に関係して、付加的なタンパク質配列を付加することが可能である。これらの技術は、同様に、タンパク質全般そして特に抗体の治療的特性のさらなる構造的及び機能的特徴付け及び最適化のためにも使用可能である（Kim Sら、２００５年）。
【００４４】
本発明についてここで以下の実施例を用いて記述するが、これらの実施例は本発明をいかなる形であれ制限するものとしてみなされるべきではない。
【実施例】
【００４５】
実施例１：ＣＰ−ＰＡＣ−１細胞系のプロテオームにおけるＰＤＡ関連液性抗原の検出
材料と方法
ヒト血清
血清試料は、患者及び健康なドナーのインフォームドコンセント及び医療機関の倫理委員会からの承認を得て、静脈血から単離させた。使用するまで、試料を−８０℃で保管した。
【００４６】
７０人のＰＤＡ患者（男性３１名、女性３９名；年令範囲３２〜８６才；平均年令±標準偏差：６７±１１才）を、一般的に使用されている分類（Faria Sら、２００４年）及びＵＩＣＣ（Union International Contre le Cancer（国際対癌協会））分類にしたがって、以下の通りの異なる臨床的病期にグループ分けした：第ＩＩ期（転移なし、分化度中）１７名、第ＩＩＩ期（転移なし、分化度低）１７名、及び第ＩＶ期（遠隔転移、未分化）。
【００４７】
これらの血清の反応度を、癌又は自己免疫疾患の前歴のない対照として使用された４０名の健康な対照（男性１４名、女性２６名、年令範囲５７〜７７才；平均年令±標準偏差：７０±７才）のものと比較した。さらに、これらの血清の反応度を、３０名の非ＰＤＡ癌患者（肝細胞癌患者９名、乳癌患者１２名、結腸癌患者８名、そして卵巣癌患者１名；男性１１名、女性１９名；年令範囲４４〜７９才；平均年令±標準偏差６６±１０）及び１５人の慢性膵炎患者（男性９名、女性６名、年令範囲４９〜７６才；平均年令±標準偏差：５９±８才）のものと比較した。
【００４８】
血清を提供する患者の異なるグループ間の年令及び性別分布は、独立両側スチューデントｔ−検定によって評価される通り、充分有意な差異を示さなかった。慢性膵炎は一般にＰＤＡよりも若い年令（平均４４才前後）で発生することから、この疾病のグループにおいてのみ、これら２つのグループの年令分布は有意に異なっていた（性別分布は有意に異なっていなかった）。
【００４９】
細胞系及び細胞抽出物調製
膵管腺癌（Schoumacher Rら、１９９０年）から誘導したＣＦ−ＰＡＣ−１細胞系（ＥＣＡＣＣ、照会番号９１１１２５０１）由来の細胞（１０7）を収穫し、ハンクス液（Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA）で洗浄した。ペレットを一晩、凍結乾燥させ、−８０℃に保管した。２００μｌの再水和緩衝液［５Ｍの尿素、２Ｍのチオ尿素、４％ｗ／ｖのＣＨＡＰＳ（Sigma Chemical Co.）、２％ｖ／ｖのＩＰＧ緩衝液３〜１０ＮＬ（GE Healthcare Bio-Sciences, Uppsala, スウェーデン）、８０ｍＭのＤＴＴ（Sigma Chemical Co.）］及び微量のブロモフェノール・ブルー（Sigma Chemical Co.）中にペレットを再懸濁させた。タンパク質濃度をブラッドフォード検定（Bio-Rad Laboratories）で測定した。
【００５０】
二次元ゲル電気泳動（２−ＤＥ）
ＣＦ−ＰＡＣ−１細胞系由来のタンパク質抽出物１００μｇを、分析用及び分取用ゲルのため、７ｃｍのＩＰＧストリップ上へのゲル中（in gel）再水和（ｐＨ３〜１０ＮＬ）により投入した。合計１６０００Ｖｋの間、最高５０００Ｖまでの電圧勾配で、ＩＰＧphorＩＥＦユニットシステム（GE Healthcare Bio-Sciences）上で、等電点電気泳動法（ＩＥＦ）を実施した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥの前に、ＩＰＧストリップを１５分間、トリス／ＨＣｌ緩衝液（５０ｍＭ；ｐＨ８．８）、尿素（６Ｍ）、グリセロール（３０％ｖ／ｖ）、ＳＤＳ（２％ｗ／ｖ）及びＤＴＴ（２％ｗ／ｖ）の溶液中で平衡化し、その後ＤＴＴに代ってブロモフェノール・ブルー及びヨードアセトアミド（２．５％ｗ／ｖ）を含有する同じ緩衝液中でさらに５分間平衡化した。第２次元については、恒常な２００ＶでNovex X-Cell IITMミニ−セルシステム（Invitrogen）を用いて、小さいNuPAGE（登録商標）Novex（登録商標）４〜１２％Bis-Trix Zoom（登録商標）プレキャストゲル（Invitrogen, Groningen、オランダ）上に７ｃｍのストリップを走らせ、これをNovex X-Cell IITMブロット・モジュール（Invitrogen）を用いてHybond ECLニトロセルロース膜（GE Healthcare Bio science）上に移すか、又は質量分析法による分析のために銀染色した（Shevchenko Aら、１９９６年）。
【００５１】
タンパク質スポットのＰＩ値を、GE Healthcare Bio-Sciencesにより提供されたｐＨ勾配グラフを用いて２−ＤＥゲル上のそれらの位置から推定した。タンパク質の分子量を、公知の分子量のSeeBlue Plus 2予備染色標準（Invitrogen）の移動との比較によって計算した。「ImageScanner」（GE Healthcare Bio Sciences）で２−ＤＥゲル画像を獲得し、「ImageMaster Labscan Ver 3.00」ソフトウェア（GE Healthcare Bio-Sciences）を用いてＴＩＦＦ書式で記録した。
【００５２】
膜を１５分間４℃で、５％の脱脂粉乳を含有するＴＢＳから成る遮断用緩衝液と共にインキュベートし、その後、スクラム（０．０５％のTween 20及び５０％の脱脂粉乳を含有するＴＢＳ中の１：２００の作業希釈液）と共に４時間インキュベートした。洗浄後、室温で９０分間１：１０００希釈度のホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）−接合型ウサギ抗ヒト免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）抗体（Santa Cruz Biotechnology）と共に膜をインキュベートした。
【００５３】
代替的には、精製された一次抗体を用いたウエスタンブロット分析のため、２−ＤＥゲルからブロッティングしたニトロセルロース膜を、マウス由来の抗体［例えばモノクローナル抗体、抗エノラーゼ１９／１２8（Moscato Sらにおいて特徴付けされたクローン１９／１２のサブクローン）、抗トリオースリン酸イソメラーゼ１（Abnova Corporation）、抗ケラチン１０（Chemicon International）、抗伸長因子ｔｕ（Abnova Corporation）］、か又はウサギ由来の抗体［例えばポリクローナル抗体、抗アルデヒドデヒドロゲナーゼ１（Chemicon International）、抗グルコース−６リン酸１−デヒドロゲナーゼ（Bethyl laboratories）、抗イソクエン酸デヒドロゲナーゼ（Biogenesis Ltd）及び抗−コフィリン１（Cell Signaling）］のいずれかの１：１０００希釈液を用いて、２５℃で１時間プローブした。その後、メーカーの指示事項にしたがって、抗マウスＩｇＧ又は抗ウサギＩｇＧのいずれかの特異的二次ＨＲＰ接合型ヤギ抗体と共に一時間膜をインキュベートした。
【００５４】
５０ｍＭのＴＲＩＳ／ＨＣｌｐＨ７．４、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１％のＮＰ４０、１％のTriton X-100、１ｍＭのＤＴＴ、１０μｌ／ｍｌの阻害性カクテル、１ｍＭのＰＭＳＦ（全てSigma Chemical Co.）及び１０μｌ／ｍｌのヌクレアーゼミックス（GE Healthcare Bio-Sciences）を含有する４００μｌの溶解緩衝液中で、氷上で均質化された合計３０〜５０ｍｇの新鮮な凍結組織（Ｔ１８基本Ultra Turrax）を用いて、膵臓組織のウエスタンブロット分析を実施した。超音波処理装置（Hielscher UP 200S、３×４０秒、振幅４０％、サイクル０．５）での超音波処理の後、ミックスを遠心分離した（３０分間４℃で１３０００ｒｐｍ／分）。上清中に含有されブラッドフォード検定（Bio-Rad Laboratories）で測定されたタンパク質抽出物２０μｇを、小さいNuPAGE（登録商標）Novex（登録商標）４−１２％Bis-Trisプレキャストゲル（Invitrogen）上に走らせ、以上で記述した通りニトロセルロース膜に移した。
【００５５】
ＥＣＬ（増強化学発光、GE Healthcare Bio-Sciences）により免疫検出を実施し、その後ハイパーフィルム（GE Healthcare Bio-Sciences）上でのオートラジオグラフィを行なった。現像したフィルムの画像を「Image Scanner」（GE Healthcare Bio-Sciences）で獲得し、「Image Master Labscan Ver 3.00」ソフトウェア（GE Healthcare Bio-Sciences）でＴＩＦＦ書式で記録し、Image Master 2D Eliteバージョン３．１ソフトウェア（GE Healthcare Bio-Sciences）を用いて解析した。
【００５６】
質量分析法（ＭＳ）によるタンパク質の同定
ＭＳ分析のために、関心対象のスポットを分取２−ＤＥゲルから切除し、マトリクス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析法（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）そして必要な場合には電子スプレーイオン化（ＥＳＩ）によって分析した。
【００５７】
タンパク質を２５ｍＭの重炭酸アンモニウム及び５０％のアセトニトリルの溶液で一晩脱染し、その後、以前に記述された通り（Hellman Uら、１９９５年）トリプシンを用いてゲル中（in gel）で消化させた（Promega, Madison, WI, USA）。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳのためには、標的ディスクに０．５μＬの各々のペプチド混合物を塗布し、空気乾燥させた。その後、０．５μＬのマトリクス（３０％のアセトニトリル、０．１％のＴＦＡの溶液中の１％ｗ／ｖのα−シアノ−４ヒドロキシ桂皮酸）を乾燥した試料中に塗布し、再び乾燥させた。Bruker Reflex III ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦスペクトロメータを用いてスペクトルを得た。タンパク質消化物のＭＳスペクトル解釈を、ＭＳ−Ｆｉｔソフトウェア（http://prospector.ucsf.edu ：Chamrad Dら、２００４年）を用いて「ペプチド質量フィンガプリント法」（ＰＭＦ）により行なった。
【００５８】
ＭＳ／ＭＳ実験のため、トリプシンペプチド混合物をZip Tip C18デバイス（Millipore）内で脱塩及び濃縮した。６０％のメタノールプラス１％の蟻酸での溶出の後、４．５μｌのトリプシンペプチド混合物を金コーティングされたホウケイ酸塩毛細管（Proxcon Biosystems）内に導入し、ナノＥＳＩ源が取付けられたＬＣＱ Thermo（Thermo Finnigan）イオントラップ質量分析計の中で分析した。毛細管の電圧を４６Ｖに、そしてスプレー電圧を１．８ｋＶに設定した。フルスキャン質量スペクトルからの最も安定した信号を捕捉し、２２〜２４％の範囲内の正規化した衝突エネルギーで低エネルギー衝突誘発型解離（ＣＩＤ）によりフラグメント化した。
【００５９】
一部のタンパク質は同様にＥＳＩイオン源の備わったＬＣＱ ＤＥＣＡ ＸＰプラスイオントラップ質量分析計（Thermo Finnigan）を用いて、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳによっても同定された。クロマトグラフィ分離とそれに続くＭＳ分析装置は、１０μＬの注入体積そして２００μｌ／分の流速で、Surveyor（オートサンプラ及びポンプ）計器（Thermo Finnigan）を用いて、Ｃ１８カラムＬｕｎａ、１５０×２．０ｍｍ（Phenomenex）上で行なわれた。
【００６０】
全てのＭＳ／ＭＳデータ解析について、Bioworks 3.0（Thermo Finnigan）ソフトウェアを使用し、結果としての配列を、ＦＡＳＴＡソフトウェア（http://www.ebi.ac.uk/fasta33/；Johnson Rら.,２００５年）を用いてＥＢＩデータベース中に存在するヒトタンパク質の配列と比較した。
【００６１】
統計的分析
全ての統計をGraph Pad Prism Softwareを用いて計測した。データを平均±ＳＥＭ（標準誤差）として提示した。ＰＤＡ及び正常な膵臓組織の中での異なるタンパク質発現の有意性を査定するために、対応のない両側（2-tailed）ｔ検定を使用した。０．０５未満の両側（2-sided）Ｐ値が、統計的に有意であるとみなされた。
【００６２】
結果
ＰＤＡ関連タンパク質発現及び細胞増殖のためのモデルとして使用されることの多いＣＦ−ＰＡＣ−１細胞系のプロテオーム（Bouvet Mら、２００１年；Szepeshazi Kら、２００５年）を使用して、一次抗体の供給源としてＰＤＡ患者からの血清を用いてＰＤＡに関連するタンパク質及び抗体の存在を同定した。
【００６３】
この細胞系からのタンパク質抽出物を２−ＤＥによって分析し、銀染色により代表的２次元マップを定義付けした。このアプローチにより、２−ＤＥゲル内のその強度及び位置にしたがって分類できかつそれについてタンパク質の量、分子量及びｐＩを近似的に決定することのできる「スポット」として、この抽出物中に含まれたタンパク質を分離することが可能となる。
【００６４】
２−ＤＥゲルは、ＰＤＡ患者又は非ＰＤＡ患者（健康な対象、その他の癌に罹患した患者及び慢性膵炎に罹患した患者を含む）のいずれかに由来する血清パネルを用いて、ウエスタンブロット法により分析するために、膜上に移された。異なるスポットマップ間（そして２−ＤＥゲルの銀染色画像とその対応するウエスタンブロット画像の間）の比較は、ＰＤＡ関連スポットの同定を導き、このスポットは、例えば制御された形でタンパク質を消化する酵素を用いてかかるスポットから抽出されたタンパク質フラグメントの質量分析法による分析によって、さらに特徴付けすることができる（図１）。
【００６５】
このアプローチを用いて、１０個のスポットが選択され、ＰＤＡ患者からの血清抗体により一意的に認識されているものとしてさらに特徴付けされた（図２Ａ）。使用された二次抗体はそのアイソフォームに特異的なものであることから、分析はヒトＩｇＧ抗体に制限された。分取ゲルから１０個のスポットを切除し、ＭＡＬＤ−ＴＯＦＭＳにより分析して、それらがどのヒトタンパク質に対応するかを同定した。このアプローチを用いて、９つの異なるタンパク質をＰＤＡ関連抗原として同定した。２対のスポットが同じタンパク質のアイソフォームに対応し、１つのスポットが、２−ＤＥによって充分に分離されていない２つの異なるタンパク質に属する配列を含有していた。対照血清を用いて実施されたウエスタンブロット法においては、これらのスポットの全てが不在であったか又はほぼ検出不能であった。これらのスポット中のタンパク質を１つ以上結合させる一次抗体が、ＰＤＡ患者から得た血清の有意な割合において同定された（表Ｉ）。
【００６６】
これらのＰＤＡ関連抗原タンパク質の中で、文献中でそれらが同定された生物活性のタイプに応じて２つのカテゴリのタンパク質を区別することができる。第１群のタンパク質には、代謝酵素すなわちα−エノラーゼ（各々１つの特異的アイソフォームに対応する２つのスポット中に存在する）、トリオースリン酸イソメラーゼ（各々特異的アイソフォームに対応する２つのスポット中に存在する）、レチナール・デヒドロゲナーゼ−１、グルコース−６−リン酸−１−デヒドロゲナーゼ、伸長因子Ｔｕ及びイソクエン酸デヒドロゲナーゼが含まれる。第２群のタンパク質は、細胞骨格タンパク質すなわちケラチンＩ型細胞骨格１０、及びコフィリン１として大部分が特徴付けされてきた。
【００６７】
ＣＦ−ＰＡＣ−１−細胞及びヒト血清を用いて得られた発見事実に加えて、健康な対象及びＰＤＡ対象から得た膵臓抽出物を、一次抗体として（ヒト血清ではなく）これらのタンパク質に対する精製済み抗体を用いたウエスタンブロット法において比較した。この分析により、（１つのアイソフォームに制限されず）１つのタンパク質の総量の定量化が可能になるが、この分析は、ＰＤＡ患者の生検材料から得た膵臓組織内でこれらのタンパク質が様々な度合で過剰発現されたということを示している（表Ｉ）。
【００６８】
これらのタンパク質の診断値（及びＰＤＡ血清中のこれらに対する特異的抗体の存在の診断値）が、対照として慢性膵炎患者由来の血清を用いて、疾病の病期に応じてグループ分けされた患者から得られたＰＤＡ血清の間で各タンパク質についてのスポットの存在を区別することによって、さらに評価された。
【００６９】
ウエスタンブロット法による分析は、異なるタンパク質に対する自己抗体の存在及び量が、異なるＰＤＡ病期にある患者の間で均等に分布していないということを示した（図２Ｂ）。大部分のタンパク質に対する自己抗体が対照血清においては不在であったが、一方、それらを含有するＰＤＡ血清の頻度は、ＥＮＯＡ１／２を顕著な例外として、大部分のタンパク質について病期ＩＩのＰＤＡ患者でわずかに存在する（２５％未満）。自己抗体産生プロファイル内のこれらの頻度は、大部分の進行した病期において確認され、ここでも又、第ＩＩＩ期及び第ＩＶ期のＰＤＡにおける頻度の恒常な増加を考えると、α−エノラーゼアイソフォームに対する自己抗体が最も興味深いものである。
【００７０】
結論
ヒト膵臓腫瘍細胞系（ＣＦ−ＰＡＣ−１）の２−ＤＥ発現プロファイリングと（ＰＤＡ患者由来の血清中のヒトＩｇＧを一次抗体として使用する）ウエスタンブロット分析とを組合せた血清学に基づくアプローチは、ＰＤＡ患者が特異的液性応答を生み出す限定数のヒトタンパク質及びそのアイソフォームの同定を可能にした。たった１つの例外（ＡＬ１Ａ１）は別にして、これらのタンパク質の発現は、ＰＤＡ生検材料においてアップレギュレートされた。その上、これらのＰＤＡ関連タンパク質に対する抗体の産生は、少なくとも一部の抗原について、進行した病期において著しく増大するように思われる。
【００７１】
これらの結果は、この場合大部分が細胞内のものである早期ＰＤＡ診断のために潜在的マーカーを同定するにあたっての血清学的アプローチが適切であることを実証している。免疫系が細胞内タンパク質に反応する機序は明確になっていないが、腫瘍細胞内の細胞内酵素の局在化を改変させる可能性のある腫瘍により作り出された独特の環境によって左右される可能性がある。
【００７２】
コフィリン１（ＣＯＦ１）は、インバドポジウム形成に関与し（Yamaguchi Hら、２００５年）かつおそらくは走化性及び成長因子刺激に応答した腫瘍細胞方向性に必要とされる（Mouneimne Gら、２００４年）アクチン脱重合酵素としてアクチンのリモデリング、運動性及び癌において１つの役割を果たす。ＣＯＦ１の過剰発現は、以前にＰＤＡ動物モデルに関連して観察されてきた（Cecconi Dら、２００３年；Sinha Pら、１９９９年）。
【００７３】
α−エノラーゼは、多数の特性を有し異なる状況下で検出された保存度の高い代謝酵素である（Pancholi V、２００１年；Piast Mら、２００５年；Terrier Bら、２００７年）。これは、プラスミノーゲンレセプタとして細胞表面上で発現され得（Lopez-Alemany Rら、２００３年）、Ｂ細胞により認識され得、潜在的にＢ細胞活性化因子として作用する（Babu Jら、２００２年）。２つのアイソフォームが、膵臓腺癌内で検出されたが、翻訳後修飾に関するその分子特性が記述されることはなかった（Shen Jら、２００４年）。
【００７４】
単一のアイソフォームとして又は多重アイソフォームの形で（ただし、ＥＮＯＡリン酸化アイソフォームの特異的発現の証拠なしで）存在するα−エノラーゼに対する自己抗体が、例えば癌関連網膜症（Adamus G ら、１９９８年；Adamus Gら、１９９６年）、非小細胞肺癌及びその他の非膵臓癌（国際公開第０７／０７２２１９号（WO07/072219）；米国特許第２００７０１７２４８７号（ＵＳ20070172487）；Hepら、２００７年）、胆汁性肝硬変（Akisawaら、１９９７年）、脳障害（Fujii Aら、２００５年）及び自己免疫疾患（Ballot Eら、２００３年；Bogdanos Dら、２００４年；Gitlits Vら、２００１年）といったような数多くの異なる生物学的及び疾病モデルにおいて同定されてきた。α−エノラーゼ及びα−エノラーゼ特異的抗体又は自己抗体の特性は、ファージ提示法（Arza Bら、１９９７年；Kemp Eら、２００２年）又はペプチド（Adamus Gら、１９９８年；Sato Nら、２０００年；Walter Mら、１９９５年；Fujii Aら、２００５年）を用いて研究されてきた。
【００７５】
ＰＤＡ患者由来の血清中のこのタンパク質の２つの特異的アイソフォーム（ＥＮＯＡ１／２）に対する自己抗体の頻度及び特異的産生を考えると、特異的α−エノラーゼアイソフォーム及びそれらを検出するための抗体は、ＰＤＡ診断にとって特に有用な手段であるということを、この結果が実証している（表Ｉ及び図２Ｂ）。抗体は、（実験の中で用いられた精製済み抗体のように）全ての又は大部分のアイソフォームに共通のエピトープ又は（ＰＤＡ血清中に存在するもののように）その他のＰＤＡ関連アイソフォームとこのＰＤＡ関連アイソフォームを区別するエピトープに対して特異的であり得る。その上、病期ＩＩからＩＶまでのＰＤＡの進行は、ＥＮＯＡ１／２に対する自己抗体の産生のきわめて有意な増強により特徴付けされ、腫瘍サイズ及び成長能力との直接的相関関係を示唆している。
【００７６】
かかるアイソフォームのより詳細な分析は、ＰＤＡ診断のための自己抗体の的中率を立証するためのみならず、それらをＰＤＡ又はこの癌に対する考えられる治療的アプローチに結びつける分子機序をより深く理解するためにも重要である。
【００７７】
実施例２：ＣＦ−ＰＡＣ−１細胞内で自己抗体によって検出されるα−エノラーゼアイソフォームの分析
材料と方法
ＭＳ分析
スポットを分取２−ＤＥゲルから切除し、マトリクス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析法（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）で分析した。タンパク質を０．０２５モル／Ｌの重炭酸アンモニウムと５０％のアセトニトリルの溶液で一晩脱染し、その後、以前に記述された通り（Hellman Uら、１９９５年）トリプシンを用いてゲル中（in gel）で消化させた（Promega, Madison, WI, USA）。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳのためには、標的ディスクに０．５μＬの各々のペプチド混合物を塗布し、空気乾燥させた。その後、０．５μＬのマトリクス溶液（３０％のアセトニトリル、０．１％のＴＦＡ中の１％ｗ／ｖのα−シアノ−４ヒドロキシ桂皮酸）を乾燥した試料中に塗布し、再び乾燥させた。Bruker Reflex III ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦスペクトロメータ（Bremen、ドイツ）を用いてスペクトルを得た。タンパク質消化物のＭＳスペクトル解釈を、ＭＳ−Ｆｉｔソフトウェアを用いて「ペプチド質量フィンガプリント法」（ＰＭＦ）により行なった。
【００７８】
リン酸化分析
インタネットにより利用可能な以下のソフトウェアを用いて、ヒトα−エノラーゼタンパク質配列の分析を実施した：
NetPhos [ http://www.cbs.dtu.dk/services/; (B lorn N ら、１９９９年)]、
NetPhosK [http://www.cbs.dtu.dk/serviccs/; (Blom Nら、２００４年)]、
dbPTM [ http ://dbPTM.mbc .nctu . edu.tw/; (Lee T ら、２００６年)]、
PPSP [http://bioinformatics.lcd-ustc.org/PPSP/; (Xue Y ら、２００６年)]及び
GPS [http://bioinformatics.lcd-ustc.org/gps_web/predict.php ; (Xue Y ら、２００５年)]。
【００７９】
以下の修正を伴って記述通りに（Yamagata Aら、２００２年）λPPase（New England Biolabs Inc.）を用いて、ホスファターゼ処理を実施した。１ｍｌの溶解緩衝液（１％ｗ／ｖのＮＰ−４０、１％ｗ／ｖのＳＤＳ、５０ｍＭのトリスｐＨ７．６及び１５０ｍＭのＮａＣｌプロテアーゼ阻害物質カクテル）中で１５時間、ペレット化されたＣＦ−ＰＡＣ−１細胞（３０×１０6個）を再懸濁させた。溶解物（２ｍｇのタンパク質に対応する１２０μｌ）を、脱イオン水で１２４０μｌの最終体積にし、その後２０μｌの２０ｍＭのＭｎＣｌ２溶液及び２０μｌのλPPase緩衝液を添加した。各々の添加後、溶液を穏やかに混合した。混合物をアリコートに分割し、１つのアリコートに６００単位のλPPaseを添加した。混合の後、アリコートを３０℃で１５時間インキュベートした。タンパク質をアセトン及びクロロホルムで沈澱させ、２−ＤＥ分析のために使用した（実施例１を参照のこと）。
【００８０】
メーカーの指示事項によって及び文献（Wu Jら、２００５年）で記述されているように、全タンパク質の検出のためにSypro Ruby染色液（Bio-Rad）を用いて及びPro Qリンタンパク質螢光染料（Molecular Probes）を使用して２−ＤＥゲル中で、リンタンパク質の染料ベースの検出を実施した。簡単に言うと、２−ＤＥの後、まず最初に５０％のメタノール／１０％の酢酸中で３０分間ゲルを固定させることによって、Pro-Q染色法を実施した。次にゲルを精製水で洗浄し、４時間Pro-Q Diamondリンタンパク質染色法に付した。Sypro Ruby螢光染料での染色（一晩）に先立って、２０％のアセトニトリルを含有する５０ｍＭの酢酸ナトリウム、ｐＨ４．０の連続的洗浄で脱染を行なった。
【００８１】
生体材料由来の膵臓組織におけるＥＮＯＡアイソフォームの発現の分析
健康な個体又はＰＤＡ患者（第ＩＩ期）のいずれかの生体材料から得た膵臓組織を、氷上で、５モル／Ｌの尿素、２モル／Ｌのチオ尿素、４％ｗ／ｖのＣＨＡＰＳ、２％ｖ／ｖＩＰＧ緩衝液、非直線的ｐＨ３−１０、０．０８モル／Ｌのジチオトレイトール（ＤＴＴ）、１０μＬ／ｍＬのヌクレアーゼミックス及び微量のブロモフェノール・ブルーを含有する４００μｌの溶解緩衝液中で均質化した（Ｔ１８塩基性Ultra Turrax, ＩＫＡ）。超音波処理装置（Hielscher ＵＰ２００Ｓ、３×４０秒、振幅４０％、サイクル０．５Hielscher Ultrasonics ＧｍｂＨ）での超音波処理の後、ミックスを、タンパク質溶液が上清中に含まれた状態で遠心分離（１３０００ｒｐｍ、４℃で３０分）した。
【００８２】
タンパク質濃度を、ブラッドフォード検定で測定した。３０μｇのタンパク質抽出物を、小さいＮｕＰＡＧＥ（登録商標）Ｎｏｖｅｘ（登録商標）４〜１２％のＢｉｓ−Ｔｒｉｓプレキャストゲル上に走らせ、ニトロセルロース膜に移し、抗α−エノラーゼモノクローナル抗体１９／１２8（Moscato Sら、２０００年）と共に４℃で一晩インキュベートし、実施例１で記述されている通りウエスタンブロット法において顕示させた。
【００８３】
組換え型ヒスチジンタグ付けされたＥＮＯＡ（ｒＥＮＯＡ）の産生
組換え型タンパク質を、ヒスチジンタグに融合された（最初の９つのアミノ酸のみが欠如している）ヒトＥＮＯＡの配列をコードするプラスミドでのトランスフェクションを受けた大腸菌（E. coli）細胞から精製した。簡単に言うと、細菌細胞を遠心分離によって１リットルの培養から収穫して、リゾチーム（１００μｇ／ｍｌ）及びサルコシル０．７％を加えた天然結合緩衝液（ＮＢＢ、２０ｍＭのリン酸ナトリウム及び５００ｍＭの塩化ナトリウム、ｐＨ７．８）２０ｍｌ中に再懸濁させた。懸濁液を４℃で１５分間ゆっくりと揺動させた。細胞溶解物を、高強度で１０回の４０秒パルスを用いて氷上で超音波処理した。４℃で１５分間１０００００ｒｐｍで溶解物を遠心分離して、不溶性画分をペレット化させ、これを、室温で１０分間、プロテアーゼ阻害物質で富化した１０ｍｌのグアニジニウム溶解緩衝液（６Ｍの塩酸グアニジン、２０ｍＭのリン酸ナトリウム、５００ｍＭの塩化ナトリウム、ｐＨ７．８）中に再懸濁させた。溶解物を、平衡化したカラム（Ｎｉ−ＮＴＡアガロースカラム、Invitrogen）に添加して、穏やかな回転を用いて４℃で３０分間樹脂に対し結合できるようにした。樹脂をＮＢＢで２回洗浄し、天然洗浄緩衝液で２回の洗浄がこれに続いた。１０ｍｌのイミダゾール溶出緩衝液（３５０ｍＭ ｐＨ６＝組換え型ヒスチジンタグ付けＥＮＯＡ（ｒＥＮＯＡ）の産生）を用いて溶出を実施した。溶出された画分を滅菌水中で透析させ、次に凍結乾燥させ、滅菌した発熱物質を含まないダルベッコリン酸緩衝溶液（ＤＰＢＳ、Sigma）中で再懸濁させた。アリコートを−２０℃で保管した。内毒素レベルは、カブトガニアメーバ状細胞溶解物検定（Pyrogent ; Bio Whittaker）において０．０３ＥＵ／ｍｌ未満であった。
【００８４】
患者の血清及びウエスタンブロット法を用いたＣＦ−ＰＡＣ−１中のＥＮＯＡアイソフォームの発現の分析
上述の通り、ＣＦ−ＰＡＣ−１ ２−ＤＥゲルをHybond ＥＣＬニトロセルロース膜（GE Healthcare）上に電気転写した。５％の脱脂粉乳を含有するＴＢＳで１時間遮断した後、異なる条件下でＥＮＯＡ１／２＋患者の３つの血清（ＴＢＳ中１：１００で希釈されたもの）のプールと共にブロットをインキュベートした。
【００８５】
一連の実験において、血清プールをまず最初に１５分間４℃で、組換え型α−エノラーゼ（ｒＥＮＯＡ）２０μｇ／ｍｌと共に揺動装置上でインキュベートしてから、膜とのインキュベーションを実施した。もう１つの一連の実験においては、膜をまず最初に、λPPase ６００単位を含有するＰＢＳ２ｍｌ、２０ｍＭのＭｃＣｌ2溶液４０μｌそしてλPPase緩衝液４０μｌと共に１５時間３０℃でインキュベートした。膜を１時間再び遮断し、ＴＴＢＳで１５分間３回洗浄し、血清のプール（希釈度１：１００）と共にインキュベートした。
【００８６】
ＥＮＯＡアイソフォームに対する血清中の抗体の結合は、実施例１に記述されているようにウエスタンブロット法において標識済み抗ヒト抗体を用いて顕示された。固定化されたＥＮＯＡの数量の対照として、膜をマウスモノクローナル抗体抗エノラーゼ１９／１２8で再度プローブした（実施例１を参照のこと）。
【００８７】
結果
ＰＤＡ患者の血清中の抗体によりヒトα−エノラーゼの２つのアイソフォームが特異的に検出されることを実証した後、異なるアプローチを用いて、このようなアイソフォーム（及びＣＦ−ＰＡＣ−１細胞内に存在するこのタンパク質のその他のあらゆるアイソフォーム）を特徴付ける機能を実施した。
【００８８】
異なるＰＤＡ患者の血清又はα−エノラーゼに対する精製済み抗体を用いて得られたウエスタンブロット法、２−ＤＥゲルの銀染色及び質量分析法による分析を比較することにより、ＰＤＡに関連しない付加的なα−エノラーゼアイソフォームに対応する４つの付加的なスポットが、ＥＮＯＡ１／２と類似の分子量をもつものの実験的ｐＩ値はより低い状態で、２−ＤＥゲル中に存在することがわかった（表ＩＩ）。これらの証拠は、２−ＤＥゲル分析中でＣＦ−ＰＡＣ−１又はＭｉａＰａｃａ−２細胞抽出物を用いて得られた。
【００８９】
このようなスポットから得たペプチドは、ＥＮＯＡのフラグメントと同一であり（かつきわめて類似のヒトガンマエノラーゼとは明らかに異なっている；図３）、スポットがＥＮＯＡアイソフォームに対応しているはずであり、ここでＥＮＯＡ１／２のみがＰＤＡ関連であるとするウエスタンブロット法の証拠を確認している。翻訳後修飾は、往々にして１つのアイソフォームをもう１つのアイソフォームと区別する機能である。予備分析は、（分子量の限定された変化から考えて）グリコシル化を排除し、そして（ｐＩの減少を考えて）示唆されたリン酸化修飾を排除するように思われた。
【００９０】
ヒトα−エノラーゼの配列は、異なるキナーゼによるリン酸化のための潜在的標的である複数のチロシン、セリン、及びトレオニン残基を含む。この仮説は、その他のタンパク質について文献中で示されているように（Kumar Yら、２００４年）、リン酸化非依存性抗体を用いて検出されるスポットの強度の何らかの変化が存在したか否かを知るため２−ＤＥ分離に先立って広く活性なホスファターゼに対してタンパク質抽出物を曝露することによって試された。実際、大部分の酸性アイソフォーム（すなわちＰＤＡ関連ＥＮＯＡ１／２及びＥＮＯＡアイソフォーム３：表ＩＩ）に対応するＥＮＯＡスポットの強度は、ホスファターゼ前処理を受けたＣＦ−ＰＡＣ−１細胞抽出物において明らかに減少していた。その上、ＥＮＯＡアイソフォーム３（ＥＮＯＡ１／２よりもさらに豊富なもの）の質量分析法による分析は、残基５５、５７、２００、２３６、２３７、２５７及び４１９がこのアイソフォームにおいてリン酸化されることを示した（図４）。
【００９１】
α−エノラーゼのインビボ又はインビトロリン酸化についての以前の報告書（Cooper Jら、１９８４年；Eigenbrodt Eら、１９８３年；Marcus Kら、２０００年；Rush Jら、２００５年；Stasykら、２００５年；Molina Hら、２００７年）は、一般に、少なくとも３つの特異的残基が同時にリン酸化され得ること、そして特にＥＮＯＡアイソフォームにおいて残渣５５、５７、２００、２３６、２３７、２５７及び４１９がリン酸化された状態で発見され得ることを示すことができなかった。その上、ＥＮＯＡアイソフォーム３におけるリン酸化された残基の組合せは、リン酸化のための部位候補の数が多いことから（図４）、ＥＮＯＡタンパク質配列のソフトウェアベースの分析を用いて予測することがほとんどできなかった。質量分析法による分析のこの段階で検出されていない付加的なリン酸化部位をＥＮＯＡアイソフォーム３が有し得ることは排除できないが、ＥＮＯＡ１／２は、ＥＮＯＡアイソフォーム３からそれらを特徴付けする（ホスファターゼを用いて得られた発見事実及びｐＩ値に起因して同じくリン酸化されている確率が最も高い）翻訳後修飾された残基を含んでいるはずである。
【００９２】
とりわけ、リン酸化状態が決定されておりリン酸化部位候補を含むＥＮＯＡ３アイソフォームから得られた２つ以上のペプチドが、このような修飾を示していない。例えば、文献中で実証済み白血病Ｔ細胞系内でリン酸化されているものとして特異的に同定されたチロシン４４（Rush Jら、２００５年）は、ＥＮＯＡアイソフォーム３の中ではリン酸化状態になっていなかった。同様にしてＥＮＯＡアイソフォーム３の場合（図４）のように残基５５とではなく残基６３と組合せてリン酸化されているものとして同定されてきた（Molina Hら、２００７年）。
【００９３】
ＰＤＡ血清及びＥＮＯＡ特異的抗体の両方を用いて検出されたＥＮＯＡアイソフォーム内のリン酸化のさらなる分析が、ウエスタンブロット法中で得られた画像と、２−ＤＥゲル内の全タンパク質を染色する（銀染色又はSypro Ruby）染料又はリンタンパク質に特異的な染料（Pro-Q Diamond）を用いて得られる画像とを比較することによって実施された。この分析は、ＥＮＯＡ１／２及び３のみがＣＦ−ＰＡＣ−１細胞内でリン酸化されることを確認した（図５Ａ；表ＩＩ）。
【００９４】
ＥＮＯＡ発現も同様に、ＰＤＡ患者の血清中で検出される６個のアイソフォーム全てに共通の特異的エピトープに対する抗−エノラーゼ抗体の結合を用いて、外科的処置を受けたＰＤＡ患者（第ＩＩ期；ｎ＝７）から得た組織及び正常な膵臓組織（ｎ＝１）についてのウエスタンブロット法によってテストされた。７つのＰＤＡ生検材料のうちの６つにおいて、６個のＥＮＯＡアイソフォーム全てが検出された。これとは対照的に、正常な膵臓においては、４つのアイソフォーム（ＥＮＯＡ３、４、５及び６）のみが明確に検出可能であった（図５Ｂ）。ＰＤＡ患者がＥＮＯＡ１／２に対する抗体を生成することのみならず、これらのアイソフォームがＰＤＡ膵臓組織内で有意に過剰発現されていることをも結論づけすることができる。
【００９５】
リン酸化されたＥＮＯＡに対するＰＤＡ患者からの血清の反応性を、この反応性がそれらのリン酸化されたエピトープに対し特異的に向けられているか否かの理解の範囲において、２−ＤＥ及びウエスタンブロット法でＣＦ−ＰＡＣ−１細胞抽出物を用いてさらに調査した。ＰＤＡ患者の血清は６つのアイソフォーム全てに反応したことから、これらは、リン酸化されたエピトープ又はリン酸化されていないエピトープのいずれかに対して反応する抗体を含有しているかもしれない。
【００９６】
第１の一連の実験においては、ＥＮＯＡ抗原に対する曝露が基準膵臓細胞系内でＥＮＯＡアイソフォームを認識する血清の能力を改変させるか否かを知るために、リン酸化された残基を含まない組換え型ヒトＥＮＯＡと共に血清を予めインキュベートした。実際、２−ＤＥウエスタンブロット法による分析は、未リン酸化ＥＮＯＡが、ＥＮＯＡ１／２アイソフォームに対する反応性に影響を及ぼすことなくアイソフォーム３、４、５及び６に対する反応性のみを著しく低減させることを顕示した。この証拠は、患者の血清がリン酸化されたＥＮＯＡ１／２アイソフォームに特異的に反応する抗体を含有することを確認するために膜をホスファターゼ（λP Pase）と共に予めインキュベートさせたもう１つの一連の実験においてさらに確認された。λPPaseが無い場合、血清は、全てのＥＮＯＡアイソフォームを認識し、一方λPPase処置はＥＮＯＡ１／２に対する血清の反応性を著しく減少させた（図６）。
【００９７】
抗−ＥＮＯＡｍＡｂは、処置された膜又は未処置の膜において全てのアイソフォームを同等に検出したことから（データ示さず）、これらのデータは、ＰＤＡ患者の血清中の抗体がリン酸化ＥＮＯＡ１／２アイソフォームに対して特異的に反応することを実証している。
【００９８】
結論
異なるプロテオームアプローチを用いて、多数のＥＮＯＡアイソフォーム及びそれらに対する抗体が同定された（Adamus Gら、１９９８年；Adamus Gら、１９９６年；Akisawa Nら、１９９７年；Ballot Eら、２００３年；Bryborn Mら、２００５年；Lubec Gら、２００３年；O’Dwyer Dら、２００２年）。しかしながら、これらの報告書は、ＰＤＡの進行中の特定のアイソフォームに対する自己抗体の産生に対するリン酸化状態と位置の間の関連性についての明らかな実証を提供していない。
【００９９】
その他の論文は、特定の細胞処置（Baty Jら、２００５年；Bottalico Lら、１９９３年；Kanamoto Tら、２００２年）又は疾病（Byrjalsen Iら、１９９９年；Clauser Kら、１９９５年；Nakanishi Tら、２００６年；Tanaka Yら、２００６年；米国特許第２００７０１７４８７号（US20070172487））に関連付けて、例えば２−ＤＥゲルのウエスタンブロット法において患者の血清を用いて検出されるα−エノラーゼスポットの強度及び／又は数の変化について報告しており、それがリン酸化といったような翻訳後修飾に起因し得るということを示唆している。
【０１００】
その他の報告書では、ヒトα−エノラーゼが、２−ＤＥゲルにより分析されたＰＤＡ試料の中で過剰発現されｍＲＮＡのレベル及び免疫細胞化学において確認された複数のタンパク質のうちの１つとして標示されているが、ＰＤＡに関連付けされたα−エノラーゼのアイソフォームを特徴付ける特異的リン酸化については全く言及されていない。（国際公開第０４／５５５４８号（WO04/55548）；Shen Jら、２００４年；Nakanishi Tら、２００６年；Mikuriya Kら、２００７年）。
【０１０１】
α−エノラーゼ内で検出された数多くの翻訳後修飾の中でも（表ＩＩＩ）、古い文献においては（Cooper Jら、１９８４年；Coussens Pら、１９８５年；Eigenbrodt Eら、１９８３年；Golden Aら、１９８６年）、インビボとインビトロの両方でリン酸化が検出されてきた。最近では、２Ｄ−ゲル、市販のマウス抗ホスホチロシン抗体（クローン４Ｇ１０、Cod. ０５−３２１；Biomol）及びヒト血小板中の質量分析法（Marcus Kら、２０００年）を用いて、α−エノラーゼの２つのリン酸化されたアイソフォームが検出されてきた。２Ｄ−ゲル、放射性標識及び質量分析法（Stasyk Tら、２００５年）を用いてＴＧＦ beta １処置済み細胞（ＭＣＦ−７細胞系）内で、又はフラボノイドでの処置の後エノラーゼリン酸化が減少したＭＩＡＰａＣａ細胞（膵臓癌細胞系）（Lee Lら、２００２年）内で、α−エノラーゼの単一のリン酸化変異体が検出された。その上、２つのリン酸化部位が、チロシン残基（４４及び２８６；Rush Jら、２００５年）又はチロシン及びセリン残基（５７及び６３；Molina Hら、２００７年）にあった。
【０１０２】
しかしながら、これらの文書のいずれも、ＰＤＡを、少なくとも３つの位置ですでにリン酸化されたα−エノラーゼアイソフォームの付加的なリン酸化と、及びそれらを結合する抗体に、関連付けすることはなかった。
【０１０３】
実施例３：α−エノラーゼのリン酸化されたアイソフォームを発現する形質転換された細胞系の成長及び増殖に対するα−エノラーゼに結合する抗体の効果
材料と方法
細胞系の増殖についての検定
負の対照として用いられたマウスＩｇＧ１アイソフォーム整合済み対照モノクローナル抗体（Ｐ＆Ｄ Systems）又は抗α−エノラーゼモノクローナル抗体７２／１（Moscato Sら、２０００年）を伴うか又は伴わない完全細胞培地（１０％のウシ胎仔血清を伴うＲＰＭＩ−１６４０）中で９６ウェルのマイクロプレート内に２〜１０×１０3個／ウェルの細胞を播種することによって、標示された細胞系を用いて細胞増殖のインビトロ検定を実施した。
【０１０４】
４４時間又は６８時間後に、３７℃でさらに４時間、各ウェルに２０μｌのメチルテトラゾリウム溶液（ＭＴＴ；５ｍｇ／ｍｌ）を添加した。培地を除去し、細胞をＤＭＳＯで溶解させた。５４０ナノメートルで分光光度計に対し平板の読取りを行なった。
【０１０５】
結果
２−ＤＥ及びウエスタンブロット法により決定されるようなα−エノラーゼ発現の異なるプロファイルを提示する細胞系の成長に対する抗α−エノラーゼ抗体の効果は、生存細胞内に取込まれ活性細胞成長、代謝及び増殖と相関関係をもつ化合物であるＭＴＴの取込みを測定することによって、テストされた。
【０１０６】
ＭＴＴベースの比色分析を用いて、膵臓由来であるか非膵臓由来であるかとは無関係に６つのアイソフォーム全てを発現する形質転換された細胞系内で、細胞増殖の有意な阻害が得られた。ＩｇＧＩアイソフォーム整合対照モノクローナル抗体又は３つのリン酸化ＥＮＯＡアイソフォームを発現しない細胞系を使用すると、この効果は最小限である（表ＩＶ）。
【０１０７】
かくして、抗α−エノラーゼ抗体は、（生検材料からの組織又は血清といった）ＰＤＡ関連生体試料内で検出されたα−エノラーゼの特異的リン酸化プロファイルを有する成長及び増殖細胞系を（少なくとも部分的に）阻害することができる。
【０１０８】
結論
一般に細胞質タンパク質とみなされているとしても、α−エノラーゼは、細胞表面上で生物学的に活性なタンパク質（Arza Bら、１９９７年；Bergman Aら、１９９７年；Moscato Sら、２０００年；Lopez-Alemany Rら、２００３年）ならびに可溶性因子（Babu J ら、２００２年；Demir Aら、２００５年）として発現され得る。
【０１０９】
インビトロデータは、細胞系がα−エノラーゼのリン酸化されたアイソフォームを発現する場合にのみ、（細胞表面レセプタとして及び／又は可溶性タンパク質として）細胞外空間内で発現されるα−エノラーゼアイソフォーム中に存在するエピトープに対する抗体の結合によって、形質転換された細胞系の成長が減速される、ということを示している。
【０１１０】
かくして、α−エノラーゼリン酸化アイソフォームを提示する細胞を特異的に結合させるモノクローナル抗体が、形質転換された細胞系の増殖を阻害できる。細胞の増殖を制御するためのこの機序は、ＰＤＡのみならずかかる分子機能を提示するその他の形態の癌においても存在するように思われ、ＰＤＡ治療用薬剤の調製及びＰＤＡ患者の診断及び治療方法といったような、癌関連の治療用利用分野のために適切なモノクローナル抗体によってターゲティングされる可能性がある。
【０１１１】
【表１】
【０１１２】
【表２】
【０１１３】
【表３】
【０１１４】
【表４】
【０１１５】
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Yunis A ら、（１９７７年)、Int J Cancer、第１９号、１２８〜３５頁。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒトの癌、特に膵臓由来の癌を診断し治療するための新規の手段に関する。
【背景技術】
【０００２】
膵管腺癌（ＰＤＡ）は、米国及び欧州において最も頻度の高い膵臓癌であり、癌による死亡の第４番目の原因である。大部分の患者は１２ヵ月以内で死亡し、診断後の５年生存率はわずか２％にすぎない。膵切除術が今なおＰＤＡの管理及び化学療法の要であり続けているが、生存率に関してはわずかな利点しか提供しない（Laheru D及びJaffee M、２００５年；Kleef Jら、２００６年）。
【０００３】
（モノクローナル抗体、ワクチン及び化学療法の使用を含めた）外科的及び医学的管理の改善にも関わらず、早期ＰＤＡ診断のためのマーカーは未だに数少なくまた信頼性の低いものである。膵臓癌の診断のために最も広く使用されている血清学的マーカーは、シアリル化ルイス血液型抗原ＣＡ１９−９であるが、その使用はほとんどが、ＰＤＡ診断ではなくむしろ療法に対する応答を監視することに向けられている。実際、この抗原は、（慢性膵炎又は胆道閉塞といったような）良性膵臓疾患に罹患した患者由来の血清中にも高濃度で存在して偽陽性を提供する可能性があり、母集団の５〜１０％においては全く発現されないことを理由として、全てのケースに使用することはできない（Okusaka Tら、２００６年）。
【０００４】
これらの理由から、生検及び組織病理学的評価といったような侵襲的手技を制限することを目的としてＰＤＡ診断において使用するため（Bouvet M, ２００４年；Brand R, ２００１年；Goggins M、２００５年；Leung Tら、２００５年）及び薬物候補を評価するため（Cohen S及びMeropol N、２００２年；Jimento A及びHidalgo M、２００６）の代替的バイオマーカーが承認審査段階にある。
【０００５】
（ＲＮＡ又はタンパク質レベルのいずれかに基づく）タンパク質発現の大規模分析を用いて候補のＰＤＡバイオマーカーを同定するために、様々な技術が近年利用されてきている。特に、二次元ゲル電気泳動法（２−ＤＥ）により分離され、癌患者からの血清抗体により認識され、そして質量分析法を用いて同定されるタンパク質を比較することにより、ＰＤＡ患者の血清中で液性応答を惹起する抗原を検出するために、プロテオーム技術が使用されてきた。タンパク質の分離、選択及び特徴付けのためのこのアプローチの変形形態は、ＳＥＲＰＡ（Klade Cら、２００１年）、ＰＲＯＴＥＯＭＥＸ（Lichtenfels Rら、２００３年）又はＳＰＥＡＲ（Unwin Rら、２００３年）といったように、文献中に異なる名称で記述されている。
【０００６】
これらの方法論に共通の研究作業前提は、癌によって特異的に発現される抗原（いわゆるヒト癌イムノーム）に対するＢ細胞レパートリーを特徴付けることによって、癌の免疫監視及び免疫編集に関与する特異的標的を定義付けし、無制御の細胞増殖及び転移を導く機序を理解することが可能であるはずである、というものである（Drake Cら、２００６年；Dunn Gら、２００４年）。
【０００７】
免疫療法は、膵臓癌の治療にとって貴重なアプローチであり得るということが示唆されてきた（Laheru D及びJaffee M、２００５年）。実際、ＰＤＡ特異的タンパク質候補のリストが、ＲＮＡレベルにおけるそれらの高い発現に基づいて（国際公開第０４／５５５１９号（WO04/55519））、あるいは血清試料及び／又は膵臓試料の大規模プロテオーム解析（Bhattacharyya Sら、２００４年；Cao Dら、２００５年；Cecconi Dら、２００３年；Chen Rら、２００５年；Gronborg Mら、２００６年；Honda Kら、２００５年；Koomen Jら、２００５年；Rodriguez Jら、２００５年；Shen Jら、２００４年、Rosty C及びGoggins M、２００５年；Sinha Pら、１９９９年；Yu Yら、２００５年）に基づいて作成されてきた。血清中のＰＤＡ診断のためのタンパク質候補は、フィブリノーゲンガンマ（Bloomston Mら、２００６年）、ＤＥＡＤ−Ｂｏｘタンパク質４８（Xia Qら、２００５年）、ＭＩＣ−１（Koopmann Jら、２００４年）、ＰＴＨ関連タンパク質（Bouvet Mら、２００１年）及びカルレティキュリン（Hong Sら、２００４年）である。
【０００８】
しかしながら、ＰＤＡの早期検出及びその他の膵臓病変又は癌との弁別のための信頼性の高いバイオマーカーがなおも必要とされている。
【発明の概要】
【０００９】
本発明は、ＰＤＡ患者由来の血清が、健康な個体から又はその他の病変に罹患した個体からの血清と比較した場合に、膵臓癌由来の細胞系の中で発現される特異的タンパク質に対する抗体を含有しているという観察事実に基づくものである。これらのタンパク質の存在は、正常な膵臓組織及びＰＤＡの膵臓組織から得た抽出物中でかかるタンパク質に特異的な精製済み抗体を使用することによって確認された。
【００１０】
本発明の主たる目的は、新規のα−エノラーゼアイソフォームの１つの中でも同様に判定済みである少なくとも３つの位置でリン酸化されているヒトα−エノラーゼ（ＥＮＯＡ）の新規のＰＤＡ関連アイソフォームにある。
【００１１】
本発明のさらなる目的は、これらのＥＮＯＡのリン酸化されたアイソフォームを結合させかつその他のＥＮＯＡアイソフォームからそれらを区別する抗体にある。これらの抗体は、モノクローナル抗体（特にヒトモノクローナル抗体）及び抗体フラグメントといったような任意の適切なフォーマットのものであり得る。
【００１２】
本発明においてＰＤＡ関連として定義付けされたタンパク質及びそれらを結合させる抗体（ならびにそれらを検出するためのその他のあらゆる特異的手段）を、ＰＤＡ診断方法において、ならびにＰＤＡを治療するための作用物質を識別するために使用することができる。特に、患者から得られた生体試料（例えば血清又は生検材料）中のＰＤＡ関連ＥＮＯＡリン酸化アイソフォームの抗体ベースの検出は、ＰＤＡの診断のため、疾病の進行を評価するため又はＰＤＡを治療するための薬物の効果を評価するための方法において使用可能である。
【００１３】
本発明のさらなる目的は、ＰＤＡの診断のため、疾病の進行を評価するため、又はＰＤＡを治療するための薬物の効果を評価するためのキットにおいて、本発明のＰＤＡ関連タンパク質及び／又はそれらを結合させる抗体のうちの少なくとも１つを含むキットにある。
【００１４】
膵臓癌の診断及び治療における特異的抗α−エノラーゼ抗体の定義付け及び使用に関するものを含めた本発明のその他の目的が、以下の記述の中で提供されている。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】ＰＤＡ（腫瘍）患者又は対照（健常）ドナーからのＣＦ−ＰＡＣ−１細胞（腫瘍細胞）及び血清を用いたＰＤＡ関連タンパク質抗原及び抗体を特徴付けするために適用されるＳＥＲＰＡ方法の概略的表示である。
【図２】（Ａ）ＰＤＡ関連タンパク質の発現を検出するための検定としてＣＦ−ＰＡＣ−１細胞系からタンパク質抽出物を使用して調製された２−ＤＥゲル。細胞抽出物中のタンパク質は、その分子量及びＰＩに応じてゲル中で分離され、銀染色を用いて顕示された。ＰＤＡ血清でのウエスタンブロット法において存在するものの対照血清では存在しないスポットの位置は、標示されている（各番号に対応する特異的タンパク質の名称は、表１に列挙されている）。（Ｂ）標示されたＰＤＡ関連タンパク質を認識する抗体を含有する、異なる病期（ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ）における慢性膵炎（ＣＰ）又はＰＤＡに罹患した患者（各グループ内の患者の数はｎとして標示されている）からの血清の百分率を表わすヒストグラム。頭文字に対応するタンパク質のフルネームは表Ｉに標示されている。
【図３】ヒトα−エノラーゼ（ＥＮＯＡ；SWISSPROT Acc. No. P06733；配列番号１）及びヒトガンマエノラーゼ（ENOG SWISSPROT Acc. No. P09104；配列番号２）タンパク質配列のアライメント（２つのタンパク質の中で同一であるアミノ酸は「：」で標示され、一方保存されているだけのタンパク質は「・」で標示されている）。２−ＤＥゲルスポットにおいて質量分析法によって同定されＥＮＯＡアイソフォームをかかるスポットに割当てるために使用されてきたペプチドの配列には下線が付されている。
【図４】異なるアルゴリズムによって予測されかつ／又は実験により同定されるヒトα−エノラーゼ（ＥＮＯＡ）のタンパク質配列内のリン酸化部位（太字、下線）の位置（タンパク質配列の下の小文字；参考文献については凡例を参照のこと）。ＥＮＯＡアイソフォーム３中でリン酸化されているものとしてＥＮＯＡ中で同定されたペプチドは、普通線（normal line）でとり囲まれている。ＥＮＯＡアイソフォーム３中でリン酸化されていないものとして同定されたペプチドは、破線でとり囲まれている。
【図５】（Ａ）異なる手段による６個のα−エノラーゼアイソフォーム（ＥＮＯＡ１，２，３，４，５，６）の検出。ＥＮＯＡ１／２及び３の位置は、白色矢印で標示されている。（Ｂ）膜上に移されその後一次抗体として抗ＥＮＯＡを用いてウエスタンブロット法でテストした正常な膵臓組織由来又はＰＤＡ患者の膵臓組織由来のタンパク質抽出物の中の６個のα−エノラーゼアイソフォーム（１、２、３、４、５、６）の検出。ＥＮＯＡ１／２アイソフォームの位置は、白色矢印で標示されている。ゲル上に投入されたタンパク質量の対照として、膜をウサギポリクローナル抗ヒトアクチン抗体（希釈度１：１００００；Sigma Chemical Co.）でプローブした。
【図６】組換え型ヒトα−エノラーゼ（＋ｒＥＮＯＡ又はｒＥＮＯＡ）での予備吸着を伴う又は伴わないＰＤＡ患者の血清のプールを（一次抗体として）用いた、２−ＤＥゲル及びウエスタンブロット法によるＣＦ−ＰＡＣ−１細胞抽出物中の６個のα−エノラーゼアイソフォーム（スポット１、２、３、４、５、６）の検出。代替的には、ＰＤＡ患者血清のプールを（一次抗体として）用いて、ウエスタンブロット法を実施する前にホスファターゼ（＋λＰＲＡＳＥ）で膜を前処理した。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
生化学的及びプロテオーム技術を組合せた形で使用することにより、疾患関連生体試料中に存在する個々のタンパク質の同定及び評価を可能にする。当該ケースにおいては、このタイプの分析は当初癌（ＰＤＡ）に向けられ、潜在的にＰＤＡの腫瘍形成及び／又は進行に関連付けされる抗体を含有する、膵管腺癌（ＰＤＡ）患者の大規模パネルから得た血清及びヒトＰＤＡから導出された細胞系（ＣＦ−ＰＡＣ−１）という２つの疾患関連分子が使用された。
【００１７】
これらの血清のウエスタンブロット分析によりＣＦ−ＰＡＣ−１抽出物中で検出された免疫反応性タンパク質のプロファイルを、ＣＦ−ＰＡＣ−１プロテオーム中のＰＤＡ関連抗体及びそれに関係する抗原の候補を立証する目的で、異なる対照集団（健康な対象、非ＰＤＡ腫瘍患者、慢性膵炎患者）からの血清を使用して得られたものと比較した（図１）。
【００１８】
全く異なる公知の生物活性を有する限定された数のタンパク質（代謝酵素及び細胞骨格タンパク質を含む）に対する抗体は、ＰＤＡ患者由来の血清中に選択的に存在することが発見されており、このことは、これらのタンパク質がＰＤＡ関連性を有し、ＰＤＡ患者においてはインビボ抗体応答を誘発し、健康な対象又は非ＰＤＡ癌患者においてはこれを誘発しない、ということを示唆していた。
【００１９】
本発明においてＰＤＡ関連として定義付けされたタンパク質及び抗体（及びこれらを検出するためのその他のあらゆる特異的手段）は、ＰＤＡ診断のための方法において、ならびにＰＤＡを治療するための作用物質を同定するために使用可能である。
【００２０】
ＰＤＡ関連ヒトタンパク質パネル（α−エノラーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、レチナール・デヒドロゲナーゼ−１、グルコース−６−リン酸−１−デヒドロゲナーゼ、伸長因子Ｔｕ及びイソクエン酸デヒドロゲナーゼ、ケラチンＩ型細胞骨格（cytoskeletal）１０、コフィリン１を含む；図２Ｂ及び表Ｉ）は、タンパク質の分離及び分析のための２−ＤＥ及び質量分析法技術を用いて、ＰＤＡ血清中に特異的に存在する抗体についての抗原として定義付けされた。その上、これらの抗原に対する精製済み抗体が、その差次的発現ひいては、ＰＤＡの早期診断のために（血清、完全又は部分的に精製された抗体、ポリクローナル抗体調製物及びペプチドを含めて）これらを検出するためそして患者の体内におけるこの癌の進行を評価するためのあらゆるタンパク質ベースの手段の有用性、を確認した。
【００２１】
これらのタンパク質は、各々個別に又は組合せた形で、ＰＤＡの早期診断のためのバイオマーカーとして、及び患者の体内でのこの癌の進行を評価するために使用することができる。これらのバイオマーカーのうち、２−ＤＥ及びウエスタンブロット法を用いて同定されるＥＮＯＡ１／２（α−エノラーゼアイソフォーム１及びアイソフォーム２）及びＣＯＦ１（コンフィリン１）が、最も信頼性の高いＰＤＡ関連タンパク質抗原であるように思われる。
【００２２】
実施例中に示されているように、かかるＰＤＡ関連抗原を結合させる抗体を、以上で列挙した範囲について使用することができる。かくして、生体試料（例えば血清、生検材料又は細胞／組織タンパク質抽出物）中のこのような抗原及び／又は抗体の検出を含む方法によって、ＰＤＡの早期診断及び患者の体内でのＰＤＡ進行の評価が可能である。
【００２３】
ＰＤＡ関連抗原の特徴付けは、以下で記述されている１つのケースを除いて、ＰＤＡ関連タンパク質内の何らかの翻訳語修飾の定義付けにまで拡張されなかった。データは、（表Ｉ右欄について使用されている精製済み抗体のような）所与の抗原の全てのアイソフォームに共通のエピトープ、又は（ＰＤＡ患者の血清中に存在しＰＤＡの進行中に測定されたもののような（図２参照））ＰＤＡ関連翻訳後修飾を含有するアイソフォーム（単複）のみに共通のエピトープを特異的に結合させるあらゆる抗体又はペプチドが、ＰＤＡの診断及び進行のために使用可能であるということを示唆している。
【００２４】
ＰＤＡを治療するための新規の治療用化合物を提供することに関心が寄せられていることから、生体試料中のＰＤＡ関連抗原及び抗体（ならびにその結合特性）の検出を含む方法は、ＰＤＡを治療するための薬物候補を評価するためにも使用することができる。このアプローチは、ＥＮＯＡアイソフォーム（ＥＮＯＡ１／２）での実施例において示されているように、ＰＤＡ関連タンパク質及び／又は抗体の存在を比較することのできる検定において応用することができる。
【００２５】
実施例及び文献中に記述されている生化学的及びプロテオーム技術を用いて立証できかつ候補化合物に対する曝露の後に見られるこれらの特性の変化は、ＰＤＡ腫瘍形成及び転移を導く生物学的経路を標示する可能性がある。例えば、患者又は動物モデルの血清中のＰＤＡ関連抗原に対する一次抗体の消滅、ならびに、抗原特異的抗体を用いた細胞抽出物中のウエスタンブロット法によるスポット数の減少を検出することによって、１つの化合物のＰＤＡ特異的活性を確認することができる。
【００２６】
候補化合物は、ＰＤＡ関連タンパク質（例えばＣＯＦ１又はＥＮＯＡ１／２など）として本発明で定義付けされているものを含め、あらゆる潜在的ＰＤＡ治療標的に指向させることができる。例えば、化合物は、それらを結合させる抗体（全般又は特異的アイソフォームのみ）の形、あるいは、修飾をもたらす酵素の活性を変調させることによりその発現又は翻訳後修飾を改変させる小分子の形をとることができる。その上、マウスモノクローナル抗体といったようなヒトα−エノラーゼを結合させる抗体が、６個のα−エノラーゼアイソフォーム（すなわちウエスタンブロット法においてＰＤＡ患者の血清を用いて検出されるようなＥＮＯＡ１／２を含む）を提示する膵臓由来の形質転換された細胞系のインビトロ成長及び増殖を阻害する、ということが発見された。インビトロ成長及び増殖に対するこの阻害効果は、このような６個のα−エノラーゼアイソフォームを提示する非膵臓由来の形質転換された細胞系についても観察されたが、わずか３個のリン酸化されていないこれらのアイソフォームしか提示しない細胞系では観察されておらず（実施例３；図５Ｂ；表ＩＶ）、ＰＤＡの治療のために抗ＥＮＯＡ抗体を使用する可能性が示唆されている。
【００２７】
このとき、シグナル変換に影響を及ぼすペプチド、ペプチド類似体及び小分子といったような異なる化合物の効果を確認するためにすでにテストされた、細胞系又は動物モデルを使用する膵臓細胞用増殖検定のいずれかにおいてかかる潜在的な治療的特性を評価することができる（Beker Cら、２００２年；Bauer Tら、２００５年；Bruns Cら、２０００年；Lee Lら、２００２年；Levitzki A及びMishani E、２００６年；Qin Yら、１９９５年；Yezhelyev Mら、２００４年；Rubio-Viqueira Bら、２００６年）。その上、膵臓癌をさらに効果的に治療するため異なる分子標的をターゲティングする化合物の組合せを使用する可能性が実証されてきた。例えば、細胞膜レセプタに特異的なキナーゼの阻害物質と共に化学療法試薬を投与することで、動物モデルにおいて実験的ヒト膵臓癌の成長が阻害され、生存期間が有意に延長された（Yokoi Nら、２００５年）。代替的には、ウイルス又はヒトの標的に向けられた２つ以上の抗体が１つの医薬組成物に組合わされた場合、結果として得られる組成物は、相加効果のみならず相乗効果に起因して、改善された治療的及び／又は診断的効能を示し得るということが記述されてきた（Logtenberg T、２００７年）。
【００２８】
ＰＤＡ関連タンパク質（例えば、ＥＮＯＡ１／２）に対する抗体を含む医薬組成物を、ヒトにおける治療及び診断を目的として投与することができる。かくして、ＰＤＡの治療又は診断のための方法は、ＰＤＡ関連タンパク質（例えばＥＮＯＡ１／２）に対する抗体を含む医薬組成物の投与を含み得る。
【００２９】
組成物は、共通の医薬賊形剤を含んでいてよく、単回又は複数回投薬量で、及び／又は適切なデバイスを用いて、筋内、静脈内、皮下、局所、粘膜経由といった様々な経路を通して、非生分解性／生分解性マトリクス材料中で、又は微粒子薬物送達系を用いて、投与可能である。特に、該組成物は、膵臓又はＰＤＡ関連タンパク質が存在し得るその他のあらゆる組織に対する有効な投与を可能にするはずである。
【００３０】
医薬組成物は、化合物が充分な時間にわたりその活性を及ぼすことができるようにする治療上又は予防上有効な量の化合物を提供すべきである。所望の効果は、ＰＤＡの成長及び増殖を制御すること及びＰＤＡの臨床症状の少なくとも一部分を減少させることによって、ＰＤＡ患者の状態を改善することである。例えば、組成物は、投与経路及び個体の状態に応じて、体重１ｋｇあたり約０．００５〜約５０ｍｇの有効量で投与されるべきである。
【００３１】
診断的な用途を有する組成物の場合には、化合物は、生体試料中のウイルスを検出するため臨床及び研究用実験室で一般的に公証済みの技術（例えばＥＬＩＳＡ又はその他の血清学的検定）を用いて、またインビボで対象に対し投与される場合には投与から少なくとも１、２、５、１０、２４時間以上後で検出されるはずである。ＰＤＡ関連タンパク質及び／又は抗体の検出は、ＰＤＡを診断するために立証された公知の手段及び手順にしたがって又はこれらと組合せた形で、本発明のＰＤＡ関連タンパク質及び／又は抗体を用いて実施可能である。
【００３２】
ＰＤＡの療法及び／又は診断のための臨床的な開発及び使用は、抗体の薬物動態及び薬物力学の特徴付け（Lobo Eら、２００４年）、データ前臨床及び臨床安全性（Tabrizi M及びRiskos L、２００７年）、そしてヒトにおける治療及びインビボ診断用の使用のためのモノクローナル抗体の生産及び品質管理に関する国際規定要件の遵守（Harris Rら、２００４年）に基づくべきである。
【００３３】
患者の体内でのＰＤＡ診断用のキットは本発明において定義されている通り以上で定義したＰＤＡ関連タンパク質及び／又は抗体を１つ以上とそれらの検出を可能にするその他のあらゆる化合物を含み得る。これらのキットは、標識された／されない抗原、抗体、又は（例えば酵素活性をもつものとして同定されたものの場合のように）かかる抗原との相互作用の後に修飾される基質を含むことができる。
【００３４】
ＰＤＡに対する液性応答の標的となるもののうち、最も有利であるのは、新規のα−エノラーゼのリン酸化されたアイソフォームがＰＤＡ血清により認識されるという事実である。ヒトα−エノラーゼの新規のアイソフォーム（ＥＮＯＡ）は少なくとも３つの位置でリン酸化されており、合計７つのリン酸化部位が同定されている（図４）。この事実の重要性は、ＰＤＡ患者から得られた血清を用いた又はＰＤＡ患者から得た膵臓組織内での２つのリン酸化度の高いＥＮＯＡアイソフォーム（ＥＮＯＡ１／２）の特異的検出によって裏付けられる（図２Ｂ、５及び６、表Ｉ及びＩＩ）。ＰＤＡ患者は、本発明のリン酸化度の高いＥＮＯＡアイソフォームを特異的に結合する抗体を提示する。
【００３５】
実施例は、ＥＮＯＡ配列内の複数の位置がリン酸化され得るにせよ、トレオニン、セリン及びチロシン残基の精密な組合せが、細胞系及びＰＤＡ組織の両方において実際にリン酸化され、ＰＤＡ患者により産生されたヒト抗体によって検出される、ということを示している。特に、トレオニン５５、チロシン５７、チロシン２００、チロシン２３６、トレオニン２３７、チロシン２５７及びセリン４１９におけるリン酸化が、ＥＮＯＡアイソフォーム３内に存在し、このアイソフォームは、ＥＮＯＡ１／２と同様、ホスファターゼによる処置により改変されるタンパク質リン酸化プロファイルを示す。患者から得た生体試料を用いてＰＤＡを診断し、疾病の進行を評価するために、タンパク質リン酸化の類似の変化を使用することができる。
【００３６】
完全ＥＮＯＡ１／２アイソフォームの代替として、図４（囲みのある配列を参照のこと）で同定されたもののようなＥＮＯＡ１／２と同じリン酸化された残基を提示するＥＮＯＡ由来の単一ペプチド、それらを含むタンパク質配列又はそのライブラリ及び組合せを生成することが有用であり得る。かかるリン酸化されたタンパク質及びペプチドを生成し使用するための方法が、文献中で開示されている（Conrads Tら、２００２年；米国特許第７６３１６４号（US763164）；国際公開第９７／３００９７号（WO97/30097））。
【００３７】
α−エノラーゼ（特にＥＮＯＡ１／２）中の翻訳後の修飾の数及び効果は、ＰＤＡ関連及び対照の試料において、公知の技術によってさらに確認することができる（Kalume Dら、２００３年；Machida Kら、２００３年；Mann Mら、２００２年；Rush Jら、２００５年；Molina Hら、２００７年；Schmeizle K及びWhite F、２００６年；Wu Jら、２００５年）。ＥＮＯＡについて公知の付加的なリン酸化及び／又は修飾（表ＩＩＩ）は、ＥＮＯＡ１／２内に存在し、これらのアイソフォームの抗原性及び生物活性ならびにアイソフォーム特異的抗体によるそれらの検出に適切であり得る。特定の病期／疾病タイプに付随する翻訳後修飾は、その他のタンパク質について示されているように、特異的修飾を有するアイソフォームを区別する抗体又は直接的タンパク質分析を含めた複数の手段によって検出可能である（Edberg Dら、２００５年；Mandell J、２００３年）。
【００３８】
２−ＤＥ及びウエスタンブロット法により非ＰＤＡ／ＰＤＡタンパク質抽出物内で差次的に発現されたタンパク質アイソフォームに対するその結合を通して定義付けされる抗体、特にモノクローナル抗体を、２−ＤＥ及びウエスタンブロット法で類似のプロファイルを有する癌の治療において使用することが可能である。かくして、ＰＤＡ治療用の医薬組成物の調製において及び、ＰＤＡ患者又はα−エノラーゼについて類似の発現プロファイルを提示する（すなわち少なくとも３つの位置でリン酸化されている本発明のヒトα−エノラーゼの新規のアイソフォームを発現する）癌患者の治療的処置のための方法において、α−エノラーゼ（全般又は特に特異的リン酸化アイソフォーム）を結合させる抗体を使用することができる。
【００３９】
リン酸化されたα−エノラーゼのアイソフォームが患者の血清中に存在することによって特徴付けされる（ＰＤＡといったような）癌の検出又は治療のために、抗体を使用することが可能である。これらの抗体は、診断上又は治療上の利点をもつ抗体を同定し、特徴付けしかつ生産するための公知の技術のうちの任意のものを応用して生成することができる（Jain Mら、２００７年；Laffly E及びSodoyer R、２００５年）。抗体は、Ｓｃｆｖ（一本鎖可変フラグメント）、Ｆａｂ（可変重／軽鎖ヘテロ２量体）、ダイアボディ、単離重鎖又は軽鎖、ペンタボディ又は二重特異性抗体といったような異なる名称で文献中に記述されている、完全抗体（例えばモノクローナル抗体、特にヒト又はヒト化モノクローナル抗体）、抗体フラグメント、抗原結合タンパク質、及びその他の工学処理された抗体ベースの融合タンパク質及びペプチドのように、機能的抗体についてのあらゆるタンパク質フォーマットで生成され得る。
【００４０】
本発明の抗体は、治療用、安定化用、標識用又は診断用の作用物質に対する融合又は（化学的リンカー又は重合体を用いた）接合によって改良することができる。これらの作用物質の例としては、結合させることのできる検出可能な標識分子（例えば放射性同位元素、螢光化合物、毒素、金属原子、化学発光性化合物、生物発光性化合物、ビオチン、酵素基質又は酵素）がある。ＥＮＯＡ特異的活性は、同様に、診断又は治療の利用分野において代謝及び／又は安定性を改変させるタンパク質又は重合体といったようなもう１つの治療用タンパク質との融合によっても改良され得る。
【００４１】
タンパク質部分、リガンド及び適切なリンカーを選択し設計するための手段ならびに融合タンパク質の構築、精製、検出及び使用のための方法及び戦略が、文献中で提供されており（Nilssonら、１９９７年、「キメラ遺伝子及びハイブリッドタンパク質の応用」Methods Enzymol. 第３２６〜３２８巻、Academic Press、２０００年；国際公開第０１／７７１３７号（WO01/77137））、臨床及び研究実験室において一般的に利用可能である。例えば、融合タンパク質は、融合タンパク質のインビボ及び／又はインビトロ同定を容易にし得る（ポリヒスチジン、ＦＬＡＧ、ｃ−Ｍｙｃ又はＨＡタグといったタグを含む）市販の抗体によって認識される配列を含有していてよい。その他のタンパク質配列は、（緑色螢光タンパク質の場合のように）直接螢光分析によって、又は（タンパク質分解部位などを用いる）特異的基質又は酵素によって、容易に同定可能である。
【００４２】
（ＥＮＯＡ１／２といったような）ＰＤＡ特異的タンパク質配列を認識する抗体又はこのような抗体から誘導されたその他のあらゆるタンパク質配列は、原核又は真核宿主細胞であり得る適切な宿主細胞を形質転換するためにかかるベクターを用いて組換え型タンパク質として発現され得、所望の組換え型タンパク質の分泌を可能にするはずである。かかるタンパク質を生産するための方法としては、タンパク質の発現に適した条件下でそのコーティング配列を含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞を培養すること、及び宿主細胞培養からタンパク質を回収することが含まれる。
【００４３】
原核又は真核宿主細胞内への発現のためのベクターは、Oxford Univ. Pressにより刊行された「実践アプローチ」シリーズ内の出版物を含め、組換え型タンパク質のクローニング及び生産方法についての書籍及び雑誌の中で記述されている（「ＤＮＡクローニング２：発現系」、１９９５年；「ＤＮＡクローニング４：哺乳動物系」、１９９６年；「タンパク質の発現」、１９９９年；「タンパク質精製技術」、２００１年）。所望の抗体フォーマット（Ｓｃｆｖ、ＦＡｂ、抗体フラグメント、完全ヒト抗体、など）、又は１つ以上の内部アミノ酸の挿入、置換又は除去に関係して、付加的なタンパク質配列を付加することが可能である。これらの技術は、同様に、タンパク質全般そして特に抗体の治療的特性のさらなる構造的及び機能的特徴付け及び最適化のためにも使用可能である（Kim Sら、２００５年）。
【００４４】
本発明についてここで以下の実施例を用いて記述するが、これらの実施例は本発明をいかなる形であれ制限するものとしてみなされるべきではない。
【実施例】
【００４５】
実施例１：ＣＰ−ＰＡＣ−１細胞系のプロテオームにおけるＰＤＡ関連液性抗原の検出
材料と方法
ヒト血清
血清試料は、患者及び健康なドナーのインフォームドコンセント及び医療機関の倫理委員会からの承認を得て、静脈血から単離させた。使用するまで、試料を−８０℃で保管した。
【００４６】
７０人のＰＤＡ患者（男性３１名、女性３９名；年令範囲３２〜８６才；平均年令±標準偏差：６７±１１才）を、一般的に使用されている分類（Faria Sら、２００４年）及びＵＩＣＣ（Union International Contre le Cancer（国際対癌協会））分類にしたがって、以下の通りの異なる臨床的病期にグループ分けした：第ＩＩ期（転移なし、分化度中）１７名、第ＩＩＩ期（転移なし、分化度低）１７名、及び第ＩＶ期（遠隔転移、未分化）。
【００４７】
これらの血清の反応度を、癌又は自己免疫疾患の前歴のない対照として使用された４０名の健康な対照（男性１４名、女性２６名、年令範囲５７〜７７才；平均年令±標準偏差：７０±７才）のものと比較した。さらに、これらの血清の反応度を、３０名の非ＰＤＡ癌患者（肝細胞癌患者９名、乳癌患者１２名、結腸癌患者８名、そして卵巣癌患者１名；男性１１名、女性１９名；年令範囲４４〜７９才；平均年令±標準偏差６６±１０）及び１５人の慢性膵炎患者（男性９名、女性６名、年令範囲４９〜７６才；平均年令±標準偏差：５９±８才）のものと比較した。
【００４８】
血清を提供する患者の異なるグループ間の年令及び性別分布は、独立両側スチューデントｔ−検定によって評価される通り、充分有意な差異を示さなかった。慢性膵炎は一般にＰＤＡよりも若い年令（平均４４才前後）で発生することから、この疾病のグループにおいてのみ、これら２つのグループの年令分布は有意に異なっていた（性別分布は有意に異なっていなかった）。
【００４９】
細胞系及び細胞抽出物調製
膵管腺癌（Schoumacher Rら、１９９０年）から誘導したＣＦ−ＰＡＣ−１細胞系（ＥＣＡＣＣ、照会番号９１１１２５０１）由来の細胞（１０7）を収穫し、ハンクス液（Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA）で洗浄した。ペレットを一晩、凍結乾燥させ、−８０℃に保管した。２００μｌの再水和緩衝液［５Ｍの尿素、２Ｍのチオ尿素、４％ｗ／ｖのＣＨＡＰＳ（Sigma Chemical Co.）、２％ｖ／ｖのＩＰＧ緩衝液３〜１０ＮＬ（GE Healthcare Bio-Sciences, Uppsala, スウェーデン）、８０ｍＭのＤＴＴ（Sigma Chemical Co.）］及び微量のブロモフェノール・ブルー（Sigma Chemical Co.）中にペレットを再懸濁させた。タンパク質濃度をブラッドフォード検定（Bio-Rad Laboratories）で測定した。
【００５０】
二次元ゲル電気泳動（２−ＤＥ）
ＣＦ−ＰＡＣ−１細胞系由来のタンパク質抽出物１００μｇを、分析用及び分取用ゲルのため、７ｃｍのＩＰＧストリップ上へのゲル中（in gel）再水和（ｐＨ３〜１０ＮＬ）により投入した。合計１６０００Ｖｋの間、最高５０００Ｖまでの電圧勾配で、ＩＰＧphorＩＥＦユニットシステム（GE Healthcare Bio-Sciences）上で、等電点電気泳動法（ＩＥＦ）を実施した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥの前に、ＩＰＧストリップを１５分間、トリス／ＨＣｌ緩衝液（５０ｍＭ；ｐＨ８．８）、尿素（６Ｍ）、グリセロール（３０％ｖ／ｖ）、ＳＤＳ（２％ｗ／ｖ）及びＤＴＴ（２％ｗ／ｖ）の溶液中で平衡化し、その後ＤＴＴに代ってブロモフェノール・ブルー及びヨードアセトアミド（２．５％ｗ／ｖ）を含有する同じ緩衝液中でさらに５分間平衡化した。第２次元については、恒常な２００ＶでNovex X-Cell IITMミニ−セルシステム（Invitrogen）を用いて、小さいNuPAGE（登録商標）Novex（登録商標）４〜１２％Bis-Trix Zoom（登録商標）プレキャストゲル（Invitrogen, Groningen、オランダ）上に７ｃｍのストリップを走らせ、これをNovex X-Cell IITMブロット・モジュール（Invitrogen）を用いてHybond ECLニトロセルロース膜（GE Healthcare Bio science）上に移すか、又は質量分析法による分析のために銀染色した（Shevchenko Aら、１９９６年）。
【００５１】
タンパク質スポットのＰＩ値を、GE Healthcare Bio-Sciencesにより提供されたｐＨ勾配グラフを用いて２−ＤＥゲル上のそれらの位置から推定した。タンパク質の分子量を、公知の分子量のSeeBlue Plus 2予備染色標準（Invitrogen）の移動との比較によって計算した。「ImageScanner」（GE Healthcare Bio Sciences）で２−ＤＥゲル画像を獲得し、「ImageMaster Labscan Ver 3.00」ソフトウェア（GE Healthcare Bio-Sciences）を用いてＴＩＦＦ書式で記録した。
【００５２】
膜を１５分間４℃で、５％の脱脂粉乳を含有するＴＢＳから成る遮断用緩衝液と共にインキュベートし、その後、スクラム（０．０５％のTween 20及び５０％の脱脂粉乳を含有するＴＢＳ中の１：２００の作業希釈液）と共に４時間インキュベートした。洗浄後、室温で９０分間１：１０００希釈度のホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）−接合型ウサギ抗ヒト免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）抗体（Santa Cruz Biotechnology）と共に膜をインキュベートした。
【００５３】
代替的には、精製された一次抗体を用いたウエスタンブロット分析のため、２−ＤＥゲルからブロッティングしたニトロセルロース膜を、マウス由来の抗体［例えばモノクローナル抗体、抗エノラーゼ１９／１２8（Moscato Sらにおいて特徴付けされたクローン１９／１２のサブクローン）、抗トリオースリン酸イソメラーゼ１（Abnova Corporation）、抗ケラチン１０（Chemicon International）、抗伸長因子ｔｕ（Abnova Corporation）］、か又はウサギ由来の抗体［例えばポリクローナル抗体、抗アルデヒドデヒドロゲナーゼ１（Chemicon International）、抗グルコース−６リン酸１−デヒドロゲナーゼ（Bethyl laboratories）、抗イソクエン酸デヒドロゲナーゼ（Biogenesis Ltd）及び抗−コフィリン１（Cell Signaling）］のいずれかの１：１０００希釈液を用いて、２５℃で１時間プローブした。その後、メーカーの指示事項にしたがって、抗マウスＩｇＧ又は抗ウサギＩｇＧのいずれかの特異的二次ＨＲＰ接合型ヤギ抗体と共に一時間膜をインキュベートした。
【００５４】
５０ｍＭのＴＲＩＳ／ＨＣｌｐＨ７．４、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１％のＮＰ４０、１％のTriton X-100、１ｍＭのＤＴＴ、１０μｌ／ｍｌの阻害性カクテル、１ｍＭのＰＭＳＦ（全てSigma Chemical Co.）及び１０μｌ／ｍｌのヌクレアーゼミックス（GE Healthcare Bio-Sciences）を含有する４００μｌの溶解緩衝液中で、氷上で均質化された合計３０〜５０ｍｇの新鮮な凍結組織（Ｔ１８基本Ultra Turrax）を用いて、膵臓組織のウエスタンブロット分析を実施した。超音波処理装置（Hielscher UP 200S、３×４０秒、振幅４０％、サイクル０．５）での超音波処理の後、ミックスを遠心分離した（３０分間４℃で１３０００ｒｐｍ／分）。上清中に含有されブラッドフォード検定（Bio-Rad Laboratories）で測定されたタンパク質抽出物２０μｇを、小さいNuPAGE（登録商標）Novex（登録商標）４−１２％Bis-Trisプレキャストゲル（Invitrogen）上に走らせ、以上で記述した通りニトロセルロース膜に移した。
【００５５】
ＥＣＬ（増強化学発光、GE Healthcare Bio-Sciences）により免疫検出を実施し、その後ハイパーフィルム（GE Healthcare Bio-Sciences）上でのオートラジオグラフィを行なった。現像したフィルムの画像を「Image Scanner」（GE Healthcare Bio-Sciences）で獲得し、「Image Master Labscan Ver 3.00」ソフトウェア（GE Healthcare Bio-Sciences）でＴＩＦＦ書式で記録し、Image Master 2D Eliteバージョン３．１ソフトウェア（GE Healthcare Bio-Sciences）を用いて解析した。
【００５６】
質量分析法（ＭＳ）によるタンパク質の同定
ＭＳ分析のために、関心対象のスポットを分取２−ＤＥゲルから切除し、マトリクス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析法（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）そして必要な場合には電子スプレーイオン化（ＥＳＩ）によって分析した。
【００５７】
タンパク質を２５ｍＭの重炭酸アンモニウム及び５０％のアセトニトリルの溶液で一晩脱染し、その後、以前に記述された通り（Hellman Uら、１９９５年）トリプシンを用いてゲル中（in gel）で消化させた（Promega, Madison, WI, USA）。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳのためには、標的ディスクに０．５μＬの各々のペプチド混合物を塗布し、空気乾燥させた。その後、０．５μＬのマトリクス（３０％のアセトニトリル、０．１％のＴＦＡの溶液中の１％ｗ／ｖのα−シアノ−４ヒドロキシ桂皮酸）を乾燥した試料中に塗布し、再び乾燥させた。Bruker Reflex III ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦスペクトロメータを用いてスペクトルを得た。タンパク質消化物のＭＳスペクトル解釈を、ＭＳ−Ｆｉｔソフトウェア（http://prospector.ucsf.edu ：Chamrad Dら、２００４年）を用いて「ペプチド質量フィンガプリント法」（ＰＭＦ）により行なった。
【００５８】
ＭＳ／ＭＳ実験のため、トリプシンペプチド混合物をZip Tip C18デバイス（Millipore）内で脱塩及び濃縮した。６０％のメタノールプラス１％の蟻酸での溶出の後、４．５μｌのトリプシンペプチド混合物を金コーティングされたホウケイ酸塩毛細管（Proxcon Biosystems）内に導入し、ナノＥＳＩ源が取付けられたＬＣＱ Thermo（Thermo Finnigan）イオントラップ質量分析計の中で分析した。毛細管の電圧を４６Ｖに、そしてスプレー電圧を１．８ｋＶに設定した。フルスキャン質量スペクトルからの最も安定した信号を捕捉し、２２〜２４％の範囲内の正規化した衝突エネルギーで低エネルギー衝突誘発型解離（ＣＩＤ）によりフラグメント化した。
【００５９】
一部のタンパク質は同様にＥＳＩイオン源の備わったＬＣＱ ＤＥＣＡ ＸＰプラスイオントラップ質量分析計（Thermo Finnigan）を用いて、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳによっても同定された。クロマトグラフィ分離とそれに続くＭＳ分析装置は、１０μＬの注入体積そして２００μｌ／分の流速で、Surveyor（オートサンプラ及びポンプ）計器（Thermo Finnigan）を用いて、Ｃ１８カラムＬｕｎａ、１５０×２．０ｍｍ（Phenomenex）上で行なわれた。
【００６０】
全てのＭＳ／ＭＳデータ解析について、Bioworks 3.0（Thermo Finnigan）ソフトウェアを使用し、結果としての配列を、ＦＡＳＴＡソフトウェア（http://www.ebi.ac.uk/fasta33/；Johnson Rら.,２００５年）を用いてＥＢＩデータベース中に存在するヒトタンパク質の配列と比較した。
【００６１】
統計的分析
全ての統計をGraph Pad Prism Softwareを用いて計測した。データを平均±ＳＥＭ（標準誤差）として提示した。ＰＤＡ及び正常な膵臓組織の中での異なるタンパク質発現の有意性を査定するために、対応のない両側（2-tailed）ｔ検定を使用した。０．０５未満の両側（2-sided）Ｐ値が、統計的に有意であるとみなされた。
【００６２】
結果
ＰＤＡ関連タンパク質発現及び細胞増殖のためのモデルとして使用されることの多いＣＦ−ＰＡＣ−１細胞系のプロテオーム（Bouvet Mら、２００１年；Szepeshazi Kら、２００５年）を使用して、一次抗体の供給源としてＰＤＡ患者からの血清を用いてＰＤＡに関連するタンパク質及び抗体の存在を同定した。
【００６３】
この細胞系からのタンパク質抽出物を２−ＤＥによって分析し、銀染色により代表的２次元マップを定義付けした。このアプローチにより、２−ＤＥゲル内のその強度及び位置にしたがって分類できかつそれについてタンパク質の量、分子量及びｐＩを近似的に決定することのできる「スポット」として、この抽出物中に含まれたタンパク質を分離することが可能となる。
【００６４】
２−ＤＥゲルは、ＰＤＡ患者又は非ＰＤＡ患者（健康な対象、その他の癌に罹患した患者及び慢性膵炎に罹患した患者を含む）のいずれかに由来する血清パネルを用いて、ウエスタンブロット法により分析するために、膜上に移された。異なるスポットマップ間（そして２−ＤＥゲルの銀染色画像とその対応するウエスタンブロット画像の間）の比較は、ＰＤＡ関連スポットの同定を導き、このスポットは、例えば制御された形でタンパク質を消化する酵素を用いてかかるスポットから抽出されたタンパク質フラグメントの質量分析法による分析によって、さらに特徴付けすることができる（図１）。
【００６５】
このアプローチを用いて、１０個のスポットが選択され、ＰＤＡ患者からの血清抗体により一意的に認識されているものとしてさらに特徴付けされた（図２Ａ）。使用された二次抗体はそのアイソフォームに特異的なものであることから、分析はヒトＩｇＧ抗体に制限された。分取ゲルから１０個のスポットを切除し、ＭＡＬＤ−ＴＯＦＭＳにより分析して、それらがどのヒトタンパク質に対応するかを同定した。このアプローチを用いて、９つの異なるタンパク質をＰＤＡ関連抗原として同定した。２対のスポットが同じタンパク質のアイソフォームに対応し、１つのスポットが、２−ＤＥによって充分に分離されていない２つの異なるタンパク質に属する配列を含有していた。対照血清を用いて実施されたウエスタンブロット法においては、これらのスポットの全てが不在であったか又はほぼ検出不能であった。これらのスポット中のタンパク質を１つ以上結合させる一次抗体が、ＰＤＡ患者から得た血清の有意な割合において同定された（表Ｉ）。
【００６６】
これらのＰＤＡ関連抗原タンパク質の中で、文献中でそれらが同定された生物活性のタイプに応じて２つのカテゴリのタンパク質を区別することができる。第１群のタンパク質には、代謝酵素すなわちα−エノラーゼ（各々１つの特異的アイソフォームに対応する２つのスポット中に存在する）、トリオースリン酸イソメラーゼ（各々特異的アイソフォームに対応する２つのスポット中に存在する）、レチナール・デヒドロゲナーゼ−１、グルコース−６−リン酸−１−デヒドロゲナーゼ、伸長因子Ｔｕ及びイソクエン酸デヒドロゲナーゼが含まれる。第２群のタンパク質は、細胞骨格タンパク質すなわちケラチンＩ型細胞骨格１０、及びコフィリン１として大部分が特徴付けされてきた。
【００６７】
ＣＦ−ＰＡＣ−１−細胞及びヒト血清を用いて得られた発見事実に加えて、健康な対象及びＰＤＡ対象から得た膵臓抽出物を、一次抗体として（ヒト血清ではなく）これらのタンパク質に対する精製済み抗体を用いたウエスタンブロット法において比較した。この分析により、（１つのアイソフォームに制限されず）１つのタンパク質の総量の定量化が可能になるが、この分析は、ＰＤＡ患者の生検材料から得た膵臓組織内でこれらのタンパク質が様々な度合で過剰発現されたということを示している（表Ｉ）。
【００６８】
これらのタンパク質の診断値（及びＰＤＡ血清中のこれらに対する特異的抗体の存在の診断値）が、対照として慢性膵炎患者由来の血清を用いて、疾病の病期に応じてグループ分けされた患者から得られたＰＤＡ血清の間で各タンパク質についてのスポットの存在を区別することによって、さらに評価された。
【００６９】
ウエスタンブロット法による分析は、異なるタンパク質に対する自己抗体の存在及び量が、異なるＰＤＡ病期にある患者の間で均等に分布していないということを示した（図２Ｂ）。大部分のタンパク質に対する自己抗体が対照血清においては不在であったが、一方、それらを含有するＰＤＡ血清の頻度は、ＥＮＯＡ１／２を顕著な例外として、大部分のタンパク質について病期ＩＩのＰＤＡ患者でわずかに存在する（２５％未満）。自己抗体産生プロファイル内のこれらの頻度は、大部分の進行した病期において確認され、ここでも又、第ＩＩＩ期及び第ＩＶ期のＰＤＡにおける頻度の恒常な増加を考えると、α−エノラーゼアイソフォームに対する自己抗体が最も興味深いものである。
【００７０】
結論
ヒト膵臓腫瘍細胞系（ＣＦ−ＰＡＣ−１）の２−ＤＥ発現プロファイリングと（ＰＤＡ患者由来の血清中のヒトＩｇＧを一次抗体として使用する）ウエスタンブロット分析とを組合せた血清学に基づくアプローチは、ＰＤＡ患者が特異的液性応答を生み出す限定数のヒトタンパク質及びそのアイソフォームの同定を可能にした。たった１つの例外（ＡＬ１Ａ１）は別にして、これらのタンパク質の発現は、ＰＤＡ生検材料においてアップレギュレートされた。その上、これらのＰＤＡ関連タンパク質に対する抗体の産生は、少なくとも一部の抗原について、進行した病期において著しく増大するように思われる。
【００７１】
これらの結果は、この場合大部分が細胞内のものである早期ＰＤＡ診断のために潜在的マーカーを同定するにあたっての血清学的アプローチが適切であることを実証している。免疫系が細胞内タンパク質に反応する機序は明確になっていないが、腫瘍細胞内の細胞内酵素の局在化を改変させる可能性のある腫瘍により作り出された独特の環境によって左右される可能性がある。
【００７２】
コフィリン１（ＣＯＦ１）は、インバドポジウム形成に関与し（Yamaguchi Hら、２００５年）かつおそらくは走化性及び成長因子刺激に応答した腫瘍細胞方向性に必要とされる（Mouneimne Gら、２００４年）アクチン脱重合酵素としてアクチンのリモデリング、運動性及び癌において１つの役割を果たす。ＣＯＦ１の過剰発現は、以前にＰＤＡ動物モデルに関連して観察されてきた（Cecconi Dら、２００３年；Sinha Pら、１９９９年）。
【００７３】
α−エノラーゼは、多数の特性を有し異なる状況下で検出された保存度の高い代謝酵素である（Pancholi V、２００１年；Piast Mら、２００５年；Terrier Bら、２００７年）。これは、プラスミノーゲンレセプタとして細胞表面上で発現され得（Lopez-Alemany Rら、２００３年）、Ｂ細胞により認識され得、潜在的にＢ細胞活性化因子として作用する（Babu Jら、２００２年）。２つのアイソフォームが、膵臓腺癌内で検出されたが、翻訳後修飾に関するその分子特性が記述されることはなかった（Shen Jら、２００４年）。
【００７４】
単一のアイソフォームとして又は多重アイソフォームの形で（ただし、ＥＮＯＡリン酸化アイソフォームの特異的発現の証拠なしで）存在するα−エノラーゼに対する自己抗体が、例えば癌関連網膜症（Adamus G ら、１９９８年；Adamus Gら、１９９６年）、非小細胞肺癌及びその他の非膵臓癌（国際公開第０７／０７２２１９号（WO07/072219）；米国特許第２００７０１７２４８７号（ＵＳ20070172487）；Hepら、２００７年）、胆汁性肝硬変（Akisawaら、１９９７年）、脳障害（Fujii Aら、２００５年）及び自己免疫疾患（Ballot Eら、２００３年；Bogdanos Dら、２００４年；Gitlits Vら、２００１年）といったような数多くの異なる生物学的及び疾病モデルにおいて同定されてきた。α−エノラーゼ及びα−エノラーゼ特異的抗体又は自己抗体の特性は、ファージ提示法（Arza Bら、１９９７年；Kemp Eら、２００２年）又はペプチド（Adamus Gら、１９９８年；Sato Nら、２０００年；Walter Mら、１９９５年；Fujii Aら、２００５年）を用いて研究されてきた。
【００７５】
ＰＤＡ患者由来の血清中のこのタンパク質の２つの特異的アイソフォーム（ＥＮＯＡ１／２）に対する自己抗体の頻度及び特異的産生を考えると、特異的α−エノラーゼアイソフォーム及びそれらを検出するための抗体は、ＰＤＡ診断にとって特に有用な手段であるということを、この結果が実証している（表Ｉ及び図２Ｂ）。抗体は、（実験の中で用いられた精製済み抗体のように）全ての又は大部分のアイソフォームに共通のエピトープ又は（ＰＤＡ血清中に存在するもののように）その他のＰＤＡ関連アイソフォームとこのＰＤＡ関連アイソフォームを区別するエピトープに対して特異的であり得る。その上、病期ＩＩからＩＶまでのＰＤＡの進行は、ＥＮＯＡ１／２に対する自己抗体の産生のきわめて有意な増強により特徴付けされ、腫瘍サイズ及び成長能力との直接的相関関係を示唆している。
【００７６】
かかるアイソフォームのより詳細な分析は、ＰＤＡ診断のための自己抗体の的中率を立証するためのみならず、それらをＰＤＡ又はこの癌に対する考えられる治療的アプローチに結びつける分子機序をより深く理解するためにも重要である。
【００７７】
実施例２：ＣＦ−ＰＡＣ−１細胞内で自己抗体によって検出されるα−エノラーゼアイソフォームの分析
材料と方法
ＭＳ分析
スポットを分取２−ＤＥゲルから切除し、マトリクス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析法（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）で分析した。タンパク質を０．０２５モル／Ｌの重炭酸アンモニウムと５０％のアセトニトリルの溶液で一晩脱染し、その後、以前に記述された通り（Hellman Uら、１９９５年）トリプシンを用いてゲル中（in gel）で消化させた（Promega, Madison, WI, USA）。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳのためには、標的ディスクに０．５μＬの各々のペプチド混合物を塗布し、空気乾燥させた。その後、０．５μＬのマトリクス溶液（３０％のアセトニトリル、０．１％のＴＦＡ中の１％ｗ／ｖのα−シアノ−４ヒドロキシ桂皮酸）を乾燥した試料中に塗布し、再び乾燥させた。Bruker Reflex III ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦスペクトロメータ（Bremen、ドイツ）を用いてスペクトルを得た。タンパク質消化物のＭＳスペクトル解釈を、ＭＳ−Ｆｉｔソフトウェアを用いて「ペプチド質量フィンガプリント法」（ＰＭＦ）により行なった。
【００７８】
リン酸化分析
インタネットにより利用可能な以下のソフトウェアを用いて、ヒトα−エノラーゼタンパク質配列の分析を実施した：
NetPhos [ http://www.cbs.dtu.dk/services/; (B lorn N ら、１９９９年)]、
NetPhosK [http://www.cbs.dtu.dk/serviccs/; (Blom Nら、２００４年)]、
dbPTM [ http ://dbPTM.mbc .nctu . edu.tw/; (Lee T ら、２００６年)]、
PPSP [http://bioinformatics.lcd-ustc.org/PPSP/; (Xue Y ら、２００６年)]及び
GPS [http://bioinformatics.lcd-ustc.org/gps_web/predict.php ; (Xue Y ら、２００５年)]。
【００７９】
以下の修正を伴って記述通りに（Yamagata Aら、２００２年）λPPase（New England Biolabs Inc.）を用いて、ホスファターゼ処理を実施した。１ｍｌの溶解緩衝液（１％ｗ／ｖのＮＰ−４０、１％ｗ／ｖのＳＤＳ、５０ｍＭのトリスｐＨ７．６及び１５０ｍＭのＮａＣｌプロテアーゼ阻害物質カクテル）中で１５時間、ペレット化されたＣＦ−ＰＡＣ−１細胞（３０×１０6個）を再懸濁させた。溶解物（２ｍｇのタンパク質に対応する１２０μｌ）を、脱イオン水で１２４０μｌの最終体積にし、その後２０μｌの２０ｍＭのＭｎＣｌ２溶液及び２０μｌのλPPase緩衝液を添加した。各々の添加後、溶液を穏やかに混合した。混合物をアリコートに分割し、１つのアリコートに６００単位のλPPaseを添加した。混合の後、アリコートを３０℃で１５時間インキュベートした。タンパク質をアセトン及びクロロホルムで沈澱させ、２−ＤＥ分析のために使用した（実施例１を参照のこと）。
【００８０】
メーカーの指示事項によって及び文献（Wu Jら、２００５年）で記述されているように、全タンパク質の検出のためにSypro Ruby染色液（Bio-Rad）を用いて及びPro Qリンタンパク質螢光染料（Molecular Probes）を使用して２−ＤＥゲル中で、リンタンパク質の染料ベースの検出を実施した。簡単に言うと、２−ＤＥの後、まず最初に５０％のメタノール／１０％の酢酸中で３０分間ゲルを固定させることによって、Pro-Q染色法を実施した。次にゲルを精製水で洗浄し、４時間Pro-Q Diamondリンタンパク質染色法に付した。Sypro Ruby螢光染料での染色（一晩）に先立って、２０％のアセトニトリルを含有する５０ｍＭの酢酸ナトリウム、ｐＨ４．０の連続的洗浄で脱染を行なった。
【００８１】
生体材料由来の膵臓組織におけるＥＮＯＡアイソフォームの発現の分析
健康な個体又はＰＤＡ患者（第ＩＩ期）のいずれかの生体材料から得た膵臓組織を、氷上で、５モル／Ｌの尿素、２モル／Ｌのチオ尿素、４％ｗ／ｖのＣＨＡＰＳ、２％ｖ／ｖＩＰＧ緩衝液、非直線的ｐＨ３−１０、０．０８モル／Ｌのジチオトレイトール（ＤＴＴ）、１０μＬ／ｍＬのヌクレアーゼミックス及び微量のブロモフェノール・ブルーを含有する４００μｌの溶解緩衝液中で均質化した（Ｔ１８塩基性Ultra Turrax, ＩＫＡ）。超音波処理装置（Hielscher ＵＰ２００Ｓ、３×４０秒、振幅４０％、サイクル０．５Hielscher Ultrasonics ＧｍｂＨ）での超音波処理の後、ミックスを、タンパク質溶液が上清中に含まれた状態で遠心分離（１３０００ｒｐｍ、４℃で３０分）した。
【００８２】
タンパク質濃度を、ブラッドフォード検定で測定した。３０μｇのタンパク質抽出物を、小さいＮｕＰＡＧＥ（登録商標）Ｎｏｖｅｘ（登録商標）４〜１２％のＢｉｓ−Ｔｒｉｓプレキャストゲル上に走らせ、ニトロセルロース膜に移し、抗α−エノラーゼモノクローナル抗体１９／１２8（Moscato Sら、２０００年）と共に４℃で一晩インキュベートし、実施例１で記述されている通りウエスタンブロット法において顕示させた。
【００８３】
組換え型ヒスチジンタグ付けされたＥＮＯＡ（ｒＥＮＯＡ）の産生
組換え型タンパク質を、ヒスチジンタグに融合された（最初の９つのアミノ酸のみが欠如している）ヒトＥＮＯＡの配列をコードするプラスミドでのトランスフェクションを受けた大腸菌（E. coli）細胞から精製した。簡単に言うと、細菌細胞を遠心分離によって１リットルの培養から収穫して、リゾチーム（１００μｇ／ｍｌ）及びサルコシル０．７％を加えた天然結合緩衝液（ＮＢＢ、２０ｍＭのリン酸ナトリウム及び５００ｍＭの塩化ナトリウム、ｐＨ７．８）２０ｍｌ中に再懸濁させた。懸濁液を４℃で１５分間ゆっくりと揺動させた。細胞溶解物を、高強度で１０回の４０秒パルスを用いて氷上で超音波処理した。４℃で１５分間１０００００ｒｐｍで溶解物を遠心分離して、不溶性画分をペレット化させ、これを、室温で１０分間、プロテアーゼ阻害物質で富化した１０ｍｌのグアニジニウム溶解緩衝液（６Ｍの塩酸グアニジン、２０ｍＭのリン酸ナトリウム、５００ｍＭの塩化ナトリウム、ｐＨ７．８）中に再懸濁させた。溶解物を、平衡化したカラム（Ｎｉ−ＮＴＡアガロースカラム、Invitrogen）に添加して、穏やかな回転を用いて４℃で３０分間樹脂に対し結合できるようにした。樹脂をＮＢＢで２回洗浄し、天然洗浄緩衝液で２回の洗浄がこれに続いた。１０ｍｌのイミダゾール溶出緩衝液（３５０ｍＭ ｐＨ６＝組換え型ヒスチジンタグ付けＥＮＯＡ（ｒＥＮＯＡ）の産生）を用いて溶出を実施した。溶出された画分を滅菌水中で透析させ、次に凍結乾燥させ、滅菌した発熱物質を含まないダルベッコリン酸緩衝溶液（ＤＰＢＳ、Sigma）中で再懸濁させた。アリコートを−２０℃で保管した。内毒素レベルは、カブトガニアメーバ状細胞溶解物検定（Pyrogent ; Bio Whittaker）において０．０３ＥＵ／ｍｌ未満であった。
【００８４】
患者の血清及びウエスタンブロット法を用いたＣＦ−ＰＡＣ−１中のＥＮＯＡアイソフォームの発現の分析
上述の通り、ＣＦ−ＰＡＣ−１ ２−ＤＥゲルをHybond ＥＣＬニトロセルロース膜（GE Healthcare）上に電気転写した。５％の脱脂粉乳を含有するＴＢＳで１時間遮断した後、異なる条件下でＥＮＯＡ１／２＋患者の３つの血清（ＴＢＳ中１：１００で希釈されたもの）のプールと共にブロットをインキュベートした。
【００８５】
一連の実験において、血清プールをまず最初に１５分間４℃で、組換え型α−エノラーゼ（ｒＥＮＯＡ）２０μｇ／ｍｌと共に揺動装置上でインキュベートしてから、膜とのインキュベーションを実施した。もう１つの一連の実験においては、膜をまず最初に、λPPase ６００単位を含有するＰＢＳ２ｍｌ、２０ｍＭのＭｃＣｌ2溶液４０μｌそしてλPPase緩衝液４０μｌと共に１５時間３０℃でインキュベートした。膜を１時間再び遮断し、ＴＴＢＳで１５分間３回洗浄し、血清のプール（希釈度１：１００）と共にインキュベートした。
【００８６】
ＥＮＯＡアイソフォームに対する血清中の抗体の結合は、実施例１に記述されているようにウエスタンブロット法において標識済み抗ヒト抗体を用いて顕示された。固定化されたＥＮＯＡの数量の対照として、膜をマウスモノクローナル抗体抗エノラーゼ１９／１２8で再度プローブした（実施例１を参照のこと）。
【００８７】
結果
ＰＤＡ患者の血清中の抗体によりヒトα−エノラーゼの２つのアイソフォームが特異的に検出されることを実証した後、異なるアプローチを用いて、このようなアイソフォーム（及びＣＦ−ＰＡＣ−１細胞内に存在するこのタンパク質のその他のあらゆるアイソフォーム）を特徴付ける機能を実施した。
【００８８】
異なるＰＤＡ患者の血清又はα−エノラーゼに対する精製済み抗体を用いて得られたウエスタンブロット法、２−ＤＥゲルの銀染色及び質量分析法による分析を比較することにより、ＰＤＡに関連しない付加的なα−エノラーゼアイソフォームに対応する４つの付加的なスポットが、ＥＮＯＡ１／２と類似の分子量をもつものの実験的ｐＩ値はより低い状態で、２−ＤＥゲル中に存在することがわかった（表ＩＩ）。これらの証拠は、２−ＤＥゲル分析中でＣＦ−ＰＡＣ−１又はＭｉａＰａｃａ−２細胞抽出物を用いて得られた。
【００８９】
このようなスポットから得たペプチドは、ＥＮＯＡのフラグメントと同一であり（かつきわめて類似のヒトガンマエノラーゼとは明らかに異なっている；図３）、スポットがＥＮＯＡアイソフォームに対応しているはずであり、ここでＥＮＯＡ１／２のみがＰＤＡ関連であるとするウエスタンブロット法の証拠を確認している。翻訳後修飾は、往々にして１つのアイソフォームをもう１つのアイソフォームと区別する機能である。予備分析は、（分子量の限定された変化から考えて）グリコシル化を排除し、そして（ｐＩの減少を考えて）示唆されたリン酸化修飾を排除するように思われた。
【００９０】
ヒトα−エノラーゼの配列は、異なるキナーゼによるリン酸化のための潜在的標的である複数のチロシン、セリン、及びトレオニン残基を含む。この仮説は、その他のタンパク質について文献中で示されているように（Kumar Yら、２００４年）、リン酸化非依存性抗体を用いて検出されるスポットの強度の何らかの変化が存在したか否かを知るため２−ＤＥ分離に先立って広く活性なホスファターゼに対してタンパク質抽出物を曝露することによって試された。実際、大部分の酸性アイソフォーム（すなわちＰＤＡ関連ＥＮＯＡ１／２及びＥＮＯＡアイソフォーム３：表ＩＩ）に対応するＥＮＯＡスポットの強度は、ホスファターゼ前処理を受けたＣＦ−ＰＡＣ−１細胞抽出物において明らかに減少していた。その上、ＥＮＯＡアイソフォーム３（ＥＮＯＡ１／２よりもさらに豊富なもの）の質量分析法による分析は、残基５５、５７、２００、２３６、２３７、２５７及び４１９がこのアイソフォームにおいてリン酸化されることを示した（図４）。
【００９１】
α−エノラーゼのインビボ又はインビトロリン酸化についての以前の報告書（Cooper Jら、１９８４年；Eigenbrodt Eら、１９８３年；Marcus Kら、２０００年；Rush Jら、２００５年；Stasykら、２００５年；Molina Hら、２００７年）は、一般に、少なくとも３つの特異的残基が同時にリン酸化され得ること、そして特にＥＮＯＡアイソフォームにおいて残渣５５、５７、２００、２３６、２３７、２５７及び４１９がリン酸化された状態で発見され得ることを示すことができなかった。その上、ＥＮＯＡアイソフォーム３におけるリン酸化された残基の組合せは、リン酸化のための部位候補の数が多いことから（図４）、ＥＮＯＡタンパク質配列のソフトウェアベースの分析を用いて予測することがほとんどできなかった。質量分析法による分析のこの段階で検出されていない付加的なリン酸化部位をＥＮＯＡアイソフォーム３が有し得ることは排除できないが、ＥＮＯＡ１／２は、ＥＮＯＡアイソフォーム３からそれらを特徴付けする（ホスファターゼを用いて得られた発見事実及びｐＩ値に起因して同じくリン酸化されている確率が最も高い）翻訳後修飾された残基を含んでいるはずである。
【００９２】
とりわけ、リン酸化状態が決定されておりリン酸化部位候補を含むＥＮＯＡ３アイソフォームから得られた２つ以上のペプチドが、このような修飾を示していない。例えば、文献中で実証済み白血病Ｔ細胞系内でリン酸化されているものとして特異的に同定されたチロシン４４（Rush Jら、２００５年）は、ＥＮＯＡアイソフォーム３の中ではリン酸化状態になっていなかった。同様にしてＥＮＯＡアイソフォーム３の場合（図４）のように残基５５とではなく残基６３と組合せてリン酸化されているものとして同定されてきた（Molina Hら、２００７年）。
【００９３】
ＰＤＡ血清及びＥＮＯＡ特異的抗体の両方を用いて検出されたＥＮＯＡアイソフォーム内のリン酸化のさらなる分析が、ウエスタンブロット法中で得られた画像と、２−ＤＥゲル内の全タンパク質を染色する（銀染色又はSypro Ruby）染料又はリンタンパク質に特異的な染料（Pro-Q Diamond）を用いて得られる画像とを比較することによって実施された。この分析は、ＥＮＯＡ１／２及び３のみがＣＦ−ＰＡＣ−１細胞内でリン酸化されることを確認した（図５Ａ；表ＩＩ）。
【００９４】
ＥＮＯＡ発現も同様に、ＰＤＡ患者の血清中で検出される６個のアイソフォーム全てに共通の特異的エピトープに対する抗−エノラーゼ抗体の結合を用いて、外科的処置を受けたＰＤＡ患者（第ＩＩ期；ｎ＝７）から得た組織及び正常な膵臓組織（ｎ＝１）についてのウエスタンブロット法によってテストされた。７つのＰＤＡ生検材料のうちの６つにおいて、６個のＥＮＯＡアイソフォーム全てが検出された。これとは対照的に、正常な膵臓においては、４つのアイソフォーム（ＥＮＯＡ３、４、５及び６）のみが明確に検出可能であった（図５Ｂ）。ＰＤＡ患者がＥＮＯＡ１／２に対する抗体を生成することのみならず、これらのアイソフォームがＰＤＡ膵臓組織内で有意に過剰発現されていることをも結論づけすることができる。
【００９５】
リン酸化されたＥＮＯＡに対するＰＤＡ患者からの血清の反応性を、この反応性がそれらのリン酸化されたエピトープに対し特異的に向けられているか否かの理解の範囲において、２−ＤＥ及びウエスタンブロット法でＣＦ−ＰＡＣ−１細胞抽出物を用いてさらに調査した。ＰＤＡ患者の血清は６つのアイソフォーム全てに反応したことから、これらは、リン酸化されたエピトープ又はリン酸化されていないエピトープのいずれかに対して反応する抗体を含有しているかもしれない。
【００９６】
第１の一連の実験においては、ＥＮＯＡ抗原に対する曝露が基準膵臓細胞系内でＥＮＯＡアイソフォームを認識する血清の能力を改変させるか否かを知るために、リン酸化された残基を含まない組換え型ヒトＥＮＯＡと共に血清を予めインキュベートした。実際、２−ＤＥウエスタンブロット法による分析は、未リン酸化ＥＮＯＡが、ＥＮＯＡ１／２アイソフォームに対する反応性に影響を及ぼすことなくアイソフォーム３、４、５及び６に対する反応性のみを著しく低減させることを顕示した。この証拠は、患者の血清がリン酸化されたＥＮＯＡ１／２アイソフォームに特異的に反応する抗体を含有することを確認するために膜をホスファターゼ（λP Pase）と共に予めインキュベートさせたもう１つの一連の実験においてさらに確認された。λPPaseが無い場合、血清は、全てのＥＮＯＡアイソフォームを認識し、一方λPPase処置はＥＮＯＡ１／２に対する血清の反応性を著しく減少させた（図６）。
【００９７】
抗−ＥＮＯＡｍＡｂは、処置された膜又は未処置の膜において全てのアイソフォームを同等に検出したことから（データ示さず）、これらのデータは、ＰＤＡ患者の血清中の抗体がリン酸化ＥＮＯＡ１／２アイソフォームに対して特異的に反応することを実証している。
【００９８】
結論
異なるプロテオームアプローチを用いて、多数のＥＮＯＡアイソフォーム及びそれらに対する抗体が同定された（Adamus Gら、１９９８年；Adamus Gら、１９９６年；Akisawa Nら、１９９７年；Ballot Eら、２００３年；Bryborn Mら、２００５年；Lubec Gら、２００３年；O’Dwyer Dら、２００２年）。しかしながら、これらの報告書は、ＰＤＡの進行中の特定のアイソフォームに対する自己抗体の産生に対するリン酸化状態と位置の間の関連性についての明らかな実証を提供していない。
【００９９】
その他の論文は、特定の細胞処置（Baty Jら、２００５年；Bottalico Lら、１９９３年；Kanamoto Tら、２００２年）又は疾病（Byrjalsen Iら、１９９９年；Clauser Kら、１９９５年；Nakanishi Tら、２００６年；Tanaka Yら、２００６年；米国特許第２００７０１７４８７号（US20070172487））に関連付けて、例えば２−ＤＥゲルのウエスタンブロット法において患者の血清を用いて検出されるα−エノラーゼスポットの強度及び／又は数の変化について報告しており、それがリン酸化といったような翻訳後修飾に起因し得るということを示唆している。
【０１００】
その他の報告書では、ヒトα−エノラーゼが、２−ＤＥゲルにより分析されたＰＤＡ試料の中で過剰発現されｍＲＮＡのレベル及び免疫細胞化学において確認された複数のタンパク質のうちの１つとして標示されているが、ＰＤＡに関連付けされたα−エノラーゼのアイソフォームを特徴付ける特異的リン酸化については全く言及されていない。（国際公開第０４／５５５４８号（WO04/55548）；Shen Jら、２００４年；Nakanishi Tら、２００６年；Mikuriya Kら、２００７年）。
【０１０１】
α−エノラーゼ内で検出された数多くの翻訳後修飾の中でも（表ＩＩＩ）、古い文献においては（Cooper Jら、１９８４年；Coussens Pら、１９８５年；Eigenbrodt Eら、１９８３年；Golden Aら、１９８６年）、インビボとインビトロの両方でリン酸化が検出されてきた。最近では、２Ｄ−ゲル、市販のマウス抗ホスホチロシン抗体（クローン４Ｇ１０、Cod. ０５−３２１；Biomol）及びヒト血小板中の質量分析法（Marcus Kら、２０００年）を用いて、α−エノラーゼの２つのリン酸化されたアイソフォームが検出されてきた。２Ｄ−ゲル、放射性標識及び質量分析法（Stasyk Tら、２００５年）を用いてＴＧＦ beta １処置済み細胞（ＭＣＦ−７細胞系）内で、又はフラボノイドでの処置の後エノラーゼリン酸化が減少したＭＩＡＰａＣａ細胞（膵臓癌細胞系）（Lee Lら、２００２年）内で、α−エノラーゼの単一のリン酸化変異体が検出された。その上、２つのリン酸化部位が、チロシン残基（４４及び２８６；Rush Jら、２００５年）又はチロシン及びセリン残基（５７及び６３；Molina Hら、２００７年）にあった。
【０１０２】
しかしながら、これらの文書のいずれも、ＰＤＡを、少なくとも３つの位置ですでにリン酸化されたα−エノラーゼアイソフォームの付加的なリン酸化と、及びそれらを結合する抗体に、関連付けすることはなかった。
【０１０３】
実施例３：α−エノラーゼのリン酸化されたアイソフォームを発現する形質転換された細胞系の成長及び増殖に対するα−エノラーゼに結合する抗体の効果
材料と方法
細胞系の増殖についての検定
負の対照として用いられたマウスＩｇＧ１アイソフォーム整合済み対照モノクローナル抗体（Ｐ＆Ｄ Systems）又は抗α−エノラーゼモノクローナル抗体７２／１（Moscato Sら、２０００年）を伴うか又は伴わない完全細胞培地（１０％のウシ胎仔血清を伴うＲＰＭＩ−１６４０）中で９６ウェルのマイクロプレート内に２〜１０×１０3個／ウェルの細胞を播種することによって、標示された細胞系を用いて細胞増殖のインビトロ検定を実施した。
【０１０４】
４４時間又は６８時間後に、３７℃でさらに４時間、各ウェルに２０μｌのメチルテトラゾリウム溶液（ＭＴＴ；５ｍｇ／ｍｌ）を添加した。培地を除去し、細胞をＤＭＳＯで溶解させた。５４０ナノメートルで分光光度計に対し平板の読取りを行なった。
【０１０５】
結果
２−ＤＥ及びウエスタンブロット法により決定されるようなα−エノラーゼ発現の異なるプロファイルを提示する細胞系の成長に対する抗α−エノラーゼ抗体の効果は、生存細胞内に取込まれ活性細胞成長、代謝及び増殖と相関関係をもつ化合物であるＭＴＴの取込みを測定することによって、テストされた。
【０１０６】
ＭＴＴベースの比色分析を用いて、膵臓由来であるか非膵臓由来であるかとは無関係に６つのアイソフォーム全てを発現する形質転換された細胞系内で、細胞増殖の有意な阻害が得られた。ＩｇＧＩアイソフォーム整合対照モノクローナル抗体又は３つのリン酸化ＥＮＯＡアイソフォームを発現しない細胞系を使用すると、この効果は最小限である（表ＩＶ）。
【０１０７】
かくして、抗α−エノラーゼ抗体は、（生検材料からの組織又は血清といった）ＰＤＡ関連生体試料内で検出されたα−エノラーゼの特異的リン酸化プロファイルを有する成長及び増殖細胞系を（少なくとも部分的に）阻害することができる。
【０１０８】
結論
一般に細胞質タンパク質とみなされているとしても、α−エノラーゼは、細胞表面上で生物学的に活性なタンパク質（Arza Bら、１９９７年；Bergman Aら、１９９７年；Moscato Sら、２０００年；Lopez-Alemany Rら、２００３年）ならびに可溶性因子（Babu J ら、２００２年；Demir Aら、２００５年）として発現され得る。
【０１０９】
インビトロデータは、細胞系がα−エノラーゼのリン酸化されたアイソフォームを発現する場合にのみ、（細胞表面レセプタとして及び／又は可溶性タンパク質として）細胞外空間内で発現されるα−エノラーゼアイソフォーム中に存在するエピトープに対する抗体の結合によって、形質転換された細胞系の成長が減速される、ということを示している。
【０１１０】
かくして、α−エノラーゼリン酸化アイソフォームを提示する細胞を特異的に結合させるモノクローナル抗体が、形質転換された細胞系の増殖を阻害できる。細胞の増殖を制御するためのこの機序は、ＰＤＡのみならずかかる分子機能を提示するその他の形態の癌においても存在するように思われ、ＰＤＡ治療用薬剤の調製及びＰＤＡ患者の診断及び治療方法といったような、癌関連の治療用利用分野のために適切なモノクローナル抗体によってターゲティングされる可能性がある。
【０１１１】
【表１】
【０１１２】
【表２】
【０１１３】
【表３】
【０１１４】
【表４】
【０１１５】
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Wu J ら、（２００５年）、Electrophoresis、第２６号、２２５〜３７頁。
Xia Q ら、（２００５年）、Biochem Biophys Res Commun.、第３３０号、５２６〜３２頁。
Xue Y ら、（２００６年）、BMC Bio informatics、第７号、１６３頁。
Xue Y ら、（２００５年）、Nucleic Acids Res.、第３３号、Ｗ１８４〜７頁。
Yamagata A ら、（２００２年）、Proteomics.、第２号、１２６７〜７６頁。
Yamaguchi H ら、（２００５年）、J Cell Biol.、第１６８号、４４１〜５２頁。
Yezhelyev MV ら、（２００4年）、Clin Cancer Res.、第１０号、８０２８〜３６頁。
Yokoi N ら、（２００５年）、Cancer Res.、第６５号、１０３７１〜１０３８０頁。
Yu Y ら、（２００５年）、Oncology第６８号、７９〜８６頁。
Yunis A ら、（１９７７年)、Int J Cancer、第１９号、１２８〜３５頁。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも３つの位置においてリン酸化されていることを特徴とする、ヒトα−エノラーゼのアイソフォーム。
【請求項２】
前記３つの位置が、トレオニン５５、チロシン５７、チロシン２００、チロシン２３６、トレオニン２３７、チロシン２５７、及びセリン４１９の中から選択される、請求項１に記載のアイソフォーム。
【請求項３】
請求項１又は２に記載のα−エノラーゼのアイソフォームと特異的に結合する抗体。
【請求項４】
モノクローナル抗体又は抗体フラグメントであることを特徴とする、請求項３に記載の抗体。
【請求項５】
検出可能な標識分子と融合しているか又は接合していることを特徴とする、請求項３又は４に記載の抗体。
【請求項６】
膵管腺癌の診断を目的とする、請求項１又は２に記載の抗α−エノラーゼのアイソフォーム又は請求項１又は２に記載の抗α−エノラーゼのアイソフォームと結合する抗体の使用。
【請求項７】
請求項１又は２に記載の抗α−エノラーゼのアイソフォームの検出及び／又は請求項１又は２に記載の抗α−エノラーゼのアイソフォームと結合する抗体の検出を含んでなる、膵管腺癌（ＰＤＡ）の診断方法。
【請求項８】
請求項１又は２に記載の抗α−エノラーゼのアイソフォーム及び／又は請求項１又は２に記載の抗α−エノラーゼのアイソフォームと結合する抗体を含んでなる、膵管腺癌（ＰＤＡ）の診断用キット。
【請求項９】
膵管腺癌の治療用の医薬組成物の調製のための抗α−エノラーゼ抗体の使用。
【請求項１０】
抗α−エノラーゼ抗体を含んでなる膵管腺癌の治療用の医薬組成物。
【請求項１】
少なくとも３つの位置においてリン酸化されていることを特徴とする、ヒトα−エノラーゼのアイソフォーム。
【請求項２】
前記３つの位置が、トレオニン５５、チロシン５７、チロシン２００、チロシン２３６、トレオニン２３７、チロシン２５７、及びセリン４１９の中から選択される、請求項１に記載のアイソフォーム。
【請求項３】
請求項１又は２に記載のα−エノラーゼのアイソフォームと特異的に結合する抗体。
【請求項４】
モノクローナル抗体又は抗体フラグメントであることを特徴とする、請求項３に記載の抗体。
【請求項５】
検出可能な標識分子と融合しているか又は接合していることを特徴とする、請求項３又は４に記載の抗体。
【請求項６】
膵管腺癌の診断を目的とする、請求項１又は２に記載の抗α−エノラーゼのアイソフォーム又は請求項１又は２に記載の抗α−エノラーゼのアイソフォームと結合する抗体の使用。
【請求項７】
請求項１又は２に記載の抗α−エノラーゼのアイソフォームの検出及び／又は請求項１又は２に記載の抗α−エノラーゼのアイソフォームと結合する抗体の検出を含んでなる、膵管腺癌（ＰＤＡ）の診断方法。
【請求項８】
請求項１又は２に記載の抗α−エノラーゼのアイソフォーム及び／又は請求項１又は２に記載の抗α−エノラーゼのアイソフォームと結合する抗体を含んでなる、膵管腺癌（ＰＤＡ）の診断用キット。
【請求項９】
膵管腺癌の治療用の医薬組成物の調製のための抗α−エノラーゼ抗体の使用。
【請求項１０】
抗α−エノラーゼ抗体を含んでなる膵管腺癌の治療用の医薬組成物。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【公表番号】特表２０１０−５０５１０４（Ｐ２０１０−５０５１０４Ａ）
【公表日】平成２２年２月１８日（２０１０．２．１８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−５２９７１３（Ｐ２００９−５２９７１３）
【出願日】平成１９年９月２８日（２００７．９．２８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００７／０６０３０５
【国際公開番号】ＷＯ２００８／０３７７９２
【国際公開日】平成２０年４月３日（２００８．４．３）
【出願人】（５０８１７８４７８）リボバックス バイオテクノロジーズ ソシエテ アノニム (6)
【出願人】（５０９０８７９３３）ビオリネ ディアニョスティーチ ソチエタ レスポンサビリタ リミテ (1)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２２年２月１８日（２０１０．２．１８）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年９月２８日（２００７．９．２８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００７／０６０３０５
【国際公開番号】ＷＯ２００８／０３７７９２
【国際公開日】平成２０年４月３日（２００８．４．３）
【出願人】（５０８１７８４７８）リボバックス バイオテクノロジーズ ソシエテ アノニム (6)
【出願人】（５０９０８７９３３）ビオリネ ディアニョスティーチ ソチエタ レスポンサビリタ リミテ (1)
【Ｆターム（参考）】
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