自己リン酸化受容体のアゴニスト、アンタゴニストのスクリーニング方法、遺伝子組換え酵母
【課題】スクリーニングの時間短縮および作業効率向上のために、酵母を利用したハイスループットスクリーニング系を提供する。
【解決手段】アゴニストのスクリーニング方法を提供し、該方法は、受容体を発現し、そしてランダム化したアゴニスト候補物質を細胞表層に提示する酵母を得る工程；および 発現した該アゴニスト候補物質が該受容体に結合している酵母を検出する工程、を含む。
【解決手段】アゴニストのスクリーニング方法を提供し、該方法は、受容体を発現し、そしてランダム化したアゴニスト候補物質を細胞表層に提示する酵母を得る工程；および 発現した該アゴニスト候補物質が該受容体に結合している酵母を検出する工程、を含む。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、受容体にアゴニストが結合したときに自己リン酸化（プロテインキナーゼ）作用が活性化される受容体を酵母で発現させ、該受容体に結合する物質（アゴニスト、アンタゴニスト）をスクリーニングする方法、遺伝子組換え酵母、キット及びコンビネーションに関する。
【背景技術】
【０００２】
受容体の多くは細胞膜に存在し、外部の刺激を認識して情報を伝達するための構造を有している。
【０００３】
受容体として、Ｇタンパク質共役型受容体（ＧＰＣＲ）を酵母に組み込んだアゴニストのハイスループットスクリーニング系が知られている(特許文献１，２)。
【特許文献１】特開2005-176605
【特許文献２】ＷＯ2006/104254
【非特許文献１】Kim YS, Bhandari R, Cochran JR, Kuriyan J, Wittrup KD. Proteins. 2006 Mar 1;62(4):1026-35.
【非特許文献２】T Yi, A L Mui, G Krystal, and J N Ihle, Mol Cell Biol. 1993 December; 13(12): 7577-7586 (共通IL-3受容体ベータ鎖（IL-5受容体のベータ鎖）のリン酸化がアゴニストに依存して起こることを示す)。
【非特許文献３】Pratt JC, Weiss M, Sieff CA, Shoelson SE, Burakoff SJ, Ravichandran KS. J Biol. Chem. 1996 May 24;271(21):12137-40 (JAK2によりリン酸化されたベータ鎖が、Shcアダプタータンパク質と結合することを示す)
【非特許文献４】Giordano V, De Falco G, Chiari R, Quinto I, Pelicci PG, Bartholomew L, Delmastro P, Gadina M, Scala G. J Immunol. 1997 May 1;158(9):4097-4103 (JAK2によりリン酸化されたgp130が、Shcアダプタータンパクと結合することを示す。)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
EGF、IL-5などの自己リン酸化型受容体は生体の基礎的機能において重要であり、例えば抗がん剤としてEGF受容体の作用するゲフィチニブが上市されている。
【０００５】
一方、自己リン酸化型受容体に対するアゴニスト/アンタゴニストのハイスループットスクリーニング系は確立されていなかった。
【０００６】
本発明は、自己リン酸化型受容体に対するアゴニスト/アンタゴニストのハイスループットスクリーニング系を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
Ｇタンパク質共役型受容体（ＧＰＣＲ）は、本来酵母にも存在するものであり、哺乳類のＧＰＣＲを酵母で発現可能であると予測される。実際、特許文献1,2では、酵母に本来存在するＧＰＣＲの三量体Gタンパク質を利用し、ＧＰＣＲに対するアゴニスト/アンタゴニストのスクリーニングを行っている。
【０００８】
一方、自己リン酸化型受容体と該受容体のリン酸化部位を認識可能なアダプタータンパク質は酵母に存在しないため、これらを別々に発現させた場合に酵母において実際に機能するかは全く予測できなかった。哺乳類由来のEGF受容体のみを酵母で発現させ、その発現を抗体で確認したこと、酵母細胞で発現させた細胞外ドメインのみを有するEGF受容体の欠失変異体は、EGFと結合できることを報告している (非特許文献1)。しかしながら、該受容体が酵母で実際に機能することは確認されておらず、また、アダプタータンパク質は同時発現されていない。従って、非特許文献1では、アゴニスト/アンタゴニストのスクリーニングを行う方法は一切開示されていない。
【０００９】
本発明では、上記の問題点を解決する手段として、哺乳類由来の自己リン酸化型受容体を発現した改変型酵母細胞を用いたスクリーニングシステムを提供する。
１． アゴニスト／アンタゴニストのスクリーニング方法であって、哺乳類の自己リン酸化型受容体と、リン酸化された該受容体を認識可能なアダプタータンパク質を共発現する酵母に前記受容体のアゴニスト／アンタゴニスト候補物質を作用させ、該アゴニスト／アンタゴニスト候補物質が該受容体に結合している酵母を検出する工程を含み、前記自己リン酸化型受容体がリガンドの結合により多量体化して、受容体自身のキナーゼ作用もしくは受容体に構成的に結合するチロシンキナーゼの作用により受容体自身および/または受容体に構成的に結合するチロシンキナーゼがリン酸化される、方法。
２． 前記自己リン酸化型受容体が、リガンドの結合により多量体化して、受容体自身のキナーゼ作用により受容体自身がリン酸化される、項１に記載の方法。
３． 前記自己リン酸化型受容体がリガンドの結合により多量体化して、受容体に構成的に結合するチロシンキナーゼの作用により受容体自身と受容体に構成的に結合するチロシンキナーゼの両方がリン酸化される、項１に記載の方法。
４． アゴニスト／アンタゴニストのスクリーニング方法であって、哺乳類の自己リン酸化型受容体を発現する酵母に前記受容体のアゴニスト／アンタゴニスト候補物質を作用させ、該アゴニスト／アンタゴニスト候補物質が該受容体に結合している酵母を検出する工程を含み、
前記自己リン酸化型受容体がアゴニストの結合により多量体化して、受容体自身のキナーゼ作用もしくは受容体に構成的に結合するチロシンキナーゼの作用により受容体自身もしくは受容体に構成的に結合するチロシンキナーゼがリン酸化され、
前記リン酸化の検出は、前記酵母の細胞壁を溶解し、細胞壁溶解酵母に前記リン酸化を検出可能な抗体を作用させることにより行なう、
方法。
５． 前記自己リン酸化型受容体がアゴニストの結合により多量体化して、受容体自身のキナーゼ作用により受容体自身がリン酸化される、項４に記載の方法。
６． 前記自己リン酸化型受容体がアゴニストの結合により多量体化して、受容体に構成的に結合するチロシンキナーゼの作用により受容体自身と受容体に構成的に結合するチロシンキナーゼの両方がリン酸化される、項４に記載の方法。
７． 哺乳類の自己リン酸化型受容体は、
(i)受容体自身が自己リン酸化作用を有するか、或いは、
(ii)gp130またはβｃを共有し、かつ、チロシンキナーゼがgp130またはβｃに構成的に結合し、該チロシンキナーゼの作用によりチロシンキナーゼ自身とgp130またはβｃの両方をリン酸化する
受容体である、項１または４に記載の方法。
８． 受容体に構成的に結合するチロシンキナーゼがＪＡＫ１，ＪＡＫ２またはＪＡＫ３である項１または４に記載の方法。
９． チロシンキナーゼが構成的に結合し、かつ、アゴニスト依存的に該チロシンキナーゼがリン酸化される受容体が、インターロイキン受容体のα鎖とβ鎖(βc)を含む、項１または４に記載の方法。
１０． チロシンキナーゼが構成的に結合し、かつ、アゴニスト依存的に該チロシンキナーゼがリン酸化される受容体が、gp130を含む、項１または４に記載の方法。
１１． アゴニストの結合により多量体化し、該アゴニストの受容体に構成的に結合するチロシンキナーゼ若しくは受容体自身が有するチロシンキナーゼの作用によりチロシンキナーゼおよび/または受容体自身がリン酸化を受ける哺乳類の自己リン酸化型受容体と、該リン酸化を酵母中で認識可能なアダプタータンパク質を共発現してなる、遺伝子組換え酵母。
１２． チロシンキナーゼ作用を有し、かつ、アゴニストの結合により多量体化して自己リン酸化する哺乳類の受容体と、該受容体のリン酸化を認識可能なアダプタータンパク質を共発現する項１１に記載の遺伝子組換え酵母。
１３． アゴニストの結合により多量体化するβcまたはgp130を共有する受容体と、該受容体に構成的に結合するチロシンキナーゼ（該チロシンキナーゼはアゴニストの結合によりβcまたはgp130とチロシンキナーゼ自身をリン酸化する）と、βc、gp130またはチロシンキナーゼのリン酸化を認識可能なアダプタータンパク質を共発現する項１１に記載の遺伝子組換え酵母。
１４． アゴニストの結合により多量体化し、該アゴニストの受容体に構成的に結合するチロシンキナーゼ若しくは受容体自身が有するチロシンキナーゼの作用によりチロシンキナーゼおよび/または受容体自身がリン酸化を受ける哺乳類の自己リン酸化型受容体と、前記リン酸化を検出可能な抗体を含む、前記受容体に対するアゴニスト／アンタゴニストをスクリーニングするためのキット。
１５． 酵母の細胞壁を溶解する酵素をさらに含む項１４に記載のキット。
１６． アゴニストの結合により多量体化し、該アゴニストの受容体に構成的に結合するチロシンキナーゼ若しくは受容体自身が有するチロシンキナーゼの作用によりチロシンキナーゼおよび/または受容体自身がリン酸化を受ける哺乳類の自己リン酸化型受容体と、前記リン酸化を検出可能な抗体のコンビネーション。
１７． アゴニストの結合により多量体化し、該アゴニストの受容体に構成的に結合するチロシンキナーゼ若しくは受容体自身が有するチロシンキナーゼの作用によりチロシンキナーゼおよび/または受容体自身がリン酸化を受ける哺乳類の自己リン酸化型受容体と、酵母の細胞壁を溶解する酵素と、前記リン酸化を検出可能な抗体のコンビネーション。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
本明細書において、自己リン酸化型受容体とは、以下の2つのタイプの受容体を含む:
(a) βcもしくはgp130を共有し、アゴニストの結合により受容体とβcもしくはgp130を含む多量体を形成し、且つ、βcもしくはgp130に構成的に結合したチロシンキナーゼを活性化してβcもしくはgp130とチロシンキナーゼをリン酸化する受容体。
【００１１】
(b) 受容体自身がチロシンキナーゼ作用を有し、アゴニストの結合により受容体が多量体化し、且つ、多量体化した受容体がチロシンキナーゼ作用により自己リン酸化する受容体。
【００１２】
上記(a)の場合には、リガンド(アゴニスト/アンタゴニスト)が結合可能な受容体部分はリン酸化されないが、該受容体部分はβcもしくはgp130とヘテロ多量体を形成し、βcもしくはgp130とチロシンキナーゼ（βcもしくはgp130に構成的に結合する）がリン酸化され、ヘテロ多量体(受容体複合体)がリン酸化されているため、本明細書では、このような受容体も自己リン酸化型受容体という。
【００１３】
「構成的に結合する」とは、チロシンキナーゼとβcもしくはgp130を酵母で別々に（キメラタンパク質ではなく）発現させた場合にもチロシンキナーゼとβcもしくはgp130が酵母内で結合/会合することを意味し、これらは別々のタンパク質として酵母中で発現されてもよく、あるいはキメラタンパク質として発現させてもよい。
【００１４】
本発明の特徴は、以下の2点にある：
第1は、酵母に存在しない哺乳類由来の受容体と酵母に存在しない(哺乳類由来が好ましい)アダプタータンパク質を酵母内で同時に発現させ、これにより、非酵母受容体システムにおいても該受容体に対するアゴニストの結合によるシグナルが酵母内で正しく伝達されることを確認したことである。
【００１５】
第2は、酵母に存在しない哺乳類由来の自己リン酸化型受容体を酵母内で発現させ、該受容体に対するアゴニストの結合による自己リン酸化を抗体により確認したことである。特に、酵母内におけるリン酸化を、酵母を破砕することなく細胞壁を溶解することで確認することができ、アゴニスト／アンタゴニストを確実にスクリーニングできることを本発明者は初めて明らかにした。
【００１６】
本発明では、アゴニストと受容体が結合したときに引き起こされる自己リン酸化型受容体のリン酸化反応と多量体形成を以下の２つの方法で検出することによりアゴニスト/アンタゴニストのスクリーニングを可能とする（図１、図６、図7参照）。ここで、リン酸化されるのは、受容体自身がチロシンキナーゼ作用を有する受容体(例えばEGF受容体)の場合には、受容体自身であり、受容体自身はチロシンキナーゼ作用を持たず、受容体に共有される(リガンドが結合した際の受容体複合体に含まれる)βcまたはgp130にチロシンキナーゼ(例えばJAK1、JAK2、JAK3などのヤヌスキナーゼ(JAK))が構成的に結合される受容体の場合には、βcまたはgp130とチロシンキナーゼの両方である。後者の場合には、アダプタータンパク質により認識されるリン酸化はβc/gp130のリン酸化とチロシンキナーゼ自身のリン酸化のいずれであってもよいが、好ましくはアダプタータンパク質はチロシンキナーゼのリン酸化を認識する。
第1の方法：リン酸化された受容体に特異的に結合するアダプタータンパク質を哺乳類(特にヒト)由来の受容体とともに酵母で同時に発現させ、アダプタータンパク質と受容体の結合をレポーター遺伝子の発現や細胞増殖により検出する方法。本明細書において、アダプタータンパク質とは、受容体に共有されるβcもしくはgp130のリン酸化、βcもしくはgp130に構成的に結合されるチロシンキナーゼのリン酸化、或いはチロシンキナーゼ作用を有する受容体自身のリン酸化を認識するタンパク質を意味する。
【００１７】
アダプタータンパク質としては、例えばShc、Grb2が挙げられ、哺乳類由来のアダプタータンパク質が好ましい。
【００１８】
Shc/Grb2は単独で酵母中に発現してもよく、GDP/GTP交換因子(例えばSos)に融合されていてもよい。本発明においては、酵母においてさらにGDP/GTP交換因子(例えばSos)を同時発現させるのが好ましい。GDP/GTP交換因子の由来は、哺乳類(特にヒト)が好ましいが、その他であってもよい。酵母としてCdc25熱感受性変異体を使用した場合には、37℃の培養条件においてGDP/GTP交換因子(例えばSos)は本来酵母で発現されているCdc25熱感受性変異体の機能を置き換えることができる。Shc/Grb2がリン酸化されたβcまたはリン酸化されたgp130に結合し、このShc/Grb2に必要に応じて融合されているGDP/GTP交換因子(例えばSos)が細胞内膜近傍へ濃縮されると、GDP/GTP交換因子(例えばSos)が酵母内在性のRas1/2に結合しているGDPをGTPに交換することを促進するため、酵母の増殖が促進される。これにより受容体へのアゴニストの結合を酵母の増殖を指標にスクリーニングすることもでき、或いは、GDP/GTP交換因子(例えばSos)の結合時におけるRas1/2を介した転写因子の活性化をレポータージーンアッセイにより検出することもできる（図1、図7参照）。
【００１９】
本発明の特に好ましい実施形態では、アダプタータンパク質Shcまたはアダプタータンパク質Grb2が哺乳動物由来Sos（GDP/GTP交換因子）と融合したもの（Shc-Sosまたは、Grb2-Sos）を使用することができる。37℃のスクリーニング条件において、哺乳動物由来Sosは、酵母内在性のCdc25H（GDP/GTP交換因子であり、熱感受性）の代わりとして働き、細胞を増殖させるシグナル伝達を行う。本スクリーニングにおいては、以下のようなシグナル伝達となっている：アゴニストが受容体に結合→受容体の多量体化→受容体のチロシン残基のリン酸化→受容体のリン酸化チロシン残基をShcまたはGrb2が認識して結合することによりShc-Sosまたは、Grb2-Sosが酵母細胞膜近傍へ濃縮される→細胞膜近傍へ濃縮されたShc-Sosまたは、Grb2-Sosが酵母内在性Cdc25Hのかわりに働き、細胞が増殖する。
【００２０】
第2の方法：リン酸化された受容体に特異的に結合する抗体により検出する方法。酵母の細胞壁を溶解させた後に抗体を作用させることで、抗体が酵母内に移行し、細胞膜表面に存在する自己リン酸化型受容体のリン酸化を検出することができる。理論により拘束されることを望むものではないが、抗体が酵母内に移行するのは、細胞壁を溶解させたときに細胞膜に小孔が開くか、あるいは細胞膜の一部又は全体の構造が弱くなり、抗体が入りやすくなるからであると本発明者は考えている。
【００２１】
アンタゴニストのスクリーニングは、あらかじめ酵母の培地中に既知のアゴニストを添加するか、アゴニストを細胞壁に発現可能な酵母を使用し、この既知のアゴニストによるレポーター遺伝子の発現や細胞増殖が無効となるような化合物をスクリーニングすることにより行うことができる。
【００２２】
酵母におけるアゴニストペプチド・タンパク質のコンビナトリアル・エンジニアリングにより、ランダムなペプチドを酵母細胞表層に発現させることができる。具体的には、ランダムなペプチドをシグナルペプチドと細胞壁表面に結合されるアンカーペプチドに連結させる。ランダムペプチドが細胞膜から分泌される際に、アンカーペプチドが細胞壁にひっかかり、ランダムなペプチドが細胞膜の受容体と結合することが可能になる。アンカータンパク質としては、以下のものが例示される：FLO42(FLO1タンパク質のC末側42個のペプチド)、α-アグルチニンのC末320アミノ酸、酵母凝集性タンパク質FLO1のC末42アミノ酸（FLO42）、C末102アミノ酸(FLO102）、C末146アミノ酸(FLO146)、C末318アミノ酸(FLO318)、エタノールアミンリン酸−６マンノースα１−２マンノースα１−６マンノースα１−４グルコサミンα１−６イノシトールリン脂質を基本構造とする糖脂質(GPIアンカー)。
【００２３】
或いは、アゴニストの候補となるペプチドを糖鎖結合タンパク質ドメインと連結して酵母で発現させ、該ドメインの糖鎖部分が細胞壁中の糖鎖と相互作用又は絡み合うことによって、細胞表層にとどまり、受容体に結合させることもできる。
【００２４】
本発明において、受容体を発現させるのに適当な酵母としては、S.cerevisiae ＢＹ４７４１、ＡＴＣＣ６０７１５、ＭＴ８−１、Ｗ３０３ａ、ＩＦＯ１０１５０、ＹＰＨ４９９、ＢＪ５４６４などが挙げられる。シグナル伝達量が多い株が好ましいので、このような酵母株を選別するのがよい。
【００２５】
本明細書において、チロシンキナーゼとしては、JAK(JAK1、JAK2、JAK3、特にJAK2)、Lyn, Yes, Fyn, Fes, Hckなどが好ましく例示され、好ましくはJAK2が例示される。自己リン酸化型受容体には、gp130やβc鎖のようにJAK(JAK1、JAK2、JAK3、特にJAK2)のようなチロシンキナーゼを構成的に結合するものと、EGF受容体(EGFR)のように、受容体(EGFR)自体にチロシンキナーゼ活性を有するものが挙げられる。具体的には:
(i) gp130を共有する受容体
IL-6R、IL-11R、LIFR、CNTFR、OSMR、CT-1Rなど。
(ii) βcを共有する受容体
IL-3R、IL-5R、GM-CSFRなど。
(iii) 自己リン酸化作用を有する受容体のリガンド
Alkを含むAlkRファミリー、Axlを含むAxlRファミリー、DDR1を含むDDRファミリー、EGFRを含むEphRファミリー、Eph A1を含むEphARファミリー、Eph B1を含むEphBRファミリー、FGFR1を含むFGFRファミリー、IFG-1Rを含むIRファミリー、Metを含むMetRファミリー、MuSKを含むMuSKRファミリー、TrkAを含むニューロトロフィンRファミリー、PDGFR-αを含むPDGFRファミリー、RETを含むRETRファミリー、Ror1を含むRorRファミリー、Rykを含むRykRファミリー、Sevを含むSevRファミリー、Tie1を含むTieRファミリー、VEGFR-1を含むVEGFRファミリーなど。
【００２６】
ベータ鎖（βc）共有型受容体のスクリーニング系とgp130共有型の受容体のスクリーニングは同様に行うことができる。例えば、非特許文献２，３は、ベータ鎖がJAK2によりリン酸化されて、そのリン酸化部位へアダプタータンパク質Shcが結合することを示す。非特許文献４は、gp130がJAK2にリン酸化されて、そこへアダプタータンパク質Shcが結合することを示す。即ち、Shcは、ベータ鎖に対してもgp130に対しても、同様に受容体の細胞内ドメインのリン酸化部位に結合する挙動を示すことから、Shcを用いた検出系は、ベータ鎖共有型受容体(例えばIL-5）とgp130共有型受容体（例えばIL-6、LIFなど）の両方のスクリーニング系に使用可能であることが明らかである。
【００２７】
本発明においてJAK（例えばJAK2）などのチロシンキナーゼとβｃ/gp130とは別個に発現させても、キメラタンパク質として発現させてもよい。JAKなどのチロシンキナーゼとβｃ/gp130を別々に発現させても「構成的」に結合することは、文献により知られている（Zhao Y, Wagner F, Frank SJ, Kraft AS. J Biol Chem. 1995 Jun 9;270(23):13814-8.）。
【００２８】
本発明のスクリーニング方法は、上記の受容体に結合可能な物質をスクリーニングすることができる。アゴニストをスクリーニングする場合には、当該酵母にアゴニストの候補物質を作用させ、受容体への候補物質の結合の有無を検出すればよい。また、アンタゴニストを検出する場合には、適当な濃度のアゴニストの存在下にアンタゴニストの候補物質を作用させ、アゴニストの結合がどの程度低下したかを検出すればよい。本発明において、
「アゴニスト／アンタゴニスト候補物質が受容体に結合している酵母を検出する工程」には、酵母にアゴニストの候補物質を作用させ、受容体への候補物質の結合の有無を検出する場合と、適当な濃度のアゴニストの存在下にアンタゴニストの候補物質を作用させ、アゴニストの結合がどの程度低下したかを検出する場合の両方が含まれる。
【００２９】
アゴニストの当該受容体への結合は、自己リン酸化されたgp130またはβcを酵母細胞の増殖や細胞内の伝達経路においてレポータータンパク質を発現させる方法、或いは抗体により検出するなどの方法を採用することができる。
【００３０】
例えば図６に示したようにＩＬ−５受容体は、ＩＬ−５受容体α鎖とβ鎖（βｃ）から構成されている。β鎖には構成的にチロシンキナーゼＪＡＫ２が結合しており、ＩＬ−５とＩＬ−５受容体α鎖が結合することによりＪＡＫ２の自己リン酸化が引き起こされる。
【００３１】
βｃの代わりにgp130を有する受容体についても同様に、受容体にリガンドが結合することによりgp130に構成的に結合したJAK2による自己リン酸化が起こる。
【００３２】
一方、図１に示されるように、EGF受容体などは、リガンド(EGF)の結合により受容体の2量体化/多量体化が起こり、これにより受容体の自己リン酸化が誘導される。
１．抗体を用いたアゴニスト・受容体反応の検出方法
受容体の自己リン酸化を抗リン酸化チロシンキナーゼ(例えばＪＡＫ２)特異的抗体により検出することにより、アゴニストのスクリーニングが可能となる。(図１)
抗リン酸化抗体が認識するリン酸化部位は、例えばJAK1、JAK2、EGF受容体では、以下の位置が例示される。但し、アミノ酸番号は、ヒト由来タンパク質におけるN末端のアミノ酸残基を１番とした番号である。
１．JAK2のリン酸化部位：Tyr221, Tyr813, Tyr1007/1008
２．JAK1のリン酸化部位：Tyr1022/1023,
３．EGF受容体のリン酸化部位：Tyr974, Tyr992, Tyr1045, Tyr1068, Tyr1086, Tyr1148, Tyr1173
上記のリン酸化部位を認識する抗体は知られており、公知の抗体を使用することにより、自己リン酸化された受容体を検出することができる。検出は、例えばリン酸化部位を特異的に認識する抗体と、該抗体を認識する標識二次抗体を酵母に作用させ、酵母の膜近傍における二次抗体標識の存在の検出に基づき行なうことができる。JAK1、JAK2以外のチロシンキナーゼ、EGF受容体以外のチロシンキナーゼ活性を有する受容体についても同様に抗体により自己リン酸化された受容体を検出することができる。
【００３３】
２．酵母内シグナル伝達を用いる方法。
ＪＡＫ２のリン酸化を検出するには、ＥＧＦ受容体のスクリーニング方法と類似したヒト由来アダプタータンパク質と酵母内在性Ｒａｓ１またはＲａｓ２へのシグナル伝達を利用する方法も使用できる（図７）。具体的には、アゴニスト依存的にリン酸化された受容体に特異的に結合するアダプタータンパク質Ｓｈｃと融合したヒト由来Ｓｏｓタンパク質がアゴニスト依存的に細胞質から細胞膜近傍に濃縮され、ＧＤＰ結合型の酵母内在性Ｒａｓ１または、Ｒａｓ２をＧＴＰ結合型に変換することにより、酵母の細胞分裂が導かれることを利用したスクリーニング方法である。
【００３４】
図６、図７で示したスクリーニング方法は、ＩＬ−５受容体と同様にβ鎖を共有する受容体群すなわち、ＩＬ−３受容体、ＧＭ−ＣＳＦに適用できる。また、ＩＬ−５受容体と類似の分子構成であり、ｇｐ１３０を共有するＩＬ−６受容体、ＩＬ−１１受容体、ＬＩＦ受容体、ＣＮＴＦ受容体、ＯＳＭ受容体、ＣＴ−１受容体のアゴニスト/アンタゴニストスクリーニング法としても適用できる。さらにＩＬ−５受容体と類似の分子構成であり、γ鎖を共有するＩＬ−２受容体、ＩＬ−４受容体、ＩＬ−７受容体、ＩＬ−９受容体、ＩＬ−１５受容体にも適用できる。
【００３５】
アンタゴニストをスクリーニングする場合には、あらかじめ酵母の培地中に既知のアゴニストを添加しておき、この既知のアゴニストによるＪＡＫ１または、ＪＡＫ２の自己リン酸化が無効となるような化合物をスクリーニングすることにより行う。
【００３６】
酵母内在性Ｒａｓタンパク質のシグナル伝達下流に位置して、 Ｒａｓの活性化に伴い発現が上昇するような酵母内在性遺伝子のプロモーターをレポーター遺伝子のプロモーターとして使用することにより、細胞増殖を指標とするスクリーニングだけでなく、レポーター遺伝子の発現を指標とするスクリーニングを行うことが出来る。レポーター遺伝子としては、GFPを含む蛍光タンパク質の遺伝子、βガラクトシダーゼやルシフェラーゼなどの発色、発光基質が開発されている酵素の遺伝子、栄養要求性マーカー遺伝子が挙げられる。酵母内在性Ｒａｓは、酵母内在性ｃＡＭＰ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔｐｈｏｓｐｈｏｄｉｅｓｔｅｒａｓｅであるＰＤＥ２を活性化する（Ｓａｓｓ Ｐ， Ｆｉｅｌｄ Ｊ， Ｎｉｋａｗａ Ｊ， Ｔｏｄａ Ｔ， Ｗｉｇｌｅｒ Ｍ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ． １９８６ Ｄｅｃ;８３(２４):９３０３−７．）。また、このＰＤＥ２の発現により発現を誘導される遺伝子は網羅的に調べられている（Ｊｏｎｅｓ ＤＬ， Ｐｅｔｔｙ Ｊ， Ｈｏｙｌｅ ＤＣ， Ｈａｙｅｓ Ａ， Ｒａｇｎｉ Ｅ， Ｐｏｐｏｌｏ Ｌ， Ｏｌｉｖｅｒ ＳＧ， Ｓｔａｔｅｖａ ＬＩ． Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ． ２００３ Ｄｅｃ １６;１６(１):１０７−１８．）。よってＰＤＥ２により発現が誘導すると報告されている遺伝子のプロモーターは、本スクリーニング方法においてレポーター遺伝子のプロモーターとなり得る。
【００３７】
本発明において、実際の薬物候補化合物のスクリーニング方法を以下に例示する。
Ｉ.低分子化合物ないしタンパク質を外部から培養液中に添加する場合
・96穴プレートに液体培地もしくは寒天培地をいれ、酵母を蒔く。そこに化合物ないしタンパク質を添加し、酵母の増殖や蛍光、発色を指標としてレポーター遺伝子の発現を観察する。この時、酵母において増殖やレポータ遺伝子の発現が検出されれば、その化合物はアゴニストである。
・96穴プレートに液体培地もしくは寒天培地をいれ、酵母を蒔く。そこに化合物ないしタンパク質を添加し、EGFRなどの受容体型チロシンキナーゼにおいては自己リン酸化を、そしてIL-5RやIL-6RなどのサイトカインレセプターなどにおいてはJAK1やJAK2の自己リン酸化を、それぞれのタンパク質特異的なリン酸化抗体を用いた免疫染色により検出する。この時、受容体型チロシンキナーゼの自己リン酸化や、JAK1やJAK2の自己リン酸化が見られれば、その化合物はアゴニストである。免疫染色には、酵母の細胞壁を除く処理を必要とする。
・96穴プレートにアゴニストを含ませた液体培地もしくは寒天培地をいれ、酵母を蒔く。そこに化合物ないしタンパク質を添加し、酵母の増殖や蛍光、発色を指標としてレポーター遺伝子の発現を観察する。この時、酵母がレポーター遺伝子が発現しなければ、その化合物はアンタゴニストである。
・96穴プレートにアゴニストを含ませた液体培地もしくは寒天培地をいれ、酵母を蒔く。そこに化合物ないしタンパク質を添加し、EGFRなどの受容体型チロシンキナーゼにおいては自己リン酸化を、そしてIL-5RやIL-6RなどのサイトカインレセプターにおいてはJAK1やJAK2の自己リン酸化を、それぞれのタンパク質特異的なリン酸化抗体を用いた免疫染色により検出する。この時、受容体型チロシンキナーゼの自己リン酸化や、JAK1やJAK2の自己リン酸化が見られなければ、その化合物はアンタゴニストである。免疫染色には、酵母の細胞壁を除く処理を必要とする。
【００３８】
ＩＩ.酵母自体にランダムなペプチドを組み込んだ場合
・ランダムなペプチドを発現する酵母を寒天培地に蒔き、酵母の増殖や蛍光、発色を指標としてレポーター遺伝子の発現を観察する。この時、酵母がレポーター遺伝子を発現すれば、その酵母はアゴニストとなるペプチドを発現する酵母である。後に、ペプチドを発現させる為に導入したプラスミドを酵母から抽出し、シークエンス解析を行えばペプチド配列を特定できる。
・ランダムなペプチドを発現する酵母を寒天培地に蒔き、EGFRなどの受容体型チロシンキナーゼにおいては自己リン酸化を、そしてIL-5RやIL-6RなどのサイトカインレセプターなどにおいてはJAK1やJAK2の自己リン酸化を、それぞれのタンパク質特異的なリン酸化抗体を用いた免疫染色により検出する。この時、受容体型チロシンキナーゼの自己リン酸化や、JAK1やJAK2の自己リン酸化が見られれば、その酵母はアゴニストとなるペプチドを発現する酵母である。免疫染色には、酵母の細胞壁を除く処理を必要とする。後に、ペプチドを発現させる為に導入したプラスミドを酵母から抽出し、シークエンス解析を行えばペプチド配列を特定できる。
・ランダムなペプチドを発現する酵母をアゴニストを含ませた寒天培地に蒔き、酵母の増殖や蛍光、発色を指標としてレポーター遺伝子の発現を観察する。この時、酵母がレポーター遺伝子を発現しなければ、その酵母はアンタゴニストとなるペプチドを発現する酵母である。後に、ペプチドを発現させる為に導入したプラスミドを酵母から抽出し、シークエンス解析を行えばペプチド配列を特定できる。
・ランダムなペプチドを発現する酵母をアゴニストを含ませた寒天培地に蒔き、EGFRなどの受容体型チロシンキナーゼにおいては自己リン酸化を、そしてIL-5RやIL-6RなどのサイトカインレセプターなどにおいてはJAK1やJAK2の自己リン酸化を、それぞれのタンパク質特異的なリン酸化抗体を用いた免疫染色により検出する。この時、受容体型チロシンキナーゼの自己リン酸化や、JAK1やJAK2の自己リン酸化が見られなければ、その酵母はアンタゴニストとなるペプチドを発現する酵母である。免疫染色には、酵母の細胞壁を除く処理を必要とする。後に、ペプチドを発現させる為に導入したプラスミドを酵母から抽出し、シークエンス解析を行えばペプチド配列を特定できる。
【００３９】
本発明の実施例に示されるように、酵母の細胞壁を溶解させて抗体を作用させることで、酵母の形態を保持した状態で、抗体による検出を行なうことができる。酵母の形を壊さない免疫染色法の利点として、以下が例示される。
・免疫染色には、抗体を用いることが必要となることはいうまでもないが、酵母細胞壁は抗体が非特異的に吸着することが、実施する際に判明した。このことから、酵母細胞壁を除く処理が必要とされた。
・酵母細胞壁を除く処理を実施するとき、スクリーニング対象である化合物、タンパク質、あるいはペプチド依存的に、ＥＧＦＲの自己リン酸化あるいはＪＡＫ１やＪＡＫ２など自己リン酸化が酵母細胞膜上で正確におこっているか観察すれば、擬陽性の排除が可能となり、より高精度なスクリーニングが可能となる。その為、酵母の形を壊さないことが好ましい。
・低分子化合物ないしタンパク質を外部から培養液中に添加する場合、自己リン酸化の有無が酵母細胞表層で正確におこっているかどうか観察することにより、使用した化合物依存的な自己リン酸化が、正確に酵母細胞膜上でおこっているかどうかが判明する。
・酵母自体にランダムなペプチドを組み込んだ場合、一細胞ハンドリング機器、具体的には、セルソーターを内蔵したＦＡＣＳや、同等のシステムを内蔵する目的細胞分取装置を用いれば、自動的に目的細胞をハイスループットで単離することが可能である。この時、ペプチドを発現させる為に導入したプラスミドを酵母から抽出し、シークエンス解析によりペプチド配列を特定する必要があり、酵母の形を壊さないことが絶対条件となる。
・以上のことより、低分子化合物ないしタンパク質を外部から培養液中に添加する場合、また酵母自体にランダムなペプチドを組み込んだ場合のいずれにおいても、酵母細胞膜内近傍の蛍光を検出するのが好ましく、酵母の形を壊さないことが有利である。
【実施例】
【００４０】
以下、本発明を実施例に従いより詳細に説明するが、本発明がこれら実施例に限定されないことはいうまでもない。
実施例１：酵母における上皮成長因子（ＥＧＦ）シグナル伝達再構成用プラスミドの構築
１−１：ＥＧＦ受容体発現プラスミドの構築
一回膜貫通型受容体であるヒト由来ＥＧＦ受容体（ＥＧＦＲ）をコードする遺伝子を用いて、以下のようにｐＧＭＨ２０−ＭＦα−ＦＬＡＧ−ＥＧＦＲを構築した。
【００４１】
１−１−１：ｐＧＭＨ２０−ＭＦα−ＦＬＡＧの構築
酵母の分泌タンパク質ＭＦα１のＰｒｅｐｒｏ配列（J. Bacteriol., 903-906頁, 1983年）をコードする遺伝子を鋳型としたＰＣＲにより、 Ｐｒｅｐｒｏ配列をコードする遺伝子の３’側にＦＬＡＧタグ配列をコードする遺伝子および両末端に制限酵素部位を付加した増幅断片（ａ）を得た。増幅断片（ａ）を制限酵素にて消化し、ｐＧＭＨ２０ベクターに挿入して、ｐＧＭＨ２０−ＭＦα−ＦＬＡＧを得た。
【００４２】
１−１−２：ｐＧＭＨ２０−ＭＦα−ＦＬＡＧ−ＥＧＦＲの構築
ＥＧＦＲ遺伝子をコードするプラスミドを鋳型としたＰＣＲにより、成熟型ＥＧＦＲタンパク質をコードする遺伝子の両末端に制限酵素部位を付加した増幅断片を得た。この増幅断片を制限酵素にて消化し、ｐＧＭＨ２０−ＭＦα−ＦＬＡＧに挿入して、ｐＧＭＨ２０−ＭＦα−ＦＬＡＧ−ＥＧＦＲを得た。
【００４３】
１−２：ＥＧＦ表層提示用プラスミドの構築
ヒト由来のＥＧＦをコードする遺伝子を用いて、以下のようにｐＹＥＳ２−ＭＦα−ＨＡ−ＥＧＦ−ＦＬＯ４２を構築した。
【００４４】
１−２−１：ｐＹＥＳ２−ＭＦα−ＦＬＯ４２の構築
１−１−１で示したようにＭＦα１のＰｒｅｐｒｏ配列をコードする遺伝子を鋳型としたＰＣＲにより、Prepro配列をコードする遺伝子の３’側にＨＡタグ配列をコードする遺伝子および両末端に制限酵素部位を付加した増幅断片（ａ）を得た。酵母の凝集タンパク質ＦＬＯ１遺伝子をコードするプラスミドを鋳型としたＰＣＲにより、ＦＬＯ１のＣ末端側４２アミノ酸残基をコードする遺伝子の両末端に制限酵素部位を付加した増幅断片を得た。これらの増幅断片（ａ）および（ｂ）を制限酵素にて消化し、ｐＹＥＳ２ベクターに挿入して、タンパク質のＮ末端側にＭＦαとＨＡ、およびＣ末端側にＦＬＯ４２が融合して発現させるプラスミドｐＹＥＳ２−ＭＦα−ＨＡ−ＦＬＯ４２を得た。
【００４５】
１−２−２：ｐＹＥＳ２−ＭＦα−ＨＡ−ＥＧＦ−ＦＬＯ４２の構築
ＥＧＦ遺伝子をコードするプラスミドを鋳型としたＰＣＲにより、成熟型ＥＧＦタンパク質をコードする遺伝子の両末端に制限酵素部位を付加した増幅断片を得た。この増幅断片を制限酵素にて消化し、ｐＹＥＳ２−ＭＦα−ＨＡ−ＦＬＯ４２に挿入して、ｐＹＥＳ２−ＭＦα−ＨＡ−ＥＧＦ−ＦＬＯ４２を得た。
【００４６】
１−３：Ｓｏｓ−Ｇｒｂ２発現プラスミドの構築
ＥＧＦの刺激を受けることにより自己リン酸化したＥＧＦＲのリン酸化部位と結合するアダプタータンパク質であるＧｒｂ２をコードする遺伝子を用いて、以下のようにｐＳｏｓ−Ｇｒｂ２を構築した。
【００４７】
１−３−１：ｐＳｏｓ−Ｇｒｂ２の構築
タンパク質のＮ末端側に哺乳動物由来のグアニン−ヌクレオチド交換タンパク質Ｓｏｓを融合して発現させるプラスミドｐＳｏｓベクターをＳｔｒａｔａｇｅｎｅ社より購入した。Ｇｒｂ２遺伝子をコードするプラスミドを鋳型としたＰＣＲにより、Ｇｒｂ２タンパク質をコードする遺伝子の両末端に制限酵素部位を付加した増幅断片を得た。この増幅断片を制限酵素にて消化し、ｐＳｏｓに挿入して、ｐＳｏｓ−Ｇｒｂ２を得た。
【００４８】
実施例２：酵母におけるＥＧＦシグナル伝達再構成例
２−１：酵母形質転換体の作成
酵母Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ Ｄ１ＢＲ２０５ａ株（ＭＡＴａ, ｕｒａ３, ｈｉｓ３, ａｄｅ２, ｌｙｓ２, ｔｒｐ１, ｌｅｕ２, ｃｄｃ２５−２, Ｇａｌ＋）およびＤ１ＢＲ２０５α（ＭＡＴａ, ｕｒａ３, Ｈｉｓ３, ａｄｅ２, ｌｙｓ２, ｔｒｐ１, ｌｅｕ２, ｃｄｃ２５−２, Ｇａｌ＋）をＳｔｒａｔａｇｅｎｅ社より入手した。１のようにして得た各プラスミドｐＹＥＳ２、ｐＹＥＳ２−ＭＦα−ＨＡ−ＥＧＦ−ＦＬＯ４２、ｐＧＭＨ２０、ｐＧＭＨ２０−ＭＦα−ＦＬＡＧ−ＥＧＦＲ、およびｐＳｏｓ−Ｇｒｂ２を、酢酸リチウム法によりＤ１ＢＲ２０５株に導入し、酵母形質転換体Ｄ１ＢＲ２０５／ｐＹＥＳ２／ｐＧＭＨ２０／ｐＳｏｓ、Ｄ１ＢＲ２０５／ｐＹＥＳ２／ｐＧＭＨ２０／ｐＳｏｓ−Ｇｒｂ２、Ｄ１ＢＲ２０５／ｐＹＥＳ２−ＭＦα−ＨＡ−ＥＧＦ−ＦＬＯ４２／ｐＧＭＨ２０／ｐＳｏｓ−Ｇｒｂ２、Ｄ１ＢＲ２０５／ｐＹＥＳ２／ｐＧＭＨ２０−ＭＦα１−ＦＬＡＧ−ＥＧＦＲ／ｐＳｏｓ−Ｇｒｂ２、およびＤ１ＢＲ２０５／ｐＹＥＳ２−ＭＦα−ＨＡ−ＥＧＦ−ＦＬＯ４２／ｐＧＭＨ２０−ＭＦα−ＦＬＡＧ−ＥＧＦＲ／ｐＳｏｓ−Ｇｒｂ２、のそれぞれを、ＳＤΔＵｒａ／Ｈｉｓ／Ｌｅｕ寒天培地上に得た。
【００４９】
２−２：酵母形質転換体の培養
上記の寒天培地上で、直径２〜３ｍｍに生育した酵母形質転換体のコロニーを３ｍＬのＳＤΔＵｒａ／Ｈｉｓ／Ｌｅｕ液体培地中で２５℃、３００ｒｐｍでＯＤ６００＝１．０〜１．５まで培養した。菌体を回収・洗浄して、５００μＬの滅菌水に懸濁し、１０ｍＬのＳＲＧΔＵｒａ／Ｈｉｓ／Ｌｅｕ液体培地に初期ＯＤ６００＝０．２０になるよう植菌した後、２５℃にて３００ｒｐｍでＯＤ６００＝１．００まで培養した。
【００５０】
２−３：酵母形質転換体におけるＥＧＦ受容体タンパク質の発現および糖鎖修飾の有無の確認
２−２のように培養したＤ１ＢＲ２０５／ｐＹＥＳ２−ＭＦα−ＨＡ−ＥＧＦ−ＦＬＯ４２／ｐＧＭＨ２０−ＭＦα−ＦＬＡＧ−ＥＧＦＲ／ｐＳｏｓ−Ｇｒｂ２および陰性コントロールのＤ１ＢＲ２０５／ｐＹＥＳ２／ｐＧＭＨ２０／ｐＳｏｓを回収して、２００μＬの溶解液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ （ｐＨ７．３），１５０ｍＭ ＮａＣｌ，１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００，１ｍＭ ＥＧＴＡ，２ｍＭ ＤＴＴ，１個／１０ｍＬ−溶解液）に懸濁し、グラスビーズで破砕して、酵母粗抽出液を得た。１０分間遠心して上清画分および沈殿画分に分離し、上清画分にはＳＤＳと２−メルカプトエタノールをそれぞれ最終濃度０．５％および１％となるよう添加した。沈殿画分には上清画分と等量のＳＤＳと２−メルカプトエタノールをそれぞれ最終濃度０．５％および１％で含む溶解液に再懸濁して、１００℃で１５分間煮た後、１０分間遠心して上清画分を分取した。２００μＬのサンプルに対して１μＬのＮ−Ｇｌｙｃｏｓｉｄａｓｅおよび１μＬのＯ−Ｇｌｙｃｏｓｉｄａｓｅを添加後、３７℃にて０および３０分間反応させ、それぞれの時間についてサンプリングして、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび抗ＦＬＡＧマウスモノクローナル抗体を用いたウェスタンブロットに供した。結果を図２に示す。酵母形質転換体において、脱糖鎖修飾処理前に見られなかったヒト由来ＥＧＦＲのバンドが、処理後に計算分子量付近に確認された。このことから酵母において、ＥＧＦＲタンパク質の発現および糖鎖修飾を受けることが確認された。
【００５１】
２−４：酵母形質転換体における表層提示型ＥＧＦ−ＦＬＯ４２タンパク質の発現および糖鎖修飾の有無の確認
２−３と同様の操作を行ってサンプルを得た後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび抗ＨＡマウスモノクローナル抗体を用いたウェスタンブロットに供した。結果を図２に示す。酵母形質転換体において、ＥＧＦ−ＦＬＯ４２のバンドが、不溶性画分において確認された。不溶性画分には細胞壁が含まれることが報告されており、酵母におけるＥＧＦ−ＦＬＯ４２タンパク質の表層提示に成功したことが示された。
【００５２】
２−５：酵母形質転換体におけるＳｏｓ−Ｇｒｂ２タンパク質の発現
２−３と同様の操作を行ってサンプルを得た後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび抗Ｓｏｓマウスモノクローナル抗体を用いたウェスタンブロットに供した。結果を図２に示す。酵母形質転換体において、Ｓｏｓ−Ｇｒｂ２のバンドが可溶性画分において確認された。２−３および２−４と合わせて、ＥＧＦ、ＥＧＦＲ、およびＳｏｓ−Ｇｒｂ２の発現が酵母において確認された。
【００５３】
２−６：酵母形質転換体におけるＥＧＦ受容体の局在の確認
２−２のように培養したＤ１ＢＲ２０５／ｐＹＥＳ２−ＭＦα−ＨＡ−ＥＧＦ−ＦＬＯ４２／ｐＧＭＨ２０−ＭＦα−ＦＬＡＧ−ＥＧＦＲ／ｐＳｏｓ−Ｇｒｂ２を回収して、４％パラホルムホルムアルデヒドで固定化した後、ソルビトールバッファー（４０ｍＭ リン酸カリウム（ｐＨ６．５），０．５ｍＭ ＭｇＣｌ２，１．２Ｍ ソルビトール）で２回洗浄した。固定化した酵母を５００μＬのソルビトールバッファーに再懸濁し、０．３ｍｇのＺｙｍｏｌｙａｓｅ ２０Ｔを添加後、３７℃にて１０分間反応させ、ソルビトールバッファーで２回洗浄した。１次抗体として抗ＦＬＡＧマウスモノクローナル抗体（クローン Ｍ２）を添加し、１時間反応後に洗浄した。さらに２次抗体としてＣｙ３標識抗マウスＩｇＧヤギポリクローナル抗体を添加し、１時間反応後に洗浄し、蛍光顕微鏡による観察を行った。結果を図３に示す。図３から酵母細胞膜にＥＧＦＲが局在することが確認された。
【００５４】
２−７：ＥＧＦ／ＥＧＦＲ／Ｓｏｓ−Ｇｒｂ２の熱感受性実験
図１に示したように酵母形質転換体に発現させたそれぞれのタンパク質が機能すれば、熱感受性酵母であるＤ１ＢＲ２０５株が３７℃において増殖可能になると期待される。そこで２−２のように培養したＤ１ＢＲ２０５／ｐＹＥＳ２／ｐＧＭＨ２０／ｐＳｏｓ−Ｇｒｂ２、Ｄ１ＢＲ２０５／ｐＹＥＳ２−ＭＦα−ＨＡ−ＥＧＦ−ＦＬＯ４２／ｐＧＭＨ２０／ｐＳｏｓ−Ｇｒｂ２、Ｄ１ＢＲ２０５／ｐＹＥＳ２／ｐＧＭＨ２０−ＭＦα１−ＦＬＡＧ−ＥＧＦＲ／ｐＳｏｓ−Ｇｒｂ２、およびＤ１ＢＲ２０５／ｐＹＥＳ２−ＭＦα−ＨＡ−ＥＧＦ−ＦＬＯ４２／ｐＧＭＨ２０−ＭＦα−ＦＬＡＧ−ＥＧＦＲ／ｐＳｏｓ−Ｇｒｂ２を、培養液原液、１０、１００、および１０００倍希釈してＳＲＧΔＵｒａ／Ｈｉｓ／Ｌｅｕ寒天培地上に１０μｌずつ滴下し、３７℃で１４日間培養した。結果を図４に示す。
【００５５】
熱感受性実験の結果、酵母においてＥＧＦシグナル伝達再構成に必要と考えられるＥＧＦ−ＦＬＯ４２、ＥＧＦＲ、およびＳｏｓ−Ｇｒｂ２を全て発現させた酵母形質転換体においてのみ、３７℃における増殖が確認された。このことから、酵母において発現させた表層提示型ＥＧＦのシグナルをＥＧＦＲが受け、Ｓｏｓ−Ｇｒｂ２にシグナルが流れていると考えられた。Ｇｒｂ２がＥＧＦＲに結合するには、ＥＧＦＲが自己リン酸化されている必要があり、本実験の結果から、ＥＧＦＲの自己リン酸化も酵母内において哺乳動物と同様に生じていると思われた。そこで次に、ＥＧＦＲの自己リン酸化を免疫染色により確かめた。
【００５６】
２−７：ＥＧＦＲの自己リン酸化の確認
２−２のように培養したＤ１ＢＲ２０５／ｐＹＥＳ２／ｐＧＭＨ２０／ｐＳｏｓ−Ｇｒｂ２、Ｄ１ＢＲ２０５／ｐＹＥＳ２／ｐＧＭＨ２０−ＭＦα１−ＦＬＡＧ−ＥＧＦＲ／ｐＳｏｓ−Ｇｒｂ２、およびＤ１ＢＲ２０５／ｐＹＥＳ２−ＭＦα−ＨＡ−ＥＧＦ−ＦＬＯ４２／ｐＧＭＨ２０−ＭＦα−ＦＬＡＧ−ＥＧＦＲ／ｐＳｏｓ−Ｇｒｂ２を回収し、２−６のように細胞壁を除去した。１次抗体として抗リン酸化ＥＧＦＲウサギポリクローナル抗体を添加し、１時間反応後に洗浄した。さらに２次抗体としてＡｌｅｘａ４８８標識抗ウサギＩｇＧヤギポリクローナル抗体を添加し、１時間反応後に洗浄し、蛍光顕微鏡による観察を行った。結果を図５に示す。図５のように、Ｄ１ＢＲ２０５／ｐＹＥＳ２／ｐＧＭＨ２０−ＭＦα１−ＦＬＡＧ−ＥＧＦＲ／ｐＳｏｓ−Ｇｒｂ２では自己リン酸化は見られなかったが、Ｄ１ＢＲ２０５／ｐＹＥＳ２−ＭＦα−ＨＡ−ＥＧＦ−ＦＬＯ４２／ｐＧＭＨ２０−ＭＦα−ＦＬＡＧ−ＥＧＦＲ／ｐＳｏｓ−Ｇｒｂ２では自己リン酸化が確認された。この結果から、酵母においてＥＧＦＲの自己リン酸化がＥＧＦ依存的に生じていることが判明した。酵母においてＥＧＦ依存的なＥＧＦＲの自己リン酸化を検出したのは本実施例が初めてである。このことは、アゴニストによりひきおこされる受容体の自己リン酸化を抗体により検出することにより、アゴニストを化合物ライブラリーからスクリーニングすることが可能であることを示す。またｐＹＥＳ２−ＭＦα−ＨＡ−ＥＧＦ−ＦＬＯ４２に含まれるＥＧＦ遺伝子をコードする部位をペプチドにすれば、ＥＧＦＲと親和性のあるペプチドのハイスループットスクリーニングが可能である。
【００５７】
実施例３：酵母におけるＩＬ−５シグナル伝達再構成用プラスミドの構築
３−１：ＩＬ−５受容体発現プラスミドの構築
一回膜貫通型サイトカイン受容体であるヒト由来ＩＬ−５受容体α鎖（ＩＬ−５Ｒα）遺伝子をコードするプラスミドｐＭＥ１８ Ｈｙｇ−ｈｕＩＬ−５Ｒ（Ｊ. Ｉｍｍｕｎｏｌ．， ６９２４-６９３２頁, １９９３年）およびヒト由来ＩＬ−５受容体β鎖（βｃ）遺伝子をコードするプラスミドｐＭＥ１８−ＫＨ９７（Ｊ. Ｂｉｏｌ. Ｃｈｅｍ．， ２８２８７-２８２９３頁, １９９６年）を用いて、以下のようにｐＧＭＨ２０−ＭＦα−ＦＬＡＧ−ＩＬ５ＲαおよびｐＧＭＴ２０−ＭＦα−ＨＡ−βｃを構築した。
【００５８】
３−１−１：ｐＧＭＨ２０−ＭＦα−ＦＬＡＧおよびｐＧＭＴ２０−ＭＦα−ＨＡの構築
酵母の分泌タンパク質ＭＦα１のＰｒｅｐｒｏ配列（Ｊ. Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．， ９０３−９０６頁, １９８３年）をコードする遺伝子を鋳型としたＰＣＲにより、Ｐｒｅｐｒｏ配列をコードする遺伝子の３’側にＦＬＡＧタグ配列をコードする遺伝子および両末端に制限酵素部位を付加した増幅断片（ａ）を得た。同遺伝子を鋳型としたＰＣＲにより、Ｐｒｅｐｒｏ配列をコードする遺伝子の３’側にＨＡタグ配列をコードする遺伝子および両末端に制限酵素部位を付加した増幅断片（ｂ）を得た。増幅断片（ａ）を制限酵素にて消化し、制限酵素にて消化したｐＧＭＨ２０ベクターに挿入して、ｐＧＭＨ２０−ＭＦα−ＦＬＡＧを得た。増幅断片（ｂ）を制限酵素にて消化し、制限酵素にて消化したｐＧＭＴ２０ベクターに挿入して、ｐＧＭＴ２０−ＭＦα−ＨＡを得た。
【００５９】
３−１−２：ｐＧＭＨ２０−ＭＦα−ＦＬＡＧ−ＩＬ５Ｒの構築
プラスミドｐＭＥ１８ Ｈｙｇ−ｈｕＩＬ−５Ｒを鋳型としたＰＣＲにより、成熟型ＩＬ−５Ｒαタンパク質をコードする遺伝子の両末端に制限酵素部位を付加した増幅断片を得た。この増幅断片を制限酵素にて消化し、制限酵素にて消化したｐＧＭＨ２０−ＭＦα−ＦＬＡＧに挿入して、ｐＧＭＨ２０−ＭＦα−ＦＬＡＧ−ＩＬ５Ｒαを得た。
【００６０】
３−１−３：ｐＧＭＴ２０−ＭＦα−ＨＡ−βｃの構築
プラスミドｐＭＥ１８−ＫＨ９７を鋳型としたＰＣＲにより、成熟型βｃタンパク質をコードする遺伝子の両末端に制限酵素部位を付加した増幅断片を得た。この増幅断片を制限酵素にて消化し、制限酵素にて消化したｐＧＭＴ２０−ＭＦα−ＨＡに挿入して、ｐＧＭＨ２０−ＭＦα−ＨＡ−βｃを得た。
【００６１】
３−２：ＪＡＫ２発現プラスミドの構築
ＩＬ−５の刺激をうけて自己リン酸化するプロテインチロシンキナーゼであるマウス由来ＪＡＫ２遺伝子をコードするプラスミドｐＳＲα−ＪＡＫ２（Ｇｅｎｅｓ ｔｏ Ｃｅｌｌｓ， ４３１−４４１頁, １９９８年）を用いて、以下のようにｐＡＵＲ１２３−Ｖ５−ＪＡＫ２およびｐＡＵＲＧＡＬ１ｐ−Ｖ５−ＪＡＫ２を構築した。
【００６２】
３−２−１：ｐＡＵＲ１２３−Ｖ５およびｐＡＵＲＧＡＬ１ｐ−Ｖ５の構築
ガラクトース誘導型プロモーターであるＧＡＬ１ｐ遺伝子をコードするｐＹＥＳ２ベクターを鋳型としたＰＣＲにより、ＧＡＬ１ｐ遺伝子をコードする増幅断片（ａ）を得た。非誘導型プロモーターであるＡＤＨ１ｐ遺伝子をコードするｐＡＵＲ１２３ベクターを鋳型としたＰＣＲにより、ＡＤＨ１ｐを欠失した増幅断片（ｂ）を得た。増幅断片（ａ）をＫｐｎＩにて消化し、ＫｐｎＩにて消化した増幅断片（ｂ）に挿入して、ｐＡＵＲＧＡＬ１ｐベクターを得た。ＫｐｎＩおよびＳａｌＩにて消化したｐＡＵＲ１２３ベクターおよびｐＡＵＲＧＡＬ１ｐベクターに、Ｖ５タグ配列をコードする遺伝子を挿入して、それぞれｐＡＵＲ１２３−Ｖ５およびｐＡＵＲＧＡＬ１ｐ−Ｖ５を得た。
【００６３】
３−２−２：ｐＧＥＭ−ＪＡＫ２の構築
プラスミドｐＳＲα−ＪＡＫ２を鋳型としたＰＣＲにより、ＪＡＫ２遺伝子をコードする増幅断片を得た。この増幅断片の３’側にＴＡｒｇｅｔ Ｃｌｏｎｅ（ＴＯＹＯＢＯ）を用いてアデニンを付加し、これをｐＧＥＭ Ｔ−Ｅａｓｙベクターに挿入して、ｐＧＥＭ−ＪＡＫ２を得た。
【００６４】
３−２−３：ｐＡＵＲ１２３−Ｖ５−ＪＡＫ２およびｐＡＵＲＧＡＬ１ｐ−Ｖ５−ＪＡＫ２の構築
プラスミドｐＧＥＭ−ＪＡＫ２を鋳型としたＰＣＲにより、ＪＡＫ２タンパク質をコードする遺伝子の両末端に制限酵素部位を付加した増幅断片を得た。この増幅断片をＳａｌＩおよびＳａｃＩにて消化し、ＳａｌＩおよびＳａｃＩにて消化したｐＡＵＲ１２３−Ｖ５ベクターおよびｐＡＵＲＧＡＬ１ｐ−Ｖ５ベクターに挿入して、ｐＡＵＲ１２３−Ｖ５−ＪＡＫ２およびｐＡＵＲＧＡＬ１ｐ−Ｖ５−ＪＡＫ２を得た。
【００６５】
実施例４：酵母におけるＩＬ−５シグナル伝達再構成例
４−１：酵母形質転換体の作成
酵母Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ Ｄ１ＢＲ２０５ａ株（ＭＡＴａ ｕｒａ３ Ｈｉｓ３ ａｄｅ２ ｌｙｓ２ ｔｒｐ１ ｌｅｕ２ ｃｄｃ２５ Ｇａｌ＋）およびＤ１ＢＲ２０５α（ＭＡＴａ ｕｒａ３ Ｈｉｓ３ ａｄｅ２ ｌｙｓ２ ｔｒｐ１ ｌｅｕ２ ｃｄｃ２５ Ｇａｌ＋）をＳｔｒａｔａｇｅｎｅ社より入手した。
【００６６】
１のようにして得た各プラスミドｐＧＭＨ２０、ｐＧＭＨ２０−ＭＦα−ＦＬＡＧ−ＩＬ５Ｒα、ｐＧＭＴ２０、ｐＧＭＴ２０−ＭＦα−ＨＡ−βｃ、ｐＡＵＲ１２３、ｐＡＵＲ１２３−Ｖ５−ＪＡＫ２、ｐＡＵＲＧＡＬ１ｐ、およびｐＡＵＲＧＡＬ１ｐ−Ｖ５−ＪＡＫ２を、酢酸リチウム法によりＤ１ＢＲ２０５株に導入し、酵母形質転換体Ｄ１ＢＲ２０５／ｐＧＭＨ２０／ｐＧＭＴ２０／ｐＡＵＲ１２３、Ｄ１ＢＲ２０５／ｐＧＭＨ２０／ｐＧＭＴ２０／ｐＡＵＲ１２３−Ｖ５−ＪＡＫ２、Ｄ１ＢＲ２０５／ｐＧＭＨ２０−ＭＦα１−ＦＬＡＧ−ＩＬ５Ｒα／ｐＧＭＴ２０−ＭＦα−ＨＡ−βｃ／ｐＡＵＲ１２３−Ｖ５−ＪＡＫ２、Ｄ１ＢＲ２０５／ｐＧＭＨ２０／ｐＧＭＴ２０／ｐＡＵＲＧＡＬ１ｐ、Ｄ１ＢＲ２０５／ｐＧＭＨ２０／ｐＧＭＴ２０／ｐＡＵＲＧＡＬ１ｐ−Ｖ５−ＪＡＫ２、およびＤ１ＢＲ２０５／ｐＧＭＨ２０−ＭＦα−ＦＬＡＧ−ＩＬ５Ｒα／ｐＧＭＴ２０−ＭＦα−ＨＡ−βｃ／ｐＡＵＲＧＡＬ１ｐ−Ｖ５−ＪＡＫ２のそれぞれを、０．５μｇ／ｍｌのオーレオバシジンＡ（TaKaRa）を含むＳＤΔＨｉｓ／Ｔｒｐ寒天培地上に得た。
【００６７】
４−２：酵母形質転換体の培養
上記の寒天培地上で、直径２〜３ｍｍに生育した酵母形質転換体のコロニーを０．５μｇ／ｍｌのオーレオバシジンＡを含む３ｍＬのＳＤΔＨｉｓ／Ｔｒｐ液体培地中で、２５℃にて３００ｒｐｍでＯＤ６００＝１．０〜１．５まで培養した。菌体を回収・洗浄して、５００μＬの滅菌水に懸濁し、０．５μｇ／ｍｌのオーレオバシジンＡを含む１０ｍＬのＳＲＧΔＨｉｓ／Ｔｒｐ液体培地に初期ＯＤ６００＝０．２０になるよう植菌した後、２５℃にて３００ｒｐｍでＯＤ６００＝０．３０〜２．００まで培養した。
【００６８】
４−３：酵母形質転換体におけるＩＬ−５Ｒαタンパク質の発現および糖鎖修飾の有無の確認
４−２のように培養したＤ１ＢＲ２０５／ｐＧＭＨ２０−ＭＦα１−ＦＬＡＧ−ＩＬ５Ｒα／ｐＧＭＴ２０−ＭＦα−ＨＡ−βｃ／ｐＡＵＲ１２３−Ｖ５−ＪＡＫ２および陰性コントロールのＤ１ＢＲ２０５／ｐＧＭＨ２０／ｐＧＭＴ２０／ｐＡＵＲ１２３を回収して、２００μＬの溶解液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ （ｐＨ７．３），１５０ｍＭ ＮａＣｌ，０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００，１ｍＭ ＥＧＴＡ，２ｍＭ ＤＴＴ，１個／１０ｍＬ−溶解液）に懸濁し、グラスビーズで破砕して、酵母粗抽出液を得た。１０分間遠心して上清画分および沈殿画分に分離し、上清画分にはＳＤＳと２−ＭＥをそれぞれ０．５％（Ｖ／Ｖ）および１％（Ｖ／Ｖ）となるよう添加した。沈殿画分には上清画分と等量のＳＤＳと２−ＭＥをそれぞれ０．５％（Ｖ／Ｖ）および１％（Ｖ／Ｖ）で含む溶解液に再懸濁して、１００℃で１５分間煮た後、１０分間遠心して上清画分を分取した。５０μＬのサンプルに対して５０μＬのＯ−グリコシダーゼおよび５０μＬのＮ−グリコシダーゼを添加後、３７℃にて０、１０、３０、および６０分間反応させ、それぞれの時間についてサンプリングして、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび抗ＦＬＡＧマウスモノクローナル抗体（クローン Ｍ２）を用いたウェスタンブロットに供した（図８）。これまでに酵母における一回膜貫通型サイトカイン受容体の発現に成功した例はない。本実施例において初めて、酵母でのヒト由来サイトカイン受容体ＩＬ−５Ｒαタンパク質の発現が確認された。また、脱糖鎖修飾処理により、ＩＬ−５Ｒαタンパク質の計算分子量より大きい位置に見られたバンドが、計算分子量付近の位置にシフトした。このことから酵母において、ＩＬ−５Ｒαタンパク質は酵母内において糖鎖修飾を受けることがわかった。
【００６９】
４−４：酵母形質転換体におけるβｃタンパク質の発現および糖鎖修飾の有無の確認
４−３と同様の操作を行ってサンプルを得た後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび抗ＨＡマウスモノクローナル抗体（クローン １２ＣＡ５）を用いたウェスタンブロットに供した（図９）。酵母形質転換体において、脱糖鎖修飾処理前に見られなかったヒト由来βｃのバンドが、処理後に計算分子量付近に確認された。このことから酵母において、βｃタンパク質の発現および糖鎖修飾を受けることが確認された。２−３において、ＩＬ−５Ｒαの発現が確認されたこととあわせて、ＩＬ−５受容体の発現が酵母において確認された。
【００７０】
４−５：酵母形質転換体におけるＩＬ−５受容体の局在の確認
４−２のように培養したＤ１ＢＲ２０５／ｐＧＭＨ２０−ＭＦα−ＦＬＡＧ−ＩＬ５Ｒα／ｐＧＭＴ２０−ＭＦα−ＨＡ−βｃ／ｐＡＵＲ１２３−Ｖ５−ＪＡＫ２および陰性コントロールのＤ１ＢＲ２０５／ｐＧＭＨ２０／ｐＧＭＴ２０／ｐＡＵＲ１２３を回収して、４％パラホルムホルムアルデヒドで固定化した後、ソルビトールバッファー（４０ｍＭ リン酸カリウム（ｐＨ６．５），０．５ｍＭ ＭｇＣｌ２，１．２Ｍ ソルビトール）で２回洗浄した。固定化した酵母を５００μＬのソルビトールバッファーに再懸濁し、０．３ｍｇの細胞壁除去酵素Ｚｙｍｏｌｙａｓｅ ２０Ｔを添加後、３７℃にて３０分間反応させ、ソルビトールバッファーで２回洗浄した。細胞壁を除去した酵母をソルビトールバッファーに懸濁し、１次抗体として抗ＦＬＡＧマウスモノクローナル抗体（クローン Ｍ２）および抗ＨＡラビットポリクローナル抗体を添加し、１時間反応後に洗浄した。さらに２次抗体としてＣｙ３標識抗マウスＩｇＧヤギポリクローナル抗体およびＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４３０標識抗ラビットＩｇＧヤギポリクローナル抗体を添加し、１時間反応後に洗浄し、蛍光顕微鏡による観察を行った。結果を図１０に示す。
【００７１】
細胞壁を除去したＤ１ＢＲ２０５／ｐＧＭＨ２０−ＭＦα−ＦＬＡＧ−ＩＬ５Ｒα／ｐＧＭＴ２０−ＭＦα−ＨＡ−βｃ／ｐＡＵＲ１２３−Ｖ５−ＪＡＫ２において、ＩＬ−５Ｒαおよびβｃは細胞膜に局在することが確認された。このことから、ヒト由来ＩＬ−５受容体の酵母細胞膜上への局在化が成功したと考えられる。
【００７２】
４−６：酵母形質転換体におけるＪＡＫ２タンパク質の発現の確認
４−２のように培養したＤ１ＢＲ２０５／ｐＧＭＨ２０／ｐＧＭＴ２０／ｐＡＵＲ１２３−Ｖ５−ＪＡＫ２、Ｄ１ＢＲ２０５／ｐＧＭＨ２０／ｐＧＭＴ２０／ｐＡＵＲＧＡＬ１ｐ−Ｖ５−ＪＡＫ２、陰性コントロールのＤ１ＢＲ２０５／ｐＧＭＨ２０／ｐＧＭＴ２０／ｐＡＵＲ１２３、およびＤ１ＢＲ２０５／ｐＧＭＨ２０／ｐＧＭＴ２０／ｐＡＵＲＧＡＬ１ｐを回収して、２００μＬの溶解液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ （ｐＨ７．３），１５０ｍＭ ＮａＣｌ，０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００，１ｍＭ ＥＧＴＡ，２ｍＭ ＤＴＴ，Ｃomplete protease inhibitor cocktail １個／１０ｍＬ−溶解液）に懸濁し、グラスビーズで破砕して、酵母粗抽出液を得た後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび抗Ｖ５マウスモノクローナル抗体（クローン Ｖ５−１０）および抗リン酸化ＪＡＫ２ラビットポクローナル抗体を用いたウェスタンブロットに供した（図１１）。ＪＡＫ２の発現は、Ｄ１ＢＲ２０５／ｐＧＭＨ２０／ｐＧＭＴ２０／ｐＡＵＲ１２３−Ｖ５−ＪＡＫ２ではＯＤ６００＝２．０で確認され、Ｄ１ＢＲ２０５／ｐＧＭＨ２０／ｐＧＭＴ２０／ｐＡＵＲＧＡＬ１ｐ−Ｖ５−ＪＡＫ２ではＯＤ６００＝０．６で確認され、ＯＤ６００＝２．０で高発現することがわかった。
【００７３】
４−７：ＩＬ−５依存的なＪＡＫ２の自己リン酸化亢進の確認
４−６で示したＪＡＫ２の自己リン酸化が、ヒト由来のリガンドであるＩＬ−５依存的に酵母内で起こるかどうか以下のように実施した。４−２のように培養したＤ１ＢＲ２０５／ｐＧＭＨ２０−ＭＦα−ＦＬＡＧ−ＩＬ５Ｒα／ｐＧＭＴ２０−ＭＦα−ＨＡ−βｃ／ｐＡＵＲ１２３−Ｖ５−ＪＡＫ２、Ｄ１ＢＲ２０５／ｐＧＭＨ２０−ＭＦα−ＦＬＡＧ−ＩＬ５Ｒα／ｐＧＭＴ２０−ＭＦα−ＨＡ−βｃ／ｐＡＵＲＧＡＬ１ｐ−Ｖ５−ＪＡＫ２、陰性コントロールのＤ１ＢＲ２０５／ｐＧＭＨ２０／ｐＧＭＴ２０／ｐＡＵＲ１２３、およびＤ１ＢＲ２０５／ｐＧＭＨ２０／ｐＧＭＴ２０／ｐＡＵＲＧＡＬ１ｐを回収・洗浄して、最終濃度２０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０）および最終濃度０．５μｇ／ｍｌのオーレオバシジンＡを含む１ｍＬのＳＲＧΔＨｉｓ／Ｔｒｐ液体培地に置換し、ＩＬ−５を最終濃度４ｎＭとなるよう添加して０ｈ、１ｈ反応させた。反応後、上記４％パラホルムアルデヒドで固定化後、細胞壁を除去したＤ１ＢＲ２０５／ｐＧＭＨ２０−ＭＦα−ＦＬＡＧ−ＩＬ５Ｒα／ｐＧＭＴ２０−ＭＦα−ＨＡ−βｃ／ｐＡＵＲ１２３−Ｖ５−ＪＡＫ２、Ｄ１ＢＲ２０５／ｐＧＭＨ２０−ＭＦα−ＦＬＡＧ−ＩＬ５Ｒα／ｐＧＭＴ２０−ＭＦα−ＨＡ−βｃ／ｐＡＵＲＧＡＬ１ｐ−Ｖ５−ＪＡＫ２、陰性コントロールのＤ１ＢＲ２０５／ｐＧＭＨ２０／ｐＧＭＴ２０／ｐＡＵＲ１２３、およびＤ１ＢＲ２０５／ｐＧＭＨ２０／ｐＧＭＴ２０／ｐＡＵＲＧＡＬ１ｐをソルビトールバッファーに懸濁し、１次抗体として抗リン酸化ＪＡＫ２ラビットポリクローナル抗体を添加し、１時間反応後に洗浄した。さらに２次抗体Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８標識抗ラビットＩｇＧヤギポリクローナル抗体を添加し、１時間反応後に洗浄し、蛍光顕微鏡による観察およびフローサイトメーター（ＦＣＭ）による解析を行った。図１２のように、ＯＤ６００＝２．０のＤ１ＢＲ２０５／ｐＧＭＨ２０−ＭＦα−ＦＬＡＧ−ＩＬ５Ｒα／ｐＧＭＴ２０−ＭＦα−ＨＡ−βｃ／ｐＡＵＲ１２３−Ｖ５−ＪＡＫ２および陰性コントロールのＤ１ＢＲ２０５／ｐＧＭＨ２０／ｐＧＭＴ２０／ｐＡＵＲ１２３にＩＬ−５を添加して１時間反応培養後にＩＬ−５依存的な蛍光強度の亢進が確認された。以上の結果より、アゴニスト依存的なＪＡＫ２のリン酸化が酵母でおこることを示すことが出来た。
【図面の簡単な説明】
【００７４】
【図１】酵母細胞シグナル伝達を応用したスクリーニング法
【図２】ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび抗ＦＬＡＧマウスモノクローナル抗体を用いたウェスタンブロットの結果を示す。
【図３】酵母形質転換体におけるＥＧＦ受容体の局在の確認
【図４】酵母においてＥＧＦシグナル伝達再構成に必要と考えられるＥＧＦ−ＦＬＯ４２、ＥＧＦＲ、およびＳｏｓ−Ｇｒｂ２を全て発現させた酵母形質転換体においてのみ、３７℃における増殖が確認されたことを示す。
【図５】ＥＧＦＲの自己リン酸化の確認
【図６】抗リン酸化ＪＡＫ２抗体を用いたリガンドスクリーニング法
【図７】酵母細胞シグナル伝達を応用したスクリーニング法、ＩＬ−５レセプター
【図８】ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび抗ＦＬＡＧマウスモノクローナル抗体（クローン Ｍ２）を用いたウェスタンブロットの結果を示す。
【図９】ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび抗ＨＡマウスモノクローナル抗体（クローン １２ＣＡ５）を用いたウェスタンブロットの結果を示す。
【図１０】酵母形質転換体におけるＩＬ−５受容体の局在の確認
【図１１】酵母形質転換体におけるＪＡＫ２タンパク質の発現の確認
【図１２】ＩＬ−５依存的なＪＡＫ２の自己リン酸化亢進の確認
【技術分野】
【０００１】
本発明は、受容体にアゴニストが結合したときに自己リン酸化（プロテインキナーゼ）作用が活性化される受容体を酵母で発現させ、該受容体に結合する物質（アゴニスト、アンタゴニスト）をスクリーニングする方法、遺伝子組換え酵母、キット及びコンビネーションに関する。
【背景技術】
【０００２】
受容体の多くは細胞膜に存在し、外部の刺激を認識して情報を伝達するための構造を有している。
【０００３】
受容体として、Ｇタンパク質共役型受容体（ＧＰＣＲ）を酵母に組み込んだアゴニストのハイスループットスクリーニング系が知られている(特許文献１，２)。
【特許文献１】特開2005-176605
【特許文献２】ＷＯ2006/104254
【非特許文献１】Kim YS, Bhandari R, Cochran JR, Kuriyan J, Wittrup KD. Proteins. 2006 Mar 1;62(4):1026-35.
【非特許文献２】T Yi, A L Mui, G Krystal, and J N Ihle, Mol Cell Biol. 1993 December; 13(12): 7577-7586 (共通IL-3受容体ベータ鎖（IL-5受容体のベータ鎖）のリン酸化がアゴニストに依存して起こることを示す)。
【非特許文献３】Pratt JC, Weiss M, Sieff CA, Shoelson SE, Burakoff SJ, Ravichandran KS. J Biol. Chem. 1996 May 24;271(21):12137-40 (JAK2によりリン酸化されたベータ鎖が、Shcアダプタータンパク質と結合することを示す)
【非特許文献４】Giordano V, De Falco G, Chiari R, Quinto I, Pelicci PG, Bartholomew L, Delmastro P, Gadina M, Scala G. J Immunol. 1997 May 1;158(9):4097-4103 (JAK2によりリン酸化されたgp130が、Shcアダプタータンパクと結合することを示す。)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
EGF、IL-5などの自己リン酸化型受容体は生体の基礎的機能において重要であり、例えば抗がん剤としてEGF受容体の作用するゲフィチニブが上市されている。
【０００５】
一方、自己リン酸化型受容体に対するアゴニスト/アンタゴニストのハイスループットスクリーニング系は確立されていなかった。
【０００６】
本発明は、自己リン酸化型受容体に対するアゴニスト/アンタゴニストのハイスループットスクリーニング系を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
Ｇタンパク質共役型受容体（ＧＰＣＲ）は、本来酵母にも存在するものであり、哺乳類のＧＰＣＲを酵母で発現可能であると予測される。実際、特許文献1,2では、酵母に本来存在するＧＰＣＲの三量体Gタンパク質を利用し、ＧＰＣＲに対するアゴニスト/アンタゴニストのスクリーニングを行っている。
【０００８】
一方、自己リン酸化型受容体と該受容体のリン酸化部位を認識可能なアダプタータンパク質は酵母に存在しないため、これらを別々に発現させた場合に酵母において実際に機能するかは全く予測できなかった。哺乳類由来のEGF受容体のみを酵母で発現させ、その発現を抗体で確認したこと、酵母細胞で発現させた細胞外ドメインのみを有するEGF受容体の欠失変異体は、EGFと結合できることを報告している (非特許文献1)。しかしながら、該受容体が酵母で実際に機能することは確認されておらず、また、アダプタータンパク質は同時発現されていない。従って、非特許文献1では、アゴニスト/アンタゴニストのスクリーニングを行う方法は一切開示されていない。
【０００９】
本発明では、上記の問題点を解決する手段として、哺乳類由来の自己リン酸化型受容体を発現した改変型酵母細胞を用いたスクリーニングシステムを提供する。
１． アゴニスト／アンタゴニストのスクリーニング方法であって、哺乳類の自己リン酸化型受容体と、リン酸化された該受容体を認識可能なアダプタータンパク質を共発現する酵母に前記受容体のアゴニスト／アンタゴニスト候補物質を作用させ、該アゴニスト／アンタゴニスト候補物質が該受容体に結合している酵母を検出する工程を含み、前記自己リン酸化型受容体がリガンドの結合により多量体化して、受容体自身のキナーゼ作用もしくは受容体に構成的に結合するチロシンキナーゼの作用により受容体自身および/または受容体に構成的に結合するチロシンキナーゼがリン酸化される、方法。
２． 前記自己リン酸化型受容体が、リガンドの結合により多量体化して、受容体自身のキナーゼ作用により受容体自身がリン酸化される、項１に記載の方法。
３． 前記自己リン酸化型受容体がリガンドの結合により多量体化して、受容体に構成的に結合するチロシンキナーゼの作用により受容体自身と受容体に構成的に結合するチロシンキナーゼの両方がリン酸化される、項１に記載の方法。
４． アゴニスト／アンタゴニストのスクリーニング方法であって、哺乳類の自己リン酸化型受容体を発現する酵母に前記受容体のアゴニスト／アンタゴニスト候補物質を作用させ、該アゴニスト／アンタゴニスト候補物質が該受容体に結合している酵母を検出する工程を含み、
前記自己リン酸化型受容体がアゴニストの結合により多量体化して、受容体自身のキナーゼ作用もしくは受容体に構成的に結合するチロシンキナーゼの作用により受容体自身もしくは受容体に構成的に結合するチロシンキナーゼがリン酸化され、
前記リン酸化の検出は、前記酵母の細胞壁を溶解し、細胞壁溶解酵母に前記リン酸化を検出可能な抗体を作用させることにより行なう、
方法。
５． 前記自己リン酸化型受容体がアゴニストの結合により多量体化して、受容体自身のキナーゼ作用により受容体自身がリン酸化される、項４に記載の方法。
６． 前記自己リン酸化型受容体がアゴニストの結合により多量体化して、受容体に構成的に結合するチロシンキナーゼの作用により受容体自身と受容体に構成的に結合するチロシンキナーゼの両方がリン酸化される、項４に記載の方法。
７． 哺乳類の自己リン酸化型受容体は、
(i)受容体自身が自己リン酸化作用を有するか、或いは、
(ii)gp130またはβｃを共有し、かつ、チロシンキナーゼがgp130またはβｃに構成的に結合し、該チロシンキナーゼの作用によりチロシンキナーゼ自身とgp130またはβｃの両方をリン酸化する
受容体である、項１または４に記載の方法。
８． 受容体に構成的に結合するチロシンキナーゼがＪＡＫ１，ＪＡＫ２またはＪＡＫ３である項１または４に記載の方法。
９． チロシンキナーゼが構成的に結合し、かつ、アゴニスト依存的に該チロシンキナーゼがリン酸化される受容体が、インターロイキン受容体のα鎖とβ鎖(βc)を含む、項１または４に記載の方法。
１０． チロシンキナーゼが構成的に結合し、かつ、アゴニスト依存的に該チロシンキナーゼがリン酸化される受容体が、gp130を含む、項１または４に記載の方法。
１１． アゴニストの結合により多量体化し、該アゴニストの受容体に構成的に結合するチロシンキナーゼ若しくは受容体自身が有するチロシンキナーゼの作用によりチロシンキナーゼおよび/または受容体自身がリン酸化を受ける哺乳類の自己リン酸化型受容体と、該リン酸化を酵母中で認識可能なアダプタータンパク質を共発現してなる、遺伝子組換え酵母。
１２． チロシンキナーゼ作用を有し、かつ、アゴニストの結合により多量体化して自己リン酸化する哺乳類の受容体と、該受容体のリン酸化を認識可能なアダプタータンパク質を共発現する項１１に記載の遺伝子組換え酵母。
１３． アゴニストの結合により多量体化するβcまたはgp130を共有する受容体と、該受容体に構成的に結合するチロシンキナーゼ（該チロシンキナーゼはアゴニストの結合によりβcまたはgp130とチロシンキナーゼ自身をリン酸化する）と、βc、gp130またはチロシンキナーゼのリン酸化を認識可能なアダプタータンパク質を共発現する項１１に記載の遺伝子組換え酵母。
１４． アゴニストの結合により多量体化し、該アゴニストの受容体に構成的に結合するチロシンキナーゼ若しくは受容体自身が有するチロシンキナーゼの作用によりチロシンキナーゼおよび/または受容体自身がリン酸化を受ける哺乳類の自己リン酸化型受容体と、前記リン酸化を検出可能な抗体を含む、前記受容体に対するアゴニスト／アンタゴニストをスクリーニングするためのキット。
１５． 酵母の細胞壁を溶解する酵素をさらに含む項１４に記載のキット。
１６． アゴニストの結合により多量体化し、該アゴニストの受容体に構成的に結合するチロシンキナーゼ若しくは受容体自身が有するチロシンキナーゼの作用によりチロシンキナーゼおよび/または受容体自身がリン酸化を受ける哺乳類の自己リン酸化型受容体と、前記リン酸化を検出可能な抗体のコンビネーション。
１７． アゴニストの結合により多量体化し、該アゴニストの受容体に構成的に結合するチロシンキナーゼ若しくは受容体自身が有するチロシンキナーゼの作用によりチロシンキナーゼおよび/または受容体自身がリン酸化を受ける哺乳類の自己リン酸化型受容体と、酵母の細胞壁を溶解する酵素と、前記リン酸化を検出可能な抗体のコンビネーション。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
本明細書において、自己リン酸化型受容体とは、以下の2つのタイプの受容体を含む:
(a) βcもしくはgp130を共有し、アゴニストの結合により受容体とβcもしくはgp130を含む多量体を形成し、且つ、βcもしくはgp130に構成的に結合したチロシンキナーゼを活性化してβcもしくはgp130とチロシンキナーゼをリン酸化する受容体。
【００１１】
(b) 受容体自身がチロシンキナーゼ作用を有し、アゴニストの結合により受容体が多量体化し、且つ、多量体化した受容体がチロシンキナーゼ作用により自己リン酸化する受容体。
【００１２】
上記(a)の場合には、リガンド(アゴニスト/アンタゴニスト)が結合可能な受容体部分はリン酸化されないが、該受容体部分はβcもしくはgp130とヘテロ多量体を形成し、βcもしくはgp130とチロシンキナーゼ（βcもしくはgp130に構成的に結合する）がリン酸化され、ヘテロ多量体(受容体複合体)がリン酸化されているため、本明細書では、このような受容体も自己リン酸化型受容体という。
【００１３】
「構成的に結合する」とは、チロシンキナーゼとβcもしくはgp130を酵母で別々に（キメラタンパク質ではなく）発現させた場合にもチロシンキナーゼとβcもしくはgp130が酵母内で結合/会合することを意味し、これらは別々のタンパク質として酵母中で発現されてもよく、あるいはキメラタンパク質として発現させてもよい。
【００１４】
本発明の特徴は、以下の2点にある：
第1は、酵母に存在しない哺乳類由来の受容体と酵母に存在しない(哺乳類由来が好ましい)アダプタータンパク質を酵母内で同時に発現させ、これにより、非酵母受容体システムにおいても該受容体に対するアゴニストの結合によるシグナルが酵母内で正しく伝達されることを確認したことである。
【００１５】
第2は、酵母に存在しない哺乳類由来の自己リン酸化型受容体を酵母内で発現させ、該受容体に対するアゴニストの結合による自己リン酸化を抗体により確認したことである。特に、酵母内におけるリン酸化を、酵母を破砕することなく細胞壁を溶解することで確認することができ、アゴニスト／アンタゴニストを確実にスクリーニングできることを本発明者は初めて明らかにした。
【００１６】
本発明では、アゴニストと受容体が結合したときに引き起こされる自己リン酸化型受容体のリン酸化反応と多量体形成を以下の２つの方法で検出することによりアゴニスト/アンタゴニストのスクリーニングを可能とする（図１、図６、図7参照）。ここで、リン酸化されるのは、受容体自身がチロシンキナーゼ作用を有する受容体(例えばEGF受容体)の場合には、受容体自身であり、受容体自身はチロシンキナーゼ作用を持たず、受容体に共有される(リガンドが結合した際の受容体複合体に含まれる)βcまたはgp130にチロシンキナーゼ(例えばJAK1、JAK2、JAK3などのヤヌスキナーゼ(JAK))が構成的に結合される受容体の場合には、βcまたはgp130とチロシンキナーゼの両方である。後者の場合には、アダプタータンパク質により認識されるリン酸化はβc/gp130のリン酸化とチロシンキナーゼ自身のリン酸化のいずれであってもよいが、好ましくはアダプタータンパク質はチロシンキナーゼのリン酸化を認識する。
第1の方法：リン酸化された受容体に特異的に結合するアダプタータンパク質を哺乳類(特にヒト)由来の受容体とともに酵母で同時に発現させ、アダプタータンパク質と受容体の結合をレポーター遺伝子の発現や細胞増殖により検出する方法。本明細書において、アダプタータンパク質とは、受容体に共有されるβcもしくはgp130のリン酸化、βcもしくはgp130に構成的に結合されるチロシンキナーゼのリン酸化、或いはチロシンキナーゼ作用を有する受容体自身のリン酸化を認識するタンパク質を意味する。
【００１７】
アダプタータンパク質としては、例えばShc、Grb2が挙げられ、哺乳類由来のアダプタータンパク質が好ましい。
【００１８】
Shc/Grb2は単独で酵母中に発現してもよく、GDP/GTP交換因子(例えばSos)に融合されていてもよい。本発明においては、酵母においてさらにGDP/GTP交換因子(例えばSos)を同時発現させるのが好ましい。GDP/GTP交換因子の由来は、哺乳類(特にヒト)が好ましいが、その他であってもよい。酵母としてCdc25熱感受性変異体を使用した場合には、37℃の培養条件においてGDP/GTP交換因子(例えばSos)は本来酵母で発現されているCdc25熱感受性変異体の機能を置き換えることができる。Shc/Grb2がリン酸化されたβcまたはリン酸化されたgp130に結合し、このShc/Grb2に必要に応じて融合されているGDP/GTP交換因子(例えばSos)が細胞内膜近傍へ濃縮されると、GDP/GTP交換因子(例えばSos)が酵母内在性のRas1/2に結合しているGDPをGTPに交換することを促進するため、酵母の増殖が促進される。これにより受容体へのアゴニストの結合を酵母の増殖を指標にスクリーニングすることもでき、或いは、GDP/GTP交換因子(例えばSos)の結合時におけるRas1/2を介した転写因子の活性化をレポータージーンアッセイにより検出することもできる（図1、図7参照）。
【００１９】
本発明の特に好ましい実施形態では、アダプタータンパク質Shcまたはアダプタータンパク質Grb2が哺乳動物由来Sos（GDP/GTP交換因子）と融合したもの（Shc-Sosまたは、Grb2-Sos）を使用することができる。37℃のスクリーニング条件において、哺乳動物由来Sosは、酵母内在性のCdc25H（GDP/GTP交換因子であり、熱感受性）の代わりとして働き、細胞を増殖させるシグナル伝達を行う。本スクリーニングにおいては、以下のようなシグナル伝達となっている：アゴニストが受容体に結合→受容体の多量体化→受容体のチロシン残基のリン酸化→受容体のリン酸化チロシン残基をShcまたはGrb2が認識して結合することによりShc-Sosまたは、Grb2-Sosが酵母細胞膜近傍へ濃縮される→細胞膜近傍へ濃縮されたShc-Sosまたは、Grb2-Sosが酵母内在性Cdc25Hのかわりに働き、細胞が増殖する。
【００２０】
第2の方法：リン酸化された受容体に特異的に結合する抗体により検出する方法。酵母の細胞壁を溶解させた後に抗体を作用させることで、抗体が酵母内に移行し、細胞膜表面に存在する自己リン酸化型受容体のリン酸化を検出することができる。理論により拘束されることを望むものではないが、抗体が酵母内に移行するのは、細胞壁を溶解させたときに細胞膜に小孔が開くか、あるいは細胞膜の一部又は全体の構造が弱くなり、抗体が入りやすくなるからであると本発明者は考えている。
【００２１】
アンタゴニストのスクリーニングは、あらかじめ酵母の培地中に既知のアゴニストを添加するか、アゴニストを細胞壁に発現可能な酵母を使用し、この既知のアゴニストによるレポーター遺伝子の発現や細胞増殖が無効となるような化合物をスクリーニングすることにより行うことができる。
【００２２】
酵母におけるアゴニストペプチド・タンパク質のコンビナトリアル・エンジニアリングにより、ランダムなペプチドを酵母細胞表層に発現させることができる。具体的には、ランダムなペプチドをシグナルペプチドと細胞壁表面に結合されるアンカーペプチドに連結させる。ランダムペプチドが細胞膜から分泌される際に、アンカーペプチドが細胞壁にひっかかり、ランダムなペプチドが細胞膜の受容体と結合することが可能になる。アンカータンパク質としては、以下のものが例示される：FLO42(FLO1タンパク質のC末側42個のペプチド)、α-アグルチニンのC末320アミノ酸、酵母凝集性タンパク質FLO1のC末42アミノ酸（FLO42）、C末102アミノ酸(FLO102）、C末146アミノ酸(FLO146)、C末318アミノ酸(FLO318)、エタノールアミンリン酸−６マンノースα１−２マンノースα１−６マンノースα１−４グルコサミンα１−６イノシトールリン脂質を基本構造とする糖脂質(GPIアンカー)。
【００２３】
或いは、アゴニストの候補となるペプチドを糖鎖結合タンパク質ドメインと連結して酵母で発現させ、該ドメインの糖鎖部分が細胞壁中の糖鎖と相互作用又は絡み合うことによって、細胞表層にとどまり、受容体に結合させることもできる。
【００２４】
本発明において、受容体を発現させるのに適当な酵母としては、S.cerevisiae ＢＹ４７４１、ＡＴＣＣ６０７１５、ＭＴ８−１、Ｗ３０３ａ、ＩＦＯ１０１５０、ＹＰＨ４９９、ＢＪ５４６４などが挙げられる。シグナル伝達量が多い株が好ましいので、このような酵母株を選別するのがよい。
【００２５】
本明細書において、チロシンキナーゼとしては、JAK(JAK1、JAK2、JAK3、特にJAK2)、Lyn, Yes, Fyn, Fes, Hckなどが好ましく例示され、好ましくはJAK2が例示される。自己リン酸化型受容体には、gp130やβc鎖のようにJAK(JAK1、JAK2、JAK3、特にJAK2)のようなチロシンキナーゼを構成的に結合するものと、EGF受容体(EGFR)のように、受容体(EGFR)自体にチロシンキナーゼ活性を有するものが挙げられる。具体的には:
(i) gp130を共有する受容体
IL-6R、IL-11R、LIFR、CNTFR、OSMR、CT-1Rなど。
(ii) βcを共有する受容体
IL-3R、IL-5R、GM-CSFRなど。
(iii) 自己リン酸化作用を有する受容体のリガンド
Alkを含むAlkRファミリー、Axlを含むAxlRファミリー、DDR1を含むDDRファミリー、EGFRを含むEphRファミリー、Eph A1を含むEphARファミリー、Eph B1を含むEphBRファミリー、FGFR1を含むFGFRファミリー、IFG-1Rを含むIRファミリー、Metを含むMetRファミリー、MuSKを含むMuSKRファミリー、TrkAを含むニューロトロフィンRファミリー、PDGFR-αを含むPDGFRファミリー、RETを含むRETRファミリー、Ror1を含むRorRファミリー、Rykを含むRykRファミリー、Sevを含むSevRファミリー、Tie1を含むTieRファミリー、VEGFR-1を含むVEGFRファミリーなど。
【００２６】
ベータ鎖（βc）共有型受容体のスクリーニング系とgp130共有型の受容体のスクリーニングは同様に行うことができる。例えば、非特許文献２，３は、ベータ鎖がJAK2によりリン酸化されて、そのリン酸化部位へアダプタータンパク質Shcが結合することを示す。非特許文献４は、gp130がJAK2にリン酸化されて、そこへアダプタータンパク質Shcが結合することを示す。即ち、Shcは、ベータ鎖に対してもgp130に対しても、同様に受容体の細胞内ドメインのリン酸化部位に結合する挙動を示すことから、Shcを用いた検出系は、ベータ鎖共有型受容体(例えばIL-5）とgp130共有型受容体（例えばIL-6、LIFなど）の両方のスクリーニング系に使用可能であることが明らかである。
【００２７】
本発明においてJAK（例えばJAK2）などのチロシンキナーゼとβｃ/gp130とは別個に発現させても、キメラタンパク質として発現させてもよい。JAKなどのチロシンキナーゼとβｃ/gp130を別々に発現させても「構成的」に結合することは、文献により知られている（Zhao Y, Wagner F, Frank SJ, Kraft AS. J Biol Chem. 1995 Jun 9;270(23):13814-8.）。
【００２８】
本発明のスクリーニング方法は、上記の受容体に結合可能な物質をスクリーニングすることができる。アゴニストをスクリーニングする場合には、当該酵母にアゴニストの候補物質を作用させ、受容体への候補物質の結合の有無を検出すればよい。また、アンタゴニストを検出する場合には、適当な濃度のアゴニストの存在下にアンタゴニストの候補物質を作用させ、アゴニストの結合がどの程度低下したかを検出すればよい。本発明において、
「アゴニスト／アンタゴニスト候補物質が受容体に結合している酵母を検出する工程」には、酵母にアゴニストの候補物質を作用させ、受容体への候補物質の結合の有無を検出する場合と、適当な濃度のアゴニストの存在下にアンタゴニストの候補物質を作用させ、アゴニストの結合がどの程度低下したかを検出する場合の両方が含まれる。
【００２９】
アゴニストの当該受容体への結合は、自己リン酸化されたgp130またはβcを酵母細胞の増殖や細胞内の伝達経路においてレポータータンパク質を発現させる方法、或いは抗体により検出するなどの方法を採用することができる。
【００３０】
例えば図６に示したようにＩＬ−５受容体は、ＩＬ−５受容体α鎖とβ鎖（βｃ）から構成されている。β鎖には構成的にチロシンキナーゼＪＡＫ２が結合しており、ＩＬ−５とＩＬ−５受容体α鎖が結合することによりＪＡＫ２の自己リン酸化が引き起こされる。
【００３１】
βｃの代わりにgp130を有する受容体についても同様に、受容体にリガンドが結合することによりgp130に構成的に結合したJAK2による自己リン酸化が起こる。
【００３２】
一方、図１に示されるように、EGF受容体などは、リガンド(EGF)の結合により受容体の2量体化/多量体化が起こり、これにより受容体の自己リン酸化が誘導される。
１．抗体を用いたアゴニスト・受容体反応の検出方法
受容体の自己リン酸化を抗リン酸化チロシンキナーゼ(例えばＪＡＫ２)特異的抗体により検出することにより、アゴニストのスクリーニングが可能となる。(図１)
抗リン酸化抗体が認識するリン酸化部位は、例えばJAK1、JAK2、EGF受容体では、以下の位置が例示される。但し、アミノ酸番号は、ヒト由来タンパク質におけるN末端のアミノ酸残基を１番とした番号である。
１．JAK2のリン酸化部位：Tyr221, Tyr813, Tyr1007/1008
２．JAK1のリン酸化部位：Tyr1022/1023,
３．EGF受容体のリン酸化部位：Tyr974, Tyr992, Tyr1045, Tyr1068, Tyr1086, Tyr1148, Tyr1173
上記のリン酸化部位を認識する抗体は知られており、公知の抗体を使用することにより、自己リン酸化された受容体を検出することができる。検出は、例えばリン酸化部位を特異的に認識する抗体と、該抗体を認識する標識二次抗体を酵母に作用させ、酵母の膜近傍における二次抗体標識の存在の検出に基づき行なうことができる。JAK1、JAK2以外のチロシンキナーゼ、EGF受容体以外のチロシンキナーゼ活性を有する受容体についても同様に抗体により自己リン酸化された受容体を検出することができる。
【００３３】
２．酵母内シグナル伝達を用いる方法。
ＪＡＫ２のリン酸化を検出するには、ＥＧＦ受容体のスクリーニング方法と類似したヒト由来アダプタータンパク質と酵母内在性Ｒａｓ１またはＲａｓ２へのシグナル伝達を利用する方法も使用できる（図７）。具体的には、アゴニスト依存的にリン酸化された受容体に特異的に結合するアダプタータンパク質Ｓｈｃと融合したヒト由来Ｓｏｓタンパク質がアゴニスト依存的に細胞質から細胞膜近傍に濃縮され、ＧＤＰ結合型の酵母内在性Ｒａｓ１または、Ｒａｓ２をＧＴＰ結合型に変換することにより、酵母の細胞分裂が導かれることを利用したスクリーニング方法である。
【００３４】
図６、図７で示したスクリーニング方法は、ＩＬ−５受容体と同様にβ鎖を共有する受容体群すなわち、ＩＬ−３受容体、ＧＭ−ＣＳＦに適用できる。また、ＩＬ−５受容体と類似の分子構成であり、ｇｐ１３０を共有するＩＬ−６受容体、ＩＬ−１１受容体、ＬＩＦ受容体、ＣＮＴＦ受容体、ＯＳＭ受容体、ＣＴ−１受容体のアゴニスト/アンタゴニストスクリーニング法としても適用できる。さらにＩＬ−５受容体と類似の分子構成であり、γ鎖を共有するＩＬ−２受容体、ＩＬ−４受容体、ＩＬ−７受容体、ＩＬ−９受容体、ＩＬ−１５受容体にも適用できる。
【００３５】
アンタゴニストをスクリーニングする場合には、あらかじめ酵母の培地中に既知のアゴニストを添加しておき、この既知のアゴニストによるＪＡＫ１または、ＪＡＫ２の自己リン酸化が無効となるような化合物をスクリーニングすることにより行う。
【００３６】
酵母内在性Ｒａｓタンパク質のシグナル伝達下流に位置して、 Ｒａｓの活性化に伴い発現が上昇するような酵母内在性遺伝子のプロモーターをレポーター遺伝子のプロモーターとして使用することにより、細胞増殖を指標とするスクリーニングだけでなく、レポーター遺伝子の発現を指標とするスクリーニングを行うことが出来る。レポーター遺伝子としては、GFPを含む蛍光タンパク質の遺伝子、βガラクトシダーゼやルシフェラーゼなどの発色、発光基質が開発されている酵素の遺伝子、栄養要求性マーカー遺伝子が挙げられる。酵母内在性Ｒａｓは、酵母内在性ｃＡＭＰ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔｐｈｏｓｐｈｏｄｉｅｓｔｅｒａｓｅであるＰＤＥ２を活性化する（Ｓａｓｓ Ｐ， Ｆｉｅｌｄ Ｊ， Ｎｉｋａｗａ Ｊ， Ｔｏｄａ Ｔ， Ｗｉｇｌｅｒ Ｍ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ． １９８６ Ｄｅｃ;８３(２４):９３０３−７．）。また、このＰＤＥ２の発現により発現を誘導される遺伝子は網羅的に調べられている（Ｊｏｎｅｓ ＤＬ， Ｐｅｔｔｙ Ｊ， Ｈｏｙｌｅ ＤＣ， Ｈａｙｅｓ Ａ， Ｒａｇｎｉ Ｅ， Ｐｏｐｏｌｏ Ｌ， Ｏｌｉｖｅｒ ＳＧ， Ｓｔａｔｅｖａ ＬＩ． Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ． ２００３ Ｄｅｃ １６;１６(１):１０７−１８．）。よってＰＤＥ２により発現が誘導すると報告されている遺伝子のプロモーターは、本スクリーニング方法においてレポーター遺伝子のプロモーターとなり得る。
【００３７】
本発明において、実際の薬物候補化合物のスクリーニング方法を以下に例示する。
Ｉ.低分子化合物ないしタンパク質を外部から培養液中に添加する場合
・96穴プレートに液体培地もしくは寒天培地をいれ、酵母を蒔く。そこに化合物ないしタンパク質を添加し、酵母の増殖や蛍光、発色を指標としてレポーター遺伝子の発現を観察する。この時、酵母において増殖やレポータ遺伝子の発現が検出されれば、その化合物はアゴニストである。
・96穴プレートに液体培地もしくは寒天培地をいれ、酵母を蒔く。そこに化合物ないしタンパク質を添加し、EGFRなどの受容体型チロシンキナーゼにおいては自己リン酸化を、そしてIL-5RやIL-6RなどのサイトカインレセプターなどにおいてはJAK1やJAK2の自己リン酸化を、それぞれのタンパク質特異的なリン酸化抗体を用いた免疫染色により検出する。この時、受容体型チロシンキナーゼの自己リン酸化や、JAK1やJAK2の自己リン酸化が見られれば、その化合物はアゴニストである。免疫染色には、酵母の細胞壁を除く処理を必要とする。
・96穴プレートにアゴニストを含ませた液体培地もしくは寒天培地をいれ、酵母を蒔く。そこに化合物ないしタンパク質を添加し、酵母の増殖や蛍光、発色を指標としてレポーター遺伝子の発現を観察する。この時、酵母がレポーター遺伝子が発現しなければ、その化合物はアンタゴニストである。
・96穴プレートにアゴニストを含ませた液体培地もしくは寒天培地をいれ、酵母を蒔く。そこに化合物ないしタンパク質を添加し、EGFRなどの受容体型チロシンキナーゼにおいては自己リン酸化を、そしてIL-5RやIL-6RなどのサイトカインレセプターにおいてはJAK1やJAK2の自己リン酸化を、それぞれのタンパク質特異的なリン酸化抗体を用いた免疫染色により検出する。この時、受容体型チロシンキナーゼの自己リン酸化や、JAK1やJAK2の自己リン酸化が見られなければ、その化合物はアンタゴニストである。免疫染色には、酵母の細胞壁を除く処理を必要とする。
【００３８】
ＩＩ.酵母自体にランダムなペプチドを組み込んだ場合
・ランダムなペプチドを発現する酵母を寒天培地に蒔き、酵母の増殖や蛍光、発色を指標としてレポーター遺伝子の発現を観察する。この時、酵母がレポーター遺伝子を発現すれば、その酵母はアゴニストとなるペプチドを発現する酵母である。後に、ペプチドを発現させる為に導入したプラスミドを酵母から抽出し、シークエンス解析を行えばペプチド配列を特定できる。
・ランダムなペプチドを発現する酵母を寒天培地に蒔き、EGFRなどの受容体型チロシンキナーゼにおいては自己リン酸化を、そしてIL-5RやIL-6RなどのサイトカインレセプターなどにおいてはJAK1やJAK2の自己リン酸化を、それぞれのタンパク質特異的なリン酸化抗体を用いた免疫染色により検出する。この時、受容体型チロシンキナーゼの自己リン酸化や、JAK1やJAK2の自己リン酸化が見られれば、その酵母はアゴニストとなるペプチドを発現する酵母である。免疫染色には、酵母の細胞壁を除く処理を必要とする。後に、ペプチドを発現させる為に導入したプラスミドを酵母から抽出し、シークエンス解析を行えばペプチド配列を特定できる。
・ランダムなペプチドを発現する酵母をアゴニストを含ませた寒天培地に蒔き、酵母の増殖や蛍光、発色を指標としてレポーター遺伝子の発現を観察する。この時、酵母がレポーター遺伝子を発現しなければ、その酵母はアンタゴニストとなるペプチドを発現する酵母である。後に、ペプチドを発現させる為に導入したプラスミドを酵母から抽出し、シークエンス解析を行えばペプチド配列を特定できる。
・ランダムなペプチドを発現する酵母をアゴニストを含ませた寒天培地に蒔き、EGFRなどの受容体型チロシンキナーゼにおいては自己リン酸化を、そしてIL-5RやIL-6RなどのサイトカインレセプターなどにおいてはJAK1やJAK2の自己リン酸化を、それぞれのタンパク質特異的なリン酸化抗体を用いた免疫染色により検出する。この時、受容体型チロシンキナーゼの自己リン酸化や、JAK1やJAK2の自己リン酸化が見られなければ、その酵母はアンタゴニストとなるペプチドを発現する酵母である。免疫染色には、酵母の細胞壁を除く処理を必要とする。後に、ペプチドを発現させる為に導入したプラスミドを酵母から抽出し、シークエンス解析を行えばペプチド配列を特定できる。
【００３９】
本発明の実施例に示されるように、酵母の細胞壁を溶解させて抗体を作用させることで、酵母の形態を保持した状態で、抗体による検出を行なうことができる。酵母の形を壊さない免疫染色法の利点として、以下が例示される。
・免疫染色には、抗体を用いることが必要となることはいうまでもないが、酵母細胞壁は抗体が非特異的に吸着することが、実施する際に判明した。このことから、酵母細胞壁を除く処理が必要とされた。
・酵母細胞壁を除く処理を実施するとき、スクリーニング対象である化合物、タンパク質、あるいはペプチド依存的に、ＥＧＦＲの自己リン酸化あるいはＪＡＫ１やＪＡＫ２など自己リン酸化が酵母細胞膜上で正確におこっているか観察すれば、擬陽性の排除が可能となり、より高精度なスクリーニングが可能となる。その為、酵母の形を壊さないことが好ましい。
・低分子化合物ないしタンパク質を外部から培養液中に添加する場合、自己リン酸化の有無が酵母細胞表層で正確におこっているかどうか観察することにより、使用した化合物依存的な自己リン酸化が、正確に酵母細胞膜上でおこっているかどうかが判明する。
・酵母自体にランダムなペプチドを組み込んだ場合、一細胞ハンドリング機器、具体的には、セルソーターを内蔵したＦＡＣＳや、同等のシステムを内蔵する目的細胞分取装置を用いれば、自動的に目的細胞をハイスループットで単離することが可能である。この時、ペプチドを発現させる為に導入したプラスミドを酵母から抽出し、シークエンス解析によりペプチド配列を特定する必要があり、酵母の形を壊さないことが絶対条件となる。
・以上のことより、低分子化合物ないしタンパク質を外部から培養液中に添加する場合、また酵母自体にランダムなペプチドを組み込んだ場合のいずれにおいても、酵母細胞膜内近傍の蛍光を検出するのが好ましく、酵母の形を壊さないことが有利である。
【実施例】
【００４０】
以下、本発明を実施例に従いより詳細に説明するが、本発明がこれら実施例に限定されないことはいうまでもない。
実施例１：酵母における上皮成長因子（ＥＧＦ）シグナル伝達再構成用プラスミドの構築
１−１：ＥＧＦ受容体発現プラスミドの構築
一回膜貫通型受容体であるヒト由来ＥＧＦ受容体（ＥＧＦＲ）をコードする遺伝子を用いて、以下のようにｐＧＭＨ２０−ＭＦα−ＦＬＡＧ−ＥＧＦＲを構築した。
【００４１】
１−１−１：ｐＧＭＨ２０−ＭＦα−ＦＬＡＧの構築
酵母の分泌タンパク質ＭＦα１のＰｒｅｐｒｏ配列（J. Bacteriol., 903-906頁, 1983年）をコードする遺伝子を鋳型としたＰＣＲにより、 Ｐｒｅｐｒｏ配列をコードする遺伝子の３’側にＦＬＡＧタグ配列をコードする遺伝子および両末端に制限酵素部位を付加した増幅断片（ａ）を得た。増幅断片（ａ）を制限酵素にて消化し、ｐＧＭＨ２０ベクターに挿入して、ｐＧＭＨ２０−ＭＦα−ＦＬＡＧを得た。
【００４２】
１−１−２：ｐＧＭＨ２０−ＭＦα−ＦＬＡＧ−ＥＧＦＲの構築
ＥＧＦＲ遺伝子をコードするプラスミドを鋳型としたＰＣＲにより、成熟型ＥＧＦＲタンパク質をコードする遺伝子の両末端に制限酵素部位を付加した増幅断片を得た。この増幅断片を制限酵素にて消化し、ｐＧＭＨ２０−ＭＦα−ＦＬＡＧに挿入して、ｐＧＭＨ２０−ＭＦα−ＦＬＡＧ−ＥＧＦＲを得た。
【００４３】
１−２：ＥＧＦ表層提示用プラスミドの構築
ヒト由来のＥＧＦをコードする遺伝子を用いて、以下のようにｐＹＥＳ２−ＭＦα−ＨＡ−ＥＧＦ−ＦＬＯ４２を構築した。
【００４４】
１−２−１：ｐＹＥＳ２−ＭＦα−ＦＬＯ４２の構築
１−１−１で示したようにＭＦα１のＰｒｅｐｒｏ配列をコードする遺伝子を鋳型としたＰＣＲにより、Prepro配列をコードする遺伝子の３’側にＨＡタグ配列をコードする遺伝子および両末端に制限酵素部位を付加した増幅断片（ａ）を得た。酵母の凝集タンパク質ＦＬＯ１遺伝子をコードするプラスミドを鋳型としたＰＣＲにより、ＦＬＯ１のＣ末端側４２アミノ酸残基をコードする遺伝子の両末端に制限酵素部位を付加した増幅断片を得た。これらの増幅断片（ａ）および（ｂ）を制限酵素にて消化し、ｐＹＥＳ２ベクターに挿入して、タンパク質のＮ末端側にＭＦαとＨＡ、およびＣ末端側にＦＬＯ４２が融合して発現させるプラスミドｐＹＥＳ２−ＭＦα−ＨＡ−ＦＬＯ４２を得た。
【００４５】
１−２−２：ｐＹＥＳ２−ＭＦα−ＨＡ−ＥＧＦ−ＦＬＯ４２の構築
ＥＧＦ遺伝子をコードするプラスミドを鋳型としたＰＣＲにより、成熟型ＥＧＦタンパク質をコードする遺伝子の両末端に制限酵素部位を付加した増幅断片を得た。この増幅断片を制限酵素にて消化し、ｐＹＥＳ２−ＭＦα−ＨＡ−ＦＬＯ４２に挿入して、ｐＹＥＳ２−ＭＦα−ＨＡ−ＥＧＦ−ＦＬＯ４２を得た。
【００４６】
１−３：Ｓｏｓ−Ｇｒｂ２発現プラスミドの構築
ＥＧＦの刺激を受けることにより自己リン酸化したＥＧＦＲのリン酸化部位と結合するアダプタータンパク質であるＧｒｂ２をコードする遺伝子を用いて、以下のようにｐＳｏｓ−Ｇｒｂ２を構築した。
【００４７】
１−３−１：ｐＳｏｓ−Ｇｒｂ２の構築
タンパク質のＮ末端側に哺乳動物由来のグアニン−ヌクレオチド交換タンパク質Ｓｏｓを融合して発現させるプラスミドｐＳｏｓベクターをＳｔｒａｔａｇｅｎｅ社より購入した。Ｇｒｂ２遺伝子をコードするプラスミドを鋳型としたＰＣＲにより、Ｇｒｂ２タンパク質をコードする遺伝子の両末端に制限酵素部位を付加した増幅断片を得た。この増幅断片を制限酵素にて消化し、ｐＳｏｓに挿入して、ｐＳｏｓ−Ｇｒｂ２を得た。
【００４８】
実施例２：酵母におけるＥＧＦシグナル伝達再構成例
２−１：酵母形質転換体の作成
酵母Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ Ｄ１ＢＲ２０５ａ株（ＭＡＴａ, ｕｒａ３, ｈｉｓ３, ａｄｅ２, ｌｙｓ２, ｔｒｐ１, ｌｅｕ２, ｃｄｃ２５−２, Ｇａｌ＋）およびＤ１ＢＲ２０５α（ＭＡＴａ, ｕｒａ３, Ｈｉｓ３, ａｄｅ２, ｌｙｓ２, ｔｒｐ１, ｌｅｕ２, ｃｄｃ２５−２, Ｇａｌ＋）をＳｔｒａｔａｇｅｎｅ社より入手した。１のようにして得た各プラスミドｐＹＥＳ２、ｐＹＥＳ２−ＭＦα−ＨＡ−ＥＧＦ−ＦＬＯ４２、ｐＧＭＨ２０、ｐＧＭＨ２０−ＭＦα−ＦＬＡＧ−ＥＧＦＲ、およびｐＳｏｓ−Ｇｒｂ２を、酢酸リチウム法によりＤ１ＢＲ２０５株に導入し、酵母形質転換体Ｄ１ＢＲ２０５／ｐＹＥＳ２／ｐＧＭＨ２０／ｐＳｏｓ、Ｄ１ＢＲ２０５／ｐＹＥＳ２／ｐＧＭＨ２０／ｐＳｏｓ−Ｇｒｂ２、Ｄ１ＢＲ２０５／ｐＹＥＳ２−ＭＦα−ＨＡ−ＥＧＦ−ＦＬＯ４２／ｐＧＭＨ２０／ｐＳｏｓ−Ｇｒｂ２、Ｄ１ＢＲ２０５／ｐＹＥＳ２／ｐＧＭＨ２０−ＭＦα１−ＦＬＡＧ−ＥＧＦＲ／ｐＳｏｓ−Ｇｒｂ２、およびＤ１ＢＲ２０５／ｐＹＥＳ２−ＭＦα−ＨＡ−ＥＧＦ−ＦＬＯ４２／ｐＧＭＨ２０−ＭＦα−ＦＬＡＧ−ＥＧＦＲ／ｐＳｏｓ−Ｇｒｂ２、のそれぞれを、ＳＤΔＵｒａ／Ｈｉｓ／Ｌｅｕ寒天培地上に得た。
【００４９】
２−２：酵母形質転換体の培養
上記の寒天培地上で、直径２〜３ｍｍに生育した酵母形質転換体のコロニーを３ｍＬのＳＤΔＵｒａ／Ｈｉｓ／Ｌｅｕ液体培地中で２５℃、３００ｒｐｍでＯＤ６００＝１．０〜１．５まで培養した。菌体を回収・洗浄して、５００μＬの滅菌水に懸濁し、１０ｍＬのＳＲＧΔＵｒａ／Ｈｉｓ／Ｌｅｕ液体培地に初期ＯＤ６００＝０．２０になるよう植菌した後、２５℃にて３００ｒｐｍでＯＤ６００＝１．００まで培養した。
【００５０】
２−３：酵母形質転換体におけるＥＧＦ受容体タンパク質の発現および糖鎖修飾の有無の確認
２−２のように培養したＤ１ＢＲ２０５／ｐＹＥＳ２−ＭＦα−ＨＡ−ＥＧＦ−ＦＬＯ４２／ｐＧＭＨ２０−ＭＦα−ＦＬＡＧ−ＥＧＦＲ／ｐＳｏｓ−Ｇｒｂ２および陰性コントロールのＤ１ＢＲ２０５／ｐＹＥＳ２／ｐＧＭＨ２０／ｐＳｏｓを回収して、２００μＬの溶解液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ （ｐＨ７．３），１５０ｍＭ ＮａＣｌ，１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００，１ｍＭ ＥＧＴＡ，２ｍＭ ＤＴＴ，１個／１０ｍＬ−溶解液）に懸濁し、グラスビーズで破砕して、酵母粗抽出液を得た。１０分間遠心して上清画分および沈殿画分に分離し、上清画分にはＳＤＳと２−メルカプトエタノールをそれぞれ最終濃度０．５％および１％となるよう添加した。沈殿画分には上清画分と等量のＳＤＳと２−メルカプトエタノールをそれぞれ最終濃度０．５％および１％で含む溶解液に再懸濁して、１００℃で１５分間煮た後、１０分間遠心して上清画分を分取した。２００μＬのサンプルに対して１μＬのＮ−Ｇｌｙｃｏｓｉｄａｓｅおよび１μＬのＯ−Ｇｌｙｃｏｓｉｄａｓｅを添加後、３７℃にて０および３０分間反応させ、それぞれの時間についてサンプリングして、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび抗ＦＬＡＧマウスモノクローナル抗体を用いたウェスタンブロットに供した。結果を図２に示す。酵母形質転換体において、脱糖鎖修飾処理前に見られなかったヒト由来ＥＧＦＲのバンドが、処理後に計算分子量付近に確認された。このことから酵母において、ＥＧＦＲタンパク質の発現および糖鎖修飾を受けることが確認された。
【００５１】
２−４：酵母形質転換体における表層提示型ＥＧＦ−ＦＬＯ４２タンパク質の発現および糖鎖修飾の有無の確認
２−３と同様の操作を行ってサンプルを得た後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび抗ＨＡマウスモノクローナル抗体を用いたウェスタンブロットに供した。結果を図２に示す。酵母形質転換体において、ＥＧＦ−ＦＬＯ４２のバンドが、不溶性画分において確認された。不溶性画分には細胞壁が含まれることが報告されており、酵母におけるＥＧＦ−ＦＬＯ４２タンパク質の表層提示に成功したことが示された。
【００５２】
２−５：酵母形質転換体におけるＳｏｓ−Ｇｒｂ２タンパク質の発現
２−３と同様の操作を行ってサンプルを得た後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび抗Ｓｏｓマウスモノクローナル抗体を用いたウェスタンブロットに供した。結果を図２に示す。酵母形質転換体において、Ｓｏｓ−Ｇｒｂ２のバンドが可溶性画分において確認された。２−３および２−４と合わせて、ＥＧＦ、ＥＧＦＲ、およびＳｏｓ−Ｇｒｂ２の発現が酵母において確認された。
【００５３】
２−６：酵母形質転換体におけるＥＧＦ受容体の局在の確認
２−２のように培養したＤ１ＢＲ２０５／ｐＹＥＳ２−ＭＦα−ＨＡ−ＥＧＦ−ＦＬＯ４２／ｐＧＭＨ２０−ＭＦα−ＦＬＡＧ−ＥＧＦＲ／ｐＳｏｓ−Ｇｒｂ２を回収して、４％パラホルムホルムアルデヒドで固定化した後、ソルビトールバッファー（４０ｍＭ リン酸カリウム（ｐＨ６．５），０．５ｍＭ ＭｇＣｌ２，１．２Ｍ ソルビトール）で２回洗浄した。固定化した酵母を５００μＬのソルビトールバッファーに再懸濁し、０．３ｍｇのＺｙｍｏｌｙａｓｅ ２０Ｔを添加後、３７℃にて１０分間反応させ、ソルビトールバッファーで２回洗浄した。１次抗体として抗ＦＬＡＧマウスモノクローナル抗体（クローン Ｍ２）を添加し、１時間反応後に洗浄した。さらに２次抗体としてＣｙ３標識抗マウスＩｇＧヤギポリクローナル抗体を添加し、１時間反応後に洗浄し、蛍光顕微鏡による観察を行った。結果を図３に示す。図３から酵母細胞膜にＥＧＦＲが局在することが確認された。
【００５４】
２−７：ＥＧＦ／ＥＧＦＲ／Ｓｏｓ−Ｇｒｂ２の熱感受性実験
図１に示したように酵母形質転換体に発現させたそれぞれのタンパク質が機能すれば、熱感受性酵母であるＤ１ＢＲ２０５株が３７℃において増殖可能になると期待される。そこで２−２のように培養したＤ１ＢＲ２０５／ｐＹＥＳ２／ｐＧＭＨ２０／ｐＳｏｓ−Ｇｒｂ２、Ｄ１ＢＲ２０５／ｐＹＥＳ２−ＭＦα−ＨＡ−ＥＧＦ−ＦＬＯ４２／ｐＧＭＨ２０／ｐＳｏｓ−Ｇｒｂ２、Ｄ１ＢＲ２０５／ｐＹＥＳ２／ｐＧＭＨ２０−ＭＦα１−ＦＬＡＧ−ＥＧＦＲ／ｐＳｏｓ−Ｇｒｂ２、およびＤ１ＢＲ２０５／ｐＹＥＳ２−ＭＦα−ＨＡ−ＥＧＦ−ＦＬＯ４２／ｐＧＭＨ２０−ＭＦα−ＦＬＡＧ−ＥＧＦＲ／ｐＳｏｓ−Ｇｒｂ２を、培養液原液、１０、１００、および１０００倍希釈してＳＲＧΔＵｒａ／Ｈｉｓ／Ｌｅｕ寒天培地上に１０μｌずつ滴下し、３７℃で１４日間培養した。結果を図４に示す。
【００５５】
熱感受性実験の結果、酵母においてＥＧＦシグナル伝達再構成に必要と考えられるＥＧＦ−ＦＬＯ４２、ＥＧＦＲ、およびＳｏｓ−Ｇｒｂ２を全て発現させた酵母形質転換体においてのみ、３７℃における増殖が確認された。このことから、酵母において発現させた表層提示型ＥＧＦのシグナルをＥＧＦＲが受け、Ｓｏｓ−Ｇｒｂ２にシグナルが流れていると考えられた。Ｇｒｂ２がＥＧＦＲに結合するには、ＥＧＦＲが自己リン酸化されている必要があり、本実験の結果から、ＥＧＦＲの自己リン酸化も酵母内において哺乳動物と同様に生じていると思われた。そこで次に、ＥＧＦＲの自己リン酸化を免疫染色により確かめた。
【００５６】
２−７：ＥＧＦＲの自己リン酸化の確認
２−２のように培養したＤ１ＢＲ２０５／ｐＹＥＳ２／ｐＧＭＨ２０／ｐＳｏｓ−Ｇｒｂ２、Ｄ１ＢＲ２０５／ｐＹＥＳ２／ｐＧＭＨ２０−ＭＦα１−ＦＬＡＧ−ＥＧＦＲ／ｐＳｏｓ−Ｇｒｂ２、およびＤ１ＢＲ２０５／ｐＹＥＳ２−ＭＦα−ＨＡ−ＥＧＦ−ＦＬＯ４２／ｐＧＭＨ２０−ＭＦα−ＦＬＡＧ−ＥＧＦＲ／ｐＳｏｓ−Ｇｒｂ２を回収し、２−６のように細胞壁を除去した。１次抗体として抗リン酸化ＥＧＦＲウサギポリクローナル抗体を添加し、１時間反応後に洗浄した。さらに２次抗体としてＡｌｅｘａ４８８標識抗ウサギＩｇＧヤギポリクローナル抗体を添加し、１時間反応後に洗浄し、蛍光顕微鏡による観察を行った。結果を図５に示す。図５のように、Ｄ１ＢＲ２０５／ｐＹＥＳ２／ｐＧＭＨ２０−ＭＦα１−ＦＬＡＧ−ＥＧＦＲ／ｐＳｏｓ−Ｇｒｂ２では自己リン酸化は見られなかったが、Ｄ１ＢＲ２０５／ｐＹＥＳ２−ＭＦα−ＨＡ−ＥＧＦ−ＦＬＯ４２／ｐＧＭＨ２０−ＭＦα−ＦＬＡＧ−ＥＧＦＲ／ｐＳｏｓ−Ｇｒｂ２では自己リン酸化が確認された。この結果から、酵母においてＥＧＦＲの自己リン酸化がＥＧＦ依存的に生じていることが判明した。酵母においてＥＧＦ依存的なＥＧＦＲの自己リン酸化を検出したのは本実施例が初めてである。このことは、アゴニストによりひきおこされる受容体の自己リン酸化を抗体により検出することにより、アゴニストを化合物ライブラリーからスクリーニングすることが可能であることを示す。またｐＹＥＳ２−ＭＦα−ＨＡ−ＥＧＦ−ＦＬＯ４２に含まれるＥＧＦ遺伝子をコードする部位をペプチドにすれば、ＥＧＦＲと親和性のあるペプチドのハイスループットスクリーニングが可能である。
【００５７】
実施例３：酵母におけるＩＬ−５シグナル伝達再構成用プラスミドの構築
３−１：ＩＬ−５受容体発現プラスミドの構築
一回膜貫通型サイトカイン受容体であるヒト由来ＩＬ−５受容体α鎖（ＩＬ−５Ｒα）遺伝子をコードするプラスミドｐＭＥ１８ Ｈｙｇ−ｈｕＩＬ−５Ｒ（Ｊ. Ｉｍｍｕｎｏｌ．， ６９２４-６９３２頁, １９９３年）およびヒト由来ＩＬ−５受容体β鎖（βｃ）遺伝子をコードするプラスミドｐＭＥ１８−ＫＨ９７（Ｊ. Ｂｉｏｌ. Ｃｈｅｍ．， ２８２８７-２８２９３頁, １９９６年）を用いて、以下のようにｐＧＭＨ２０−ＭＦα−ＦＬＡＧ−ＩＬ５ＲαおよびｐＧＭＴ２０−ＭＦα−ＨＡ−βｃを構築した。
【００５８】
３−１−１：ｐＧＭＨ２０−ＭＦα−ＦＬＡＧおよびｐＧＭＴ２０−ＭＦα−ＨＡの構築
酵母の分泌タンパク質ＭＦα１のＰｒｅｐｒｏ配列（Ｊ. Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．， ９０３−９０６頁, １９８３年）をコードする遺伝子を鋳型としたＰＣＲにより、Ｐｒｅｐｒｏ配列をコードする遺伝子の３’側にＦＬＡＧタグ配列をコードする遺伝子および両末端に制限酵素部位を付加した増幅断片（ａ）を得た。同遺伝子を鋳型としたＰＣＲにより、Ｐｒｅｐｒｏ配列をコードする遺伝子の３’側にＨＡタグ配列をコードする遺伝子および両末端に制限酵素部位を付加した増幅断片（ｂ）を得た。増幅断片（ａ）を制限酵素にて消化し、制限酵素にて消化したｐＧＭＨ２０ベクターに挿入して、ｐＧＭＨ２０−ＭＦα−ＦＬＡＧを得た。増幅断片（ｂ）を制限酵素にて消化し、制限酵素にて消化したｐＧＭＴ２０ベクターに挿入して、ｐＧＭＴ２０−ＭＦα−ＨＡを得た。
【００５９】
３−１−２：ｐＧＭＨ２０−ＭＦα−ＦＬＡＧ−ＩＬ５Ｒの構築
プラスミドｐＭＥ１８ Ｈｙｇ−ｈｕＩＬ−５Ｒを鋳型としたＰＣＲにより、成熟型ＩＬ−５Ｒαタンパク質をコードする遺伝子の両末端に制限酵素部位を付加した増幅断片を得た。この増幅断片を制限酵素にて消化し、制限酵素にて消化したｐＧＭＨ２０−ＭＦα−ＦＬＡＧに挿入して、ｐＧＭＨ２０−ＭＦα−ＦＬＡＧ−ＩＬ５Ｒαを得た。
【００６０】
３−１−３：ｐＧＭＴ２０−ＭＦα−ＨＡ−βｃの構築
プラスミドｐＭＥ１８−ＫＨ９７を鋳型としたＰＣＲにより、成熟型βｃタンパク質をコードする遺伝子の両末端に制限酵素部位を付加した増幅断片を得た。この増幅断片を制限酵素にて消化し、制限酵素にて消化したｐＧＭＴ２０−ＭＦα−ＨＡに挿入して、ｐＧＭＨ２０−ＭＦα−ＨＡ−βｃを得た。
【００６１】
３−２：ＪＡＫ２発現プラスミドの構築
ＩＬ−５の刺激をうけて自己リン酸化するプロテインチロシンキナーゼであるマウス由来ＪＡＫ２遺伝子をコードするプラスミドｐＳＲα−ＪＡＫ２（Ｇｅｎｅｓ ｔｏ Ｃｅｌｌｓ， ４３１−４４１頁, １９９８年）を用いて、以下のようにｐＡＵＲ１２３−Ｖ５−ＪＡＫ２およびｐＡＵＲＧＡＬ１ｐ−Ｖ５−ＪＡＫ２を構築した。
【００６２】
３−２−１：ｐＡＵＲ１２３−Ｖ５およびｐＡＵＲＧＡＬ１ｐ−Ｖ５の構築
ガラクトース誘導型プロモーターであるＧＡＬ１ｐ遺伝子をコードするｐＹＥＳ２ベクターを鋳型としたＰＣＲにより、ＧＡＬ１ｐ遺伝子をコードする増幅断片（ａ）を得た。非誘導型プロモーターであるＡＤＨ１ｐ遺伝子をコードするｐＡＵＲ１２３ベクターを鋳型としたＰＣＲにより、ＡＤＨ１ｐを欠失した増幅断片（ｂ）を得た。増幅断片（ａ）をＫｐｎＩにて消化し、ＫｐｎＩにて消化した増幅断片（ｂ）に挿入して、ｐＡＵＲＧＡＬ１ｐベクターを得た。ＫｐｎＩおよびＳａｌＩにて消化したｐＡＵＲ１２３ベクターおよびｐＡＵＲＧＡＬ１ｐベクターに、Ｖ５タグ配列をコードする遺伝子を挿入して、それぞれｐＡＵＲ１２３−Ｖ５およびｐＡＵＲＧＡＬ１ｐ−Ｖ５を得た。
【００６３】
３−２−２：ｐＧＥＭ−ＪＡＫ２の構築
プラスミドｐＳＲα−ＪＡＫ２を鋳型としたＰＣＲにより、ＪＡＫ２遺伝子をコードする増幅断片を得た。この増幅断片の３’側にＴＡｒｇｅｔ Ｃｌｏｎｅ（ＴＯＹＯＢＯ）を用いてアデニンを付加し、これをｐＧＥＭ Ｔ−Ｅａｓｙベクターに挿入して、ｐＧＥＭ−ＪＡＫ２を得た。
【００６４】
３−２−３：ｐＡＵＲ１２３−Ｖ５−ＪＡＫ２およびｐＡＵＲＧＡＬ１ｐ−Ｖ５−ＪＡＫ２の構築
プラスミドｐＧＥＭ−ＪＡＫ２を鋳型としたＰＣＲにより、ＪＡＫ２タンパク質をコードする遺伝子の両末端に制限酵素部位を付加した増幅断片を得た。この増幅断片をＳａｌＩおよびＳａｃＩにて消化し、ＳａｌＩおよびＳａｃＩにて消化したｐＡＵＲ１２３−Ｖ５ベクターおよびｐＡＵＲＧＡＬ１ｐ−Ｖ５ベクターに挿入して、ｐＡＵＲ１２３−Ｖ５−ＪＡＫ２およびｐＡＵＲＧＡＬ１ｐ−Ｖ５−ＪＡＫ２を得た。
【００６５】
実施例４：酵母におけるＩＬ−５シグナル伝達再構成例
４−１：酵母形質転換体の作成
酵母Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ Ｄ１ＢＲ２０５ａ株（ＭＡＴａ ｕｒａ３ Ｈｉｓ３ ａｄｅ２ ｌｙｓ２ ｔｒｐ１ ｌｅｕ２ ｃｄｃ２５ Ｇａｌ＋）およびＤ１ＢＲ２０５α（ＭＡＴａ ｕｒａ３ Ｈｉｓ３ ａｄｅ２ ｌｙｓ２ ｔｒｐ１ ｌｅｕ２ ｃｄｃ２５ Ｇａｌ＋）をＳｔｒａｔａｇｅｎｅ社より入手した。
【００６６】
１のようにして得た各プラスミドｐＧＭＨ２０、ｐＧＭＨ２０−ＭＦα−ＦＬＡＧ−ＩＬ５Ｒα、ｐＧＭＴ２０、ｐＧＭＴ２０−ＭＦα−ＨＡ−βｃ、ｐＡＵＲ１２３、ｐＡＵＲ１２３−Ｖ５−ＪＡＫ２、ｐＡＵＲＧＡＬ１ｐ、およびｐＡＵＲＧＡＬ１ｐ−Ｖ５−ＪＡＫ２を、酢酸リチウム法によりＤ１ＢＲ２０５株に導入し、酵母形質転換体Ｄ１ＢＲ２０５／ｐＧＭＨ２０／ｐＧＭＴ２０／ｐＡＵＲ１２３、Ｄ１ＢＲ２０５／ｐＧＭＨ２０／ｐＧＭＴ２０／ｐＡＵＲ１２３−Ｖ５−ＪＡＫ２、Ｄ１ＢＲ２０５／ｐＧＭＨ２０−ＭＦα１−ＦＬＡＧ−ＩＬ５Ｒα／ｐＧＭＴ２０−ＭＦα−ＨＡ−βｃ／ｐＡＵＲ１２３−Ｖ５−ＪＡＫ２、Ｄ１ＢＲ２０５／ｐＧＭＨ２０／ｐＧＭＴ２０／ｐＡＵＲＧＡＬ１ｐ、Ｄ１ＢＲ２０５／ｐＧＭＨ２０／ｐＧＭＴ２０／ｐＡＵＲＧＡＬ１ｐ−Ｖ５−ＪＡＫ２、およびＤ１ＢＲ２０５／ｐＧＭＨ２０−ＭＦα−ＦＬＡＧ−ＩＬ５Ｒα／ｐＧＭＴ２０−ＭＦα−ＨＡ−βｃ／ｐＡＵＲＧＡＬ１ｐ−Ｖ５−ＪＡＫ２のそれぞれを、０．５μｇ／ｍｌのオーレオバシジンＡ（TaKaRa）を含むＳＤΔＨｉｓ／Ｔｒｐ寒天培地上に得た。
【００６７】
４−２：酵母形質転換体の培養
上記の寒天培地上で、直径２〜３ｍｍに生育した酵母形質転換体のコロニーを０．５μｇ／ｍｌのオーレオバシジンＡを含む３ｍＬのＳＤΔＨｉｓ／Ｔｒｐ液体培地中で、２５℃にて３００ｒｐｍでＯＤ６００＝１．０〜１．５まで培養した。菌体を回収・洗浄して、５００μＬの滅菌水に懸濁し、０．５μｇ／ｍｌのオーレオバシジンＡを含む１０ｍＬのＳＲＧΔＨｉｓ／Ｔｒｐ液体培地に初期ＯＤ６００＝０．２０になるよう植菌した後、２５℃にて３００ｒｐｍでＯＤ６００＝０．３０〜２．００まで培養した。
【００６８】
４−３：酵母形質転換体におけるＩＬ−５Ｒαタンパク質の発現および糖鎖修飾の有無の確認
４−２のように培養したＤ１ＢＲ２０５／ｐＧＭＨ２０−ＭＦα１−ＦＬＡＧ−ＩＬ５Ｒα／ｐＧＭＴ２０−ＭＦα−ＨＡ−βｃ／ｐＡＵＲ１２３−Ｖ５−ＪＡＫ２および陰性コントロールのＤ１ＢＲ２０５／ｐＧＭＨ２０／ｐＧＭＴ２０／ｐＡＵＲ１２３を回収して、２００μＬの溶解液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ （ｐＨ７．３），１５０ｍＭ ＮａＣｌ，０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００，１ｍＭ ＥＧＴＡ，２ｍＭ ＤＴＴ，１個／１０ｍＬ−溶解液）に懸濁し、グラスビーズで破砕して、酵母粗抽出液を得た。１０分間遠心して上清画分および沈殿画分に分離し、上清画分にはＳＤＳと２−ＭＥをそれぞれ０．５％（Ｖ／Ｖ）および１％（Ｖ／Ｖ）となるよう添加した。沈殿画分には上清画分と等量のＳＤＳと２−ＭＥをそれぞれ０．５％（Ｖ／Ｖ）および１％（Ｖ／Ｖ）で含む溶解液に再懸濁して、１００℃で１５分間煮た後、１０分間遠心して上清画分を分取した。５０μＬのサンプルに対して５０μＬのＯ−グリコシダーゼおよび５０μＬのＮ−グリコシダーゼを添加後、３７℃にて０、１０、３０、および６０分間反応させ、それぞれの時間についてサンプリングして、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび抗ＦＬＡＧマウスモノクローナル抗体（クローン Ｍ２）を用いたウェスタンブロットに供した（図８）。これまでに酵母における一回膜貫通型サイトカイン受容体の発現に成功した例はない。本実施例において初めて、酵母でのヒト由来サイトカイン受容体ＩＬ−５Ｒαタンパク質の発現が確認された。また、脱糖鎖修飾処理により、ＩＬ−５Ｒαタンパク質の計算分子量より大きい位置に見られたバンドが、計算分子量付近の位置にシフトした。このことから酵母において、ＩＬ−５Ｒαタンパク質は酵母内において糖鎖修飾を受けることがわかった。
【００６９】
４−４：酵母形質転換体におけるβｃタンパク質の発現および糖鎖修飾の有無の確認
４−３と同様の操作を行ってサンプルを得た後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび抗ＨＡマウスモノクローナル抗体（クローン １２ＣＡ５）を用いたウェスタンブロットに供した（図９）。酵母形質転換体において、脱糖鎖修飾処理前に見られなかったヒト由来βｃのバンドが、処理後に計算分子量付近に確認された。このことから酵母において、βｃタンパク質の発現および糖鎖修飾を受けることが確認された。２−３において、ＩＬ−５Ｒαの発現が確認されたこととあわせて、ＩＬ−５受容体の発現が酵母において確認された。
【００７０】
４−５：酵母形質転換体におけるＩＬ−５受容体の局在の確認
４−２のように培養したＤ１ＢＲ２０５／ｐＧＭＨ２０−ＭＦα−ＦＬＡＧ−ＩＬ５Ｒα／ｐＧＭＴ２０−ＭＦα−ＨＡ−βｃ／ｐＡＵＲ１２３−Ｖ５−ＪＡＫ２および陰性コントロールのＤ１ＢＲ２０５／ｐＧＭＨ２０／ｐＧＭＴ２０／ｐＡＵＲ１２３を回収して、４％パラホルムホルムアルデヒドで固定化した後、ソルビトールバッファー（４０ｍＭ リン酸カリウム（ｐＨ６．５），０．５ｍＭ ＭｇＣｌ２，１．２Ｍ ソルビトール）で２回洗浄した。固定化した酵母を５００μＬのソルビトールバッファーに再懸濁し、０．３ｍｇの細胞壁除去酵素Ｚｙｍｏｌｙａｓｅ ２０Ｔを添加後、３７℃にて３０分間反応させ、ソルビトールバッファーで２回洗浄した。細胞壁を除去した酵母をソルビトールバッファーに懸濁し、１次抗体として抗ＦＬＡＧマウスモノクローナル抗体（クローン Ｍ２）および抗ＨＡラビットポリクローナル抗体を添加し、１時間反応後に洗浄した。さらに２次抗体としてＣｙ３標識抗マウスＩｇＧヤギポリクローナル抗体およびＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４３０標識抗ラビットＩｇＧヤギポリクローナル抗体を添加し、１時間反応後に洗浄し、蛍光顕微鏡による観察を行った。結果を図１０に示す。
【００７１】
細胞壁を除去したＤ１ＢＲ２０５／ｐＧＭＨ２０−ＭＦα−ＦＬＡＧ−ＩＬ５Ｒα／ｐＧＭＴ２０−ＭＦα−ＨＡ−βｃ／ｐＡＵＲ１２３−Ｖ５−ＪＡＫ２において、ＩＬ−５Ｒαおよびβｃは細胞膜に局在することが確認された。このことから、ヒト由来ＩＬ−５受容体の酵母細胞膜上への局在化が成功したと考えられる。
【００７２】
４−６：酵母形質転換体におけるＪＡＫ２タンパク質の発現の確認
４−２のように培養したＤ１ＢＲ２０５／ｐＧＭＨ２０／ｐＧＭＴ２０／ｐＡＵＲ１２３−Ｖ５−ＪＡＫ２、Ｄ１ＢＲ２０５／ｐＧＭＨ２０／ｐＧＭＴ２０／ｐＡＵＲＧＡＬ１ｐ−Ｖ５−ＪＡＫ２、陰性コントロールのＤ１ＢＲ２０５／ｐＧＭＨ２０／ｐＧＭＴ２０／ｐＡＵＲ１２３、およびＤ１ＢＲ２０５／ｐＧＭＨ２０／ｐＧＭＴ２０／ｐＡＵＲＧＡＬ１ｐを回収して、２００μＬの溶解液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ （ｐＨ７．３），１５０ｍＭ ＮａＣｌ，０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００，１ｍＭ ＥＧＴＡ，２ｍＭ ＤＴＴ，Ｃomplete protease inhibitor cocktail １個／１０ｍＬ−溶解液）に懸濁し、グラスビーズで破砕して、酵母粗抽出液を得た後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび抗Ｖ５マウスモノクローナル抗体（クローン Ｖ５−１０）および抗リン酸化ＪＡＫ２ラビットポクローナル抗体を用いたウェスタンブロットに供した（図１１）。ＪＡＫ２の発現は、Ｄ１ＢＲ２０５／ｐＧＭＨ２０／ｐＧＭＴ２０／ｐＡＵＲ１２３−Ｖ５−ＪＡＫ２ではＯＤ６００＝２．０で確認され、Ｄ１ＢＲ２０５／ｐＧＭＨ２０／ｐＧＭＴ２０／ｐＡＵＲＧＡＬ１ｐ−Ｖ５−ＪＡＫ２ではＯＤ６００＝０．６で確認され、ＯＤ６００＝２．０で高発現することがわかった。
【００７３】
４−７：ＩＬ−５依存的なＪＡＫ２の自己リン酸化亢進の確認
４−６で示したＪＡＫ２の自己リン酸化が、ヒト由来のリガンドであるＩＬ−５依存的に酵母内で起こるかどうか以下のように実施した。４−２のように培養したＤ１ＢＲ２０５／ｐＧＭＨ２０−ＭＦα−ＦＬＡＧ−ＩＬ５Ｒα／ｐＧＭＴ２０−ＭＦα−ＨＡ−βｃ／ｐＡＵＲ１２３−Ｖ５−ＪＡＫ２、Ｄ１ＢＲ２０５／ｐＧＭＨ２０−ＭＦα−ＦＬＡＧ−ＩＬ５Ｒα／ｐＧＭＴ２０−ＭＦα−ＨＡ−βｃ／ｐＡＵＲＧＡＬ１ｐ−Ｖ５−ＪＡＫ２、陰性コントロールのＤ１ＢＲ２０５／ｐＧＭＨ２０／ｐＧＭＴ２０／ｐＡＵＲ１２３、およびＤ１ＢＲ２０５／ｐＧＭＨ２０／ｐＧＭＴ２０／ｐＡＵＲＧＡＬ１ｐを回収・洗浄して、最終濃度２０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０）および最終濃度０．５μｇ／ｍｌのオーレオバシジンＡを含む１ｍＬのＳＲＧΔＨｉｓ／Ｔｒｐ液体培地に置換し、ＩＬ−５を最終濃度４ｎＭとなるよう添加して０ｈ、１ｈ反応させた。反応後、上記４％パラホルムアルデヒドで固定化後、細胞壁を除去したＤ１ＢＲ２０５／ｐＧＭＨ２０−ＭＦα−ＦＬＡＧ−ＩＬ５Ｒα／ｐＧＭＴ２０−ＭＦα−ＨＡ−βｃ／ｐＡＵＲ１２３−Ｖ５−ＪＡＫ２、Ｄ１ＢＲ２０５／ｐＧＭＨ２０−ＭＦα−ＦＬＡＧ−ＩＬ５Ｒα／ｐＧＭＴ２０−ＭＦα−ＨＡ−βｃ／ｐＡＵＲＧＡＬ１ｐ−Ｖ５−ＪＡＫ２、陰性コントロールのＤ１ＢＲ２０５／ｐＧＭＨ２０／ｐＧＭＴ２０／ｐＡＵＲ１２３、およびＤ１ＢＲ２０５／ｐＧＭＨ２０／ｐＧＭＴ２０／ｐＡＵＲＧＡＬ１ｐをソルビトールバッファーに懸濁し、１次抗体として抗リン酸化ＪＡＫ２ラビットポリクローナル抗体を添加し、１時間反応後に洗浄した。さらに２次抗体Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８標識抗ラビットＩｇＧヤギポリクローナル抗体を添加し、１時間反応後に洗浄し、蛍光顕微鏡による観察およびフローサイトメーター（ＦＣＭ）による解析を行った。図１２のように、ＯＤ６００＝２．０のＤ１ＢＲ２０５／ｐＧＭＨ２０−ＭＦα−ＦＬＡＧ−ＩＬ５Ｒα／ｐＧＭＴ２０−ＭＦα−ＨＡ−βｃ／ｐＡＵＲ１２３−Ｖ５−ＪＡＫ２および陰性コントロールのＤ１ＢＲ２０５／ｐＧＭＨ２０／ｐＧＭＴ２０／ｐＡＵＲ１２３にＩＬ−５を添加して１時間反応培養後にＩＬ−５依存的な蛍光強度の亢進が確認された。以上の結果より、アゴニスト依存的なＪＡＫ２のリン酸化が酵母でおこることを示すことが出来た。
【図面の簡単な説明】
【００７４】
【図１】酵母細胞シグナル伝達を応用したスクリーニング法
【図２】ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび抗ＦＬＡＧマウスモノクローナル抗体を用いたウェスタンブロットの結果を示す。
【図３】酵母形質転換体におけるＥＧＦ受容体の局在の確認
【図４】酵母においてＥＧＦシグナル伝達再構成に必要と考えられるＥＧＦ−ＦＬＯ４２、ＥＧＦＲ、およびＳｏｓ−Ｇｒｂ２を全て発現させた酵母形質転換体においてのみ、３７℃における増殖が確認されたことを示す。
【図５】ＥＧＦＲの自己リン酸化の確認
【図６】抗リン酸化ＪＡＫ２抗体を用いたリガンドスクリーニング法
【図７】酵母細胞シグナル伝達を応用したスクリーニング法、ＩＬ−５レセプター
【図８】ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび抗ＦＬＡＧマウスモノクローナル抗体（クローン Ｍ２）を用いたウェスタンブロットの結果を示す。
【図９】ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび抗ＨＡマウスモノクローナル抗体（クローン １２ＣＡ５）を用いたウェスタンブロットの結果を示す。
【図１０】酵母形質転換体におけるＩＬ−５受容体の局在の確認
【図１１】酵母形質転換体におけるＪＡＫ２タンパク質の発現の確認
【図１２】ＩＬ−５依存的なＪＡＫ２の自己リン酸化亢進の確認
【特許請求の範囲】
【請求項１】
アゴニスト／アンタゴニストのスクリーニング方法であって、哺乳類の自己リン酸化型受容体と、リン酸化された該受容体を認識可能なアダプタータンパク質を共発現する酵母に前記受容体のアゴニスト／アンタゴニスト候補物質を作用させ、該アゴニスト／アンタゴニスト候補物質が該受容体に結合している酵母を検出する工程を含み、前記自己リン酸化型受容体がリガンドの結合により多量体化して、受容体自身のキナーゼ作用もしくは受容体に構成的に結合するチロシンキナーゼの作用により受容体自身および/または受容体に構成的に結合するチロシンキナーゼがリン酸化される、方法。
【請求項２】
前記自己リン酸化型受容体が、リガンドの結合により多量体化して、受容体自身のキナーゼ作用により受容体自身がリン酸化される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記自己リン酸化型受容体がリガンドの結合により多量体化して、受容体に構成的に結合するチロシンキナーゼの作用により受容体自身と受容体に構成的に結合するチロシンキナーゼの両方がリン酸化される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
アゴニスト／アンタゴニストのスクリーニング方法であって、哺乳類の自己リン酸化型受容体を発現する酵母に前記受容体のアゴニスト／アンタゴニスト候補物質を作用させ、該アゴニスト／アンタゴニスト候補物質が該受容体に結合している酵母を検出する工程を含み、
前記自己リン酸化型受容体がアゴニストの結合により多量体化して、受容体自身のキナーゼ作用もしくは受容体に構成的に結合するチロシンキナーゼの作用により受容体自身もしくは受容体に構成的に結合するチロシンキナーゼがリン酸化され、
前記リン酸化の検出は、前記酵母の細胞壁を溶解し、細胞壁溶解酵母に前記リン酸化を検出可能な抗体を作用させることにより行なう、
方法。
【請求項５】
前記自己リン酸化型受容体がアゴニストの結合により多量体化して、受容体自身のキナーゼ作用により受容体自身がリン酸化される、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記自己リン酸化型受容体がアゴニストの結合により多量体化して、受容体に構成的に結合するチロシンキナーゼの作用により受容体自身と受容体に構成的に結合するチロシンキナーゼの両方がリン酸化される、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
哺乳類の自己リン酸化型受容体は、
(i)受容体自身が自己リン酸化作用を有するか、或いは、
(ii)gp130またはβｃを共有し、かつ、チロシンキナーゼがgp130またはβｃに構成的に結合し、該チロシンキナーゼの作用によりチロシンキナーゼ自身とgp130またはβｃの両方をリン酸化する
受容体である、請求項１または４に記載の方法。
【請求項８】
受容体に構成的に結合するチロシンキナーゼがＪＡＫ１，ＪＡＫ２またはＪＡＫ３である請求項１または４に記載の方法。
【請求項９】
チロシンキナーゼが構成的に結合し、かつ、アゴニスト依存的に該チロシンキナーゼがリン酸化される受容体が、インターロイキン受容体のα鎖とβ鎖(βc)を含む、請求項１または４に記載の方法。
【請求項１０】
チロシンキナーゼが構成的に結合し、かつ、アゴニスト依存的に該チロシンキナーゼがリン酸化される受容体が、gp130を含む、請求項１または４に記載の方法。
【請求項１１】
アゴニストの結合により多量体化し、該アゴニストの受容体に構成的に結合するチロシンキナーゼ若しくは受容体自身が有するチロシンキナーゼの作用によりチロシンキナーゼおよび/または受容体自身がリン酸化を受ける哺乳類の自己リン酸化型受容体と、該リン酸化を酵母中で認識可能なアダプタータンパク質を共発現してなる、遺伝子組換え酵母。
【請求項１２】
チロシンキナーゼ作用を有し、かつ、アゴニストの結合により多量体化して自己リン酸化する哺乳類の受容体と、該受容体のリン酸化を認識可能なアダプタータンパク質を共発現する請求項１１に記載の遺伝子組換え酵母。
【請求項１３】
アゴニストの結合により多量体化するβcまたはgp130を共有する受容体と、該受容体に構成的に結合するチロシンキナーゼ（該チロシンキナーゼはアゴニストの結合によりβcまたはgp130とチロシンキナーゼ自身をリン酸化する）と、βc、gp130またはチロシンキナーゼのリン酸化を認識可能なアダプタータンパク質を共発現する請求項１１に記載の遺伝子組換え酵母。
【請求項１４】
アゴニストの結合により多量体化し、該アゴニストの受容体に構成的に結合するチロシンキナーゼ若しくは受容体自身が有するチロシンキナーゼの作用によりチロシンキナーゼおよび/または受容体自身がリン酸化を受ける哺乳類の自己リン酸化型受容体と、前記リン酸化を検出可能な抗体を含む、前記受容体に対するアゴニスト／アンタゴニストをスクリーニングするためのキット。
【請求項１５】
酵母の細胞壁を溶解する酵素をさらに含む請求項１４に記載のキット。
【請求項１６】
アゴニストの結合により多量体化し、該アゴニストの受容体に構成的に結合するチロシンキナーゼ若しくは受容体自身が有するチロシンキナーゼの作用によりチロシンキナーゼおよび/または受容体自身がリン酸化を受ける哺乳類の自己リン酸化型受容体と、前記リン酸化を検出可能な抗体のコンビネーション。
【請求項１７】
アゴニストの結合により多量体化し、該アゴニストの受容体に構成的に結合するチロシンキナーゼ若しくは受容体自身が有するチロシンキナーゼの作用によりチロシンキナーゼおよび/または受容体自身がリン酸化を受ける哺乳類の自己リン酸化型受容体と、酵母の細胞壁を溶解する酵素と、前記リン酸化を検出可能な抗体のコンビネーション。
【請求項１】
アゴニスト／アンタゴニストのスクリーニング方法であって、哺乳類の自己リン酸化型受容体と、リン酸化された該受容体を認識可能なアダプタータンパク質を共発現する酵母に前記受容体のアゴニスト／アンタゴニスト候補物質を作用させ、該アゴニスト／アンタゴニスト候補物質が該受容体に結合している酵母を検出する工程を含み、前記自己リン酸化型受容体がリガンドの結合により多量体化して、受容体自身のキナーゼ作用もしくは受容体に構成的に結合するチロシンキナーゼの作用により受容体自身および/または受容体に構成的に結合するチロシンキナーゼがリン酸化される、方法。
【請求項２】
前記自己リン酸化型受容体が、リガンドの結合により多量体化して、受容体自身のキナーゼ作用により受容体自身がリン酸化される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記自己リン酸化型受容体がリガンドの結合により多量体化して、受容体に構成的に結合するチロシンキナーゼの作用により受容体自身と受容体に構成的に結合するチロシンキナーゼの両方がリン酸化される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
アゴニスト／アンタゴニストのスクリーニング方法であって、哺乳類の自己リン酸化型受容体を発現する酵母に前記受容体のアゴニスト／アンタゴニスト候補物質を作用させ、該アゴニスト／アンタゴニスト候補物質が該受容体に結合している酵母を検出する工程を含み、
前記自己リン酸化型受容体がアゴニストの結合により多量体化して、受容体自身のキナーゼ作用もしくは受容体に構成的に結合するチロシンキナーゼの作用により受容体自身もしくは受容体に構成的に結合するチロシンキナーゼがリン酸化され、
前記リン酸化の検出は、前記酵母の細胞壁を溶解し、細胞壁溶解酵母に前記リン酸化を検出可能な抗体を作用させることにより行なう、
方法。
【請求項５】
前記自己リン酸化型受容体がアゴニストの結合により多量体化して、受容体自身のキナーゼ作用により受容体自身がリン酸化される、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記自己リン酸化型受容体がアゴニストの結合により多量体化して、受容体に構成的に結合するチロシンキナーゼの作用により受容体自身と受容体に構成的に結合するチロシンキナーゼの両方がリン酸化される、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
哺乳類の自己リン酸化型受容体は、
(i)受容体自身が自己リン酸化作用を有するか、或いは、
(ii)gp130またはβｃを共有し、かつ、チロシンキナーゼがgp130またはβｃに構成的に結合し、該チロシンキナーゼの作用によりチロシンキナーゼ自身とgp130またはβｃの両方をリン酸化する
受容体である、請求項１または４に記載の方法。
【請求項８】
受容体に構成的に結合するチロシンキナーゼがＪＡＫ１，ＪＡＫ２またはＪＡＫ３である請求項１または４に記載の方法。
【請求項９】
チロシンキナーゼが構成的に結合し、かつ、アゴニスト依存的に該チロシンキナーゼがリン酸化される受容体が、インターロイキン受容体のα鎖とβ鎖(βc)を含む、請求項１または４に記載の方法。
【請求項１０】
チロシンキナーゼが構成的に結合し、かつ、アゴニスト依存的に該チロシンキナーゼがリン酸化される受容体が、gp130を含む、請求項１または４に記載の方法。
【請求項１１】
アゴニストの結合により多量体化し、該アゴニストの受容体に構成的に結合するチロシンキナーゼ若しくは受容体自身が有するチロシンキナーゼの作用によりチロシンキナーゼおよび/または受容体自身がリン酸化を受ける哺乳類の自己リン酸化型受容体と、該リン酸化を酵母中で認識可能なアダプタータンパク質を共発現してなる、遺伝子組換え酵母。
【請求項１２】
チロシンキナーゼ作用を有し、かつ、アゴニストの結合により多量体化して自己リン酸化する哺乳類の受容体と、該受容体のリン酸化を認識可能なアダプタータンパク質を共発現する請求項１１に記載の遺伝子組換え酵母。
【請求項１３】
アゴニストの結合により多量体化するβcまたはgp130を共有する受容体と、該受容体に構成的に結合するチロシンキナーゼ（該チロシンキナーゼはアゴニストの結合によりβcまたはgp130とチロシンキナーゼ自身をリン酸化する）と、βc、gp130またはチロシンキナーゼのリン酸化を認識可能なアダプタータンパク質を共発現する請求項１１に記載の遺伝子組換え酵母。
【請求項１４】
アゴニストの結合により多量体化し、該アゴニストの受容体に構成的に結合するチロシンキナーゼ若しくは受容体自身が有するチロシンキナーゼの作用によりチロシンキナーゼおよび/または受容体自身がリン酸化を受ける哺乳類の自己リン酸化型受容体と、前記リン酸化を検出可能な抗体を含む、前記受容体に対するアゴニスト／アンタゴニストをスクリーニングするためのキット。
【請求項１５】
酵母の細胞壁を溶解する酵素をさらに含む請求項１４に記載のキット。
【請求項１６】
アゴニストの結合により多量体化し、該アゴニストの受容体に構成的に結合するチロシンキナーゼ若しくは受容体自身が有するチロシンキナーゼの作用によりチロシンキナーゼおよび/または受容体自身がリン酸化を受ける哺乳類の自己リン酸化型受容体と、前記リン酸化を検出可能な抗体のコンビネーション。
【請求項１７】
アゴニストの結合により多量体化し、該アゴニストの受容体に構成的に結合するチロシンキナーゼ若しくは受容体自身が有するチロシンキナーゼの作用によりチロシンキナーゼおよび/または受容体自身がリン酸化を受ける哺乳類の自己リン酸化型受容体と、酵母の細胞壁を溶解する酵素と、前記リン酸化を検出可能な抗体のコンビネーション。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【公開番号】特開２００８−２４５５９２（Ｐ２００８−２４５５９２Ａ）
【公開日】平成２０年１０月１６日（２００８．１０．１６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−９２４９２（Ｐ２００７−９２４９２）
【出願日】平成１９年３月３０日（２００７．３．３０）
【出願人】（３９７０６９８６８）アズワン株式会社 (23)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２０年１０月１６日（２００８．１０．１６）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年３月３０日（２００７．３．３０）
【出願人】（３９７０６９８６８）アズワン株式会社 (23)
【Ｆターム（参考）】
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