蛍光顕微鏡用全反射バイオチップ及びその製法、並びに蛍光顕微鏡用全反射バイオチップアセンブリ
【課題】低コストで大量生産することができ、再利用が可能であり、さらには種々の標本配設手段を適用することができる蛍光顕微鏡用全反射バイオチップを提供する。
【解決手段】全反射蛍光観察される標本１２が第１の面に設けられた標本配設手段Ｓの第２の面が密接される当接面１ａを有するチップ本体１と、光源からの照明光を前記標本配設手段Ｓの第１の面と標本１２との境界面に照射して全反射させ当該標本側にエバネッセント光を滲み出させるとともに、全反射した照射光を外部に導出するためのレンズ系２とが、実質的に透明な材料で一体に成形されている
【解決手段】全反射蛍光観察される標本１２が第１の面に設けられた標本配設手段Ｓの第２の面が密接される当接面１ａを有するチップ本体１と、光源からの照明光を前記標本配設手段Ｓの第１の面と標本１２との境界面に照射して全反射させ当該標本側にエバネッセント光を滲み出させるとともに、全反射した照射光を外部に導出するためのレンズ系２とが、実質的に透明な材料で一体に成形されている
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は蛍光顕微鏡用全反射バイオチップ及びその製法、並びに蛍光顕微鏡用全反射バイオチップアセンブリに関する。
【背景技術】
【０００２】
様々な機能性蛍光試薬（イオン感受性蛍光試薬やＣａｇｅｄ化合物など）や蛍光性蛋白質（ＧＦＰなど）の開発により、分子・細胞生物学の研究において蛍光顕微鏡が重要なツールとなっている。蛍光観察の原理は、一般的に蛍光性のない生物標本に蛍光性物質を導入し（又は蛍光性蛋白を発現させ）、観察対象となる分子や構造を「光る画像」としてとらえることである。
【０００３】
かかる蛍光観察のうち、光軸方向全体に励起光を照射して、その中で発する蛍光を観察する「落射蛍光観察」が従来より用いられていたが、最近、さらなる観察法として、「全反射照明蛍光観察法」が注目されている。この「全反射照明蛍光観察法」では、カバーガラス近傍のごく限定された領域（カバーガラス表面から１００〜１５０ｎｍ程度）にのみ励起光（エバネッセント光）を発生させ、その限定された領域における励起により生じる蛍光現象を観察する。このような特殊な励起方法を用いることにより、境界面近傍でのみ起こる現象の画像化や背景光の少ない高感度の蛍光分子検出が可能になる。
【０００４】
前記「全反射照明蛍光観察法」を行うためには、標本が設けられたカバーガラスと当該標本との境界面に光源からの光を照射して全反射させ前記エバネッセント光を発生させるとともに、全反射した照射光を外部に導出するためのレンズ系を設ける必要がある。
【０００５】
非特許文献１には、このレンズ系と、光源からの光を導く光ファイバと、前記標本が設けられるカバーガラスとを一体化したバイオチップが記載されている。このバイオチップは、図２２に示されるように、シリコン基板２０の上面（図２２において上方の面）にＳＵ−８からなる厚膜レジスト２１が設けられており、また、この厚膜レジスト２１上には、光源からの光をチップ内に導入するマルチモード光ファイバ２６が配置されている。
【０００６】
さらに、厚膜レジスト２１の上面には、いずれもＳＵ−８からなるスペーサ２３、プリズム２４及び柱状レンズ２５が配置されている。また、これらスペーサ２３、プリズム２４などの上面には、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）からなるプレート２７が配設されている。観察対象物である標本２８は、厚膜レジスト２１の上面であって、スペーサ２３とプリズム２４との間のスペースに設けられている。マルチモード光ファイバ２６の先端から照射されたレーザ光２９は、柱状レンズ２５及びプリズム２４を経由して厚膜レジスト２１と標本２８との境界面に達し、この境界面で全反射をし、標本２８側の限定された領域にエバネッセント光を発生させる。そして、標本から発せられる蛍光は、図２２において、例えばプレート２７の上方に配設される対物レンズ（図示せず）を介してＣＣＤカメラなどの撮像手段（図示せず）に取り込まれる。また、前記境界面で全反射をしたレーザ光２９は、シリコン基板２０の上面に配置されたマルチモード光ファイバ２２を経由して外部に導出される。
【０００７】
【非特許文献１】Ｓｈｉｈ−Ｈａｏ Ｈｕａｎｇ ａｎｄ Ｆａｎ−Ｇａｎｇ Ｔｓｅｎｇ，“Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ａ ｍｏｎｏｌｉｔｈｉｃ ｔｏｔａｌ ｉｎｔｅｒｎａｌｒｅｆｌｅｃｔｉｏｎ−ｂａｓｅｄ ｂｉｏｃｈｉｐ ｕｔｉｌｉｚｉｎｇ ａ ｍｉｃｒｏｐｒｉｓｍ ａｒｒａｙ ｆｏｒ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｓｅｎｓｉｎｇ”，Ｊｏｕｎａｌ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｍｅｃａｎｉｃｓ ａｎｄ Ｍｉｃｒｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，１５（２００５），ｐｐ２２３５−２２４２
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
しかしながら、非特許文献１のバイオチップは、微細加工法によって当該チップを構成する各要素を作製しており、これら要素をチップ毎に組み立てる必要があることから、作製するのに時間と労力を要し、大量生産するのが困難である。
【０００９】
本発明は、このような事情に鑑みてなされたものであり、作製が容易であり、大量生産に向いている蛍光顕微鏡用全反射バイオチップ及びその製法、並びに蛍光顕微鏡用全反射バイオチップアセンブリを提供することを目的としている。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明の蛍光顕微鏡用全反射バイオチップは、全反射蛍光観察される標本が第１の面に設けられた標本配設手段の第２の面が密接される当接面を有するチップ本体と、光源からの照明光を前記標本配設手段の第１の面と標本との境界面に照射して全反射させ当該標本側にエバネッセント光を滲み出させるとともに、全反射した照射光を外部に導出するためのレンズ系とが、実質的に透明な材料で一体に成形されていることを特徴としている。
【００１１】
本発明の蛍光顕微鏡用全反射バイオチップでは、標本配設手段（標本が塗布又は配置される面を有するガラスプレートなどの手段）が密接される当接面を有するチップ本体と、レンズ系とが一体成形されているので、構造が簡略化されるとともに、使用材料の種類が少なくなる。したがって、製造が容易であり、大量生産に向いている。その結果、低コストで製造することができる。また、バイオチップが、標本が塗布されるガラスプレートなどの標本配設手段とは別体になっているので、ガラススライド、フローセル、マイクロチャンネルなどの中から、標本の種類や観察条件などに応じて最適の標本配設手段を選択することができる。これらの標本配設手段は、特別の接着剤などを用いることなく、単にバイオチップと標本配設手段の面同士を当接させるだけで材料の付着力（ファンデルワールス力）により簡単に付着させることができる。さらに、標本配設手段が、バイオチップとは別体であるので、標本の種類に応じた表面処理（機能性蛍光試薬の塗布などの処理）を容易に行うことができる。そして、観察終了後に標本配設手段を剥がしたバイオチップは、消耗ないしは損傷部分がないので、他の標本を観察するのに再利用することができる。
【００１２】
また、前記蛍光顕微鏡用全反射バイオチップにおいて、前記レンズ系を、前記チップ本体上の異なる位置に配設された複数のレンズ部を備えたものとし、かつ、前記複数のレンズ部を、前記エバネッセント光を滲み出させる一つの領域に対して相異なる波長の前記照明光を複数の方向から照射させる位置にそれぞれ配設することができる。
この蛍光顕微鏡用全反射バイオチップでは、チップ本体上の異なる位置に配設された複数のレンズ部が、エバネッセント光を滲み出させる一つの領域に対して、相異なる波長の照明光を複数の方向からそれぞれ照射させるので、当該照明光によりそれぞれ形成される複数のエバネッセント場が、前記一つの領域で重ね合わされる。その結果、一つの領域において、複数のエバネッセント光による複数の観察対象（蛍光対象）を、同時に検出することが可能となる。
【００１３】
また、レンズ系が複数のレンズ部を備えている前記蛍光顕微鏡用全反射バイオチップは、前記複数のレンズ部が前記一つの領域を挟んで対称に配置されている構成とすることができる。この場合、複数のレンズ部が対称に配置されていることから、チップの構造が簡略化されたものとなる。
または、前記複数のレンズ部が前記一つの領域を中心として放射状に配置されている構成とすることができる。この場合、チップ本体上に複数のレンズ部を配設することが可能となり、多くの照明光を、前記一つの領域に照射することができる。さらに、放射状に配置されているレンズ部を通じて、照明光を前記一つの領域に照射させることで、多くの照明光によってそれぞれ生じさせるエバネッセント場を、容易に重ね合わせることができる。
【００１４】
また、本発明の蛍光顕微鏡用全反射バイオチップアセンブリは、前記バイオチップと、このバイオチップの前記当接面に密接される標本配設手段とを有しており、この標本配設手段が、スペーサを介して対向して配置された一対のガラススライドからなり、両ガラススライド間に全反射蛍光観察される標本が充填されていることを特徴としている。
【００１５】
本発明の蛍光顕微鏡用全反射バイオチップアセンブリでは、前述した効果に加えて、標本配設手段が透明な一対のガラススライドからなっているので、バイオチップの両面からの観察が可能であり、正立型顕微鏡だけでなく、倒立型顕微鏡を用いた観察を行うことができ、観察のためのシステム設計の自由度を向上させることができる。
【００１６】
さらに、本発明の蛍光顕微鏡用全反射バイオチップの製法は、前記バイオチップを製造する方法であって、エッチングを含む微細加工をウェハに施して前記チップ本体及びレンズ系のための金型を作製するステップと、前記金型を用いて実質的に透明な材料によりバイオチップを一体成形するステップとを含むことを特徴としている。
【００１７】
本発明の蛍光顕微鏡用全反射バイオチップの製法では、まず金型を作製し、この金型を用いてチップ本体及びレンズ系を含むバイオチップを製造しており、バイオチップを構成する要素の組立工程が不要であるので、当該バイオチップを低コストで大量生産することができる。
【００１８】
また、前記レンズ系が複数のレンズ部を備えている前記蛍光顕微鏡用全反射バイオチップを製造する方法は、エッチングを含む微細加工をウェハに施して前記チップ本体及びレンズ系のための金型を作製する金型作製ステップと、前記金型を用いて実質的に透明な材料によりバイオチップを一体成形するチップ成形ステップとを含み、前記チップ成形ステップには、異なる方向から照射された相異なる波長の複数の前記照明光を前記一つの領域に到達させる光路を前記チップ本体が有するように、当該チップ本体の厚さを設定する、厚さ設定ステップが含まれていることを特徴としている。
【００１９】
このような、レンズ系が複数のレンズ部を備えている蛍光顕微鏡用全反射バイオチップの製法によれば、チップ本体の厚さを設定してバイオチップを一体成形することにより、当該バイオチップは、複数の方向から照射される相異なる波長の照明光を、前記一つの領域に到達させることができる。このように、相異なる波長の複数の照明光によりそれぞれ形成されるエバネッセント場を、一つの領域で重ね合わせることのできるバイオチップが得られる。
【発明の効果】
【００２０】
本発明の蛍光顕微鏡用全反射バイオチップによれば、低コストで大量生産することができ、再利用が可能であり、さらには種々の標本配設手段を適用することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】
以下、添付図面を参照しつつ、本発明の蛍光顕微鏡用全反射バイオチップ（以下、単に「バイオチップ」ともいう）及びその製法、並びに蛍光顕微鏡用全反射バイオチップアセンブリ（以下、単に「アセンブリ」ともいう）について詳細に説明する。
【００２２】
［実施の形態１］
図１は、本発明の実施の形態１に係るアセンブリＡの断面説明図である。このアセンブリＡは、チップ本体１とレンズ系２とを備えたバイオチップＢと、このバイオチップＢに付着させて用いる標本配設手段Ｓとからなっている。
この標本配設手段Ｓは、紙製のスペーサ３を介して対向して配置された一対のガラススライド４からなっており、この一対のガラススライド４間に全反射蛍光観察される標本１２が充填されている。
【００２３】
前記チップ本体１は、一方のガラススライド４の片面（第２の面。図１において、上側のガラススライド４の上面）が当接される当接面１ａを有している。レンズ系２は、断面台形状のプリズム２ａと、柱状レンズ２ｂとで構成されており、光源（図示せず）からの照明光を上側のガラススライド４の下面（第１の面）と標本１２との境界面に照射して全反射させ当該標本側にエバネッセント光を滲み出させるとともに、前記境界面で全反射した照明光を外部に導出する役割を果たす。前記プリズム２ａと柱状レンズ２ｂは、チップ本体１の、前記標本配設手段Ｓが設けられる側とは反対側に設けられている。前記レンズ系２と前記チップ本体１とは実質的に透明な材料であるポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）により一体に成形されている（一体に継目無く成形されている）。図２２に示される従来技術では、５３２ｎｍなどの光源波長において、ＳＵ−８の自家蛍光によって画像上Ｓ／Ｎ比が低くなるという問題があるが、このＰＤＭＳで作製すると、５３２ｎｍなどの光源波長において自家蛍光することがなく、Ｓ／Ｎ比の低下という問題を克服することができる。なお、ＰＤＭＳに代えて、例えばＰＭＭＡなど他の材料を用いることもできる。ＰＭＭＡの場合、ＵＶ照明光に対して自家蛍光がない。
【００２４】
また、チップ本体１は、光源からの光をチップ内に導入する光ファイバ５の先端部が当接するストッパー６及び当該光ファイバ５を保持するＶ型溝７ａを有する保持部７（図１０参照）を備えており、これらストッパー６及び保持部７も、チップ本体１と同じ材料（ＰＤＭＳ）で当該チップ本体１と一体に成形されている。なお、図１において、８は集光するための光トラップである。
【００２５】
光ファイバ５の先端から導出されたレーザ光９は、前記柱状レンズ２ｂ及びプリズム２ａを経由して、標本配設手段Ｓを構成する上側のガラススライド４内に照射され、さらにこの上側のガラススライド４の下面と標本との境界面で全反射する。この全反射した照明光は、前記上側のガラススライド４及びプリズム２ａを経由して、当該プリズム２ａの端面から外部に照射され、この照射光を光トラップ８が受光する。
【００２６】
一方、前記境界面から標本側のごく限られた領域で発生するエバネッセント光の励起により生じる蛍光現象は、標本配設手段Ｓの下方に配置された対物レンズ１０を経由してＣＣＤカメラなどの撮像手段（図示せず）に取り込まれる。なお、図１において、１１は、前記エバネッセント光が発生する領域であるエバネッセント場を示している。
【００２７】
本実施の形態に係るバイオチップＢでは、チップ本体１、レンズ系２、ストッパー６及び保持部７が一体成形されているので、構造が簡略化されるとともに、使用材料の種類が少なくなる。したがって、製造が容易であり、大量生産に向いている。その結果、低コストで製造することができる。前記一体成形は、溶融材料を金型内に注入することで行うこともできるし、ホット型押し付け機を用いて行うこともできる。
【００２８】
また、バイオチップＢは、一対のガラススライド４からなる標本配設手段Ｓとは別体になっているので、ガラススライドに限らず、標本の種類や観察条件などに応じて、フローセル、マイクロチャンネルなど他の標本配設手段を選択することができる。これらの標本配設手段は、特別の接着剤などを用いることなく、単に面同士を当接させるだけで材料の付着力（ファンデルワールス力）により簡単に固着させることができる。さらに、標本配設手段Ｓが、バイオチップＢとは別体であるので、標本の種類に応じた表面処理（機能性蛍光試薬の塗布などの処理）を容易に行うことができる。そして、観察終了後に標本配設手段Ｓを剥がしたバイオチップＢは、消耗ないしは損傷部分がないので、他の標本を観察するのに再利用することができる。
【００２９】
また、前記アセンブリＡは、標本配設手段Ｓが透明な一対のガラススライド４からなっているので、バイオチップＢの両面からの観察が可能であり、正立型顕微鏡だけでなく、倒立型顕微鏡を用いた観察を行うことができ、観察のためのシステム設計の自由度を向上させることができる。
【００３０】
つぎに、図２〜１０を参照しつつ、前述したバイオチップＢの製法を説明する。このバイオチップＢは、従来のシリコンウェハの微細加工技術とＰＤＭＳの成型技術を用いて製造することができる。なお、図２〜１０では、分かり易くするために、膜や層の厚さを誇張して描いている。また、図示した例では、柱状レンズ２ｂ及びプリズム２ａからなるレンズ系２とともに、ストッパー６及び保持部７がチップ本体１と一体化されている。
【００３１】
（１）シリコンウェハの熱酸化（図２参照）
まず、厚さ３００〜５００μｍのシリコンウェハ４０に熱酸化処理を施して、当該シリコンウェハ４０の両面に厚さ３００〜５００ｎｍのＳｉＯ2層４１を形成する。酸素及び水素を、例えばそれぞれ１．１及び０．５ｓｌｍの流量で流しつつ、１１００℃の温度下で１７０分間酸化させる。
なお、ＳｉＯ2層に代えて、ＣＶＤ装置を用いたチッ化処理によりシリコンウェハにＳｉＮX層を形成してもよい。
【００３２】
（２）ＳｉＯ2層４１のパターニング（図３参照）
ついで、シリコンウェハ４０の両面のＳｉＯ2層４１をフォトリソグラフィ工程及びＢＨＦ（ｂｕｆｆｅｒ ｈｙｄｒｏｆｌｕｏｒｉｃ ａｃｉｄ）エッチングによりパターニングする。
まずシリコンウェハ４０の上面に、前記プリズム２ａ及び保持部７のパターンがフォトリソグラフィ工程及びＢＨＦエッチングにより形成され、一方、シリコンウェハ４０の下面に、前記柱状レンズ２ｂのパターンがフォトリソグラフィ工程及びＢＨＦエッチングにより形成される。
【００３３】
より詳細には、まず、シリコンウェハ４０の下面をフォトレジスト膜により保護する。ついで、フォトレジスト膜との密着性を高めるためにシリコンウェハ４０の上面に、ＯＡＰ（ＯＦＰＲ Ａｄｈｅｓｉｖｅ Ｐｒｏｍｏｔｏｒ）を加熱して発生する蒸気を当てる。ついで、シリコンウェハ４０の上面にスピンコーティング法によりフォトレジスト膜を形成し、さらにフォトリソグラフィ工程により所定のパターニングを行う。フォトレジスト膜を現像した後に、ＢＨＦエッチング処理を行い、ついで残っているフォトレジスト膜を除去する（図３の（ｃ）参照）。
【００３４】
つぎに、シリコンウェハ４０の下面のＳｉＯ2層４１をエッチング処理するに先立って、シリコンウェハ４０の上面をフォトレジスト膜により保護する。ついで、フォトレジスト膜との密着性を高めるためにシリコンウェハ４０の下面に、ＯＡＰを加熱して発生する蒸気を当てる。ついで、シリコンウェハ４０の下面にスピンコーティング法によりフォトレジスト膜を形成し、さらにフォトリソグラフィ工程により所定のパターニングを行う。フォトレジスト膜を現像した後に、ＢＨＦエッチング処理を行い、ついで残っているフォトレジスト膜を除去する（図３の（ｂ）参照）。
【００３５】
（３）下面へのアルミ薄膜の蒸着及びアルミエッチング（図４参照）
ついで、シリコンウェハ４０の下面にアルミ薄膜４２を蒸着し、フォトリソグラフィとアルミエッチング処理を行う。
より詳細には、まずアルミニウムを蒸着させてシリコンウェハ４０の下面にアルミ薄膜４２を形成する（図４の（ｂ）参照）。ついで、フォトレジスト膜との密着性を高めるためにシリコンウェハ４０の下面に、ＯＡＰを加熱して発生する蒸気を当てる。ついで、シリコンウェハ４０の下面にスピンコーティング法によりフォトレジスト膜を形成し、さらにフォトリソグラフィ工程により所定のパターニングを行う。フォトレジスト膜を現像した後に、アルミエッチング処理を行い、ついで残っているフォトレジスト膜を除去する（図４の（ｃ）参照）。
なお、アルミニウム薄膜４２に代えて、Ａｕなど他の金属の薄膜をスパッタリング又は蒸着によりシリコンウェハ４０の下面に形成することもできる。
【００３６】
（４）上面のＴＭＡＨエッチング（図５参照）
ついで、下面に形成したアルミ薄膜を保護しつつ、上面側のシリコンをＴＭＡＨ溶液（水酸化テトラメチルアンモニウム水溶液）でエッチングする。
より詳細には、まず、シリコンウェハ４０の下面にＰＤＭＳフィルム及び保護ジグを利用して、当該シリコンウェハ４０の下面に形成したアルミ薄膜４２を保護する。ついで、シリコンウェハ４０の上面を、ＴＭＡＨ溶液で異方性エッチング処理を行う。
なお、ＴＭＡＨ溶液による異方性エッチング処理に代えて、ＫＯＨ溶液を用いた異方性エッチング処理を採用することができる。この場合、ＳｉＮXからなるマスキング層を用いるのが好ましい。
【００３７】
（５）下面の反応性イオンエッチング（図６参照）
ついで、下面のシリコンを反応性イオンエッチング（ＩＣＰ−ＲＩＥ）法で貫通エッチングする。
（６）ＳｉＯ2層４１とアルミ薄膜４２の除去（図７参照）
ついで、シリコンウェハ４０の上面及び下面のＳｉＯ2層４１、及び下面のアルミ薄膜４２を除去する。
より詳細には、まずアルミエッチング溶液を用いてシリコンウェハ４０の下面のアルミ薄膜４２を除去し、つぎに、ＢＨＦ溶液を用いてＳｉＯ2層４１を除去する。これにより、チップ本体、レンズ系及び保持部を一体化して作製するためのシリコン金型４３を得ることができる。
【００３８】
（７）ガラススライドへの固着（図８参照）
ついで、得られたシリコン金型４３の下面をエポキシ系の接着剤４４を用いてガラススライド１４に固着する。ガラススライド１４としては、例えば３２×３２ｍｍの大きさで、厚さ０．１２〜０．１７ｍｍのものを用いることができる。エポキシ系の接着剤以外は陽極接合や癒着接合などでシリコンとガラス接合できる（以上、金型作製ステップ）。
（８）ＰＤＭＳの注入（図９参照）
ついで、前記シリコン金型４３を含む金型内に溶融したＰＤＭＳを注入し、その後大気下で２０〜４０分間ガス抜きを行い、さらに７０〜１００℃で約３０分間、オーブンで硬化させる。
（９）離型（図１０参照）
ついで、硬化したＰＤＭＳ製品をシリコン金型４３から剥がすことで、柱状レンズ２ｂ及びプリズム２ａからなるレンズ系２並びに保持部７がチップ本体１と一体化されたバイオチップＢを得ることができる（以上、チップ成形ステップ）。
【００３９】
以上のようにして製造されたバイオチップＢ（図１）は、光ファイバ５の先端部から導出された所定の波長のレーザ光９を、エバネッセント光を滲み出させる領域に対して一方向から照射するために、バイオチップＢのレンズ系２は、プリズム２ａとレンズ２ｂとで構成された一組のレンズ部を備えている。
このバイオチップＢを備えているアセンブリＡによれば、全反射照明を用いた低バックグラウンドノイズでの高感度蛍光分子検出が可能となる。そして、このアセンブリＡは、細胞膜や一分子計測等の生化学分野をはじめとする様々な分野における蛍光物質の検出に用いられる。なお、このバイオチップＢのように単一の光ファイバ５が用いられている場合であっても、この光ファイバ５の基部側にカップリング部（図示せず）を設け、このカップリング部に接続する光源を変更することにより、光の波長を変更することができ、任意の波長による励起が可能となる。また、水銀光のように波長に幅を持たせた光を、光ファイバ５を介してチップ内に導入することも可能である。
【００４０】
さらに、近年では、複数種類（例えば二種類）の蛍光分子の検出や蛍光相互相関分光法のために、複数波長同時励起（例えば二波長同時励起）による全反射照明法が提案されている。しかし、従来における、二波長同時励起のために用いられている対物レンズ型やプリズム型等の様々な光学機構は、大型であり、高価であり、また、複雑な組み立てが必要である。このため従来の光学機構は、作製が困難であり、大量生産には不向きである。
【００４１】
そこで、作製が容易でかつ大量生産に向いている、複数波長同時励起による蛍光顕微鏡用全反射バイオチップ（以下、単に「バイオチップ」ともいう）及びその製法、並びに蛍光顕微鏡用全反射バイオチップアセンブリ（以下、単に「アセンブリ」ともいう）について説明する。
【００４２】
［実施の形態２］
図１１は、本発明の実施の形態２に係るアセンブリＡ２の断面説明図である。このアセンブリＡ２は、前記実施の形態（図１参照）と同様に、チップ本体５１とレンズ系５２とを備えたバイオチップＢ２と、このバイオチップＢ２に付着させて用いる標本配設手段Ｓ２とからなっており、標本配設手段Ｓ２は、スペーサ５３を介して対向して配置された一対のガラススライド５４からなっており、この一対のガラススライド５４間に全反射蛍光観察される標本６２が充填されている。
【００４３】
前記チップ本体５１は、一方のガラススライド５４の片面（第２の面。図１１において、上側のガラススライド５４の上面）が当接される当接面５１ａを有している。前記レンズ系５２は、チップ本体５１上の異なる位置（図１１において、長手方向の両側の異なる位置）に配設された二つのレンズ部３１，３２を備えている。第１のレンズ部３１は、断面台形状（四角錐台形状）のプリズム３３の一部３３ａ（図１１では左側部分）と、柱状レンズ５２ｂとで構成されており、第１の光源（図示せず）からの照明光を上側のガラススライド５４の下面（第１の面）と標本６２との境界面に照射して全反射させ当該標本側にエバネッセント光を滲み出させる役割を果たす。第２のレンズ部３２は、前記プリズム３３の他部３３ｂ（図１１では右側部分）と、柱状レンズ１５２ｂとで構成されており、第２の光源（図示せず）からの照明光を前記境界面に照射して全反射させ当該標本側にエバネッセント光を滲み出させる役割を果たす。なお、前記第１の光源からチップ内に導入される照明光の波長λ１と、前記第２の光源からチップ内に導入される照明光の波長λ２とは異なっている。また、プリズム３３は、各方向から前記境界面に照射して全反射した照明光を外部に導出する役割を果たす。そして、この実施の形態２では、第１のレンズ部３１と第２のレンズ部３２とが一つのプリズム３３を兼用している。
【００４４】
プリズム３３と柱状レンズ５２ｂ，１５２ｂは、チップ本体５１の、前記標本配設手段Ｓ２が設けられる側とは反対側に設けられている。プリズム３３及び柱状レンズ５２ｂ，１５２ｂと、前記チップ本体５１とは、実質的に透明な材料であるポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）により継目無く一体に成形されている。
【００４５】
また、チップ本体５１には、第１のレンズ部３１に照明光を導出する光ファイバ５５の先端部を取り付けるための第１取付部３６と、第２のレンズ部３２に照明光を導出する光ファイバ１５５の先端部を取り付けるための第２取付部３７とが設けられている。第１取付部３６は、光ファイバ５５の先端部が当接するストッパー５６、当該光ファイバ５５を保持するＶ型溝５７ａを有する保持部５７（図２０参照）を備えている。これと同様に、第２取付部３７は、光ファイバ１５５の先端部のためのストッパー１５６及び保持部１５７を備えている。これらストッパー５６，１５６及び保持部５７，１５７も、チップ本体５１と同じ材料（ＰＤＭＳ）で当該チップ本体５１と継目無く一体に成形されている。
【００４６】
二つのレンズ部３１，３２の配置及び構成を説明する。前記二つのレンズ部３１，３２は、エバネッセント光を滲み出させる一つの領域（エバネッセント場６１を生じさせる領域）Ｅに対して、相異なる波長λ１，λ２の二つの照明光（レーザ光）５９，１５９を二方向から照射して全反射させることのできる位置にそれぞれ配設されている。そして、図１１の実施の形態では、二つのレンズ部３１，３２は、エバネッセント光を滲み出させる前記一つの領域Ｅを挟んで、左右対称に配置されている。
【００４７】
具体的に説明すると、チップ本体５１は一方向（図１１では左右方向）に長い板状に形成されている。プリズム３３の左右方向の中心が、チップ本体５１の左右方向の中心と一致するように、当該プリズム３３は形成されている。第１のレンズ部３１の柱状レンズ５２ｂは、プリズム３３の左右方向の中心よりも長手方向の一方側（図１１では左側）に設けられており、第２のレンズ部３２の柱状レンズ１５２ｂは、前記中心よりも長手方向の他方側（図１１では右側）に設けられている。柱状レンズ５２ｂと柱状レンズ１５２ｂとは、プリズム３３の左右方向の中心に対して対称の配置にある。そして、プリズム３３の前記中心が、エバネッセント光を滲み出させる前記一つの領域Ｅの直上位置にある。また、光ファイバ５５，１５５の先端部を取り付けるための二つの取付部３６，３７も、プリズム３３の前記中心に対して、対称の配置である。
【００４８】
この配置及び構成により、図１１の左側の光ファイバ５５の先端から導出されたレーザ光５９は、前記第１のレンズ部３１を経由して、上側のガラススライド５４内に照射され、さらにこの上側のガラススライド４の下面と標本との境界面にある所定領域で全反射する。そして、右側の光ファイバ１５５の先端から導出されたレーザ光１５９は、前記第２のレンズ部３２を経由して、上側のガラススライド５４内に照射され、前記境界面の前記所定領域で全反射する。そして、前記所定領域が、エバネッセント光を滲み出させる前記一つの領域Ｅである。すなわち、第１のレンズ部３１は、エバネッセント光を滲み出させる一つの領域Ｅに対して、第１の波長λ１のレーザ光５９を、長手方向の一方側から他方側へ向かう方向に照射させて全反射させることができる配置及び構成となっている。そして、第２のレンズ部３２は、前記一つの領域Ｅに対して、第２の波長λ２のレーザ光１５９を、長手方向の他方側から一方側へ向かう方向に照射させて全反射させることができる配置及び構成となっている。
【００４９】
このように、チップ本体５１上の二つの異なる位置にそれぞれ配設された二つのレンズ部３１，３２が、エバネッセント光を滲み出させる一つの同じ領域Ｅに対して、相異なる二つの波長λ１，λ２の照明光を、二方向からそれぞれ照射して全反射させることで、当該照明光によりそれぞれ形成されるエバネッセント場を重ね合わせることができる。すなわち、第１の光源からの照明光（第１の波長λの光）によって励起されエバネッセント光を滲み出させる領域と、第２の光源からの照明光（第２の波長λ２の光）によって励起されエバネッセント光を滲み出させる領域と、が重ね合わされる。
【００５０】
この結果、前記一つの同じ領域Ｅにおいて、第１の波長λ１による励起光（エバネッセント光）を発生させ、当該励起により生じる第１の蛍光現象を観察することができ、かつ、第２の波長λ２による励起光（エバネッセント光）を発生させ、当該励起により生じる第２の蛍光現象を観察することができる。このため、蛍光色が第１の蛍光現象と第２の蛍光現象とで異なることにより、前記一つの同じ領域Ｅにおいて、二種類（二色）の蛍光対象を区別して同時に検出することが可能となる。
そして、ガラススライド５４の下面（第１の面）と標本６２との境界面から標本側のごく限られた前記領域Ｅで発生するエバネッセント光の励起により生じた前記蛍光現象は、標本配設手段Ｓ２の下方に配置された対物レンズ６０を経由してＣＣＤカメラなどの撮像手段（図示せず）に取り込まれる。低倍率の対物レンズ６０を用いることで、例えば細胞全体における複数の蛍光分子（蛍光対象）のそれぞれの挙動の観察が可能となり、高倍率の対物レンズ６０を用いることで、蛍光分子レベルの観察が可能となる。なお、図１１において、６１は、前記エバネッセント光が発生する領域Ｅであるエバネッセント場を示している。
【００５１】
つぎに、図１２〜２０を参照しつつ、図１１に示したバイオチップＢ２の製法を説明する。このバイオチップＢ２は、図１の実施の形態と同様に、従来のシリコンウェハの微細加工技術とＰＤＭＳの成型技術を用いて製造することができる。なお、図１２〜２０では、分かり易くするために、膜や層の厚さを誇張して描いている。また、図示した例では、第１のレンズ部３１及び第２のレンズ部３２からなるレンズ系５２とともに、ストッパー５６，１５６及び保持部５７，１５７がチップ本体５１と一体化されている。また、第１のレンズ部３１と第２のレンズ部３２とが、プリズム３３の中心に対して対称となるように形成されている。
【００５２】
（１）シリコンウェハの熱酸化（図１２参照）
まず、厚さ３００〜５００μｍのシリコンウェハ９０に熱酸化処理を施して、当該シリコンウェハ９０の両面に厚さ３００〜５００ｎｍのＳｉＯ2層９１を形成する。酸素及び水素を、例えばそれぞれ１．１及び０．５ｓｌｍの流量で流しつつ、１１００℃の温度下で１７０分間酸化させる。
なお、ＳｉＯ2層に代えて、ＣＶＤ装置を用いたチッ化処理によりシリコンウェハにＳｉＮX層を形成してもよい。
【００５３】
（２）ＳｉＯ2層９１のパターニング（図１３参照）
ついで、シリコンウェハ９０の両面のＳｉＯ2層９１をフォトリソグラフィ工程及びＢＨＦ（ｂｕｆｆｅｒ ｈｙｄｒｏｆｌｕｏｒｉｃ ａｃｉｄ）エッチングによりパターニングする。
まずシリコンウェハ９０の上面に、前記プリズム３３のパターンがフォトリソグラフィ工程及びＢＨＦエッチングにより形成され、一方、シリコンウェハ９０の下面に、前記柱状レンズ５２ｂ，１５２ｂ、前記第１取付部３６及び前記第２取付部３７のパターンがフォトリソグラフィ工程及びＢＨＦエッチングにより形成される。
【００５４】
より詳細には、まず、シリコンウェハ９０の下面をフォトレジスト膜により保護する。ついで、フォトレジスト膜との密着性を高めるためにシリコンウェハ９０の上面に、ＯＡＰ（ＯＦＰＲ Ａｄｈｅｓｉｖｅ Ｐｒｏｍｏｔｏｒ）を加熱して発生する蒸気を当てる。ついで、シリコンウェハ９０の上面にスピンコーティング法によりフォトレジスト膜を形成し、さらにフォトリソグラフィ工程により所定のパターニングを行う。フォトレジスト膜を現像した後に、ＢＨＦエッチング処理を行い、ついで残っているフォトレジスト膜を除去する（図１３の（ｃ）参照）。
【００５５】
つぎに、シリコンウェハ９０の下面のＳｉＯ2層９１をエッチング処理するに先立って、シリコンウェハ９０の上面をフォトレジスト膜により保護する。ついで、フォトレジスト膜との密着性を高めるためにシリコンウェハ９０の下面に、ＯＡＰを加熱して発生する蒸気を当てる。ついで、シリコンウェハ９０の下面にスピンコーティング法によりフォトレジスト膜を形成し、さらにフォトリソグラフィ工程により所定のパターニングを行う。フォトレジスト膜を現像した後に、ＢＨＦエッチング処理を行い、ついで残っているフォトレジスト膜を除去する（図１３の（ｂ）参照）。
【００５６】
（３）下面へのアルミ薄膜の蒸着及びアルミエッチング（図１４参照）
ついで、シリコンウェハ９０の下面にアルミ薄膜９２を蒸着し、フォトリソグラフィとアルミエッチング処理を行う。
より詳細には、まずアルミニウムを蒸着させてシリコンウェハ９０の下面にアルミ薄膜９２を形成する（図１４の（ｂ）参照）。ついで、フォトレジスト膜との密着性を高めるためにシリコンウェハ９０の下面に、ＯＡＰを加熱して発生する蒸気を当てる。ついで、シリコンウェハ９０の下面にスピンコーティング法によりフォトレジスト膜を形成し、さらにフォトリソグラフィ工程により所定のパターニングを行う。フォトレジスト膜を現像した後に、アルミエッチング処理を行い、ついで残っているフォトレジスト膜を除去する（図１４の（ｃ）参照）。
なお、アルミニウム薄膜９２に代えて、Ａｕなど他の金属の薄膜をスパッタリング又は蒸着によりシリコンウェハ４０の下面に形成することもできる。
【００５７】
（４）上面のＴＭＡＨエッチング（図１５参照）
ついで、下面に形成したアルミ薄膜を保護しつつ、上面側のシリコンをＴＭＡＨ溶液（水酸化テトラメチルアンモニウム水溶液）でエッチングする。
より詳細には、まず、シリコンウェハ９０の下面にＰＤＭＳフィルム及び保護ジグを利用して、当該シリコンウェハ９０の下面に形成したアルミ薄膜４２を保護する。ついで、シリコンウェハ９０の上面を、ＴＭＡＨ溶液で異方性エッチング処理を行う。
なお、ＴＭＡＨ溶液による異方性エッチング処理に代えて、ＫＯＨ溶液を用いた異方性エッチング処理を採用することができる。この場合、ＳｉＮXからなるマスキング層を用いるのが好ましい。
【００５８】
（５）下面の反応性イオンエッチング（図１６参照）
ついで、下面のシリコンを反応性イオンエッチング（ＩＣＰ−ＲＩＥ）法で貫通エッチングする。
（６）ＳｉＯ2層４１とアルミ薄膜４２の除去（図１７参照）
ついで、シリコンウェハ４０の上面及び下面のＳｉＯ2層９１、及び下面のアルミ薄膜９２を除去する。
より詳細には、まずアルミエッチング溶液を用いてシリコンウェハ９０の下面のアルミ薄膜９２を除去し、つぎに、ＢＨＦ溶液を用いてＳｉＯ2層９１を除去する。これにより、チップ本体、レンズ系及び取付部を一体化して作製するためのシリコン金型９３を得ることができる。
【００５９】
（７）ガラススライドへの固着（図１８参照）
ついで、得られたシリコン金型９３の下面をエポキシ系の接着剤９４を用いてガラススライド６４に固着する（以上、金型作製ステップ）。
（８）ＰＤＭＳの注入（図１９参照）
ついで、前記シリコン金型９３を含む金型内に溶融したＰＤＭＳを注入し、その後大気下で２０〜４０分間ガス抜きを行い、さらに７０〜１００℃で約３０分間、オーブンで硬化させる。
（９）離型（図２０参照）
ついで、硬化したＰＤＭＳ製品をシリコン金型９３から剥がすことで、レンズ系５２、第１取付部３６及び第２取付部３７がチップ本体５１と一体化されたバイオチップＢ２を得ることができる。このバイオチップＢ２の第１のレンズ部３１と第２のレンズ部３２とは、プリズム３３の中心に対して対称となるようにして形成される（以上、チップ成形ステップ）。
【００６０】
図１９で説明したステップにおいて、溶融したＰＤＭＳをシリコン金型９３に注入する際、チップ本体５１の内の平板状のベース部６５（図１１参照）となる部分の厚さｔ１を設定する。例えば、ガラススライド５４の厚さを０．１７ｍｍとした場合、ベース部６５の厚さｔ１は６００μｍと設定される。この厚さｔ１は、以下の式（１）によって設定され、式（１）中の角度θｉ及び角度θ３等は、以下の式（２）〜式（８）の条件を満たすようにして求められる。
【００６１】
【数１】
【数２】
【数３】
【数４】
【数５】
【数６】
【数７】
【数８】
【００６２】
なお、前記式（１）〜式（８）及び図１１において、ｔ２はガラススライド５４の厚さ、ｔ３はプリズム３３の厚さ（ベース部６５の厚さｔ１を除いた厚さ）である。ｎAは外気における（空気の）屈折率、ｎPはバイオチップＢ２の屈折率、ｎGはガラススライド５４の屈折率、ｎWは標本６２の屈折率である。θ１はプリズム３３への入射角、θ２は屈折角、θ３はガラススライド５４への入射角、θｉは屈折角、θ４はプリズム３３の側面（入射面）の傾斜角度（例えば５４．７°）である。Ｌはプリズム３３の寸法であって、二方向から照射する照射光の入射点（ｔ３／２の高さ位置）における寸法である。Ｌ１は光ファイバの先端から照射光のプリズム３３の入射点までの距離であり、Ｌ２は、照射光のプリズム３３への入射点からエバネッセント光を滲み出させる前記一つの領域Ｅ（の中心点）までの距離である。左右方向の位置が、前記一つの領域Ｅ（の中心点）とプリズム３３の中心とで一致していることから、距離Ｌ２は、プリズム３３の前記寸法Ｌの半分の距離となる（Ｌ２＝Ｌ／２）。また、前記式（８）は、ガラススライド５４と標本６２との境界面において入射光が全反射を起こし、エバネッセント場６１を生じさせるための条件式である。この条件式により、標本６２の特性が変更されても、全反射を確実に起こすことが可能となる。
【００６３】
このように、前記チップ成形ステップには、チップ本体５１のベース部６５の厚さｔ１を設定する厚さ設定ステップが含まれている。この厚さ設定ステップは、二方向から照射される相異なる波長λ１，λ２の二つの照明光を一つの領域Ｅに到達させることのできる光路ｅを、チップ本体１に備えさせるためのステップである。すなわち、バイオチップＢ２を製造する際に、前記厚さｔ１を設定することにより、チップ本体５１のベース部６５における光路長が調整され、かつ、前記式（１）〜式（８）の条件を満たすことにより、プリズム３３の中心の直下に位置する一つの領域Ｅに二方向からの照射光を到達させることができ、ガラススライド５４と標本６２との境界面における同じ領域で、二方向からの照射光を共に全反射させることが可能となる。
【００６４】
したがって、この厚さ設定ステップによれば、左右二方向からの照明光によって生じる二つのエバネッセント場を、一つの領域Ｅで自動的に重ね合わせることができるバイオチップＢ２を得ることができる。このように、チップ本体５１のベース部６５の厚さｔ１を設定すれば、エバネッセント場の重ね合わせを容易に実現することができる。なお、バイオチップＢ２やガラススライド５４の材質を変更しても、前記式（１）〜式（８）を満たすようにして、バイオチップＢ２の各部を設定することで、左右対称の位置から光を入射して、エバネッセント場を重ね合わせることを容易に実現することができる。
また、二つのレンズ部３１，３２を左右対称の配置として形成していることで、バイオチップＢ２の構造を簡略化し、製造を容易としている。
【００６５】
［実施の形態３］
本発明の別の実施の形態３について説明する。
図１１の実施の形態２では、二種類の波長の照明光によって二種類の蛍光対象（蛍光分子）を、高いＳＮ比で超高感度に同時に検出することができる二波長同時励起のバイオチップＢ２を説明した。本発明では、励起波長を前記実施の形態よりも多くすることができ、例えば励起波長を四種類とすることができる（実施の形態３）。この実施の形態３のバイオチップＢ３及びこのバイオチップＢ３に付着させて用いる標本配設手段Ｓ３を備えたアセンブリＡ３を、図２１に示す。
このバイオチップＢ３も、図１及び図１１のチップと同様に、チップ本体１５１とレンズ系１５２とを備えており、チップ本体１５１とレンズ系１５２とが、実質的に透明な材料で一体に継目無く成形されている。標本配設手段Ｓ２は、図１及び図１１のチップと同様の構成であり、説明を省略する。
【００６６】
実施の形態３におけるチップ本体１５１は平面視において正方形であり、レンズ系１５２は、チップ本体５１上の異なる位置（図２１において、対角線で区画されたそれぞれの領域）に配設された四つのレンズ部１３１，１３２，１３４，１３５を備えている。第１のレンズ部１３１と第２のレンズ部１３２とは、プリズム１３３の中心を挟んで対称の配置にあり、第３のレンズ部１３４と第２のレンズ部１３５とは、プリズム１３３の中心を挟んで対称の配置にある。
【００６７】
各レンズ部は、図１１の実施の形態２と同様に、四角錐台のプリズム１３３の一部（四分の一の部分）と、柱状レンズとで構成されており、各光源（図示せず）からの照明光を上側のガラススライド１５４の下面（第１の面）と標本との境界面に照射して全反射させ当該標本側にエバネッセント光を滲み出させる役割を果たす。そして、四つのレンズ部は、エバネッセント光を滲み出させる領域Ｅを中心として（プリズム１３３の中心から）放射状に配置されている。そして、四つのレンズ部は、エバネッセント光を滲み出させる一つの領域Ｅに対して、相異なる四種類の波長の照明光を四方向から照射して全反射させる位置にそれぞれ配設されている。前記領域Ｅは、プリズム１３３の中心の直下位置にある。また、光ファイバ２５５ａ，２５５ｂ，２５５ｃ，２５５ｄの先端部を取り付けるための四つの取付部も、プリズム１３３の中心から放射状に配置されている。
【００６８】
この実施の形態３によれば、エバネッセント光を滲み出させる一つの領域Ｅに、四種類の波長の照明光を四方向から照射することができる。このように、四つのレンズ部を通じて四方向から照明光を一つの領域Ｅに照射することで、前記四種類の波長の照明光によってそれぞれ生じさせるエバネッセント場を、領域Ｅにおいて容易に重ね合わせることができる。
【００６９】
さらに、図２１のバイオチップＢ３の製造方法は、図１１のバイオチップＢ２の製造方法と同様であり、チップ成形ステップに、チップ本体１５１のベース部１６５の厚さｔ１を設定する厚さ設定ステップが含まれている。このステップによれば、前記実施の形態２で説明したのと同様に、バイオチップＢ３を製造する際に、前記厚さｔ１を設定することにより、チップ本体１５１のベース部１６５における光路長が調整され、かつ、前記式（１）〜式（８）の条件を満たすことにより、プリズム１３３の中心の直下に位置する一つの領域Ｅに四方向からの照射光を到達させることができ、ガラススライド１５４と標本との境界面における同じ領域で、四方向からの照射光を共に全反射させることが可能となる。
【００７０】
したがって、四方向からの照明光によって生じる四つのエバネッセント場を、一つの領域Ｅで自動的に重ね合わせることができるバイオチップＢ３を得ることができる。このように、チップ本体１５１のベース部１６５の厚さｔ１を設定すれば、エバネッセント場の重ね合わせを容易に実現することができる。チップ成形ステップに厚さ設定ステップが含まれていることで、複数波長（四波長）同時励起による蛍光顕微鏡用全反射バイオチップＢ３を簡単に構成することができるので、このバイオチップＢ３は、作製が容易でかつ大量生産に向いている。
【００７１】
［実施例］
つぎに本発明のバイオチップの製法を実施例に基づいて説明するが、本発明はもとよりかかる実施例にのみ限定されるものではない。
［実施例１］
（１）まず、厚さ３００μｍのシリコンウェハに熱酸化処理を施して、当該シリコンウェハの両面に厚さ３８０ｎｍのＳｉＯ2層を形成した（図２参照）。この酸化処理は、酸素及び水素をそれぞれ１．１及び０．５ｓｌｍの流量で流しつつ、１０００℃の温度下で１７０分間行った。
【００７２】
（２）ついで、シリコンウェハの下面をフォトレジスト膜により保護した。使用したフォトレジストは、ＯＦＰＲ−８００（商品名。東京応化株式会社製フォトレジスト。粘度：５０ｃｐ）であり、これを２段階スピンコーティング法（５００ｒｐｍ（５秒）と２０００ｒｐｍ（３０秒））によりシリコンウェハの下面に塗布した。ホットプレートを用いて１１０℃で９０秒間予備加熱し、ついでオーブンにて１２０℃で１０分間本加熱した。
【００７３】
ついで、フォトレジスト膜との密着性を高めるためにシリコンウェハの上面に、２０ｍｌのＯＡＰを石英ビーカー内で１２０℃に加熱して発生する蒸気を２分間当てた。
ついで、シリコンウェハの上面にスピンコーティング法によりフォトレジスト膜を形成した。使用したフォトレジストは、ＯＦＰＲ−８００（粘度：５０ｃｐ）であり、これを２段階スピンコーティング法（５００ｒｐｍ（５秒）と３０００ｒｐｍ（３０秒））によりシリコンウェハの上面に塗布した。
【００７４】
ついで、両面マスクアラインナー露光装置で真空接触モードにてフォトリソグラフィ工程を行い、所定のパターンを形成した。アラインメントギャップは２５μｍであり、露光時間は１．５秒であった。
ＮＭＤ−３（商品名。東京応化株式会社製現像液）を用いて２分間現像し、ついで純水で５分間すすぎ、Ｎ2ガンを用いて乾燥させ、その後オーブンで１２０℃で２５分間加熱した。
【００７５】
ついで、ＢＨＦ溶液（１４％ＨＦ）を用いて、１０分間エッチング処理を行い、ついで純水で１０分間すすぎ、Ｎ2ガンを用いて乾燥させた。
ついで、剥離液１０６（商品名。東京応化株式会社製フォトレジスト除去剤）を用いて、ホットプレートで９５℃に加熱し、１０分間除去作業を行った。その後、アセトンで５分間洗浄し、さらにエタノールで５分間洗浄した。ついで、純水で１０分間すすぎ、オーブンにて１５分間脱水処理を行った。
【００７６】
ついで、シリコンウェハの上面をフォトレジスト膜により保護した。使用したフォトレジストは、ＯＦＰＲ−８００（粘度：５０ｃｐ）であり、これを２段階スピンコーティング法（５００ｒｐｍ（５秒）と２０００ｒｐｍ（３０秒））によりシリコンウェハの上面に塗布した。ホットプレートを用いて１１０℃で９０秒間予備加熱し、ついでオーブンにて１２０℃で１０分間本加熱した。
ついで、フォトレジスト膜との密着性を高めるためにシリコンウェハの下面に、２０ｍｌのＯＡＰを石英ビーカー内で１２０℃に加熱して発生する蒸気を２分間当てた。
【００７７】
ついで、シリコンウェハの下面にスピンコーティング法によりフォトレジスト膜を形成した。使用したフォトレジストは、ＯＦＰＲ−８００（粘度：５０ｃｐ）であり、これを２段階スピンコーティング法（５００ｒｐｍ（５秒）と３０００ｒｐｍ（３０秒））によりシリコンウェハの下面に塗布した。
ついで、両面マスクアラインナー露光装置で近接（プロクシミティ）プリンティングモードにてフォトリソグラフィ工程を行い、所定のパターンを形成した。アラインメントギャップは２５μｍであり、露光ギャップは８０μｍであり、露光時間は１０秒間であった。
【００７８】
ついで、ＮＭＤ−３を用いて２分間現像し、純水で５分間すすぎ、Ｎ2ガンを用いて乾燥させ、その後オーブンで１２０℃で２５分間加熱した。
ついで、ＢＨＦ溶液（１４％ＨＦ）を用いて、１０分間エッチング処理を行い、ついで純水で１０分間すすぎ、Ｎ2ガンを用いて乾燥させた。
ついで、剥離液１０６を用いて、フォトレジストを除去した。剥離液１０６をホットプレートで９５℃に加熱し、１０分間除去作業を行った。その後、アセトンで５分間洗浄し、さらにエタノールで５分間洗浄した。ついで、純水で１０分間すすぎ、オーブンにて１５分間脱水処理を行った。
【００７９】
（３）ついでアルミニウムをシリコンウェハの下面に蒸着させた。蒸着圧は０．００２５ｔｏｒｒであり、電流は６５Ａであり、蒸着時間は３分間であった。
ついで、フォトレジスト膜との密着性を高めるためにシリコンウェハの下面に、２０ｍｌのＯＡＰを石英ビーカー内で１２０℃に沸騰させて発生する蒸気を２分間当てた。
ついで、シリコンウェハの下面にスピンコーティング法によりフォトレジスト膜を形成した。使用したフォトレジストは、ＯＦＰＲ−８００（粘度：５０ｃｐ）であり、これを２段階スピンコーティング法（５００ｒｐｍ（５秒）と３０００ｒｐｍ（３０秒））によりシリコンウェハの下面に塗布した。
【００８０】
ついで、両面マスクアラインナー露光装置で真空接触モードにてフォトリソグラフィ工程を行い、所定のパターンを形成した。アラインメントギャップは２５μｍであり、露光時間は１．５秒間であった。
ついで、ＮＭＤ−３を用いて２分間現像し、純水で５分間すすぎ、Ｎ2ガンを用いて乾燥させ、その後オーブンで１２０℃で２５分間加熱した。
ついで、Ａｌエッチング溶液を用いて、エッチング処理を行い、ついで純水で１０分間すすぎ、Ｎ2ガンを用いて乾燥させた。
【００８１】
ついで、剥離液１０６をホットプレートで９５℃に加熱し、１０分間でフォトレジスト除去作業を行った。その後、アセトンで５分間洗浄し、さらにエタノールで５分間洗浄した。ついで、純水で１０分間すすぎ、オーブンにて１５分間脱水処理を行った。
その後、シリコンウェハをシングルチップ（２７ｍｍ×２７ｍｍ）の大きさに切断した。
【００８２】
（４）ついで、シリコンウェハの下面にスピンコーティング法により厚さ１５０μｍのＰＤＭＳフィルムを形成し、さらに保護ジグを利用して、当該シリコンウェハの下面に形成したアルミ薄膜を保護した。
つぎに、ＴＭＡＨ溶液（２０重量％）、大きな石英ビーカー、及び磁性攪拌機を備えたホットプレートを用いて異方性エッチング処理を行った。磁性攪拌機を２５０ｒｐｍで操作しつつＴＭＡＨ溶液を９０℃に維持した。エッチング時間は６時間、エッチング深さは２７０μｍ、エッチング速度はシリコン単結晶の＜１００＞方向において０．７５μｍ／分であった。
ついで、純水で１０分間すすぎ、オーブンにて１５分間脱水処理を行った。
【００８３】
（５）ついで、下面のシリコンを反応性イオンエッチング（ＩＣＰ−ＲＩＥ）法でエッチング処理した。エッチング時間１０秒に対しパッシベーション時間５秒のサイクルであり、トータルのエッチング時間は１１０分であった。
その後、アセトンで５分間洗浄し、さらにエタノールで５分間洗浄した。ついで純水で１０分間すすぎ、オーブンにて１５分間脱水処理を行った。
【００８４】
（６）ついで、アルミエッチング溶液を用いてシリコンウェハの下面のアルミ薄膜を除去（除去時間：１０分）した後に、純水で１０分間すすぎ、Ｎ2ガンを用いて乾燥させた。つぎに、ＢＨＦ溶液（１４％ＨＦ）を用いてＳｉＯ2層をエッチングにより除去した（エッチング時間：１０分）。その後、純水で１０分間すすぎ、Ｎ2ガンを用いて乾燥させた。
【００８５】
（７）ついで、得られたチップの下面にエポキシ系の接着剤を用いてガラススライド（３２ｍｍ×３２ｍｍ、厚さ０．２ｍｍ、松浪硝子工業株式会社製）に固着した。つぎに、９０℃のオーブンにて３０分間硬化させた。
（８）ついで、得られたシリコン金型を含む金型内に、Ｓｉｌｐｏｔ１８４Ｗ／Ｃ（商品名。ダウコーニング社製ＰＤＭＳ）の混合物（重量比で硬化剤１に対しプレポリマー１０を混合したもの）を溶融させたものを注入し、その後大気下で３０分間ガス抜きを行い、さらに８０℃の炉内で３０分間硬化させた。
（９）成型されたチップを注意深くシリコン金型から剥がした。
【００８６】
［実施例２］
図１１に示されるように、一体に成形されたチップ本体５１及びレンズ系５２を有しており、かつ、レンズ系５２は、チップ本体５１上の異なる位置に配設された二つのレンズ部３１，３２を備えたバイオチップを製造した。レンズ系５２及び取付部３６，３７の形成のためのマスクのパターンを変えるとともに、厚さ設定ステップを実行した以外は、実施例１と同様にしてバイオチップを製造した。すなわち、シリコン金型９３をガラススライド６４へ固着したのちのＰＤＭＳの注入（図１９参照）のステップにおいて、得られたシリコン金型９３を含む金型内に、Ｓｉｌｐｏｔ１８４Ｗ／Ｃ（商品名。ダウコーニング社製ＰＤＭＳ）の混合物（重量比で硬化剤１に対しプレポリマー１０を混合したもの）を溶融させたものを注入し、その後大気下で３０分間ガス抜きを行い、さらに８０℃の炉内で３０分間硬化させた。この際、チップ本体５１のベース部６５の厚さｔ１を所定の値（６００μｍ）に設定するために、０．３ｍｌのプレポリマーを金型に流し込み、水平な台上に置いてガス抜きを行い、硬化させた。
【００８７】
また、前記各実施の形態において、光源からの照明光をバイオチップ内に導入する光ファイバの基部側には、カップリング部（図示せず）が設けられており、このカップリング部には、ＬＥＤやレーザ発振器（レーザダイオード）等の様々な光源を接続することができる。
さらに、図１１と図２１の実施の形態のように、複数方向から照明光を領域Ｅに照射させるために、直線的な配置で対のレンズ部（例えば図２１ではレンズ部１３１とレンズ部１３２）が形成されているバイオチップである場合、一方のレンズ部側に光ファイバ（光源）を設け、他方のレンズ部側に光検出器（光トラップ）を設けることができる。この場合、光ファイバから一方のレンズ部へ導出され、ガラススライドと標本との間の境界面で全反射した後の光を、他方のレンズ部によって光検出器へ導入させることができ、光検出器を吸光度センサとして機能させることができる。
【００８８】
また、本発明のバイオチップ、アセンブリは、図示する形態に限らず本発明の範囲内において他の形態のものであっても良い。例えば、前記実施の形態では、レンズ系が備えているレンズを柱状（円筒状）として説明したが、これ以外に球状であってもよい。
また、図１１と図２１の実施の形態では、複数のレンズ部が一つのプリズムを兼用した構成としたが、各レンズ部が一つのプリズムをそれぞれ有している構成（図示せず）としてもよい。また、光ファイバの先端部が当接するストッパー及び保持部についても、図示した形状以外のものであってもよい。
【図面の簡単な説明】
【００８９】
【図１】本発明のアセンブリの一実施の形態の断面説明図である。
【図２】本発明のバイオチップの製造工程を示しており、（ａ）は断面説明図、（ｂ）は上方から見た斜視説明図である。
【図３】本発明のバイオチップの製造工程を示しており、（ａ）は断面説明図、（ｂ）は下方から見た斜視説明図、（ｃ）は上方から見た斜視説明図である。
【図４】本発明のバイオチップの製造工程を示しており、（ａ）は断面説明図、（ｂ）及び（ｃ）は下方から見た斜視説明図である。
【図５】本発明のバイオチップの製造工程を示しており、（ａ）は断面説明図、（ｂ）は上方から見た斜視説明図である。
【図６】本発明のバイオチップの製造工程を示しており、（ａ）は断面説明図、（ｂ）は下方から見た斜視説明図である。
【図７】本発明のバイオチップの製造工程を示しており、（ａ）は断面説明図、（ｂ）は上方から見た斜視説明図である。
【図８】本発明のバイオチップの製造工程を示しており、（ａ）は断面説明図、（ｂ）は上方から見た斜視説明図である。
【図９】本発明のバイオチップの製造工程を示しており、（ａ）は断面説明図、（ｂ）は上方から見た斜視説明図である。
【図１０】本発明のバイオチップの製造工程を示しており、（ａ）は断面説明図、（ｂ）は上方から見た斜視説明図である。
【図１１】本発明のアセンブリの他の実施の形態の断面説明図である。
【図１２】図１１のバイオチップの製造工程を示しており、（ａ）は断面説明図、（ｂ）は上方から見た斜視説明図である。
【図１３】図１１のバイオチップの製造工程を示しており、（ａ）は断面説明図、（ｂ）は下方から見た斜視説明図、（ｃ）は上方から見た斜視説明図である。
【図１４】図１１のバイオチップの製造工程を示しており、（ａ）は断面説明図、（ｂ）及び（ｃ）は下方から見た斜視説明図である。
【図１５】図１１のバイオチップの製造工程を示しており、（ａ）は断面説明図、（ｂ）は上方から見た斜視説明図である。
【図１６】図１１のバイオチップの製造工程を示しており、（ａ）は断面説明図、（ｂ）は下方から見た斜視説明図である。
【図１７】図１１のバイオチップの製造工程を示しており、（ａ）は断面説明図、（ｂ）は上方から見た斜視説明図である。
【図１８】図１１のバイオチップの製造工程を示しており、（ａ）は断面説明図、（ｂ）は上方から見た斜視説明図である。
【図１９】図１１のバイオチップの製造工程を示しており、（ａ）は断面説明図、（ｂ）は上方から見た斜視説明図である。
【図２０】図１１のバイオチップの製造工程を示しており、（ａ）は断面説明図、（ｂ）は上方から見た斜視説明図である。
【図２１】本発明のアセンブリの他の実施の形態の斜視説明図である。
【図２２】従来のバイオチップの断面説明図である。
【符号の説明】
【００９０】
１ チップ本体
２ レンズ系
２ａ プリズム
２ｂ 柱状レンズ
３ スペーサ
４ ガラススライド
５ 光ファイバ
６ ストッパー
７ 保持部
８ 光トラップ
９ レーザ光
１０ 対物レンズ
１１ エバネッセント場
１２ 標本
３１，３２ レンズ部
１３１，１３２,１３４，１３５ レンズ部
４０ シリコンウェハ
４１ ＳｉＯ2層
４２ アルミ薄膜
４３ シリコン金型
Ａ，Ａ２，Ａ３ アセンブリ
Ｂ，Ｂ２，Ｂ３ バイオチップ
Ｅ 領域
Ｓ，Ｓ２，Ｓ３ 標本配設手段
ｔ１ チップ本体の厚さ
【技術分野】
【０００１】
本発明は蛍光顕微鏡用全反射バイオチップ及びその製法、並びに蛍光顕微鏡用全反射バイオチップアセンブリに関する。
【背景技術】
【０００２】
様々な機能性蛍光試薬（イオン感受性蛍光試薬やＣａｇｅｄ化合物など）や蛍光性蛋白質（ＧＦＰなど）の開発により、分子・細胞生物学の研究において蛍光顕微鏡が重要なツールとなっている。蛍光観察の原理は、一般的に蛍光性のない生物標本に蛍光性物質を導入し（又は蛍光性蛋白を発現させ）、観察対象となる分子や構造を「光る画像」としてとらえることである。
【０００３】
かかる蛍光観察のうち、光軸方向全体に励起光を照射して、その中で発する蛍光を観察する「落射蛍光観察」が従来より用いられていたが、最近、さらなる観察法として、「全反射照明蛍光観察法」が注目されている。この「全反射照明蛍光観察法」では、カバーガラス近傍のごく限定された領域（カバーガラス表面から１００〜１５０ｎｍ程度）にのみ励起光（エバネッセント光）を発生させ、その限定された領域における励起により生じる蛍光現象を観察する。このような特殊な励起方法を用いることにより、境界面近傍でのみ起こる現象の画像化や背景光の少ない高感度の蛍光分子検出が可能になる。
【０００４】
前記「全反射照明蛍光観察法」を行うためには、標本が設けられたカバーガラスと当該標本との境界面に光源からの光を照射して全反射させ前記エバネッセント光を発生させるとともに、全反射した照射光を外部に導出するためのレンズ系を設ける必要がある。
【０００５】
非特許文献１には、このレンズ系と、光源からの光を導く光ファイバと、前記標本が設けられるカバーガラスとを一体化したバイオチップが記載されている。このバイオチップは、図２２に示されるように、シリコン基板２０の上面（図２２において上方の面）にＳＵ−８からなる厚膜レジスト２１が設けられており、また、この厚膜レジスト２１上には、光源からの光をチップ内に導入するマルチモード光ファイバ２６が配置されている。
【０００６】
さらに、厚膜レジスト２１の上面には、いずれもＳＵ−８からなるスペーサ２３、プリズム２４及び柱状レンズ２５が配置されている。また、これらスペーサ２３、プリズム２４などの上面には、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）からなるプレート２７が配設されている。観察対象物である標本２８は、厚膜レジスト２１の上面であって、スペーサ２３とプリズム２４との間のスペースに設けられている。マルチモード光ファイバ２６の先端から照射されたレーザ光２９は、柱状レンズ２５及びプリズム２４を経由して厚膜レジスト２１と標本２８との境界面に達し、この境界面で全反射をし、標本２８側の限定された領域にエバネッセント光を発生させる。そして、標本から発せられる蛍光は、図２２において、例えばプレート２７の上方に配設される対物レンズ（図示せず）を介してＣＣＤカメラなどの撮像手段（図示せず）に取り込まれる。また、前記境界面で全反射をしたレーザ光２９は、シリコン基板２０の上面に配置されたマルチモード光ファイバ２２を経由して外部に導出される。
【０００７】
【非特許文献１】Ｓｈｉｈ−Ｈａｏ Ｈｕａｎｇ ａｎｄ Ｆａｎ−Ｇａｎｇ Ｔｓｅｎｇ，“Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ａ ｍｏｎｏｌｉｔｈｉｃ ｔｏｔａｌ ｉｎｔｅｒｎａｌｒｅｆｌｅｃｔｉｏｎ−ｂａｓｅｄ ｂｉｏｃｈｉｐ ｕｔｉｌｉｚｉｎｇ ａ ｍｉｃｒｏｐｒｉｓｍ ａｒｒａｙ ｆｏｒ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｓｅｎｓｉｎｇ”，Ｊｏｕｎａｌ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｍｅｃａｎｉｃｓ ａｎｄ Ｍｉｃｒｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，１５（２００５），ｐｐ２２３５−２２４２
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
しかしながら、非特許文献１のバイオチップは、微細加工法によって当該チップを構成する各要素を作製しており、これら要素をチップ毎に組み立てる必要があることから、作製するのに時間と労力を要し、大量生産するのが困難である。
【０００９】
本発明は、このような事情に鑑みてなされたものであり、作製が容易であり、大量生産に向いている蛍光顕微鏡用全反射バイオチップ及びその製法、並びに蛍光顕微鏡用全反射バイオチップアセンブリを提供することを目的としている。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明の蛍光顕微鏡用全反射バイオチップは、全反射蛍光観察される標本が第１の面に設けられた標本配設手段の第２の面が密接される当接面を有するチップ本体と、光源からの照明光を前記標本配設手段の第１の面と標本との境界面に照射して全反射させ当該標本側にエバネッセント光を滲み出させるとともに、全反射した照射光を外部に導出するためのレンズ系とが、実質的に透明な材料で一体に成形されていることを特徴としている。
【００１１】
本発明の蛍光顕微鏡用全反射バイオチップでは、標本配設手段（標本が塗布又は配置される面を有するガラスプレートなどの手段）が密接される当接面を有するチップ本体と、レンズ系とが一体成形されているので、構造が簡略化されるとともに、使用材料の種類が少なくなる。したがって、製造が容易であり、大量生産に向いている。その結果、低コストで製造することができる。また、バイオチップが、標本が塗布されるガラスプレートなどの標本配設手段とは別体になっているので、ガラススライド、フローセル、マイクロチャンネルなどの中から、標本の種類や観察条件などに応じて最適の標本配設手段を選択することができる。これらの標本配設手段は、特別の接着剤などを用いることなく、単にバイオチップと標本配設手段の面同士を当接させるだけで材料の付着力（ファンデルワールス力）により簡単に付着させることができる。さらに、標本配設手段が、バイオチップとは別体であるので、標本の種類に応じた表面処理（機能性蛍光試薬の塗布などの処理）を容易に行うことができる。そして、観察終了後に標本配設手段を剥がしたバイオチップは、消耗ないしは損傷部分がないので、他の標本を観察するのに再利用することができる。
【００１２】
また、前記蛍光顕微鏡用全反射バイオチップにおいて、前記レンズ系を、前記チップ本体上の異なる位置に配設された複数のレンズ部を備えたものとし、かつ、前記複数のレンズ部を、前記エバネッセント光を滲み出させる一つの領域に対して相異なる波長の前記照明光を複数の方向から照射させる位置にそれぞれ配設することができる。
この蛍光顕微鏡用全反射バイオチップでは、チップ本体上の異なる位置に配設された複数のレンズ部が、エバネッセント光を滲み出させる一つの領域に対して、相異なる波長の照明光を複数の方向からそれぞれ照射させるので、当該照明光によりそれぞれ形成される複数のエバネッセント場が、前記一つの領域で重ね合わされる。その結果、一つの領域において、複数のエバネッセント光による複数の観察対象（蛍光対象）を、同時に検出することが可能となる。
【００１３】
また、レンズ系が複数のレンズ部を備えている前記蛍光顕微鏡用全反射バイオチップは、前記複数のレンズ部が前記一つの領域を挟んで対称に配置されている構成とすることができる。この場合、複数のレンズ部が対称に配置されていることから、チップの構造が簡略化されたものとなる。
または、前記複数のレンズ部が前記一つの領域を中心として放射状に配置されている構成とすることができる。この場合、チップ本体上に複数のレンズ部を配設することが可能となり、多くの照明光を、前記一つの領域に照射することができる。さらに、放射状に配置されているレンズ部を通じて、照明光を前記一つの領域に照射させることで、多くの照明光によってそれぞれ生じさせるエバネッセント場を、容易に重ね合わせることができる。
【００１４】
また、本発明の蛍光顕微鏡用全反射バイオチップアセンブリは、前記バイオチップと、このバイオチップの前記当接面に密接される標本配設手段とを有しており、この標本配設手段が、スペーサを介して対向して配置された一対のガラススライドからなり、両ガラススライド間に全反射蛍光観察される標本が充填されていることを特徴としている。
【００１５】
本発明の蛍光顕微鏡用全反射バイオチップアセンブリでは、前述した効果に加えて、標本配設手段が透明な一対のガラススライドからなっているので、バイオチップの両面からの観察が可能であり、正立型顕微鏡だけでなく、倒立型顕微鏡を用いた観察を行うことができ、観察のためのシステム設計の自由度を向上させることができる。
【００１６】
さらに、本発明の蛍光顕微鏡用全反射バイオチップの製法は、前記バイオチップを製造する方法であって、エッチングを含む微細加工をウェハに施して前記チップ本体及びレンズ系のための金型を作製するステップと、前記金型を用いて実質的に透明な材料によりバイオチップを一体成形するステップとを含むことを特徴としている。
【００１７】
本発明の蛍光顕微鏡用全反射バイオチップの製法では、まず金型を作製し、この金型を用いてチップ本体及びレンズ系を含むバイオチップを製造しており、バイオチップを構成する要素の組立工程が不要であるので、当該バイオチップを低コストで大量生産することができる。
【００１８】
また、前記レンズ系が複数のレンズ部を備えている前記蛍光顕微鏡用全反射バイオチップを製造する方法は、エッチングを含む微細加工をウェハに施して前記チップ本体及びレンズ系のための金型を作製する金型作製ステップと、前記金型を用いて実質的に透明な材料によりバイオチップを一体成形するチップ成形ステップとを含み、前記チップ成形ステップには、異なる方向から照射された相異なる波長の複数の前記照明光を前記一つの領域に到達させる光路を前記チップ本体が有するように、当該チップ本体の厚さを設定する、厚さ設定ステップが含まれていることを特徴としている。
【００１９】
このような、レンズ系が複数のレンズ部を備えている蛍光顕微鏡用全反射バイオチップの製法によれば、チップ本体の厚さを設定してバイオチップを一体成形することにより、当該バイオチップは、複数の方向から照射される相異なる波長の照明光を、前記一つの領域に到達させることができる。このように、相異なる波長の複数の照明光によりそれぞれ形成されるエバネッセント場を、一つの領域で重ね合わせることのできるバイオチップが得られる。
【発明の効果】
【００２０】
本発明の蛍光顕微鏡用全反射バイオチップによれば、低コストで大量生産することができ、再利用が可能であり、さらには種々の標本配設手段を適用することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】
以下、添付図面を参照しつつ、本発明の蛍光顕微鏡用全反射バイオチップ（以下、単に「バイオチップ」ともいう）及びその製法、並びに蛍光顕微鏡用全反射バイオチップアセンブリ（以下、単に「アセンブリ」ともいう）について詳細に説明する。
【００２２】
［実施の形態１］
図１は、本発明の実施の形態１に係るアセンブリＡの断面説明図である。このアセンブリＡは、チップ本体１とレンズ系２とを備えたバイオチップＢと、このバイオチップＢに付着させて用いる標本配設手段Ｓとからなっている。
この標本配設手段Ｓは、紙製のスペーサ３を介して対向して配置された一対のガラススライド４からなっており、この一対のガラススライド４間に全反射蛍光観察される標本１２が充填されている。
【００２３】
前記チップ本体１は、一方のガラススライド４の片面（第２の面。図１において、上側のガラススライド４の上面）が当接される当接面１ａを有している。レンズ系２は、断面台形状のプリズム２ａと、柱状レンズ２ｂとで構成されており、光源（図示せず）からの照明光を上側のガラススライド４の下面（第１の面）と標本１２との境界面に照射して全反射させ当該標本側にエバネッセント光を滲み出させるとともに、前記境界面で全反射した照明光を外部に導出する役割を果たす。前記プリズム２ａと柱状レンズ２ｂは、チップ本体１の、前記標本配設手段Ｓが設けられる側とは反対側に設けられている。前記レンズ系２と前記チップ本体１とは実質的に透明な材料であるポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）により一体に成形されている（一体に継目無く成形されている）。図２２に示される従来技術では、５３２ｎｍなどの光源波長において、ＳＵ−８の自家蛍光によって画像上Ｓ／Ｎ比が低くなるという問題があるが、このＰＤＭＳで作製すると、５３２ｎｍなどの光源波長において自家蛍光することがなく、Ｓ／Ｎ比の低下という問題を克服することができる。なお、ＰＤＭＳに代えて、例えばＰＭＭＡなど他の材料を用いることもできる。ＰＭＭＡの場合、ＵＶ照明光に対して自家蛍光がない。
【００２４】
また、チップ本体１は、光源からの光をチップ内に導入する光ファイバ５の先端部が当接するストッパー６及び当該光ファイバ５を保持するＶ型溝７ａを有する保持部７（図１０参照）を備えており、これらストッパー６及び保持部７も、チップ本体１と同じ材料（ＰＤＭＳ）で当該チップ本体１と一体に成形されている。なお、図１において、８は集光するための光トラップである。
【００２５】
光ファイバ５の先端から導出されたレーザ光９は、前記柱状レンズ２ｂ及びプリズム２ａを経由して、標本配設手段Ｓを構成する上側のガラススライド４内に照射され、さらにこの上側のガラススライド４の下面と標本との境界面で全反射する。この全反射した照明光は、前記上側のガラススライド４及びプリズム２ａを経由して、当該プリズム２ａの端面から外部に照射され、この照射光を光トラップ８が受光する。
【００２６】
一方、前記境界面から標本側のごく限られた領域で発生するエバネッセント光の励起により生じる蛍光現象は、標本配設手段Ｓの下方に配置された対物レンズ１０を経由してＣＣＤカメラなどの撮像手段（図示せず）に取り込まれる。なお、図１において、１１は、前記エバネッセント光が発生する領域であるエバネッセント場を示している。
【００２７】
本実施の形態に係るバイオチップＢでは、チップ本体１、レンズ系２、ストッパー６及び保持部７が一体成形されているので、構造が簡略化されるとともに、使用材料の種類が少なくなる。したがって、製造が容易であり、大量生産に向いている。その結果、低コストで製造することができる。前記一体成形は、溶融材料を金型内に注入することで行うこともできるし、ホット型押し付け機を用いて行うこともできる。
【００２８】
また、バイオチップＢは、一対のガラススライド４からなる標本配設手段Ｓとは別体になっているので、ガラススライドに限らず、標本の種類や観察条件などに応じて、フローセル、マイクロチャンネルなど他の標本配設手段を選択することができる。これらの標本配設手段は、特別の接着剤などを用いることなく、単に面同士を当接させるだけで材料の付着力（ファンデルワールス力）により簡単に固着させることができる。さらに、標本配設手段Ｓが、バイオチップＢとは別体であるので、標本の種類に応じた表面処理（機能性蛍光試薬の塗布などの処理）を容易に行うことができる。そして、観察終了後に標本配設手段Ｓを剥がしたバイオチップＢは、消耗ないしは損傷部分がないので、他の標本を観察するのに再利用することができる。
【００２９】
また、前記アセンブリＡは、標本配設手段Ｓが透明な一対のガラススライド４からなっているので、バイオチップＢの両面からの観察が可能であり、正立型顕微鏡だけでなく、倒立型顕微鏡を用いた観察を行うことができ、観察のためのシステム設計の自由度を向上させることができる。
【００３０】
つぎに、図２〜１０を参照しつつ、前述したバイオチップＢの製法を説明する。このバイオチップＢは、従来のシリコンウェハの微細加工技術とＰＤＭＳの成型技術を用いて製造することができる。なお、図２〜１０では、分かり易くするために、膜や層の厚さを誇張して描いている。また、図示した例では、柱状レンズ２ｂ及びプリズム２ａからなるレンズ系２とともに、ストッパー６及び保持部７がチップ本体１と一体化されている。
【００３１】
（１）シリコンウェハの熱酸化（図２参照）
まず、厚さ３００〜５００μｍのシリコンウェハ４０に熱酸化処理を施して、当該シリコンウェハ４０の両面に厚さ３００〜５００ｎｍのＳｉＯ2層４１を形成する。酸素及び水素を、例えばそれぞれ１．１及び０．５ｓｌｍの流量で流しつつ、１１００℃の温度下で１７０分間酸化させる。
なお、ＳｉＯ2層に代えて、ＣＶＤ装置を用いたチッ化処理によりシリコンウェハにＳｉＮX層を形成してもよい。
【００３２】
（２）ＳｉＯ2層４１のパターニング（図３参照）
ついで、シリコンウェハ４０の両面のＳｉＯ2層４１をフォトリソグラフィ工程及びＢＨＦ（ｂｕｆｆｅｒ ｈｙｄｒｏｆｌｕｏｒｉｃ ａｃｉｄ）エッチングによりパターニングする。
まずシリコンウェハ４０の上面に、前記プリズム２ａ及び保持部７のパターンがフォトリソグラフィ工程及びＢＨＦエッチングにより形成され、一方、シリコンウェハ４０の下面に、前記柱状レンズ２ｂのパターンがフォトリソグラフィ工程及びＢＨＦエッチングにより形成される。
【００３３】
より詳細には、まず、シリコンウェハ４０の下面をフォトレジスト膜により保護する。ついで、フォトレジスト膜との密着性を高めるためにシリコンウェハ４０の上面に、ＯＡＰ（ＯＦＰＲ Ａｄｈｅｓｉｖｅ Ｐｒｏｍｏｔｏｒ）を加熱して発生する蒸気を当てる。ついで、シリコンウェハ４０の上面にスピンコーティング法によりフォトレジスト膜を形成し、さらにフォトリソグラフィ工程により所定のパターニングを行う。フォトレジスト膜を現像した後に、ＢＨＦエッチング処理を行い、ついで残っているフォトレジスト膜を除去する（図３の（ｃ）参照）。
【００３４】
つぎに、シリコンウェハ４０の下面のＳｉＯ2層４１をエッチング処理するに先立って、シリコンウェハ４０の上面をフォトレジスト膜により保護する。ついで、フォトレジスト膜との密着性を高めるためにシリコンウェハ４０の下面に、ＯＡＰを加熱して発生する蒸気を当てる。ついで、シリコンウェハ４０の下面にスピンコーティング法によりフォトレジスト膜を形成し、さらにフォトリソグラフィ工程により所定のパターニングを行う。フォトレジスト膜を現像した後に、ＢＨＦエッチング処理を行い、ついで残っているフォトレジスト膜を除去する（図３の（ｂ）参照）。
【００３５】
（３）下面へのアルミ薄膜の蒸着及びアルミエッチング（図４参照）
ついで、シリコンウェハ４０の下面にアルミ薄膜４２を蒸着し、フォトリソグラフィとアルミエッチング処理を行う。
より詳細には、まずアルミニウムを蒸着させてシリコンウェハ４０の下面にアルミ薄膜４２を形成する（図４の（ｂ）参照）。ついで、フォトレジスト膜との密着性を高めるためにシリコンウェハ４０の下面に、ＯＡＰを加熱して発生する蒸気を当てる。ついで、シリコンウェハ４０の下面にスピンコーティング法によりフォトレジスト膜を形成し、さらにフォトリソグラフィ工程により所定のパターニングを行う。フォトレジスト膜を現像した後に、アルミエッチング処理を行い、ついで残っているフォトレジスト膜を除去する（図４の（ｃ）参照）。
なお、アルミニウム薄膜４２に代えて、Ａｕなど他の金属の薄膜をスパッタリング又は蒸着によりシリコンウェハ４０の下面に形成することもできる。
【００３６】
（４）上面のＴＭＡＨエッチング（図５参照）
ついで、下面に形成したアルミ薄膜を保護しつつ、上面側のシリコンをＴＭＡＨ溶液（水酸化テトラメチルアンモニウム水溶液）でエッチングする。
より詳細には、まず、シリコンウェハ４０の下面にＰＤＭＳフィルム及び保護ジグを利用して、当該シリコンウェハ４０の下面に形成したアルミ薄膜４２を保護する。ついで、シリコンウェハ４０の上面を、ＴＭＡＨ溶液で異方性エッチング処理を行う。
なお、ＴＭＡＨ溶液による異方性エッチング処理に代えて、ＫＯＨ溶液を用いた異方性エッチング処理を採用することができる。この場合、ＳｉＮXからなるマスキング層を用いるのが好ましい。
【００３７】
（５）下面の反応性イオンエッチング（図６参照）
ついで、下面のシリコンを反応性イオンエッチング（ＩＣＰ−ＲＩＥ）法で貫通エッチングする。
（６）ＳｉＯ2層４１とアルミ薄膜４２の除去（図７参照）
ついで、シリコンウェハ４０の上面及び下面のＳｉＯ2層４１、及び下面のアルミ薄膜４２を除去する。
より詳細には、まずアルミエッチング溶液を用いてシリコンウェハ４０の下面のアルミ薄膜４２を除去し、つぎに、ＢＨＦ溶液を用いてＳｉＯ2層４１を除去する。これにより、チップ本体、レンズ系及び保持部を一体化して作製するためのシリコン金型４３を得ることができる。
【００３８】
（７）ガラススライドへの固着（図８参照）
ついで、得られたシリコン金型４３の下面をエポキシ系の接着剤４４を用いてガラススライド１４に固着する。ガラススライド１４としては、例えば３２×３２ｍｍの大きさで、厚さ０．１２〜０．１７ｍｍのものを用いることができる。エポキシ系の接着剤以外は陽極接合や癒着接合などでシリコンとガラス接合できる（以上、金型作製ステップ）。
（８）ＰＤＭＳの注入（図９参照）
ついで、前記シリコン金型４３を含む金型内に溶融したＰＤＭＳを注入し、その後大気下で２０〜４０分間ガス抜きを行い、さらに７０〜１００℃で約３０分間、オーブンで硬化させる。
（９）離型（図１０参照）
ついで、硬化したＰＤＭＳ製品をシリコン金型４３から剥がすことで、柱状レンズ２ｂ及びプリズム２ａからなるレンズ系２並びに保持部７がチップ本体１と一体化されたバイオチップＢを得ることができる（以上、チップ成形ステップ）。
【００３９】
以上のようにして製造されたバイオチップＢ（図１）は、光ファイバ５の先端部から導出された所定の波長のレーザ光９を、エバネッセント光を滲み出させる領域に対して一方向から照射するために、バイオチップＢのレンズ系２は、プリズム２ａとレンズ２ｂとで構成された一組のレンズ部を備えている。
このバイオチップＢを備えているアセンブリＡによれば、全反射照明を用いた低バックグラウンドノイズでの高感度蛍光分子検出が可能となる。そして、このアセンブリＡは、細胞膜や一分子計測等の生化学分野をはじめとする様々な分野における蛍光物質の検出に用いられる。なお、このバイオチップＢのように単一の光ファイバ５が用いられている場合であっても、この光ファイバ５の基部側にカップリング部（図示せず）を設け、このカップリング部に接続する光源を変更することにより、光の波長を変更することができ、任意の波長による励起が可能となる。また、水銀光のように波長に幅を持たせた光を、光ファイバ５を介してチップ内に導入することも可能である。
【００４０】
さらに、近年では、複数種類（例えば二種類）の蛍光分子の検出や蛍光相互相関分光法のために、複数波長同時励起（例えば二波長同時励起）による全反射照明法が提案されている。しかし、従来における、二波長同時励起のために用いられている対物レンズ型やプリズム型等の様々な光学機構は、大型であり、高価であり、また、複雑な組み立てが必要である。このため従来の光学機構は、作製が困難であり、大量生産には不向きである。
【００４１】
そこで、作製が容易でかつ大量生産に向いている、複数波長同時励起による蛍光顕微鏡用全反射バイオチップ（以下、単に「バイオチップ」ともいう）及びその製法、並びに蛍光顕微鏡用全反射バイオチップアセンブリ（以下、単に「アセンブリ」ともいう）について説明する。
【００４２】
［実施の形態２］
図１１は、本発明の実施の形態２に係るアセンブリＡ２の断面説明図である。このアセンブリＡ２は、前記実施の形態（図１参照）と同様に、チップ本体５１とレンズ系５２とを備えたバイオチップＢ２と、このバイオチップＢ２に付着させて用いる標本配設手段Ｓ２とからなっており、標本配設手段Ｓ２は、スペーサ５３を介して対向して配置された一対のガラススライド５４からなっており、この一対のガラススライド５４間に全反射蛍光観察される標本６２が充填されている。
【００４３】
前記チップ本体５１は、一方のガラススライド５４の片面（第２の面。図１１において、上側のガラススライド５４の上面）が当接される当接面５１ａを有している。前記レンズ系５２は、チップ本体５１上の異なる位置（図１１において、長手方向の両側の異なる位置）に配設された二つのレンズ部３１，３２を備えている。第１のレンズ部３１は、断面台形状（四角錐台形状）のプリズム３３の一部３３ａ（図１１では左側部分）と、柱状レンズ５２ｂとで構成されており、第１の光源（図示せず）からの照明光を上側のガラススライド５４の下面（第１の面）と標本６２との境界面に照射して全反射させ当該標本側にエバネッセント光を滲み出させる役割を果たす。第２のレンズ部３２は、前記プリズム３３の他部３３ｂ（図１１では右側部分）と、柱状レンズ１５２ｂとで構成されており、第２の光源（図示せず）からの照明光を前記境界面に照射して全反射させ当該標本側にエバネッセント光を滲み出させる役割を果たす。なお、前記第１の光源からチップ内に導入される照明光の波長λ１と、前記第２の光源からチップ内に導入される照明光の波長λ２とは異なっている。また、プリズム３３は、各方向から前記境界面に照射して全反射した照明光を外部に導出する役割を果たす。そして、この実施の形態２では、第１のレンズ部３１と第２のレンズ部３２とが一つのプリズム３３を兼用している。
【００４４】
プリズム３３と柱状レンズ５２ｂ，１５２ｂは、チップ本体５１の、前記標本配設手段Ｓ２が設けられる側とは反対側に設けられている。プリズム３３及び柱状レンズ５２ｂ，１５２ｂと、前記チップ本体５１とは、実質的に透明な材料であるポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）により継目無く一体に成形されている。
【００４５】
また、チップ本体５１には、第１のレンズ部３１に照明光を導出する光ファイバ５５の先端部を取り付けるための第１取付部３６と、第２のレンズ部３２に照明光を導出する光ファイバ１５５の先端部を取り付けるための第２取付部３７とが設けられている。第１取付部３６は、光ファイバ５５の先端部が当接するストッパー５６、当該光ファイバ５５を保持するＶ型溝５７ａを有する保持部５７（図２０参照）を備えている。これと同様に、第２取付部３７は、光ファイバ１５５の先端部のためのストッパー１５６及び保持部１５７を備えている。これらストッパー５６，１５６及び保持部５７，１５７も、チップ本体５１と同じ材料（ＰＤＭＳ）で当該チップ本体５１と継目無く一体に成形されている。
【００４６】
二つのレンズ部３１，３２の配置及び構成を説明する。前記二つのレンズ部３１，３２は、エバネッセント光を滲み出させる一つの領域（エバネッセント場６１を生じさせる領域）Ｅに対して、相異なる波長λ１，λ２の二つの照明光（レーザ光）５９，１５９を二方向から照射して全反射させることのできる位置にそれぞれ配設されている。そして、図１１の実施の形態では、二つのレンズ部３１，３２は、エバネッセント光を滲み出させる前記一つの領域Ｅを挟んで、左右対称に配置されている。
【００４７】
具体的に説明すると、チップ本体５１は一方向（図１１では左右方向）に長い板状に形成されている。プリズム３３の左右方向の中心が、チップ本体５１の左右方向の中心と一致するように、当該プリズム３３は形成されている。第１のレンズ部３１の柱状レンズ５２ｂは、プリズム３３の左右方向の中心よりも長手方向の一方側（図１１では左側）に設けられており、第２のレンズ部３２の柱状レンズ１５２ｂは、前記中心よりも長手方向の他方側（図１１では右側）に設けられている。柱状レンズ５２ｂと柱状レンズ１５２ｂとは、プリズム３３の左右方向の中心に対して対称の配置にある。そして、プリズム３３の前記中心が、エバネッセント光を滲み出させる前記一つの領域Ｅの直上位置にある。また、光ファイバ５５，１５５の先端部を取り付けるための二つの取付部３６，３７も、プリズム３３の前記中心に対して、対称の配置である。
【００４８】
この配置及び構成により、図１１の左側の光ファイバ５５の先端から導出されたレーザ光５９は、前記第１のレンズ部３１を経由して、上側のガラススライド５４内に照射され、さらにこの上側のガラススライド４の下面と標本との境界面にある所定領域で全反射する。そして、右側の光ファイバ１５５の先端から導出されたレーザ光１５９は、前記第２のレンズ部３２を経由して、上側のガラススライド５４内に照射され、前記境界面の前記所定領域で全反射する。そして、前記所定領域が、エバネッセント光を滲み出させる前記一つの領域Ｅである。すなわち、第１のレンズ部３１は、エバネッセント光を滲み出させる一つの領域Ｅに対して、第１の波長λ１のレーザ光５９を、長手方向の一方側から他方側へ向かう方向に照射させて全反射させることができる配置及び構成となっている。そして、第２のレンズ部３２は、前記一つの領域Ｅに対して、第２の波長λ２のレーザ光１５９を、長手方向の他方側から一方側へ向かう方向に照射させて全反射させることができる配置及び構成となっている。
【００４９】
このように、チップ本体５１上の二つの異なる位置にそれぞれ配設された二つのレンズ部３１，３２が、エバネッセント光を滲み出させる一つの同じ領域Ｅに対して、相異なる二つの波長λ１，λ２の照明光を、二方向からそれぞれ照射して全反射させることで、当該照明光によりそれぞれ形成されるエバネッセント場を重ね合わせることができる。すなわち、第１の光源からの照明光（第１の波長λの光）によって励起されエバネッセント光を滲み出させる領域と、第２の光源からの照明光（第２の波長λ２の光）によって励起されエバネッセント光を滲み出させる領域と、が重ね合わされる。
【００５０】
この結果、前記一つの同じ領域Ｅにおいて、第１の波長λ１による励起光（エバネッセント光）を発生させ、当該励起により生じる第１の蛍光現象を観察することができ、かつ、第２の波長λ２による励起光（エバネッセント光）を発生させ、当該励起により生じる第２の蛍光現象を観察することができる。このため、蛍光色が第１の蛍光現象と第２の蛍光現象とで異なることにより、前記一つの同じ領域Ｅにおいて、二種類（二色）の蛍光対象を区別して同時に検出することが可能となる。
そして、ガラススライド５４の下面（第１の面）と標本６２との境界面から標本側のごく限られた前記領域Ｅで発生するエバネッセント光の励起により生じた前記蛍光現象は、標本配設手段Ｓ２の下方に配置された対物レンズ６０を経由してＣＣＤカメラなどの撮像手段（図示せず）に取り込まれる。低倍率の対物レンズ６０を用いることで、例えば細胞全体における複数の蛍光分子（蛍光対象）のそれぞれの挙動の観察が可能となり、高倍率の対物レンズ６０を用いることで、蛍光分子レベルの観察が可能となる。なお、図１１において、６１は、前記エバネッセント光が発生する領域Ｅであるエバネッセント場を示している。
【００５１】
つぎに、図１２〜２０を参照しつつ、図１１に示したバイオチップＢ２の製法を説明する。このバイオチップＢ２は、図１の実施の形態と同様に、従来のシリコンウェハの微細加工技術とＰＤＭＳの成型技術を用いて製造することができる。なお、図１２〜２０では、分かり易くするために、膜や層の厚さを誇張して描いている。また、図示した例では、第１のレンズ部３１及び第２のレンズ部３２からなるレンズ系５２とともに、ストッパー５６，１５６及び保持部５７，１５７がチップ本体５１と一体化されている。また、第１のレンズ部３１と第２のレンズ部３２とが、プリズム３３の中心に対して対称となるように形成されている。
【００５２】
（１）シリコンウェハの熱酸化（図１２参照）
まず、厚さ３００〜５００μｍのシリコンウェハ９０に熱酸化処理を施して、当該シリコンウェハ９０の両面に厚さ３００〜５００ｎｍのＳｉＯ2層９１を形成する。酸素及び水素を、例えばそれぞれ１．１及び０．５ｓｌｍの流量で流しつつ、１１００℃の温度下で１７０分間酸化させる。
なお、ＳｉＯ2層に代えて、ＣＶＤ装置を用いたチッ化処理によりシリコンウェハにＳｉＮX層を形成してもよい。
【００５３】
（２）ＳｉＯ2層９１のパターニング（図１３参照）
ついで、シリコンウェハ９０の両面のＳｉＯ2層９１をフォトリソグラフィ工程及びＢＨＦ（ｂｕｆｆｅｒ ｈｙｄｒｏｆｌｕｏｒｉｃ ａｃｉｄ）エッチングによりパターニングする。
まずシリコンウェハ９０の上面に、前記プリズム３３のパターンがフォトリソグラフィ工程及びＢＨＦエッチングにより形成され、一方、シリコンウェハ９０の下面に、前記柱状レンズ５２ｂ，１５２ｂ、前記第１取付部３６及び前記第２取付部３７のパターンがフォトリソグラフィ工程及びＢＨＦエッチングにより形成される。
【００５４】
より詳細には、まず、シリコンウェハ９０の下面をフォトレジスト膜により保護する。ついで、フォトレジスト膜との密着性を高めるためにシリコンウェハ９０の上面に、ＯＡＰ（ＯＦＰＲ Ａｄｈｅｓｉｖｅ Ｐｒｏｍｏｔｏｒ）を加熱して発生する蒸気を当てる。ついで、シリコンウェハ９０の上面にスピンコーティング法によりフォトレジスト膜を形成し、さらにフォトリソグラフィ工程により所定のパターニングを行う。フォトレジスト膜を現像した後に、ＢＨＦエッチング処理を行い、ついで残っているフォトレジスト膜を除去する（図１３の（ｃ）参照）。
【００５５】
つぎに、シリコンウェハ９０の下面のＳｉＯ2層９１をエッチング処理するに先立って、シリコンウェハ９０の上面をフォトレジスト膜により保護する。ついで、フォトレジスト膜との密着性を高めるためにシリコンウェハ９０の下面に、ＯＡＰを加熱して発生する蒸気を当てる。ついで、シリコンウェハ９０の下面にスピンコーティング法によりフォトレジスト膜を形成し、さらにフォトリソグラフィ工程により所定のパターニングを行う。フォトレジスト膜を現像した後に、ＢＨＦエッチング処理を行い、ついで残っているフォトレジスト膜を除去する（図１３の（ｂ）参照）。
【００５６】
（３）下面へのアルミ薄膜の蒸着及びアルミエッチング（図１４参照）
ついで、シリコンウェハ９０の下面にアルミ薄膜９２を蒸着し、フォトリソグラフィとアルミエッチング処理を行う。
より詳細には、まずアルミニウムを蒸着させてシリコンウェハ９０の下面にアルミ薄膜９２を形成する（図１４の（ｂ）参照）。ついで、フォトレジスト膜との密着性を高めるためにシリコンウェハ９０の下面に、ＯＡＰを加熱して発生する蒸気を当てる。ついで、シリコンウェハ９０の下面にスピンコーティング法によりフォトレジスト膜を形成し、さらにフォトリソグラフィ工程により所定のパターニングを行う。フォトレジスト膜を現像した後に、アルミエッチング処理を行い、ついで残っているフォトレジスト膜を除去する（図１４の（ｃ）参照）。
なお、アルミニウム薄膜９２に代えて、Ａｕなど他の金属の薄膜をスパッタリング又は蒸着によりシリコンウェハ４０の下面に形成することもできる。
【００５７】
（４）上面のＴＭＡＨエッチング（図１５参照）
ついで、下面に形成したアルミ薄膜を保護しつつ、上面側のシリコンをＴＭＡＨ溶液（水酸化テトラメチルアンモニウム水溶液）でエッチングする。
より詳細には、まず、シリコンウェハ９０の下面にＰＤＭＳフィルム及び保護ジグを利用して、当該シリコンウェハ９０の下面に形成したアルミ薄膜４２を保護する。ついで、シリコンウェハ９０の上面を、ＴＭＡＨ溶液で異方性エッチング処理を行う。
なお、ＴＭＡＨ溶液による異方性エッチング処理に代えて、ＫＯＨ溶液を用いた異方性エッチング処理を採用することができる。この場合、ＳｉＮXからなるマスキング層を用いるのが好ましい。
【００５８】
（５）下面の反応性イオンエッチング（図１６参照）
ついで、下面のシリコンを反応性イオンエッチング（ＩＣＰ−ＲＩＥ）法で貫通エッチングする。
（６）ＳｉＯ2層４１とアルミ薄膜４２の除去（図１７参照）
ついで、シリコンウェハ４０の上面及び下面のＳｉＯ2層９１、及び下面のアルミ薄膜９２を除去する。
より詳細には、まずアルミエッチング溶液を用いてシリコンウェハ９０の下面のアルミ薄膜９２を除去し、つぎに、ＢＨＦ溶液を用いてＳｉＯ2層９１を除去する。これにより、チップ本体、レンズ系及び取付部を一体化して作製するためのシリコン金型９３を得ることができる。
【００５９】
（７）ガラススライドへの固着（図１８参照）
ついで、得られたシリコン金型９３の下面をエポキシ系の接着剤９４を用いてガラススライド６４に固着する（以上、金型作製ステップ）。
（８）ＰＤＭＳの注入（図１９参照）
ついで、前記シリコン金型９３を含む金型内に溶融したＰＤＭＳを注入し、その後大気下で２０〜４０分間ガス抜きを行い、さらに７０〜１００℃で約３０分間、オーブンで硬化させる。
（９）離型（図２０参照）
ついで、硬化したＰＤＭＳ製品をシリコン金型９３から剥がすことで、レンズ系５２、第１取付部３６及び第２取付部３７がチップ本体５１と一体化されたバイオチップＢ２を得ることができる。このバイオチップＢ２の第１のレンズ部３１と第２のレンズ部３２とは、プリズム３３の中心に対して対称となるようにして形成される（以上、チップ成形ステップ）。
【００６０】
図１９で説明したステップにおいて、溶融したＰＤＭＳをシリコン金型９３に注入する際、チップ本体５１の内の平板状のベース部６５（図１１参照）となる部分の厚さｔ１を設定する。例えば、ガラススライド５４の厚さを０．１７ｍｍとした場合、ベース部６５の厚さｔ１は６００μｍと設定される。この厚さｔ１は、以下の式（１）によって設定され、式（１）中の角度θｉ及び角度θ３等は、以下の式（２）〜式（８）の条件を満たすようにして求められる。
【００６１】
【数１】
【数２】
【数３】
【数４】
【数５】
【数６】
【数７】
【数８】
【００６２】
なお、前記式（１）〜式（８）及び図１１において、ｔ２はガラススライド５４の厚さ、ｔ３はプリズム３３の厚さ（ベース部６５の厚さｔ１を除いた厚さ）である。ｎAは外気における（空気の）屈折率、ｎPはバイオチップＢ２の屈折率、ｎGはガラススライド５４の屈折率、ｎWは標本６２の屈折率である。θ１はプリズム３３への入射角、θ２は屈折角、θ３はガラススライド５４への入射角、θｉは屈折角、θ４はプリズム３３の側面（入射面）の傾斜角度（例えば５４．７°）である。Ｌはプリズム３３の寸法であって、二方向から照射する照射光の入射点（ｔ３／２の高さ位置）における寸法である。Ｌ１は光ファイバの先端から照射光のプリズム３３の入射点までの距離であり、Ｌ２は、照射光のプリズム３３への入射点からエバネッセント光を滲み出させる前記一つの領域Ｅ（の中心点）までの距離である。左右方向の位置が、前記一つの領域Ｅ（の中心点）とプリズム３３の中心とで一致していることから、距離Ｌ２は、プリズム３３の前記寸法Ｌの半分の距離となる（Ｌ２＝Ｌ／２）。また、前記式（８）は、ガラススライド５４と標本６２との境界面において入射光が全反射を起こし、エバネッセント場６１を生じさせるための条件式である。この条件式により、標本６２の特性が変更されても、全反射を確実に起こすことが可能となる。
【００６３】
このように、前記チップ成形ステップには、チップ本体５１のベース部６５の厚さｔ１を設定する厚さ設定ステップが含まれている。この厚さ設定ステップは、二方向から照射される相異なる波長λ１，λ２の二つの照明光を一つの領域Ｅに到達させることのできる光路ｅを、チップ本体１に備えさせるためのステップである。すなわち、バイオチップＢ２を製造する際に、前記厚さｔ１を設定することにより、チップ本体５１のベース部６５における光路長が調整され、かつ、前記式（１）〜式（８）の条件を満たすことにより、プリズム３３の中心の直下に位置する一つの領域Ｅに二方向からの照射光を到達させることができ、ガラススライド５４と標本６２との境界面における同じ領域で、二方向からの照射光を共に全反射させることが可能となる。
【００６４】
したがって、この厚さ設定ステップによれば、左右二方向からの照明光によって生じる二つのエバネッセント場を、一つの領域Ｅで自動的に重ね合わせることができるバイオチップＢ２を得ることができる。このように、チップ本体５１のベース部６５の厚さｔ１を設定すれば、エバネッセント場の重ね合わせを容易に実現することができる。なお、バイオチップＢ２やガラススライド５４の材質を変更しても、前記式（１）〜式（８）を満たすようにして、バイオチップＢ２の各部を設定することで、左右対称の位置から光を入射して、エバネッセント場を重ね合わせることを容易に実現することができる。
また、二つのレンズ部３１，３２を左右対称の配置として形成していることで、バイオチップＢ２の構造を簡略化し、製造を容易としている。
【００６５】
［実施の形態３］
本発明の別の実施の形態３について説明する。
図１１の実施の形態２では、二種類の波長の照明光によって二種類の蛍光対象（蛍光分子）を、高いＳＮ比で超高感度に同時に検出することができる二波長同時励起のバイオチップＢ２を説明した。本発明では、励起波長を前記実施の形態よりも多くすることができ、例えば励起波長を四種類とすることができる（実施の形態３）。この実施の形態３のバイオチップＢ３及びこのバイオチップＢ３に付着させて用いる標本配設手段Ｓ３を備えたアセンブリＡ３を、図２１に示す。
このバイオチップＢ３も、図１及び図１１のチップと同様に、チップ本体１５１とレンズ系１５２とを備えており、チップ本体１５１とレンズ系１５２とが、実質的に透明な材料で一体に継目無く成形されている。標本配設手段Ｓ２は、図１及び図１１のチップと同様の構成であり、説明を省略する。
【００６６】
実施の形態３におけるチップ本体１５１は平面視において正方形であり、レンズ系１５２は、チップ本体５１上の異なる位置（図２１において、対角線で区画されたそれぞれの領域）に配設された四つのレンズ部１３１，１３２，１３４，１３５を備えている。第１のレンズ部１３１と第２のレンズ部１３２とは、プリズム１３３の中心を挟んで対称の配置にあり、第３のレンズ部１３４と第２のレンズ部１３５とは、プリズム１３３の中心を挟んで対称の配置にある。
【００６７】
各レンズ部は、図１１の実施の形態２と同様に、四角錐台のプリズム１３３の一部（四分の一の部分）と、柱状レンズとで構成されており、各光源（図示せず）からの照明光を上側のガラススライド１５４の下面（第１の面）と標本との境界面に照射して全反射させ当該標本側にエバネッセント光を滲み出させる役割を果たす。そして、四つのレンズ部は、エバネッセント光を滲み出させる領域Ｅを中心として（プリズム１３３の中心から）放射状に配置されている。そして、四つのレンズ部は、エバネッセント光を滲み出させる一つの領域Ｅに対して、相異なる四種類の波長の照明光を四方向から照射して全反射させる位置にそれぞれ配設されている。前記領域Ｅは、プリズム１３３の中心の直下位置にある。また、光ファイバ２５５ａ，２５５ｂ，２５５ｃ，２５５ｄの先端部を取り付けるための四つの取付部も、プリズム１３３の中心から放射状に配置されている。
【００６８】
この実施の形態３によれば、エバネッセント光を滲み出させる一つの領域Ｅに、四種類の波長の照明光を四方向から照射することができる。このように、四つのレンズ部を通じて四方向から照明光を一つの領域Ｅに照射することで、前記四種類の波長の照明光によってそれぞれ生じさせるエバネッセント場を、領域Ｅにおいて容易に重ね合わせることができる。
【００６９】
さらに、図２１のバイオチップＢ３の製造方法は、図１１のバイオチップＢ２の製造方法と同様であり、チップ成形ステップに、チップ本体１５１のベース部１６５の厚さｔ１を設定する厚さ設定ステップが含まれている。このステップによれば、前記実施の形態２で説明したのと同様に、バイオチップＢ３を製造する際に、前記厚さｔ１を設定することにより、チップ本体１５１のベース部１６５における光路長が調整され、かつ、前記式（１）〜式（８）の条件を満たすことにより、プリズム１３３の中心の直下に位置する一つの領域Ｅに四方向からの照射光を到達させることができ、ガラススライド１５４と標本との境界面における同じ領域で、四方向からの照射光を共に全反射させることが可能となる。
【００７０】
したがって、四方向からの照明光によって生じる四つのエバネッセント場を、一つの領域Ｅで自動的に重ね合わせることができるバイオチップＢ３を得ることができる。このように、チップ本体１５１のベース部１６５の厚さｔ１を設定すれば、エバネッセント場の重ね合わせを容易に実現することができる。チップ成形ステップに厚さ設定ステップが含まれていることで、複数波長（四波長）同時励起による蛍光顕微鏡用全反射バイオチップＢ３を簡単に構成することができるので、このバイオチップＢ３は、作製が容易でかつ大量生産に向いている。
【００７１】
［実施例］
つぎに本発明のバイオチップの製法を実施例に基づいて説明するが、本発明はもとよりかかる実施例にのみ限定されるものではない。
［実施例１］
（１）まず、厚さ３００μｍのシリコンウェハに熱酸化処理を施して、当該シリコンウェハの両面に厚さ３８０ｎｍのＳｉＯ2層を形成した（図２参照）。この酸化処理は、酸素及び水素をそれぞれ１．１及び０．５ｓｌｍの流量で流しつつ、１０００℃の温度下で１７０分間行った。
【００７２】
（２）ついで、シリコンウェハの下面をフォトレジスト膜により保護した。使用したフォトレジストは、ＯＦＰＲ−８００（商品名。東京応化株式会社製フォトレジスト。粘度：５０ｃｐ）であり、これを２段階スピンコーティング法（５００ｒｐｍ（５秒）と２０００ｒｐｍ（３０秒））によりシリコンウェハの下面に塗布した。ホットプレートを用いて１１０℃で９０秒間予備加熱し、ついでオーブンにて１２０℃で１０分間本加熱した。
【００７３】
ついで、フォトレジスト膜との密着性を高めるためにシリコンウェハの上面に、２０ｍｌのＯＡＰを石英ビーカー内で１２０℃に加熱して発生する蒸気を２分間当てた。
ついで、シリコンウェハの上面にスピンコーティング法によりフォトレジスト膜を形成した。使用したフォトレジストは、ＯＦＰＲ−８００（粘度：５０ｃｐ）であり、これを２段階スピンコーティング法（５００ｒｐｍ（５秒）と３０００ｒｐｍ（３０秒））によりシリコンウェハの上面に塗布した。
【００７４】
ついで、両面マスクアラインナー露光装置で真空接触モードにてフォトリソグラフィ工程を行い、所定のパターンを形成した。アラインメントギャップは２５μｍであり、露光時間は１．５秒であった。
ＮＭＤ−３（商品名。東京応化株式会社製現像液）を用いて２分間現像し、ついで純水で５分間すすぎ、Ｎ2ガンを用いて乾燥させ、その後オーブンで１２０℃で２５分間加熱した。
【００７５】
ついで、ＢＨＦ溶液（１４％ＨＦ）を用いて、１０分間エッチング処理を行い、ついで純水で１０分間すすぎ、Ｎ2ガンを用いて乾燥させた。
ついで、剥離液１０６（商品名。東京応化株式会社製フォトレジスト除去剤）を用いて、ホットプレートで９５℃に加熱し、１０分間除去作業を行った。その後、アセトンで５分間洗浄し、さらにエタノールで５分間洗浄した。ついで、純水で１０分間すすぎ、オーブンにて１５分間脱水処理を行った。
【００７６】
ついで、シリコンウェハの上面をフォトレジスト膜により保護した。使用したフォトレジストは、ＯＦＰＲ−８００（粘度：５０ｃｐ）であり、これを２段階スピンコーティング法（５００ｒｐｍ（５秒）と２０００ｒｐｍ（３０秒））によりシリコンウェハの上面に塗布した。ホットプレートを用いて１１０℃で９０秒間予備加熱し、ついでオーブンにて１２０℃で１０分間本加熱した。
ついで、フォトレジスト膜との密着性を高めるためにシリコンウェハの下面に、２０ｍｌのＯＡＰを石英ビーカー内で１２０℃に加熱して発生する蒸気を２分間当てた。
【００７７】
ついで、シリコンウェハの下面にスピンコーティング法によりフォトレジスト膜を形成した。使用したフォトレジストは、ＯＦＰＲ−８００（粘度：５０ｃｐ）であり、これを２段階スピンコーティング法（５００ｒｐｍ（５秒）と３０００ｒｐｍ（３０秒））によりシリコンウェハの下面に塗布した。
ついで、両面マスクアラインナー露光装置で近接（プロクシミティ）プリンティングモードにてフォトリソグラフィ工程を行い、所定のパターンを形成した。アラインメントギャップは２５μｍであり、露光ギャップは８０μｍであり、露光時間は１０秒間であった。
【００７８】
ついで、ＮＭＤ−３を用いて２分間現像し、純水で５分間すすぎ、Ｎ2ガンを用いて乾燥させ、その後オーブンで１２０℃で２５分間加熱した。
ついで、ＢＨＦ溶液（１４％ＨＦ）を用いて、１０分間エッチング処理を行い、ついで純水で１０分間すすぎ、Ｎ2ガンを用いて乾燥させた。
ついで、剥離液１０６を用いて、フォトレジストを除去した。剥離液１０６をホットプレートで９５℃に加熱し、１０分間除去作業を行った。その後、アセトンで５分間洗浄し、さらにエタノールで５分間洗浄した。ついで、純水で１０分間すすぎ、オーブンにて１５分間脱水処理を行った。
【００７９】
（３）ついでアルミニウムをシリコンウェハの下面に蒸着させた。蒸着圧は０．００２５ｔｏｒｒであり、電流は６５Ａであり、蒸着時間は３分間であった。
ついで、フォトレジスト膜との密着性を高めるためにシリコンウェハの下面に、２０ｍｌのＯＡＰを石英ビーカー内で１２０℃に沸騰させて発生する蒸気を２分間当てた。
ついで、シリコンウェハの下面にスピンコーティング法によりフォトレジスト膜を形成した。使用したフォトレジストは、ＯＦＰＲ−８００（粘度：５０ｃｐ）であり、これを２段階スピンコーティング法（５００ｒｐｍ（５秒）と３０００ｒｐｍ（３０秒））によりシリコンウェハの下面に塗布した。
【００８０】
ついで、両面マスクアラインナー露光装置で真空接触モードにてフォトリソグラフィ工程を行い、所定のパターンを形成した。アラインメントギャップは２５μｍであり、露光時間は１．５秒間であった。
ついで、ＮＭＤ−３を用いて２分間現像し、純水で５分間すすぎ、Ｎ2ガンを用いて乾燥させ、その後オーブンで１２０℃で２５分間加熱した。
ついで、Ａｌエッチング溶液を用いて、エッチング処理を行い、ついで純水で１０分間すすぎ、Ｎ2ガンを用いて乾燥させた。
【００８１】
ついで、剥離液１０６をホットプレートで９５℃に加熱し、１０分間でフォトレジスト除去作業を行った。その後、アセトンで５分間洗浄し、さらにエタノールで５分間洗浄した。ついで、純水で１０分間すすぎ、オーブンにて１５分間脱水処理を行った。
その後、シリコンウェハをシングルチップ（２７ｍｍ×２７ｍｍ）の大きさに切断した。
【００８２】
（４）ついで、シリコンウェハの下面にスピンコーティング法により厚さ１５０μｍのＰＤＭＳフィルムを形成し、さらに保護ジグを利用して、当該シリコンウェハの下面に形成したアルミ薄膜を保護した。
つぎに、ＴＭＡＨ溶液（２０重量％）、大きな石英ビーカー、及び磁性攪拌機を備えたホットプレートを用いて異方性エッチング処理を行った。磁性攪拌機を２５０ｒｐｍで操作しつつＴＭＡＨ溶液を９０℃に維持した。エッチング時間は６時間、エッチング深さは２７０μｍ、エッチング速度はシリコン単結晶の＜１００＞方向において０．７５μｍ／分であった。
ついで、純水で１０分間すすぎ、オーブンにて１５分間脱水処理を行った。
【００８３】
（５）ついで、下面のシリコンを反応性イオンエッチング（ＩＣＰ−ＲＩＥ）法でエッチング処理した。エッチング時間１０秒に対しパッシベーション時間５秒のサイクルであり、トータルのエッチング時間は１１０分であった。
その後、アセトンで５分間洗浄し、さらにエタノールで５分間洗浄した。ついで純水で１０分間すすぎ、オーブンにて１５分間脱水処理を行った。
【００８４】
（６）ついで、アルミエッチング溶液を用いてシリコンウェハの下面のアルミ薄膜を除去（除去時間：１０分）した後に、純水で１０分間すすぎ、Ｎ2ガンを用いて乾燥させた。つぎに、ＢＨＦ溶液（１４％ＨＦ）を用いてＳｉＯ2層をエッチングにより除去した（エッチング時間：１０分）。その後、純水で１０分間すすぎ、Ｎ2ガンを用いて乾燥させた。
【００８５】
（７）ついで、得られたチップの下面にエポキシ系の接着剤を用いてガラススライド（３２ｍｍ×３２ｍｍ、厚さ０．２ｍｍ、松浪硝子工業株式会社製）に固着した。つぎに、９０℃のオーブンにて３０分間硬化させた。
（８）ついで、得られたシリコン金型を含む金型内に、Ｓｉｌｐｏｔ１８４Ｗ／Ｃ（商品名。ダウコーニング社製ＰＤＭＳ）の混合物（重量比で硬化剤１に対しプレポリマー１０を混合したもの）を溶融させたものを注入し、その後大気下で３０分間ガス抜きを行い、さらに８０℃の炉内で３０分間硬化させた。
（９）成型されたチップを注意深くシリコン金型から剥がした。
【００８６】
［実施例２］
図１１に示されるように、一体に成形されたチップ本体５１及びレンズ系５２を有しており、かつ、レンズ系５２は、チップ本体５１上の異なる位置に配設された二つのレンズ部３１，３２を備えたバイオチップを製造した。レンズ系５２及び取付部３６，３７の形成のためのマスクのパターンを変えるとともに、厚さ設定ステップを実行した以外は、実施例１と同様にしてバイオチップを製造した。すなわち、シリコン金型９３をガラススライド６４へ固着したのちのＰＤＭＳの注入（図１９参照）のステップにおいて、得られたシリコン金型９３を含む金型内に、Ｓｉｌｐｏｔ１８４Ｗ／Ｃ（商品名。ダウコーニング社製ＰＤＭＳ）の混合物（重量比で硬化剤１に対しプレポリマー１０を混合したもの）を溶融させたものを注入し、その後大気下で３０分間ガス抜きを行い、さらに８０℃の炉内で３０分間硬化させた。この際、チップ本体５１のベース部６５の厚さｔ１を所定の値（６００μｍ）に設定するために、０．３ｍｌのプレポリマーを金型に流し込み、水平な台上に置いてガス抜きを行い、硬化させた。
【００８７】
また、前記各実施の形態において、光源からの照明光をバイオチップ内に導入する光ファイバの基部側には、カップリング部（図示せず）が設けられており、このカップリング部には、ＬＥＤやレーザ発振器（レーザダイオード）等の様々な光源を接続することができる。
さらに、図１１と図２１の実施の形態のように、複数方向から照明光を領域Ｅに照射させるために、直線的な配置で対のレンズ部（例えば図２１ではレンズ部１３１とレンズ部１３２）が形成されているバイオチップである場合、一方のレンズ部側に光ファイバ（光源）を設け、他方のレンズ部側に光検出器（光トラップ）を設けることができる。この場合、光ファイバから一方のレンズ部へ導出され、ガラススライドと標本との間の境界面で全反射した後の光を、他方のレンズ部によって光検出器へ導入させることができ、光検出器を吸光度センサとして機能させることができる。
【００８８】
また、本発明のバイオチップ、アセンブリは、図示する形態に限らず本発明の範囲内において他の形態のものであっても良い。例えば、前記実施の形態では、レンズ系が備えているレンズを柱状（円筒状）として説明したが、これ以外に球状であってもよい。
また、図１１と図２１の実施の形態では、複数のレンズ部が一つのプリズムを兼用した構成としたが、各レンズ部が一つのプリズムをそれぞれ有している構成（図示せず）としてもよい。また、光ファイバの先端部が当接するストッパー及び保持部についても、図示した形状以外のものであってもよい。
【図面の簡単な説明】
【００８９】
【図１】本発明のアセンブリの一実施の形態の断面説明図である。
【図２】本発明のバイオチップの製造工程を示しており、（ａ）は断面説明図、（ｂ）は上方から見た斜視説明図である。
【図３】本発明のバイオチップの製造工程を示しており、（ａ）は断面説明図、（ｂ）は下方から見た斜視説明図、（ｃ）は上方から見た斜視説明図である。
【図４】本発明のバイオチップの製造工程を示しており、（ａ）は断面説明図、（ｂ）及び（ｃ）は下方から見た斜視説明図である。
【図５】本発明のバイオチップの製造工程を示しており、（ａ）は断面説明図、（ｂ）は上方から見た斜視説明図である。
【図６】本発明のバイオチップの製造工程を示しており、（ａ）は断面説明図、（ｂ）は下方から見た斜視説明図である。
【図７】本発明のバイオチップの製造工程を示しており、（ａ）は断面説明図、（ｂ）は上方から見た斜視説明図である。
【図８】本発明のバイオチップの製造工程を示しており、（ａ）は断面説明図、（ｂ）は上方から見た斜視説明図である。
【図９】本発明のバイオチップの製造工程を示しており、（ａ）は断面説明図、（ｂ）は上方から見た斜視説明図である。
【図１０】本発明のバイオチップの製造工程を示しており、（ａ）は断面説明図、（ｂ）は上方から見た斜視説明図である。
【図１１】本発明のアセンブリの他の実施の形態の断面説明図である。
【図１２】図１１のバイオチップの製造工程を示しており、（ａ）は断面説明図、（ｂ）は上方から見た斜視説明図である。
【図１３】図１１のバイオチップの製造工程を示しており、（ａ）は断面説明図、（ｂ）は下方から見た斜視説明図、（ｃ）は上方から見た斜視説明図である。
【図１４】図１１のバイオチップの製造工程を示しており、（ａ）は断面説明図、（ｂ）及び（ｃ）は下方から見た斜視説明図である。
【図１５】図１１のバイオチップの製造工程を示しており、（ａ）は断面説明図、（ｂ）は上方から見た斜視説明図である。
【図１６】図１１のバイオチップの製造工程を示しており、（ａ）は断面説明図、（ｂ）は下方から見た斜視説明図である。
【図１７】図１１のバイオチップの製造工程を示しており、（ａ）は断面説明図、（ｂ）は上方から見た斜視説明図である。
【図１８】図１１のバイオチップの製造工程を示しており、（ａ）は断面説明図、（ｂ）は上方から見た斜視説明図である。
【図１９】図１１のバイオチップの製造工程を示しており、（ａ）は断面説明図、（ｂ）は上方から見た斜視説明図である。
【図２０】図１１のバイオチップの製造工程を示しており、（ａ）は断面説明図、（ｂ）は上方から見た斜視説明図である。
【図２１】本発明のアセンブリの他の実施の形態の斜視説明図である。
【図２２】従来のバイオチップの断面説明図である。
【符号の説明】
【００９０】
１ チップ本体
２ レンズ系
２ａ プリズム
２ｂ 柱状レンズ
３ スペーサ
４ ガラススライド
５ 光ファイバ
６ ストッパー
７ 保持部
８ 光トラップ
９ レーザ光
１０ 対物レンズ
１１ エバネッセント場
１２ 標本
３１，３２ レンズ部
１３１，１３２,１３４，１３５ レンズ部
４０ シリコンウェハ
４１ ＳｉＯ2層
４２ アルミ薄膜
４３ シリコン金型
Ａ，Ａ２，Ａ３ アセンブリ
Ｂ，Ｂ２，Ｂ３ バイオチップ
Ｅ 領域
Ｓ，Ｓ２，Ｓ３ 標本配設手段
ｔ１ チップ本体の厚さ
【特許請求の範囲】
【請求項１】
全反射蛍光観察される標本が第１の面に設けられた標本配設手段の第２の面が密接される当接面を有するチップ本体と、光源からの照明光を前記標本配設手段の第１の面と標本との境界面に照射して全反射させ当該標本側にエバネッセント光を滲み出させるとともに、全反射した照射光を外部に導出するためのレンズ系とが、実質的に透明な材料で一体に成形されていることを特徴とする蛍光顕微鏡用全反射バイオチップ。
【請求項２】
前記レンズ系は、前記チップ本体上の異なる位置に配設された複数のレンズ部を備え、前記複数のレンズ部は、前記エバネッセント光を滲み出させる一つの領域に対して相異なる波長の前記照明光を複数の方向から照射させる位置にそれぞれ配設されている請求項１に記載の蛍光顕微鏡用全反射バイオチップ。
【請求項３】
前記複数のレンズ部は、前記一つの領域を挟んで対称に配置されている請求項２に記載の蛍光顕微鏡用全反射バイオチップ。
【請求項４】
前記複数のレンズ部は、前記一つの領域を中心として放射状に配置されている請求項２に記載の蛍光顕微鏡用全反射バイオチップ。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか一項に記載のバイオチップと、このバイオチップの前記当接面に密接される標本配設手段とを有しており、この標本配設手段が、スペーサを介して対向して配置された一対のガラススライドからなり、両ガラススライド間に全反射蛍光観察される標本が充填されていることを特徴とする蛍光顕微鏡用全反射バイオチップアセンブリ。
【請求項６】
請求項１〜４のいずれか一項に記載のバイオチップを製造する方法であって、
エッチングを含む微細加工をウェハに施して前記チップ本体及びレンズ系のための金型を作製するステップと、
前記金型を用いて実質的に透明な材料によりバイオチップを一体成形するステップと
を含むことを特徴とする蛍光顕微鏡用全反射バイオチップの製法。
【請求項７】
請求項２〜４のいずれか一項に記載のバイオチップを製造する方法であって、
エッチングを含む微細加工をウェハに施して前記チップ本体及びレンズ系のための金型を作製する金型作製ステップと、
前記金型を用いて実質的に透明な材料によりバイオチップを一体成形するチップ成形ステップと、を含み、
前記チップ成形ステップには、
複数の方向から照射される相異なる波長の前記照明光を前記一つの領域に到達させる光路を前記チップ本体が有するように、当該チップ本体の厚さを設定する、厚さ設定ステップが含まれていることを特徴とする蛍光顕微鏡用全反射バイオチップの製法。
【請求項１】
全反射蛍光観察される標本が第１の面に設けられた標本配設手段の第２の面が密接される当接面を有するチップ本体と、光源からの照明光を前記標本配設手段の第１の面と標本との境界面に照射して全反射させ当該標本側にエバネッセント光を滲み出させるとともに、全反射した照射光を外部に導出するためのレンズ系とが、実質的に透明な材料で一体に成形されていることを特徴とする蛍光顕微鏡用全反射バイオチップ。
【請求項２】
前記レンズ系は、前記チップ本体上の異なる位置に配設された複数のレンズ部を備え、前記複数のレンズ部は、前記エバネッセント光を滲み出させる一つの領域に対して相異なる波長の前記照明光を複数の方向から照射させる位置にそれぞれ配設されている請求項１に記載の蛍光顕微鏡用全反射バイオチップ。
【請求項３】
前記複数のレンズ部は、前記一つの領域を挟んで対称に配置されている請求項２に記載の蛍光顕微鏡用全反射バイオチップ。
【請求項４】
前記複数のレンズ部は、前記一つの領域を中心として放射状に配置されている請求項２に記載の蛍光顕微鏡用全反射バイオチップ。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか一項に記載のバイオチップと、このバイオチップの前記当接面に密接される標本配設手段とを有しており、この標本配設手段が、スペーサを介して対向して配置された一対のガラススライドからなり、両ガラススライド間に全反射蛍光観察される標本が充填されていることを特徴とする蛍光顕微鏡用全反射バイオチップアセンブリ。
【請求項６】
請求項１〜４のいずれか一項に記載のバイオチップを製造する方法であって、
エッチングを含む微細加工をウェハに施して前記チップ本体及びレンズ系のための金型を作製するステップと、
前記金型を用いて実質的に透明な材料によりバイオチップを一体成形するステップと
を含むことを特徴とする蛍光顕微鏡用全反射バイオチップの製法。
【請求項７】
請求項２〜４のいずれか一項に記載のバイオチップを製造する方法であって、
エッチングを含む微細加工をウェハに施して前記チップ本体及びレンズ系のための金型を作製する金型作製ステップと、
前記金型を用いて実質的に透明な材料によりバイオチップを一体成形するチップ成形ステップと、を含み、
前記チップ成形ステップには、
複数の方向から照射される相異なる波長の前記照明光を前記一つの領域に到達させる光路を前記チップ本体が有するように、当該チップ本体の厚さを設定する、厚さ設定ステップが含まれていることを特徴とする蛍光顕微鏡用全反射バイオチップの製法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【公開番号】特開２００８−２９８７７１（Ｐ２００８−２９８７７１Ａ）
【公開日】平成２０年１２月１１日（２００８．１２．１１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−１１９８３６（Ｐ２００８−１１９８３６）
【出願日】平成２０年５月１日（２００８．５．１）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り 平成１８年１２月１日 立命館大学主催の「文部科学省２１世紀ＣＯＥ拠点形成プログラム 立命館大学 放射光生命科学研究プロジェクト 放射光生命科学研究センター第４回年次報告会」に文書をもって発表
【出願人】（５９３００６６３０）学校法人立命館 (359)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２０年１２月１１日（２００８．１２．１１）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年５月１日（２００８．５．１）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り 平成１８年１２月１日 立命館大学主催の「文部科学省２１世紀ＣＯＥ拠点形成プログラム 立命館大学 放射光生命科学研究プロジェクト 放射光生命科学研究センター第４回年次報告会」に文書をもって発表
【出願人】（５９３００６６３０）学校法人立命館 (359)
【Ｆターム（参考）】
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