蛍光組織マーカー及びその製造方法
【課題】臓器外側からでも位置の認識が可能であり、長時間局所的に留まることが可能な蛍光組織マーカー及びその製造方法を提供すること。
【解決手段】まず、リン脂質と近赤外蛍光色素が複合して形成されたベシクルを親水性溶媒に内包させ、乳化剤により複数のカプセルを形成、凝集させたベシクルクラスターを有する蛍光組織マーカーとする。または、第一の親水性溶媒に近赤外蛍光色素とリン脂質を加えて攪拌し、疎水性溶媒に、前記第一の親水性溶媒と乳化剤を加えて懸濁液を形成し、前記懸濁液と第二の親水性溶媒とを用いて遠心分離する、蛍光組織マーカーの製造方法とする。
【解決手段】まず、リン脂質と近赤外蛍光色素が複合して形成されたベシクルを親水性溶媒に内包させ、乳化剤により複数のカプセルを形成、凝集させたベシクルクラスターを有する蛍光組織マーカーとする。または、第一の親水性溶媒に近赤外蛍光色素とリン脂質を加えて攪拌し、疎水性溶媒に、前記第一の親水性溶媒と乳化剤を加えて懸濁液を形成し、前記懸濁液と第二の親水性溶媒とを用いて遠心分離する、蛍光組織マーカーの製造方法とする。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、蛍光組織マーカー及びその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、内視鏡を用いた手術が発展し、診断・治療の手法として多く利用されるようになってきている。上記手術において、組織マーカーは極めて有用である。組織マーカーとは、診断・治療するために必要な部位にマーキングを施すものであり、マーキングを施すことで診断・治療するための部位を簡便に特定することができるようになる。
【０００３】
公知の組織マーカーに関する技術としては、例えば、インドシアニングリーンに関する技術が、例えば下記非特許文献１乃至６、特許文献１及び２（以下これらを「文献」という。）に記載されている。下記文献には、インドシアニングリーンとゼラチンとを混合して作製した組織マーカーを用い、内視鏡カメラによって可視領域の吸収を観察したことが開示されている。
【０００４】
【非特許文献１】草野満夫 編著，ＩＣＧ 蛍光Ｎａｖｉｇａｔｉｏｎ Ｓｕｒｇｅｒｙのすべて，インターメディカ，２００８．
【非特許文献２】Ｓ．Ｙｏｎｅｙａ ｅｔ ａｌ，Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｖｅ Ｏｐｈｔａｌｍｏｌｇｙ ａｎｄ Ｖｉｓｕａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ １９９８；３９：１２８６−１２９０．
【非特許文献３】Ｓ．Ｉｔｏ ｅｔ ａｌ，Ｅｎｄｏｓｃｏｐｙ ２００１；３３：８４９−８５３
【非特許文献４】Ｒ．Ａｓｈｉｄａ ｅｔ ａｌ，Ｅｎｄｏｓｃｏｐｙ ２００６；３８：１９０−１９２．
【非特許文献５】Ｓ．Ｔａｏｋａ ｅｔ ａｌ，Ｄｉｇｅｓｔｉｖｅ Ｅｎｄｏｓｃｏｐｙ １９９９；１１：３２１−３２６．
【非特許文献６】Ｊ．Ｖ．Ｆｒａｎｇｉｏｎｉ，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎＣｈｅｍｉｃａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２００３；７：６２６−６３４．
【特許文献１】特開２００７−２６２０６２号公報
【特許文献２】特開２００８−６９１０７号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、上記文献に記載の技術は、内視鏡のみで対応できる手術には非常に有用であるものの、実際に開腹し、腫瘍等を含む組織を切除する手術にまで応用することは容易でない。具体的に説明すると、上記文献に記載の技術では、内視鏡により臓器内側の組織及び当該組織にマーキングされたマーカーを直接観察することができるものの、可視領域の光を殆ど通さない臓器の外側からマーキングした位置を確認し、必要な部分のみを切除しようとする場合等に困難性がある。また、ＩＣＧを単にゼラチンと混合して使用しただけでは、体内組織内における血管を通じて早期に拡散してしまい、マーキングした位置の特定が困難になってしまう。
【０００６】
これら課題は、マーカーとしての機能において改善の余地があることを意味する。すなわち、生体透過率が高い近赤外領域の蛍光が弱く可視光の吸収に大きく依存したマーカーでは、臓器内側からマーキングしたとしても外側から発見することが困難であり、また、マーカーがすぐに拡散してしまうと、マーキング箇所が拡散して広くなる結果、体内組織を必要以上切除しなければならず、患者に対する負担が大きくなってしまう。
【０００７】
そこで、本発明は、上記課題を鑑み、臓器外側からでも位置の認識が可能であり、長時間局所的に留まることが可能な蛍光組織マーカー及びその製造方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上記課題について、発明者らが鋭意検討を行ったところ、リン脂質と近赤外蛍光色素が複合されたベシクルを形成し、更に、このベシクルを親水性溶媒に分散させ、乳化剤のカプセルに内包し、かつ、これらカプセルを複数凝集化させることで従来よりも近赤外領域で強く蛍光を発する蛍光組織マーカーとして活用できることを発見し、本発明を完成させるに至った。
【０００９】
すなわち、本発明の一観点に係る蛍光組織マーカーは、リン脂質と近赤外蛍光色素が複合して形成されたベシクルを親水性溶媒に内包させ、乳化剤により複数のカプセルを形成、凝集させたベシクルクラスターを有する。
【００１０】
また、本発明の他の一観点に係る蛍光組織マーカーの製造方法は、第一の親水性溶媒に近赤外蛍光色素とリン脂質を加えて攪拌し、疎水性溶媒に、第一の親水性溶媒と乳化剤を加えて懸濁液を形成し、懸濁液と第二の親水性溶媒とを用いて遠心分離する。
【発明の効果】
【００１１】
以上、本発明により、臓器外側からでも位置の認識が可能であり、長時間局所的に留まることが可能な蛍光組織マーカー及びその製造方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】実施形態に係るベシクルクラスターのイメージ図である。
【図２】実施形態に係るベシクルのイメージ図である。
【図３】実施形態に係るベシクルクラスターの製造方法の工程の概略を示す図である。
【図４】実施形態に係る、懸濁液と第二の親水性溶媒とを用いて遠心分離する工程のイメージを示す図である。
【図５】実施例に係るベクシルクラスターの微分干渉顕微鏡像を示す図である。
【図６】実施例に係るベクシルクラスターを膜染色剤で染めた蛍光顕微鏡像を示す図である。
【図７】実施例に係るベクシルクラスターの微分干渉顕微鏡像を示す図である。
【図８】実施例に係るベクシルクラスターを膜染色剤で染めた蛍光顕微鏡像を示す図である。
【図９】実施例に係る蛍光観察の結果を示す図である。
【図１０】実施例に係る蛍光観察の一例における蛍光強度のプロファイルを示す図である。
【図１１】実施例に係るベクシルクラスター分散液の蛍光強度の卵黄レシチン濃度依存性を示す図である。
【図１２】図１１における蛍光強度のプロファイルを示す図である。
【図１３】実施例に係るベクシルクラスター分散液の粘度測定の結果（２５℃）を示す図である。
【図１４】実施例に係るベクシルクラスター分散液の粘度測定の結果（３７℃）を示す図である。
【図１５】実施例に係るベクシルクラスターのブタの胃における蛍光観察の結果（ゼラチン無し）を示す図である。
【図１６】実施例に係るベクシルクラスターのブタの胃における蛍光観察の結果を示す図（ゼラチン有り）である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
以下、本発明を実施するための形態について図面を用いて詳細に説明する。ただし、本発明は多くの異なる形態による実施が可能であり、以下に示す実施形態、実施例における例示に限定されるものでないことはいうまでもない。
【００１４】
（蛍光組織マーカー）
本実施形態に係る蛍光組織マーカーは、リン脂質と近赤外蛍光色素が複合して形成されたベシクルを親水性溶媒に内包させ、乳化剤により複数のカプセルを形成、凝集させたベシクルクラスター（以下「クラスター」という。）を有する。図１は、本実施形態に係る蛍光組織マーカーにおけるクラスター１のイメージ図であり、図２は、クラスター１に含まれるベクシル２のイメージ図である。
【００１５】
まず図２で示すように、本実施形態に係るベシクル２は、リン脂質２１と、近赤外蛍光色素２２と、を有して形成されている。ここでベシクルとは、リン脂質が分子間力により自己集合することで形成される袋状の二分子膜をいう。そして近赤外蛍光色素２２は、リン脂質２１と複合化され、ベシクルの構成要素となっている。ここで「複合」とは、主に疎水性相互作用の分子間相互作用によってベシクルと複合体を形成する状態もしくは、ベシクルの内部に溶解している状態を意味する。近赤外蛍光色素２２をリン脂質２１に結合させることで、本実施形態に係るベシクルは近赤外蛍光色素２２を安定化させ、近赤外領域において蛍光を安定的に発することができるようになる。
【００１６】
なお本実施形態においてリン脂質２１は、ベシクルを形成することができるものである限りにおいて限定されるわけではないが、例えばレシチン、フォスファチジルコリン及びこれらのうちの二以上の混合物を用いることができる。なおレシチンとしては、限定されるわけではないが、卵黄レシチン、大豆レシチン又はこれらの混合物を例示することができるが、体内における蛍光強度の関係から、リン脂質は卵黄レシチンが好適である。
【００１７】
またフォスファチジルコリンの場合、上記の要求を満たす限りにおいて限定されるわけではないが、例えば１−パルミトイル−２−オレオイル−３−ｓｎ−グリセロフォスファチジルコリン、１−ステアリル−２−オレオイル−３−ｓｎ−グリセロフォスファチジルコリン、１−パルミトイル−２−リノレイル−３−ｓｎ−グリセロフォスファチジルコリン、１−ステアリル−２−リノレイル−３−ｓｎ−グリセロフォスファチジルコリン、１，２−ジオレオイル−３−ｓｎ−フォスファチジルコリン、１，２−ジパルミトイル−３−ｓｎ−グリセロフォスファチジルコリン、１，２−ジステアリル−３−ｓｎ−グリセロフォスファチジルコリン、１，２−ジリノレイル−３−ｓｎ−グリセロフォスファチジルコリン及びこれらのうちの二以上の混合物を用いることができる。
【００１８】
また本実施形態において、近赤外蛍光色素２２は、インドシアニングリーンやブリリアントグリーンそのものを含み、その誘導体を含む。インドシアニングリーンは下記式で示される化合物をいい、近赤外蛍光色素とは、インドシアニングリーンやブリリアントグリーンの主要な骨格及び機能を維持しつつその一部を他の官能基等で置換した化合物をいう。
【化１】
【化２】
【００１９】
本実施形態におけるベシクル２の大きさとしては、特に限定されないが、一般に１０ｎｍ以上１００μｍ以下となっていることが好ましく、より好ましくは１００ｎｍ以上１０μｍ以下である。
【００２０】
本実施形態のベシクルにおいて、含まれるリン脂質及び近赤外蛍光色素の量は、適宜調整可能であり限定されるわけではないが、例えば、リン脂質であるレシチンの重量を１とすると、近赤外蛍光色素であるインドシアニングリーンは、１×１０−４以上１×１０−３以下であることが好ましく、４×１０−３以上６×１０−３以下であることがより好ましい。１×１０−４以上１×１０−３以下とすることで、臓器内部のマーキングされた組織部分を臓器外部からより容易に認識することができるといった利点があり、４×１０−３以上６×１０−３以下とすることでこの効果がより顕著となる。
【００２１】
また図１で示すように、本実施形態に係るクラスター１は、親水性溶媒３が内包されたカプセル４を、乳化剤により複数形成、凝集させものとなっている。なお親水性溶媒３には、上記ベクシル２が内包されている。
【００２２】
親水性溶媒３は、ベクシル２を安定的に内包するために用いるものであり、この限りにおいて限定されるわけではないが、例えば水、生理食塩水、リン酸緩衝液、ＴＲＩＳ塩酸緩衝液、ＨＥＰＥＳ緩衝液及びこれらのうち二以上の混合物であることが好ましい。なお、リン酸緩衝液、ＴＲＩＳ塩酸緩衝液、ＨＥＰＥＳ緩衝液の場合、ｐＨ６．５以上８以下であることが好ましい。
【００２３】
また親水性溶媒３には、体内組織のマーキングされた位置で長時間安定して留まることが可能となるよう、食用増粘剤を加えておくことが好ましい。食用増粘剤の種類としては、限定されるわけではないが、例えばゼラチン、寒天、フィブリノーゲン、糖類及びこれらのうちの二以上の混合物を挙げることができる。
【００２４】
ゼラチンの場合、限定されるわけではないが、コラーゲンＩ型、コラーゲンＩＩ型、コラーゲンＩＩＩ型、コラーゲンＶ型及びこれらのうちの二以上の混合物を挙げることができる。
【００２５】
寒天の場合、限定されるわけではないが、分子量が数千〜数万のアガロース、アガロペクチン及びこれらのうちの二以上の混合物を挙げることができる。
【００２６】
フィブリノーゲンの場合、限定されるわけではないが、濃度５ｍｇ／ｍＬ〜５０ｍｇ／ｍＬのフィブリノーゲンを主成分とし、塩化カルシウム、プロトロンビン及びこれらのうちの二以上の混合物を挙げることができる。
【００２７】
糖類の場合、限定されるわけではないが、例えばグルコース、スクロース、マントース、ガラクトース、アラビノース、リブロース、フルクトース、ルトース、マンノース、スクロース、マルトース、ラクトース、セロビオース及びこれらのうちの二以上の混合物を挙げることができる。
【００２８】
また、食用増粘剤を添加する量としては、限定されるわけではないが、カプセルに含まれる親水性溶媒の重量を１とすると、１×１０−３以上１０以下であることが好ましく、１×１０−１以上１以下とすることがより好ましい。１×１０−３以上とすることで親水性溶媒３の粘度を向上することができるといった効果があり、１×１０−１以上とすることでこの効果がより顕著となる。また１０以下とすることで親水性溶媒３の流動性低下を抑制できるといった効果があり、１以下とすることでこの効果がより顕著となる。
【００２９】
また、本実施形態において、親水性溶媒に加える近赤外蛍光色素とリン脂質の合計の重量（通常ベクシルの重量）は、組織マーカーとして十分な光の量を確保することができる限りにおいて限定されるわけではないが、親水性溶媒の重量（食用増粘剤等を含む場合はそれを含む重量）を１とした場合に、１×１０−４以上１×１０−１以下、より好ましくは１×１０−３以上１×１０−２以下の範囲である。１×１０−４以上とすることでマーカーからの蛍光強度を向上することができるといった効果があり、１×１０−３以上とすることでこの効果がより顕著となる。一方、１×１０−１以下とすることで親水性溶媒中でベシクルではなくラメラ相に変化することを抑制する効果があり、１×１０−２以下とすることでこの効果がより顕著となる。
【００３０】
また、本実施形態において、乳化剤は、親水性溶媒を内包するカプセルの壁部を形成すると共に、これらをクラスターとして凝集させるために用いられるものである。そして本実施形態における乳化剤は、カプセルの壁部を形成するとともに、クラスター全体を覆う表皮をも形成することができ、複数のカプセルを凝集、結合させることができる。本実施形態に係る乳化剤としては、限定されるわけではないが、例えばポリグリセリルポリリシノレート、ポリグリセリルポリリシノレート誘導体、グリセリン脂肪酸エステル誘導体およびこれらのうち二以上の混合物を用いることができる。
【００３１】
また、本実施形態において、カプセル形成のための乳化剤の重量（通常ベクシルの重量）は、組織マーカーとして十分な光の量を確保することができる限りにおいて限定されるわけではないが、 またこの工程において、加える乳化剤の量としては、限定されることなく適宜調整可能であるが、例えば親水性溶媒（近赤外蛍光色素およびリン脂質の合計の重量、食用増粘剤等を含む場合はそれを含む重量）の量を１とした場合、１×１０−３以上１以下であることが好ましく、より好ましくは１×１０−２以上１×１０−１以下である。１×１０−３以上とすることで親水性溶媒のカプセルを安定に乳化剤がつくることができるといった効果があり、１×１０−２以上とすることでこの効果がより顕著となる。また、１以下とすることで乳化剤と疎水性溶媒と第一親水性溶媒とがゲル層を形成する反応を抑制するといった効果があり、１×１０−１以下とすることでこの効果がより顕著となる。
【００３２】
なお本実施形態において、クラスターの粒径としては、組織マーカーとしての機能を保持することができる限りにおいて限定されないが例えば５０μｍ以上５００μｍ以下であることが好ましく、より好ましくは１００μｍ以上２５０μｍ以下である。５０μｍ以上とすることでマーカーからの蛍光強度を向上することができ、１００μｍ以上とすることでこの効果がより顕著となる。また５００μｍ以下とすることで内視鏡を通じて注射する針が詰まることを抑制することができ、２５０μｍ以下とすることでこの効果がより顕著となる。
【００３３】
また本実施形態において、１つのクラスター内におけるカプセルの数は、組織マーカーとしての機能を維持することができる限りにおいて限定されないが例えば１個以上１０３個以下であることが好ましく、より好ましくは１０個以上１０２個以下である。１個以上とすることでマーカーからの蛍光強度を向上するといった効果があり、１０個以上とすることでこの効果がより顕著となる。また１０３個以下とすることでカプセルの強度の向上とマーカーが安定化するといった効果があり、１０２個以下とすることでこの効果がより顕著となる。
【００３４】
また、本実施形態における蛍光組織マーカーは、クラスターを保持するために、例えば疎水性溶媒を用い、この疎水性溶媒にクラスターを保持させることが好ましい。このようにすることで、カプセルを複数形成して凝集させることができるようになるといった効果がある。またもちろん、上記溶媒のほか、蛍光組織マーカーの機能を安定又は増強させるために他の要素、例えば疎水性高分子等を加え架橋することができる。
【００３５】
以上、本実施形態に係る蛍光組織マーカーにより、臓器外側からでも位置の認識が可能であり、長時間局所的に留まることが可能な蛍光組織マーカー及びその製造方法を提供することができる。より具体的に説明すると、本実施形態に係る蛍光組織マーカーは、近赤外蛍光色素がベシクルに結合しているため近赤外の蛍光を強く安定に発し、かつベシクルを親水性溶媒に内包しそのカプセルをクラスターとして形成するため、臓器へ打ち込んで生体内の組織液に接してもカプセルどうしが解離しにくく、長期にわたって局所的に留まるといった利点があり、更にクラスターのカプセルに食用増粘剤を用いるため、局所的に長期に留まるだけの強度をもちつつ、内視鏡の流路を経て臓器へ注射される柔軟性を有するといった利点がある。
【００３６】
（クラスターの製造方法）
ここで、上記蛍光組織マーカーの製造方法（以下「本製造方法」という。）の一例について、詳細に説明する。図３は、本製造方法の概略を示す図である。
【００３７】
本図で示すように、本製造方法は、（１）第一の親水性溶媒に近赤外蛍光色素とリン脂質を加えて攪拌し、（２）疎水性溶媒に、上記の近赤外蛍光色素とリン脂質が加えられた第一の親水性溶媒と乳化剤を加えて懸濁液を形成し、（３）懸濁液と第二の親水性溶媒とを用いて遠心分離することを特徴とする。
【００３８】
（１）第一の親水性溶媒に近赤外蛍光色素とリン脂質を加えて攪拌する工程によると、近赤外蛍光色素が結合したリン脂質を含むベクシルを形成することができるようになる。
【００３９】
この工程において、第一の親水性溶媒は、上記カプセルの内部に存在する親水性溶媒と同一のものを採用することがカプセル４を容易に形成する観点から好ましい。すなわち水、生理食塩水、リン酸緩衝液、ＴＲＩＳ塩酸緩衝液、ＨＥＰＥＳ緩衝液及びこれらのうち二以上の混合物であることが好ましい。
【００４０】
また、第一の親水性溶媒には、食用増粘剤を含ませることも好ましい。含ませる食用増粘剤は、上記の通り、ゼラチン、寒天、フィブリノーゲン、糖類及びこれらのうちの二以上の混合物を挙げることができる。
【００４１】
また、第一の親水性溶媒の量に対する近赤外蛍光色素とリン脂質の量は、限定されるわけではないが、カプセル内に存在する親水性溶媒における近赤外蛍光色素とリン脂質との重量関係と同様の範囲とすることが好ましい。すなわち、例えば、第一の親水性溶媒の重量（食用増粘剤等を含む場合はそれを含む重量）を１とした場合に、１×１０−４以上１×１０−１以下、より好ましくは１×１０−３以上１×１０−２以下の範囲である。１×１０−４以上とすることでマーカーからの蛍光強度を向上することができるといった効果があり、１×１０−３以上とすることでこの効果がより顕著となる。一方、１×１０−１以下とすることで親水性溶媒中でベシクルではなくラメラ相に変化することと抑制する効果があり、１×１０−２以下とすることでこの効果がより顕著となる。
【００４２】
また、この工程を行なう温度は、ベクシルを形成することができる限りにおいて限定されるわけではないが、４℃以上８０℃以下であることが好ましく、室温程度で行なうことが簡便でありより好ましい。またこの工程において、第一の親水性溶媒を攪拌する時間も、ベクシルを形成することができる限りにおいて限定されるわけではないが、５分以上１時間以内であることが好ましく、より好ましくは１０分以上３０分以下である。
【００４３】
（２）疎水性溶媒に、第一の親水性溶媒と乳化剤を加えて懸濁液を形成する工程によると、ベクシルを内包させた第一の親水性溶媒の周囲に乳化剤を取り囲ませ、疎水性溶媒中にカプセル状のエマルションを多数形成させることができる。
【００４４】
本工程おいて、疎水性溶媒は、４℃以上８０℃以下でカプセル状のエマルションができる限りにおいて限定されるわけではないが、例えばケロシン、ヘキサン、デカン、ドデカン、ヘプタン、スクアレン、スクアラン、流動パラフィン、ミネラルオイル及びこれらのうち二以上の混合物を用いることができる。
【００４５】
また、本実施形態において疎水性溶媒の重量は、限定されるわけではないが、第一の親水性溶媒の重量を１とした場合、１以上１００以下であることが好ましく、より好ましくは５以上１０以下である。1以上とすることでカプセル状のエマルションがゲル相へ転移してしまうことを抑制することができ、５以上とすることでこの効果がより顕著となる。一方、１００以下とすることでカプセル状のエマルションの粒径を安定に保持してクラスターとすることができるといった効果があり、１０以下とすることでこの効果がより顕著となる。
【００４６】
なお本工程において乳化剤は、上記記載したものを採用することができる。
【００４７】
またこの工程において、加える第一の親水性溶媒の量としては、限定されることなく適宜調整可能であるが、例えば疎水性溶媒の重量を１とした場合、１×１０−３以上１以下であることが好ましく、より好ましくは１×１０−２以上１×１０−１以下である。１×１０−３以上とすることでクラスターあたりのカプセルの数を増加させマーカーの蛍光強度を向上できるといった効果があり、１×１０−２以上とすることでこの効果がより顕著となる。また、１以下とすることで親水性溶媒と疎水性溶媒との相分離を抑制するといった効果があり、１０−１以下とすることでこの効果がより顕著となる。
【００４８】
またこの工程において、加える乳化剤の量としては、限定されることなく適宜調整可能であるが、例えば加える第一の親水性溶媒の量を１とした場合、１×１０−３以上１以下であることが好ましく、より好ましくは１×１０−２以上１×１０−１以下である。１×１０−３以上とすることで親水性溶媒のカプセルを安定に乳化剤がつくることができるといった効果があり、１×１０−２以上とすることでこの効果がより顕著となる。また、１以下とすることで乳化剤と疎水性溶媒と第一親水性溶媒とがゲル層を形成する反応を抑制するといった効果があり、１×１０−１以下とすることでこの効果がより顕著となる。
【００４９】
本実施形態において、（３）懸濁液と第二の親水性溶媒とを用いて遠心分離する工程は、疎水性溶媒層と親水性溶媒層を相分離させて配置し、疎水性溶媒中に存在するカプセル状のエマルションを遠心分離を用いて親水性溶媒側に沈降させていく方法であり、このイメージを図４に示しておく。この結果、疎水性溶媒層と親水性溶媒層との間の界面の乳化剤がカプセルからクラスターを形成させることができる。
【００５０】
第二の親水性溶媒は、遠心分離するために用いられるものであり、この限りにおいて限定されるわけではないが、例えば水、生理食塩水、リン酸緩衝液、ＴＲＩＳ塩酸緩衝液、ＨＥＰＥＳ緩衝液及びこれらのうち二以上の混合物を好適に用いることができる。
【００５１】
なお、第二の溶媒の量としては、限定されるわけではないが、例えば懸濁液の重量を１とした場合、１以上１０００以下であることが好ましく、より好ましくは１０以上１００以下である。１以上とすることで疎水性溶媒層と親水性溶媒層との相分離を安定化させることができるといった効果があり、１０以上とすることでこの効果がより顕著となる。また、１０００以下とすることでマーカーの粘度が減少することを抑制することができるといった効果があり、１００以下とすることでこの効果がより顕著となる。
【００５２】
そしてこの結果、上記した蛍光組織マーカーを構成することができる。
【実施例】
【００５３】
ここで、上記実施形態において説明した蛍光組織マーカーについて、実際に作製を行い、その効果を確認した。以下詳細に説明する。
【００５４】
（組織マーカーの作製）
まず、卵黄レシチン（０〜６０ｍＭ）とインドシアニングリーンを水に分散させ、ベクシル分散液を調製した。そして、この分散液に、スクロース（１Ｍ）とゼラチン（０〜４５ｍｇ／ｍＬ）を含むＴＲＩＳ塩酸緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ７．７）を混合し、この混合液５００μＬをポリグリセリンポリリシノレート（５〜６０％）と膜染色剤としてローダミン６Ｇ（０．０５０ｍＭ）を溶解したケロシン３．５ｍＬ中に懸濁しエマルションを調製した。
【００５５】
このエマルションを、グルコース１Ｍを溶解したＴＲＩＳ塩酸緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ７．７）７．０ｍＬ上に重層し、遠心分離することでベクシルクラスターを形成した。なお、遠心分離の条件は、遠心力３５００ｒｐｍ、遠心時間４０分、温度２９℃とした。遠心沈降後、ポンプにより油相上澄みを除去し、更に、水相上澄みについても残存液量が約２ｍＬとなるよう除去した。
【００５６】
（ベクシルクラスターの確認）
ここで、微分干渉顕微鏡と蛍光顕微鏡を用い、ベクシルクラスターの確認を行なった。ポリグリセリンポリリシノレートの重量％濃度が５％のベクシルクラスター分散液の微分干渉顕微鏡像を図５に、蛍光顕微鏡像を図６にそれぞれ示す。
【００５７】
この結果、ベクシルクラスターの膜が薄く染色されていることが確認でき、親油性の膜染色剤であるローダミン６Ｇがベクシルクラスターの親油性溶媒であるケロシンに溶解し、それが遠心分離によって沈降することで水相を取り込みながら二分子膜を形成していると考えられた。
【００５８】
そして次に、ポリグリセリンポリリシノレートの重量％濃度を４０％にして、上記と同様の確認を行なった。ベクシルクラスター分散液の微分干渉顕微鏡像を図７に、蛍光顕微鏡像を図８にそれぞれ示す。
【００５９】
この結果、クラスターにおけるカプセルの数が多いことに加え、膜にローダミン６Ｇが組み込まれる様子もより鮮明に得ることができた。
【００６０】
（蛍光観察）
そして、上記得られたベクシルクラスターを用い、蛍光観測を行なった。蛍光観察は、ＬＥＤ光源（フィルタ：７８０ｎｍ以下）をベシクルクラスターのサンプルに照射し、試料において励起した蛍光をモノクロカメラ（フィルタ：８１０ｎｍ以上）で観察した。なお、試料は、インドシアニングリーンの濃度をパラメータとしてふり、形成したベシクルクラスターの分散液１００μＬをプラスチックケースに入れて作成した。なおＬＥＤ光源及びモノクロカメラとサンプルとの距離は約２０ｃｍとした。この結果を図９に示す。
【００６１】
この結果、インドシアニングリーンの濃度が３．２×１０−２ｍＭの場合に最も強い蛍光を確認することができた。また、この場合における蛍光強度のプロファイルを図１０に示しておく。なおこの結果から、低濃度では、励起される分子数が少ないために蛍光強度が低い一方、高濃度としすぎると未励起分子と励起分子との衝突による消光や未励起分子同士の衝突による消光などが生じるためであろうと考えられる。
【００６２】
次に、卵黄レシチンの濃度をパラメータとしてふり、同様に蛍光観察を行なった。この結果を図１１に示す。
【００６３】
この結果、卵黄レシチンの濃度が上昇するにつれて蛍光強度も上昇することが確認できた。なお、この結果における蛍光強度のプロファイルを図１２に示しておく。なおこの結果は、卵黄レシチン濃度とインドシアニングリーンの蛍光強度には相関があることが見て取れる。これは、卵黄レシチンの疎水性部位にインドシアニングリーンの発色団部位が取り込まれることで、発色団部位の平面構造が維持され、吸収エネルギーが振動エネルギーとして熱変換されることを抑制でき、光学的に安定化したインドシアニングリーンの蛍光強度を得ることができることを意味していると考えられる。
【００６４】
（粘度測定）
一方、上記作成したベクシルクラスター分散液約０．５ｍＬを全量が約２ｍＬとなるようグルコース（１Ｍ）を溶解したＴＲＩＳ緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ７．７）に分散させた。そしてこの分散液の粘度をコーンプレート型レオメータにより測定した。測定は、温度２５℃の場合と３７℃の場合とで行なった。この結果を図１３、図１４に示しておく。
【００６５】
この結果、一般的に、ゼラチンのある場合の方が、ゼラチンがない場合よりも粘度が高くなっていることが確認できた。特に３７℃の場合、ゼラチンがある場合、ＰＧＰＲ重量％濃度が１０重量％より大きい場合、粘度が顕著に高くなっていくことが確認できた。
【００６６】
（ブタの胃における蛍光観察）
次に、ゼラチンを４５ｍｇ／ｍＬとなるように添加したベクシルクラスター分散液を、麻酔をかけたブタの胃の内壁粘膜下層へ内視鏡（バリクサー）を用いて約３００μＬ局所注射し、注射直後とその５時間後に、開腹した状態で外部から胃をＬＥＤ−モノクロカメラ観察装置で観察した。なおこの観察は、ゼラチンのあるベシクルクラスターを用いた状態、ゼラチンの無いベシクルクラスターを用いた状態のそれぞれにおいて行なった。なおその他の条件としては、ポリグリセリンポリリシノレート重量％濃度５重量％、卵黄レシチン濃度６０ｍＭ、インドシアニングリーン濃度は３．２×１０−２ｍＭとした。この結果の図を図１５（ゼラチン無し）、図１６（ゼラチン有り）にそれぞれ示しておく。
【００６７】
この結果、ゼラチン無しのベシクルクラスターの分散液を注射した場合では、注射直後であっても拡散していることが確認でき、５時間後には更に広範囲に拡散していることが確認できた。一方、ゼラチン添加ありのベシクルクラスター分散液を注射した場合、注射直後だけでなく、５時間経過しても殆ど拡散していない様子が確認できた。
【００６８】
この結果、臓器外側からでも位置の認識が可能であり、長時間局所的に留まることが可能な蛍光組織マーカー及びその製造方法を提供することができることを確認した。
【産業上の利用可能性】
【００６９】
本発明は、蛍光組織マーカーとして産業上の利用可能性がある。
【符号の説明】
【００７０】
１…ベシクルクラスター、２…ベシクル、３…親水性溶媒、４…カプセル
【技術分野】
【０００１】
本発明は、蛍光組織マーカー及びその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、内視鏡を用いた手術が発展し、診断・治療の手法として多く利用されるようになってきている。上記手術において、組織マーカーは極めて有用である。組織マーカーとは、診断・治療するために必要な部位にマーキングを施すものであり、マーキングを施すことで診断・治療するための部位を簡便に特定することができるようになる。
【０００３】
公知の組織マーカーに関する技術としては、例えば、インドシアニングリーンに関する技術が、例えば下記非特許文献１乃至６、特許文献１及び２（以下これらを「文献」という。）に記載されている。下記文献には、インドシアニングリーンとゼラチンとを混合して作製した組織マーカーを用い、内視鏡カメラによって可視領域の吸収を観察したことが開示されている。
【０００４】
【非特許文献１】草野満夫 編著，ＩＣＧ 蛍光Ｎａｖｉｇａｔｉｏｎ Ｓｕｒｇｅｒｙのすべて，インターメディカ，２００８．
【非特許文献２】Ｓ．Ｙｏｎｅｙａ ｅｔ ａｌ，Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｖｅ Ｏｐｈｔａｌｍｏｌｇｙ ａｎｄ Ｖｉｓｕａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ １９９８；３９：１２８６−１２９０．
【非特許文献３】Ｓ．Ｉｔｏ ｅｔ ａｌ，Ｅｎｄｏｓｃｏｐｙ ２００１；３３：８４９−８５３
【非特許文献４】Ｒ．Ａｓｈｉｄａ ｅｔ ａｌ，Ｅｎｄｏｓｃｏｐｙ ２００６；３８：１９０−１９２．
【非特許文献５】Ｓ．Ｔａｏｋａ ｅｔ ａｌ，Ｄｉｇｅｓｔｉｖｅ Ｅｎｄｏｓｃｏｐｙ １９９９；１１：３２１−３２６．
【非特許文献６】Ｊ．Ｖ．Ｆｒａｎｇｉｏｎｉ，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎＣｈｅｍｉｃａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２００３；７：６２６−６３４．
【特許文献１】特開２００７−２６２０６２号公報
【特許文献２】特開２００８−６９１０７号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、上記文献に記載の技術は、内視鏡のみで対応できる手術には非常に有用であるものの、実際に開腹し、腫瘍等を含む組織を切除する手術にまで応用することは容易でない。具体的に説明すると、上記文献に記載の技術では、内視鏡により臓器内側の組織及び当該組織にマーキングされたマーカーを直接観察することができるものの、可視領域の光を殆ど通さない臓器の外側からマーキングした位置を確認し、必要な部分のみを切除しようとする場合等に困難性がある。また、ＩＣＧを単にゼラチンと混合して使用しただけでは、体内組織内における血管を通じて早期に拡散してしまい、マーキングした位置の特定が困難になってしまう。
【０００６】
これら課題は、マーカーとしての機能において改善の余地があることを意味する。すなわち、生体透過率が高い近赤外領域の蛍光が弱く可視光の吸収に大きく依存したマーカーでは、臓器内側からマーキングしたとしても外側から発見することが困難であり、また、マーカーがすぐに拡散してしまうと、マーキング箇所が拡散して広くなる結果、体内組織を必要以上切除しなければならず、患者に対する負担が大きくなってしまう。
【０００７】
そこで、本発明は、上記課題を鑑み、臓器外側からでも位置の認識が可能であり、長時間局所的に留まることが可能な蛍光組織マーカー及びその製造方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上記課題について、発明者らが鋭意検討を行ったところ、リン脂質と近赤外蛍光色素が複合されたベシクルを形成し、更に、このベシクルを親水性溶媒に分散させ、乳化剤のカプセルに内包し、かつ、これらカプセルを複数凝集化させることで従来よりも近赤外領域で強く蛍光を発する蛍光組織マーカーとして活用できることを発見し、本発明を完成させるに至った。
【０００９】
すなわち、本発明の一観点に係る蛍光組織マーカーは、リン脂質と近赤外蛍光色素が複合して形成されたベシクルを親水性溶媒に内包させ、乳化剤により複数のカプセルを形成、凝集させたベシクルクラスターを有する。
【００１０】
また、本発明の他の一観点に係る蛍光組織マーカーの製造方法は、第一の親水性溶媒に近赤外蛍光色素とリン脂質を加えて攪拌し、疎水性溶媒に、第一の親水性溶媒と乳化剤を加えて懸濁液を形成し、懸濁液と第二の親水性溶媒とを用いて遠心分離する。
【発明の効果】
【００１１】
以上、本発明により、臓器外側からでも位置の認識が可能であり、長時間局所的に留まることが可能な蛍光組織マーカー及びその製造方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】実施形態に係るベシクルクラスターのイメージ図である。
【図２】実施形態に係るベシクルのイメージ図である。
【図３】実施形態に係るベシクルクラスターの製造方法の工程の概略を示す図である。
【図４】実施形態に係る、懸濁液と第二の親水性溶媒とを用いて遠心分離する工程のイメージを示す図である。
【図５】実施例に係るベクシルクラスターの微分干渉顕微鏡像を示す図である。
【図６】実施例に係るベクシルクラスターを膜染色剤で染めた蛍光顕微鏡像を示す図である。
【図７】実施例に係るベクシルクラスターの微分干渉顕微鏡像を示す図である。
【図８】実施例に係るベクシルクラスターを膜染色剤で染めた蛍光顕微鏡像を示す図である。
【図９】実施例に係る蛍光観察の結果を示す図である。
【図１０】実施例に係る蛍光観察の一例における蛍光強度のプロファイルを示す図である。
【図１１】実施例に係るベクシルクラスター分散液の蛍光強度の卵黄レシチン濃度依存性を示す図である。
【図１２】図１１における蛍光強度のプロファイルを示す図である。
【図１３】実施例に係るベクシルクラスター分散液の粘度測定の結果（２５℃）を示す図である。
【図１４】実施例に係るベクシルクラスター分散液の粘度測定の結果（３７℃）を示す図である。
【図１５】実施例に係るベクシルクラスターのブタの胃における蛍光観察の結果（ゼラチン無し）を示す図である。
【図１６】実施例に係るベクシルクラスターのブタの胃における蛍光観察の結果を示す図（ゼラチン有り）である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
以下、本発明を実施するための形態について図面を用いて詳細に説明する。ただし、本発明は多くの異なる形態による実施が可能であり、以下に示す実施形態、実施例における例示に限定されるものでないことはいうまでもない。
【００１４】
（蛍光組織マーカー）
本実施形態に係る蛍光組織マーカーは、リン脂質と近赤外蛍光色素が複合して形成されたベシクルを親水性溶媒に内包させ、乳化剤により複数のカプセルを形成、凝集させたベシクルクラスター（以下「クラスター」という。）を有する。図１は、本実施形態に係る蛍光組織マーカーにおけるクラスター１のイメージ図であり、図２は、クラスター１に含まれるベクシル２のイメージ図である。
【００１５】
まず図２で示すように、本実施形態に係るベシクル２は、リン脂質２１と、近赤外蛍光色素２２と、を有して形成されている。ここでベシクルとは、リン脂質が分子間力により自己集合することで形成される袋状の二分子膜をいう。そして近赤外蛍光色素２２は、リン脂質２１と複合化され、ベシクルの構成要素となっている。ここで「複合」とは、主に疎水性相互作用の分子間相互作用によってベシクルと複合体を形成する状態もしくは、ベシクルの内部に溶解している状態を意味する。近赤外蛍光色素２２をリン脂質２１に結合させることで、本実施形態に係るベシクルは近赤外蛍光色素２２を安定化させ、近赤外領域において蛍光を安定的に発することができるようになる。
【００１６】
なお本実施形態においてリン脂質２１は、ベシクルを形成することができるものである限りにおいて限定されるわけではないが、例えばレシチン、フォスファチジルコリン及びこれらのうちの二以上の混合物を用いることができる。なおレシチンとしては、限定されるわけではないが、卵黄レシチン、大豆レシチン又はこれらの混合物を例示することができるが、体内における蛍光強度の関係から、リン脂質は卵黄レシチンが好適である。
【００１７】
またフォスファチジルコリンの場合、上記の要求を満たす限りにおいて限定されるわけではないが、例えば１−パルミトイル−２−オレオイル−３−ｓｎ−グリセロフォスファチジルコリン、１−ステアリル−２−オレオイル−３−ｓｎ−グリセロフォスファチジルコリン、１−パルミトイル−２−リノレイル−３−ｓｎ−グリセロフォスファチジルコリン、１−ステアリル−２−リノレイル−３−ｓｎ−グリセロフォスファチジルコリン、１，２−ジオレオイル−３−ｓｎ−フォスファチジルコリン、１，２−ジパルミトイル−３−ｓｎ−グリセロフォスファチジルコリン、１，２−ジステアリル−３−ｓｎ−グリセロフォスファチジルコリン、１，２−ジリノレイル−３−ｓｎ−グリセロフォスファチジルコリン及びこれらのうちの二以上の混合物を用いることができる。
【００１８】
また本実施形態において、近赤外蛍光色素２２は、インドシアニングリーンやブリリアントグリーンそのものを含み、その誘導体を含む。インドシアニングリーンは下記式で示される化合物をいい、近赤外蛍光色素とは、インドシアニングリーンやブリリアントグリーンの主要な骨格及び機能を維持しつつその一部を他の官能基等で置換した化合物をいう。
【化１】
【化２】
【００１９】
本実施形態におけるベシクル２の大きさとしては、特に限定されないが、一般に１０ｎｍ以上１００μｍ以下となっていることが好ましく、より好ましくは１００ｎｍ以上１０μｍ以下である。
【００２０】
本実施形態のベシクルにおいて、含まれるリン脂質及び近赤外蛍光色素の量は、適宜調整可能であり限定されるわけではないが、例えば、リン脂質であるレシチンの重量を１とすると、近赤外蛍光色素であるインドシアニングリーンは、１×１０−４以上１×１０−３以下であることが好ましく、４×１０−３以上６×１０−３以下であることがより好ましい。１×１０−４以上１×１０−３以下とすることで、臓器内部のマーキングされた組織部分を臓器外部からより容易に認識することができるといった利点があり、４×１０−３以上６×１０−３以下とすることでこの効果がより顕著となる。
【００２１】
また図１で示すように、本実施形態に係るクラスター１は、親水性溶媒３が内包されたカプセル４を、乳化剤により複数形成、凝集させものとなっている。なお親水性溶媒３には、上記ベクシル２が内包されている。
【００２２】
親水性溶媒３は、ベクシル２を安定的に内包するために用いるものであり、この限りにおいて限定されるわけではないが、例えば水、生理食塩水、リン酸緩衝液、ＴＲＩＳ塩酸緩衝液、ＨＥＰＥＳ緩衝液及びこれらのうち二以上の混合物であることが好ましい。なお、リン酸緩衝液、ＴＲＩＳ塩酸緩衝液、ＨＥＰＥＳ緩衝液の場合、ｐＨ６．５以上８以下であることが好ましい。
【００２３】
また親水性溶媒３には、体内組織のマーキングされた位置で長時間安定して留まることが可能となるよう、食用増粘剤を加えておくことが好ましい。食用増粘剤の種類としては、限定されるわけではないが、例えばゼラチン、寒天、フィブリノーゲン、糖類及びこれらのうちの二以上の混合物を挙げることができる。
【００２４】
ゼラチンの場合、限定されるわけではないが、コラーゲンＩ型、コラーゲンＩＩ型、コラーゲンＩＩＩ型、コラーゲンＶ型及びこれらのうちの二以上の混合物を挙げることができる。
【００２５】
寒天の場合、限定されるわけではないが、分子量が数千〜数万のアガロース、アガロペクチン及びこれらのうちの二以上の混合物を挙げることができる。
【００２６】
フィブリノーゲンの場合、限定されるわけではないが、濃度５ｍｇ／ｍＬ〜５０ｍｇ／ｍＬのフィブリノーゲンを主成分とし、塩化カルシウム、プロトロンビン及びこれらのうちの二以上の混合物を挙げることができる。
【００２７】
糖類の場合、限定されるわけではないが、例えばグルコース、スクロース、マントース、ガラクトース、アラビノース、リブロース、フルクトース、ルトース、マンノース、スクロース、マルトース、ラクトース、セロビオース及びこれらのうちの二以上の混合物を挙げることができる。
【００２８】
また、食用増粘剤を添加する量としては、限定されるわけではないが、カプセルに含まれる親水性溶媒の重量を１とすると、１×１０−３以上１０以下であることが好ましく、１×１０−１以上１以下とすることがより好ましい。１×１０−３以上とすることで親水性溶媒３の粘度を向上することができるといった効果があり、１×１０−１以上とすることでこの効果がより顕著となる。また１０以下とすることで親水性溶媒３の流動性低下を抑制できるといった効果があり、１以下とすることでこの効果がより顕著となる。
【００２９】
また、本実施形態において、親水性溶媒に加える近赤外蛍光色素とリン脂質の合計の重量（通常ベクシルの重量）は、組織マーカーとして十分な光の量を確保することができる限りにおいて限定されるわけではないが、親水性溶媒の重量（食用増粘剤等を含む場合はそれを含む重量）を１とした場合に、１×１０−４以上１×１０−１以下、より好ましくは１×１０−３以上１×１０−２以下の範囲である。１×１０−４以上とすることでマーカーからの蛍光強度を向上することができるといった効果があり、１×１０−３以上とすることでこの効果がより顕著となる。一方、１×１０−１以下とすることで親水性溶媒中でベシクルではなくラメラ相に変化することを抑制する効果があり、１×１０−２以下とすることでこの効果がより顕著となる。
【００３０】
また、本実施形態において、乳化剤は、親水性溶媒を内包するカプセルの壁部を形成すると共に、これらをクラスターとして凝集させるために用いられるものである。そして本実施形態における乳化剤は、カプセルの壁部を形成するとともに、クラスター全体を覆う表皮をも形成することができ、複数のカプセルを凝集、結合させることができる。本実施形態に係る乳化剤としては、限定されるわけではないが、例えばポリグリセリルポリリシノレート、ポリグリセリルポリリシノレート誘導体、グリセリン脂肪酸エステル誘導体およびこれらのうち二以上の混合物を用いることができる。
【００３１】
また、本実施形態において、カプセル形成のための乳化剤の重量（通常ベクシルの重量）は、組織マーカーとして十分な光の量を確保することができる限りにおいて限定されるわけではないが、 またこの工程において、加える乳化剤の量としては、限定されることなく適宜調整可能であるが、例えば親水性溶媒（近赤外蛍光色素およびリン脂質の合計の重量、食用増粘剤等を含む場合はそれを含む重量）の量を１とした場合、１×１０−３以上１以下であることが好ましく、より好ましくは１×１０−２以上１×１０−１以下である。１×１０−３以上とすることで親水性溶媒のカプセルを安定に乳化剤がつくることができるといった効果があり、１×１０−２以上とすることでこの効果がより顕著となる。また、１以下とすることで乳化剤と疎水性溶媒と第一親水性溶媒とがゲル層を形成する反応を抑制するといった効果があり、１×１０−１以下とすることでこの効果がより顕著となる。
【００３２】
なお本実施形態において、クラスターの粒径としては、組織マーカーとしての機能を保持することができる限りにおいて限定されないが例えば５０μｍ以上５００μｍ以下であることが好ましく、より好ましくは１００μｍ以上２５０μｍ以下である。５０μｍ以上とすることでマーカーからの蛍光強度を向上することができ、１００μｍ以上とすることでこの効果がより顕著となる。また５００μｍ以下とすることで内視鏡を通じて注射する針が詰まることを抑制することができ、２５０μｍ以下とすることでこの効果がより顕著となる。
【００３３】
また本実施形態において、１つのクラスター内におけるカプセルの数は、組織マーカーとしての機能を維持することができる限りにおいて限定されないが例えば１個以上１０３個以下であることが好ましく、より好ましくは１０個以上１０２個以下である。１個以上とすることでマーカーからの蛍光強度を向上するといった効果があり、１０個以上とすることでこの効果がより顕著となる。また１０３個以下とすることでカプセルの強度の向上とマーカーが安定化するといった効果があり、１０２個以下とすることでこの効果がより顕著となる。
【００３４】
また、本実施形態における蛍光組織マーカーは、クラスターを保持するために、例えば疎水性溶媒を用い、この疎水性溶媒にクラスターを保持させることが好ましい。このようにすることで、カプセルを複数形成して凝集させることができるようになるといった効果がある。またもちろん、上記溶媒のほか、蛍光組織マーカーの機能を安定又は増強させるために他の要素、例えば疎水性高分子等を加え架橋することができる。
【００３５】
以上、本実施形態に係る蛍光組織マーカーにより、臓器外側からでも位置の認識が可能であり、長時間局所的に留まることが可能な蛍光組織マーカー及びその製造方法を提供することができる。より具体的に説明すると、本実施形態に係る蛍光組織マーカーは、近赤外蛍光色素がベシクルに結合しているため近赤外の蛍光を強く安定に発し、かつベシクルを親水性溶媒に内包しそのカプセルをクラスターとして形成するため、臓器へ打ち込んで生体内の組織液に接してもカプセルどうしが解離しにくく、長期にわたって局所的に留まるといった利点があり、更にクラスターのカプセルに食用増粘剤を用いるため、局所的に長期に留まるだけの強度をもちつつ、内視鏡の流路を経て臓器へ注射される柔軟性を有するといった利点がある。
【００３６】
（クラスターの製造方法）
ここで、上記蛍光組織マーカーの製造方法（以下「本製造方法」という。）の一例について、詳細に説明する。図３は、本製造方法の概略を示す図である。
【００３７】
本図で示すように、本製造方法は、（１）第一の親水性溶媒に近赤外蛍光色素とリン脂質を加えて攪拌し、（２）疎水性溶媒に、上記の近赤外蛍光色素とリン脂質が加えられた第一の親水性溶媒と乳化剤を加えて懸濁液を形成し、（３）懸濁液と第二の親水性溶媒とを用いて遠心分離することを特徴とする。
【００３８】
（１）第一の親水性溶媒に近赤外蛍光色素とリン脂質を加えて攪拌する工程によると、近赤外蛍光色素が結合したリン脂質を含むベクシルを形成することができるようになる。
【００３９】
この工程において、第一の親水性溶媒は、上記カプセルの内部に存在する親水性溶媒と同一のものを採用することがカプセル４を容易に形成する観点から好ましい。すなわち水、生理食塩水、リン酸緩衝液、ＴＲＩＳ塩酸緩衝液、ＨＥＰＥＳ緩衝液及びこれらのうち二以上の混合物であることが好ましい。
【００４０】
また、第一の親水性溶媒には、食用増粘剤を含ませることも好ましい。含ませる食用増粘剤は、上記の通り、ゼラチン、寒天、フィブリノーゲン、糖類及びこれらのうちの二以上の混合物を挙げることができる。
【００４１】
また、第一の親水性溶媒の量に対する近赤外蛍光色素とリン脂質の量は、限定されるわけではないが、カプセル内に存在する親水性溶媒における近赤外蛍光色素とリン脂質との重量関係と同様の範囲とすることが好ましい。すなわち、例えば、第一の親水性溶媒の重量（食用増粘剤等を含む場合はそれを含む重量）を１とした場合に、１×１０−４以上１×１０−１以下、より好ましくは１×１０−３以上１×１０−２以下の範囲である。１×１０−４以上とすることでマーカーからの蛍光強度を向上することができるといった効果があり、１×１０−３以上とすることでこの効果がより顕著となる。一方、１×１０−１以下とすることで親水性溶媒中でベシクルではなくラメラ相に変化することと抑制する効果があり、１×１０−２以下とすることでこの効果がより顕著となる。
【００４２】
また、この工程を行なう温度は、ベクシルを形成することができる限りにおいて限定されるわけではないが、４℃以上８０℃以下であることが好ましく、室温程度で行なうことが簡便でありより好ましい。またこの工程において、第一の親水性溶媒を攪拌する時間も、ベクシルを形成することができる限りにおいて限定されるわけではないが、５分以上１時間以内であることが好ましく、より好ましくは１０分以上３０分以下である。
【００４３】
（２）疎水性溶媒に、第一の親水性溶媒と乳化剤を加えて懸濁液を形成する工程によると、ベクシルを内包させた第一の親水性溶媒の周囲に乳化剤を取り囲ませ、疎水性溶媒中にカプセル状のエマルションを多数形成させることができる。
【００４４】
本工程おいて、疎水性溶媒は、４℃以上８０℃以下でカプセル状のエマルションができる限りにおいて限定されるわけではないが、例えばケロシン、ヘキサン、デカン、ドデカン、ヘプタン、スクアレン、スクアラン、流動パラフィン、ミネラルオイル及びこれらのうち二以上の混合物を用いることができる。
【００４５】
また、本実施形態において疎水性溶媒の重量は、限定されるわけではないが、第一の親水性溶媒の重量を１とした場合、１以上１００以下であることが好ましく、より好ましくは５以上１０以下である。1以上とすることでカプセル状のエマルションがゲル相へ転移してしまうことを抑制することができ、５以上とすることでこの効果がより顕著となる。一方、１００以下とすることでカプセル状のエマルションの粒径を安定に保持してクラスターとすることができるといった効果があり、１０以下とすることでこの効果がより顕著となる。
【００４６】
なお本工程において乳化剤は、上記記載したものを採用することができる。
【００４７】
またこの工程において、加える第一の親水性溶媒の量としては、限定されることなく適宜調整可能であるが、例えば疎水性溶媒の重量を１とした場合、１×１０−３以上１以下であることが好ましく、より好ましくは１×１０−２以上１×１０−１以下である。１×１０−３以上とすることでクラスターあたりのカプセルの数を増加させマーカーの蛍光強度を向上できるといった効果があり、１×１０−２以上とすることでこの効果がより顕著となる。また、１以下とすることで親水性溶媒と疎水性溶媒との相分離を抑制するといった効果があり、１０−１以下とすることでこの効果がより顕著となる。
【００４８】
またこの工程において、加える乳化剤の量としては、限定されることなく適宜調整可能であるが、例えば加える第一の親水性溶媒の量を１とした場合、１×１０−３以上１以下であることが好ましく、より好ましくは１×１０−２以上１×１０−１以下である。１×１０−３以上とすることで親水性溶媒のカプセルを安定に乳化剤がつくることができるといった効果があり、１×１０−２以上とすることでこの効果がより顕著となる。また、１以下とすることで乳化剤と疎水性溶媒と第一親水性溶媒とがゲル層を形成する反応を抑制するといった効果があり、１×１０−１以下とすることでこの効果がより顕著となる。
【００４９】
本実施形態において、（３）懸濁液と第二の親水性溶媒とを用いて遠心分離する工程は、疎水性溶媒層と親水性溶媒層を相分離させて配置し、疎水性溶媒中に存在するカプセル状のエマルションを遠心分離を用いて親水性溶媒側に沈降させていく方法であり、このイメージを図４に示しておく。この結果、疎水性溶媒層と親水性溶媒層との間の界面の乳化剤がカプセルからクラスターを形成させることができる。
【００５０】
第二の親水性溶媒は、遠心分離するために用いられるものであり、この限りにおいて限定されるわけではないが、例えば水、生理食塩水、リン酸緩衝液、ＴＲＩＳ塩酸緩衝液、ＨＥＰＥＳ緩衝液及びこれらのうち二以上の混合物を好適に用いることができる。
【００５１】
なお、第二の溶媒の量としては、限定されるわけではないが、例えば懸濁液の重量を１とした場合、１以上１０００以下であることが好ましく、より好ましくは１０以上１００以下である。１以上とすることで疎水性溶媒層と親水性溶媒層との相分離を安定化させることができるといった効果があり、１０以上とすることでこの効果がより顕著となる。また、１０００以下とすることでマーカーの粘度が減少することを抑制することができるといった効果があり、１００以下とすることでこの効果がより顕著となる。
【００５２】
そしてこの結果、上記した蛍光組織マーカーを構成することができる。
【実施例】
【００５３】
ここで、上記実施形態において説明した蛍光組織マーカーについて、実際に作製を行い、その効果を確認した。以下詳細に説明する。
【００５４】
（組織マーカーの作製）
まず、卵黄レシチン（０〜６０ｍＭ）とインドシアニングリーンを水に分散させ、ベクシル分散液を調製した。そして、この分散液に、スクロース（１Ｍ）とゼラチン（０〜４５ｍｇ／ｍＬ）を含むＴＲＩＳ塩酸緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ７．７）を混合し、この混合液５００μＬをポリグリセリンポリリシノレート（５〜６０％）と膜染色剤としてローダミン６Ｇ（０．０５０ｍＭ）を溶解したケロシン３．５ｍＬ中に懸濁しエマルションを調製した。
【００５５】
このエマルションを、グルコース１Ｍを溶解したＴＲＩＳ塩酸緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ７．７）７．０ｍＬ上に重層し、遠心分離することでベクシルクラスターを形成した。なお、遠心分離の条件は、遠心力３５００ｒｐｍ、遠心時間４０分、温度２９℃とした。遠心沈降後、ポンプにより油相上澄みを除去し、更に、水相上澄みについても残存液量が約２ｍＬとなるよう除去した。
【００５６】
（ベクシルクラスターの確認）
ここで、微分干渉顕微鏡と蛍光顕微鏡を用い、ベクシルクラスターの確認を行なった。ポリグリセリンポリリシノレートの重量％濃度が５％のベクシルクラスター分散液の微分干渉顕微鏡像を図５に、蛍光顕微鏡像を図６にそれぞれ示す。
【００５７】
この結果、ベクシルクラスターの膜が薄く染色されていることが確認でき、親油性の膜染色剤であるローダミン６Ｇがベクシルクラスターの親油性溶媒であるケロシンに溶解し、それが遠心分離によって沈降することで水相を取り込みながら二分子膜を形成していると考えられた。
【００５８】
そして次に、ポリグリセリンポリリシノレートの重量％濃度を４０％にして、上記と同様の確認を行なった。ベクシルクラスター分散液の微分干渉顕微鏡像を図７に、蛍光顕微鏡像を図８にそれぞれ示す。
【００５９】
この結果、クラスターにおけるカプセルの数が多いことに加え、膜にローダミン６Ｇが組み込まれる様子もより鮮明に得ることができた。
【００６０】
（蛍光観察）
そして、上記得られたベクシルクラスターを用い、蛍光観測を行なった。蛍光観察は、ＬＥＤ光源（フィルタ：７８０ｎｍ以下）をベシクルクラスターのサンプルに照射し、試料において励起した蛍光をモノクロカメラ（フィルタ：８１０ｎｍ以上）で観察した。なお、試料は、インドシアニングリーンの濃度をパラメータとしてふり、形成したベシクルクラスターの分散液１００μＬをプラスチックケースに入れて作成した。なおＬＥＤ光源及びモノクロカメラとサンプルとの距離は約２０ｃｍとした。この結果を図９に示す。
【００６１】
この結果、インドシアニングリーンの濃度が３．２×１０−２ｍＭの場合に最も強い蛍光を確認することができた。また、この場合における蛍光強度のプロファイルを図１０に示しておく。なおこの結果から、低濃度では、励起される分子数が少ないために蛍光強度が低い一方、高濃度としすぎると未励起分子と励起分子との衝突による消光や未励起分子同士の衝突による消光などが生じるためであろうと考えられる。
【００６２】
次に、卵黄レシチンの濃度をパラメータとしてふり、同様に蛍光観察を行なった。この結果を図１１に示す。
【００６３】
この結果、卵黄レシチンの濃度が上昇するにつれて蛍光強度も上昇することが確認できた。なお、この結果における蛍光強度のプロファイルを図１２に示しておく。なおこの結果は、卵黄レシチン濃度とインドシアニングリーンの蛍光強度には相関があることが見て取れる。これは、卵黄レシチンの疎水性部位にインドシアニングリーンの発色団部位が取り込まれることで、発色団部位の平面構造が維持され、吸収エネルギーが振動エネルギーとして熱変換されることを抑制でき、光学的に安定化したインドシアニングリーンの蛍光強度を得ることができることを意味していると考えられる。
【００６４】
（粘度測定）
一方、上記作成したベクシルクラスター分散液約０．５ｍＬを全量が約２ｍＬとなるようグルコース（１Ｍ）を溶解したＴＲＩＳ緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ７．７）に分散させた。そしてこの分散液の粘度をコーンプレート型レオメータにより測定した。測定は、温度２５℃の場合と３７℃の場合とで行なった。この結果を図１３、図１４に示しておく。
【００６５】
この結果、一般的に、ゼラチンのある場合の方が、ゼラチンがない場合よりも粘度が高くなっていることが確認できた。特に３７℃の場合、ゼラチンがある場合、ＰＧＰＲ重量％濃度が１０重量％より大きい場合、粘度が顕著に高くなっていくことが確認できた。
【００６６】
（ブタの胃における蛍光観察）
次に、ゼラチンを４５ｍｇ／ｍＬとなるように添加したベクシルクラスター分散液を、麻酔をかけたブタの胃の内壁粘膜下層へ内視鏡（バリクサー）を用いて約３００μＬ局所注射し、注射直後とその５時間後に、開腹した状態で外部から胃をＬＥＤ−モノクロカメラ観察装置で観察した。なおこの観察は、ゼラチンのあるベシクルクラスターを用いた状態、ゼラチンの無いベシクルクラスターを用いた状態のそれぞれにおいて行なった。なおその他の条件としては、ポリグリセリンポリリシノレート重量％濃度５重量％、卵黄レシチン濃度６０ｍＭ、インドシアニングリーン濃度は３．２×１０−２ｍＭとした。この結果の図を図１５（ゼラチン無し）、図１６（ゼラチン有り）にそれぞれ示しておく。
【００６７】
この結果、ゼラチン無しのベシクルクラスターの分散液を注射した場合では、注射直後であっても拡散していることが確認でき、５時間後には更に広範囲に拡散していることが確認できた。一方、ゼラチン添加ありのベシクルクラスター分散液を注射した場合、注射直後だけでなく、５時間経過しても殆ど拡散していない様子が確認できた。
【００６８】
この結果、臓器外側からでも位置の認識が可能であり、長時間局所的に留まることが可能な蛍光組織マーカー及びその製造方法を提供することができることを確認した。
【産業上の利用可能性】
【００６９】
本発明は、蛍光組織マーカーとして産業上の利用可能性がある。
【符号の説明】
【００７０】
１…ベシクルクラスター、２…ベシクル、３…親水性溶媒、４…カプセル
【特許請求の範囲】
【請求項１】
リン脂質と近赤外蛍光色素が複合して形成されたベシクルを親水性溶媒に内包させ、乳化剤により複数のカプセルを形成、凝集させたベシクルクラスターを有する蛍光組織マーカー。
【請求項２】
前記近赤外蛍光色素は、インドシアニングリーン及びその誘導体、ブリリアントグリーン及びその誘導体の少なくともいずれかである請求項１記載の蛍光組織マーカー。
【請求項３】
前記リン脂質は、レシチン及びフォスファチジルコリンの少なくともいずれかである請求項１記載の蛍光組織マーカー。
【請求項４】
前記親水性溶媒は、水と食用増粘剤を含む、請求項１記載の蛍光組織マーカー。
【請求項５】
第一の親水性溶媒に近赤外蛍光色素とリン脂質を加えて攪拌し、
疎水性溶媒に、前記第一の親水性溶媒と乳化剤を加えて懸濁液を形成し、
前記懸濁液と第二の親水性溶媒とを用いて遠心分離する、蛍光組織マーカーの製造方法。
【請求項６】
前記リン脂質は、レシチン及びフォスファチジルコリンの少なくともいずれかである請求項５記載の蛍光組織マーカーの製造方法。
【請求項７】
前記第一の親水性溶媒は、水と食用増粘剤を含む、請求項５記載の蛍光組織マーカーの製造方法。
【請求項１】
リン脂質と近赤外蛍光色素が複合して形成されたベシクルを親水性溶媒に内包させ、乳化剤により複数のカプセルを形成、凝集させたベシクルクラスターを有する蛍光組織マーカー。
【請求項２】
前記近赤外蛍光色素は、インドシアニングリーン及びその誘導体、ブリリアントグリーン及びその誘導体の少なくともいずれかである請求項１記載の蛍光組織マーカー。
【請求項３】
前記リン脂質は、レシチン及びフォスファチジルコリンの少なくともいずれかである請求項１記載の蛍光組織マーカー。
【請求項４】
前記親水性溶媒は、水と食用増粘剤を含む、請求項１記載の蛍光組織マーカー。
【請求項５】
第一の親水性溶媒に近赤外蛍光色素とリン脂質を加えて攪拌し、
疎水性溶媒に、前記第一の親水性溶媒と乳化剤を加えて懸濁液を形成し、
前記懸濁液と第二の親水性溶媒とを用いて遠心分離する、蛍光組織マーカーの製造方法。
【請求項６】
前記リン脂質は、レシチン及びフォスファチジルコリンの少なくともいずれかである請求項５記載の蛍光組織マーカーの製造方法。
【請求項７】
前記第一の親水性溶媒は、水と食用増粘剤を含む、請求項５記載の蛍光組織マーカーの製造方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【公開番号】特開２０１０−２６５２３１（Ｐ２０１０−２６５２３１Ａ）
【公開日】平成２２年１１月２５日（２０１０．１１．２５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−１１９３３８（Ｐ２００９−１１９３３８）
【出願日】平成２１年５月１５日（２００９．５．１５）
【出願人】（３０４０２１８３１）国立大学法人 千葉大学 (601)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年１１月２５日（２０１０．１１．２５）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年５月１５日（２００９．５．１５）
【出願人】（３０４０２１８３１）国立大学法人 千葉大学 (601)
【Ｆターム（参考）】
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