薬物送達用に設計されたナノ粒子
本発明は、ミニエマルジョン法によるナノ粒子の製造方法に関連する。反応系に安定剤を所定量加えることにより、前記ナノ粒子は製造される。更に、本発明は、この方法により製造されるナノ粒子、および少なくとも一つの生理学的障壁、特に血液脳関門を通過する医薬品を必要とする疾病および状態の治療のためのそれらの使用に関連する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ミニエマルジョン法によるナノ粒子の製造方法に関連する。反応系に安定剤を所定量加えることにより、前記ナノ粒子は製造される。更に、本発明は、この方法により製造されるナノ粒子、並びに、少なくとも一つの生理学的障壁、特に血液脳関門を通過する医薬品を必要とする疾病および状態を治療するためのそれらの使用に関連する。
【背景技術】
【０００２】
ナノ粒子は、いくつかの疾病、特にガンの検出および治療に新たな希望を提案する。したがって、ナノ粒子は、医薬、特にガンの治療における多くの分野に大きな可能性を持っている。ガン性細胞に直接的に腫瘍致死薬（ｔｕｍｏｒ−ｋｉｌｌｉｎｇ ｄｒｕｇｓ）を送達し、それにより化学療法薬の不要な副作用を回避することへの期待は、医学界において、ナノ粒子への多数の関心を呼んでいる。
【０００３】
また、標的送達（ｔａｒｇｅｔｅｄ ｄｅｌｉｖｅｒｙ）とは別に、ナノ粒子は、ヒトおよび動物の身体の特定の障壁を通過する能力に関して、いくつかの驚異的な効果を示した。例えば、米国特許出願番号０８／２０３，３２６、およびそれに対応する国際特許出願番号ＰＣＴ／ＥＰ９５／００７２４（特許文献１に対応）において、薬物を混合し（取り込み、吸着し、または吸収し）、適切な界面活性剤によるコーティングにより包まれたナノ粒子を用いた手段により、薬物が哺乳類の身体、特にヒトの身体に送達され、血液脳関門を通過して輸送され得ることが報告されている。前記両出願には、前記薬物は、免疫抑制剤または抗ガン剤であってもよいことが教示されている。前記適切な界面活性剤として、一般的に購入可能な界面活性剤、例えば、ポリソルベート８０またはＴｗｅｅｎ８０等が記載されている。
【０００４】
特許文献２もまた、ナノ粒子に関連しており、特許文献１により教示されたナノ粒子／薬物複合体（ｃｏｍｐｌｅｘ）を包む付加的なコーティングを必要としないことを開示している。
【０００５】
従来技術においては、前記ナノ粒子は、一般的に“溶媒中エマルジョン化蒸発技術（ｉｎ−ｓｏｌｖｅｎｔ ｅｍｕｌｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ−ｅｖａｐｏｒａｔｉｏｎ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ）”と呼ばれる技術により調製される。前記技術では、前記取り込まれる医薬品が疎水性または親水性のいずれであるかに応じて、単一の（オイル−イン−ウォーターすなわち水中油滴）または複数のエマルジョン化（ウォーター−イン−オイル−イン−ウォーター）を用いる。
【０００６】
前記ナノ粒子の形成後、前記溶媒を前記エマルジョンから蒸発させる。前記ナノ粒子を、遠心分離または、好ましくは、超遠心（１２０，０００〜１４５，０００ｇ）により残渣から分離後、水で洗浄し、再度遠心後、デカンテーションする。
【０００７】
従来技術から、ミニエマルジョンにおいて、ポリマーへの変換を実施することも公知である。ミニエマルジョンは、例えば、水相、油相および少なくとも一つの界面活性剤の分散系であり、約５０〜５００ｎｍのサイズの滴を有する。前記ミニエマルジョンは、準安定的であると考えられている（非特許文献１および２参照）。これらの分散系は、洗浄剤、化粧品またはボディーケア商品の技術分野において、幅広い応用が見つかっている。
【０００８】
オレフィン性（ｏｌｅｆｉｎｉｃａｌｌｙ）不飽和モノマーのフリーラジカルミニエマルジョン重合法による初期水分散系（ａｑｕｅｏｕｓ ｐｒｉｍａｒｙ ｄｉｓｐｅｒｓｉｏｎｓ）の調製は、例えば、特許文献３または特許文献４および５により公知である。これらの公知の方法の場合において、前記モノマーは、別の低分子量、オリゴマーまたはポリマーの疎水性物質の存在下において、共重合され得る。
【０００９】
ナノ粒子形成の好ましい方法は、Ｋ．Ｌａｎｄｆｅｓｔｅｒにより開発されたミニエマルジョン技術である。
【００１０】
ここで、ミニエマルジョンとは、５０〜５００ｎｍの範囲のサイズで臨界的に安定した油滴の分散系であり、水、界面活性剤（または、“安定剤”）および疎水性物質を含む系をせん断することにより調製される。そのようなミニエマルジョン中におけるモノマーの重合は、最初の滴とほぼ同じサイズを有する粒子をもたらす。前記ミニエマルジョン重合の原理を概要的に図１に示す（非特許文献３〜５）。
【００１１】
特許文献６（特許文献７）は、適切なモノマーの非ラジカルミニエマルジョン重合、好ましくは、重付加を用いた活性成分または活性物質のｉｎ−ｓｉｔｕカプセル封入法による前記活性成分または活性物質を含むポリマーカプセル、ペレット（ｐｅｌｌｅｔ）または滴の製造方法を開示している。前述の方法により生産された前記活性成分または活性物質を含むポリマー媒体システム（ｐｏｌｙｍｅｒ ｖｅｈｉｃｌｅ ｓｙｓｔｅｍ）は、送達システム（ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｓｙｓｔｅｍ）、特に化粧品およびボディーケアの分野、医薬品、接着処理および／または洗浄剤の分野において用いられ得る。
【００１２】
特許文献８は、界面活性剤（Ｓ１）および共界面活性剤（ｃｏ−ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ）（Ｓ２）の補助によって油／水のミクロまたはミニエマルジョンを安定化する方法を開示している。前記（Ｓ２）は、浸透圧的に安定化されたエマルジョンを与えるために、ヘキサデカン、セチルアルコール、ドデシルメルカプタン、長鎖アルキルメタクリレートおよびダイスタッフブルー７０（ｄｙｅｓｔｕｆｆ Ｂｌｕｅ ７０）以外から選択される水に不溶性の化合物からなる。前記特許文献８は、更に、油相、水相、界面活性剤（Ｓ１）および上述した超疎水性の共界面活性剤（Ｓ２）を含む浸透圧的に安定化されたミクロまたはミニエマルジョンを開示している。
【００１３】
特許文献９は、真核細胞中へのＤＮＡトランスフェクションのためのナノ粒子の使用を開示している。前記特許文献９は、更に、ヒトまたは動物の身体における標的臓器へのＤＮＡの投与を開示している。前記特許文献９は、特にヒトまたは動物の身体内の腫瘍に冒された標的臓器、例えば、脳腫瘍の場合における脳に対し、ガン治療に関連するＤＮＡを投与するためのナノ粒子の使用を教示している。前記特許文献９は、ＤＮＡとナノ粒子との結合のエンハンサー（ｅｎｈａｎｃｅｒ）として振舞う物質（“安定剤”）を使用することも開示している。特にジエチルアミノエチル−（ＤＥＡＥ）−デキストランおよびデキストラン７０．０００が、安定剤として記載されている。
【００１４】
しかしながら、特許文献９に記載のそれらのナノ粒子の製造方法は、従来のエマルジョン重合、すなわち、溶媒中のモノマー溶液から直接的にナノ粒子を形成するものでしかない。
【００１５】
【特許文献１】国際公開ＷＯ９５／２２９６３号パンフレット
【特許文献２】国際公開ＷＯ９８／５６３６１号パンフレット
【特許文献３】国際公開ＷＯ９８／０２４６６号パンフレット
【特許文献４】ドイツ公開特許第１９６２８１４３Ａ１号公報
【特許文献５】ドイツ公開特許第１９６２８１４２Ａ１号公報
【特許文献６】国際公開ＷＯ０２／０９８６２号パンフレット
【特許文献７】ドイツ公開特許第１０１０１８９２Ａ１号公報
【特許文献８】ドイツ公開特許第１９８５２７８４Ａ１号公報
【特許文献９】国際公開ＷＯ２００４／０１７９４５号パンフレット
【非特許文献１】Ｅｍｕｌｓｉｏｎ Ｐｏｌｙｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｅｍｕｌｓｉｏｎ Ｐｏｌｙｍｅｒｓ， Ｅｄｉｔｏｒｓ Ｐ． Ａ． Ｌｏｖｅｌｌ ａｎｄ Ｍｏｈａｍｅｄ Ｓ． Ｅｌ−Ａａｓｓｅｒ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ， Ｃｈｉｃｈｅｓｔｅｒ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， Ｗｅｉｎｈｅｉｍ， １９９７， ｐａｇｅ ７００
【非特許文献２】Ｍｏｈａｍｅｄ Ｓ． Ｅｌ−Ａａｓｓｅｒ， Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｅｍｕｌｓｉｏｎ Ｐｏｌｙｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｌａｔｅｘ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， ３０ｔｈ Ａｎｎｕａｌ Ｓｈｏｒｔ Ｃｏｕｒｓｅ， Ｖｏｌｕｍｅ ３， Ｊｕｎ． ７−１１， １９９９， Ｅｍｕｌｓｉｏｎ Ｐｏｌｙｍｅｒｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ， Ｌｅｈｉｇｈ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｂｅｔｈｌｅｈｅｍ， Ｐａ．， ＵＳＡ
【非特許文献３】Ｋ． Ｌａｎｄｆｅｓｔｅｒ， Ｐｏｌｙｒｅａｃｔｉｏｎｓ ｉｎ ｍｉｎｉｅｍｕｌｓｉｏｎｓ， Ｍａｃｒｏｍｏｌ． Ｒａｐｉｄ Ｃｏｍｍ． ２００１， ８９６−９３６．
【非特許文献４】Ｋ． Ｌａｎｄｆｅｓｔｅｒ， Ｎ． Ｂｅｃｈｔｈｏｌｄ， Ｆ． Ｔｉａｒｋｓ， ａｎｄ Ｍ． Ａｎｔｏｎｉｅｔｔｉ， Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ｏｆ ｐｏｌｙｍｅｒｉｚａｂｌｅ ｍｉｎｉｅｍｕｌｓｉｏｎｓ． Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ １９９９， ３２， ５２２２．
【非特許文献５】Ｋ． Ｌａｎｄｆｅｓｔｅｒ， Ｒｅｃｅｎｔ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓ ｉｎ Ｍｉｎｉｅｍｕｌｓｉｏｎｓ − Ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｓｔａｂｉｌｉｔｙ Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ． Ｍａｃｒｏｍｏｌ． Ｓｙｍｐ． ２０００， １５０， １７１
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
そこで、本発明は、媒体（ｖｅｈｉｃｌｅｓ）を高収率で、固形成分として得ることができる、改良された薬物送達媒体（ｄｒｕｇ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｖｅｈｉｃｌｅｓ）の製造方法を提供することを目的とする。更に、本発明は、前記媒体の大規模生産に適した薬物送達媒体の製造方法を提供することを目的とする。更に、本発明は、特に所望の放出特性に適合し得る医薬品用の送達媒体を提供することを目的とする。特に本発明は、医学的状態を変化させるための使用に適し、特に動物またはヒトの身体内の主要な生理学的または生物学的障壁を通過することができ、続いて、標的組織における医薬品の徐放性または遷延性放出等の修飾された放出特性を示す送達媒体を提供することを目的とする。本発明は、ナノ粒子上のコーティングとして、例えば、ポリソルベート８０等の界面活性剤の使用を避けることを付加的な目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
前記目的は、独立形式請求項の内容により達成される。好ましい実施形態は、従属形式請求項により示される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
一般的な所見として、本発明の前記ナノ粒子は、“ミニエマルジョン法”により形成される。このミニエマルジョン法は、それ自体はよく知られており、例えば、前記非特許文献３および、Ｋ． Ｌａｎｄｆｅｓｔｅｒ， Ｎ． Ｂｅｃｈｔｈｏｌｄ， Ｆ． Ｔｉａｒｋｓ， ａｎｄ Ｍ． Ａｎｔｏｎｉｅｔｔｉ， “Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ｏｆ ｐｏｌｙｍｅｒｉｚａｂｌｅ ｍｉｎｉｅｍｕｌｓｉｏｎｓ”中において開示されている。基本的に、この技術は、製造工程の順序が異なる点で、周知の伝統的な方法（例えば、特許文献９において用いられる方法等）とは異なる。この取り組みにおいては、分散された疎水性物質を含むミニエマルジョン、すなわち親水性連続相中にモノマーを含む滴をポリマー粒子に形成する。前記従来の取り組みにおいて、前記ポリマーは、モノマーを含む前記溶液から直接形成される。
【００１９】
このように、本明細書中で用いられる“ミニエマルジョン”という用語は、一般的に、連続的な水（親水性）相と前記連続相中に分散された油（疎水性）相とを含む分散系を形成する技術を意味する。更に、この用語は、１〜１０００ｎｍの範囲、通常、約５０〜５００ｎｍの範囲で形成されるエマルジョン滴（後の重合による粒子のサイズと、同一、またはほぼ同一である）を示す。
【００２０】
更に、前記従来法と前記ミニエマルジョン法とのもう一つの違いは、後者では、２つの液相が前記方法の開始時に接触し、続いてエマルジョンが形成されることである。前記従来のエマルジョン法では、最初に、一方の相の滴が他方の相中に落下するだけである。
【００２１】
前記従来の取り組みの主要な欠点の一つは、約１％のナノ粒子（固体成分）を含む懸濁液しか得られないという事実に見ることができる。対照的に、本発明のミニエマルジョンの取り組みは、２５％ｗ／ｗ（前記Ｏ／Ｗ反応系の重量全体に基づく）のモノマー成分に基づき、１５〜２４％またはそれ以上のナノ粒子の固体成分を得ることができる。このように、固体ナノ粒子の収率は劇的に増加しており、投入したモノマーの約６０〜９６％に該当する。
【００２２】
この方法では、高濃度の固体成分（１５％〜２４％の範囲）のナノ粒子懸濁液を得ることが可能である。このように、収率（６０％〜９６％）が高いことは、スケールアップの観点から非常に重要なことである。前記プロセスは、再現性がある。製造された前記ナノ粒子の平均径は、２００〜３００ｎｍ（１μｍ未満の範囲）である（図２参照）。
【００２３】
一例として、前記油相が、６ｇのモノマー＋２５０ｍｇの疎水性物質からなり、前記水相が、２４ｇの０．０１Ｎ（０．０１ｍｏｌ／Ｌ） 塩酸＋安定剤からなる場合は、固体の最大含有量は、収率１００％に相当し、２５％ｗ／ｗ（６／２４×１００）となる見込みである。含有量が２０％ｗ／ｗであれば、対応する収率は８０％である。この場合、モノマーで表現される残りの２０％は、例えば、容器の表面またはホモジナイザーなどで重合すること等により、重合中に失われる。
【００２４】
本発明と従来の取り組みとの主な違いは、本発明のナノ粒子には、界面活性剤コーティングを用いる必要がないことにある。驚いたことに、少なくとも一つの薬物を輸送する場合、周知の界面活性剤コーティングが、前記ナノ粒子の治療上の安全性において、有害な作用を有しうることが判明している。特に最初に添加された薬物（ナノ粒子に吸収させる）のうち、最高４０重量％が、界面活性剤コーティングにより置き換えられるという実験結果が示された。これにより、ナノ粒子に結合した薬物の量が、容認し難いほど変化し、不明確となり、ナノ粒子をコーティングした薬物の治療効果と信頼性を低下させてしまう。
【００２５】
しかしながら、前記界面活性剤コーティングを省略すると、例えば、血液脳関門等の生理学的障壁を通過するナノ粒子の能力が低下してしまう。このことは、前記界面活性剤コーティングの材料（例えば、Ｔｗｅｅｎ８０）が、血中に存在するＡｐｏＥおよびＡｐｏＡを、それぞれ、吸収できることで、血液脳関門のリポタンパク質受容体へのナノ粒子の提示を可能にするという事実により説明することができる。言い換えると、このことにより、ナノ粒子の受容体媒介エンドサイトーシス（ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｍｅｄｉａｔｅｄ ｅｎｄｏｃｙｔｏｓｉｓ）、およびナノ粒子の前記血液脳関門の通過が導かれる。
【００２６】
したがって、前記ナノ粒子に吸収された薬物の置換を避けるために、単に、前記界面活性剤コーティングを省略するというのには、不都合がある。
【００２７】
そこで、本発明者等は、両問題点を克服するための解決法、すなわち、界面活性剤コーティングの使用に関する欠点を避け、生理学的障壁、特に血液脳関門の通過に関する前記コーティングの好ましい効果を維持する方法を見出した。
【００２８】
従来技術における界面活性剤コーティングを形成するのと同一または類似する界面活性剤を、製造工程において、先に、ナノ粒子内に取り込む。より正確には、前記界面活性剤または安定剤を、重合可能なモノマーの全重量に基づいて１０〜２５重量％の量で、ナノ粒子中に取り込むことが効果的であることが見出されている。従って、本発明の製造方法は、臓器への適用前に界面活性剤を用いて混合する必要がないため、製造工程を大幅に簡略化し、臨床治療の適用を促進する。
【００２９】
したがって、第１の局面において、本発明のナノ粒子の製造方法は、
ａ）油相型および水相型の液相、少なくとも一つの安定剤ならびに重合可能なモノマーを含み、前記少なくとも一つの安定剤を、前記重合可能なモノマーの全重量に基づいて１０〜２５重量％の量で加える反応系を供給する工程と、
ｂ）前記油相滴が前記モノマーを含むＯ／Ｗ型のミニエマルジョンを形成する工程と、
ｃ）ナノ粒子を形成するために前記モノマーを重合する工程とを含み、
前記ナノ粒子に結合可能な少なくとも一つの医薬品を前記ナノ粒子に加えることで、前記少なくとも一つの医薬品によりコーティングされたナノ粒子を製造し、および／または前記工程ａ）において、少なくとも一つの医薬品を加える。
【００３０】
前記少なくとも一つの安定剤の量は、前記重合可能なモノマーの全重量に基づいて１０〜２５重量％であり、すなわち、１０重量％および２５重量％の値を含まないことが好ましい。更に、本明細書中で用いられる“安定剤の量”とは、複数の安定剤を組合せた全体量も含まれることを申し添える。前記１０〜２５重量％の量は、例えば、１０％のドデシル硫酸ナトリウムと１０％のポリソルベート８０とから構成されてもよい（実施例２参照）。
【００３１】
本発明において用いられる“安定剤”という用語は、エマルジョンを安定化することのできる任意の物質を含んでもよい。これらの物質は、界面活性物質、すなわち、界面活性剤であることが好ましい。
【００３２】
別の一局面において、本発明は、前述した工程からなるナノ粒子を製造する方法を提供する。
【００３３】
本発明者等は、本発明のナノ粒子中に取り込まれる安定剤または界面活性剤のできる限り最も広い範囲が、前記重合可能なモノマーの全重量に基づいて、１０〜２５重量％であることを見出した。この範囲は、評価した全ての安定剤（界面活性剤）に当てはまる。この範囲が、前記重合可能なモノマーの全重量に基づいて、１０重量％以下である場合、十分な量におけるナノ粒子の生理学的障壁の通過が十分でないことを示す実験結果により、説明することができる。一方、前記重合可能なモノマーの全重量に基づいて、２５重量％以上用いた場合、容認し難い多量の安定剤（界面活性剤）が、患者の体内に送達されてしまう。
【００３４】
更に、２５重量％以上の安定剤が、重合工程自体の不要な開始を引き起こしてしまうことが判明した。この不都合な事情の結果として、粒子が塊になってしまうため、区別できるナノ粒子が形成されない。
【００３５】
本明細書中で用いられる“反応系”という用語は、前記定義したミニエマルジョンを形成するという要件を満す、任意の環境と定義される。
【００３６】
前述のとおり、前記ミニエマルジョンを調製するためには、例えば、Ｌａｎｄｆｅｓｔｅｒ ｅｔ ａｌ（前記）により開示された既知のエマルジョン技術を用いることができる。この方法は、例えば、まず、モノマー、油相、水相および安定剤（以下で定義する）を組合せて行ってもよい。更に、前記水相は、例えば、適切なｐＨ値にセッティングするための塩酸またはリン酸等の成分を含んでいてもよいことを申し添える。次に、すべての成分を混合するために、前記反応系を、例えば、ホモジナイザー等により混合してもよい。
【００３７】
前記ミニエマルジョンの調製自体は、前記反応系に、例えば、超音波ホモジナイザーおよび高圧ホモジナイザーにより強力なせん断力を適用して行う。更に、前記せん断力は、前記反応系のサイズと使用する前記ホモジナイザーに応じ、２〜５分の範囲の時間で適用してもよい。基本的に、３〜４分の範囲の時間で十分であると認識される。
【００３８】
前記超音波ホモジナイザーは、約６０〜１００％の振幅（ａｍｐｌｉｔｕｄｅ）、好ましくは、約７０〜９０％の振幅を有し得る。
【００３９】
この工程で用いられる温度は、好ましくは、−１〜５℃、好ましくは、０℃である。
【００４０】
一般的に、前記油相と水相の重量比は、１５〜４０％ｗ／ｗの範囲、好ましくは、２０〜３０％ｗ／ｗの範囲、より好ましくは、約２５％ｗ／ｗである。
【００４１】
前記ミニエマルジョンを調製した後、例えば、単に前記ｐＨをｐＨ７．０等の値に増加させることにより前記重合工程を開始する。この方法は、前記反応系においてＰＢＣＡモノマーを用いる場合はいつでも行うことができる。そして、前記ｐＨの増加は、例えば、十分な量の炭酸カリウム（Ｋ２ＣＯ３）を前記反応系に加えることにより、または前記調製したミニエマルジョンを、０．５Ｍ アンモニア（ＮＨ３）水溶液、０．１Ｍ Ｔｒｉｓ−塩基性水溶液、または０．１Ｍ 水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）水溶液からなる塩基性溶液中に注ぐことにより行う。
【００４２】
本発明のナノ粒子は、好ましくは、５０〜５００ｎｍの範囲、より好ましくは、２００〜３００ｎｍの範囲の直径を有する（例えば、図２参照）。一方で、高いモル濃度のリン酸（Ｈ３ＰＯ４）水溶液をミニエマルジョンの調製に用いた場合、粒子径が小さくなることが観察される。
【００４３】
本発明において、驚いたことに、前記ミニエマルジョン法により調製されたナノ粒子が、予期しなかった特徴と利点を有していることが判明した。第一に、前述のとおり、前記製造方法による収率は、従来の製造方法と比較して非常に高い。更に、本発明の方法により製造されたナノ粒子は、その表面に医薬品を結合する改善された能力を有していることが判明した。驚いたことに、この効果は、含まれる医薬品（または、薬物）の特徴とは独立して現れた。
【００４４】
いかなる特定の理論にも拘束されるものではないが、本発明の前記ナノ粒子の三次元構造は、前記ナノ粒子への薬物分子のより安定的な付着を可能にすると推測される。顕微鏡による評価により、ナノ粒子の表面は、滑らかでも均一でもなく、その表面は、クリュー様構造（ｃｒｅｗ−ｌｉｋｅ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ）であることが明らかになった。このクリュー様構造が、物理的または化学的挙動とは独立して、前記ナノ粒子への薬物分子の結合を促進するというのが、本発明者らの見解である。
【００４５】
しかしながら、前記少なくとも一つの医薬品が、必ずしも前記ナノ粒子上にコーティングされなければならないわけではないことも述べておかなければならない。工程ａ）において、前記医薬品を先に加えておくことで、前記医薬品を前記ナノ粒子中に取り込むことも可能である。このことは、医薬品ならびにその化学的および／または物理的特性に依存する。この場合において、前記二つの相中に、前記医薬品を導入することが好ましい。脂溶性の医薬品は、Ｏ型液相に取り込まれ、水溶性の医薬品は、Ｗ型液相中に導入されることが好ましい。両方の取り組みを併用すること、すなわち、工程ａ）において、医薬品を加え、調製後のナノ粒子上に医薬品をコーティングすることも可能である。
【００４６】
好ましい実施形態によれば、前記安定剤は、前記重合可能なモノマーの全重量に基づいて、１２〜２３の量、より好ましくは、１５〜２０重量％の量で添加される。
【００４７】
更なる実施形態によれば、更に、投与後に哺乳動物の体内または体外の標的に前記ナノ粒子の輸送を可能にするために、前記ナノ粒子に媒質を加える工程ｄ）を行う。より好ましくは、前記工程ｄ）は、薬学的組成物の形成において前記ナノ粒子を供給する。
【００４８】
前記薬学的組成物は、投与後に哺乳動物、好ましくは、ヒトの体内の標的に前記ナノ粒子の輸送を可能にする生理学的に許容可能な担体および／または希釈液を含む。前記担体および／または希釈液は、水、塩および／または緩衝液を含む生理学的に許容可能な水溶液、並びに哺乳動物への投与のために許容可能な任意の他の溶液からなる群から選択されることが好ましい。前記担体および希釈液は、この分野の当業者にとって周知であり、蒸留水、脱イオン水、純水、超純水、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を含み、かつ薬物送達システム等における他の成分と相性のよい通常の緩衝液を含む溶液を含む。
【００４９】
ｉｎ ｖｉｖｏにおいてナノ粒子を用いるために、一般的な生理食塩水またはリン酸緩衝水溶液を用いて生理学的なｐＨおよび浸透圧で、前記ナノ粒子を懸濁液に再構成してもよい。
【００５０】
典型的には、前記ナノ粒子は、注射可能な懸濁液中に０．１ｍｇナノ粒子／ｍｌ懸濁液〜１００ｍｇナノ粒子／ｍｌ懸濁液の範囲の濃度で存在する。前記濃度は、１０ｍｇナノ粒子／ｍｌが好ましい。用いられる前記ナノ粒子の量は、個々のナノ粒子に含まれる前記医薬品の量に強く依存し、熟練者または医師であれば、特定の状況に応じて、前記ナノ粒子の用量をあらかじめ適合させることができるであろう。
【００５１】
その他、前記薬学的組成物は、前記本発明の送達媒体を輸送し、別の生理学的障壁、例えば、血液空気関門を通過させるために必要な別の形態をとってもよい。従って、前記薬学的組成物は、吸入により前記組成物を問題の障壁に送達するために、例えば、エアロゾル等の形態を有していてもよい。
【００５２】
前記薬学的組成物は、経口、静脈内、腹腔内、皮下、筋肉内、鼻腔内、肺または直腸投与用の薬物の形態を取ることが好ましく、経口または静脈内投与用の薬物の形態をとることがより好ましい。
【００５３】
本発明の方法において、医薬品を用いて前記ナノ粒子をコーティングする工程は、好ましくは、前記少なくとも一つの医薬品の溶液とともに前記ナノ粒子を混合する工程と、前記少なくとも一つの医薬品の有効量が前記ナノ粒子表面および／または内部に吸収されるために十分な時間放置する工程とを含む。
【００５４】
本発明の方法において用いられる前記油相は、好ましくは、オリーブ油、ミグリオール、ダイズ油および／または、ヘキサデカン、ｎ−ヘキサン、流動パラフィン、ビタミンＥまたはトリグリセリドの脂肪酸エステルから選択される疎水性物質を含む。前記疎水性物質の量は、通常、相対的に少量であり、オストワルド熟成を妨げるのに十分である（前記油相（更に前記モノマーを含む）の全重量に基づいて約２〜２０％ｗ／ｗ）。
【００５５】
前記重合可能なモノマーは、ポリマー材料を形成するために用いられ、ポリアクリレート、ポリメタクリレート、ポリシアノアクリレート、好ましくは、ポリアルキルシアノアクリレート、ポリアリールアミド、ポリラクテート、ポリグリコレート、ポリアンハイドレート、ポリオルトエステル、ゼラチン、ポリサッカライド、アルブミン、ポリスチレン、ポリビニル、ポリアクロレイン、ポリグルタルアルデヒド、並びにそれらの誘導体、コポリマーおよび混合物からなる群から選択されることが好ましい。
【００５６】
好ましいポリマー材料は、固体またはフィルム状のポリマー、好ましくは、ポリアルキルシアノアクリレート、より好ましくは、ポリブチルシアノアクリレート、ポリ乳酸、ポリ酪酸並びにそれらの混合物および誘導体を含んでいる。
【００５７】
本発明において用いられる（生産される）前記ポリマー材料は、生分解性であることが好ましい。この用語は、生体内での使用に適している、すなわち、生物学的に不活性で、生理学的に許容可能で、無毒であることが知られている合成または天然由来のポリマー材料を示している。そして、本発明の前記送達システムでは、前記生分解性ポリマーは、使用環境において生分解され、すなわち、生体に吸収され得る。
【００５８】
ナノ粒子を形成するのに用いられ得るさらなる生分解性ポリマーは、ポリグリコライドおよびポリ乳酸ポリグリコライドコポリマー（ＰＬＧＡ）等のポリエステル；ヒドロキシ終端化ポリ（ε−カプロラクトン）−ポリエーテル、またはポリカプロラクトン（ＰＣＬ）等のポリエーテル；ポリアンヒドリド；ポリアクリルアミド；ポリ（オルトエステル）；ポリアミノ酸；および生分解性ポリウレタン等を含むが、これらに限定されない。ポリマーという前記用語は、コポリマーおよびオリゴマーを含むと解釈するべきである。
【００５９】
一実施形態において、工程ａ）で供給される前記安定剤は、少なくとも一つの下記の物質：
グリセロール、ソルビトールおよび他の一価、または多価アルコールの脂肪酸エステル、好ましくは、ベンジルアルコール、グリセロールモノステアリン酸エステル、ソルビタンモノラウリン酸エステルまたはソルビタンモノオレイン酸エステル；ポリサッカライド、ベンジルベンゾエート、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ２００、３００、４００、５００、６００）、ポリエチレングリコールヒドロキシステアリン酸エステル、好ましくは、ソルトール ＨＳ １５（Ｓｏｌｕｔｏｌ ＨＳ １５）；ポロキサミン（ｐｏｌｏｘａｍｉｎｅ）、好ましくは、ポロキサミン９０４、９０８または１５０８；ポリオキシエチレンエーテルおよびポリオキシエチレンエステル；エトキシトリグリセリド；エトキシフェノールおよびエトキシジフェノール；ポリオキシルカストール油（ｐｏｌｙｏｘｙｌ ｃａｓｔｏｒ ｏｉｌ）、好ましくは、クレモフォール ＥＬＰ（Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ ＥＬＰ）；レシチン（ｌｅｃｉｔｈｉｎ）、脂肪酸の金属塩、脂肪族アルコール硫酸エステルの金属塩；およびスルフォサクシネートの金属塩；好ましくは、ポリソルベート、より好ましくは、ポリソルベート２０、６０、およびもっとも好ましくは、ポリソルベート８０；好ましくは、ポロクサマー（ｐｏｌｏｘａｍｅｒ）、より好ましくは、ポロクサマー１８８、３３８または４０７；好ましくは、ポリオキシエチレングリコール、より好ましくは、ルテンゾール５０または８０；アニオン性界面活性剤、例えば、ドデシル硫酸ナトリウム；および前記物質の少なくとも２つの混合物を含む。
【００６０】
これらの安定剤（または、界面活性剤）のすべての分子構造は、その特性において類似していることを申し添える。
【００６１】
前記ナノ粒子をコーティングするのに用いる前記少なくとも一つの医薬品は、治療薬および診断薬から選択される。
【００６２】
前記治療薬は、送達媒体または担体なしでは生理学的障壁を通過できない物質から選択されることが好ましい。前記生理学的障壁は、限定はしないが、血液脳関門（ｂｂｂ）、血液空気関門、血液脳脊髄液関門および頬粘膜からなる群から選択されることが好ましい。加えて、前記少なくとも一つの治療薬は、中枢神経系活性を有するが送達媒体なしでは血液脳関門を通過し得ない治療薬であってもよい。
【００６３】
本明細書中では、“薬物”と“治療薬”は、交換的に用いられる。
【００６４】
好ましい実施形態によれば、本発明の前記送達媒体は、シナプス部位およびニューロエフェクタージャンクション部位に活性を有する薬物；全身麻酔剤および局所麻酔剤；催眠剤および鎮痛剤；うつ病および総合失調症等の精神病学的異常の治療用の薬物；抗てんかん薬および抗痙攣薬；パーキンソン病、ハンチントン病、老化およびアルツハイマー病治療のための薬物；興奮性アミノ酸拮抗薬、神経栄養因子および神経再生薬；栄養性因子；ＣＮＳ外傷または発作治療を意図した薬物；耽溺性および薬物濫用治療のための薬物；抗肥満薬；オータコイドおよび抗炎症薬；寄生的な感染症および微生物により引き起こされる疾病のための化学療法薬；免疫抑制剤および抗がん剤；ホルモンおよびホルモン拮抗薬；重金属および重金属拮抗薬；非金属性毒素のための拮抗薬；ガン治療のための細胞分裂阻害剤；核医学において用いるための診断物質；免疫活性剤および免疫反応性剤；トランスミッターおよび前記トランスミッターそれぞれのレセプター作用薬およびレセプター拮抗薬、前記トランスミッターそれぞれの前駆物質および代謝物質；輸送体阻害剤；抗生物質；鎮痙薬；抗ヒスタミン薬；吐き気止め薬；弛緩薬；興奮薬；センスオリゴヌクレオチドおよびアンチセンスオリゴヌクレオチド；脳血管拡張薬；向精神薬；抗そう病薬；血管拡張薬および血管収縮薬；降圧薬；偏頭痛治療薬；催眠薬、高血糖薬および低血糖薬；抗喘息薬；抗ウイルス薬、好ましくは、抗ＨＩＶ薬；疾病のＤＮＡ治療、ｓｉ−ＲＮＡ治療またはアンチセンス治療に適した遺伝子材料；およびそれらの混合物からなる群から選択される少なくとも一つの治療薬を含む。
【００６５】
本願の明細書において用いられる“ＤＮＡ”という用語は、基本的には、現在の技術分野において考えられうる任意のＤＮＡに言及する。好ましい実施形態によれば、前記“ＤＮＡ”という用語は、２種類のＤＮＡ、すなわち、プラスミドＤＮＡ、より好ましくは、腫瘍抑制遺伝子の情報を含むプラスミドＤＮＡ、更に好ましくは、腫瘍抑制遺伝子ｐ５３およびｐＲＢの情報を含むプラスミドＤＮＡ、およびもう一つはアンチセンスオリゴヌクレオチド、より好ましくは、ガン遺伝子に対するアンチセンスオリゴヌクレオチド、更に好ましくは、Ｂｃｌ２等のガン遺伝子に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドを含むことを意味する。本発明において、一種類のＤＮＡ（結果として、１種類のＤＮＡを取り込んだナノ粒子）を用いてもよいし、本発明において用いることができる別々の種類のＤＮＡを取り込んだ複数種のナノ粒子を用いた結果として、二種類以上のＤＮＡを用いてもよい。
【００６６】
驚いたことに、ＤＮＡおよび、特に前記２種類のＤＮＡは、ナノ粒子上に吸収され得る。その結果として生じるＤＮＡ−ナノ粒子複合体を、組織、特にガン（特に、限定されないが、脳腫瘍）を患っている組織中に接種することができる。その後、腫瘍増殖の抑制が観られ、腫瘍壊死およびアポトーシスが引き起こされ得る。
【００６７】
本発明の本質的ではない好ましい実施形態において、プロモーターを含むプラスミドＤＮＡ、より好ましくは、誘導プロモーターを含むプラスミドＤＮＡは、前記ナノ粒子上に取り込まれ得る。前記誘導プロモーターを含むＤＮＡを前記ナノ粒子上に取り込み、細胞内で誘導プロモーターを発現させる新規工程により、関連する遺伝子の発現の外部制御を達成し、前記遺伝子のオン−オフを自在に切り替え得る。従来技術からは予期しなかった利点として、遺伝子／ＤＮＡ発現のタイミングを制御できることがあげられる。制御できることにより、持続的な遺伝子の発現による有毒な副作用を減少させ、および／またはネガティブ選択（ｎｅｇａｔｉｖｅ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ）の発生により、細胞が遺伝子産物への抵抗性を持つようになる可能性を低減することができる。
【００６８】
本発明の好ましい実施形態によれば、ヒトのパピローマウイルスの調節領域（ＨＰＶ−ＵＲＲ）を、誘導プロモーターとして用いる。腫瘍抑制因子の発現は、デキサメタゾン（Ｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ）または他の誘導物質もしくは化合物の投与後に誘導される。そのようにして、腫瘍細胞のアポトーシスおよび腫瘍の退行を達成することができる。本発明において用いることのできる他の典型的なプロモーターは、サイトメガリアウイルス（ｃｙｔｏｍｅｇａｌｉａ ｖｉｒｕｓ、ＣＭＶ）プロモーターまたはシミアンウイルス４０（ＳＶ４０）プロモーターである。
【００６９】
更に、腫瘍縮小を含む強力な効果は、一種類のＤＮＡを含む一種類または複数種類のナノ粒子、および細胞増殖抑制効果を有する物質を一種類または複数種類含むナノ粒子を組合せて投与することにより達成することができる。
【００７０】
好ましい実施形態によれば、腫瘍抑制ＤＮＡを、細胞増殖抑制効果を有する化合物を含むナノ粒子複合体の接種に先立って、更に好ましくは、誘導プロモーターの後に、注入してもよい。更に好ましい実施形態によれば、前記細胞増殖抑制効果を有する化合物は、ドキソルビシン（Ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎｅ）である。
【００７１】
なお、細胞へのＤＮＡのトランスフェクション法、およびヒトまたは動物の体内の標的臓器にＤＮＡを投与する方法において、その第１工程として、前述の方法によるナノ粒子の調製を含む。
【００７２】
更なる情報は、ＷＯ２００４／０１７９４５号パンフレットに明確に言及され、その内容は、本明細書中に全体として取り込まれている。
【００７３】
更に、典型的な活性成分（例えば、薬物）は、神経系に影響する任意の物質、または前記神経系の診断テストに用いられる物質であってもよい。これらについては、Ｇｉｌｍａｎ ｅｔ ａｌ． （１９９０）， “Ｇｏｏｄｍａｎ ａｎｄ Ｇｉｌｍａｎ’ｓ − Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ”， Ｐｅｒｇａｍｏｎ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋに記載されており、下記の薬物を含む。
アセチルコリンおよび合成コリンエステル、天然由来のコリン作用性アルカロイドおよびその合成同属体、抗コリンエステラーゼ薬、神経節刺激薬、アトロピン、スコポラミンおよび関連する抗ムスカリン薬類、カテコールアミンならびにエピネフリン、ノルエピネフリンおよびドパミン等の交換神経刺激薬、アドレナリン作用薬、アドレナリン受容体拮抗薬、ＧＡＢＡ、グリシン、グルタミン酸塩、アセチルコリン、ドパミン、５−ヒドロキシトリプタミンおよびヒスタミン、向神経活性ペプチド等のトランスミッター；オピオイド系鎮痛薬等の鎮痛薬および麻酔薬並びに拮抗薬；ベンゾジアゼピン類、バルビツール酸類、抗ヒスタミン薬、フェノチアジンおよびブチルフェノン等の麻酔前投薬および麻酔薬；オピオイド；制吐剤；アトロピン、スコポラミンまたは、グリコピロレート等の抗コリン薬；コカイン；クロラール誘導体；エトクロルビノール；グルテチミド；メチプリロン；メプロバメート；パーアルデヒド；ジスルフィラム；モルヒネ、フェンタニルおよびナロキソン；フェノチアジン、チオキサンチンおよび他のヘテロ環化合物（例えば、ハルペリオドール（ｈａｌｐｅｒｉｏｄｏｌ））等の精神病用薬；デシミプラミンおよびイミプラミンのような三環系抗うつ薬；異型性抗うつ薬（例えば、フルオキセチンおよびトラゾドン）、イソカルボキサジド等のモノアミンオキシダーゼ阻害剤；リチウム塩；クロルジアゼポキシドおよびジアゼパム等の抗不安薬；ヒダントインを含む抗てんかん薬、抗痙攣薬、バルビツール酸類、イミノスチルビン（例えば、カルバマゼピン）、サクシニミド、バルプロ酸、オキサゾリジンジオンおよびベンゾジアゼピン、Ｌ−ＤＯＰＡ／ＣＡＲＢＩＤＯＰＡ、アポモルヒネ、アマタジン、エルゴリン、セレギリン、ロピノロール、ブロモクリプチンメシレートおよび抗コリン薬等の抗パーキンソン病薬；バクロフェン、ヂアゼパムおよびダントロレンのような抗痙攣薬；興奮性アミノ酸拮抗薬等の神経保護薬、神経栄養因子および脳由来の神経栄養因子、繊毛様神経親和性因子、または神経成長因子；ニューロトロフィン（ＮＴ）３（ＮＴ３）；ＮＴ４およびＮＴ５；ガングリオシド；神経再生薬；オピオイド拮抗薬および抗うつ薬を含む耽溺性および薬物濫用治療のための薬物；ヒスタミン、ブラジキニン、カイリジンおよび前記それぞれの作用薬および拮抗薬等のオータコイドおよび抗炎症薬；寄生的な感染症および微生物による疾病のための化学療法薬；アルキル化薬（例えば、ニトロソ尿素）を含む抗がん剤および代謝拮抗物質；ナイトロジェンマスタード、エチレンアミンおよびメチルメラミン；アルキルスルホン酸；葉酸類似体；ピリミジン類似体、プリン類似体、ビンカアルカロイド；フェンジメトラジン、フェンテルミン、ジエチルプロピオン、シブトラミン等の抗肥満薬；ならびに抗生物質
【００７４】
好ましい実施形態によれば、前記診断薬は、核医学および放射線治療の分野の診断における有用な診断薬からなる群から選択される。
【００７５】
本発明の方法の一実施形態において、工程ｃ）後に、前記安定剤を、前記ナノ粒子から少なくとも部分的に除去する工程を含むことが好ましい。ただし、本発明の工程ａ）において示した通り、１０〜２５重量％の範囲が観測されなければならない。
【００７６】
前記追加工程は、透析または遠心分離により行われることが好ましい。驚いたことに、前記安定剤は、前記製造方法自体においては必要とされるが、前記最終のナノ粒子が形成された後には、少なくとも部分的に除去されるのがよいことが判明した。言い換えれば、“過剰な”安定剤は、前記ナノ粒子の安定性を維持するのに必要ではなく、ｉｎ ｖｉｖｏでの適用において潜在的なリスクを引き起こしかねないため、除去しておくのがよい。ｉｎ ｖｉｖｏでのリスクを低減するためには、前記ナノ粒子中における前記安定剤の量は、可能である最低限の量が望ましいと想定される。ただし、前記量が少な過ぎると、前記生理学的障壁を通過するナノ粒子の能力を妨げることになる。
【００７７】
第２の局面において、本発明は、前述した方法により得られるコーティングされたナノ粒子、または薬学的組成物を提供する。
【００７８】
前記コーティングされたナノ粒子、または前記薬学的組成物は、少なくとも一つの生理学的障壁、特に血液脳関門を通過する医薬品を必要とする疾病および状態の治療用薬物を製造するために用いられ得る。
【００７９】
本明細書中で言及した、すべての刊行物、特許出願、特許および他の文献は、参照することにより、全体として取り込まれている。抵触する場合には、定義を含み、本願明細書が支配する。加えて、材料、方法および実施例は、説明のためであって、限定することを意図しない。
【００８０】
本発明を添付の図面によりさらに例示する。
図１は、前記ミニエマルジョン重合技術を示す図である。
図２は、本発明に従って製造されたナノ粒子の写真である。
図３は、実施例１において製造された前記ナノ粒子の粒子径分布の一例である。
図４は、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）により安定化されたポリブチルシアノアクリレートナノ粒子に取り込まれた異なる量のポリソルベート８０（１．４％、２．５％、５％、７．５％および１０％）を示す。得られたナノ粒子懸濁液の粒子径を、光子相関分光法により測定した。得られたナノ粒子懸濁液の粒子径と、ポリソルベート８０の取り込まれた量との関係を示す。
図５は、純粋なＦＩＴＣ−標識されたナノ粒子（本発明に従っていない）を静脈内注射した後のラットの脳組織凍結切片（ｃｒｙｏｓｔａｔｉｃ ｓｌｉｄｅｓ）を示す。
図６は、取り込まれたポリソルベート８０を含むＦＩＴＣ−標識されたＳＤＳ−ナノ粒子（本発明に従った）を静脈内注射した後のラットの脳組織凍結切片（ｃｒｙｏｓｔａｔｉｃ ｓｌｉｄｅｓ）を示す。
図７は、取り込まれたポリソルベート８０を含むＦＩＴＣ−標識されたナノ粒子（本発明に従った）を静脈内注射した後のラットの脳組織凍結切片（ｃｒｙｏｓｔａｔｉｃ ｓｌｉｄｅｓ）を示す。
【実施例】
【００８１】
［実施例１］ミニエマルジョン法を用いたＳＤＳ安定化ポリブチルシアノアクリレートナノ粒子中へのポリソルベート８０の取り込み
【００８２】
２種類の別々の溶液を調製する。
【００８３】
溶液１：
１０ｍｌフラスコ（ＰＰ）に、２．４ｍｌの塩酸（０．１ｍｏｌｌ−１）を加える。つづいて、この溶液に、０．０６ｇのドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、および３０ｍｇのポリソルベート８０を加える。得られた溶液を、透明な溶液が形成されるまで攪拌する。
【００８４】
溶液２：
５ｍｌフラスコに、３２．３μＬのヘキサデカン、および５４５．５μＬ（０．６ｇ）のｎ−ブチル−α−シアノアクリレート（インダーミル（登録商標））を加える。前記フラスコを、均質な溶液が形成されるまで転倒混和する。
【００８５】
前記溶液１に前記溶液２を加え、得られた懸濁液を２分間超音波処理すること（振幅の７０％、０℃）により、ただちにミニエマルジョンが形成される。つづいて、２．４ｍｌの水酸化ナトリウム水溶液（０．１ｍｏｌｌ−１）（１０ｍｌフラスコ）中に、前記ミニエマルジョンを加えて、ｐＨの値を１から７に急速に変えることにより前記モノマー滴の重合が開始される。つづいて、前記得られた懸濁液を５分間攪拌する。前記ナノ粒子懸濁液は、１１１．８ｍｇ／ｍｌの固体成分、および１１８．４±０．７ｎｍの平均粒子径（光子相関分光法）を有する。
【００８６】
［実施例２］ミニエマルジョン法を用いたＳＤＳ安定化ポリブチルシアノアクリレートナノ粒子中へのポリソルベート８０およびＦＩＴＣ−デキストランの取り込み
【００８７】
２種類の別々の溶液を調製する。
【００８８】
溶液１：
１０ｍｌフラスコ（ＰＰ）に、２．４ｍｌの塩酸（０．１ｍｏｌｌ−１）を加える。つづいて、この溶液に、０．０６ｇのドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、６０ｍｇのポリソルベート８０、および９．０ｍｇのフルオレセインイソチオシアネート−デキストラン７７．０００（ＦＩＴＣ−デキストラン）を加える。得られた溶液を、透明な溶液が形成されるまで攪拌する。
【００８９】
溶液２：
５ｍｌフラスコに、３２．３μＬのヘキサデカン、および５４５．５μＬ（０．６ｇ）のｎ−ブチル−α−シアノアクリレート（インダーミル（登録商標））を加える。前記フラスコを、均質な溶液が形成されるまで転倒混和する。
【００９０】
前記溶液１に前記溶液２を加え、得られた懸濁液を２分間超音波処理すること（振幅の７０％、０℃）により、ただちにミニエマルジョンが形成される。つづいて、２．４ｍｌの水酸化ナトリウム水溶液（０．１ｍｏｌｌ−１）（１０ｍｌフラスコ）中に、前記ミニエマルジョンを加えて、ｐＨの値を１から７に急速に変えることにより前記モノマー滴の重合が開始される。つづいて、前記得られた懸濁液を５分間攪拌する。つづいて、得られた標識されたナノ粒子を、結合しなかった可能性のあるＦＩＴＣ−デキストランおよび過剰の安定剤を除去するために透析（１０回）する。前記ナノ粒子懸濁液は、２８．９ｍｇ／ｍｌの固体成分、および２５８．４±７．０ｎｍの平均粒子径（光子相関分光法）を有する。
【００９１】
つづいて、得られた前記ナノ粒子懸濁液を、ｉｎ ｖｉｖｏ実験用に、０．９％の塩化ナトリウム溶液で希釈（１：１）した。
【００９２】
［実施例３］ミニエマルジョン法を用いたポリブチルシアノアクリレートナノ粒子中へのポリソルベート８０およびＦＩＴＣ−デキストランの取り込み
【００９３】
２種類の別々の溶液を調製する。
【００９４】
溶液１：
５０ｍｌフラスコに、０．０３３８ｇ（１．５％）のフルオレセインイソチオシアネート７７．０００（ＦＩＴＣ−デキストラン）、および０．５１３ｇ（２２．７５％）のＴｗｅｅｎ８０を加える。つづいて、９ｍｌのリン酸（０．８ｍｏｌ／ｌ）を加える。得られた溶液を、透明な溶液が形成されるまで３０分間攪拌する。
【００９５】
溶液２：
１０ｍｌフラスコに、０．０９ｇ（４％）のダイズ油を加える。つづいて、２．０５０ｍｌ（２．２５５ｇ）のｎ−ブチル−α−シアノアクリレート（インダーミル（登録商標）、４℃に冷却）を加える。得られた溶液を、ピペットを用いて混和する。
【００９６】
前記溶液１に前記溶液２を加え、得られた懸濁液を４分間超音波処理すること（振幅の７０％、０℃、Ｔｉｔａｎｐｌａｔｅ ＴＴ １３）により、ただちにミニエマルジョンが形成される。つづいて、９ｍｌのアンモニア水溶液（０．５ｍｏｌｌ−１）（５０ｍｌフラスコ）中に、前記ミニエマルジョンを加えてｐＨの値を１から７に急速に変えることにより前記モノマー滴の重合が開始される。つづいて、前記得られた懸濁液を５分間攪拌する。前記ｐＨの値は、ｐＨ計を用いて確認した。アンモニア溶液を、ｐＨ値が７になるように加える。前記ナノ粒子懸濁液は、９７．４６ｍｇ／ｍｌの固体成分、および１５１ｎｍ±１．３１（ＰＤＩ ０．２４４）の平均粒子径（光子相関分光法）を有する。透析（２７回）後のナノ粒子懸濁液は、１４３ｎｍ±１．０（ＰＤＩ ０．２３２）の平均粒子径（光子相関分光法）を有する。取り込まれたＦＩＴＣ−デキストランの量を、ＵＶ分光法を用いて、３３．９８％（１１．４８ｍｇ）と決定した。
【００９７】
実施例３の手順に続く追加選択的な仕様は、
１． Ｔｗｅｅｎ８０：２０％、ダイズ油：４．２％、０．８Ｍ Ｈ３ＰＯ４、０．５Ｍ ＮＨ３、粒子径：１２０ｎｍ、ＰＤＩ：０．１４、固体成分：１００ｍｇ／ｍｌ
２． Ｔｗｅｅｎ８０：２０％、ダイズ油：４．０％、１Ｍ Ｈ３ＰＯ４、０．５Ｍ ＮＨ３、粒子径：１４０ｎｍ、ＰＤＩ：０．１９、固体成分：１１０ｍｇ／ｍｌ
３． Ｔｗｅｅｎ８０：２２．７５％、ダイズ油：４．０％、０．８Ｍ Ｈ３ＰＯ４、０．１Ｍ Ｔｒｉｓ−塩基性（Ｔｒｉｓ−Ｂａｓｅ）、粒子径：１２０ｎｍ、ＰＤＩ：０．１５、固体成分：４０ｍｇ／ｍｌ
４． Ｔｗｅｅｎ８０：２０％、ダイズ油：４．２％、１Ｍ Ｈ３ＰＯ４、０．１Ｍ Ｔｒｉｓ−塩基性（Ｔｒｉｓ−Ｂａｓｅ）、粒子径：１２５ｎｍ、ＰＤＩ：０．１３、固体成分：４５ｍｇ／ｍｌ
である。
【００９８】
つづいて、前記得られたナノ粒子懸濁液を、ｉｎ ｖｉｖｏ実験用に、０．９％の塩化ナトリウム溶液で希釈した。
【００９９】
［比較例］ミニエマルジョン法を用いたＳＤＳ安定化ポリブチルシアノアクリレートナノ粒子中へのＦＩＴＣ−デキストランの取り込み
【０１００】
２種類の別々の溶液を調製する。
【０１０１】
溶液１：
１０ｍｌフラスコ（ＰＰ）に、２．４ｍｌの塩酸（０．１ｍｏｌｌ−１）を加える。つづいて、この溶液に、０．０６ｇのドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、および９．０ｍｇのフルオレセインイソチオシアネート−デキストラン７７．０００（ＦＩＴＣ−デキストラン）を加える。得られた溶液を、透明な溶液が形成されるまで攪拌する。
【０１０２】
溶液２：
５ｍｌフラスコに、３２．３μＬのヘキサデカン、および５４５．５μＬ（０．６ｇ）のｎ−ブチル−α−シアノアクリレート（インダーミル（登録商標））を加える。前記フラスコを、均質な溶液が形成されるまで転倒混和する。
【０１０３】
前記溶液１に前記溶液２を加え、得られた懸濁液を２分間超音波処理すること（振幅の７０％、０℃）により、ただちにミニエマルジョンが形成される。つづいて、２．４ｍｌの水酸化ナトリウム水溶液（０．１ｍｏｌｌ−１）（１０ｍｌフラスコ）中に前記ミニエマルジョンを加えてｐＨの値を１から７に急速に変えることにより前記モノマー滴の重合が開始される。つづいて、得られた懸濁液を５分間攪拌する。つづいて、得られた標識されたナノ粒子を、結合しなかった可能性のあるＦＩＴＣ−デキストランおよび過剰の安定剤を除去するために、透析（１０回）する。前記ナノ粒子懸濁液は、２５．２ｍｇ／ｍｌの固体成分、および２３０．９±９．８ｎｍの平均粒子径（光子相関分光法）を有する。
【０１０４】
つづいて、前記により得られたナノ粒子懸濁液を、ｉｎ ｖｉｖｏ実験用に、０．９％の塩化ナトリウム溶液で希釈（１：１）した。
【０１０５】
Ｉｎ Ｖｉｖｏ実験
【０１０６】
［実施例５］
グループあたりのラット数：２
【０１０７】
グループ１：純粋な５００μｌのＦＩＴＣ−標識されたＳＤＳ−ナノ粒子（実施例４）の静脈内注射
グループ２：取り込まれたポリソルベート８０を含む５００μｌのＦＩＴＣ−標識されたＳＤＳ−ナノ粒子（実施例２）の静脈内注射
【０１０８】
前記標識されたナノ粒子の静脈内注射の４５分後、ラットを、イソフルランを用いて麻酔し、首を骨折させて殺した。その脳を取り出し、液体窒素中で保管した。凍結切片（Ｃｒｙｏｓｔａｔｉｃ ｓｌｉｃｅｓ）（１５μｍ）を調製し、蛍光顕微鏡を用いて観察した（図５および６参照）。
【０１０９】
結果：
図５は、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて、純粋なＦＩＴＣ−標識されたＳＤＳ−ナノ粒子を注射した後のラットの脳組織を示す。前記脳組織では、脳内に前記標識されたナノ粒子が輸送されたことに由来する蛍光が見られなかった。対照的に、図６は、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて取り込まれたポリソルベート８０を含むＦＩＴＣ−標識されたＳＤＳ−ナノ粒子を注射した後のラットの脳組織において、顕著な蛍光をはっきり示している。ナノ粒子の製造工程において、所定量の安定剤（この場合においては、ポリソルベート８０）が取り込まれることにより、界面活性剤コーティングを必要とせずに、ナノ粒子は、ラットの脳内の血液脳関門を通過し、顕著に輸送されると結論付けることができる。
【０１１０】
［実施例６］
グループあたりのラット数：１
【０１１１】
グループ：取り込まれたポリソルベート８０を含む５００μｌのＦＩＴＣ−標識されたＰＢＣＡ−ナノ粒子（実施例３）の静脈内注射
【０１１２】
前記標識されたナノ粒子の静脈内注射の６０分後、ラットを、イソフルランを用いて麻酔し、首を骨折させて殺した。その脳を取り出し、液体窒素中で保管した。凍結切片（Ｃｒｙｏｓｔａｔｉｃ ｓｌｉｃｅｓ）（１５μｍ）を調製し、蛍光顕微鏡を用いて観察した（図７参照）。
【０１１３】
結果：
図７は、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて、２２．７５％の量で取り込まれたポリソルベート８０を含むＦＩＴＣ−標識されたＰＢＣＡ−ナノ粒子を注射した後のラットの脳組織において、顕著な蛍光を示している。この結果は、ナノ粒子の製造工程において、ポリソルベート８０が取り込まれることにより、ナノ粒子は、ラットの脳内の血液脳関門を通過し、顕著に輸送されるという仮定を明確に示す。
【図面の簡単な説明】
【０１１４】
【図１】図１は、前記ミニエマルジョン重合技術を示す図である。
【図２】図２は、本発明に従って製造されたナノ粒子の写真である。
【図３】図３は、実施例１において製造された前記ナノ粒子の粒子径分布の一例である。
【図４】図４は、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）により安定化されたポリブチルシアノアクリレートナノ粒子に取り込まれた異なる量のポリソルベート８０（１．４％、２．５％、５％、７．５％および１０％）を示す。得られたナノ粒子懸濁液の粒子径を、光子相関分光法により測定した。得られたナノ粒子懸濁液の粒子径と、ポリソルベート８０の取り込まれた量との関係を示す。
【図５】図５は、純粋なＦＩＴＣ−標識されたナノ粒子（本発明に従っていない）を静脈内注射した後のラットの脳組織凍結切片（ｃｒｙｏｓｔａｔｉｃ ｓｌｉｄｅｓ）を示す。
【図６】図６は、取り込まれたポリソルベート８０を含むＦＩＴＣ−標識されたＳＤＳ−ナノ粒子（本発明に従った）を静脈内注射した後のラットの脳組織凍結切片（ｃｒｙｏｓｔａｔｉｃ ｓｌｉｄｅｓ）を示す。
【図７】図７は、取り込まれたポリソルベート８０を含むＦＩＴＣ−標識されたナノ粒子（本発明に従った）を静脈内注射した後のラットの脳組織凍結切片（ｃｒｙｏｓｔａｔｉｃ ｓｌｉｄｅｓ）を示す。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ミニエマルジョン法によるナノ粒子の製造方法に関連する。反応系に安定剤を所定量加えることにより、前記ナノ粒子は製造される。更に、本発明は、この方法により製造されるナノ粒子、並びに、少なくとも一つの生理学的障壁、特に血液脳関門を通過する医薬品を必要とする疾病および状態を治療するためのそれらの使用に関連する。
【背景技術】
【０００２】
ナノ粒子は、いくつかの疾病、特にガンの検出および治療に新たな希望を提案する。したがって、ナノ粒子は、医薬、特にガンの治療における多くの分野に大きな可能性を持っている。ガン性細胞に直接的に腫瘍致死薬（ｔｕｍｏｒ−ｋｉｌｌｉｎｇ ｄｒｕｇｓ）を送達し、それにより化学療法薬の不要な副作用を回避することへの期待は、医学界において、ナノ粒子への多数の関心を呼んでいる。
【０００３】
また、標的送達（ｔａｒｇｅｔｅｄ ｄｅｌｉｖｅｒｙ）とは別に、ナノ粒子は、ヒトおよび動物の身体の特定の障壁を通過する能力に関して、いくつかの驚異的な効果を示した。例えば、米国特許出願番号０８／２０３，３２６、およびそれに対応する国際特許出願番号ＰＣＴ／ＥＰ９５／００７２４（特許文献１に対応）において、薬物を混合し（取り込み、吸着し、または吸収し）、適切な界面活性剤によるコーティングにより包まれたナノ粒子を用いた手段により、薬物が哺乳類の身体、特にヒトの身体に送達され、血液脳関門を通過して輸送され得ることが報告されている。前記両出願には、前記薬物は、免疫抑制剤または抗ガン剤であってもよいことが教示されている。前記適切な界面活性剤として、一般的に購入可能な界面活性剤、例えば、ポリソルベート８０またはＴｗｅｅｎ８０等が記載されている。
【０００４】
特許文献２もまた、ナノ粒子に関連しており、特許文献１により教示されたナノ粒子／薬物複合体（ｃｏｍｐｌｅｘ）を包む付加的なコーティングを必要としないことを開示している。
【０００５】
従来技術においては、前記ナノ粒子は、一般的に“溶媒中エマルジョン化蒸発技術（ｉｎ−ｓｏｌｖｅｎｔ ｅｍｕｌｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ−ｅｖａｐｏｒａｔｉｏｎ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ）”と呼ばれる技術により調製される。前記技術では、前記取り込まれる医薬品が疎水性または親水性のいずれであるかに応じて、単一の（オイル−イン−ウォーターすなわち水中油滴）または複数のエマルジョン化（ウォーター−イン−オイル−イン−ウォーター）を用いる。
【０００６】
前記ナノ粒子の形成後、前記溶媒を前記エマルジョンから蒸発させる。前記ナノ粒子を、遠心分離または、好ましくは、超遠心（１２０，０００〜１４５，０００ｇ）により残渣から分離後、水で洗浄し、再度遠心後、デカンテーションする。
【０００７】
従来技術から、ミニエマルジョンにおいて、ポリマーへの変換を実施することも公知である。ミニエマルジョンは、例えば、水相、油相および少なくとも一つの界面活性剤の分散系であり、約５０〜５００ｎｍのサイズの滴を有する。前記ミニエマルジョンは、準安定的であると考えられている（非特許文献１および２参照）。これらの分散系は、洗浄剤、化粧品またはボディーケア商品の技術分野において、幅広い応用が見つかっている。
【０００８】
オレフィン性（ｏｌｅｆｉｎｉｃａｌｌｙ）不飽和モノマーのフリーラジカルミニエマルジョン重合法による初期水分散系（ａｑｕｅｏｕｓ ｐｒｉｍａｒｙ ｄｉｓｐｅｒｓｉｏｎｓ）の調製は、例えば、特許文献３または特許文献４および５により公知である。これらの公知の方法の場合において、前記モノマーは、別の低分子量、オリゴマーまたはポリマーの疎水性物質の存在下において、共重合され得る。
【０００９】
ナノ粒子形成の好ましい方法は、Ｋ．Ｌａｎｄｆｅｓｔｅｒにより開発されたミニエマルジョン技術である。
【００１０】
ここで、ミニエマルジョンとは、５０〜５００ｎｍの範囲のサイズで臨界的に安定した油滴の分散系であり、水、界面活性剤（または、“安定剤”）および疎水性物質を含む系をせん断することにより調製される。そのようなミニエマルジョン中におけるモノマーの重合は、最初の滴とほぼ同じサイズを有する粒子をもたらす。前記ミニエマルジョン重合の原理を概要的に図１に示す（非特許文献３〜５）。
【００１１】
特許文献６（特許文献７）は、適切なモノマーの非ラジカルミニエマルジョン重合、好ましくは、重付加を用いた活性成分または活性物質のｉｎ−ｓｉｔｕカプセル封入法による前記活性成分または活性物質を含むポリマーカプセル、ペレット（ｐｅｌｌｅｔ）または滴の製造方法を開示している。前述の方法により生産された前記活性成分または活性物質を含むポリマー媒体システム（ｐｏｌｙｍｅｒ ｖｅｈｉｃｌｅ ｓｙｓｔｅｍ）は、送達システム（ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｓｙｓｔｅｍ）、特に化粧品およびボディーケアの分野、医薬品、接着処理および／または洗浄剤の分野において用いられ得る。
【００１２】
特許文献８は、界面活性剤（Ｓ１）および共界面活性剤（ｃｏ−ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ）（Ｓ２）の補助によって油／水のミクロまたはミニエマルジョンを安定化する方法を開示している。前記（Ｓ２）は、浸透圧的に安定化されたエマルジョンを与えるために、ヘキサデカン、セチルアルコール、ドデシルメルカプタン、長鎖アルキルメタクリレートおよびダイスタッフブルー７０（ｄｙｅｓｔｕｆｆ Ｂｌｕｅ ７０）以外から選択される水に不溶性の化合物からなる。前記特許文献８は、更に、油相、水相、界面活性剤（Ｓ１）および上述した超疎水性の共界面活性剤（Ｓ２）を含む浸透圧的に安定化されたミクロまたはミニエマルジョンを開示している。
【００１３】
特許文献９は、真核細胞中へのＤＮＡトランスフェクションのためのナノ粒子の使用を開示している。前記特許文献９は、更に、ヒトまたは動物の身体における標的臓器へのＤＮＡの投与を開示している。前記特許文献９は、特にヒトまたは動物の身体内の腫瘍に冒された標的臓器、例えば、脳腫瘍の場合における脳に対し、ガン治療に関連するＤＮＡを投与するためのナノ粒子の使用を教示している。前記特許文献９は、ＤＮＡとナノ粒子との結合のエンハンサー（ｅｎｈａｎｃｅｒ）として振舞う物質（“安定剤”）を使用することも開示している。特にジエチルアミノエチル−（ＤＥＡＥ）−デキストランおよびデキストラン７０．０００が、安定剤として記載されている。
【００１４】
しかしながら、特許文献９に記載のそれらのナノ粒子の製造方法は、従来のエマルジョン重合、すなわち、溶媒中のモノマー溶液から直接的にナノ粒子を形成するものでしかない。
【００１５】
【特許文献１】国際公開ＷＯ９５／２２９６３号パンフレット
【特許文献２】国際公開ＷＯ９８／５６３６１号パンフレット
【特許文献３】国際公開ＷＯ９８／０２４６６号パンフレット
【特許文献４】ドイツ公開特許第１９６２８１４３Ａ１号公報
【特許文献５】ドイツ公開特許第１９６２８１４２Ａ１号公報
【特許文献６】国際公開ＷＯ０２／０９８６２号パンフレット
【特許文献７】ドイツ公開特許第１０１０１８９２Ａ１号公報
【特許文献８】ドイツ公開特許第１９８５２７８４Ａ１号公報
【特許文献９】国際公開ＷＯ２００４／０１７９４５号パンフレット
【非特許文献１】Ｅｍｕｌｓｉｏｎ Ｐｏｌｙｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｅｍｕｌｓｉｏｎ Ｐｏｌｙｍｅｒｓ， Ｅｄｉｔｏｒｓ Ｐ． Ａ． Ｌｏｖｅｌｌ ａｎｄ Ｍｏｈａｍｅｄ Ｓ． Ｅｌ−Ａａｓｓｅｒ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ， Ｃｈｉｃｈｅｓｔｅｒ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， Ｗｅｉｎｈｅｉｍ， １９９７， ｐａｇｅ ７００
【非特許文献２】Ｍｏｈａｍｅｄ Ｓ． Ｅｌ−Ａａｓｓｅｒ， Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｅｍｕｌｓｉｏｎ Ｐｏｌｙｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｌａｔｅｘ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， ３０ｔｈ Ａｎｎｕａｌ Ｓｈｏｒｔ Ｃｏｕｒｓｅ， Ｖｏｌｕｍｅ ３， Ｊｕｎ． ７−１１， １９９９， Ｅｍｕｌｓｉｏｎ Ｐｏｌｙｍｅｒｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ， Ｌｅｈｉｇｈ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｂｅｔｈｌｅｈｅｍ， Ｐａ．， ＵＳＡ
【非特許文献３】Ｋ． Ｌａｎｄｆｅｓｔｅｒ， Ｐｏｌｙｒｅａｃｔｉｏｎｓ ｉｎ ｍｉｎｉｅｍｕｌｓｉｏｎｓ， Ｍａｃｒｏｍｏｌ． Ｒａｐｉｄ Ｃｏｍｍ． ２００１， ８９６−９３６．
【非特許文献４】Ｋ． Ｌａｎｄｆｅｓｔｅｒ， Ｎ． Ｂｅｃｈｔｈｏｌｄ， Ｆ． Ｔｉａｒｋｓ， ａｎｄ Ｍ． Ａｎｔｏｎｉｅｔｔｉ， Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ｏｆ ｐｏｌｙｍｅｒｉｚａｂｌｅ ｍｉｎｉｅｍｕｌｓｉｏｎｓ． Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ １９９９， ３２， ５２２２．
【非特許文献５】Ｋ． Ｌａｎｄｆｅｓｔｅｒ， Ｒｅｃｅｎｔ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓ ｉｎ Ｍｉｎｉｅｍｕｌｓｉｏｎｓ − Ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｓｔａｂｉｌｉｔｙ Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ． Ｍａｃｒｏｍｏｌ． Ｓｙｍｐ． ２０００， １５０， １７１
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
そこで、本発明は、媒体（ｖｅｈｉｃｌｅｓ）を高収率で、固形成分として得ることができる、改良された薬物送達媒体（ｄｒｕｇ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｖｅｈｉｃｌｅｓ）の製造方法を提供することを目的とする。更に、本発明は、前記媒体の大規模生産に適した薬物送達媒体の製造方法を提供することを目的とする。更に、本発明は、特に所望の放出特性に適合し得る医薬品用の送達媒体を提供することを目的とする。特に本発明は、医学的状態を変化させるための使用に適し、特に動物またはヒトの身体内の主要な生理学的または生物学的障壁を通過することができ、続いて、標的組織における医薬品の徐放性または遷延性放出等の修飾された放出特性を示す送達媒体を提供することを目的とする。本発明は、ナノ粒子上のコーティングとして、例えば、ポリソルベート８０等の界面活性剤の使用を避けることを付加的な目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
前記目的は、独立形式請求項の内容により達成される。好ましい実施形態は、従属形式請求項により示される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
一般的な所見として、本発明の前記ナノ粒子は、“ミニエマルジョン法”により形成される。このミニエマルジョン法は、それ自体はよく知られており、例えば、前記非特許文献３および、Ｋ． Ｌａｎｄｆｅｓｔｅｒ， Ｎ． Ｂｅｃｈｔｈｏｌｄ， Ｆ． Ｔｉａｒｋｓ， ａｎｄ Ｍ． Ａｎｔｏｎｉｅｔｔｉ， “Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ｏｆ ｐｏｌｙｍｅｒｉｚａｂｌｅ ｍｉｎｉｅｍｕｌｓｉｏｎｓ”中において開示されている。基本的に、この技術は、製造工程の順序が異なる点で、周知の伝統的な方法（例えば、特許文献９において用いられる方法等）とは異なる。この取り組みにおいては、分散された疎水性物質を含むミニエマルジョン、すなわち親水性連続相中にモノマーを含む滴をポリマー粒子に形成する。前記従来の取り組みにおいて、前記ポリマーは、モノマーを含む前記溶液から直接形成される。
【００１９】
このように、本明細書中で用いられる“ミニエマルジョン”という用語は、一般的に、連続的な水（親水性）相と前記連続相中に分散された油（疎水性）相とを含む分散系を形成する技術を意味する。更に、この用語は、１〜１０００ｎｍの範囲、通常、約５０〜５００ｎｍの範囲で形成されるエマルジョン滴（後の重合による粒子のサイズと、同一、またはほぼ同一である）を示す。
【００２０】
更に、前記従来法と前記ミニエマルジョン法とのもう一つの違いは、後者では、２つの液相が前記方法の開始時に接触し、続いてエマルジョンが形成されることである。前記従来のエマルジョン法では、最初に、一方の相の滴が他方の相中に落下するだけである。
【００２１】
前記従来の取り組みの主要な欠点の一つは、約１％のナノ粒子（固体成分）を含む懸濁液しか得られないという事実に見ることができる。対照的に、本発明のミニエマルジョンの取り組みは、２５％ｗ／ｗ（前記Ｏ／Ｗ反応系の重量全体に基づく）のモノマー成分に基づき、１５〜２４％またはそれ以上のナノ粒子の固体成分を得ることができる。このように、固体ナノ粒子の収率は劇的に増加しており、投入したモノマーの約６０〜９６％に該当する。
【００２２】
この方法では、高濃度の固体成分（１５％〜２４％の範囲）のナノ粒子懸濁液を得ることが可能である。このように、収率（６０％〜９６％）が高いことは、スケールアップの観点から非常に重要なことである。前記プロセスは、再現性がある。製造された前記ナノ粒子の平均径は、２００〜３００ｎｍ（１μｍ未満の範囲）である（図２参照）。
【００２３】
一例として、前記油相が、６ｇのモノマー＋２５０ｍｇの疎水性物質からなり、前記水相が、２４ｇの０．０１Ｎ（０．０１ｍｏｌ／Ｌ） 塩酸＋安定剤からなる場合は、固体の最大含有量は、収率１００％に相当し、２５％ｗ／ｗ（６／２４×１００）となる見込みである。含有量が２０％ｗ／ｗであれば、対応する収率は８０％である。この場合、モノマーで表現される残りの２０％は、例えば、容器の表面またはホモジナイザーなどで重合すること等により、重合中に失われる。
【００２４】
本発明と従来の取り組みとの主な違いは、本発明のナノ粒子には、界面活性剤コーティングを用いる必要がないことにある。驚いたことに、少なくとも一つの薬物を輸送する場合、周知の界面活性剤コーティングが、前記ナノ粒子の治療上の安全性において、有害な作用を有しうることが判明している。特に最初に添加された薬物（ナノ粒子に吸収させる）のうち、最高４０重量％が、界面活性剤コーティングにより置き換えられるという実験結果が示された。これにより、ナノ粒子に結合した薬物の量が、容認し難いほど変化し、不明確となり、ナノ粒子をコーティングした薬物の治療効果と信頼性を低下させてしまう。
【００２５】
しかしながら、前記界面活性剤コーティングを省略すると、例えば、血液脳関門等の生理学的障壁を通過するナノ粒子の能力が低下してしまう。このことは、前記界面活性剤コーティングの材料（例えば、Ｔｗｅｅｎ８０）が、血中に存在するＡｐｏＥおよびＡｐｏＡを、それぞれ、吸収できることで、血液脳関門のリポタンパク質受容体へのナノ粒子の提示を可能にするという事実により説明することができる。言い換えると、このことにより、ナノ粒子の受容体媒介エンドサイトーシス（ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｍｅｄｉａｔｅｄ ｅｎｄｏｃｙｔｏｓｉｓ）、およびナノ粒子の前記血液脳関門の通過が導かれる。
【００２６】
したがって、前記ナノ粒子に吸収された薬物の置換を避けるために、単に、前記界面活性剤コーティングを省略するというのには、不都合がある。
【００２７】
そこで、本発明者等は、両問題点を克服するための解決法、すなわち、界面活性剤コーティングの使用に関する欠点を避け、生理学的障壁、特に血液脳関門の通過に関する前記コーティングの好ましい効果を維持する方法を見出した。
【００２８】
従来技術における界面活性剤コーティングを形成するのと同一または類似する界面活性剤を、製造工程において、先に、ナノ粒子内に取り込む。より正確には、前記界面活性剤または安定剤を、重合可能なモノマーの全重量に基づいて１０〜２５重量％の量で、ナノ粒子中に取り込むことが効果的であることが見出されている。従って、本発明の製造方法は、臓器への適用前に界面活性剤を用いて混合する必要がないため、製造工程を大幅に簡略化し、臨床治療の適用を促進する。
【００２９】
したがって、第１の局面において、本発明のナノ粒子の製造方法は、
ａ）油相型および水相型の液相、少なくとも一つの安定剤ならびに重合可能なモノマーを含み、前記少なくとも一つの安定剤を、前記重合可能なモノマーの全重量に基づいて１０〜２５重量％の量で加える反応系を供給する工程と、
ｂ）前記油相滴が前記モノマーを含むＯ／Ｗ型のミニエマルジョンを形成する工程と、
ｃ）ナノ粒子を形成するために前記モノマーを重合する工程とを含み、
前記ナノ粒子に結合可能な少なくとも一つの医薬品を前記ナノ粒子に加えることで、前記少なくとも一つの医薬品によりコーティングされたナノ粒子を製造し、および／または前記工程ａ）において、少なくとも一つの医薬品を加える。
【００３０】
前記少なくとも一つの安定剤の量は、前記重合可能なモノマーの全重量に基づいて１０〜２５重量％であり、すなわち、１０重量％および２５重量％の値を含まないことが好ましい。更に、本明細書中で用いられる“安定剤の量”とは、複数の安定剤を組合せた全体量も含まれることを申し添える。前記１０〜２５重量％の量は、例えば、１０％のドデシル硫酸ナトリウムと１０％のポリソルベート８０とから構成されてもよい（実施例２参照）。
【００３１】
本発明において用いられる“安定剤”という用語は、エマルジョンを安定化することのできる任意の物質を含んでもよい。これらの物質は、界面活性物質、すなわち、界面活性剤であることが好ましい。
【００３２】
別の一局面において、本発明は、前述した工程からなるナノ粒子を製造する方法を提供する。
【００３３】
本発明者等は、本発明のナノ粒子中に取り込まれる安定剤または界面活性剤のできる限り最も広い範囲が、前記重合可能なモノマーの全重量に基づいて、１０〜２５重量％であることを見出した。この範囲は、評価した全ての安定剤（界面活性剤）に当てはまる。この範囲が、前記重合可能なモノマーの全重量に基づいて、１０重量％以下である場合、十分な量におけるナノ粒子の生理学的障壁の通過が十分でないことを示す実験結果により、説明することができる。一方、前記重合可能なモノマーの全重量に基づいて、２５重量％以上用いた場合、容認し難い多量の安定剤（界面活性剤）が、患者の体内に送達されてしまう。
【００３４】
更に、２５重量％以上の安定剤が、重合工程自体の不要な開始を引き起こしてしまうことが判明した。この不都合な事情の結果として、粒子が塊になってしまうため、区別できるナノ粒子が形成されない。
【００３５】
本明細書中で用いられる“反応系”という用語は、前記定義したミニエマルジョンを形成するという要件を満す、任意の環境と定義される。
【００３６】
前述のとおり、前記ミニエマルジョンを調製するためには、例えば、Ｌａｎｄｆｅｓｔｅｒ ｅｔ ａｌ（前記）により開示された既知のエマルジョン技術を用いることができる。この方法は、例えば、まず、モノマー、油相、水相および安定剤（以下で定義する）を組合せて行ってもよい。更に、前記水相は、例えば、適切なｐＨ値にセッティングするための塩酸またはリン酸等の成分を含んでいてもよいことを申し添える。次に、すべての成分を混合するために、前記反応系を、例えば、ホモジナイザー等により混合してもよい。
【００３７】
前記ミニエマルジョンの調製自体は、前記反応系に、例えば、超音波ホモジナイザーおよび高圧ホモジナイザーにより強力なせん断力を適用して行う。更に、前記せん断力は、前記反応系のサイズと使用する前記ホモジナイザーに応じ、２〜５分の範囲の時間で適用してもよい。基本的に、３〜４分の範囲の時間で十分であると認識される。
【００３８】
前記超音波ホモジナイザーは、約６０〜１００％の振幅（ａｍｐｌｉｔｕｄｅ）、好ましくは、約７０〜９０％の振幅を有し得る。
【００３９】
この工程で用いられる温度は、好ましくは、−１〜５℃、好ましくは、０℃である。
【００４０】
一般的に、前記油相と水相の重量比は、１５〜４０％ｗ／ｗの範囲、好ましくは、２０〜３０％ｗ／ｗの範囲、より好ましくは、約２５％ｗ／ｗである。
【００４１】
前記ミニエマルジョンを調製した後、例えば、単に前記ｐＨをｐＨ７．０等の値に増加させることにより前記重合工程を開始する。この方法は、前記反応系においてＰＢＣＡモノマーを用いる場合はいつでも行うことができる。そして、前記ｐＨの増加は、例えば、十分な量の炭酸カリウム（Ｋ２ＣＯ３）を前記反応系に加えることにより、または前記調製したミニエマルジョンを、０．５Ｍ アンモニア（ＮＨ３）水溶液、０．１Ｍ Ｔｒｉｓ−塩基性水溶液、または０．１Ｍ 水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）水溶液からなる塩基性溶液中に注ぐことにより行う。
【００４２】
本発明のナノ粒子は、好ましくは、５０〜５００ｎｍの範囲、より好ましくは、２００〜３００ｎｍの範囲の直径を有する（例えば、図２参照）。一方で、高いモル濃度のリン酸（Ｈ３ＰＯ４）水溶液をミニエマルジョンの調製に用いた場合、粒子径が小さくなることが観察される。
【００４３】
本発明において、驚いたことに、前記ミニエマルジョン法により調製されたナノ粒子が、予期しなかった特徴と利点を有していることが判明した。第一に、前述のとおり、前記製造方法による収率は、従来の製造方法と比較して非常に高い。更に、本発明の方法により製造されたナノ粒子は、その表面に医薬品を結合する改善された能力を有していることが判明した。驚いたことに、この効果は、含まれる医薬品（または、薬物）の特徴とは独立して現れた。
【００４４】
いかなる特定の理論にも拘束されるものではないが、本発明の前記ナノ粒子の三次元構造は、前記ナノ粒子への薬物分子のより安定的な付着を可能にすると推測される。顕微鏡による評価により、ナノ粒子の表面は、滑らかでも均一でもなく、その表面は、クリュー様構造（ｃｒｅｗ−ｌｉｋｅ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ）であることが明らかになった。このクリュー様構造が、物理的または化学的挙動とは独立して、前記ナノ粒子への薬物分子の結合を促進するというのが、本発明者らの見解である。
【００４５】
しかしながら、前記少なくとも一つの医薬品が、必ずしも前記ナノ粒子上にコーティングされなければならないわけではないことも述べておかなければならない。工程ａ）において、前記医薬品を先に加えておくことで、前記医薬品を前記ナノ粒子中に取り込むことも可能である。このことは、医薬品ならびにその化学的および／または物理的特性に依存する。この場合において、前記二つの相中に、前記医薬品を導入することが好ましい。脂溶性の医薬品は、Ｏ型液相に取り込まれ、水溶性の医薬品は、Ｗ型液相中に導入されることが好ましい。両方の取り組みを併用すること、すなわち、工程ａ）において、医薬品を加え、調製後のナノ粒子上に医薬品をコーティングすることも可能である。
【００４６】
好ましい実施形態によれば、前記安定剤は、前記重合可能なモノマーの全重量に基づいて、１２〜２３の量、より好ましくは、１５〜２０重量％の量で添加される。
【００４７】
更なる実施形態によれば、更に、投与後に哺乳動物の体内または体外の標的に前記ナノ粒子の輸送を可能にするために、前記ナノ粒子に媒質を加える工程ｄ）を行う。より好ましくは、前記工程ｄ）は、薬学的組成物の形成において前記ナノ粒子を供給する。
【００４８】
前記薬学的組成物は、投与後に哺乳動物、好ましくは、ヒトの体内の標的に前記ナノ粒子の輸送を可能にする生理学的に許容可能な担体および／または希釈液を含む。前記担体および／または希釈液は、水、塩および／または緩衝液を含む生理学的に許容可能な水溶液、並びに哺乳動物への投与のために許容可能な任意の他の溶液からなる群から選択されることが好ましい。前記担体および希釈液は、この分野の当業者にとって周知であり、蒸留水、脱イオン水、純水、超純水、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を含み、かつ薬物送達システム等における他の成分と相性のよい通常の緩衝液を含む溶液を含む。
【００４９】
ｉｎ ｖｉｖｏにおいてナノ粒子を用いるために、一般的な生理食塩水またはリン酸緩衝水溶液を用いて生理学的なｐＨおよび浸透圧で、前記ナノ粒子を懸濁液に再構成してもよい。
【００５０】
典型的には、前記ナノ粒子は、注射可能な懸濁液中に０．１ｍｇナノ粒子／ｍｌ懸濁液〜１００ｍｇナノ粒子／ｍｌ懸濁液の範囲の濃度で存在する。前記濃度は、１０ｍｇナノ粒子／ｍｌが好ましい。用いられる前記ナノ粒子の量は、個々のナノ粒子に含まれる前記医薬品の量に強く依存し、熟練者または医師であれば、特定の状況に応じて、前記ナノ粒子の用量をあらかじめ適合させることができるであろう。
【００５１】
その他、前記薬学的組成物は、前記本発明の送達媒体を輸送し、別の生理学的障壁、例えば、血液空気関門を通過させるために必要な別の形態をとってもよい。従って、前記薬学的組成物は、吸入により前記組成物を問題の障壁に送達するために、例えば、エアロゾル等の形態を有していてもよい。
【００５２】
前記薬学的組成物は、経口、静脈内、腹腔内、皮下、筋肉内、鼻腔内、肺または直腸投与用の薬物の形態を取ることが好ましく、経口または静脈内投与用の薬物の形態をとることがより好ましい。
【００５３】
本発明の方法において、医薬品を用いて前記ナノ粒子をコーティングする工程は、好ましくは、前記少なくとも一つの医薬品の溶液とともに前記ナノ粒子を混合する工程と、前記少なくとも一つの医薬品の有効量が前記ナノ粒子表面および／または内部に吸収されるために十分な時間放置する工程とを含む。
【００５４】
本発明の方法において用いられる前記油相は、好ましくは、オリーブ油、ミグリオール、ダイズ油および／または、ヘキサデカン、ｎ−ヘキサン、流動パラフィン、ビタミンＥまたはトリグリセリドの脂肪酸エステルから選択される疎水性物質を含む。前記疎水性物質の量は、通常、相対的に少量であり、オストワルド熟成を妨げるのに十分である（前記油相（更に前記モノマーを含む）の全重量に基づいて約２〜２０％ｗ／ｗ）。
【００５５】
前記重合可能なモノマーは、ポリマー材料を形成するために用いられ、ポリアクリレート、ポリメタクリレート、ポリシアノアクリレート、好ましくは、ポリアルキルシアノアクリレート、ポリアリールアミド、ポリラクテート、ポリグリコレート、ポリアンハイドレート、ポリオルトエステル、ゼラチン、ポリサッカライド、アルブミン、ポリスチレン、ポリビニル、ポリアクロレイン、ポリグルタルアルデヒド、並びにそれらの誘導体、コポリマーおよび混合物からなる群から選択されることが好ましい。
【００５６】
好ましいポリマー材料は、固体またはフィルム状のポリマー、好ましくは、ポリアルキルシアノアクリレート、より好ましくは、ポリブチルシアノアクリレート、ポリ乳酸、ポリ酪酸並びにそれらの混合物および誘導体を含んでいる。
【００５７】
本発明において用いられる（生産される）前記ポリマー材料は、生分解性であることが好ましい。この用語は、生体内での使用に適している、すなわち、生物学的に不活性で、生理学的に許容可能で、無毒であることが知られている合成または天然由来のポリマー材料を示している。そして、本発明の前記送達システムでは、前記生分解性ポリマーは、使用環境において生分解され、すなわち、生体に吸収され得る。
【００５８】
ナノ粒子を形成するのに用いられ得るさらなる生分解性ポリマーは、ポリグリコライドおよびポリ乳酸ポリグリコライドコポリマー（ＰＬＧＡ）等のポリエステル；ヒドロキシ終端化ポリ（ε−カプロラクトン）−ポリエーテル、またはポリカプロラクトン（ＰＣＬ）等のポリエーテル；ポリアンヒドリド；ポリアクリルアミド；ポリ（オルトエステル）；ポリアミノ酸；および生分解性ポリウレタン等を含むが、これらに限定されない。ポリマーという前記用語は、コポリマーおよびオリゴマーを含むと解釈するべきである。
【００５９】
一実施形態において、工程ａ）で供給される前記安定剤は、少なくとも一つの下記の物質：
グリセロール、ソルビトールおよび他の一価、または多価アルコールの脂肪酸エステル、好ましくは、ベンジルアルコール、グリセロールモノステアリン酸エステル、ソルビタンモノラウリン酸エステルまたはソルビタンモノオレイン酸エステル；ポリサッカライド、ベンジルベンゾエート、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ２００、３００、４００、５００、６００）、ポリエチレングリコールヒドロキシステアリン酸エステル、好ましくは、ソルトール ＨＳ １５（Ｓｏｌｕｔｏｌ ＨＳ １５）；ポロキサミン（ｐｏｌｏｘａｍｉｎｅ）、好ましくは、ポロキサミン９０４、９０８または１５０８；ポリオキシエチレンエーテルおよびポリオキシエチレンエステル；エトキシトリグリセリド；エトキシフェノールおよびエトキシジフェノール；ポリオキシルカストール油（ｐｏｌｙｏｘｙｌ ｃａｓｔｏｒ ｏｉｌ）、好ましくは、クレモフォール ＥＬＰ（Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ ＥＬＰ）；レシチン（ｌｅｃｉｔｈｉｎ）、脂肪酸の金属塩、脂肪族アルコール硫酸エステルの金属塩；およびスルフォサクシネートの金属塩；好ましくは、ポリソルベート、より好ましくは、ポリソルベート２０、６０、およびもっとも好ましくは、ポリソルベート８０；好ましくは、ポロクサマー（ｐｏｌｏｘａｍｅｒ）、より好ましくは、ポロクサマー１８８、３３８または４０７；好ましくは、ポリオキシエチレングリコール、より好ましくは、ルテンゾール５０または８０；アニオン性界面活性剤、例えば、ドデシル硫酸ナトリウム；および前記物質の少なくとも２つの混合物を含む。
【００６０】
これらの安定剤（または、界面活性剤）のすべての分子構造は、その特性において類似していることを申し添える。
【００６１】
前記ナノ粒子をコーティングするのに用いる前記少なくとも一つの医薬品は、治療薬および診断薬から選択される。
【００６２】
前記治療薬は、送達媒体または担体なしでは生理学的障壁を通過できない物質から選択されることが好ましい。前記生理学的障壁は、限定はしないが、血液脳関門（ｂｂｂ）、血液空気関門、血液脳脊髄液関門および頬粘膜からなる群から選択されることが好ましい。加えて、前記少なくとも一つの治療薬は、中枢神経系活性を有するが送達媒体なしでは血液脳関門を通過し得ない治療薬であってもよい。
【００６３】
本明細書中では、“薬物”と“治療薬”は、交換的に用いられる。
【００６４】
好ましい実施形態によれば、本発明の前記送達媒体は、シナプス部位およびニューロエフェクタージャンクション部位に活性を有する薬物；全身麻酔剤および局所麻酔剤；催眠剤および鎮痛剤；うつ病および総合失調症等の精神病学的異常の治療用の薬物；抗てんかん薬および抗痙攣薬；パーキンソン病、ハンチントン病、老化およびアルツハイマー病治療のための薬物；興奮性アミノ酸拮抗薬、神経栄養因子および神経再生薬；栄養性因子；ＣＮＳ外傷または発作治療を意図した薬物；耽溺性および薬物濫用治療のための薬物；抗肥満薬；オータコイドおよび抗炎症薬；寄生的な感染症および微生物により引き起こされる疾病のための化学療法薬；免疫抑制剤および抗がん剤；ホルモンおよびホルモン拮抗薬；重金属および重金属拮抗薬；非金属性毒素のための拮抗薬；ガン治療のための細胞分裂阻害剤；核医学において用いるための診断物質；免疫活性剤および免疫反応性剤；トランスミッターおよび前記トランスミッターそれぞれのレセプター作用薬およびレセプター拮抗薬、前記トランスミッターそれぞれの前駆物質および代謝物質；輸送体阻害剤；抗生物質；鎮痙薬；抗ヒスタミン薬；吐き気止め薬；弛緩薬；興奮薬；センスオリゴヌクレオチドおよびアンチセンスオリゴヌクレオチド；脳血管拡張薬；向精神薬；抗そう病薬；血管拡張薬および血管収縮薬；降圧薬；偏頭痛治療薬；催眠薬、高血糖薬および低血糖薬；抗喘息薬；抗ウイルス薬、好ましくは、抗ＨＩＶ薬；疾病のＤＮＡ治療、ｓｉ−ＲＮＡ治療またはアンチセンス治療に適した遺伝子材料；およびそれらの混合物からなる群から選択される少なくとも一つの治療薬を含む。
【００６５】
本願の明細書において用いられる“ＤＮＡ”という用語は、基本的には、現在の技術分野において考えられうる任意のＤＮＡに言及する。好ましい実施形態によれば、前記“ＤＮＡ”という用語は、２種類のＤＮＡ、すなわち、プラスミドＤＮＡ、より好ましくは、腫瘍抑制遺伝子の情報を含むプラスミドＤＮＡ、更に好ましくは、腫瘍抑制遺伝子ｐ５３およびｐＲＢの情報を含むプラスミドＤＮＡ、およびもう一つはアンチセンスオリゴヌクレオチド、より好ましくは、ガン遺伝子に対するアンチセンスオリゴヌクレオチド、更に好ましくは、Ｂｃｌ２等のガン遺伝子に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドを含むことを意味する。本発明において、一種類のＤＮＡ（結果として、１種類のＤＮＡを取り込んだナノ粒子）を用いてもよいし、本発明において用いることができる別々の種類のＤＮＡを取り込んだ複数種のナノ粒子を用いた結果として、二種類以上のＤＮＡを用いてもよい。
【００６６】
驚いたことに、ＤＮＡおよび、特に前記２種類のＤＮＡは、ナノ粒子上に吸収され得る。その結果として生じるＤＮＡ−ナノ粒子複合体を、組織、特にガン（特に、限定されないが、脳腫瘍）を患っている組織中に接種することができる。その後、腫瘍増殖の抑制が観られ、腫瘍壊死およびアポトーシスが引き起こされ得る。
【００６７】
本発明の本質的ではない好ましい実施形態において、プロモーターを含むプラスミドＤＮＡ、より好ましくは、誘導プロモーターを含むプラスミドＤＮＡは、前記ナノ粒子上に取り込まれ得る。前記誘導プロモーターを含むＤＮＡを前記ナノ粒子上に取り込み、細胞内で誘導プロモーターを発現させる新規工程により、関連する遺伝子の発現の外部制御を達成し、前記遺伝子のオン−オフを自在に切り替え得る。従来技術からは予期しなかった利点として、遺伝子／ＤＮＡ発現のタイミングを制御できることがあげられる。制御できることにより、持続的な遺伝子の発現による有毒な副作用を減少させ、および／またはネガティブ選択（ｎｅｇａｔｉｖｅ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ）の発生により、細胞が遺伝子産物への抵抗性を持つようになる可能性を低減することができる。
【００６８】
本発明の好ましい実施形態によれば、ヒトのパピローマウイルスの調節領域（ＨＰＶ−ＵＲＲ）を、誘導プロモーターとして用いる。腫瘍抑制因子の発現は、デキサメタゾン（Ｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ）または他の誘導物質もしくは化合物の投与後に誘導される。そのようにして、腫瘍細胞のアポトーシスおよび腫瘍の退行を達成することができる。本発明において用いることのできる他の典型的なプロモーターは、サイトメガリアウイルス（ｃｙｔｏｍｅｇａｌｉａ ｖｉｒｕｓ、ＣＭＶ）プロモーターまたはシミアンウイルス４０（ＳＶ４０）プロモーターである。
【００６９】
更に、腫瘍縮小を含む強力な効果は、一種類のＤＮＡを含む一種類または複数種類のナノ粒子、および細胞増殖抑制効果を有する物質を一種類または複数種類含むナノ粒子を組合せて投与することにより達成することができる。
【００７０】
好ましい実施形態によれば、腫瘍抑制ＤＮＡを、細胞増殖抑制効果を有する化合物を含むナノ粒子複合体の接種に先立って、更に好ましくは、誘導プロモーターの後に、注入してもよい。更に好ましい実施形態によれば、前記細胞増殖抑制効果を有する化合物は、ドキソルビシン（Ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎｅ）である。
【００７１】
なお、細胞へのＤＮＡのトランスフェクション法、およびヒトまたは動物の体内の標的臓器にＤＮＡを投与する方法において、その第１工程として、前述の方法によるナノ粒子の調製を含む。
【００７２】
更なる情報は、ＷＯ２００４／０１７９４５号パンフレットに明確に言及され、その内容は、本明細書中に全体として取り込まれている。
【００７３】
更に、典型的な活性成分（例えば、薬物）は、神経系に影響する任意の物質、または前記神経系の診断テストに用いられる物質であってもよい。これらについては、Ｇｉｌｍａｎ ｅｔ ａｌ． （１９９０）， “Ｇｏｏｄｍａｎ ａｎｄ Ｇｉｌｍａｎ’ｓ − Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ”， Ｐｅｒｇａｍｏｎ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋに記載されており、下記の薬物を含む。
アセチルコリンおよび合成コリンエステル、天然由来のコリン作用性アルカロイドおよびその合成同属体、抗コリンエステラーゼ薬、神経節刺激薬、アトロピン、スコポラミンおよび関連する抗ムスカリン薬類、カテコールアミンならびにエピネフリン、ノルエピネフリンおよびドパミン等の交換神経刺激薬、アドレナリン作用薬、アドレナリン受容体拮抗薬、ＧＡＢＡ、グリシン、グルタミン酸塩、アセチルコリン、ドパミン、５−ヒドロキシトリプタミンおよびヒスタミン、向神経活性ペプチド等のトランスミッター；オピオイド系鎮痛薬等の鎮痛薬および麻酔薬並びに拮抗薬；ベンゾジアゼピン類、バルビツール酸類、抗ヒスタミン薬、フェノチアジンおよびブチルフェノン等の麻酔前投薬および麻酔薬；オピオイド；制吐剤；アトロピン、スコポラミンまたは、グリコピロレート等の抗コリン薬；コカイン；クロラール誘導体；エトクロルビノール；グルテチミド；メチプリロン；メプロバメート；パーアルデヒド；ジスルフィラム；モルヒネ、フェンタニルおよびナロキソン；フェノチアジン、チオキサンチンおよび他のヘテロ環化合物（例えば、ハルペリオドール（ｈａｌｐｅｒｉｏｄｏｌ））等の精神病用薬；デシミプラミンおよびイミプラミンのような三環系抗うつ薬；異型性抗うつ薬（例えば、フルオキセチンおよびトラゾドン）、イソカルボキサジド等のモノアミンオキシダーゼ阻害剤；リチウム塩；クロルジアゼポキシドおよびジアゼパム等の抗不安薬；ヒダントインを含む抗てんかん薬、抗痙攣薬、バルビツール酸類、イミノスチルビン（例えば、カルバマゼピン）、サクシニミド、バルプロ酸、オキサゾリジンジオンおよびベンゾジアゼピン、Ｌ−ＤＯＰＡ／ＣＡＲＢＩＤＯＰＡ、アポモルヒネ、アマタジン、エルゴリン、セレギリン、ロピノロール、ブロモクリプチンメシレートおよび抗コリン薬等の抗パーキンソン病薬；バクロフェン、ヂアゼパムおよびダントロレンのような抗痙攣薬；興奮性アミノ酸拮抗薬等の神経保護薬、神経栄養因子および脳由来の神経栄養因子、繊毛様神経親和性因子、または神経成長因子；ニューロトロフィン（ＮＴ）３（ＮＴ３）；ＮＴ４およびＮＴ５；ガングリオシド；神経再生薬；オピオイド拮抗薬および抗うつ薬を含む耽溺性および薬物濫用治療のための薬物；ヒスタミン、ブラジキニン、カイリジンおよび前記それぞれの作用薬および拮抗薬等のオータコイドおよび抗炎症薬；寄生的な感染症および微生物による疾病のための化学療法薬；アルキル化薬（例えば、ニトロソ尿素）を含む抗がん剤および代謝拮抗物質；ナイトロジェンマスタード、エチレンアミンおよびメチルメラミン；アルキルスルホン酸；葉酸類似体；ピリミジン類似体、プリン類似体、ビンカアルカロイド；フェンジメトラジン、フェンテルミン、ジエチルプロピオン、シブトラミン等の抗肥満薬；ならびに抗生物質
【００７４】
好ましい実施形態によれば、前記診断薬は、核医学および放射線治療の分野の診断における有用な診断薬からなる群から選択される。
【００７５】
本発明の方法の一実施形態において、工程ｃ）後に、前記安定剤を、前記ナノ粒子から少なくとも部分的に除去する工程を含むことが好ましい。ただし、本発明の工程ａ）において示した通り、１０〜２５重量％の範囲が観測されなければならない。
【００７６】
前記追加工程は、透析または遠心分離により行われることが好ましい。驚いたことに、前記安定剤は、前記製造方法自体においては必要とされるが、前記最終のナノ粒子が形成された後には、少なくとも部分的に除去されるのがよいことが判明した。言い換えれば、“過剰な”安定剤は、前記ナノ粒子の安定性を維持するのに必要ではなく、ｉｎ ｖｉｖｏでの適用において潜在的なリスクを引き起こしかねないため、除去しておくのがよい。ｉｎ ｖｉｖｏでのリスクを低減するためには、前記ナノ粒子中における前記安定剤の量は、可能である最低限の量が望ましいと想定される。ただし、前記量が少な過ぎると、前記生理学的障壁を通過するナノ粒子の能力を妨げることになる。
【００７７】
第２の局面において、本発明は、前述した方法により得られるコーティングされたナノ粒子、または薬学的組成物を提供する。
【００７８】
前記コーティングされたナノ粒子、または前記薬学的組成物は、少なくとも一つの生理学的障壁、特に血液脳関門を通過する医薬品を必要とする疾病および状態の治療用薬物を製造するために用いられ得る。
【００７９】
本明細書中で言及した、すべての刊行物、特許出願、特許および他の文献は、参照することにより、全体として取り込まれている。抵触する場合には、定義を含み、本願明細書が支配する。加えて、材料、方法および実施例は、説明のためであって、限定することを意図しない。
【００８０】
本発明を添付の図面によりさらに例示する。
図１は、前記ミニエマルジョン重合技術を示す図である。
図２は、本発明に従って製造されたナノ粒子の写真である。
図３は、実施例１において製造された前記ナノ粒子の粒子径分布の一例である。
図４は、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）により安定化されたポリブチルシアノアクリレートナノ粒子に取り込まれた異なる量のポリソルベート８０（１．４％、２．５％、５％、７．５％および１０％）を示す。得られたナノ粒子懸濁液の粒子径を、光子相関分光法により測定した。得られたナノ粒子懸濁液の粒子径と、ポリソルベート８０の取り込まれた量との関係を示す。
図５は、純粋なＦＩＴＣ−標識されたナノ粒子（本発明に従っていない）を静脈内注射した後のラットの脳組織凍結切片（ｃｒｙｏｓｔａｔｉｃ ｓｌｉｄｅｓ）を示す。
図６は、取り込まれたポリソルベート８０を含むＦＩＴＣ−標識されたＳＤＳ−ナノ粒子（本発明に従った）を静脈内注射した後のラットの脳組織凍結切片（ｃｒｙｏｓｔａｔｉｃ ｓｌｉｄｅｓ）を示す。
図７は、取り込まれたポリソルベート８０を含むＦＩＴＣ−標識されたナノ粒子（本発明に従った）を静脈内注射した後のラットの脳組織凍結切片（ｃｒｙｏｓｔａｔｉｃ ｓｌｉｄｅｓ）を示す。
【実施例】
【００８１】
［実施例１］ミニエマルジョン法を用いたＳＤＳ安定化ポリブチルシアノアクリレートナノ粒子中へのポリソルベート８０の取り込み
【００８２】
２種類の別々の溶液を調製する。
【００８３】
溶液１：
１０ｍｌフラスコ（ＰＰ）に、２．４ｍｌの塩酸（０．１ｍｏｌｌ−１）を加える。つづいて、この溶液に、０．０６ｇのドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、および３０ｍｇのポリソルベート８０を加える。得られた溶液を、透明な溶液が形成されるまで攪拌する。
【００８４】
溶液２：
５ｍｌフラスコに、３２．３μＬのヘキサデカン、および５４５．５μＬ（０．６ｇ）のｎ−ブチル−α−シアノアクリレート（インダーミル（登録商標））を加える。前記フラスコを、均質な溶液が形成されるまで転倒混和する。
【００８５】
前記溶液１に前記溶液２を加え、得られた懸濁液を２分間超音波処理すること（振幅の７０％、０℃）により、ただちにミニエマルジョンが形成される。つづいて、２．４ｍｌの水酸化ナトリウム水溶液（０．１ｍｏｌｌ−１）（１０ｍｌフラスコ）中に、前記ミニエマルジョンを加えて、ｐＨの値を１から７に急速に変えることにより前記モノマー滴の重合が開始される。つづいて、前記得られた懸濁液を５分間攪拌する。前記ナノ粒子懸濁液は、１１１．８ｍｇ／ｍｌの固体成分、および１１８．４±０．７ｎｍの平均粒子径（光子相関分光法）を有する。
【００８６】
［実施例２］ミニエマルジョン法を用いたＳＤＳ安定化ポリブチルシアノアクリレートナノ粒子中へのポリソルベート８０およびＦＩＴＣ−デキストランの取り込み
【００８７】
２種類の別々の溶液を調製する。
【００８８】
溶液１：
１０ｍｌフラスコ（ＰＰ）に、２．４ｍｌの塩酸（０．１ｍｏｌｌ−１）を加える。つづいて、この溶液に、０．０６ｇのドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、６０ｍｇのポリソルベート８０、および９．０ｍｇのフルオレセインイソチオシアネート−デキストラン７７．０００（ＦＩＴＣ−デキストラン）を加える。得られた溶液を、透明な溶液が形成されるまで攪拌する。
【００８９】
溶液２：
５ｍｌフラスコに、３２．３μＬのヘキサデカン、および５４５．５μＬ（０．６ｇ）のｎ−ブチル−α−シアノアクリレート（インダーミル（登録商標））を加える。前記フラスコを、均質な溶液が形成されるまで転倒混和する。
【００９０】
前記溶液１に前記溶液２を加え、得られた懸濁液を２分間超音波処理すること（振幅の７０％、０℃）により、ただちにミニエマルジョンが形成される。つづいて、２．４ｍｌの水酸化ナトリウム水溶液（０．１ｍｏｌｌ−１）（１０ｍｌフラスコ）中に、前記ミニエマルジョンを加えて、ｐＨの値を１から７に急速に変えることにより前記モノマー滴の重合が開始される。つづいて、前記得られた懸濁液を５分間攪拌する。つづいて、得られた標識されたナノ粒子を、結合しなかった可能性のあるＦＩＴＣ−デキストランおよび過剰の安定剤を除去するために透析（１０回）する。前記ナノ粒子懸濁液は、２８．９ｍｇ／ｍｌの固体成分、および２５８．４±７．０ｎｍの平均粒子径（光子相関分光法）を有する。
【００９１】
つづいて、得られた前記ナノ粒子懸濁液を、ｉｎ ｖｉｖｏ実験用に、０．９％の塩化ナトリウム溶液で希釈（１：１）した。
【００９２】
［実施例３］ミニエマルジョン法を用いたポリブチルシアノアクリレートナノ粒子中へのポリソルベート８０およびＦＩＴＣ−デキストランの取り込み
【００９３】
２種類の別々の溶液を調製する。
【００９４】
溶液１：
５０ｍｌフラスコに、０．０３３８ｇ（１．５％）のフルオレセインイソチオシアネート７７．０００（ＦＩＴＣ−デキストラン）、および０．５１３ｇ（２２．７５％）のＴｗｅｅｎ８０を加える。つづいて、９ｍｌのリン酸（０．８ｍｏｌ／ｌ）を加える。得られた溶液を、透明な溶液が形成されるまで３０分間攪拌する。
【００９５】
溶液２：
１０ｍｌフラスコに、０．０９ｇ（４％）のダイズ油を加える。つづいて、２．０５０ｍｌ（２．２５５ｇ）のｎ−ブチル−α−シアノアクリレート（インダーミル（登録商標）、４℃に冷却）を加える。得られた溶液を、ピペットを用いて混和する。
【００９６】
前記溶液１に前記溶液２を加え、得られた懸濁液を４分間超音波処理すること（振幅の７０％、０℃、Ｔｉｔａｎｐｌａｔｅ ＴＴ １３）により、ただちにミニエマルジョンが形成される。つづいて、９ｍｌのアンモニア水溶液（０．５ｍｏｌｌ−１）（５０ｍｌフラスコ）中に、前記ミニエマルジョンを加えてｐＨの値を１から７に急速に変えることにより前記モノマー滴の重合が開始される。つづいて、前記得られた懸濁液を５分間攪拌する。前記ｐＨの値は、ｐＨ計を用いて確認した。アンモニア溶液を、ｐＨ値が７になるように加える。前記ナノ粒子懸濁液は、９７．４６ｍｇ／ｍｌの固体成分、および１５１ｎｍ±１．３１（ＰＤＩ ０．２４４）の平均粒子径（光子相関分光法）を有する。透析（２７回）後のナノ粒子懸濁液は、１４３ｎｍ±１．０（ＰＤＩ ０．２３２）の平均粒子径（光子相関分光法）を有する。取り込まれたＦＩＴＣ−デキストランの量を、ＵＶ分光法を用いて、３３．９８％（１１．４８ｍｇ）と決定した。
【００９７】
実施例３の手順に続く追加選択的な仕様は、
１． Ｔｗｅｅｎ８０：２０％、ダイズ油：４．２％、０．８Ｍ Ｈ３ＰＯ４、０．５Ｍ ＮＨ３、粒子径：１２０ｎｍ、ＰＤＩ：０．１４、固体成分：１００ｍｇ／ｍｌ
２． Ｔｗｅｅｎ８０：２０％、ダイズ油：４．０％、１Ｍ Ｈ３ＰＯ４、０．５Ｍ ＮＨ３、粒子径：１４０ｎｍ、ＰＤＩ：０．１９、固体成分：１１０ｍｇ／ｍｌ
３． Ｔｗｅｅｎ８０：２２．７５％、ダイズ油：４．０％、０．８Ｍ Ｈ３ＰＯ４、０．１Ｍ Ｔｒｉｓ−塩基性（Ｔｒｉｓ−Ｂａｓｅ）、粒子径：１２０ｎｍ、ＰＤＩ：０．１５、固体成分：４０ｍｇ／ｍｌ
４． Ｔｗｅｅｎ８０：２０％、ダイズ油：４．２％、１Ｍ Ｈ３ＰＯ４、０．１Ｍ Ｔｒｉｓ−塩基性（Ｔｒｉｓ−Ｂａｓｅ）、粒子径：１２５ｎｍ、ＰＤＩ：０．１３、固体成分：４５ｍｇ／ｍｌ
である。
【００９８】
つづいて、前記得られたナノ粒子懸濁液を、ｉｎ ｖｉｖｏ実験用に、０．９％の塩化ナトリウム溶液で希釈した。
【００９９】
［比較例］ミニエマルジョン法を用いたＳＤＳ安定化ポリブチルシアノアクリレートナノ粒子中へのＦＩＴＣ−デキストランの取り込み
【０１００】
２種類の別々の溶液を調製する。
【０１０１】
溶液１：
１０ｍｌフラスコ（ＰＰ）に、２．４ｍｌの塩酸（０．１ｍｏｌｌ−１）を加える。つづいて、この溶液に、０．０６ｇのドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、および９．０ｍｇのフルオレセインイソチオシアネート−デキストラン７７．０００（ＦＩＴＣ−デキストラン）を加える。得られた溶液を、透明な溶液が形成されるまで攪拌する。
【０１０２】
溶液２：
５ｍｌフラスコに、３２．３μＬのヘキサデカン、および５４５．５μＬ（０．６ｇ）のｎ−ブチル−α−シアノアクリレート（インダーミル（登録商標））を加える。前記フラスコを、均質な溶液が形成されるまで転倒混和する。
【０１０３】
前記溶液１に前記溶液２を加え、得られた懸濁液を２分間超音波処理すること（振幅の７０％、０℃）により、ただちにミニエマルジョンが形成される。つづいて、２．４ｍｌの水酸化ナトリウム水溶液（０．１ｍｏｌｌ−１）（１０ｍｌフラスコ）中に前記ミニエマルジョンを加えてｐＨの値を１から７に急速に変えることにより前記モノマー滴の重合が開始される。つづいて、得られた懸濁液を５分間攪拌する。つづいて、得られた標識されたナノ粒子を、結合しなかった可能性のあるＦＩＴＣ−デキストランおよび過剰の安定剤を除去するために、透析（１０回）する。前記ナノ粒子懸濁液は、２５．２ｍｇ／ｍｌの固体成分、および２３０．９±９．８ｎｍの平均粒子径（光子相関分光法）を有する。
【０１０４】
つづいて、前記により得られたナノ粒子懸濁液を、ｉｎ ｖｉｖｏ実験用に、０．９％の塩化ナトリウム溶液で希釈（１：１）した。
【０１０５】
Ｉｎ Ｖｉｖｏ実験
【０１０６】
［実施例５］
グループあたりのラット数：２
【０１０７】
グループ１：純粋な５００μｌのＦＩＴＣ−標識されたＳＤＳ−ナノ粒子（実施例４）の静脈内注射
グループ２：取り込まれたポリソルベート８０を含む５００μｌのＦＩＴＣ−標識されたＳＤＳ−ナノ粒子（実施例２）の静脈内注射
【０１０８】
前記標識されたナノ粒子の静脈内注射の４５分後、ラットを、イソフルランを用いて麻酔し、首を骨折させて殺した。その脳を取り出し、液体窒素中で保管した。凍結切片（Ｃｒｙｏｓｔａｔｉｃ ｓｌｉｃｅｓ）（１５μｍ）を調製し、蛍光顕微鏡を用いて観察した（図５および６参照）。
【０１０９】
結果：
図５は、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて、純粋なＦＩＴＣ−標識されたＳＤＳ−ナノ粒子を注射した後のラットの脳組織を示す。前記脳組織では、脳内に前記標識されたナノ粒子が輸送されたことに由来する蛍光が見られなかった。対照的に、図６は、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて取り込まれたポリソルベート８０を含むＦＩＴＣ−標識されたＳＤＳ−ナノ粒子を注射した後のラットの脳組織において、顕著な蛍光をはっきり示している。ナノ粒子の製造工程において、所定量の安定剤（この場合においては、ポリソルベート８０）が取り込まれることにより、界面活性剤コーティングを必要とせずに、ナノ粒子は、ラットの脳内の血液脳関門を通過し、顕著に輸送されると結論付けることができる。
【０１１０】
［実施例６］
グループあたりのラット数：１
【０１１１】
グループ：取り込まれたポリソルベート８０を含む５００μｌのＦＩＴＣ−標識されたＰＢＣＡ−ナノ粒子（実施例３）の静脈内注射
【０１１２】
前記標識されたナノ粒子の静脈内注射の６０分後、ラットを、イソフルランを用いて麻酔し、首を骨折させて殺した。その脳を取り出し、液体窒素中で保管した。凍結切片（Ｃｒｙｏｓｔａｔｉｃ ｓｌｉｃｅｓ）（１５μｍ）を調製し、蛍光顕微鏡を用いて観察した（図７参照）。
【０１１３】
結果：
図７は、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて、２２．７５％の量で取り込まれたポリソルベート８０を含むＦＩＴＣ−標識されたＰＢＣＡ−ナノ粒子を注射した後のラットの脳組織において、顕著な蛍光を示している。この結果は、ナノ粒子の製造工程において、ポリソルベート８０が取り込まれることにより、ナノ粒子は、ラットの脳内の血液脳関門を通過し、顕著に輸送されるという仮定を明確に示す。
【図面の簡単な説明】
【０１１４】
【図１】図１は、前記ミニエマルジョン重合技術を示す図である。
【図２】図２は、本発明に従って製造されたナノ粒子の写真である。
【図３】図３は、実施例１において製造された前記ナノ粒子の粒子径分布の一例である。
【図４】図４は、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）により安定化されたポリブチルシアノアクリレートナノ粒子に取り込まれた異なる量のポリソルベート８０（１．４％、２．５％、５％、７．５％および１０％）を示す。得られたナノ粒子懸濁液の粒子径を、光子相関分光法により測定した。得られたナノ粒子懸濁液の粒子径と、ポリソルベート８０の取り込まれた量との関係を示す。
【図５】図５は、純粋なＦＩＴＣ−標識されたナノ粒子（本発明に従っていない）を静脈内注射した後のラットの脳組織凍結切片（ｃｒｙｏｓｔａｔｉｃ ｓｌｉｄｅｓ）を示す。
【図６】図６は、取り込まれたポリソルベート８０を含むＦＩＴＣ−標識されたＳＤＳ−ナノ粒子（本発明に従った）を静脈内注射した後のラットの脳組織凍結切片（ｃｒｙｏｓｔａｔｉｃ ｓｌｉｄｅｓ）を示す。
【図７】図７は、取り込まれたポリソルベート８０を含むＦＩＴＣ−標識されたナノ粒子（本発明に従った）を静脈内注射した後のラットの脳組織凍結切片（ｃｒｙｏｓｔａｔｉｃ ｓｌｉｄｅｓ）を示す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも一つの医薬品を含むナノ粒子の製造方法であって、
ａ）油相型および水相型の液相、少なくとも一つの安定剤ならびに重合可能なモノマーを含み、前記少なくとも一つの安定剤が、前記重合可能なモノマーの全重量に基づいて１０〜２５重量％の量で添加されている反応系を供給する工程と、
ｂ）前記油相滴が前記モノマーを含むＯ／Ｗ型のミニエマルジョンを形成する工程と、
ｃ）ナノ粒子を形成するために前記モノマーを重合する工程とを含み、
前記ナノ粒子に結合可能な少なくとも一つの医薬品を前記ナノ粒子に加えることで、前記少なくとも一つの医薬品によりコーティングされたナノ粒子を製造するか、または前記工程ａ）において、少なくとも一つの医薬品を加える製造方法。
【請求項２】
前記工程ａ）において、前記少なくとも一つの安定剤を、前記重合可能なモノマーの全重量に基づいて、１２〜２３の量で加える請求項１記載の製造方法。
【請求項３】
前記工程ａ）において、前記少なくとも一つの安定剤を、前記重合可能なモノマーの全重量に基づいて、１５〜２０重量％の量で加える請求項１または２記載の製造方法。
【請求項４】
投与後における哺乳動物の体内または体外の標的に対する前記ナノ粒子の輸送を可能にするために、前記ナノ粒子に媒質を加える工程ｄ）をさらに行う請求項１から３のいずれか一項に記載の製造方法。
【請求項５】
前記工程ｄ）が、好ましくは、経口、静脈内、腹腔内、皮下、筋肉内、鼻腔内、肺または直腸投与用の薬物の形態、より好ましくは、経口または静脈内投与用の薬物の形態をとる薬学的組成物の形態で、ナノ粒子を供給する請求項４記載の製造方法。
【請求項６】
前記少なくとも一つの医薬品を用いて前記ナノ粒子をコーティングする工程が、前記少なくとも一つの医薬品の溶液とともに前記ナノ粒子を混合する工程と、前記少なくとも一つの医薬品の有効量が前記ナノ粒子表面および／または内部に吸収されるために十分な時間放置する工程とを含む請求項１から５のいずれか一項に記載の製造方法。
【請求項７】
前記油相が、オリーブ油、ミグリオールおよび／またはヘキサデカンを含む請求項１から６のいずれか一項に記載の製造方法。
【請求項８】
前記ポリマー材料が、ポリアクリレート、ポリメタクリレート、ポリシアノアクリレート、好ましくは、ポリアルキルシアノアクリレート、ポリアリールアミド、ポリラクテート、ポリグリコレート、ポリアンハイドレート（ｐｏｌｙａｎｈｙｄｒａｔｅｓ）、ポリオルトエステル、ゼラチン、ポリサッカライド、アルブミン、ポリスチレン、ポリビニル、ポリアクロレイン（ｐｏｌｙａｃｒｏｌｅｉｎ）、ポリグルタルアルデヒド、並びにそれらの誘導体、コポリマーおよび混合物からなる群から選択される請求項１から７のいずれか一項に記載の製造方法。
【請求項９】
前記工程ａ）において供給される前記安定剤が、少なくとも一つの下記物質を含む請求項１から８のいずれか一項に記載の製造方法。
ソルビトールの脂肪酸エステル、好ましくは、ソルビタンモノラウリン酸エステルまたはソルビタンモノオレイン酸エステル；ポロキサミン（ｐｏｌｏｘａｍｉｎｅｓ）、好ましくは、ポロキサミン９０４または１５０８；ポリオキシエチレンエーテルおよびポリオキシエチレンエステル；ラウリル硫酸ナトリウム；ドデシル硫酸ナトリウム；ポリソルベート；ポロクサマー；ポリオキシエチレングリコール；並びに前記物質のうち少なくとも２つの混合物
【請求項１０】
前記ポリソルベートが、ポリソルベート６０またはポリソルベート８０である請求項９記載の製造方法。
【請求項１１】
前記ポロクサマーが、ポロクサマー１８８、３３８または４０７から選択される請求項１から１０のいずれか一項に記載の製造方法。
【請求項１２】
前記ポリオキシエチレングリコールが、ルテンゾール５０または８０から選択される請求項９から１１のいずれか一項に記載の製造方法。
【請求項１３】
前記少なくとも一つの医薬品が、治療薬および診断薬から選択され、前記治療薬が、好ましくは、中枢神経系活性を有するが送達媒体なしでは血液脳関門を通過できない治療薬から選択され、前記診断薬が、核医学における診断および放射線治療に有用な診断薬からなる群から選択される請求項１から１２のいずれか一項に記載の製造方法。
【請求項１４】
ナノ粒子の製造方法の後に、前記安定剤を、前記ナノ粒子から少なくとも部分的に除去し、好ましくは、前記除去を透析または遠心分離により行う請求項１から１３のいずれか一項に記載の製造方法。
【請求項１５】
請求項１から１４のいずれか一項に記載の方法により得られるナノ粒子または薬学的組成物。
【請求項１６】
少なくとも一つの生理学的障壁、特に血液脳関門を通過する医薬品を必要とする疾病および状態の治療用薬物を製造するための請求項１５記載のナノ粒子または薬学的組成物の使用。
【請求項１】
少なくとも一つの医薬品を含むナノ粒子の製造方法であって、
ａ）油相型および水相型の液相、少なくとも一つの安定剤ならびに重合可能なモノマーを含み、前記少なくとも一つの安定剤が、前記重合可能なモノマーの全重量に基づいて１０〜２５重量％の量で添加されている反応系を供給する工程と、
ｂ）前記油相滴が前記モノマーを含むＯ／Ｗ型のミニエマルジョンを形成する工程と、
ｃ）ナノ粒子を形成するために前記モノマーを重合する工程とを含み、
前記ナノ粒子に結合可能な少なくとも一つの医薬品を前記ナノ粒子に加えることで、前記少なくとも一つの医薬品によりコーティングされたナノ粒子を製造するか、または前記工程ａ）において、少なくとも一つの医薬品を加える製造方法。
【請求項２】
前記工程ａ）において、前記少なくとも一つの安定剤を、前記重合可能なモノマーの全重量に基づいて、１２〜２３の量で加える請求項１記載の製造方法。
【請求項３】
前記工程ａ）において、前記少なくとも一つの安定剤を、前記重合可能なモノマーの全重量に基づいて、１５〜２０重量％の量で加える請求項１または２記載の製造方法。
【請求項４】
投与後における哺乳動物の体内または体外の標的に対する前記ナノ粒子の輸送を可能にするために、前記ナノ粒子に媒質を加える工程ｄ）をさらに行う請求項１から３のいずれか一項に記載の製造方法。
【請求項５】
前記工程ｄ）が、好ましくは、経口、静脈内、腹腔内、皮下、筋肉内、鼻腔内、肺または直腸投与用の薬物の形態、より好ましくは、経口または静脈内投与用の薬物の形態をとる薬学的組成物の形態で、ナノ粒子を供給する請求項４記載の製造方法。
【請求項６】
前記少なくとも一つの医薬品を用いて前記ナノ粒子をコーティングする工程が、前記少なくとも一つの医薬品の溶液とともに前記ナノ粒子を混合する工程と、前記少なくとも一つの医薬品の有効量が前記ナノ粒子表面および／または内部に吸収されるために十分な時間放置する工程とを含む請求項１から５のいずれか一項に記載の製造方法。
【請求項７】
前記油相が、オリーブ油、ミグリオールおよび／またはヘキサデカンを含む請求項１から６のいずれか一項に記載の製造方法。
【請求項８】
前記ポリマー材料が、ポリアクリレート、ポリメタクリレート、ポリシアノアクリレート、好ましくは、ポリアルキルシアノアクリレート、ポリアリールアミド、ポリラクテート、ポリグリコレート、ポリアンハイドレート（ｐｏｌｙａｎｈｙｄｒａｔｅｓ）、ポリオルトエステル、ゼラチン、ポリサッカライド、アルブミン、ポリスチレン、ポリビニル、ポリアクロレイン（ｐｏｌｙａｃｒｏｌｅｉｎ）、ポリグルタルアルデヒド、並びにそれらの誘導体、コポリマーおよび混合物からなる群から選択される請求項１から７のいずれか一項に記載の製造方法。
【請求項９】
前記工程ａ）において供給される前記安定剤が、少なくとも一つの下記物質を含む請求項１から８のいずれか一項に記載の製造方法。
ソルビトールの脂肪酸エステル、好ましくは、ソルビタンモノラウリン酸エステルまたはソルビタンモノオレイン酸エステル；ポロキサミン（ｐｏｌｏｘａｍｉｎｅｓ）、好ましくは、ポロキサミン９０４または１５０８；ポリオキシエチレンエーテルおよびポリオキシエチレンエステル；ラウリル硫酸ナトリウム；ドデシル硫酸ナトリウム；ポリソルベート；ポロクサマー；ポリオキシエチレングリコール；並びに前記物質のうち少なくとも２つの混合物
【請求項１０】
前記ポリソルベートが、ポリソルベート６０またはポリソルベート８０である請求項９記載の製造方法。
【請求項１１】
前記ポロクサマーが、ポロクサマー１８８、３３８または４０７から選択される請求項１から１０のいずれか一項に記載の製造方法。
【請求項１２】
前記ポリオキシエチレングリコールが、ルテンゾール５０または８０から選択される請求項９から１１のいずれか一項に記載の製造方法。
【請求項１３】
前記少なくとも一つの医薬品が、治療薬および診断薬から選択され、前記治療薬が、好ましくは、中枢神経系活性を有するが送達媒体なしでは血液脳関門を通過できない治療薬から選択され、前記診断薬が、核医学における診断および放射線治療に有用な診断薬からなる群から選択される請求項１から１２のいずれか一項に記載の製造方法。
【請求項１４】
ナノ粒子の製造方法の後に、前記安定剤を、前記ナノ粒子から少なくとも部分的に除去し、好ましくは、前記除去を透析または遠心分離により行う請求項１から１３のいずれか一項に記載の製造方法。
【請求項１５】
請求項１から１４のいずれか一項に記載の方法により得られるナノ粒子または薬学的組成物。
【請求項１６】
少なくとも一つの生理学的障壁、特に血液脳関門を通過する医薬品を必要とする疾病および状態の治療用薬物を製造するための請求項１５記載のナノ粒子または薬学的組成物の使用。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【公表番号】特表２００９−５２５２９８（Ｐ２００９−５２５２９８Ａ）
【公表日】平成２１年７月９日（２００９．７．９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−５５２７５３（Ｐ２００８−５５２７５３）
【出願日】平成１９年２月２日（２００７．２．２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００７／０００９２０
【国際公開番号】ＷＯ２００７／０８８０６６
【国際公開日】平成１９年８月９日（２００７．８．９）
【出願人】（５０７０８００９７）ナノデル テクノロジーズ ゲーエムベーハー (3)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２１年７月９日（２００９．７．９）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年２月２日（２００７．２．２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００７／０００９２０
【国際公開番号】ＷＯ２００７／０８８０６６
【国際公開日】平成１９年８月９日（２００７．８．９）
【出願人】（５０７０８００９７）ナノデル テクノロジーズ ゲーエムベーハー (3)
【Ｆターム（参考）】
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