蛍光による分析対象物質の決定における多機能参照システム
本発明は液体試料中の分析対象物質をルミネセンスによって検出するためのシステムに関し、そのシステムは分析対象物質に特異的な物質と比較参照物質を含む担体を包含する。さらに、本発明は前記システムを使って液体試料中の分析対象物質を検出する方法に関する。本発明によるシステムは、分析対象物質の検出以外に、分析試料量の決定、分析対象物質量の決定、および／または検出用担体の使用準備状態の確認にも適する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は液体試料中の分析対象物質をルミネセンスによって検出するためのシステムに係り、そのシステムは分析対象物質に特異的な物質と比較参照物質を含む担体を包含する。さらに、本発明は前記システムを使って液体試料中の分析対象物質を検出する方法にも係る。本発明によるシステムは、分析対象物質の検出以外に、分析試料量の決定、分析対象物質量の決定、および／または検出用担体の使用準備状態の確認にも適する。
【０００２】
分析対象物質を検出する、本発明によるシステムおよび方法は、ルミネセンスによる検出、特に蛍光による検出に基づいている。
【背景技術】
【０００３】
このようなシステムは、現在の技術水準において、すでに古くから知られている。現在の分析法にあって、分析検査エレメントの光度測定による評価は、試料中の分析対象物質の迅速な検出または濃度の迅速な決定を行うために、最もよく使用されている方法の一つである。一般に、光度測定評価は、分析、環境分析の分野に加えて、特に医療診断の分野で使用されている。特に、毛細血管から採取した血液の分野では光度測定によって評価される検査エレメントが、非常に重要な位置を占めている。
【０００４】
蛍光分光光度測定による検出システムの場合、蛍光を発する物質の発光強度は、励起強度に直接に比例する。励起強度は、多くの要因、たとえば光源の時間的変化や光路の変化によって影響を受ける。正に、確定目的以外に使用される検査室の小型機器では、光路に変化があると励起強度にも変化が生じる。それゆえ、再現性を維持して蛍光の絶対強度を測定することはきわめて困難である。
【０００５】
したがって、現在使用されている蛍光検査システムは、これとの関連づけが可能な比較参照物質が使われる。そのような比較参照物質にはさまざまな種類のものが知られている。
【０００６】
たとえば、現在の技術水準では、蛍光物質に基づく検出系に、分析対象物質に特異的な蛍光物質とは異なる波長で発光する第二の蛍光物質が使用されることが知られている。それゆえ、この第二の蛍光物質を比較参照物質として使用できる。その場合、両蛍光物質の区別は、二つの異なるフィルター（および二つの検出器）によって行うことができ、その場合、一方の蛍光物質は化学反応を受けず、比較参照物質として使用できる。この検出システムは、たとえば文献：Principles of Fluoresence Spectroscopy, J.R. Lackowicz, Kluver Academic/Plenum Publishers, New York, Boston, Dordrecht, Moscow １９９９年、第２版に記載されている。
【０００７】
別の手法として、時間を分割して参照する方法と位相を変調する方法とがある。これらの方法では、分析対象物質に特異的な蛍光物質が短寿命なのに対してそれより寿命の長いきわめて長寿命な蛍光物質が比較参照物質として使用される。寿命の長いルミネセンスは分析対象物質のパラメーターに影響を及ぼさないのに対して、分析対象物質に特異的な短寿命発光物質の強度は、分析対象物質のそのときどきの濃度によって変化する。そこで、最初に分析対象物質の蛍光物質を時間分割法で測定し、そのあとで比較参照物質の（蛍光の）減衰を測定する。減衰信号と、分析対象物質の信号と比較参照物質の信号との比は、入射強度に関係なく常に一定でなくてはならない。
【０００８】
ＷＯ第９９／０６８２１号はそのようなシステムを開示している。それによれば、少なくとも２種類の発光物質が一つの共通担体上に固定化され、そのうちの第一の発光物質は、少なくともルミネセンス強度が、分析対象物質の決定すべきパラメータに対応し、そして第二の発光物質は、少なくともルミネセンス強度および減衰時間が、測定すべきパラメーターには対応しない。発光物質は減衰時間がそれぞれ異なっている。それゆえ、生じるルミネセンス応答の時間的および位相的挙動を、比較対照物質の測定すべきパラメーターを決定するための比較参照量の形成に使用することができる。
【０００９】
ＷＯ第０２／０５６０２３号は、試料の少なくとも一つのパラメーターを決定するための光学センサーを開示しているが、ここでもパラメーターに対応する、減衰時間の短い表示物質とパラメーターに対応しない、減衰時間の長い比較参照物質が使われる。その場合、表示物質および比較参照物質は一つの共通短体上に固体され、試料側は光透過性の層で被覆される。
【００１０】
異なる波長で測定される第二の蛍光物質を通じて参照することは、当然に、機器面で必要コストが高くなる。たとえば、励起光を遮蔽できるようにするため、ただ一つのフィルターに替わって二つのフィルターが必要となり、普通それに合わせて検出器も二つ必要になる。それに加えて、励起後の光路を異なる検出器に分離することで、両光路の一方に間違いが生じるおそれがあり、その場合は間違った比較参照が行われることになる。
【００１１】
時間分割または位相分割による比較参照には、常に発光性バックグラウンドを背景にして分析対象物質の測定を行わなければならないという欠点がある。このことは、測定範囲を制限するある一定のオフセットまたはシグナルバックグラウンドがあることを意味している。この原理は、図１に例示されている。
【００１２】
図１には比較参照を使用した場合の分析シグナルの測定範囲と使用しない場合の測定範囲があげてある。参照蛍光物質を使用しない場合、測定範囲は、包含すべきダイナミックレンジに最もよく合致する。それに対して参照蛍光物質を使用する場合は、比較参照の測定範囲の一部が要求される。
【００１３】
比較参照物質または比較対照発光物質は、分析対象物質と比較するための比較参照物質としてのみ使用でき、それ以外の機能を満たすことはできない。
【００１４】
しかし、検査の場（Testfeld）が湿っていることを認識することと充填状態を監視することも、診断分野で分析対象物質を決定するときの重要なテーマである。
【００１５】
この領域にも、現在の技術水準において、既存の方法を改善すべき点がある。ＷＯ第８３／００９３１号は、液体試料のつける量が十分か判定し、検出するための装置および方法を開示している。それは、光源を包む液滴検知器から、水吸収バンドの中に置かれた試料に光が当たるようにすることで実現される。まず乾燥状態で試料の担体に光を当て、それから湿潤状態で光を当てて水分を測定する。つづいて、検出した信号の差から試料の水分含量を計算する。
【００１６】
米国特許第５，１１４，３５０号は、体液試料中の分析対象物質の濃度を決定する方法および装置を開示している。水分量が増すほど減少する反射光の強さを測定することで、反応担体の水分量が測定される。
【００１７】
ＤＥ第１０２４８５５５ Ａ１号は、検査ストリップの用量不足を知り、それを補償するための方法を開示している。この明細書には、試料中の分析対象物と相互作用する、分析対象物質に特異的な試薬と、試料の試料マトリックスと相互作用する対照物質とを、包含する検査エレメントが記載されている。分析対象物質と特異的に反応する試薬は、検出波長領域における分析対象物質の濃度に依存して、分析対象物質の濃度と相互作用する。対照シーケンスは、検査場に照射すると、検査場に供される試料の量に依存して、試料マトリックスと相互作用する。その場合、対照物質は、試料マトリックスに含まれる水分とも反応する。ＤＥ第１０２４８５５５号に挙げられている例は、試料量を決定するための、分析対象物質に依存しない色素形成物質としてクロロフェノールレッドを、また、試料中の、たとえば血液中のブドウ糖の濃度を決定するための、分析対象物質に特異的な試薬として２，１８−リンモリブデン酸を使用している。したがって、この明細書の上に挙げた例では、２つの波長領域で検出を行う必要があり、そのためこの検査システムは装置的にコストがかかる。
【００１８】
本発明の根底にある課題は、比較参照物質と、分析対象物質に特異的な物質とを使用し、その際、現在の技術水準に記載されているコストのかかる装置を購入する必要がない、液体試料中の分析対象物質を検出するためのシステムおよび方法を提供することにある。
【発明の開示】
【００１９】
本発明の課題は、担体を包含し、分析対象物質と接触してルミネセンスを放射できる、分析対象物質に特異的な物質と、液体試料接触することによって実質的に消される（消光される）第二のルミネセンスシグナルを発することができる比較参照物質とを包含し、液体試料中の分析対象物質のルミネセンスを検出するシステムによって解決される。
【００２０】
驚いたことに、本発明による比較参照物質を使用すれば、試料が存在しなければ比較参照シグナルとして使用できるルミネセンスシグナルを発生し、現在の技術水準によって公知の検出法を単純化することができる。このルミネセンスは、試料を添加すると実質的に消され、もはや実質的にシグナルが発生しないか、少なくとも大幅にシグナルが減衰する。
【００２１】
分析対象物質に特異的な物質に見られるように、励起波長と発光波長とが実質的に同じ場合は、本発明にとって特に有利である。このことはルミネセンスの検出に必要な検出器が一つですむことを意味している。
【００２２】
比較参照物質の特性により、試料の不在で発生するルミネセンスシグナルは、試料と接触させると消されるため、比較参照物質は、分析対象物質の検出だけでなく、試料量の決定、分析対象物質量および／または担体機能の準備状態の確認にも使用できる。比較参照物質は、たとえば、濡れるとシグナルが消されるように選択することができる。そうすれば、検査システムが機能する準備ができているかを目で見て確認できるようにすることができる。すなわち、検査システムを含む担体が保存時に湿ってしまうか、そのような物質あるいは別の物質が担体と接触すると、比較参照物質のこのルミネセンスシグナルが消されるため、この検査システムが機能する準備ができていないことがわかる。
【００２３】
消光は、好ましくは可逆的である、すなわち試料を取り去るか、具体的には、湿潤状態を取り去るか、もとの状態に戻せば、ルミネセンスシグナルを再度発生させることができる。
【００２４】
そうすれば、比較参照することとならんで、湿潤状態を知ること、および／または充填状態の監視が、本発明によるシステムで実現可能となる。たとえば、検査場が担体上に準備されていて、その検査場が試料で十分湿潤されなかった場合、ルミネセンスシグナルは残ったままになる。その場合は、残ったルミネセンスを使ってコンピューターで計算し、分析対象物質に対する補正を行うことができる。
【００２５】
ルミネセンスの特性が、環境の水分に対して可逆的な場合は、このような比較参照物質を水分インジケーターとして使うことができる。その場合、水分インジケーターは、検査システムの保存条件および、このシステムが機能するための準備状態に関する情報をもたらす。この比較参照物質は、検査システムの選択すべき使用期限に対するインジケーターとして使用することもできる。
【００２６】
このような特性を持つルミネセンス物質、そして特に蛍光物質は、現在の技術水準ではほとんど知られていない。ほとんどの蛍光物質は湿潤環境で蛍光性を高め、消されない。
【００２７】
分析対象物質に特異的な物質のルミネセンス特性がｐＨ値に依存する場合は、分析対象物質に特異的な物質をｐＨ値の決定に使用できる。それゆえ、一つの実施形態において、本発明によるシステムは、ｐＨセンサー、すなわち、そのルミネセンスシグナルがｐＨ値に依存する物質から、分析対象物質に特異的な物質が選択される。この実施形態において、比較参照物質は、好ましくは、ｐＨ値が変動したときにそのルミネセンスシグナルが実質的に消されてしまうような物質であってはならない。たとえば、約３．５ないし約７．０または約４．５ないし約６．０の範囲でｐＨ値を決定するには、分析対象物質に特異的な物質としては、好ましくはＬｙｓｏＳｅｎｓｏｒ Ｂｌｕｅ ＤＮＤ−１６７か、またはその誘導体である。
【００２８】
本発明によるｐＨセンサーの担体は、好ましくは、試料をつける前に、分析対象物質に特異的な物質が実質的にルミネセンスを示さないｐＨ値を有する。ＬｙｓｏＳｅｎｓｏｒ Ｂｌｕｅ ＤＮＤ−１６７の場合、約７ないし約１０か、または約８ないし約９の範囲から選択されるｐＨが可能である。
【００２９】
また、緩衝作用によって、担体のｐＨ値が事実上完全に試料のｐＨ値に変わるよう、あらかじめ担体のｐＨ値を設定しておくことができる。当業者は、どのようにして担体にこのような緩衝能力を設定すべきか、その方法を知っている。
【００３０】
試料と接触することによって、実質的に消されるルミネセンスシグナルを発生することができる物質であれば、いかなる物質であっても、原理的には比較参照物質の対象となりうる。すなわち、試料成分と接触することにより、そのルミネセンスシグナルが消される物質であればあらゆる種類の物質が使用できる。検査試料中にあって、消光を引き起こすことのできる成分は、たとえば水、カルシウム、マグネシウムもしくはその他の金属、またはそれらのイオン、ｐＨ値、およびその他の要因である。
【００３１】
消光を引き起こす要因が水の場合は、好ましくは、式Ｉで表されるカルコン類から比較参照物質が選ばれる。
【００３２】
現在の技術水準において、カルコンは公知である（B.M. Krasovitskii, D.G. Pereyaslova, ZH.Vsesoyuznogo Obscchestva im. D.I. Mendeleeva, 10(6), 704(1965); G.E. Dobretsov, V.A. Petrov, Yu.A. Vladimirov, Studia Biophysica Berlin, 71(3), 181-187(1978)）。
【００３３】
好ましい物質は一般式Ｉで表される：
【化１】
式中、残基Ｒ2、Ｒ3、およびＲ5の一つはＮＲ11Ｒ12およびＳＯ3Ｎａの中から選択され、残りの置換基Ｒ1、Ｒ4、Ｒ6、Ｒ7、Ｒ8、Ｒ9およびＲ10は任意の置換基が可能であるが、好ましくは水素またはハロゲン、特にＦ，Ｃｌ，ＢｒおよびＩである。
【００３４】
Ｒ11およびＲ12は、好ましくは水素、Ｃ1−Ｃ4アルキル、特にメチル、エチル、プロピルおよびブチルであり、その場合、Ｃ1−Ｃ4アルキルは−ＯＨ、−ＳＨ、ホスファート、−ＣＯＯＨ、−ＮＨ2、−ＳＯ3Ｎａ、−ＮＯ2、ハロゲン、特にＦ，Ｃｌ，ＢｒおよびＩで置換が可能である。好ましい置換アルキル基はＣＨ2ＣＨ2−ＳＯ3Ｎａである。
【００３５】
本発明による比較参照物質として好適な、特に好ましい物質は、特に式II、IIIおよびIVで表されるアミノカルコンおよびクロロカルコンである。
【化２】
【化３】
【化４】
【００３６】
クロロカルコンは、Krasovitskiiの方法によって合成した（B.M. Krasovitskii, D.G. Pereyaslova, ZH. Vsesoyuznogo Obscchestva im. D.I. Mendeleeva, 10(6), 704(1965)）。
【００３７】
Ｒ11およびＲ12がメチル基のアミノカルコンは、市販品が入手可能であり、方向づけの研究に使用した。
【００３８】
一般式Ｖで表され、Ｒ11およびＲ12の両方が、ＣＨ2ＣＨ2−ＳＯ3Ｎａであるアミノカルコンは、多段階合成によって調製した。
【００３９】
さらに別の好ましい物質は、式Ｖで表される物質である。
【化５】
【００４０】
消光反応は、金属イオンでも引き起こすことができる。それゆえ、この種の化合物も本発明による比較参照物質として好適であり、そのルミネセンスシグナルは、金属イオンと接触すると実質的に消される。
【００４１】
特に、カルシウムイオンまたはマグネシウムイオンと接触するとルミネセンスシグナルが消されるように、比較参照物質を選択することが可能である。それには、たとえばＣａ2+および／またはＭｇ2+と錯形成したとき、蛍光が停止するか、大きく減衰する蛍光色素が考慮の対象になる。
【００４２】
このような蛍光色素の一例は、Ｍｏｌｐｒｏｂｅｓ社から入手できるＦｕｒａＲＥＤである。ＦｕｒａＲＥＤの構造は次式で表される：
【化６】
【００４３】
本発明による好適な第三の比較参照物質は、ｐＨ変化に応答する物質である。ｐＨ値が変化すると、そのルミネセンスシグナルが実質的に消される物質がこれに該当する。
【００４４】
これは、たとえば血液のような試料に対して特に有利である。血液はきわめて大きな緩衝能力を持つため、あらかじめ検査システムに設定されたｐＨ値をカバーできる。たとえば検査システムを低いｐＨ値（たとえばｐＨ５）に設定しても、血液試料をつけたときに検査システムのｐＨ値は７に変化する。
【００４５】
このような比較参照物質の例はＭｏｌｐｒｏｂｅｓのＬｙｓｏＳｅｎｓｏｒ Ｂｌｕｅ ＤＮＤ−１６７（カタログ番号Ｌ７５３３、ＡＢＳ／ＥＭ’ｎｍ）：３７３／４２５， ＰＫＡ：５．１、好適なｐＨ範囲：４．５〜６．０）である。
【００４６】
ＬｙｓｏＳｅｎｓｏｒ Ｂｌｕｅ ＤＮＤ−１６７
【化７】
【００４７】
さらに、本発明によるシステムまたは本発明による方法には、ＬｙｓｏＳｅｎｓｏｒ Ｂｌｕｅ ＤＮＤ−１６７より水溶性に優れたＬｙｓｏＳｅｎｓｏｒ Ｂｌｕｅ ＤＮＤ−１６７の誘導体を使用することができる。水溶性が高いと分析対象物質を含む試料との反応速度を高めることができる。
【００４８】
本発明によるＬｙｓｏＳｅｎｓｏｒ Ｂｌｕｅ ＤＮＤ−１６７の誘導体において、一つ以上の水素原子が互いに独立に置換基で置換され、その際、一つの炭素原子が複数個の置換基を持つことができる。特に好適な置換基は、少なくとも一つの正電荷および／または負電荷を有することのできる極性置換基である。
【００４９】
ＬｙｓｏＳｅｎｓｏｒ Ｂｌｕｅ ＤＮＤ−１６７のアントラセン骨格の水素が結合するすべての位置、二つのモルホリニル基および二つのメチレン基が、本発明による置換に適している。
【００５０】
ＬｙｓｏＳｅｎｓｏｒ Ｂｌｕｅ ＤＮＤ−１６７の本発明による誘導体は、正確には、１個、２個、３個または４個の置換基を有することが好ましい。
【００５１】
好ましい置換基として、は−ＯＨ、−ＳＨ、ホスファート、−ＣＯＯＲ11、−ＮＲ11Ｒ12、−ＳＯ3Ｎａ、−ＮＯ2、ハロゲン、特にＦ，Ｃｌ，ＢｒおよびＩを挙げることができる。Ｒ11およびＲ12は、好ましくは水素、Ｃ1−Ｃ4アルキル、特にメチル、エチル、プロピルおよびブチルから選択され、その場合、Ｃ1−Ｃ4アルキルは−ＯＨ、−ＳＨ、ホスファート、−ＣＯＯＨ、−ＮＨ2、−ＳＯ3Ｎａ、−ＮＯ2、ハロゲン、特にＦ，Ｃｌ，ＢｒおよびＩで置換が可能である。好ましい置換アルキル基はＣＨ2ＣＨ2−ＳＯ3Ｎａである。
【００５２】
ＬｙｓｏＳｅｎｓｏｒ Ｂｌｕｅ ＤＮＤ−１６７の誘導体は、たとえば式VIIで表される化合物である：
【化８】
【００５３】
好ましい実施形態において、本発明によるシステムはブドウ糖、特に血糖を決定するためのシステムである。分析対象物質に特異的な物質としては、たとえばＮＡＤまたはＮＡＤＰが使用可能であり、両者は、適当な酵素、たとえばグルコースデヒドロゲナーゼの存在で、ルミネセンスを示すＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨを形成する。ブドウ糖を決定するための本発明によるシステムにおいて、比較参照物質には、たとえばｐＨが変化するとルミネセンスが実質的に消される物質、たとえばＬｙｓｏＳｅｎｓｏｒ Ｂｌｕｅ ＤＮＤ−１６７またはその誘導体が使用される。
【００５４】
本発明のさらにもう一つの対象は、液体試料中の分析対象物質をルミネセンスによって検出する方法であって、その方法は：
（ｉ）分析対象物質と接触して第一のルミネセンスを発生することができる分析対象物質に特異的な物質を含み、そして液体試料と接触することによって、実質的に消される第二のルミネセンスシグナルを発生することができる比較参照物質を含む担体を準備することと、
（ｉｉ）担体を、検出すべき分析対象物質を含む液体試料と接触させることと、
（ｉｉｉ）ルミネセンス信号を測定し、そしてルミネセンス信号を比較することによって、分析対象物質を検出することと、を含む。
【００５５】
この方法においても、すでに説明したように、実質的に同じ波長領域で励起され、発光する、参照物質および分析対象物質を使用することが好ましい。好ましくは、まず試料不在下で比較参照物質のルミネセンスシグナルを測定して、それから液体試料をつけて、試料が引き起こすルミネセンス信号を測定する。これは、好ましくはただ一つの検出器を使って行うことができる。しかし、特に、参照物質の波長領域と分析対象物質の波長領域とが異なる場合は、複数個の検出器を使用することもできる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００５６】
実施例１
単純な処方でジメチルアミノカルコンの機能を調べた。このカルコンは水に溶けないため、水にメタノールを加えたものを使用した。
【００５７】
その場合、乾燥状態ではＵＶ光の下で強い蛍光を発するカルコンにＭｅＯＨを１滴加えると、急速に蛍光は消えるのを目で見ることができる。
【００５８】
検査用処方１
【表１】
【００５９】
カルコンをＭｅＯＨに溶かし、トランスパフィル（Transpafill）を加えた。この混合物にプロピオファン（Propiofan）を添加して均一な粥状にした。つづいて、混合物をポカロン（Pokalon）ホイル上につけ、５０℃で５分間乾燥した。
【００６０】
図２に示した測定曲線は、ポカロン（Pokalon）ホイル上に付着した緑色に輝く層に、メタノール１滴を加えたときの消光の動的変化を表す。このグラフから、メタノールを加えるとほとんど瞬時に消されること、そしてメタノールがカルコン層から揮発すると、すなわち乾燥すると、可逆的に復帰することがはっきりと見て取れる。
【００６１】
実施例２
１．蛍光のｐＨ依存性
色素ＬｙｓｏＳｅｎｓｏｒ Ｂｌｕｅ ＤＮＤ−１６７をｐＨ値の異なる各種緩衝液に溶解し、その溶液を、光沢あるホイルだけを滴下面とする検査ストリップ上に滴下する。これを測定器にかけて測定する。
【００６２】
励起波長：３７５ｎｍ（Ｒｏｉｔｈｎｅｒ社製ＵＶ−ＬＥＤ）、Ｓｃｈｏｔｔ社製長光路蛍光フィルターＫＶ ４１８、検出器ＢＰＷ３４を使用して、４２０ｎｍで検出した。
【００６３】
結果を図７に示す（ブランク値＝色素を含まない溶液）。ｐＨ値が高くなるほど蛍光は弱くなっている。ｐＨ＝８ではブランク値に近い値にまで低下している。
【００６４】
２．ｐＨ５の層における色素ＬｙｓｏＳｅｎｓｏｒ Ｂｌｕｅ ＤＮＤ−１６７
グルコースデヒドロゲナーゼ、ＮＡＤおよび緩衝液を含む層を作った。層のｐＨ値は５であった。
【００６５】
図８は、ｐＨ７の緩衝液を滴下したときに蛍光が減衰する様子を示したものである。層のｐＨ値はｐＨ５からｐＨ７に変化した。ｐＨの変化によって蛍光は減衰した。
【００６６】
さらに別の実験では、緩衝化したブドウ糖溶液を層に滴下した。層状に覆われた反応を認めることができた；一方で、色素のｐＨが変化したことによって蛍光が減衰し（図８を参照）、他方で、ブドウ糖の反応により、ブドウ糖の濃度に対応する蛍光性ＮＡＤＨが生成した。その結果を図９に示す。
【図面の簡単な説明】
【００６７】
【図１】現在の技術水準の方法による、比較参照物質を使用する場合と使用しない場合の、分析対象物質のルミネセンスを測定するための測定範囲を示す。
【図２】湿潤時におけるジメチルアミノカルコンの消光の動力学を示す。
【図３】０．０５％の固体含量で、カルコンを使用した検査システムである。試料には、ブドウ糖をそれぞれ０ｍｇ／ｄｌ、１００ｍｇ／ｄｌ、３００ｍｇ／ｄｌおよび７００ｍｇ／ｄｌ含む４種類の溶液を使用した。ルミネセンスを測定し、ブドウ糖が０ｍｇ／ｄｌの対照試料について得られた、消されたシグナルと比較した。試料を十分つけた場合に示差カウントは最大となる。この示差カウントは、つける試料の量が少ないほど小さくなる。
【図４】図３で記述した検査フォーマットにおける、体積当たりのカウント数である。約１μｌからプラトー（曲線平坦部）に達しているが、これより試料が少ないと信頼できる測定は不可能である。
【図５】ＦｕｒａＲＥＤの吸収スペクトルおよび発光スペクトルである。
【図６】ＬｙｓｏＳｅｎｓｏｒ Ｂｌｕｅ ＤＮＤ−１６７の蛍光発光のｐＨ依存性。
【図７】ＬｙｓｏＳｅｎｓｏｒ Ｂｌｕｅ ＤＮＤ−１６７の蛍光発光のｐＨ依存性。
【図８】ＬｙｓｏＳｅｎｓｏｒ Ｂｌｕｅ ＤＮＤ−１６７、ＮＡＤおよびｐＨ＝５緩衝液を使用した検査システムである。試料には、ブドウ糖をそれぞれ０ｍｇ／ｄｌ、１ｍｇ／ｄｌおよび２ｍｇ／ｄｌ含む３種類の溶液およびｐＨ＝７の緩衝液を使用した。試料をつけてから２４秒間にわたるルミネセンス強度の変化を測定した。ｐＨ＝７の試料液を加えて、ＬｙｓｏＳｅｎｓｏｒ Ｂｌｕｅ ＤＮＤ−１６７を含む層のｐＨを変化させた。時間の経過とともにルミネセンスが減衰するのが観察された。２４秒後にはルミネセンスの変化はほとんど測定できなかった。
【図９】ＬｙｓｏＳｅｎｓｏｒ Ｂｌｕｅ ＤＮＤ−１６７、ＮＡＤおよびｐＨ＝５緩衝液を使用した検査システムである。試料には、ブドウ糖をそれぞれ０ｍｇ／ｄｌ、９０ｍｇ／ｄｌ、３００ｍｇ／ｄｌおよび７００ｍｇ／ｄｌ含む４種類の溶液およびｐＨ＝７の緩衝液を使用した。試料をつけてから２４秒間にわたるルミネセンス強度の変化を測定した。ｐＨ＝７の試料液を加えて、ＬｙｓｏＳｅｎｓｏｒ Ｂｌｕｅ ＤＮＤ−１６７を含む層のｐＨを変化させた。ブドウ糖を０ｍｇ／ｄｌ含む試料での結果は図８から得た結果と合致する。ブドウ糖の濃度が高くなるにつれて時間に依存するルミネセンスは弱くなるか（９０ｍｇ／ｄｌ）、初期値まで増す（ブドウ糖濃度３００ｍｇ／ｄｌおよび７００ｍｇ／ｄｌ）。ＬｙｓｏＳｅｎｓｏｒ Ｂｌｕｅ ＤＮＤ−１６７およびＮＡＤＨに依存するルミネセンスの時間的変化の違いがはっきり見て取れる。
【技術分野】
【０００１】
本発明は液体試料中の分析対象物質をルミネセンスによって検出するためのシステムに係り、そのシステムは分析対象物質に特異的な物質と比較参照物質を含む担体を包含する。さらに、本発明は前記システムを使って液体試料中の分析対象物質を検出する方法にも係る。本発明によるシステムは、分析対象物質の検出以外に、分析試料量の決定、分析対象物質量の決定、および／または検出用担体の使用準備状態の確認にも適する。
【０００２】
分析対象物質を検出する、本発明によるシステムおよび方法は、ルミネセンスによる検出、特に蛍光による検出に基づいている。
【背景技術】
【０００３】
このようなシステムは、現在の技術水準において、すでに古くから知られている。現在の分析法にあって、分析検査エレメントの光度測定による評価は、試料中の分析対象物質の迅速な検出または濃度の迅速な決定を行うために、最もよく使用されている方法の一つである。一般に、光度測定評価は、分析、環境分析の分野に加えて、特に医療診断の分野で使用されている。特に、毛細血管から採取した血液の分野では光度測定によって評価される検査エレメントが、非常に重要な位置を占めている。
【０００４】
蛍光分光光度測定による検出システムの場合、蛍光を発する物質の発光強度は、励起強度に直接に比例する。励起強度は、多くの要因、たとえば光源の時間的変化や光路の変化によって影響を受ける。正に、確定目的以外に使用される検査室の小型機器では、光路に変化があると励起強度にも変化が生じる。それゆえ、再現性を維持して蛍光の絶対強度を測定することはきわめて困難である。
【０００５】
したがって、現在使用されている蛍光検査システムは、これとの関連づけが可能な比較参照物質が使われる。そのような比較参照物質にはさまざまな種類のものが知られている。
【０００６】
たとえば、現在の技術水準では、蛍光物質に基づく検出系に、分析対象物質に特異的な蛍光物質とは異なる波長で発光する第二の蛍光物質が使用されることが知られている。それゆえ、この第二の蛍光物質を比較参照物質として使用できる。その場合、両蛍光物質の区別は、二つの異なるフィルター（および二つの検出器）によって行うことができ、その場合、一方の蛍光物質は化学反応を受けず、比較参照物質として使用できる。この検出システムは、たとえば文献：Principles of Fluoresence Spectroscopy, J.R. Lackowicz, Kluver Academic/Plenum Publishers, New York, Boston, Dordrecht, Moscow １９９９年、第２版に記載されている。
【０００７】
別の手法として、時間を分割して参照する方法と位相を変調する方法とがある。これらの方法では、分析対象物質に特異的な蛍光物質が短寿命なのに対してそれより寿命の長いきわめて長寿命な蛍光物質が比較参照物質として使用される。寿命の長いルミネセンスは分析対象物質のパラメーターに影響を及ぼさないのに対して、分析対象物質に特異的な短寿命発光物質の強度は、分析対象物質のそのときどきの濃度によって変化する。そこで、最初に分析対象物質の蛍光物質を時間分割法で測定し、そのあとで比較参照物質の（蛍光の）減衰を測定する。減衰信号と、分析対象物質の信号と比較参照物質の信号との比は、入射強度に関係なく常に一定でなくてはならない。
【０００８】
ＷＯ第９９／０６８２１号はそのようなシステムを開示している。それによれば、少なくとも２種類の発光物質が一つの共通担体上に固定化され、そのうちの第一の発光物質は、少なくともルミネセンス強度が、分析対象物質の決定すべきパラメータに対応し、そして第二の発光物質は、少なくともルミネセンス強度および減衰時間が、測定すべきパラメーターには対応しない。発光物質は減衰時間がそれぞれ異なっている。それゆえ、生じるルミネセンス応答の時間的および位相的挙動を、比較対照物質の測定すべきパラメーターを決定するための比較参照量の形成に使用することができる。
【０００９】
ＷＯ第０２／０５６０２３号は、試料の少なくとも一つのパラメーターを決定するための光学センサーを開示しているが、ここでもパラメーターに対応する、減衰時間の短い表示物質とパラメーターに対応しない、減衰時間の長い比較参照物質が使われる。その場合、表示物質および比較参照物質は一つの共通短体上に固体され、試料側は光透過性の層で被覆される。
【００１０】
異なる波長で測定される第二の蛍光物質を通じて参照することは、当然に、機器面で必要コストが高くなる。たとえば、励起光を遮蔽できるようにするため、ただ一つのフィルターに替わって二つのフィルターが必要となり、普通それに合わせて検出器も二つ必要になる。それに加えて、励起後の光路を異なる検出器に分離することで、両光路の一方に間違いが生じるおそれがあり、その場合は間違った比較参照が行われることになる。
【００１１】
時間分割または位相分割による比較参照には、常に発光性バックグラウンドを背景にして分析対象物質の測定を行わなければならないという欠点がある。このことは、測定範囲を制限するある一定のオフセットまたはシグナルバックグラウンドがあることを意味している。この原理は、図１に例示されている。
【００１２】
図１には比較参照を使用した場合の分析シグナルの測定範囲と使用しない場合の測定範囲があげてある。参照蛍光物質を使用しない場合、測定範囲は、包含すべきダイナミックレンジに最もよく合致する。それに対して参照蛍光物質を使用する場合は、比較参照の測定範囲の一部が要求される。
【００１３】
比較参照物質または比較対照発光物質は、分析対象物質と比較するための比較参照物質としてのみ使用でき、それ以外の機能を満たすことはできない。
【００１４】
しかし、検査の場（Testfeld）が湿っていることを認識することと充填状態を監視することも、診断分野で分析対象物質を決定するときの重要なテーマである。
【００１５】
この領域にも、現在の技術水準において、既存の方法を改善すべき点がある。ＷＯ第８３／００９３１号は、液体試料のつける量が十分か判定し、検出するための装置および方法を開示している。それは、光源を包む液滴検知器から、水吸収バンドの中に置かれた試料に光が当たるようにすることで実現される。まず乾燥状態で試料の担体に光を当て、それから湿潤状態で光を当てて水分を測定する。つづいて、検出した信号の差から試料の水分含量を計算する。
【００１６】
米国特許第５，１１４，３５０号は、体液試料中の分析対象物質の濃度を決定する方法および装置を開示している。水分量が増すほど減少する反射光の強さを測定することで、反応担体の水分量が測定される。
【００１７】
ＤＥ第１０２４８５５５ Ａ１号は、検査ストリップの用量不足を知り、それを補償するための方法を開示している。この明細書には、試料中の分析対象物と相互作用する、分析対象物質に特異的な試薬と、試料の試料マトリックスと相互作用する対照物質とを、包含する検査エレメントが記載されている。分析対象物質と特異的に反応する試薬は、検出波長領域における分析対象物質の濃度に依存して、分析対象物質の濃度と相互作用する。対照シーケンスは、検査場に照射すると、検査場に供される試料の量に依存して、試料マトリックスと相互作用する。その場合、対照物質は、試料マトリックスに含まれる水分とも反応する。ＤＥ第１０２４８５５５号に挙げられている例は、試料量を決定するための、分析対象物質に依存しない色素形成物質としてクロロフェノールレッドを、また、試料中の、たとえば血液中のブドウ糖の濃度を決定するための、分析対象物質に特異的な試薬として２，１８−リンモリブデン酸を使用している。したがって、この明細書の上に挙げた例では、２つの波長領域で検出を行う必要があり、そのためこの検査システムは装置的にコストがかかる。
【００１８】
本発明の根底にある課題は、比較参照物質と、分析対象物質に特異的な物質とを使用し、その際、現在の技術水準に記載されているコストのかかる装置を購入する必要がない、液体試料中の分析対象物質を検出するためのシステムおよび方法を提供することにある。
【発明の開示】
【００１９】
本発明の課題は、担体を包含し、分析対象物質と接触してルミネセンスを放射できる、分析対象物質に特異的な物質と、液体試料接触することによって実質的に消される（消光される）第二のルミネセンスシグナルを発することができる比較参照物質とを包含し、液体試料中の分析対象物質のルミネセンスを検出するシステムによって解決される。
【００２０】
驚いたことに、本発明による比較参照物質を使用すれば、試料が存在しなければ比較参照シグナルとして使用できるルミネセンスシグナルを発生し、現在の技術水準によって公知の検出法を単純化することができる。このルミネセンスは、試料を添加すると実質的に消され、もはや実質的にシグナルが発生しないか、少なくとも大幅にシグナルが減衰する。
【００２１】
分析対象物質に特異的な物質に見られるように、励起波長と発光波長とが実質的に同じ場合は、本発明にとって特に有利である。このことはルミネセンスの検出に必要な検出器が一つですむことを意味している。
【００２２】
比較参照物質の特性により、試料の不在で発生するルミネセンスシグナルは、試料と接触させると消されるため、比較参照物質は、分析対象物質の検出だけでなく、試料量の決定、分析対象物質量および／または担体機能の準備状態の確認にも使用できる。比較参照物質は、たとえば、濡れるとシグナルが消されるように選択することができる。そうすれば、検査システムが機能する準備ができているかを目で見て確認できるようにすることができる。すなわち、検査システムを含む担体が保存時に湿ってしまうか、そのような物質あるいは別の物質が担体と接触すると、比較参照物質のこのルミネセンスシグナルが消されるため、この検査システムが機能する準備ができていないことがわかる。
【００２３】
消光は、好ましくは可逆的である、すなわち試料を取り去るか、具体的には、湿潤状態を取り去るか、もとの状態に戻せば、ルミネセンスシグナルを再度発生させることができる。
【００２４】
そうすれば、比較参照することとならんで、湿潤状態を知ること、および／または充填状態の監視が、本発明によるシステムで実現可能となる。たとえば、検査場が担体上に準備されていて、その検査場が試料で十分湿潤されなかった場合、ルミネセンスシグナルは残ったままになる。その場合は、残ったルミネセンスを使ってコンピューターで計算し、分析対象物質に対する補正を行うことができる。
【００２５】
ルミネセンスの特性が、環境の水分に対して可逆的な場合は、このような比較参照物質を水分インジケーターとして使うことができる。その場合、水分インジケーターは、検査システムの保存条件および、このシステムが機能するための準備状態に関する情報をもたらす。この比較参照物質は、検査システムの選択すべき使用期限に対するインジケーターとして使用することもできる。
【００２６】
このような特性を持つルミネセンス物質、そして特に蛍光物質は、現在の技術水準ではほとんど知られていない。ほとんどの蛍光物質は湿潤環境で蛍光性を高め、消されない。
【００２７】
分析対象物質に特異的な物質のルミネセンス特性がｐＨ値に依存する場合は、分析対象物質に特異的な物質をｐＨ値の決定に使用できる。それゆえ、一つの実施形態において、本発明によるシステムは、ｐＨセンサー、すなわち、そのルミネセンスシグナルがｐＨ値に依存する物質から、分析対象物質に特異的な物質が選択される。この実施形態において、比較参照物質は、好ましくは、ｐＨ値が変動したときにそのルミネセンスシグナルが実質的に消されてしまうような物質であってはならない。たとえば、約３．５ないし約７．０または約４．５ないし約６．０の範囲でｐＨ値を決定するには、分析対象物質に特異的な物質としては、好ましくはＬｙｓｏＳｅｎｓｏｒ Ｂｌｕｅ ＤＮＤ−１６７か、またはその誘導体である。
【００２８】
本発明によるｐＨセンサーの担体は、好ましくは、試料をつける前に、分析対象物質に特異的な物質が実質的にルミネセンスを示さないｐＨ値を有する。ＬｙｓｏＳｅｎｓｏｒ Ｂｌｕｅ ＤＮＤ−１６７の場合、約７ないし約１０か、または約８ないし約９の範囲から選択されるｐＨが可能である。
【００２９】
また、緩衝作用によって、担体のｐＨ値が事実上完全に試料のｐＨ値に変わるよう、あらかじめ担体のｐＨ値を設定しておくことができる。当業者は、どのようにして担体にこのような緩衝能力を設定すべきか、その方法を知っている。
【００３０】
試料と接触することによって、実質的に消されるルミネセンスシグナルを発生することができる物質であれば、いかなる物質であっても、原理的には比較参照物質の対象となりうる。すなわち、試料成分と接触することにより、そのルミネセンスシグナルが消される物質であればあらゆる種類の物質が使用できる。検査試料中にあって、消光を引き起こすことのできる成分は、たとえば水、カルシウム、マグネシウムもしくはその他の金属、またはそれらのイオン、ｐＨ値、およびその他の要因である。
【００３１】
消光を引き起こす要因が水の場合は、好ましくは、式Ｉで表されるカルコン類から比較参照物質が選ばれる。
【００３２】
現在の技術水準において、カルコンは公知である（B.M. Krasovitskii, D.G. Pereyaslova, ZH.Vsesoyuznogo Obscchestva im. D.I. Mendeleeva, 10(6), 704(1965); G.E. Dobretsov, V.A. Petrov, Yu.A. Vladimirov, Studia Biophysica Berlin, 71(3), 181-187(1978)）。
【００３３】
好ましい物質は一般式Ｉで表される：
【化１】
式中、残基Ｒ2、Ｒ3、およびＲ5の一つはＮＲ11Ｒ12およびＳＯ3Ｎａの中から選択され、残りの置換基Ｒ1、Ｒ4、Ｒ6、Ｒ7、Ｒ8、Ｒ9およびＲ10は任意の置換基が可能であるが、好ましくは水素またはハロゲン、特にＦ，Ｃｌ，ＢｒおよびＩである。
【００３４】
Ｒ11およびＲ12は、好ましくは水素、Ｃ1−Ｃ4アルキル、特にメチル、エチル、プロピルおよびブチルであり、その場合、Ｃ1−Ｃ4アルキルは−ＯＨ、−ＳＨ、ホスファート、−ＣＯＯＨ、−ＮＨ2、−ＳＯ3Ｎａ、−ＮＯ2、ハロゲン、特にＦ，Ｃｌ，ＢｒおよびＩで置換が可能である。好ましい置換アルキル基はＣＨ2ＣＨ2−ＳＯ3Ｎａである。
【００３５】
本発明による比較参照物質として好適な、特に好ましい物質は、特に式II、IIIおよびIVで表されるアミノカルコンおよびクロロカルコンである。
【化２】
【化３】
【化４】
【００３６】
クロロカルコンは、Krasovitskiiの方法によって合成した（B.M. Krasovitskii, D.G. Pereyaslova, ZH. Vsesoyuznogo Obscchestva im. D.I. Mendeleeva, 10(6), 704(1965)）。
【００３７】
Ｒ11およびＲ12がメチル基のアミノカルコンは、市販品が入手可能であり、方向づけの研究に使用した。
【００３８】
一般式Ｖで表され、Ｒ11およびＲ12の両方が、ＣＨ2ＣＨ2−ＳＯ3Ｎａであるアミノカルコンは、多段階合成によって調製した。
【００３９】
さらに別の好ましい物質は、式Ｖで表される物質である。
【化５】
【００４０】
消光反応は、金属イオンでも引き起こすことができる。それゆえ、この種の化合物も本発明による比較参照物質として好適であり、そのルミネセンスシグナルは、金属イオンと接触すると実質的に消される。
【００４１】
特に、カルシウムイオンまたはマグネシウムイオンと接触するとルミネセンスシグナルが消されるように、比較参照物質を選択することが可能である。それには、たとえばＣａ2+および／またはＭｇ2+と錯形成したとき、蛍光が停止するか、大きく減衰する蛍光色素が考慮の対象になる。
【００４２】
このような蛍光色素の一例は、Ｍｏｌｐｒｏｂｅｓ社から入手できるＦｕｒａＲＥＤである。ＦｕｒａＲＥＤの構造は次式で表される：
【化６】
【００４３】
本発明による好適な第三の比較参照物質は、ｐＨ変化に応答する物質である。ｐＨ値が変化すると、そのルミネセンスシグナルが実質的に消される物質がこれに該当する。
【００４４】
これは、たとえば血液のような試料に対して特に有利である。血液はきわめて大きな緩衝能力を持つため、あらかじめ検査システムに設定されたｐＨ値をカバーできる。たとえば検査システムを低いｐＨ値（たとえばｐＨ５）に設定しても、血液試料をつけたときに検査システムのｐＨ値は７に変化する。
【００４５】
このような比較参照物質の例はＭｏｌｐｒｏｂｅｓのＬｙｓｏＳｅｎｓｏｒ Ｂｌｕｅ ＤＮＤ−１６７（カタログ番号Ｌ７５３３、ＡＢＳ／ＥＭ’ｎｍ）：３７３／４２５， ＰＫＡ：５．１、好適なｐＨ範囲：４．５〜６．０）である。
【００４６】
ＬｙｓｏＳｅｎｓｏｒ Ｂｌｕｅ ＤＮＤ−１６７
【化７】
【００４７】
さらに、本発明によるシステムまたは本発明による方法には、ＬｙｓｏＳｅｎｓｏｒ Ｂｌｕｅ ＤＮＤ−１６７より水溶性に優れたＬｙｓｏＳｅｎｓｏｒ Ｂｌｕｅ ＤＮＤ−１６７の誘導体を使用することができる。水溶性が高いと分析対象物質を含む試料との反応速度を高めることができる。
【００４８】
本発明によるＬｙｓｏＳｅｎｓｏｒ Ｂｌｕｅ ＤＮＤ−１６７の誘導体において、一つ以上の水素原子が互いに独立に置換基で置換され、その際、一つの炭素原子が複数個の置換基を持つことができる。特に好適な置換基は、少なくとも一つの正電荷および／または負電荷を有することのできる極性置換基である。
【００４９】
ＬｙｓｏＳｅｎｓｏｒ Ｂｌｕｅ ＤＮＤ−１６７のアントラセン骨格の水素が結合するすべての位置、二つのモルホリニル基および二つのメチレン基が、本発明による置換に適している。
【００５０】
ＬｙｓｏＳｅｎｓｏｒ Ｂｌｕｅ ＤＮＤ−１６７の本発明による誘導体は、正確には、１個、２個、３個または４個の置換基を有することが好ましい。
【００５１】
好ましい置換基として、は−ＯＨ、−ＳＨ、ホスファート、−ＣＯＯＲ11、−ＮＲ11Ｒ12、−ＳＯ3Ｎａ、−ＮＯ2、ハロゲン、特にＦ，Ｃｌ，ＢｒおよびＩを挙げることができる。Ｒ11およびＲ12は、好ましくは水素、Ｃ1−Ｃ4アルキル、特にメチル、エチル、プロピルおよびブチルから選択され、その場合、Ｃ1−Ｃ4アルキルは−ＯＨ、−ＳＨ、ホスファート、−ＣＯＯＨ、−ＮＨ2、−ＳＯ3Ｎａ、−ＮＯ2、ハロゲン、特にＦ，Ｃｌ，ＢｒおよびＩで置換が可能である。好ましい置換アルキル基はＣＨ2ＣＨ2−ＳＯ3Ｎａである。
【００５２】
ＬｙｓｏＳｅｎｓｏｒ Ｂｌｕｅ ＤＮＤ−１６７の誘導体は、たとえば式VIIで表される化合物である：
【化８】
【００５３】
好ましい実施形態において、本発明によるシステムはブドウ糖、特に血糖を決定するためのシステムである。分析対象物質に特異的な物質としては、たとえばＮＡＤまたはＮＡＤＰが使用可能であり、両者は、適当な酵素、たとえばグルコースデヒドロゲナーゼの存在で、ルミネセンスを示すＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨを形成する。ブドウ糖を決定するための本発明によるシステムにおいて、比較参照物質には、たとえばｐＨが変化するとルミネセンスが実質的に消される物質、たとえばＬｙｓｏＳｅｎｓｏｒ Ｂｌｕｅ ＤＮＤ−１６７またはその誘導体が使用される。
【００５４】
本発明のさらにもう一つの対象は、液体試料中の分析対象物質をルミネセンスによって検出する方法であって、その方法は：
（ｉ）分析対象物質と接触して第一のルミネセンスを発生することができる分析対象物質に特異的な物質を含み、そして液体試料と接触することによって、実質的に消される第二のルミネセンスシグナルを発生することができる比較参照物質を含む担体を準備することと、
（ｉｉ）担体を、検出すべき分析対象物質を含む液体試料と接触させることと、
（ｉｉｉ）ルミネセンス信号を測定し、そしてルミネセンス信号を比較することによって、分析対象物質を検出することと、を含む。
【００５５】
この方法においても、すでに説明したように、実質的に同じ波長領域で励起され、発光する、参照物質および分析対象物質を使用することが好ましい。好ましくは、まず試料不在下で比較参照物質のルミネセンスシグナルを測定して、それから液体試料をつけて、試料が引き起こすルミネセンス信号を測定する。これは、好ましくはただ一つの検出器を使って行うことができる。しかし、特に、参照物質の波長領域と分析対象物質の波長領域とが異なる場合は、複数個の検出器を使用することもできる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００５６】
実施例１
単純な処方でジメチルアミノカルコンの機能を調べた。このカルコンは水に溶けないため、水にメタノールを加えたものを使用した。
【００５７】
その場合、乾燥状態ではＵＶ光の下で強い蛍光を発するカルコンにＭｅＯＨを１滴加えると、急速に蛍光は消えるのを目で見ることができる。
【００５８】
検査用処方１
【表１】
【００５９】
カルコンをＭｅＯＨに溶かし、トランスパフィル（Transpafill）を加えた。この混合物にプロピオファン（Propiofan）を添加して均一な粥状にした。つづいて、混合物をポカロン（Pokalon）ホイル上につけ、５０℃で５分間乾燥した。
【００６０】
図２に示した測定曲線は、ポカロン（Pokalon）ホイル上に付着した緑色に輝く層に、メタノール１滴を加えたときの消光の動的変化を表す。このグラフから、メタノールを加えるとほとんど瞬時に消されること、そしてメタノールがカルコン層から揮発すると、すなわち乾燥すると、可逆的に復帰することがはっきりと見て取れる。
【００６１】
実施例２
１．蛍光のｐＨ依存性
色素ＬｙｓｏＳｅｎｓｏｒ Ｂｌｕｅ ＤＮＤ−１６７をｐＨ値の異なる各種緩衝液に溶解し、その溶液を、光沢あるホイルだけを滴下面とする検査ストリップ上に滴下する。これを測定器にかけて測定する。
【００６２】
励起波長：３７５ｎｍ（Ｒｏｉｔｈｎｅｒ社製ＵＶ−ＬＥＤ）、Ｓｃｈｏｔｔ社製長光路蛍光フィルターＫＶ ４１８、検出器ＢＰＷ３４を使用して、４２０ｎｍで検出した。
【００６３】
結果を図７に示す（ブランク値＝色素を含まない溶液）。ｐＨ値が高くなるほど蛍光は弱くなっている。ｐＨ＝８ではブランク値に近い値にまで低下している。
【００６４】
２．ｐＨ５の層における色素ＬｙｓｏＳｅｎｓｏｒ Ｂｌｕｅ ＤＮＤ−１６７
グルコースデヒドロゲナーゼ、ＮＡＤおよび緩衝液を含む層を作った。層のｐＨ値は５であった。
【００６５】
図８は、ｐＨ７の緩衝液を滴下したときに蛍光が減衰する様子を示したものである。層のｐＨ値はｐＨ５からｐＨ７に変化した。ｐＨの変化によって蛍光は減衰した。
【００６６】
さらに別の実験では、緩衝化したブドウ糖溶液を層に滴下した。層状に覆われた反応を認めることができた；一方で、色素のｐＨが変化したことによって蛍光が減衰し（図８を参照）、他方で、ブドウ糖の反応により、ブドウ糖の濃度に対応する蛍光性ＮＡＤＨが生成した。その結果を図９に示す。
【図面の簡単な説明】
【００６７】
【図１】現在の技術水準の方法による、比較参照物質を使用する場合と使用しない場合の、分析対象物質のルミネセンスを測定するための測定範囲を示す。
【図２】湿潤時におけるジメチルアミノカルコンの消光の動力学を示す。
【図３】０．０５％の固体含量で、カルコンを使用した検査システムである。試料には、ブドウ糖をそれぞれ０ｍｇ／ｄｌ、１００ｍｇ／ｄｌ、３００ｍｇ／ｄｌおよび７００ｍｇ／ｄｌ含む４種類の溶液を使用した。ルミネセンスを測定し、ブドウ糖が０ｍｇ／ｄｌの対照試料について得られた、消されたシグナルと比較した。試料を十分つけた場合に示差カウントは最大となる。この示差カウントは、つける試料の量が少ないほど小さくなる。
【図４】図３で記述した検査フォーマットにおける、体積当たりのカウント数である。約１μｌからプラトー（曲線平坦部）に達しているが、これより試料が少ないと信頼できる測定は不可能である。
【図５】ＦｕｒａＲＥＤの吸収スペクトルおよび発光スペクトルである。
【図６】ＬｙｓｏＳｅｎｓｏｒ Ｂｌｕｅ ＤＮＤ−１６７の蛍光発光のｐＨ依存性。
【図７】ＬｙｓｏＳｅｎｓｏｒ Ｂｌｕｅ ＤＮＤ−１６７の蛍光発光のｐＨ依存性。
【図８】ＬｙｓｏＳｅｎｓｏｒ Ｂｌｕｅ ＤＮＤ−１６７、ＮＡＤおよびｐＨ＝５緩衝液を使用した検査システムである。試料には、ブドウ糖をそれぞれ０ｍｇ／ｄｌ、１ｍｇ／ｄｌおよび２ｍｇ／ｄｌ含む３種類の溶液およびｐＨ＝７の緩衝液を使用した。試料をつけてから２４秒間にわたるルミネセンス強度の変化を測定した。ｐＨ＝７の試料液を加えて、ＬｙｓｏＳｅｎｓｏｒ Ｂｌｕｅ ＤＮＤ−１６７を含む層のｐＨを変化させた。時間の経過とともにルミネセンスが減衰するのが観察された。２４秒後にはルミネセンスの変化はほとんど測定できなかった。
【図９】ＬｙｓｏＳｅｎｓｏｒ Ｂｌｕｅ ＤＮＤ−１６７、ＮＡＤおよびｐＨ＝５緩衝液を使用した検査システムである。試料には、ブドウ糖をそれぞれ０ｍｇ／ｄｌ、９０ｍｇ／ｄｌ、３００ｍｇ／ｄｌおよび７００ｍｇ／ｄｌ含む４種類の溶液およびｐＨ＝７の緩衝液を使用した。試料をつけてから２４秒間にわたるルミネセンス強度の変化を測定した。ｐＨ＝７の試料液を加えて、ＬｙｓｏＳｅｎｓｏｒ Ｂｌｕｅ ＤＮＤ−１６７を含む層のｐＨを変化させた。ブドウ糖を０ｍｇ／ｄｌ含む試料での結果は図８から得た結果と合致する。ブドウ糖の濃度が高くなるにつれて時間に依存するルミネセンスは弱くなるか（９０ｍｇ／ｄｌ）、初期値まで増す（ブドウ糖濃度３００ｍｇ／ｄｌおよび７００ｍｇ／ｄｌ）。ＬｙｓｏＳｅｎｓｏｒ Ｂｌｕｅ ＤＮＤ−１６７およびＮＡＤＨに依存するルミネセンスの時間的変化の違いがはっきり見て取れる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
液体試料中の分析対象物質をルミネセンスによって検出するためのシステムであって、分析対象物質と接触すると、第一のルミネセンスシグナルを発生することができる、分析対象物質に特異的な物質と、
液体試料と接触することによって実質的に消される、第二のルミネセンスシグナルを発生することができる比較参照物質とを含む担体を具備するシステム。
【請求項２】
さらに、分析対象物質に特異的な物質のシグナルと比較参照物質のシグナルとを測定するための、少なくとも一つの検出器を具備する請求項１記載のシステム。
【請求項３】
さらに、試料の量、分析対象物質の量、および／または担体の準備状態を確認する評価ユニットを具備する請求項１または２記載のシステム。
【請求項４】
分析対象物質および比較参照物質が、蛍光物質である請求項１〜３のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項５】
水と接触するとルミネセンスが実質的に消される物質の中から、比較参照物質が選択される請求項１〜４のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項６】
比較参照物質が式Ｉで表される化合物である請求項５記載のシステム。
【請求項７】
金属イオンと接触するとルミネセンスが実質的に消される物質の中から、比較参照物質が選択される請求項１〜４のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項８】
比較参照物質がＦｕｒａＲＥＤである請求項７記載のシステム。
【請求項９】
ｐＨが変化するとルミネセンスが実質的に消される物質の中から、比較参照物質が選択される請求項１〜４のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項１０】
比較参照物質が、ＬｙｓｏＳｅｎｓｏｒ Ｂｌｕｅ ＤＮＤ−１６７か、またはその誘導体である請求項９記載のシステム。
【請求項１１】
ルミネセンスがｐＨに依存する物質から、分析対象物質に特異的な物質が選択される請求項１〜４のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項１２】
分析対象物質に特異的な物質が、ＬｙｓｏＳｅｎｓｏｒ Ｂｌｕｅ ＤＮＤ−１６７か、またはその誘導体である請求項１２記載のシステム。
【請求項１３】
分析対象物質および比較参照物質が、実質的に同じ波長領域で励起され、発光する請求項１〜１２のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項１４】
分析対象物質のルミネセンスシグナルおよび比較参照物質のルミネセンスシグナルを測定するためにただ一つの検出器が使用される請求項１〜１３のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項１５】
液体と接触すると実質的に消されるルミネセンスシグナルを発生することができる物質を、比較参照物質として、分析対象物質を検出する方法に使用する用途。
【請求項１６】
液体と接触すると実質的に消されるルミネセンスシグナルを発生することができる物質を、試料量を決定するための比較参照物質として使用する用途。
【請求項１７】
液体と接触すると実質的に消されるルミネセンスシグナルを発生することができる物質を、分析対象物質を検出するためのシステムが機能する準備ができているかを確認するための比較参照物質として使用する用途。
【請求項１８】
ルミネセンスによって液体試料中の分析対象物質を検出する方法であって、
（ｉ）分析対象物質と接触して第一のルミネセンスを発生することができる分析対象物質に特異的な物質を含み、そして液体試料と接触することによって、実質的に消される第二のルミネセンスシグナルを発生することができる比較参照物質を含む担体を準備することと、
（ｉｉ）担体を、検出すべき分析対象物質を含む液体試料と接触させることと、
（ｉｉｉ）ルミネセンス信号を測定し、そしてルミネセンス信号を比較することによって、分析対象物質を検出することとを含む方法。
【請求項１９】
担体が液体試料と接触する前に比較参照物質のルミネセンスシグナルを測定する請求項１８記載の方法。
【請求項１】
液体試料中の分析対象物質をルミネセンスによって検出するためのシステムであって、分析対象物質と接触すると、第一のルミネセンスシグナルを発生することができる、分析対象物質に特異的な物質と、
液体試料と接触することによって実質的に消される、第二のルミネセンスシグナルを発生することができる比較参照物質とを含む担体を具備するシステム。
【請求項２】
さらに、分析対象物質に特異的な物質のシグナルと比較参照物質のシグナルとを測定するための、少なくとも一つの検出器を具備する請求項１記載のシステム。
【請求項３】
さらに、試料の量、分析対象物質の量、および／または担体の準備状態を確認する評価ユニットを具備する請求項１または２記載のシステム。
【請求項４】
分析対象物質および比較参照物質が、蛍光物質である請求項１〜３のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項５】
水と接触するとルミネセンスが実質的に消される物質の中から、比較参照物質が選択される請求項１〜４のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項６】
比較参照物質が式Ｉで表される化合物である請求項５記載のシステム。
【請求項７】
金属イオンと接触するとルミネセンスが実質的に消される物質の中から、比較参照物質が選択される請求項１〜４のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項８】
比較参照物質がＦｕｒａＲＥＤである請求項７記載のシステム。
【請求項９】
ｐＨが変化するとルミネセンスが実質的に消される物質の中から、比較参照物質が選択される請求項１〜４のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項１０】
比較参照物質が、ＬｙｓｏＳｅｎｓｏｒ Ｂｌｕｅ ＤＮＤ−１６７か、またはその誘導体である請求項９記載のシステム。
【請求項１１】
ルミネセンスがｐＨに依存する物質から、分析対象物質に特異的な物質が選択される請求項１〜４のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項１２】
分析対象物質に特異的な物質が、ＬｙｓｏＳｅｎｓｏｒ Ｂｌｕｅ ＤＮＤ−１６７か、またはその誘導体である請求項１２記載のシステム。
【請求項１３】
分析対象物質および比較参照物質が、実質的に同じ波長領域で励起され、発光する請求項１〜１２のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項１４】
分析対象物質のルミネセンスシグナルおよび比較参照物質のルミネセンスシグナルを測定するためにただ一つの検出器が使用される請求項１〜１３のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項１５】
液体と接触すると実質的に消されるルミネセンスシグナルを発生することができる物質を、比較参照物質として、分析対象物質を検出する方法に使用する用途。
【請求項１６】
液体と接触すると実質的に消されるルミネセンスシグナルを発生することができる物質を、試料量を決定するための比較参照物質として使用する用途。
【請求項１７】
液体と接触すると実質的に消されるルミネセンスシグナルを発生することができる物質を、分析対象物質を検出するためのシステムが機能する準備ができているかを確認するための比較参照物質として使用する用途。
【請求項１８】
ルミネセンスによって液体試料中の分析対象物質を検出する方法であって、
（ｉ）分析対象物質と接触して第一のルミネセンスを発生することができる分析対象物質に特異的な物質を含み、そして液体試料と接触することによって、実質的に消される第二のルミネセンスシグナルを発生することができる比較参照物質を含む担体を準備することと、
（ｉｉ）担体を、検出すべき分析対象物質を含む液体試料と接触させることと、
（ｉｉｉ）ルミネセンス信号を測定し、そしてルミネセンス信号を比較することによって、分析対象物質を検出することとを含む方法。
【請求項１９】
担体が液体試料と接触する前に比較参照物質のルミネセンスシグナルを測定する請求項１８記載の方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【公表番号】特表２００８−５１８１９９（Ｐ２００８−５１８１９９Ａ）
【公表日】平成２０年５月２９日（２００８．５．２９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−５３７２３４（Ｐ２００７−５３７２３４）
【出願日】平成１７年１０月２５日（２００５．１０．２５）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００５／０１１４４８
【国際公開番号】ＷＯ２００６／０４５５９６
【国際公開日】平成１８年５月４日（２００６．５．４）
【出願人】（５０１２０５１０８）エフ ホフマン−ラ ロッシュ アクチェン ゲゼルシャフト (285)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２０年５月２９日（２００８．５．２９）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年１０月２５日（２００５．１０．２５）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００５／０１１４４８
【国際公開番号】ＷＯ２００６／０４５５９６
【国際公開日】平成１８年５月４日（２００６．５．４）
【出願人】（５０１２０５１０８）エフ ホフマン−ラ ロッシュ アクチェン ゲゼルシャフト (285)
【Ｆターム（参考）】
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