蛋白質精製用分離剤及び蛋白質精製方法
【課題】蛋白質精製用の新規な分離剤を提供。
【解決手段】下記式（１）
（上記式中、ｍは２〜６の整数を表す。）で示されるリガンド、及び下記式（２）
（上記式中、Ｒ１、Ｒ２は水素原子又は炭素数１〜４のアルキル基を表し、ｎは１〜６の整数を表す。）で示されるリガンドを、担体上にウレタン結合により固定化。
【解決手段】下記式（１）
（上記式中、ｍは２〜６の整数を表す。）で示されるリガンド、及び下記式（２）
（上記式中、Ｒ１、Ｒ２は水素原子又は炭素数１〜４のアルキル基を表し、ｎは１〜６の整数を表す。）で示されるリガンドを、担体上にウレタン結合により固定化。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、特定のリガンドを有する新規な蛋白質精製用分離剤、及びその製造方法、並びにそれを用いた蛋白質の精製方法に関する。本発明の分離剤は蛋白質精製の分野において特に利用価値が高い。
【背景技術】
【０００２】
標的化合物の水性混合物からの分離及び精製を可能とするため、近年、いくつかの技術が開発及び／又は最適化されてきている。このような分離及び／又は精製技術として、例えば、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）（例えば、非特許文献１参照）、吸着クロマトグラフィー等が知られている。これらクロマトグラフィー技術の多様性は、標的化合物を分離及び／又は精製する複雑さを最小化する一方で、分離及び／又は精製を行なう困難さを反映している。そして、上記の各々の技術は、それらの幅広い産業的規模での利用を制限している一以上の欠点を有している。
【０００３】
例えば、ミックスモードクロマトグラフィー用樹脂は、疎水的な条件下では当該樹脂が標的化合物を結合することが可能であり、静電気的（イオン的）又は親水性条件下では当該樹脂から標的化合物を放出することが可能である分野で用いられている（例えば、非特許文献２〜５参照）。
【０００４】
従来のミックスモードクロマトグラフィー用樹脂の典型的な問題の１つは、標的化合物の溶液において、高塩濃度が用いられていない場合、あまり疎水的でない標的化合物の当該樹脂への結合効率がそれほど高くないことである。
【０００５】
例えば、非特許文献２においては、予備的なレベルでのタンパク質の当該樹脂への結合は、１Ｍ ＮａＣｌ溶液を用いることにより達成されている。標的化合物を含んでいる水性溶液に塩の添加を必要とするクロマトグラフィー技術は、産業的規模での収率を達成するためには、大量の試薬が必要であり、相当な工程を必要とする。すなわち、高い濃度の塩の使用を必要とするクロマトグラフィー用樹脂は、このような標的化合物の産業的な量の回収及び／又は精製のための最も効果的かつコスト効果を有する方法ではない。
【０００６】
このため、特許文献１は、１つのイオン性官能基及びリガンドを樹脂の固体支持マトリックスに共有結合で連結させている１つのスペーサーから成る特定のイオン性リガンドの利用と、組み合わされたミックスモードクロマトグラフィー用樹脂上の高リガンド密度の利用により、標的化合物が高イオン強度及び低イオン強度で樹脂に結合するような、十分な疎水性の性質を提供できるとしている。また、特許文献１は、標的化合物の樹脂からの放出を、イオン性官能基を介した樹脂上の電荷の量を増加させ、単純に放出溶液のｐＨを変化させることによって、親水的又は静電気的（イオン性）相互作用によって達成することが可能であるとしている。
【０００７】
しかしながら、特許文献１に記載の方法においては、担体（固体支持マトリックス）とリガンドとの間にスペーサーアームを介するために、その製造方法において非常に複雑で多くのプロセスを経るため、製造コストが非常に高くなるという問題がある。
【０００８】
すなわち、特許文献１に記載の方法において、スペーサーアームとは、イオン性官能基を固体支持マトリックスに共有結合的に取り付ける原子団又は置換体を意味する。このようなスペーサーアームとしては、アルキレン基、芳香族基、アルキル芳香族基、アミド基、アミノ基、ウレア基、カルバメート基、Ｒ１およびＲ２が１つのアルキレン基（例えば、Ｃ１−Ｃ６）でＹが酸素または硫黄である−Ｒ１−Ｙ−Ｒ２−基、及びそれらに類するものが例示されている。
【０００９】
そして、上記スペーサーアームの担体への取り付け（結合）方法としては、例えば、固体支持マトリックスをカルボニルジイミダゾール（ＣＤＩ）を用いて活性化し、アミノカプロン酸と反応させ、ウレタン中性結合を形成させる方法が実施されている（特許文献１、実施例６参照）。
【００１０】
また、上記スペーサーアームへのリガンドの取り付け（結合）方法としては、例えば、カルボジイミド（ＥＤＣ）を用い、アミンリガンドをアミノカプロン酸樹脂とカップリング反応させ、アミド結合を形成させる方法が実施されている（特許文献１、実施例７参照）。
【００１１】
このように、特許文献１に記載の方法では、クロマトグラフィー用樹脂の製造にあたって、煩雑なプロセスを経る必要がある。また、リガンド、スペーサーアーム、及び固体支持マトリックスの選択に応じて、最適なｐＨ範囲に制御する必要があり、プロセスがさらに煩雑化するという問題も生じる。
【００１２】
一方、従来の蛋白質精製用のクロマトグラフィー用充填剤は、蛋白質を吸着する際の緩衝液中に大量の塩を添加する必要があり、後でこれを除去するために、コストと労力が必要であるため、塩の量を低減する簡便な操作で蛋白質を吸着できる充填剤の開発が望まれている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１３】
【特許文献１】特表平１０−５０６９８７号公報
【非特許文献】
【００１４】
【非特許文献１】Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ，Ｖｏｌ．６０，１〜１５頁（１９７８）
【非特許文献２】Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．，Ｖｏｌ．５１０，１４９〜１５４頁（１９９０）
【非特許文献３】Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．，Ｖｏｌ．２９６，３２９〜３３７頁（１９８４）
【非特許文献４】Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．，Ｖｏｌ．８９，３０９〜３１９頁（１９８９）
【非特許文献５】Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．，Ｖｏｌ．３１７，２５１〜２６１頁（１９８４）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
本発明は上記の背景技術に鑑みてなされたものであり、その目的は、低塩濃度の緩衝液で容易に蛋白質を吸着でき、その吸着量は蛋白質を精製するのに十分な量であり、更に、その緩衝液のｐＨを変えるだけで容易に蛋白質を溶離できる蛋白質精製用の新規な分離剤、その簡便かつ経済的な製造方法、及びそれを用いた蛋白質精製方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本発明者らは、蛋白質精製用の分離剤について鋭意検討を重ねた結果、ウレタン結合により結合された特定のリガンドを担体上に有する分離剤が、本発明の目的を達成することを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１７】
すなわち、本発明は、以下に示すとおりの蛋白質精製用分離剤及びそれを用いた蛋白質精製方法である。
【００１８】
［１］下記式（１）
【００１９】
【化１】
（上記式中、ｍは２〜６の整数を表す。）
で示されるリガンド、及び下記式（２）
【００２０】
【化２】
（上記式中、Ｒ１、Ｒ２は各々独立して水素原子又は炭素数１〜４のアルキル基を表し、ｎは１〜６の整数を表す。）
で示されるリガンドからなる群より選ばれる１種又は２種以上のリガンドが、担体上にウレタン結合により結合されていることを特徴とする蛋白質精製用分離剤。
【００２１】
［２］式（１）で示されるリガンドが、下記式（３）で表わされることを特徴とする上記［１］に記載の蛋白質精製用分離剤。
【００２２】
【化３】
（上記式中、ｍは２〜４の整数を表す。）
［３］式（２）で示されるリガンドが下記式（４）
【００２３】
【化４】
（上記式中、Ｒ１、Ｒ２は各々独立して水素原子又は炭素数１〜４のアルキル基を表し、ｎは１〜４の整数を表す。）
で表されることを特徴とする上記［１］又は［２］に記載の蛋白質精製用分離剤。
【００２４】
［４］担体上のリガンドの含有量が、１００μｍｏｌ／ｍｌ−担体以上であることを特徴とする上記［１］乃至［３］のいずれか記載の蛋白質精製用分離剤。
【００２５】
［５］担体が、架橋高分子からなる担体であることを特徴とする上記［１］乃至［４］のいずれかに記載の蛋白質精製用分離剤。
【００２６】
［６］担体を有機溶媒中で活性化剤と反応させ、担体表面の水酸基を活性化した後、その活性化担体を有機溶媒中で、下記式（５）
【００２７】
【化５】
（上記式中、ｎは２〜６の整数を表す。）
で示される１級アミン、及び下記式（６）
【００２８】
【化６】
（上記式中、Ｒ１、Ｒ２は各々独立して水素原子又は炭素数１〜４のアルキル基を表し、ｎは１〜６の整数を表す。）
で示される１級アミンからなる群より選ばれる１種又は２種以上のアミンと反応させることを特徴とする上記［１］乃至［５］のいずれかに記載の蛋白質精製用分離剤の製造方法。
【００２９】
［７］式（５）で示される１級アミンが、下記式（７）で表わされることを特徴とする請求項６に記載の蛋白質精製用分離剤の製造方法。
【００３０】
【化７】
（上記式中、ｍは２〜４の整数を表す。）
［８］式（６）で示される１級アミンが下記式（８）
【００３１】
【化８】
（上記式中、Ｒ１、Ｒ２は各々独立して水素原子又は炭素数１〜４のアルキル基を表し、ｎは１〜４の整数を表す。）
で表されることを特徴とする上記［６］又は［７］に記載の蛋白質精製用分離剤の製造方法。
【００３２】
［９］活性化剤がカルボニルジイミダゾールであることを特徴とする上記［６］乃至［８］のいずれかに記載の蛋白質精製用分離剤の製造方法。
【００３３】
［１０］精製目的の蛋白質を第一の緩衝液に溶解させ、その蛋白質溶液を、［１］乃至［５］のいずれかに記載の蛋白質精製用分離剤と接触させて蛋白質を吸着させた後、第一の緩衝液とｐＨが異なる第二の緩衝液を当該分離剤に流して、当該分離剤に吸着した蛋白質を溶出させることを特徴とする蛋白質精製方法。
【発明の効果】
【００３４】
本発明の蛋白質精製用分離剤は、イオン交換性及び疎水性を有する特定のリガンドが、スペーサーアームを介することなく、担体上にウレタン結合により結合されているため、簡便かつ経済的な製造方法により調製できる。
【００３５】
また、本発明の蛋白質精製用分離剤において、上記リガンドは、蛋白質を吸着するために十分な量が担体に固定化されており、イオン交換性及び疎水性の両方の性質を有しているため、低濃度の緩衝液で容易に蛋白質が吸着され、その量も蛋白質精製用として十分な吸着量となる。さらに、上記リガンドは、緩衝液のｐＨを変えるだけで容易に吸着した蛋白質を脱離することが可能である。よって、本発明の分離剤は、例えば、蛋白質精製用のクロマトグラフィー用充填剤として、工業的に極めて有用である。
【発明を実施するための形態】
【００３６】
以下に本発明を詳細に説明する。
【００３７】
本発明の蛋白質精製用分離剤は、下記式（１）
【００３８】
【化９】
（上記式中、ｍは２〜６の整数を表す。）
で示されるリガンド、及び下記式（２）
【００３９】
【化１０】
（上記式中、Ｒ１、Ｒ２は各々独立して水素原子又は炭素数１〜４のアルキル基を表し、ｎは１〜６の整数を表す。）
で示されるリガンドからなる群より選ばれる１種又は２種以上のリガンドが、スペーサーアームを介することなく、担体上にウレタン結合により結合されていることをその特徴とする。
【００４０】
本発明において、リガンドとは、分離・精製を目的とする物質と特異的に結合する物質を意味する。
【００４１】
本発明において、上記式（１）で示されるリガンドとしては、特に限定するものではないが、下記式（３）
【００４２】
【化１１】
（上記式中、ｍは２〜４の整数を表す。）
で表されるリガンドが好ましく、４−ピリジルエチル基［上記式（３）中、ｍ＝２］が特に好ましい。
【００４３】
また、本発明において、上記式（２）で示されるリガンドとしては、特に限定するものではないが、下記式（４）
【００４４】
【化１２】
（上記式中、Ｒ１、Ｒ２は各々独立して水素原子又は炭素数１〜４のアルキル基を表し、ｎは１〜４の整数を表す。）
で表されるリガンドが好ましく、４−アミノベンジル基［上記式（４）中、Ｒ１、Ｒ２は水素原子、ｎ＝１］が特に好ましい。
【００４５】
本発明の蛋白質精製用分離剤に使用する担体としては、カラムクロマトグラフィー用の充填剤として使用される公知の担体を使用することができ、特に限定するものではない。例えば、多孔質ガラス、多孔質シリカゲル等の無機多孔質材料；アガロース、デキストラン、セルロース等の多糖類；ポリアクリルアミド、ポリメチルメタクリレート、ポリビニルアルコール、スチレン−ジビニルベンゼン共重合体等の合成高分子；等が好適なものとして挙げられる。
【００４６】
本発明においては、上記リガンドを、スペーサーアームを介することなく、ウレタン結合により担体上に結合するため、当該担体の表面に水酸基を有することが望ましい。また、担体の表面に従来公知の方法により水酸基を導入してもよい。
【００４７】
本発明の蛋白質精製用分離剤を工業スケールで使用する場合には、精製操作の後に充填剤のアルカリ洗浄が実施されるため、担体としては、アルカリに対して耐性のある多糖類や、合成高分子からなる担体が好ましい。合成高分子としては、親水性ビニルポリマーや、（メタ）アクリレート架橋共重合体等の架橋高分子が特に好ましい。
【００４８】
本発明において、担体の形状としては、その使用形態により異なるため、特に限定するものではないが、例えば、球状粒子、非球状粒子、膜、モノリス（連続体）等が挙げられる。例えば、カラムクロマトグラフィー用の充填剤として用いる場合には、粒子状とすることが好ましく、カラム中に均一な充填を行うためには球状粒子とすることがさらに好ましい。また、連続した一体型の円柱状の多孔質体をカラムに装着したものでもよい。さらには、膜状の分離剤を用いたクロマトグラフィーも可能である。
【００４９】
担体の形状を粒子状にして使用する場合、その大きさは、使用条件によって適当な大きさを選択することが好ましく、特に限定するものではないが、例えば、ＨＰＬＣ用の充填剤として用いる場合は、平均粒子径が５〜１５μｍ程度のものを用いるのが好ましく、８〜１２μｍの範囲のものがさらに好ましい。また、少量の分取を目的とする場合には通常１５〜５０μｍ程度、好ましくは２０〜３０μｍの範囲、工業プロセスで使用する目的では、通常５０〜３００μｍ程度、好ましくは５０〜１００μｍの範囲の平均粒子径のものを用いるのが好ましい。
【００５０】
本発明の充填剤において、上記したリガンドを、担体上にウレタン結合にて固定化する方法としては、従来公知の方法を用いることができる。
【００５１】
例えば、担体を有機溶媒中で活性化剤と反応させて、担体の表面に有する又は導入されている水酸基を活性化した後、その活性化担体を有機溶媒中で、下記式（５）
【００５２】
【化１３】
（上記式中、ｎは２〜６の整数を表す。）
で示される１級アミン、及び下記式（６）
【００５３】
【化１４】
（上記式中、Ｒ１、Ｒ２は各々独立して水素原子又は炭素数１〜４のアルキル基を表し、ｎは１〜６の整数を表す。）
で示される１級アミンからなる群より選ばれる１種又は２種以上のアミンと反応させることにより、ウレタン結合を形成して、上記リガンドをウレタン結合により担体上に固定化することができる。当該方法はにより、簡便かつ経済的に本発明の蛋白質精製用分離剤を調製することができる。
【００５４】
この固定化方法において、活性化剤としては、特に限定するものではないが、例えば、カルボニルジイミダゾール（ＣＤＩ）等が好適なものとして挙げられる。
【００５５】
また、上記式（５）で示される１級アミンとしては、下記式（７）
【００５６】
【化１５】
（上記式中、ｍは２〜４の整数を表す。）
で表される１級アミンが好ましく、４−（２−アミノエチル）ピリジン［上記式（７）中、ｍ＝２］が特に好ましい。
【００５７】
上記式（６）で示される１級アミンとしては、下記式（８）
【００５８】
【化１６】
（上記式中、Ｒ１、Ｒ２は各々独立して水素原子又は炭素数１〜４のアルキル基を表し、ｎは１〜４の整数を表す。）
で表される１級アミンが好ましく、４−アミノベンジルアミン［上記式（８）中、Ｒ１、Ｒ２は水素原子、ｎ＝１］が特に好ましい。
【００５９】
これらの一連の反応に用いる有機溶媒は、特に限定するものではないが、１，４−ジオキサンやジメチルスルホキシド等の非プロトン性溶媒を通常用いる。担体をＣＤＩで活性化する反応は、通常１５〜３０℃、好ましくは２０〜２５℃の範囲で実施し、反応時間は通常１時間〜３時間の範囲である。ＣＤＩで活性化した担体を、上記式（５）で示される１級アミン、及び上記式（６）で示される１級アミンからなる群より選べる１種又は２種以上のアミンと反応させ、上記したリガンドをウレタン結合により担体上に固定化する反応は、通常１５〜３０℃、好ましくは２０〜２５℃の範囲で実施し、反応時間は、通常１８〜３０時間の範囲である。
【００６０】
担体上のリガンドの含有量は、蛋白質吸着効率を著しく向上させるためには、担体１ｍｌ当たり、上記１級アミンが１００μｍｏｌ以上（以下、１００μｍｏｌ／ｍｌ−担体以上と表記する。）であることが好ましく、２００μｍｏｌ／ｍｌ−担体以上であることがより好ましい。
【００６１】
本発明の蛋白質精製用分離剤で精製できる蛋白質としては、特に限定するものではないが、例えば、免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）、免疫グロブリンＡ（ＩｇＡ）、免疫グロブリンＭ（ＩｇＭ）、免疫グロブリンＥ（ＩｇＥ）、アルブミン、キモトリプシノーゲンＡ、キモトリプシノーゲンＢ、キモトリプシノーゲンＣ、キモトリプシンＡα、キモトリプシンＣ、キモトリプシンインヒビター、トリプシン、トリプシンインヒビター、リゾチーム、リボヌクレアーゼＡ、リボヌクレアーゼＴ１、リボヌクレアーゼＴ２、アスパラギナーゼ、α−アミラーゼ、β−アミラーゼ、α−アミラーゼインヒビターＩ、α−アミラーゼインヒビターＩＩ、アルギナーゼ、インスリン、インターフェロン、ウリカーゼ、ウロキナーゼ、エストロゲンレセプターＩ、エノラーゼ、エラスターゼ、エリスロポエチン、黄体形成ホルモン、カタラーゼ、カリクレイン、カリクレインインヒビター、カルシトニン、キモシン、プロキモシン、パパイン、キモパパインＡ、キモパパインＢ、グルカゴン、α−グルコシダーゼ、β−グルコシダーゼ、血液凝固因子、甲状腺刺激ホルモン、コリンエステラーゼ、コンカナバリンＡ、チトクロームｂ５、チトクロームｂ５６２、チトクロームｃ、チトクロームｃ２、チトクロームｃ５５０、チトクロームｆ、スブチリシン、成長ホルモン、セルラーゼ、セルロプラスミン、チログロブリン、ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼ、デオキシリボヌクレアーゼＩ、デオキシリボヌクレアーゼＩＩ、デオキシリボヌクレアーゼインヒビターＩＩ、トランスフェリン、トリプシノーゲン、トロンビン、プロトロンビン、ヌクレアーゼ、ノイラミニダーゼ、パンクレアチン、フィブリノーゲン、副甲状腺ホルモン、副腎皮質刺激ホルモン、プラスミノーゲン、プラスミン、プラスミンインヒビター、プロテアーゼ、プロテアーゼインヒビター、プロテインキナーゼ、プロラクチン、ヘキソキナーゼ、ペプシノーゲン、ペプシン、ヘモグロビン、ヘモシアニン、ヘモペキシン、ペルオキシダーゼ、ホスホグルコムターゼ、ホスホグリセロムターゼ、ホスホリパーゼＡ２、ホスホリパーゼＣ、ホスホリラーゼａ、ホスホリラーゼｂ、ホスホリラーゼキナーゼ、ポリアミンオキシダーゼ、ミオグロビン、メタロチオネイン、モノアミンオキシダーゼ、α−ラクトアルブミン、β−ラクトグロブリン、ラクトフェリン、リパーゼ、レクチン、レニン、ロドプシン等が挙げられる。これらの蛋白質は、天然由来でも組み換え型でも良い。
【００６２】
本発明の蛋白質の精製方法は、精製目的の蛋白質を生理食塩水程度の濃度の塩を含む第一の緩衝液に溶解させ、その蛋白質溶液を本発明の蛋白質精製用分離剤と接触させて、蛋白質を吸着させた後、第一の緩衝液とｐＨが異なる第二の緩衝液を当該分離剤に流して、当該分離剤に吸着した蛋白質を溶出させることをその特徴とする。
【００６３】
本発明の精製方法において、精製目的の蛋白質を蛋白質精製用分離剤と接触させる方法としては、特に限定するものではないが、例えば、従来公知のカラムクロマトグラフィーによる方法を使用することができる。すなわち、本発明の蛋白質精製用分離剤をカラムへ充填し、蛋白質溶液を蛋白質精製用分離剤が充填されたカラムに付与し、その後、当該蛋白質を溶出させる。
【００６４】
本発明の精製方法において、本発明の蛋白質精製用分離剤に吸着した蛋白質を溶出させる方法としては、特に限定するものではないが、例えば、溶離液の塩濃度及び溶離液のｐＨを直線的に変化させ、吸着した蛋白質を溶出させる方法（リニアグラジエント溶出）、溶離液の塩濃度及び溶離液のｐＨを段階的に変化させ、吸着した蛋白質を溶出させる方法（ステップワイズグラジエント溶出）等を使用することができる。
【実施例】
【００６５】
以下の実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明はこれら実施例により限定して解釈されるものではない。
【００６６】
なお、ＴＳＫｇｅｌトヨパールＨＷタイプ（商品名，東ソー社製）は、親水性ビニルポリマーを基材とした中速サイズ排除クロマトグラフィー用充填剤であり、実施例において担体として使用したＴＳＫｇｅｌトヨパールＨＷ−６５（商品名，東ソー社製）は、蛋白質排除限界分子量が約５，０００，０００の親水性ビニルポリマーを基材とした中速サイズ排除クロマトグラフィー用充填剤である。
【００６７】
（リガンド固定化量の測定方法）
東ソー社製ＵＶ−８０１０検出器と東ソー社製ＣＣＰＭ−ＩＩポンプに、東ソー社製ＴＳＫｇｅｌ ＯＤＳ−８０Ｔｓ（内径０．４６ｃｍ，長さ１５ｃｍ）カラムを装着した。４０（ｖ／ｖ）％アセトニトリル水溶液に、０．５（ｖ／ｖ）％となるようにトリフルオロ酢酸を添加した溶離液を別途調製した。溶離液を０．５ｍＬ／ｍｉｎ．の流速でカラムに流し、１級アミンの固定化実施前後の懸濁液５０μＬを採取し、２ｍＬの溶離液で希釈した上澄みの１０μＬを注入して、ＵＶ−８０１０の波長２５４ｎｍで検出したとき、約３．０分に出現するピーク高さの割合から、固定化に使用された１級アミンの量（μｍｏｌ／ｍｌ−担体）を求め、リガンド固定化量とした。
【００６８】
（ＩｇＧ結合量の測定方法）
実施例に示した蛋白質精製用分離剤を製造後、その０．５ｍＬをオープンカラム（内径０．８ｃｍ，長さ１０ｃｍ）に充填し、緩衝液Ｂ（５０ｍＭクエン酸ナトリウム、ｐＨ３．０）３ｍＬ，次いで緩衝液Ａ（０．１５Ｍ塩化ナトリウムを含む５０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．２）５ｍＬを３回流して平衡化した。１５０ｍｇ／ｍＬのＩｇＧを含有したヒトγ−グロブリン（化学及血清療法研究所製）を、緩衝液Ａで１０ｍｇ／ｍＬの濃度となるように調製した溶液５ｍＬをカラムに添加し、密閉後室温で１時間穏やかに振とうして、充填剤にＩｇＧを結合させた。緩衝液Ａ５ｍＬでカラムを洗浄後、緩衝液Ｂ５ｍＬを流してＩｇＧを脱着回収し、日立製作所社製Ｕ−２０１０紫外可視分光光度計で２８０ｎｍの波長での吸光度から、蛋白質精製用分離剤１ｍｌに吸着したＩｇＧの量（μｍｏｌ／ｍＬ−分離剤）を求め、ＩｇＧ結合量とした。
【００６９】
実施例１．
ＴＳＫｇｅｌトヨパールＨＷ−６５を分級後、１，４−ジオキサンに置換し、その１０ｇを１００ｍＬのセパラブルフラスコに秤量し、そこへＣＤＩを０．７０ｇ／ｇ−乾燥トヨパール量となるように添加した。そこへ１，４−ジオキサン２０ｍＬを添加し、２００ｒｐｍの回転数で、室温中１．５時間攪拌翼で攪拌して活性化を行った。得られたＣＤＩ活性化トヨパールを１００ｍＬの１，４−ジオキサンで洗浄後、１００ｍＬのセパラブルフラスコに移し、１，４−ジオキサン２０ｍＬを添加後、乾燥トヨパール１ｇ当たり０．６１ｇとなるように、１級アミンとして４−アミノベンジルアミンを添加し（以下、０．６１ｇ／ｇ−乾燥トヨパール量と表記する。）、２００ｒｐｍの回転数で、室温中２４時間攪拌翼で攪拌して固定化を行い、本発明の蛋白質精製用分離剤を製造した。
【００７０】
４−アミノベンジルアミンが固定化された蛋白質精製用分離剤を７５質量％の１，４−ジオキサン水溶液３０ｍＬ，３３質量％の１，４−ジオキサン水溶液２０ｍＬ，純水１００ｍＬ，０．１Ｎ ＨＣｌ水溶液２０ｍＬ，純水１００ｍＬの順で洗浄した。その後、上記した方法により、ＩｇＧの結合量を測定したところ、５０ｍｇ／ｍＬ−充填剤であった。また、上記した方法により、リガンド固定化量を求めたところ、４０４μｍｏｌ／ｍＬ−担体であった。
【００７１】
さらに、製造した蛋白質精製用分離剤をステンレスカラム（内径０．７５ｃｍ，長さ７．５ｃｍ）に充填し、０．１５Ｍ塩化ナトリウムを含有した５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．２）で平衡化し、ＩｇＧ，トリプシンインヒビター，ヒト血清アルブミン，ウシ血清アルブミン，リボヌクレアーゼＡ，α−ラクトアルブミンの各々２．５ｍｇ／ｍＬ、及びα−キモトリプシノゲンＡ，リゾチームの各々２．０ｍｇ／ｍＬの２００μＬを各々単独で注入したとき、注入した蛋白質は全て蛋白質精製用分離剤に吸着された。その後、５０ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ３．０）にステップワイズで切り替えたとき、蛋白質精製用分離剤に吸着された蛋白質が脱着回収された。
【００７２】
実施例２．
固定化に用いる４−アミノベンジルアミンの量を０．３１ｇ／ｇ−乾燥トヨパール量となるようにした以外は、実施例１と同様に実施し、本発明の蛋白質精製用分離剤を製造した。
【００７３】
製造した蛋白質精製用分離剤を、実施例１と同様に洗浄した後、上記した方法により、ＩｇＧの結合量を測定したところ、２９ｍｇ／ｍＬ−分離剤であった。また、上記した方法により、リガンド固定化量を求めたところ、１１８μｍｏｌ／ｍＬ−担体であった。
【００７４】
さらに、製造した蛋白質精製用分離剤をステンレスカラム（内径０．７５ｃｍ，長さ７．５ｃｍ）に充填し、実施例１と同様に蛋白質をカラムに注入したところ、ＩｇＧ，トリプシンインヒビター，α−キモトリプシノゲンＡ，及びリゾチームが充填剤に吸着され、その他の蛋白質は素通りした。５０ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ３．０）にステップワイズで切り替えたとき、蛋白質精製用分離剤に吸着された蛋白質が脱着回収された。
【００７５】
実施例３．
１級アミンとして４−（２−アミノエチル）ピリジンを０．７６ｇ／ｇ−乾燥トヨパール量となるように用いた以外は、実施例１と同様に実施し、本発明の蛋白質精製用分離剤を製造した。
【００７６】
製造した蛋白質精製用分離剤を、実施例１と同様に洗浄後、上記した方法により、ＩｇＧの結合量を測定したところ、１９ｍｇ／ｍＬ−充填剤であった。
【００７７】
さらに、製造した蛋白質精製用分離剤をステンレスカラム（内径０．７５ｃｍ，長さ７．５ｃｍ）に充填し、実施例１と同様に蛋白質をカラムに注入したところ、ＩｇＧ，トリプシンインヒビター，α−キモトリプシノゲンＡ，及びリゾチームが充填剤に吸着され、その他の蛋白質は素通りした。５０ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ３．０）にステップワイズで切り替えたとき、蛋白質精製用分離剤に吸着された蛋白質が脱着回収された。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、特定のリガンドを有する新規な蛋白質精製用分離剤、及びその製造方法、並びにそれを用いた蛋白質の精製方法に関する。本発明の分離剤は蛋白質精製の分野において特に利用価値が高い。
【背景技術】
【０００２】
標的化合物の水性混合物からの分離及び精製を可能とするため、近年、いくつかの技術が開発及び／又は最適化されてきている。このような分離及び／又は精製技術として、例えば、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）（例えば、非特許文献１参照）、吸着クロマトグラフィー等が知られている。これらクロマトグラフィー技術の多様性は、標的化合物を分離及び／又は精製する複雑さを最小化する一方で、分離及び／又は精製を行なう困難さを反映している。そして、上記の各々の技術は、それらの幅広い産業的規模での利用を制限している一以上の欠点を有している。
【０００３】
例えば、ミックスモードクロマトグラフィー用樹脂は、疎水的な条件下では当該樹脂が標的化合物を結合することが可能であり、静電気的（イオン的）又は親水性条件下では当該樹脂から標的化合物を放出することが可能である分野で用いられている（例えば、非特許文献２〜５参照）。
【０００４】
従来のミックスモードクロマトグラフィー用樹脂の典型的な問題の１つは、標的化合物の溶液において、高塩濃度が用いられていない場合、あまり疎水的でない標的化合物の当該樹脂への結合効率がそれほど高くないことである。
【０００５】
例えば、非特許文献２においては、予備的なレベルでのタンパク質の当該樹脂への結合は、１Ｍ ＮａＣｌ溶液を用いることにより達成されている。標的化合物を含んでいる水性溶液に塩の添加を必要とするクロマトグラフィー技術は、産業的規模での収率を達成するためには、大量の試薬が必要であり、相当な工程を必要とする。すなわち、高い濃度の塩の使用を必要とするクロマトグラフィー用樹脂は、このような標的化合物の産業的な量の回収及び／又は精製のための最も効果的かつコスト効果を有する方法ではない。
【０００６】
このため、特許文献１は、１つのイオン性官能基及びリガンドを樹脂の固体支持マトリックスに共有結合で連結させている１つのスペーサーから成る特定のイオン性リガンドの利用と、組み合わされたミックスモードクロマトグラフィー用樹脂上の高リガンド密度の利用により、標的化合物が高イオン強度及び低イオン強度で樹脂に結合するような、十分な疎水性の性質を提供できるとしている。また、特許文献１は、標的化合物の樹脂からの放出を、イオン性官能基を介した樹脂上の電荷の量を増加させ、単純に放出溶液のｐＨを変化させることによって、親水的又は静電気的（イオン性）相互作用によって達成することが可能であるとしている。
【０００７】
しかしながら、特許文献１に記載の方法においては、担体（固体支持マトリックス）とリガンドとの間にスペーサーアームを介するために、その製造方法において非常に複雑で多くのプロセスを経るため、製造コストが非常に高くなるという問題がある。
【０００８】
すなわち、特許文献１に記載の方法において、スペーサーアームとは、イオン性官能基を固体支持マトリックスに共有結合的に取り付ける原子団又は置換体を意味する。このようなスペーサーアームとしては、アルキレン基、芳香族基、アルキル芳香族基、アミド基、アミノ基、ウレア基、カルバメート基、Ｒ１およびＲ２が１つのアルキレン基（例えば、Ｃ１−Ｃ６）でＹが酸素または硫黄である−Ｒ１−Ｙ−Ｒ２−基、及びそれらに類するものが例示されている。
【０００９】
そして、上記スペーサーアームの担体への取り付け（結合）方法としては、例えば、固体支持マトリックスをカルボニルジイミダゾール（ＣＤＩ）を用いて活性化し、アミノカプロン酸と反応させ、ウレタン中性結合を形成させる方法が実施されている（特許文献１、実施例６参照）。
【００１０】
また、上記スペーサーアームへのリガンドの取り付け（結合）方法としては、例えば、カルボジイミド（ＥＤＣ）を用い、アミンリガンドをアミノカプロン酸樹脂とカップリング反応させ、アミド結合を形成させる方法が実施されている（特許文献１、実施例７参照）。
【００１１】
このように、特許文献１に記載の方法では、クロマトグラフィー用樹脂の製造にあたって、煩雑なプロセスを経る必要がある。また、リガンド、スペーサーアーム、及び固体支持マトリックスの選択に応じて、最適なｐＨ範囲に制御する必要があり、プロセスがさらに煩雑化するという問題も生じる。
【００１２】
一方、従来の蛋白質精製用のクロマトグラフィー用充填剤は、蛋白質を吸着する際の緩衝液中に大量の塩を添加する必要があり、後でこれを除去するために、コストと労力が必要であるため、塩の量を低減する簡便な操作で蛋白質を吸着できる充填剤の開発が望まれている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１３】
【特許文献１】特表平１０−５０６９８７号公報
【非特許文献】
【００１４】
【非特許文献１】Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ，Ｖｏｌ．６０，１〜１５頁（１９７８）
【非特許文献２】Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．，Ｖｏｌ．５１０，１４９〜１５４頁（１９９０）
【非特許文献３】Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．，Ｖｏｌ．２９６，３２９〜３３７頁（１９８４）
【非特許文献４】Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．，Ｖｏｌ．８９，３０９〜３１９頁（１９８９）
【非特許文献５】Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．，Ｖｏｌ．３１７，２５１〜２６１頁（１９８４）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
本発明は上記の背景技術に鑑みてなされたものであり、その目的は、低塩濃度の緩衝液で容易に蛋白質を吸着でき、その吸着量は蛋白質を精製するのに十分な量であり、更に、その緩衝液のｐＨを変えるだけで容易に蛋白質を溶離できる蛋白質精製用の新規な分離剤、その簡便かつ経済的な製造方法、及びそれを用いた蛋白質精製方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本発明者らは、蛋白質精製用の分離剤について鋭意検討を重ねた結果、ウレタン結合により結合された特定のリガンドを担体上に有する分離剤が、本発明の目的を達成することを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１７】
すなわち、本発明は、以下に示すとおりの蛋白質精製用分離剤及びそれを用いた蛋白質精製方法である。
【００１８】
［１］下記式（１）
【００１９】
【化１】
（上記式中、ｍは２〜６の整数を表す。）
で示されるリガンド、及び下記式（２）
【００２０】
【化２】
（上記式中、Ｒ１、Ｒ２は各々独立して水素原子又は炭素数１〜４のアルキル基を表し、ｎは１〜６の整数を表す。）
で示されるリガンドからなる群より選ばれる１種又は２種以上のリガンドが、担体上にウレタン結合により結合されていることを特徴とする蛋白質精製用分離剤。
【００２１】
［２］式（１）で示されるリガンドが、下記式（３）で表わされることを特徴とする上記［１］に記載の蛋白質精製用分離剤。
【００２２】
【化３】
（上記式中、ｍは２〜４の整数を表す。）
［３］式（２）で示されるリガンドが下記式（４）
【００２３】
【化４】
（上記式中、Ｒ１、Ｒ２は各々独立して水素原子又は炭素数１〜４のアルキル基を表し、ｎは１〜４の整数を表す。）
で表されることを特徴とする上記［１］又は［２］に記載の蛋白質精製用分離剤。
【００２４】
［４］担体上のリガンドの含有量が、１００μｍｏｌ／ｍｌ−担体以上であることを特徴とする上記［１］乃至［３］のいずれか記載の蛋白質精製用分離剤。
【００２５】
［５］担体が、架橋高分子からなる担体であることを特徴とする上記［１］乃至［４］のいずれかに記載の蛋白質精製用分離剤。
【００２６】
［６］担体を有機溶媒中で活性化剤と反応させ、担体表面の水酸基を活性化した後、その活性化担体を有機溶媒中で、下記式（５）
【００２７】
【化５】
（上記式中、ｎは２〜６の整数を表す。）
で示される１級アミン、及び下記式（６）
【００２８】
【化６】
（上記式中、Ｒ１、Ｒ２は各々独立して水素原子又は炭素数１〜４のアルキル基を表し、ｎは１〜６の整数を表す。）
で示される１級アミンからなる群より選ばれる１種又は２種以上のアミンと反応させることを特徴とする上記［１］乃至［５］のいずれかに記載の蛋白質精製用分離剤の製造方法。
【００２９】
［７］式（５）で示される１級アミンが、下記式（７）で表わされることを特徴とする請求項６に記載の蛋白質精製用分離剤の製造方法。
【００３０】
【化７】
（上記式中、ｍは２〜４の整数を表す。）
［８］式（６）で示される１級アミンが下記式（８）
【００３１】
【化８】
（上記式中、Ｒ１、Ｒ２は各々独立して水素原子又は炭素数１〜４のアルキル基を表し、ｎは１〜４の整数を表す。）
で表されることを特徴とする上記［６］又は［７］に記載の蛋白質精製用分離剤の製造方法。
【００３２】
［９］活性化剤がカルボニルジイミダゾールであることを特徴とする上記［６］乃至［８］のいずれかに記載の蛋白質精製用分離剤の製造方法。
【００３３】
［１０］精製目的の蛋白質を第一の緩衝液に溶解させ、その蛋白質溶液を、［１］乃至［５］のいずれかに記載の蛋白質精製用分離剤と接触させて蛋白質を吸着させた後、第一の緩衝液とｐＨが異なる第二の緩衝液を当該分離剤に流して、当該分離剤に吸着した蛋白質を溶出させることを特徴とする蛋白質精製方法。
【発明の効果】
【００３４】
本発明の蛋白質精製用分離剤は、イオン交換性及び疎水性を有する特定のリガンドが、スペーサーアームを介することなく、担体上にウレタン結合により結合されているため、簡便かつ経済的な製造方法により調製できる。
【００３５】
また、本発明の蛋白質精製用分離剤において、上記リガンドは、蛋白質を吸着するために十分な量が担体に固定化されており、イオン交換性及び疎水性の両方の性質を有しているため、低濃度の緩衝液で容易に蛋白質が吸着され、その量も蛋白質精製用として十分な吸着量となる。さらに、上記リガンドは、緩衝液のｐＨを変えるだけで容易に吸着した蛋白質を脱離することが可能である。よって、本発明の分離剤は、例えば、蛋白質精製用のクロマトグラフィー用充填剤として、工業的に極めて有用である。
【発明を実施するための形態】
【００３６】
以下に本発明を詳細に説明する。
【００３７】
本発明の蛋白質精製用分離剤は、下記式（１）
【００３８】
【化９】
（上記式中、ｍは２〜６の整数を表す。）
で示されるリガンド、及び下記式（２）
【００３９】
【化１０】
（上記式中、Ｒ１、Ｒ２は各々独立して水素原子又は炭素数１〜４のアルキル基を表し、ｎは１〜６の整数を表す。）
で示されるリガンドからなる群より選ばれる１種又は２種以上のリガンドが、スペーサーアームを介することなく、担体上にウレタン結合により結合されていることをその特徴とする。
【００４０】
本発明において、リガンドとは、分離・精製を目的とする物質と特異的に結合する物質を意味する。
【００４１】
本発明において、上記式（１）で示されるリガンドとしては、特に限定するものではないが、下記式（３）
【００４２】
【化１１】
（上記式中、ｍは２〜４の整数を表す。）
で表されるリガンドが好ましく、４−ピリジルエチル基［上記式（３）中、ｍ＝２］が特に好ましい。
【００４３】
また、本発明において、上記式（２）で示されるリガンドとしては、特に限定するものではないが、下記式（４）
【００４４】
【化１２】
（上記式中、Ｒ１、Ｒ２は各々独立して水素原子又は炭素数１〜４のアルキル基を表し、ｎは１〜４の整数を表す。）
で表されるリガンドが好ましく、４−アミノベンジル基［上記式（４）中、Ｒ１、Ｒ２は水素原子、ｎ＝１］が特に好ましい。
【００４５】
本発明の蛋白質精製用分離剤に使用する担体としては、カラムクロマトグラフィー用の充填剤として使用される公知の担体を使用することができ、特に限定するものではない。例えば、多孔質ガラス、多孔質シリカゲル等の無機多孔質材料；アガロース、デキストラン、セルロース等の多糖類；ポリアクリルアミド、ポリメチルメタクリレート、ポリビニルアルコール、スチレン−ジビニルベンゼン共重合体等の合成高分子；等が好適なものとして挙げられる。
【００４６】
本発明においては、上記リガンドを、スペーサーアームを介することなく、ウレタン結合により担体上に結合するため、当該担体の表面に水酸基を有することが望ましい。また、担体の表面に従来公知の方法により水酸基を導入してもよい。
【００４７】
本発明の蛋白質精製用分離剤を工業スケールで使用する場合には、精製操作の後に充填剤のアルカリ洗浄が実施されるため、担体としては、アルカリに対して耐性のある多糖類や、合成高分子からなる担体が好ましい。合成高分子としては、親水性ビニルポリマーや、（メタ）アクリレート架橋共重合体等の架橋高分子が特に好ましい。
【００４８】
本発明において、担体の形状としては、その使用形態により異なるため、特に限定するものではないが、例えば、球状粒子、非球状粒子、膜、モノリス（連続体）等が挙げられる。例えば、カラムクロマトグラフィー用の充填剤として用いる場合には、粒子状とすることが好ましく、カラム中に均一な充填を行うためには球状粒子とすることがさらに好ましい。また、連続した一体型の円柱状の多孔質体をカラムに装着したものでもよい。さらには、膜状の分離剤を用いたクロマトグラフィーも可能である。
【００４９】
担体の形状を粒子状にして使用する場合、その大きさは、使用条件によって適当な大きさを選択することが好ましく、特に限定するものではないが、例えば、ＨＰＬＣ用の充填剤として用いる場合は、平均粒子径が５〜１５μｍ程度のものを用いるのが好ましく、８〜１２μｍの範囲のものがさらに好ましい。また、少量の分取を目的とする場合には通常１５〜５０μｍ程度、好ましくは２０〜３０μｍの範囲、工業プロセスで使用する目的では、通常５０〜３００μｍ程度、好ましくは５０〜１００μｍの範囲の平均粒子径のものを用いるのが好ましい。
【００５０】
本発明の充填剤において、上記したリガンドを、担体上にウレタン結合にて固定化する方法としては、従来公知の方法を用いることができる。
【００５１】
例えば、担体を有機溶媒中で活性化剤と反応させて、担体の表面に有する又は導入されている水酸基を活性化した後、その活性化担体を有機溶媒中で、下記式（５）
【００５２】
【化１３】
（上記式中、ｎは２〜６の整数を表す。）
で示される１級アミン、及び下記式（６）
【００５３】
【化１４】
（上記式中、Ｒ１、Ｒ２は各々独立して水素原子又は炭素数１〜４のアルキル基を表し、ｎは１〜６の整数を表す。）
で示される１級アミンからなる群より選ばれる１種又は２種以上のアミンと反応させることにより、ウレタン結合を形成して、上記リガンドをウレタン結合により担体上に固定化することができる。当該方法はにより、簡便かつ経済的に本発明の蛋白質精製用分離剤を調製することができる。
【００５４】
この固定化方法において、活性化剤としては、特に限定するものではないが、例えば、カルボニルジイミダゾール（ＣＤＩ）等が好適なものとして挙げられる。
【００５５】
また、上記式（５）で示される１級アミンとしては、下記式（７）
【００５６】
【化１５】
（上記式中、ｍは２〜４の整数を表す。）
で表される１級アミンが好ましく、４−（２−アミノエチル）ピリジン［上記式（７）中、ｍ＝２］が特に好ましい。
【００５７】
上記式（６）で示される１級アミンとしては、下記式（８）
【００５８】
【化１６】
（上記式中、Ｒ１、Ｒ２は各々独立して水素原子又は炭素数１〜４のアルキル基を表し、ｎは１〜４の整数を表す。）
で表される１級アミンが好ましく、４−アミノベンジルアミン［上記式（８）中、Ｒ１、Ｒ２は水素原子、ｎ＝１］が特に好ましい。
【００５９】
これらの一連の反応に用いる有機溶媒は、特に限定するものではないが、１，４−ジオキサンやジメチルスルホキシド等の非プロトン性溶媒を通常用いる。担体をＣＤＩで活性化する反応は、通常１５〜３０℃、好ましくは２０〜２５℃の範囲で実施し、反応時間は通常１時間〜３時間の範囲である。ＣＤＩで活性化した担体を、上記式（５）で示される１級アミン、及び上記式（６）で示される１級アミンからなる群より選べる１種又は２種以上のアミンと反応させ、上記したリガンドをウレタン結合により担体上に固定化する反応は、通常１５〜３０℃、好ましくは２０〜２５℃の範囲で実施し、反応時間は、通常１８〜３０時間の範囲である。
【００６０】
担体上のリガンドの含有量は、蛋白質吸着効率を著しく向上させるためには、担体１ｍｌ当たり、上記１級アミンが１００μｍｏｌ以上（以下、１００μｍｏｌ／ｍｌ−担体以上と表記する。）であることが好ましく、２００μｍｏｌ／ｍｌ−担体以上であることがより好ましい。
【００６１】
本発明の蛋白質精製用分離剤で精製できる蛋白質としては、特に限定するものではないが、例えば、免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）、免疫グロブリンＡ（ＩｇＡ）、免疫グロブリンＭ（ＩｇＭ）、免疫グロブリンＥ（ＩｇＥ）、アルブミン、キモトリプシノーゲンＡ、キモトリプシノーゲンＢ、キモトリプシノーゲンＣ、キモトリプシンＡα、キモトリプシンＣ、キモトリプシンインヒビター、トリプシン、トリプシンインヒビター、リゾチーム、リボヌクレアーゼＡ、リボヌクレアーゼＴ１、リボヌクレアーゼＴ２、アスパラギナーゼ、α−アミラーゼ、β−アミラーゼ、α−アミラーゼインヒビターＩ、α−アミラーゼインヒビターＩＩ、アルギナーゼ、インスリン、インターフェロン、ウリカーゼ、ウロキナーゼ、エストロゲンレセプターＩ、エノラーゼ、エラスターゼ、エリスロポエチン、黄体形成ホルモン、カタラーゼ、カリクレイン、カリクレインインヒビター、カルシトニン、キモシン、プロキモシン、パパイン、キモパパインＡ、キモパパインＢ、グルカゴン、α−グルコシダーゼ、β−グルコシダーゼ、血液凝固因子、甲状腺刺激ホルモン、コリンエステラーゼ、コンカナバリンＡ、チトクロームｂ５、チトクロームｂ５６２、チトクロームｃ、チトクロームｃ２、チトクロームｃ５５０、チトクロームｆ、スブチリシン、成長ホルモン、セルラーゼ、セルロプラスミン、チログロブリン、ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼ、デオキシリボヌクレアーゼＩ、デオキシリボヌクレアーゼＩＩ、デオキシリボヌクレアーゼインヒビターＩＩ、トランスフェリン、トリプシノーゲン、トロンビン、プロトロンビン、ヌクレアーゼ、ノイラミニダーゼ、パンクレアチン、フィブリノーゲン、副甲状腺ホルモン、副腎皮質刺激ホルモン、プラスミノーゲン、プラスミン、プラスミンインヒビター、プロテアーゼ、プロテアーゼインヒビター、プロテインキナーゼ、プロラクチン、ヘキソキナーゼ、ペプシノーゲン、ペプシン、ヘモグロビン、ヘモシアニン、ヘモペキシン、ペルオキシダーゼ、ホスホグルコムターゼ、ホスホグリセロムターゼ、ホスホリパーゼＡ２、ホスホリパーゼＣ、ホスホリラーゼａ、ホスホリラーゼｂ、ホスホリラーゼキナーゼ、ポリアミンオキシダーゼ、ミオグロビン、メタロチオネイン、モノアミンオキシダーゼ、α−ラクトアルブミン、β−ラクトグロブリン、ラクトフェリン、リパーゼ、レクチン、レニン、ロドプシン等が挙げられる。これらの蛋白質は、天然由来でも組み換え型でも良い。
【００６２】
本発明の蛋白質の精製方法は、精製目的の蛋白質を生理食塩水程度の濃度の塩を含む第一の緩衝液に溶解させ、その蛋白質溶液を本発明の蛋白質精製用分離剤と接触させて、蛋白質を吸着させた後、第一の緩衝液とｐＨが異なる第二の緩衝液を当該分離剤に流して、当該分離剤に吸着した蛋白質を溶出させることをその特徴とする。
【００６３】
本発明の精製方法において、精製目的の蛋白質を蛋白質精製用分離剤と接触させる方法としては、特に限定するものではないが、例えば、従来公知のカラムクロマトグラフィーによる方法を使用することができる。すなわち、本発明の蛋白質精製用分離剤をカラムへ充填し、蛋白質溶液を蛋白質精製用分離剤が充填されたカラムに付与し、その後、当該蛋白質を溶出させる。
【００６４】
本発明の精製方法において、本発明の蛋白質精製用分離剤に吸着した蛋白質を溶出させる方法としては、特に限定するものではないが、例えば、溶離液の塩濃度及び溶離液のｐＨを直線的に変化させ、吸着した蛋白質を溶出させる方法（リニアグラジエント溶出）、溶離液の塩濃度及び溶離液のｐＨを段階的に変化させ、吸着した蛋白質を溶出させる方法（ステップワイズグラジエント溶出）等を使用することができる。
【実施例】
【００６５】
以下の実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明はこれら実施例により限定して解釈されるものではない。
【００６６】
なお、ＴＳＫｇｅｌトヨパールＨＷタイプ（商品名，東ソー社製）は、親水性ビニルポリマーを基材とした中速サイズ排除クロマトグラフィー用充填剤であり、実施例において担体として使用したＴＳＫｇｅｌトヨパールＨＷ−６５（商品名，東ソー社製）は、蛋白質排除限界分子量が約５，０００，０００の親水性ビニルポリマーを基材とした中速サイズ排除クロマトグラフィー用充填剤である。
【００６７】
（リガンド固定化量の測定方法）
東ソー社製ＵＶ−８０１０検出器と東ソー社製ＣＣＰＭ−ＩＩポンプに、東ソー社製ＴＳＫｇｅｌ ＯＤＳ−８０Ｔｓ（内径０．４６ｃｍ，長さ１５ｃｍ）カラムを装着した。４０（ｖ／ｖ）％アセトニトリル水溶液に、０．５（ｖ／ｖ）％となるようにトリフルオロ酢酸を添加した溶離液を別途調製した。溶離液を０．５ｍＬ／ｍｉｎ．の流速でカラムに流し、１級アミンの固定化実施前後の懸濁液５０μＬを採取し、２ｍＬの溶離液で希釈した上澄みの１０μＬを注入して、ＵＶ−８０１０の波長２５４ｎｍで検出したとき、約３．０分に出現するピーク高さの割合から、固定化に使用された１級アミンの量（μｍｏｌ／ｍｌ−担体）を求め、リガンド固定化量とした。
【００６８】
（ＩｇＧ結合量の測定方法）
実施例に示した蛋白質精製用分離剤を製造後、その０．５ｍＬをオープンカラム（内径０．８ｃｍ，長さ１０ｃｍ）に充填し、緩衝液Ｂ（５０ｍＭクエン酸ナトリウム、ｐＨ３．０）３ｍＬ，次いで緩衝液Ａ（０．１５Ｍ塩化ナトリウムを含む５０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．２）５ｍＬを３回流して平衡化した。１５０ｍｇ／ｍＬのＩｇＧを含有したヒトγ−グロブリン（化学及血清療法研究所製）を、緩衝液Ａで１０ｍｇ／ｍＬの濃度となるように調製した溶液５ｍＬをカラムに添加し、密閉後室温で１時間穏やかに振とうして、充填剤にＩｇＧを結合させた。緩衝液Ａ５ｍＬでカラムを洗浄後、緩衝液Ｂ５ｍＬを流してＩｇＧを脱着回収し、日立製作所社製Ｕ−２０１０紫外可視分光光度計で２８０ｎｍの波長での吸光度から、蛋白質精製用分離剤１ｍｌに吸着したＩｇＧの量（μｍｏｌ／ｍＬ−分離剤）を求め、ＩｇＧ結合量とした。
【００６９】
実施例１．
ＴＳＫｇｅｌトヨパールＨＷ−６５を分級後、１，４−ジオキサンに置換し、その１０ｇを１００ｍＬのセパラブルフラスコに秤量し、そこへＣＤＩを０．７０ｇ／ｇ−乾燥トヨパール量となるように添加した。そこへ１，４−ジオキサン２０ｍＬを添加し、２００ｒｐｍの回転数で、室温中１．５時間攪拌翼で攪拌して活性化を行った。得られたＣＤＩ活性化トヨパールを１００ｍＬの１，４−ジオキサンで洗浄後、１００ｍＬのセパラブルフラスコに移し、１，４−ジオキサン２０ｍＬを添加後、乾燥トヨパール１ｇ当たり０．６１ｇとなるように、１級アミンとして４−アミノベンジルアミンを添加し（以下、０．６１ｇ／ｇ−乾燥トヨパール量と表記する。）、２００ｒｐｍの回転数で、室温中２４時間攪拌翼で攪拌して固定化を行い、本発明の蛋白質精製用分離剤を製造した。
【００７０】
４−アミノベンジルアミンが固定化された蛋白質精製用分離剤を７５質量％の１，４−ジオキサン水溶液３０ｍＬ，３３質量％の１，４−ジオキサン水溶液２０ｍＬ，純水１００ｍＬ，０．１Ｎ ＨＣｌ水溶液２０ｍＬ，純水１００ｍＬの順で洗浄した。その後、上記した方法により、ＩｇＧの結合量を測定したところ、５０ｍｇ／ｍＬ−充填剤であった。また、上記した方法により、リガンド固定化量を求めたところ、４０４μｍｏｌ／ｍＬ−担体であった。
【００７１】
さらに、製造した蛋白質精製用分離剤をステンレスカラム（内径０．７５ｃｍ，長さ７．５ｃｍ）に充填し、０．１５Ｍ塩化ナトリウムを含有した５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．２）で平衡化し、ＩｇＧ，トリプシンインヒビター，ヒト血清アルブミン，ウシ血清アルブミン，リボヌクレアーゼＡ，α−ラクトアルブミンの各々２．５ｍｇ／ｍＬ、及びα−キモトリプシノゲンＡ，リゾチームの各々２．０ｍｇ／ｍＬの２００μＬを各々単独で注入したとき、注入した蛋白質は全て蛋白質精製用分離剤に吸着された。その後、５０ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ３．０）にステップワイズで切り替えたとき、蛋白質精製用分離剤に吸着された蛋白質が脱着回収された。
【００７２】
実施例２．
固定化に用いる４−アミノベンジルアミンの量を０．３１ｇ／ｇ−乾燥トヨパール量となるようにした以外は、実施例１と同様に実施し、本発明の蛋白質精製用分離剤を製造した。
【００７３】
製造した蛋白質精製用分離剤を、実施例１と同様に洗浄した後、上記した方法により、ＩｇＧの結合量を測定したところ、２９ｍｇ／ｍＬ−分離剤であった。また、上記した方法により、リガンド固定化量を求めたところ、１１８μｍｏｌ／ｍＬ−担体であった。
【００７４】
さらに、製造した蛋白質精製用分離剤をステンレスカラム（内径０．７５ｃｍ，長さ７．５ｃｍ）に充填し、実施例１と同様に蛋白質をカラムに注入したところ、ＩｇＧ，トリプシンインヒビター，α−キモトリプシノゲンＡ，及びリゾチームが充填剤に吸着され、その他の蛋白質は素通りした。５０ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ３．０）にステップワイズで切り替えたとき、蛋白質精製用分離剤に吸着された蛋白質が脱着回収された。
【００７５】
実施例３．
１級アミンとして４−（２−アミノエチル）ピリジンを０．７６ｇ／ｇ−乾燥トヨパール量となるように用いた以外は、実施例１と同様に実施し、本発明の蛋白質精製用分離剤を製造した。
【００７６】
製造した蛋白質精製用分離剤を、実施例１と同様に洗浄後、上記した方法により、ＩｇＧの結合量を測定したところ、１９ｍｇ／ｍＬ−充填剤であった。
【００７７】
さらに、製造した蛋白質精製用分離剤をステンレスカラム（内径０．７５ｃｍ，長さ７．５ｃｍ）に充填し、実施例１と同様に蛋白質をカラムに注入したところ、ＩｇＧ，トリプシンインヒビター，α−キモトリプシノゲンＡ，及びリゾチームが充填剤に吸着され、その他の蛋白質は素通りした。５０ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ３．０）にステップワイズで切り替えたとき、蛋白質精製用分離剤に吸着された蛋白質が脱着回収された。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式（１）
【化１】
（上記式中、ｍは２〜６の整数を表す。）
で示されるリガンド、及び下記式（２）
【化２】
（上記式中、Ｒ１、Ｒ２は各々独立して水素原子又は炭素数１〜４のアルキル基を表し、ｎは１〜６の整数を表す。）
で示されるリガンドからなる群より選ばれる１種又は２種以上のリガンドが、担体上にウレタン結合により結合されていることを特徴とする蛋白質精製用分離剤。
【請求項２】
式（１）で示されるリガンドが、下記式（３）で表わされることを特徴とする請求項１に記載の蛋白質精製用分離剤。
【化３】
（上記式中、ｍは２〜４の整数を表す。）
【請求項３】
式（２）で示されるリガンドが下記式（４）
【化４】
（上記式中、Ｒ１、Ｒ２は各々独立して水素原子又は炭素数１〜４のアルキル基を表し、ｎは１〜４の整数を表す。）
で表されることを特徴とする請求項１又は請求項２に記載の蛋白質精製用分離剤。
【請求項４】
担体上のリガンドの含有量が、１００μｍｏｌ／ｍｌ−担体以上であることを特徴とする請求項１乃至請求項３のいずれか記載の蛋白質精製用分離剤。
【請求項５】
担体が、架橋高分子からなる担体であることを特徴とする請求項１乃至請求項４のいずれかに記載の蛋白質精製用分離剤。
【請求項６】
担体を有機溶媒中で活性化剤と反応させ、担体表面の水酸基を活性化した後、その活性化担体を有機溶媒中で、下記式（５）
【化５】
（上記式中、ｎは２〜６の整数を表す。）
で示される１級アミン、及び下記式（６）
【化６】
（上記式中、Ｒ１、Ｒ２は各々独立して水素原子又は炭素数１〜４のアルキル基を表し、ｎは１〜６の整数を表す。）
で示される１級アミンからなる群より選ばれる１種又は２種以上のアミンと反応させることを特徴とする請求項１乃至請求項５のいずれかに記載の蛋白質精製用分離剤の製造方法。
【請求項７】
式（５）で示される１級アミンが、下記式（７）で表わされることを特徴とする請求項６に記載の蛋白質精製用分離剤の製造方法。
【化７】
（上記式中、ｍは２〜４の整数を表す。）
【請求項８】
式（６）で示される１級アミンが下記式（８）
【化８】
（上記式中、Ｒ１、Ｒ２は各々独立して水素原子又は炭素数１〜４のアルキル基を表し、ｎは１〜４の整数を表す。）
で表されることを特徴とする請求項６又は請求項７に記載の蛋白質精製用分離剤の製造方法。
【請求項９】
活性化剤がカルボニルジイミダゾールであることを特徴とする請求項６乃至請求項８のいずれかに記載の蛋白質精製用分離剤の製造方法。
【請求項１０】
精製目的の蛋白質を第一の緩衝液に溶解させ、その蛋白質溶液を、請求項１乃至請求項５のいずれかに記載の蛋白質精製用分離剤と接触させて蛋白質を吸着させた後、第一の緩衝液とｐＨが異なる第二の緩衝液を当該分離剤に流して、当該分離剤に吸着した蛋白質を溶出させることを特徴とする蛋白質精製方法。
【請求項１】
下記式（１）
【化１】
（上記式中、ｍは２〜６の整数を表す。）
で示されるリガンド、及び下記式（２）
【化２】
（上記式中、Ｒ１、Ｒ２は各々独立して水素原子又は炭素数１〜４のアルキル基を表し、ｎは１〜６の整数を表す。）
で示されるリガンドからなる群より選ばれる１種又は２種以上のリガンドが、担体上にウレタン結合により結合されていることを特徴とする蛋白質精製用分離剤。
【請求項２】
式（１）で示されるリガンドが、下記式（３）で表わされることを特徴とする請求項１に記載の蛋白質精製用分離剤。
【化３】
（上記式中、ｍは２〜４の整数を表す。）
【請求項３】
式（２）で示されるリガンドが下記式（４）
【化４】
（上記式中、Ｒ１、Ｒ２は各々独立して水素原子又は炭素数１〜４のアルキル基を表し、ｎは１〜４の整数を表す。）
で表されることを特徴とする請求項１又は請求項２に記載の蛋白質精製用分離剤。
【請求項４】
担体上のリガンドの含有量が、１００μｍｏｌ／ｍｌ−担体以上であることを特徴とする請求項１乃至請求項３のいずれか記載の蛋白質精製用分離剤。
【請求項５】
担体が、架橋高分子からなる担体であることを特徴とする請求項１乃至請求項４のいずれかに記載の蛋白質精製用分離剤。
【請求項６】
担体を有機溶媒中で活性化剤と反応させ、担体表面の水酸基を活性化した後、その活性化担体を有機溶媒中で、下記式（５）
【化５】
（上記式中、ｎは２〜６の整数を表す。）
で示される１級アミン、及び下記式（６）
【化６】
（上記式中、Ｒ１、Ｒ２は各々独立して水素原子又は炭素数１〜４のアルキル基を表し、ｎは１〜６の整数を表す。）
で示される１級アミンからなる群より選ばれる１種又は２種以上のアミンと反応させることを特徴とする請求項１乃至請求項５のいずれかに記載の蛋白質精製用分離剤の製造方法。
【請求項７】
式（５）で示される１級アミンが、下記式（７）で表わされることを特徴とする請求項６に記載の蛋白質精製用分離剤の製造方法。
【化７】
（上記式中、ｍは２〜４の整数を表す。）
【請求項８】
式（６）で示される１級アミンが下記式（８）
【化８】
（上記式中、Ｒ１、Ｒ２は各々独立して水素原子又は炭素数１〜４のアルキル基を表し、ｎは１〜４の整数を表す。）
で表されることを特徴とする請求項６又は請求項７に記載の蛋白質精製用分離剤の製造方法。
【請求項９】
活性化剤がカルボニルジイミダゾールであることを特徴とする請求項６乃至請求項８のいずれかに記載の蛋白質精製用分離剤の製造方法。
【請求項１０】
精製目的の蛋白質を第一の緩衝液に溶解させ、その蛋白質溶液を、請求項１乃至請求項５のいずれかに記載の蛋白質精製用分離剤と接触させて蛋白質を吸着させた後、第一の緩衝液とｐＨが異なる第二の緩衝液を当該分離剤に流して、当該分離剤に吸着した蛋白質を溶出させることを特徴とする蛋白質精製方法。
【公開番号】特開２０１０−２９８４５（Ｐ２０１０−２９８４５Ａ）
【公開日】平成２２年２月１２日（２０１０．２．１２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−１４７５８６（Ｐ２００９−１４７５８６）
【出願日】平成２１年６月２２日（２００９．６．２２）
【出願人】（０００００３３００）東ソー株式会社 (1,901)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年２月１２日（２０１０．２．１２）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年６月２２日（２００９．６．２２）
【出願人】（０００００３３００）東ソー株式会社 (1,901)
【Ｆターム（参考）】
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