蛍光検査装置及び蛍光検査方法
【課題】コロニーを形成した微生物群等の複数の測定対象物であっても、従来のフローサイトメータのように単離することなく、迅速に複数の測定対象物の発する蛍光の測定を行う。
【解決手段】複数の測定対象物のそれぞれがレーザ光の照射を受けて発する蛍光を受光するとき、測定対象物が分散する基板に対してレーザ光の照射範囲を定めてレーザ光を照射する。これにより、レーザ光を受光した測定対象物のそれぞれが発する蛍光の蛍光信号の信号処理を行い、蛍光の特徴量を算出する。この特徴量を用いて、測定対象物が目的対象物を含むか否かの判定をする。この判定の結果に応じて、レーザ光の照射範囲を狭くして、レーザ光の照射、蛍光の受光、信号処理、上記判定を繰り返す。これにより、目的対象物の基板上における位置を特定する。さらに、特定された位置にある目的対象物を測定対象物から抜き取る。
【解決手段】複数の測定対象物のそれぞれがレーザ光の照射を受けて発する蛍光を受光するとき、測定対象物が分散する基板に対してレーザ光の照射範囲を定めてレーザ光を照射する。これにより、レーザ光を受光した測定対象物のそれぞれが発する蛍光の蛍光信号の信号処理を行い、蛍光の特徴量を算出する。この特徴量を用いて、測定対象物が目的対象物を含むか否かの判定をする。この判定の結果に応じて、レーザ光の照射範囲を狭くして、レーザ光の照射、蛍光の受光、信号処理、上記判定を繰り返す。これにより、目的対象物の基板上における位置を特定する。さらに、特定された位置にある目的対象物を測定対象物から抜き取る。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、複数の測定対象物のそれぞれがレーザ光の照射を受けて発する蛍光を受光することにより、蛍光検査を行う蛍光検査装置及び蛍光検査方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
微生物や細胞等の生体の培養には、無菌環境における厳密な管理が行われている。しかし、微生物や細胞等の生体の培養時、異なる種類の微生物の混入が容易に起こるため、定期的に有用な微生物の選別が行われている。有用な微生物の選別とは、例えば、雑多な微生物から特定の微生物を選別することである。また、紫外線及び放射線による突然変異が生じた変異種の微生物を有用な微生物として選別することも行われている。変異種の微生物の選別は、専ら、顕微鏡を用いて行われ、あるいは、培地培養等を行って成長した微生物のコロニーの微視的な特徴や巨視的な特徴を利用して行われる。
【０００３】
近年、特定の蛍光を発する有機薬剤により、特定のタンパク質を染色し、有機薬剤の発する特定の蛍光を受光することにより、特定のタンパク質を識別する方法が広く行われている。この方法は、微生物の識別のために、盛んに用いられている。
【０００４】
例えば、細胞内の含硫化合物含有量が上昇した微生物、特に酵母、を効率よく迅速にスクリーニングする方法が知られている（特許文献１）。
当該スクリーニング方法は、具体的には、親株に遺伝子改変処理を施して得られた微生物細胞群に-SH基と結合する蛍光指示薬を導入し含硫化合物を標識させ、励起光照射し、細胞内の蛍光指示薬が発する蛍光を光学的検出器を用いて検出する。このとき、細胞群の中から蛍光強度が相対的に高い細胞を分別機構により分取する。
【０００５】
より具体的には、当該スクリーニング方法は、検出する光学的検出器としてフローサイトメータを使用する。このとき、分別機構としてフローサイトメータからの信号に対応して作動するセルソータが用いられる。フローサイトメータは、細胞懸濁液を細管中に高速で流し、一方からレーザ光などを照射して前方散乱光、側方散乱光あるいは発せられた蛍光細胞からの光の強度を測定することで細胞一つ一つの情報を自動的にサンプリングし解析する。セルソータ機能を有するフローサイトメータを用いることにより、指定した散乱光および蛍光を発する特定の細胞のみを分取する。
これにより、極めて低い頻度でしか出現しない細胞内の含硫化合物含有量が上昇した微生物変異体を迅速にスクリーニングすることができる、とされている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２００７−３７５３４号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかし、フローサイトメータでは、個々の微生物を培養液中で分離して培養する必要があるため、凝集して単離するのが困難な微生物等を検査対象とすることは難しい。
基板に載せられた培養液中で培養されてコロニーを形成した微生物群に、レーザ光を照射して蛍光強度を測定する場合、コロニーのサイズによって蛍光強度が異なるため、蛍光強度のみでは、特定の細胞を分取することは難しい。
【０００８】
そこで、本発明は、上記問題点を解決するために、コロニーを形成した微生物群等の複数の測定対象物であっても、従来のフローサイトメータのように単離することなく、複数の測定対象物が発する蛍光の測定を行って、測定対象物内に目的対象物が含まれているか否かを迅速に判定する蛍光検査装置及び蛍光検査方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明の一態様は、複数の測定対象物のそれぞれがレーザ光の照射を受けて発する蛍光を受光することにより、蛍光検査を行う蛍光検査装置であって、
基板上に分散する測定対象物に対してレーザ光の照射範囲を定めてレーザ光を照射するレーザ光照射部と、
前記レーザ光を受光した測定対象物のそれぞれが発する蛍光を受光して、蛍光信号を出力する受光部と、
前記蛍光信号の信号処理を行い、蛍光の特徴量を算出することにより、前記測定対象物が目的対象物を含むか否かを判定する処理部と、
前記処理部の判定結果に応じて、前記レーザ光の照射範囲を変更する制御部と、を有することを特徴とする蛍光検査装置である。
【００１０】
前記処理部が、前記測定対象物が目的対象物を含むと判定した場合、前記制御部は、前記レーザ光の前記照射範囲を狭くして、前記レーザ光を前記測定対象物の一部に照射するように制御する、ことが好ましい。
また、前記制御部は、前記レーザ光の照射位置の前記照射範囲を狭くすることにより、前記目的対象物の位置を特定する、ことが好ましい。
さらに、特定された位置にある前記目的対象物を前記測定対象物から抜き取る抜き取り部を有する、ことが好ましい。
【００１１】
前記測定対象物に照射される前記レーザ光は、例えば、所定の周波数の変調信号で強度変調され、前記処理部は、蛍光信号の、前記変調信号に対する位相遅れを、前記特徴量として算出する。
前記目的対象物は、例えば、第１の物質と第２の物質とが結合した構成物を含み、
前記第１の物質には、第１の蛍光物質が設けられ、
前記第２の物質には、第２の蛍光物質が設けられ、
前記受光部は、前記レーザ光の照射により前記第２の蛍光物質が発する第１の蛍光と、前記レーザ光の照射により受けた前記第１の蛍光物質の励起エネルギーが第２の蛍光物質に移動することにより、前記第２の蛍光物質が発する第２の蛍光と、を受け、
前記処理部は、前記第１の蛍光および前記第２の蛍光の信号のそれぞれを、前記蛍光信号として処理する、ことが好ましい。
その際、前記処理部は、前記第１の蛍光の発光過程に起因して生じる位相遅れと前記第２の蛍光の発光過程に起因して生じる位相遅れとの間の比率に基づいて、前記測定対象物が目的対象物を含むか否かを判定する、ことが好ましい。
前記測定対象物は、例えば、前記基板上の培地において複数の生体が互いに集まった生体コロニーである。
【００１２】
さらに、本発明の他の態様は、複数の測定対象物のそれぞれがレーザ光の照射を受けて発する蛍光を受光することにより、測定対象物の蛍光検査を行う蛍光検査方法であって、
基板上に分散する測定対象物に対してレーザ光の照射範囲を定めてレーザ光を照射する第１ステップと、
前記レーザ光を受光した測定対象物のそれぞれが発する蛍光を受光して、蛍光信号を出力する第２ステップと、
前記蛍光信号の信号処理を行い、蛍光の特徴量を算出することにより、前記測定対象物が目的対象物を含むか否かの判定をする第３ステップと、
前記判定の結果に応じて、前記レーザ光が照射する、前記基板上の照射範囲を狭くして、前記第１ステップ、前記第２ステップおよび前記第３ステップを繰り返す、第４ステップと、
前記第４ステップを行うことにより、目的対象物の前記基板上における位置を特定する第５ステップと、を有する蛍光検査方法である。
【００１３】
前記蛍光検出方法には、さらに、特定された位置にある前記目的対象物を前記測定対象物から抜き取る第６ステップを有する、ことが好ましい。
前記測定対象物は、例えば、前記基板上の培地において複数の生体が互いに集まった生体コロニーである。
【発明の効果】
【００１４】
上述の蛍光検査装置及び蛍光検査方法は、コロニーを形成した微生物群等の複数の測定対象物であっても、従来のフローサイトメータのように単離することなく、複数の測定対象物が発する蛍光の測定を行って、測定対象物内に目的対象物が含まれているか否かを迅速に判定することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】本実施形態の蛍光検査装置の一例を説明する図である。
【図２】図１に示す蛍光検査装置の照射ユニットを説明する図である。
【図３】（ａ），（ｂ）は、図２に示す照射ユニットが照射するレーザ光の照射範囲を説明する図である。
【図４】図１に示す蛍光検査装置の受光ユニットを説明する図である。
【図５】（ａ），（ｂ）は、図１に示す蛍光検査装置のデータ処理部・制御部を説明する図である。
【図６】図１に示す蛍光検査装置の分析装置を説明する図である。
【図７】（ａ），（ｂ）は、図６に示す分析装置で行われるＦＲＥＴの発生の有無の判定法を説明する図である。
【図８】図１に示す蛍光検査装置で用いるマニピュレータを説明する図である。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
以下、本発明の蛍光検査装置および蛍光検査方法について詳細に説明する。
図１は、本実施形態の蛍光検査装置１０の一例を説明する図である。
蛍光検査装置１０は、基板上の培地にて培養した微生物や生体組織等に対して、蛍光検査を行う装置である。蛍光検査装置１０は、培養した微生物や生体組織が、取り出すべき目的対象物（目的微生物や目的生体組織）であるか否かを判定し、判定結果に応じて、目的微生物や目的生体組織を取り出す。
【００１７】
蛍光検査を行う複数の測定対象物は、予め以下のようなラベル処理が施されている。
２種類の蛍光色素（ドナー蛍光色素およびアクセプター蛍光色素）が別々に付加されている２種類の物質Ａ，Ｂが用意される。蛍光色素を有する物質Ａは、微生物や生体組織等の測定対象物が備える特定部分に結合する物質である。この物質Ａが、測定対象物に付着して、蛍光色素でラベル化されている。
この後、別の蛍光色素を有する物質Ｂを含む培地を用いて、測定対象物を培養する。培養中、物質Ｂとして、測定対象物群のうち目的対象物特有の反応や活性により目的対象物内に取り込まれ、物質Ａと近接する物質が用いられる。こうして、培養された測定対象物に対して、蛍光検査を行う。
【００１８】
このとき、物質Ａと物質Ｂが近接する場合、２種類の蛍光色素も近接する。物質Ａ，Ｂに付加する２種類の蛍光色素は、近接することにより、一方の蛍光色素であるドナー蛍光色素がレーザ光の照射により励起したエネルギーが蛍光を発することなくアクセプター蛍光色素に移動する（蛍光共鳴移動（ＦＲＥＴ:Fluorescence Resonant Energy Transfer ））。アクセプター蛍光色素は、この移動したエネルギーにより、励起されて特定の波長の蛍光を発する。以降、この蛍光をＦＲＥＴ蛍光という。
なお、測定対象物に照射されるレーザ光によってアクセプター蛍光色素も励起されるので、このレーザ光の励起によって発する蛍光も発する。以降、この蛍光をアクセプター蛍光という。
蛍光検査装置１０は、ＦＲＥＴ蛍光とアクセプター蛍光のそれぞれの発光過程に起因して生じる位相遅れの比を用いて、ＦＲＥＴの発生の有無を判定する。
【００１９】
蛍光検査装置１０は、移動台１２と、レーザ光照射ユニット１４と、受光ユニット１６と、
データ処理部・制御部１８と、分析装置２０と、マニピュレータ３０（図８参照）と、を有する。
【００２０】
移動台１２は、測定対象物を培養する培地容器２２を載置するステージ２４と、ステージ２４を２次元的に（図中のｘ方向、ｙ方向に）移動する移動機構２６と、を有する。
移動機構２６は、分析装置２０から延びる制御線と接続され、分析装置２０からの指示に基づいて培地容器２２を２次元的に移動することができる構成になっている。ステージ２４に載置される培地容器２２は、測定対象物が培地中に分散して基板上に載せられている。本実施形態の測定対象物は、培地中で複数の生体が互いに集まった複数の生体コロニーである。複数の生体コロニーは、基板上の培地において分散している。この生体コロニーは、１つの生体が培養されて増殖して形成されたものである場合が多い。したがって、生体コロニー内の１つの生体が選別対象である場合、この生体コロニーに属する生体は略全て選別対象である場合が多い。
選別対象の生体コロニーは、ステージ２４におけるこの生体コロニーの位置を特定することにより、特定された位置に基づいてマニピュレータ３０により抜き取られる。これにより、目的対象物である生体コロニーを、他の生体コロニーから抜き取ることができる。
【００２１】
以降、蛍光検査装置１０の構成を説明する。
レーザ光照射ユニット１４は、培地容器２２内の測定対象物に照射するレーザ光を出射する。図２は、レーザ光照射ユニット１４の構成を示すブロック図である。レーザ光照射ユニット１４は、レーザ光源１４ａ，１４ｂと、レーザドライバ１４ｃ，１４ｄと、スキャニングミラー１４ｅと、駆動部１４ｆと、駆動制御部１４ｇと、ダイクロイックミラー１４ｈと、を有する。
レーザ光源１４ａは、ドナー蛍光色素を励起するレーザ光Ｌ1を出射する。レーザ光源１４ｂは、アクセプター蛍光色素を励起するレーザ光Ｌ2を出射する。ドナー蛍光色素を励起するレーザ光Ｌ1と、アクセプター蛍光色素を励起するレーザ光Ｌ2とは、ドナー蛍光色素、アクセプター蛍光色素をそれぞれ好適に励起することができるように波長帯域が異なっている。例えば、ドナー蛍光色素としてＣＦＰ(Cyan Fluorescent Protein)を用いる場合、波長４０５〜４４０ｎｍのレーザ光が用いられ、アクセプター蛍光色素としてＹＦＰ(Yellow Fluorescent Protein)を用いる場合、波長４７０〜５３０ｎｍのレーザ光が用いられる。レーザ光照射ユニット１４は、このような可視光帯域の連続波のレーザ光Ｌ1，Ｌ2を所定の周波数で強度変調して出射する。
【００２２】
ダイクロイックミラー１４ｈは、反射特性および透過特性が波長によって異なるミラーである。ダイクロイックミラー１４ｈは、レーザ光源１４ａから出射するレーザ光Ｌ1を透過し、レーザ光源１４ｂから出射するレーザ光Ｌ2を反射することにより、レーザ光を１つのビームとして、測定対象物に照射する。
各レーザ光源には、それぞれの光源を駆動してレーザ光Ｌ1，Ｌ2を出射させるレーザドライバ１４ｃ，１４ｄが接続されている。レーザドライバ１４ｃ，１４ｄは、後述するデータ処理部・制御部１８ａからの信号によって、レーザ光を強度変調するように制御される。
【００２３】
レーザ光を出射するレーザ光源１４ａ，１４ｂとして例えば半導体レーザが用いられ、例えば５〜１００ｍＷ程度の出力でレーザ光がレーザ光源１４ａ，１４ｂから出射される。レーザ光の強度変調の周波数(変調周波数)は、その強度変調の周期がドナー蛍光色素、アクセプター蛍光色素が発する蛍光の蛍光緩和時間に比べて長く、例えば１０〜１００ＭＨｚである。ドナー蛍光色素を励起するためのレーザ光Ｌ1とアクセプター栄光色素を励起するためのレーザ光Ｌ2とは、強度変調の周波数が１００〜２ＭＨｚ異なり、ドナー蛍光色素を励起するレーザ光Ｌ1の強度変調の周波数が、アクセプター蛍光色素を励起するレーザ光Ｌ2の強度変調の周波数に対して、高くなっている。アクセプター蛍光色素を励起するレーザ光Ｌ2の強度変調の周波数がドナー蛍光色素を励起するためのレーザ光Ｌ1の強度変調の周波数に比べて高くてもよい。このように、レーザ光Ｌ1，Ｌ2の強度変調の周波数を僅かに変えるのは、後述するように、受光した蛍光の蛍光信号の処理が短時間に行われるようにするためである。
【００２４】
レーザ光源１４ａ，１４ｂのそれぞれが出射するレーザ光Ｌ1，Ｌ2は、レーザ光Ｌ1，Ｌ2がドナー蛍光色素及びアクセプター蛍光色素をそれぞれ励起して特定の波長帯域の蛍光を発するように、予め定められた波長帯域で発振する。レーザ光Ｌ1，Ｌ2によって発する蛍光は、測定対象物中のドナー蛍光色素及びアクセプター蛍光色素の発する蛍光であり、培地容器２２上のレーザ光を照射する照射範囲に位置する測定対象物は、レーザ光Ｌ1，Ｌ2の照射を受けて蛍光色素特有の波長で蛍光を発する。
【００２５】
スキャニングミラー１４ｅは、レーザ光源１４ａ，１４ｂが出射するレーザ光Ｌ1，Ｌ2を反射して、レーザ光を、培地容器２２上の所定の範囲に照射する。具体的には、スキャニングミラー１４ｅはレーザ光の反射角度を制御することにより、培地容器２２上の所定の範囲を、一定の径のレーザ光のビームをスキャンさせる。スキャニングミラー１４ｅは、駆動部１４ｆによって駆動される。駆動部１４ｆは、駆動制御部１４ｇから送られた制御信号に基づいて、スキャニングミラー１４ｅを駆動する。これにより、スキャニングミラー１４ｅの反射角度は制御される。駆動制御部１４ｇは、後述する測定範囲制御部２０ｈと接続されて、制御信号が提供される。
【００２６】
スキャニングミラー１４ｅを用いたレーザ光Ｌ1，Ｌ2の照射範囲は、例えば、図３（ａ）に示すように、レーザ光を一方向に延在した線状の範囲である。また、スキャニングミラー１４ｅの反射角度の制御により、例えば、図３（ｂ）に示すように、図３（ａ）に示す線状の範囲を狭くして、レーザ光を照射する。このように、スキャニングミラー１４ｅの反射角度の制御により、レーザ光の照射範囲は自在に調整される。レーザ光の照射範囲は、後述する測定範囲制御部２０ｈにより、測定対象物である生体コロニーの位置を通るように、直線状に設定されている。なお、レーザ光のスポット径と生体コロニーの大きさとは、同程度であることが好ましい。例えば、レーザ光のスポット径が１ｍｍ程度とすると、コロニーも１ｍｍ程度に成長したものを測定対象に用いることが好ましい。
【００２７】
図４は、受光ユニット１６の概略の構成を示すブロック図である。
受光ユニット１６は、レンズ系１６ａと、ダイクロイックミラー１６ｂと、バンドパスフィルタ１６ｃ，１６ｄと、光電子増倍管やアバランシェフォトダイオード等の光電変換器１６ｅ，１６ｆと、撮影器１６ｇと、制御器１６ｈと、を有する。
レンズ系１６ａは、受光ユニット１６に入射した蛍光を光電変換器１６ｅ，１６ｆの受光面に集束させるように構成される。
【００２８】
ダイクロイックミラー１６ｂは、アクセプター蛍光色素の蛍光を透過させ、ドナー蛍光色素の蛍光を反射させるように、反射、透過の波長特性が定められて構成されたミラーである。バンドパスフィルタ１６ｃ，１６ｄでフィルタリングして光電変換器１６ｅ，１６ｆは、それぞれドナー蛍光色素の蛍光及びアクセプター蛍光色素の蛍光の所定の波長帯域の蛍光を取り込む。したがって、光電変換器１６ｅは、ドナー蛍光色素の発する蛍光を受光し、光電変換器１６ｆは、アクセプター蛍光色素の発する蛍光を受光する。
【００２９】
バンドパスフィルタ１６ｃ，１６ｄは、各光電変換器１６ｅ，１６ｆの受光面の前面に設けられ、所定の波長帯域の蛍光のみが透過するフィルタである。透過する蛍光の波長帯域は、ドナー蛍光色素の蛍光及びアクセプター蛍光色素の蛍光の波長帯域に対応して設定されており、互いに異なる波長帯域となっている。
【００３０】
光電変換器１６ｅ，１６ｆは、例えば光電子増倍管等のセンサを備え、受光面で受光した光を電気信号に変換するセンサである。ここで、受光する蛍光は強度変調されたレーザ光の照射によって発する位相が遅れた蛍光である。この蛍光は、位相遅れの情報を持った光信号として受光される。このため、出力される電気信号は位相差の信号情報を持った蛍光信号となる。この蛍光信号は、データ処理部・制御部１８に供給され、増幅器で増幅される。
【００３１】
撮影器１６ｇは、測定しようとする培地容器２２中の培地全体を撮影する。撮影した画像は、後述する分析装置２０において、基板上の生体コロニーの位置を特定するために画像処理が施される。撮影した画像上の各位置は、培地容器２２上の各位置と対応付けられている。したがって、生体コロニーの画像上の位置が特定されると、生体コロニーの培地容器２２上の位置を特定することができる。
制御部１６ｈは、撮像器１６ｇの動作を制御する。
【００３２】
図５（ａ），（ｂ）は、データ処理部・制御部１８の概略の構成を示すブロック図である。
データ処理部・制御部１８は、制御部１８ａ（図５（ａ）参照）とデータ処理部１８ｂ（図５（ｂ）参照）とを有する。
制御部１８ａは、システム制御器１９と、発振部１８ｃとを有する。発振部１８ｃは、発振器１８ｄ，１８ｅと、パワースプリッタ１８ｆと、ＳＳＢ(Single Side Band)変調器１８ｇと、アンプ１８ｈと、を有する。
システム制御器１９は、本装置全体の動作指示及び動作タイミングの制御を行う。発振部１８ｃに対しては、システム制御器１９が変調信号の生成を指示する。
【００３３】
発振器１８ｄ，１８ｅは、システム制御器１９の指示に応じた所定の周波数の信号（正弦波信号）を発振する。
発振器１８ｄは周波数ｆの信号（１０〜１００ＭＨｚ）の信号を発振する。出力した周波数ｆの信号は、パワースプリッタ１８ｆに入力される。パワースプリッタ１８ｆは、入力された周波数ｆの信号を分割し、一方の信号をレーザドライバ１４ｄに出力する。分割した周波数ｆの信号は、レーザドライバ１４ｄに出力され、レーザ光の変調信号として用いられる。他方の信号は、増幅器１８ｈで増幅された後、データ処理部１８ｂに出力され、さらに他方の信号は、ＳＳＢ変調器１８ｇに出力される。周波数ｆの信号をデータ処理部１８ｂに出力するのは、データ処理部１８ｂにおいて、蛍光信号の検波のための参照信号として用いるためである。
一方、発振器１８ｅは、周波数Δｆ（１００ｋＨｚ〜２ＭＨｚ）の信号を発振する。周波数の信号Δｆは、ＳＳＢ変調器１８ｇに出力される。ＳＳＢ変調器１８ｇは、入力された周波数ｆの信号と、周波数Δｆの信号に基づいて、周波数（ｆ＋Δｆ）の信号を生成する。生成した周波数（ｆ＋Δｆ）の信号は、レーザドライバ１４ｃに出力され、レーザ光の変調信号として用いられる。
【００３４】
データ処理部１８ｂは、光電変換器１６ｅ，１６ｆから出力される蛍光信号を用いて、レーザ光の照射により測定対象物が発する蛍光の位相遅れに関する情報(位相差)を抽出する。データ処理部１８ｂは、アンプ１８ｉ，１８ｊと、パワースプリッタ１８ｋと、ＩＱミキサ１８ｌ，１８ｍと、ローパスフィルタ１８ｎと、増幅器１８ｏと、ＡＤ変換器１８ｐと、を有する。アンプ１８ｉ，１８ｊは、光電変換器１６ｅ，１６ｆから出力される蛍光信号を増幅する。パワースプリッタ１８ｋは、蛍光信号のそれぞれに対して、発振部１８ｃから供給された周波数fの信号である変調信号を分配する。ＩＱミキサ１８ｍ，１８ｌは、増幅された蛍光信号を上記変調信号とミキシングする。
【００３５】
ＩＱミキサ１８ｌ、１８ｍは、ドナー蛍光色素が発する蛍光の蛍光信号及びアクセプター蛍光色素が発する蛍光の蛍光信号を、発振部１８ｃから供給される信号を参照信号としてミキシングするために、光電変換器１６ｅ，１６ｆ別に設けられている。変調信号を参照信号として同期してミキシングすることで、後述するように、蛍光の位相遅れを求めることができる。具体的には、ＩＱミキサ１６ｅ，１６ｆのそれぞれは、参照信号を蛍光信号(ＲＦ信号)と乗算して、蛍光信号のcos成分(実数部)と高周波成分を含む処理信号を算出するとともに、参照信号の位相を９０度シフトさせた信号を蛍光信号と乗算して、蛍光信号のsin成分(虚数部)と高周波成分を含む処理信号を算出する。処理信号は、ドナー蛍光色素が発した蛍光の信号及びアクセプター蛍光色素が発した２つの蛍光の信号である。このcos成分を含む処理信号及びsin成分を含む処理信号は、ローパスフィルタ１８ｎに出力される。
【００３６】
ローパスフィルタ１８ｎは、入力したcos成分、sin成分に高周波成分が加算された処理信号から高周波成分を取り除く。アンプ１８ｏは、高周波成分の取り除かれたcos成分、sin成分の処理信号を増幅する。ＡＤ変換器１８ｐは、増幅された処理信号をサンプリングする。ＡＤ変換器１８ｐでは、高周波成分の取り除かれたcos成分、sin成分の処理信号がサンプリングされて、分析装置２０に出力される。サンプリングは、上述の周波数Δfの整数倍(好ましくは3倍以上の整数倍)の周波数をサンプリング周波数とする。ローパスフィルタ１８ｎは、ＡＤ変換器１８ｐによるデジタル化のときのアンチエリアジングのために、かつ周波数Δfの信号成分を通過させるために、周波数特性が定められる。
【００３７】
分析装置２０は、ＡＤ変換器１８ｐでデジタル化された蛍光信号（cos成分、sin成分）を用いて、蛍光強度と蛍光の発光過程における位相遅れを蛍光の特徴量として算出し、この特徴量に基づいて、ＦＲＥＴが発生しているか否かを判定する。これにより、分析装置２０は、ＦＲＥＴが発生しているとき、測定対象物（複数の生体コロニー）に目的対象物（選別すべき生体コロニー）が含まれていると判定する。さらに、この判定結果に応じて、レーザ光の照射範囲を変更する、例えば、照射範囲を狭くする。こうして、分析装置２０は、レーザ光の照射範囲を狭くすることにより、目的対象物の位置を特定することができる。もし、レーザ光の照射範囲内で、ＦＲＥＴが発生していないと判定した場合、分析装置２０は、レーザ光の照射範囲を、別の範囲に移動するように、レーザ光照射ユニット１４を制御する。
【００３８】
分析装置は、ＣＰＵ２０ａと、メモリ２０ｂと、データベース２０ｃと、を有するコンピュータで構成される。分析装置２０は、メモリ２０ｂに記憶されているプログラムを起動することにより、モジュールが立ち上がる。
モジュールは、周波数分析部２０ｄと、位相遅れ算出部２０ｅと、蛍光強度算出部２０ｆと、ＦＲＥＴ判定部２０ｇと、画像処理部２０ｉと、測定範囲制御部２０ｈと、を含む。
データベース２０ｃは、例えば、撮像器１６ｇで撮像した画像上の測定対象物の位置情報や、特定した目的対象物の位置情報を記憶する。
【００３９】
周波数分析部２０ｄは、データ処理部１８ｂから供給された蛍光信号について周波数分析を行い、周波数０の信号成分の値と、周波数Δｆの信号成分の値を算出する。周波数０の信号成分の値および周波数Δｆの信号成分の値として、例えば周波数０，Δｆに対して所定の範囲のパワースペクトル値が用いられてもよい。レーザ光照射ユニット１４は、スキャニングミラー１４ｅの反射角度の制御によってレーザ光を定められている照射範囲でスキャンするが、このレーザ光のスキャンによって収集される蛍光信号のｃｏｓ成分およびｓｉｎ成分の時系列信号が周波数分析部２０ｄに入力される。したがって、周波数分析部２０ｄは、このｃｏｓ成分およびｓｉｎ成分の時系列信号に対して、例えばＦＦＴ（Fast Fourier Trandformation）処理を行う。
蛍光信号は、ｃｏｓ成分の信号とｓｉｎ成分の信号を有するので、算出される値は、ｃｏｓ成分の周波数０の成分の値および周波数Δｆの成分の値と、ｓｉｎ成分の周波数０の成分の値および周波数Δｆの成分の値とを含む。しかも、ｃｏｓ成分の信号とｓｉｎ成分の信号は、光電変換器１６ｆから出力されたアクセプター蛍光色素が発する蛍光の信号に由来するものと、光電変換器１６ｅから出力されたドナー蛍光色素が発する蛍光の信号に由来するものがある。
アクセプター蛍光色素が発する蛍光の信号に由来する周波数０におけるｃｏｓ成分およびｓｉｎ成分は、アクセプター蛍光色素がレーザ光で励起されて発するアクセプター蛍光の信号成分である。アクセプター蛍光色素が発する蛍光の信号に由来する周波数Δｆにおけるｃｏｓ成分およびｓｉｎ成分は、ＦＲＥＴによりアクセプター蛍光色素が発するＦＲＥＴ蛍光の信号成分である。
同様に、ドナー蛍光色素が発する蛍光の、周波数Δｆにおけるｃｏｓ成分およびｓｉｎ成分は、ドナー蛍光色素がレーザ光で励起されて発するドナー蛍光の信号成分である。
これらの算出された値は、位相遅れ算出部２０ｅおよび蛍光強度算出部２０ｆに提供される。
【００４０】
位相遅れ算出部２０ｅは、周波数０，Δｆにおけるｃｏｓ成分およびｓｉｎ成分の値を用いて、（ｓｉｎ成分の値）／（ｃｏｓ成分の値）を算出することにより、位相遅れｔａｎθを周波数０，Δｆについて算出する。
例えば、アクセプター蛍光色素が発する蛍光の信号に由来する周波数０における位相遅れｔａｎθ０は、レーザ光の照射を受けたアクセプター蛍光色素が発する蛍光の発光過程（一次緩和過程）に起因する遅れを表す。アクセプター蛍光色素が発する蛍光の信号に由来する周波数Δｆにおける位相遅れｔａｎθΔｆは、ＦＲＥＴ蛍光の発光過程（一次緩和過程）に起因する遅れを表す。算出された周波数０，Δｆにおける位相遅れｔａｎθ０，ｔａｎθΔｆは、ＦＲＥＴ判定部２０ｇに提供される。このような位相遅れｔａｎθ０，ｔａｎθΔｆと蛍光の発光過程については、ＷＯ２００９／０２８０６３公報に記載されている。
蛍光強度算出部２０ｆは、周波数０，Δｆにおけるｃｏｓ成分およびｓｉｎ成分の値の二乗加算和の平方根を算出することにより、蛍光強度Ｐ０，ＰΔｆを算出する。算出された周波数０，Δｆにおける蛍光強度Ｐ０，ＰΔｆは、ＦＲＥＴ判定部２０ｇに提供される。
【００４１】
ＦＲＥＴ判定部２０ｇは、算出された周波数０，Δｆにおける蛍光強度Ｐ０，ＰΔｆと、周波数０，Δｆにおける位相遅れｔａｎθ０，ｔａｎθΔｆを用いて、ＦＲＥＴの発生の有無を調べることにより、測定対象物群内に、目的対象物が含まれているか否かを判定する。
図７（ａ），（ｂ）は、ＦＲＥＴ判定部２０ｇがＦＲＥＴの発生の有無の判定方法の一例を説明する図である。この例では、アクセプター蛍光とＦＲＥＴ蛍光の蛍光強度と位相遅れを用いる。なお、アクセプター蛍光とは、レーザ光によってアクセプター蛍光色素が直接励起されることにより発する蛍光をいう。ＦＲＥＴ蛍光とは、レーザ光の照射を受けて励起したドナー蛍光色素の励起エネルギーがＦＲＥＴによりアクセプター蛍光色素に移動し、この励起エネルギーによってアクセプター蛍光色素が発する蛍光をいう。
図７（ａ）に示すように、周波数０におけるアクセプター蛍光の蛍光強度Ｐ０の値のα倍（０＜α＜１）を閾値として、周波数ΔｆにおけるＦＲＥＴ蛍光の蛍光強度ＰΔｆの値がこの閾値以下の場合、ＦＲＥＴ判定部２０ｇは、ＦＲＥＴは発生していないと判定する。一方、周波数ΔｆにおけるＦＲＥＴ蛍光の蛍光強度ＰΔｆの値がこの閾値を越える場合であっても、周波数０におけるアクセプター蛍光の位相遅れｔａｎθ０の値のβ倍（１＜β）を閾値として、周波数Δｆにおける位相遅れｔａｎθΔｆの値がこの閾値以下である場合、ＦＲＥＴ判定部２０ｇは、ＦＲＥＴは発生していないと判定する。ＦＲＥＴ蛍光の蛍光強度ＰΔｆが閾値α・Ｐ0を越え、ＦＲＥＴ蛍光の位相遅れｔａｎθΔｆが閾値β・ｔａｎθ０を越える場合、ＦＲＥＴ判定部２０ｇは、ＦＲＥＴの発生は発生している、と判定する。ＦＲＥＴ判定部２０ｇは、ＦＲＥＴの発生の有無により、レーザ光の照射範囲内に目的対象物が存在したか否かを判定する。
この他の判定方法として、アクセプター蛍光の蛍光強度Ｐ０および位相遅れｔａｎθ０の代わりに、ドナー蛍光色素が発する蛍光における蛍光強度Ｐ０および位相遅れｔａｎθ０を用いることもできる。判定結果の情報は、測定範囲制御部２０ｈに提供される。
【００４２】
このようにＦＲＥＴ判定部２０ｇがＦＲＥＴ蛍光の蛍光強度ＰΔｆを調べるのは、位相遅れｔａｎθΔｆが閾値β・ｔａｎθ０を越える場合であっても、ＦＲＥＴが発生していない場合があるからである。位相遅れｔａｎθΔｆは、（ｓｉｎ成分の値）／（ｃｏｓ成分の値）で算出されるので、ＦＲＥＴが発生せず、蛍光強度ＰΔｆが極めて小さくても、位相遅れｔａｎθΔｆがノイズ成分の影響を受けて閾値β・ｔａｎθ０を越える場合があるからである。このため、ＦＲＥＴ判定部２０ｇは、蛍光強度ＰΔｆが閾値を越えるときのみ、位相遅れｔａｎθΔｆが閾値β・ｔａｎθ０を越えるか否かを調べる。
なお、培地容器２２内では、生体コロニーを形成するが、このような生体コロニーのサイズは生体コロニー間でばらばらであるため、従来のように、蛍光強度を用いるだけでは、精度の高い判定はできない。本実施形態のように、生体コロニーのサイズに影響を受けない位相遅れを用いることにより、精度の高い判定が達成できる。
判定に用いられた、位相遅れｔａｎθ０，ｔａｎθΔｆ及び蛍光強度Ｐ０，ＰΔｆは図示されないディスプレイあるいはプリンタ等の出力装置に出力される。
【００４３】
測定範囲制御部２０ｈは、後述する画像処理部２０ｉから提供される、培地上の測定対象物である生体コロニーの位置情報に基づいて、レーザ光の照射範囲を自動的に定めて、レーザ光照射ユニット１４を制御する。さらに、測定範囲制御部２０ｈは、ＦＲＥＴ判定部２０ｇから提供される判定結果の情報に応じて、レーザ光の照射範囲を変更する。レーザ光の照射範囲の変更とは、定められているレーザ光の照射範囲を狭くすること、及び、定められているレーザ光の照射範囲を他の照射範囲に移すこと、を含む。例えば、ＦＲＥＴ判定部２０ｇの判定により、ＦＲＥＴの発生がなく、レーザ光の照射範囲に目的対象物が存在しない場合、測定範囲制御部２０ｈは、レーザ光の照射範囲を他の照射範囲に移す。一方、ＦＲＥＴ判定部２０ｇの判定により、ＦＲＥＴの発生が認められ、レーザ光の照射範囲に目的対象物が存在する場合、測定範囲制御部２０ｈは、レーザ光の照射範囲を狭くする。この場合、レーザ光の照射範囲を徐々に狭くして、レーザ光による蛍光の検査を繰り返すことにより、測定範囲制御部２０ｈは、ＦＲＥＴが発生する目的対象物の位置を特定することができる。
なお、測定範囲制御部２０ｈは、画像処理部２０ｉで定まる画像上の位置と、ステージ２４上の位置とを関連付けた参照テーブルを有する。測定範囲制御部２０ｈは、この参照テーブルを用いて、画像上の測定対象物の位置からステージ２４上の位置を求め、レーザ光の照射範囲を定める。
測定範囲制御部２０ｈは、レーザ光の照射範囲の情報をレーザ光照射ユニット１４に提供し、システム制御器１９に蛍光検出を行うように指示をする。さらに、測定範囲制御部２０ｈは、目的対象物を見出して位置が特定されたとき、後述するマニピュレータ３０に、特定された位置の情報を提供する。
【００４４】
画像処理部２０ｉは、撮像器１６ｇ（図４参照）にて撮影された培地上の測定対象物の画像のコントラスト処理、明度処理、二値化処理等を行って、測定対象物である生体コロニーの位置を特定する。生体コロニーの位置は、画像上の位置座標により特定される。コロニーの位置座標は、コロニーの位置情報として、データベース２０ｃに記憶されるとともに、測定範囲制御部２０ｈに提供される。
【００４５】
マニピュレータ３０は、図８に示すように、測定範囲制御部２０ｈによってステージ２４上の特定された位置にある目的対象物を培地内から抜き取り、目的サンプル容器３２に集める。目的対象物の抜き取りは、マニピュレータ３０の先端に設けられた管により吸引により行われる。このとき、測定範囲制御部２０ｈは、移動機構２６によりステージ２４をｘ方向、ｙ方向に移動させて、効率よく目的対象物を抜き取ってもよい。
以上が、蛍光検査装置１０の構成である。
【００４６】
このような蛍光検査装置１０は、以下の蛍光検査方法を行う。
まず、測定範囲制御部２０ｈは、測定対象物が分散する培地容器２２の基板に対してレーザ光の照射範囲を設定する。具体的には、測定範囲制御部２０は、予め撮像器１６ｇにより得られる測定対象物の画像から分散する測定対象物の位置を特定することにより、この測定対象物を照射するように、レーザ光の照射範囲を設定する。
レーザ光照射ユニット１４は、定められた照射範囲でレーザ光を照射する。例えば、スキャニングミラー１４ｅの反射角度を制御することにより、図３（ａ）に示すように、レーザ光が一定の範囲をスキャンしながら直線状に照射する。このとき、レーザ光は、所定の周波数ｆと周波数Δｆで強度変調された２つのレーザ光Ｌ1，Ｌ2が重なったビームである。
【００４７】
次に、受光ユニット１６は、レーザ光の照射を受けた測定対象物のそれぞれが発する蛍光を受光して、蛍光信号を出力する。
この後、データ処理部１８ｂは、蛍光信号の信号処理を行う。さらに、分析装置２０は、蛍光の特徴量である位相遅れｔａｎθ０，ｔａｎθΔｆ及び蛍光強度Ｐ０，ＰΔｆを算出することにより、測定対象物が目的対象物を含むか否かの判定をする。この判定は、図７（ａ），（ｂ）に示す方法によってＦＲＥＴが発生しているか否かを調べることにより行われる。
【００４８】
さらに、分析装置２０は、上記判定の結果に応じて、レーザ光が照射する照射範囲を狭くする。蛍光検出装置１０は、レーザ光照射ユニット１４によるレーザ光の照射、受光ユニット１６による蛍光の受光、およびデータ処理部１８ｂにおける信号処理、分析装置２０における判定、を繰り返す。
こうして、分析装置２０は、レーザ光の照射範囲を徐々に狭くすることにより、目的対象物の位置を特定する。
この後、分析装置２０で特定された位置にある目的対象物を抜き取り、目的サンプル容器３２に集める。
【００４９】
以上のように、本実施形態は、レーザ光を受光した測定対象物が発する蛍光の蛍光信号の信号処理を行い、蛍光の特徴量を算出することにより、測定対象物が目的対象物を含むか否かを判定する。本実施形態は、この判定結果に応じて、レーザ光の照射範囲を変更する、このため、レーザ光を照射した測定対象物内に目的対象物が含まれない場合、本実施形態は、すぐに測定対象物の別の範囲を検査することができるので、効率よく目的対象物を見出すことができる。また、本実施形態は、測定対象物内に目的対象物が含まれる場合、レーザ光の照射範囲を狭くすることができるので、効率よく目的対象物の位置を特定することができる。特に、ＦＲＥＴを利用して、精度の高く目的対象物を見出すことができる。
従来は、蛍光強度に基づいて目的対象物を判別するが、目的対象物の大きさに応じて蛍光強度を規格化する必要があり、目的対象物の判別が容易でなかったが、本実施形態のようにＦＲＥＴを用いることにより、迅速に目的対象物の有無を判定することができる。
このような実施形態は、生体コロニーを形成した微生物群等の複数の測定対象物であっても、従来のフローサイトメータのように単離する必要がなく、コロニー単位で目的対象物を見出すことができる。また、本実施形態は、生体コロニーを単離する必要がないので、生体が損傷を受ける可能性が極めて少ない。
また、本実施形態では、ＦＲＥＴを用いるので、ＦＲＥＴの発生する目的対象物の割合が少なくても、ＦＲＥＴの発生を効率よく見つけ出すことができる。
【００５０】
本実施形態では、目的対象物の存在の判定を行うために、２つの蛍光色素を用いたＦＲＥＴを利用するが、このＦＲＥＴを利用した判定方法として、ＷＯ２００９／０２８０６２公報に記載される、１つのレーザ光源を用いて行うＦＲＥＴ検出方法を用いることもできる。
なお、本実施形態では、目的対象物の存在の判定を行うために、２つの蛍光色素を用いたＦＲＥＴを利用するが、必ずしもＦＲＥＴを利用しなくてもよい。例えば、選別対象とする生体のみが取り込みやすい物質あるいは取り込みにくい物質に付着した蛍光色素をラベルとして用いて、蛍光検査を行うこともできる。この場合、レーザ光を出射するレーザ光源は、２つではなく、１つのみが用いられてもよい。
また、本実施形態では、ドナー蛍光色素が発する蛍光を受光する光電変換器１６ｅと、アクセプター蛍光色素が発する蛍光を受光する光電変換器１６ｆが用いられる。しかし、ドナー蛍光色素の発する蛍光の蛍光強度及び蛍光緩和時間が、ＦＲＥＴの判定に用いられない場合、ドナー蛍光色素が発する蛍光を受光する光電変換器１６ｅを用いず、アクセプター蛍光色素が発する蛍光を受光する光電変換器１６ｆのみが用いられてもよい。
本実施形態は、蛍光の位相遅れとしてｔａｎθを用いるが、ｔａｎθの代わりに角度であるθを用いてもよい。
【００５１】
以上、本発明の蛍光検査装置および蛍光検査方法について詳細に説明したが、本発明は上記実施形態に限定されず、本発明の主旨を逸脱しない範囲において、種々の改良や変更をしてもよいのはもちろんである。
【符号の説明】
【００５２】
１０ 蛍光検査装置
１２ 移動台
１４レーザ光照射ユニット
１４ａ，１４ｂ レーザ光源
１４ｃ，１４ｄ レーザドライバ
１４ｅ スキャニングミラー
１４ｆ 駆動部
１４ｇ 駆動制御部
１４ｈ ダイクロイックミラー
１６ 受光ユニット
１６ａ レンズ系
１６ｂ ダイクロイックミラー
１６ｃ，１６ｄ バンドパスフィルタ
１６ｅ，１６ｆ 光電変換器
１６ｇ 撮影器
１６ｈ 制御器
１８ データ処理部・制御部
１８ａ 制御部
１８ｂ データ処理部
１８ｃ 発振部
１８ｄ，１８ｅ 発振器
１８ｆ パワースプリッタ
１８ｇ ＳＳＢ変調器
１８ｈ アンプ
１８ｉ，１８ｊ アンプ
１８ｋ パワースプリッタ
１８ｌ，１８ｍ ＩＱミキサ
１８ｎ ローパスフィルタ
１８ｏ増幅器
１８ｐ ＡＤ変換器
１９ システム制御器
２０ 分析装置
２０ａ ＣＰＵ
２０ｂ メモリ
２０ｃ データベース
２０ｄ 周波数分析部
２０ｅ 位相遅れ算出部
２０ｆ 蛍光強度算出部
２０ｇ ＦＲＥＴ判定部
２０ｈ 測定範囲制御部
２０ｉ 画像処理部
２２ 培地容器
２４ ステージ
２６ 移動機構
３０ マニピュレータ
３２ 目的サンプル容器
【技術分野】
【０００１】
本発明は、複数の測定対象物のそれぞれがレーザ光の照射を受けて発する蛍光を受光することにより、蛍光検査を行う蛍光検査装置及び蛍光検査方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
微生物や細胞等の生体の培養には、無菌環境における厳密な管理が行われている。しかし、微生物や細胞等の生体の培養時、異なる種類の微生物の混入が容易に起こるため、定期的に有用な微生物の選別が行われている。有用な微生物の選別とは、例えば、雑多な微生物から特定の微生物を選別することである。また、紫外線及び放射線による突然変異が生じた変異種の微生物を有用な微生物として選別することも行われている。変異種の微生物の選別は、専ら、顕微鏡を用いて行われ、あるいは、培地培養等を行って成長した微生物のコロニーの微視的な特徴や巨視的な特徴を利用して行われる。
【０００３】
近年、特定の蛍光を発する有機薬剤により、特定のタンパク質を染色し、有機薬剤の発する特定の蛍光を受光することにより、特定のタンパク質を識別する方法が広く行われている。この方法は、微生物の識別のために、盛んに用いられている。
【０００４】
例えば、細胞内の含硫化合物含有量が上昇した微生物、特に酵母、を効率よく迅速にスクリーニングする方法が知られている（特許文献１）。
当該スクリーニング方法は、具体的には、親株に遺伝子改変処理を施して得られた微生物細胞群に-SH基と結合する蛍光指示薬を導入し含硫化合物を標識させ、励起光照射し、細胞内の蛍光指示薬が発する蛍光を光学的検出器を用いて検出する。このとき、細胞群の中から蛍光強度が相対的に高い細胞を分別機構により分取する。
【０００５】
より具体的には、当該スクリーニング方法は、検出する光学的検出器としてフローサイトメータを使用する。このとき、分別機構としてフローサイトメータからの信号に対応して作動するセルソータが用いられる。フローサイトメータは、細胞懸濁液を細管中に高速で流し、一方からレーザ光などを照射して前方散乱光、側方散乱光あるいは発せられた蛍光細胞からの光の強度を測定することで細胞一つ一つの情報を自動的にサンプリングし解析する。セルソータ機能を有するフローサイトメータを用いることにより、指定した散乱光および蛍光を発する特定の細胞のみを分取する。
これにより、極めて低い頻度でしか出現しない細胞内の含硫化合物含有量が上昇した微生物変異体を迅速にスクリーニングすることができる、とされている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２００７−３７５３４号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかし、フローサイトメータでは、個々の微生物を培養液中で分離して培養する必要があるため、凝集して単離するのが困難な微生物等を検査対象とすることは難しい。
基板に載せられた培養液中で培養されてコロニーを形成した微生物群に、レーザ光を照射して蛍光強度を測定する場合、コロニーのサイズによって蛍光強度が異なるため、蛍光強度のみでは、特定の細胞を分取することは難しい。
【０００８】
そこで、本発明は、上記問題点を解決するために、コロニーを形成した微生物群等の複数の測定対象物であっても、従来のフローサイトメータのように単離することなく、複数の測定対象物が発する蛍光の測定を行って、測定対象物内に目的対象物が含まれているか否かを迅速に判定する蛍光検査装置及び蛍光検査方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明の一態様は、複数の測定対象物のそれぞれがレーザ光の照射を受けて発する蛍光を受光することにより、蛍光検査を行う蛍光検査装置であって、
基板上に分散する測定対象物に対してレーザ光の照射範囲を定めてレーザ光を照射するレーザ光照射部と、
前記レーザ光を受光した測定対象物のそれぞれが発する蛍光を受光して、蛍光信号を出力する受光部と、
前記蛍光信号の信号処理を行い、蛍光の特徴量を算出することにより、前記測定対象物が目的対象物を含むか否かを判定する処理部と、
前記処理部の判定結果に応じて、前記レーザ光の照射範囲を変更する制御部と、を有することを特徴とする蛍光検査装置である。
【００１０】
前記処理部が、前記測定対象物が目的対象物を含むと判定した場合、前記制御部は、前記レーザ光の前記照射範囲を狭くして、前記レーザ光を前記測定対象物の一部に照射するように制御する、ことが好ましい。
また、前記制御部は、前記レーザ光の照射位置の前記照射範囲を狭くすることにより、前記目的対象物の位置を特定する、ことが好ましい。
さらに、特定された位置にある前記目的対象物を前記測定対象物から抜き取る抜き取り部を有する、ことが好ましい。
【００１１】
前記測定対象物に照射される前記レーザ光は、例えば、所定の周波数の変調信号で強度変調され、前記処理部は、蛍光信号の、前記変調信号に対する位相遅れを、前記特徴量として算出する。
前記目的対象物は、例えば、第１の物質と第２の物質とが結合した構成物を含み、
前記第１の物質には、第１の蛍光物質が設けられ、
前記第２の物質には、第２の蛍光物質が設けられ、
前記受光部は、前記レーザ光の照射により前記第２の蛍光物質が発する第１の蛍光と、前記レーザ光の照射により受けた前記第１の蛍光物質の励起エネルギーが第２の蛍光物質に移動することにより、前記第２の蛍光物質が発する第２の蛍光と、を受け、
前記処理部は、前記第１の蛍光および前記第２の蛍光の信号のそれぞれを、前記蛍光信号として処理する、ことが好ましい。
その際、前記処理部は、前記第１の蛍光の発光過程に起因して生じる位相遅れと前記第２の蛍光の発光過程に起因して生じる位相遅れとの間の比率に基づいて、前記測定対象物が目的対象物を含むか否かを判定する、ことが好ましい。
前記測定対象物は、例えば、前記基板上の培地において複数の生体が互いに集まった生体コロニーである。
【００１２】
さらに、本発明の他の態様は、複数の測定対象物のそれぞれがレーザ光の照射を受けて発する蛍光を受光することにより、測定対象物の蛍光検査を行う蛍光検査方法であって、
基板上に分散する測定対象物に対してレーザ光の照射範囲を定めてレーザ光を照射する第１ステップと、
前記レーザ光を受光した測定対象物のそれぞれが発する蛍光を受光して、蛍光信号を出力する第２ステップと、
前記蛍光信号の信号処理を行い、蛍光の特徴量を算出することにより、前記測定対象物が目的対象物を含むか否かの判定をする第３ステップと、
前記判定の結果に応じて、前記レーザ光が照射する、前記基板上の照射範囲を狭くして、前記第１ステップ、前記第２ステップおよび前記第３ステップを繰り返す、第４ステップと、
前記第４ステップを行うことにより、目的対象物の前記基板上における位置を特定する第５ステップと、を有する蛍光検査方法である。
【００１３】
前記蛍光検出方法には、さらに、特定された位置にある前記目的対象物を前記測定対象物から抜き取る第６ステップを有する、ことが好ましい。
前記測定対象物は、例えば、前記基板上の培地において複数の生体が互いに集まった生体コロニーである。
【発明の効果】
【００１４】
上述の蛍光検査装置及び蛍光検査方法は、コロニーを形成した微生物群等の複数の測定対象物であっても、従来のフローサイトメータのように単離することなく、複数の測定対象物が発する蛍光の測定を行って、測定対象物内に目的対象物が含まれているか否かを迅速に判定することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】本実施形態の蛍光検査装置の一例を説明する図である。
【図２】図１に示す蛍光検査装置の照射ユニットを説明する図である。
【図３】（ａ），（ｂ）は、図２に示す照射ユニットが照射するレーザ光の照射範囲を説明する図である。
【図４】図１に示す蛍光検査装置の受光ユニットを説明する図である。
【図５】（ａ），（ｂ）は、図１に示す蛍光検査装置のデータ処理部・制御部を説明する図である。
【図６】図１に示す蛍光検査装置の分析装置を説明する図である。
【図７】（ａ），（ｂ）は、図６に示す分析装置で行われるＦＲＥＴの発生の有無の判定法を説明する図である。
【図８】図１に示す蛍光検査装置で用いるマニピュレータを説明する図である。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
以下、本発明の蛍光検査装置および蛍光検査方法について詳細に説明する。
図１は、本実施形態の蛍光検査装置１０の一例を説明する図である。
蛍光検査装置１０は、基板上の培地にて培養した微生物や生体組織等に対して、蛍光検査を行う装置である。蛍光検査装置１０は、培養した微生物や生体組織が、取り出すべき目的対象物（目的微生物や目的生体組織）であるか否かを判定し、判定結果に応じて、目的微生物や目的生体組織を取り出す。
【００１７】
蛍光検査を行う複数の測定対象物は、予め以下のようなラベル処理が施されている。
２種類の蛍光色素（ドナー蛍光色素およびアクセプター蛍光色素）が別々に付加されている２種類の物質Ａ，Ｂが用意される。蛍光色素を有する物質Ａは、微生物や生体組織等の測定対象物が備える特定部分に結合する物質である。この物質Ａが、測定対象物に付着して、蛍光色素でラベル化されている。
この後、別の蛍光色素を有する物質Ｂを含む培地を用いて、測定対象物を培養する。培養中、物質Ｂとして、測定対象物群のうち目的対象物特有の反応や活性により目的対象物内に取り込まれ、物質Ａと近接する物質が用いられる。こうして、培養された測定対象物に対して、蛍光検査を行う。
【００１８】
このとき、物質Ａと物質Ｂが近接する場合、２種類の蛍光色素も近接する。物質Ａ，Ｂに付加する２種類の蛍光色素は、近接することにより、一方の蛍光色素であるドナー蛍光色素がレーザ光の照射により励起したエネルギーが蛍光を発することなくアクセプター蛍光色素に移動する（蛍光共鳴移動（ＦＲＥＴ:Fluorescence Resonant Energy Transfer ））。アクセプター蛍光色素は、この移動したエネルギーにより、励起されて特定の波長の蛍光を発する。以降、この蛍光をＦＲＥＴ蛍光という。
なお、測定対象物に照射されるレーザ光によってアクセプター蛍光色素も励起されるので、このレーザ光の励起によって発する蛍光も発する。以降、この蛍光をアクセプター蛍光という。
蛍光検査装置１０は、ＦＲＥＴ蛍光とアクセプター蛍光のそれぞれの発光過程に起因して生じる位相遅れの比を用いて、ＦＲＥＴの発生の有無を判定する。
【００１９】
蛍光検査装置１０は、移動台１２と、レーザ光照射ユニット１４と、受光ユニット１６と、
データ処理部・制御部１８と、分析装置２０と、マニピュレータ３０（図８参照）と、を有する。
【００２０】
移動台１２は、測定対象物を培養する培地容器２２を載置するステージ２４と、ステージ２４を２次元的に（図中のｘ方向、ｙ方向に）移動する移動機構２６と、を有する。
移動機構２６は、分析装置２０から延びる制御線と接続され、分析装置２０からの指示に基づいて培地容器２２を２次元的に移動することができる構成になっている。ステージ２４に載置される培地容器２２は、測定対象物が培地中に分散して基板上に載せられている。本実施形態の測定対象物は、培地中で複数の生体が互いに集まった複数の生体コロニーである。複数の生体コロニーは、基板上の培地において分散している。この生体コロニーは、１つの生体が培養されて増殖して形成されたものである場合が多い。したがって、生体コロニー内の１つの生体が選別対象である場合、この生体コロニーに属する生体は略全て選別対象である場合が多い。
選別対象の生体コロニーは、ステージ２４におけるこの生体コロニーの位置を特定することにより、特定された位置に基づいてマニピュレータ３０により抜き取られる。これにより、目的対象物である生体コロニーを、他の生体コロニーから抜き取ることができる。
【００２１】
以降、蛍光検査装置１０の構成を説明する。
レーザ光照射ユニット１４は、培地容器２２内の測定対象物に照射するレーザ光を出射する。図２は、レーザ光照射ユニット１４の構成を示すブロック図である。レーザ光照射ユニット１４は、レーザ光源１４ａ，１４ｂと、レーザドライバ１４ｃ，１４ｄと、スキャニングミラー１４ｅと、駆動部１４ｆと、駆動制御部１４ｇと、ダイクロイックミラー１４ｈと、を有する。
レーザ光源１４ａは、ドナー蛍光色素を励起するレーザ光Ｌ1を出射する。レーザ光源１４ｂは、アクセプター蛍光色素を励起するレーザ光Ｌ2を出射する。ドナー蛍光色素を励起するレーザ光Ｌ1と、アクセプター蛍光色素を励起するレーザ光Ｌ2とは、ドナー蛍光色素、アクセプター蛍光色素をそれぞれ好適に励起することができるように波長帯域が異なっている。例えば、ドナー蛍光色素としてＣＦＰ(Cyan Fluorescent Protein)を用いる場合、波長４０５〜４４０ｎｍのレーザ光が用いられ、アクセプター蛍光色素としてＹＦＰ(Yellow Fluorescent Protein)を用いる場合、波長４７０〜５３０ｎｍのレーザ光が用いられる。レーザ光照射ユニット１４は、このような可視光帯域の連続波のレーザ光Ｌ1，Ｌ2を所定の周波数で強度変調して出射する。
【００２２】
ダイクロイックミラー１４ｈは、反射特性および透過特性が波長によって異なるミラーである。ダイクロイックミラー１４ｈは、レーザ光源１４ａから出射するレーザ光Ｌ1を透過し、レーザ光源１４ｂから出射するレーザ光Ｌ2を反射することにより、レーザ光を１つのビームとして、測定対象物に照射する。
各レーザ光源には、それぞれの光源を駆動してレーザ光Ｌ1，Ｌ2を出射させるレーザドライバ１４ｃ，１４ｄが接続されている。レーザドライバ１４ｃ，１４ｄは、後述するデータ処理部・制御部１８ａからの信号によって、レーザ光を強度変調するように制御される。
【００２３】
レーザ光を出射するレーザ光源１４ａ，１４ｂとして例えば半導体レーザが用いられ、例えば５〜１００ｍＷ程度の出力でレーザ光がレーザ光源１４ａ，１４ｂから出射される。レーザ光の強度変調の周波数(変調周波数)は、その強度変調の周期がドナー蛍光色素、アクセプター蛍光色素が発する蛍光の蛍光緩和時間に比べて長く、例えば１０〜１００ＭＨｚである。ドナー蛍光色素を励起するためのレーザ光Ｌ1とアクセプター栄光色素を励起するためのレーザ光Ｌ2とは、強度変調の周波数が１００〜２ＭＨｚ異なり、ドナー蛍光色素を励起するレーザ光Ｌ1の強度変調の周波数が、アクセプター蛍光色素を励起するレーザ光Ｌ2の強度変調の周波数に対して、高くなっている。アクセプター蛍光色素を励起するレーザ光Ｌ2の強度変調の周波数がドナー蛍光色素を励起するためのレーザ光Ｌ1の強度変調の周波数に比べて高くてもよい。このように、レーザ光Ｌ1，Ｌ2の強度変調の周波数を僅かに変えるのは、後述するように、受光した蛍光の蛍光信号の処理が短時間に行われるようにするためである。
【００２４】
レーザ光源１４ａ，１４ｂのそれぞれが出射するレーザ光Ｌ1，Ｌ2は、レーザ光Ｌ1，Ｌ2がドナー蛍光色素及びアクセプター蛍光色素をそれぞれ励起して特定の波長帯域の蛍光を発するように、予め定められた波長帯域で発振する。レーザ光Ｌ1，Ｌ2によって発する蛍光は、測定対象物中のドナー蛍光色素及びアクセプター蛍光色素の発する蛍光であり、培地容器２２上のレーザ光を照射する照射範囲に位置する測定対象物は、レーザ光Ｌ1，Ｌ2の照射を受けて蛍光色素特有の波長で蛍光を発する。
【００２５】
スキャニングミラー１４ｅは、レーザ光源１４ａ，１４ｂが出射するレーザ光Ｌ1，Ｌ2を反射して、レーザ光を、培地容器２２上の所定の範囲に照射する。具体的には、スキャニングミラー１４ｅはレーザ光の反射角度を制御することにより、培地容器２２上の所定の範囲を、一定の径のレーザ光のビームをスキャンさせる。スキャニングミラー１４ｅは、駆動部１４ｆによって駆動される。駆動部１４ｆは、駆動制御部１４ｇから送られた制御信号に基づいて、スキャニングミラー１４ｅを駆動する。これにより、スキャニングミラー１４ｅの反射角度は制御される。駆動制御部１４ｇは、後述する測定範囲制御部２０ｈと接続されて、制御信号が提供される。
【００２６】
スキャニングミラー１４ｅを用いたレーザ光Ｌ1，Ｌ2の照射範囲は、例えば、図３（ａ）に示すように、レーザ光を一方向に延在した線状の範囲である。また、スキャニングミラー１４ｅの反射角度の制御により、例えば、図３（ｂ）に示すように、図３（ａ）に示す線状の範囲を狭くして、レーザ光を照射する。このように、スキャニングミラー１４ｅの反射角度の制御により、レーザ光の照射範囲は自在に調整される。レーザ光の照射範囲は、後述する測定範囲制御部２０ｈにより、測定対象物である生体コロニーの位置を通るように、直線状に設定されている。なお、レーザ光のスポット径と生体コロニーの大きさとは、同程度であることが好ましい。例えば、レーザ光のスポット径が１ｍｍ程度とすると、コロニーも１ｍｍ程度に成長したものを測定対象に用いることが好ましい。
【００２７】
図４は、受光ユニット１６の概略の構成を示すブロック図である。
受光ユニット１６は、レンズ系１６ａと、ダイクロイックミラー１６ｂと、バンドパスフィルタ１６ｃ，１６ｄと、光電子増倍管やアバランシェフォトダイオード等の光電変換器１６ｅ，１６ｆと、撮影器１６ｇと、制御器１６ｈと、を有する。
レンズ系１６ａは、受光ユニット１６に入射した蛍光を光電変換器１６ｅ，１６ｆの受光面に集束させるように構成される。
【００２８】
ダイクロイックミラー１６ｂは、アクセプター蛍光色素の蛍光を透過させ、ドナー蛍光色素の蛍光を反射させるように、反射、透過の波長特性が定められて構成されたミラーである。バンドパスフィルタ１６ｃ，１６ｄでフィルタリングして光電変換器１６ｅ，１６ｆは、それぞれドナー蛍光色素の蛍光及びアクセプター蛍光色素の蛍光の所定の波長帯域の蛍光を取り込む。したがって、光電変換器１６ｅは、ドナー蛍光色素の発する蛍光を受光し、光電変換器１６ｆは、アクセプター蛍光色素の発する蛍光を受光する。
【００２９】
バンドパスフィルタ１６ｃ，１６ｄは、各光電変換器１６ｅ，１６ｆの受光面の前面に設けられ、所定の波長帯域の蛍光のみが透過するフィルタである。透過する蛍光の波長帯域は、ドナー蛍光色素の蛍光及びアクセプター蛍光色素の蛍光の波長帯域に対応して設定されており、互いに異なる波長帯域となっている。
【００３０】
光電変換器１６ｅ，１６ｆは、例えば光電子増倍管等のセンサを備え、受光面で受光した光を電気信号に変換するセンサである。ここで、受光する蛍光は強度変調されたレーザ光の照射によって発する位相が遅れた蛍光である。この蛍光は、位相遅れの情報を持った光信号として受光される。このため、出力される電気信号は位相差の信号情報を持った蛍光信号となる。この蛍光信号は、データ処理部・制御部１８に供給され、増幅器で増幅される。
【００３１】
撮影器１６ｇは、測定しようとする培地容器２２中の培地全体を撮影する。撮影した画像は、後述する分析装置２０において、基板上の生体コロニーの位置を特定するために画像処理が施される。撮影した画像上の各位置は、培地容器２２上の各位置と対応付けられている。したがって、生体コロニーの画像上の位置が特定されると、生体コロニーの培地容器２２上の位置を特定することができる。
制御部１６ｈは、撮像器１６ｇの動作を制御する。
【００３２】
図５（ａ），（ｂ）は、データ処理部・制御部１８の概略の構成を示すブロック図である。
データ処理部・制御部１８は、制御部１８ａ（図５（ａ）参照）とデータ処理部１８ｂ（図５（ｂ）参照）とを有する。
制御部１８ａは、システム制御器１９と、発振部１８ｃとを有する。発振部１８ｃは、発振器１８ｄ，１８ｅと、パワースプリッタ１８ｆと、ＳＳＢ(Single Side Band)変調器１８ｇと、アンプ１８ｈと、を有する。
システム制御器１９は、本装置全体の動作指示及び動作タイミングの制御を行う。発振部１８ｃに対しては、システム制御器１９が変調信号の生成を指示する。
【００３３】
発振器１８ｄ，１８ｅは、システム制御器１９の指示に応じた所定の周波数の信号（正弦波信号）を発振する。
発振器１８ｄは周波数ｆの信号（１０〜１００ＭＨｚ）の信号を発振する。出力した周波数ｆの信号は、パワースプリッタ１８ｆに入力される。パワースプリッタ１８ｆは、入力された周波数ｆの信号を分割し、一方の信号をレーザドライバ１４ｄに出力する。分割した周波数ｆの信号は、レーザドライバ１４ｄに出力され、レーザ光の変調信号として用いられる。他方の信号は、増幅器１８ｈで増幅された後、データ処理部１８ｂに出力され、さらに他方の信号は、ＳＳＢ変調器１８ｇに出力される。周波数ｆの信号をデータ処理部１８ｂに出力するのは、データ処理部１８ｂにおいて、蛍光信号の検波のための参照信号として用いるためである。
一方、発振器１８ｅは、周波数Δｆ（１００ｋＨｚ〜２ＭＨｚ）の信号を発振する。周波数の信号Δｆは、ＳＳＢ変調器１８ｇに出力される。ＳＳＢ変調器１８ｇは、入力された周波数ｆの信号と、周波数Δｆの信号に基づいて、周波数（ｆ＋Δｆ）の信号を生成する。生成した周波数（ｆ＋Δｆ）の信号は、レーザドライバ１４ｃに出力され、レーザ光の変調信号として用いられる。
【００３４】
データ処理部１８ｂは、光電変換器１６ｅ，１６ｆから出力される蛍光信号を用いて、レーザ光の照射により測定対象物が発する蛍光の位相遅れに関する情報(位相差)を抽出する。データ処理部１８ｂは、アンプ１８ｉ，１８ｊと、パワースプリッタ１８ｋと、ＩＱミキサ１８ｌ，１８ｍと、ローパスフィルタ１８ｎと、増幅器１８ｏと、ＡＤ変換器１８ｐと、を有する。アンプ１８ｉ，１８ｊは、光電変換器１６ｅ，１６ｆから出力される蛍光信号を増幅する。パワースプリッタ１８ｋは、蛍光信号のそれぞれに対して、発振部１８ｃから供給された周波数fの信号である変調信号を分配する。ＩＱミキサ１８ｍ，１８ｌは、増幅された蛍光信号を上記変調信号とミキシングする。
【００３５】
ＩＱミキサ１８ｌ、１８ｍは、ドナー蛍光色素が発する蛍光の蛍光信号及びアクセプター蛍光色素が発する蛍光の蛍光信号を、発振部１８ｃから供給される信号を参照信号としてミキシングするために、光電変換器１６ｅ，１６ｆ別に設けられている。変調信号を参照信号として同期してミキシングすることで、後述するように、蛍光の位相遅れを求めることができる。具体的には、ＩＱミキサ１６ｅ，１６ｆのそれぞれは、参照信号を蛍光信号(ＲＦ信号)と乗算して、蛍光信号のcos成分(実数部)と高周波成分を含む処理信号を算出するとともに、参照信号の位相を９０度シフトさせた信号を蛍光信号と乗算して、蛍光信号のsin成分(虚数部)と高周波成分を含む処理信号を算出する。処理信号は、ドナー蛍光色素が発した蛍光の信号及びアクセプター蛍光色素が発した２つの蛍光の信号である。このcos成分を含む処理信号及びsin成分を含む処理信号は、ローパスフィルタ１８ｎに出力される。
【００３６】
ローパスフィルタ１８ｎは、入力したcos成分、sin成分に高周波成分が加算された処理信号から高周波成分を取り除く。アンプ１８ｏは、高周波成分の取り除かれたcos成分、sin成分の処理信号を増幅する。ＡＤ変換器１８ｐは、増幅された処理信号をサンプリングする。ＡＤ変換器１８ｐでは、高周波成分の取り除かれたcos成分、sin成分の処理信号がサンプリングされて、分析装置２０に出力される。サンプリングは、上述の周波数Δfの整数倍(好ましくは3倍以上の整数倍)の周波数をサンプリング周波数とする。ローパスフィルタ１８ｎは、ＡＤ変換器１８ｐによるデジタル化のときのアンチエリアジングのために、かつ周波数Δfの信号成分を通過させるために、周波数特性が定められる。
【００３７】
分析装置２０は、ＡＤ変換器１８ｐでデジタル化された蛍光信号（cos成分、sin成分）を用いて、蛍光強度と蛍光の発光過程における位相遅れを蛍光の特徴量として算出し、この特徴量に基づいて、ＦＲＥＴが発生しているか否かを判定する。これにより、分析装置２０は、ＦＲＥＴが発生しているとき、測定対象物（複数の生体コロニー）に目的対象物（選別すべき生体コロニー）が含まれていると判定する。さらに、この判定結果に応じて、レーザ光の照射範囲を変更する、例えば、照射範囲を狭くする。こうして、分析装置２０は、レーザ光の照射範囲を狭くすることにより、目的対象物の位置を特定することができる。もし、レーザ光の照射範囲内で、ＦＲＥＴが発生していないと判定した場合、分析装置２０は、レーザ光の照射範囲を、別の範囲に移動するように、レーザ光照射ユニット１４を制御する。
【００３８】
分析装置は、ＣＰＵ２０ａと、メモリ２０ｂと、データベース２０ｃと、を有するコンピュータで構成される。分析装置２０は、メモリ２０ｂに記憶されているプログラムを起動することにより、モジュールが立ち上がる。
モジュールは、周波数分析部２０ｄと、位相遅れ算出部２０ｅと、蛍光強度算出部２０ｆと、ＦＲＥＴ判定部２０ｇと、画像処理部２０ｉと、測定範囲制御部２０ｈと、を含む。
データベース２０ｃは、例えば、撮像器１６ｇで撮像した画像上の測定対象物の位置情報や、特定した目的対象物の位置情報を記憶する。
【００３９】
周波数分析部２０ｄは、データ処理部１８ｂから供給された蛍光信号について周波数分析を行い、周波数０の信号成分の値と、周波数Δｆの信号成分の値を算出する。周波数０の信号成分の値および周波数Δｆの信号成分の値として、例えば周波数０，Δｆに対して所定の範囲のパワースペクトル値が用いられてもよい。レーザ光照射ユニット１４は、スキャニングミラー１４ｅの反射角度の制御によってレーザ光を定められている照射範囲でスキャンするが、このレーザ光のスキャンによって収集される蛍光信号のｃｏｓ成分およびｓｉｎ成分の時系列信号が周波数分析部２０ｄに入力される。したがって、周波数分析部２０ｄは、このｃｏｓ成分およびｓｉｎ成分の時系列信号に対して、例えばＦＦＴ（Fast Fourier Trandformation）処理を行う。
蛍光信号は、ｃｏｓ成分の信号とｓｉｎ成分の信号を有するので、算出される値は、ｃｏｓ成分の周波数０の成分の値および周波数Δｆの成分の値と、ｓｉｎ成分の周波数０の成分の値および周波数Δｆの成分の値とを含む。しかも、ｃｏｓ成分の信号とｓｉｎ成分の信号は、光電変換器１６ｆから出力されたアクセプター蛍光色素が発する蛍光の信号に由来するものと、光電変換器１６ｅから出力されたドナー蛍光色素が発する蛍光の信号に由来するものがある。
アクセプター蛍光色素が発する蛍光の信号に由来する周波数０におけるｃｏｓ成分およびｓｉｎ成分は、アクセプター蛍光色素がレーザ光で励起されて発するアクセプター蛍光の信号成分である。アクセプター蛍光色素が発する蛍光の信号に由来する周波数Δｆにおけるｃｏｓ成分およびｓｉｎ成分は、ＦＲＥＴによりアクセプター蛍光色素が発するＦＲＥＴ蛍光の信号成分である。
同様に、ドナー蛍光色素が発する蛍光の、周波数Δｆにおけるｃｏｓ成分およびｓｉｎ成分は、ドナー蛍光色素がレーザ光で励起されて発するドナー蛍光の信号成分である。
これらの算出された値は、位相遅れ算出部２０ｅおよび蛍光強度算出部２０ｆに提供される。
【００４０】
位相遅れ算出部２０ｅは、周波数０，Δｆにおけるｃｏｓ成分およびｓｉｎ成分の値を用いて、（ｓｉｎ成分の値）／（ｃｏｓ成分の値）を算出することにより、位相遅れｔａｎθを周波数０，Δｆについて算出する。
例えば、アクセプター蛍光色素が発する蛍光の信号に由来する周波数０における位相遅れｔａｎθ０は、レーザ光の照射を受けたアクセプター蛍光色素が発する蛍光の発光過程（一次緩和過程）に起因する遅れを表す。アクセプター蛍光色素が発する蛍光の信号に由来する周波数Δｆにおける位相遅れｔａｎθΔｆは、ＦＲＥＴ蛍光の発光過程（一次緩和過程）に起因する遅れを表す。算出された周波数０，Δｆにおける位相遅れｔａｎθ０，ｔａｎθΔｆは、ＦＲＥＴ判定部２０ｇに提供される。このような位相遅れｔａｎθ０，ｔａｎθΔｆと蛍光の発光過程については、ＷＯ２００９／０２８０６３公報に記載されている。
蛍光強度算出部２０ｆは、周波数０，Δｆにおけるｃｏｓ成分およびｓｉｎ成分の値の二乗加算和の平方根を算出することにより、蛍光強度Ｐ０，ＰΔｆを算出する。算出された周波数０，Δｆにおける蛍光強度Ｐ０，ＰΔｆは、ＦＲＥＴ判定部２０ｇに提供される。
【００４１】
ＦＲＥＴ判定部２０ｇは、算出された周波数０，Δｆにおける蛍光強度Ｐ０，ＰΔｆと、周波数０，Δｆにおける位相遅れｔａｎθ０，ｔａｎθΔｆを用いて、ＦＲＥＴの発生の有無を調べることにより、測定対象物群内に、目的対象物が含まれているか否かを判定する。
図７（ａ），（ｂ）は、ＦＲＥＴ判定部２０ｇがＦＲＥＴの発生の有無の判定方法の一例を説明する図である。この例では、アクセプター蛍光とＦＲＥＴ蛍光の蛍光強度と位相遅れを用いる。なお、アクセプター蛍光とは、レーザ光によってアクセプター蛍光色素が直接励起されることにより発する蛍光をいう。ＦＲＥＴ蛍光とは、レーザ光の照射を受けて励起したドナー蛍光色素の励起エネルギーがＦＲＥＴによりアクセプター蛍光色素に移動し、この励起エネルギーによってアクセプター蛍光色素が発する蛍光をいう。
図７（ａ）に示すように、周波数０におけるアクセプター蛍光の蛍光強度Ｐ０の値のα倍（０＜α＜１）を閾値として、周波数ΔｆにおけるＦＲＥＴ蛍光の蛍光強度ＰΔｆの値がこの閾値以下の場合、ＦＲＥＴ判定部２０ｇは、ＦＲＥＴは発生していないと判定する。一方、周波数ΔｆにおけるＦＲＥＴ蛍光の蛍光強度ＰΔｆの値がこの閾値を越える場合であっても、周波数０におけるアクセプター蛍光の位相遅れｔａｎθ０の値のβ倍（１＜β）を閾値として、周波数Δｆにおける位相遅れｔａｎθΔｆの値がこの閾値以下である場合、ＦＲＥＴ判定部２０ｇは、ＦＲＥＴは発生していないと判定する。ＦＲＥＴ蛍光の蛍光強度ＰΔｆが閾値α・Ｐ0を越え、ＦＲＥＴ蛍光の位相遅れｔａｎθΔｆが閾値β・ｔａｎθ０を越える場合、ＦＲＥＴ判定部２０ｇは、ＦＲＥＴの発生は発生している、と判定する。ＦＲＥＴ判定部２０ｇは、ＦＲＥＴの発生の有無により、レーザ光の照射範囲内に目的対象物が存在したか否かを判定する。
この他の判定方法として、アクセプター蛍光の蛍光強度Ｐ０および位相遅れｔａｎθ０の代わりに、ドナー蛍光色素が発する蛍光における蛍光強度Ｐ０および位相遅れｔａｎθ０を用いることもできる。判定結果の情報は、測定範囲制御部２０ｈに提供される。
【００４２】
このようにＦＲＥＴ判定部２０ｇがＦＲＥＴ蛍光の蛍光強度ＰΔｆを調べるのは、位相遅れｔａｎθΔｆが閾値β・ｔａｎθ０を越える場合であっても、ＦＲＥＴが発生していない場合があるからである。位相遅れｔａｎθΔｆは、（ｓｉｎ成分の値）／（ｃｏｓ成分の値）で算出されるので、ＦＲＥＴが発生せず、蛍光強度ＰΔｆが極めて小さくても、位相遅れｔａｎθΔｆがノイズ成分の影響を受けて閾値β・ｔａｎθ０を越える場合があるからである。このため、ＦＲＥＴ判定部２０ｇは、蛍光強度ＰΔｆが閾値を越えるときのみ、位相遅れｔａｎθΔｆが閾値β・ｔａｎθ０を越えるか否かを調べる。
なお、培地容器２２内では、生体コロニーを形成するが、このような生体コロニーのサイズは生体コロニー間でばらばらであるため、従来のように、蛍光強度を用いるだけでは、精度の高い判定はできない。本実施形態のように、生体コロニーのサイズに影響を受けない位相遅れを用いることにより、精度の高い判定が達成できる。
判定に用いられた、位相遅れｔａｎθ０，ｔａｎθΔｆ及び蛍光強度Ｐ０，ＰΔｆは図示されないディスプレイあるいはプリンタ等の出力装置に出力される。
【００４３】
測定範囲制御部２０ｈは、後述する画像処理部２０ｉから提供される、培地上の測定対象物である生体コロニーの位置情報に基づいて、レーザ光の照射範囲を自動的に定めて、レーザ光照射ユニット１４を制御する。さらに、測定範囲制御部２０ｈは、ＦＲＥＴ判定部２０ｇから提供される判定結果の情報に応じて、レーザ光の照射範囲を変更する。レーザ光の照射範囲の変更とは、定められているレーザ光の照射範囲を狭くすること、及び、定められているレーザ光の照射範囲を他の照射範囲に移すこと、を含む。例えば、ＦＲＥＴ判定部２０ｇの判定により、ＦＲＥＴの発生がなく、レーザ光の照射範囲に目的対象物が存在しない場合、測定範囲制御部２０ｈは、レーザ光の照射範囲を他の照射範囲に移す。一方、ＦＲＥＴ判定部２０ｇの判定により、ＦＲＥＴの発生が認められ、レーザ光の照射範囲に目的対象物が存在する場合、測定範囲制御部２０ｈは、レーザ光の照射範囲を狭くする。この場合、レーザ光の照射範囲を徐々に狭くして、レーザ光による蛍光の検査を繰り返すことにより、測定範囲制御部２０ｈは、ＦＲＥＴが発生する目的対象物の位置を特定することができる。
なお、測定範囲制御部２０ｈは、画像処理部２０ｉで定まる画像上の位置と、ステージ２４上の位置とを関連付けた参照テーブルを有する。測定範囲制御部２０ｈは、この参照テーブルを用いて、画像上の測定対象物の位置からステージ２４上の位置を求め、レーザ光の照射範囲を定める。
測定範囲制御部２０ｈは、レーザ光の照射範囲の情報をレーザ光照射ユニット１４に提供し、システム制御器１９に蛍光検出を行うように指示をする。さらに、測定範囲制御部２０ｈは、目的対象物を見出して位置が特定されたとき、後述するマニピュレータ３０に、特定された位置の情報を提供する。
【００４４】
画像処理部２０ｉは、撮像器１６ｇ（図４参照）にて撮影された培地上の測定対象物の画像のコントラスト処理、明度処理、二値化処理等を行って、測定対象物である生体コロニーの位置を特定する。生体コロニーの位置は、画像上の位置座標により特定される。コロニーの位置座標は、コロニーの位置情報として、データベース２０ｃに記憶されるとともに、測定範囲制御部２０ｈに提供される。
【００４５】
マニピュレータ３０は、図８に示すように、測定範囲制御部２０ｈによってステージ２４上の特定された位置にある目的対象物を培地内から抜き取り、目的サンプル容器３２に集める。目的対象物の抜き取りは、マニピュレータ３０の先端に設けられた管により吸引により行われる。このとき、測定範囲制御部２０ｈは、移動機構２６によりステージ２４をｘ方向、ｙ方向に移動させて、効率よく目的対象物を抜き取ってもよい。
以上が、蛍光検査装置１０の構成である。
【００４６】
このような蛍光検査装置１０は、以下の蛍光検査方法を行う。
まず、測定範囲制御部２０ｈは、測定対象物が分散する培地容器２２の基板に対してレーザ光の照射範囲を設定する。具体的には、測定範囲制御部２０は、予め撮像器１６ｇにより得られる測定対象物の画像から分散する測定対象物の位置を特定することにより、この測定対象物を照射するように、レーザ光の照射範囲を設定する。
レーザ光照射ユニット１４は、定められた照射範囲でレーザ光を照射する。例えば、スキャニングミラー１４ｅの反射角度を制御することにより、図３（ａ）に示すように、レーザ光が一定の範囲をスキャンしながら直線状に照射する。このとき、レーザ光は、所定の周波数ｆと周波数Δｆで強度変調された２つのレーザ光Ｌ1，Ｌ2が重なったビームである。
【００４７】
次に、受光ユニット１６は、レーザ光の照射を受けた測定対象物のそれぞれが発する蛍光を受光して、蛍光信号を出力する。
この後、データ処理部１８ｂは、蛍光信号の信号処理を行う。さらに、分析装置２０は、蛍光の特徴量である位相遅れｔａｎθ０，ｔａｎθΔｆ及び蛍光強度Ｐ０，ＰΔｆを算出することにより、測定対象物が目的対象物を含むか否かの判定をする。この判定は、図７（ａ），（ｂ）に示す方法によってＦＲＥＴが発生しているか否かを調べることにより行われる。
【００４８】
さらに、分析装置２０は、上記判定の結果に応じて、レーザ光が照射する照射範囲を狭くする。蛍光検出装置１０は、レーザ光照射ユニット１４によるレーザ光の照射、受光ユニット１６による蛍光の受光、およびデータ処理部１８ｂにおける信号処理、分析装置２０における判定、を繰り返す。
こうして、分析装置２０は、レーザ光の照射範囲を徐々に狭くすることにより、目的対象物の位置を特定する。
この後、分析装置２０で特定された位置にある目的対象物を抜き取り、目的サンプル容器３２に集める。
【００４９】
以上のように、本実施形態は、レーザ光を受光した測定対象物が発する蛍光の蛍光信号の信号処理を行い、蛍光の特徴量を算出することにより、測定対象物が目的対象物を含むか否かを判定する。本実施形態は、この判定結果に応じて、レーザ光の照射範囲を変更する、このため、レーザ光を照射した測定対象物内に目的対象物が含まれない場合、本実施形態は、すぐに測定対象物の別の範囲を検査することができるので、効率よく目的対象物を見出すことができる。また、本実施形態は、測定対象物内に目的対象物が含まれる場合、レーザ光の照射範囲を狭くすることができるので、効率よく目的対象物の位置を特定することができる。特に、ＦＲＥＴを利用して、精度の高く目的対象物を見出すことができる。
従来は、蛍光強度に基づいて目的対象物を判別するが、目的対象物の大きさに応じて蛍光強度を規格化する必要があり、目的対象物の判別が容易でなかったが、本実施形態のようにＦＲＥＴを用いることにより、迅速に目的対象物の有無を判定することができる。
このような実施形態は、生体コロニーを形成した微生物群等の複数の測定対象物であっても、従来のフローサイトメータのように単離する必要がなく、コロニー単位で目的対象物を見出すことができる。また、本実施形態は、生体コロニーを単離する必要がないので、生体が損傷を受ける可能性が極めて少ない。
また、本実施形態では、ＦＲＥＴを用いるので、ＦＲＥＴの発生する目的対象物の割合が少なくても、ＦＲＥＴの発生を効率よく見つけ出すことができる。
【００５０】
本実施形態では、目的対象物の存在の判定を行うために、２つの蛍光色素を用いたＦＲＥＴを利用するが、このＦＲＥＴを利用した判定方法として、ＷＯ２００９／０２８０６２公報に記載される、１つのレーザ光源を用いて行うＦＲＥＴ検出方法を用いることもできる。
なお、本実施形態では、目的対象物の存在の判定を行うために、２つの蛍光色素を用いたＦＲＥＴを利用するが、必ずしもＦＲＥＴを利用しなくてもよい。例えば、選別対象とする生体のみが取り込みやすい物質あるいは取り込みにくい物質に付着した蛍光色素をラベルとして用いて、蛍光検査を行うこともできる。この場合、レーザ光を出射するレーザ光源は、２つではなく、１つのみが用いられてもよい。
また、本実施形態では、ドナー蛍光色素が発する蛍光を受光する光電変換器１６ｅと、アクセプター蛍光色素が発する蛍光を受光する光電変換器１６ｆが用いられる。しかし、ドナー蛍光色素の発する蛍光の蛍光強度及び蛍光緩和時間が、ＦＲＥＴの判定に用いられない場合、ドナー蛍光色素が発する蛍光を受光する光電変換器１６ｅを用いず、アクセプター蛍光色素が発する蛍光を受光する光電変換器１６ｆのみが用いられてもよい。
本実施形態は、蛍光の位相遅れとしてｔａｎθを用いるが、ｔａｎθの代わりに角度であるθを用いてもよい。
【００５１】
以上、本発明の蛍光検査装置および蛍光検査方法について詳細に説明したが、本発明は上記実施形態に限定されず、本発明の主旨を逸脱しない範囲において、種々の改良や変更をしてもよいのはもちろんである。
【符号の説明】
【００５２】
１０ 蛍光検査装置
１２ 移動台
１４レーザ光照射ユニット
１４ａ，１４ｂ レーザ光源
１４ｃ，１４ｄ レーザドライバ
１４ｅ スキャニングミラー
１４ｆ 駆動部
１４ｇ 駆動制御部
１４ｈ ダイクロイックミラー
１６ 受光ユニット
１６ａ レンズ系
１６ｂ ダイクロイックミラー
１６ｃ，１６ｄ バンドパスフィルタ
１６ｅ，１６ｆ 光電変換器
１６ｇ 撮影器
１６ｈ 制御器
１８ データ処理部・制御部
１８ａ 制御部
１８ｂ データ処理部
１８ｃ 発振部
１８ｄ，１８ｅ 発振器
１８ｆ パワースプリッタ
１８ｇ ＳＳＢ変調器
１８ｈ アンプ
１８ｉ，１８ｊ アンプ
１８ｋ パワースプリッタ
１８ｌ，１８ｍ ＩＱミキサ
１８ｎ ローパスフィルタ
１８ｏ増幅器
１８ｐ ＡＤ変換器
１９ システム制御器
２０ 分析装置
２０ａ ＣＰＵ
２０ｂ メモリ
２０ｃ データベース
２０ｄ 周波数分析部
２０ｅ 位相遅れ算出部
２０ｆ 蛍光強度算出部
２０ｇ ＦＲＥＴ判定部
２０ｈ 測定範囲制御部
２０ｉ 画像処理部
２２ 培地容器
２４ ステージ
２６ 移動機構
３０ マニピュレータ
３２ 目的サンプル容器
【特許請求の範囲】
【請求項１】
複数の測定対象物のそれぞれがレーザ光の照射を受けて発する蛍光を受光することにより、蛍光検査を行う蛍光検査装置であって、
基板上に分散する測定対象物に対してレーザ光の照射範囲を定めてレーザ光を照射するレーザ光照射部と、
前記レーザ光を受光した測定対象物のそれぞれが発する蛍光を受光して、蛍光信号を出力する受光部と、
前記蛍光信号の信号処理を行い、蛍光の特徴量を算出することにより、前記測定対象物が目的対象物を含むか否かを判定する処理部と、
前記処理部の判定結果に応じて、前記レーザ光の照射範囲を変更する制御部と、を有することを特徴とする蛍光検査装置。
【請求項２】
前記処理部が、前記測定対象物が目的対象物を含むと判定した場合、
前記制御部は、前記レーザ光の前記照射範囲を狭くして、前記レーザ光を前記測定対象物の一部に照射するように制御する、請求項１に記載の蛍光検査装置。
【請求項３】
前記制御部は、前記レーザ光の照射位置の前記照射範囲を狭くすることにより、前記目的対象物の位置を特定する、請求項２に記載の蛍光検査装置。
【請求項４】
さらに、特定された位置にある前記目的対象物を前記測定対象物から抜き取る抜き取り部を有する、請求項３に記載の蛍光検査装置。
【請求項５】
前記測定対象物に照射される前記レーザ光は、所定の周波数の変調信号で強度変調され、
前記処理部は、蛍光信号の、前記変調信号に対する位相遅れを、前記特徴量として算出する、請求項１〜４のいずれか１項に記載の蛍光検査装置。
【請求項６】
前記目的対象物は、第１の物質と第２の物質とが結合した構成物を含み、
前記第１の物質には、第１の蛍光物質が設けられ、
前記第２の物質には、第２の蛍光物質が設けられ、
前記受光部は、前記レーザ光の照射により前記第２の蛍光物質が発する第１の蛍光と、前記レーザ光の照射により受けた前記第１の蛍光物質の励起エネルギーが第２の蛍光物質に移動することにより、前記第２の蛍光物質が発する第２の蛍光と、を受け、
前記処理部は、前記第１の蛍光および前記第２の蛍光の信号のそれぞれを、前記蛍光信号として処理する、請求項５に記載の蛍光検査装置。
【請求項７】
前記処理部は、前記第１の蛍光の発光過程に起因して生じる位相遅れと前記第２の蛍光の発光過程に起因して生じる位相遅れとの間の比率に基づいて、前記測定対象物が目的対象物を含むか否かを判定する、請求項６に記載の蛍光検査装置。
【請求項８】
前記測定対象物は、前記基板上の培地において複数の生体が互いに集まった生体コロニーである、請求項１〜７のいずれか１項に記載の蛍光検査装置。
【請求項９】
複数の測定対象物のそれぞれがレーザ光の照射を受けて発する蛍光を受光することにより、測定対象物の蛍光検査を行う蛍光検査方法であって、
基板上に分散する測定対象物に対してレーザ光の照射範囲を定めてレーザ光を照射する第１ステップと、
前記レーザ光を受光した測定対象物のそれぞれが発する蛍光を受光して、蛍光信号を出力する第２ステップと、
前記蛍光信号の信号処理を行い、蛍光の特徴量を算出することにより、前記測定対象物が目的対象物を含むか否かの判定をする第３ステップと、
前記判定の結果に応じて、前記レーザ光が照射する、前記基板上の照射範囲を狭くして、前記第１ステップ、前記第２ステップおよび前記第３ステップを繰り返す、第４ステップと、
前記第４ステップを行うことにより、目的対象物の前記基板上における位置を特定する第５ステップと、を有する蛍光検査方法。
【請求項１０】
さらに、特定された位置にある前記目的対象物を前記測定対象物から抜き取る第６ステップを有する、請求項９に記載の蛍光検査方法。
【請求項１１】
前記測定対象物は、前記基板上の培地において複数の生体が互いに集まった生体コロニーである、請求項９または１０に記載の蛍光検査方法。
【請求項１】
複数の測定対象物のそれぞれがレーザ光の照射を受けて発する蛍光を受光することにより、蛍光検査を行う蛍光検査装置であって、
基板上に分散する測定対象物に対してレーザ光の照射範囲を定めてレーザ光を照射するレーザ光照射部と、
前記レーザ光を受光した測定対象物のそれぞれが発する蛍光を受光して、蛍光信号を出力する受光部と、
前記蛍光信号の信号処理を行い、蛍光の特徴量を算出することにより、前記測定対象物が目的対象物を含むか否かを判定する処理部と、
前記処理部の判定結果に応じて、前記レーザ光の照射範囲を変更する制御部と、を有することを特徴とする蛍光検査装置。
【請求項２】
前記処理部が、前記測定対象物が目的対象物を含むと判定した場合、
前記制御部は、前記レーザ光の前記照射範囲を狭くして、前記レーザ光を前記測定対象物の一部に照射するように制御する、請求項１に記載の蛍光検査装置。
【請求項３】
前記制御部は、前記レーザ光の照射位置の前記照射範囲を狭くすることにより、前記目的対象物の位置を特定する、請求項２に記載の蛍光検査装置。
【請求項４】
さらに、特定された位置にある前記目的対象物を前記測定対象物から抜き取る抜き取り部を有する、請求項３に記載の蛍光検査装置。
【請求項５】
前記測定対象物に照射される前記レーザ光は、所定の周波数の変調信号で強度変調され、
前記処理部は、蛍光信号の、前記変調信号に対する位相遅れを、前記特徴量として算出する、請求項１〜４のいずれか１項に記載の蛍光検査装置。
【請求項６】
前記目的対象物は、第１の物質と第２の物質とが結合した構成物を含み、
前記第１の物質には、第１の蛍光物質が設けられ、
前記第２の物質には、第２の蛍光物質が設けられ、
前記受光部は、前記レーザ光の照射により前記第２の蛍光物質が発する第１の蛍光と、前記レーザ光の照射により受けた前記第１の蛍光物質の励起エネルギーが第２の蛍光物質に移動することにより、前記第２の蛍光物質が発する第２の蛍光と、を受け、
前記処理部は、前記第１の蛍光および前記第２の蛍光の信号のそれぞれを、前記蛍光信号として処理する、請求項５に記載の蛍光検査装置。
【請求項７】
前記処理部は、前記第１の蛍光の発光過程に起因して生じる位相遅れと前記第２の蛍光の発光過程に起因して生じる位相遅れとの間の比率に基づいて、前記測定対象物が目的対象物を含むか否かを判定する、請求項６に記載の蛍光検査装置。
【請求項８】
前記測定対象物は、前記基板上の培地において複数の生体が互いに集まった生体コロニーである、請求項１〜７のいずれか１項に記載の蛍光検査装置。
【請求項９】
複数の測定対象物のそれぞれがレーザ光の照射を受けて発する蛍光を受光することにより、測定対象物の蛍光検査を行う蛍光検査方法であって、
基板上に分散する測定対象物に対してレーザ光の照射範囲を定めてレーザ光を照射する第１ステップと、
前記レーザ光を受光した測定対象物のそれぞれが発する蛍光を受光して、蛍光信号を出力する第２ステップと、
前記蛍光信号の信号処理を行い、蛍光の特徴量を算出することにより、前記測定対象物が目的対象物を含むか否かの判定をする第３ステップと、
前記判定の結果に応じて、前記レーザ光が照射する、前記基板上の照射範囲を狭くして、前記第１ステップ、前記第２ステップおよび前記第３ステップを繰り返す、第４ステップと、
前記第４ステップを行うことにより、目的対象物の前記基板上における位置を特定する第５ステップと、を有する蛍光検査方法。
【請求項１０】
さらに、特定された位置にある前記目的対象物を前記測定対象物から抜き取る第６ステップを有する、請求項９に記載の蛍光検査方法。
【請求項１１】
前記測定対象物は、前記基板上の培地において複数の生体が互いに集まった生体コロニーである、請求項９または１０に記載の蛍光検査方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【公開番号】特開２０１１−１７４７９１（Ｐ２０１１−１７４７９１Ａ）
【公開日】平成２３年９月８日（２０１１．９．８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−３８５２８（Ｐ２０１０−３８５２８）
【出願日】平成２２年２月２４日（２０１０．２．２４）
【出願人】（０００００５９０２）三井造船株式会社 (1,723)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２３年９月８日（２０１１．９．８）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年２月２４日（２０１０．２．２４）
【出願人】（０００００５９０２）三井造船株式会社 (1,723)
【Ｆターム（参考）】
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